RU2294370C2 - Способ получения спирта с использованием микроорганизма - Google Patents
Способ получения спирта с использованием микроорганизма Download PDFInfo
- Publication number
- RU2294370C2 RU2294370C2 RU2004110229/13A RU2004110229A RU2294370C2 RU 2294370 C2 RU2294370 C2 RU 2294370C2 RU 2004110229/13 A RU2004110229/13 A RU 2004110229/13A RU 2004110229 A RU2004110229 A RU 2004110229A RU 2294370 C2 RU2294370 C2 RU 2294370C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- methane
- microorganism
- methanol
- smmo
- alcohol
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title abstract description 46
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 38
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 120
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 13
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 52
- 241000589346 Methylococcus capsulatus Species 0.000 claims description 18
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 6
- 101710096763 Methane monooxygenase component A alpha chain Proteins 0.000 claims description 3
- 101710111912 Methane monooxygenase component A beta chain Proteins 0.000 claims description 3
- 101710166008 Methane monooxygenase component A gamma chain Proteins 0.000 claims description 3
- 101710162120 Methane monooxygenase component C Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 4
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 39
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 14
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 10
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 102100039702 Alcohol dehydrogenase class-3 Human genes 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LVZWSLJZHVFIQJ-UHFFFAOYSA-N Cyclopropane Chemical compound C1CC1 LVZWSLJZHVFIQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010048916 alcohol dehydrogenase (acceptor) Proteins 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 4
- 108010051015 glutathione-independent formaldehyde dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- JORABGDXCIBAFL-UHFFFAOYSA-M iodonitrotetrazolium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C=CC=CC=2)=N1 JORABGDXCIBAFL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- -1 methanol Chemical compound 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241001037822 Bacillus bacterium Species 0.000 description 2
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241001003008 Methylococcus capsulatus str. Bath Species 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 150000004696 coordination complex Chemical class 0.000 description 1
- 241000186254 coryneform bacterium Species 0.000 description 1
- 150000001924 cycloalkanes Chemical class 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000007792 gaseous phase Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 101150063217 mmoB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150006494 mmoC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150004571 mmoX gene Proteins 0.000 description 1
- 101150066671 mmoY gene Proteins 0.000 description 1
- 101150009934 mmoZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002407 reforming Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
- C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения метанола. Данный способ включает культивирование рекомбинанта E.coli при температуре 20-30°С, а полученную культуру, клетки, выделенные из этой культуры, или обработанный продукт этих клеток оставляют с метаном для продукции метанола. При этом указанный рекомбинант приобрел способность превращать метан в спирт вследствие трансформации ДНК, кодирующей метаноксигеназу растворимого типа. Согласно данному изобретению экспрессируются все компоненты метаноксигеназы, что позволяет осуществить способ получения метанола в более мягких условиях. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к способу получения спирта, такого как метанол, с использованием микроорганизма. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу превращения алкана в спирт при чрезвычайно мягких условиях биохимического окисления с использованием микроорганизма.
Уровень техники
Используемый в настоящее время способ получения метанола включает в себя «стадию получения синтез-газа» для реформинга метана в качестве сырья в смешанный газ моноксида углерода и водорода, и «стадию синтеза метанола» для реакции синтез-газа в присутствии катализатора для превращения этого газа в метанол. Стадию получения синтез-газа и стадию синтеза метанола проводят при высокой температуре и при высоком давлении, а именно, стадию получения синтез-газа проводят при 850-880°С, а стадию синтеза метанола проводят при 50-100 атм. Таким образом, желательным является способ синтеза метанола, который может проводиться при более мягких условиях. Хотя недавно был описан способ синтеза метанола из метана с высоким выходом с использованием сравнительно термостабильного катализатора типа комплекса металла (Science, vol. 280, 24, 560-563, April, 1998), этот способ все-таки требует температуры 100°С или выше.
Между тем, если используют фермент монооксигеназу (далее упоминаемую в виде аббревиатуры "ММО"), утилизирующей метан бактерии, метанол может быть синтезирован непосредственно из метана при обычной температуре и обычном давлении. Известно, что имеется ММО растворимого типа и ММО мембраносвязанного типа. Фермент ММО растворимого типа является комплексным белком, состоящим из трех компонентов: гидроксилазы, Компонента В и редуктазы (Компонента С). Реакцию окисления проводят гидроксилазой среди этих компонентов, и сообщалось, что, если эта гидроксилаза является химически восстановленной, вместо использования редуктазы, эта реакция окисления может катализироваться только гидроксилазой (J. Biol. Chem., 264(17) 10023-10033, 1989). Эту гидроксилазу называют также Компонентом А, и она состоит из трех типов белковых субъединиц, α, β и γ.
В патенте США № 5190870 описан ферментативный способ получения спирта с использованием гидроксилазы, очищенной из утилизирующей метан бактерии. Однако способ очистки этой гидроксилазы является сложным, и уменьшение активности этого фермента является значительным после его выделения, что приводит к нестабильной активности этого фермента. Кроме того, хотя в патенте США № 5192672 описан способ стабилизации активности гидроксилазы после очистки, фундаментальная проблема этого сложного способа очистки все еще остается нерешенной.
Кроме того, известен также способ микробиологического получения метанола с использованием утилизирующей метан бактерии. Однако клетки, содержащие ММО, содержат также метанолдегидрогеназу и т.д. и, следовательно, существует проблема, что метанол, производимый окислением метана, немедленно окисляется и посредством этого превращается в формальдегид, т.е. метанол метаболизируется в этих клетках. В патенте Японии Japanese Patent Laid-open (KOKAI) № 3-43090 описывает способ селективного ингибирования метанолдегидрогеназы циклопропаном. Однако этот способ является чрезвычайно сложным, т.е. он включает в себя замену циклопропаном воздушной фазы в суспензии клеток, содержащих ММО, и затем удаление циклопропана гелием и т.д., и этот способ страдает также от проблемы, заключающейся в том, что метанолдегидрогеназа может не инактивироваться в достаточной степени циклопропаном.
