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WO2005109006A1 - 非アルコール性脂肪肝炎鑑別方法 - Google Patents

非アルコール性脂肪肝炎鑑別方法 Download PDF

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WO2005109006A1
WO2005109006A1 PCT/JP2005/007806 JP2005007806W WO2005109006A1 WO 2005109006 A1 WO2005109006 A1 WO 2005109006A1 JP 2005007806 W JP2005007806 W JP 2005007806W WO 2005109006 A1 WO2005109006 A1 WO 2005109006A1
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WO
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peripheral blood
phosphatidylcholine
normal value
alcoholic steatohepatitis
fatty acids
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Fumihiko Takatsuki
Takato Ueno
Michio Sata
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Ajinomoto Co Inc
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Ajinomoto Co Inc
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
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    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
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    • Y10T436/203332—Hydroxyl containing
    • Y10T436/204165—Ethanol

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying non-alcoholic steatohepatitis using phospholipids and the fatty acid composition of phospholipids as an index, a method for searching for a therapeutic agent for non-alcoholic steatohepatitis using phospholipids and their fatty acid compositions as an index, and non-alcoholic steatohepatitis.
  • the present invention relates to a drug for treating alcoholic steatohepatitis.
  • Non-Patent Document 1 Non-alcoholic steatohepatitis
  • This disease excludes viral and autoimmune liver diseases, and is characterized by changes in liver histology similar to alcoholic liver disease, but it can be used to reduce liver damage from normal fatty liver to liver damage. It is the cause of fibrosis and its cause.
  • Previous reports have suggested the involvement of leptin, a cytokinin such as TNF- ⁇ , lipid peroxides, and free fatty acids.
  • leptin a cytokinin
  • lipid peroxides lipid peroxides
  • free fatty acids free lipid acids
  • insulin resistance which is the background of NASH
  • insulin resistance which is the background of NASH
  • the onset of fatty liver involve an increase in free fatty acids, that specific lipids have cytotoxicity, that T cells receptors in the immune system, It has been reported to be a ligand for G protein-coupled receptors (GPCRs).
  • GPCRs G protein-coupled receptors
  • Non-patent document 2 First, in the case of hyperinsulinemia or the like, modulation of triacylglcyeride metabolism occurs to produce fatty liver ( Ist hit), but when any 2nd hit is added to the state, an inflammatory response is induced, and mitochondria are induced. It is thought that reduced function, cell degeneration and fibrosis occur. However, 2 nd hit Nitsu In addition, oxidative stress, direct toxicity of fatty acids, and endotoxin have been proposed as candidates, but the substance is unknown.
  • Non-Patent Document 3 In the case of high insulin and obesity, which are background factors of NASH, younsi M et al.'S analysis report on membrane lipid components and the viewpoint of rheological change and morphological change of erythrocytes is known (Non-Patent Document 3). However, although changes in fatty acid composition in NASH cases have been reported, there is no comparative analysis of fatty acid composition for each complex lipid, which is a functional unit of lipid, and information that can lead to a search method for NASH's therapeutic agent can be obtained. Was difficult.
  • Non-Patent Document 1 Gastroenterology 121; 710-723
  • Non-Patent Document 2 Gastroenterology 114: 842-845
  • Non-Patent Document 3 Metabolism 51: 1261-1268
  • Non-Patent Document ⁇ Am J Gastroenterol.; 94 (9): 2467-74. (1999)
  • An object of the present invention is to provide a method for evaluating a NASH therapeutic drug utilizing lipids and lipid composition fluctuations which specifically appear in NASH patients, a method for distinguishing NASH using peripheral blood, and the creation of a therapeutic drug. .
  • Non-Patent Document 4 histologically NASH.Two blood samples were taken on an empty stomach in two patients and four healthy subjects. The fractionation of various lipids and their fatty acid components in the plasma, which were fractionated into plasma and blood cells, was measured, and phosphatidylserine / phosphatidylinositol, phosphatidylinositol and phosphatidylinositol in the blood cells were more remarkable in NASH patients than in healthy subjects. A decrease in the amount of fatidylcholine was found.
  • the present invention provides a method for distinguishing NASH using peripheral blood, a method for evaluating a therapeutic agent for NASH, and a therapeutic agent for NASH.
  • the present invention is a method for identifying non-alcoholic steatohepatitis, which comprises measuring the phospholipids in peripheral blood and / or the fatty acid composition thereof.
  • the amounts of phosphatidylserine / phosphatidylinositol and phosphatidylcholine in peripheral blood are measured, and at least one of the respective values is lower than the normal value!
  • Non-alcoholic steatohepatitis also relates to a method for identifying peripheral blood as a blood cell component in the present invention.
  • the present invention provides a force 22: 5n3, 22: 6n3, 20: 3n3 in cardiolipin in peripheral blood cells, which is determined by an increase as compared with a normal value of any one of 16:00, 18: ln9 and 20: 3n3 fatty acids.
