[go: up one dir, main page]

WO2005087941A1 - Ｌ−フクロースの製造方法およびｌ−フコースの製造方法 - Google Patents

Ｌ−フクロースの製造方法およびｌ−フコースの製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2005087941A1
WO2005087941A1 PCT/JP2005/004701 JP2005004701W WO2005087941A1 WO 2005087941 A1 WO2005087941 A1 WO 2005087941A1 JP 2005004701 W JP2005004701 W JP 2005004701W WO 2005087941 A1 WO2005087941 A1 WO 2005087941A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fucitol
producing
microorganism
fucose
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2005/004701
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shunichi Suzuki
Kunihiko Watanabe
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co Inc filed Critical Ajinomoto Co Inc
Priority to EP05720936A priority Critical patent/EP1743943A4/en
Priority to JP2006511058A priority patent/JP4775258B2/ja
Publication of WO2005087941A1 publication Critical patent/WO2005087941A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US11/532,618 priority patent/US7575910B2/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing L-fucose and a method for producing L-fucose, and more particularly, to a simple and efficient method for producing L-fucose and a method for producing L-fucose.
  • L-fucose (L6-dexoxygalatatose) widely exists in the living world as a non-reducing terminal sugar of various sugars.
  • fucoidan fucoidan
  • the role of L-fucose in vivo is thought to be involved in the uptake of serum glycoproteins into the liver, the receptor for macrophage migration element factors, and the like.
  • Research is also being conducted on L-fucose in relation to diseases, and research is being conducted on the use of L-fucose as, for example, a pharmaceutical intermediate.
  • cancer diagnosis based on changes in the ratio of L-fucose in glycoproteins and glycolipids and the amount of free L-fucose in urine of cancer patients, development of cancer metastasis inhibitors or antiviral agents, control of leukocytes, It is expected to be used for the treatment of rheumatoid arthritis.
  • Patent Document 3 a method of hydrolyzing a polysaccharide produced by a microorganism and isolating a decomposed product L fucose has been attempted.
  • this method is also technically difficult to isolate and purify, and the yield is extremely low.
  • Non-Patent Document 1 a chemical synthesis method using D-galactose as a raw material is known.
  • this method has many steps The yield is low !, so it is not practical as industrial production! / ,.
  • Non-Patent Documents 2 and 3 As oxidation of L-fucitol using a microorganism, an experimental report using an acetic acid bacterium has been reported (for example, Non-Patent Documents 2 and 3). However, these reports did not identify the enzyme. Further, the product obtained by oxidizing L-fucitol differs depending on the site where L-fucitol is oxidized. In this experimental report, the main component of the obtained oxide is the 4-position oxide of L-fucitol, which is not L-fucose or L-fucrose (L-foco-4- ketose). In addition, various studies have been made on acetic acid bacteria with respect to enzymes using sugar as a substrate (for example, Patent Document 6, Non-Patent Document 3, Non-Patent Document 4, etc.).
  • Patent Document 1 JP-A-61-57520
  • Patent Document 2 JP-A-11 35591
  • Patent Document 3 JP-A-59-51798
  • Patent Document 4 International Publication No. 97Z15683 pamphlet
  • Patent Document 5 International Publication No. 02Z06506 pamphlet
  • Patent Document 6 JP-A-8-242850
  • Non-Patent Document 1 Carbohydrate research 270; 93-96 (1995)
  • Non-Patent Document 2 Journal of American Chemical Society; 4934-4937 (1950)
  • Non-Patent Document 3 Canadian Journal of Chemistry 45: 741-744 (1967)
  • Non-Patent Document 4 Biosci.Biotechnol.Biochem. 65: 2755-2762 (2001)
  • Non-Patent Document 5 Planta 202: 487-493 (1997)
  • the present inventors proceeded with research as in the examples described in detail below. As a result, they found the presence of a protein having a fusitol dehydrogenase activity derived from a microorganism, and found that L-fucitole-Luca other than L-fucrose Under the condition that a protein having ketohexose-forming activity is not present or its activity is suppressed, various methods for producing L-fucitol L-fuculose have been found, and L-fuculose, an intermediate in L-fucose production, has been discovered. An industrially suitable production method was completed, and an industrially advantageous method for producing L-fucose was completed. That is, the present invention provides the following method for producing L-fucrose and L-fucose.
  • L-Fucitol power A method for producing L-fucose, wherein L-fucose is produced from L-fucitol in the presence of a microorganism-derived protein having a dehydrogenase activity that produces L-fucrose.
  • a method for producing L-fuculose which comprises producing L-fuculose from L-fucitol in the presence of one or more selected from the group consisting of:
  • At least one microorganism selected from the group consisting of Darconobacter i-xylinus subspecies xylinas and Darconobacta oxydans, a culture of the microorganism, and A method for producing L-fuculose, wherein L-fuculose is produced from L-fucitol in the presence of one or more selected from the group consisting of the treatment of microorganisms.
  • a non-genetically modified microorganism which has a protein having a dehydrogenase activity that also produces L-fucitol, and has substantially no ability to produce xose from L-fucitol to keto other than L-fucrose;
  • a method for producing L-fuculose comprising producing L-fuculose from L-fucitol in the presence of one or more selected from the group consisting of a culture of the non-genetically modified microorganism and a cell treatment product of the non-genetically modified microorganism.
  • L-fucitol power A second protein having a first protein derived from a microorganism having a dehydrogenase activity for producing L-fuculose and having an L-fucitol power for producing ketohexose other than L-fucrose.
  • L-fucitol generates L-fucose. -How to make fukurosu.
  • L-fucitol power Characteristically capable of expressing a first protein derived from a microorganism having dehydrogenase activity that does not substantially produce a ketohexose other than L-fucrose and has a dehydrogenase activity that generates L-fucitol power.
  • L-fucitol is also produced under the reaction conditions under which the formation of ketohexose other than L-fuculose is suppressed, L-fucitol is produced from L-fucitol, according to any one of the above (1) to (4). Production method of L-fucrose.
  • a microorganism having the ability to produce L-fucrose from L-fucitol and make the amount of L-fuculose to be 50 wt% or more of L-fucitol acidulant, a culture of the microorganism, and a property of treating the microorganism with the microorganism An L-fuculose producing step of producing L-fuculose from L-fucitol in the presence of one or more selected from the group consisting of:
  • a non-genetically modified microorganism having a protein having a dehydrogenase activity for producing L-fucitol and having substantially no ability to produce xose from L-fucitol to keto other than L-fucrose;
  • L-fucitol power A gene encoding a protein having a protein having dehydrogenase activity for generating L-fucrose and having an activity for generating hexose from L-fucitol to keto other than L-fucrose has been disrupted.
  • L for producing L-fuculose from L-fucitol L for producing L-fuculose from L-fucitol in the presence of one or more selected from the group consisting of a microorganism, a culture of the microorganism and a cell treatment of the microorganism.
  • a fucrose generation step A gene encoding a protein having a protein having dehydrogenase activity for generating L-fucrose and having an activity for generating hexose from L-fucitol to keto other than L-fucrose has been disrupted.
  • L for producing L-fuculose from L-fucitol L for producing L-fuculose from L-fucito
  • a microorganism which has substantially no ability to produce a ketohexose other than L-fucitol L-fuculose and is capable of expressing a protein derived from a microorganism having a dehydrogenase activity capable of producing L-fucitol L-fucrose; L-fuculose that produces L-fucose from L-fucitol and L-fucose that produces L-fucitol from L-fucitol in the presence of one or more species selected from the group consisting of a culture of the microorganism and a cell treatment of the microorganism. Generating step;
  • L-fucitol activity A microorganism-derived protein having substantially no ability to produce ketohexoses other than L-fucrose and having a dehydrogenase activity that produces L-fucitol activity, and L-fucose activity also produces L-fucose L-fucose is produced from L-fucitol in the presence of one or more selected from the group consisting of a microorganism transformed to express a protein, a culture of the microorganism, and a cell treatment of the microorganism. The production method of Lofucose.
  • the transformant described in [28] above is a microorganism, and the microorganism is cultured in a medium to produce L-fucitol L-fuculose in the medium and in the Z or microorganism.
  • a method for producing a protein comprising accumulating a protein having dehydrogenase activity.
  • the transformant according to (28) is a microorganism
  • One or more selected from the group consisting of the microorganism, a culture of the microorganism, and a processed cell of the microorganism are added to a reaction system containing L-fucitol to produce L-fucose with L-fucitol power.
  • the production method of L-fucrose is the production method of L-fucrose.
  • the transformant described in (28) above is a microorganism, and one or more selected from the group consisting of the microorganism, a culture of the microorganism, and a material for treating cells of the microorganism are selected from the group consisting of L L-fucose is produced in a reaction system containing fucitol, and L-fucose is produced from L-fucitol.
  • (32) a protein having a dehydrogenase activity for producing L-fucitol L-fuculose, into which the recombinant polynucleotide according to (25) and the recombinant polynucleotide according to claim 26 have been introduced;
  • a transformant which expresses a protein having an activity of producing a protein.
  • the recombinant polynucleotide according to (26) is introduced, and a transformed microorganism expressing a protein having an activity of generating NAD from NADH is cultured in a medium, and the transformed microorganism is cultured in the medium and Z or the microorganism.
  • a method for producing a protein comprising accumulating a protein having an activity of producing NADH-powered NAD.
  • the transformant according to (32) is a microorganism
  • One or more selected from the group consisting of the microorganism, a culture of the microorganism, and a processed cell of the microorganism are added to a reaction system containing L-fucitol to produce L-fucose with L-fucitol power.
  • the production method of L-fucrose is the production method of L-fucrose.
  • the transformant described in (32) above is a microorganism, and one or more selected from the group consisting of the microorganism, a culture of the microorganism, and a treatment of the microorganism with the microorganism are selected from the group consisting of L —Cultured in a reaction system containing fucitol to produce L-fuculose from L-fucitol The process of producing L-fucrose,
  • the transformant described in the above [36] is a microorganism, and the microorganism is cultured in a medium, and a dehydrogenase activity that generates L-fucitol L-fuculose in the medium and in the Z or microorganism is measured.
  • a method for producing a protein comprising accumulating a protein having an activity of producing a NAD protein and an NAD-forming NAD.
  • the transformant according to (36) is a microorganism
  • One or more selected from the group consisting of the microorganism, a culture of the microorganism, and a processed cell of the microorganism are added to a reaction system containing L-fucitol to produce L-fucose with L-fucitol power.
  • the production method of L-fucrose is the production method of L-fucrose.
  • the transformant described in the above (36) is a microorganism, and one or more selected from the group consisting of the microorganism, a culture of the microorganism, and a substance treated with the microorganism are selected from the group consisting of L L-fucose is produced in a reaction system containing fucitol, and L-fucose is produced from L-fucitol.
  • sequence shown in SEQ ID NO in the present specification refers to the sequence described in the sequence listing unless otherwise specified.
  • the present invention there are provided a method for producing L-fucose and a method for producing L-fucose which are suitable for industrial production.
  • the production method of the present invention is simple as industrial production. Further, the production method of the present invention can suppress or eliminate the generation of by-products, This is a highly efficient manufacturing method. Further, the production method of the present invention can use a low-cost raw material such as D-galactose as a starting material, so that the production cost can be reduced, which is extremely advantageous for industrial production.
  • FIG. 1 is a diagram showing a reaction process up to D-galactose force L-fucose.
  • FIG. 2 is a graph showing the amount of L-fucitol converted by acetic acid bacteria expressing Fuel.
  • FIG. 3 is a graph showing the amount of by-product (BP) produced during the production of L-fuculose from L-fucitol under different pH conditions.
  • FIG. 4 is a diagram showing the amount of by-product (BP) produced when L-fucitol is produced from L-fucitol when EDTA is cultivated.
  • BP by-product
  • Fig. 5 is a diagram showing the amount of by-product (BP) produced when L-fucitol is produced from L-fucitol force when the sldA gene is disrupted.
  • FIG. 6 is a diagram showing a result of SDS-PAGE of purified FcDH.
  • FIG. 7 shows the results of SDS-PAGE of purified NOX.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of measuring the pH optimum for the reaction of purified FcDH.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of measuring the pH stability of purified FcDH.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of measuring the optimal reaction temperature of purified FcDH.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of measuring the temperature stability of purified FcDH.
  • FIG. 12 shows the results of measuring the specific activity of purified FcDH with respect to the concentrations of (A) D-arabitol and (B) L fucitol.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of examining the oxidized products of D-arabitol, D-manitol and D-sorbitol by FcDH by HPLC analysis.
  • FIG. 14 is a view showing the results of measuring the specific activity of purified FcDH with respect to the NAD concentration.
  • Fig. 15 is a view showing the result of measuring the optimum pH of the reaction of purified NOX.
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of measuring the pH stability of purified NOX.
  • FIG. 17 is a view showing the result of measuring the optimal reaction temperature of purified NOX.
  • FIG. 18 shows the results of measuring the temperature stability of purified NOX.
  • FIG. 19 shows the results of measuring the specific activity of purified NOX with respect to the flavin coenzyme (FAD, riboflavin, and FMN) concentration.
  • FAD flavin coenzyme
  • FIG. 20 is a view showing the result of measuring the specific activity of purified NOX with respect to the NADH concentration (FIG. 20 (A)).
  • Figure 20 (B) shows the results of (A) in a Lineweaver-Burk plot.
  • Figure 21 shows E. coli / pUC18, E. coli / pIEXll, E. coli / pFEX3052,
  • FIG. 3 is a view showing the results of observation by SDS-PAGE of cell-free extracts prepared from E. coli / pFNEX4105 and E. coli / pFNIEX5706, respectively.
  • FIG. 22 is a diagram showing an SDS-PAGE observation result of rFcDH purified from E. coli / pFEX3052.
  • FIG. 23 is a diagram showing an SDS-PAGE observation result of rNOX purified from E. coli / pFNEX4105.
  • FIG. 24 is a view showing the time course of conversion of L-fucitol using FcDH and NOX purified from G. oxydans.
  • FIG. 25 shows the time course of conversion of L-fucitol using rFcDH and rNOX prepared from recombinant E. col beams.
  • FIG. 26 is a diagram showing the time course of conversion of L-fucitol by a recombinant E. coli intatocell.
  • FIG. 27 is a view showing the time course of conversion of L-fucitol in the presence of catalase.
  • L-fucrose is produced using a microorganism-derived protein having a dehydrogenase activity for producing L-fucose from L-fucitol.
  • a microorganism-derived protein having a dehydrogenase activity for producing L-fucose from L-fucitol As will be described in detail in the following examples, the present inventors have found that, in a microorganism, a protein having an activity of generating L-fucitol power L-fuculose and an activity of generating L-fucitol power of a ketohexose other than L-fuculose It has been found that a protein having and exists separately.
  • a protein having an activity of producing L-fuculose with L-fuculose activity and a predetermined microbial activity the production of by-products other than L-fucrose can be reduced or eliminated.
  • it is a protein derived from microorganisms, it is easier to handle such as isolation and purification than proteins derived from cells such as plants and animals, and heterologous recombination in microorganisms for mass production of enzymes. Even when considering large-scale expression, it is advantageous in terms of compatibility with the host. Cultivation of microorganisms is easier than cultivation of plant and animal cells, and it is also easy to obtain sufficient amounts for industrial production.
  • the present inventors specified the amino acid sequence and the nucleotide sequence of the protein isolated from Gluconobacter oxydans.
  • L-fucitol can easily be obtained from L-galactose, which is an inexpensive raw material. Therefore, the method for producing L-fucrose of the present invention can reduce costs and is advantageous for industrial production.
  • the method for obtaining D-galactose power L-fucitol is described, for example, in Non-Patent Document 1 and the like.
  • the protein to be used may be a protein derived from a microorganism and having a dehydrogenase activity that generates L-fucitol power.
  • microorganisms include prokaryotic microorganisms, eukaryotic microorganisms and viruses, but do not include plant cells containing algae.
  • Microorganisms from which such proteins can be obtained include, for example, acetic acid bacteria. More specifically, the acetic acid bacteria include bacteria belonging to the genus Darconobacter and genus Acetobacter, and more specifically, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter frateurii, Gluconobacter oxydans, and Gluconobacter frateurii.
  • Acetobacter 'Melanogenes (Acetobacter melanogenus), Gunorekonono Kuta one roseus (Gluconobacter roseus), Gunorekonono Kuta ⁇ ⁇ Serinasu (Gluconobacter cerinus), Darukonobakuta ⁇ ⁇ ⁇ Okishidansu-Sabusupishi ⁇ 's, 'Sabuo 3 r Ngunsu (tjluconoDacter oxydans suosp.
  • the microorganisms may be cultured and propagated in an appropriate medium depending on the type.
  • the medium for this purpose is not particularly limited as long as the microorganism can grow, and may be a normal medium containing normal carbon sources, nitrogen sources, phosphorus sources, sulfur sources, inorganic ions, and, if necessary, organic nutrient sources. ⁇ .
  • any of the above microorganisms can be used, and specific examples thereof include sugars such as glucose, fructose, maltose, and amylose; alcohols such as sorbitol, ethanol, and glycerol; Organic acids such as fumaric acid, citric acid, acetic acid, and propionic acid, salts thereof, hydrocarbons such as noraffin, and mixtures thereof can be used.
  • sugars such as glucose, fructose, maltose, and amylose
  • alcohols such as sorbitol, ethanol, and glycerol
  • Organic acids such as fumaric acid, citric acid, acetic acid, and propionic acid, salts thereof, hydrocarbons such as noraffin, and mixtures thereof can be used.
  • Examples of the nitrogen source include ammonium salts of inorganic acids such as ammonium sulfate and ammonium chloride, ammonium salts of organic acids such as ammonium fumarate and ammonium citrate, sodium nitrate, and potassium nitrate.
  • ammonium salts of inorganic acids such as ammonium sulfate and ammonium chloride
  • ammonium salts of organic acids such as ammonium fumarate and ammonium citrate, sodium nitrate, and potassium nitrate.
  • Nitrate, peptone, yeast extract, meat extract, organic nitrogen compounds such as corn steep liquor, and mixtures thereof can be used.
  • nutrients used in ordinary culture media such as inorganic salts, trace metal salts, and vitamins, can be appropriately mixed and used.
  • the culture can be performed for about 12 to 70 hours while appropriately controlling the pH and temperature in the range of 40 ° C. Yes.
  • Purification of a protein derived from a microorganism includes all conventional methods usually used for purifying a protein, such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration, ion-exchange chromatography, and water-phobic chromatography. Can be adopted. When purifying, use the cell extract as the starting material.If uncrushed or unlysed bacterial residues are present, the lysate is centrifuged again to precipitate. Removing residues is more advantageous for purification
  • L-Fucitol Power L-Fucose can be produced from L-fucitol using a microorganism-derived protein having a dehydrogenase activity that produces L-fucrose by contacting L-fucitol with the above-mentioned microorganism-derived protein in a medium.
  • L-fucitol and a purified protein derived from the above microorganism may be added to a buffer solution or the like to cause a reaction.
  • the time such as pH, temperature, reaction time, and amount of enzyme added may be appropriately changed depending on the type of the protein derived from the microorganism.
  • the pH is preferably 5-11, more preferably 7-10.
  • the temperature is preferably 20-50. C, more preferably 25-40. C.
  • a method using a microorganism, a culture of the microorganism, or a treated product of the microorganism will be described.
  • a microorganism having the above-mentioned microorganism-derived protein, a culture thereof, or a treated product of a microorganism can also be used.
  • the microorganism may also have the ability to produce ketohexoses other than L-fuculose (hereinafter, also referred to as by-products!). It is preferable to use a small number.
  • microorganisms satisfying the above conditions (i) and (ii) preferably include, for example, Darconobacter xylinus subspecies.
  • Xylinas and darconobacter oxydance, etc. and more preferably Darconobacter xylinas subspecies.
  • Examples include the 'Xylinus ATCC53582 strain, the ATCC23767 strain, and the Dalconobacter oxydans IFO 3189 strain, and more preferably, the Dalconobacter xylinus'Subspaces' xylinas ATCC53582 strain.
  • These microorganisms are microorganisms which do not substantially produce ketohexoses other than L-fuculose without the genetic manipulation as described below!
  • a preferred embodiment of the present invention provides, as another embodiment, a protein having a dehydrogenase activity that also produces L-fucitol and also has an ability to produce a ketohexose other than L-fucose from L-fucitol.
  • a non-genetically engineered microorganism or the like having substantially no E. coli is used.
  • the phrase “substantially has no” means that the amount of by-products is below the detection limit under the conditions shown in Example 1 below, and specifically when the amount is about ImM or below.
  • genetically modified microorganism refers to a microorganism whose gene has been artificially manipulated using a genetic engineering technique, and does not include a mutant that has occurred in the natural world.
  • Non-genetically modified microorganisms are those that are not genetically modified microorganisms.
  • a culture of a microorganism is a product obtained by culturing a microorganism, and more specifically, is produced by a microorganism cell, a medium used for culturing the microorganism, and a cultured microorganism. Mixture, and also the supernatant thereof.
  • the treated cell refers to a cell obtained by subjecting a cell of a microorganism, that is, a cell of the microorganism, to some kind of artificial operation.
  • a treated cell may be obtained by crushing, lysing, and freeze-drying the cell.
  • the processed cells include a crude protein recovered by processing cells and the like, and a purified protein that is further purified.
  • a partially purified protein obtained by various purification methods or the like may be used, or a protein obtained by immobilizing the protein by a covalent bonding method, an adsorption method, an inclusive method, or the like may be used. .
  • the processed bacterial cells include those in which the cell contents of the microbial cells are mixed. Therefore, when using the processed bacterial cells, by-products may be generated.
  • processed bacterial cells use micro-organisms that have the ability to make L-fucrose production amount 50% by weight or more of L-fucitol acid chloride. Is preferred.
  • a protein having an activity of producing microbial power L-fucitol L-fuculose is sufficiently purified and this purified protein is used, the microorganism is merely an origin and, as already described above, Is not limited by its ability to produce by-products.
  • a microorganism-derived protein having L-fucose-forming activity such as adding L-fucitol into a culture of the microorganism, uses L-fucitol as a substrate.
  • the reaction may be carried out as follows.
  • the treated bacterial cell is used, the treated bacterial cell is mixed with L-fucitol so that the reaction of L-fucitol-producing protein derived from microorganisms using L-fucitol as a substrate is performed.
  • a reaction system should be constructed according to a reaction system using enzymes, bioactive substances, and the like!
  • a form using a microorganism having a first protein having L-fucrose-forming activity and having a disrupted gene encoding a second protein having an activity of producing by-products You. Even microorganisms that originally produce by-products can be transformed into microorganisms suitable for the production of L-fucrose by disrupting enzyme genes and other factors that cause by-products. It is possible to produce L-fuculose with high efficiency.
  • Gene disruption means that a gene of a target protein is modified to reduce or lose the original function of the protein.
  • a gene refers to a medium that encodes genetic information, and examples of the medium include polynucleotides such as DNA, RNA, and hybrid or chimeric molecules thereof.
  • Gene disruption includes, for example, introducing mutations such as deletion, substitution, insertion and inversion to alter the protein itself, and inhibiting the expression of the protein by inhibiting transcription and translation. Methods are included.
  • the method for disrupting the gene! / ⁇ There is no particular limitation on the method for disrupting the gene! / ⁇ . Examples of how to disrupt genes
  • the gene may be mutated or the gene may be deleted. Inactivation of the gene can be achieved by UV irradiation or-
  • N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
  • mutagenesis site-directed mutagenesis, homologous recombination, or insertion-deletion mutagenesis, also known as Red-driven integration (Datsenko KA and Wanner B ⁇ ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, Vol. 97, No. 12, p6640-45).
  • a DNA containing a deleted gene (part of a recombinant gene, which has been deleted so that a part of the target gene has been deleted so as not to produce a normally functioning peptidase) ) Is prepared.
  • the microorganism deficient in the peptidase gene on the chromosome can be transformed. can get.
  • a protein other than L-fucitol capella and other L-fuculose, which has a high activity of producing ketohexose is preferable.
  • a dehydrogenase which does not substantially have the ability to produce hexose from L-fucitol to a keto other than L-fucrose, and produces L-fucitol-luca L-fucrose
  • a microorganism or the like transformed so as to express a first protein derived from a microorganism having activity.
  • a microorganism suitable for the production of L-fuculose can be obtained by producing a transformant into which a gene has been introduced so as to express such a protein, even if it does not originally possess a protein having L-fuculose-forming activity. be able to.
  • a microorganism which does not generate a by-product and can efficiently produce L-fucrose can be easily obtained by selecting a transformant which does not originally have the ability to generate a by-product.
  • Microorganisms that do not substantially have the ability to produce ketohexoses other than L-fucitol power L-fuculose include those that originally do not have such ability, but that do not have the ability to produce ketohexose.
  • a microorganism in which a gene encoding a protein having an activity of producing hexose has been disrupted can also be used. Proteins targeted for gene disruption In the same manner as described above, for example, a protein having an activity of generating D-xylulose as D-arabitol force can also be mentioned.
  • Transformants can be prepared according to a standard method.
  • a transformant can be obtained as follows.
  • the above-mentioned microbial activity also obtains a target protein such as a protein having L-fucose-forming activity, and determines the amino acid sequence of the purified target protein.
  • the amino acid sequence can be determined using the Edman method (Edman, P., Acta Chem. Scand. 4, 227 (1950)).
  • the amino acid sequence can be determined using a sequencer manufactured by Applied Biosystems.
  • An N-terminal amino acid sequence of the purified protein is also determined to have 30 residues, and the nucleotide sequence of the DNA encoding the amino acid sequence can be deduced based on the apparent amino acid sequence.
  • a universal sardine is used.
  • a DNA molecule of about 30 base pairs is synthesized. Methods for synthesizing DNA molecules are disclosed in Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981).
  • a DNA molecule can be synthesized using a synthesizer manufactured by Applied Biosystems. The DNA molecule synthesized in this manner can be used as a probe when isolating the full length DNA encoding the target protein from a chromosomal gene library of a microorganism.
  • a DNA encoding the target protein is used as a primer when amplifying by PCR.
  • a method for determining the base sequence of the DNA encoding the isolated target protein is described in A Practical uuiae to Molecular loning, John Wiley & 3 ⁇ 4ons, Inc. (1985).
  • the nucleotide sequence can be determined using a DNA sequencer manufactured by Applied Biosystems.
  • the DNA isolated as described above may be introduced into a host cell. That is, the isolated DNA is incorporated into an expression vector that can be expressed in a host cell, and this is introduced into the host cell.
  • bacterial cells When a protein is mass-produced using recombinant DNA technology, bacterial cells, actinomycete cells, yeast cells, mold cells, plant cells, animal cells, and the like can be used as transformed host cells.
  • intestinal bacteria preferably E. coli (Escherichia coli) and the like are suitable. This is because there is a lot of knowledge about technology for mass-producing proteins using intestinal bacteria such as Escherichia coli.
  • a method for producing the introduced protein using the transformed E. coli will be described.
  • promoters that are usually used for the production of heterologous proteins in Escherichia coli can be used.
  • T7 promoter lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter
  • strong promoters such as the promoter, the P promoter of lambda phage, and the P promoter.
  • the codon reading frames should be matched. Either ligate at an appropriate restriction site or use synthetic DNA with an appropriate sequence.
  • a terminator which is a transcription termination sequence, downstream of the protein gene.
  • the terminator include a T7 terminator, an fd phage terminator, a T4 terminator, a terminator for a tetracycline resistance gene, and a terminator for an Escherichia coli trpA gene.
  • a so-called multicopy type is preferable, and a plasmid having a replication origin derived from ColEl, such as a pUC-based plasmid or a pBR322-based plasmid is preferred.
  • Plasmids! / ⁇ include their derivatives.
  • the “derivative” means a plasmid obtained by modifying a plasmid by substitution, deletion, insertion, addition of base, Z or inversion, or the like.
  • the modification referred to here is It also includes modification by mutagenesis by UV irradiation or the like, or modification by spontaneous mutation. More specifically, as the vector, if f columns, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299
  • phage DNA and transposon DNA vectors can be used.
  • the vector has an advantage such as an ampicillin resistance gene.
  • plasmids are commercially available expression vectors having a strong promoter, Ru (P UC system (manufactured by Takara Shuzo (Ltd.)), PPROK system (manufactured by Clone Tetsu h), Ho pKK233-2 (Clontech) Power ).
  • a gene encoding a promoter, a peptide-forming enzyme or a fusion protein of a peptide-forming enzyme and another protein, a DNA fragment linked in the order of a terminator, and a vector DNA are linked to obtain a thread-recombinant DNA.
  • Escherichia coli is transformed with the obtained recombinant DNA, and the Escherichia coli is cultured, whereby the target protein is expressed and produced.
  • a strain that is commonly used for expressing a heterologous gene can be used as the host to be transformed.
  • Escherichia coli 'MJ109 strain which is a kind of Escherichia coli K12 subsp., Is preferable.
  • Method of performing transformation, and methods of the transformants selected ⁇ 1 J is Molecular Cloning, 2nd edition, are described in Cold bpnng Harbor press (1989), or the like.
  • a production medium a medium usually used for culturing Escherichia coli, such as an M9-amino acid medium or an LB medium, may be used. Culture conditions and production induction conditions are appropriately selected depending on the type of the vector marker, promoter, host bacterium and the like used.
  • the target protein can be recovered by the same method as the above-described separation and purification of the protein.
  • L-Fucitol power Even when a microorganism that produces by-products other than L-fucrose is used, industrial reaction can be achieved by performing an oxidation reaction of L-fucitol under conditions that suppress the production of by-products.
  • the production method of L-fucrose can be endured as a simple production method.
  • adjust the pH conditions For example, a technique such as adding an inhibitor that selectively inhibits an enzyme can be used.
  • a by-product generation inhibitor may be added to the reaction system. It is desirable that the inhibitor does not inhibit the production of L-fuculose from L-fucitol at all, but any inhibitor can be used as long as it can produce L-fuculose sufficiently compared to the production of by-products.
  • the by-product generation inhibitor include a divalent ion chelating agent and the like, and preferably, EDTA (ethylenediaminetetraacetate) and the like.
  • L-fuculose which produces L-fuculose from L-fucitol in the presence of a protein having an activity to regenerate NAD from NADH converted from NAD during L-fuculose production, A manufacturing method is provided. By using a reaction system to which NAD is supplied, continuous and efficient production of L-fucrose is possible, which is extremely advantageous for industrial production.
  • a protein having an activity of producing NAD from NADH may be present in a microorganism having the ability to produce L-fucose from L-fucitol.
  • the microorganism or a microorganism of the microorganism may be present. What is necessary is just to add the body treatment product to the reaction system.
  • a protein having this activity should be added.
  • Many dehydrogenases have the activity to produce NADH capra NAD, and the reduction activity of these dehydrogenases may be used.In this case, since NADH is used as a coenzyme, reaction Must also be added together.
  • oxidase or peroxidase that oxidizes NADH to NAD can also be used.
  • the substrate required for the reaction is oxygen; for peroxidase, it is hydrogen peroxide.
  • the reaction solution can be easily supplied into the reaction solution by stirring or the like, and even in the latter case, hydrogen peroxide is very inexpensive and advantageous in terms of cost. .
  • Known oxidases and peroxidases can be used, and commercial products also exist.
  • an L-fucose producing step for producing L-fuculose according to the method for producing L-fucose of the present invention, and an L-fucose producing L-fucose from L-fucrose.
  • a generation step Each of the above steps may be performed in a separate reaction system or in the same reaction system.
  • L-fucitol which is a raw material for L-fucrose, can easily obtain the inexpensive material strength of D-galactose, and the method of the present invention is simple, so that the L-fucose of the present invention is simple. Is an industrially superior method that is simple and can reduce costs.
  • the L-fuculose producing step is as described in the section "1. Method for producing L-fuculose" above.
  • the above-described various embodiments can be adopted also in the method for producing L-fuculose of the present invention.
  • L-fucose generation step A method for producing L-fucose from L-fucrose is disclosed in Patent Document 5, for example. More specifically, L-fucose is preferably obtained using L-fucose isomerase. L-fucose isomerase is registered in the database of the National Center for Biotechnology Information, for example.
  • a microorganism transformed to express L-fucose isomerase may be produced to produce L-fucose isomerase, and L-fucose isomerase may be isolated and used.
  • a microorganism transformed to express L-fucose isomerase or a cell treated product of this microorganism may be used. Preparation of transformant Can be carried out in the same manner as the method described in the section of “11. Embodiment Using Genetically Engineered Strain”.
  • a co-expressor is produced and used to produce L-fucitol and L-fucose in one reaction system.
  • L-fucitol has substantially no ability to generate ketohexoses other than L-fucose
  • L-fucitol has a microorganism-derived protein having dehydrogenase activity to generate L-fuculose
  • L-fucrose also has L-fucose.
  • L-fucitol power L-fucose is produced in the presence of at least one of a microorganism which has been transformed so as to be capable of expressing a protein having a producing activity and a processed product of the microorganism.
  • the protein of the above (A) can be isolated from Gluconobacter oxydans IFO 3255 and the like.
  • the protein of the present invention includes a protein substantially the same as (A), and specifically corresponds to the protein power of (B). Further, substantially the same protein can be isolated from each strain described in Table 1.
  • the protein or the like of the present invention specified by the above sequence is not limited to its isolated origin.
  • a transformed microorganism or the like can be prepared using a gene recombination technique based on the above sequence to produce the above protein.
  • “several” differs depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but is within a range that does not significantly impair the three-dimensional structure and activity of the amino acid residue in the protein. Specifically, the number is 2 to 100, preferably 2 to 50, more preferably 2 to 30 and more preferably 2 to 10.
  • an amino acid sequence containing one or several mutations of one or several amino acids selected from the group consisting of one or several substitutions, deletions, insertions, additions and inversions in the amino acid sequence of the protein are selected from the group consisting of one or several substitutions, deletions, insertions, additions and inversions in the amino acid sequence of the protein.
  • the protein of (A) at 30 ° C and pH 9.5, at least about half, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, and particularly preferably at least 95%. It is desirable to have.
  • Amino acid mutations such as those shown in (B) above are such that amino acids at specific sites in the gene encoding the present protein are substituted, deleted, inserted, added, etc. by, for example, site-directed mutagenesis.
  • site-directed mutagenesis By modifying the base sequence.
  • the polypeptide having the modified base sequence as described above can be obtained by a conventionally known mutation treatment.
  • Examples of the mutation treatment include a method in which DNA encoding (A) is treated in vitro with hydroxylamine or the like, and a method for bacterium belonging to the genus Escherichia harboring DNA encoding (A) is performed by ultraviolet irradiation or N-methyl-N'- Examples include a method of treating with a mutagen that is commonly used for artificial mutation, such as -tro-tosoguanidine (NTG) or nitrite.
  • NTG -tro-tosoguanidine
  • mutations such as amino acid substitution, deletion, insertion, addition, and inversion caused by base modification as described above also include naturally occurring mutations such as differences among microorganism species or strains.
