-
Die
Erfindung betrifft eine Pipetteneinrichtung, die zur Manipulation
biologischer Zellen, insbesondere unter Ultraschalleinwirkung, eingerichtet
ist, eine Manipulationseinrichtung, die mit einer derartigen Pipetteneinrichtung
ausgestattet ist, und Verfahren zur Manipulation biologischer Zellen.
-
Es
ist allgemein bekannt, Zellen mit einer enzymatischen Behandlung
(z. B. durch Behandlung mit Trypsin) von festen Oberflächen
abzulösen. Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht darin,
dass es während der Einwirkzeit des Enzyms zu Zellschäden kommen
kann. Des weiteren kann, falls nur ein Teil der Zellen aus einer
Kultur abgelöst werden soll, die Ablösung nur
mit einem erheblichen experimentellen Aufwand auf einen Teilbereich
der Oberfläche beschränkt werden, da sich die
enzymatische Behandlung typischerweise auf die gesamte Oberfläche
z. B. eines Kultivierungssubstrates erstreckt.
-
Sehr
häufig ist jedoch gerade die lokale Ablösung von
Zellen (insbesondere Zellklonen) von Oberflächen erwünscht.
Dies ist z. B. für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern
erforderlich, wenn nur bestimmte antikörperproduzierende
Zellklone aus einer Petrischale entnommen werden sollen. Eine weitere
Anwendung betrifft die gezielte Ablösung von transfizierten
Zellen aus einem Zellrasen. Auch in diesem Fall ist es vorteilhaft,
die ggf. durch einen Marker identifizierten Zellen gezielt aus einem Zellrasen
zu entnehmen.
-
In
DE 197 42 163 sind ein
Verfahren und eine Vorrichtung beschrieben, die das lokale Perfundieren von
Zellen auf abgegrenzten Oberflächen ermöglichen.
Dabei wird zunächst eine Perfusionsflüssigkeit in
eine Pipettenspitze aufgenommen und anschließend ein Perfusionsring
auf die Pipettenspitze gesteckt. Der Perfusionsring wird mit der
Pipettenspitze auf den Boden eines Kultivierungsgefäßes
aufgesetzt, so dass der Perfusionsring einen zu behandelnden Bereich
der Oberfläche eingrenzt. Durch Einwirken einer Enzymlösung
und eine gleichzeitige Perfusion des abgegrenzten Bereiches können
die Zellen durch die Enzymlösung und durch Scherkräfte in
der Flüssigkeit abgelöst werden.
-
Ein
Nachteil des aus
DE 197 42 163 bekannten
Verfahrens kann darin bestehen, dass der Ablösevorgang
wesentlich von der Einwirkzeit der Enzymlösung (Inkubationszeit)
abhängig ist. Die erforderliche Inkubatiorszeit ist für
verschiedene Zelltypen variabel, was eine schnelle Entnahme der
Zellen erschwert. Durch lange Einwirkzeiten von Enzymlösungen
kann es ferner zu Zellschädigungen kommen. Ein Nachteil
kann auch darin bestehen, dass durch die variablen Inkubationszeiten
(für verschiedene Zelltypen) der Ablöseprozess
nicht standardisiert werden kann. Die Anwendung der in
DE 197 42 163 beschriebenen Technik
ist des Weiteren dahingehend beschränkt, dass ausschließlich
eine Entnahme von Zellen vorgesehen ist. Eine weitere Bearbeitung
der Zellen ist jedoch nur mit einem erheblichen Zusatzaufwand möglich.
-
Bei
bestimmten Aufgaben in der Zellbiologie kann ein Interesse an einer
lokalen Behandlung der Zellen bestehen, z. B. für das Anfertigen
von so genannten Zellarrays, bei denen ein Zellrasen an verschiedenen
Stellen behandelt (z. B. transfiziert oder Wirkstoffen ausgesetzt)
wird. Die Herstellung von Microarrays (siehe z. B.
Chiosis
et al. in "Trends in Biotechnology", Bd. 23, 2005, S. 271)
ist für viele Anwendungen in der Biologie erwünscht.
-
In
DE 101 08 799 A1 wird
ein Verfahren zur Einführung von biologischem oder pharmakologischem
Material in biologisches Zellmaterial unter der Wirkung von Ultraschallschwingungen
beschrieben. Die Ultraschallschwingungen induzieren Kavitationen,
die in Zellmembranen zu Poren führen, durch die das biologische
oder pharmakologische Material eingeschleust wird. Die Ultraschallschwingungen werden
durch eine schwingende Glasfaser erzeugt, die in einem Katheterrohr
verläuft und am Ende des Katheterrohres vorragt. Bei Beaufschlagung
der Glasfaser mit einer Ultraschallschwingung, die mit einem vom
Katheterrohr getrennten Ultraschallgenerator erzeugt wird, breiten
sich in der Umgebung des vorragenden Endes der Glasfaser die Ultraschallschwingungen
aus.
-
Die
in
DE 101 08 799 A1 beschriebene
Technik hat als ersten Nachteil, dass eine lokale Einwirkung auf
einzelne Zellen oder Zellgruppen praktisch nicht möglich
ist, da die Ultraschallwellen allseitig vom Ende der Glasfaser in
die Umgebung abgestrahlt werden. Ein weiterer Nachteil besteht in
der geringen Effektivität der Ultraschallerzeugung. Ein großer
Teil der Schwingungsenergie geht entlang der Länge der
Glasfaser verloren. Des weiteren kann die Wirksamkeit der Erzeugung
von Ultraschallwellen am biologischen Material von der Position
des Katheterrohrs relativ zum Schwingungsgenerator abhängen.
Der Betrieb der herkömmlichen Vorrichtung ist nachteilig,
da eine Automatisierbarkeit, insbesondere unter sterilen Bedingungen
ausgeschlossen ist. Schließlich ist die Anwendung der Technik
gemäß
DE 101
08 799 A1 auf Transfektionsverfahren beschränkt.
-
Ein
weiterer genereller Nachteil von aus der Praxis bekannten Techniken
zur lokalen Perfusion von Zellen besteht im Auftreten von unerwünschten Totvolumina
in den für die Perfusion verwendeten Einrichtungen. Für
die Perfusion, z. B. zum Behandeln oder Ablösen von Zellen
sind Dosierungen im μl-Bereich erforderlich. Die Dosiergenauigkeit
ist jedoch erheblich eingeschränkt, wenn Totvolumina auftreten,
die ggf. sogar durch Gaspolster gefüllt sind.
-
Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, verbesserte Vorrichtungen
zur Manipulation biologischer Zellen bereitzustellen, mit denen
Nachteile im Stand der Technik überwunden werden können.
Der Erfindung liegt des Weiteren die Aufgabe zugrunde, verbesserte
Verfahren zur Manipulation biologischer Zellen bereitzustellen.
