DE10328830A1

DE10328830A1 - Nachweis von Protease-resistentem Prion-Protein nach asymmetrischer Interaktion

Info

Publication number: DE10328830A1
Application number: DE10328830A
Authority: DE
Inventors: Dieter Dr. Gassner
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2003-06-26
Filing date: 2003-06-26
Publication date: 2005-01-20
Also published as: CA2524030A1; JP2009513927A; EP1636591A1; US20060154239A1; WO2004113925A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis von infektiösem Prion-Protein mit verbesserter Sensitivität. Hierzu erfolgt ein Zusatz von heterologem nicht-pathogenem Protease-sensitivem Prio-Protein PrPc zu einer zu untersuchenden Probe, welches - bei Vorhandensein von infektiösem Prion-Protein PrPSc in der Probe - durch asymmetrische spontane Interaktion zu Protease-resistenten Prion-Aggregaten transformiert wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis von infektiösem Prion-Protein mit verbesserter Sensitivität. Hierzu erfolgt ein Zusatz von heterologem nicht-pathogenem Protease-sensitivem Prio-Protein PrPc zu einer zu untersuchenden Probe, welches – bei Vorhandensein von infektiösem Prion-Protein PrPSc in der Probe – durch asymmetrische spontane Interaktion zu Protease-resistenten Prion-Aggregaten transformiert wird.

Prionen sind die für übertragbare spongiforme Encephalopathien (TSE), wie etwa Kuru, Variante Creutzfeld-Jakob-Krankheit (vCJD), Spongiforme Encephalopathie beim Rind (BSE), chronische Auszehrungskrankheit (CWD) und Scrapie, verantwortliche infektiöse Partikel. Der Hauptbestandteil von Prionen ist das Glycoprotein PrPSc, bei dem es sich um eine konformationellmodifizierte Isoform eines normalen Zelloberflächenproteins PrPc handelt (Prusiner, PNAS USA 95, 1363–1383, 1998). Das Krankheits-assoziierte Prionmolekül PrPSc ist in der Lage, sich durch Konversion von normalen Prionmolekülen PrPc zu replizieren.

Es wird angenommen, dass die Prionenreplikation nach dem "Nukleation/Polymerisations"-Modell erfolgt, basierend auf einem thermodynamischen Gleichgewicht von PrPc und PrPSc in Lösung (Jarrett and Landsbury, Cell, Vol 73, 1055–1058, 1993; Masel, Jansen and Nowak, Biophys. Chem. 77, 139–152, 1999).

Das Modell basisert auf der Grundlage, dass das infektiöse Partikel ein multimeres, hoch geordnetes Aggregat von PrPSc darstellt, während ein monomeres PrPSc-Molekül unstabil ist und erst durch Aggregation mit anderen PrPSc-Molekülen stabilisiert wird. Der Geschwindigkeits-bestimmende Schritt der Replikation ist somit die Bildung eines Nukleus, der zur weiteren Stabilisierung von PrPSc-Aggregaten fungiert.

Das PrPSc-Oligomer verlängert sich an den Enden des Aggregats und zwar in dem Maße, wie neue PrPc-Moleküle angelagert, konvertiert und inkorporiert werden. Die Kinetik einer solchen "nukleierten Prionenreplikation" ist somit begrenzt durch die Anzahl von PrPSc-Nuklei, die in der Probe vorhanden sind und dem Potenzial der Interaktion von PrPc und PrPSc miteinander.

Zur Diagnose von Erkrankungen des TSE-Typs steht das Prion-Protein PrPSc als bisher einziger Marker zur Verfügung. Die Konzentration von PrPSc ist jedoch so gering, dass es selbst im Gehirn nur in den relativ späten Phasen einer TSE-Erkrankung diagnostisch nachweisbar ist. Somit existiert nur ein recht beschränktes diagnostisches Fenster zum Nachweis von TSE-Erkrankungen.

Es gibt daher Bestrebungen, die Sensitivität des Nachweises von PrPSc zu steigern. Basierend auf dem obigen Modell der Prionenreplikation wurde vor Kurzem ein Verfahren zur Erhöhung der Sensitivität des Nachweises von PrPSc in einer Probe entwickelt (Saborio et al., Nature 411, 810–813; 2001 und Soto, Biochem. Soc. Trans. 30, 569–574, 2002, WO 02/04954). Dieses als Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA) bezeichnete Verfahren umfasst das Inkontaktbringen einer zu untersuchenden Probe mit nicht-pathogenem PrPc, wobei in der Probe vorhandene kleine Mengen an PrPSc mit zugesetztem PrPc unter Bildung von Aggregaten interagieren, das Deaggregieren gebildeter Aggregate und das Bestimmen von pathogenem PrPc in der Probe. Bei dem der Probe zugesetzten nicht-pathogenem PrPc handelt es sich um homologes PrPc, welches von derselben Spezies wie die zu untersuchende Probe stammt. Üblicherweise besteht das Verfahren aus mehreren Zyklen einer experimentell beschleunigten Prionenreplikation. Jeder Zyklus besteht aus zwei Phasen. In der ersten Phase interagieren kleinste Mengen von PrPSc mit einigen PrPc-Molekülen, konvertieren diese und induzieren dadurch das Wachstum von PrPSc-Polymeren.