  • a DNA encoding a protein substantially identical to the protein represented by SEQ ID NO: 16 can be obtained.
  • Examples of the polynucleotide encoding the protein used in the production method of the present invention include a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. Due to codon degeneracy, there can be a plurality of base sequences that define one amino acid sequence. That is, the polynucleotide of the present invention includes a polynucleotide having a base sequence encoding the following protein.
  • A a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16
  • B the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, which has an amino acid sequence containing one or several amino acid mutations selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion, and L-fucitol Having a protein having dehydrogenase activity to produce L-fucrose from yeast
  • the base sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16 is exemplified. Further, the following polynucleotides may be mentioned as polynucleotides substantially identical to the DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 15. A polynucleotide or a nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 from a polynucleotide encoding a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or a cell carrying the same.
  • SEQ ID NO: 15 by isolating a polynucleotide encoding a protein having an activity having a dehydrogenase activity that hybridizes under stringent conditions with a probe prepared from L-Fucitol and generates L-fuculose from L-fucitol.
  • a polynucleotide substantially identical to the polynucleotide having the described base sequence is obtained.
  • polynucleotide of the present invention include the following polynucleotides (a) and (b).
  • the probe can be prepared by a standard method based on, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15. Further, a method of preparing a polynucleotide that hybridizes with the probe using a probe and isolating the target polynucleotide may be performed according to a standard method. For example, a DNA probe can be prepared by amplifying a base sequence cloned into a plasmid or a phage vector, cutting out a base sequence to be used as a probe with a restriction enzyme, and extracting the base sequence. Excision point can be adjusted according to the target DNA
  • stringent conditions means that a so-called specific hybrid is formed, The conditions must be met before non-specific hybrids are formed. Although it is difficult to clearly express this condition in terms of numerical values, for example, DNAs with high homology, for example, 50% or more, more preferably 80% or more, further preferably 90% or more, particularly preferably DNA hybrids with 95% or more homology will hybridize, and DNAs with lower homology will not hybridize! /, Or under the condition of washing ordinary Southern hybridizations! 60 ° C, 1 X SSC that, 0. 1 0/0 SDS, or preferably ⁇ , 0. 1 X SSC, 0. 1 0/0 SDS to Ne th person to Roh at a salt concentration include Iburidizu conditions . Some of the genes that hybridize under these conditions include those with a stop codon in the middle or those that have lost their activity due to mutations in the active center. The enzyme can be easily removed by measuring the enzyme activity of the expression product by the method described in the Examples below.
  • L-fucitol of about half or more, more preferably 80% or more, and even more preferably 90% or more of the protein having the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 retains the dehydrogenase activity to generate L-fucrose. It is desirable to encode a protein.
  • DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 is, for example, Gluconobacter oxydans IFO
  • PCR polymerase
  • Primers used for PCR can be designed based on, for example, an internal amino acid sequence determined based on a purified protein having peptide-forming activity.
  • a primer having a sequence corresponding to the 5 ′ untranslated region and the 3 ′ untranslated region is used as a PCR primer, the entire coding region of the present protein can be amplified.
  • the primers are synthesized by, for example, using a DNA synthesizer model 380B manufactured by Applied Biosystems and using a phosphoramidite method (see Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859). It can be synthesized according to the method.
  • the PCR reaction can be performed using, for example, Gene Amp PCR System 9600 (manufactured by PERKIN ELMER) and TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) according to the method specified by the supplier such as each manufacturer. .
  • a preferred embodiment of the method for producing fuculose of the present invention includes an embodiment in which NADH oxidase is added to a reaction system.
  • NADH oxidase is added to a reaction system.
  • Specific examples of the NAD oxidase used herein include the following proteins (C) and (D).
  • the protein of the above (C) can be isolated from Gluconobacter oxydans IFO 3255 and the like.
  • the protein of the present invention includes a protein substantially the same as (C), and specifically corresponds to the protein power of (D). Furthermore, it may be possible to isolate substantially the same protein from each of the strains listed in Table 1.
  • Examples of the polynucleotide encoding the protein used in the production method of the present invention include a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. Due to codon degeneracy, there can be a plurality of base sequences that define one amino acid sequence. That is, the polynucleotide of the present invention includes a polynucleotide having a base sequence encoding the following protein. Leotide.
  • the polynucleotide of the present invention is preferably, for example, a polynucleotide shown in the following (c) or (d).
  • a recombinant in which the above polynucleotide is incorporated alone may be prepared, or "L fusitol power" L-fuculose-producing protein having dehydrogenase activity "together with a polynucleotide encoding the same.
  • a transformant expressing the above NADH oxidase and a transformant expressing a protein having a dehydrogenase activity producing L-fucitol capella and L-fuculose are separately prepared.
  • dehydrogenase, NADH oxidase, and NAD need to be present in the same reaction field, and the produced enzyme is required.
  • dehydrogenase, NADH oxidase, and NAD need to be present in the same reaction field, and the produced enzyme is required.
  • an enzymatic reaction using DNA or a treated cell with disrupted cell membrane produce dehydrogenase and NADH oxidase in separate hosts.
  • untreated cells are used as a catalyst, it is desirable to co-express both enzymes in the same host.
  • Example 1 Search for microorganisms that produce L-foculose by oxidizing L-focitol 1
  • Acetobacter strains refreshed by culturing on YPG agar medium (10 g / 1 glycerol, 0.3 g / 1 yeast extract, 0.3 g / 1 peptone, 20 g / 1 agar, pH 6.5) at 30 ° C for 18-66 hours was sterilized in an autoclave at 120 ° C for 20 minutes.10 g / 1 (61 mM) L-fuccitonol, 10 g / 1 glycerol, 3 g / 1 yeast extract, 3 g / 1 peptone, 20 g / i ,
  • L-fucose was eluted at an analysis time of about 7.6 minutes
  • L-fucitol was eluted at an analysis time of about 11.9 minutes
  • L-fucose was eluted at an analysis time of about 13.6 minutes.
  • the elution position was confirmed and the concentration in the analytical sample was calculated using a commercial product manufactured by Sigma as a standard compound. Since a commercially available L-fucose standard cannot be obtained, a substance that also produces L-fucose power by L-fucose isomerase, which will be described in detail below, was considered as L-fuculose.
  • the sum of the integrated values (peak area values) of both peaks on the chart of the residual L-fucose and the generated L-fucrose is L-fuco Since the peak area value of L-fuculose per unit concentration was assumed to be the same as that of the same L-fucose, the concentration of L-fuculose in the analytical sample was calculated because it remained almost unchanged before and after the action of sucrose isomerase. .
  • the detection limit is about 1 mM in the case of the analysis in the following examples. In many analyses, an unidentified peak, which is considered to be a conversion product derived from L-fucitol based on the size of the peak area, was observed at an analysis time of about 8.0 minutes.
  • BP concentration of the unidentified substance
  • BP concentration of the unidentified substance
  • Table 1 shows the analysis results.
  • Gluconobacter may be abbreviated as “ni”
  • Acetobacter may be abbreviated as “A.”.
  • YP-dulcitol agar medium (10 g / 1 dulcitol, 0.3 g / 1 yeast extract, 0.3 g / 1 peptone, etc.) was used to induce the expression of L-fucitol oxidase by dulcitol, which has a similar structure to L-fucitol.
  • Examples 1 and 2 there is a genus Gluconobacter that produces L-fuculose from L-fucitol as a raw material! /, The ability to detect a plurality of acetic acid bacteria belonging to the genus Acetobacter. Most of them produced BPs other than L-fuculose at the same time, and the only microorganism that produced only L-fuculose was only one strain of the ATCC53582 strain of Darconobacter xylinus subsp. Xylinus (Gluconobacter xylinus subsp.
  • Example 3 Identification of substance assumed to be L-fuculose by HPLC analysis
  • L-fucose isomer Bioassay was studied using L-focose isomerase.
  • L-Fucose isomerase (EC 5.3.1.3. Hereinafter, referred to as "FucI”) is an enzyme that catalyzes the isomerization between L-fucose and L-fucose (L- foC0se ). It was thought that if the compound assumed to be L-fucrose was L-fucrose, it would be converted to L-fucose by the addition of fuel. There is a commercially available L-fucose (for example, manufactured by Sigma), and HPLC analysis using this as a standard compound or colorimetric determination using L-focose dehydrogenase described in Japanese Patent No. 3132913 can be performed. It is possible.
  • Fuel was prepared as follows. Fuel is derived from E. coli strain K12. This yeast is registered as Accession number AAC75844 strain in the National Institute for Biotechnology Information. In order to express this enzyme in large amounts in E. coli and to facilitate purification, in order to insert a histidine tag at the N-terminus of Fuel, QIAGEN We decided to use PQE30, which is more commercially available. To insert the Fuel gene (foci) between Sphl and Hindlll sites in the multicloning site of pQE30, the following PCR primer 1 (SEQ ID NO: 1) and PCR primer 2 (SEQ ID NO: 2) were prepared and PCR was performed using the obtained genomic DNA derived from E.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 2 PCR primer 2
  • coli W3110 as a template to obtain a fragment of about 1.8 kbp length.
  • This fragment and the pQE30 vector were digested with Sphl and Hindlll, purified, and ligated to prepare a plasmid pQE30FucIH6 for expressing a Fuel protein having a His-Tag sequence at the N-terminus (hereinafter, referred to as FucIH6).
  • the entire nucleotide sequence of fodH6 formed by the gene encoded on this plasmid and the predicted amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively.
  • E. coli JM109 strain was transformed to prepare FucIH6-expressing strain E. coli _JM109 / pQE30FucIH6.
  • the strain was cultured at 37 ° C in LB medium, and when the absorbance at 600 nm of the culture broth reached approximately 0.4 during the culture, fodH6 expression was induced by adding 1 mM IPTG to a final concentration of 1 mM. Was done. After culturing was continued for 2 hours after the induction, the obtained culture solution was collected by centrifugation, and the obtained cells were washed with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0). The washed cells obtained were disrupted by sonication at 200 W for 10 minutes. The solution was used.
  • a final concentration of 10 mM Imidazole and 0.3 M NaCl are added to this crude enzyme solution, respectively, and 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM Imidazole, 0.3 M NaCl (this is called buffer solution W)
  • the protein was mixed with 1 ml of Ni-NTA resin (manufactured by QIAGEN) equilibrated in step 1 and shaken overnight to bind the protein having the His-Tag sequence to the resin. After shaking, the resin was recovered by centrifugation. The resin was washed several times with buffer solution W, and then transferred to the column. Next, the adsorbed protein was eluted from the resin with 0.2 M Imidazole. The eluted fraction obtained was dialyzed against 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM 2-mercaptoethanoU 0.1 mM MnCl, and, if necessary, concentrated.
  • the obtained culture solution was centrifuged to remove cells, and an equal volume of 0.2 M potassium phosphate buffer was added.
  • SEQ ID NO: 1 5 'primer base sequence for obtaining foci gene
  • SEQ ID NO: 2 Base sequence of 3 'primer for obtaining fticl gene
  • Example 4 L-Fucitol conversion by Fuel-expressing acetic acid bacteria
  • Example 3 showed that L-fucose could be produced from L-fucitol by acetic acid bacteria and L-fucose could be converted to L-fucose using Fuel.
  • the production of L-fucose using L-fucitol as a raw material the production of L-fucose from L-fucitol and the production of L-fucose from L-fucose can be performed separately as in Example 3.
  • the fact that the same reaction can be performed at the same time is advantageous in terms of actual production, because the process can be simplified.
  • the acetic acid bacterium itself is also transformed into L-fucose. It was considered that if the exchange rate could be maintained, it would be possible to produce L-fucitol-potential L-fucose by a single strain, which was an advantageous method.
  • G. oxydans capable of producing L-fuculose from L-fucitol
  • a strain expressing E. coli-derived Fuel will be constructed on behalf of the IF03171 strain.
  • Examples of specific protein expression systems in acetic acid bacteria include, for example, Biosci. Biotechnol.
  • a gene fragment encoding the full-length Fuel derived from E. coli was obtained by PCR in the same manner as described in Example 3, and this was inserted into the multicloning site of pSA to obtain the Fuel expression plasmid pSA19Fud for acetic acid bacteria. Created. However, unlike in Example 3, His-Tag was not inserted into Fuel, and wild-type Fuel was expressed, and SEQ ID NOS: 5 and 6 were described as primers used for PCR closing from E. coli. Was used. As a result, the expected amino acid sequence of the expressed Fuel and the foci gene inserted on pSA19FucI are the same as those of the wild-type enzyme. The method for transforming the G. oxydans IF03171 strain with the obtained pSA19FucI was also performed with reference to the above-mentioned literature.
  • SEQ ID NO: 5 Base sequence of 5 'primer for obtaining fod gene
  • SEQ ID NO: 6 Base sequence of 3 'primer for obtaining fod gene
  • Example 5 Attempt to reduce by-products (BP) during L-fucose production with L-fucitol power 1; Control of reaction pH
  • reaction pH was investigated in order to suppress the production of BP, which is a problem in L-fucose production from L-fucitol.
  • G. oxydans IF03255, G. oxydans IF03171, G. roseus AJ2840 and A. turbidans AJ2908 were used as test strains.
  • Liquid consisting of sterilized 10 g / 1 glycerol, 10 g / 1 L-fucitol, 0.3 g / 1 yeast extract, 0.3 g / 1 peptone, 20 g / 1 CaCO 2, pH 6.5, sterilized strain refreshed on YPG agar medium
  • 10 g / 1 glycerol 10 g / 1 L-fucitol
  • 0.3 g / 1 yeast extract 0.3 g / 1 peptone
  • 20 g / 1 CaCO 2 pH 6.5
  • the cells were seeded and cultured in a test tube at 30 ° C for 42 hours. Dispense 1 ml each of the obtained culture solution, obtain cells by centrifugation, and then use 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.0), 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), or Washing was performed using 0.1 M glycine NaOH buffer (pH 8.8). Resuspend the washed cells in 0.5 ml of each washing solution, add L-fucitol to a final concentration of 10 g / 1, and incubate at 30 ° C for 66 hours using a 96-well microplate with a volume of 2 ml per 1 ⁇ l. I let it. After the reaction, the cells were removed from the reaction solution by centrifugation, and the supernatant was analyzed by HPLC. Figure 3 shows the analysis results. In the figure, NT indicates that the experiment was not performed.
  • Example 6 Attempt to reduce by-product (BP) during production of L-fuculose from L-fucitol 2;
  • G. oxydans IF03255 strain was used as the test strain.
  • the plate was washed with a 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.0). 0.5 ml of washed cells Resuspend in the same buffer, add L fucitol to a final concentration of 10 g / 1, and EDTA or MgCl to a final concentration of 10 mM, and use a 96-well microplate with a volume of 2 ml per well.
  • a 0.1 M potassium phosphate buffer pH 6.0.
  • the reaction was performed at 30 ° C for 90 hours. After the reaction, the cells are removed from the reaction solution by centrifugation, and the supernatant is removed.
  • Example 7 Attempt to reduce by-product (BP) during L-fucrose production due to L-fucitol power 3; disruption of sldA gene
  • D-arabitol dehydrogenase is deficient to drastically reduce BP production. Thought it could be eliminated. Based on this hypothesis, we attempted to create a strain deficient in the D-arabitol dehydrogenase described above.
  • D-arabitol dehydrogenase present on the cell membrane is sometimes referred to by another name such as glycerol dehydrogenase or D-sorbitol dehydrogenase because of its wide substrate specificity.
  • glycerol dehydrogenase or D-sorbitol dehydrogenase because of its wide substrate specificity.
  • D-sorbitol dehydrogenase it is called D-sorbitol dehydrogenase, and its gene cloning and nucleotide sequence are determined.
  • the gene encoding the catalytic subunit of D-arabitol dehydrogenase is hereinafter referred to as sldA, and the encoded protein is referred to as SldA.
  • a method for creating an SldA-deficient strain a method is used in which a DNA fragment lacking the internal partial sequence of sldA is created, introduced into acetic acid bacteria, and homologously recombined with sldA on chromosomal DNA by homologous recombination. I decided.
  • the kanamycin resistance gene Kmr was introduced simultaneously with the deletion of the internal sequence deletion fragment of sldA, and growth on a kanamycin-containing medium was performed. Mutants were easily detected.
  • the fragment containing the internal sequence of sldA was prepared using primers shown in SEQ ID NOs: 7 and 8 (having Kpnl and Pstl recognition sites, respectively). Obtained by PCR.
  • the template includes genomic DNA prepared from the Gluconobacter oxydans IF03255 strain, for which the base sequence of sldA has been reported, as well as the force that may be derived from the high homology of the sequence, dalconobacter oxydans (
  • a fragment obtained by PCR using acetic acid bacteria genomic DNA as a template was digested and purified with Kpnl and Pstl, and also digested and purified with Kpnl and Pstl by a conventional method.
  • PUC18 (Takara Bio
  • An E. coli JM109 strain transformed with this plasmid was prepared, cultured, and then the plasmid was extracted and purified, digested with BamHU Bglll, and purified.
  • a fragment prepared by PCR from pHSG298 containing Kmr was ligated to obtain a novel plasmid.
  • the E. coli JM109 strain was transformed with this plasmid, and after culture, the plasmid was extracted and purified, and further digested and purified with Kpnl and Pstl to obtain a sldA partial sequence fragment into which the Kmr gene was inserted.
  • the Kmr gene-inserted sldA partial sequence fragment derived from each of the IF03255 and IF03171 strains was introduced into IF03255 and IF03171 strains, respectively, by electorifice poration (electrode spacing 0.5 mm, 14.0 kV / cm).
  • G. oxydans IF03255 sldA Kmr strain
  • G. oxydans IF03171 sldA Kmr strain were obtained by selecting strains capable of growing in E. coli.
  • FIG. 5 shows the analysis results.
  • WT indicates a wild strain
  • a SldA indicates a Slda gene-disrupted strain.
  • SEQ ID NO: 7 Base sequence of 5 'primer for obtaining internal sequence of sldA
  • SEQ ID NO: 8 Base sequence of 3 'primer for obtaining internal sequence of sldA
  • SEQ ID NO: 9 Base sequence of 5 'primer for obtaining Kmr gene
  • SEQ ID NO: 10 Base sequence of 3 'primer for obtaining Kmr gene
  • Example 8 Search for enzyme activity to generate L-fucitol with L-fucitol power 1
  • Example 7 it was shown that the enzyme that produces L-fucitol exists in addition to SldA in L-fucitol power, and therefore, it was decided to search for an enzyme activity that catalyzes this activity.
  • NAD (P) -dependent dehydrogenase was considered as a candidate for the enzyme.
  • NAD (P) -dependent dehydrogenases that catalyze the oxidation of L-fucitol include red algae; D-arabitol dehydrogenase zeka NAD from Gardieria sulphuraria. It is reported that L-fucitol is oxidized in a dependent manner (Planta 202: 487-493).
  • Example 9 L-Fucitol conversion reaction using acetic acid bacteria cell-free extract
  • Example 8 The cell-free extract obtained in Example 8 was used as an enzyme source, and the added amount was added to the reaction solution so that the final protein concentration became 0, 0.8, 1.6, or 4.0, and 10 g / 1 L fucitol, 0.1 M After standing at 30 ° C for 90 hours with Glycine-NaOH (pH 8.8), 0.03 mM FAD, 1 mg / ml BSA, and 2 mM NAD, the product was analyzed by HPLC.
  • Glycine-NaOH pH 8.8
  • 0.03 mM FAD 1 mg / ml BSA
  • 2 mM NAD the product was analyzed by HPLC.
  • NADH used Oxidase is an enzyme that produces NADH, molecular oxygen NAD, and hydrogen peroxide (derived from Bacillus liqueniformis, manufactured by Nacalai Tesque, Inc.). It was expected to be reused in fushitoru shidani.
  • the amount of added calo-NADH oxidase was 0.1 U / ml at the final concentration, and catalase at a final concentration of 10 U / ml was also added to consume the generated hydrogen peroxide. Table 5 shows the results.
  • L-fucose was produced in a small amount, and L-fucose isomerase activity, which produces L-fucose from L-fucose, was found in the cell-free extract.
  • the existence of enzymes such as L-fucitol oxidase was suggested.
  • the amount of L-fuculose produced exceeded the amount of added NAD, irrespective of the addition of NAD oxidase. This result was considered to suggest that the activity of converting NADH generated by NAD force due to the oxidation reaction into NAD again exists in the cell-free extract. This activity is considered to be, for example, NADH oxidase activity.
  • Example 10 NADH oxidase activity in cell-free extract of acetic acid bacteria
  • Example 9 since the presence of NADH oxidase activity (NADH oxidation activity) in the cell-free extract of acetic acid bacteria was suggested, detection of the enzyme activity was attempted.
  • NADH oxidation activity was detected at both pH 8.0 and 8.8. Measurements at pH 8.0 also showed that this activity was promoted by the addition of FAD. Many known NADH oxidase activities It has been reported that the activity expression depends on FAD.Therefore, NADH oxidase activity present in the extract used in this experiment is also carried by similar NADH oxidase. The possibility was shown.
  • Example 11 Determination of enzyme source cells and culture conditions for enzyme production
  • Refresh the stock strain by culturing it for 2 ⁇ at 30 ° C using YPG medium (3 g / 1 peptone, 3 g / 1 yeast extract, 1 g / 1 glycerol, pH 6.5) containing 20 g / 1 agar. I did it.
  • the refreshed cells were inoculated into a test tube containing 3 ml of each autoclaved medium, and cultured with shaking at 30 ° C for 24 or 66 hours. After completion of the culture, the cells were collected from 3 ml of the culture solution by centrifugation, washed with 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), and suspended by adding 0.3 ml of the same buffer. This was subjected to an ultrasonic crusher to crush the cells, and a centrifuged supernatant obtained by centrifugation at 200,000 ⁇ g for 30 minutes was obtained, which was used as a sample for enzyme activity measurement.
  • YPG medium 3 g / 1 peptone,
  • FcDH enzyme activity was measured under standard conditions; 0.2 M Gly-NaOH (pH 9.5), 1 mM
  • the measurement was performed three times in succession, and the measurement results were averaged, and are shown together with the standard deviation in the figure.
  • Table 7 shows the measurement results.
  • G. oxydans IFO 3255 was used as an FcDH-producing strain using the FcDH specific activity per unit protein amount and the amount of activity that also yielded a unit culture volume as an index.
  • the culture conditions were 10 g / 1 D-mannitol. , 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 peptone (pH 6.5), and a culture time of 24 hours.
  • G. oxydans IFO 3255 stocks were refreshed by culturing 2 ⁇ at 30 ° C on YPG agar medium. Each of the refreshed cells was autoclaved in A test tube containing 3 ml was inoculated and cultured with shaking at 30 ° C for 18 hours. This was further seeded in a 500 ml Sakaguchi flask containing 100 ml of the same autoclaved medium and seeded at 1% (v / v) and cultured at 30 ° C for 24 hours. After the completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, and the cells were washed with 25 mM Tris-HCl (pH 8.0).
  • Tris-HCl pH 8.0
  • 1.2 M (NH) SO 1.2 M
  • 1 mM MnCl were dialyzed.
  • FcDH eluted at an elution position estimated to have a molecular weight of 102 kDa.
  • the fraction containing FcDH activity was collected, concentrated, and the purity was confirmed by SDS-PAGE.
  • FcDH was recognized as a single band estimated to have a molecular weight of about 27 kDa (FIG. 6).
  • the specific activity of FcDH was increased 520-fold from 0.015 U / mg of the crude extract to 7.8 U / mg.
  • the amount of the purified FcDH obtained was 0.60 mg, and the activity recovery was 34% (Table 8).
  • G. oxydans IFO 3255 stocks were refreshed by culturing 2 ⁇ at 30 ° C on YPG agar medium.
  • the refreshed cells were inoculated into a test tube containing 3 ml of each autoclaved medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 18 hours. This was further seeded in a 500 ml Sakaguchi flask containing 100 ml of the same autoclaved medium and seeded at 1% (v / v) and cultured at 30 ° C for 24 hours. After the completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, and the cells were washed with 25 mM Tris-HCl (pH 8.0).
  • the fraction containing NOX activity was collected, concentrated, dialyzed against 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), concentrated, and equilibrated with the same buffer to obtain a 1.5 ml volume. This was supplied to FAD-agarose resin (Sigma). After thoroughly washing the non-adsorbed protein with the same buffer, the adsorbed protein was eluted with a buffer consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1 mM FAD. By this operation, NOX was specifically adsorbed on the resin and then eluted with a buffer containing FAD. The eluted fraction was collected, concentrated, and its purity was confirmed by SDS-PAGE. As a result, NOX was recognized as a single band estimated to have a molecular weight of about 15 kDa (Fig. 7).
  • the purified NOX solution was superdex 200 equilibrated with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0).
  • NOX eluted at the elution position estimated to have a molecular weight of 34 kDa.
  • a sample that had been purified by SDS-PAGE into a single band and further treated with Superdex 200 16/60 was used as a purified enzyme preparation.
  • the reaction was performed at 30 ° C with a solution consisting of 1.1 / z g / ml purified FcDH.
  • FIG. 9 shows the residual activity of FcDH at each pH at which the measuring power was also obtained, as a percentage of the residual activity at pH 7.2 at which the maximum stability was exhibited. At a pH of about 5 to 10, a residual activity of 80% or more was observed.
  • FcDH showed various sugar alcohol oxidizing activities in addition to L-fucitol, and the k / K value was D-arabitol> L-fucitol> xylitol> D-sorbitol cat m
  • FIG. 12 shows the results of measuring the specific activity of purified FcDH.
  • D-arabitol and L-fucitol substrate inhibition was observed at high substrate concentrations .
  • FIGS. 12 (C) and (D) show the results of (A) and (B), respectively, in a Lineweaver-Burk plot.
  • the K and k values were determined from the range where no inhibition of the substrate m cat was observed, that is, from the straight lines shown by broken lines in FIGS. 12 (C) and (D). Therefore, in the case of these substrates, k and K values were determined within a substrate concentration at which this inhibitory effect was not observed.
  • the oxidation product from L fucitol was L fucose, but the oxidation products of other substrates were examined.
  • the substrates used were D-arabitol, D-manitol and D-sorbitol, 0.5 g / dl substrate, 50 mM Gly-NaOH (pH 9.5), 1 mM NAD, 30 mM FAD, 5 mM MgCl, 0.6 U / ml
  • a reaction solution containing purified FcDH, 0.2 U / ml NOX, and 0.1 mg / ml catalase was reacted at 30 ° C. for 16 hours and analyzed by HPLC (FIG. 13).
  • D-rabbitol and D-Xylulose were produced from D-arabitol, and D-fructose was produced from D-mannitol.
  • D sorbitol identified a product that appeared to be L-Sorbose.
  • Example 15 Grasp of various properties of NOX
  • the residual activity of NOX at each pH obtained from the measurement is shown in FIG. 16 as a percentage of the residual activity at pH 8.8 at which the maximum stability was exhibited. At a pH of about 6 to 11, a residual activity of 80% or more was observed.
  • Purified NOX solution is incubated at 0, 25, 30, 37, 50 and 60 ° C for 30 min. After the incubation, NOX was diluted to a final concentration of 0.055 ⁇ g / ml, reacted under standard conditions, and the residual NOX activity was measured. The residual activity of NOX at each temperature at which the measurement power was also obtained is shown in FIG. 18 as a percentage of the residual activity when allowed to stand at 0 ° C. Up to 50 ° C, 80% or more of the remaining activity was observed.
  • the solution consisting of EDTA, DTT and purified NOX is placed on Tris-HC1 (pH 8.0), the solution containing purified NOX and various flavin coenzyme caps for 30 min on ice, and then NADH is added. Response has begun.
  • the flavin concentration in the reaction solution was adjusted to 0 to 300 M, and the others were adjusted to the standard activity measurement conditions. The results are shown in FIG. As a result, the FAD, Riboflavin, and FMNO used, and the NOX-activating effect was observed in the gaps. The effect was almost the same for FAD and Riboflavin, and relatively weak for FMN.
  • the partial amino acid sequence of the purified FcDH and NOX was determined. Both enzymes were subjected to SDS-PAGE, the gel at the position where the band was observed was cut out, and the protein contained in the gel was used as a sample, which was obtained by fragmentation by trypsin treatment and separation by reverse phase HPLC according to a conventional method. Some of the fractions were subjected to a protein sequencer. The obtained sequences are shown in SEQ ID NOs: 11 to 14.
  • Genomic DNA prepared from 3255 by a conventional method was used as type III, and a PCR reaction was performed. After purifying the obtained fragment, the nucleotide sequence was analyzed by a DNA sequencer. As a result, a DNA sequence encoding the peptide sequence obtained in Example 16 was found in the obtained PCR product.
  • a positive clone was obtained by Southern hybridization and colony hybridization using the DNA fragment as a probe according to a conventional method.
  • a plasmid was prepared from the obtained clone, its DNA sequence was analyzed, and the FcDH-encoding gene (fcdh) consisting of 774 base (including the termination codon) shown in SEQ ID NO: 15 and 474 base (termination) shown in SEQ ID NO: 17 A NOX-encoding gene (nox) was obtained.
  • the sequence The entire amino acid sequence of FcDH consisting of 257 residues shown in No. 16 and NOX consisting of 157 residues shown in SEQ ID No. 18 was determined. This contained the peptide sequence determined in Example 6.
  • Amino acid sequence power The estimated molecular weight was 27.522 Da for FcDH and 16,777 Da for NOX, which were almost identical to the molecular weights estimated by SDS-PAGE.
  • PCR was performed using genomic DNA of G. oxydans IFO 3255 strain as a template and synthetic primers shown in SEQ ID NOs: 19 and 20, to obtain a 858 bp fragment containing the fcdh gene.
  • the obtained PCR product was digested with EcoRI and Pstl, and inserted into a corresponding position of plasmid pUC18 (Takara Bio Inc.) to prepare a plasmid PFEX3052 for FcDH expression.
  • PCR was performed using the genomic DNA of G. oxydans IFO 3255 as a template and the synthetic primers shown in SEQ ID NOS: 21 and 22 to obtain a 605 bp fragment containing the nox gene. Fragment was obtained.
  • the obtained PCR product was digested with Pstl and Hindlll, and inserted into a corresponding position of plasmid PFEX3052 to prepare a plasmid for co-expression of FcDH and NOX PFNEX4105.
  • PCR was carried out using this plasmid pFNEX4105 as a template and the synthetic primers shown in SEQ ID NOs: 19 and 23, to obtain a 1390 bp fragment containing a gene fragment in which the fcdh gene and the nox gene were tandemly linked. .
  • the obtained PCR product was digested with EcoRI and Kpnl, and inserted into the corresponding position of plasmid pUC18 to prepare pFNEX4502.
  • genomic DNA obtained from E. coli W3110 strain by a conventional method was used as a template, and based on the foci gene sequence described in Accession No. NC_000913, SEQ ID NO: 24 PCR was performed using the synthetic primers shown in and 25 to obtain a 1873 bp fragment containing the foci gene.
  • the obtained PCR product was digested with Kpnl and Sail, and inserted into the corresponding position of plasmid PFNEX4502 to prepare plasmid PFNIEX5706 for co-expression of FcDH, NOX and Fuel.
  • a plasmid pIEX11 for expressing fuel alone was prepared. This is achieved by obtaining the Fuel gene by PCR using the synthetic primers shown in SEQ ID NOs: 26 and 27 in the same manner as described above, digesting the resulting product with EcoRI and Pstl, and inserting it into the corresponding position of plasmid pUC18. Created. [0186] Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Bio Inc.) was transformed with each of the constructed plasmids pFEX3052, pFNEX4105, pFNIEX5706 and pIEXll, and the FcDH expression strain E.
  • the washed cells were resuspended in 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), disrupted by sonication (200 W, 10 minutes), and centrifuged at 14,000 g for 15 minutes to obtain a supernatant.
  • Tris-HCl pH 8.0
  • sonication 200 W, 10 minutes
  • centrifuged 14,000 g for 15 minutes to obtain a supernatant.
  • FIG. 21 shows the SDS-PAGE analysis results of the cell-free extracts obtained from E. coli / pUC18, E. coli / pIEXll, E. coli / pFEX3052, E. coli / pFNEX4105, and E. coli / pFNIEX5706, respectively.
  • Fuel is E. coli / pIEXll
  • FcDH is E. coli / pFEX3052
  • E. coli / pFNEX4105 FcDH and NOX were produced, and in E. coli / pFNIEX5706, Fucl, FcDH and NOX were produced, and bands were observed at the corresponding molecular weight positions.
  • this cell-free extract was further subjected to ultracentrifugation at 200,000 g for 30 min, and the obtained supernatant was used as a material.
  • the fraction containing NOX activity was collected, concentrated, and then subjected to Superdex 200 16/60 equilibrated with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) to collect the fraction containing NOX activity. After concentration, the purity was confirmed by SDS-PAGE, and as a result, rNOX was recognized as a single band estimated to have a molecular weight of about 15 kDa (Fig. 23).
  • FcDH, NOX, and Fuel activities were measured in cell-free extracts obtained from E. coli / pUC18, E. coli / pIEXll, E. coli / pFEX3052, E. coli / pFNEX4105, and E. coli / pFNIEX5706, respectively. Table 12).
  • the activity of the purified rFcDH and rNOX purified samples was also measured, and the specific activity of rFcDH was 11.1 U / mg and the specific activity of rNOX was 175 U / mg. This value was considered to be approximately the same as the specific activity of purified FcDH prepared from G. oxydans, 7.8 U / mg, and the specific activity of purified NOX, 196 U / mg.
  • the Fuel activity was measured as follows. An enzyme solution is appropriately added to 0.1 M L-fucose, 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) and 5 mM MgCl, and the reaction is performed at 30 ° C.
  • the amount of L-fuculose produced by isomerization of L-fucose was calculated by measuring by HPLC. The activity was determined from the initial velocity in the range where the amount of produced L-fucrose did not exceed 3 mM. The activity of isomerizing 1 / z mol of L-fucose per minute at 30 ° C. for 1 minute to generate L fucose was defined as 1 U as Fuel activity.
  • FucIH6 prepared from QE30FucIH6 was used.
  • enzymes having NOX activity include H 0
  • H0 is generated, and H0 is generally avoided because it inhibits many enzyme activities.
  • catalase an enzyme that converts HO to H20, was also performed.
  • the enzyme used was a commercial enzyme sample (Nacalai Tesque, Bovine Liver). Standard reaction conditions include 62 mM L-Fucitol, 0.1 M Gly-NaOH (pH 9.5), 2 mM NAD, 30 FAD, 1 mM MgCl, 0.1 U / ml purified FcDH, 0.1 U / ml purified NOX,
  • a reaction solution of 0.2 mg / ml purified FudH6 and 0.1 mg / ml catalase was reacted with shaking at 30 ° C, sampled as appropriate, and L-fucitol, L-fucose and L-fucose were quantified by HPLC.
  • Table 13 shows the results of the analysis and the results of the analysis 48 hours after the reaction.
  • Fig. 24 shows the conversion time course in each experimental section.
  • ⁇ open circles indicate L-fucose
  • ⁇ open triangles indicate L-fucitol concentration.
  • B is the standard condition (62 mM L-Fucitol, 0.1 M Gly-NaOH (pH 9.5), 2 mM NAD, 30 ⁇ M FAD, 1 mM MgCl, 0.1 U / ml
  • the results are for purified FcDH, 0.1 U / ml purified NOX, 0.2 mg / ml purified FucIH6, 0.1 mg / ml force tarase).
  • A shows the results with no enzyme added
  • C shows the results without FudH6,
  • D shows the results without FcDH
  • E shows the results without NOX
  • F shows the results without catalase.
  • ⁇ open circles indicate L-fucose
  • ⁇ open triangles indicate L-fucitol concentration.
  • A is the standard condition (120 mM Fucitol, 0.1 M Gly-NaOH (pH 9.5), 2 mM NAD, 30 ⁇ M FAD, 1 mM MgCl, 1 U / ml
  • the results are for purified rFcDH, 1 U / ml purified rNOX, 0.2 mg / ml purified FucIH6, 0.1 mg / ml force tarase).
  • B shows the results without NAD,
  • C without FAD,
  • D without phytase, and
  • E without FudH6.
  • NAD H
  • 2 mM NAD was able to generate approximately 100 mM L-fucrose from L-fucitol.
  • the produced L-fucose was converted into L-fucose, and as a result, L-fucose could be produced from L-fucitol.
  • the effect of adding catalase was observed in the same manner as in 20-1 above.
  • Example 21 Conversion of L-fucitol by recombinant E. coli cell reaction
  • H0 which may be derived from NOX activity, inhibits the conversion of L-Fudtol.
  • the obtained PCR product was digested with Sall and Pstl, and inserted into a corresponding position of plasmid pSTV28 (manufactured by Takara Bio Inc.) to prepare a KatE expression plasmid pKEX5804. Furthermore, the E. coli / pFNIEX5706 strain was transformed with this plasmid, and a strain carrying both the PFNIEX5706 and pCEX8401 plasmids
  • E.coli / FNIC7001 strain was prepared.
  • This strain was refreshed by culturing it at 37 ° C on an LBZAmp + Cm (chloramphenecol, 0.03 mg / ml) plate. Liquid culture was performed at 37 ° C using LBZAmp + Cm liquid medium. After inoculation of the refreshed cells, IPTG having a final concentration of 1 mM was added, and the cells were cultured for 6 to 18 hours, and then collected by centrifugation. The collected cells were washed with a 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) and used in subsequent experiments. In addition, instead of LB medium, TB medium (12 g / 1 trypton, 24 g / 1 yeast extract, 4 g / 1 glycerol, 2.3 g / 1 KH
  • Example 23 Measurement of enzyme activity in cell-free extract of E. coli / FNIC7001 strain
  • the activity was calculated from the initial speed, which was defined as the change in absorbance during the first minute of the initial reaction.
  • An experimental section to which no enzyme source was added at the time of measurement was also prepared and used as a blank value.
  • the activity that consumes 1 ⁇ mol of ⁇ 0 per minute at 30 ° C. as the KatE activity was defined as 1 U.
  • Table 16 shows the determined enzyme activities. At any of the culture temperatures of 30 ° C and 37 ° C, it was confirmed that the E. coli / FNIC7001 strain having PKEX5804 had higher KatE activity than E. coli / pFNIEX5706.
  • Example 24 Conversion of L-fucitol by E.coli / FNIC7001 strain
  • an L. fucitol conversion experiment was performed using a washed intact cell of the E. coli / FNIC7001 strain cultured at 27 30 33 or 37 ° C. Reaction was performed with 380 mM L-Fucitol, 0.2 M Gly-NaOH (pH 9.5), 50 ⁇ M riboflavin, 1 mM MnCl
  • the cells were cultured at 27 (Fig. A), 30 (Fig. B), 33 (Fig. C) or 37 ° C (Fig. D).
  • the present invention is suitable for industrial production of L-fucose.
  • the present invention is expected to contribute to various fields using L-fucose.
  • SEQ ID NO: 17 NOX coding gene base sequence of nox
  • SEQ ID NO: 24 5 'primer for obtaining foci SEQ ID NO: 25: 3 'primer for fod acquisition

