WO2005094890A1

WO2005094890A1 - 身長増加用組成物

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Publication number: WO2005094890A1
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Inventors: Kazuwa Nakao; Akihiro Yasoda; Hidetomo Kitamura
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Filing date: 2005-03-31
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Abstract

本発明は、低身長症患者又は低身長症患者以外の個体において身長を増加させるための組成物を提供する。具体的には、本発明は、グアニルシクラーゼB（GC-B）活性化物質を有効成分として含む、FGFR3異常を有しない個体に投与する身長増加用組成物、GC-Bを活性化することによって、FGFR3異常を有しない個体の身長を増加するための方法、GC-Bの活性を指標として身長増加剤を選択することを含む身長増加剤のスクリーニング方法、並びにGC-Bを活性化することによりFGFR3異常を有しない軟骨性骨を伸長させる方法を提供する。

Description

身長増加用組成物

技術分野

本発明は、グァ -ルシクラーゼ B (GC-B) を活性化する物質を有効成分として含む身長増加用組成物に関する。具体的には、本発明の組成物は、 FGFR3 異常を有しない、低身長症患者に対する治療用途又は低身長症患者以外の個体での伸長明

用途に使用しうる。

糸

本発明はまた、 GC - Bを活性化することによる身長増加方法に関する。

本発明はさらに、 GC - Bの洁性を指標とした書身長増加剤のスクリ一二ング方法に関する。本発明はさらに GC-Bを活性化することにより FGFR3異常を有しない軟骨性骨を伸長させる方法に関する。発明の背景

医学的な低身長症とは、「同性、同年齢の身長の平均値より- 2SD (SD :標準偏差）以下」と定義され、この基準に該当する場合に低身長症として診断されている。そして低身長症には、成長ホルモンやインシュリン様成長因子- 1 (IGF- 1)分泌不全などに伴う内分泌性低身長症と、家族性低身長、胎内発育不全性低身長、染色体異常などの非内分泌性低身長症、さらに薬物治療や放射線療法による二次性低身長症に大別される。

従来、低身長症の治療として成長ホルモンの投与や、股関節の人工関節置換や脚延長術などの整形外科手術が行われてきた。脚延長術は、 10歳以降に骨を切つて特殊な機械（脚延長器）により、半年くらいかけて徐々に身長を伸ばすが、この手術は患者に大きな苦痛を与える。また成長ホルモン療法は幼児期からの定期的な成長ホルモン注射により身長の伸びは改善するが、注射を止めると伸ぴは止まってしまう。これらのいずれの治療法も病気を治すものではなく、患者の Q0L の観点からも理想的ではないと考えられている（American Journal of Medi cal

Genetics 1997； 72： 71-76) ； European Journal of Endocrinology 1998； 138： 275- 280 (非特許文献 2) )。低身長症のうち内分泌性低身長症は遺伝子組み替え成長ホルモンや IGF- 1などの薬剤での治療が可能な疾患であるが、非内分泌性低身長症である家族性低身長症、胎内発育不全性低身長症の原因は明らかではなく、成長ホルモンは非内分泌性低身長症には効果が認められていないことから、有効な治療薬は存在しなかった（メルクマニュアル第 17版 1999年日経 B P社 Z日経 B P出版センター）。これらの状況から新しい機序に基づく治療薬の開発が望まれてきた。

グァニノレシクラーゼ (GC) は、 GTP からセカンドメッセンジャーである c GMP の合成を触媒する酵素フアミリーに属する膜蛋白質であり、 GC-A， GC-B, ·· ·, GC- F が知られている。 GC - Bは主に血管内皮細胞に見出され、平滑筋の弛緩に関与すると考えられている。

ナトリゥム利尿ぺプチド（NP)類は、 ANP (心房性ナトリゥムぺプチド）、 BNP (脳性ナトリウム利尿べプチド）および CNP (C型ナトリウム利尿ぺプチド）の 3種類からなり、 2種類のグァニリルシクラーゼ共役受容体（ANPおよび BNPに対する NPR - A、 CNPに対する NPR - B) を介して細胞内 cGMP濃度を上昇させ、さらに複数の c GMP エフェクター分子の仲介によって細胞内シグナル伝達が行われると考えられている（Ann Rev Biochem 1991 ; 60： 229-255)。 NP類は、体液の恒常性の制御や血圧の調節に重要な役割を果たすと報告されているが（J Cl in Invest 1987 ; 93 : 1911-1921, J Cl in Invest 1994； 87： 1402-1412)、心臓血管系以外の様々な組織での発現とその生理活性も知られている（Endocrinol 1991； 129： 1104 - 1106, Ann Rev Biochem 1991；60： 553-575)。軟骨に関しては、 BNP (Pro Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998 ; 95 : 2337-2342) または CNPの関節部位における過剰発現が、繊維芽細胞増殖因子レセプター 3 (FGFR3) 遺伝子の変異に起因する軟骨無形成症の治療に有効であることが報告されている（Nat Med 2004 ; 10 (1)： 80 - 86 ；特開 2003- 113116公報）。

' 本発明の目的は、 FGFR3 異常を有しない、低身長症患者又は低身長症患者以外の個体において治療又は美容等のために身長を増加させるための組成物を提供することである。

本発明の別の目的は、 GC- Bを活性化することにより、 FGFR3異常を有しない、低身長症患者又は低身長症患者以外の個体の身長を増加させる方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、 GC - Bの活性を指標として身長増加剤をスクリー二ングする方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は GC-Bを活性化することにより FGFR3異常を有しない軟骨性骨を伸長させる方法に関することである。発明の概要