In der zweiten Phase werden diese Polymere durch die Applikation von Ultraschallwellen in kleine Teile zerlegt, wodurch die Anzahl von potenziellen Nuklei in jedem Zyklus exponentiell gesteigert wird. Die zyklische Natur der Methode erlaubt zumindest theoretisch soviele Zyklen bis der gewünschte Amplifizierungsstatus für die Detektion von PrPSc erreicht ist.

Letztlich hat die Methode das Ziel, einen exponentiellen Anstieg in der Anzahl von Templat-Einheiten zu erreichen und zwar auf Kosten eines PrPc-Substrates mit Hilfe einer zyklischen Reaktion, welche aus den Phasen Aggregationswachstum und Multiplikation der Templat-Einheiten besteht.

Das im Hamster-Modell angewandte PMCA-Verfahren wurde kürzlich ebenfalls für andere Spezies, wie Maus, Schaf, Ziege, Rind und Mensch, beschrieben mit dem Hinweis, dass in Abhängigkeit mit welcher Spezies gearbeitet wurde, offenbar in Abhängigkeit vom Aggregatzustand der jeweiligen PrPSc-Polymere insbesondere die zu applizierende Ultraschallstärke, die zur Amplifikation notwendig ist, angepasst werden muss (Anderes et al., Poster presentation, Transmissible Spongiform Encephalopathies. New perspectives for prion therapeutics, International Conference, December 1.–3., 2002, Paris, France.

Die zyklische Methode zur Prionenamplifikation erscheint jedoch technisch anfällig und benötigt in der beschriebenen Art und Weise lange Inkubations-Sonifizierungs-Zyklen.

Wen-Quan und Cashman (J. Biochem. Chem. 277, 43942–43947, 2002) beschreiben, dass die Bildung von PrPSc-artigen Isoformen aus nicht-pathogenem PrPc durch Behandlung von Hirnhomogenaten mit Säure/Guanidiniumhydrochlorid hervorgerufen werden kann. Die Bildung dieser Isoformen kann durch Zugabe geringer Mengen von infektiösem Prion-Protein PrPSc aus dem Gehirn von Creutzfeld-Jacob-Patienten erhöht werden.

Lucassen et al. (Biochem. 42, 4127–4135, 2003) beschreiben eine in vitro Amplifikation von Protease-resistenten Prion-Protein PrPSc durch Vermischen von Scrapie-infiziertem Hirnhomogenat aus Hamster oder Maus mit homologen Normalhirnhomogenaten.

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, ein einfaches, schnelles und sensitives Verfahren zum Nachweis von krankheitsassoziiertem oder/und infektiösem Prion-Protein PrPSc in einer Probe bereitzustellen. Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe umfasst die Schritte:

(a) Bereitstellen einer zu untersuchenden Probe,
(b) Zugeben von heterologem nicht-pathogenem Protease-sensitivem Prion-Protein PrPc,
(c) Transformieren von zugesetztem heterologem normalen Protease-sensitivem Prion-Protein PrPc zu Protease-resistenten Prion-Protein-Aggregaten bei Anwesenheit von PrPSc in der Probe,
(d) Inkubieren mit Protease und
(e) Bestimmen von Protease-resistenten Prion-Protein-Aggregaten in de Probe.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, dass extern zugegebenes heterologes nicht-pathogenes Protase-sensitives Prion-Protein in Gegenwart von krankheitsspezifischen PrPSc-Aggregaten durch eine als asymmetrische spontane Interaktion bezeichnete, selbst induzierte Bindungsreaktion zwischen PrPSc und PrPc unter geeigneten Bedingungen an PrPSc-Aggregate gebunden wird und überraschenderweise durch eine Bindungsinteraktion den Zustand einer diagnostisch nachweisbaren Protease-Resistenz erreicht.

Dabei wird davon ausgegangen, dass in einer für PrPSc positiven Probe neben hochmolekularen Protease-resistenten PrPSc-Aggregaten auch Protease-sensitives niederaggregiertes PrPSc in unterschiedlichen Aggregationszuständen von heterogenen Polymergrößen existiert (Tzaban et al., Biochemistry 41, 12868–12875, 2002). Dieses niederaggregierte PrPSc kann der Probe zugesetztem heterologem PrPc als Templat für eine asymmetrische spontane Interaktion dienen, welche die Bildung von Protease-resistenten Prion-Protein-Aggregaten erlaubt.

