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TWI500767B - 高產量之異丙醇生產細菌 - Google Patents

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TWI500767B
TWI500767B TW100107771A TW100107771A TWI500767B TW I500767 B TWI500767 B TW I500767B TW 100107771 A TW100107771 A TW 100107771A TW 100107771 A TW100107771 A TW 100107771A TW I500767 B TWI500767 B TW I500767B
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Yoshiko Matsumoto
Junichiiro Hirano
Takashi Morishige
Tomokazu Shirai
Hitoshi Takahashi
Koh Amano
Nozomi Takebayashi
Mitsufumi Wada
Hiroshi Shimizu
Chikara Furusawa
Takashi Hirasawa
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Mitsui Chemicals Inc
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Description

高產量之異丙醇生產細菌
本發明係關於異丙醇生產細菌及使用此異丙醇生產細菌之異丙醇生產方法。
丙烯係聚丙烯等合成樹脂或石油化學製品的重要基礎原料，廣泛使用在汽車用保險桿或食品容器、膜、醫療設備等。
由植物來源原料製造的異丙醇，可經脫水步驟而變換為丙烯，因此，有希望作為碳中性的丙烯的原料。依照京都議定書，先進國家們有義務在2008年至2012年間將二氧化碳排出量比起1990年降低5%，現在，碳中性的丙烯由於其泛用性，在地球環境上極為重要。
將植物來源原料同化(anabolize)而生產異丙醇的細菌為已知。例如國際公開2009/008377號小冊中，記載改變為能以葡萄糖當做原料而生產異丙醇的細菌，由於異丙醇的選擇性高，因此具有當作工業生產用生物體觸媒之優異性質。
異丙醇製造大腸菌中由於異丙醇之原料為葡萄糖，因此由解糖及異化獲得的多數的化合物均會成為副產物。另一方面，該等化合物為了使大腸菌生長，有時會成為必要物質，無法完全抑制在該等副反應消耗的葡萄糖量。因此，為了使副產物最小化且異丙醇之生產速度提高，必需在考慮大腸菌內發生的所有代謝反應的狀態，使得對異丙醇的代謝的流量成為最大，從生物活性與物質生產的觀點，已有人提議了各種技術。
例如國際公開2009/008377號小冊中，揭示導入有乙醯乙酸去羧酶、異丙醇去氫酶、輔酶A轉移酶及硫解酶之各基因，能從植物來源的原料生成異丙醇的異丙醇生成細菌。並記載該異丙醇生產細菌的能力為生產速度0.6g/L/hr、累積量28.4g/L。
國際公開2009/049274號小冊及Appl. Environ. Biotechnol.,73(24),pp.7814-7818,(2007)中，揭示導入有乙醯基輔酶A乙醯基轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A轉移酶、乙醯乙酸去羧酶及二級醇去氫酶之各基因並製造異丙醇的大腸菌。並記載該等細菌的能力為生產速度0.4g/L/hr、產率43.5%、累積量4.9g/L。
國際公開2009/028582號小冊中揭示導入有乙醯乙酸去羧酶、異丙醇去氫酶、乙醯基輔酶A：乙酸酯輔酶A-轉移酶及乙醯基輔酶A乙醯基轉移酶之各基因並製造異丙醇的大腸菌。並記載該細菌的能力為累積量9.7g/L。
Appl. Microbiol. Biotechnol.,77(6),pp.1219-1224,(2008)中，揭示導入有硫解酶、輔酶A-轉移酶、乙醯乙酸酯去羧酶、一級-二級醇去氫酶之各基因且製造異丙醇的大腸菌。並記載該細菌的能力為生產速度0.6g/L/hr、產率51%、累積量13.6g/L。
國際公開2009/103026號小冊中揭示導入有乙醯乙酸去羧酶、乙醯基輔酶A：乙酸酯輔酶A-轉移酶及乙醯基輔酶A乙醯基轉移酶及異丙醇去氫酶之各基因且能製造異丙醇的大腸菌。並記載可期待該細菌的能力為產率50%、生產速度0.4g/L/hr、最終生產量14g/L。
國際公開2009/247217號小冊中揭示導入有乙醯乙酸酯去羧酶、輔酶A轉移酶、硫解酶及2-丙醇去氫酶之各基因且能製造異丙醇的大腸菌。並記載該細菌的能力為最終生產量2g/L。
在此，異丙醇去氫酶、二級醇去氫酶、一級-二級醇去氫酶及2-丙醇去氫酶，雖然名稱不同，但是係催化相同反應的酵素，輔酶A轉移酶、乙醯乙醯基輔酶A轉移酶、乙醯基輔酶A：乙酸酯輔酶A-轉移酶及輔酶A-轉移酶，雖然名稱不同但是係催化相同反應的酵素。又，乙醯乙酸去羧酶與乙醯乙酸酯去羧酶雖然名稱不同但是係催化相同反應的酵素，硫解酶與乙醯基輔酶A乙醯基轉移酶亦為雖名稱不同但是係催化相同反應的酵素。因此，該等文獻中的異丙醇生產大腸菌，雖然在生產性方面有各種差異，但是用於製造異丙醇而利用的酵素與記載在國際公開2009/008377號小冊的乙醯乙酸去羧酶、異丙醇去氫酶、輔酶A轉移酶及硫解酶的4種為相同者，於以提高生產性或產率等為目的時，以往已探討此等4種酵素。
另一方面，就提高微生物中的物質生產的產率及生產性的方法，已知有使微生物具有的酵素蘋果酸去氫酶缺失的方法。
例如國際公開2009/023493號小冊中記載：於利用大腸菌生產1,4-丁二醇時，藉由將該大腸菌保有的蘋果酸去氫酶基因或蘋果酸去氫酶基因與轉氫酶基因同時破壞，產率會提高。
又，國際公開2009/012210號小冊中記載於利用大腸菌生產乙醇時，藉由將該大腸菌保有的蘋果酸去氫酶基因與D-乳酸去氫酶基因同時破壞，產率會提高。
再者，於國際公開2009/111672號小冊中記載：於利用酵母生產十二醇時，藉由將該酵母保有的乙醛-輔酶A去氫酶基因與D-乳酸去氫酶基因及蘋果酸去氫酶基因同時破壞，有提高生產性的效果。
但是於能生產異丙醇的上述細菌當中任一者，均難稱得上具有充分的生產能力，提高利用異丙醇生產細菌生產異丙醇的產率與生產速度，為待解決的大課題。
本發明的目的在於提供能快速且以高產率生產異丙醇的大腸菌及使用該大腸菌的異丙醇生產方法。
本發明有鑑於上述狀況而生，本發明之異丙醇生產大腸菌及異丙醇生產方法如下。
[1]　一種異丙醇生產大腸菌，係具備異丙醇生產系之大腸菌，其具有選自經強化的蘋果酸去氫酶活性、經強化的NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)活性、及經強化的硫解酶活性構成的群組當中至少1種的強化酵素活性。
[2]　如[1]之異丙醇生產大腸菌，其中該強化酵素活性包含前述經強化的蘋果酸去氫酶活性。
[3]　如[1]之異丙醇生產大腸菌，其中前述強化酵素活性包含前述經強化的蘋果酸去氫酶活性及前述經強化的硫解酶活性。
[4]　如[1]之異丙醇生產大腸菌，其中前述強化酵素活性包含前述經強化的蘋果酸去氫酶活性及前述經強化的NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)活性。
[5]　如[1]之異丙醇生產大腸菌，其中前述強化酵素活性為前述經強化的蘋果酸去氫酶活性及前述經強化的NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)活性及前述經強化的硫解酶活性。
[6]　如[1]至[5]中任一項之異丙醇生產大腸菌，其中前述強化酵素活性係來自於利用從菌體外導入的酵素基因所為之強化及利用於菌體內的酵素基因的表現增強所為之強化至少其中之一者。
[7]　如[1]至[6]中任一項之異丙醇生產大腸菌，其中前述強化酵素活性係來自利用於寄主大腸菌的基因體上的強化及質體導入所為之強化至少其中之一者。
[8]　如[1]至[7]中任一項之異丙醇生產大腸菌，其中前述強化酵素活性係來自於艾氏菌(Escherichia)屬細菌來源的各酵素的編碼基因。
[9]　如[1]至[8]中任一項之異丙醇生產大腸菌，其中前述異丙醇生產系係利用乙醯乙酸去羧酶、異丙醇去氫酶、輔酶A轉移酶、及硫解酶之各酵素基因加以構建。
[10]　如[1]至[8]中任一項之異丙醇生產大腸菌，其中前述異丙醇生產系係利用前述乙醯乙酸去羧酶、異丙醇去氫酶、輔酶A轉移酶及硫解酶之各酵素基因加以構建，且各酵素基因係各自獨立地來自於選自於由梭狀芽孢桿菌(Clostridium)屬細菌、桿菌(Bacillus)屬細菌及艾氏菌(Escherichia)屬細菌構成的群組當中至少1種原核生物。
[11]　如[1]至[8]中任一項之異丙醇生產大腸菌，其中前述乙醯乙酸去羧酶活性係來自於丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌(Clostridium acetobutylicum)來源的酵素的編碼基因，前述異丙醇去氫酶活性係來自於拜氏梭狀芽孢桿菌(Clostridium beijerinckii)來源的酵素的編碼基因，前述輔酶A轉移酶活性、硫解酶活性、蘋果酸去氫酶活性及NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)活性係來自於大腸桿菌(Escherichia coli)來源的各酵素的編碼基因。
