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WO2004113925A1 - Nachweis von protease-resistentem prion-protein nach asymmetrischer spontaner interaktion - Google Patents

Nachweis von protease-resistentem prion-protein nach asymmetrischer spontaner interaktion Download PDF

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WO2004113925A1
WO2004113925A1 PCT/EP2004/006860 EP2004006860W WO2004113925A1 WO 2004113925 A1 WO2004113925 A1 WO 2004113925A1 EP 2004006860 W EP2004006860 W EP 2004006860W WO 2004113925 A1 WO2004113925 A1 WO 2004113925A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
prion protein
protease
heterologous
prpsc
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP2004/006860
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English (en)
French (fr)
Inventor
Dieter Gassner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Roche Diagnostics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG, Roche Diagnostics GmbH filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Priority to JP2006516051A priority Critical patent/JP2009513927A/ja
Priority to CA002524030A priority patent/CA2524030A1/en
Priority to EP04740273A priority patent/EP1636591A1/de
Publication of WO2004113925A1 publication Critical patent/WO2004113925A1/de
Priority to US11/303,902 priority patent/US20060154239A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2828—Prion diseases

Definitions

  • the present invention relates to methods for the detection of infectious prion protein with improved sensitivity.
  • heterologous, non-pathogenic protease-sensitive prio-protein PrPc is added to a sample to be examined, which — in the presence of infectious prion protein PrPSc in the sample — is transformed into protease-resistant prion aggregates by asymmetric spontaneous interaction.
  • Prions are those that are responsible for transferable spongiform encephalopathies (TSE), such as Kuru, variant Creutzfeld-Jakob disease (vCJD), spongiform encephalopathy in cattle (BSE), chronic wasting disease (CWD) and scrapie, infectious particles.
  • TSE transferable spongiform encephalopathies
  • the main component of prions is the glycoprotein PrPSc, which is a conformationally modified isoform of a normal cell surface protein PrPc (Prusiner, PNAS USA 95, 1 363-1 383, 1 998).
  • PrPSc is able to replicate itself by converting normal prion molecules PrPc.
  • the model is based on the fact that the infectious particle is a multimeric, highly ordered aggregate of PrPSc, while a monomeric PrPSc molecule is unstable and is only stabilized by aggregation with other PrPSc molecules.
  • the rate-determining step of replication is thus the formation of a nucleus that functions to further stabilize PrPSc aggregates.
  • the PrPSc oligomer extends at the ends of the aggregate as new PrPc molecules attach, convert, and incorporate.
  • the kinetics of such a "nucleated prion replication" is thus limited by the number of PrPSc nuclei that are present in the sample and the potential for the interaction of PrPc and PrPSc with one another.
  • PrPSc The prion protein PrPSc is the only marker available to date for diagnosing diseases of the TSE type. However, the concentration of PrPSc is so low that it can only be diagnosed in the brain in the relatively late phases of a TSE disease. Thus there is only a very limited diagnostic window for the detection of TSE diseases.
  • Efforts are therefore being made to increase the sensitivity of the detection of PrPSc.
  • a method for increasing the sensitivity of the detection of PrPSc in a sample has recently been developed (Saborio et al., Nature 41 1, 810-813; 2001 and Soto, Biochem. Soc. Trans. 30, 569-574, 2002, WO 02/04954).
  • This method known as protein misfolding cyclic amplification (PMCA), involves contacting a sample to be examined with non-pathogenic PrPc, small amounts of PrPSc present in the sample interacting with added PrPc to form aggregates, deaggregating aggregates formed and determining pathogenic PrPc in the sample.
  • PMCA protein misfolding cyclic amplification
  • the non-pathogenic PrPc added to the sample is homologous PrPc, which comes from the same species as the sample to be examined.
  • the process consists of several cycles of experimentally accelerated prion replication. Each cycle consists of two phases. In the first phase, minute amounts of PrPSc interact with some PrPc molecules, converting them and thereby inducing the growth of PrPSc polymers.
  • these polymers are broken down into small parts by the application of ultrasound waves, which exponentially increases the number of potential nuclei in each cycle.
  • the cyclical nature of the method allows at least theoretically as many cycles until the desired amplification status for the detection of PrPSc is reached.
  • the method aims to achieve an exponential increase in the number of template units at the expense of a PrPc-
  • the PMCA method used in the hamster model has also recently been described for other species, such as mice, sheep, goats, cattle and humans, with the indication that depending on which species was used, apparently depending on the physical state of the respective PrPSc Polymers in particular the ultrasound strength to be applied, which is necessary for the amplification, must be adapted (Anderes et al., Poster presentation, Transmissible Spongiform Encephalopathies. New perspectives for prion therapeutics, International Conference, December 1-3, 2002, Paris, France ).
  • Lucassen et al. describe an in vitro amplification of protease-resistant prion protein PrPSc by mixing scrapie-infected brain homogenate from hamsters or mice with homologous normal brain homogenates.
  • heterologous protease-sensitive prion protein PrPc can bind to protease-resistant prion protein PrPSc, but is only converted to the protease-resistant state to an extremely small extent. Furthermore, the presence of heterologous protease-sensitive prion protein PrPc can interfere with the conversion of homologous protease-sensitive prion protein PrPc to protease-resistant PrPSc.
  • prion protein aggregates which are formed from protease-resistant prion protein PrPSc and heterologous protease-sensitive prion protein PrPc, have sufficient protease resistance for a diagnostic detection method.
  • the object underlying the present invention was to provide a simple, fast and sensitive method for the detection of disease-associated and / or infectious prion protein PrPSc in a sample.
  • the solution to this problem according to the invention comprises the steps: (a) providing a sample to be examined,
  • the method according to the invention is based on the fact that externally added heterologous non-pathogenic protase-sensitive prion protein is bound to PrPSc aggregates in the presence of disease-specific PrPSc aggregates by a self-induced binding reaction between PrPSc and PrPc, which is referred to as asymmetric spontaneous interaction, under suitable conditions and surprisingly achieves the state of diagnostically detectable protease resistance through a binding interaction.
  • the method allows detection of infectious prion protein PrPSc with improved sensitivity and detection of heterologous prion protein isoforms using species-specific prion antibodies.
  • a protective binding event for the substrate can now be brought about by admixing the heterologous PrPc substrate and its attachment / binding to differently aggregated PrPSc aggregates, from which an increase in resistance to protease digestion results for the heterologous PrPc through its binding interaction with PrPSc ,
  • an increased protease resistance of the aggregates and consequently also of their constituents can apparently be obtained by increasing the state of aggregation as a result of the binding of heterologous PrPc.
  • PrPSc / PrPc mixing assemblies which contain heterologous PrPc that has become protease-resistant and, depending on the selection of appropriate species-specific / cross-reactive detection antibodies against prion protein, can be detected.
  • the detection can be carried out using known methods, e.g. Western blot, ELISA etc., for the direct or indirect detection of disease-specific PrPSc (depending on the selection of the specificity of the prion detection antibodies used, in addition to the existing PrPSc or exclusively).
  • the method leads to a significant increase in sensitivity in the detection of disease-specific PrPSc, in particular if a copolymerization (ie binding) of both homologous and, above all, and especially heterologous protease-sensitive prion protein induced by protease-resistant prion protein takes place continuously in a mixing system (Progressive binding events of heterologous PrPc via binding in the aggregate, possibly due to binding of conformationally changed but not convertible to PrPSc).