Unter entsprechenden Bedingungen kann nun durch Zumischen von heterologem PrPc-Substrat und dessen Anlagerung/Bindung an unterschiedlich aggregierte PrPSc-Aggregate ein schützendes Bindungsereignis für das Substrat herbeigeführt werden, aus welchem für das heterologe PrPc durch seine Bindungsinteraktion an PrPSc eine Zunahme der Resistenz gegenüber Proteaseverdau resultiert. Darüber hinaus kann offenbar durch Erhöhung des Aggregationszustandes infolge der Bindung von heterologem PrPc eine erhöhte Proteaseresistenz der Aggregate und konsequenterweise auch ihrer Bestandteile erhalten werden.

Dies führt ausschließlich bei Anwesenheit von PrPSc in der Probe zur Bildung von PrPSc/PrPc-Mischaggregaten, die Protease-resistent gewordenes heterologes PrPc enthalten und je nach Auswahl entsprechender speziesspezifischer/kreuzreagierender Nachweisantikörper gegen Prion-Protein nachgewiesen werden können. Der Nachweis kann durch Anwendung bekannter Methoden, wie z.B. Western Blot, ELISA etc., zum direkten oder indirekten Nachweis von krankheitsspezifischem PrPSc (je nach Auswahl der Spezifität der benutzten Prion-Nachweisantikörper additiv zum vorhandenen PrPSc oder exklusiv) erfolgen.

Das Verfahren führt zu einer erheblichen Sensitivitätssteigerung beim Nachweis von krankheitsspezifischem PrPSc, insbesondere, wenn eine durch Protease-resistentes Prion-Protein induzierte Copolymerisation (d.h Bindung) von sowohl homologem als auch und vor allem heterologem Protease-sensitivem Prion-Protein in einem Mischsystem fortlaufend erfolgt (fortschreitende Bindungsereignisse von heterologem PrPc via im Aggregat gebundenem, möglicherweise infolge Bindung von konformationsverändertem, aber nicht zu PrPSc konvertierbarem PrPc).

In einer ersten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Zumischung von heterologem PrPc-Substrat (z.B. normales Hamsterhirnhomogenat) zu einem potenziell PrPSc positivem bzw. negativem Templat (z.B. BSE positivem oder BSE negativem Rinderhomogenat) unter geeigneten Bedingungen gefolgt von einem Inkubationsschritt zur spontanen Bindungsinteraktion der beiden heterologen Protease-sensitiven Prion-Protein PrP-Formen an ein PrPSc-Templat-Aggregat und einen anschließenden Protease-Verdau.

Nur in Anwesenheit von PrPSc-Templat findet eine Bindungsinteraktion von heterologem (und homologem) PrPc statt, während in Abwesenheit von PrPSc-Templat heterologes PrPc gemeinsam mit dem endogenen homologen PrPc vollkommen durch Protease verdaut wird.

Das durch Bindung an PrPSc-Templat im Aggregat gegenüber dem Protease-Verdau resistente heterologe PrPc kann dann anschließend durch ein entsprechend ausgewähltes Nachweissystem diagnostisch erfasst und als sensitiver Indikator von primär vorhandenem krankheitsspezifischem Prion-Protein PrPSc herangezogen werden.

Nach Zusatz des heterologen Protease-sensitiven PrPc wird die Probe vorzugsweise unter Membransolubilisierungsbedingungen inkubiert, bei denen zur Bindung von PrPc an PrPSc erforderliche Sphingomyelin/Cholesterin reiche Detergenz-resistente Membranen (DRM), sogenannte "Lipid Rafts" bzw. Caveolae-artige Domänen (CLDs) (Vey et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 93, 14945–14949, 1996; Baron et al., EMBO J., 21, 1031–1040, 2002), vorliegen, mit welchen offenbar PrPc und PrPSc via Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-Ankern assoziiert sind.

Unter entsprechenden Bedingungen findet dann in einem zellfreien Bindungs/Konvertierungssystem durch eine PrPc/PrPSc-"Lipid Raft"-Membraninteraktion der in den "Lipid Rafts" lokalisierten heterologen Prion-Protein-Formen eine asymmetrische spontane Bindungsreaktion von PrPc an ein PrPSc-Templat statt, resultierend in einer diagnostisch zum PrPSc-Nachweis nutzbaren, relativen Proteaseresistenz des heterologen PrPc durch das Bindungsereignis mit den PrPSc-Aggregaten.