В Journal of General Microbiology (1992), 138, 1301-1307 описано, что активность ММО могла бы успешно экспрессироваться экспрессией Компонента В и редуктазы ММО растворимого типа, происходящей из Methylococcus capsulatus (Bath), в Escherichia coli и смешиванием их с природной гидроксилазой. Кроме того, в Arch. Microbiol. (1999) 171:364-370, сообщается, что активность ММО могла бы успешно экспрессироваться введением гена ММО растворимого типа в утилизирующую метан бактерию, имеющую только ММО мембраносвязанного типа. Однако, нет примера экспрессии активностей всех компонентов ММО в микроорганизме, который не утилизирует метан или метанол, и, следовательно, желательной является экспрессия этого сложного комплекса ферментов в гетерогенном организме.
Описание изобретения
Целью настоящего изобретения является экспрессия всех компонентов ММО растворимого типа (далее называемой также сокращенно "sMMO") в микроорганизме, который не утилизирует метан и метанол, и посредством этого продукция активного фермента sMMO и обеспечение способа получения спирта из алкана с использованием такого микроорганизма.
Авторы настоящего изобретения, поначалу ставили целью ввести кластер генов, кодирующий ММО растворимого типа, в микроорганизм, не имеющий какого-либо фермента, окисляющего метанол, такого как метанолдегидрогеназа, т.е. в микроорганизм, который не утилизирует метан или метанол, для конструирования микроорганизма, который экспрессирует этот кластер генов в виде активных белков, и тем самым обеспечить способ получения метанола из метана с использованием этого микроорганизма. Однако sMMO является комплексным белком, состоящим из 5 субъединиц, и, следовательно, нелегко экспрессировать его в активной форме, в частности, в гетерогенном микроорганизме. Таким образом, авторы изобретения провели широкое исследование на типах плазмид и промоторов, используемых для плазмиды, предназначенной для экспрессии ММО растворимого типа, и условий культивирования. В результате авторам изобретения удалось экспрессировать sMMO в клетках гетерогенного микроорганизма с сохранением активности этого фермента. Кроме того, авторам изобретения удалось также получить метанол из метана с использованием полученного микроорганизма и, следовательно, осуществить настоящее изобретение.
Настоящее изобретение обеспечивает следующее.
(1) Способ получения спирта, предусматривающий культивирование рекомбинанта микроорганизма, которому несвойственна способность утилизировать алкан и спирт, образующийся окислением этого алкана, причем указанный рекомбинант приобрел способность превращения алкана в спирт вследствие трансформации ДНК, кодирующей метаноксигеназу, и оставление полученной культуры, клеток, выделенных из этой культуры, или обработанного продукта этих клеток с алканом для продукции спирта.
(2) Способ получения спирта по пункту (1), где указанная метаноксигеназа является метаноксигеназой растворимого типа.
(3) Способ получения спирта по пункту (2), где указанная метаноксигеназа состоит из метангидроксилазы, Компонента В и редуктазы.
(4) Способ получения спирта по любому из пунктов (1)-(3), где указанная ДНК, кодирующая метаноксигеназу, является геном метаноксигеназы растворимого типа Methylococcus capsulatus.
(5) Способ получения спирта по любому из пунктов (1)-(4), где указанным микроорганизмом является бактерия Escherichia, коринеформная бактерия или бактерия Bacillus.
(6) Способ получения спирта по пункту (5), где указанный микроорганизм является бактерией Escherichia.
(7) Способ получения спирта по пункту (6), где указанный микроорганизм культивируют при 20-30°С.
(8) Способ получения спирта по любому из пунктов (1)-(7), где указанный алкан является алканом, имеющим 1-8 атомов углерода, а спирт является спиртом, который образуется окислением этого алкана.
(9) Способ получения спирта по пункту (8), где указанный алкан является метаном, а указанный спирт является метанолом.
ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ
Далее настоящее изобретение будет объяснено подробно.
Микроорганизм, используемый в настоящем изобретении, является микроорганизмом, которому несвойственна способность утилизировать алкан и спирт, образующийся окислением этого алкана, но этот микроорганизм приобрел способность превращения алкана в спирт вследствие трансформации его ДНК, кодирующей sMMO. Что касается свойства, заключающегося в том, что используемый в настоящем изобретении микроорганизм не утилизирует спирт, оно является несущественным, превращает ли этот микроорганизм алкан в спирт или не превращает, тогда как предпочтительным для накопления продуцируемого спирта является то, что данный микроорганизм не должен утилизировать спирт.
Микроорганизм, который не имеет природной способности утилизировать алкан и спирт, который образуется окислением этого алкана, не ограничивается особо, пока он является микроорганизмом, который может приобретать способность превращения алкана в спирт. Характерные примеры включают в себя бактерии Escherichia, такие как Escherichia coli, коринеформные бактерии, такие как Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum), и бактерии Bacillus, такие как Bacillus subtilis, и т.д.
ДНК, кодирующая метаноксигеназу, предпочтительно является ДНК, кодирующей ММО растворимого типа (sMMO). sMMO состоит из Компонента А (метангидроксилазы), Компонента В и Компонента С (редуктазы). Компонент А состоит из субъединиц α, β и γ. Хотя эти компоненты могут вводиться в данный микроорганизм по отдельности, их предпочтительно вводят с использованием единого вектора, содержащего ДНК, кодирующую все эти компоненты. В дальнейшем описании кластер генов, кодирующий все эти компоненты sMMO, называют для удобства геном sMMO.