  • the method comprises admixing a heterologous PrPc substrate (eg normal hamster brain homogenate) with a potentially PrPSc positive or negative template (eg BSE) positive or BSE negative bovine homogenate) under suitable conditions followed by an incubation step for spontaneous binding interaction of the two heterologous protease-sensitive prion-protein PrP forms to a PrPSc template aggregate and a subsequent protease digestion.
  • a heterologous PrPc substrate eg normal hamster brain homogenate
  • a potentially PrPSc positive or negative template eg BSE positive or BSE negative bovine homogenate
  • the heterologous PrPc which is resistant to the protease digestion by binding to the PrPSc template in the aggregate, can then subsequently be diagnosed by means of an appropriately selected detection system and used as a sensitive indicator of primarily present disease-specific prion protein PrPSc.
  • the sample is preferably incubated under membrane solubilization conditions in which sphingomyelin / cholesterol-rich detergent-resistant membranes (DRM) required for binding PrPc to PrPSc, so-called “lipid rafts” or Caveolae-like domains (CLDs) ) (Vey et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, Vol. 93, 14945-14949, 1996; Baron et al., EMBO J., 21, 1031-1040, 2002), with which apparently PrPc and PrPSc are associated via glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchors.
  • DRM cholesterol-rich detergent-resistant membranes
  • CLDs Caveolae-like domains
  • an asymmetric spontaneous binding reaction of PrPc to a PrPSc template then takes place in a cell-free binding / conversion system by means of a PrPc / PrPSc “lipid raft” membrane interaction of the heterologous prion protein forms located in the “lipid rafts”, resulting in a diagnostic to the PrPSc Evidence of usable, relative protease resistance of the heterologous PrPc through the binding event with the PrPSc aggregates.
  • ASI asymmetric spontaneous binding interaction
  • the procedure is simple under almost physiological conditions in e.g. Brain homogenates or other cell-free systems, feasible;
  • Step (a) of the method comprises providing a sample to be examined.
  • the sample can be derived from tissue or body fluids that may contain prion protein, such as brain, nerve tissue, or the lymphoreticular system, such as blood or blood components.
  • the samples are usually provided in the form of homogenates which contain a detergent containing "lipid raft", for example a nonionic detergent such as Triton X100.
  • Bovine or human samples in particular are preferably free of ionic detergents, such as SDS.
  • Samples from body fluids such as blood, cellular blood components, buffy coats etc. can be provided by enrichment of cells containing prion protein, for example by obtaining lymphocytes and other mononuclear cells from anticoagulated whole blood (for example Accuspin-System Histopaque 1077, Sigma Diagnostics).
  • the sample is preferably provided under essentially physiological conditions, for example pH 6-8 and salt concentrations corresponding to 50 to 500 mmol / l NaCl.
  • a protease inhibitor or a combination of protease inhibitors is advantageously added to the sample in order to activate endogenous proteases present in the sample.
  • the sample is preferably used directly or freshly after homogenization, ie without freezing beforehand.
  • Step (b) of the method according to the invention comprises adding heterologous non-pathogenic protease-sensitive prion protein PrPc to the sample to be examined.
  • the ratio of the heterologous prion protein added to the prion protein present in the sample is 1:99 to 99: 1, particularly preferably 10:90 to 90:10, with in general homogenates each having essentially the same concentrations, for example 10%, be used.
  • heterologous in the sense of the present invention means that normal prion protein PrPc from a foreign species, preferably a foreign genus, is added to the sample.
  • rodent PrPc for example hamster PrPc or mouse PrPc
  • rodent PrPc for example hamster PrPc or mouse PrPc
  • human PrPc to a bovine sample or bovine or sheep PrPc to a human sample.
  • the heterologous material added to the sample preferably a PrPc homogenate, is particularly preferably a fresh homogenate that was not frozen after the homogenization.
  • Step (c) of the method according to the invention preferably comprises incubating the sample under conditions in which an asymmetric spontaneous interaction of heterologous protease-sensitive prion protein PrPc with infectious prion protein PrPSc present in the sample to form protease-resistant prion protein Aggregates are carried out.
  • This asymmetric spontaneous interaction involves an attachment of heterologous non-pathogenic prion protein PrPc to infectious prion protein PrPSc present in the sample.
  • the sample is preferably incubated at a temperature of 20-55 ° C, in particular 35-50 ° C.
  • the incubation is carried out for a time sufficient to achieve an effective increase in sensitivity.
  • the incubation period is at least 10 minutes, e.g. from 10-240 min and particularly preferably from 1 5-1 20 min.
  • a disaggregation step can be carried out before step (c), in which high-molecular PrPSc aggregates are disaggregated to low-molecular aggregates.
  • a step can include a single ultrasound treatment.
  • the method according to the invention can carry out one or more additional amplification cycles, ie one or more successive ultrasound / incubation cycles, for example according to the PMCA method.
  • the protease according to step (d) of the method according to the invention is selected such that it is able to cleave non-pathogenic, homologous and added heterologous prion protein PrPc present in the sample in a monomeric form, while added heterologous PrPc in the form of Aggregates with PrPSc are largely resistant to cleavage.
  • An example of a suitable protease is proteinase K. Proteinase K is particularly preferably used in a concentration of 50-100 ⁇ g / ml.
  • Step (e) of the method according to the invention comprises the determination of protease-resistant prion protein PrPSc in the sample. This determination can be made qualitatively or / and quantitatively by all methods known in the prior art. Examples of suitable methods are immunological methods in which pathogenic prion protein is determined by reaction with a specific antibody.
  • prion protein is determined by a Western blot.
  • the sample is electrophoretically separated under denaturing conditions, for example by SDS-PAGE, and the proteins contained therein are blotted onto a suitable membrane, for example a nitrocellulose or polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • the prion protein is then visualized by reaction with polyclonal or monoclonal anti-prion antibodies, which can be labeled directly, or by a labeled one Secondary antibodies can be detected.
  • Enzymatic labeling using a detectable substrate for example a chemiluminescent substrate, is preferred.
  • Anti-prion antibodies are mentioned in the examples.
  • the determination can also be carried out by an immunoassay, the sample being brought into contact with suitable detection reagents without prior electrophoretic separation.
  • the immunoassay is a sandwich assay using a solid phase, e.g. a biotinylated and a labeled e.g. of an enzyme-labeled antibody against the prion protein.
  • the detection is particularly preferably carried out by a sandwich ELISA, one or more anti-prion antibodies and an enzyme-antibody conjugate being used as the labeled secondary antibody together with a detectable enzyme substrate.
  • antibody combinations comprising antibodies specific for rodents, e.g. Hamster or / and bovine prion protein, or antibodies specific for bovine or / and human prion protein.
  • Example 1 Asymmetric spontaneous interaction between heterologous PrP forms in the cattle / hamster system
  • BSE-positive bovine brain homogenate (20% homogenate in 10% sucrose), obtained from the Obex region of the Medulla oblongata (VLA case 99/00946), was diluted 100-fold with ice-cold:
  • Bovine normal brain homogenate (homologous system), obtained from the obex region of the medulla oblongata of a healthy bovine as a 10% homogenate in PBS buffer with 0.5% Triton-X100 and
  • the homogenates were made entirely using a Ribolyzer tissue homogenizer (Hybaid, UK) and green tubes with ceramic beads from Hybaid (UK). After homogenization of normal brain samples in PBS buffer with protease inhibitor cocktail complete, Triton-X100 was added to a final concentration of 0.5% and the homogenates were solubilized for 1 5 min at 25 ° C. with shaking. The normal brain homogenates were then placed in an ice bath and treated with BSE Brain homogenate mixed as indicated above. 200 ⁇ ⁇ aliquots were subjected to the treatment procedures described below, the 0 min samples being kept in an ice bath.