  • This is a method for differentiating non-alcoholic steatohepatitis using the decrease of 4n6 fatty acid compared to the normal value of any one as an index.
  • the present invention also relates to phosphatidylcholine in peripheral blood cells at 16:00, 18: ln9,
  • the present invention provides a method for measuring the power of at least one of fatty acid at 16:00, 18: ln9, and 20: 3n3 in plasma diacylglyceride as an index based on the increase thereof, as compared to the normal value of at least one of 20: 5n3, 22:22. : 6n3, 20: 4n6 fatty acid, is a method for differentiating non-alcoholic steatohepatitis using its decrease compared to one normal value as an index. It should be noted that at least one of the above discrimination methods may be combined with another discrimination method.
  • the invention also provides a combination of thin-layer chromatography, gas chromatography, and mass spectroscopy (! //) to obtain normal values of phosphatidylserine / phosphatidylinositol or phosphatidylcholine from patient peripheral blood samples. Or higher caloric content of the polyunsaturated fatty acid composition of cardiolipin, phosphatidylcholine, and diacylglyceride compared to the normal value of the fatty acid composition at 16:00, 18: ln9, 20: 3n3, or 22 : 5n3, 20: 5n3, 22: 6n3, 20: 4n6
  • This is a non-alcoholic steatohepatitis diagnostic laboratory test device that detects a decrease compared to normal values.
  • the present invention relates to a method of administering a test drug in vivo to peripheral blood cells and plasma phosphatidylserine / phosphatidylinositol, phosphatidylcholine amounts, and cardiolipin at 16:00, 18: ln9 and 20: Fatty acid composition of 3n3, 22: 5n3, 22: 6n3, 20: 4n6, phosphatidylcholine at 16:00, 18: ln9, 20: 3n3, 22: 5n3, 22: 6n3, 20: 4n6, di: Selects one that recovers at least one of the abnormal values of 16.0, 18: ln9, 20: 3n3, 20: 5n3, 22: 6n3, and 20: 4n6 of glycylglyceride to the normal value.
  • an enzyme involved in the acylation exchange reaction of the complex lipid is preferable to use the activity of an enzyme involved in the acylation exchange reaction of the complex lipid as an index. It is also preferable to use the activity of an enzyme involved in the transacylation reaction of cardiolipin, phosphatidylcholine, and diacylglyceride as an index.
  • the present invention also provides a non-alcoholic fat containing, as an active ingredient, any of hormones, ecologically-derived low-molecular-weight proteins, existing low-molecular-weight drugs, and low-molecular-weight compounds that have been determined to be positive using the above-described search method. Hepatitis treatment drug.
  • the present invention relates to peripheral blood cells, plasma phosphatidylserine / phosphatidylinositol, phosphatidylcholine amount, and cardiolipin 16:00, 18: ln9, 20: 3n3, 22: 5n3, 22: 6n3, 20: 4n6 fatty acid and phosphatidylcholine
  • a therapeutic drug for non-alcoholic steatohepatitis containing as an active ingredient a compound having a function of restoring at least one of the abnormal values of 4n6 to a normal value.
  • the peripheral blood phospholipid used in the identification method and the like of the present invention includes phosphatidylserine ( Phosphatidylserine), phosphatidylinositol (Phosphatidylinositol), phosphatidinolecholine (Phosphatidylcholine), lysophosphatidylinoline (
  • Phosphatidylethanolamine Phosphatidylethanolamine
  • sphingomyeline Sphingomyeline
  • canoleisolipine Cardiolipin
  • Phosphatidylserine / Inositol that is, a mixed system
  • phosphatidylcholine that is, a mixed system
  • cardiolipin phosphatidylcholine
  • Examples of the fatty acid in the peripheral blood phospholipid used in the identification method and the like of the present invention include various peripheral saturated and unsaturated fatty acids (fatty acid residues are considered as fatty acids) that constitute the phospholipid.
  • the method of measuring these fatty acids may be used in the present invention if the method of measurement has already been established, but also includes the methods of which measurement methods will be established in the future.
  • Fatty acids of interest include, for example, 16:00, 18: ln9, 20: 3n3, 22: 5n3, 22: 6n3, 20: 4n6 fatty acids of cardiolipin, 16:00, 18: ln9, 20 of phosphatidylcholine.
  • the phospholipids and / or fatty acids in these phospholipids or fatty acids in peripheral blood are measured and compared with the value (normal value) of a healthy person (Normal). Alternatively, discrimination can be made by evaluating the change.
  • phosphatidylserine and phosphatidylinositol which are phospholipids of peripheral blood (Phosphatidylserine / Inositol), and phosphatidylcholine are used as indices
  • phosphatidylserine and phosphatidylinositol which are phospholipids of peripheral blood (Phosphatidylserine / Inositol)
  • phosphatidylcholine which are phospholipids of peripheral blood (Phosphatidylserine / Inositol)
  • phosphatidylcholine phospholipids of peripheral blood
  • cardiolipin a phospholipid in peripheral blood cells
  • a phospholipid in peripheral blood cells is used as an index, when 16:00, 18: ln9 and 20: 3n3 fatty acids in cardiolipin are measured and any value increases compared to the normal value Or 22: 5n3, 22: 6n3, 20: 4n6 fatty acids in cardiolipin If the value is lower than the normal value, it can be identified as a NASH patient.