Ген sMMO может быть получен из хромосомной ДНК, утилизирующей метан бактерии, например, штамма Methylococcus capsulatus NCIMB 11132. Этот штамм может быть получен из BCIMB (The National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria Ltd., 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, UK).
Пример способа получения фрагмента, содержащего ген sMMO, из Methylococcus capsulatus в качестве утилизирующей метан бактерии Bacillus описан ниже. Однако такой фрагмент может быть также получен из других утилизирующих метан бактерий подобным образом.
Сначала средой для культивирования Methylococcus capsulatus может быть любая среда, в которой эта бактерия может пролиферировать в достаточной степени. Пример предпочтительной среды включает в себя среду Whittenbury et al. (J. Gen. Microbiol., 61, 205-208, 1970). Все пространство в культуральном сосуде, содержащем эту среду, заменяют смешанным газом и кислородсодержащим газом (воздухом и т.д.) и Methylococcus capsulatus инокулируют в эту среду, находящуюся в контакте с этим газом. Methylococcus capsulatus является аэробной бактерией, и культивирование проводят при 20-50°С в аэробных условиях в виде периодической культуры или непрерывной культуры.
ДНК-фрагмент, содержащий ген sMMO, может быть выделен и получен гибридизационным способом, как описано ниже, из библиотеки ДНК, полученной из хромосом штамма Methylococcus capsulatus, с использованием, например, зонда, ДНК-фрагмента, содержащего часть гена sMMO, полученного при помощи ПЦР (полимеразной цепной реакции) с применением олигонуклеотидов, приготовленных на основании известной нуклеотидной последовательности гена sMMO (GenBank Accession M90050 M32314 M58498 M58499, Stainthorpe, A.C., et al., Gene, 91 (1), 27-34, 1990, SEQ ID NO:5), в качестве праймеров и хромосомной ДНК Methylococcus capsulatus в качестве матрицы. Открытые рамки считывания, содержащиеся в гене sMMO, обозначены mmoX, mmoY, mmoB, mmoZ, OrfY и mmoC в этом порядке от 5'-конца.
Хромосомная ДНК может быть экстрагирована из культурального бульона штамма Methylococcus capsulatus NCIMB 11132 обычно используемым способом, известным per se (например, способом, описанным в Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963) и т.д.).
Библиотека ДНК может быть получена разрушением хромосомной ДНК с использованием подходящего рестрикционного фермента, такого как BamHI, лигированием полученных ДНК-фрагментов разного размера с плазмидным вектором, таким как pUC18 (производимым Takara Shuzo), и трансформацией подходящего хозяина, такого как Escherichia coli JM109, реакционной смесью лигирования.
Зонд для отбора клона, имеющего ДНК-фрагмент, содержащий ген sMMO, гибридизацией может быть получен при помощи ПЦР с использованием олигонуклеотидов, сконструированных подходящим образом на основании известной нуклеотидной последовательности гена sMMO, например, нуклеотидных последовательностей, показанных как SEQ ID NO:1 и 2, в качестве праймеров и хромосомной ДНК Methylococcus capsulatus в качестве матрицы.
Гибридизацию колоний выполняют в отношении библиотеки хромосомной ДНК штамма Methylococcus capsulatus NCIMB 11132 с использованием зонда, полученного, как описано выше. ДНК-фрагмент, содержащий ген sMMO или его часть, может быть получен экстракцией плазмидной ДНК из клона, который гибридизовался с этим частичным ДНК-фрагментом гена sMMO, используемым в качестве зонда в гибридизации, и получением инсертированного фрагмента расщеплением этой плазмидной ДНК подходящей рестриктазой.
Когда фрагмент клона, полученный, как описано выше, содержит часть гена sMMO, может быть получена другая область при помощи ПЦР-способа, способа гибридизации и т.п. Например, когда клонированный фрагмент не имеет 5'-концевой области гена sMMO, область выше от клонированного фрагмента может быть получен при помощи способа 5'-RACE (способа быстрой амплификации концов кДНК). Кроме того, область выше от гена sMMO может быть также получен при помощи ПЦР с использованием олигонуклеотидов, показанных в виде SEQ ID NO:3 и 4, в качестве праймеров и хромосомной ДНК штамма NCIMB в качестве матрицы. Полученный ДНК-фрагмент может быть лигирован с полученным ранее фрагментом гена sMMO с получением полноразмерного фермента sMMO.
Белки, не являющиеся белками дикого типа, каждый компонент или каждая субъединица sMMO могут иметь аминокислотную последовательность, которая включает в себя делецию, инсерцию или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков, если сохраняется функция каждого компонента или каждой субъединицы. Хотя число «нескольких» аминокислот, указанных здесь, отличается в зависимости от положения аминокислотных остатков в трехмерной структуре белка или типа аминокислот, оно может быть предпочтительно 2-10, более предпочтительно 2-5, наиболее предпочтительно 2-3.
ДНК, кодирующая белок или пептид, по существу идентичный описанному выше ферменту sMMO, включает в себя ДНК, которая может гибридизоваться с открытой рамкой считывания в нуклеотидной последовательности, показанной в виде SEQ ID NO:4, или зондом, который может быть получен из этой последовательности при строгих условиях и кодирует белок, который может составлять активный фермент sMMO. Вышеупомянутые "строгие условия" включают в себя условия, в которых образуется так называемый специфический гибрид, а неспецифический гибрид не образуется. Трудно выразить эти строгие условия с использованием какой-либо числовой величины. Однако, например, строгие условия включают в себя условия, в которых ДНК, имеющие высокую гомологию, например, ДНК, имеющие гомологию 50% или более, гибридизуются друг с другом, но ДНК, имеющие гомологию, более низкую, чем указанная выше, не гибридизуются друг с другом. Альтернативно, строгие условия включают в себя условия, посредством которых ДНК гибридизуются друг с другом при концентрации соли, соответствующей типичным условиям промывания гибридизации по Саузерну, т.е. 1×SSC, 0,1% ДСН, предпочтительно 0,1×SSC, 0,1% ДСН, при 60°С.