  • SDS-PAGE was performed by mixing the sample with 2x SDS sample buffer under reducing conditions (5 min at 95 ° C), followed by electroblotting on a PVDF membrane.
  • Monoclonal antibodies for the Western blot Monoclonal antibodies for the Western blot.
  • Antibody L42 (R Biopharm, Germany): 250 ng / ml; L42 reacts with human and bovine PrP, but has only a weak cross-reactivity with hamster PrP in the Western blot (FIG. 6).
  • ICSM 1 8 (Imperial College London, UK): 500ng / ml; ICSM 1 8 reacts with hamsters, human and bovine PrP ( Figure 1).
  • ICSM 35 (Imperial College London, UK): 500ng / ml; ICSM 35 reacts with human and bovine PrP and, compared to ICSM 18, more strongly with hamster PrP than with bovine PrP (FIG. 3).
  • 3F4 (Signet, USA): 500ng / ml; 3F4 reacts with hamster and human PrP, but not with bovine PrP in a Western blot (FIG. 4).
  • 1 2F10 (SPIO-BIO, France): 500 ng / ml; 1 2F10 reacts with human and bovine PrP ( Figure 2).
  • 6H4 (Prionics, Switzerland): 500 mg / ml; 6H4 reacts with human and bovine PrP and to a lesser extent with hamster PrP (Figure 5).
  • proteinase K-resistant hamster prion bands (approximately 35 kDa), presumably consisting of hamster PrPc, can be recognized in the heterologous bovine PrPSc / Hamster PrPc systems, ie in systems in which a heterologous PrPc bond can take place (cf. antibody reactivity pattern ICSM 1 8, 35, 3F4 and 6H4, samples 3-8).
  • the samples were mixed with 2 ⁇ guanidinium-HCl denaturation buffer (7.6 M guanidinium-HCl, final concentration 3.8 M guanidinium-HCl) for 15 min at room temperature with shaking at 450 rpm to expose antibody-reactive epitopes.
  • 40 ⁇ l of the samples were then added to 200 ⁇ l incubation buffer which contained an antibody conjugate mixture of ICSM 35 IgG-Biotin (1 ⁇ g / ml) / ICSM18 Fab'-POD polyconjugate (100 mU / ml) and for 2 h at 25 ° C with shaking (400 rpm) in a microtiter plate coated with Thermo-RSA streptavidin (Biocoat, Germany).
  • the plates were washed with PBS / 0.05% Tween 20 and the immobilized immune complexes were detected using the substrate TMB (200 ⁇ ⁇ , 5 min).
  • the enzyme reaction was stopped by adding 50 / I stop solution (2M H 2 SO 4 ).
  • Proteinase K-resistant bovine PrP aggregates in the homologous bovine PrPSc / bovine PrPc system arise regardless of the incubation time (0-60 min) under the experimental conditions used (cf. samples 10-1 3 and 14-17).
  • Sample 9 is a bovine normal brain homogenate (PrPc digestion control) used as a PrPc source in the homologous dilution experiment. Proteinase K-resistant aggregates can be seen in the heterologous bovine PrPSc / hamster PrPc system, which arise regardless of the incubation time / temperature under the experimental conditions used (see samples 3/4, 5/6, 7/8) , Surprisingly, the values in the heterologous bovine PrPSc / hamster PrPc system are far higher than in the homologous bovine PrPSc / bovine PrPc system.
  • Sample 2 represents a hamster normal brain homogenate (PrPc digestion control), which was used as the PrPc source in the heterologous dilution experiment.
  • a decrease in the OD value in the ELISA system after ultrasound treatment can occur in the heterologous bovine PrPSc / hamster PrPc system (ELISA samples 7, 8; decrease of approximately 25%) compared to the samples without ultrasound treatment (ELISA samples 5, 6).
  • this decrease does not occur in the homologous bovine PrPSc / bovine PrPc system (cf. ELISA samples 10-1 3 with samples 14-1 7).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweise von infektiösem Prion-Protein mit verbesserter Sensitivität. Hierzu erfolgt ein Zusatz von heterologem nicht-pathogenem Protease-sensitivem Prio-Protein PrPc zu einer zu untersuchenden Probe, welches -bei Vorhandensein von infektiösem Prion-Protein PrPSc in der Probe - durch asymmetrische spontane Interaktion zu Protease-resistenten Prion-Aggregaten transformiert wird.

Description

Nachweis von Protease-resistentem Prion-Protein nach asymmetrischer spontaner Interaktion
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis von infektiösem Prion-Protein mit verbesserter Sensitivität. Hierzu erfolgt ein Zusatz von heterologem nicht-pathogenem Protease-sensitivem Prio-Protein PrPc zu einer zu untersuchenden Probe, welches -bei Vorhandensein von infektiösem Prion-Protein PrPSc in der Probe - durch asymmetrische spontane Interaktion zu Protease-resistenten Prion-Aggregaten transformiert wird.
Prionen sind die für übertragbare spongiforme Encephalopathien (TSE), wie etwa Kuru, Variante Creutzfeld-Jakob-Krankheit (vCJD), Spongiforme Encephalopathie beim Rind (BSE), chronische Auszehrungskrankheit (CWD) und Scrapie, verantwortliche infektiöse Partikel. Der Hauptbestandteil von Prionen ist das Glycoprotein PrPSc, bei dem es sich um eine konformationell modifizierte Isoform eines normalen Zelloberflächenproteins PrPc handelt (Prusiner, PNAS USA 95, 1 363-1 383, 1 998). Das Krankheits- assoziierte Prionmolekül PrPSc ist in der Lage, sich durch Konversion von normalen Prionmolekülen PrPc zu replizieren.
Es wird angenommen, dass die Prionenreplikation nach dem "Nukleation/Polymerisations"-Modell erfolgt, basierend auf einem thermodynamischen Gleichgewicht von PrPc und PrPSc in Lösung (Jarrett and Landsbury, Cell, Vol 73, 1055-1058, 1 993; Masel, Jansen and Nowak, Biophys. Chem. 77, 139-1 52, 1 999).
Das Modell basisert auf der Grundlage, dass das infektiöse Partikel ein multimeres, hoch geordnetes Aggregat von PrPSc darstellt, während ein monomeres PrPSc-Molekül unstabil ist und erst durch Aggregation mit anderen PrPSc-Molekülen stabilisiert wird. Der Geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Replikation ist somit die Bildung eines Nukleus, der zur weiteren Stabilisierung von PrPSc-Aggregaten fungiert.
Das PrPSc-Oligomer verlängert sich an den Enden des Aggregats und zwar in dem Maße, wie neue PrPc-Moleküle angelagert, konvertiert und inkorporiert werden. Die Kinetik einer solchen "nukleierten Prionenreplikation" ist somit begrenzt durch die Anzahl von PrPSc-Nuklei, die in der Probe vorhanden sind und dem Potenzial der Interaktion von PrPc und PrPSc miteinander.
Zur Diagnose von Erkrankungen des TSE-Typs steht das Prion-Protein PrPSc als bisher einziger Marker zur Verfügung. Die Konzentration von PrPSc ist jedoch so gering, dass es selbst im Gehirn nur in den relativ späten Phasen einer TSE-Erkrankung diagnostisch nachweisbar ist. Somit existiert nur ein recht beschränktes diagnostisches Fenster zum Nachweis von TSE-Erkrankungen.