  • phosphatidylcholine which is a phospholipid in peripheral blood cells
  • 16:00, 18: ln9 and 20: 3n3 fatty acids in phosphatidylcholine are measured, and either value is normal.
  • 22: 5n3, 22: 6n3, and 20: 4n6 fatty acids in phosphatidylcholine are measured, and any value is lower than the normal value.
  • diacylglyceride which is a phospholipid in peripheral blood cells
  • 16:00, 18: ln9, and 20: 3n3 fatty acids in diacylglyceride are measured, and any value is compared to the normal value. If the value increases, or if 20: 5n3, 22: 6n3, and 20: 4n6 fatty acids in diacylglyceride are measured and any of the values is lower than the normal value, the patient can be identified as a NASH patient.
  • the non-alcoholic steatohepatitis diagnostic clinical test device combines the above-mentioned identification method with one of the well-known thin layer chromatography, gas chromatography, and mass spectrometry to obtain the peripheral blood sample strength of the patient. Or normal blood data in which the amount of phosphatidylserine / phosphatidylinositol or phosphatidylcholine in blood cell components was reduced from the normal value, and the amount of cardiolipin, phosphatidylcholine, and diacylglyceride was increased. It is an automated device that measures fluctuations in polyunsaturated fatty acid composition (lipid composition) and can perform these analyzes on a computer program. The above device can be manufactured by combining known techniques.
  • the method for searching for a therapeutic agent for NASH of the present invention can be achieved by selecting the above-mentioned compound that changes the phospholipid or fatty acid composition by screening by the above-mentioned identification method.
  • a change in the above-mentioned index may be observed in a mammalian cell culture system to search for a substance that restores at least one of the abnormal values to a normal value.
  • examples include cardiolipin, phosphatidylcholine, and diacylglyceride. It is possible to search using the activity of the enzyme involved in the exchange reaction as an index.
  • search methods include in vivo administration of peripheral blood cells and plasma phosphatidylserine / phosphatidylinositol, phosphatidylcholine levels, and cardiolipin at 16:00, 18: ln9, 20: 3n3, and 22: 5n3.
  • the target compound can be obtained by screening a compound having a function of restoring at least one or more abnormal values of 4n6 to a normal value.
  • mammalian (human or rat is preferred) hepatocytes are cultured in a 24-well plate by a general method, various drugs are added and cultured for 24 hours, and after the culture is completed, phosphatidylserine / phosphatidyl in the cell membrane is obtained.
  • Select the target compound (drug) based on the amount of inositol and phosphatidylcholine, and 22: 5n3, 22: 6n3, and 20: 4n6 of phosphatidylserine / phosphatidylinositol, phosphatidylcholine, and cardiolipin. It is possible.
  • delta-5 desaturylase delta-6 desaturase
  • elongase oxidase
  • acyltransferase as indices.
  • delta-5 desaturase delta-6 desaturase
  • elongase saccharose
  • lecithin cholesterol acyltransferase
  • lecithin retinol acyltransferase sn-glycerol ⁇ ⁇ phosphate acyltransferase
  • NASH therapeutic drugs obtained by these search methods include, for example, hormones, ecologically-derived low-molecular proteins, existing low-molecular drugs, and low-molecular compounds.
  • These therapeutic agents for NASH can be administered in appropriate combinations of doses, administration methods, dosage forms, etc., depending on the disease state.
  • the dosage form can be appropriately determined by combining known techniques.
  • these drugs can be used to treat other NASH drugs, such as ursodexico-lic acid, betaine, metformin, glitazone, fibrates, vitamins, antioxidants, anti-inflammatory drugs, antidiabetic drugs, and hyperlipidemia. It can be used in combination with drugs, anti-obesity drugs, etc. Although there is no specific dosage, it contains lug to 100g as an active ingredient. You should give it in the form of the drug you have!
  • the present invention provides a method for identifying a NASH patient, an identification device, a method for evaluating a NASH therapeutic agent, and a therapeutic agent for NASH.
  • Plasma and RBC lipids were extracted by the Folch method. Each lipid was first developed by thin-layer chromatography. Each lipid SPOT was recovered and treated with 3N methanolic Z-hydrochloric acid at 100 ° C for 45 minutes under nitrogen gas filling. The liberated fatty acid methyl ester was extracted under nitrogen gas using 0.05% butylated hydroxytoluene-containing hexane. Fatty acid methyl esters were separated by gas chromatography and quantified with a Flame-ionization detector based on each fatty acid methyl ester sample.