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

　本発明により工業的な製法として好適なＬ−フクロースの製造方法およびＬ−フコースの製造方法が提供される。Ｌ−フシトールからＬ−フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物由来タンパク質の存在下で、Ｌ−フシトールからＬ−フクロースを生成せしめる。この反応系においてはＮＡＤＨオキシダーゼが含まれることが望ましい。得られたＬ−フクロースは、さらにＬ−フコースに変換される。

Description

明 細 書
L一フクロースの製造方法および Lーフコースの製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、 L フクロースの製造方法および Lーフコースの製造方法に関し、より詳し くは、簡便で効率の良い L フクロースの製造方法および Lーフコースの製造方法に 関するものである。
背景技術
[0002] Lーフコース (L 6—デォキシガラタトース）は、種々の糖質の主として非還元末端糖 として広く生物界に存在している。 Lーフコースを構成成分とする多糖として、海草類 中のフコダイン (focoidan)などが知られている。 Lーフコースの生体内おける役割とし ては、肝臓への血清糖タンパク質の取り込み、マクロファージ遊走素子因子の受容 体などに関与して 、ると考えられて 、る。 Lーフコースは疾病との関連にっ 、ても研究 が進められており、 Lーフコースを例えば医薬中間体などとして利用することなどにつ いて研究が進められている。例えば、癌患者の糖タンパク質や糖脂質中の L フコー ス構成比や尿中の遊離 Lーフコース量の変化などを指標とする癌診断、癌転移阻害 剤もしくは抗ウィルス剤の開発、白血球のコントロール、リウマチ関節炎の治療などへ の利用が期待されるところである。
[0003] 上記のように Lーフコースについては今後の様々な利用の開発が期待されていると ころであり、 Lーフコースの入手方法、製造方法についてはいくつかの方法が開発さ れている。例えば、モズクに含まれるフコダインを抽出する方法 (特許文献 1)、モズク 由来のフコダイン力も L フコースを単離する方法 (特許文献 2)が知られている。しか しながら、これらの方法は大量のモズクが必要になる上、単離精製は実際には困難 なものと 、わざるをえず、また収量が少な 、と!/、う問題点があった。
[0004] また、微生物が産生する多糖類を加水分解し分解物力 L フコースを単離すると いう方法も試みられている（特許文献 3)。しかし、この方法も、単離精製が実際には 技術的に困難であり、また収量も極めて少ない。さら〖こ、 D ガラクトースを原料とした 化学合成法が知られている（非特許文献 1)。しかし、この方法は、ステップ数が多ぐ 収率が低!、ため、工業的な生産として実用的ではな!/、。
[0005] また、酵素を用いた合成法として、 L フクロース 1 リン酸力 産生ホスファターゼ を用 、て Lーフコースに転換し、さらに Lーフコースイソメラーゼを用 、て Lーフコースへ と転換させる製造方法が知られている (特許文献 4)。しかし、この方法で出発物質と して用いられる Lーフコース 1 リン酸は高価であり、より低コストに生産可能な方法が 求められる。
[0006] さらに、植物（紅色植物、赤藻類; red alage)由来の NAD 依存型デヒドロゲナー ゼを用いた L フシトールの酸ィ匕について報告がされている（例えば特許文献 5、非 特許文献 5など）。し力し、 L—フシトールのどの部位を酸化しているのかについては 明らかではなぐ得られる生成物についてははっきり確認されていない。また一般に、 植物由来の酵素は、工業的に利用可能なほど大量に生産することが困難であり、植 物由来の酵素であるが故の取り扱いの不便さが伴う。
[0007] さらに、微生物を用いた L一フシトールの酸化として、酢酸菌を用いた実験報告がな されている（例えば、非特許文献 2、非特許文献 3)。しかしながら、これらの報告では 酵素の同定はされていない。また、 L—フシトールを酸ィ匕することにより得られる生成 物は、 L—フシトールの酸ィ匕される部位によって異なるものとなる。この実験報告にお いては、得られた酸化物の主成分は、 L—フコースや L フクロースではなぐ L—フシト ールの 4位の酸化物（非特許文献 2中、 L-foco-4-ketose)であることを報告して 、る。 また、糖を基質とする酵素に関し、酢酸菌については様々な研究がなされている (例 えば、特許文献 6、非特許文献 3、非特許文献 4など)。
[0008] 特許文献 1 :特開昭 61— 57520号公報
特許文献 2：特開平 11 35591号公報
特許文献 3 :特開昭 59-51798号公報
特許文献 4 :国際公開第 97Z15683号パンフレット
特許文献 5：国際公開第 02Z06506号パンフレット
特許文献 6：特開平 8- 242850号公報
非特許文献 1 : Carbohydrate research 270; 93-96(1995)
非特許文献 2 Journal of American Chemical Society; 4934-4937(1950) 非特許文献 3 : Canadian Journal of Chemistry 45: 741-744(1967) 非特許文献 4: Biosci. Biotechnol. Biochem. 65: 2755-2762(2001)
非特許文献 5 : Planta 202: 487-493(1997)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 上記のように、 Lーフコースは様々な利用法が期待されているにもかかわらず、工業 生産として実用に足るような製造方法は確立されていない。本発明は、簡便性および コストなどの点において工業的な製法として好適な Lーフコースの製造方法を提供す ることを課題とするちのである。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは、以下に詳述する実施例のように研究を進めたところ、微生物由来の フシトールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質の存在を突きとめ、かつ L フシト 一ルカ L フクロース以外のケトへキソースを生成する活性を有するタンパク質が存 在しな 、或いは活性を抑制させる条件下で、 L フシトール力 L フクロースを生成 せしめる様々な手法を見出し、 Lーフコース生産における中間体である L フクロース の工業的にも好適な製造方法を完成させ、さらに工業的に有利な Lーフコースの製造 方法を完成させた。すなわち、本発明は、下記の L フクロースの製造方法および L フコースの製造方法を提供するものである。
[0011] 〔1〕L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物 由来タンパク質の存在下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる、 L—フク ロースの製造方法。
〔2〕前記微生物が酢酸菌である、上記〔1〕に記載の L フクロースの製造方法。
〔3〕 L—フシトールから L フクロースを生成し、 L—フクロース生成量を L フシトール酸 化物中の 50wt%以上にする能力を有する微生物、当該微生物の培養物および当該 微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上の存在下で、 Lーフ シトールから L フクロースを生成せしめる、 L フクロースの製造方法。
〔4〕ダルコノバクタ一'キシリナス ·サブスピーシーズ ·キシリナスおよびダルコノバクタ 一 ·ォキシダンスのうちの少なくとも一方の微生物、当該微生物の培養物、並びに当 該微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上の存在下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる、 L フクロースの製造方法。
〔5〕L—フシトール力も L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパ ク質を有し、かつ、 L フシトールから L フクロース以外のケトへキソースを生成する 能力を実質的に有しない非遺伝子操作微生物、当該非遺伝子操作微生物の培養 物および当該非遺伝子操作微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上の存在下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる、 L フクロース の製造方法。〔6〕 L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を 有する微生物由来の第 1のタンパク質を有し、かつ、 L フシトール力も L—フクロース 以外のケトへキソースを生成する活性を有する第 2のタンパク質をコードする遺伝子 が破壊された微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からな る群より選ばれる 1種または 2種以上の存在下で、 L フシトール力 L フクロースを 生成せしめる、 L-フクロースの製造方法。
〔7〕L フシトール力 L フクロース以外のケトへキソースを生成する能力を実質的に 有せず、 L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微 生物由来の第 1のタンパク質を発現可能に形質転換された微生物、当該微生物の培 養物および当該微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上の 存在下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる、 L—フクロースの製造方 法。
〔8〕前記微生物が、 L フシトール力 L フクロース以外のケトへキソースを生成する 活性を有する第 2のタンパク質をコードする遺伝子が破壊された微生物である、上記 〔7〕に記載の L フクロースの製造方法。
〔9〕L—フシトール力も L フクロース以外のケトへキソースの生成が抑制される反応条 件下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる、上記〔1〕から〔4〕のいずれ か一項に記載の L フクロースの製造方法。
〔 10〕 L フシトールから L フクロース以外のケトへキソースの生成が抑制される pH条 件下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる、上記〔1〕から〔4〕のいずれ か一項に記載の L フクロースの製造方法。 〔11〕 2価イオンキレート剤が共存し、 L フシトール力 L フクロース以外のケトへキ ソースの生成が抑制される条件下で、 L フシトール力 L—フクロースを生成せしめる 、請求項 1から 4の 、ずれか一項に記載の L フクロースの製造方法。
〔 12〕 NADH力 NADを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フシトー ルカも L フクロースを生成せしめる、上記〔1〕から〔8〕の!、ずれか一項に記載の L— フクロースの製造方法。
〔13〕 L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生 物由来タンパク質の存在下で、 L フシトール力 L フクロースを生成せしめる Lーフ クロース生成工程と、
L フクロースカゝら Lーフコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フクロースから Lーフコースを生成せしめる Lーフコース生成工程と、
を含む、 Lーフコースの製造方法。
〔14〕 L フシトールから L フクロースを生成し、 L—フクロース生成量を L フシトール 酸ィ匕物中の 50wt%以上にする能力を有する微生物、当該微生物の培養物および当 該微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上の存在下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる L フクロース生成工程と、
L フクロースカゝら Lーフコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フクロースから Lーフコースを生成せしめる Lーフコース生成工程と、
を含む、 Lーフコースの製造方法。
〔15〕 L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタン パク質を有し、かつ、 L フシトールから L フクロース以外のケトへキソースを生成す る能力を実質的に有しない非遺伝子操作微生物、当該非遺伝子操作微生物の培養 物および当該非遺伝子操作微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上の存在下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる、 L フシトール 力 L フクロースを生成せしめる L フクロース生成工程と、
L フクロースカゝら Lーフコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フクロースから Lーフコースを生成せしめる Lーフコース生成工程と、
を含む、 Lーフコースの製造方法。 〔 16〕 L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタン パク質を有し、かつ、 L フシトールから L フクロース以外のケトへキソースを生成す る活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が破壊された微生物、当該微生物の 培養物および当該微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上 の存在下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる、 L フシトールから L— フクロースを生成せしめる L フクロース生成工程と、
L フクロースカゝら Lーフコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フクロースから Lーフコースを生成せしめる Lーフコース生成工程と、
を含む、 Lーフコースの製造方法。
〔 17〕 L フシトール力 L フクロース以外のケトへキソースを生成する能力を実質的 に有せず、 L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する 微生物由来タンパク質を発現可能に形質転換された微生物、当該微生物の培養物 および当該微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上の存在 下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる、 L—フシトールから L フクロー スを生成せしめる L フクロース生成工程と、
L フクロースカゝら Lーフコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フクロースから Lーフコースを生成せしめる Lーフコース生成工程と、
を含む、 Lーフコースの製造方法。
〔 18〕 L フシトール力 L フクロース以外のケトへキソースを生成する能力を実質的 に有せず、 L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する 微生物由来タンパク質および L フクロース力も Lーフコースを生成する活性を有する タンパク質を発現可能に形質転換された微生物、当該微生物の培養物ならびに当 該微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上の存在下で、 L フシトールから Lーフコースを生成せしめる、 Lーフコースの製造方法。
〔 19〕下記 (A)または（B)のタンパク質。
(A)配列番号 16に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号 16に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 L フシトールから L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタン パク質
〔20〕上記〔 19〕に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔21〕下記 (a)または (b)に示すポリヌクレオチド。
(a)配列番号 15に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(b)配列番号 15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと ストリンジェントな条件下にお 、てハイブリダィズし、かつ L フシトールから L フク口 ースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチ ド〔22〕下記 (C)または (D)のタンパク質。
(C)配列番号 18に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号 18に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 NADHォキシダーゼ活性を有するタンパク質
〔23〕上記〔22〕に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔24〕下記 (c)または (d)に示すポリヌクレオチド。
(c)配列番号 17に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(d)配列番号 17に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと ストリンジェントな条件下にお 、てハイブリダィズし、かつ NADHから NADを生成す る活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔25〕上記〔20〕に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。 〔26〕上記〔23〕に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
[27]上記〔20〕に記載のポリヌクレオチドおよび請求項 23に記載のポリヌクレオチド が組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
〔28〕上記〔25〕に記載の組換えポリヌクレオチドが導入され、 L フシトール力 Lーフ クロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を発現する、形質転換 体。
〔29〕上記〔28〕に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物を培地中で培 養し、培地中および Zまたは微生物中に、 L フシトール力 L フクロースを生成す るデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク 質の製造方法。
〔30〕上記〔28〕に記載された形質転換体が微生物であり、
当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より 選ばれる 1種または 2種以上を、 L—フシトールを含む反応系に添カ卩し、 L フシトール 力も L フクロースを生成せしめる、 L フクロースの製造方法。
〔31〕上記〔28〕に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物、当該微生物 の培養物および当該微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以 上を、 L—フシトールを含む反応系に添カ卩し、 L フシトールから L フクロースを生成 せしめる、 L フクロース生成工程と、
L フクロースカゝら Lーフコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フクロースから Lーフコースを生成せしめる Lーフコース生成工程と、
を含む、 Lーフコースの製造方法。
〔32〕上記〔25〕に記載の組換えポリヌクレオチドおよび請求項 26に記載の組換えポ リヌクレオチドが導入され、 L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナー ゼ活性を有するタンパク質および NADHカゝら NADを生成する活性を有するタンパク 質を発現する、形質転換体。
〔33〕上記〔26〕に記載の組換えポリヌクレオチドが導入され、 NADHから NADを生 成する活性を有するタンパク質を発現する形質転換微生物を培地中で培養し、培地 中および Zまたは微生物中に、 NADH力 NADを生成する活性を有するタンパク 質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
〔34〕上記〔32〕に記載された形質転換体が微生物であり、
当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より 選ばれる 1種または 2種以上を、 L—フシトールを含む反応系に添カ卩し、 L フシトール 力も L フクロースを生成せしめる、 L フクロースの製造方法。
〔35〕上記〔32〕に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物、当該微生物 の培養物および当該微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以 上を、 L—フシトールを含む反応系に添カ卩し、 L フシトールから L フクロースを生成 せしめる、 L フクロース生成工程と、
L フクロースカゝら Lーフコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フクロースから Lーフコースを生成せしめる Lーフコース生成工程と、
を含む、 Lーフコースの製造方法。
〔36〕上記〔27〕に記載の組換えポリヌクレオチドが導入され、 L フシトール力 Lーフ クロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質および NADH力 NA Dを生成する活性を有するタンパク質を発現する、形質転換体。
〔37〕上記〔36〕に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物を培地中で培 養し、培地中および Zまたは微生物中に、 L フシトール力 L フクロースを生成す るデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質および NADHカゝら NADを生成する活性 を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
〔38〕上記〔36〕に記載された形質転換体が微生物であり、
当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より 選ばれる 1種または 2種以上を、 L—フシトールを含む反応系に添カ卩し、 L フシトール 力も L フクロースを生成せしめる、 L フクロースの製造方法。
〔39〕上記〔36〕に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物、当該微生物 の培養物および当該微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以 上を、 L—フシトールを含む反応系に添カ卩し、 L フシトールから L フクロースを生成 せしめる、 L フクロース生成工程と、
L フクロースカゝら Lーフコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フクロースから Lーフコースを生成せしめる Lーフコース生成工程と、
を含む、 Lーフコースの製造方法。
[0012] なお、本明細書中の配列番号に示す配列は、特に断らない限り、配列表に記載の 配列を指す。
発明の効果
[0013] 本発明によれば、工業的生産としても好適な L フクロースの製造方法および Lーフ コースの製造方法が提供される。本発明の製造方法は、工業生産として簡便である。 また、本発明の製造方法は、副産物の生成を抑制またはなくすことが可能であり、効 率の良い製造方法である。また、本発明の製造方法は、 D ガラクトースという低単価 の原料を出発物質とすることができるため、製造コストを低減させることができ、工業 生産上極めて有利である。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、 D ガラクトース力 Lーフコースまでの反応工程を示す図である。
[図 2]図 2は、 Fuel発現酢酸菌による L フシトール変換量を示す図である。
[図 3]図 3は、異なる pH条件下での L フシトールからの L フクロース生成時の副生 物（BP)の生成量を示す図である。
[図 4]図 4は、 EDTAをカ卩えた場合の L フシトールからの L フクロース生成時の副生 物（BP)の生成量を示す図である。
[図 5]図 5は、 sldA遺伝子を破壊した場合の L フシトール力ゝらの L フクロース生成時 の副生物（BP)の生成量を示す図である。
[図 6]図 6は、精製した FcDHの SDS-PAGEの結果を示す図である。
[図 7]図 7は、精製した NOXの SDS-PAGEの結果を示す図である。
[図 8]図 8は、精製 FcDHの反応至適 pHを測定した結果を示す図である。
[図 9]図 9は、精製 FcDHの pH安定性を測定した結果を示す図である。
[図 10]図 10は、精製 FcDHの反応至適温度を測定した結果を示す図である。
[図 11]図 11は、精製 FcDHの温度安定性を測定した結果を示す図である。
[図 12]図 12は、精製 FcDHの (A)D—ァラビトール、（B) L フシトールの濃度に対する 比活性を測定した結果を示す図である。
[図 13]図 13は、 FcDHによる D—ァラビトール、 D マン-トールおよび D ソルビトール の酸ィ匕生成物を HPLC解析によって調べた結果を示す図である。
[図 14]図 14は、精製 FcDHの NAD濃度に対する比活性を測定した結果を示す図であ る
[図 15]図 15は、精製 NOXの反応至適 pHを測定した結果を示す図である。
[図 16]図 16は、精製 NOXの pH安定性を測定した結果を示す図である。
[図 17]図 17は、精製 NOXの反応至適温度を測定した結果を示す図である。
[図 18]図 18は、精製 NOXの温度安定性を測定した結果を示す図である。 [図 19]図 19は、精製 NOXのフラビン補酵素（FAD、リボフラビンおよび FMN)濃度に 対する比活性を測定した結果を示す図である。
[図 20]図 20は、精製 NOXの NADH濃度に対する比活性を測定した結果を示す図で ある（図 20 (A) )。図 20 (B)は、（A)の結果を Lineweaver- Burkプロットにて示したもの である。
[図 21]図 21は、 E. coli/pUC18、 E. coli/pIEXll、 E. coli/pFEX3052、 E.
coli/pFNEX4105および E. coli/pFNIEX5706よりそれぞれ調製した無細胞抽出液の SDS-PAGEによる観察結果を示す図である。
[図 22]図 22は、 E. coli/pFEX3052より精製した rFcDHの SDS- PAGE観察結果を示す 図である。
[図 23]図 23は、 E.coli/pFNEX4105より精製した rNOXの SDS- PAGE観察結果を示す 図である。
[図 24]図 24は、 G. oxydansより精製した FcDHおよび NOXを用いた L フシトールの 変換時間経過を示した図である。
[図 25]組換え E. colはり調製した rFcDHおよび rNOXを用いた L フシトールの変換 時間経過を示したものである。
[図 26]図 26は、組換え E. coliインタタトセルによる L フシトールの変換時間経過を 示した図である。
[図 27]図 27は、カタラーゼ存在下での L フシトールの変換時間経過を示した図であ る。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 以下、本発明の実施の形態について、その最良の形態を含め、説明する。なお、 以下に挙げる種々の遺伝子工学的な技法については、 Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)、細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら 編、羊土社 (1992)、新遺伝子工学ハンドブック改訂第 3版、村松ら編、羊土社 (1999 )など、多くの当業者にとって標準的な実験マニュアルがあり、これらマニュアルおよ び本明細書を参照することにより当業者が実施可能である。
[0016] 1. L フクロースの製造方法 1-1 微生物由来タンパク質を用いる形態
本発明のフクロースの製造方法では、 L フシトールから L フクロースを生成するデ ヒドロゲナーゼ活性を有する微生物由来タンパク質を用いて L フシトールカゝら Lーフ クロースを生成する。下記実施例において詳説されるが、本発明者らは、微生物にお いて、 L—フシトール力 L フクロースを生成する活性を有するタンパク質と、 L フシ トール力も L フクロース以外のケトへキソースを生成する活性を有するタンパク質と が別個に存在することを見出した。したがって、 L フクロース力も L フクロースを生 成する活性を有するタンパク質を、所定の微生物力も得ることにより、 L フクロース以 外の副産物の生成を低減またはなくすことができる。また、微生物由来のタンパク質 であるため、植物、動物などの細胞に由来するタンパク質より、単離、精製等の取り扱 いが簡便であり、酵素の大量生産を行うための微生物での異種組換え大量発現を考 える際でも、宿主との相性の点で有利である。また微生物を培養することは、植物、 動物細胞の培養より容易であり、工業的生産を行うために要する量を十分に得ること も容易である。
なお、下記に別途詳説するが、本発明者らは、 Gluconobacter oxydansから単離さ れたタンパク質に基づき、そのアミノ酸配列および塩基配列を特定した。
[0017] さらに、 L—フシトールは L ガラクトースという安価な原料力 容易に得られるため、 本発明の L—フクロースの製造方法は、コストの低減を図ることができ、工業生産とし て有利である。 D—ガラクトース力 L—フシトールを得る方法に方法については、例え ば非特許文献 1などに記載されて 、る。
[0018] 用いられるタンパク質は、微生物由来であって、かつ、 L—フシトール力 L フク口 ースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するものであればよい。なお、本明細書に おいては、微生物には、原核微生物、真核微生物およびウィルスが含まれるが、藻 類を含む植物細胞は含まな 、。このようなタンパク質を得ることができる微生物として は、例えば、酢酸菌などが挙げられる。酢酸菌としてより具体的には、ダルコノバクタ ー属に属する細菌およびァセトパクター属に属する細菌などが挙げられ、より具体的 には、ダルコノバクタ^ ~ ·ォキシダンス（Gluconobacter oxydans)、ダルコノバクタ^ ~ · フラテゥリ（Gluconobacter frateurii)、ァセトパクター 'メラノゲナス（Acetobacter melanogenus)、グノレコノノ クタ一 ·ロセウス (Gluconobacter roseus)、グノレコノノ クタ ~ ·セリナス（Gluconobacter cerinus)、ダルコノバクタ^ ~ ·ォキシダンス ·サブスピーシ ~~ズ、'サブォ3 rングンス (tjluconoDacter oxydans suosp. suboxydansノ、ァセトノ クタ ~ ·タービダンス (Acetobacter melanogenus)、ダルコノバクタ^ ~ ·キシリナス ·サブスピ ~~シ' ~~ズ · =τンリナス (Gluconobacter xylinus subsp. xylinus)、 /セトノヽクグ ~~ 'ォ ~~ ランティウス (Acetobacter aurantius)、グノレコノノ クタ一'メラノゲナス (Gluconobacter melanogenus)、クノレコノノ クタ1 ~~ 'スクレロづァウス (Gluconobacter scleroideus)、ク ルコノバクタ^ ~ ·サブォキシダンス (Gluconobacter suboxydans)等が例示される。より 具体的には、例えば、下記表 1に記載の各種菌株から、上記タンパク質を得ることが できる。
[0019] このような微生物を十分な量得るには、これらの微生物を種類に応じて適当な培地 で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば 特に制限はなぐ通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に 応じ有機栄養源を含む通常の培地でょ ヽ。
[0020] 例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であれば ヽずれも使用でき、具体 的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、ェ タノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クェン酸、酢酸、プロピオン酸 などの有機酸類及びこれらの塩類、ノ ラフィンなどの炭化水素類あるいはこれらの混 合物などを使用することができる。
[0021] 窒素源としては、硫酸アンモ-ゥム、塩化アンモ-ゥムなどの無機酸のアンモ-ゥム 塩、フマル酸アンモニゥム、クェン酸アンモニゥムなどの有機酸のアンモニゥム塩、硝 酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンス ティープリカ一などの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができ る。
[0022] 他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜 混合して用いることができる。
[0023] 培養条件にも格別の制限はなぐ例えば、好気的条件下にて pH5— 8、温度 15—
40°Cの範囲で pHおよび温度を適当に制限しつつ 12— 70時間程度培養を行えばよ い。
[0024] 微生物由来のタンパク質の精製には、通常タンパク質の精製を行うために用いられ る全ての定法、例えば硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎 水クロマトグラフィー法等を採用し得る。精製する際には、菌体抽出液を出発材料と して精製することになる力 未破砕あるいは未溶菌残查が存在するようであれば、可 溶化液を再度遠心分離操作に供し、沈殿する残查を除いた方が、精製に有利である
[0025] L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物由 来タンパク質を用いて L フシトールから L フクロースを生成するには、 L フシトール と上記微生物由来タンパク質とを媒体中で接触させるなどすればよぐ例えば、緩衝 溶液中などに L フシトールと上記微生物由来の精製タンパク質を添加するなどして 反応させればよい。 pH、温度、反応時間、酵素添加量等の時間は、上記微生物由 来タンパク質の種類などに応じて適宜変更してよい。例を挙げると、 pHについては、 好ましくは 5— 11、より好ましくは 7— 10である。また、温度については、好ましくは、 2 0— 50。C、より好ましくは 25— 40。Cである。