Die diagnostischen Vorteile der asymmetrischen spontanen Bindungsinteraktion (ASI) können wie folgt beschrieben werden:

– Das Verfahren ist einfach unter nahezu physiologischen Bedingungen in z.B. Gehirnhomogenaten oder anderen zellfreien Systemen, durchführbar;
– Erhöhung der Sensitivität des PrPSc-Nachweises durch Zunahme der Proteaseresistenz von heterologem PrPc nach Bindung an PrPSc;
– Möglichkeit eines indirekten Nachweises von PrPSc via heterologem PrPc-Substrat;
– Je nach Auswahl von Nachweisantikörpern ist ein additiver Nachweis von PrPSc/heterologem PrPc bzw. ein exklusiver heterologer PrPc-Nachweis möglich, so dass eine Sensitivitätssteigerung beim Nachweis von PrPSc in Geweben und z.B. zellulären Blutbestandteilen, wie Buffy coat etc., oder in anderen Körperflüssigkeiten erreicht wird, in welchen nur sehr geringe Konzentrationen von PrPSc-Templat existieren;
– Gegenüber einer homologen PrPSc/PrPc-Bindungsaktion (Spontane Transformationsreaktion, STR) besteht ein zusätzlicher Vorteil, dass je nach Speziesspezifität (auf der molekularen Basis von Unterschieden in den Aminosäuresequenzen von Host/Inoculum PrP-Molekülen) nicht konvertierungsfähiges bzw. nur teilweise konvertierungsfähiges heterologes PrPc im Gegensatz zu homologem, also konvertierungsfähigem PrPc, im Protease-resistentem Aggregat nachgewiesen werden kann. In Abhängigkeit der jeweiligen Denaturierungsbedingungen, um Antikörperepitope im PrPSc-Aggregat erst zugänglich zu machen, kann das angelagerte, nicht konvertierte heterologe PrPc als Monomer leichter abgelöst werden und zum sensitiven Nachweis von primär vorhandenem PrPSc nach einem erfolgten Proteaseverdau beitragen können.

Schritt (a) des Verfahrens umfasst die Bereitstellung einer zu untersuchenden Probe. Die Probe kann aus Gewebe oder Körperflüssigkeiten, die Prion-Protein enthalten können, wie etwa Hirn, Nervengewebe oder dem lymphoretikulären System, z.B. Blut oder Blutbestandteilen, stammen. Die Proben werden üblicherweise in Form von Homogenaten bereitgestellt, die ein "Lipid Raft" erhaltendes Detergenz, z.B. ein nichtionisches Detergenz, wie etwa Triton X100 enthalten. Insbesondere Proben aus Rind oder dem Menschen sind vorzugsweise frei von ionischen Detergenzien, wie etwa SDS. Proben aus Körperflüssigkeiten wie etwa Blut, zellulären Blutbestandteilen, Buffy coats etc. können durch Anreicherungen von Prion-Protein enthaltenden Zellen bereitgestellt werden, z.B. durch Gewinnung von Lymphozyten und anderen mononuklären Zellen aus antikoaguliertem Gesamtblut (z.B. Accuspin-System Histopaque 1077, Sigma Diagnostics). Die Probe wird vorzugsweise unter im Wesentlichen physiologischen Bedingungen, z.B. pH 6–8 und Salzkonzentrationen entsprechend 50 bis 500 mmol/l NaCl bereitgestellt. Der Probe wird günstigerweise ein Proteasehemmer oder eine Kombination von Proteasehemmern (z.B. Protease-Inhibitor-Cocktail complete, Roche Diagnostics) zugesetzt, um in der Probe vorhandene endogene Proteasen zu aktivieren. Die Probe wird vorzugsweise nach der Homogenisierung direkt bzw. frisch, d.h. ohne vorheriges Einfrieren eingesetzt.

Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Zugeben von heterologem nicht-pathogenem Protease-sensitivem Prion-Protein PrPc zu der zu untersuchenden Probe. Das Verhältnis von zugegebenem heterologem Prion-Protein zu in der Probe vorhandenem Prion-Protein beträgt 1:99 bis 99:1, besonders bevorzugt 10:90 bis 90:10, wobei im Allgemeinen Homogenate mit jeweils im Wesentlichen gleichen Konzentrationen, z.B. 10 %, eingesetzt werden.

Der Begriff "heterolog" im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass normales Prion-Protein PrPc einer fremden Spezies, vorzugsweise einer fremden Gattung, der Probe zugegeben wird. Besonders bevorzugt ist beispielsweise die Zugabe von Nager-PrPc, z.B. Hamster-PrPc oder Maus-PrPc, zu einer Rinderprobe, einer Schafprobe oder einer humanen Probe. Weiterhin bevorzugt ist die Zugabe von humanem PrPc zu einer Rinderprobe oder Rind- bzw. Schaf-PrPc zu einer humanen Probe. Das der Probe zugesetzte heterologe Material, vorzugsweise ein PrPc-Homogenat, ist besonders bevorzugt ein frisches Homogenat, das nach der Homogenisierung nicht eingefroren wurde.

Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst vorzugsweise eine Inkubation der Probe unter Bedingungen, bei denen eine asymmetrische spontane Interaktion von heterologem Protease-sensitivem Prion-Protein PrPc mit in der Probe vorhandenen infektiösem Prion-Protein PrPSc unter Bildung von Protease-resistenten Prion-Protein-Aggregaten erfolgt. Diese asymmetrische spontane Interaktion umfasst eine Anlagerung von heterologem nicht-pathogenem Prion-Protein PrPc an in der Probe vorhandenes infektiöses Prion-Protein PrPSc.

