DE69621837T2

DE69621837T2 - Methoden zur feststellung von alzheimerscher krankheit

Info

Publication number: DE69621837T2
Application number: DE69621837T
Authority: DE
Inventors: M Kay
Original assignee: Research Corp Technologies Inc
Current assignee: Research Corp Technologies Inc
Priority date: 1996-01-19
Filing date: 1996-12-13
Publication date: 2002-11-28
Anticipated expiration: 2016-12-14
Also published as: ES2176523T3; DE69621837D1; EP0877939A1; ATE219247T1; WO1997026537A1; CA2242343A1; EP0877939B1; JP2000503391A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG:

Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren zum Nachweis von Alzheimer-Erkrankung gerichtet. Genauer stellt die vorliegende Erfindung Antikörper gegen das Bande 3-Protein bereit, die in der Lage sind, zwischen Gewebe mit Alzheimer-Erkrankung und normalem Gewebe zu unterscheiden. Weiterhin stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Alzheimer- Erkrankung, umfassend die differenzielle Bestimmung der Bande 3-Phosphorylierung, bereit.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG:

Bande 3 ist ein ubiquitäres Anionenaustauschprotein. Es kommt in Kern-, Golgi-, Mitochondrien- und Zellmembranen vor und in allen bisher untersuchten Geweben. Bande 3-Proteine in kernhaltigen Zellen nehmen Teil an durch Antikörper induzierte Bande 3-Oberflächen-Patching und -Capping. Bande 3 hält das Säure-Base-Gleichgewicht aufrecht, indem es den Austausch von Anionen fördert, es ist die Bindungsstelle für glykolytische Enzyme und ist das Hauptstrukturprotein, das die Plasmamembran mit dem Cytoskelett verbindet. Aufgrund seiner zentralen Rolle in der CO&sub2;-Ausscheidung ist die Bande 3 das am meisten genutzte Ionentransportsystem in vertebraten Tieren.
Das Bande 3-Protein der Human-Erythrozyten ist der Prototyp für alle Bande 3-Proteine. Aufgrund der translatierten Sequenz der cDNA besteht das Bande 3-Protein der Human-Erythrozyten aus 911 Aminosäuren (Tanner et al., 1988, Biochem. J. 256 : 703). Die N-terminalen 397 Aminosäuren befinden sich im Cytoplasma der Zelle. Arten- und gewebespezifische Variationen der Bande 3 und die wenigen bekannten Bande 3-Polymorphismen sind primär im cytoplasmatischen Segment zu finden, das sich aufgrund von enzymatischen Studien auf die Aminosäuren 1 bis ca. 400 bezieht. Zwei wesentliche Eigenschaften des Bande 3-Moleküls, der Anionentransport und die Antigenizität des Senescenz-Zell-Antigens (SCA), lässt sich in der membranassoziierten Domäne lokalisieren, die aus den C-terminalen 500 Aminosäuren besteht [Kay et al. (1991), Trans. Med. Rev., 5: 173-195].
SCA, ein Biomarker für das Altern und neurologische Erkrankung, wird durch Oxidation und Abbau der Bande 3 gebildet. SCA erscheint auf alten Zellen und wirkt als spezifisches Signal für den Abbau der Zelle, indem es die Bindung von IgG-Autoantikörper und das anschliessende Entfernen durch Phagozyten initiiert [Kay (1978) J. Supramol. Struct. 9: 555-567]. Dies scheint ein allgemeines physiologisches Verfahren zur Entfernung von alternden und beschädigten Zellen in Säugern und anderen Vertebraten zu sein. SCA wurde auf allen untersuchten Zellen, einschliesslich Neuronen, gefunden. Abgesehen von seiner zentralen Rolle bei der Entfernung von alternden und beschädigten Zellen ist SCA in neurofibrilären Verflechtungen und in senilen Plaques bei Alzheimer-Erkrankung anwesend, es ist involviert in der Entfernung von neuralen Zellen und Plättchen und der Entfernung von Erythrozyten (RBC) bei klinischen, hämolytischen Anämien, Sichelzellanämie und Malaria.