本発明者らは、グァ -ルシクラーゼ B (GC-B) 活性化物質の 1種である C型ナトリゥム利尿性ぺプチド（CNP) が全身で発現し、血中濃度が上昇する CNP トランスジエニックマウスを作製し、身長への影響および成長軟骨への影響を検証した結果、 CNP トランスジエニックマウスでは、身長増加が促進されていることおよぴ大腿骨成長軟骨が有意に肥厚していること、また、これらの CNP トランスジェニックマウスの性状解析から、 FGFR3異常を有しない場合において CNPが血行性に作用することで身長増加が促進されることを見出した。

したがって、本発明は、下記の発明からなる。

本発明は、第 1の態様において、 GC- Bを活性化する物質を有効成分として含む、 FGFR3異常を有しない個体に投与する身長増加用組成物を提供する。

本発明の一の実施態様において、上記組成物が FGFR3異常を有しない低身長症患者に使用される。

本発明の別の実施態様において、上記組成物が FGFR3異常を有しない低身長症患者以外の個体に使用される。

本発明の別の実施態様において、上記身長増加が軟骨性骨の伸長である。

本発明の別の実施態様において、上記身長増加が大腿骨、脛骨、橈骨及び/又は尺骨の伸長である。

本発明の別の実施態様において、上記物質がぺプチドである。

本発明の別の実施態様において、上記べプチドが CNP又はその誘導体である。本発明の別の実施態様において、上記 CNPが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP-22及び CNP - 53から選択される。本発明の別の実施態様において、上記 CNPが配列番号 1の CNP- 22又は配列番号 2の CNP-53である。

本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のァミノ酸配列において 1〜数個のァミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである。

本発明は、第 2の態様において、 GC-Bを活性化することによって、 FGFR3異常を有しない個体の身長を増加することを特徴とする、身長増加方法を提供する。本発明の一の実施態様において、上記身長增加が軟骨性骨の伸長である。本発明の別の実施態様において、上記身長増加が大腿骨、脛骨、橈骨及び/又は尺骨の伸長である。

本発明の別の実施態様において、上記 GC- Bが、 CNP又はその誘導体によって活性化される。

本発明の別の実施態様において、上記 CNPが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP- 22又は CNP- 53である。

本発明の別の実施態様において、上記 CNP 、配列番号 1の CNP-22又は配列番号 2の CNP- 53である。

本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のァミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである。

本発明は、第 3の態様において、 GC-Bの活性を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリ一二ングすることを含む、身長増加剤のスクリーニング方法を提供する。

本発明の一の実施態様において、上記 GC- Bの活性が、細胞内 c GMP産生量として測定される。

本発明の別の実施態様において、上記方法が、ヒト GC - Bを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を被験物質の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細 ^内 c GMP の産生量を測定し、該被験物質の存在下と非存在化での細胞内 c GMP産生量の差を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーユングすることを含む。本発明はさらに、 GC-Bを活性化することにより FGFR3異常を有しない軟骨性骨を伸長させる方法を提'供する。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2004-107871号の明細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、 CNP トランスジエニックマウス作製用ベクターの構築を示す。図 1A： pGEM-T Easyベクターに組み込まれたマウス CNPの cDNAを Pstlで切り出し両末端を平滑化した。図 1 B： pSGl を Eco RIで処理して断端を平滑化した。図 1 C：図 1 Aで得られたマウス CNPの cDNAを図 1 Bで得られた pSGlに組み込んだ。図 2は、ィンジェクション用 DNAフラグメントを示す。図 1 Cの p SG卜 CNPから、 Hindlllおよび Xholで処理した後、 CNP遺伝子を含む断片（約 2. 3kb)を切り出し、ィンジェクション用のフラグメントとした。

図 3は、 CNP トランスジヱニックマウスの遺伝子型解析結果を示す。野生型マウス（WT) では 3本のシグナル（野生型 CNP遺伝子）が検出され、トランスジェニックマウス（Tgm) では野生型 CNP遺伝子に加えて、導入遺伝子由来のシグナル (トランスジーン) が 2本検出された

図 4は、 CNP トランスジヱニックマウスの成長曲線の推移を示す。雌の CNP トランスジニックマウス（TG)は、 2週齢以降継続して正常同腹仔（WT) に対して有意に鼻肛長が長かった（図 4A)。雄では、 4週齢以降継続して正常同腹仔（WT) に対して有意に鼻肛長が長かった（図 4B)。 * : pく 0. 05， ** : pく 0. 01 vs. WT, 対応のなレヽ Student t検定。

図 5は、 CNP トランスジヱニックマウスの大腿骨成長軟骨の肥厚を示す。 CNP トランスジヱニックマウス（ CNP tgm ) は、休止層（Resting)、増殖層 (Prol iferating)、肥大層（Hypertrophy) およびこれらの合計（Total) のすベてについて正常同腹仔（Wi ld) に対して有意に厚かった。 * : pく 0. 05， **： p<0. 01 vs. 野生型，対応のない Student t検定。発明の詳細な説明図面を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明する。

本発明者らが後述の実施例 2に記載のように作製した CNP-トランスジェニックマウス（CNPTgm) についてサザンブロット法を用いて遺伝子型解析を行ったところ、図 3に示されるように、野生型マウスでは 3本のシグナル（野生型 CNP遺伝子）が検出され、 CNPTgmでは野生型 CNP遺伝子に加えて、導入遺伝子由来の 2 本のシグナル（トランスジーン）が検出された。 CNPTgmでの CNPの発現を検討するため、導入した遺伝子の高発現が予想される臓器である肝臓および血漿での CNP の濃度を調べたところ、 CNP Tgmは野生型に対し、肝臓で約 10倍、血漿で約 24 倍の CNP濃度を示しており、 .統計学的に有意に CNPぺプチドが過剰発現されていることが確認された（実施例 4の表 1 )。

