DE10234905A1

DE10234905A1 - Verfahren zur Verbesserung des akustisch induzierten Molekültransfers

Info

Publication number: DE10234905A1
Application number: DE2002134905
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr.-Ing. Hepp
Original assignee: Dornier Medizintechnik GmbH
Current assignee: Dornier Medizintechnik GmbH
Priority date: 2002-07-31
Filing date: 2002-07-31
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2022-08-01
Also published as: DE10234905B4

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Transferieren von Molekülen medizinisch wirksamer Stoffe (Agenzien) - wie zum Beispiel DNA, Oligos, bestimmte Chemikalien etc. - in Zellen von Menschen, Tieren und/oder Pflanzen mittels durch akustische Energie erzeugten Scherkräften, und zwar in vitro wie auch in vivo. DOLLAR A Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass die Scherkräfte durch Einwirkung der akustischen Wellen auf in dem gesamten Probenvolumen verteilte Streukörper erzeugt werden. Dabei ist es vorteilhaft, wenn sich deren Schalldichte von derjenigen der Trägerflüssigkeit mit den darin enthaltenen Zellen und den zu transferierenden Agenzien unterscheidet.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Transferieren von Molekülen medizinisch wirksamer Stoffe (Agenzien wie zum Beispiel DNA, Oligos, bestimmte Chemikalien etc. – in Zellen von Menschen, Tieren und/oder Pflanzen mittels durch akustische Energie erzeugten Scherkräften, und zwar in vitro wie auch in vivo.
Die Membran lebender Zellen bildet sowohl bei Einzellern in Nährlösungen wie bei Vielzellern im Gewebeverband einen natürlichen Schutz gegen das Eindringen unerwünschter Moleküle, Gene oder Viren.

Im Rahmen der Biotechnologie oder der Therapie ist es jedoch erforderlich, die Zellmembran zu überwinden und bestimmte Moleküle mit meist höherem Molekulargewicht – sogenannte Biomoleküle, Genabschnitte (Oligos) oder Gene – in das Zytoplasma der Zelle einzubringen, ohne die Lebens- und/oder die Proliferationsfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen.

Hierzu kommen heute physikalische Verfahren, wie zum Beispiel die Elektroporation wie auch biologische Methoden, zum Beispiel in Form von viralen Vektoren zur Anwendung. Leider haben diese Verfahren auch Nachteile vor allem in Bezug auf die Überlebensrate der zu transfizierenden Zellen.

Seit einiger Zeit verspricht auch der Einsatz akustischer Energie in Form von Ultraschall oder Stosswellen Fortschritte im Hinblick auf Effektivität und Anwendungsbreite, was in zahleichen Versuchen mittels akustischer Verfahren nachgewiesen wurde.

Bei der akustischen Transfektion, der sogenannten Sonication, stand an erster Stelle die zuerst von Delius vertretene Hypothese, dass die Ausbildung von Kavitationsjets das eigentliche Wirkprinzip sei; durch diese Jets würden die in der Umgebung der Zelle befindlichen Moleküle, Genabschnitte, Oligonukleotide oder Gene mitgerissen und im Zytoplasma der Zellen deponiert. Dieser Mechanismus erklärt einen Teil der Effekte angesichts der Erkenntnis, dass durch Überdruck der Molekültransfer erheblich reduziert werden kann. Diese Hypothese erklärt auch die Beobachtung, dass nur ein kleiner Teil der Zellen pro Puls transfiziert wird, jedoch ein erheblicher Teil der Zellen der Zerstörung anheimfällt. Ein Vergleich der Größenverhältnisse der zu transfizierenden Zellen (5 bis 30 μm) mit denjenigen der Kavitationsereignisse (40 bis 1000 μm) erklärt diese Problematik.

Eine zweite Hypothese sieht in der Einwirkung von Scherkräften auf die Zellen den vorwiegenden Wirkungsmechanismus für den Molekültransfer, wobei die Scherkräfte sekundär durch Kavitationsereignisse hervorgerufen werden.

Flotierende Zellen können physikalisch als eine Hülle mit hoher Formanpassungsfähigkeit betrachtet werden, die eine Flüssigkeit umschließt, die ihrerseits durch das Zytoskelett gegenüber der Umgebung eine erhöhte Viskosität mit höheren inneren Reibungsverlusten aufweist. Das Zytoskelett ist eine Art Faserstruktur, die den Innenraum der Zelle ausfüllt und mit der Zellmembran in Verbindung steht, was einer Formveränderung der Zelle durch äußere Kräfte entgegenwirkt. Bei einer Deformation der Zelle über eine bestimmte Schwelle hinaus kann es zu kurzzeitiger Durchlässigkeit der Zellmembran kommen; bei weiterer Deformation stellen sich jedoch irreversible Schäden an den Zellen ein.

Die Deformation einer flotierenden Zelle wird bewirkt durch Zug- oder Scherspannungen, die in Fluiden durch inhomogene Strömungen erzeugt werden können.