  • the identification method and the identification device of the present invention enable NASH patients to be identified, and the NASH therapeutic drug search method of the present invention enables the search for NASH therapeutic agents, which is useful.

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Abstract

　末梢血のリン脂質とその脂肪酸組成を測定する。特に末梢血中のフォスファチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリン量並びに脂肪酸組成を測定する。これにより、NASH患者に有用なNASH治療薬の評価方法、NASHの鑑別方法並びにその治療薬剤を提供することができる。

Description

非アルコール性脂肪肝炎鑑別方法 技術分野
[0001] 本発明はリン脂質、リン脂質の脂肪酸組成を指標にした非アルコール性脂肪肝炎 の鑑別法、リン脂質とその脂肪酸組成を指標にした非アルコール性脂肪肝炎治療薬 の探索方法、並びに非アルコール性脂肪肝炎の治療薬に関する。
[0002] (発明の背景）
食生活等、ライフスタイルの変化は肥満、糖尿病、高脂血症といった生活習慣病を 増加させている。これら生活習慣病とその予備軍では脂肪肝が認められ、その頻度 は約 20%と想定されている。これまで、非アルコール性の脂肪肝は予後が良好な疾 患とされてきたが、近年、 2— 3%の頻度で肝実質への脂肪沈着とともに炎症性細胞 の浸潤 肝実質の障害、線維化を介して肝硬変に至る非アルコール性脂肪肝炎（ non-alcoholic steatohepatitis：以下 NASHと言う）の存在が明らかになつてきた（非特 許文献 1)。本疾患はウィルス性、自己免疫性の肝疾患を除外したものであり、アルコ 一ル性肝疾患と類似の肝組織学的変化をとることを特徴にするが、通常の脂肪肝か ら肝障害、線維化に進展する力その原因であり問題視されている。これまでの報告か らレプチン、 TNF- αと言ったサイト力イン、過酸化脂質、遊離脂肪酸の関与が示唆さ れている。一方で、近年、 NASHの背景にあるインスリン抵抗性、脂肪肝の発症には 遊離脂肪酸増加が関与していること、特定の脂質が、細胞傷害性を持つこと、免疫 系の T細胞受容体や G蛋白質共役型受容体 (GPCR)のリガンドになることが報告され ている。さらにミトコンドリアに多量に存在する脂質カルジォリピンの脂肪酸組成変化 が電子伝達系の分子のエネルギー交換効率に影響を与えて 、ることが知られて 、る 。特定の脂肪酸、複合脂質の脂肪酸組成変化は肝実質細胞障害の増加、炎症反応 の惹起、ミトコンドリア機能の低下を介して NASHの原因となる可能性が高い。 NASH は 2つのステップを経て発症すると想定されている（2hit theory)。（非特許文献 2)ま ず、高インスリン血症等で triacylglcyeride代謝に変調が生じて脂肪肝が発生する（Ist hit)がその状態に何らかの 2nd hitが加わることにより炎症反応の惹起、ミトコンドリ ァ機能の低下、細胞の変性、線維化が生じると考えられている。しかし、 2nd hitにつ いては酸化ストレス、脂肪酸の直接毒性、エンドトキシンが候補として挙げられている がその本体は不明である。
なお、 NASHの背景因子である高インスリン、肥満では、赤血球のレオロジ一変化や 形態変化の視点力も膜脂質成分に関する Younsi Mらの解析報告が知られている (非 特許文献 3)。しかし、 NASH症例での脂肪酸組成の変化については報告があるが、 脂質の機能単位である複合脂質毎の脂肪酸組成の比較解析は皆無であり、 NASH の治療薬の探索手法につながる情報を得ることは困難であった。
[0003] 現在、 NASHと脂肪肝の間の確定診断は肝生検であり、負担、リスクが高くルーチン には実施できない。早期に、 NASHを診断し運動療法、栄養療法を開始するために 末梢血等を用いた簡便な NASH鑑別方法が切望されて ヽる。 NASH患者の末梢血で 特異的に変動する脂質 脂質脂肪酸組成が発見できれば簡便な検査法として広く 適用可能である。
[0004] 非特許文献 1 : Gastroenterology 121;710-723
非特許文献 2： Gastroenterology 114： 842-845
非特許文献 3： Metabolism 51:1261-1268
非特許文献 ^Am J Gastroenterol.;94(9):2467- 74. (1999)
発明の開示
[0005] 本発明の課題は NASH患者において特異的に出現する脂質、脂質の組成変動を 利用した、 NASH治療薬の評価方法と末梢血を利用した NASHの鑑別方法と治療薬 剤の創出である。
NASHの原因は不明であり動物モデルが存在しないことから、本発明者は組織学的 に NASHと判断できた (非特許文献 4)患者 2例と健常人 4例で空腹時に採血を実施し 、血漿と血球に分画し血漿中の各種脂質並びにその脂肪酸糸且成の変動を測定した ところ、 NASH患者では健常人に比べて顕著な血球中のフォスファチジルセリン /フォ スファチジルイノシトール、フォスファチジルコリン量の低下を見出した。さらに NASH 患者では血球カルジォリピン中の脂肪酸における 16:00,18:ln9、 20:3n3の比率増加 、 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6の比率減少が認められた。また同様の傾向が血球フォスフ ァチジルコリンと血漿中ジァシルグリセライドでも観察され、この知見に基づいて本発 明を完成するに到った。すなわち、本発明は末梢血を利用した NASHの鑑別方法、 NASH治療薬の評価方法並びに NASH治療薬剤を提供する。