-
Diese
Aufgaben werden mit einer Pipetteneinrichtung, einer Manipulationseinrichtung
und Verfahren mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche
gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen
der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
-
Gemäß einem
ersten Gesichtspunkt basiert die Erfindung auf der allgemeinen technischen
Lehre, eine Pipetteneinrichtung bereitzustellen, die ein Pipettenrohr
und eine Schwingungseinrichtung aufweist, wobei eine Schwingungsquelle
der Schwingungseinrichtung an der Pipetteneinrichtung angebracht
ist und ein Schwingelement der Schwingungseinrichtung im Pipettenrohr,
in einer Pipettenspitze, die am Pipettenrohr vorgesehen ist und/oder
in einem an der Pipettenspitze oder dem Pipettenrohr befestigten
Perfusionsring angeordnet ist. Vorteilhafterweise ist erfindungsgemäß ein
kompakter Aufbau der Schwingungseinrichtung vorgesehen, die zur
Erzeugung von mindestens einer Schwingung, vorzugsweise mindestens
einer Ult raschallschwingung eingerichtet ist. Sowohl die Schwingungsquelle (Schwingungsgeber)
als auch das Schwingelement, das zur Einführung der Schwingung
in eine Umgebung der Pipetteneinrichtung und/oder in die Pipettenspitze
eingerichtet ist, bilden mit dem Pipettenrohr und der Pipettenspitze
oder mit dem Pipettenrohr, der Pipettenspitze und dem Perfusionsring
einen Verbund. Der Verbund zeichnet sich vorteilhafterweise durch
eine vereinfachte Handhabbarkeit aus. In jeder Betriebsposition
der Pipetteneinrichtung sind die Bedingungen der Erzeugung und Übertragung
der Schwingung konstant, so dass sich die Pipetteneinrichtung durch
stabile Schwingungsparameter auszeichnet. Der Weg zwischen der Schwingungsquelle und
dem Ort der Überführung der Schwingung in die Umgebung
ist auf die Dimension der Pipetteneinrichtung beschränkt,
wodurch eine erhöhte Effektivität der Schwingungserzeugung
erzielt wird. Vorteilhafterweise wird des weiteren durch die Positionierung des
Schwingelements im Pipettenrohr oder der Pipettenspitze oder optional
im Perfusionsring eine Lokalisierung der Schwingung auf einen eng
begrenzten Raum erreicht. Die Schwingung wird auf einen Bereich
begrenzt, dessen Dimension dem Durchmesser einer Austrittsöffnung
des Pipettenrohres oder der Pipettenspitze oder dem Durchmesser
des Perfusionsrings entspricht.
-
Ein
weiterer wichtiger Vorteil der erfindungsgemäßen
Kombination einer Pipetteneinrichtung mit einer Schwingungseinrichtung
ergibt sich aus der Möglichkeit, nach der Ablösung
der Zellen von einem Zellträger diese mit der Pipetteneinrichtung
aufzunehmen. Die Pipetteneinrichtung kann vorteilhafterweise sowohl
als Trennwerkzeug als auch als Zellaufnahme zur Überführung
der Zellen für eine weitere Anwendung oder Bearbeitung
verwendet werden.
-
Erfindungsgemäß wird
die Schwingung in einem lokal begrenzten Teilbereich (so genannter Wirkbereich)
der Oberfläche des Zellträgers zugeführt.
Im Wirkbereich sind die Zellen bei Betrieb der Schwingungseinrichtung
den Schwingungen ausgesetzt, während außerhalb
des Wirkbereiches die Zellen von den Schwingungen weniger beeinflusst
oder unbeeinflusst bleiben. Vorteilhafterweise kann damit eine lokale,
gezielte Beeinflussung adhärent wachsender Zellen erreicht
und die Erzeugung von Zell-Arrays verbessert werden. Die Abgrenzung
des Wirkbereiches gegenüber anderen Oberflächenbereichen
des Zellträgers erfolgt mit mindestens einer Komponente
der Pipetteneinrichtung, vorzugsweise mit der Pipettenspitze oder
dem optional vorgesehen Perfusionsring.
-
Gemäß einem
zweiten Gesichtspunkt der Erfindung wird eine Manipulationseinrichtung
bereitgestellt, die zur Manipulation mindestens einer biologischen
Zelle eingerichtet ist und die Pipetteneinrichtung gemäß dem
ersten Gesichtspunkt der Erfindung und eine Positioniereinrichtung
umfasst, mit der die Pipetteneinrichtung in Bezug auf die mindestens
eine biologische Zelle, insbesondere in Bezug auf einen Zellträger
zur Aufnahme der Zelle positionierbar ist. Vorteilhafterweise ermöglicht
die Kombination der Pipetten- und Positioniereinrichtungen eine
genaue und reproduzierbare Einstellung der Position der Pipetteneinrichtung
und damit des Bereichs der Einwirkung der Schwingung auf den Zellträger.
-
Die
mindestens eine zu behandelnde biologische Zelle ist auf einem Zellträger
in einer Konditionierungs- und/oder Kultivierungsflüssigkeit
(im folgenden allgemein als Behandlungsflüssigkeit bezeichnet)
angeordnet. Der Zellträger umfasst eine feste Oberfläche
wie zum Beispiel ein Kultivierungssubstrat oder den Boden eines
Kultivierungsgefäßes. Alternativ kann der Zellträger
ein Teil der Pipetteneinrichtung, insbesondere der Pipettenspitze
sein.
-
Gemäß einem
dritten Gesichtspunkt basiert die Erfindung auf der allgemeinen
technischen Lehre, ein Verfahren zur Manipulation mindestens einer biologischen
Zelle bereitzustellen, die in einer Flüssigkeit auf einem
Zellträger angeordnet ist und unter Wirkung einer Schwingung
behandelt wird, die mit der Pipetteneinrichtung gemäß dem
oben genannten ersten Gesichtspunkt in einem lokal begrenzten Teilbereich
der Flüssigkeit erzeugt wird. Erfindungsgemäß kann
eine Behandlung einer einzelnen Zelle, einer Zelle innerhalb einer
Zellgruppe, einer einzelnen Zellgruppe oder einer Zellgruppe innerhalb
eines größeren Zellverbandes auf dem Zellträger
vorgesehen sein.
-
Vorteilhafterweise
ermöglicht die Erfindung eine gezielte Behandlung von einer
oder mehreren Zellen auf Oberflächen mit Schwingungen,
insbesondere Ultraschall. Mit der Schwingungseinrichtung wird eine
Pipetteneinrichtung mit einem Zusatzwerkzeug ausgestattet, mit dem
die Anwendung herkömmlicher Manipulatoren zur Behandlung
der Zellen mit Schwingungen erheblich erweitert wird.
-
Mit
dem Begriff "Pipetteneinrichtung" (oder: "Pipette") wird hier allgemein
eine Vorrichtung bezeichnet, die zur Aufnahme und/oder Abgabe von Flüssigkeiten
aus oder in offene Flüssigkeitsreservoire eingerichtet
ist. Die Pipetteneinrichtung ermöglicht die Aufnahme, die
zeitweilige Speicherung und die spätere Abgabe einer Flüssigkeit,
die ggf. mindestens eine suspendierte Zelle enthält. Die
Pipetteneinrichtung weist ein Pipettenrohr und eine Flüssigkeitsleitung
(Pipettenspitze) auf, durch die eine fluidische Verbindung mit dem
Flüssigkeitsreservoir gebildet werden kann. Alternativ
kann die Pi petteneinrichtung mehrere Pipettenspitzen aufweisen,
die mit einem gemeinsamen Pipettenrohr verbunden sind. In diesem
Fall ist vorzugsweise in mindestens einer der Pipettenspitzen ein
Schwingelement der Schwingungseinrichtung angeordnet.
-
Mit
dem Begriff "Schwingungseinrichtung" (oder: "Schwingungserzeuger")
wird hier allgemein eine Vorrichtung zur Erzeugung mindestens einer mechanischen
Schwingung bezeichnet. Die Schwingungseinrichtung weist ein Schwingelement
auf, über das die Schwingung in die Umgebung übertragen
wird. Das Schwingelement ist dazu eingerichtet, in einer umgebenden
Flüssigkeit eine mechanische Schwingung anzuregen. Die
mechanische Schwingung kann allgemein eine Schwingung mit einer
Frequenz umfassen, die im Bereich des Infraschalls, Hörschalls
oder Ultraschalls gewählt ist. Vorzugsweise ist das Schwingelement
zur Anregung einer Ultraschallschwingung in der umgebenden Flüssigkeit eingerichtet,
da mit dieser eine besonders hohe Wirksamkeit der Zellbehandlung
erreicht werden kann. Die Ultraschallschwingung weist vorzugsweise
eine Frequenz im Bereich von 1 kHz bis 1 GHz auf. Entsprechend umfasst
die Schwingungseinrichtung vorzugsweise eine Ultraschallquelle.