[12]　一種異丙醇生產方法，係包含使用如[1]至[11]中任一項之異丙醇生產大腸菌從植物來源的原料生產異丙醇。
 [實施發明之形態]
本發明之異丙醇生產大腸菌，係具備異丙醇生產系，且同時具有選自由經強化的蘋果酸去氫酶活性、經強化的NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)活性、及經強化的硫解酶活性構成的群組當中至少1種強化酵素活性。
本發明之異丙醇生產大腸菌，由於具備上述3種酵素活性當中至少其中1種的強化酵素活性，因此能快速且以高產率生產異丙醇。
亦即本發明為了提高異丙醇生產系的活性而進行了各種探討，結果發現藉由使位於葡萄糖的代謝路徑的酵素之一的蘋果酸去氫酶的活性、與NADH及NADP+ 的氧化還原相關的酵素即NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)活性、為異丙醇生產系之一的硫解酶活性當中至少任一者的活性強化，能提高利用該大腸菌生產為產物的異丙醇的生產速度並提高產率。
本發明中，「活性」或「能力」之「強化」，廣泛意指在強化前的異丙醇生產大腸菌的各種酵素活性於強化後增高之意。
強化方法，只要是異丙醇生產大腸菌原本具有的各種酵素的活性提高即可，無特殊限制，例如利用從菌體外導入的酵素基因所為之強化、利用增強菌體內的酵素基因表現所為之強化或此等的組合。
利用從菌體外導入之酵素基因所為之強化，具體而言，例如：將比起寄主來源的酵素更為高活性的酵素的編碼基因從寄主細菌的菌體外導入菌體內，而利用經導入的酵素基因使酵素活性追加，或將來自於寄主的酵素基因所得的酵素活性利用該導入的酵素基因而取代酵素活性、使寄主來源的酵素基因或來自菌體外的酵素基因的數目增加為2以上，或此等的組合。
利用菌體內的酵素基因的表現增強所為之強化，具體而言，例如：將增強酵素基因表現的鹼基序列從寄主細菌的菌體外導入菌體內、將寄主細菌在基因體上保有的酵素基因的啟動子取代為其他啟動子而藉此強化酵素基因表現、或此等的組合。
本發明中，「寄主」係指接受1個以上基因從菌體外導入的結果，而成為本發明之異丙醇生產大腸菌的該大腸菌。
又，本說明書中，用語「步驟」不僅指獨立的步驟，即使與其他步驟無法明確區別的情形，只要能達成本步驟所期待的作用，也包含在本用語。
本說明書，使用「~」表示的數值範圍，代表包含「~」的前後記載的數值各當做最小值及最大值的範圍。
以下說明本發明。
本發明中，蘋果酸去氫酶係指分類為依據國際生化學協會(I.U.B.)酵素委員會報告的酵素編號1.1.1.40，催化從L-蘋果酸生成丙酮酸與CO2 的反應的酵素的總稱。
如此的酵素，例如來自於陰道鞭毛蟲(Tritrichomonas vaginalis)等三毛滴蟲(Tritrichomonas)屬原蟲、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)等根瘤菌(Rhizobium)細菌、Sulfolobus fataricus等硫化葉菌(Sulfolobus)細菌、麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)等棒狀桿菌(Corynebacterium)屬細菌、大腸桿菌(Escherichia coli)等艾氏菌(Escherichia)屬細菌、Sinorhizobium meliloti等中華根瘤菌(Sinorhizobium)屬細菌者。
本發明中使用的蘋果酸去氫酶的基因，可利用具有從上述各來源生物獲得的蘋果酸去氫酶的編碼基因的鹼基序列的DNA或依據其公知之鹼基序列合成的合成DNA序列。較佳者例如來自於：根瘤菌(Rhizobium)細菌、硫化葉菌(Sulfolobus)細菌、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬細菌、艾氏菌(Escherichia)屬細菌或中華根瘤菌(Sinorhizobium)屬細菌等原核生物者，尤佳為具有來自於大腸桿菌(Escherichia coli)之基因之鹼基序列的DNA。
就提高有用物質生產的目的而言，到目前完全未見到強化蘋果酸去氫酶之活性及該酵素之編碼基因之表現的見解。而且，利用微生物進行物質生產時，如WO2009/023493、WO2009/012210、WO2009/111672所記載，一般的想法是為了提高生產性或產率，應該使微生物內存在的蘋果酸去氫酶的活性或編碼為該酵素之基因缺失。因此，藉由強化蘋果酸去氫酶之活性而提高異丙醇之生產速度與產率，完全是料想之外。
本發明中，NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)，係指分類為依據國際生化學協會(I.U.B.)酵素委員會報告之酵素編號1.6.1.2，催化以下反應之酵素之總稱。
在此，NADP係指菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)，NADPH係指其還原型。又，NAD係指菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide)，NADH指其還原型。
NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)，例如來自於大腸桿菌(Escherichia coli)等艾氏菌(Escherichia)屬細菌、Rhodobacter sphaeroides及Rhodobacter capsulatus等紅桿菌屬(Rhodobacter)屬細菌、克雷白氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)等克雷白氏菌(Klebsiella)屬細菌者。
本發明可使用的NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)的基因，可利用具有從上述各來源生物獲得的NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)的編碼基因的鹼基序列的DNA或依據其公知之鹼基序列合成的合成DNA序列。較佳者，例如來自於艾氏菌(Escherichia)屬細菌、紅桿菌(Rhodobacter)屬細菌、克雷白氏菌(Klebsiella)屬細菌等原核生物者，例如具有大腸桿菌(Escherichia coli)之基因之鹼基序列的DNA。尤佳為具有來自於大腸桿菌(Escherichia coli)之基因的鹼基序列的DNA。
本發明中，硫解酶係指分類為依據國際生化學協會(I.U.B.)酵素委員會報告之酵素編號2.3.1.9，催化從乙醯基輔酶A生成乙醯乙醯基輔酶A之反應的酵素的總稱。
如此的酵素，例如來自於：丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭狀芽孢桿菌(Clostridium beijerinckii)等梭狀芽孢桿菌屬細菌、大腸桿菌(Escherichia coli)等艾氏菌屬細菌、鹽桿菌種(Halobacterium sp.)細菌、Zoogloea ramigera等Zoogloea屬細菌、根瘤菌種(Rhizobium sp.)細菌、日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)等慢生根瘤菌屬細菌、熱帶念珠菌(Candida tropicalis)等念珠菌屬細菌、新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)等柄桿菌屬細菌、Streptomyces collinus等鏈黴菌屬細菌、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)等腸球菌屬細菌者。
本發明可使用的硫解酶的基因，可利用具有從上述各來源生物獲得的硫解酶的編碼基因的鹼基序列的DNA或依據其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。較佳者例如具有來自於：丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌、拜氏梭狀芽孢桿菌等梭狀芽孢桿菌屬細菌、大腸桿菌等艾氏菌屬細菌、鹽桿菌種之細菌、Zoogloea ramigera等Zoogloea屬細菌、根瘤菌種細菌、日本慢生根瘤菌等慢生根瘤菌屬細菌、熱帶念珠菌等念珠菌屬細菌、新月柄桿菌等柄桿菌屬細菌、Streptomyces collinus等鏈黴菌屬細菌、糞腸球菌等腸球菌屬細菌之基因之鹼基序列的DNA。更佳者，例如來自於梭狀芽孢桿菌屬細菌或艾氏菌屬細菌等原核生物者，尤佳者例如具有來自於丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌或大腸桿菌之基因之鹼基序列的DNA。