Bande 3 erfüllt die gleichen strukturellen und funktionellen Aktivitäten im Erwachsenengehirn wie bei Erythrozyten und Lymphozyten [Kay et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80: 6882-6886]. Somit zeigt es die gleichen Eigenschaften wie in Bande 3 bei Erythrozyten und Lymphozyten [Cover et al. (1996), Life Sciences 58: 655-664; Kay und Goodman (1996), Gerontology, 11, im Druck]. Bande 3 altert wie Zellen und Gewebe altern. Anfänglich unterliegt Bande 3 einer bisher nicht charakterisierten strukturellen Veränderung. Nach dieser strukturellen Veränderung unterliegt Bande 3 einem Schneiden im Transmembran-Anionentransportbereich, was zur Bildung von SCA führt. Die Erfinder haben Antikörper gegen diese "gealterte Bande 3" entwickelt, die an bestimmte Regionen der Bande 3 binden (bei alten aber nicht den mittelalten oder jungen Zellen). Diese Regionen, sogenannte "Alters-Antigen-Bereiche" ("aging antigenic sites") bei der Bande 3 befinden sich bei den Resten 538-554 und 812-830 des Bande 3- Moleküls. Das Altern der Bande 3 ist assoziiert mit funktionalen Veränderungen, einschliesslich einer erniedrigten Wirksamkeit beim Anionentransport, erniedrigtem Glucosetransport, erhöhtem Abbau von schmalen Fragmenten und erhöhter Bindung von physiologischen IgG- Autoantikörpern in situ.
Saitoh et al. (1992), Ann. NY Acad. Sci. 675: 180, und Kay et al. (1994), Ann. NY Acad. Sci. 719: 419, haben vorgeschlagen, dass ein Abbau der Bande 3 in Membranen des Gehirns von Patienten mit Alzheimer-Erkrankung erfolgt. Mit Hilfe der Immunhistochemie färbt ein Antikörper gegen ein synthetisches Peptid der Bande 3 (pep-COOH, Reste 812-827 gemäss Numerierung von Tanner et al.) mehr Neuronen im Frontalcortex von Alzheimer-Patienten als von normalen Kontrollen. Serum Autoantikörper gegen Bande 3-Peptide 588-602 und 822-839 waren im Vergleich zu Kontrollen bei Patienten mit Alzheimer-Erkrankung erhöht. Kay (1991), Ann. NY Acad. Sci. 621: 179, schlägt vor, dass die Bande 3 des Gehirns bei Alzheimer-Erkrankung verändert ist.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wurde überraschend gefunden, dass bestimmte Anti-Bande 3-Antikörper zwischen normalen roten Blutzellen und roten Blutzellen von Alzheimer-Patienten diskriminieren können und einen bequemen und wiederholbaren Assay für die Erkrankung erlauben. Weiterhin haben unerwartete Alterationen im Phosphorylierungsstatus der Bande 3 bei Alzheimer-Patienten einen weiteren Assay für diese Erkrankung bereitgestellt. Ausserdem wurde gefunden, dass posttranslationale Veränderungen der Bande 3 von RBC auftreten, die parallel zu Änderungen der Bande 3 im Gehirn führen. Diese Änderungen schliessen erniedrigte ³²P- Phosphat-Markierung von Polypeptiden in Gehirn und RBC in vitro ein, erhöhter Abbau der Bande 3, Alteration der Bande 3, erkannt durch polyklonale und monoklonale Antikörper, erniedrigter Anionen- und Glucosetransport durch rote Blutzellen und erhöhter Abbau der Bande 3 zu kleineren Fragmenten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis der Alzheimer-Erkrankung bereit, umfassend das In-Kontakt-Bringen eines Antikörpers, der die Bande 3 bei Alzheimer von einer normalen Bande 3 in einer Gewebeprobe eines Patienten, der möglicherweise Alzheimer-Erkrankung aufweist, unter Bedingungen unterscheidet, wobei ein Antikörper-Antigen- Komplex gebildet wird; Nachweis des Komplexes und Vergleich der Menge des Komplexes mit der Menge an Komplex, gebildet unter den gleichen Bedingungen mit einer Kontrollprobe eines Gesunden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Gewebeproben cerebraler Cortex, Blut oder eine Fraktion davon, rote Blutzellen, weisse Blutzellen oder rote Blutzellmembranen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Nachweis der Alzheimer-Erkrankung bereit, umfassend das In-Kontakt-Bringen eines Antikörpers, der zwischen Bande 3 bei Alzheimer von einer normalen Bande 3 in einer Gewebeprobe bei einem Patienten mit Verdacht auf Alzheimer- Erkrankung differenzieren kann unter Bedingungen, wobei ein Antigen- Antikörper-Komplex gebildet wird, und Nachweis des Komplexes.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Nachweis der Alzheimer-Erkrankung bereit, umfassend das Bestimmen der Menge an Phosphorylierung des Bande 3-Proteins oder der Abbauprodukte davon in einer ersten Gewebeprobe eines Patienten mit Verdacht auf Alzheimer-Erkrankung und Vergleich dieser Menge an Phosporylierung des Bande 3-Proteins oder der Abbauprodukte davon mit der Phosphorylierungsmenge des Bande 3-Proteins oder der Abbauprodukte davon in einer zweiten Gewebeprobe eines Kontroll- Gesunden, wobei erniedrigte Phosphorylierung in der ersten Probe indikativ für Alzheimer-Erkrankung ist. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Gewebeproben cerebraler Cortex, Blut oder eine Fraktion davon, rote Blutzellen, weisse Blutzellen oder rote Blutzellmembranen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN:

Fig. 1A bis 1D sind Säulendiagramme, die die Ergebnisse von Immunoblots von Blutproben, die mit Bande 3-Antikörpern untersucht wurden, darstellen.