Вектор, используемый для введения гена sMMO в микроорганизм-хозяин, может быть любым вектором, автономно реплицирующимся в клетке микроорганизма-хозяина, и характерные примеры включают в себя, для Escherichia coli, плазмидные векторы pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 и т.д. Кроме того, векторы для коринеформных бактерий включают в себя рАМ330 (см. выложенную публикацию патента Японии № 58-67699), pHM1519 (см. выложенную публикацию патента Японии № 58-77895), pAJ655, pFJ611, pAJ1844 (см. выложенную публикацию патента Японии № 58-192900 в отношении этих плазмид), pCG1 (см. выложенную публикацию патента Японии № 57-134500), pCG2 (см. выложенную публикацию патента Японии № 58-35197), pCG4, pCG11 (см. выложенную публикацию патента Японии № 57-183799 в отношении этих плазмид), pHK4 (см. выложенную публикацию патента Японии № 5-7491) и т.д. Кроме того, векторы для бактерий Bacillus включают в себя pUB110, pHY300PLK, pHV1248, pE194, pC194, pBС16, pSA0501, pSA2100, pAM77, pT181, pBD6, pBD8 и pBD64, pHV14 и т.д.
Промотор гена sMMO может быть заменен подходящим промотором в зависимости от микроорганизма, в который вводят этот ген. Примеры таких промоторов включают в себя промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор PR и промотор PL фага лямбда, промотор tet, промотор amyE и т.д. Если экспрессирующий вектор, содержащий промотор, используют в качестве вектора, лигирование гена sMMO, вектора и промотора может достигаться в единой операции лигирования. Примеры таких векторов включают в себя рКК233-3, содержащий промотор tac (производимый Pharmacia), и т.д.
В качестве способа трансформации для введения вектора с включенным в него геном sMMO в рассматриваемый микроорганизм может быть использован, например, способ обработки реципиентных клеток хлоридом кальция для увеличения проницаемости этих клеток для ДНК, который был сообщен для Escherichia coli К-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) и способ получения компетентных клеток из клеток, которые находятся в фазе роста, с последующим введением в них ДНК, который был сообщен для Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)). Альтернативно может быть также использован способ превращения ДНК-реципиентных клеток в протопласты или сферопласты, которые могут легко поглощать рекомбинантную ДНК, с последующим введением рекомбинантной ДНК в ДНК-акцепторные клетки, который, как известно, применим к Bacillus subtilis, актиномицетам и дрожжам (Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978)). Способ трансформации может быть подходящим образом выбран из этих способов в зависимости от клетки, используемой в качестве хозяина. Кроме того, рекомбинантная ДНК может быть введена в реципиентную бактерию, принадлежащую к бактериям Brevibacterium или Corynebacterium, способом электропорации (Sugimoto et al., выложенный патент Японии № 2-207791) (ОР1999).
Способы получения библиотеки геномной ДНК, гибридизации, ПЦР, получения плазмидной ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации и т.д. описаны в Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989).
Штамм E. coli JM109, трансформированный экспрессирующим вектором pRSsMMOTB, был депонирован в независимом административном агентстве National Institute of Advanced Industrial Depository (postal code 305-5466, Tsukuba Central 6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) on August 2, 2001 и получил номер доступа FERM P-18446. Затем этот депозит был превращен в международный депозит согласно условиям Будапештского договора 19 августа 2002 года и получил номер доступа FERM BP-8153.
Культивированием микроорганизма, который приобрел способность превращать алкан в спирт благодаря трансформации ДНК, кодирующей ДНК, содержащую ген sMMO, и обеспечением возможности полученной культуре или клеткам, выделенным из этой культуры, существовать с алканом для продуцирования спирта может быть получен этот спирт.
Среда, используемая для культивирования микроорганизма с введенным геном sMMO, может быть подходящим образом выбрана в зависимости от используемого микроорганизма. Например, она может быть обычной средой, которая содержит источник углерода, источник азота, неорганические ионы и другие органические ингредиенты, если требуется.
В качестве источника углерода могут быть использованы сахариды, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, галактоза, фруктоза или гидролизат крахмала, спирты, такие как глицерин или сорбит, или органические кислоты, такие как фумаровая кислота, лимонная кислота или янтарная кислота.В качестве источника азота могут быть использованы неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония или фосфат аммония, органический азот, такой как гидролизат белка сои, газообразный аммиак, водный аммиак и т.д.
Желательным является добавление необходимых веществ, таких как витамин В1, дрожжевой экстракт и т.д. к среде в подходящих количествах в виде органических питательных веществ, требующихся в незначительных количествах. Кроме них фосфат калия, сульфат магния, ионы железа, ионы марганца и т.д. добавляют в небольших количествах, если требуется.
Культивирование проводят предпочтительно в аэробных условиях в течение 16-72 часов. Температуру культуры предпочтительно регулируют таким образом, чтобы она составляла 25°С-45°С, а рН предпочтительно регулируют таким образом, чтобы он был равен 5-8, во время культивирования. Для коррекции рН могут быть использованы неорганические или органические, кислотные или щелочные вещества, а также газообразный аммиак и т.д.
При применении в качестве микроорганизма-хозяина бактерии Escherichia культивирование предпочтительно проводят при 20-30°С для получения субъединиц, составляющих sMMO, в виде растворимых пептидов.