本發明之異丙醇生產大腸菌，具備上述3種酵素活性分別經提高的強化酵素活性當中至少1種酵素活性。3種強化酵素活性當中，硫解酶活性，由於也是構成後述異丙醇生產系當中之一的酵素，所以當含有當做本大腸菌的強化酵素活性的對象時，必需是使硫解酶活性更強化者。如此的強化，如前述，例如於質體或基因體上強化硫解酶之編碼基因的表現、增加硫解酶基因的副本數或此等的組合等。
本發明中，異丙醇生產大腸菌為具備異丙醇生產系之大腸菌，係指利用基因重組而導入或保有經改變的異丙醇生產能力的大腸菌。如此的異丙醇生產系，只要是成為對象的大腸菌能生產異丙醇均可。
較佳為例如強化涉及異丙醇生產的酵素活性。本發明中，異丙醇生產大腸菌，為乙醯乙酸去羧酶活性、異丙醇去氫酶活性、輔酶A轉移酶活性及前述硫解酶活性的4種酵素活性，較佳為從菌體外賦予或增強於菌體內的表現者，或兩者均有。
本發明中，用語「利用基因重組」，只要是對於本來的基因的鹼基序列插入其他DNA，或藉由使基因的某部分取代、缺失或此等組合而在鹼基序列上產生變化，均全部包含，例如也可為因為突變的結果而獲得者。
本發明中，乙醯乙酸去羧酶係指分類為依據國際生化學協會(I.U.B.)酵素委員會報告之酵素編號4.1.1.4，催化從乙醯乙酸生成丙酮之反應的酵素的總稱。
如此的酵素例如來自於丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭狀芽孢桿菌(Clostridium beijerinckii)等梭狀芽孢桿菌屬細菌、多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)等芽孢桿菌屬細菌者。
對於本發明之寄主細菌導入之乙醯乙酸去羧酶的基因，可利用具有從上述各來源生物獲得的乙醯乙酸去羧酶的編碼基因的鹼基序列的DNA或依據其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。較佳者，例如梭狀芽孢桿菌屬細菌或芽孢桿菌屬細菌來源者，例如具有丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌、多黏芽孢桿菌來源的基因的鹼基序列的DNA。尤佳為，具有丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌來源的基因的鹼基序列的DNA。
本發明中，異丙醇去氫酶係指分類為依據國際生化學協會(I.U.B.)酵素委員會報告之酵素編號1.1.1.80，催化從丙酮生成異丙醇之反應的酵素的總稱。
如此的酵素例如拜氏梭狀芽孢桿菌(Clostridium beijerinckii)等梭狀芽孢桿菌屬細菌來源者。
對於本發明之寄主細菌導入的異丙醇去氫酶的基因，可利用具有從上述各來源生物獲得之異丙醇去氫酶的編碼基因的鹼基序列的DNA或依據其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。較佳者，例如來自梭狀芽孢桿菌屬細菌者，例如具有來自於拜氏梭狀芽孢桿菌之基因之鹼基序列的DNA。
本發明中，輔酶A轉移酶係指分類為依據國際生化學協會(I.U.B.)酵素委員會報告之酵素編號2.8.3.8，催化從乙醯乙醯基輔酶A生成乙醯乙酸之反應的酵素的總稱。
如此的酵素例如來自於丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭狀芽孢桿菌(Clostridium beijerinckii)等梭狀芽孢桿菌屬細菌、Roseburia intestinalis等Roseburia屬細菌、Faecalibacterium prausnitzii等Faecalibacterium屬細菌、糞球菌(Coprococcus)屬細菌、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)等錐蟲(Trypanosoma)、大腸桿菌(大腸桿菌(Escherichia coli)：大腸菌)等艾氏菌屬細菌者。
本發明中可使用的輔酶A轉移酶的基因，可利用具有從上述各來源生物獲得的輔酶A轉移酶的編碼基因的鹼基序列的DNA或依據其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。較佳者例如具有來自於丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌等梭狀芽孢桿菌屬細菌、Roseburia intestinalis等Roseburia屬細菌、Faecalibacterium prausnitzii等Faecalibacterium屬細菌、糞球菌屬細菌、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)等錐蟲(Trypanosoma)、大腸桿菌等艾氏菌屬細菌之基因之鹼基序列的DNA。更佳者，例如來自於梭狀芽孢桿菌屬細菌或艾氏菌屬細菌者，尤佳者，例如具有來自於丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌或大腸桿菌之基因之鹼基序列之DNA。
本發明中，用於異丙醇生產而使用的硫解酶，如前述，係指分類為依據國際生化學協會(I.U.B.)酵素委員會報告之酵素編號2.3.1.9，催化從乙醯基輔酶A生成乙醯乙醯基輔酶A之反應之酵素之總稱。關於如此的硫解酶的事項，可直接適用前述事項。
其中，上述4種酵素各別為來自於選自由梭狀芽孢桿菌屬細菌、芽孢桿菌屬細菌及艾氏菌屬細菌構成之群組當中至少1種者，從酵素活性之觀點為較佳，其中，又以乙醯乙酸去羧酶及異丙醇去氫酶為梭狀芽孢桿菌屬細菌來源，輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性為艾氏菌屬細菌來源的情形，以及此等4種酵素均為梭狀芽孢桿菌細菌來源的情形更佳。
其中，本發明之4種酵素，各為來自於丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌、拜氏梭狀芽孢桿菌或大腸桿菌任一者時，從酵素活性之觀點為較佳，乙醯乙酸去羧酶為丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌來源的酵素，輔酶A轉移酶及硫解酶各為丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌或大腸桿菌來源的酵素，異丙醇去氫酶為拜氏梭狀芽孢桿菌來源的酵素更佳，上述4種酵素從酵素活性的觀點，乙醯乙酸去羧酶活性為丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌來源，前述異丙醇去氫酶活性為拜氏梭狀芽孢桿菌來源，輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性為大腸桿菌來源者尤佳。
本發明中，具備含有硫解酶活性之異丙醇生產系的異丙醇生產大腸菌，例如WO2009/008377號記載之pIPA/B株或pIaaa/B株。又，該大腸菌，包含在涉及異丙醇生產的酵素當中，輔酶A轉移酶活性與硫解酶活性之增強係藉由強化該大腸菌在基因體上的各基因的表現而進行，異丙醇去氫酶活性與乙醯乙酸去羧酶活性之增強係於質體強化各基因之表現的菌株(有時稱為pIa/B::atoDAB株)。
本發明中，強化酵素活性，從更有效提高異丙醇生產性之觀點，宜含有經強化的蘋果酸去氫酶活性。含有經強化的蘋果酸去氫酶活性及經強化的硫解酶活性、或含有經強化的蘋果酸去氫酶活性及經強化的NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)活性更佳，具備經強化的蘋果酸去氫酶活性及經強化的NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)活性及經強化的硫解酶活性之強化酵素活性其中任一者最佳。
又，本發明中，增強上述蘋果酸去氫酶、NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)及硫解酶之各編碼基因的表現為最佳。藉此，比起單獨強化各酵素活性的情形，能驚人地提高異丙醇的生產性及產率。
本發明中，異丙醇生產大腸菌之較佳態樣，為在上述pIPA/B株、pIaaa/B株或pIa/B::atoDAB株中，除了蘋果酸去氫酶活性或蘋果酸去氫酶活性以外，NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)及/或硫解酶活性也強化之菌株。該菌株的硫解酶活性，可為在質體與基因體兩者上增強硫解酶之編碼基因的表現者。
更好的態樣為，對於上述pIPA/B株、pIaaa/B株或pIa/B::atoDAB株，將蘋果酸去氫酶活性或除了蘋果酸去氫酶活性以外，也將NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)及/或硫解酶的活性同時強化的菌株。該株的硫解酶活性，可為於質體與基因體上兩者增強硫解酶之編碼基因之表現者。
尤佳的態樣，為對於上述pIPA/B株、pIaaa/B株或pIa/B::atoDAB株同時將蘋果酸去氫酶活性、NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)活性及硫解酶活性強化之菌株。該菌株中的硫解酶活性，可為在質體與基因體上兩者增強硫解酶之編碼基因之表現者。