さらに雌雄の CNPTgmおよびその正常同腹仔の鼻肛長を、 2〜9週間にわたり経時的に測定した結果、雌雄ともに CNPTgmは鼻肛長が正常同腹仔よりも大きく、身長が増加していることが判明した（図 4； A：雌、 B :雄）。従って血中の CNP濃度を上昇させることで身長増加が促進されることが確認された。

CNPTgmの成長軟骨の厚さを組織学的に解析する目的で、大腿骨膝蓋面の成長軟骨の休止層、増殖層、肥大層の厚さの平均値および成長軟骨の厚さとして前記 3 層の合計値を用いて解析を行ったところ、 CNPTgm においては、休止層、増殖層、肥大層およびその合計のすべてについて統計学的に有意に厚いことが確認された (図 5)。 CNPは、大腿骨の軟骨性骨以外にも、例えば脛骨、橈骨、尺骨等の他の軟骨性骨の休止層、増殖層、肥大層各層を厚くすることによつても動物の身長増加を促進することが示された。

従って、本発明は、 GC-Bを活性化する物質を有効成分として含む、 FGFR3異常を有しない個体に投与する身長増加用組成物を提供する。

本発明において、「FGFR3異常」とは、 FGFR3 (繊維芽細胞増殖因子レセプター 3 ) 遺伝子の変異による軟骨の成長抑制に起因する軟骨無形成症及ぴ軟骨形成不全症や、 FGFR3遺伝子の変異による FGFR3の機能亢進を含み、さらには FGFR3の機能抑制不全、又は FGFR3遺伝子の発現亢進などを原因とする軟骨無形成症及び軟骨形成不全症を意味する (特開 2003- 113116、 Nat Med 2004, 10 (1) : 80-86、国際公開 W002/074234)。本発明の実施態様において、上記組成物は FGFR3異常を有しなレ、低身長症患者に使用される。本発明において「低身長症」として、 FGFR3 異常を除いた低身長症をいい、例えば（1)成長ホルモン分泌不全性低身長症（下垂体性小人症）、甲状腺機能低下症、副腎皮質機能亢進症等による内分泌性低身長症、（2)家族性低身長、胎内発育不全性低身長、染色体異常（ターナー症候群、プラーダー ·ヴィリ症候群など）などによる非内分泌性低身長症、並びに（3)薬物治療や放射線療法による二次性低身長症を包含する。

本発明の別の実施態様において、上記組成物はさらに FGFR3異常を有しない、低身長症患者以外の個体にも使用されうる。本発明において、 FGFR3 異常を有しない低身長症患者以外の個体での使用又は伸長用途としては、美容医療分野及びスポーツ分野、さらには身長増加を望むヒトでの使用を包含する。

本発明で使用を意図する個体は、ヒトを含む哺乳動物、例えばヒト、ブタ、ゥシなどを含むが、これらの特定例によって制限されない。好ましい個体は、ヒトである。

本発明の別の実施態様において、上記身長増加は軟骨性骨の伸長である。

本発明のさらに別の実施態様において、上記身長増加は大腿骨、脛骨、橈骨及び/又は尺骨の伸長である。

本発明においてグァニルシクラーゼ B (GC- B)とは、ナトリゥム利尿ぺプチド受容体 B (NPR - B)と同義の用語として使用する。

本発明において GC-B活性とは、グァ -ルシクラーゼ活性と同義の用語として使用する。

本発明において、グァニルシクラーゼ B (GC-B) 活性化物質又は GC- B活性化物質は、 CNPの受容体として知られる GC-Bと結合してこれを活性化するぺプチド又は非べプチド性低分子化合物であり、好ましくは CNPぺプチド又はその誘導体である。ここでペプチドは、複数の（L -、 D-及び/又は修飾）アミノ酸のアミド結合連鎖からなる物質を指し、この中にはポリぺプチド及ぴ蛋白質も包含される。 GC-B 活性化物質は、例えば、 COS- 7等の培養細胞株に GC-B受容体を発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば 37°C、 5分間）細胞株を培養したのち、細胞内の c GMP産生量を測定する方法（Sci ence 1991 ; 252： 120-123) によって同定されうる。すなわち、このようなアツセィ系を使用して細胞内 c GMP の産生量を指標として GC - B活性化物質を同定し、それを本発明に使用することができる。

本発明の実施態様において、 GC-B活性化物質はぺプチドであり、好ましくは CNP 又はその誘導体である。好ましい CNPは、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP - 22 及び CNP - 53から選択されるものであり、さらに好ましくは、配列番号 1の CNP - 22 又は配列番号 2の CNP- 53である。

本発明の別の実施態様において、上記 CNP誘導体は、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP 活性を有するものである。あるいは、上記 CNP誘導体は、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列と約 70%以上、約 80%以上、約 85%以上、約 90%以上、約 95%以上、約 97%以上、約 98%以上、約 99%以上の％同一性を有する配列を含みかつ CNP活性を有するものである。

本明細書中で使用される「1〜数個」という用語は、通常 1〜10、好ましくは：!〜 5、さらに好ましくは 1〜 3の任意の整数を表す。また、 2つのアミノ酸配列間の「％同一性」は、当業者に公知の BLASTタンパク質'検索などの手法を用いて決定することができる（Altschul, S. F.， Gish, W.， Miller, W.， Myers, E. W. & Lipraan, D. J. (1990) Basic Local Al ignment Search Tool J. Mol. Biol. 215 : 403-410)。

本発明で使用可能な CNP には、ヒトを含む哺乳類由来 CNP (CNP- 22 : Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990 ; 168 : 863 - 870，国際公開 W091/16342、 CNP - 53 : Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990； 170 : 973-979，特開平 4 - 74198号公報、特開平 4-139199号公報、特開平 4-121190号公報）、鳥類由来 CNP (特開平 4-120094 号公報）、両生類由来 CNP (特開平 4-120095号公報）、並びに、特開平 6- 9688号公報、国際公開 W002/074234に開示される CNP類似体ぺプチドのような CNP誘導体が含まれる。