Es wird heute davon ausgegangen, dass eine Zelle unter Einwirkung von Scherspannungen auslösenden Strömungen ihre Form derart ändert, dass sich dadurch kurzzeitig ihre Zellmembran für den Transfer von Molekülen aus dem extrazellulären Raum öffnet. Beobachtungen an Vollblut, das bei turbulenten Strömungen mit hohen Scherkräften der Hämolyse unterliegt, legt die Wirkung von Scherkräften auf Zellen nahe. Als Schwelle für die Zerstörung von roten Blutkörperchen werden Scherspannungen von 500 dyn/cm² angegeben. Außerdem wurde in durchströmten Blutgefäßen mit turbulenzerhöhenden Hindernissen im Epithel die Abgabe von Wirkstoffen aus den Zellen gemessen. Physiologische Scherspannungen liegen dagegen im Bereich von 2 bis 5 dyn/cm².

Der Erfindung liegt damit die Aufgabe zugrunde, zur Verbesserung des Molekültransfers in Zellen von Lebewesen unter gleichzeitiger Erhöhung der Überlebensrate der Zellen beim Transferieren in der betreffenden Nährlösung bzw. Suspensionsflüssigkeit Scherkräfte zu erzeugen, die gleichmäßig über das gesamte Probenvolumen verteilt, vorteilhaft in der Größenordnung von 5 bis 500 dyn/cm² liegen.

Gelöst ist diese Aufgabe im wesentlichen durch das Kennzeichen des Patentanspruches 1. Die Erfindung ist damit primär darin zu sehen, dass die Scherkräfte durch Einwirkung der akustischen Wellen auf in dem gesamten Probenvolumen verteilte Streukörper erzeugt werden. Die Streukörper fungieren als akustische Hindernisse. Ihre Größenordnung entspricht in etwa derjenigen der Zellen. Ihre Schalldichte weicht jedoch von derjenigen der Nährlösung mit den darin enthaltenen Zellen und den zu transferierenden Molekülen deutlich ab. Die erfindungsgemäß zu erzeugenden Scherkräfte entstehen, sobald das Probenvolumen mit einer akustischen Welle durchschallt wird. Letztere kann in Form von gepulstem Ultraschall oder beispielsweise auch als akustische Stoßwelle eingestrahlt werden.

Die erfindungsgemäß möglichst gleichmäßig in der Nährlösung verteilten Streukörper erfahren infolge ihrer unterschiedlichen Schalldichte bei der Pulsbeaufschlagung durch die Schallwelle eine Eigenbewegung, die dem Durchlauf der akustischen Welle nachfolgt. Die Eigenbewegung der Streukörper gipfelt in einer Relativbewegung gegenüber ihrer Umgebung, wodurch kurzzeitig lokale Scherspannungen in Streukörpernähe erzeugt werden bzw. entstehen. Die Scherspannungen können durch die Intensität und durch das Zeitprofil der akustischen Welle, durch die Größe und Schalldichte der erfindungsgemäßen Streukörper, durch die hydrophilen Eigenschaften der Oberfläche der Streukörper und durch die Viskosität der Probenflüssigkeit bedarfsweise modifiziert bzw. so eingestellt werden, dass sie die jeweilige Transferaufgabe so optimal wie möglich lösen.

Weitere Einzelheiten im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den Patentansprüchen 2 bis 9.

In den Abbildungen ist die Erfindung zeichnerisch anhand von Beispielen erläutert.

Es zeigen: 1a einen Großausschnitt aus einem Probengefäß mit zu transfizierenden Molekülen, Zellen und Sreukörpern.

1b eine vergrößerte Darstellung eines Streukörpers mit seiner unmittelbaren Umgebung gemäß Ausschnitt 7 aus der 1a

2 ein Diagramm „Verformung V über der Zeit t" mit Ortskurven eines Partikels der Suspension und eines Streukörpers.

3 drei Probengefäße vergleichsweise nebeneinander mit unterschiedlichen Streukörpern.

Gemäß 1a befinden sich in einem ausschnittweise dargestellten Probengefäß neben Zellen 2a, 2b und zu transferierenden Molekülen 3 sogenannte akustische Hindernisse in Form von Streukörpern 1. Alle Teilmengen 1 bis 3 schweben in einer Nähr- bzw. Suspensionslösung 4.

Wie weiterhin aus der 1 hervorgeht, sind die erfindungsgemäßen Streukörper 1 und die Zellen 2a, 2b größen- und zahlenmäßig in etwa gleich bemessen; erfindungsgemäß unterscheiden sie sich jedoch deutlich hinsichtlich ihrer Schalldichte, die vorteilhafterweise bei den Streukörpern 1 wesentlich größer ist als bei den Zellen 2a, 2b und der Flüssigkeit. Des weiteren ist in der 1a zeichnerisch angedeutet, dass das vorgenannte Gemisch aus den Teilmengen 1 bis 4 mit akustischen Pulsen 5, beispielsweise mit Stoßwellen beaufschlagbar ist. Die erfindungsgemäße Folge einer Pulsbeaufschlagung ist aus der 1b erkennbar, die eine starke Vergrößerung des Ausschnitts 7 aus der 1a darstellt.