又最佳態樣為，對於上述或pIa/B::atoDAB株同時將蘋果酸去氫酶活性、NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)活性及硫解酶活性強化之菌株。該菌株中，硫解酶活性可為在質體與基因體上兩者增強硫解酶之編碼基因之表現者。
本發明中，基因的啟動子，只要可控制上述任一基因之表現者即可，但是係為一直在微生物內作用的強力啟動子且即使於葡萄糖存在下其表現也不易受抑制之啟動子，具體而言，例如甘油醛3-磷酸去氫酶(以下有時稱為GAPDH)之啟動子或絲胺酸羥基甲基轉移酶之啟動子。
本發明中，啟動子係指具有sigma因子之RNA聚合酶結合並開始轉錄之部位。例如大腸桿菌來源的GAPDH啟動子，在GenBank存取號碼X02662的鹼基序列資訊中，記載在鹼基編號397-440。
大腸菌來源的輔酶A轉移酶基因(atoD及atoA)與硫解酶基因(atoB)，由於以atoD、atoA、atoB的順序在大腸菌基因體上形成操縱子(Journal of Baceteriology Vol.169 pp 42-52 Lauren Sallus Jenkins等人)，因此藉由改變atoD之啟動子，可同時控制輔酶A轉移酶基因與硫解酶基因的表現。
由此，當輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性係由寄主大腸菌的基因體基因獲得時，從獲得充分的異丙醇生產能力的觀點，宜藉由使擔當兩酵素基因表現的啟動子取代為其他之啟動子等而增強兩酵素基因之表現。用於增強輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性之表現而可使用的啟動子，例如前述大腸桿菌來源的GAPDH啟動子等。
本發明中，該等酵素之活性，可藉由從菌體外導入菌體內，或強化寄主細菌在基因體上保有之酵素基因之啟動子活性或藉由取其他啟動子取代，而使酵素基因強表現。
酵素活性之導入，例如可藉由將酵素之編碼基因使用基因重組技術從寄主細菌之菌體外導入菌體內而進行。此時，導入之酵素基因，對於寄主細胞可為同種或異種。從菌體外將基因導入菌體內時必要的基因體DNA的製備、DNA之切斷及連結、轉形、PCR(Polymerase Chain Reaction)、當做引子使用的寡核苷酸的設計、合成等方法，可利用該技術領域之人士熟知的通常方法進行。此等方法，記載於Sambrook,J.,et al.,”Molecular Cloning A Laboratory Manual,Second Edition”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)等。
本發明中，酵素活性經強化的大腸菌，係指利用某種方法使該酵素活性經強化的大腸菌。此等大腸菌，可利用例如將該酵素及蛋白質之編碼基因使用與前述同樣的基因重組技術從菌體外使用質體導入菌體內，或強化寄主大腸菌在基因體上保有的酵素基因之啟動子活性或取代為其他啟動子而使得酵素基因強表現等方法製作。
本發明中，大腸菌係指無論原本是否具有從植物來源的原料生產異丙醇的能力，而藉由使用某個方法而獲得從植物來源的原料生產異丙醇之能力的大腸菌。
在此，成為上述基因重組之對象的大腸菌，也可為不具異丙醇生產能力者，只要可進行上述各基因之導入及變更，任一大腸菌均可。
更佳為，預先賦予異丙醇生產能力的大腸菌，藉此能以更良好效率生產異丙醇。
如此的異丙醇生產大腸菌，例如WO2009/008377號小冊記載之經賦予乙醯乙酸去羧酶活性、異丙醇去氫酶活性、輔酶A轉移酶活性、及硫解酶活性，能從植物來源的原料生產異丙醇的異丙醇生成大腸菌等。
本發明之異丙醇生產方法，包含使用上述異丙醇生產大腸菌而從植物來源的原料生產異丙醇，亦即，包含使上述異丙醇生產大腸菌與植物來源的原料接觸而培養之步驟，以及回收由於接觸而獲得之異丙醇之回收步驟。
上述異丙醇生產方法可使用的植物來源的原料，係指由植物獲得的碳源，只要是植物來源的原料即不特別限定。本發明中，係指根、莖、幹、枝、葉、花、種子等器官、包含此等的植物體、此等植物器官的分解產物，又，植物體、植物器官，或從此等的分解產物獲得的碳源當中可利用於微生物培養的碳源者，也包含在植物來源原料。
如此的植物來源的原料中包含的碳源，就一般者而言，例如：澱粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等糖類，或含有多量此等成分之草木質分解產物、纖維素水解物等或此等的組合，再者，植物油來源的甘油或脂肪酸也可包含在本發明的碳源。
本發明中，植物來源原料，較佳者例如：穀物等農作物、玉米、米、小麥、大豆、甘蔗、甜菜、棉等或此等的組合，其作為原料的使用形態，為未加工品、搾汁、粉碎物等，不特別限定。又，也可僅為上述碳源的形態。
培養步驟中，異丙醇生產大腸菌與植物來源的原料的接觸，一般而言係藉由以含有植物來源的原料的培養基培養異丙醇生產大腸菌而進行。
植物來源的原料與異丙醇生產大腸菌的接觸密度，視異丙醇生產大腸菌活性而異，但一般而言，就培養基中之植物來源的原料之濃度而言，可定為以葡萄糖換算時，起始糖濃度相對於混合物總質量為20質量%以下，從大腸菌的耐糖性的觀點，起始糖濃度可定為15質量%以下。其他各成分，可以對微生物的培養基通常添加之量添加即可，無特殊限制。
又，培養基中之異丙醇生產大腸菌之含量，視大腸菌之種類及活性而異，但一般而言，起始的菌濃度相對於培養液可定為0.1質量%至30質量%，從培養條件控制之觀點，較佳為定在1質量%~10質量%。
異丙醇生產大腸菌之培養使用的培養基，只要是含有碳源、氮源、無機離子及微生物為了生產異丙醇所要求的有機微量元素、核酸、維生素類等之通常使用的培養基即可，無特別限制。
本發明之培養時，培養條件無特別限制，例如可於好氣條件下於pH4~9，較佳為pH6~8、溫度20℃~50℃，更佳為25℃~42℃之範圍內於適當控制pH與溫度之狀態培養。
對於前述混合物中的氣體通氣量，無特別限制，但是氣體僅使用空氣時，一般而言，係0.02vvm~2.0vvm(vvm；通氣容量[mL]/液容量[mL]/時間[分])，從抑制對於大腸菌的物理性損害的觀點，於0.1vvm~2.0vvm進行較佳。
培養步驟，可從培養開始持續到混合物中的植物來源的原料消耗為止，或持續到異丙醇生產大腸菌的活性消失為止。培養步驟之期間，視混合物中的異丙醇生產大腸菌數目及活性以及植物來源的原料的量而異，但一般而言為1小時以上，較佳為4小時以上即可。另一方面，可藉由再投入植物來源的原料或異丙醇生產大腸菌，而藉此無限制地使培養期間連續，但是從處理效率的觀點，一般而言可定為5日以下，較佳為72小時以下。其他條件，可直接適用通常培養使用的條件。
回收累積於培養液中的異丙醇的方法，無特別限制，例如可採用從培養液離心分離菌體等並除去後，以蒸餾或膜分離等通常分離方法分離異丙醇之方法。
又，本發明之異丙醇之生產方法，在為了生產異丙醇之培養步驟之前，也可含有用於使得使用的異丙醇生產大腸菌成為適當菌數或適度活性狀態的前培養步驟。前培養步驟，可利用因應於異丙醇生產細菌種類之通常使用的培養條件培養即可。
本發明之異丙醇之生產方法，較佳為含有：一面對於含有前述異丙醇生產細菌及植物來源的原料的混合物中供給氣體，一面培養該異丙醇生產大腸菌之培養步驟，以及從混合物將由前述培養生成的異丙醇分離並回收的回收步驟。
依照此方法，一面對於混合物供給氣體一面培養生產大腸菌(通氣培養)。利用該通氣培養，生產的異丙醇會釋放到混合物中，同時從混合物蒸散，其結果可輕易地從混合物分離生成的異丙醇。又，因為連續地將生成的異丙醇從混合物分離，故可抑制混合物中的異丙醇濃度上升。藉此，無需特別考慮異丙醇生產大腸菌對於異丙醇之耐性。
又，本方法中，混合物以大腸菌培養一般可使用之基本培養基為主體即可。關於培養條件，可直接適用前述事項。
回收步驟中，係將培養步驟生成、並從混合物分離的異丙醇回收。其回收方法，只要能將利用通常培養而從混合物蒸散的氣體狀或飛沫狀異丙醇收集者即可。如此的方法，例如可為容納於如一般使用的密閉容器等收集構件等，其中從僅將異丙醇以高純度回收之觀點，宜包含使得使用於捕捉異丙醇之捕捉液與從混合物分離的異丙醇接觸之步驟。
本方法中，異丙醇能以溶解於捕捉液或混合物之態樣回收。如此的回收方法，例如國際公開2009/008377號小冊記載之方法等。回收的異丙醇，可利用HPLC等通常的檢測方法確認。回收的異丙醇，可視需要進一步精製。如此的精製方法例如蒸餾。
回收的異丙醇為水溶液的狀態時，本異丙醇的生產方法，除了回收步驟以外，也可更包含脫水步驟。異丙醇之脫水，可依照常法進行。
在能以溶於捕捉液或混合物之態樣回收的異丙醇的生產方法中可應用的裝置，例如國際公開2009/008377號小冊的圖1所示之生產裝置。
該生產裝置，係於容納有含有異丙醇生產細菌與植物來源的原料的培養基的培養槽，連結用於從裝置外部注入氣體之注入管，可對於培養基通氣。
又，培養槽經由連結管而連結於容納有當做捕捉液之捕集液的捕集槽。此時，往捕集槽移動的氣體或液體與捕集液接觸而起泡。
藉此，於培養槽由於通氣培養而生成的異丙醇，因為通氣而蒸散容易從培養基分離，且同時對捕集槽補充捕集液。其結果，能以更精製的形態連續且簡便地生產異丙醇。