天然由来 CNPとして、 22及び 53アミノ残基からなる CNP-22及び CNP - 53が知られており、鳥類及ぴヒトを含む哺乳類由来の各 CNPを比較すると種を超えて配列相同が高いため、本発明においては、鳥類又はヒトを含む哺乳類由来の CNP、好ましくはヒトを含む哺乳類由来の CNP、さらに好ましくはヒト由来の CNPが使用されうる。ヒト CNP - 22及び CNP - 53のァミノ酸配列は、下記の配列番号 1及び配列番号 2：

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg lie Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys (ヒト CNP- 22：配列番号 1 ) ；

Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gin Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg lie Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys (ヒ卜 CNP - 53 : 配列番号 2)

.として示される配列を有しており、いずれも分子内ジスルフィド結合を有し、すなわちヒト CNP- ²2では 6位のシスティン残基と 22位のシスティン残基との間で、またヒト CNP- 53では 37位のシスティン残基と 53位のシスティン残基との間でそれぞれ分子内ジスルフィド結合を有し、環状ペプチド構造を形成している。

ブタ CNP- 22及びラット CNP - 22は、ヒト CNP - 22と同一のァミノ酸配列を有するが、一方、ブタ CNP- 53及びラット CNP- 53では 17位及び 28位のアミノ酸残基がそれぞれ Hi s及び Glyであるのに対しヒト CNP- 53ではそれぞれ Gin及び Alaであり、 2つのアミノ酸が相違する（特開平 4-139199号公報、特開平 4- 121190号公報、特開平 4- 74198号公報）。さらにまた、ニヮトリ CNP - 22は、 9位のアミノ酸残基 Val のみがヒト CNP - 22 と異なる以外は同じ一次構造を有している（特開 4-120094号公報）。

本発明で使用しうる上記 CNPは、天然からの精製 CNP、既知の遺伝子工学的手法で製造された遺伝子組換え CNP、既知の化学合成法（例えばペプチド合成機を用いる固相合成法）で製造された CNPを含み、好ましくは遺伝子工学的手法で製造されたヒト CNP - 2²およびヒト CNP - 53である。遺伝子工学的手法によるヒト CNP の製造は、例えば、ヒト CNP- 22又は CNP-53の DNA配列（特開平 4-139199号公報）をプラスミド、ファージなどのベクターに組み込み、大腸菌や酵母などの原核もしくは真核生物宿主細胞に形質転換したのち、適する培地中で発現し、好ましくは細胞外に CNPぺプチドを分泌させ、産生した CNPぺプチドを回収し精製する各工程を含む。また、目的 DNAの増幅のために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR) 技術 W を使用することができる。

遺伝子組換え技術、部位特異的突然変異誘発法、 PCR 技術などの基本的な手法は当業者には公知であり、例えば J. Sambrook ら， Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990)； Ausubel ら， Current Protocols In Molecular Biology, John Wi ley & Sons (1998)などに記載されており、そこに開示される技術を本発明のために利用することができる。またベクターとしては、市販のベクターあるいは刊行物記載のベクタ一が使用できる。

本発明で使用しうる CNP誘導体は、 CNP活性を有するとともに、ヒト CNP-22又は CNP- 53 と同一の 2 のシスティン残基間のジスルフィド結合による環状ぺプチド構造を有するものであって、上記 CNPのフラグメント、上記 CNP又はそのフラグメントの構成ァミノ酸の少なくとも 1つをその他のアミノ酸に置換したぺプチド、上記 CNPそのもの又はその部分ペプチドの構成アミノ酸の少なくとも 1つを欠失したぺプチド、及び上記 CNPそのもの又はその部分べプチドの構成ァミノ酸に 1つ以上のアミノ酸を付加したペプチドを含む。アミノ酸の置換、欠失、付加とは、 CNP 活性を損なわない限り、部位特異的突然変異誘発法などの周知の方法にてアミノ酸の置換、欠失又は付加できる程度の数のァミノ酸が置換、欠失又は付加されることを意味する。このような CNP- 22又は CNP-53の誘導体は例えば、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである。

アミノ酸の置換については、一般的に保存的アミノ酸置換が好ましい。保存的アミノ酸は、例えば極性度（または疎水性度）や電荷の種類によって分類されることができる。例えば、非極性の非電荷型アミノ酸にはグリシン、ァラニン、パリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンなど、芳香族アミノ酸にはフエニルァラニン、チロシン、トリプトファン、極性の非電荷型アミノ酸にはセリン、トレォニン、システィン、メチォニン、ァスパラギン、グルタミンなど、負電荷アミノ酸にはァスパラギン酸、グルタミン酸、正電荷アミノ酸にはリジン、アルギニン、ヒスチジンが、それぞれ含まれる。

本明細書中で使用される「CNP活性」とは、 GC-Bに作用してグァニルシクラーゼ活性を上昇させる活性あるいは身長を有意に増加させる活性をいう。 CNP 活性は、細胞のグァニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内 c GMP の産生量を測定することによること、あるいはマウス、ラットなどの動物に一定期間 GC - B活性化物質を投与したのち、後述の実施例 5に記載されるように鼻肛長を測定すること、によって決定しうる。

CNP-22類似べプチドには、例えば特開平 6-9688号公報や国際公開 W002/074234 に記載されるような下記の環状ペプチドが含まれる（なお、配列中の下線はヒト CNP-22からの変異を表す）。

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg lie Gly Ala Met Ser Gly Leu Gly Cys (配列番号 3)

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg lie Gly Ser Gin Ser Gly Leu Gly Cys (配列番号 4)

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg lie Gly Ser Ala Ser Gly Leu Gly Cys (配列番号 5)

Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg lie Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys (配歹 lj 番号 6)

Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg lie Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys (配列番号 7)

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg lie Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr (配列番号 8)

Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg lie Gly Ser Gin Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr (配列番号 9)

Cys Phe Gly Xaa Xbb XccAsp Arg lie Gly Xdd Xee Ser Xff XRR Gly Cys

(ここで、 Xaa=Leu， lie, Val; Xbb=Lys, Leu, Met; Xcc=Leu, lie, Ala, Val;

Xdd=Ser, Ala, Gly, Thr, Asn; Xee=Met, Ala, Trp, His, Lys, Ser, Gly; Xff=Gly,

Lys, Ala, Leu; Xgg=Leu, Metである。）（配列番号 10)

また、 CNP- 53類似べプチドには、上記の CNP-22類似ぺプチドに対応するアミノ酸の同様の変異を含む環状ペプチドが含まれる。

本発明はまた、 GC-Bを活性化することによって、 FGFR3異常を有じない個体の身長を増加することを特徴とする、身長増加方法を提供する。この発明は、 GC - B 活性化物質が、 FGFR3 異常を有しない個体の身長を増加するという知見に基づくものである。具体的には、上記身長増加は軟骨性骨の伸長であり、さらに具体的には、大腿骨、脛骨、橈骨及び/又は尺骨の伸長である。 GC-B '活性化物質の具体例は、上記定義の CNP又はその誘導体である。 CNPは、好ましくは、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP - 22又は CNP- 53であり、さらに好ましくは、配列番号 1の CNP- 22又は配列番号 2の CNP- 53である。また、 CNP誘導体は、配列番号 1 又は配列番号 2のァミノ酸配列において 1〜数個のァミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものを含む。他の GC - B活性化物質は、例えば、 COS - 7 等の培養細胞株に GC- B受容体を発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば 37°C、 5分間）細胞株を培養したのち、細胞内の c GMP産生量を測定する方法（Sci ence 1991； 252： 120- 123)によって同定されうる。すなわち、このようなアツセィ系を使用して細胞内 c GMPの産生量を指標として GC-B 活性化物質を同定し、それを本発明に使用することができる。

本発明はさらに、 GC - Bの活性を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリ一二ングすることを含む、身長増加剤のスクリーニング方法を提供する。本発明の実施態様により、GC - Bは、上記定義の CNP又はその誘導体によって活性化されうる。 GC-Bは、グァエルシクラーゼ活性により GTPからセカンドメッセンジャーである c GMP の合成を触媒することが知られているので、 GC-B の活性は、細胞内 c GMP 産生量として測定されうる。

本発明の実施態様において、上記スクリ一ユング方法は GC- Bを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞の GC- B 活性を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーニングすることからなる方法を含む。

本発明の実施態様において好ましくは、 GC- Bを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内 c G Pの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内 c GMP産生量の差を指標として身長増加について候補薬剤をスクリーニングすることからなる方法を含む。本発明のスクリーニング法は、例えば、 COS- 7等の培養細胞株に GC- B受容体を発現させ、培地に被験物質を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば 37°C、 5 分間）細胞株を培養したのち、細胞内の c GMP 産生量を測定する方法（Sci ence 1991 ; 252： 120- 123)によって身長増加剤をスクリーニングすることができる。本発明はさらに GC- Bを活性化することにより FGFR3異常を有しない軟骨性骨を伸長させる方法を提供する。本発明の実施態様においては、 GC - Bを活性化することにより in vivo, ex vivoあるいは in vitroにて軟骨性骨の伸長を促進することができる。本発明の実施態様においては好ましくは培養骨、培養軟骨の培養時において GC - Bを活性化する物質を添加することにより FGFR3異常を有しない軟骨性骨の伸長を促進する方法を含む。

本発明の組成物は、有効成分としての上記定義の GC- B活性化物質を、製薬上許容可能な担体、賦形剤、添加剤などと組み合わせて、経口投与用又は非経口投与用に製剤化される。

本発明の組成物は、上記定義の GC-B活性化物質を有効成分として含み、さらに通常の製剤化の際に用いられる担体ゃ賦形剤、その他の添加剤を用いて調製される。

製剤用の担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシゥム、デンプン、タノレク、ゼラチン、寒天、ぺクチン、アラビアゴム、ォリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコールなどやその他常用されるものをあげることができる。

経口投与のための固体組成物としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などが用いられる。このような固体組成物においては、少なくともひとつの有効成分が少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、デンプン、ポリビュルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合される。組成物は、常法にしたがって不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、ステアリン酸マグネシゥムのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシゥムのような崩壊剤、グルタミン酸又はァスパラギン酸のような溶解補助剤を含んでいてもよい。錠剤又. は丸剤は、必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣や胃溶性又は腸溶性物質のフィルムで被覆してもよいし、

2つ以上の層で被覆してもよい。さらに、ゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも含まれる。

経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤などを含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールなどを含んでいてもよい。この組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤などを含んでいてもよレ、。

非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、注射用水及び注射用生理食塩液が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、プロピレングリコー^、ポリエチレングリコー^/、ォリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート 80 (登録商標）などが含まれる。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、乳糖）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、ァスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらは、例えば、精密ろ過膜によるろ過滅菌、高圧蒸気滅菌のような加熱滅菌、あるいは、殺菌剤の配合などの通常の滅菌方法によって無菌化することが可能である。注射剤は溶液製剤であっても、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することが出来る。

本発明の治療剤又は予防剤は、医薬に一般に使用されている経口投与方法又は非経口投与方法のいずれかによつて投与される。好ましくは非経口投与方法、例えば注射による投与（皮下注射、静脈注射、筋肉注射、腹腔内への注射などによる投与）、経皮投与、経粘膜投与（経鼻投与、経直腸投与など）、経肺投与などであるが、経口投与方法による投与も可能である。