В качестве катализатора для превращения алкана в спирт, кроме клеток и культуры, содержащей клетки, может быть также использован обработанный продукт этих клеток. Обработанным продуктом клеток могут быть клетки, обработанные ацетоном, лиофилизированные клетки, бесклеточный экстракт, полученный из обработанных ацетоном или лиофилизированных клеток, или живых клеток, продукт фракционирования, такой как мембранная фракция, фракционированная из бесклеточного экстракта, и иммобилизованный продукт этих клеток, бесклеточный экстракт или продукт фракционирования. Приведением таких клеток или обработанного продукта клеток в контакт с алканом и обеспечением возможности реакции может быть получен спирт в этом реакционном растворе. Используемый микроорганизм может состоять из одного типа микроорганизма или из смеси двух или нескольких типов микроорганизмов. Если алкан не ингибирует рост данного микроорганизма, алкан может быть добавлен к среде, используемой для культивирования данного микроорганизма для одновременного проведения культивирования микроорганизма и получения спирта. В этом случае алкан может быть введен в среду добавлением в газообразную фазу, находящуюся в контакте со средой, или барботированием среды алканом. Кроме того, с использованием микроорганизма, обнаруживающего сильную восстанавливающую активность, такого как бактерии Escherichia, в качестве микроорганизма, используемого в настоящем изобретении, или добавлением НАДН к реакционной смеси, реакция, катализируемая sMMO, может быть эффективно усилена.
Алкан, к которому применяют настоящее изобретение, предпочтительно является алканом, имеющим 1-8 атомов углерода, более предпочтительно 1-6 атомов углерода, особенно предпочтительно 1-5 атомов углерода. В частности, наиболее предпочтительным является метан. Кроме того, положение атома водорода в алкане, окисляемого sMMO, особо не ограничивается, и он может быть водородом, связывающимся с концевым углеродом, или водородом, связывающимся с углеродом, с которым связаны два или более углеродов. Алкан может быть линейным, разветвленным или циклическим алканом. Алкан может иметь заместитель, такой как галоген.
Исследовали субстратную специфичность sMMO, полученного из штамма Methylococcus capsulatus Bath, и было установлено, что этот штамм способен окислять алканы, в том числе по меньшей мере от метана до октана, с образованием спирта.
Краткое объяснение чертежа
чертеж показывает калибровочные кривые, полученные построением с концентрацией метанола (мМ) на абсциссе и оптической плотности на ординате. Результаты для E. coli JM109/pRS показаны ◆, а результаты для E. coli JM109/pRSsMMOTB (AJ 13852) показаны ■.
Наилучший способ осуществления изобретения.
Далее настоящее изобретение будет объясняться более конкретно со ссылкой на следующие примеры.
<1> Получение библиотеки хромосомной ДНК, утилизирующей метан бактерии, Methylococcus capsulatus
Пространство в культуральном сосуде, содержащем среду Whittenbury et al. (J. Gen. Microbiol., 61, 205-208, 1970), заменяли смешанным газом метана и воздуха. Утилизирующую метан бактерию, штамм Methylococcus capsulatus NCIMB 11132, инокулировали в эту среду, находящуюся в контакте с газом, и культивировали в аэробных условиях в виде периодической культуры при продолжении замены газа. Хромосомную ДНК экстрагировали из клеток Methylococcus capsulatus NCIMB 11132, культивируемых, как описано выше, по способу, описанному в Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963). Хромосомные ДНК полностью расщепляли рестриктазой BamHI. Полученные ДНК-фрагменты различных размеров встраивали в плазмидный вектор pUC18 (производимый Takara Shuzo) в сайте BamHI. Escherichia coli JM109 трансформировали полученными рекомбинантными плазмидами с получением библиотеки хромосомной ДНК.
<2> Клонирование гена sMMO гибридизацией колоний
Клон, содержащий фрагмент гена sMMO, отбирали из вышеупомянутой библиотеки хромосомной ДНК гибридизацией колоний. Гибридизационный зонд получали амплификацией фрагмента гена sMMO с использованием ПЦР-способа. Нуклеотидная последовательность гена sMMO Methylococcus capsulatus сообщалась (Gene, 91, 27-34 (1990)), и олигонуклеотиды, имеющие нуклеотидные последовательности, показанные как SEQ ID NO:1 и 2, синтезировали на основе этой последовательности.
Хромосомные ДНК Methylococcus capsulatus, полученные, как описано выше, использовали в качестве матрицы, а вышеупомянутые олигонуклеотиды использовали в качестве праймеров для проведения ПЦР. Для ПЦР проводили 30 циклов, причем каждый цикл состоял из стадии денатурации (94°С, 10 секунд), стадии отжига (55°С, 30 секунд) и стадии удлинения (72°С, 1 минута и 30 секунд).
Гибридизацию колоний проводили в отношении вышеупомянутой библиотеки хромосомной ДНК с использованием частичного фрагмента гена sMMO, амплифицированного, как описано выше, в качестве зонда. Мечение этого зонда и реакцию гибридизации выполняли с использованием набора для детектирования DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Kit I (купленного из Boehringer Mannheim) в соответствии с прилагаемым протоколом.
Рекомбинантные плазмидные ДНК экстрагировали из клонов, которые показали положительные результаты в отношении гибридизации, и плазмидные ДНК расщепляли рестриктазой BamHI для подтверждения инсертированных фрагментов. В результате, кроме ДНК-фрагмента, имеющего длину приблизительно 2,3 т.п.н., соответствующий длине плазмиды PUC18, был подтвержден инсертированный ДНК-фрагмент, имеющий размер приблизительно 6 т.п.н.