-
Die
Schwingungseinrichtung ist z. B. eine piezoelektrische Schwingungseinrichtung,
bei welcher die Schwingungsquelle durch einen piezoelektrischen
Körper und das Schwingelement durch einen mit dem piezoelektrischen
Körper verbundenen Schwingungstransmitter gebildet wird.
Der Schwingungstransmitter ist z. B. ein Stift zur Einleitung des Schalls
in eine Flüssigkeit oder ein festes Material).
-
Vorzugsweise
ist das Schwingelement im Bereich der Pipettenspitze positioniert.
Mit der Positionierung des Schwingelements im Bereich der Pipettenspitze
wird eine geometrische Anordnung bezeichnet, bei der das Schwingelement
in einer unmittelbaren Umgebung des Wandmaterials der Pipettenspitze
positioniert ist. Das Schwingelement kann das Wandmaterial der Pipettenspitze
berühren, um die Einkopplung der Schwingungen in das Wandmaterial zu
verbessern. Alternativ kann das Schwingelement mit Abstand von dem
Wandmaterial der Pipettenspitze angeordnet sein, um die Schwingung
bevorzugt in die Flüssigkeit einzukoppeln. Vorteilhafterweise
kann die Schwingung durch die Flüssigkeit und/oder das Wandmaterial
der Pipettenspitze an deren freies Ende und dessen Umgebung zu den
zu behandelnden Zellen geleitet werden. Erfindungsgemäß werden
die Zellen vorzugsweise außerhalb der Pipettenspitze mit
der Schwingung beaufschlagt. Alternativ ermöglicht die
Erfindung, dass die Zellen in der Pipettenspitze mit der Schwingung
beaufschlagt werden.
-
Vorteilhafterweise
bestehen keine Beschränkungen in Bezug auf den Ort der
Befestigung der Schwingungsquelle an der Pipetteneinrichtung. Gemäß bevorzugten
Alternativen ist die Schwingungsquelle am Pipettenrohr oder an der
Pipettenspitze oder an dem optional vorgesehenen Perfusionsring angeordnet.
Besonders bevorzugt ist die Verbindung der Schwingungsquelle mit
dem Pipettenrohr oder dem Perfusionsring, da dies eine optimale
Ausrichtung des Schwingelements, das mit der Schwingungsquelle verbunden
ist, in Bezug auf die Pipettenspitze ermöglicht. Es wird
insbesondere ermöglicht, dass das Schwingelement im Bereich
der Pipettenspitze mit einem Abstand von der Pipettenspitze angeordnet
ist.
-
Wenn
das Schwingelement in der Pipettenspitze angeordnet ist, so ist
das Schwingelement gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung vollständig von der Pipettenspitze aufgenommen.
Das Schwingelement ist angeordnet, ohne in eine axiale Richtung
aus einem freien Ende (Pipettenaustrittsöff nung) der Pipettenspitze
herauszuragen. Durch die Anordnung des Schwingelements im Inneren
der Pipettenspitze können die Schwingungen lokal in die
Behandlungsflüssigkeit und zu den Zellen geleitet werden.
Die Abgrenzung des Wirkbereiches erfolgt durch die Dämpfung
der Schwingungen in der Umgebung der Pipettenspitze, eine Wand der
auf dem Zellträger aufgesetzten Pipettenspitze und/oder
den an der Pipettenspitze angebrachten Perfusionsring. Vorteilhafterweise
wird damit die Lokalisierung der Schwingungswirkung verbessert.
-
Gemäß einer
vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist die Schwingungseinrichtung,
insbesondere die Schwingungsquelle oder das Schwingelement mit einer
Kopplungseinrichtung verbunden, welche die Pipettenspitze mit dem
Pipettenrohr verbindet. Vorteilhafterweise kann damit die Schwingungseinrichtung
so in der Pipetteneinrichtung angeordnet sein, dass die Schwingungsquelle
im Pipettenrohr und das Schwingelement in der Pipettenspitze positioniert
sind. Im Pipettenrohr ist mehr Platz vorhanden, um die Schwingungsquelle,
wie zum Beispiel den piezoelektrischen Kristall, vollständig
aufzunehmen, während mit dem sich in der Pipettenspitze
erstreckenden Schwingelement eine Erzeugung der Schwingung in der
Pipettenspitze nahe von deren Öffnung ermöglicht
wird.
-
Gemäß einer
alternativen, bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
ist die Schwingungseinrichtung mit einer Halteeinrichtung verbunden,
die im Pipettenrohr angeordnet ist. Mit dieser Variante der Erfindung
kann vorteilhafterweise ein Austausch der Pipettenspitze vereinfacht
werden. Die Pipetteneinrichtung kann flexibel für verschiedene
Aufgaben angepasst werden. Ein weiterer Vorteil besteht in der Variabilität
der Gestaltung der Halteeinrichtung, deren Aufbau in Abhängigkeit
von der verwendeten Schwingungsquelle gewählt werden kann.
-
Die
Halteeinrichtung kann vorzugsweise eines der folgenden Teile oder
eine Zusammensetzung aus diesen Teilen umfassen. In einer ersten
Variante umfasst die Halteeinrichtung einen Haltestab, der im Pipettenrohr
befestigt ist und sich in einer axialen Richtung des Pipettenrohres
erstreckt. Die Verwendung des Haltestabes hat den Vorteil, dass
mit diesem die Positionierung der Schwingungsquelle leicht an die
Länge des Pipettenrohres angepasst werden kann. In einer
zweiten Variante umfasst die Halteeinrichtung einen Haltestopfen.
Der Haltestopfen erstreckt sich in radialer Richtung über
den Innenquerschnitt des Pipettenrohres. Vorteilhafterweise kann der
Haltestopfen im Pipettenrohr in der Nähe von dessen distalem
Ende, d. h. in der Nähe der Pipettenspitze positioniert
werden. Dies ermöglicht eine Verringerung des Totvolumens
im Pipettenrohr. In einer dritten Variante kann die Halteeinrichtung
einen Haltering umfassen, dessen Innendurchmesser zur Aufnahme der
Schwingungsquelle eingerichtet ist und dessen Außendurchmesser
dem Innendurchmesser des Pipettenrohres entspricht. Die Kombination
aus Haltering und Schwingungsquelle kann entsprechend einen Haltestopfen
ersetzen. Eine Zusammensetzung der genannten Teile kann zum Beispiel einen
Haltestopfen mit einem zur Pipettenspitze weisenden Haltestab oder
einen Haltestopfen mit einem Haltering oder eine Kombination aus
allen drei Teilen umfassen. Des weiteren können mehrere
der genannten Teile, wie zum Beispiel mehrere Haltestäbe oder
mehrere Halteringe vorgesehen sein.
-
Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist
die Schwingungsquelle schwingungsgedämpft an der Pipetteneinrichtung befestigt.
Ein größerer Anteil der mit der Schwingungsquelle
erzeugten Schwingungen wird von der Schwingungsquelle über
das Schwingelement in die Umgebung der Pipetteneinrichtung geleitet,
während nur ein geringer Bruch teil an das Pipettenrohr übertragen
wird. Vorteilhafterweise kann damit die Effektivität der
Schwingungserzeugung verbessert werden. Es bestehen verschiedene
Varianten, die Schwingungsquelle schwingungsgedämpft an
der Pipetteneinrichtung, insbesondere im Pipettenrohr und/oder am
Perfusionsring befestigen. Hierzu kann beispielsweise ein elastisch
deformierbares Material verwendet werden, das an der Halteeinrichtung,
insbesondere an dem Haltestab, dem Haltestopfen und/oder dem Haltering
vorgesehen ist. Besonders bevorzugt wird die schwingungsgedämpfte
Fixierung der Schwingungsquelle im Pipettenrohr durch einen Haltering
aus elastisch deformierbarem Material, z. B. Gummi bereitgestellt.