本発明の製剤中に含まれる有効成分である GC - B活性化物質、好ましくは上記定義の CNP又はその誘導体、の量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度、患者の年齢などに応じて決定できるが、一般に 0. 005 μ g/kg〜100mg/kgの範囲で投与することができるが、 O. OS ^ g/kg Smg/kgで投与することが好ましい。しカしながら本発明の GC- B 活性化物質を含有する医薬剤はこれらの投与量に制限されるものではない。

本発明として以下の事項を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

(1) GC-B活性化物質を有効成分として含む、 FGFR3異常を有しない個体に投与する身長増加用組成物。

(2)低身長症患者に使用される、上記（1)に記載の組成物。

(3)低身長症患者以外の個体に使用される、上記（1)に記載の組成物。

(4)上記身長増加が軟骨性骨の伸長である、上記（1)〜（3)のいずれかに記載の組成物。

(5)上記身長増加が大腿骨、脛骨、橈骨及び/又は尺骨の伸長である、上記（1)〜（4) のいずれかに記載の組成物。

(6)上記物質がペプチドである、上記（1 )〜（5)のいずれかに記載の組成物。

(7)上記べプチドが CNP又はその誘導体である、上記（6)に記載の組成物。

(8)上記 CNP力 S、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP - 22及び CNP - 53から選択される、上記（7)に記載の組成物。

(9)上記 CNPが配列番号 1の CNP- 22又は配列番号 2の CNP- 53である、上記（7)に記載の組成物。

(10)上記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである、上記（7) に記載の組成物。

(11) GC-Bを活性化することによって、 FGFR3異常を有しない個体の身長を増加することを特徴とする、身長増加方法。

(12)上記身長増加が軟骨性骨の伸長である、' 上記（11)に記載の身長増加方法。

(13)上記身長増加が大腿骨、脛骨、橈骨及び/又は尺骨の伸長である、上記（11) 又は（12)に記載の身長増加方法。

(14)上記 GC- Bが、 CNP又はその誘導体によって活性化される、上記（11)〜（13)のいずれかに記載の身長増加方法。 . (15)上記 CNPが、ヒトを含む乳類又は鳥類由来の CNP- 22又は CNP-53である、上記（14)に記載の身長増加方法。

(16)上記 CNP力配列番号 1の CNP-22又は配列番号 2の CNP- 53である、上記（14) に記載の身長増加方法。

(17)上記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである、（14)に記載の身長増加方法。

(18) GC - B の活性を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーユングすることを含む、身長増加剤のスクリーニング方法。

(19) GC-Bを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞の GC- B活性を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリ一二ングすることを含む、（18)に記載のスクリーエング方法。

(20)上記 GC-Bの活性が、細胞内 c GMP産生量として測定される、上記（18)又は（19) に記載のスクリーニング方法。

(2D GC-Bを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を被験物質の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内 c GMP の産生量を測定し、該被験物質の存在下と非存在化での細胞内 c GMP 産生量の差を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記（18)〜（20)に記載のスクリーニング方法。

(22) GC-Bを活性化することにより FGFR3異常を有しない軟骨性骨を伸長させる方法。

以下の実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は単に例示を目的としたものであって、本発明を制限するものではない。それゆえ、本発明は、これらの実施例によって制限されないものとする。実施例 1 ·

CNP トランスジエニックマウス作製用ベクターの構築

図 1 A tこ示すよう（こ、 pGEM— T easy vector ( Promega社製）こマウス CNP cDNA (526 bp ; FEBS Lett. 276 : 209-213， 1990)をサブクローニングさせたものを Pst Iで切断し、断端を平滑化してマウス CNP cDNAを調製した。 pSG I ベクター（P_romeg_a 社製；図 1 B)を Eco RIで切断し断端を平滑化して、図 1 Cのようにマウス CNP cDNA を l igat ionし、 SAP-mCNP ベクター（pSGl - CNP) を作製した。実施例 2

CNP トランスジエニックマウスの作製

インジェクション用 DNAフラグメントは、次のようにして調製した。まず CNP 遺伝子を挿入した SAP-mCNPベクター（pSGl- CNP；図 1C)を、 Hindlllおよび Xhol で処理した後、 CNP遺伝子を含む断片（約 2. 3kb)を切り出した。この断片を、 Gel Extracti on Kit (QIAGEN)により回収し、 3 ng/ μ 1になるように PBS—で希釈してィンジヱクシヨン用 DNAフラグメント（図 2)とした。

DNA フラグメントを注入するマウス前核期卵は、次のようにして回収した。すなわち、まず C57BL/6雌マウス（日本クレア）に 5 i. uの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（PMSG)を腹腔内投与、さらに 48時間後 5 i. uのヒト絨毛ゴナドトロピン（hCG) を腹腔内投与することによって、過排卵処理した。この雌マウスを同系統の雄マウスと交配させた。交配の翌朝、プラグを確認したマウスの卵管を灌流してマウス前核期卵を回収した。

インジェクション用 DNAフラグメントは、マイクロマニピュレーターを用いて前核期卵へ注入した（ジーンターゲティングの最新技術（羊土社）， 190- 207, 2000) _c DNAフラグメントを 660個の C57BL/6J胚へ注入し、翌日、 2細胞期に発生していた胚 561個を、偽妊娠 1 日目の受容雌の卵管に片側当たり 10個前後（1匹あたり 20個前後）を移植した。

分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し里親に哺育させた。 136例の産仔が得られ、そのうちの 5例が CNP遺伝子が導入されたトランスジエニックマウス（以下、 Tgm と記載する）であった。以下、最初に得られたマウスを Founderと記載する。