Es gibt daher Bestrebungen, die Sensitivität des Nachweises von PrPSc zu steigern. Basierend auf dem obigen Modell der Prionenreplikation wurde vor Kurzem ein Verfahren zur Erhöhung der Sensitivität des Nachweises von PrPSc in einer Probe entwickelt (Saborio et al., Nature 41 1 , 810-813; 2001 und Soto, Biochem. Soc. Trans. 30, 569-574, 2002, WO 02/04954). Dieses als Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA) bezeichnete Verfahren umfasst das Inkontaktbringen einer zu untersuchenden Probe mit nicht-pathogenem PrPc, wobei in der Probe vorhandene kleine Mengen an PrPSc mit zugesetztem PrPc unter Bildung von Aggregaten interagieren, das Deaggregieren gebildeter Aggregate und das Bestimmen von pathogenem PrPc in der Probe. Bei dem der Probe zugesetzten nicht- pathogenem PrPc handelt es sich um homologes PrPc, welches von derselben Spezies wie die zu untersuchende Probe stammt. Üblicherweise besteht das Verfahren aus mehreren Zyklen einer experimentell beschleunigten Prionenreplikation. Jeder Zyklus besteht aus zwei Phasen. In der ersten Phase interagieren kleinste Mengen von PrPSc mit einigen PrPc-Molekülen, konvertieren diese und induzieren dadurch das Wachstum von PrPSc-Polymeren.
In der zweiten Phase werden diese Polymere durch die Applikation von Ultraschallwellen in kleine Teile zerlegt, wodurch die Anzahl von potenziellen Nuklei in jedem Zyklus exponentiell gesteigert wird. Die zyklische Natur der Methode erlaubt zumindest theoretisch soviele Zyklen bis der gewünschte Amplifizierungsstatus für die Detektion von PrPSc erreicht ist.
Letztlich hat die Methode das Ziel, einen exponentiellen Anstieg in der Anzahl von Templat-Einheiten zu erreichen und zwar auf Kosten eines PrPc-
Substrates mit Hilfe einer zyklischen Reaktion, welche aus den Phasen
Aggregationswachstum und Multiplikation der Templat-Einheiten besteht.
Das im Hamster-Modell angewandte PMCA-Verfahren wurde kürzlich ebenfalls für andere Spezies, wie Maus, Schaf, Ziege, Rind und Mensch, beschrieben mit dem Hinweis, dass in Abhängigkeit mit welcher Spezies gearbeitet wurde, offenbar in Abhängigkeit vom Aggregatzustand der jeweiligen PrPSc-Polymere insbesondere die zu applizierende Ultraschallstärke, die zur Amplifikation notwendig ist, angepasst werden muss (Anderes et al., Poster presentation, Transmissible Spongiform Encephalopathies. New perspectives for prion therapeutics, International Conference, December 1 .-3., 2002, Paris, France).
Die zyklische Methode zur Prionenamplifikation erscheint jedoch technisch anfällig und benötigt in der beschriebenen Art und Weise lange Inkubations- Sonifizierungs-Zyklen. Wen-Quan und Cashman (J. Biochem. Chem. 277, 43942-43947, 2002) beschreiben, dass die Bildung von PrPSc-artigen Isoformen aus nicht- pathogenem PrPc durch Behandlung von Hirnhomogenaten mit Säure/ Guanidiniumhydrochlorid hervorgerufen werden kann. Die Bildung dieser Isoformen kann durch Zugabe geringer Mengen von infektiösem Prion- Protein PrPSc aus dem Gehirn von Creutzfeld-Jacob-Patienten erhöht werden.
Lucassen et al. (Biochem. 42, 4127-4135, 2003) beschreiben eine in vitro Amplifikation von Protease-resistenten Prion-Protein PrPSc durch Vermischen von Scrapie-infiziertem Hirnhomogenat aus Hamster oder Maus mit homologen Normalhirnhomogenaten.
Horiuchi et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97 (2000), 5836-5841 ) beschreiben Wechselwirkungen zwischen heterologen Formen von Prion- Proteinen. Es wurde gefunden, dass heterologes Protease-sensitives Prion- Protein PrPc an Protease-resistentes Prion-Protein PrPSc binden kann, jedoch dabei nur in äußerst geringem Ausmaß in den Protease-resistenten Zustand umgewandelt wird. Weiterhin kann die Anwesenheit von heterologem Protease-sensitivem Prion-Protein PrPc mit der Umwandlung von homologem Protease-sensitivem Prion-Protein PrPc zu Protease- resistentem PrPSc interferieren. Aufgrund dieser Befunde war nicht zu erwarten, dass Prion-Protein-Aggregate, die aus Protease-resistentem Prion- Protein PrPSc und heterologem Protease-sensitivem Prion-Protein PrPc gebildet sind, eine ausreichende Protease-Resistenz für ein diagnostisches Nachweisverfahren aufweisen.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, ein einfaches, schnelles und sensitives Verfahren zum Nachweis von krankheitsassoziiertem oder/und infektiösem Prion-Protein PrPSc in einer Probe bereitzustellen. Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe umfasst die Schritte: (a) Bereitstellen einer zu untersuchenden Probe,
(b) Zugeben von heterologem nicht-pathogenem Protease-sensitivem Prion-Protein PrPc,
(c) Transformieren von zugesetztem heterologem normalen Protease- sensitivem Prion-Protein PrPc zu Protease-resistenten Prion-Protein-
Aggregaten bei Anwesenheit von PrPSc in der Probe,
(d) Inkubieren mit Protease und
(e) Bestimmen von Protease-resistenten Prion-Protein-Aggregaten in der Probe.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, dass extern zugegebenes heterologes nicht-pathogenes Protase-sensitives Prion-Protein in Gegenwart von krankheitsspezifischen PrPSc-Aggregaten durch eine als asymmetrische spontane Interaktion bezeichnete, selbst induzierte Bindungsreaktion zwischen PrPSc und PrPc unter geeigneten Bedingungen an PrPSc-Aggregate gebunden wird und überraschenderweise durch eine Bindungsinteraktion den Zustand einer diagnostisch nachweisbaren Protease-Resistenz erreicht. Das Verfahren erlaubt einen Nachweis von infektiösem Prion-Protein PrPSc mit verbesserter Sensitivität sowie einen Nachweis von heterologen Prion-Protein-Isoformen unter Verwendung von Spezies-spezifischen Prion-Antikörpern.
Dabei wird davon ausgegangen, dass in einer für PrPSc positiven Probe neben hochmolekularen Protease-resistenten PrPSc-Aggregaten auch Protease-sensitives niederaggregiertes PrPSc in unterschiedlichen Aggregationszuständen von heterogenen Polymergrößen existiert (Tzaban et al., Biochemistry 41 , 1 2868-1 2875, 2002). Dieses niederaggregierte PrPSc kann der Probe zugesetztem heterologem PrPc als Templat für eine asymmetrische spontane Interaktion dienen, welche die Bildung von Protease-resistenten Prion-Protein-Aggregaten erlaubt. Unter entsprechenden Bedingungen kann nun durch Zumischen von heterologem PrPc-Substrat und dessen Anlagerung/Bindung an unterschiedlich aggregierte PrPSc-Aggregate ein schützendes Bindungsereignis für das Substrat herbeigeführt werden, aus welchem für das heterologe PrPc durch seine Bindungsinteraktion an PrPSc eine Zunahme der Resistenz gegenüber Proteaseverdau resultiert. Darüber hinaus kann offenbar durch Erhöhung des Aggregationszustandes infolge der Bindung von heterologem PrPc eine erhöhte Proteaseresistenz der Aggregate und konsequenterweise auch ihrer Bestandteile erhalten werden.