本發明之異丙醇之生產方法，能快速生成異丙醇，以同樣方法通常獲得之生產速度比起未適用本發明時更高。生產速度視生產方法之條件或使用之異丙醇生產大腸菌之狀態而異，但是可為0.7~2.0g/L/hr，較佳為0.9~1.9g/L/hr。又，本發明之異丙醇之生產方法中，可從葡萄糖以良好效率生成異丙醇，以同樣方法通常獲得之產率比起未適用本發明之情形更高。於培養步驟結束時的產率視生產方法之條件或使用之異丙醇生產大腸菌之狀態而異，但是可定為51~80%，較佳為51~66%。
本發明中，產率係指依據基質葡萄糖變換為代謝產物異丙醇之化學量論式的變換率。在異丙醇製造大腸菌中，由於葡萄糖1mol會生成異丙醇1mol，因此若考量葡萄糖及異丙醇之分子量(葡萄糖=180、異丙醇=60)，即便將葡萄糖180g完全變換為異丙醇，也僅會生成異丙醇60g，無法更多。其理論上最大的變換率在本發明中定為產率100%。
如上，本發明之異丙醇生產大腸菌為了能以快速、高產率生產異丙醇，例如使用本發明之大腸菌觸媒製造異丙醇時，能於培養72小時累積97g/L以上之異丙醇，可獲得遠高於習知觸媒的產量。
【實施例】
以下記載本發明之實施例，但本發明不限定於此等實施例。又，記載中的「%」若無特別指明，係指質量基準。
[實施例1] ＜[B::pntA]　大腸桿菌B株pnt基因體強化株之製作＞
將大腸桿菌B株之基因體上的pntA基因啟動子取代為GAPDH啟動子，並強化pntA基因之表現。
大腸桿菌MG1655株之基因體DNA之全部鹼基序列為公知(GenBank存取號碼U00096)，大腸桿菌之NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)α次單元的編碼基因(以下有時簡稱為pntA)的鹼基序列也已有人報告(GenBank存取號碼X04195)。又，大腸桿菌MG1655株之基因體DNA上中，已知pntA與膜轉氫酶β次單元(pntB)形成操縱子。
為了表現上述基因所必要的啟動子的鹼基序列，可使用GenBank存取號碼X02662之鹼基序列資訊中記載於397-440的大腸桿菌來源的甘油醛3-磷酸去氫酶(以下有時稱為GAPDH)之啟動子序列。為了取得GAPDH啟動子，使用大腸桿菌MG1655株之基因體DNA當成模板，利用cgctcaattgcaatgattgacacgattccg(序列編號1)、及acagaattcgctatttgttagtgaataaaagg(序列編號2)以PCR法放大，將獲得的DNA片段以限制酶MfeI及EcoRI消化，藉此獲得約100bp之編碼GAPDH啟動子之DNA片段。將獲得的DNA片段與將質體pUC19(GenBank存取號碼X02514)以限制酶EcoRI消化並經過鹼性磷解酶處理過者混合，使用接合酶結合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)轉形，得到於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長的轉形體。將獲得的菌落10個各於含安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，回收質體，淘選以限制酶EcoRI及KpnI消化時不會切出GAPDH啟動子者，再確認DNA序列，以正確插入有GAPDH啟動子者當成pUCgapP。將獲得的pUCgapP以限制酶EcoRI及HindIII消化。
再者，為了取得pntA，使用大腸桿菌MG1655株之基因體DNA當成模板，利用gcagcaattgctggtggaacatatgcgaattggcataccaag(序列編號3)、及ggacaagcttaatttttgcggaacattttcagc(序列編號4)以PCR法放大，並將獲得的DNA片段以限制酶MfeI及HindIII消化，藉此獲得約1.6kbp之pntA片段。將該DNA片段與先前經限制酶EcoRI及HindIII消化之pUCgapP混合，使用接合酶結合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)轉形，獲得於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。從得到的菌體回收質體，確認已正確插入pntA，將該質體命名為pGAPpntA。
又，大腸桿菌MG1655株可從美國典型培養物保藏中心(ATCC)取得。
如前所述，大腸桿菌MG1655株之基因體DNA為已知，pntA附近的鹼基序列也已有人報告。使用依據大腸桿菌MG1655株之pntA之5’附近區域之基因資訊製作的atggtaccgcagtaatacgctggttgc(序列編號5)與cctctagacttccatcggttttattgatgatgg(序列編號6)，以大腸桿菌MG1655株之基因體DNA當做模板進行PCR，藉此將約1.0kbp的DNA片段放大。將該DNA片段以限制酶KpnI與XbaI處理。
又，使用依據大腸桿菌MG1655株之GAPDH啟動子之序列資訊製作之ggtctagagcaatgattgacacgattccg(序列編號7)與依據大腸桿菌MG1655株之pntA之序列資訊製作之序列編號4之引子，以先前製作之表現載體pGAPpntA當做模板進行PCR，獲得由GAPDH啟動子與pntA構成的約1.7kbp的DNA片段。將該DNA片段以限制酶XbaI與HindIII處理。
將上述獲得之pntA5’附近區域之DNA片段、及由GAPDH啟動子與pntA構成之DNA片段與溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank存取號碼AB019610)[Hashimoto-Gotoh,T.,Gene,241,185-191(2000)]以KpnI與HindIII消化而獲得之DNA片段混合，使用接合酶結合後，對於DH5α株轉形，獲得於含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板於30℃生長的轉形體。將獲得的菌落於含有氯黴素10μg/ml的LB液體培養基於30℃培養一晚，並從獲得的菌體回收質體，確認已正確插入pntA5’附近區域、GAPDH啟動子、pntA。將該質體對於大腸桿菌B株(ATCC11303)轉形，於含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得的轉形體接種於含有氯黴素10μg/ml的LB液體培養基，於30℃培養一晚。將獲得的培養菌體塗佈於含有氯黴素10μg/ml的LB瓊脂平板，於42℃培養獲得菌落。將獲得的菌落於不含抗生物質之LB液體培養基於30℃培養4小時，並塗佈於不含抗生物質之LB瓊脂平板，獲得於42℃生長的菌落。
從出現的菌落當中隨機挑取100個菌落，並各使其生長於不含抗生物質之LB瓊脂平板與含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板，選擇氯黴素感受性之選殖體。再從該等選殖體之基因體DNA利用PCR放大含有GAPDH啟動子與pntA之約1.7kbp片段，淘選pntA啟動子區域取代為GAPDH啟動子之菌株，將滿足以上的選殖體命名為大腸桿菌B株pntA缺失GAPppntA基因體插入株(以下有時稱為B::pnt株)。
又，大腸桿菌B株(ATCC11303)可從為細胞‧微生物‧基因庫的美國典型培養物保藏中心取得。
[實施例2] ＜[pGAP-Iaaa/B::pnt]　導入有大腸桿菌來源之硫解酶基因、大腸桿菌來源之輔酶A轉移酶基因、梭狀芽孢桿菌屬細菌來源之乙醯乙酸去羧酶基因、梭狀芽孢桿菌屬細菌來源之異丙醇去氫酶基因表現載體之大腸桿菌B株pnt基因體強化株之製作＞
如以下，製作使NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)基因(pnt)之表現經過強化的異丙醇製造大腸菌。
藉由將WO2009/008377之實施例4記載的pGAP-Iaaa對於實施例1製作之B::pnt株轉形，獲得pGAP-Iaaa/B::pnt株。pGAP-Iaaa，係指具有將大腸桿菌來源之硫解酶基因、大腸桿菌來源之輔酶A轉移酶基因、丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌來源之乙醯乙酸去羧酶基因、及拜氏梭狀芽孢桿菌來源之異丙醇去氫酶基因使用大腸桿菌來源之甘油醛-3-磷酸去氫酶(GAPDH)之啟動子而強化表現的功能的表現載體質體。pGAP-Iaaa之製作方法，明確記載於WO2009/008377之實施例4。
[實施例3] ＜[B::atoDAB]　大腸桿菌B株atoDAB基因體強化株之製作＞
大腸菌來源之輔酶A轉移酶基因(atoD及atoA)與硫解酶基因(atoB)，由於係以atoD、atoA、atoB的順序在大腸菌基因體上形成操縱子(Journal of Baceteriology Vol.169 pp 42-52 Lauren Sallus Jenkins等人)，因此藉由改變atoD之啟動子，可同時控制輔酶A轉移酶基因與硫解酶基因之表現。所以，將寄主大腸菌之基因體上之atoD基因之啟動子取代為GAPDH啟動子，並製作基因體上之atoD、atoA及atoB基因之表現經強化之大腸菌。
大腸桿菌MG1655株之基因體DNA之全部鹼基序列為公知(GenBank存取號碼U00096)，大腸桿菌MG1655株之輔酶A轉移酶α次單元的編碼基因(以下有時簡稱atoD)的鹼基序列也已有人報告。亦即，atoD記載於GenBank存取號碼U00096之大腸桿菌MG1655株基因體序列的2321469~2322131。