[0026] 1-2 微生物、その培養物または菌体処理物を用いる形態
次に、微生物、微生物の培養物または微生物の菌体処理物を用いた方法につい て説明する。上記のような微生物由来タンパク質を用いて L フクロースを生成する形 態として、上記のような微生物由来タンパク質を有する微生物、その培養物または微 生物の菌体処理物を用いることもできる。しかし、微生物そのものを用いる場合、その 微生物が L フクロース以外のケトへキソース（以下、副産物とも!、う）を生成する能力 も有する場合があるため、微生物そのものを用いる場合には、副産物の生成が少な いものを用いることが好ましい。すなわち、用いられる微生物の特徴として、（i) Lーフ シトール力 L フクロースを生成する能力を有すること、 (ii)さらに L—フクロース生成 量として、 L フシトールを酸ィ匕して得られる酸ィ匕物中の、好ましくは 50wt%以上、より 好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 90%以上を L フクロースがしめるように、 L フクロースを生成する能力を有することの少なくとも 2つの性質を兼ね備えた微生物 が用いられることが好ましい。 [0027] 上記 (i)および (ii)の条件を兼ね備えた微生物として、好ましくはダルコノバクタ一 · キシリナス ·サブスピーシーズ.キシリナスおよびダルコノバクタ一.ォキシダンスなどが 挙げられ、より好ましくはダルコノバクタ一 ·キシリナス ·サブスピーシーズ'キシリナス ATCC53582株、あるいは ATCC23767株、およびダルコノバクタ一'ォキシダンス IFO 3189株などが挙げられ、さらに好ましくはダルコノバクタ一 ·キシリナス 'サブスピ ーシーズ'キシリナス ATCC53582株が挙げられる。これらの微生物は、下記に示す ような遺伝子操作等をしなくても、 L フクロース以外のケトへキソースを実質的に生 成しな!/、、または生成量が少な!/、微生物である。
[0028] すなわち、本発明の好まし 、他の実施形態として、 L フシトール力も L フクロース を生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を有し、かつ、 L フシトールから L フクロース以外のケトへキソースを生成する能力を実質的に有しない非遺伝子操 作微生物等を用いるという形態も提供される。実質的に有しないとは、下記実施例 1 に示す条件において、副産物の生成量が検出限界以下であることをいい、数値によ り具体的に例示すると、約 ImM以下であることをいう。
[0029] なお、遺伝子操作微生物とは、遺伝子工学的な手法を用いて人為的に遺伝子を 操作された微生物のことを 、い、自然界にお 、て発生した突然変異体などは含まな い。非遺伝子操作微生物とは、遺伝子操作微生物ではないもののことをいう。
[0030] 微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、 微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成さ れた物質の混合物、さらにその上清などを含む。
[0031] 菌体処理物とは、微生物の菌体すなわち微生物の細胞に何らかの人為的操作を カロえたものをいい、例えば、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したもの などが含まれる。また、菌体処理物には、菌体などを処理して回収される粗タンパク 質、さらに精製した精製タンパク質なども含まれる。精製処理されたタンパク質として は、各種精製法によって得られる部分精製タンパク質等を使用してもよいし、これらを 共有結合法、吸着法、包括法等によって固定ィ匕した固定ィ匕タンパク質としてもよい。
[0032] 上記のように、菌体処理物には、微生物細胞が有する細胞内容物が混在した状態 のものが含まれる。したがって、菌体処理物を用いる場合、副産物を生成してしまう他 のタンパク質が混在している場合があり得るため、菌体処理物を用いる場合にも L— フクロース生成量を L フシトール酸ィ匕物中の 50wt%以上にする能力を有する微生 物を用いることが好ましい。なお、微生物力 L-フシトール力 L-フクロースを生成 する活性を有するタンパク質を十分に精製し、この精製タンパク質を用いる場合には 、微生物は単なる由来元であり、既に上記にて説明したとおり、微生物が副産物を生 成する力否かによって制限されるものではない。
[0033] 微生物を用いて L フクロースを生成する場合、微生物を培養し、微生物の培養物 中に L フシトールを添加するなど、微生物に由来する L フクロース生成活性を有す るタンパク質が L フシトールを基質として反応が行われるようにすればよい。また、菌 体処理物を用いる場合にも、同様に、菌体処理物と L フシトールとを混合し、微生物 に由来する L フクロース生成活性を有するタンパク質が L フシトールを基質とする 反応が行われるようにすればよい。すなわち、酵素や生体活性物質などを利用した 反応系に準じて反応系を構築すればよ!、。
[0034] 1-3 遺伝子操作株を用いる形態
本発明の他の実施形態として、 L フクロース生成活性を有する第 1のタンパク質を 有する一方で、副産物を生成する活性を有する第 2のタンパク質をコードする遺伝子 が破壊された微生物を用いる形態が提供される。本来は副産物を生成してしまう微 生物であっても、副産物を生成する原因となる酵素遺伝子等を破壊することにより、 L フクロースの製造に適した微生物とすることができ、副産物の生成が実質的になく 効率のょ 、L-フクロース生産を行うことができる。
[0035] 遺伝子破壊とは、標的とするタンパク質の遺伝子に改変が加えられ、そのタンパク 質本来の機能を低下または失わせることをいう。遺伝子とは、遺伝情報をコードする 媒体のことをいい、媒体としては、例えば、 DNA、 RNAおよびこれらのハイブリッド分 子もしくはキメラ分子などのポリヌクレオチドが含まれる。遺伝子破壊には、例えば、タ ンパク質自体を変性させるように、欠失、置換、挿入および逆位などの変異を導入し たり、転写阻害、翻訳阻害等によりそのタンパク質の発現を阻害するなどの手法が含 まれる。
[0036] 遺伝子を破壊する方法には特に制限はな!/ヽ。遺伝子を破壊する方法としては、例 えば、遺伝子を突然変異させるか、あるいは、同遺伝子を欠損すればよい。遺伝子 の不活性化は UV照射や-トロソグァニンジン（
N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)による変異処理、部位特異的変異法、相同 組み換え、または「Red- driven integrationとも呼ばれる挿入 欠失変異法（ Datsenko K.A. and Wanner B丄.、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 2000年， 第 97卷、第 12号、 p6640-45)による遺伝子破壊などの一般的な方法によって行うこと ができる。
[0037] 例えば、相同組み換えによる遺伝子の破壊をする場合、標的とする遺伝子の一部 を欠失し、正常に機能するべプチダーゼを産生しないように改変した欠失型遺伝子 を含む DNA (組み換え体)を調製する。欠失型遺伝子を含む DNAで微生物を形質 転換し、欠失型ぺプチダーゼ遺伝子と染色体上のぺプチダーゼ遺伝子との間で組 換えを起こさせることにより、染色体上のぺプチダーゼ遺伝子を欠損した微生物が得 られる。
[0038] 遺伝子破壊の対象となる第 2のタンパク質としては、 L—フシトールカゝら L フクロース 以外のケトへキソースの生成する活性が高いタンパク質が好適である。
[0039] また、遺伝子操作を加えた微生物を用いる他の実施形態として、 L フシトールから L フクロース以外のケトへキソースを生成する能力を実質的に有せず、 L フシトー ルカ L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物由来の第 1のタ ンパク質を発現可能に形質転換された微生物等を用いる形態が提供される。本来 L -フクロース生成活性を有するタンパク質を保有して ヽなくても、このようなタンパク質 を発現するように遺伝子を導入した形質転換体を作製することにより、 L フクロース の製造に適した微生物を得ることができる。また、形質転換体を作製する場合、元々 副産物を生成する能力を持たないものを選択することにより、副産物を生成せず L フクロースを効率よく生成する微生物を容易に得ることができる。
[0040] なお、 L フシトール力 L フクロース以外のケトへキソースを生成する能力を実質 的に有しない微生物としては、元来そのような能力を有しないもののほ力、 L フク口 ース以外のケトへキソースを生成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が 破壊された微生物を用いることもできる。遺伝子破壊の対象とするタンパク質としては 、上記と同様に、例えば D—ァラビトール力も D—キシルロースを生成する活性を有す るタンパク質などが挙げられる。
[0041] 形質転換体の作製は、定法に従って行うことができる。例えば、次のようにして形質 転換体を得ることができる。上記の微生物力も L—フコース生成活性を有するタンパク 質などの目的タンパク質を得て、精製された目的タンパク質のアミノ酸配列を決定す る。エドマン法（Edman,P.， Acta Chem. Scand. 4, 227 (1950))を用いてアミノ酸 配列を決定することができる。また Applied Biosystems社製などのシークェンサ一を 用いてアミノ酸配列を決定することができる。精製されたタンパク質について、 N末端 力も 30残基のアミノ酸配列を決定し、明ら力となったアミノ酸配列に基づいて、これを コードする DNAの塩基配列を演繹できる。 DNAの塩基配列を演繹するには、ュニ バーサルコドンを採用する。
[0042] 演繹された塩基配列に基づ!/ヽて、 30塩基対程度の DNA分子を合成する。 DNA 分子を合成する方法は Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)に開示されている。 また、 Applied Biosystems社製などのシンセサイザーを用いて DNA分子を合成でき る。このようにして合成された DNA分子は、目的タンパク質をコードする DNA全長を 、微生物の染色体遺伝子ライブラリーから単離する際に、プローブとして利用できる。 あるいは、目的タンパク質をコードする DNAを、 PCR法で増幅する際にプライマーと して禾 lj用でさる。
[0043] PCR法の操作については、 White, T.J. et al.， Trends Genet. 5, 185 (1989) 等に記載されている。染色体 DNAを調製する方法、さらに DNA分子をプローブとし て用いて、遺伝子ライブラリーから目的とする DNA分子を単離する方法については 、 Molecular し loning, 2nd edition, し old Spring Harbor press(1989)等【こ ci載 れている。
[0044] 単離された目的タンパク質をコードする DNAの塩基配列を決定する方法は、 A Practical uuiae to Molecular し loning, John Wiley & ¾ons, Inc. (1985)に g己 載されている。また、 Applied Biosystems社製などの DNAシークェンサ一を用いて、 塩基配列を決定することができる。
[0045] 次に、目的タンパク質を発現する形質転換体の作製につ!ヽて説明する。組み換え DNA技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多 く知られており、組み換え DNA技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タン ノ ク質であっても大量生産できる。
[0046] 目的タンパク質を発現する形質転換体を作製するためには、上記のようにして単離 された DNAを宿主細胞に導入すればよい。すなわち、単離された DNAを宿主細胞 で発現可能な発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入する。
[0047] タンパク質を組み換え DNA技術を用いて大量生産する場合、形質転換される宿主 細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞 等を用いることができるが、一般に腸内細菌、好ましくは大腸菌 (エシ リヒア'コリ、 Escherichia coli)などが好適である。大腸菌などの腸内細菌を用いてタンパクを大量 生産する技術について数多くの知見があるためである。以下、形質転換された大腸 菌を用いて導入されたタンパク質を製造する方法について説明する。
[0048] 目的タンパク質をコードする DNAを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌に おける異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、 T 7プロモータ、 lacプロモータ、 trpプロモータ、 trcプロモータ、 tacプロモータ、ラムダ ファージの Pプロモータ、 Pプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。
R L
[0049] これらの目的タンパク質をコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取り フレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な 配列の合成 DNAを利用すればょ ヽ。
[0050] また、生産量を増大させるためには、タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列で あるターミネータを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、 T7 ターミネータ、 fdファージターミネータ、 T4ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子 のターミネータ、大腸菌 trpA遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
[0051] 目的タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、 いわゆるマルチコピー型のものが好ましぐ ColEl由来の複製開始点を有するプラス ミド、例えば pUC系のプラスミドや pBR322系のプラスミドある!/ヽはその誘導体が挙げ られる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および Zまたは逆位 などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変 異剤ゃ uv照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。よ り具体的には、ベクターとしては、 f列えば、、 pUC19、 pUC18、 pBR322、 pHSG299
、 pHSG298、 pHSG399、 pHSG398、 RSF1010、 pMW119、 pMW118、 pMW
219、 pMW218等を用いることができる。他にもファージ DNA、トランスポゾン DNA のベクターも利用できる。
[0052] また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマ 一力一を有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ 発現ベクターが市販されて 、る (PUC系（宝酒造 (株)製）、 pPROK系（クローンテツ ク製）、 PKK233-2 (クローンテック製）ほ力）。
[0053] プロモータ、ペプチド生成酵素またはペプチド生成酵素と他のタンパク質との融合 タンパク質をコードする遺伝子、ターミネータの順に連結した DNA断片と、ベクター DNAとを連結して糸且み換え DNAを得る。
[0054] 得られた組み換え DNAを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、 目的タンパク質が発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通 常用いられる株を使用することができる力 例えば、大腸菌 K12亜種の一種であるェ シエリヒア'コリ JM109株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選 另1 Jする方法は Molecular Cloning, 2nd edition, Cold bpnng Harbor press (1989)等に記載されている。
[0055] 生産培地としては、 M9—力ザミノ酸培地、 LB培地など、大腸菌を培養するために 通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクター のマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
[0056] 目的タンパク質の回収は、上記にて説明したタンパク質の分離、精製と同様の手法 により行うことができる。
[0057] 1-4 副産物生成を抑制する反応条件下で製造する形態
L—フシトール力 L—フクロース以外の副産物を生成してしまう微生物等を用いた 場合であっても、副産物の生成を抑制する条件下で L—フシトールの酸ィ匕反応を行う ことにより、工業的な生産方法として耐えうる L—フクロースの製法とすることができる。 副産物の生成を抑制するためには、例えば、 pH条件を調整する、副産物生成を司 る酵素を選択的に阻害する阻害剤を加えるなどの手法をとり得る。
[0058] 副産物の生成を抑制し得る pH条件は、微生物の種類等によって異なるため、微生 物の種類に応じて予備実験を行う。予備実験は、例えば下記実施例に示すような条 件にて行うことができ、下記実施例に基づけば当業者は容易に副産物を抑制する p H条件を設定し得る。
[0059] 副産物の生成を抑制するために、反応系に、副産物の生成阻害剤を添加してもよ い。阻害剤は、 L—フシトールからの L—フクロースの生成はまったく阻害しないものが 望ましいが、相対的に副産物の生成に比べて L—フクロースを十分に生成し得るもの であれば、使用可能である。副産物の生成阻害剤としては、例えば、 2価イオンキレ ート剤などが挙げられ、好ましくは、 EDTA (エチレンジァミン四酢酸塩)などが挙げら れる。
[0060] 1-5 NAD供給系
下記実施例に示されるように、 L—フシトールカゝら L フクロースを生成する活性を有 するタンパク質は、 NAD依存性を有することが示された。この場合、 NADは生成す る L フクロースとモル数で等量必要となる力 NADは高価であり、工業的生産を考 える場合、等量の NADの添カ卩はその生産価格の点で不利である。係る知見に基づ き、 L フクロース生成の際に NADから変換生成する NADHから、 NADを再生成す る活性を有するタンパク質の存在下で、 L フシトールカゝら L—フクロースを生成せしめ る、 L フクロースの製造方法が提供される。 NADが供給される反応系とすることによ り、連続的に効率よく L—フクロースの生産が可能であり、工業生産として極めて有利 である。
[0061] NADHから NADを生成する活性を有するタンパク質は、 L—フシトールから L—フク ロースを生成する能力を有する微生物が有している場合があり、この場合その微生 物またはその微生物の菌体処理物を反応系に加えればよいことになる。また、反応 系に NADHカゝら NADを生成する活性を有するタンパク質が存在しな ヽ場合には、 この活性を有するタンパク質を添加すればょ ヽ。 NADHカゝら NADを生成する活性 は、多くのデヒドロゲナーゼ類が有しており、これらデヒドロゲナーゼの還元活性を利 用すれば良いが、この場合、 NADHは補酵素として利用されるため、他にこの反応 の基質も併せて添加する必要がある。これらデヒドロゲナーゼ類の他、 NADHを NA Dに酸化するォキシダーゼやペルォキシダーゼを用いることもできる。 NADHォキシ ダーゼでは反応に必要な基質は酸素であり、ペルォキシダーゼでは過酸化水素で ある。前者の場合は、反応液を攪拌する等によって反応液中に容易に供給すること 力 Sできるし、後者の場合でも過酸ィヒ水素は非常に安価であり、費用の点で有利であ る。これらォキシダーゼ、ペルォキシダーゼは、公知のものを用いることができ、巿販 品も存在する。
[0062] 2. Lーフコースの製造方法
次に、本発明の L—フコースの製造方法について説明する。本発明の L—フコースの 製造方法は、上記本発明の L—フクロースの製造方法に従い、 L—フクロースを生成 する L—フクロース生成工程と、 L—フクロースから L—フコースを生成する、 L—フコース 生成工程とを含むものである。上記各行程は、別個の反応系において行っても、同 一反応系において行ってもよい。 L—フクロースの原料となる L—フシトールは、上記で 説明したとおり、 D—ガラクトースという安価な材料力も容易に得られ、また本発明の方 法は簡便であることから、本発明の L—フコースの製造方法は、簡便で、コストを低減 することができる工業的優れた方法である。
[0063] L—フクロース生成工程は、上記「1. L—フクロースの製造方法」の欄にて説明したと おりである。本発明の L—フクロースの製造方法においても、上記の様々な実施形態 が採用され得る。
[0064] 次に、 L—フコース生成工程について説明する。 L—フクロースから L—フコースを生 成する方法は、例えば、特許文献 5などに示されている。より具体的には、好ましくは L—フコースイソメラーゼが用いて、 L—フコースを得る。 L—フコースイソメラーゼは、例 えば、 National Center for Biotechnology Information等のァータベースに酉己歹 [J力 登録されている。
[0065] L—フコースイソメラーゼを用いる場合、 Lーフコースイソメラーゼを発現するように形 質転換された微生物を作製して Lーフコースイソメラーゼを生成させ、 Lーフコースイソ メラーゼを単離して用いてもょ 、し、 Lーフコースイソメラーゼを発現するように形質転 換された微生物またはこの微生物の菌体処理物を用いてもょ 、。形質転換体の作製 は、上記「1一 3 遺伝子操作株を用いる実施形態」の欄で説明した手法と同様にして 行うことができる。
[0066] 本発明の L—フコースを製造する方法の好ましい一実施形態として、共発現体を作 製し、これを用いて一つの反応系にお 、て L—フシトール力も L—フコースを生成する 形態が挙げられる。すなわち、 L—フシトール力も L フクロース以外のケトへキソース を生成する能力を実質的に有せず、 L フシトール力 L フクロースを生成するデヒ ドロゲナーゼ活性を有する微生物由来タンパク質および L フクロース力も L フコー スを生成する活性を有するタンパク質を発現可能に形質転換された微生物ならびに 当該微生物の菌体処理物のうちの少なくとも一方の存在下で、 L フシトール力 L フコースを生成せしめる。上記のような共発現体を作製して、これを用いることにより、 工程を簡略ィ匕することができ、工業的生産として極めて有用である。
[0067] 3. L フシトールから L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク 質およびこれをコードするポリヌクレオチド
L フシトール力 L フクロース以外のケトへキソースを生成する能力を実質的に有 せず、かつ L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する タンパク質として具体的には下記 (A)または (B)のタンパク質が挙げられる。
(A)配列番号 16に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号 16に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 L フシトールから L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタン パク質
[0068] 上記（A)のタンパク質は、 Gluconobacter oxydans IFO 3255などから単離し得る 。本発明のタンパク質としては (A)と実質的に同一のタンパク質も含まれ、具体的に は（B)のタンパク質力これに該当する。さらに、表 1に記載の各菌株等からも実質的 に同一のタンパク質は単離し得る。し力しながら、上記配列によって特定される本発 明のタンパク質等は、その単離由来等に限定されるものではない。下記に詳説するよ うに、上記の配列に基づき遺伝子組換え技術を用いて形質転換微生物等を作製し、 上記タンパク質を製造することができる。 [0069] ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類に よっても異なるが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない 範囲のものであり、具体的には、 2— 100個、好ましくは 2— 50個、さらに好ましくは 2 一 30個、さらに好ましくは 2— 10個である。ただし、（B)タンパク質のアミノ酸配列に おいて 1または数個の置換、欠失、挿入、付加および逆位力 なる群より選ばれる 1ま たは数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列の場合には、 30°C、 pH9. 5の条件下 で、（A)のタンパク質の半分程度以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90 %以上、特に好ましくは 95%以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
[0070] 上記 (B)に示されるようなアミノ酸の変異は、例えば部位特異的変異法によって、 本タンパク質をコードする遺伝子の特定部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加な どされるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変され た塩基配列を有するポリペプチドは、従来知られて!/、る突然変異処理によっても取 得され得る。突然変異処理としては、（A)をコードする DNAをヒドロキシルァミン等で インビトロ処理する方法、及び (A)をコードする DNAを保持するェシエリヒア属細菌 を、紫外線照射または N-メチル -N'--トロ- トロソグァ二ジン (NTG)もしくは亜 硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げ られる。
[0071] また、上記のような塩基改変に伴うアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、および逆位 等の変異には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。 上記のような変異を有する DNAを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性 を調べることにより、配列番号 16に記載のタンパク質と実質的に同一のタンパク質を コードする DNAは得られる。
[0072] 本発明の製造方法で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 配列番号 16に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。コドン の縮重により、 1つのアミノ酸配列を規定する塩基配列は複数あり得る。すなわち、本 発明のポリヌクレオチドには下記のタンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌク レオチドが含まれる。
(A)配列番号 16に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質 (B)配列番号 16に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 L フシトールから L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタン パク質を有するタンパク質
[0073] 配列番号 16に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列として配列番号 15に記載 の塩基配列が例示される。さらに、配列番号 15に示す塩基配列を有する DNAと実 質的に同一のポリヌクレオチドとして次のようなポリヌクレオチドが挙げられる。配列番 号 15に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこ れを保持する細胞などから、配列番号 15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列か らなるポリヌクレオチドもしくは同塩基配列から調製されるプローブとストリンジェントな 条件下でハイブリダィズし、かつ、 L フシトールから L フクロースを生成するデヒドロ ゲナーゼ活性を有する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離 することによって、配列番号 15に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドと実質的 に同一のポリヌクレオチドが得られる。
[0074] すなわち、本発明のポリヌクレオチドとして好ましくは、具体例として下記 (a)または（ b)に示すポリヌクレオチドが挙げられる。
(a)配列番号 15に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(b)配列番号 15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと ストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ L フシトールから L フクロースを生 成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
[0075] プローブは、例えば配列番号 15に記載の塩基配列に基づ 、て定法により作製す ることができる。また、プローブを用いてこれとハイブリダィズするポリヌクレオチドをつ り上げ、 目的とするポリヌクレオチドを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例 えば、 DNAプローブはプラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列 を増幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調 製することができる。切り出す箇所は、 目的とする DNAに応じて調節することができる
[0076] ここで 、う「ストリンジェントな条件」とは、 、わゆる特異的なハイブリッドが形成され、 非特異的なハイブリッドが形成されな 、条件を 、う。この条件を明確に数値ィ匕するこ とは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い DNA同士、例えば 50%以上、より 好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上の相同 性を有する DNA同士がハイブリダィズし、それより相同性が低い DNA同士がハイブ リダィズしな!/、条件、あるいは通常のサザンハイブリダィゼーシヨンの洗!、の条件であ る 60°C、 1 X SSC、 0. 10/0SDS、好ましく ίま、 0. 1 X SSC、 0. 10/0SDSにネ目当する 塩濃度でノ、イブリダィズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダィズする 遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性 を失ったものも含まれる力 それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当 な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を下記実施例に記載の方法で測定する ことによって容易に取り除くことができる。
[0077] なお、上記のように、 (B)のタンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチ ドおよび上記 (b)のポリヌクレオチドの場合には、 30°C、 pH9. 5の条件下で、配列番 号 1の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上、 より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上の L フシトール力も L フクロー スを生成するデヒドロゲナーゼ活性を保持して 、るタンパク質をコードして 、ることが 望ましい。
[0078] 配列番号 15の塩基配列を有する DNAは、例えば、 Gluconobacter oxydans IFO
3255または IFO 3171の染色体 DNA、もしくは DNAライブラリーから、 PCR( polymerase
chain reactionゝ White,T.J. et al ； Trends Genet., 5, 185(1989)参照）またはハイ ブリダィゼーシヨンによって取得することができる。 PCRに用いるプライマーは、例え ばペプチド生成活性を有する精製タンパク質に基づいて決定された内部アミノ酸配 列に基づいて設計することができる。 PCR用のプライマーとして、 5'非翻訳領域及び 3'非翻訳領域に対応する配列を有するプライマーを用いると、本タンパク質のコード 領域全長を増幅することができる。
[0079] プライマーの合成は、例えば、 Applied Biosystems社製 DNA合成機 model 380B を使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）常 法に従って合成できる。 PCR反応は、例えば Gene Amp PCR System 9600 ( PERKIN ELMER社製）及び TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (Takara Bio Inc.製)を用い、各メーカーなど供給者により指定された方法に従って行うことがで きる。
[0080] 上記のポリヌクレオチドを用いて、発現ベクターなどの糸且換えポリヌクレオチドおよび 形質転換体を作製する方法については、上記「1 3 遺伝子操作株を用いる形態」 の欄にて説明したとおりである。
[0081] 4. NADHォキシダーゼ活性を有するタンパク質およびこれをコードするポリヌクレオ チド
上記のように、本発明のフクロースの製造方法の好ま 、形態一形態としては NA DHォキシダーゼを反応系内に添加する形態が挙げられる。ここで用いられる NAD Hォキシダーゼの具体例としては下記 (C)または (D)のタンパク質が例示される。
(C)配列番号 18に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号 18に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 NADHォキシダーゼ活性を有するタンパク質
[0082] 上記（C)のタンパク質は、 Gluconobacter oxydans IFO 3255などから単離し得る 。本発明のタンパク質としては (C)と実質的に同一のタンパク質も含まれ、具体的に は（D)のタンパク質力これに該当する。さらに、表 1に記載の各菌株等からも実質的 に同一のタンパク質は単離し得る可能性もある。