Die Probe wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 20–55 °C, insbesondere von 35–50 °C, inkubiert. Die Inkubation erfolgt für eine Dauer, die ausreicht, um eine wirksame Sensitivitätssteigerung zu erzielen. Vorzugsweise beträgt die Inkubationsdauer mindestens 10 min, z.B. von 10–240 min und besonders bevorzugt von 15–120 min. Gegebenenfalls kann vor Schritt (c) ein Desaggregierungsschritt durchgeführt werden, bei dem hochmolekulare PrPSc-Aggregate zu niedermolekularen Aggregaten desaggregiert werden. Beispielsweise kann ein solcher Schritt eine einmalige Ultraschallbehandlung umfassen.

Weiterhin kann das erfindungsgemäße Verfahren die Durchführung eines oder mehrerer zusätzlicher Amplifikationszyklen, d.h. eines oder mehrerer aufeinander folgender Ultraschall/Inkubationszyklen, z.B. entsprechend dem PMCA-Verfahren umfassen.

Andererseits wurde – bei Analyse im Immunoassay – gefunden, dass in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung eine längere Inkubationszeit bzw. eine Amplifikation nicht erforderlich sind, um eine hohe Sensitivität zu erreichen.

Die Protease gemäß Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird so gewählt, dass sie in der Lage ist, nicht-pathogenes, in der Probe vorhandenes homologes und zugesetztes heterologes Prion-Protein PrPc in monomerer Form zu spalten, während zugesetztes heterologes PrPc in Form von Aggregaten mit PrPSc weitgehend gegen die Spaltung resistent ist. Ein Beispiel für eine geeignete Protease ist Proteinase K. Besonders bevorzugt verwendet man Proteinase K in einer Konzentration von 50–100 μg/ml.

Schritt(e) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Bestimmung von Protease-resistentem Prion-Protein PrPSc in der Probe. Diese Bestimmung kann nach allen im Stand der Technik bekannten Verfahren qualitativ oder/und quantitativ erfolgen. Beispiele für geeignete Methoden sind immunologische Verfahren, bei denen pathogenes Prion-Protein durch Reaktion mit einem spezifischen Antikörper bestimmt wird.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmung von Prion-Protein durch einen Westernblot. Hierzu wird die Probe unter denaturierenden Bedingungen, z.B. durch SDS-PAGE, elektrophoretisch aufgetrennt und die darin enthaltenen Proteine auf eine geeignete Membran, z.B. eine Nitrocellulose- oder Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran, geblottet. Dort wird das Prion-Protein dann durch Reaktion mit polyklonalen oder monoklonalen Anti-Prion-Antikörpern sichtbar gemacht, die direkt markiert sein können, oder durch einen markierten Sekundärantikörper nachgewiesen werden können. Bevorzugt ist hierbei eine enzymatische Markierung unter Verwendung eines nachweisbaren Substrats, z.B. eines Chemilumineszenz-Substrats. Kommerziell verfügbare Anti-Prion-Antikörper sind in den Beispielen genannt.

Andererseits kann die Bestimmung auch durch einen Immunoassay erfolgen, wobei die Probe – ohne vorherige elektrophoretische Auftrennung – mit geeigneten Nachweisreagenzien in Kontakt gebracht wird. Bevorzugt wird der Immunoassay als Sandwich-Assay unter Verwendung eines Festphasen-seitigen, z.B. eines biotinylierten und eines markierten, z.B. eines Enzym-markierten Antikörpers, gegen das Prion-Protein durchgeführt. Besonders bevorzugt erfolgt der Nachweis durch einen Sandwich-ELISA, wobei ein oder mehrere Anti-Prion-Antikörper und als markierter Sekundärantikörper ein Enzym-Antikörper-Konjugat zusammen mit einem nachweisbaren Enzymsubstrat verwendet wird.

Zum Nachweis der bei Vorhandensein von infektiösem PrPSc in der Probe entstehenden Protease-resistenten Aggregate kann man – wie zuvor ausgeführt – Antikörper verwenden, die das Prion-Protein spezies- oder -gattungsspezifisch bzw. spezies- oder gattungsübergreifend erkennen. Auch Kombinationen oder Mischungen von zwei oder mehreren solcher Antikörper können eingesetzt werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Antikörperkombinationen verwendet, umfassend Antikörper spezifisch für Nager, z.B. Hamster- oder/und Rind-Prion-Protein, bzw. Antikörper spezifisch für Rind- oder/und Human-Prion-Protein.

Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele erläutert werden.