Эту инсертированную ДНК расщепляли различными рестриктазами для подтверждения, что она была фрагментом, содержащим большую часть рассматриваемого гена sMMO. В результате стало ясным, что часть гена, кодирующего субъединицу α, являющуюся компонентом sMMO, была делетирована в вышеупомянутом фрагменте. Рекомбинантная плазмида, содержащая этот инсертированный ДНК-фрагмент приблизительно 6 т.п.н., была названа pUC6K.
<3> Конструирование плазмиды, содержащей полноразмерный ген sMMO
Затем с использованием ПЦР была получена область, расположенная выше гена sMMO, включающего делецию, как описано ниже. Нуклеотидные последовательности синтезированных праймеров показаны в Списке последовательностей в виде SEQ ID NO:3 и 4. Хромосомные ДНК штамма NCIMB 11132 использовали в качестве матрицы вместе с вышеупомянутыми олигонуклеотидами в качестве праймеров для проведения ПЦР. Для ПЦР проводили 30 циклов, причем каждый цикл состоял из стадии денатурации (98°С, 10 секунд), стадии отжига (60°С, 30 секунд) и стадии удлинения (72°С, 180 секунд). Полученный амплифицированный ДНК-фрагмент приблизительно 1,5 т.п.н. расщепляли рестриктазами EcoRI и BamHI и лигировали в сайте множественного клонирования pUC118. Фрагмент приблизительно 6 т.п.н., вырезанный из pUC6K с использованием BamHI, включали в сайт BamHI вышеупомянутой плазмиды с получением плазмиды pUCsMMO, содержащей ген sMMO полной длины.
<4> Конструирование экспрессионной плазмиды гена sMMO
Затем этот участок гена sMMO вырезали из вышеупомянутой плазмиды pUCsMMO с использованием рестриктаз EcoRI и HindIII и включали в экспрессионный вектор рКК233-3 с получением экспрессионной плазмиды pKKsMMO, которую конструировали таким образом, что транскрипция от промотора tac должна была продолжаться в ген sMMO.
Ген sMMO, включающий в себя область промотора tac, полученную из рКК3-233, вырезали из pKKsMMO расщеплением рестриктазами NdeI и DraI, концы затупляли, расщепляли рестриктазой PstI и затем лигировали с вектором с затупленными концами pRS, подходящим для широкого круга хозяев (описанным в Международной патентной публикации на японском языке (Kohyo) № 3-501682), с получением экспрессионнной плазмиды sMMO pRSsMMOTB.
<5> Подтверждение экспрессии sMMO
Штамм AJ13852 инокулировали в жидкую среду LB (Luria-Bertani), содержащую 20 мг/мл стрептомицина, предварительно культивировали при 25°С, затем инокулировали в таким же образом приготовленную среду в количестве 1% (об./об.) и культивировали при 25°С в качестве основной культуры. Во время выращивания основной культуры, когда достигалась оптическая плотность OD660 0,6, к среде добавляли IPTG (изопропил-β-D-тиокалактопиранозид) в конечной концентрации 1 мМ и эти клетки дополнительно культивировали в течение 2,5 часов. Клетки, полученные с использованием описанных выше условий, разрушали обработкой ультразвуком и фракционировали на растворимую фракцию и нерастворимую фракцию центрифугированием. Каждую фракцию анализировали с использованием антител, направленных на каждый из компонентов-пептидов, составляющих sMMO. В результате, было подтверждено, что все из этих субъединиц, α, β и γ и оба Компонента В и С sMMO, находились в растворимой фракции.
При выполнении всех вышеупомянутых стадий культивирования при 37°С субъединица α полностью образовывала тела включения и не существовала в растворимой фракции. Кроме того, большая часть субъединиц β и γ также были нерастворимыми. Кроме того, при проведении культивирования при 30°С, количество субъединицы α, находящееся в растворимой фракции, становилось меньше в сравнении со случаем, когда культивирование проводили при 25°С.
<6> Получение метанола из метана
Штамм AJ13852 культивировали таким же образом, как описано выше, с использованием 100 мл среды (температура была 25°С) и клетки собирали и затем промывали 50 мМ калийфосфатным буфером (рН 7,0). Затем эти клетки суспендировали в том же самом буфере (рН 7,0) и бесклеточный экстракт получали обработкой ультразвуком. Концентрацию общего белка бесклеточного экстракта доводили до 15 мг/мл. В объеме 1 мл вышеупомянутый бесклеточный экстракт вводили в герметизируемый алюминием флакон с объемом 5 мл, смешивали с НАДН (восстановленным никотинамидадениндинуклеотидом) до конечной концентрации 1 мМ и герметизировали. Затем 5 мл (объем под давлением) метана вводили в этот флакон и давали происходить реакции. Реакции давали происходить при 37°С в течение 60 минут при встряхивании. Кроме того, штамм AJ13852 и E. coli JM109/pRS, в которые был введен только вектор pRS, также культивировали таким же образом, как описано выше, за исключением того, что не вводили метан.
Концентрацию метанола определяли количественно с использованием системы для количественного определения, имеющей три стадии ферментативных реакций. Составы реакционных смесей показаны в таблице 1. Сначала брали 600 мкл реакционной смеси после вышеупомянутой реакции образования метанола, смешивали с 50 мкл 5 н. гидроксида калия, перемешивали в течение достаточного времени и оставляли на 5 минут. Затем реакционную смесь смешивали с 50 мкл 5 М хлорида натрия и доводили до рН 7,5 1 М калийфосфатным буфером. После этого каждую реакционную смесь использовали для следующей ферментативной реакции, после того как денатурированные белки удаляли центрифугированием.