[0006] 本発明は、末梢血のリン脂質及び/又はその脂肪酸組成を測定することを特徴とす る非アルコール性脂肪肝炎の鑑別方法である。この発明において末梢血中のフォス ファチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリン量を測定し、 それぞれの 、ずれか少なくとも一つの値力 正常値より低!、場合を非アルコール性 脂肪肝炎とする鑑別方法、またこの発明にお ヽて末梢血が血球成分である鑑別方法 である。
また本発明は、末梢血血球中のカルジォリピンにおける 16:00、 18:ln9、 20:3n3脂肪 酸いずれか一つの正常値に比べた増加を指標とする力 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6脂 肪酸のいずれか一つの正常値に比べたその低下を指標とする非アルコール性脂肪 肝炎鑑別方法である。
[0007] また本発明は、末梢血血球中のフォスファチジルコリンにおける 16:00、 18:ln9、
20:3n3脂肪酸いずれか一つの正常値に比べた増加を指標とするか、 22:5n3、 22:6n3 、 20:4n6脂肪酸 、ずれか一つの正常値に比べてのその低下を指標とする非アルコ ール性脂肪肝炎鑑別方法である。
また本発明は、血漿中のジァシルグリセライドにおける 16:00、 18:ln9、 20:3n3脂肪 酸いずれか少なくとも一つの正常値に比べてのその増加を指標とする力、 20:5n3、 22:6n3、 20:4n6脂肪酸 、ずれか一つの正常値に比べてのその低下を指標とする非 アルコール性脂肪肝炎鑑別方法である。なお、上記鑑別方法の少なくとも 1つ以上を 他の鑑別方法と組み合わせること特徴とすることもできる。
また発明は、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、マススペクトルグラフィ 一の!/、ずれかを組み合わせ、患者末梢血サンプルからフォスファチジルセリン/フォ スファチジルイノシトールもしくはフォスファチジルコリン量の正常値よりの低下、又は カルジォリピン、フォスファチジルコリン、ジァシルグリセライドの多価不飽和脂肪酸組 成の 16:00,18:ln9、 20:3n3の脂肪酸組成の正常値に比較した増カロ、もしくは 22:5n3、 20:5n3、 22:6n3、 20:4n6の正常値に比較した低下を検出する非アルコール性脂肪肝 炎診断臨床検査装置である。 [0008] また本発明は、被験薬を生体内投与により末梢血血球、血漿のフォスファチジルセ リン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリン量、カルジォリピンの 16:00 、 18:ln9、 20:3n3、 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6の脂肪酸組成、フォスファチジルコリンの 16:00、 18:ln9、 20:3n3、 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6の脂肪酸組成、ジァシルグリセライド の 16:00、 18:ln9、 20:3n3、 20:5n3、 22:6n3、 20:4n6の異常値の少なくとも 1つ以上を 正常値に回復させるものを選択することを特徴とする治療薬剤 (好ましくは非アルコ ール性脂肪肝炎治療薬剤)の探索方法である。 ンの合成と分解に関与する酵素の活性を指標にするのが好ましい。また、哺乳類細 コリンの合成と分解に関与する酵素の変化を指標とするのが好ましい。また、哺乳類 細胞培養系でフォスファチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジ ルコリンの合成と分解に関与する酵素の遺伝子発現変化を指標とするのが好ましい 。また、複合脂質のァシル化交換反応に関わる酵素の活性を指標とするのが好まし い。又、カルジォリピン、フォスファチジルコリン、ジァシルグリセライドのァシル化交換 反応に関わる酵素の活性を指標とするのが好ましい。
[0009] また本発明は、上記探索方法を用いて陽性と判断された、ホルモン、生態由来低 分子蛋白、既存低分子薬剤、低分子化合物のいずれかの化合物を有効成分とする 非アルコール性脂肪肝炎治療薬剤である。
また本発明は、生体内投与により末梢血血球、血漿のフォスファチジルセリン/フォ スファチジルイノシトール、フォスファチジルコリン量、カルジォリピンの 16:00,18:ln9、 20:3n3、 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6の脂肪酸糸且成、フォスファチジルコリンの