[0083] 上記にいう「数個」の意義、変異の導入方法や種類等は、上記「3. L フシトールか ら L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびこれをコ ードするポリヌクレオチド」における説明と同様である。し力しながら、上記配列によつ て特定される本発明のタンパク質等は、その単離由来等に限定されるものではない。
[0084] 本発明の製造方法で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 配列番号 18に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが例示される。コドン の縮重により、 1つのアミノ酸配列を規定する塩基配列は複数あり得る。すなわち、本 発明のポリヌクレオチドには下記のタンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌク レオチドが含まれる。
(C)配列番号 18に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号 18に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 NADHデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
[0085] 配列番号 18に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列として配列番号 17に記載 の塩基配列が例示される。すなわち、本発明のポリヌクレオチドとして好ましくは、具 体例として下記 (c)または (d)に示すポリヌクレオチドが挙げられる。
(c)配列番号 17に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(d)配列番号 17に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ NADHデヒドロゲナーゼ活性を有す るタンパク質をコードするポリヌクレオチド
[0086] 「ストリンジヱントな条件」、単離のためのプローブやプライマーの作製方法、これら を利用した DNAの単離方法などは、上記「3. L フシトール力 L フクロースを生成 するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質およびこれをコードするポリヌクレオチ ド」における説明と同様である。
[0087] NADHォキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターなどの糸且換えポリ ヌクレオチドに組み込む場合、上記のポリヌクレオチドを単独で組み込んだ組換え体 を作製してもよいし、あるいは、「L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲ ナーゼ活性を有するタンパク質」をコードするポリヌクレオチドと共に同じ組換え体に 組み込んでもよい。さらに、形質転換体を作製する場合においても、上記 NADHォ キシダーゼを発現する形質転換体と、 L フシトールカゝら L フクロースを生成するデヒ ドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を発現する形質転換体とを別個に作製してもよ いし、あるいは同じ微生物内で共発現するように設計してもよい。但し、本発明のよう に他のデヒドロゲナーゼと共に用いて、 NADの再生系として用いる場合には、デヒド ロゲナーゼ、 NADHォキシダーゼ、および NADは同じ反応場に存在することが必 要であり、生産された酵素を用いる酵素反応、細胞膜を破砕した菌体処理物を用い る場合は、デヒドロゲナーゼと NADHォキシダーゼをそれぞれ別の宿主で生産して も良いが、未処理の菌体を触媒として用いる場合には、両酵素を同一の宿主内に共 発現させることが望ましい。
実施例
[0088] 以下、実施例を挙げ、本発明についてより詳細に説明するが、本発明は下記実施 例に限定されるものではない。
[0089] 実施例 1 : L フシトール（L-focitol)を酸化し、 L フクロース（L-foculose)を生成す る微生物の探索 1
YPG寒天培地（10 g/1 glycerol, 0.3 g/1 yeast extract, 0.3 g/1 peptone, 20 g/1 agar, pH 6.5)で 30°C、 18— 66時間培養することによりリフレッシュした酢酸菌 菌株を、 120°C、 20分のオートクレーブにより滅菌した 10 g/1 (61 mM) L フシトー ノレ, 10 g/1 glycerol, 3 g/1 yeast extract, 3 g/1 peptone, 20 g/i し aCO ,
3 pH 6.5からなる液体培地 0.5 ml〖こ 1白金耳シードし、 30°Cで 42時間振盪培養した。 培養は 1ゥエルあたり 2 ml容の 96穴マイクロプレートを用いた。培養液から遠心操作 により菌体を除去し、遠心上清を高速液体クロマトグラフィー (HPLC)解析にて分析し 、生成した L-フクロース濃度を定量した。 HPLC分析条件は、
カラム： Shodex製 Sugar SC1011、直径 10 mm、長さ 300 mm
カラム温度： 75°C
移動相： 50 ppm Ca-EDTA in H O
2
'Λ-2 ml/min
検出:示差屈折 (RI)検出器
である。
[0090] この分析により、 Lーフコースは分析時間約 7.6分、 L フシトールは分析時間約 11.9 分、 L フクロースは分析時間約 13.6分にそれぞれ溶出した。 L フシトールおよび L フコースは Sigma社製の巿販標品を標準化合物として用いることにより、その溶出位 置確認と分析標品中の濃度算出を行った。 L フクロース標準標品は市販品を入手 することができないため、下記詳細する Lーフコースイソメラーゼによって Lーフコース 力も生成する物質を L フクロースとみなした。また、この場合、残存 Lーフコースと生 成 L フクロースのチャート上での両ピークの積分値（ピークエリア値）の和は、 Lーフコ ースイソメラーゼの作用の前後でほぼ変化なく一定であったため、単位濃度あたりの L—フクロースの示すピークエリア値は、同 Lーフコースの示すそれと同じとみなし、分 析標品中の L フクロース濃度を算出した。なお、検出限界はいずれも、下記実施例 の分析の場合には 1 mM程度である。また多くの分析において、そのピークエリアの 大きさから L-フシトール由来の変換物と思われる未同定ピークが分析時間約 8.0分に 観察された。この分析時間約 8.0分に溶出する未同定物質 (以下 BPと呼ぶ)の濃度検 定は、便宜上、 L フクロース同様、 Lーフコースの単位濃度あたりのピークエリア値を 用いて算出した。分析結果を表 1に示す。なお、以下、「Gluconobacter」は、「に」と、 また「Acetobacter」は「A.」と略記する場合がある。
[表 1]
表 1 L一フシトールから L一フクロースを生成する微生物 1
Figure imgf000032_0001
Gluconobacter oxydans IFO 3171 14.4 25.5 6.9 36.1
G. frateuri IF03264 14.1 27.3 16.2 34.1
G.。A cfe"s ATCC621 12.3 1 7.3 20.0 41.6
Acetobacter melanogenus IF03190 12.2 1 7.3 20.5 41.4
G. ?¾te""7IF03268 1 1.6 18-7 29.0 38.3
G. roseus AJ2840 10.3 13.1 22.9 44.0
G. cerinus W032&2 10.2 14.5 26.2 41.3
G. oxydans 1 03255 9.1 14.5 36.4 38.6
G. roseus Α 28 5 9.0 1 7.0 23.9 34.6
G. oxydans subsp. suboxydans AJ2866 7.8 21.9 23.9 26.3
G. roseus AJ28A3 7.7 13.8 28.1 35.8
G. oxydans W03294 7.6 15.5 28.0 32.9
G. ce 77i/s IF03276 6.9 1 1.6 37.3 37.3
G. suboxydans AJ2849 6.3 15.4 26.5 29.0
A. melanogenus AJ2867 5.8 10.5 36.0 35.6
G. cerinus YFOZlQl 5.5 10.2 39.4 35.0
G. frateuriiVFQZ25A 4.9 8.9 46.2 35.5
A. turb/dans AJ2908 4.0 7.3 42.9 35.4
G. suboxydans AJ2846 3.9 10.2 31.4 27.7
G. xylinus subsp. xylinus ATCC53582 3.6 0.0 54.8 100.0
A. aurantius WOZl^ 3.1 7.5 40.1 29.2
G. melanogenus AJ2876 2.9 7.9 39.9 26.9
G. oxydans IF014819 2.4 8.9 49.0 21 .2
G. sc/ero/deus A02838 1.4 2.5 45.3 35.9
G. suboxydans AJ2841 1.3 3.6 46.2 26.5
G. xylinus subsp. xylinus ATCC23767 1.1 1.0 52.2 52.4
G. oxydans WO 3189 1.0 0.1 54.1 90.9
*実施例 1の条件にて、 1 mM以上の L- -フクロースを生成した微生物を記す。
上記菌株のうち、 ATCC番号が記載されているものは、アメリカン 'タイプ ·カルチヤ 一 ·コレクション（P.O.Box 1549 Manassas, VA 20110, the United States of America)に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。上記菌株 のうち、 IFO番号が記載されているものは、財団法人発酵研究所（日本国大阪巿淀 川区十三本町 2丁目 17— 85)に寄託されたものである力 平成 14年 6月 30日以降、 その業務は独立行政法人製品評価技術基盤機構 (ΝΙΤΕ) ·バイオテクノロジー本部 (DOB) '生物遺伝資源部門（NBRC)に移管され、 NBRCより上記 IFO番号を参照 して分譲を受けることができる。 [0093] 実施例 2 : L フシトールを酸ィ匕し、 L フクロースを生成する微生物の探索 2
L フシトールに構造の類似したズルシトール（dulcitol)による L フシトール酸化酵 素の発現誘導を試みる意味で、 YP-dulcitol寒天培地（10 g/1 dulcitol, 0.3 g/1 yeast extract, 0.3 g/1 peptone, 20 g/1 agar, pH 6.5)で 30°C、 18— 66時間培 養することによりリフレッシュした酢酸菌の菌株を、 120°C、 20分のオートクレープによ り滅菌した 10 g/1 L フシトール， 3 g/1 yeast extract, 3 g/1 peptone, pH 6.5 力もなる液体培地 0.5 mlに 1白金耳シードし、 30°Cで 42時間振盪培養した。この培養 液を実施例 1と同様に分析を行った。分析結果を表 2に示す。
[0094] [表 2]
表 2 L—フシ! ^一ルから L一フク口一スを生成する微生物 2
L—フクロース Z
L一フク L一
BP フシト
( L—フクロース
Strain ロース —ル
(mM) + BP)
(mM) (mM)
(wt% )
G. xylinus subsp. xylinus ATCC53582 7.8 0.0 48.5 100.0
Gluconobacter roseus AJ2840 3.8 6.9 49.9 35.5
G. oxydans subsup suboxydans AJ2866 3.6 10.4 34.5 25.7
G. oxydansWmi55 1.6 6.2 41.7 20.5
G. ox o^ns IFO 3189 1.6 0.1 57.6 94.1
*実施例 2の条件にて、 1 mM以上の L- -フクロースを生成した微生物を記す。
[0095] 実施例 1、 2のいずれにおいても L フシトールを原料に L フクロースを生成するグ ルコノバクタ一（Gluconobacter)属ある!/、はァセトパクター（Acetobacter)属に属する 酢酸菌が複数見出された力 その多くは L フクロース以外の BPをも同時に生じ、 L フクロースのみを生成する微生物はダルコノバクタ一.キシリナス ·サブスピーシシー ズ-キシリナス（Gluconobacter xylinus subsp. xylinus) ATCC53582株の 1株のみで あった。ダルコノバクタ一'キシリナス ·サブスピーシーズ'キシリナス ATCC53582株の 他、ダルコノバクタ一.キシリナス'サブスピーシーズ'キシリナス ATCC23767株、グル コノバクタ^ ~ ·ォキシダンス（Gluconobacter oxydans) IFO 3189株は、 L フクロース および BPの合計生成量に対し、 L フクロースの生成量が 50%以上となることが示さ れた。
[0096] 実施例 3： HPLC解析で L-フクロースと想定された物質の同定
HPLC解析で L フクロースと想定された物質の同定を行うため、 Lーフコースイソメラ ーゼ（L- focose isomerase)を用 、たバイオアツセィを検討した。
[0097] Lーフコースイソメラーゼ（EC 5.3.1.3. 以下「FucI」と記載する）は L フクロースと L ーフコース (L-foC0se)間の異性ィ匕を触媒する酵素であり、実施例 1あるいは 2で Lーフ クロースと想定された化合物が L フクロースであれば、 Fuelの添カ卩により Lーフコース に変換されると考えられた。 L-フコースは市販品（例えば Sigma社製など）が存在し、 これを標準化合物として用いた HPLC解析、あるいは特許 3132913号公報記載の L フコースデヒドロゲナーゼ（L-focose dehydrogenase)を用いた比色定量が可能であ る。
[0098] まず、 Fuelを以下のように調製した。 Fuelは E. coli K12株由来の Fuelを用いること とし 7こ。本酵 は National し enter for Biotechnology Informationのァ ~~タへ' ~~ス に Accession number AAC75844株として登録されている。本酵素を E. coliにて大 量発現させる目的で、またこの際、精製を容易にする目的で、 Fuelの N末端にヒスチ ジン タグを挿入させることを目的として、 Fuelの発現ベクターとして QIAGEN社より発 売されている PQE30を用いることとした。 pQE30のマルチクローユングサイト中の Sphl 及び Hindlllサイト間に Fuel遺伝子（foci)を挿入するため、下記の PCRプライマー 1 ( 配列番号 1)、 PCRプライマー 2 (配列番号 2)を作成し、常法により得た E. coli W3110株由来のゲノミック DNAをテンプレートとした PCRを行い、約 1.8 kbp長のフラ グメントを得た。このフラグメントおよび pQE30ベクターを Sphlおよび Hindlllで消化、精 製後、ライゲーシヨンし、 N末端に His-Tag配列を有する Fuelタンパク質 (以下、 FucIH6と記載する）発現用のプラスミド pQE30FucIH6を作成した。このプラスミド上に コードされる遺伝子によって形成される fodH6の全塩基配列および予想されるァミノ 酸配列を以下の配列番号 3、 4にそれぞれ記す。本プラスミドを用いて E. coli JM 109株を形質転換し、 FucIH6発現株 E. coli _JM109/pQE30FucIH6を作成した。
[0099] 本菌株を、 LB培地を用いて 37°Cで培養し、培養途中その培養液の 600nmにおける 吸光度がおよそ 0.4となったところで終濃度 1 mMの IPTGを添加することにより fodH6 の発現誘導を行った。誘導後 2時間培養を継続した後、得られた培養液を遠心操作 により集菌し、得られた菌体を 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)で洗浄した。得られた洗 浄菌体を 200 W、 10分の超音波処理にて破砕し、この破砕物の遠心上清を粗酵素 溶液とした。この粗酵素溶液に、それぞれ終濃度で 10 mMの Imidazoleと 0.3 Mの NaClをカ卩え、 50 mM Tris— HCl (pH 8.0), 10 mM Imidazole, 0.3 M NaCl (これ を緩衝液 Wと呼ぶ）にて平衡化した lml容の Ni-NTA resin (QIAGEN社製）と混合し、 一晩振盪することにより His-Tag配列を有するタンパク質をレジン (resin)に結合させ た。振盪後、遠心操作によってレジンを回収し、更に緩衝液 Wによって数回レジンを 洗浄した後、レジンをカラムに移した。次に 0.2 M Imidazoleの添カ卩により吸着タンパ ク質をレジンから溶出した。得られた溶出画分は 50 mM Tris- HCl (pH 8.0)、 1 mM 2-mercaptoethanoU 0.1 mM MnClに対して透析し、更に必要に応じて膜濃
2
縮して後の実験に用いた。得られた酵素溶液を SDS-PAGEに供したところ、 FudH6と 思われる分子量およそ 67 kDaのバンドがほぼ単一の状態で観察された。
[0100] L フシトールの酢酸菌による変換実験に用いる供試菌株として、下記表 3に掲げる 菌株を用いた。リフレッシュした各菌株を 0.5 mlの滅菌した 10 g/1 L フシトール， 10 g/1 glycerol, 3 g/1 yeast extract, 3 g/1 peptone, pH 6.5力らなる液体培 地 0.5 ml〖こ 1白金耳シードし、 30°Cで 42時間振盪培養した。但しこの際、ダルコノバ クタ^ ~ ·キシリナス'サブスピーシーズ ·キシリナス（Gluconobacter xylinus subsp. xylinus) ATCC53582株の場合のみ、培地組成からグリセロール（glycerol)を除 、た培 養液を用いた。培養は 1ゥエルあたり 2 ml容の 96穴マイクロプレートを用いた。
[0101] 得られた培養液力も遠心操作により菌体を除去し、等容の 0.2 M リン酸カリウム緩 衝液
(pH 7.0), 2 mM 2— mercaptoethanol, 0.2 mM MnCl , 0.4 mg/ml FucIH6溶液
2
をカロえ（終濃度は各 2分の 1)、 37°Cで 2時間反応させた。この際、 FudH6を加えない 実験区も同時に作成し、コントロールとした。
[0102] 反応終了後、反応液を HPLCにて分析した。 Lーフコースと BPが同時に生成する場 合、互いの溶出位置が近く HPLCでの厳密な定量が困難であったため、このような 場合 Lーフコースは L フコースデヒドロゲナーゼを用いた比色法によっても定量を行 つた。定量は、適宜希釈した FucIH6反応溶液に、終濃度で 0.2 mg/ml Lーフコース デヒドロゲナーゼ（キッコーマン社製、 NADP依存型）， 1 mM NADP, 0.1 M Glycine- NaOH buffer (pH 9.5)となるよう加え、 37°C、 30分反応し、 NADPHの生成 に伴う吸光度の変化を 340nmにて測定することにより行った。測定結果を表 3に示す [表 3] 表 3 L-フシ! ^一ル変換によって生じた化合物の FudH6による変換 (A) With Fuel
比色法 HPLC
L—フコ ヒーフコ L—フク L一フシ卜
Strain BP
—ス —ス 口一ス —ル
(mM)
(m ) (mM) (mM) (mM)
G. x iinus subsp. x ltnus ATCC53582 7.86 6.5 0 1 7.7 34.1
Giuconobacter roseus AJ2840 7.52 7 1.6 0 51 .4
G. oxydans subsup suboxydans AJ2866 7.51 6.4 0 18.5 32.8
G. oxydans W l^ 7.44 6.2 0 19.6 33.5
G. oAyo¾ 7sIF0 3189 7.06 6 0 1 7.3 35.1
G. xyiinus subsp. xyiinus ATCC53582 6.94 5.8 0 25.6 29.1
Giuconobacter roseus AJ2840 6.72 5.2 0 1 7.3 38.3
G. oxydans subsup suboxydans AJ2866 5.41 3.8 0 9.6 44.5
G. oxydansWO^l 5.32 3.8 0 18.6 37.2
G. oxydansWO \m 5.2フ 3.5 0 15.6 41.7
G. s IF0 3189 2.45 1.3 0 9 51 .8
(B) Without Fuel
比色法 HPし C
Lーフコ Lーフコ し一フク L一フシト
BP
Strain ース —ス 口一ス ール
(mM)
(mM) (mM) (mM) (mM)
Giuconobacter oxydans IFO 3171 0.56 0 8 15.1 33.4
G. xyiinus subsp. xyiinus ATCC53582 0.59 0.1 8.2 0 51.6
G. oxyd3ns \F03255 0.75 0 7.3 16 35.5
G. roseus MlQ 0.76 0 7.2 16.1 34.2
G. roseus A 2SA3 0.41 0 7.4 15.8 37.5
G. oxydans C&1\ 0.58 0 7 23.7 29.1
G. frateun7\F0326S 0.41 0 6.6 15.3 38.9
Acetobacter turbidans AJ2908 0.02 0 4.4 7.8 45.8
G. oxydans subsp. suboxydans AJ2866 0.49 0 4.8 17.6 38.1
G, cennus 03261 0.07 0 4.3 12.9 45
G. mefanogenus AJ2876 0.67 0 1.5 6.5 52.7 結果、 HPLC解析にて L-フクロースと想定された物質は、 FudH6との反応により L フコースへと変換され、この結果より、予想通り L フクロースであると確認された。同 時に、本実験結果は、酢酸菌によって L フシトールから生成せしめた L フクロース に、さらに Lーフコースイソメラーゼを作用させることにより、 Lーフコースを生成せしめる ことが可能であることを示している。また、 BPと L-フコースの HPLC上での分離の悪さ より、 Lーフコース定量性が問題となった力 L フコースデヒドロゲナーゼを用いた比 色法による定量結果と良い相関が得られ、 HPLCを用いてもほぼ問題なく定量がなさ れていることが確認された。一方、副生物と考えられる BPは、 FucIH6の添カ卩によって も変換されず、 FucIH6の基質となる L フクロース、 Lーフコースとは異なる化合物であ ることが確認された。
[0105] 配列番号 1： foci遺伝子取得用 5'プライマー塩基配列
GAAGCATGCATGAAAAAAATCAGCTTACCG
[0106] 配列番号 2 :fticl遺伝子取得用 3'プライマー塩基配列
TGTTCAGGCCCGGAAGCTTGAGCGACCGGG
[0107] 配列番号 3 :fticIH6遺伝子塩基配列
atgagaggatcgcatcaccatcaccatcacggatccgcatgcatgaaaaaaatcagcttaccgaaaattggtatccgcc cggttattgacggtcgtcgcatgggtgttcgtgagtcgcttgaagaacaaacaatgaatatggcgaaagctacggccgc actgctgaccgagaaactgcgccatgcctgcggagctgccgtcgagtgtgtcatttccgatacctgtatcgcgggtatg gctgaagccgctgcttgcgaagaaaaattcagcagtcagaatgtaggcctcaccattacggtaacgccttgctggtgct atggcagtgaaaccatcgacatggatccaacccgcccgaaggccatttggggctttaacggcactgaacgccccggcg ctgtttacctggcagcggctctggcagctcacagccagaaaggcatcccagcattctccatttacggtcatgacgttcag gatgccgatgacacatcgattcctgccgatgttgaagaaaaactgctgcgctttgcccgcgccggtttggccgtcgcca gcatgaaaggtaaaagctatctgtcgctgggcggcgtttcgatgggtatcgccggttccattgttgatcacaacttctttg aatcctggctgggaatgaaagtccaggcggtggatatgaccgaactgcgtcgccgtatcgatcagaagatttacgacga agccgaattggaaatggcactggcctgggctgataaaaacttccgctatggcgaagatgaaaataacaaacagtatcaa cgtaatgccgagcaaagccgcgcagttctgcgcgaaagtttactgatggcgatgtgtatccgcgacatgatgcaaggca acagcaaactggccgatattggtcgcgtggaagaatcacttggctacaacgccatcgctgcgggcttccaggggcaac gtcactggaccgatcaatatcccaatggtgacaccgccgaagcgatcctcaacagttcatttgactggaatggcgtgcg cgaaccctttgtcgtggcgaccgaaaacgacagtcttaacggcgtggcaatgctaatgggtcaccagctcaccggcac cgctcaggtatttgccgatgtgcgtacctactggtcaccagaagcaattgagcgtgtaacggggcataaactggatgga ctggcagaacacggcatcatccatttgatcaactccggttctgctgcgctggacggttcctgtaaacaacgcgacagcg aaggtaacccgacgatgaagccacactgggaaatctctcagcaagaggctgacgcttgcctcgccgctaccgaatggt gcccggcgatccacgaatacttccgtggcggcggttactcttcccgcttccttaccgaaggcggcgtcccgttcaccat gactcgtgtcaacatcatcaaaggcctgggaccggtactgcaaatcgcggaaggctggagcgtggaattgccgaagga tgtgcatgacatcctcaacaaacgcaccaactcaacctggccaaccacctggtttgcaccgcgcctcaccggtaaagg gccgtttacggatgtgtactcggtaatggcgaactggggcgctaaccatggggttctgaccatcggccacgttggcgca gactttatcactctcgcctccatgctgcgtatcccggtatgtatgcacaacgttgaagagaccaaagtgtatcgtccttct gcctgggctgcgcacggcatggatattgaaggccaggattaccgcgcttgccagaactacggtccgttgtacaagcgtt aa
[0108] 配列番号 4 :focIH6アミノ酸配列
Figure imgf000038_0001
KR*
[0109] 実施例 4： Fuel発現酢酸菌による L フシトール変換
実施例 3において、酢酸菌による L フシトールからの L フクロースの生成と、 Fuel を用いた L フクロースの Lーフコースへの変換が可能であることが示された。 L フシト ールを原料とする Lーフコースの生産を考えた場合、実施例 3のように L フシトールか らの L フクロースの生産と、 L フクロースからの Lーフコースへの生産を分離して行う ことも可能であるが、同反応が同時に行えることは実生産を考えた場合、工程を簡略 化できる点で有利である。特に、酢酸菌自体に L フクロース力も Lーフコースへの変 換能を保持させることができれば、単一の菌株によって L フシトール力 Lーフコース の生産が可能となり、有利な方法であると考えられた。
[0110] この目的のため、 L—フシトールから L フクロース生成能を有する G. oxydans
IF03171株を代表として、 E. coli由来の Fuelを発現する株の構築を行うこととした。酢 酸菌における特定タンパク質発現系の例として、例えば Biosci. Biotechnol.
Biochem., 67: 584-591 (2003)に記載のプラスミド pSA19を利用する方法の利用が 可能である。実施例 3に記載の方法と同様に PCRによって E. coli由来の Fuel全長を コードする遺伝子断片を得て、これを pSAのマルチクローユングサイトに挿入すること により酢酸菌用の Fuel発現プラスミド pSA19Fudを作成した。但し、実施例 3とは異な り、 Fuelに His-Tagは挿入せず、野生型の Fuelを発現させることとし、 E. coliからの PCRクローユングの際に用いるプライマーとしては配列番号 5、 6記載のものを用いた 。これにより、予想される発現 Fuelのアミノ酸配列および pSA19FucI上に挿入される foci遺伝子は野生型酵素と同じとなる。得られた pSA19FucIによる G. oxydans IF03171株の形質転換法も前述の文献を参考に行つた。
[0111] 配列番号 5 :fod遺伝子取得用 5'プライマー塩基配列
AACTGAATTCATTTTCCGAATAAAGTGAGG
[0112] 配列番号 6 :fod遺伝子取得用 3'プライマー塩基配列
GTTCAGGCCCTGCAGCCGGAGCGACCGGGC
[0113] 得られた形質転換体 G. oxydans IF03171/pSA19FucIを YPG寒天培地上でリフレ ッシュした後、 10 g/1 L—フシトール， 10 g/1 glycerol, 3 g/1 yeast extract, 3 g/1 peptone, pH 6.5からなる液体培地 3 mlに 1白金耳シードし、 30°Cで 18時間振 盪培養した。得られた培養液を 1 ml分から遠心操作操作により菌体を得た後、 0.1 M トリス塩酸緩衝液 （pH 8.0)を用いて洗浄した。洗浄菌体を 0.5 mlの同緩衝液に 再懸濁し、終濃度 10 g/1となるよう L フシトールをカ卩え、 1ゥエルあたり 2 ml容の 96穴 マイクロプレートを用いて 30°C、 90時間反応させた。反応後、反応液から遠心操作に より菌体を除去し、上清を HPLC解析した。なお、算出された生成物および残存基質 濃度の総和は、変換反応開始時の基質濃度を上回ったが、これは変換反応中の反 応溶液の蒸発に由来するものと考えられた。解析結果を図 2に示す。図 2中、 WTは 野生株を、 + Fuelは Fuel発現株を示す。
[0114] 結果、野生株を用いた変換で生成して 、た L フクロースは、 Fuel発現株では Lーフ コースにまで変換されるという予想通りの効果が見られた。これにより、酢酸菌単独の 変換による L フシトールからの Lーフコースの生産が可能となった。
[0115] 実施例 5 :L フシトール力もの L フクロース生成時の副生物（BP)低減の試み 1 ;反 応 pHのコントロール
L フシトールを原料とする L フクロース生産における問題点である BPの生成を抑 制する目的で、反応 pHの検討を行った。
[0116] 供試菌株として G. oxydans IF03255株， G. oxydans IF03171株， G. roseus AJ2840株および A. turbidans AJ2908株を用いた。 YPG寒天培地上でリフレッシュし た菌株を滅菌した 10 g/1 glycerol, 10 g/1 L—フシトール， 0.3 g/1 yeast extract, 0.3 g/1 peptone, 20 g/1 CaCO , pH 6.5からなる液体培地に 1白金耳
3
シードし、試験管で 30°C、 42時間培養した。得られた培養液を 1 mlずつ分注し、遠 心操作操作により菌体を得た後、 0.1 M リン酸カリウム緩衝液 (pH 6.0)、 0.1 M ト リス塩酸緩衝液 （pH 8.0)、または 0.1 M グリシン NaOH緩衝液 （pH 8.8)を用いて 洗浄した。洗浄菌体を 0.5 mlのそれぞれの洗浄液に再懸濁し、終濃度 10 g/1となる よう L フシトールを加え、 1ゥエルあたり 2 ml容の 96穴マイクロプレートを用いて 30°C 、 66時間反応させた。反応後、反応液から遠心操作により菌体を除去し、上清を HPLC解析した。解析結果を図 3に示す。図中 NTは実験未実施を示す。
[0117] 結果、いずれの菌株を用いた場合においても、反応 pHの上昇に伴い L フクロース の生成量は増大したが、 BPの生成量は pH8において極小化した。
[0118] 実施例 6 : L フシトールからの L フクロース生成時の副生物（BP)低減の試み 2 ;
EDTAの添カロ
L フシトールを原料とする L フクロース生産における問題点である BPの生成を抑 制する目的で、反応液中への EDTAの添加効果を検討した。
[0119] 供試菌株として G. oxydans IF03255株を用いた。実施例 5と同様に得た培養液（ 但し培養時に CaCOは無添加）を 1 mlずつ分注し、遠心操作操作により菌体を得た
3
後、 0.1 M リン酸カリウム緩衝液 (pH 6.0)を用いて洗浄した。洗浄菌体を 0.5 mlの 同緩衝液に再懸濁し、終濃度 10 g/1となる L フシトール、および終濃度 10 mMとな る EDTAまたは MgClをカ卩え、 1ゥエルあたり 2 ml容の 96穴マイクロプレートを用いて
2
30°C、 90時間反応させた。反応後、反応液から遠心操作により菌体を除去し、上清を
HPLC解析した。解析結果を図 4に示す。
[0120] 結果、 EDTA添カ卩により、 L フクロース生成量は影響を受けないものの、一方で副 生物 BP生成量は著しく減少し、ほぼゼロとなった。
[0121] 実施例 7 : L フシトール力もの L フクロース生成時の副生物（BP)低減の試み 3 ; sldA遺伝子の破壊
実施例 5、 6で示した方法は、 L フシトールを原料とする L フクロース生産時の BP の生成抑制に効果的であることが示された。
[0122] 実施例 5、 6の結果から、 L フシトール力 L フクロースを生成する酵素と BPを生 成する酵素がそれぞれ独立して存在する可能性が示されたため、 BPの発生を抜本 的に解決するための他の手法として、 BP生成を司る酵素を欠損させることが有効で あると考えられた。
[0123] 酢酸菌を用いた L フシトールの変換に関わる先行文献として、例えば Journal of American Chemical Society 72: 4934-4937 (1950) (非特許文献 2)や Canadian Journal of
Chemistry 45: 741-744 (1967) (非特許文献 3)がある。これらの中では、酢酸菌ょ つて L—フシトールが酸化され、結果、 L フクロースと 1—デォキシー D—グリセ口— 3— へタスロース（1- deoxy- D- glycero- 3- hexulose)が生成すると記載されて 、る。我々が 行った結果においても L フクロースと未同定物質 (BP)が酢酸菌による L フシトール 酸ィ匕物として検出されたことから、未同定物質 (BP)は、先行文献に記載の 1 デォキ シー D—グリセ口— 3—へタスロース（1- deoxy- D- glycero- 3- hexulose)である可能性が 強く示唆される。先行文献の中でも、これら物質を生成する酵素は独立して存在して いる可能性が議論されているが、独立存在の証明、あるいはそれぞれの反応を司る 酵素の同定はなされて 、な 、。