-
Wenn
gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
in der Erfindung die Pipetteneinrichtung eine Innenform aufweist,
durch welche die Schwingung vom Schwingelement zu der Pipettenspitze
und deren Öffnung gerichtet wird, kann vorteilhafterweise
die Effektivität der Schwingungserzeugung und die Lokalisierung
der Schwingungswirkung verbessert werden. Die gerichtete Leitung
der Schwingung zu der Pipettenspitze wird vorzugsweise durch eine
sich verjüngende Innenform der Pipettenspitze, des Pipettenrohres
und/oder des optional vorgesehenen Perfusionsrings erreicht. Besonders
bevorzugt ist eine Variante der Erfindung, bei der das Pipettenrohr
einen konischen Ansatz aufweist. Der konische Ansatz umfasst einen
Abschnitt des Pipettenrohrs, in dem sich die Innen- und Außendurchmesser
des Pipettenrohres hin zur Pipettenspitze verringern. Dies ermöglicht
eine vereinfachte Aufnahme der Pipettenspitze auf dem Ende des Pipettenrohres
und die Bereitstellung der sich zur Pipettenspitze hin verjüngenden
Innenform.
-
Vorteilhafterweise
kann die Fokussierung der Schwingung weiter verbessert werden, wenn
gemäß einer weiteren Variante der Erfindung die
Pipetteneinrichtung mit einer Fokussiereinrich tung ausgestattet
ist. Mit der Fokussiereinrichtung ist die Schwingung in der Pipettenspitze
auf deren Öffnung fokussierbar. Die Fokussiereinrichtung
umfasst zum Beispiel mechanische Elemente in der Pipettenspitze,
die zur gerichteten Leitung der Schwingung eingerichtet sind. Alternativ
oder zusätzlich umfasst die Fokussiereinrichtung einen
Oberflächenbereich des Schwingelements. Beispielsweise
kann eine Schallfokussierung mit einer parabolisch oder kugelförmig gebildeten
Oberfläche des Schwingelements erreicht werden.
-
Die
Pipettenspitze der erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung
kann optional mit einem Perfusionsring ausgestattet sein. Mit „Perfusionsring"
wird allgemein ein ringförmiges Bauteil bezeichnet, das die
Pipettenspitze radial umgibt und in Richtung des freien Endes der
Pipettenspitze eine abdichtende Auflagefläche aufweist,
die auf den Zellträger aufsetzbar ist. Mit dem Perfusionsring
wird um die Pipettenspitze ein Behandlungsvolumen geschaffen, auf das
die erfindungsgemäße Schallbehandlung lokal begrenzt
wird. Der Perfusionsring ist vorzugsweise so gebildet, wie der in
DE 197 42 163 A1 beschriebene
Perfusionsring.
DE
197 42 163 A1 wird hinsichtlich des Aufbaus und der Handhabung
des Perfusionsrings durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung
eingeführt.
-
Der
Perfusionsring ermöglicht vorteilhafterweise eine weitere
Abgrenzung der Schwingungswirkung in der Umgebung der Pipettenspitze.
Die Kombination der Pipettenspitze mit dem Perfusionsring ermöglicht
insbesondere, dass die Herstellung von Zellarrays vereinfacht wird,
da mit dem Perfusionsring die lokale Ultraschalleinwirkung verbessert
wird. Die Zellen können mit der erfindungsgemäßen Schallbehandlung
auf einen Zellträger lokal begrenzt Ultraschall-gestützt
transfiziert werden.
-
Vorzugsweise
ist der Perfusionsring an der Pipettenspitze lösbar befestigt.
Erfindungsgemäß kann der Perfusionsring mit der
Pipettenspitze fest verbunden sein. Gemäß einer
bevorzugten Variante der Erfindung ist jedoch eine lösbare
Verbindung, wie z. B. eine Steckverbindung vorgesehen, um den Perfusionsring
bei Bedarf an die Pipettenspitze aufzustecken oder nach der Schallbehandlung
der Zellen von der Pipettenspitze zu trennen. Der Vorteil der Trennbarkeit
des Perfusionsrings von der Pipettenspitze besteht in der Flexibilität
bei der Anpassung der Pipetteneinrichtung an eine konkrete Anwendung.
Vorzugsweise weist der Perfusionsring einen inneren Halterungsbereich
(Spitzenaufnahme) auf, in den die Pipettenspitze kraftschlüssig
einsteckbar ist. Mit der Bereitstellung der Spitzenaufnahme wird
die schnelle Verbindung und Trennung des Perfusionsrings und der
Pipettenspitze vereinfacht.
-
Wenn
die Pipetteneinrichtung mit dem Perfusionsring ausgestattet ist,
kann gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung das Schwingelement außerhalb der Pipettenspitze
im Perfusionsring angeordnet sein. In diesem Fall ergibt sich vorteilhafterweise
ein vergrößerter, jedoch scharf abgegrenzter Bereich
der Schwingungswirkung auf dem Zellträger. Beispielsweise
kann die Schwingungsquelle der Schwingungseinrichtung am Perfusionsring
befestigt sein, so dass das Schwingelement in den freien Innenraum
des Perfusionsrings ragt. Vorzugsweise hat das Schwingelement einen Abstand
sowohl zur Pipettenspitze als auch zum Perfusionsring, so dass die
Schwingung bevorzugt in die Flüssigkeit auf dem Zellträger übertragen
und auf die mindestens eine biologische Zelle auf dem Zellträger zugeführt
wird.
-
Weitere
Vorteile für die Anpassung der Pipetteneinrichtung an konkrete
Anforderungen der Manipulation einer biologischen Zelle werden erzielt, wenn
die Übertragung der Schwingung vom Schwingelement in die
Umgebung durch die Form des freien Endes der Pipettenspitze beeinflusst
wird. Beispielsweise kann die Pipettenaustrittsöffnung
eine seitliche Öffnung, wie z. B. eine Einkerbung aufweisen,
die mehrere Funktionen erfüllen kann. Durch die seitliche Öffnung
können, wenn die Pipettenspitze mit der Pipettenaustrittsöffnung
auf einem Zellträger aufgesetzt ist, Zellen in die Pipettenspitze
aufgenommen und dort der Schwingungswirkung ausgesetzt werden. Des
weiteren kann die Schwingung bevorzugt durch die seitliche Öffnung
in die Umgebung geleitet werden.
-
Gemäß einer
weiteren Variante der Erfindung kann die Pipettenaustrittsöffnung
relativ zur axialen Längsrichtung der Pipettenspitze schräg
gebildet sein. Die Pipettenaustrittsöffnung weist eine Randkante
auf, die in einer Ebene verläuft, die mit der Achse der
Pipettenspitze einen Winkel ungleich 90° bildet. Die schräge
Randkante ermöglicht vorteilhafterweise ein geneigtes Aufsetzen
der Pipetteneinrichtung auf den Zellträger und damit eine
gerichtete Übertragung der Schwingung auf Zellen auf dem Zellträger
und eine vereinfachte Aufnahme von Zellen, die unter der Wirkung
der Schwingung vom Zellträger abgelöst wurden.
Vorzugsweise bildet die schräge Randkante am freien Ende
der Pipettenspitze einen Spitzenbereich, mit dem die Pipettenspitze auf
den Zellträger aufgesetzt werden kann, so dass keine oder
nur wenige Zellen auf dem Zellträger verletzt werden.
-
Gemäß weiteren
bevorzugten Merkmalen ist die erfindungsgemäße
Pipetteneinrichtung mit einer Federeinrichtung und/oder einer Dosiereinrichtung ausgestattet.
Die Federeinrichtung ist vorzugsweise an dem Pipettenrohr angebracht.