Dies führt ausschließlich bei Anwesenheit von PrPSc in der Probe zur Bildung von PrPSc/PrPc-Mischaggregaten, die Protease-resistent gewordenes heterologes PrPc enthalten und je nach Auswahl entsprechender speziesspezifischer/kreuzreagierender Nachweisantikörper gegen Prion-Protein nachgewiesen werden können. Der Nachweis kann durch Anwendung bekannter Methoden, wie z.B. Western Blot, ELISA etc., zum direkten oder indirekten Nachweis von krankheitsspezifischem PrPSc (je nach Auswahl der Spezifität der benutzten Prion-Nachweisantikörper additiv zum vorhandenen PrPSc oder exklusiv) erfolgen.
Das Verfahren führt zu einer erheblichen Sensitivitätssteigerung beim Nachweis von krankheitsspezifischem PrPSc, insbesondere, wenn eine durch Protease-resistentes Prion-Protein induzierte Copolymerisation (d.h Bindung) von sowohl homologem als auch und vor allem heterologem Protease-sensitivem Prion-Protein in einem Mischsystem fortlaufend erfolgt (fortschreitende Bindungsereignisse von heterologem PrPc via im Aggregat g e b u n d e n e m , m ö g l i c h e r w e i s e i n f o l g e B i n d u n g v o n konformationsverändertem, aber nicht zu PrPSc konvertierbarem PrPc) .
In einer ersten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Zumischung von heterologem PrPc-Substrat (z.B. normales Hamsterhirnhomogenat) zu einem potenziell PrPSc positivem bzw. negativem Templat (z.B. BSE positivem oder BSE negativem Rinderhomogenat) unter geeigneten Bedingungen gefolgt von einem Inkubationsschritt zur spontanen Bindungsinteraktion der beiden heterologen Protease-sensitiven Prion- Protein PrP-Formen an ein PrPSc- Templat-Aggregat und einen anschließenden Protease-Verdau.
Nur in Anwesenheit von PrPSc-Templat findet eine Bindungsinteraktion von heterologem (und homologem) PrPc statt, während in Abwesenheit von PrPSc-Templat heterologes PrPc gemeinsam mit dem endogenen homologen PrPc vollkommen durch Protease verdaut wird.
Das durch Bindung an PrPSc-Templat im Aggregat gegenüber dem Protease-Verdau resistente heterologe PrPc kann dann anschließend durch ein entsprechend ausgewähltes Nachweissystem diagnostisch erfasst und als sensitiver Indikator von primär vorhandenem krankheitsspezifischem Prion-Protein PrPSc herangezogen werden.
Nach Zusatz des heterologen Protease-sensitiven PrPc wird die Probe vorzugsweise unter Membransolubilisierungsbedingungen inkubiert, bei denen zur Bindung von PrPc an PrPSc erforderliche Sphingomyelin/ Cholesterin reiche Detergenz-resistente Membranen (DRM), sogenannte "Lipid Rafts" bzw. Caveolae-artige Domänen (CLDs) (Vey et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, Vol. 93, 14945-14949, 1996; Baron et al., EMBO J., 21 , 1031 -1040, 2002), vorliegen, mit welchen offenbar PrPc und PrPSc via Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-Ankern assoziiert sind.
Unter entsprechenden Bedingungen findet dann in einem zellfreien Bindungs/Konvertierungssystem durch eine PrPc/PrPSc-" Lipid Raft"- Membraninteraktion der in den "Lipid Rafts" lokalisierten heterologen Prion- Protein-Formen eine asymmetrische spontane Bindungsreaktion von PrPc an ein PrPSc-Templat statt, resultierend in einer diagnostisch zum PrPSc- Nachweis nutzbaren, relativen Proteaseresistenz des heterologen PrPc durch das Bindungsereignis mit den PrPSc-Aggregaten.
Die diagnostischen Vorteile der asymmetrischen spontanen Bindungsinteraktion (ASI) können wie folgt beschrieben werden:
Das Verfahren ist einfach unter nahezu physiologischen Bedingungen in z.B. Gehirnhomogenaten oder anderen zellfreien Systemen, durchführbar;
Erhöhung der Sensitivität des PrPSc-Nachweises durch Zunahme der Proteaseresistenz von heterologem PrPc nach Bindung an PrPSc;
Möglichkeit eines indirekten Nachweises von PrPSc via heterologem PrPc-Substrat;
Je nach Auswahl von Nachweisantikörpern ist ein additiver Nachweis von PrPSc/heterologem PrPc bzw. ein exklusiver heterologer PrPc-N achweis möglich , so dass eine
Sensitivitätssteigerung beim Nachweis von PrPSc in Geweben und z.B. zellulären Blutbestandteilen, wie Buffy coat etc., oder in anderen Körperflüssigkeiten erreicht wird, in welchen nur sehr geringe Konzentrationen von PrPSc-Templat existieren; - Gegenüber einer homologen PrPSc/PrPc-Bindungsaktion (Spontane
Transformationsreaktion, STR) besteht ein zusätzlicher Vorteil, dass je nach Speziesspezifität (auf der molekularen Basis von Unterschieden in den Aminosäuresequenzen von Host/Inoculum PrP- Molekülen) nicht konvertierungsfähiges bzw. nur teilweise konvertierungsfähiges heterologes PrPc im Gegensatz zu homologem, also konvertierungsfähigem PrPc, im Protease- resistentem Aggregat nachgewiesen werden kann. In Abhängigkeit der jeweiligen Denaturierungsbedingungen, um Antikörperepitope im PrPSc-Aggregat erst zugänglich zu machen, kann das angelagerte, nicht konvertierte heterologe PrPc als Monomer leichter abgelöst werden und zum sensitiven Nachweis von primär vorhandenem PrPSc nach einem erfolgten Proteaseverdau beitragen können. Schritt (a) des Verfahrens umfasst die Bereitstellung einer zu untersuchenden Probe. Die Probe kann aus Gewebe oder Körperflüssigkeiten, die Prion-Protein enthalten können, wie etwa Hirn, Nervengewebe oder dem lymphoretikulären System, z.B. Blut oder Blutbestandteilen, stammen. Die Proben werden üblicherweise in Form von Homogenaten bereitgestellt, die ein "Lipid Raft" erhaltendes Detergenz, z.B. ein nichtionisches Detergenz, wie etwa Triton X100 enthalten. Insbesondere Proben aus Rind oder dem Menschen sind vorzugsweise frei von ionischen Detergenzien, wie etwa SDS. Proben aus Körperflüssigkeiten wie etwa Blut, zellulären Blutbestandteilen, Buffy coats etc. können durch Anreicherungen von Prion-Protein enthaltenden Zellen bereitgestellt werden, z.B. durch Gewinnung von Lymphozyten und anderen mononuklären Zellen aus antikoaguliertem Gesamtblut (z.B. Accuspin- System Histopaque 1077, Sigma Diagnostics). Die Probe wird vorzugsweise unter im Wesentlichen physiologischen Bedingungen, z.B. pH 6-8 und Salzkonzentrationen entsprechend 50 bis 500 mmol/l NaCI bereitgestellt. Der Probe wird günstigerweise ein Proteasehemmer oder eine Kombination von Proteasehemmern (z.B. Protease-Inhibitor-Cocktail complete, Röche Diagnostics) zugesetzt, um in der Probe vorhandene endogene Proteasen zu aktivieren. Die Probe wird vorzugsweise nach der Homogenisierung direkt bzw. frisch, d.h. ohne vorheriges Einfrieren eingesetzt.
Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Zugeben von heterologem nicht-pathogenem Protease-sensitivem Prion-Protein PrPc zu der zu untersuchenden Probe. Das Verhältnis von zugegebenem heterologem Prion-Protein zu in der Probe vorhandenem Prion-Protein beträgt 1 :99 bis 99: 1 , besonders bevorzugt 10:90 bis 90: 10, wobei im Allgemeinen Homogenate mit jeweils im Wesentlichen gleichen Konzentrationen, z.B. 10 %, eingesetzt werden. Der Begriff "heterolog" im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass normales Prion-Protein PrPc einer fremden Spezies, vorzugsweise einer fremden Gattung, der Probe zugegeben wird. Besonders bevorzugt ist beispielsweise die Zugabe von Nager-PrPc, z.B. Hamster-PrPc oder Maus- PrPc, zu einer Rinderprobe, einer Schafprobe oder einer humanen Probe. Weiterhin bevorzugt ist die Zugabe von humanem PrPc zu einer Rinderprobe oder Rind- bzw. Schaf-PrPc zu einer humanen Probe. Das der Probe zugesetzte heterologe Material, vorzugsweise ein PrPc-Homogenat, ist besonders bevorzugt ein frisches Homogenat, das nach der Homogenisierung nicht eingefroren wurde.
Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst vorzugsweise eine Inkubation der Probe unter Bedingungen, bei denen eine asymmetrische spontane Interaktion von heterologem Protease-sensitivem Prion-Protein PrPc mit in der Probe vorhandenen infektiösem Prion-Protein PrPSc unter Bildung von Protease-resistenten Prion-Protein-Aggregaten erfolgt. Diese asymmetrische spontane Interaktion umfasst eine Anlagerung von heterologem nicht-pathogenem Prion-Protein PrPc an in der Probe vorhandenes infektiöses Prion-Protein PrPSc.
Die Probe wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 20-55 °C, insbesondere von 35-50 °C, inkubiert. Die Inkubation erfolgt für eine Dauer, die ausreicht, um eine wirksame Sensitivitätssteigerung zu erzielen. Vorzugsweise beträgt die Inkubationsdauer mindestens 10 min, z.B. von 10-240 min und besonders bevorzugt von 1 5-1 20 min. Gegebenenfalls kann vor Schritt (c) ein Desaggregierungsschritt durchgeführt werden, bei dem hochmolekulare PrPSc-Aggregate zu niedermolekularen Aggregaten desaggregiert werden. Beispielsweise kann ein solcher Schritt eine einmalige Ultraschallbehandlung umfassen.
Weiterhin kann das erfindungsgemäße Verfahren die Durchführung eines oder mehrerer zusätzlicher Amplifikationszyklen, d.h. eines oder mehrerer aufeinanderfolgender Ultraschall/Inkubationszyklen, z.B. entsprechend dem PMCA-Verfahren umfassen.
Andererseits wurde - bei Analyse im Immunoassay - gefunden, dass in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung eine längere Inkubationszeit bzw. eine Amplifikation nicht erforderlich sind, um eine hohe Sensitivität zu erreichen.
Die Protease gemäß Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird so gewählt, dass sie in der Lage ist, nicht-pathogenes, in der Probe vorhandenes homologes und zugesetztes heterologes Prion-Protein PrPc in monomerer Form zu spalten, während zugesetztes heterologes PrPc in Form von Aggregaten mit PrPSc weitgehend gegen die Spaltung resistent ist. Ein Beispiel für eine geeignete Protease ist Proteinase K. Besonders bevorzugt verwendet man Proteinase K in einer Konzentration von 50-100 μg/ml.
Schritt (e) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Bestimmung von Protease-resistentem Prion-Protein PrPSc in der Probe. Diese Bestimmung kann nach allen im Stand der Technik bekannten Verfahren qualitativ oder/und quantitativ erfolgen. Beispiele für geeignete Methoden sind immunologische Verfahren, bei denen pathogenes Prion-Protein durch Reaktion mit einem spezifischen Antikörper bestimmt wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmung von Prion-Protein durch einen Westernblot. Hierzu wird die Probe unter denaturierenden Bedingungen, z.B. durch SDS-PAGE, elektrophoretisch aufgetrennt und die darin enthaltenen Proteine auf eine geeignete Membran, z.B. eine Nitrocellulose- oder Polyvinylidenfluorid (PVDF)- Membran, geblottet. Dort wird das Prion-Protein dann durch Reaktion mit polyklonalen oder monoklonalen Anti-Prion-Antikörpern sichtbar gemacht, die direkt markiert sein können, oder durch einen markierten Sekundärantikörper nachgewiesen werden können. Bevorzugt ist hierbei eine enzymatische Markierung unter Verwendung eines nachweisbaren Substrats, z.B. eines Chemilumineszenz-Substrats. Kommerziell verfügbare Anti-Prion-Antikörper sind in den Beispielen genannt.
Andererseits kann die Bestimmung auch durch einen Immunoassay erfolgen, wobei die Probe - ohne vorherige elektrophoretische Auftrennung - mit geeigneten Nachweisreagenzien in Kontakt gebracht wird. Bevorzugt wird der Immunoassay als Sandwich-Assay unter Verwendung eines Festphasen-seitigen, z.B. eines biotinylierten und eines markierten, z.B. eines Enzym-markierten Antikörpers, gegen das Prion-Protein durchgeführt. Besonders bevorzugt erfolgt der Nachweis durch einen Sandwich-ELISA, wobei ein oder mehrere Anti-Prion-Antikörper und als markierter Sekundärantikörper ein Enzym-Antikörper-Konjugat zusammen mit einem nachweisbaren Enzymsubstrat verwendet wird.
Zum Nachweis der bei Vorhandensein von infektiösem PrPSc in der Probe entstehenden Protease-resistenten Aggregate kann man - wie zuvor ausgeführt - Antikörper verwenden, die das Prion-Protein spezies- oder -gattungsspezifisch bzw. spezies- oder gattungsübergreifend erkennen. Auch Kombinationen oder Mischungen von zwei oder mehreren solcher Antikörper können eingesetzt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Antikörperkombinationen verwendet, umfassend Antikörper spezifisch für Nager, z.B. Hamster- oder/und Rind-Prion-Protein, bzw. Antikörper spezifisch für Rind- oder/und Human-Prion-Protein.
Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele erläutert werden. Beispiele
Beispiel 1 : Asymmetrische spontane Wechselwirkung zwischen heterologen PrP-Formen im Rind/Hamster-System
In diesem Beispiel wird gezeigt, dass eine asymmetrische spontane Wechselwirkung zwischen heterologen PrP-Formen, z.B. Bindung von Hamster PrPc an Rinder-PrPSc-Aggregate, stattfinden kann. Es erfolgt ein Vergleich mit einer spontanen Transformationsreaktion zwischen homologen PrP-Formen, z.B. Bindung von Rinder-PrPc an Rinder-PrPSc- Aggregate, in einem zellfreien Binde/Konversionssystem.
1 .1 Probenherstellung
BSE-positives Rinderhirn-Homogenat (20 % Homogenat in 10 % Saccharose), gewonnen aus der Obex-Region der Medulla oblongata (VLA Fall 99/ 00946) wurde 100fach verdünnt mit eiskaltem:
(a) Normalhirnhomogenat vom Rind (homologes System), gewonnen aus der Obexregion der Medulla oblongata eines gesunden Rinds als 10 %iges Homogenat in PBS-Puffer mit 0,5 % Triton-X100 und
Protease-Inhibitoren-Cocktail complete (Röche Diagnostics) oder
(b) Normalhirnhomogenat von syrischem Hamster (heterologes System), als 10 %iges Homogenat in PBS-Puffer, mit 0,5 % Triton-X1 00 und Protease-Inhibitoren-Cocktail complete (Röche Diagnostics).