為了表現上述之基因而必要的啟動子之鹼基序列，可使用在GenBank存取號碼X02662的鹼基序列資訊中記載於397-440的大腸桿菌來源之甘油醛3-磷酸去氫酶(GAPDH)之啟動子序列。為了取得GAPDH啟動子，使用大腸桿菌MG1655株之基因體DNA當做模板，利用cgctcaattgcaatgattgacacgattccg(序列編號1)、及acagaattcgctatttgttagtgaataaaagg(序列編號2)以PCR法放大，並將獲得的DNA片段以限制酶MfeI及EcoRI消化，藉此獲得約100bp之編碼GAPDH啟動子之DNA片段。將獲得的DNA片段與將質體pUC19(GenBank存取號碼X02514)以限制酶EcoRI消化再經鹼性磷解酶處理過者混合，使用接合酶結合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)轉形，獲得於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長的轉形體。將獲得的菌落10個各於含有安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚並回收質體，淘選於以限制酶EcoRI及KpnI消化時未切出GAPDH啟動子者，再確認DNA序列，以正確插入有GAPDH啟動子者當做pUCgapP。將獲得的pUCgapP以限制酶EcoRI及KpnI消化。
又，為了取得atoD，以大腸桿菌MG1655株之基因體DNA當做模板，利用cgaattcgctggtggaacatatgaaaacaaaattgatgacattacaagac(序列編號8)、及gcggtaccttatttgctctcctgtgaaacg(序列編號9)以PCR法放大，並將獲得的DNA片段以限制酶EcoRI及KpnI消化，藉此獲得約690bp之atoD片段。將該DNA片段與先前經以限制酶EcoRI及KpnI消化之pUCgapP混合，使用接合酶結合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)轉形，獲得於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。從獲得之菌體回收質體，確認已正確插入atoD，將該質體命名為pGAPatoD。
又，大腸桿菌MG1655株可從美國典型培養物保藏中心取得。
如上述，大腸桿菌MG1655株之基因體DNA中的atoD的鹼基序列也已有人報告。使用依據大腸桿菌MG1655株之atoD之5’附近區域之基因資訊製作的gctctagatgctgaaatccactagtcttgtc(序列編號10)與tactgcagcgttccagcaccttatcaacc(序列編號11)，以大腸桿菌MG1655株之基因體DNA當做模板進行PCR，藉此將約1.1kbp之DNA片段放大。
再者，使用依據大腸桿菌MG1655株之GAPDH啟動子之序列資訊製作之ggtctagagcaatgattgacacgattccg(序列編號12)與依據大腸桿菌MG1655株之atoD之序列資訊製作之序列編號9之引子，以先前製作的表現載體pGAPatoD當做模板進行PCR，獲得由GAPDH啟動子與atoD構成的約790bp的DNA片段。
將上述獲得之片段各以限制酶PstI與XbaI、XbaI與KpnI消化，並將該片段與將溫度感受性質體pTH18cS1(GenBank存取號碼AB019610)[Hashimoto-Gotoh,T.,Gene,241,185-191(2000)]以PstI與KpnI消化而得之片段混合，使用接合酶結合後，對於DH5α株轉形，獲得於含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板於30℃生長的轉形體。將獲得的菌落於含氯黴素10μg/ml之LB液體培養基於30℃培養一晚，並從獲得之菌體回收質體。將該質體對於大腸桿菌B株(ATCC11303)轉形，於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得之轉形體接種於含氯黴素10μg/ml之LB液體培養基，於30℃培養一晚。將獲得的培養菌體塗佈於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板，並於42℃培養獲得菌落。將獲得的菌落於不含抗生物質之LB液體培養基於30℃培養2小時，塗佈於不含抗生物質之LB瓊脂平板，獲得於42℃生長的菌落。
從出現的菌落當中隨機挑取100個菌落，分別使其生長於不含抗生物質之LB瓊脂平板與含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板，選取氯黴素感受性之選殖體。再從該等選殖體的染色體DNA利用PCR放大含GAPDH啟動子與atoD之約790bp之片段，淘選atoD啟動子區域取代為GAPDH啟動子之菌株，將滿足以上之選殖體命名為大腸桿菌B株atoD缺失GAPpatoD基因體插入株(以下有時稱為B：：atoDAB株)。
[實施例4] <[pGAP-Ia]梭狀芽孢桿菌屬細菌來源之乙醯乙酸去羧酶基因、梭狀芽孢桿菌屬細菌來源之異丙醇去氫酶基因表現載體之構建>
為了取得異丙醇去氫酶基因(IPAdh)，使用拜氏梭狀芽孢桿菌(Clostridium beijerinckii)NRRLB-593之基因體DNA當做模板，利用aatatgcatgctggtggaacatatgaaaggttttgcaatgctagg(序列編號13)、及gcggatccctcgagttataatataactactgctttaattaagtc(序列編號14)以PCR法放大，並將獲得的DNA片段以限制酶SphI、BamHI消化，獲得約1.1kbp之異丙醇去氫酶片段。將獲得的DNA片段與將pBRgapP(記載於WO2009/008377之實施例4)以限制酶SphI及BamHI消化獲得的片段混合，使用接合酶結合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)轉形，獲得於含有安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長的轉形體。將獲得的菌落於含安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，並從 獲得菌體回收質體，確認已正確插入IPAdh，將該質體命名為pGAP-IPAdh。
為了取得乙醯乙酸去羧酶基因(adc)，使用丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824之基因體DNA當做模板以PCR法放大，將獲得的DNA片段以限制酶消化，藉此獲得約700bp之乙醯乙酸去羧酶片段。將獲得之DNA片段與先前製作之質體pGAP-IPAdh以限制酶消化所獲得之片段混合，使用接合酶結合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)轉形，獲得於含安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長的轉形體。將獲得的菌落於含安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從獲得的菌體回收質體，確認已正確插入adc，將該質體命名為pGAP-Ia。
又，拜氏梭狀芽孢桿菌(Clostridium beijerinckii)NRRL B-593可從為細胞．微生物庫之VTT培養物收集中心取得。
[實施例5] <[pGAP-Ia-gapP-atoB]梭狀芽孢桿菌屬細菌來源之乙醯乙酸去羧酶基因、梭狀芽孢桿菌屬細菌來源之異丙醇去氫酶基因及大腸桿菌來源之硫解酶基因表現載體之構建>
大腸桿菌B株之基因體DNA之全部鹼基序列為公知(GenBa nk存取號碼CP000819)、大腸桿菌之硫解酶(乙醯基輔酶AC-乙醯基轉移酶)之編碼基因(atoB)的鹼基序列也已有人報告(GenBank存取號碼U08465)。為了選殖atoB(1,185bp)，合成2種寡核苷酸引子。
大腸桿菌B株(ATCC11303)之基因體DNA使用QIAGEN公司製DNeasy Tissue kit製備，以獲得之基因體DNA當做模板，進行PCR，藉此放大約1.2kb之DNA片段(以下有時稱為atoB片段)。將該atoB片段以瓊脂電泳分離、回收，並以限制酶消化。將該消化片段與前述pBRgapP之限制酶消化物混合，以T4DNA接合酶反應後，對於大腸桿菌DH5α勝任細胞(東洋紡社製)轉形，獲得於含安皮西林50μg/ml之LB瓊脂平板於37℃生長的轉形體。將獲 得之菌落於含安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從獲得之菌體回收質體，確認已正確插入atoB，將該質體命名為pGAP-atoB。將獲得之質體pGAP-atoB以限制酶消化，將含GAPDH啟動子與atoB之片段以瓊脂電泳分離、回收，以該片段當做gapP-atoB。將該片段gapP-atoB與將於實施例4製作之質體pGAP-Ia以限制酶消化所獲得之片段混合，使用接合酶結合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)轉形，獲得於含安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長之轉形體。將獲得之菌落於含安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，並從獲得之菌體回收質體，確認已正確插入gapP-atoB，將該質體命名為pGAP-Ia-gapP-atoB。