Founderは全て雄マウスで、これら 5ラインの内 4ラインから、次世代（F1マウス）の産仔が得られた。実施例 3

CNP トランスジニックマウスの遺伝子型解析

遺伝子型解析は下記に示す手順に従ってサザンプロット法によって行った。 3週齢になったマウスの尾（約 15mm) を採取して proteinase K処理（55°C、 100 rpmで 1昼夜振盪）して溶解液を得た。この溶解液を核酸自動分離装置（KURAB0 NA-1000) にかけてゲノム DNAを調製した。ゲノム DNA15 μ gを Pvu II (200 U) で処理してからフエノール · クロロホルム処理によって制限酵素を除いた後にェタノール沈殿で DNAを回収した。回収された DNAを 25 μ Lの ΤΕに溶解して 0. 7% ァガロースゲル電気泳動（50V定電圧）にかけ、泳動終了後、ゲルを 0. 25 M HC1 溶液で 15分間処理して DNAを切断し、水洗してから 0. 4 M NaOH溶液でナイロンメンプレンに一晚ブロッティングした。その後、メンブレン上の DNAを UVクロスリンク法で固定した。メンブレンをハイブリダイゼーション溶液 (50% ホルムァミド、 0. 5 X Denhardt ' s、 0. 5% SDS、 5x SSPE) で処理（42°C、 2時間）してから、 CNPの cDNA (約 0. 5kb) を鎵型として BcaBEST Labeling Kit (TaKaRa) で調製した ³²P標識プローブを加えて 42°Cでー晚ハイブリダイゼーシヨンした。その後、洗浄溶液（2 x SSC、 0. 1% SDS) で 55°C、 20分間処理してから Imaging Plate (Fuj i Film) にー晚露光し、導入遺伝子のシグナルを BAS2000 (Fuj i Film) で検出した（図 3 )。野生型マウス（WT) では 3本のシグナル (野生型 CNP遺伝子）が検出され、トランスジエニックマウス（Tgm) では野生型 CNP遺伝子に加えて、導入遺伝子由来のシグナル（トランスジーン）が 2本検出された。実施例 4

CNP トランスジエニックマウスにおける CNPの発現

CNP濃度の測定には、 CNP-22 EIA測定キット (PHOENIX PHARMACEUTICALS INC. 社製）を用いた。

7週齢の雌雄 CNP トランスジヱニックマウスおょぴ雌雄の正常同腹マウス各

3例をエーテル麻酔下で後大静脈から全採血して安楽死させた。

導入した遺伝子の高発現が予想される臓器である肝臓を採取し、肝重量 0. l g に対して、上記測定キットの EIA assay バッファー 1 mLを加え氷冷した。ヮーリングブレンダー（ヒスコトロン社製）でホモジナイズし、遠心分離（², 000 rpm、 5分間）した上清を C NP - 22濃度測定サンプルとした。

採取した血液に、 l mgのエチレンジァミン 4酢酸 ' 4ナトリウム塩（純正化学社製）と 2 トリプシン阻害単位のァプロチニン（Sigma社製）を添加して攪拌して血漿を分離し、 CNP-22濃度測定サンプルとした。

測定結果を表 1に示した。

CNP トランスジエニックマウスにおける CNPの発現

** : pく 0. 01 (対応のなレヽ Student t- test)

#： p<0. 05 (Wilcoxon 順位和検定）

CNP トランスジエニックマウスは野生型に対する平均値土標準偏差 (mean土 SD) の比較では肝臓で約 10倍、血漿で約 24倍の CNP-22濃度を示しており、いずれも統計学的に有意な差であった。これらの結果より、 CNP トランスジエニックマウスにおいて、 CNPぺプチドが過剩発現されていることが確認された。実施例 5

CNP トランスジエニックマウスにおける成長曲線

雌雄の CNP トランスジエニックマウスおよびその正常同腹仔の鼻肛長 (naso-anal length, cm)を、 2〜9 週間にわたり経時的に測定した（図 4 )。その結果、雌雄ともに CNP トランスジエニックマウスは鼻肛長が正常同腹仔よりも大きく、身長増加が促進されていることが判明した。また、この結果は、血中の CNP 濃度を上昇させることで身長増加が促進されることも同時に示すものである。実施例 6

CNP トランスジエニックマウス成長軟骨の組織学的解析

成長軟骨の厚さを組織学的に解析する目的で、 9週齢の CNP トランスジェニックマウスおよび同腹の正常マウスの雌 5例をエーテル麻酔下で後大静脈から全採血して安楽死させ、大腿骨を 20%ホルマリンにより 1週間固定した。その後 20% EDTA-4Na (純正化学社製）水溶液（ρΗ7· 4) に浸漬して脱灰した後、大腿骨膝蓋面を正中矢状断して常法に従いパラフィン包埋し、パラフィンプロックを作製した。厚さ 4 μ ηιの切片をミク口トームを用いて薄切してパラフィン切片を作製し、へマトキシリン 'ェォジン染色した。成長軟骨の厚さは、対物レンズ 10倍での 1 視野を画像解析ソフト（ΙΡΑΡ，住化テクノサービス社製）に取り込み、同ソフトを用いて視野中の 5点について、休止層、増殖層、肥大層の厚さを計測して平均値を算出し、その個体の各層の厚さとした。また、上記 3層の合計値をその個体の成長軟骨の厚さとした。これら項目について、正常同腹仔と CNP トランスジェニックマウスの間で平均値および標準偏差を算出し（Microsoft Excel2000, マイクロソフト社製）、対応のない Student の t検定によって統計学的解析を行った (SAS ver. 6. 12， SASインスティチュートジャパン社製）。

CNP トランスジエニックマウス（CNP tgm)においては、正常マウス（野生型）に比して休止層（Resting)、増殖層 (Prol iferating)、肥大層（Hypertrophy)およびその合計（Total)のすべてについて統計学的に有意に成長軟骨層が厚いことが判明した（図 5 )。これらの結果から、 GC - B活性化物質の 1種である CNPは成長軟骨の各層を厚くすることにより、哺乳動物の身長増加を促進することが判明した。産業上の利用可能性