| Таблица 1 | |
| Калибровочная кривая | |
| МеОН (0-1000 мМ) | 20 мкл |
| Окисленный никотинамидадениндинуклеотид (конечная концентрация: 1 мМ) | 2 мкл |
| Алкогольоксидаза (1 мг/мл) | 7 мкл |
| Формальдегиддегидрогеназа (1 мг/мл) | 17 мкл |
| Диафораза (конечная концентрация: 2 Е/мл) | 20 мкл |
| Иоднитротетразолий (конечная концентрация: 1 мМ) | 20 мкл |
| Проба (без газообразного метана) | 20 мкл |
| 25 мМ калийфосфатный буфер | 94 мкл |
| Всего 200 мкл | |
| Измеряемая проба | |
| Окисленный никотинамидадениндинуклеотид (конечная концентрация: 1 мМ) | 2 мкл |
| Алкогольоксидаза (1 мг/мл) | 7 мкл |
| Формальдегиддегидрогеназа (1 мг/мл) | 17 мкл |
| Диафораза (конечная концентрация: 2 Е/мл) | 20 мкл |
| Иоднитротетразолий (конечная концентрация: 1 мМ) | 20 мкл |
| Проба (без газообразного метана) | 20 мкл |
| 25 мМ калийфосфатный буфер | 114 мкл |
| Всего 200 мкл | |
Ферментативную реакцию проводили в соответствии со следующими процедурами. Метанол превращали в формальдегид алкогольоксидазой и получали муравьиную кислоту из формальдегида с использованием формальдегиддегидрогеназы. НАДН, образующийся в вышеупомянутой реакции, определяли количественно с использованием цветной реакции диафоразы в виде оптической плотности при 550 нм. Алкогольдегидрогеназу и формальдегиддегидрогеназу приобретали из Sigma, диафоразу приобретали из Toyobo и иоднитротетразолий приобретали из Nikalai Tesque.
Реакционные смеси, полученные с использованием штамма AJ13852 и E. coli JM109/pRS, в которые вводили только вектор pRS без введения метана, подвергали вышеупомянутой трехстадийной ферментативной реакции, и считали, что измеренные величины оптической плотности соответствуют концентрации метанола 0 М. На основании этих величин метанол добавляли к вышеупомянутой системе определения количества в различных концентрациях и количества метанола строили в зависимости от величин оптической плотности для получения калибровочных кривых (см. чертеж). В результате было обнаружено, что величина концентрации метанола линейно соответствует величине оптической плотности в диапазоне концентраций метанола 200-1000 мкМ в этой системе измерения.
Количество полученного метанола для каждого типа клеток определяли количественно с использованием вышеупомянутых калибровочных кривых. В результате продуцирование метанола не детектировали для E. coli JM109/pRS, тогда как продуцирование метанола детектировали для штамма AJ13852, и концентрация была 240 мкМ. Удельная активность в этой реакции была равна 0,33 нмоль/мин/1 мг белка в растворе фермента.
Промышленная применимость
Согласно настоящему изобретению, способность превращать алкан в спирт могла быть сообщена микроорганизму, которому несвойственна способность утилизировать алкан и спирт, который образуется окислением этого алкана, и с использованием этого полученного микроорганизма может быть получен спирт из алкана.
Claims (3)
1. Способ получения метанола, включающий культивирование рекомбинанта Escherichia coli при 20-30°С, причем указанный рекомбинант приобрел способность превращать метан в метанол вследствие трансформации ДНК, кодирующей метаноксигеназу растворимого типа, и оставление полученной культуры, клеток, выделенных из этой культуры, или обработанного продукта указанных клеток с метаном для продукции метанола.
2. Способ получения метанола по п.1, где указанная метаноксигеназа состоит из метангидроксилазы, компонента В и редуктазы.
3. Способ получения метанола по п.1, где указанная ДНК, кодирующая метаноксигеназу растворимого типа, является геном метаноксигеназы растворимого типа Methylococcus capsulatus.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001-270903 | 2001-09-06 | ||
| JP2001270903 | 2001-09-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004110229A RU2004110229A (ru) | 2005-04-20 |
| RU2294370C2 true RU2294370C2 (ru) | 2007-02-27 |
Family
ID=19096495
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004110229/13A RU2294370C2 (ru) | 2001-09-06 | 2002-09-05 | Способ получения спирта с использованием микроорганизма |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1433856A4 (ru) |
| JP (1) | JPWO2003027301A1 (ru) |
| RU (1) | RU2294370C2 (ru) |
| WO (1) | WO2003027301A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200401750B (ru) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2376619A4 (en) | 2008-12-15 | 2012-07-04 | Greenlight Biosciences Inc | METHODS FOR CONTROLLING FLOWS IN METABOLIC PATHWAYS |
| ES2718844T3 (es) | 2010-05-07 | 2019-07-04 | Greenlight Biosciences Inc | Métodos para controlar el flujo en rutas metabólicas mediante la reubicación de enzimas |
| EP3219796B1 (en) | 2010-08-31 | 2020-10-07 | GreenLight Biosciences, Inc. | Methods for control of flux in metabolic pathways through protease manipulation |
| EP2753702B1 (en) | 2011-09-09 | 2021-12-15 | GreenLight Biosciences, Inc. | Cell-free preparation of carbapenems |
| EP2607479A1 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-26 | Evonik Industries AG | Biotechnological production of alcohols and derivatives thereof |
| US10480016B2 (en) * | 2012-10-15 | 2019-11-19 | Calysta, Inc. | Genetically engineered microorganisms for biological oxidation of hydrocarbons |
| HK1216547A1 (zh) | 2012-12-21 | 2016-11-18 | Greenlight Biosciences Inc. | 用於將甲烷轉化成燃料、丙酮酸或異丁醇的無細胞系統 |