[實施例6] <[pGAP-Ia-gapP-atoB/B：：atoDAB株]導入有pGAP-Ia-gapP-atoB之大腸桿菌B株atoDAB基因體強化株之製作>
將上述實施例5記載之pGAP-Ia-gapP-atoB對於在實施例3製作之B：：atoDAB株轉形，獲得於質體與基因體兩者強化硫解酶基因(atoB)之表現的丙醇製造大腸菌pGAP-Ia-gapP-atoB/B：：atoDAB株。
[實施例7] <[pGAP-Ia-maeB]梭狀芽孢桿菌屬細菌來源之乙醯乙酸去羧酶基因、梭狀芽孢桿菌屬細菌來源之異丙醇去氫酶基因及大腸桿菌來源之蘋果酸去氫酶基因表現載體之構建>
為了取得蘋果酸去氫酶基因，使用大腸桿菌B株(ATCC11303)之基因體DNA當做模板，以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶消化，藉此獲得約2300bp之蘋果酸去氫酶片段。將獲得之DNA片段與將實施例4製作之質體pGAP-Ia以限制酶消化所獲得之片段混合，使用接合酶結合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)轉形，獲得於含安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長的轉形體。將獲得之菌落於含安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從得到的菌體回收質體， 確認已正確插入蘋果酸去氫酶基因，將該質體命名為pGAP-Ia-maeB。
[實施例8] <[pGAP-Ia-maeB/B：：atoDAB株]導入有pGAP-Ia-maeB之大腸桿菌B株atoDAB基因體強化株之製作>
將上述實施例7記載之pGAP-Ia-maeB對於於實施例3製作之B：：atoDAB株轉形，獲得蘋果酸去氫酶基因(maeB)之表現經強化之異丙醇製造大腸菌pGAP-Ia-maeB/B：：atoDAB株。
[實施例9] <[pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB]梭狀芽孢桿菌屬細菌來源之乙醯乙酸去羧酶基因、梭狀芽孢桿菌屬細菌來源之異丙醇去氫酶基因、大腸桿菌來源之蘋果酸去氫酶基因及大腸桿菌來源之硫解酶基因表現載體之構建>
將上述實施例7製作之質體pGAP-Ia-maeB以限制酶消化所獲得之片段，和與實施例5以同樣方式獲得之DNA片段gapP-atoB混合，使用接合酶結合後，對於大腸桿菌DH5α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)轉形，獲得於含安皮西林50μg/mL之LB瓊脂平板生長的轉形體。將獲得之菌落於含安皮西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，並從獲得之菌體回收質體，確認已正確插入gapP-atoB，將該質體命名為pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB。
[實施例10] <[pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B：：atoDAB株]導入有pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB之大腸桿菌B株atoDAB基因體強化株之製作>
將上述實施例9記載之pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB，對於實施例3製作之B：：atoDAB株轉形，獲得蘋果酸去氫酶基因(maeB)與硫解酶基因(atoB)兩者的表現經強化的異丙醇製造大腸菌pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B：：atoDAB株。
[實施例11] <[B：：atoDAB：：pnt]大腸桿菌B株atoDAB及pnt基因體強化株之製作>
將與實施例1以同樣方式獲得之pntA5’附近區域之DNA片段與由GAPDH啟動子及pntA構成的DNA片段導入於溫度感受性質體pTH18cs1而成的質體，對於實施例3製作的B：：atoDAB株轉形，於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得之轉形體接種於含氯黴素10μg/ml之LB液體培養基，於30℃培養一晚。將獲得之培養菌體塗佈於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板，於42℃培養獲得菌落。將獲得之菌落於不含抗生物質之LB液體培養基於30℃培養2小時，並塗佈於不含抗生物質之LB瓊脂平板，獲得於42℃生長的菌落。
從出現的菌落當中隨機挑取100個菌落，各使生長於不含抗生物質之LB瓊脂平板與含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂平板，選取氯黴素感受性之選殖體。再從此等選殖體之染色體DNA利用PCR將含GAPDH啟動子與pntA之約1.7kbp之片段放大，淘選pntA啟動子區域取代為GAPDH啟動子之菌株，將滿足以上之選殖體命名為大腸桿菌B株atoD缺失GAPpatoDGAPppntA基因體插入株(以下有時簡稱為B：：atoDAB：：pnt株)。
[實施例12] <[pGAP-Ia-maeB/B：：atoDAB：：pnt]導入有pGAP-Ia-maeB之大腸桿菌B株atoDAB及pnt強化株之製作>
將實施例7記載之pGAP-Ia-maeB對於實施例11製作之B：：atoDAB：：pnt株轉形，獲得蘋果酸去氫酶基因(maeB)與NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)基因(pnt)兩者的表現經強化的異丙醇製造大腸菌pGAP-Ia-maeB/B：：atoDAB：：pnt。
[實施例13] <[pGAP-Ia-gapP-atoB/B：：atoDAB：：pnt]導入有pGAP-Ia-gapP-atoB之大腸桿菌B株atoDAB及pnt強化株之製作>
將實施例5記載之pGAP-Ia-gapP-atoB對於實施例11製作之B：：atoDAB：：pnt株轉形，使硫解酶基因(atoB)之表現於質體及基因體兩者強化，並獲得NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)基因(pnt)之表現經強化之異丙醇製造大腸菌pGAP-Ia-gapP-atoB/B：：atoDAB：：pnt。
[實施例14] <[pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B：：atoDAB：：pnt株]導入有pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB之大腸桿菌B株atoDAB及pntA基因體強化株之製作>
將上述實施例9記載之pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB對於實施例11製作之B：：atoDAB：：pnt株轉形，將蘋果酸去氫酶基因(maeB)與NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)基因(pnt)之表現強化，並且獲得硫解酶基因(atoB)的表現於質體及基因體兩者經強化之異丙醇製造大腸菌pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B：：atoDAB：：pnt株。
[評價實驗1] <利用[pGAP-Iaaa/B株][pGAP-Iaaa/B：：pntA株][pGAP-Ia-gapP-atoB/B：：atoDAB株][pGAP-Ia-maeB/B：：atoDAB株][pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B：：atoDAB株][pGAP-Ia-maeB/B：：atoDAB：：pnt][pGAP-Ia-gapP-atoB/B：：atoDAB：：pnt][pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B：：atoDAB：：pnt株]生產異丙醇>
本評價實驗係使用WO2009/008377號小冊圖1所示之生產裝置生產異丙醇。培養槽使用3公升容量者，捕集槽使用10L容量者。培養槽、捕集槽、注入管、連結管、排出管，均為玻璃製品。捕集槽中注入有當做捕集液之水(捕集水)9L。又，於培養槽設置廢液管，利用糖或中和劑的流加，將增量的培養液適當排出到培養槽外。