Die Homogenate wurden vollständig unter Verwendung eines Ribolyser Gewebehomogenisators (Hybaid, UK) und grünen Röhren mit Keramikbeads von Hybaid (UK) hergestellt. Nach Homogenisierung von Normalhirnproben in PBS Puffer mit Protease-Inhibitoren-Cocktail complete wurde Triton- X100 bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % zugegeben und die Homogenate für 1 5 min bei 25 °C unter Schütteln solubilisiert. Die Normalhirnhomogenate wurden dann in ein Eisbad gegeben und mit BSE- Hirnhomogenat, wie oben angegeben, vermischt. 200 μ\ Aliquots wurden den im Folgenden beschriebenen Behandlungsprozeduren unterzogen, wobei die 0 min Proben im Eisbad gehalten wurden.
Unmittelbar nach der Inkubation wurden alle Proben mit Proteinase K (Endkonzentration 100 μg/ml für 60 min bei 37 °C) verdaut. Die Reaktion wurde durch Zugabe von PMSF in einer Endkonzentration von 40 mM gestoppt. Dann wurden die Proben in Aliquots unterteilt und analysiert.
Normale Hamsterprobe (Verdauungskontrolle): Probe 2; Normale Rinderprobe (Verdauungskontrolle): Probe 9;
Homologes System (Rinder-PrPSc/Rinder-PrPc):
Inkubation bei 47 °C für 0/1 5/30/60 min unter Schütteln bei 500 Upm (Eppendorf-Schüttler); Proben 10-13;
Indirekte Sonifizierung ( 1 Puls von 1 5 sec) unter Verwendung eines Mikrosonicators (Bandelin Electronik, Sono plus, Berlin) ausgestattet mit einem Becherresonator (BR30) und einer Probenhaltevorrichtung (EH3) gefolgt von Inkubation bei 47 °C für 0/1 5/30/60 min unter Schütteln bei 500 Upm (Eppendorf-Schüttler): Proben 14-1 7;
Heterologes System (Rinder-PrPSc/Hamster-PrPc):
Inkubation bei Raumtemperatur für 0/60 min unter Schütteln bei 500 Upm (Eppendorf-Schüttler): Proben 3, 4;
Inkubation bei 47 °C für 0/60 min unter Schütteln bei 500 Upm (Eppendorf-Schüttler): Proben 5, 6;
Indirekte Sonifizierung (1 Puls von 1 5 sec) unter Verwendung eines Mikrosonicators (Bandelin Electronik, Sono plus, Berlin) ausgestattet mit einem Becherresonator (BR30) und einer Probenhaltevorrichtung (EH3) gefolgt von Inkubation bei 47 °C für 0/60 min unter Schütteln bei 500 Upm (Eppendorf-Schüttler): Proben 7, 8.
Nach den angegebenen Inkubationszeiten wurden die Proben in das Eisbad zurückgegeben und anschließend parallel mit Proteinase K verdaut.
1 .2 Analyse im Westernblot
Es wurde eine SDS-PAGE durch Vermischen der Probe mit 2x SDS- Probenpuffer unter reduzierenden Bedingungen (5 min bei 95 °C) durchgeführt, gefolgt von einem Elektroblot auf eine PVDF-Membran. Die
Membranen wurden mit dem Dig-Block- und Waschpuffer-Kit (Röche
Diagnostics) behandelt und für 1 h mit einem Satz verschiedener speziesspezifischer monoklonaler Anti-Prionenantikörper (wie im Folgenden angegeben) inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit Schaf-Anti-Maus-
IgG-alkalisches Phosphatase-Konjugat (40 mU/ml) Fab-Fragment (Röche
Diagnostics) für 30 min. Die Reaktivität auf der Membran wurde durch
Verwendung eines CDP-Star Chemilumineszenzsubstrats entwickelt, gefolgt durch Visualisierung (etwa 10 min) mit einem Lumilmager-System (Röche Diagnostics).
Monoklonale Antikörper für den Westernblot.
Antikörper L42 (R Biopharm, Deutschland): 250 ng/ml; L42 reagiert mit humanem und Rinder-PrP, hat aber nur eine schwache Kreuzreaktivität mit Hamster-PrP im Westernblot (Figur 6).
ICSM 1 8 (Imperial College London, UK): 500 ng/ml; ICSM 1 8 reagiert mit Hamster, humanem und Rinder-PrP (Figur 1 ).
ICSM 35 (Imperial College London, UK): 500 ng/ml; ICSM 35 reagiert mit humanem und Rinder-PrP und im Vergleich zu ICSM 18 stärker mit Hamster-PrP als mit Rinder-PrP (Figur 3). 3F4 (Signet, USA): 500 ng/ml; 3F4 reagiert mit Hamster- und humanem PrP, nicht jedoch mit Rinder-PrP im Westernblot (Figur 4).
1 2F10 (SPIO-BIO, Frankreich): 500 ng/ml; 1 2F10 reagiert mit humanem und Rinder-PrP (Figur 2).
6H4 (Prionics, Schweiz): 500 mg/ml; 6H4 reagiert mit humanem und Rinder-PrP und im geringeren Ausmaß mit Hamster-PrP (Figur 5).
Die Ergebnisse der Proben 2-1 7 im Westernblot sind in den Figuren 1 -6 dargestellt. Es wurden Proteinase K-resistente Rinder-Prionen-Banden von < 30 kD (doppelt glycosylierte, einfach glycosylierte und unglycosylierte Banden typisch für PrPSc) in homologen Rinder-PrPSc/Rinder-PrPc- Systemen (Proben 10-1 7) abhängig von der Spezifität des verwendeten Antikörpers (vgl. ICSM 1 8, 1 2F10, 6H4 und L42) gefunden. Das Bandenmuster bei etwa 35 kDa muss als gebundenes, aber noch nicht konvertiertes Rinder-PrPc interpretiert werden (vgl. Proben 10-1 7).
Andererseits sind Proteinase K-resistente Hamster-Prionen-Banden (etwa 35 kDa), vermutlich bestehend aus Hamster-PrPc, in den heterologen Rinder-PrPSc/Hamster-PrPc-Systemen zu erkennen, d.h. in Systemen, in denen eine heterologe PrPc-Bindung stattfinden kann (vgl. Antikörper- Reaktivitätsmuster ICSM 1 8, 35, 3F4 und 6H4, Proben 3-8). Abhängig von den Speziesunterschieden in den Prionen-Protein-Aminosäuresequenzen und der Antikörper-Epitoperkennung auf dem Prionen-Protein kann man einen begrenzten Konversionsvorgang (vgl. ICSM 18 Erkennungsmuster, Proben 3-8) sogar mit der Glycoformverteilung und den scheinbaren Molekularmassen der im heterologen System gebildeten PrPSc-Moleküle finden, die den neu konvertierten PrPSc-Molekülen im homologen System entsprechen (Visualisiert nur als Konsequenz des Prionen-Protein- Erkennungsmusters des Antikörpers ICSM 1 8). Verdauungskontrollen von normalen Hamsterhirn/Rinderhirnhomogenaten (verwendet für das Verdünnungsexperiment) ergaben keine Protease-resistenten PrP-Banden (Proben 2 und 9). Eine gewisse Kreuzreaktivität des zweiten Antikörpers im Westernblot mit Proteinase K zeigt sich durch das Vorhandensein einer Bande bei etwa 30 kDa (Proben 2, 9, 3-8, 10-17).