本発明の、 GC - B活性化物質を有効成分として含む組成物は、 FGFR3異常を有しない個体における内分泌性低身長症、非内分泌性低身長症及び二次性低身長症などの低身長症を治療することを可能にする。この組成物は、成長ホルモンやインシュリン様成長因子- 1 (IGF-I)の注射や骨切り術などの整形外科手術と比べて患者の負担、苦痛が少なく、患者の Q0Lに配慮した優れた治療剤となりうる。本発明の組成物はまた、 FGFR3 異常を有しない、低身長症患者以外の個体での伸長用途に用いることができる。本発明はまた GC - Bを活性化することにより in vivo、 ex vivoあるいは in vitroにて FGFR3異常を有しない軟骨性骨を伸長させることができる。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。配列表フリーテキスト

配列番号 1の説明： 6 - Cysと 22- Cysの間でジスルフィド結合が形成されている。配列番号 2の説明： 37 - Cysと 53- Cysの間でジスルフィド結合が形成されている。配列番号 3の人工配列の説明： CNP-22誘導体（ここで、 6 - Cysと 22- Cysの間でジスルフィド結合が形成される）。

配列番号 4の人工配列の説明： CNP- 22誘導体（. で、 6- Cysと 22- Cysの間でジスルフィド結合が形成される）。

配列番号 5の人工配列の説明： CNP- 22誘導体（.ここで、 6- Cys と 22- Cysの間でジスルフィド結合が形成される）。

配列番号 6の人工配列の説明： CNP - 22誘導体（ここで、 1- Cysと 17- Cysの間でジスルフィド結合が形成される）,

配列番号 7の人工配列の説明： CNP- 22誘導体（ここで、 7- Cysと 23 - Cysの間でジスルフィド結合が形成される）。

配列番号 8の人工配列の説明： CNP-22誘導体（ここで、 6-Cysと 22 - Cysの間でジスルフィド結合が形成される）。

配列番号 9の人工配列の説明： CNP-22誘導体（ここで、 1 - Cysと 17- Cysの間でジスルフィド結合が形成される）。

配列番号 10の人工配列の説明： CNP-22誘導体（ここで、 4 - Xaa=Leu， li e, Val ; 5-Xaa=Lys, Leu, Met ; 6-Xaa=Leu, l ie, Ala, Val ; l l-Xaa=Ser, Ala, Gly, Thr, Asn ; 12-Xaa=Met, Ala, Trp, His, Lys, Ser, Gly, 14-Xaa=Gly, Lys, Ala, Leu ; 15-Xaa=Leu, Met。また、 1 - Cysと 1ァ- Cysの間でジスルフィド結合が形成されている。）。

Claims

請求の範囲

1 . グァニルシクラーゼ B (GC-B) 活性化物質を有効成分として含む、 FGFR3 異常を有しない個体に投与する身長増加用組成物。

2 . 低身長症患者に使用される、請求項 1に記載の組成物。

3 . 低身長症患者以外の個体に使用される、請求項 1に記載の組成物。

4 . 前記身長増加が軟骨性骨の伸長である、請求項 1に記載の組成物。

5 . 前記身長増加が大腿骨、脛骨、橈骨及び/又は尺骨の伸長である、請求項 1に記載の組成物。

6 . 前記物質がぺプチドである、請求項 1に記載の組成物。

7 . 前記ペプチドが C型ナトリゥム利尿べプチド（CNP) 又はその誘導体である、請求項 6に記載の組成物。

8 . 前記 CNPが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP - 22及ぴ CNP - 53から選択される、請求項 7に記載の組成物。

9 . 前記 CNPが配列番号 1の CNP- 22又は配列番号 2の CNP- 53である、請求項 7に記載の組成物。

1 0 . 前記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のァミノ酸配列において 1 〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである、請求項 7に記載の組成物。

1 1 . GC - Bを活性化することによって、 FGFR3異常を有しない個体の身長を増加することを特徴とする、身長増加方法。

1 2 . 前記身長増加が軟骨性骨の伸長である、請求項 11に記載の身長増加方法。

1 3 . 前記身長増加が大腿骨、脛骨、橈骨及び/又は尺骨の伸長である、請求項 11に記載の身長増加方法。

1 4 . 前記 GC-Bが、 CNP又はその誘導体によって活性化される、請求項 11 に記載の身長増加方法。

1 5 . 前記 CNPが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来の CNP- 22又は CNP- 53である、請求項 14に記載の身長増加方法。

1 6 . 前記 CNPが、配列番号 1の CNF- 22又は配列番号 2の CNP- 53である、請求項 14に記載の身長増加方法。

1 7 . 前記誘導体が、配列番号 1又は配列番号 2のアミノ酸配列において 1 〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつ CNP活性を有するものである、請求項 14に記載の身長増加方法。

1 8 . GC-Bの活性を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリ一二ングすることを含む、身長増加剤のスクリーニング方法。

1 9 . GC-Bを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞の GC-B活性を指標として身長増加剤の候捕薬剤をスクリ一二ングすることを含む、請求項 18に記載のスクリ一二ング方法。

2 0 . 前記 GC - B活性が、細胞内 c GMP産生量として測定される、請求項 18 に記載のスクリー-ング方法。

2 1 . GC-Bを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を被験物質の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内 c GMP の産生量を測定し、該被験物質の存在下と非存在化での細胞内 c GMP 産生量の差を指標として身長増加剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、請求項 18に記載のスクリーユング方法。

2 2 . GC - Bを活性化することにより FGFR3異常を有しない軟骨性骨を伸長させる方法。