將WO2009/008377號小冊記載之pGAP-Iaaa/B株、上述實施例2製作之pGAP-Iaaa/B：：pnt株、實施例6製作之pGAP-Ia-gapP-atoB/B：：atoDAB株、實施例8製作之pGAP-Ia-maeB/B：：atoDAB株、實施例10製作之pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B：：atoDAB株、實施例12製作之pGAP-Ia-maeB/B：：atoDAB：：pnt株、實施例13製作之pGAP-Ia-gapP-atoB/B：：atoDAB：：pnt株、及實施例14製作之pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B：：atoDAB：：pnt株，接菌於裝有含安皮西林50μg/mL之LB Broth,Miller培養液(Difc0244620)100mL的500mL容量的三角燒瓶當做前培養，於培養溫度30℃、120rpm，一 面攪拌一面進行前培養一晚。
又，WO2009/008377號小冊記載之pGAP-Iaaa/B株，為了生產異丙醇僅賦予硫解酶活性，未達成蘋果酸去氫酶活性及NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)活性兩者之強化，因此不該當本發明之異丙醇生產大腸菌。
將獲得之前培養物45mL移到裝有以下所示組成之培養基855g的3L容量的培養槽(ABLE公司製培養裝置BMS-PI)並培養。培養係於大氣壓下、通氣量0.9L/min、攪拌速度550rpm、培養溫度30℃、pH7.0(以NH3 水溶液調整)進行。從培養開始起至8小時後的期間，以7.5g/L/小時的流速添加45wt/wt%的葡萄糖水溶液。之後以20g/L/小時的流速添加45wt/wt%的葡萄糖水溶液。從培養開始至72小時為止分數次取樣菌體培養液，並利用離心操作除去菌體後，以HPLC依照定法測定獲得的培養上清中及捕集水中的異丙醇累積量。又，測定值係培養後之培養液與捕集水(9L)中之合計值。結果如圖1及表1所示。又，生產速度、產率及異丙醇累積量整理表示於表2。
又，表1中的數值代表g/L，圖1中的符號如下：黑圓：pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B：：atoDAB：：pnt株、黑四角：pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B：：atoDAB株白圓：pGAP-Ia-maeB/B：：atoDAB株、白三角：pGAP-Ia-gapP-atoB/B：：atoDAB株、白四角：pGAP-Iaaa/B：：pnt株、×：pGAP-Iaaa/B株、白菱形：pGAP-Ia-maeB/B：：atoDAB：：pnt株、黑菱形：pGAP-Ia-gapP-atoB/B：：atoDAB：：pnt株。
<培養基組成>
玉米浸液(日本食品化工製)：20g/L
Fe2 SO4 ．7H2 O：0.1g/L
K2 HPO4 ：2g/L
KH2 PO4 ：2g/L
MgSO4 ．7H2 O：2g/L
(NH4 )2 SO4：2g/L
Adekanol LG126(旭電化工業)0.1g/L
(殘量：水)
由此等結果顯示，對於習知之異丙醇製造大腸菌(pGAP-Iaaa/B株)，僅NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)基因(pnt)之表現經強化而成之菌株(pGAP-Iaaa/B：：pntA株)、僅賦予利用硫解酶基因(atoB)之表現強化及基因體強化之兩者經強化而成之菌株(pGAP-Ia-gapP-atoB/B：：atoDAB株)、僅有蘋果酸去氫酶基因(maeB)之表現經強化而成之菌株(pGAP-Ia-maeB/B：：atoDAB株)，均比起習知的異丙醇生產大腸菌顯示更高生產性，累積量各為約1.7倍、約2.0倍、及約2.1倍。又，僅有蘋果酸去氫酶基因(maeB)之表現經強化之菌株(pGAP-Ia-maeB/B：：atoDAB株)中，丙酮、甲酸、乙酸等副產物減少。
又，atoB及maeB兩者經強化時(pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B：： atoDAB株)、maeB及pnt之兩者之表現經強化時(pGAP-Ia-maeB/B：：atoDAB：：pnt)、atoB及pnt經強化時(pGAP-Ia-gapP-atoB/B：：atoDAB：：pnt)、atoB及maeB及pnt3種全部的酵素基因的表現經強化時，異丙醇生產性更提高，累積量各成為約2.4倍、約2.3倍、約2.4倍、及約2.8倍。尤其可知：NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)(pnt)、硫解酶基因(atoB)及蘋果酸去氫酶基因(maeB)之表現同時經強化時，比起pGAP-Iaaa/B株生產速度驚人地提高成3.2倍、產率為2.1倍、累積量為2.8倍。
於2010年3月9日提申的日本專利申請案第2010-052249號之揭示其全體納入本說明書當做參照。
本說明書記載之所有文獻、專利申請案及技術規格，與各個文獻、專利申請案及技術規格納入當做參考時，與具體的各別記載時為同程度納入並援用於本說明書中。
圖1顯示本發明之評價實驗1中的各種IPA生產大腸菌之IPA生產能力比較圖。
<110> Mitsui Chemicals,Inc.
<120> Isopropyl alcohol-producing bacterium with high productivity
<130> MT-F03090-00
<150> JP2010-052249
<151> 2010-03-09
<160> 20
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
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<212> DNA
<213> Artificial
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<223> primer
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Claims (12)

  1. 一種異丙醇生產大腸菌，係具備異丙醇生產系，其具有選自於由以下構成的群組當中至少1種的強化酵素活性：經強化的蘋果酸去氫酶活性、經強化的NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)活性。
  2. 如申請專利範圍第1項之異丙醇生產大腸菌，其中該強化酵素活性包含該經強化的蘋果酸去氫酶活性。
  3. 如申請專利範圍第1項之異丙醇生產大腸菌，其中該強化酵素活性包含該經強化的蘋果酸去氫酶活性及經強化的硫解酶活性。
  4. 如申請專利範圍第1項之異丙醇生產大腸菌，其中該強化酵素活性包含該經強化的蘋果酸去氫酶活性及該經強化的NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)活性。
  5. 如申請專利範圍第1項之異丙醇生產大腸菌，其中該強化酵素活性為該經強化的蘋果酸去氫酶活性及該經強化的NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)活性及經強化的硫解酶活性。
  6. 如申請專利範圍第1項之異丙醇生產大腸菌，其中該強化酵素活性係來自於利用從菌體外將酵素基因導入而成的強化及利用菌體內酵素基因表現增強所為之強化至少一種。
  7. 如申請專利範圍第1項之異丙醇生產大腸菌，其中該強化酵素活性係來自於寄主大腸菌之基因體上所為之強化及質體導入所為之強化至少其中之一。
  8. 如申請專利範圍第1項之異丙醇生產大腸菌，其中該強化酵素活性係來自於艾氏菌屬(Escherichia)細菌來源之各酵素的編碼基因。
  9. 如申請專利範圍第1項之異丙醇生產大腸菌，其中該異丙醇生產系係利用乙醯乙酸去羧酶、異丙醇去氫酶、輔酶A轉移酶及硫解酶之各酵素基因所構建者。
  10. 如申請專利範圍第1項之異丙醇生產大腸菌，其中該異丙醇生產系係藉由乙醯乙酸去羧酶、異丙醇去氫酶、輔酶A轉移酶 及硫解酶之各酵素基因而構建者，且該各酵素基因係各自獨立地選自於由梭狀芽孢桿菌屬細菌、芽孢桿菌屬細菌及艾氏菌屬細菌構成的群組當中至少1種原核生物。
  11. 如申請專利範圍第10項之異丙醇生產大腸菌，其中該乙醯乙酸去羧酶活性係來自於丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌來源之酵素的編碼基因，該異丙醇去氫酶活性係來自於拜氏梭狀芽孢桿菌來源之酵素之編碼基因，該輔酶A轉移酶活性、硫解酶活性、蘋果酸去氫酶活性及NAD(P)+ 轉氫酶(AB專一性)活性係來自於大腸桿菌來源之各酵素之編碼基因者。
  12. 一種異丙醇生產方法，包含使用如申請專利範圍第1項之異丙醇生產大腸菌從植物來源的原料生產異丙醇。
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