16:00, 18: ln9、 203n3、 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6の脂肪酸組成、ジァシルグリセライドの 16:00,18:ln9、 20:3n3、 20:5n3、 22:6n3、 20:4n6の異常値の少なくとも 1つ以上を正常 値に回復させる機能を有する化合物を有効成分とする非アルコール性脂肪肝炎治 療薬剤である。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明の鑑別方法等に用いる末梢血のリン脂質とは、フォスファチジルセリン（ Phosphatidylserine)、フォスファチジルイノシトール（Phosphatidylinositol)、フォスファ チジノレコリン（Phosphatidylcholine)、リゾフォスファチジノレコリン（
Lysophosphatidylcholine)、フォスファチジルエタノールアミン（
Phosphatidylethanolamine)、スフインゴミエリン (Sphingomyeline)、カノレジオリピン（ Cardiolipin)等の公知のものであり、現時点では測定方法が確立されたものをもつぱ ら本発明において用いるが、今後測定法方が確立されるものも含まれる。好ましいも
Phosphatidylserine/Inositol ;つまり混合系）、フォスファチジルコリン、カルジォリピン があげられる。上記のようにこれら末梢血のリン脂質の測定は、既に確立されたもの を用いることができる。
[0011] 本発明の鑑別方法等に用いる末梢血のリン脂質における脂肪酸としては、リン脂質 を構成する末梢種々の飽和、不飽和の脂肪酸 (脂肪酸残基を脂肪酸として考える） が上げられる。また、これら脂肪酸の測定法も既に測定方法が確立されたものをもつ ばら本発明において用いるが、今後測定法方が確立されるものも含まれる。対象とす る脂肪酸としては例えばカルジォリピンの 16:00、 18: ln9、 20:3n3、 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6の脂肪酸、フォスファチジルコリンの 16:00、 18:ln9、 20:3n3、 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6の脂肪酸、ジァシルグリセライドの 16:00、 18:ln9、 20:3n3、 20:5n3、 22:6n3、 20:4n6の脂肪酸が上げられる。
[0012] 本発明の鑑別方法においては、上記リン脂質、及びもしくはこれらリン脂質における 脂肪酸または末梢血中の脂肪酸を測定し、健常人 (Normal)の値 (正常値)との比較 をするか、もしくは変化を評価することで鑑別する事ができる。
例えば、末梢血のリン脂質であるフォスファチジルセリンとフォスファチジルイノシト ールの併せたもの（Phosphatidylserine/Inositol)及びフォスファチジルコリンを指標と した場合、正常値より低い場合が NASH患者と鑑定できる。この場合、全血を用いる より血球成分を用いる事が好ま 、。
また、末梢血血球中のリン脂質であるカルジォリピンを指標とした場合、カルジオリ ピン中の 16:00, 18:ln9、 20:3n3脂肪酸を測定しいずれかの値が正常値に比べた増加 した場合、もしくはカルジォリピン中の 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6脂肪酸を測定しいずれ かの値が正常値に比べて低下したに NASH患者と鑑定できる。
また、末梢血血球中のリン脂質であるフォスファチジルコリンを指標とした場合、フォ スファチジルコリン中の 16:00,18:ln9、 20:3n3脂肪酸を測定しいずれかの値が正常値 に比べた増加した場合、もしくはフォスファチジルコリン中の 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6 脂肪酸を測定しいずれかの値が正常値に比べて低下したに NASH患者と鑑定でき る。
また、末梢血血球中のリン脂質であるジァシルグリセリドを指標とした場合、ジァシ ルグリセリド中の 16:00、 18:ln9、 20:3n3脂肪酸を測定しいずれかの値が正常値に比 ベた増加した場合、もしくはジァシルグリセリド中の 20:5n3、 22:6n3、 20:4n6脂肪酸を 測定しいずれかの値が正常値に比べて低下したに NASH患者と鑑定できる。
なお本発明にお 、て 、ずれかの鑑定方法を適宜組み合わせても構わな 、。
非アルコール性脂肪肝炎診断臨床検査装置は、上記の鑑定方法と公知の薄層ク 口マトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、マススペクトルグラフィ一のいずれかを組み 合わせ、患者末梢血サンプル力 得られた全血、又は血球成分におけるフォスファ チジルセリン/フォスファチジルイノシトールもしくはフォスファチジルコリン量の正常値 よりの低下をあら力じめ得た健常人データーと比較したり、カルジォリピン、フォスファ チジルコリン、ジァシルグリセライドの多価不飽和脂肪酸組成 (脂質組成)の変動を測 定し、これらの解析をコンピュータープログラム上で実施できる自動化した装置である 。上記装置は公知の技術を組み合わせる事により製造できる。
また本発明の NASH治療薬剤の探索方法は、上記鑑別方法により上記のリン脂質 もしくは脂肪酸組成を変化する化合物をスクリーニングにより選別する事により達成 する事ができる。例えば哺乳類細胞培養系で上記指標の変化を観察し、異常値の 少なくとも 1つ以上を正常値に回復させるものを探索すればよいが、例としてカルジォ リピン、フォスファチジルコリン、ジァシルグリセライドのァシルイ匕交換反応に関わる酵 素の活性を指標として探索する事ができる。