Fig. 2 zeigt die erniedrigte Band 3-Phosphorylierung in alten Mäusen im Vergleich zu mittelalten Mäusen.
Fig. 3 zeigt die erniedrigte Band 3-Phosphorylierung in Alzheimer- Patienten im Vergleich zu Proben von Kontroll-temporalem Cortex.
Fig. 4 zeigt die Bindung von ³²Phosphat bei Alzheimer-Erkrankung (AD) und Kontroll-RBC Bande 3. Die Bande 3-Proteinbanden wurden durch Antikörperbindung, nachgewiesen mit alkalischer Phosphatase, identifiziert. Die Phosphorylierung wurde durch ³²P-Bindung quantifiziert.
Fig. 4A zeigt die Bindung von Anti-Phosphotyrosin-Antikörpern an Bande 3 in Frontalgyrusmembranen oder mittelalten RBC-Membranen von AD und Kontrollen. A: Kontroll-Frontalgyrus, B: AD-Frontalgyrus, C: AD mittelalte RBC-Membranen, D: Kontrolle mittelalte RBC-Membranen.
Fig. 5 zeigt die Bindung von Antikörper 980 an AD, aber nicht an Kontroll-Hirnmembranen. Bahnen: A, E, G, H = Kontrollmembranen, B, C, D, F = AD-Membranen. AB = Amidoschwarz-Färbung für Proteine; AR = Autoradiografie.
Fig. 6 zeigt dass Antikörper 980 ein internes Anionentransportsegment der Bande 3 erkennt, ANION 2, Reste 588-602 (LRKFKNSSYFPGKLR), diese stellt eine bei Alter anfällige Stelle für eine Beschädigung der Bande 3 dar. ANION 2 (AN 2), Reste 588-602 (LRKFKNSSYFPGKLR) mit geringer Bindung zu COOH. ANION 2 scheint intrazellulär zu sein, da potentielle N-Glycosylierungsstellen bei ASN-593 nicht glycosyliert sind. RBC, rote Blutzellmembran; ANION 1 (AN 1) = Position 538-554: (SKLIKIFQDHPLQKTYN) COOH = 812-827: (LFKPPKYHPDVPYVKR); COOH&supmin;'6, 813-818: (FKPPKY); Glycos, 630-648 (QKLSVPDGFKVSNSSARGW); BR = Hirn. Die Autoradiografie zeigt die Bindung von Antikörpern an Bande 3 links und Antikörper an gealterte Antikörper-Bande 3 rechts. AB = Amidoschwarz-Färbung für Proteine, AR = Autoradiografie.
Fig. 7A zeigt, dass die Antikörper AD-BD3 und Peptid COOH zwischen AD und Kontroll-Temporalcortex unterscheiden. Die Antikörper wurden gegen AD und Kontroll-Temporalcortex in Immunodots getestet. Andere Anti-Bande 3- Peptid-Antikörper unterscheiden ebenfalls zwischen AD und normalem Gewebe.
Fig. 7B und 7C zeigen, dass Antikörper gegen Bande 3-Peptide (AD-BD3 und pep-CYTO) zwischen AD und Kontroll-Frontalcortex und mittelalten (MA) RBC-Immunodots differenzieren.
Fig. 8 zeigt Beispiele für Heterohybridom-Antikörper gegen erythroides synthetisches SCA, die stärker mit AD-Gewebe reagieren. Die Monoklonalen der Passagen 1-3 wurden in Immunodots getestet. Die Antikörperinkubation betrug 5 Stunden.
Fig. 9 zeigt Beispiele für Heterohybridom-Antikörper gegen erythroides synthetisches SCA, die stärker mit Kontrollgewebe reagieren. Die Monoklonalen aus der Passage 6 wurden in Immunodots getestet.