Beispiel 1: Asymmetrische spontane Wechselwirkung zwischen heterologen PrP-Formen im Rind/Hamster-System
In diesem Beispiel wird gezeigt, dass eine asymmetrische spontane Wechselwirkung zwischen heterologen PrP-Formen, z.B. Bindung von Hamster PrPc an Rinder-PrPSc-Aggregate, stattfinden kann. Es erfolgt ein Vergleich mit einer spontanen Transformationsreaktion zwischen homologen PrP-Formen, z.B. Bindung von Rinder-PrPc an Rinder-PrPSc-Aggregate, in einem zellfreien Binde/Konversionssystem.
1.1 Probenherstellung
BSE-positives Rinderhirn-Homogenat (20 % Homogenat in 10 % Saccharose), gewonnen aus der Obex-Region der Medulla oblongata (VLA Fall 99/00946) wurde 100fach verdünnt mit eiskaltem:

(a) Normalhirnhomogenat vom Rind (homologes System), gewonnen aus der Obexregion der Medulla oblongata eines gesunden Rinds als 10 %iges Homogenat in PBS-Puffer mit 0,5 % Triton-X100 und Protease-Inhibitoren-Cocktail complete (Roche Diagnostics) oder
(b) Normalhirnhomogenat von syrischem Hamster (heterologes System), als 10 %iges Homogenat in PBS-Puffer, mit 0,5 % Triton-X100 und Protease-Inhibitoren-Cocktail complete (Roche Diagnostics).

Die Homogenate wurden vollständig unter Verwendung eines Ribolyser Gewebehomogenisators (Hybaid, UK) und grünen Röhren mit Keramikbeads von Hybaid (UK) hergestellt. Nach Homogenisierung von Normalhirnproben in PBS Puffer mit Protease-Inhibitoren-Cocktail complete wurde Triton-X100 bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % zugegeben und die Homogenate für 15 min bei 25 °C unter Schütteln solubilisiert. Die Normalhirnhomogenate wurden dann in ein Eisbad gegeben und mit BSE-Hirnhomogenat, wie oben angegeben, vermischt. 200 μl Aliquots wurden den im Folgenden beschriebenen Behandlungsprozeduren unterzogen, wobei die 0 min Proben im Eisbad gehalten wurden.
Unmittelbar nach der Inkubation wurden alle Proben mit Proteinase K (Endkonzentration 100 μg/ml für 60 min bei 37 °C) verdaut. Die Reaktion wurde durch Zugabe von PMSF in einer Endkonzentration von 40 mM gestoppt. Dann wurden die Proben in Aliquots unterteilt und analysiert.
Normale Hamsterprobe (Verdauungskontrolle): Probe 2;
Normale Rinderprobe (Verdauungskontrolle): Probe 9;
Homologes System (Rinder-PrPSc/Rinder-PrPc):

Inkubation bei 47 °C für 0/15/30/60 min unter Schütteln bei 500 Upm (Eppendorf-Schüttler); Proben 10–13;
Indirekte Sonifizierung (1 Puls von 15 sec) unter Verwendung eines Mikrosonicators (Bandelin Electronik, Sono plus, Berlin) ausgestattet mit einem Becherresonator (BR30) und einer Probenhaltevorrichtung (EH3) gefolgt von Inkubation bei 47 °C für 0/15/30/60 min unter Schütteln bei 500 Upm (Eppendorf-Schüttler): Proben 14–17;

Heterologes System (Rinder-PrPSc/Hamster-PrPc):

Inkubation bei Raumtemperatur für 0/60 min unter Schütteln bei 500 Upm (Eppendorf-Schüttler): Proben 3, 4;
Inkubation bei 47 °C für 0/60 min unter Schütteln bei 500 Upm (Eppendorf-Schüttler): Proben 5, 6;
Indirekte Sonifizierung (1 Puls von 15 sec) unter Verwendung eines Mikrosonicators (Bandelin Electronik, Sono plus, Berlin) ausgestattet mit einem Becherresonator (BR30) und einer Probenhaltevorrichtung (EH3) gefolgt von Inkubation bei 47 °C für 0/60 min unter Schütteln bei 500 Upm (Eppendorf-Schüttler): Proben 7, 8.

Nach den angegebenen Inkubationszeiten wurden die Proben in das Eisbad zurückgegeben und anschließend parallel mit Proteinase K verdaut.
1.2 Analyse im Westernblot
Es wurde eine SDS-PAGE durch Vermischen der Probe mit 2 × SDS-Probenpuffer unter reduzierenden Bedingungen (5 min bei 95 °C) durchgeführt, gefolgt von einem Elektroblot auf eine PVDF-Membran. Die Membranen wurden mit dem Dig-Block- und Waschpuffer-Kit (Roche Diagnostics) behandelt und für 1 h mit einem Satz verschiedener speziesspezifischer monoklonaler Anti-Prionenantikörper (wie im Folgenden angegeben) inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit Schaf-Anti-Maus-IgG-alkalisches Phosphatase-Konjugat (40 mU/ml) Fab-Fragment (Roche Diagnostics) für 30 min. Die Reaktivität auf der Membran wurde durch Verwendung eines CDP-Star Chemilumineszenzsubstrats entwickelt, gefolgt durch Visualisierung (etwa 10 min) mit einem Lumilmager-System (Roche Diagnostics).
Monoklonale Antikörper für den Westernblot.