[0124] 別の先行文献として、 Biosci. Biotechnol. Biochem. 65: 2755-2762 (2001)には 、酢酸菌の膜上に存在する D-ァラビトールデヒドロゲナーゼが、多くの糖化合物の酸 化を司っていると報告されている。この文献においては、 L フシトールの酸ィ匕に関す る記載がないものの、その基質特異性の広さから、 L フシトールの酸ィ匕をも触媒し、 L フクロースある ヽは 1ーデ才キシ D—グリセロー 3—へタスロース (
1- deoxy- D- glycero- 3- hexulose)と考えられる BPを生成する可能性を考慮し、後者の 場合には、この D-ァラビトールデヒドロゲナーゼを欠損させることにより、 BPの生成を 抜本的になくすことができると考えた。この仮説に基づき、以下、上記の D-ァラビトー ルデヒドロゲナーゼを欠損させた菌株の作成を試みた。
[0125] 細胞膜上に存在する D-ァラビトールデヒドロゲナーゼは、その基質特異性の広さか らグリセロールデヒドロゲナーゼあるいは D-ソルビトールデヒドロゲナーゼなどの別名 で呼ばれることもあった。先行文献のうち、例えば特開平 8-242850号公報 (特許文献 6)においては、 D-ソルビトールデヒドロゲナーゼの名で呼ばれ、その遺伝子クロー- ング、塩基配列の決定がなされている。この文献情報に基づいて、当該 D-ァラビトー ルデヒドロゲナーゼ触媒サブユニットをコードする遺伝子を sldA、コードされるタンパク 質を SldAと以下表記する。 SldA欠損株作成の方法として、 sldAの内部部分配列を欠 失した DNAフラグメントを作成し、これを酢酸菌に導入した後、相同組み換えにより染 色体 DNA上の sldAと相同組換えさせる方法を用いることとした。また、相同組換えが 生じた変異株の検出のため、 sldAの内部配列欠失フラグメント作成時に、欠失と同時 にカナマイシン耐性遺伝子 Kmrを導入し、カナマイシン含有培地上での生育によつ て、変異株を容易に検出できるようにした。
[0126] まず、相同組換え領域を含むフラグメントを作成するため、 sldA内部部分配列を含 むフラグメントを、配列番号 7、 8に示すプライマー（それぞれ Kpnl、 Pstl認識部位を持 つ）を用いて、 PCRによって得た。テンプレートは sldAの塩基配列が報告されている Gluconobacter oxydans IF03255株から調製したゲノミック DNAの他、配列の相同 性が高いことに由来すると思われる力、ダルコノバクタ一 ·ォキシダンス（
Gluconobacter oxydans) IF03171株から調製したゲノミック DNAを用いた場合にも、 予想された長さのフラグメントの増幅が認められた。いずれの場合も、制限酵素処理 による解析により、 BamHIと Bglllの認識部位が各 1箇所ずつ存在することが示された ため、この両サイト間の sldA部分配列を欠損させ、かわりに Kmr遺伝子をこの部位に 挿入することとした。 Kmr遺伝子は、 Kmrを持つプラスミド pHSG298 (Takara Bio Inc. 製)をテンプレートに、配列番号 9、 10に示すプライマーを用いて PCRによって得た。
[0127] 酢酸菌ゲノミック DNAをテンプレートとする PCRによって得られた断片を、 Kpnlと Pstl で消化、精製し、同じく Kpnl、 Pstlで消化常法によって消化、精製した pUC18 (Takara Bio
In 製）にサブクローユングした。このプラスミドで形質転換した E. coli JM109株を作 成し、培養後、プラスミドを抽出、精製し、 BamHU Bglllにて消化後、精製した。ここに 、 Kmrを含む pHSG298より PCRにて調製したフラグメントをライゲーシヨンし、新規プラ スミドを得た。このプラスミドにより E. coli JM109株を形質転換し、培養後プラスミドを 抽出、精製し、更に Kpnl、 Pstlにて消化、精製することにより、 Kmr遺伝子挿入 sldA部 分配列フラグメントを得た。 IF03255株と IF03171株のそれぞれに由来する Kmr遺伝 子挿入 sldA部分配列フラグメントをエレクト口ポレーシヨン（電極間隔 0.5 mm、 14.0 kV/cm)にて、それぞれ IF03255株、 IF03171株に導入し、カナマイシン含有プレート 上に生育可能な株を選抜することにより、 G. oxydans IF03255 sldA:Kmr株、 G. oxydans IF03171 sldA:Kmr株を得た。
[0128] ここで得た両変異株、 G. oxydans IF03255 sldA:Kmr株、 G. oxydans IF03171 sldA:Kmr株を供試菌株として、 L フシトール変換反応を行った。実施例 6と同様に 得た培養液を 1 mlずつ分注し、遠心操作操作により菌体を得た後、 0.1 M グリシン -NaOH緩衝液 (pH 8.8)を用いて洗浄した。洗浄菌体を 0.5 mlの同緩衝液に再懸 濁し、終濃度 10 g/1となる L フシトール、および終濃度 10 mMとなる MgClを加え、 1
2 ゥエルあたり 2 ml容の 96穴マイクロプレートを用いて 30°C、 66時間反応させた。反応 後、反応液から遠心操作により菌体を除去し、上清を HPLC解析した。解析結果を図 5に示す。図 5中、 WTは野生株を、 A SldAは Slda遺伝子破壊株を示す。
[0129] 結果、得られた変異株は L フクロースは生成するものの、 BPは全く生成しないこと が認められた。この結果から、 L—フシトールからの BP生成は SldAによって触媒されて いることが示され、また、 SldAとは別に L—フシトール力 L フクロースを生成する酵 素が存在することが示された。 SldAの欠損株の利用は、 pHのコントロールや EDTAの 添加などの操作を必要とせず、 L フシトールから副生物を生じることなく L フクロー スを生産するのに有効であることが示された。
[0130] 配列番号 7： sldA内部配列取得用 5'プライマー塩基配列
gccggcggtaccttctagcaacagccgcaggactc
[0131] 配列番号 8： sldA内部配列取得用 3'プライマー塩基配列
acaccttgtctgcagcatcactacgcagggcgctg
[0132] 配列番号 9： Kmr遺伝子取得用 5'プライマー塩基配列
taaaactggatccttacataaacagtaatacaagg
[0133] 配列番号 10： Kmr遺伝子取得用 3'プライマー塩基配列
atgctctgccagatctacaaccaattaaccaattc
[0134] 実施例 8 : L フシトール力 の L フクロースを生成する酵素活性の探索 1
L フシトール力も L フクロースを生成する酵素が SldA以外に存在することが実施 例 7において示されたため、本活性を触媒する酵素活性を探索することとした。
[0135] L フシトール力 L フクロースを生成する反応は酸ィ匕反応であるため、当該酵素 の候補として NAD(P)依存性デヒドロゲナーゼを考えた。 NAD(P)依存性のデヒドロゲ ナーゼが L フシトールの酸ィ匕を触媒する例としては、紅色藻類 (red algae)；ガルデ イエリア.スルフユラリア（Galdieria sulphuraria)由来の D-ァラビトールデヒドロゲナー ゼカNAD依存的に L フシトールを酸化するという報告がある（Planta 202: 487-493
(2003) ;非特許文献 5)が、活性が微弱でその生成物は同定されておらず、 L フク ロース- formingである力、ある!/、は SldAのように L—フクロース以外の生成物を生じる のかは調べられて ヽな 、。
[0136] まず、酢酸菌に NAD(P)依存的に L フシトールを酸ィ匕する活性が存在するかどうか を調べることとした。 G. oxydans IF03255株由来の sldA:Kmr変異株を YPG寒天培 地上でリフレッシュした後、 10 g/1 glycerol, 0.3 g/1 yeast extract, 0.3 g/1 peptone, pH 6.5からなる液体培地に 1白金耳シードし、試験管で 30°C、 24時間培 養した。得られた培養液を 1 mlを、同液体培地 50 mlに加え、 500 ml容の坂ロフラ スコを用いて 30°C、 18時間培養した。得られた培養液カゝら遠心操作によって菌体を 得、 9 g/1 NaClを用いて洗浄した後、 200W、 10分の超音波処理にて菌体破砕物を 得た。更に 15,000 g、 15分の遠心を行い、この遠心上清を無細胞抽出液とした。この 無細胞抽出液を酵素源として、終濃度 0.1 Mグリシン- NaOH緩衝液 (pH 8.8)または 0.1 M リン酸カリウム緩衝液 (pH 6.0)の存在下、終濃度 10 mM L フシトール、 1 mM NAD(P)と 30°Cで反応させることにより、 L フシトール酸ィ匕活性を測定した。測 定時には L フシトールを添加しない実験区も作成し、コントロールとした。酸化活性 は NAD(P)Hの生成に伴う 340nmにおける吸光度上昇により定量し、活性の単位は、 1 分間に 1 molの基質を酸化する活性を 1 Uとして算出した。測定結果を表 4に示す
[0137] 結果、 NADを補酵素とする L フシトールデヒドロゲナーゼ活性が検出された。本活 性は pH 6.0よりも 8.8の方が強く、生成物が L フクロースであることは確認できていな いものの、実施例 5において観察された高 pHほど L フクロース生成量が増加すると V、う結果と一致し、本活性が L フクロース生成を担って 、る可能性が示された。
[0138] [表 4] 表 4 G. oxydans IF03255 sldA:Kmr変異株無細胞抽出液中の
NAD(P)依存性 L一フシトール酸化活性
デヒドロゲナーゼ活性
(Dehydrogenase activity (xl 0"3 U/mg))
(C enzyme) NAD NADP
基質 pH 6.0 8.8 6.0 8.8
H20 0.0 0.0 0.0 0.0
L -フシ! ^一ル 3.1 18.4 0.0 1.9
[0139] 実施例 9：酢酸菌無細胞抽出液を用いた L フシトール変換反応
酢酸菌の無細胞抽出液中に L フシトール酸ィ匕活性が存在することから、本活性を 用いた L フシトール変換反応を試みることとした。
[0140] 実施例 8で得た無細胞抽出液を酵素源とし、その添加量を終タンパク濃度で 0、 0.8 、 1.6、 4.0となるよう反応液に加え、 10 g/1 L フシトール、0.1 M Glycine- NaOH (pH 8.8)、 0.03 mM FAD、 1 mg/ml BSA、 2 mM NADと共に 30°Cで 90時間静置 した後、生成物を HPLC解析した。 L フシトール変換反応の NAD依存性を確認する ため、反応の際には NAD無添カ卩区、および反応進行時に消費される NADを補うこと を目的として NADHォキシダーゼ添力卩区を作成しコントロールとした。用いた NADHォ キシダーゼは NADHと酸素分子力 NADと過酸ィ匕水素を生成する酵素（ナカライテス ク社製、 Bacillus liqueniformis由来）であり、この添カ卩によって反応中に生成した NADHが NADに再変換され、 L フシトール酸ィ匕に再利用されることを期待した。添カロ NADHォキシダーゼ量は終濃度で 0.1 U/mlとし、生じる過酸化水素を消費する目的 で終濃度で 10 U/mlのカタラーゼも併せて添加した。結果を表 5に示す。
[0141] 酢酸菌無細胞抽出液による L フシトールの変換は、 NADを添カ卩している区のいず れにおいても抽出液の添加量に応じて観察された力 NAD無添加の区では全く観察 されず、本変換が NAD依存的に進行することが確認され、実施例 8の結果を支持し た。このため、本変換を担っている活性は、実施例 8で認められたデヒドロゲナーゼで あることが示唆された。本変換における生成物は L フクロースと Lーフコースであり、 BPは全く観察されな力つた。よって、本無細胞抽出液中に存在する L フシトール酸 化酵素は、 L フクロース生成（L-foculose-forming)酵素であることが確認された。ま た、本変換においては微量ながら Lーフコースの生成も認められたため、無細胞抽出 液中に L フクロースから Lーフコースを生成する Lーフコースイソメラーゼ活性、ある!/ヽ は L フシトールから直接 Lーフコースを生成する L フシトールォキシダーゼなどの酵 素の存在が示唆された。更に、 L—フクロース生成量は、 NADォキシダーゼの添加に よらず、添加 NAD量を上回った。この結果は、酸ィ匕反応によって NAD力 生じた NADHを再度 NADに変換する活性が無細胞抽出液中にも存在することを示唆して ヽ ると考えられた。この活性は、たとえば NADHォキシダーゼ (NADH oxidase)活性と 考えられる。
[0142] [表 5]
表 5 G. oxydans IF03255 sldA:Kmr変異株無細胞抽出液を用いた
Figure imgf000047_0001
0.0 2 + 0.0 0.0 0.0 61.6
0.8 2 + 6.1 0.4 0.0 35.9
1 .6 2 + 8.0 2.2 0.0 29.4
4.0 2 + 13.3 2.6 0.0 21.9
0.0 2 - 0.0 0.0 0.0 55.8
0.8 2 - 2.8 0.0 0.0 36.2
1.6 2 - 6.6 1.7 0.0 29.3
4.0 2 - 12.6 1.9 0.0 22.5
0.8 0 + 0.0 0.0 0.0 53.0
[0143] 実施例 10：酢酸菌無細胞抽出液中の NADHォキシダーゼ活性
実施例 9にお ヽて酢酸菌無細胞抽出液中における NADHォキシダーゼ活性 ( NADH酸化活性)の存在が示唆されたため、本酵素活性の検出を試みた。
[0144] 実施例 8で得た無細胞抽出液を酵素源とし、終濃度 0.1 Mトリス- HC藤衝液 (pH
8.0)または 0.1 Mグリシン- NaOH緩衝液 (pH 8.8)の存在下、終濃度 0.2 mM NADH 、 ±0.03 mM FADと 30°Cで反応させることにより、 NADH酸ィ匕活性を測定した。測定 時には抽出液を添加しない実験区も作成し、コントロールとした。酸ィ匕活性は NADH の NADへの変換に伴う 340nmにおける吸光度減少により定量し、活性の単位は、 30 °C、 1分間に： L molの NADHを酸ィ匕する活性を 1Uとして算出した。測定結果を表 6 に示す。
[0145] 結果、 pH 8.0、 8.8のいずれにおいても NADH酸化活性が検出された。 pH 8.0に おける測定では、本活性が FADの添カ卩によって促進されることも併せて示された。既 知の多くの NADHォキシダーゼ力 その活性発現が FADに依存することが報告され ていることから、本実験に用いた抽出液中に存在する NADH酸ィ匕活性も、同様な NADHォキシダーゼによって担われている可能性が示された。
[0146] [表 6] G. oxydans IF03255 sldA:Kmr変異株無細胞抽出液中の
NADH oxidase活性
抽出物 FAD 活性
(Extract) pn (mM) (x10"3 U/mg)
+ 8.0 0 3.6
+ 8.0 0.03 26.3
一 8.0 0.03 0.0
+ 8.0 0.03 22.5
一 8.0 0.03 0.0
[0147] 実施例 11：酵素源菌体および酵素生産培養条件の決定
L フクロース産生型 L フシトールデヒドロゲナーゼ （FcDH)の単離精製に向け、 酵素源菌株およびその培養条件の検討を行った。
[0148] 菌株： Gluconobacter oxydans IFO 3255または IFO 3171
培地： 10 g/1 炭素源、 5 g/1 yeast extract、 5 g/1 peptone (pH 6.5) 炭素源：グリセロール（glycerol)、 D—マン-トール（D- mannitol)、 D—ァラビトール（ D- arabitol)、キシリトール（xylitol)
培養温度： 30°C
培養時間： 20時間または 66時間
[0149] 方法：
保存菌株を、 20 g/1 寒天を含む YPG培地（3 g/1 peptone, 3 g/1 yeast extract, 1 g/1 glycerol, pH 6.5)を用いて 30°Cで 2晚培養することによりリフレツシ ュした。このリフレッシュ菌体を、オートクレーブしたそれぞれの培地を 3 ml含む試験 管に接種し、 30°Cで 24あるいは 66時間振盪培養した。培養終了後、 3 mlの培養液か ら遠心操作により集菌し、 25 mM Tris-HCl (pH 8.0)で菌体を洗浄後、 0.3 mlの 同緩衝液を加え懸濁した。これを超音波破砕装置に供し菌体を破砕後、 200,000xg、 30分 minの遠心操作により得た遠心上清を得、これを酵素活性測定用サンプルとした
[0150] FcDHの酵素活性測定は、標準条件として； 0.2 M Gly-NaOH (pH 9.5), 1 mM
MgCl , 10 mM L—フシトール， 1 mM NADに適宜酵素溶液を加え、 30°Cの条
2
件にて反応を行い、活性定量として；酸化に伴う NADからの NADH の生成を 340 nmにおける吸光度変化をモニターすることにより行った。測定は NADの添カ卩によりス タートし、活性は初発 1分間の吸光度変化を初速度とし、ここ力 算出した。測定時に は L-フシトールを添加しない実験区も作成し、これブランク値とした。 FcDH活性とし て、 30°Cで 1分間に: molの L フシトールを酸ィ匕する活性を 1 Unit (U)として定義 した。 NADHの吸光係数は e =0.63 πιΜ— πΓ1として計算した。測定は、原則として
340
3回連続で行い、測定結果はその平均値を用い、図中には標準偏差と共に示した。
[0151] 結果：
測定結果を表 7に示す。単位タンパク質量当たりの FcDH比活性および、単位培養 液量力も得られる活性量の両者を指標にして、 FcDH生産菌株として G. oxydans IFO 3255、その培養条件として、培地： 10 g/1 D- mannitol、 5 g/1 yeast extract, 5 g/1 peptone (pH 6.5)、培養時間として 24時間を採択することとした。
[0152] [表 7]
表 7
培養時間 タンパク質 ^
炭素源 (h) mg/ml) (mU/ml) (mU/ml)
G. oxydans IFO 3255 グリセ口一ル 24 7.8 6.1 46.9 a oxydans IFO 3255 グリセロール 66 6.6 4.2 28.0 a oxydans IFO 3255 D-マンニトール 24 4.1 18.7 77.5 a oxydans IFO 3255 D -マンニトール 66 2.8 16.フ 46.6 a oxydans IFO 3255 D-マンニトール 24 5.1 1 7.6 89.6
G. oxydans IFO 3255 キシリトール 66 5.0 10.5 52.4
G. oxydans IFO 3255 キシリトール 24 7.2 13.9 100.2 a oxydans IFO 3255 グリセロール 66 3.8 9.4 35.9
G. oxydans IFO 31 71 グリセロール 24 5.4 5.7 31.1 a oxydans IFO 3171 D—マンニトール 66 5.0 0.4 2.0 a oxydans IFO 31 71 D-マンニ! ^一ル 24 7.6 2.7 20.4
G. oxydans IFO 31 71 D-マンニトール 66 7.5 1.9 14.0 a oxydans IFO 31 71 D-ァラビ! ^一ル 24 9.2 1.8 1 6.0
G. oxydans IFO 31 71 キシリトール 66 6.6 0.9 5.8
G. oxydans IFO 31 71 キシリ I ル 24 7.3 4.7 34.3 a oxydans IFO 31 71 キシリトール 66 8.4 0.5 4.2
[0153] 実施例 12 : FcDHの精製
G. oxydans IFO 3255保存菌株を YPG寒天培地を用いて 30°Cで 2晚培養すること によりリフレッシュした。このリフレッシュ菌体を、オートクレーブしたそれぞれの培地を 3 ml含む試験管に接種し、 30°Cで 18時間振盪培養した。これを更に、オートクレー ブした同培地 100 mlを含む 500 ml容の坂口フラスコに 1% (v/v)シードし、 30°Cで 24 時間培養した。培養終了後、遠心操作により集菌し、 25 mM Tris-HCl (pH 8.0)で 菌体を洗浄後、培養液の 25分の 1容の同緩衝液を加え懸濁した。これを超音波破砕 装置に供し菌体を破砕後、 200,000xg、 30 minの遠心操作により得た遠心上清を得 た (粗抽出液: Crude extract)。およそ 3 1の培養液より得た粗抽出液中に 934 mgの タンパク質を得た。
[0154] 次にこの粗抽出液の 30%— 60%飽和硫安分画画分を得、緩衝液 1 (50 mM
Tris-HCl (pH 8.0), 1.2 M (NH ) SO , 1 mM MnCl )に対してー晚透析した。こ
4 2 4 2
こで得たサンプルを緩衝液 1で平衡化した Phenyl Sepharose HP 26/10
(Amersham Biosciences社)に供し、緩衝液中の (NH ) SO濃度を 1.2 Mから 0 Mに
4 2 4
減少させることにより、担体に吸着したタンパク質を溶出させた。この操作で、 FcDH 活性は (NH ) SO濃度およそ 0.2 M近傍に検出された。 FcDH活性を含む分画画分
4 2 4
を回収し、濃縮後、 50 mM リン酸カリウム （pH 6.0)に対して透析した後、同緩衝液 にて平衡化した Q- Sepharose 16/10 (Amersham Biosciences社)に供し、緩衝液中 の NaCl濃度を 0 Mから 0.5 Mに増加させることにより、担体に吸着したタンパク質を 溶出させた。この操作で、 FcDH活性は NaCl濃度およそ 0.4 M近傍に検出された。 FcDH活性を含む分画画分を回収し、濃縮後、 50 mM リン酸カリウム （pH 6.0)で 平衡化した Superdex 200 16/60 (Amersham Biosciences社)に供した。この操作に より、 FcDHは分子量 102 kDaと見積もられる溶出位置に溶出した。 FcDH活性を含む 画分を回収し、濃縮後、 SDS-PAGEにてその純度を確認した結果、 FcDHは分子量 約 27 kDaと見積もられる単一バンドとして認められた（図 6)。この一連の精製操作に より、 FcDHの比活性は粗抽出液の 0.015 U/mgから 7.8 U/mgに 520倍に上昇した。 また、得られた精製 FcDH量は 0.60 mgで、活性の回収率は 34%であった（表 8)。
[0155] [表 8] 表 8 ステップ (step) タンパク質 活性 回収率 比活性 精製
(mg/ml) (U) (%) (U/mg) (-fold) 粗精製 934 14 100 0.015 1.0 硫酸アンモニゥム透析 535 1 1 79 0.020 1.4 クロマトグラフィー
64 7.1 51 0.1 1 7.4 (Phenyl Sepharosej
クロマトグラフィー 1.1 7.0 50 6.4 427 (Q-Sepharose)
クロマトグラフィー
0.60 4.7 34 7.8 520 (Superdex)
[0156] 実施例 13 :NOXの精製
G. oxydans IFO 3255保存菌株を YPG寒天培地を用いて 30°Cで 2晚培養すること によりリフレッシュした。このリフレッシュ菌体を、オートクレーブしたそれぞれの培地を 3 ml含む試験管に接種し、 30°Cで 18時間振盪培養した。これを更に、オートクレー ブした同培地 100 mlを含む 500 ml容の坂口フラスコに 1% (v/v)シードし、 30°Cで 24 時間培養した。培養終了後、遠心操作により集菌し、 25 mM Tris-HCl (pH 8.0)で 菌体を洗浄後、培養液の 25分の 1容の同緩衝液を加え懸濁した。これを超音波破砕 装置に供し菌体を破砕後、 200,000xg、 30 minの遠心操作により得た遠心上清を得 た (粗抽出液)。およそ 4 1の培養液より得た粗抽出液中に 1253 mgのタンパク質を得 た。
[0157] 次にこの粗抽出液の 30%— 60%飽和硫安分画画分を得、緩衝液 2 (50 mM リン酸 カリウム （pH 6.0), 1 mM DTT, 0.5 mM EDTA)に対してー晚透析した。ここで 得たサンプルを緩衝液 2で平衡化した Q- Sepharose 26/ 10に供し、緩衝液中の NaCl 濃度を 0 M力 0.5 Mに増加させることにより、担体に吸着したタンパク質を溶出させ た。この操作で、 NOX活性は NaCl濃度およそ 0.25 M近傍に検出された。 NOX活性 を含む分画画分を回収し、濃縮後、緩衝液 3 (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.6 M (NH ) SO )に対して透析した後、同緩衝液にて平衡化した Pheny卜 Sepharose
4 2 4
16/10に供し、緩衝液中の (NH ) SO濃度を 0.6 Mから 0 Mに減少させることにより、
4 2 4
担体に吸着したタンパク質を溶出させた。この操作で NOX活性は (NH ) SOおよそ
4 2 4
0.2 M近傍に検出された。 NOX活性を含む分画画分を回収し、濃縮後、 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)に対して透析し、濃縮後、同緩衝液で平衡ィ匕した 1.5 ml容の FAD-agarose resin (Sigma社)に供した。非吸着タンパク質を同緩衝液で十分に洗 浄後、 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM FADからなる緩衝液にて吸着タンパク 質を溶出させた。この操作により、 NOXは特異的に前記 resinに吸着後、 FADを含む 緩衝液の添カ卩により溶出した。この溶出画分を回収し、濃縮後、 SDS-PAGEにてその 純度を確認した結果、 NOXは分子量約 15 kDaと見積もられる単一バンドとして認め られた（図 7)。
[0158] 上記一連の精製操作により、 NOXの比活性は粗抽出物の 0.029 U/mgから 196
U/mgに 6763倍に上昇した。また、得られた精製 NOX量は 0.014 mgで、活性の回収 率は 7.3%であった（表 9)。
[0159] [表 9]
表 9 ステップ (step)
Figure imgf000052_0001
粗精製 1253 14 100 0.029 1.0 硫酸アンモニゥ厶透析 486 1 1 54 0.041 1.4 クロマトグラフィー
87 7.1 26 0.1 1 3.8 (Phenyl Sep arose)
クロマトグラフィ一 4.2 7.0 8.9 0.79 27 (Q - Sepharose)
クロマトグラフィー 0.014 4.7 7.3 196 6763 (rAD agarose)
[0160] また、精製 NOX溶液を、 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)で平衡化した Superdex 200
16/60に供した結果、 NOXは分子量 34 kDaと見積もられる溶出位置に溶出した。 後の実験には、 SDS-PAGEで単一バンドに精製後、更に Superdex 200 16/60処理 を行ったサンプルを精製酵素標品として用いた。
[0161] なお、 NOX活性の測定は、標準条件として以下の要領にて行った。 0.1 M
Tris-HCl (pH 8.0), 30 ^ M FAD, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 0.2 mM NADHに適宜酵素溶液を加え、 30°Cで反応を行った。活性定量は、 NADH力ゝらの NAD生成に伴う 340 nmにおける吸光度減少をモニターすることにより行った。測定 は NADHの添カ卩によりスタートし、活性は初発 1分間の吸光度変化を初速度とし、ここ 力も算出した。測定時には酵素源を添加しない実験区も作成し、これをブランク値と した。 NOX活性として、 30°C、 1分間に 1 μ molの NADHを酸化する活性を 1 Uとして 定義した。測定は、原則として 3回連続で行い、測定結果はその平均値を用い、図中 には標準偏差と共に示した。
[0162] 実施例 14 : FcDHの諸性質把握
実施例 12の精製した FcDH標品を酵素源として、その諸性質を調べた。 4 - 1)反応至適 pH
0.1 M pH buffer, 1 mM MgCl , 10 mM L—フシトール， 1 mM NADおよび
2
1.1 /z g/ml 精製 FcDHからなる溶液にて 30°Cで反応を行い、 NADHの生成を A の
340 測定値から見積もった。用いた pH bufferとして、酢酸ナトリウム (pH 4.8, 5.7)、リン 酸カリウム （pH 6.4, 7.2), Tris-HCl (pH 6.7, 7.6, 8.5)、 CAPS— NaOH (Sodium cyclohexylaminopropanesulfonate) (pH 8.3, 9.5)、および炭酸ナトリウム (pH 10.1, 10.7, 11.2)を用いた。測定力も得た各 pHにおける FcDHの比活性を、最大比活性を 示した pH 9.5での比活性に対する百分率として図 8に示した。
[0163] 4 2) pH安定性
0.1 M pH buffer, 80 ^ g/ml 精製 FcDHを含む溶液を氷上 30分静置した後、 FcDHが終濃度で 1.6 μ g/mlとなるよう希釈し、標準条件で反応を行い、残存する FcDH活性を測定した。用いた pH bufferとして、クェン酸ナトリウム (pH 2.6, 3.7, 5.1)、酢酸ナトリウム (pH 4.7, 5.8)、リン酸カリウム (pH 6.1, 7.2), Tris-HCl (pH 7.0, 7.8, 8.8)、 CAPS— NaOH(pH 8.8, 9.5)、および炭酸ナトリウム （pH 10.1, 10.6, 11.2)を用いた。測定力も得た各 pHにおける FcDHの残存活性を、最大安定性 を示した pH 7.2での残存活性に対する百分率として図 9に示した。 pHおよそ 5から 1 0で 80%以上の残存活性が認められた。
[0164] 4 3)反応至適温度
Gly-NaOH (pH 9.5), MgCl , Fucitolおよび精製 FcDHからなる溶液を各反応温
2
度（25, 30, 37, 45, 55および 65°C)にて 3分間のプレインキュベーションを行った 後、別途各温度でプレインキュベーションを行った NADを添加し、反応を開始した。 反応液中の終濃度は、標準活性測定条件となるように調製し、 FcDH終濃度は 1.6 μ g/mlとした。測定力も得た各温度における FcDHの比活性を、最大比活性を示した 37°Cでの比活性に対する百分率として図 10に示した。
[0165] 4 4)温度安定性
0.1 M Gly-NaOH (pH 9.5), 80 g/ml 精製 FcDHを含む溶液を 0, 25, 30, 37, 50および 60°Cで 30 min静置した後、 FcDHが終濃度で 1.6 g/mlとなるよう希 釈し、標準条件で反応を行い、残存する FcDH活性を測定した。測定から得た各温度 における FcDHの残存活性を、 0°Cでの静置時の残存活性に対する百分率として図 1 1に示した。 30°Cまで、 80%以上の残存活性が認められた。
[0166] 4 5)基質特異性
L フシトールを含む各種糖アルコールに対する FcDHの反応性を測定した。さまざ まな基質濃度下にお 、て反応初速度を測定し、この結果を Lineweaver-Burkプロット することにより、それぞれの基質に対する k および K値を求めた。結果を表 10に示
cat m
す。結果、 FcDHには、 L フシトールの他種々糖アルコール酸ィ匕活性が認められ、 k /K値は D—ァラビトール 〉 L フシトール 〉 キシリトール > D ソルビトール cat m
> D マン-トール 〉 リビトール（Ribitol) > ズシトール（Dulcitol) > グリセロール の順であった。
[0167] [表 10] 表 10
Kcat Km kcat/Km
(U- mg-1 ) (mM) (U- mg-^ mM"1)
D-ァラビトール 32.9 1.3 25.19
L-フシトール 33.8 31.9 1.06 キシリトール 9.3 31.9 0.29
D -ソルビトール 4.2 22.4 0.19
D -マンニ! ^一ル 4.7 30.2 0.16 リビトール 2.9 20.4 0.14 ズルシ I ^一ル 3.1 30.5 0.10 グリセロール 0.9 10.1 0.09 また、図 12に、精製 FcDHの比活性を測定した結果を示す。 D—ァラビトールおよび L フシトールに対しては、基質高濃度時において基質による反応阻害が認められた 。 D—ァラビトールでは濃度 5 mM以上で (A)、L フシトールでは濃度 100 mM以上 で (B)、それぞれ比活性の低下が認められた。図 12 (C)および (D)には、それぞれ (A)および (B)の結果を Lineweaver-Burkプロットにて示した。 Kおよび k 値は、基質 m cat 阻害が見られない範囲から、すなわち、図 12 (C)および (D)において破線で示した 直線から求めた。このため、これらの基質の場合には、この阻害効果が認められない 基質濃度内で k および K値を求めた。その他の糖アルコール類に対しては、基質 cat m
濃度 100 mMまでで、基質による阻害効果は認められなかった。
[0169] FcDHの認識が認められた基質の内、 L フシトールからの酸化生成物は L フク口 ースであるが、その他の基質の酸化生成物について調べた。用いた基質は D—ァラ ビトール、 D マン-トールおよび D ソルビトールで、 0.5 g/dl 基質， 50 mM Gly-NaOH (pH 9.5), 1 mM NAD, 30 mM FAD, 5 mM MgCl , 0.6 U/ml
2
精製 FcDH, 0.2 U/ml NOX, 0.1 mg/ml カタラーゼからなる反応液を 30°Cで 16 時間反応後、 HPLCで解析を行った（図 13)。結果、 D—ァラビトールからは D リブ口 ース（D- Ribulose)および D キシルロース（D- Xylulose)と思われる生成物が、 D マ ン-トールからは D フルクトース（D- Fructose)と思われる生成物が、そして D ソル ビトールからは L ソルボース（L-Sorbose)と思われる生成物が確認された。
[0170] 4 6) 2価金属イオン特異性
FcDHの活性発現には 2価イオンの添カ卩が必要であることが認められたため、 FcDH の各種 2価金属イオン利用性を測定した。測定は、 Gly-NaOH (pH 9.5), 精製 FcDHおよび各種 2価金属イオン（あるいは EDTA)からなる溶液を氷上 30 min静置し た後、 L フシトールおよび NADを添加して反応を開始した。反応液中の 2価金属ィ オンまたは EDTA終濃度は 5 mM、 FcDH濃度は 1.6 g/ml、その他は標準活性測 定条件となるように調製した。測定力も得た FcDHの各比活性を、最大比活性を示し た MnCl添カ卩時の比活性に対する百分率として表 11に示す。結果、 FcDHに対する
2
賦活ィ匕効果は、 Mn2+、 Mg2+、 Ca2+イオンにほぼ同程度認められ、 Ni2+、 Co2+イオンには 効果がなぐ Zn \ Cu2+イオンには逆に阻害効果が認められた。 EDTAで 2価金属ィォ ンをキレートした場合、 FcDHの活性はほぼ消失した。
[0171] [表 11] 表 1 1
添加試薬 相対活性（%)
none 35.1 ±0.5
MnCI2 100.0±6.9
MgCI2 93.7± 2.9
CaCし 89.9±3.4
NiCI2 42.4±0.7
CoCI。 34.8± 1.1
ZnS04 1 1.7±0.5
CuCI2 5.0±0.5
EDTA 3.2±0.7
[0172] 4 7) NADおよび NADP特異性
FcDHは NADを補酵素とすることが認められたため、 NADおよび NADPの利用性を 測定した。活性測定は、標準条件下、さまざまな濃度の NADあるいは NADP添加の下 行った。この結果を Lineweaver-Burkプロットすることにより（図 14 (B) )、それぞれの 補酵素に対する K値を求めた。結果、図 14に示すように、 NADに対する K値は m m