この他の探索方法としては生体内投与により末梢血血球、血漿のフォスファチジル セリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリン量、カルジォリピンの 16:00,18:ln9、 20:3n3、 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6の脂肪酸組成、フォスファチジルコリ ンの 16:00, 18:ln9、 203n3、 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6の脂肪酸組成、ジァシルグリセラ イドの 16:00, 18:ln9、 20:3n3、 20:5n3、 22:6n3、 20:4n6の異常値の少なくとも 1つ以上 を正常値に回復させる機能の化合物をスクリーニングする事により目的の化合物を得 る事がでさる。
具体的には、哺乳類 (人もしくはラットが望ま 、)肝実質細胞を一般的な手法で 24 穴プレートで培養し各種薬物を添加し 24時間培養し、培養終了後細胞膜のフォスフ ァチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリン量、さらにフォス ファチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリン、カルジオリピ ンの 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6を指標に目的の化合物 (薬物）を選択することが可能で ある。
上記において同様の培養系で、培養終了後、肝実質細胞力 RNAを抽出し、 delta-5デサチユラーゼ、 delta-6デサチユラーゼ、 ェロンガーゼ、 ォキシダーゼ、 ァシル基転移酵素の発現量を指標に薬物をスクリーニングすることが可能である。具 体的には RT-PCRの一般的手法を用いて delta-5デサチユラーゼ、 delta-6デサチュ フーセ、 エロン ーセ、 才ゃシターセ、 lecithin:cholesterol acyltransferase、 lecithin retinol acyltransferase、 sn— glycerol ύ~ phosphate acyltransferase、
1—acyl—sn— glycerol— 3— phosphate acyltransferase^ phosphocholine
cytidylyltransferase, phoshplipase Al、 A2などの遺伝子発現の変動を指標にするこ とがでさる。
これらの探索方法により得られる NASH治療薬剤は例えばホルモン、生態由来低 分子蛋白、既存低分子薬剤、低分子化合物が上げられる。
これらの NASH治療薬剤は病状に応じて適宜、用量、投与方法、剤形等を組み合 わせて投与する事ができる。ここで剤形にっ 、ては公知技術を組み合わせて適宜決 める事ができる。
またこれらの薬剤を他の NASHに治療効果がある薬剤、たとえばウルソデォキシコ 一リックァシヅド、ベタイン、メトホルミン、グリタゾン、フイブレート類、ビタミン類、抗酸 ィ匕剤、抗炎症剤、抗糖尿病薬、高脂血症薬、抗肥満薬などと組み合わせて使うこと が可能である。投与量として特に定めはないが、有効成分として lugから 100gを含 有した薬剤の形態で与えれば良!、。
本発明は、 NASH患者の鑑別方法、鑑別装置、 NASH治療薬の評価方法並び NASHの治療薬剤を提供する。
実施例
[0015] 実施例 1 NASHの脂質 '脂肪酸解析方法
健常人 4例と Brunt E.M.らの報告 (非特許文献 4)に基づき肝生検により NASHと確 定診断した患者 2例を対象とした。空腹時に EDTA入り試験管を用いて腕静脈から 5πύ採血した。試験管をよく攪拌後、赤血球 (RBC)数を測定した。その後遠心分離（ 3000rpm、室温、 5分)し、血漿を回収した。血漿は解析まで 80°Cに凍結し保存した 。チューブに残った RBCの pelletは生理食塩水（EDTA入り）にてよく洗浄し、 RBC1 xlO9個分をは力りとり遠心分離（3000rpm、室温、 5分）を行い RBCの pelletを得た。 RBCは解析まで 80°Cに凍結し保存した。血漿、 RBCの脂質は Folchの方法にて抽 出した。各脂質はまず薄層クロマトグラフィーにて展開した。脂質の SPOTをそれぞれ 回収し 3Nのメタノール Z塩酸で窒素ガス封入下、 100°Cで 45分処理した。遊離した 脂肪酸メチルエステルは 0. 05%の butylated hydroxytoluene含有へキサンを用いて 窒素ガス下で抽出した。脂肪酸メチルエステルはガスクロマトグラフィーで分離し Flame-ionization detectorで各脂肪酸メチルエステル標品をもとに定量した。
結果を表 1及び表 2に示す。表から明らかなように NASH患者では血球中のフォスフ ァチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルコリン量の低下が認 められた。 NASH患者では血球中カルジォリピンの 16:00、 18:ln9、 20:3n3の増加、 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6の減少が認められた。同様の傾向が赤血球フォスファチジル コリンと血漿中ジァシルグリセライドでも観察されたことからこれらの指標を元に NAS H患者の鑑別が可能となった。
[0016] [表 1] 脂《組成変動 formal 1 Normal 2 Normal 3 Normal 4 NASH 1 NASH 2 赤血球 (nM/g)