| US9688977B2 (en) | 2013-08-05 | 2017-06-27 | Greenlight Biosciences, Inc. | Engineered phosphoglucose isomerase proteins with a protease cleavage site |
| RU2016133400A (ru) | 2014-01-16 | 2018-02-19 | Калиста, Инк. | Композиции и способы для добычи трудноизвлекаемых газа и нефти |
| CA2945951A1 (en) | 2014-04-15 | 2015-10-22 | Industrial Microbes, Inc. | Synthetic methanotrophic microorganisms |
| KR101664665B1 (ko) * | 2015-03-06 | 2016-10-12 | 서강대학교산학협력단 | 메조포러스 물질을 이용한 수중 메탄의 물질 전달 계수 향상방법 |
| CR20170485A (es) | 2015-03-30 | 2018-02-05 | Greenlight Biosciences Inc | Producción de ácido ribonucleico libre de células |
| EP3093337A3 (en) * | 2015-05-13 | 2017-03-15 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Microorganism including gene encoding protein having hydroxylase activity and method of reducing concentration of fluorinated methane in sample using the same |
| US10150080B2 (en) | 2015-10-23 | 2018-12-11 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Microorganism including gene encoding protein having dehalogenase activity and method of reducing concentration of fluorinated methane in sample using the same |
| EP3926038A3 (en) | 2015-11-18 | 2022-03-16 | Industrial Microbes, Inc. | Functional expression of monooxygenases and methods of use |
| US10358632B2 (en) | 2015-12-07 | 2019-07-23 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Bacterial cytochrome P450 protein variant and method of reducing concentration of fluorinated methane in sample using the same |
| CA3020312A1 (en) | 2016-04-06 | 2017-10-12 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free production of ribonucleic acid |
| CA3078726A1 (en) | 2017-10-11 | 2019-04-18 | Greenlight Biosciences, Inc. | Methods and compositions for nucleoside triphosphate and ribonucleic acid production |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2057745C1 (ru) * | 1993-07-12 | 1996-04-10 | Арутюнов Владимир Сергеевич | Способ получения метанола |
| JP2000166584A (ja) * | 1998-12-08 | 2000-06-20 | Osaka Gas Co Ltd | アルカノール製造リアクター |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4266034A (en) * | 1978-04-14 | 1981-05-05 | Exxon Research And Engineering Company | Method for producing microbial cells and use thereof to produce oxidation products |
-
2002
- 2002-09-05 RU RU2004110229/13A patent/RU2294370C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-09-05 EP EP02799459A patent/EP1433856A4/en not_active Withdrawn
- 2002-09-05 JP JP2003530866A patent/JPWO2003027301A1/ja active Pending
- 2002-09-05 WO PCT/JP2002/009029 patent/WO2003027301A1/ja not_active Ceased
-
2004
- 2004-03-03 ZA ZA200401750A patent/ZA200401750B/en unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2057745C1 (ru) * | 1993-07-12 | 1996-04-10 | Арутюнов Владимир Сергеевич | Способ получения метанола |
| JP2000166584A (ja) * | 1998-12-08 | 2000-06-20 | Osaka Gas Co Ltd | アルカノール製造リアクター |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| STAINTHORPE A.C. et al. The methane monooxygenase gene cluster of Methylococcus capsulatus (Bath) Gene, 1990, vol 91, no 1 p.27-34. WEST CA et al. Functional expression in Escherichia coli of proteins B and С from soluble methane monooxygenase of Methylococcus capsulatus (Bath), Journal of General Microbiology, 1992, vol 138, p.1301-1307. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1433856A4 (en) | 2009-09-23 |
| RU2004110229A (ru) | 2005-04-20 |
| EP1433856A1 (en) | 2004-06-30 |
| JPWO2003027301A1 (ja) | 2005-01-06 |
| ZA200401750B (en) | 2005-03-03 |
| WO2003027301A1 (fr) | 2003-04-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2294370C2 (ru) | Способ получения спирта с использованием микроорганизма | |
| US20050176121A1 (en) | Method for producing alcohol by using microorganism | |
| JP3716427B2 (ja) | α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 | |
| KR100676160B1 (ko) | 말릭효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법 | |
| US6878533B2 (en) | Gene encoding dihydrodipicolinate synthase from Bacillus methanolicus and methods of making lysine wing said gene | |
| KR100869623B1 (ko) | 하이드록시 카복실산류의 생산 방법 | |
| US9534240B2 (en) | Recombinant microorganism producing quinolinic acid and a method for producing quinolinic acid using the same | |
| JP2015126752A (ja) | 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびｌ−アミノ酸、２−オキソ酸、又はｄ−アミノ酸の製造方法 | |
| JP4337298B2 (ja) | 高温耐性コリネ型細菌の耐熱性アミノ酸生合成系酵素遺伝子 | |
| CN109072264A (zh) | 不饱和氨基酸 | |
| US7575910B2 (en) | Method for producing L-fuculose and method for producing L-fucose | |
| US20110086396A1 (en) | D-amino acid oxidase, and method for production of l-amino acid, 2-oxo acid, or cyclic imine | |
| CN1054637C (zh) | Ｌ-古洛糖酸-γ-内酯脱氢酶 | |
| JP5115708B2 (ja) | 新規過酸化水素生成型ｎａｄｈオキシダーゼ及びそれをコードするｄｎａ | |
| US7329523B2 (en) | Phosphoserine phosphatase of coryneform bacteria and variants thereof | |
| CN1303928A (zh) | 细胞色素c氧化酶复合体 | |
| JP2006246701A (ja) | 中央代謝系の酵素活性が増強された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 | |
| JP2006230329A (ja) | 酢酸発酵能が増強された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 | |
| WO1999045131A1 (fr) | Gene de la proteine fixatrice de penicilline et procede de production d'acide l-glutamique | |
| JPWO2005123921A1 (ja) | 新規グリセロール脱水素酵素、その遺伝子、及びその利用法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100906 |