0.20mMと見積もられた。一方、 NADPを補酵素とした場合には、有意な活性は認めら れな力つた (不図示)。
[0173] 実施例 15 : NOXの諸性質把握
実施例 13において精製した NOX標品を酵素源として、その諸性質を調べた。 15 - 1)反応至適 pH
0.1 M pH buffer, 30 ^ M FAD, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 0.2 mM NADHおよび 0.055 μ g/m\ 精製 NOXからなる溶液にて 30°Cで反応を行い、 NADH の減少を A の測定値から見積もった。用いた pH bufferとして、クェン酸ナトリウム
340
(pH 3.6, 4.7, 5.7)、酢酸ナトリウム （pH 4.8, 5.7)、リン酸カリウム （pH 6.4, 7.2) 、Tris- HCl (pH 6.7, 7.6, 8.5)および CAPS- NaOH (pH 8.3, 9.5)を用いた。測定 力も得た各 pHにおける NOXの比活性を、最大比活性を示した pH 5.7での比活性に 対する百分率として図 15に示した。
[0174] 15—2) 1"1安定性 0.1 M pH buffer, 30 ^ M FAD, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 100 ^ g/ml 精製 NOXを含む溶液を氷上 30 min静置した後、 NOXが終濃度で 0.055 μ g/mlと なるよう希釈し、標準条件で反応を行い、残存する NOX活性を測定した。用いた pH bufferとして、クェン酸ナトリウム （pH 2.6, 3.7, 5.1)、酢酸ナトリウム （pH 4.7, 5.8)、リン酸カリウム （pH 6.1, 7.2)、 Tris— HC1 (pH 7.0, 7.8, 8.8)、 CAPS— NaOH
(pH 8.8, 9.5)、および炭酸ナトリウム (pH 10.1, 10.6, 11.2)を用いた。測定から 得た各 pHにおける NOXの残存活性を、最大安定性を示した pH 8.8での残存活性に 対する百分率として図 16に示した。 pHおよそ 6から 11で 80%以上の残存活性が認 められた。
[0175] 15— 3)反応至適温度
Tris-HCl (pH 8.0), FAD, EDTA, DTTおよび精製 NOXからなる溶液を各反応 温度（25, 30, 37, 45, 55および 65°C)にて 3分間のプレインキュベーションを行つ た後、別途各温度でプレインキュベーションを行った NADHを添加し、反応を開始し た。反応液中の終濃度は、標準活性測定条件となるように調製し、 NOX終濃度は 0.055 μ g/mlとした。測定力も得た各温度における NOXの比活性を、最大比活性を 示した 37°Cでの比活性に対する百分率 (残存活性）として図 17に示した。
[0176] 15— 4)温度安定性
0.1 M Tris-HCl (pH 8.0), 30 ^ M FAD, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 100 g/ml 精製 NOXを含む溶液を 0, 25, 30, 37, 50および 60°Cで 30 min静置 した後、 NOXが終濃度で 0.055 μ g/mlとなるよう希釈し、標準条件で反応を行 、、残 存する NOX活性を測定した。測定力も得た各温度における NOXの残存活性を、 0°C での静置時の残存活性に対する百分率として図 18に示した。 50°Cまで、 80%以上の 残存活性が認められた。
[0177] 15— 5)フラビン補酵素特異性
NOXの活性発現にはフラビン補酵素の添カ卩が必要であることが認められたため、 NOXの各種フラビン補酵素利用性を測定した。測定は、 Tris-HCl (pH 8.0), FAD,
EDTA, DTTおよび精製 NOXからなる溶液を Tris- HC1 (pH 8.0), 精製 NOXおよ び各種フラビン補酵素カゝらなる溶液を氷上 30 min静置した後、 NADHを添加して反 応を開始した。反応液中のフラビン濃度は 0 — 300 Mとし、その他は標準活性測 定条件となるように調製した。結果を図 19に示す。結果、用いた FAD、 Riboflavin, FMNO 、ずれにも NOX賦活化効果が認められた力 その効果は FADと Riboflavinで はほぼ同程度で、 FMNでは相対的に弱力つた。
[0178] 15—6) NADHぉょびNADPH特異性
NOXに NADH酸化活性が認められたため、 NADHおよび NADPHに対する基質特 異性を測定した。標準条件下、基質濃度を変化させて活性測定を行い、結果を Lineweaver-Burkプロットすることにより、基質に対する K値を求めた。結果、 NADH m
に対する 値は 29 μ Μと見積もられた（図 20)。一方、 NADPHを基質とした場合に m
は、有意な活性は認められなかった (不図示)。
[0179] 実施例 16 : FcDH、 NOXの部分アミノ酸配列の決定
精製した FcDHおよび NOXを材料にその部分アミノ酸配列の決定を行った。両酵素 を SDS-PAGEに供し、バンドの認められる位置のゲルを切り出し、ここに含まれるタン パク質を試料とし、常法に従いトリプシン処理によるフラグメント化と逆相 HPLCによる 分離を経て、得られた分画の内、幾つかをプロテインシーケンサーに供した。得られ た配列を、配列番号 11から 14に示す。
[0180] 実施例 17 : FcDH、 NOXをコードする遺伝子のクローユング
FcDH, NOXをコードする遺伝子クローユングのため、実施例 16で得られたぺプチ ド配列から、それらに相当する DNAミックスプライマーを合成した。 G. oxydans IFO
3255から常法により調製したゲノミック DNAを铸型とし、 PCR反応を行った。得られ たフラグメントを精製の後、 DNAシーケンサーでその塩基配列を解析した結果、得ら れた PCR産物中に、実施例 16で得られたペプチド配列をコードする DNA配列が認め られた。
[0181] 次に、この DNAフラグメントをプローブとしたサザンハイブリダィゼーシヨン、コロニー ハイブリダィゼーシヨンを常法に従い、ポジティブクローンを得た。得られたクローンか らプラスミドを調製し、その DNA配列を解析し、配列番号 15に示す 774 base (終止コ ドン含む）から成る FcDHコード遺伝子（fcdh)および配列番号 17に示す 474 base (終 止コドン含む)から成る NOXコード遺伝子 (nox)を得た。また、この塩基配列より配列 番号 16に示す 257残基から成る FcDH、および配列番号 18に示す 157残基力 成る NOXの全アミノ酸配列が決定された。この中には、実施例 6で決定されたペプチド配 列が含まれていた。アミノ酸配列力 見積もられる分子量は FcDHが 27.522 Da、 NOXが 16,777 Daで、 SDS-PAGEで見積もられた分子量とそれぞれほぼ一致した。
[0182] 実施例 18 : FcDH、 FcDH+NOX、 FcDH+NOX+FucI発現株の作成とその培養
FcDH発現のため、 G. oxydans IFO 3255株のゲノミック DNAをテンプレートとし、 配列番号 19および 20に示す合成プライマーを用いて PCRを行 、、 fcdh遺伝子を含 む 858 bpの断片を得た。得られた PCR産物を EcoRI、 Pstlで消化後、プラスミド pUC18 (Takara Bio Inc.社）の相当する位置に挿入し、 FcDH発現用プラスミド PFEX3052を作成した。
[0183] 次に nox遺伝子を得るため、 G. oxydans IFO 3255株のゲノミック DNAをテンプレ ートとし、配列番号 21および 22に示す合成プライマーを用 、て PCRを行 、nox遺伝 子を含む 605 bpの断片を得た。得られた PCR産物を Pstl、 Hindlllで消化後、プラスミ ド PFEX3052の相当する位置に挿入し、 FcDHおよび NOX共発現用プラスミド PFNEX4105を作成した。
[0184] 更にこのプラスミド pFNEX4105をテンプレートとし、配列番号 19および 23に示す合 成プライマーを用いて PCRを行 、、 fcdh遺伝子と nox遺伝子がタンデムにつながれた 遺伝子断片を含む 1390 bpの断片を得た。得られた PCR産物を EcoRI、 Kpnlで消化 後、プラスミド pUC18の相当する位置に挿入し、 pFNEX4502を作成した。
[0185] 次に Fuelをコードする foci遺伝子を得るため、 E. coli W3110株から常法によって 得たゲノミック DNAをテンプレートとし、 Accession No. NC_000913記載の foci遺伝子 配列に基づ 、て、配列番号 24および 25に示した合成プライマーを用いて PCRを行 い、 foci遺伝子を含む 1873 bpの断片を得た。得られた PCR産物を Kpnl、 Sailで消化 後、プラスミド PFNEX4502の相当する位置に挿入し、 FcDH, NOXおよび Fuel共発現 用プラスミド PFNIEX5706を作成した。また後の実験に供試する必要から、 Fuel単独 発現用プラスミド pIEX 11を作成した。これは、配列番号 26および 27に示した合成プ ライマーを用いて、上記同様 PCRによって Fuel遺伝子を得、得られた産物を EcoRI、 Pstlで消化後、プラスミド pUC18の相当する位置に挿入することによって作成した。 [0186] 構築したプラスミド pFEX3052、 pFNEX4105、 pFNIEX5706および pIEXllをそれぞれ を用いて Escherichia coli JM 109 (Takara Bio Inc.製）を形質転換し、 FcDH発現 株 E. coli/pFEX3052、 FcDH·NOX共発現株E. coli/pFNEX4105、 FcDH' NOX · Fuel共発現株 E. coli/pFNIEX5706及び Fuel発現株 E. coli/pIEXllをそれぞれ作成 した。
[0187] 得られた発現株、及び、対照として用いる挿入遺伝子を含まない pUC18にて形質 転換した E. coli/pUC18は、 LBZAmpプレート上 37°Cで培養することによりリフレツシ ュした。液体培養には LBZAmp液体培地を用い 37°Cで培養した。リフレッシュした菌 体を接種した後、終濃度 1 mMの IPTGを添加し、 6— 18時間培養を行った後、遠心 操作により集菌した。集菌した菌体は、 25 mMの Tris- HC1 buffer (pH 8.0)で洗浄 し、後の実験に用いた。また、 LB培地の替わりに TB培地（12 g/1 trypton, 24 g/1 yeast extract, 4 g/1 glycerol, 2.3 g/1 KH PO , 12.5 g/1 K HPO )を用いた場
2 4 2 4 合もあるが、菌体量が多く得られる点以外、本質的に変わりはなかった。
[0188] 実施例 19 :無細胞抽出液の調製と発現タンパク質の精製
(19-1) 無細胞抽出液の調製
洗浄菌体を 25 mM Tris-HCl (pH 8.0)に再懸濁し、超音波処理（200W, 10分） にて破砕し、 14,000 gで 15分遠心した上清を得、これを無細胞抽出液として各種実 験に用いた。 E.
coli/pUC18、 E. coli/pIEXll, E. coli/pFEX3052、 E. coli/pFNEX4105および E. coli/pFNIEX5706よりそれぞれ得た無細胞抽出液の SDS-PAGE解析結果を図 21に 示す。 E. coli/pIEXllでは Fuelが、 E. coli/pFEX3052では FcDHが、 E.
coli/pFNEX4105では FcDHと NOXが、そして E. coli/pFNIEX5706では Fucl、 FcDH および NOXがそれぞれ生産され、相当する分子量の位置にバンドが観察された。発 現タンパク質を精製する場合、この無細胞抽出液を、さらに 200,000 gで 30 minの超 遠心操作にかけ、得られた上清を材料とした。
[0189] (19-2) 組換え発現 FcDH (rFcDH)の精製
E. coli/pFEX3052の無細胞抽出液の超遠心上清より精製した。粗酵素溶液を 50 mM リン酸カリウム （pH 6.0)に対して透析した後、同緩衝液にて平衡化した Q-Sepharose 16/ 10に供し、緩衝液中の NaCl濃度を 0 M力 0.5 Mに増加させるこ とにより、担体に吸着したタンパク質を溶出させた。 FcDH活性を含む分画画分を回 収し、濃縮後、 50 mM リン酸カリウム
(pH 6.0)で平衡化した Superdex 200 16/60に供した。 FcDH活性を含む画分を回 収し、濃縮後、 SDS-PAGEにてその純度を確認した結果、 rFcDHは分子量約 27 kDa と見積もられる単一バンドとして認められた（図 22)。
[0190] (19-3) 組換え発現 NOX (rNOX)の精製
E. coli/pFEX4105の無細胞抽出液の超遠心上清より精製した。粗酵素溶液を、 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)で平衡化した FAD- agarose resin に供し、非吸着タンパ ク質を同緩衝液で十分に洗浄後、 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM FAD力ら なる緩衝液にて吸着タンパク質を溶出させた。この操作により、 NOXは特異的に resin に吸着後、 FADを含む緩衝液の添カ卩により溶出した。 NOX活性を含む画分を回収し 、濃縮後、 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)で平衡化した Superdex 200 16/60に供し、 NOX活性を含む画分を回収した。これを濃縮後、 SDS-PAGEにてその純度を確認し た結果、 rNOXは分子量約 15 kDaと見積もられる単一バンドとして認められた（図 23
) o
[0191] (19-4) 酵素活性測定
E. coli/pUC18、 E. coli/pIEXll、 E. coli/pFEX3052、 E. coli/pFNEX4105および E. coli/pFNIEX5706よりそれぞれ得た無細胞抽出液中の FcDH、 NOXおよび Fuel活 性を測定した (表 12)。また上記のように精製した rFcDHおよび rNOX精製標品につ いても活性測定を行い、 rFcDHの比活性は 11.1 U/mg、 rNOXの比活性は 175 U/mgであった。この値は G. oxydansより調製した精製 FcDHの比活性 7.8 U/mg、精 製 NOXの比活性 196 U/mgとそれぞれほぼ同程度とみなせた。
[0192] [表 12] 表 12
酵素活性（U/mg)
Plasmids FcDH NOX Fuel
pUC18 ND* 0.03 ND*
pIEX1 1 NT** NT** 0.84
PFEX3052 3.08 0.04 ND*
pFNEX4105 2.95 5.90 ND*
PFNIEX5706 3.55 6.08 0.27
*ND, Not detected
**NT, Not tested
[0193] なお Fuel活性は以下のように測定した。 0.1 M Lーフコース， 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgClに適宜酵素溶液をカ卩え、 30°Cで反応を行い、活性定量は
2
、 Lーフコースの異性化によって生成する L—フクロース量を HPLCにて測定することに より算出した。活性は生成 L フクロース量が 3 mMを超えない範囲での初速度から 求めた。 Fuel活性として、 30°C、 1分間に 1 /z molの Lーフコースを異性化して L フク口 ースを生成する活性を 1 Uとして定義した。
[0194] 発現を試みた遺伝子と測定された酵素活性の関係はそれぞれ妥当であり、クロー ユングした fcdhおよび nox遺伝子は、それぞれ FcDHおよび NOXをコードするものと考 えられた。また、 noxを発現させない実験区においてもわずかな NOX活性が認められ た力 これは宿主 E.
col油来の活性と考えられた。
[0195] 実施例 20：酵素反応による L フシトールの変換
(20-1) G. oxydans IF03255より調製した精製酵素による変換
G. oxydansより調製した精製 FcDHおよび NOXを用いて、 L フシトールから L—フク ロースある 、は Lーフコースへの変換を試みた。 L—フクロースから Lーフコースへの酵 素変換には、 Lーフコースイソメラーゼが必要であるため、これには E. coli/p
QE30FucIH6より調製した FucIH6を用いた。また、 NOX活性を有する酵素には、 H 0
2 生成型と H 0生成型が報告されており、 H 0生成方の場合、 NADHの酸ィ匕に伴い H
2 2 2 2 2
0が生成し、一般に H 0は多くの酵素活性を阻害する性質があるため、これを回避 する目的で H Oを H20に変換する酵素カタラーゼの添加も併せて行った。カタラー
2 2
ゼは巿販酵素標品（Nacalai Tesque製、 Bovine Liver由来）を用いた。標準反応条 件として、 62 mM L—フシトール， 0.1 M Gly-NaOH (pH 9.5), 2 mM NAD, 30 FAD, 1 mM MgCl , 0.1 U/ml 精製 FcDH, 0.1 U/ml 精製 NOX,
2
0.2 mg/ml 精製 FudH6, 0.1 mg/ml カタラーゼカ なる反応液を 30°Cで振盪反 応し、適宜サンプリングを行い、 L フシトール、 L フクロースおよび L—フコースを HPLCにて定量した。実験区および反応 48時間後の解析結果を以下表 13に示す。 各実験区における変換時間経過は図 24に示す。
[0196] [表 13] 表 13
48時間変換後
実験区 条件 L_フコース L-フクロース L-フシ I ル
(mM) (mM) (mM)
A 酵素なし 0.0 0.0 67.1
B 標準条件 54.2 6.4 3.3
C FucIH6無添加 0.0 45.7 13.4
D FcDH無添加 0.2 0.0 64.2
E NOX無添力 Q 3.9 0.7 57.4
F catalase無添カロ 26.1 6.0 29.0
[0197] 図 24内の各プロット中、〇：白丸は Lーフコース、參：黒丸は L フクロース、△:白三 角は L フシトール濃度を示す。（B)が標準条件（62 mM L-Fucitol, 0.1 M Gly-NaOH (pH 9.5), 2 mM NAD, 30 ^ M FAD, 1 mM MgCl , 0.1 U/ml
2
精製 FcDH, 0.1 U/ml 精製 NOX, 0.2 mg/ml 精製 FucIH6, 0.1 mg/ml 力タラ ーゼ）における結果である。（A)では酵素無添加、（C)では FudH6無添加、（D)では FcDH無添加、（E)では NOX無添加、および (F)ではカタラーゼ無添加での結果をそ れぞれ示す。
[0198] 表 13および図 24に示される結果より、 FcDHと NOXの両酵素の存在によって
NAD(H)のリサイクルが可能であり、添加 2 mMの NADで 50 mM以上の L—フクロース の L フシトールからの生成が可能であった。また、 Fuel酵素が更に存在することによ り、生成した L フクロースは Lーフコースに変換され、結果、 L フシトールから Lーフコ ースの生成が可能であった。カタラーゼ無添カ卩区では変換阻害が見られたことから、 今回用いた NOXは H202生成型であること、 H 0は L フシトール酸化反応を阻害す
2 2
ること、生成する H 0はカタラーゼ添加によって除去可能であること、が推察された。
2 2
[0199] (20-2) E. coliから調製した組換え発現酵素による変換
E. coliで組換え発現の後に精製した rFcDHおよび rNOXを用いて、 20— 1と同様に L フシトールの酵素的変換を試みた。標準反応条件として、 120 mM L フシトー ル， 0.1 M
Gly-NaOH (pH 9.5), 2 mM NAD, 30 ^ M FAD, 1 mM MgCl , 1 U/ml
2
精製 rFcDH, 1 U/ml 精製 rNOX, 0.2 mg/ml 精製 FucIH6, 0.1 mg/ml 力タラ ーゼ力 なる反応液を 30°Cで振盪反応し、適宜サンプリングを行い、 L フシトール、 L フクロースおよび Lーフコースを HPLCにて定量した。実験区および反応 40時間後 の解析結果を以下表 14に示す。各実験区における変換時間経過は図 25に示す。
[0200] [表 14]
表 14
40時間変換後
実験区 条件 --フコース L-フクロース L -フシ! ^一ル
(mM) (mM) (mM)
A 標準 1 13.0 14.8 0.0
B NAD無添加 0.2 0.0 121.2
C FAD無添加 62.3 13.0 48.7
D C3t3l3S6無添加 91.5 23.6 14.2
E FuclH6無添加 0.0 95.6 28.0
[0201] 図 25内の各プロット中、〇：白丸は Lーフコース、參：黒丸は Lフクロース、△:白三 角は L フシトール濃度を示す。（A)が標準条件（120 mML フシトール， 0.1 M Gly-NaOH (pH 9.5), 2 mM NAD, 30 ^ M FAD, 1 mM MgCl , 1 U/ml
2
精製 rFcDH, 1 U/ml 精製 rNOX, 0.2 mg/ml 精製 FucIH6, 0.1 mg/ml 力タラ ーゼ）における結果である。（B)では NAD無添加、（C)では FAD無添加、（D)では力 タラーゼ無添加、および (E)では FudH6無添加での結果をそれぞれ示す。
[0202] 表 14および図 25に示される結果より、 G. oxydansより調製した FcDHと NOX同様、 E. coliで組換え生産された rFcDHと rNOXの両酵素の作用によって NAD(H)のリサイ クルが可能であり、添加 2 mMの NADでおよそ 100 mMの L フクロースの L フシトー ルからの生成が可能であった。また、 Fuel酵素を更に共存させることにより、生成した L—フクロースは Lーフコースに変換され、結果、 L フシトールから Lーフコースの生成 が可能であった。カタラーゼ添加効果は、上記 20— 1と同様に認められた。また、本 実験では、補酵素 NADおよび FADの添加必要性の確認を併せて行った。 NAD無添 加区では、 FcDHと NOXの両酵素が存在していても、 L フシトールの変換は全く進行 せず、変換には少なくとも触媒量の NADの添カ卩が必要であると考えられた。 FAD無添 加区では、変換は進行するものの、添加区に比べその進行に遅延が見られ、実施例 15— 5で示したように、フラビン補酵素添カ卩による NOXの活性化が、変換には有効で あることが示された。
[0203] 実施例 21 :組換え E. coli菌体反応による L フシトールの変換
生産された酵素を菌体力 取り出すことなぐインタタトセルによる L フシトールの 変換を目的として実験を行った。用いた菌株は、 E. coli/pUC 18、 E. coli/pIEXl l , E. coli/pFEX3052、 E. coli/pFNEX4105および E. coli/pFNIEX5706で、単独、ある いは組み合わせて行った。標準反応条件として、 120 mM L フシトール， 0.2 M Gly-NaOH (pH 9.5), 50 μ Riboflavin, 1 mM MgClおよび洗浄菌体（反応
2
液中の終濃度が、 A =5.0となるように調製)からなる反応液を 30°Cで振盪反応し、適
610
宜サンプリングを行い、 L フシトール、 L フクロースおよび L—フコースを HPLCにて 定量した。 1種類の菌体での反応には、 E. coli/pUC 18、 E. coli/pFEX3052、 E. coli/pFNEX4105および E. coli/pFNIEX5706を用い、 E. coli/pIEXl lは 2種類目の 添加菌体としてのみ利用し、この場合、 1種類目の菌体の終濃度は A =5.0とし、 E.
610
coli〃pIEXl lは終濃度 A =2.5となるように調製した。実験区および反応 40時間後の
610
解析結果を以下表 15に示す。各実験区における変換時間経過は図 26に示す。
[0204] [表 15] 40時間変換後 実験区 菌株 L-フコ一ス L -フクロース L -フシトール
(mM) (mM) (mM)
A E. coli/pUC1 8 0.0 0.0 1 23.8
B E. coli/PFEX3052 0.1 10.3 1 1 2.5
C E. coli/pFNEX4105 1 .7 37.6 72.9
D E, coli/pUC18 + /pIEX1 1 0.3 0.0 128.9
E E. coli/pFEX3052 + /pIEX1 1 1 2.9 0.7 1 10.3
F E, coli/pFNEX4105 + /pIEX1 1 45.3 7.7 63.9
G E. coli/pFNIEX5706 95.7 13.0 12.2
[0205] 図 26内の各プロット中、〇：白丸は Lーフコース、參：黒丸は L フクロース、△:白三 角は L フシトール濃度を示す。反応液組成は、 120 mM L フシトール， 0.2 M Gly-NaOH (pH 9.5), 50 μ Μ リボフラビン（Riboflavin) , 1 mM MgClおよび A
2
=5.0となるよう調製した洗浄菌体である。（A)および (D)では E.coli/pUC 18を、（B)
610
および（E)では E. coli/pFEX3052を、（C)および（F)では E. coli/pFNEX4105を、（G )では E. coli/pFNIEX5706をそれぞれ用いた結果であり、（D)、（E)および Fでは上 記組成に加え、 A =2.5となるよう調製した E. coli/pIEXl lの洗浄菌体も添カ卩した。
610
[0206] 結果、実験区 (A)に示すように対照区 E. coli/pUC 18によっては L フシトールは全 く変換されないのに対し、 FcDH発現株 E. coli/pFEX3052によっては実験区（B)に示 すように L フクロースの生成が認められた。このことから、インタタトセルによる反応で は、宿主菌体内に存在する NADが補酵素として機能し得ること、および若干の NOX 活性を宿主が有することが示された。実験区 (C)に示す FcDHおよび NOX発現株 E. coli/pFNEX4105によっては、 FcDH発現株に比べ L フクロース生産性が向上してお り、 NOXの発現により、 NAD(H)のリサイクルが効率的に行われるようになっていると考 えられた。 E. coli/pFEX3052あるいは E. coli/pFNEX4105による変換時に、 Fuel発 現株 E.coli/pIEXl lを共存させることにより、実験区 (E)、 （F)にそれぞれ示すように、 生成する L フクロースは Lーフコースに変換されることがそれぞれ認められた。更に、 FcDH, NOXおよび FucI3酵素発現株 E. coli/pFNIEX5706を用いた変換では、実験 区 (G)に示すように単一菌株により L フシトールが Lーフコースに変換可能なことが 示された。 [0207] 実施例 22： FcDH+NOX+FucI+KatE発現株の作成とその培養
NOX活性に由来すると思われる H 0生成が、 L-Fudtolの変換を阻害することが酵
2 2
素反応の結果力も認められ、また、カタラーゼの添カ卩によりその阻害を除去すること が可能であったため、 FcDH+NOX+FucI共発現菌に、更にカタラーゼをも共発現する 菌株を作成した。カタラーゼは E.col油来カタラーゼである KatEタンパク質を用いるこ ととした。本酵素をコードする遺伝子は National Center for Biotechnology Informationのデータベースに Accession number M55161として登録されている。本 酵素を E. coliに大量発現させる目的で、下記の PCRプライマー（配列番号 28、配列 番号 29)を作成し、常法により得た E. coli W3110株由来のゲノミック DNAをテンプレ ートとした PCRを行い、約 2.5 kbp長のフラグメントを得た。得られた PCR産物を Sall、 Pstlで消化後、プラスミド pSTV28 (Takara Bio Inc.製）の相当する位置に挿入し、 KatE発現用プラスミド pKEX5804を作成した。更に本プラスミドで E.coli/pFNIEX5706 株を形質転換し、 PFNIEX5706および pCEX8401両プラスミドを保持する菌株
E.coli/FNIC7001株を作成した。
[0208] 配列 28： KatE取得用 5'プライマー
GGCTTCACTAGTCGACTATTAAAAATCAGAAAAAC
配列 29： KatE取得用 3'プライマー
ATGTAAATCCTGCAGGCGGCGCAATTGCGCGCTCC
[0209] 本株は、 LBZAmp + Cm (クロラムフエ-コール、 0.03 mg/ml)プレート上 37°Cで培 養することによりリフレッシュした。液体培養には LBZAmp+Cm液体培地を用い 37°C で培養した。リフレッシュした菌体を接種した後、終濃度 1 mMの IPTGを添加し、 6— 18 h時間培養を行った後、遠心操作により集菌した。集菌した菌体は、 25 mMの Tris-HCl buffer (pH 8.0)で洗浄し、後の実験に用いた。また、 LB培地の替わりに TB培地（12 g/1 trypton, 24 g/1 yeast extract, 4 g/1 glycerol, 2.3 g/1 KH
2
PO , 12.5 g/1 K HPO )を用いた場合もある力 菌体量が多く得られる点以外、本
4 2 4
質的に変わりはなかった。
[0210] 実施例 23 : E.coli/FNIC7001株無細胞抽出液中の酵素活性測定
TB培地を用い、 30°Cあるいは 37°Cで培養した後、集菌、洗浄した菌体を 25 mM Tris-HCl
(pH 8.0)に再懸濁し、超音波処理（200W, 10 min)にて破砕し、 14,000 gで 15 min 遠心した上清を得、これを無細胞抽出液として、酵素活性測定の酵素源とした。対照 として E.coli/pFNIEX5706株も用いた。
[0211] KatE活性の測定は、標準条件として以下の要領にて行った。 0.1 M Tris-HCl
(pH 8.0)で適宜希釈した酵素溶液 1容に、 0.5容の 59 mMの H 0を加え、 30°Cで反
2 2
応を行い、活性定量は、 H 0の減少に伴う 240 における吸光度減少をモニター
2 2
することにより行った。 H 0の吸光係数は e =43.6M— m— 1を用いた。測定は H 0の
2 2 240 2 2 添カ卩によりスタートし、活性は初発 1分間の吸光度変化を初速度とし、ここから算出し た。測定時には酵素源を添加しない実験区も作成し、これをブランク値とした。 KatE 活性として、 30°Cで 1分間に 1 μ molの Η 0を消費する活性を 1 Uとして定義した。測
2 2
定した酵素活性を表 16に示す。 30°C 37°Cのいずれの培養温度においても、 PKEX5804を有する E.coli/FNIC7001株の方が E.coli/pFNIEX5706に比べ、高い KatE 活性を有することが認められた。
[0212] [表 16]
表 16
Stram p PllaacsnmmiHd 培養温）度 K (aut/Em活g性) pF
Figure imgf000068_0001
FNIC7001 55.0
[0213] 実施例 24 : E.coli/FNIC7001株による L フシトールの変換
TB/Amp+Cm培地を用いて、 27 30 33、あるいは 37°Cで培養した E.coli/FNIC7001 株の洗浄インタタトセルによる L フシトールの変換実験を行った。反応は、 380 mM L-Fucitol, 0.2 M Gly-NaOH (pH 9.5), 50 ^ M リボフラビン， 1 mM MnCl
2
, 0.1 mg/ml Amp, 0.03mg/ml Cmおよび洗浄菌体 (反応液中の終濃度力 A
610
=10.0となるように調製)からなる反応液を 30°Cで振盪反応することにより行い、適宜サ ンプリングを行い、 L フシトール、 L—フクロースおよび Lーフコースを HPLCにて定量 した。実験区および反応 45時間後の解析結果を以下表 17に、各実験区における変 換時間経過は図 27に示す。また、各培養温度より得た菌体から調製した無細胞抽出 液中の酵素活性を表 18に示す。
[0214] [表 17] 表 17
45時間変換後
菌体培養温度
実験区 (°C) L-フコース L-フクロース L -フシ! ^一ル
(mM) (mM) (mM)
A 27 312.2 31.3 36.2
B 30 327.1 30.3 26.9
C 33 299.4 27.4 50.3
D 37 108.5 9.0 269.3
[0215] [表 8]
表 18
酵素活性（U/mg)
ί口 ;皿 βι·
(°C) FcDH NOX Fuel KatE
27 0.57 1 .32 0.41 51.3
30 0.65 1 .62 0.42 52.0
33 1.63 4.71 0.87 57.3
37 2.05 6.49 0.92 50.8
[0216] 図 27内の各プロット中、〇：白丸は Lーフコース、參：黒丸は L フクロース、△:白三 角は L フシトール濃度を示す。反応液組成は、 380 mM L フシトール， 0.2 M Gly-NaOH (pH 9.5), 50 μ リボフラビン， 1 mM MnCl , 0.1 mg/ml Amp,
2
0.03mg/ml Cmおよび A =10.0となるよう調製した洗浄菌体である。変換反応に用い
610
た菌体は、 27 (図 A)、 30 (図 B)、 33 (図 C)あるいは 37°C (図 D)にて培養したものを用 いた。
[0217] 結果、菌体培養温度が高いほど単位タンパク質量当たりの酵素活性は高い傾向が あつたが、インタタトセルを用いた変換反応では、菌体培養温度が 37°Cの場合よりも 27、 30あるいは 33°Cの場合の方力 変換速度が速かった。 産業上の利用可能性
本発明は、 L-フコースの工業的生産に好適である。本発明は、 L-フコースを利用 する様々な分野に寄与することが期待される。
配列表フリーテキスト
配列番号 1 fod遺伝子取得用 5，プライマー
配列番号 2 fod遺伝子取得用 3，プライマー
配列番号 3 E. coli由来 fod遺伝子塩基配列
配列番号 4 E. col油来 Fuelアミノ酸配列
配列番号 5 foci遺伝子取得用 PCRプライマー
配列番号 6 foci遺伝子取得用 PCRプライマー
配列番号 7 sldA遺伝子取得用 5 'プライマー
配列番号 8 sldA遺伝子取得用 3 'プライマー
配列番号 9 Kmr遺伝子取得用 5，プライマー
配列番号 10 Kmr遺伝子取得用 3，プライマ
配列番号 11 FcDH由来ペプチドフラグメント F1のアミノ酸配列
配列番号 12 FcDH由来ペプチドフラグメント F2のアミノ酸配列
配列番号 13 NOX由来ペプチドフラグメント N1のアミノ酸配列
配列番号 14 NOX由来ペプチドフラグメント N2のアミノ酸配列
配列番号 15 FcDHコード遺伝子 fcdhの塩基配列
配列番号 16 FcDHアミノ酸配列
配列番号 17 NOXコード遺伝子 noxの塩基配列
配列番号 18 NOXアミノ酸配列
配列番号 19 fcdh取得用 5'プライマー
配列番号 20 fcdh取得用 3'プライマー
配列番号 21 nox取得用 5'プライマー
配列番号 22 nox取得用 3'プライマー
配列番号 23 fcdh+nox取得用 3'プライマー
配列番号 24 foci取得用 5'プライマー 配列番号 25 :fod取得用 3'プライマー 配列番号 26 :fod取得 (単独発現用） 5'プライマ 配列番号 27 :fod取得 (単独発現用） 3'プライマ 配列番号 28： KatE取得用 5'プライマー 配列番号 29： KatE取得用 3'プライマー