Phosp atidylserine/lnos'rtol 1131.2 1181.4 1342.6 988.2 564.0 515.7
Phosphattdylethanolamine 565.8 418.2 355.5 357.2 396.5 2B4.3
Phosphatidylcholine 1251.3 1646.0 1446.9 2300.5 938.2 555.6
Lysophosphatidylcholine 113.4 105.2 93.4 115.6 103.6 73.8
Cardiolipin 467.9 256.6 235.5 273.0 240.4 241.3 血 ¾ (nM/g)
Phosphatidylserine/lnositol
Phosphattdylethanolamine 378.3 237.6 370.1 341.5 333.7 199.3
Phosphatidylcholine 1319.5 1313.0 1666.7 1164.3 1059.8 1318.6
Lysophosphatidylcholine 210.2 186.3 209.6 196.0 166.7 182.6
Cardiolipin
Triacylglcyeride I 388.2 319.5 668.5 573.8 970.9 1319.2 [表 2]
Figure imgf000010_0001
本発明の鑑別方法、鑑別装置により、 NASH患者の鑑別が可能となり、また本発 明の NASH治療薬の探索方法により、 NASH治療薬の探索が可能となり有用であ る。

Claims

請求の範囲
[I] 末梢血のリン脂質若しくはリン脂質の脂肪酸組成を測定することを特徴とする非ァ ルコール性脂肪肝炎の鑑別方法。
[2] 末梢血中のフォスファチジルセリン/フォスファチジルイノシトール、フォスファチジル コリン量を測定し、それぞれのいずれか少なくとも一つの値が、正常値より低い場合 を非アルコール性脂肪肝炎とする請求項第 i項記載の鑑別方法。
[3] 末梢血が血球成分である請求項第 2項記載の鑑別方法。
[4] 末梢血血球中のカルジォリピンにおける 16:00、 18:ln9、 20:3n3脂肪酸のいずれか 少なくとも一つの正常値に比べてその増加を指標とした非アルコール性脂肪肝炎鑑 別方法。
[5] 末梢血血球中のカルジォリピンにおける 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6脂肪酸のいずれか 少なくとも一つの正常値に比べてその低下を指標とした非アルコール性脂肪肝炎鑑 別方法。
[6] 末梢血血球中のフォスファチジルコリンにおける 16:00、 18:ln9、 20:3n3脂肪酸のい ずれ力少なくとも一つの正常値に比べての増加を指標とした非アルコール性脂肪肝 炎鑑別方法。
[7] 末梢血血球中のフォスファチジルコリンにおける 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6脂肪酸の いずれか少なくとも一つの正常値に比べてのその低下を指標とした非アルコール性 脂肪肝炎鑑別方法。
[8] 血漿中ジァシルグリセライドにおける 16:00、 18:ln9、 20:3n3脂肪酸のいずれか少な くとも一つの正常値に比べてのその増加を指標とした非アルコール性脂肪肝炎鑑別 方法。
[9] 血漿中ジァシルグリセライドにおける 20:5n3、 22:6n3、 20:4n6脂肪酸のいずれか一 つの正常値に比べてのその低下を指標とした非アルコール性脂肪肝炎の鑑別方法
[10] 請求項 4乃至 9のいずれか 1項記載の鑑別方法の少なくとも 1つ以上を他の鑑別方 法と組み合わせること特徴とする非アルコール性脂肪肝炎の鑑別方法。
[I I] 薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、マススペクトルグラフィ一の!、ずれ かを組み合わせ、患者末梢血サンプルからフォスファチジルセリン/フォスファチジル イノシトールもしくはフォスファチジルコリン量の正常値よりの低下、又はカルジオリピ ン、フォスファチジルコリン、ジァシルグリセライドの多価不飽和脂肪酸組成の
16:00, 18: 1η9、 20:3n3の脂肪酸組成の正常値に比較した増カロ、もしくは 22:5n3、 20:5n3、 22:6n3、 20:4n6の正常値に比較した低下を検出する非アルコール性脂肪肝 炎診断臨床検査装置。
[12] 被験薬を生体内投与により末梢血血球、血漿のフォスファチジルセリン/フォスファ チジルイノシトール、フォスファチジルコリン量、カルジォリピンの 16:00、 18:ln9、 20:3n3、 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6の脂肪酸組成、フォスファチジルコリンの 16:00、 18:ln9、 20:3n3、 22:5n3、 22:6n3、 20:4n6の脂肪酸組成、ジァシルグリセライドの 16:00 、 18:ln9、 203n3、 20:5n3、 22:6n3、 20:4n6の異常値の少なくとも 1つ以上を正常値に 回復させるものを選択することを特徴とする治療薬剤の探索方法。
[13] 請求項 12記載の探索方法を用いて陽性と判断された、ホルモン、生態由来低分子 蛋白、既存低分子薬剤、低分子化合物のいずれかの化合物を有効成分とする非ァ ルコール性脂肪肝炎治療薬剤。
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