Als Molekulargewichtsstandard wurde Magic Mark Western Standard (Invitrogen) mit Banden von 120, 100, 80, 60, 50, 40, 30 und 20 kDa verwendet (jeweils Probe 1 ).
1.3 Auswertung durch ELISA
Die Proben wurden mit 2x Guanidinium-HCI-Denaturierungspuffer (7,6 M Guanidinium-HCI, Endkonzentration 3,8 M Guanidinium-HCI) für 15 min bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 450 Upm zur Exponierung Antikörper- reaktiver Epitope vermischt. 40 μ\ der Proben wurden dann zu 200 μ\ Inkubationspuffer gegeben, der ein Antikörperkonjugatgemisch von ICSM 35 IgG-Biotin (1 μg/ml)/ICSM18 Fab'-POD-Polykonjugat (100 mU/ml) enthielt und für 2 h bei 25 °C unter Schütteln (400 Upm) in einer mit Thermo-RSA-Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatte (Biocoat, Deutschland) inkubiert. Die Platten wurden mit PBS/0,05 % Tween 20 gewaschen und die immobilisierten Immunkomplexe durch Verwendung des Substrats TMB (200 μ\, 5 min) nachgewiesen. Die Enzymreaktion wurde durch Zugabe von 50 /I Stopplösung (2M H2SO4) gestoppt. Die OD- Werte wurden mit einem Zweiwellenlängen-Fotometer bei 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 690 nm bestimmt (Leerwert = 0,017).
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Figure imgf000019_0001
Proteinase K-resistente Rinder-PrP-Aggregate im homologen Rinder- PrPSc/Rinder-PrPc-System entstehen unabhängig von der Inkubationszeit (0-60 min) unter den verwendeten experimentellen Bedingungen (vgl. Proben 10-1 3 und 14-17).
Probe 9 istein Rindernormalhirnhomogenat (PrPc-Verdauungskontrolle), das als PrPc-Quelle im homologen Verdünnungsexperiment verwendet wurde. Es sind Proteinase K-resistente Aggregate im heterologen Rinder- PrPSc/Hamster-PrPc-System zu erkennen, die unabhängig von der Inkubationszeit/Temperatur unter den verwendeten experimentellen Bedingungen entstehen (vgl. Proben 3/4, 5/6, 7/8). Überraschenderweise sind die Werte im heterologen Rinder-PrPSc/Hamster-PrPc-System weit höher als im homologen Rinder-PrPSc/Rinder-PrPc-System.
Probe 2 stellt ein Hamsternormalhirnhomogenat dar (PrPc- Verdauungskontrolle) , das als PrPc-Quelle im heterologen Verdünnungsexperiment verwendet wurde. Eine Abnahme des OD-Werts im ELISA-System nach Ultraschallbehandlung kann im heterologen Rinder- PrPSc/Hamster-PrPc-System auftreten (ELISA-Proben 7, 8; Abnahme von etwa 25 %), verglichen mit den Proben ohne Ultraschallbehandlung (ELISA- Proben 5, 6). Andererseits tritt diese Abnahme nicht im homologen Rinder- PrPSc/Rinder-PrPc-System auf (vgl. ELISA-Proben 10-1 3 mit Proben 14- 1 7).

Claims

Ansprüche
1 . Verfahren zum Nachweis von Prion-Protein PrPSc in einer Probe, 5 umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer zu untersuchenden Probe,
(b) Zugeben von heterologem normalem Protease-sensitivem Prion-Protein PrPc,
(c) Transformieren von zugesetztem heterologem normalem o Protease-sensitivem Prion-Protein PrPc zu Protease-resistenten
Prion-Protein-Aggregaten bei Anwesenheit von PrPSc in der Probe,
(d) Inkubieren mit Protease und
(e) Bestimmen von Protease-resistenten Prion-Protein-Aggregaten 5 in der Probe.
2. Verfahren nach Anspruch 1 zum Nachweis von Prion-Protein aus Rind, Maus, Hamster, Schaf, Ziege oder Mensch.
0 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe aus Gewebe oder Körperflüssigkeiten, wie etwa Hirn, Nervengewebe oder dem lymphoretikulären System, stammt.
5 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Detergenz enthaltende Probe untersucht.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 0 dadurch gekennzeichnet, dass die Probe als Homogenat, insbesondere als zellfreies Homogenat bereitgestellt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein frisches Homogenat verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das in Schritt (b) zugesetzte heterologe Prion-Protein aus einer Spezies stammt, die von der Spezies, aus der die Probe stammt, verschieden ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das in Schritt (b) zugesetzte heterologe Prion-Protein aus einer Gattung stammt, die von der Gattung, aus der die Probe stammt, verschieden ist.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass (i) das in Schritt (b) zugesetzte heterologe Prion-Protein aus einer Nagerspezies stammt und die Probe vom Rind, Schaf oder
Menschen stammt, (ii) das in Schritt (b) zugesetzte heterologe Prion- Protein vom Menschen stammt und die Probe vom Rind oder Schaf stammt, oder (iii) das in Schritt (b) zugesetzte heterologe Prion- Protein vom Rind oder Schaf und die Probe vom Menschen stammt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Prio-Protein als Homogenat, insbesondere als zellfreies Homogenat zugesetzt wird.
1 1 . Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein frisches Homogenat verwendet wird.
1 2. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (c) eine Inkubation der Probe unter Bedingungen umfasst, bei denen eine asymmetrische spontane Interaktion von heterologem Protease-sensitivem Prion-Protein PrPc mit in der Probe vorhandenem infektiösem Prion-Protein PrPSc unter Bildung von zu
Protease-resistenten Prion-Protein-Aggregaten erfolgt.
1 3. Verfahren nach Anspruch 1 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation bei einer Temperatur von 20-55 °C, insbesondere von 35-50 °C, erfolgt.
14. Verfahren nach Anspruch 1 2 oder 1 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation für eine Zeitdauer von mindestens 1 0 min, insbesondere von 10-240 min, erfolgt.
1 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekannzeichnet, dass Schritt (c) eine Inkubation unter im Wesentlichen physiologischen Bedingungen umfasst.
1 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 5, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt (c) eine Ultraschallbehandlung durchgeführt wird.
1 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Amplifikations/Inkubationszyklen durchgeführt werden.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 7, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (d) die Proteinase K verwendet wird.
1 9. Verfahren nach Anspruch 1 8, dadurch gekennzeichnet, dass man Proteinase K in einer Konzentration von 50-100 //g/ml verwendet.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 9, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (e) eine quantitative Bestimmung erfolgt.
21 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (e) die Bestimmung durch ein immunologisches Verfahren erfolgt.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung durch einen Western-Blot erfolgt.
23. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung durch einen Immunoassay erfolgt.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung durch einen Sandwich-Assay, insbesondere durch einen Sandwich-ELISA, erfolgt.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24 zur Diagnose von TSE-Erkrankungen.
26. Verfahren nach Anspruch 25 zum Nachweis von TSE-Erkrankungen beim Menschen.
27. Verfahren nach Anspruch 25 zum Nachweis von TSE-Erkrankungen bei Haus-, Nutz- und Wildtieren.
PCT/EP2004/006860 2003-06-26 2004-06-24 Nachweis von protease-resistentem prion-protein nach asymmetrischer spontaner interaktion Ceased WO2004113925A1 (de)

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