Ein Teil der Federeinrichtung ist mit dem Pipettenrohr fest verbunden, während
ein anderes, relativ zum Pipettenrohr elastisch verschiebba res Teil
einen Anschlag für eine Kraftwirkung, wie zum Beispiel
eine manuelle Betätigungskraft oder eine Antriebskraft
der Positioniereinrichtung bildet. Mit der Federeinrichtung ist
eine Aufsetzkraft der Pipetteneinrichtung, insbesondere der Pipettenspitze
und des optional vorgesehenen Perfusionsrings auf dem Zellträger
einstellbar. Die Dosiereinrichtung ist zur Befüllung eines
Innenraums des Pipettenrohres und der Pipettenspitze mit einer Betriebsflüssigkeit
eingerichtet. Vorteilhafterweise kann mit der Dosiereinrichtung
das Volumen der zugeführten Betriebsflüssigkeit
eingestellt werden. Die Betriebsflüssigkeit umfasst vorzugsweise
eine physiologische Salzlösung, eine Flüssigkeit
mit mindestens einem Enzym, insbesondere zum enzymatischen Abbau
adhärent auf dem Zellträger gewachsener Zellen,
und/oder eine Flüssigkeit mit mindestens einem Schallkontrastmittel.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Manipulationseinrichtung ist diese mit einer Kameraeinrichtung ausgestattet.
Die Kameraeinrichtung ist zur Bildaufnahme der Pipetteneinrichtung,
insbesondere der Pipettenspitze und/oder des optional vorgesehenen
Perfusionsringes, und/oder des Zellträgers eingerichtet.
Die Kameraeinrichtung vereinfacht die Einstellung der Pipetteneinrichtung
mit der Positioniereinrichtung. Insbesondere wird ein automatisierter
Betrieb der Manipulationseinrichtung ermöglicht, bei dem
eine Steuereinrichtung in Abhängigkeit von Bildern der
Pipettenspitze, des Perfusionsringes und/oder des Zellträgers
die Positioniereinrichtung ansteuert.
-
Ein
weiterer wichtiger Vorteil der Erfindung besteht in der Variabilität
der möglichen Schwingungsbehandlungen. Die Behandlung der
Zellen umfasst gemäß bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung eine Einführung mindestens einer Wirkkomponente
in die Zellen (Transfektion) und/oder eine Ablösung der Zellen
vom Zellträger oder einer auf dem Zellträger gebildeten
Zellkultur. Mit der Erfindung wird nicht nur ermöglicht,
dass der Ablösevorgang von Zellen von den Oberflächen
beschleunigt wird, sondern dass auch vorbestimmte Anordnungen (insbesondere
Mikroarrays) von spezifisch behandelten, adhärenten Zellen
erzeugt werden.
-
Mit
dem Begriff "Wirkkomponente" wird hier allgemein ein Material (z.
B. Substanz, Substanz-Zusammensetzung oder Gasbläschen)
bezeichnet, das durch eine Zellmembran in die Zelle einführbar
ist und in der Zelle eine vorbestimmte Wirkung für den weiteren
Zustand der Zelle (z. B. den Stoffwechsel oder die Zellteilung)
oder eine Markierung (Nachweisbarkeit) der Zelle hat. Die Einführung
der Wirkkomponente in die Zelle erfolgt vorzugsweise durch eine
vorübergehende, reversible Unterbrechung der Zellmembran
(Poration).
-
Gemäß einer
bevorzugten Variante der Erfindung wird ein Schallkontrastmittel
als Wirkkomponente in die Zellen eingeführt. In diesem
Fall können sich Vorteile für eine Beobachtung
der Zelle mit einem bildgebenden Verfahren unter Verwendung von Ultraschall
ergeben. Ein „Schallkontrastmittel" ist allgemein ein Material,
das im Innern der Zellen in Bezug auf die Zellbestandteile Grenzflächen
bildet, an denen eine Reflektion von Schallwellen erfolgt. Die Transfektion
eines Schallkontrastmittels in die adhärent auf dem Zellträger
angeordneten Zellen hat den Vorteil, dass die mit den Schwingungen
behandelten Zellen bei der weiteren Manipulation mit schallbasierten
Nachweisverfahren beobachtet werden können.
-
Besonders
bevorzugt ist die Einführung eines mit mindestens einer
Wirksubstanz beladenen Schallkontrastmittels, das zusätzlich
zur Kontrastfunktion eine Transportfunktion erfüllt. Wenn
gemäß dieser Variante der Erfindung das Schallkontrast mittel
mindestens eine Wirksubstanz enthält, kann vorteilhafterweise
neben der genannten Markierungsfunktion des Kontrastmittels eine
zweite Wirkung, wie z. B. eine Beeinflussung der Zellbestandteile
oder des Stoffwechsels in der Zelle erreicht werden. Besonders bevorzugt
ist eine Ausführungsform der Erfindung, bei der das Schallkontrastmittel
mit biologischen Makromolekülen, wie z. B. DNS- oder RNS-Molekülen
oder -Bestandteilen, Proteinen, Peptiden etc. beladen wird, mit
denen vorteilhafterweise direkt zellbiologische Vorgänge
in der Zelle beeinflusst werden können.
-
Beispiele
für erfindungsgemäß verwendete Ultraschallkontrastmittel
sind: freie Gasbläschen, Vorläufersubstanzen von
Gasen, von organischen oder anorganischen Substanzen umkapselte
Gasbläschen, Lösungen, kolloidale Lösungen,
Suspensionen, Dispersionen, Ionophoren, gelöste Mikropartikel,
gelöste Polymer-Sphären, gelöste organische und/oder
anorganische Moleküle, zuckerhaltige Lösungen,
Mikropartikel, ferro- oder paramagnetische Metalle, Mikroaggregate,
poröse Partikel von organische und/oder anorganischem Material,
lipidhaltigen Mikrosphären und/oder Emulsionen, wobei die
Gasbläschen vorzugsweise Luft, Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid,
fluoriertes Gas und/oder ein anderes biokompatibles Gas enthalten.
Erfindungsgemäß werden besonders bevorzugt kohlenhydratbasierte, Bläschen
bildende Ultraschallkontrastmittel, wie z. B. Levovist (Handelsbezeichnung)
oder Optison (Handelsbezeichnung, Octafluoropropangas verkapselt
in einer Sphäre aus humanem Albumin) verwendet. Der Gaseinschluss
in diesen Ultraschallkontrastmitteln führt vorteilhafterweise
zu einer verbesserten Kraftübertragung.
-
Erfindungsgemäß können
die in die Zellen eingeführten Partikel als solche eine
zellbiologische Wirkung haben. Besonders bevorzugt ist jedoch eine Ausführungsform
der Erfindung, bei der die Partikel eine Wirksubstanz tragen, wie
z. B. die oben genannten biologischen Makromoleküle. Mindestens
eine Wirksubstanz kann beispielsweise als Schicht auf der Oberfläche
der Nanopartikel gebunden sein, um mit den Nanopartikeln in das
Innere der Zellen zu gelangen.
-
Vorzugsweise
wird die mindestens eine Schwingung in der Flüssigkeit,
welche die biologische Zelle umgibt, mit einer Energie derart erzeugt, dass
in der Flüssigkeit Kavitationen auftreten. Vorteilhafterweise
wird in der Zellmembran mindestens eine Perforation gebildet, die
eine Einführung des Schallkontrastmittels und/oder einer
Wirksubstanz von der Flüssigkeit in die Zelle ermöglicht.
-
Wenn
die erfindungsgemäße Zellbehandlung eine Ablösung
der Zellen vom Zellträger umfasst, wird gemäß einer
weiteren bevorzugten Variante der Erfindung als Behandlungsflüssigkeit
eine physiologische Lösung verwendet, die ein Enzym zur Förderung
der Zellablösung enthält. Das Enzym umfasst vorzugsweise
Trypsin oder ein anderes proteolytisches Enzym, wie z. B. Kollagenase.
Durch den Enzymzusatz wird die Schallwirkung unterstützt,
so dass der Ablösungsvorgang vorteilhafterweise beschleunigt
wird.
-
Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt
die Ablösung der Zellen vom Zellträger berührungslos,
d. h. ausschließlich unter der Einwirkung der auf dem Zellträger
die Zellen überdeckenden Behandlungsflüssigkeit
und ohne Kontakt mit festen Oberflächen von Trennwerkzeugen.