Antikörper L42 (R Biopharm, Deutschland): 250 ng/ml; L42 reagiert mit humanem und Rinder-PrP, hat aber nur eine schwache Kreuzreaktivität mit Hamster-PrP im Westernblot (6).
ICSM 18 (Imperial College London, UK): 500 ng/ml; ICSM 18 reagiert mit Hamster, humanem und Rinder-PrP (1).
ICSM 35 (Imperial College London, UK): 500 ng/ml; ICSM 35 reagiert mit humanem und Rinder-PrP und im Vergleich zu ICSM 18 stärker mit Hamster-PrP als mit Rinder-PrP (3).
3F4 (Signet, USA): 500 ng/ml; 3F4 reagiert mit Hamster- und humanem PrP, nicht jedoch mit Rinder-PrP im Westernblot (4).
12F10 (SPIO-BIO, Frankreich): 500 ng/ml; 12F10 reagiert mit humanem und Rinder-PrP (2).
6H4 (Prionics, Schweiz): 500 mg/ml; 6H4 reagiert mit humanem und Rinder-PrP und im geringeren Ausmaß mit Hamster-PrP (5).

Die Ergebnisse der Proben 2–17 im Westernblot sind in den 1-6 dargestellt. Es wurden Proteinase K-resistente Rinder-Prionen-Banden von < 30 kD (doppelt glycosylierte, einfach glycosylierte und unglycosylierte Banden typisch für PrPSc) in homologen Rinder-PrPSc/Rinder-PrPc-Systemen (Proben 10–17) abhängig von der Spezifität des verwendeten Antikörpers (vgl. ICSM 18, 12F10, 6H4 und L42) gefunden. Das Bandenmuster bei etwa 35 kDa muss als gebundenes, aber noch nicht konvertiertes Rinder-PrPc interpretiert werden (vgl. Proben 10–17).
Andererseits sind Proteinase K-resistente Hamster-Prionen-Banden (etwa 35 kDa), vermutlich bestehend aus Hamster-PrPc, in den heterologen Rinder-PrPSc/Hamster-PrPc-Systemen zu erkennen, d.h. in Systemen, in denen eine heterologe PrPc-Bindung stattfinden kann (vgl. Antikörper-Reaktivitätsmuster ICSM 18, 35, 3F4 und 6H4, Proben 3–8). Abhängig von den Speziesunterschieden in den Prionen-Protein-Aminosäuresequenzen und der Antikörper-Epitoperkennung auf dem Prionen-Protein kann man einen begrenzten Konversionsvorgang (vgl. ICSM 18 Erkennungsmuster, Proben 3–8) sogar mit der Glycoformverteilung und den scheinbaren Molekularmassen der im heterologen System gebildeten PrPSc-Moleküle finden, die den neu konvertierten PrPSc-Molekülen im homologen System entsprechen (Visualisiert nur als Konsequenz des Prionen-Protein-Erkennungsmusters des Antikörpers ICSM 18). Verdauungskontrollen von normalen Hamsterhirn/Rinderhirnhomogenaten (verwendet für das Verdünnungsexperiment) ergaben keine Protease-resistenten PrP-Banden (Proben 2 und 9). Eine gewisse Kreuzreaktivität des zweiten Antikörpers im Westernblot mit Proteinase K zeigt sich durch das Vorhandensein einer Bande bei etwa 30 kDa (Proben 2, 9, 3–8, 10–17).
Als Molekulargewichtsstandard wurde Magic Mark Western Standard (Invitrogen) mit Banden von 120, 100, 80, 60, 50, 40, 30 und 20 kDa verwendet (jeweils Probe 1).
1.3 Auswertung durch ELISA
Die Proben wurden mit 2 × Guanidinium-HCl-Denaturierungspuffer (7,6 M Guanidinium-HCl, Endkonzentration 3,8 M Guanidinium-HCl) für 15 min bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 450 Upm zur Exponierung Antikörper-reaktiver Epitope vermischt. 40 μl der Proben wurden dann zu 200 μl Inkubationspuffer gegeben, der ein Antikörperkonjugatgemisch von ICSM, 35 IgG-Biotin (1 μg/ml)/ICSM18 Fab'-POD-Polykonjugat (100 mU/ml) enthielt und für 2 h bei 25 °C unter Schütteln (400 Upm) in einer mit Thermo-RSA-Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatte (Biocoat, Deutschland) inkubiert. Die Platten wurden mit PBS/0,05 % Tween 20 gewaschen und die immobilisierten Immunkomplexe durch Verwendung des Substrats TMB (200 μl, 5 min) nachgewiesen. Die Enzymreaktion wurde durch Zugabe von 50 μl Stopplösung (2M H₂SO₄) gestoppt. Die OD-Werte wurden mit einem Zweiwellenlängen-Fotometer bei 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 690 nm bestimmt (Leerwert = 0,017).
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Proteinase K-resistente Rinder-PrP-Aggregate im homologen Rinder-PrPSc/Rinder-PrPc-System entstehen unabhängig von der Inkubationszeit (0–60 min) unter den verwendeten experimentellen Bedingungen (vgl. Proben 10–13 und 14-17).
Probe 9 ist ein Rindernormalhirnhomogenat (PrPc-Verdauungskontrolle), das als PrPc-Quelle im homologen Verdünnungsexperiment verwendet wurde.
Es sind Proteinase K-resistente Aggregate im heterologen Rinder-PrPSc/Hamster-PrPc-System zu erkennen, die unabhängig von der Inkubationszeit/Temperatur unter den verwendeten experimentellen Bedingungen entstehen (vgl. Proben 3/4, 5/6, 7/8). Überraschenderweise sind die Werte im heterologen Rinder-PrPSc/Hamster-PrPc-System weit höher als im homologen Rinder-PrPSc/Rinder-PrPc-System.
Probe 2 stellt ein Hamsternormalhirnhomogenat dar (PrPc-Verdauungskontrolle), das als PrPc-Quelle im heterologen Verdünnungsexperiment verwendet wurde. Eine Abnahme des OD-Werts im ELISA-System nach Ultraschallbehandlung kann im heterologen Rinder-PrPSc/Hamster-PrPc-System auftreten (ELISA-Proben 7, 8; Abnahme von etwa 25 %), verglichen mit den Proben ohne Ultraschallbehandlung (ELISA-Proben 5, 6). Andererseits tritt diese Abnahme nicht im homologen Rinder-PrPSc/Rinder-PrPc-System auf (vgl. ELISA-Proben 10–13 mit Proben 14–17).