Claims

請求の範囲
[1] L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物由 来タンパク質の存在下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる、 L—フク口 ースの製造方法。
[2] 前記微生物が酢酸菌である、請求項 1に記載の L フクロースの製造方法。
[3] L フシトールから L フクロースを生成し、 L—フクロース生成量を L フシトール酸化 物中の 50wt%以上にする能力を有する微生物、当該微生物の培養物および当該微 生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上の存在下で、 L フシト ールから L フクロースを生成せしめる、 L フクロースの製造方法。
[4] ダルコノバクタ一.キシリナス ·サブスピーシーズ'キシリナスおよびダルコノバクタ一' ォキシダンスのうちの少なくとも一方の微生物、当該微生物の培養物、並びに当該微 生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上の存在下で、 L フシト ールから L フクロースを生成せしめる、 L フクロースの製造方法。
[5] L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク 質を有し、かつ、 L フシトール力も L フクロース以外のケトへキソースを生成する能 力を実質的に有しない非遺伝子操作微生物、当該非遺伝子操作微生物の培養物 および当該非遺伝子操作微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2 種以上の存在下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる、 L フクロース の製造方法。
[6] L フシトール力も L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物由 来の第 1のタンパク質を有し、かつ、 L フシトールから L フクロース以外のケトへキソ ースを生成する活性を有する第 2のタンパク質をコードする遺伝子が破壊された微生 物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1 種または 2種以上の存在下で、 L フシトール力も L フクロースを生成せしめる、 L- フクロースの製造方法。
[7] L フシトール力 L フクロース以外のケトへキソースを生成する能力を実質的に有 せず、 L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生 物由来の第 1のタンパク質を発現可能に形質転換された微生物、当該微生物の培養 物および当該微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上の存 在下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる、 L—フクロースの製造方法。
[8] 前記微生物が、 L フシトール力 L フクロース以外のケトへキソースを生成する活 性を有する第 2のタンパク質をコードする遺伝子が破壊された微生物である、請求項
7に記載の L フクロースの製造方法。
[9] L フシトール力も L フクロース以外のケトへキソースの生成が抑制される反応条件 下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる、請求項 1から 4のいずれか一 項に記載の L フクロースの製造方法。
[10] L フシトールから L フクロース以外のケトへキソースの生成が抑制される pH条件 下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる、請求項 1から 4のいずれか一 項に記載の L フクロースの製造方法。
[11] 2価イオンキレート剤が共存し、 L フシトール力も L フクロース以外のケトへキソー スの生成が抑制される条件下で、 L フシトール力も L フクロースを生成せしめる、請 求項 1から 4のいずれか一項に記載の L フクロースの製造方法。
[12] NADHから NADを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フシトールか ら L フクロースを生成せしめる、請求項 1から 8のいずれか一項に記載の L フクロー スの製造方法。
[13] L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物由 来タンパク質の存在下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる L フクロー ス生成工程と、
L フクロースカゝら Lーフコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フクロースから Lーフコースを生成せしめる Lーフコース生成工程と、
を含む、 Lーフコースの製造方法。
[14] L フシトールから L フクロースを生成し、 L—フクロース生成量を L フシトール酸化 物中の 50wt%以上にする能力を有する微生物、当該微生物の培養物および当該微 生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上の存在下で、 L フシト ールから L フクロースを生成せしめる L フクロース生成工程と、
L フクロースカゝら Lーフコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フクロースから Lーフコースを生成せしめる Lーフコース生成工程と、
を含む、 Lーフコースの製造方法。
[15] L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク 質を有し、かつ、 L フシトール力も L フクロース以外のケトへキソースを生成する能 力を実質的に有しない非遺伝子操作微生物、当該非遺伝子操作微生物の培養物 および当該非遺伝子操作微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2 種以上の存在下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる、 L フシトール 力 L フクロースを生成せしめる L フクロース生成工程と、
L フクロースカゝら Lーフコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フクロースから Lーフコースを生成せしめる Lーフコース生成工程と、
を含む、 Lーフコースの製造方法。
[16] L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク 質を有し、かつ、 L フシトールから L フクロース以外のケトへキソースを生成する活 性を有するタンパク質をコードする遺伝子が破壊された微生物、当該微生物の培養 物および当該微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上の存 在下で、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる、 L—フシトールから L フク口 ースを生成せしめる L フクロース生成工程と、
L フクロースカゝら Lーフコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フクロースから Lーフコースを生成せしめる Lーフコース生成工程と、
を含む、 Lーフコースの製造方法。
[17] L フシトール力 L フクロース以外のケトへキソースを生成する能力を実質的に有 せず、 L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生 物由来タンパク質を発現可能に形質転換された微生物、当該微生物の培養物およ び当該微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上の存在下で 、 L フシトールから L フクロースを生成せしめる、 L フシトールから L フクロースを 生成せしめる L フクロース生成工程と、
L フクロースカゝら Lーフコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フクロースから Lーフコースを生成せしめる Lーフコース生成工程と、 を含む、 Lーフコースの製造方法。
[18] L フシトール力 L フクロース以外のケトへキソースを生成する能力を実質的に有 せず、 L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有する微生 物由来タンパク質および L フクロース力 Lーフコースを生成する活性を有するタン パク質を発現可能に形質転換された微生物、当該微生物の培養物ならびに当該微 生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上の存在下で、 L フシト ールから Lーフコースを生成せしめる、 Lーフコースの製造方法。
[19] 下記 (A)または（B)のタンパク質。
(A)配列番号 16に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号 16に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 L フシトールから L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタン パク質
[20] 請求項 19に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[21] 下記 (a)または (b)に示すポリヌクレオチド。
(a)配列番号 15に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(b)配列番号 15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと ストリンジェントな条件下にお 、てハイブリダィズし、かつ L フシトールから L フク口 ースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチ ド、
[22] 下記 (C)または（D)のタンパク質。
(C)配列番号 18に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号 18に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆 位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 NADHォキシダーゼ活性を有するタンパク質
[23] 請求項 22に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[24] 下記 (c)または (d)に示すポリヌクレオチド。
(c)配列番号 17に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド (d)配列番号 17に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと ストリンジェントな条件下にお 、てハイブリダィズし、かつ NADHから NADを生成す る活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
[25] 請求項 20に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
[26] 請求項 23に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
[27] 請求項 20に記載のポリヌクレオチドおよび請求項 23に記載のポリヌクレオチドが組 み込まれた組換えポリヌクレオチド。
[28] 請求項 25に記載の組換えポリヌクレオチドが導入され、 L フシトール力も L フク口 ースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を発現する、形質転換体。
[29] 請求項 28に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物を培地中で培養 し、培地中および Zまたは微生物中に、 L—フシトール力 L フクロースを生成する デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質 の製造方法。
[30] 請求項 28に記載された形質転換体が微生物であり、
当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より 選ばれる 1種または 2種以上を、 L—フシトールを含む反応系に添カ卩し、 L フシトール 力も L フクロースを生成せしめる、 L フクロースの製造方法。
[31] 請求項 28に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物、当該微生物の 培養物および当該微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上 を、 L—フシトールを含む反応系に添カ卩し、 L フシトールから L フクロースを生成せし める、 L-フクロース生成工程と、
L フクロースカゝら Lーフコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フクロースから Lーフコースを生成せしめる Lーフコース生成工程と、
を含む、 Lーフコースの製造方法。
[32] 請求項 25に記載の組換えポリヌクレオチドおよび請求項 26に記載の組換えポリヌ クレオチドが導入され、 L フシトール力 L フクロースを生成するデヒドロゲナーゼ 活性を有するタンパク質および NADHカゝら NADを生成する活性を有するタンパク質 を発現する、形質転換体。
[33] 請求項 26に記載の組換えポリヌクレオチドが導入され、 NADH力も NADを生成す る活性を有するタンパク質を発現する形質転換微生物を培地中で培養し、培地中お よび Zまたは微生物中に、 NADH力も NADを生成する活性を有するタンパク質を 蓄積させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
[34] 請求項 32に記載された形質転換体が微生物であり、
当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より 選ばれる 1種または 2種以上を、 L—フシトールを含む反応系に添カ卩し、 L フシトール 力も L フクロースを生成せしめる、 L フクロースの製造方法。
[35] 請求項 32に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物、当該微生物の 培養物および当該微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上 を、 L—フシトールを含む反応系に添カ卩し、 L フシトールから L フクロースを生成せし める、 L-フクロース生成工程と、
L フクロースカゝら Lーフコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フクロースから Lーフコースを生成せしめる Lーフコース生成工程と、
を含む、 Lーフコースの製造方法。
[36] 請求項 27に記載の組換えポリヌクレオチドが導入され、 L フシトール力も L フク口 ースを生成するデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質および NADH力 NADを 生成する活性を有するタンパク質を発現する、形質転換体。
[37] 請求項 36に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物を培地中で培養 し、培地中および Zまたは微生物中に、 L—フシトール力 L フクロースを生成する デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質および NADHカゝら NADを生成する活性を 有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
[38] 請求項 36に記載された形質転換体が微生物であり、
当該微生物、当該微生物の培養物および当該微生物の菌体処理物からなる群より 選ばれる 1種または 2種以上を、 L—フシトールを含む反応系に添カ卩し、 L フシトール 力も L フクロースを生成せしめる、 L フクロースの製造方法。
[39] 請求項 36に記載された形質転換体が微生物であり、当該微生物、当該微生物の 培養物および当該微生物の菌体処理物力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上 を、 L—フシトールを含む反応系に添カ卩し、 L フシトールから L フクロースを生成せし める、 L-フクロース生成工程と、
L フクロースカゝら Lーフコースを生成する活性を有するタンパク質の存在下で、 L フクロースから Lーフコースを生成せしめる Lーフコース生成工程と、
を含む、 Lーフコースの製造方法。
PCT/JP2005/004701 2004-03-17 2005-03-16 Ｌ−フクロースの製造方法およびｌ−フコースの製造方法 Ceased WO2005087941A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05720936A EP1743943A4 (en) 2004-03-17 2005-03-16 PROCESS FOR PREPARING L-FUCULOSE AND METHOD FOR PRODUCING L-FUCOSE
JP2006511058A JP4775258B2 (ja) 2004-03-17 2005-03-16 Ｌ−フクロースの製造方法およびｌ−フコースの製造方法
US11/532,618 US7575910B2 (en) 2004-03-17 2006-09-18 Method for producing L-fuculose and method for producing L-fucose

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004077117 2004-03-17
JP2004-077117 2004-03-17

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US11/532,618 Continuation US7575910B2 (en) 2004-03-17 2006-09-18 Method for producing L-fuculose and method for producing L-fucose

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005087941A1 true WO2005087941A1 (ja) 2005-09-22

Family

ID=34975590

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/004701 Ceased WO2005087941A1 (ja) 2004-03-17 2005-03-16 Ｌ−フクロースの製造方法およびｌ−フコースの製造方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US7575910B2 (ja)
EP (1) EP1743943A4 (ja)
JP (1) JP4775258B2 (ja)
WO (1) WO2005087941A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019101629A1 (en) 2017-11-21 2019-05-31 Jennewein Biotechnologie Gmbh Process for the purification of l-fucose from a fermentation broth
US10428361B2 (en) 2015-03-26 2019-10-01 Basf Se Biocatalytic production of l-fucose

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4452914B2 (ja) * 2003-09-08 2010-04-21 味の素株式会社 新規トランスポータタンパク質
JP4655539B2 (ja) * 2004-08-06 2011-03-23 味の素株式会社 アシラーゼを用いたβアミノ酸の製造方法
JP4877227B2 (ja) * 2005-05-20 2012-02-15 味の素株式会社 Ｌ−セリン誘導体の製造方法およびこれに用いる酵素
JP4806963B2 (ja) 2005-05-20 2011-11-02 味の素株式会社 β−ヒドロキシアミノ酸の製造方法およびこれに用いる酵素
RU2007147436A (ru) * 2007-12-21 2009-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Бактерия-продуцент (2s,3r,4s)-4-гидрокси-l-изолейцина и способ продукции (2s,3r,4s)-4-гидрокси-l-изолейцина
JP5532928B2 (ja) * 2008-01-18 2014-06-25 味の素株式会社 セリン誘導体の製造方法及びこれに用いるタンパク質
DE112009001080T5 (de) * 2008-05-12 2011-03-03 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zum Herstellen von β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002006506A1 (de) * 2000-07-17 2002-01-24 Novabiotec Dr. Fechter Gmbh Verfahren zur enzymatischen herstellung von seltenen monosacchariden, insbesondere von tagatose

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5951798A (ja) 1982-08-10 1984-03-26 ヘキスト・アクチエンゲゼルシヤフト ラムノ−スまたはフコ−スの製法
JPS6157520A (ja) 1984-08-29 1986-03-24 Kibun Food Chemiphar:Kk フコイダン純度の高い溶液又は、フコイダンの製造方法
JP3194160B2 (ja) 1992-05-08 2001-07-30 株式会社林原生物化学研究所 Ｌ−タガトースの製造方法
JP3132913B2 (ja) 1992-09-11 2001-02-05 キッコーマン株式会社 Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びｌ−フコースデヒドロゲナーゼの製造法
ES2284162T3 (es) 1995-02-27 2007-11-01 Dsm Ip Assets B.V. D-sorbitol dehidrogenasa.
US6713287B1 (en) * 1995-10-24 2004-03-30 The Scripps Research Institute Enzymatic synthesis of L-fucose and L-fucose analogs
JPH1135591A (ja) 1997-07-18 1999-02-09 Masakuni Tako オキナワモズクから分離したフコイダンからのｌ−フコ ースの製造とそれの製造法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002006506A1 (de) * 2000-07-17 2002-01-24 Novabiotec Dr. Fechter Gmbh Verfahren zur enzymatischen herstellung von seltenen monosacchariden, insbesondere von tagatose

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1743943A4 *
SEEMANN E. ET AL: "Structure and mechanism of L-fucose isomerase from Escherichia coli.", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY., vol. 273, no. 1, 1997, pages 256 - 268, XP004461405 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10428361B2 (en) 2015-03-26 2019-10-01 Basf Se Biocatalytic production of l-fucose
WO2019101629A1 (en) 2017-11-21 2019-05-31 Jennewein Biotechnologie Gmbh Process for the purification of l-fucose from a fermentation broth
US11732282B2 (en) 2017-11-21 2023-08-22 Chr. Hansen HMO GmbH Process for the purification of L-fucose from a fermentation broth

Also Published As

Publication number Publication date
JP4775258B2 (ja) 2011-09-21
EP1743943A4 (en) 2012-01-18
JPWO2005087941A1 (ja) 2008-01-31
US20070026504A1 (en) 2007-02-01
EP1743943A1 (en) 2007-01-17
US7575910B2 (en) 2009-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9834795B2 (en) Recombinant microorganisms and uses therefor
CA2737428C (en) Bacterium capable of producing lactic acid, and method for producing lactic acid
Chandra Raj et al. Pyruvate decarboxylase: a key enzyme for the oxidative metabolism of lactic acid by Acetobacter pasteurianus
JP6375227B2 (ja) 組換え細胞、並びに、イソプレンの生産方法
CN107690482A (zh) 用于2,4‑二羟基丁酸的优化生产的经修饰的微生物
RU2294370C2 (ru) Способ получения спирта с использованием микроорганизма
Oh et al. Purification and characterization of a malate: quinone oxidoreductase from Pseudomonas taetrolens capable of producing valuable lactobionic acid
JP4775258B2 (ja) Ｌ−フクロースの製造方法およびｌ−フコースの製造方法
Fukuda et al. Characterization of an archaeal malic enzyme from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1
TWI500767B (zh) 高產量之異丙醇生產細菌
EP1226265B1 (en) Bioproduction of para-hydroxycinnamic acid
JP2011067139A (ja) 組換えベクター、形質転換体、及び２ｈ−ピラン−２−オン−４，６−ジカルボン酸の製造方法
JP4216719B2 (ja) ハロゲン化合物耐性新規ギ酸脱水素酵素及びその製造方法
US6630341B2 (en) Phosphohexuloisomerase and gene therefor
JP2005507255A (ja) バイオテクノロジープロセスを実施する能力が増強された真菌微生物
JP4333088B2 (ja) グルコノバクター属細菌の新規遺伝子及び目的物質の製造法
JP4272231B2 (ja) キラルなヒドロキシアルデヒド化合物の製造方法
JP5115708B2 (ja) 新規過酸化水素生成型ｎａｄｈオキシダーゼ及びそれをコードするｄｎａ
EP2119770B1 (en) Production of alpha-oxyfunctionalized carbonyl compounds
Zhou et al. Molecular genetic characterization of the thermostable L-lactate dehydrogenase gene (ldhL) of Thermoanaerobacter ethanolicus JW200 and biochemical characterization of the enzyme
JP2008043325A (ja) 温度感受性アルコール脱水素酵素を有する酵母及び有機酸の製造方法
JPWO2005080572A1 (ja) トリテルペン水酸化酵素
JP2004504025A (ja) 大腸菌における、コマモナスのシクロペンタノン１，２−モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子
US20050239180A1 (en) Nucleotide sequence coding for a mannitol-2 dehydrogenase and method for the production of d-mannitol
CN113215122B (zh) 一种羰基还原酶突变体及其编码基因和应用

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006511058

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005720936

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11532618

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005720936

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 11532618

Country of ref document: US