Die abgelöste Zelle ist frei von Berührungen durch
mechanische Werkzeuge. Die Behandlungsflüssigkeit wird
zur Übertragung der Schwingungen auf die Zellen verwendet.
Unter der Wirkung der Schwingungen wird eine Abtrennung der adhärenten Zellkontakte
mit dem Zellträger gefördert. Die Wirkung der
Behandlungsflüssigkeit kann optional gesteigert werden,
indem eine Perfusionsströmung erzeugt wird. Um die Schwingung,
insbesondere den Ultraschall unmittelbar von dem Schwingelement
der Schwingungseinrichtung zu den Zellen zu leiten, ist das Schwingelement
gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung in der Pipetteneinrichtung so angeordnet, dass das
Schwingelement einen Abstand von Wänden der Pipettenspitze aufweist
und von der Behandlungsflüssigkeit in der Pipettenspitze
umgeben ist.
-
Alternativ
können die Schwingungen mit der auf den Zellträger
aufgesetzten Pipettenspitze direkt auf die Zellen geleitet werden.
Die Zellen werden in diesem Fall durch die mechanische Schwingung
der Pipettenspitze vom Zellträger abgezogen.
-
Eine
besonders vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung zeichnet
sich durch die Aufnahme der mindestens einen abgelösten
biologischen Zelle in die Pipetteneinrichtung aus. Am Pipettenrohr und/oder
der Pipettenspitze wird, vorzugsweise mit der Dosiereinrichtung
ein Unterdruck gebildet, durch den Flüssigkeit mit der
abgelösten Zelle durch die Pipettenaustrittsöffnung
in die Pipettenspitze eingesogen wird. Vorteilhafterweise erfüllt
die Pipetteneinrichtung somit eine Doppelfunktion, nämlich
die Funktion der lokal begrenzten Beaufschlagung der biologischen
Zelle mit einer Schwingung und die Funktion der Aufnahme der abgelösten
Zelle für weitere Manipulationen, wie zum Beispiel eine Übertragung
zu einem anderen Zellträger oder eine Perfusion.
-
Weitere
Einzelheiten und Vorteile der Erfindungen werden aus der folgenden
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung
ersichtlich, die in den beigefügten Zeichnungen dargestellt
sind. Es zeigen:
-
1 eine
erste Ausführungsform einer erfindungsgemäßen
Pipetteneinrichtung;
-
2 und 3:
Varianten der Pipettenspitze der Pipetteneinrichtung gemäß 1;
-
4 bis 6:
weitere Ausführungsformen der erfindungsgemäßen
Pipetteneinrichtung; und
-
7:
eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen
Manipulationseinrichtung.
-
1 zeigt
in schematischer Perspektivansicht eine erste Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung 10 mit
der Pipettenspitze 11, dem Pipettenrohr 13 und
der Schwingungseinrichtung 20, die im Inneren der Pipetteneinrichtung 10,
insbesondere in einem inneren Volumen innerhalb der Pipettenspitze 11 und/oder
des Pipettenrohrs 13 angeordnet ist. Die Pipettenspitze 11 ist durch
eine Kopplungseinrichtung 12 mit dem Pipettenrohr 13 verbunden.
Die Komponenten 11, 12 und 13 sind bei
der dargestellten Ausführungsform im wesentlichen so aufgebaut,
wie es von herkömmlichen Flüssigkeitspipetten
bekannt ist.
-
Die
Pipettenspitze 11 hat eine Form, die sich von der Kopplungseinrichtung 12 zum
freien Ende der Pipettenspitze 11 mit der Pipettenaustrittsöffnung 14 verjüngt.
Das Wandmaterial der Pipettenspitze 11 besteht z. B. aus
Kunststoff. Typische Dimensionen der Pipettenspitze 11 umfassen
z. B.: axiale Lange: 5 cm, Durchmesser der Pipettenaustrittsöffnung 14: 0.1
mm bis 2 mm, und Durchmesser an der Kopplungseinrichtung 12:
6 mm. Die Kopplungseinrichtung 12 umfasst ein Verbindungsstück
zur lösbaren Verbindung der Pipettenspitze 11 am
Pipettenrohr 13. Es ist beispielsweise eine Schraubverbindung aus
Kunst stoff vorgesehen. Das Pipettenrohr 13 umfasst beispielsweise
ein Kunststoffrohr oder eine Leitung mit einem Durchmesser im Bereich
von z. B. 1 mm bis 0.3 cm.
-
Die
Schwingungseinrichtung 20 umfasst als Schwingungsquelle 21 einen
Ultraschallschwinger zur Erzeugung von Ultraschall und als Schwingelement 22 einen
Stift oder eine Nadel, der oder die zur Übertragung des
Ultraschalls auf die Flüssigkeit in der Pipettenspitze 11 vorgesehen
ist. Die Schwingungsquelle 21 ist über Verbindungsleitungen 23 elektrisch
mit einer Steuereinrichtung (nicht dargestellt) verbunden. Die Schwingungsquelle 21 umfasst z.
B. einen piezoelektrischen Kristall, der zur Erzeugung von Ultraschallschwingungen
im Bereich von 0.1 bis 3 MHz eingerichtet ist. Das Schwingelement 22 ist
mit der Schwingungsquelle 21 fest verbunden. Die Schwingungseinrichtung 20 ist
an der Kopplungseinrichtung 12 befestigt, so dass der Stift 22 in das
innere Volumen der Pipettenspitze 11 ragt.
-
Das
Schwingelement 22 kann als Fokussiereinrichtung einen parabolischen
oder kugelförmigen Oberflächenbereich 24 aufweisen,
der an der Spitze des Schwingelements 22 eine Hohlform
bildet (siehe vergrößertes Teilbild in 1).
Der hohlförmige Oberflächenbereich 24 ist
vorzugsweise an einer Oberfläche der Spitze oder eines
Zylinders mit einem Durchmesser von mindestens 10 mm gebildet.
-
Eine
bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens
umfasst die folgenden Schritte. Zuerst wird die Pipetteneinrichtung 10 in
der Nähe der zu behandelnden Zellen 1 auf einen
Zellträger 70 aufgesetzt. Die Zellen 1 bilden
auf der Oberfläche des Zellträgers 70 eine
adhärente Zellkultur, die mit einer Flüssigkeit
(z. B. Behandlungs- und/oder Kultivierungsflüssigkeit,
nicht dargestellt) überdeckt ist.
-
Bei
der in 1 dargestellten Variante der Erfindung wird die
Pipetteneinrichtung 10 so angeordnet, dass die Pipettenaustrittsöffnung 14 mit
einem Abstand von der Oberfläche des Zellträgers 70 positioniert
ist. Der Abstand wird beispielsweise im Bereich von 50 μm
bis 1 mm gewählt. In diesem Zustand ist die Pipettenspitze 11 in
die Flüssigkeit auf dem Zellträger 70 eingetaucht.
-
Anschließend
wird die Pipetteneinrichtung 10 betätigt, um die
Flüssigkeit in die Pipettenspitze 11 einzusaugen.
Hierzu wird am Pipettenrohr 13 ein Unterdruck gebildet,
wie es von herkömmlichen Pipetten bekannt ist. Das Volumen
der eingesaugten Flüssigkeit wird so gewählt,
dass das Schwingelement 22 der Schwingungseinrichtung 20 mit
der Flüssigkeit zumindest teilweise bedeckt ist. Vorzugsweise
wird die Pipettenspitze 11 nicht vollständig gefüllt,
sondern ein Abstand der Oberfläche 2 der Flüssigkeit von
der Kopplungseinrichtung 12 gebildet. Dadurch kann vorteilhafterweise
die bevorzugte Einleitung des Ultraschalls in die Flüssigkeit
und die gezielte Übertragung des Ultraschalls zu den Zellen 1 verbessert
werden.