Claims

Verfahren zum Nachweis von Prion-Protein PrPSc in einer Probe, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer zu untersuchenden Probe, (b) Zugeben von heterologem normalem Protease-sensitivem Prion-Protein PrPc, (c) Transformieren von zugesetztem heterologem normalem Protease-sensitivem Prion-Protein PrPc zu Protease-resistenten Prion-Protein-Aggregaten bei Anwesenheit von PrPSc in der Probe, (d) Inkubieren mit Protease und (e) Bestimmen von Protease-resistenten Prion-Protein-Aggregaten in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Nachweis von Prion-Protein aus Rind, Maus, Hamster, Schaf, Ziege oder Mensch.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe aus Gewebe oder Körperflüssigkeiten, wie etwa Hirn, Nervengewebe oder dem lymphoretikulären System, stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Detergenz enthaltende Probe untersucht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe als Homogenat, insbesondere als zellfreies Homogenat bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein frisches Homogenat verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das in Schritt (b) zugesetzte heterologe Prion-Protein aus einer Spezies stammt, die von der Spezies, aus der die Probe stammt, verschieden ist.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das in Schritt (b) zugesetzte heterologe Prion-Protein aus einer Gattung stammt, die von der Gattung, aus der die Probe stammt, verschieden ist.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass (i) das in Schritt (b) zugesetzte heterologe Prion-Protein aus einer Nagerspezies stammt und die Probe vom Rind, Schaf oder Menschen stammt, (ii) das in Schritt (b) zugesetzte heterologe Prion-Protein vom Menschen stammt und die Probe vom Rind oder Schaf stammt, oder (iii) das in Schritt (b) zugesetzte heterologe Prion-Protein vom Rind oder Schaf und die Probe vom Menschen stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Prio-Protein als Homogenat, insbesondere als zellfreies Homogenat zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein frisches Homogenat verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (c) eine Inkubation der Probe unter Bedingungen umfasst, bei denen eine asymmetrische spontane Interaktion von heterologem Protease-sensitivem Prion-Protein PrPc mit in der Probe vorhandenem infektiösem Prion-Protein PrPSc unter Bildung von zu Protease-resistenten Prion-Protein-Aggregaten erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation bei einer Temperatur von 20–55 °C, insbesondere von 35–50 °C, erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation für eine Zeitdauer von mindestens 10 min, insbesondere von 10–240 min, erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (c) eine Inkubation unter im Wesentlichen physiologischen Bedingungen umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt (c) eine Ultraschallbehandlung durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Amplifikations/Inkubationszyklen durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (d) die Proteinase K verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass man Proteinase K in einer Konzentration von 50–100 μg/ml verwendet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (e) eine quantitative Bestimmung erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (e) die Bestimmung durch ein immunologisches Verfahren erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung durch einen Western-Blot erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung durch einen Immunoassay erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung durch einen Sandwich-Assay, insbesondere durch einen Sandwich-ELISA, erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24 zur Diagnose von TSE-Erkrankungen.
Verfahren nach Anspruch 25 zum Nachweis von TSE-Erkrankungen beim Menschen.
Verfahren nach Anspruch 25 zum Nachweis von TSE-Erkrankungen bei Haus-, Nutz- und Wildtieren.