Gemäß 1b befindet sich eine noch nicht transfizierte Zelle 2a kurz vor dem Auftreffen auf einen Streukörper 1, der durch seine schnellere Bewegung in seiner Umgebung Scherspannungen im Bereich der Stromlinien 6 erzeugt. Bei den gestrichelten Linien 6a handelt es sich um Linien gleicher Scherspannungen.

Sobald die Zellen 2a in den Bereich der Stromlinien 6 gelangen, erfahren sie eine Deformation durch die dort vorherrschenden Scherspannungen, während der sie ihre Membran zur Aufnahme der Moleküle 3 kurzzeitig öffnen. Nach Verlassen des Stromlinienbereiches 6 nehmen die Zellen 2b im wesentlichen wieder ihre ursprüngliche Form an; in diesem Zustand befinden sich dann allerdings in ihrem Inneren die transferierten Moleküle 3.

Die 2 zeigt in einem Diagramm „Verformung V über der Zeit t" die Ortskurve 9 eines Streukörpers 1 im Vergleich zu der Ortskurve 8 eines Partikels 3 der Suspension 4.

Gemäß dem Probengefäß 10a in 3 sind die Streukörper 1 vorteilhafterweise kugelförmig ausgebildet, damit sie durch ihre glatte Oberfläche keine Verletzungsgefahr für die Zellen 2 darstellen.

Das Probengefäß 10b zeigt im Rahmen der Erfindung Streukörper in Form von Streunetzen 11 innerhalb der Suspensionslösung 4.

Ein weiteres Beispiel für mögliche Streukörperausbildungen zeigt das Probengefäß 10c in 3, in welchem sich Sreuwolle bzw. Streugewebe 12 als akustisches Hindernis befindet. Die charakteristischen Durchmesser 13 der Streukörper 1, 11, 12 liegen in der Größenordnung der zu transfizierenden Zellen, das heißt im Bereich von 5 bis 30 μm.

Streukörper in Form von Netzen 11 und Geweben 12 haben den Vorteil, dass sie nach der Transfektion einfach entfernt werden können, während Streukörper in Partikelform zum Entfernen zentrifugiert oder sedimentiert werden müssen.

1: Streukörper (akustische Hindernisse)
2a: Zellen vor ihrem Transfer
2b: Zellen nach ihrem Transfer
3: Zu transfizierende Moleküle
4: Nähr- bzw. Suspensionslösung
5: Akustischer Puls (hier Stosswelle)
6: Stromlinien
7: Ausschnittvergrößerung aus Fig. 1a
8: Ortskwve eines Partikels 3 der Suspension 4
9: Ortskurve des Streukörpers 1,11,12
10a bis 10c: Probengefäße
11: Streukörper in Form von Netzen
12: Streukörper in Form von Wolle bzw. Gewebe
13: Charakteristischer Durchmesser der Streukörper

Claims

Verfahren zum Transferieren von Molekülen medizinisch wirksamer Stoffe (Agenzien)..., – wie zum Beispiel DNA, Oligos, bestimmte Chemikalien etc. – in Zellen von Menschen, Tieren und/oder Pflanzen mittels durch akustische Energie erzeugten Scherkräften, und zwar in vitro wie auch in vivo, dadurch gekennzeichnet, dass die Scherkräfte durch Einwirkung der akustischen Wellen auf in dem gesamten Probenvolumen verteilte Streukörper (1,11,12) erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Schalldichte der Streukörper (1,11,12) von der Schalldichte der Trägerflüssigkeit (4) mit den darin enthaltenen Zellen (2a,2b) und den zu transferierenden Agenzien (3) unterscheidet.
Verfahren nach Anspruch 1 und 2 , dadurch gekennzeichnet, dass die Streukörper (1,11,12) aus inertem Material mit hoher Schalldichte wie zum Beispiel aus Quarz, aus Keramik und/oder aus Edelmetallen bestehen.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, das die Größe der Streukörper (1) in etwa der Größe der Zellen (2a,2b) entspricht.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Streukörper (1) kugelförmig sind und in Suspension gehalten werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Streukörper in Form von Fasern, Netzen (11), Wolle, Fäden und/oder Gewebe (12) und dergleichen in das Probenvolumen für die Zeit des Molekültransfers eingebracht werden.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der Streukörper (1) pro Volumeneinheit in etwa der Zahl der zu tranferierenden Zellen (2a,2b) entspricht.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Streukörper (1,11,12) durch geeignete Vorbehandlungen hydrophil sind.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Streukörper (1,11,12) durch geeignete Vorbehandlungen die zu transferierenden Moleküle (3) an sich binden.