-
Die
Positionierung und Betätigung der Pipetteneinrichtung
10 erfolgt
mit einer Steuereinrichtung (nicht dargestellt), wie sie beispielsweise
in
DE 197 42 163 als
ein Manipulator beschrieben ist.
DE 197 42 163 A1 wird hinsichtlich des Aufbaus
und der Handhabung des Manipulators durch Bezugnahme in die vorliegende
Beschreibung eingeführt.
-
Bei
Betätigung der Schwingungseinrichtung 20 werden
Ultraschallwellen 4 durch die Flüssigkeit innerhalb
der Pipettenspitze 11 durch die Pipettenaustrittsöffnung 14 zu
den Zellen 1 geleitet und auf deren Oberfläche
und deren Grenze zum Zellträger 70 übertragen.
Durch die mit der Pipettenspitze 11 auf einen Teilbereich
der Flüssigkeit und des Zellträgers 70 begrenzte
Beaufschlagung mit den Ultraschallwellen werden lokal Kontaktstellen
zwischen den Zellen und der Oberfläche des Zellträgers 70 gelöst,
so dass sich Zellen als abgelöste Zellen 3 in
der Flüssigkeitsschicht über dem Zellträger 40 frei
bewegen können. Im weiteren Verfahren können die
abgelösten Zellen 3 mit der Pipetteneinrichtung 10 aufgesaugt
werden.
-
Um
die Aufnahme der Zellen in die Pipettenspitze 11 zu erleichtern
oder die Lokalisierung des Ultraschalls auf einen bestimmten geometrischen
Bereich zu verbessern, kann die Pipettenaustrittsöffnung 14 gemäß den 2 und 3 gestaltet
sein. Gemäß 2 ist eine
seitliche Öffnung 15 vorgesehen, durch die bei
Erzeugung eines Unterdrucks in der Pipetteneinrichtung 10 die
Flüssigkeit in die Pipettenspitze 11 eingesaugt
wird. Die Flüssigkeitszufuhr wird durch die Öffnung 15 ermöglicht,
ohne dass die Pipettenspitze 11 von der Oberfläche
des Zellträgers 70 abgehoben werden muss. Gemäß 3 weist
die Pipettenaustrittsöffnung 14 einen Umfangsrand 16 auf,
der gegenüber der axialen Ausdehnung der Pipettenspitze 11 geneigt
ist. Der Umfangsrand 16 bildet einen Spitzenbereich, der
alternativ als unmittelbar auf die Zellen einwirkendes mechanisches Ultraschall-Werkzeug
verwendet werden kann.
-
4 zeigt
eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Pipetteneinrichtung 10 mit der Pipettenspitze 11 und
dem Pipettenrohr 13. Das Pipettenrohr 13 weist
an seinem Ende einen konischen Ansatz 17 auf, auf dem die
Pipettenspitze 11 aufsteckbar ist. Die Pipettenspitze 11 kann
im aufgesteckten Zustand mit dem Ansatz 17 eine Klemmpassung
bilden. Zur Bildung der Klemmpassung weisen der Ansatz 17 und
die Pipettenspitze 11 entsprechend gleiche äußere
und innere Konuswinkel und mindestens eines der Teile eine elastische
Deformierbar keit auf. Alternativ oder zusätzlich kann die Pipettenspitze 11 mit
einer Kopplungseinrichtung (siehe 1) auf dem
Pipettenrohr 13 festgeschraubt sein. In 4 sind
die Pipettenspitze 11 und das Pipettenrohr 13 im
getrennten Zustand gezeigt. Zur Verbindung beider Teile wird die
Pipettenspitze 11 auf das Pipettenrohr 13 aufgeschoben
(siehe Pfeil).
-
Die
Schwingungseinrichtung 20 mit der Schwingungsquelle 21 und
dem Schwingelement 22 ist mit einer Halteeinrichtung 30 so
in der Pipetteneinrichtung 10 angeordnet, dass ein Teil
des Schwingelements 22 in die Pipettenspitze 11 ragt.
Die Halteeinrichtung 30 umfasst einen Haltestab 31 und
einen Haltestopfen 32. Der Haltestopfen 32 sitzt
im Pipettenrohr 13, wobei eine Form- oder Presspassung
gebildet ist. Der Haltestab 31, an dem die Schwingungsquelle 21 fixiert
ist, steckt auf der zur Pipettenspitze 11 weisenden Seite
des Haltestopfens 32. Der Haltestab 31 besteht
zum Beispiel aus einem Kunststoff oder einem anderen schwingungsdämpfenden
Material, wie zum Beispiel Silikongummi, insbesondere gehärteter
Silikongummi.
-
Vorteilhafterweise
kann der Haltestopfen 32 eine Mehrfachfunktion erfüllen.
Neben der Haltefunktion für die Schwingungseinrichtung 20 wird
das Pipettenrohr 13 an seinem rückseitigen Ende
mit dem Haltestopfen 32 dicht verschlossen. Des weiteren kann
der Haltestopfen 32 zur Schwingungsdämpfung eingerichtet
sein, so dass die Schwingungsübertragung von der Schwingungseinrichtung
auf das Pipettenrohr 13 vermindert wird und bevorzugt zu
der Flüssigkeit in der Pipettenspitze 11 erfolgt.
Für die Abdichtungs- und Schwingungsdämpfungsfunktionen
besteht der Haltestopfen 32 vorzugsweise aus einem elastisch
deformierbaren Material, zum Beispiel aus Schaumstoff oder Silikongummi.
-
Da
das Pipettenrohr 13 durch die Halteeinrichtung 30 rückseitig
verschlossen ist, erfordert die in 4 gezeigte
Ausführungsform der Pipetteneinrichtung 10 eine
weitere Komponente zur Flüssigkeitszufuhr im inneren Volumen
der Pipetteneinrichtung 10. Für diese Funktion
ist die Pipetteneinrichtung 10 vorzugsweise mit einer Dosiereinrichtung 50 ausgestattet,
die einen Spritzenkolben mit einem Flüssigkeitsreservoir
umfasst. Die Dosiereinrichtung 50 ist seitlich am Pipettenrohr 13 angebracht
und dazu eingerichtet, bei Betätigung des Spritzenkolbens
Flüssigkeit in das Pipettenrohr 13 und die Pipettenspitze 11 zuzuführen
oder im inneren Volumen der Pipetteneinrichtung 10 einen
Unterdruck zu bilden. Aus Übersichtlichkeitsgründen
ist die Dosiereinrichtung 50 schematisch verkleinert dargestellt.
In der Praxis weist der Spritzenkolben der Dosiereinrichtung 50 ein
Volumen von zum Beispiel 0,5 ml auf. Die Dosiereinrichtung 50 kann
manuell oder durch eine Antriebseinrichtung (nicht dargestellt)
betätigt werden. Die Dosiereinrichtung 50 kann
insbesondere bei Betrieb der erfindungsgemäßen
Manipulationseinrichtung (siehe 7) automatisiert
betätigt werden.
-
Die
Integration der Halteeinrichtung 30 in das Pipettenrohr 13 hat
den weiteren Vorteil, dass das Totvolumen im Innenvolumen der Pipetteneinrichtung 10 verkleinert
werden kann. Mit der Dosiereinrichtung 50 können
kleinste Flüssigkeitsvolumina mit hoher Genauigkeit und
Reproduzierbarkeit auf die zu behandelnden Zellen übertragen
werden.
-
Gemäß einer
weiteren Alternative kann die Halteeinrichtung 30 im Pipettenrohr 13 verstellbar angeordnet
sein. Beispielsweise kann der Haltestopfen 32 über
eine Schraubverbindung mit dem Pipettenrohr 13 verbunden
sein. Vorteilhafterweise kann dadurch die Position des Schwingelements 22 verändert
werden. Es kann insbesondere eine Eintauchtiefe des Schwingelements 22 in
eine Flüssigkeit in der Pipettenspitze variiert und das
Totvolumen in der Pipetteneinrichtung minimiert werden.
-
Die 5A und 5B zeigen
eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Pipetteneinrichtung 10, die sich vorteilhafterweise durch
ein weiter verringertes Totvolumen auszeichnet. Die Pipetteneinrichtung 10 umfasst
die Pipettenspitze 11 und das Pipettenrohr 13,
die über den konischen Ansatz 17 eine Steck- oder
Schraubverbindung bilden. Die Schwingungseinrichtung 20 mit
der Schwingungsquelle 21 und dem Schwingelement 22 ist
im zusammengesetzten Zustand der Pipetteneinrichtung 10 in der
Pipettenspitze 11 angeordnet. Das Schwingelement 22 umfasst
eine spitz auslaufende Nadel, z. B. aus Edelstahl.
-
Die
Halteeinrichtung 30 zur Positionierung der Schwingungseinrichtung 20 umfasst
einen Haltestopfen 32, der sich im Pipettenrohr 13 bis
in den konischen Ansatz 17 erstreckt. Der Haltestopfen 32 wird
im Pipettenrohr 13 durch zwei Halteringe 33 fixiert.
Die Halteringe 33 dienen der Abdichtung des Pipettenrohres 13 und
der Schwingungsdämpfung. Im Haltestopfen 32 sind
mehrere Kanäle 34, 35 enthalten, wie
schematisch in der Längsansicht der 5A und
der Querschnittsansicht der 5B gezeigt
ist. Die Kanäle umfassen die axial verlaufenden Kanäle 34,
die zur Aufnahme der Verbindungsleitungen 23 der Schwingungsquelle 21 eingerichtet
und zur Rückseite des Pipettenrohrs 13 mit Dichtungen 36 verschlossen
sind. Die Dichtungen 36 umfassen zum Beispiel Klebstoff,
mit dem das Innere der Kanäle 34 flüssigkeitsdicht
von der Umgebung getrennt wird. Des weiteren umfassen die Kanäle
einen radialen Kanal 35, der für eine Verteilung
von Flüssigkeit von der Dosiereinrichtung 50 in
die Pipettenspitze 11 oder zur Bildung eines Luftpolsters
eingerichtet ist.
-
Der
Haltestopfen 32 weist mindestens eine seitliche Ausnehmung 37 (siehe 5B) auf, mit der vorteilhafterweise der
mechanische Kontakt des Haltestopfens 32 mit dem Pipettenrohr 13 minimiert
wird. Entsprechend kann die Schwingungsübertragung zum
Pipettenrohr 13 minimiert werden.
-
Eine
weitere Abwandlung der erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung 10 ist
in 6 gezeigt. Die Pipetteneinrichtung 10,
die entsprechend der Ausführungsform mit 4 aufgebaut
ist, umfasst zusätzlich eine Federeinrichtung 60,
mit der eine Aufsetzkraft einstellbar ist, mit der die Pipetteneinrichtung 10 auf
dem Zellträger 70 aufsetzbar ist. Die Federeinrichtung 60 umfasst
einen Führungsstab 61, der mit der Rückseite
des Haltestopfens 32 verbunden ist und zur Führung
einer Vortriebsplatte 62 eingerichtet ist. Die Vortriebsplatte 62 wird über
eine Spiralfeder 63 von dem Haltestopfen 32 getragen. Bei
Ausübung einer Vortriebskraft auf die Vortriebsplatte 62 wird
die Vortriebskraft teilweise von der Spiralfeder 63 aufgenommen,
so dass die Kraft, mit der die Pipetteneinrichtung 10 auf
dem Zellträger 70 aufgesetzt wird, entsprechend
verringert wird. Vorteilhafterweise wird damit eine Beschädigung
der Pipettenaustrittsöffnung der Pipettenspitze 11 oder
des optional vorgesehenen Perfusionsringes vermieden.
-
Bei
der in
6 gezeigten Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Pipetteneinrichtung
10 ist zusätzlich auf der
Pipettenspitze
11 ein Perfusionsring
40 angeordnet
ist. Der Perfusionsring
40 umfasst eine Ringwand
41 mit
einem inneren Halterungsbereich
42, der über Stege
43 mit
der Ringwand
41 verbunden ist. Der Perfusionsring
40 besteht
z. B. aus Kunststoff. Die Pipettenspitze
11 ist in den
Halterungsbereich
42 eingesteckt, wie es in
DE 197 42 163 A1 beschrieben
ist.
-
Optional
kann bei der Ausführungsform gemäß 6 die
Schwingungseinrichtung 20' derart angeordnet sein, dass
das Schwingelement 22' außerhalb der Pipettenspitze 11 im
Perfusionsring 40 angeordnet ist (gestrichelt gezeigt).
Hierzu wird die Schwingungseinrichtung 20' am Perfusionsring 40 befestigt
oder mit einer zusätzlichen Stelleinrichtung (nicht dargestellt)
als separates, von den übrigen Teilen der Pipetteneinrichtung 10 getrenntes
Bauteil in den Perfusionsring 40 eingeführt. Gemäß einer
weiteren Variante (nicht dargestellt) kann die Schwingungseinrichtung
derart angeordnet sein, dass das Schwingelement in direktem mechanischen
Kontakt mit der Wand der Pipettenspitze 11 steht.
-
7 illustriert
eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Manipulationseinrichtung 100, welche die Pipetteneinrichtung 10,
die Positioniereinrichtung 200 und optional die Kameraeinrichtung 300 umfasst.
Die in 7 beispielhaft in Verbindung mit der Manipulationseinrichtung 100 gezeigte
Pipetteneinrichtung 10 umfasst die Pipettenspitze 11 und
das Pipettenrohr 13, das im Bereich des konischen Ansatzes 17 kompakt
gebildet ist und eine axiale Durchgangsöffnung 18 zur Aufnahme
des Schwingelements 22 und eine radiale Durchgangsöffnung 19 zur
Zuführung von Flüssigkeit von der Dosiereinrichtung 50 aufweist.
Durch den kompakten Aufbau des Pipettenrohrs 13 im Bereich des
konischen Ansatzes 17 wird vorteilhafterweise das Totvolumen
weiter vermindert. Die Schwingungseinrichtung 20 umfasst
die Schwingungsquelle 21, die mit Halteringen 33 im
Pipettenrohr 13 angebracht ist. Von der Schwingungsquelle 21 ragt
das stiftförmige Schwingelement 22 durch die axiale
Durchgangsöffnung 19 bis in die Pipettenspitze 11.
Die Schwingungsübertragung auf das Pipettenrohr 13 wird durch
ein Dämpfungselement, z. B. die Halteringe 33, die
insbesondere aus Gummi bestehen, eingeschränkt.
-
Die
Pipetteneinrichtung 10 gemäß 7 umfasst
zum Beispiel die folgenden Maße: axiale Länge
a der Pipettenspitze 11: 35 bis 40 mm, Abstand b der Spitze
des Schwingelements 22 von der Pipettenaustrittsöffnung 16:
25 bis 30 mm, und Abstand c der Pipettenaustrittsöffnung 16 vom
Zellträger 70 (Betriebsposition zur Manipulation
biologischer Zellen): 0,5 bis 1 mm.
-
Die
Positioniereinrichtung 200 umfasst einen Träger,
mit dem die Pipetteneinrichtung 10 relativ zum Zellkulturträger 70 verstellbar
ist. Des weiteren kann die Positioniereinrichtung 200 einen
Vortrieb für die Dosiereinrichtung 50 enthalten.
Die Komponenten 200, 300 und 50 können
mit einer gemeinsamen Steuereinrichtung (nicht dargestellt) gesteuert
werden.
-
Die
in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen
offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln
als auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung
in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- - DE 19742163 [0004, 0005, 0005, 0062]
- - DE 10108799 A1 [0007, 0008, 0008]
- - DE 19742163 A1 [0031, 0031, 0062, 0075]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Chiosis et
al. in "Trends in Biotechnology", Bd. 23, 2005, S. 271 [0006]