Fig. 10 zeigt, dass Antikörper gegen Bande 3 und synthetische Peptide der Bande 3 zwischen AD und normalem Kontroll-Hirn in Gewebeschnitten unterscheidet. Die Elektronenmikroskopie wurde mit geätzten Schnitten von AD und Kontroll-Hirngewebe, das mit Antipeptid-Antikörpern reagiert wurde, durchgeführt. Antikörperbindung wurde mit Protein A-gekoppeltem kolloiden Gold dargestellt. Antikörper gegen pep-COOH, die Bande 3-Abbauprodukte (10A) und ein Glucose-Transportkanalprotein (10B) erkennen, reagiert mit AD aber nicht mit Kontroll-Hirngewebe. Antikörper reagieren nicht mit Kontroll-Gewebe (100)
Fig. 11 zeigt, dass Heterohybridom-Antikörper gegen erythroides SCA zwischen AD und Kontroll-RBC differenzieren.
Fig. 12 zeigt AD und Kontrollserum-Autoantikörper gegen synthetische Peptide bei Bande 3 und SCA, quantifiziert mit ELISA. Die Werte sind als Mittelwert ± mittlere Standardfehler dargestellt.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis der Alzheimer-Erkrankung. Insbesondere wurde erfindungsgemäss gefunden, dass bestimmte Antikörper gegen die Bande 3 oder Fragmente davon in der Lage sind, zwischen Alzheimer und normalen Gewebeproben zu unterscheiden. Die Antikörper sind in der Lage, sowohl Blut- als auch Hirnproben zu unterscheiden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäss bei dem Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen eine Bande 3-Art, die als "gealterte Bande 3" bekannt ist. Es ist bekannt und beschrieben, z. B. von Kay et al. (1994), Ann. NY Acad. Sci. 719: 419, dass das Transportmembranmolekül Bande 3 einer undefinierten Änderung, assoziiert mit dem Altern, unterliegt, dies geschieht vor dem Abbau der Bande 3 zu SCA. Diese intakte aber veränderte Bande 3 ist als "gealterte Bande 3" bekannt. Antikörper gegen die gealterte Bande 3 können identifiziert werden durch ihre Fähigkeit, an die Bande 3 in alten aber nicht mittelalten oder jungen Zellen zu binden. Rote Blutzellen können einfach in Populationen verschiedenen Alters durch allgemein bekannte Verfahren hergestellt werden (Bennett et al., 1981, Exp. Hematol., 9: 297), um eine Quelle für Zellen zur Identifikation der Antikörper gegen gealtertes Bande 3 bereitzustellen. Ein bevorzugter Antikörper gegen gealterte Bande 3 ist der Antikörper 980, dieser ist durch Kay et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 5834, beschrieben. Antikörper 980 identifiziert Alterungsunterschiede bei der Bande 3, die vor dessen Bildung zu SCA auftreten [Kay (1991), Ann. NY Acad. Sci., 621: 179-205]. Ein anderer bevorzugter Antikörper gegen gealterte Bande 3 ist der Antikörper AD-BD3, beschrieben von Kay et al. (1990), Clin. Exper. Immunogenetics, 7: 181-199. AD-BD3 wurde als Antiidiotyp gegen Alters-IgG hergestellt (SC IgG), der Autoantikörper der von gealterten Erythrozyten eluiert. Antiidiotypische Antikörper können konventionell gemäss Verfahren gemäss Kay (1985), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 1731-1735, hergestellt werden. Pep-CYTO ist ein Antikörper gegen ein cytoplasmatisches Peptid der Bande 3, Reste 122-144. Andere Antikörper gegen gealterte Bande 3 können als IgG-Autoantikörper aus Humanserum isoliert werden oder können gemäss Standardverfahren, die allgemein bekannt sind, hergestellt werden. Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper sind in dem erfindungsgemässen Verfahren nützlich. Monoklonale Antikörper, einschliesslich Nager, Kaninchen, Human, humanisiert, CDRgrafted und Chimäre sind bevorzugt. Human- und humanisierte monoklonale Antikörper gegen gealterte Bande 3 sind bevorzugt. Stabile Human- Antikörper-sekretierende Heterohybridome wurden durch Fusion von humanen B-Zellen mit einer Maus-Myeloma-Zellinie gemäss den Verfahren von Thompson et al. (1986), J. Immunol. 94: 7-12, hergestellt.
Es wurde durch die Erfinder gefunden, dass Antikörper 980 ein Bande 3-Peptid mit den Resten 588-602 erkennt. Die Reste 588-602 sind bekannt an ANION 2. ANION 2 ist eine dem "Altern zugängliche Stelle". Eine dem "Altern zugängliche Stelle", wie erfindungsgemäss definiert, ist eine Bande 3- Region, die eine Zahl von Aminosäuren enthält, die einer Beschädigung durch Altern zugänglich ist und einen Bande 3-Abbau initiieren. Asparagin an Position 593 deaminiert z. B. und verursacht anschliessend eine Veränderung der Bande 3-Konfiguration. ANION 2 ist auch Serinproteasen zugänglich.
Entsprechend sind Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 588-602 erfindungsgemäss eingeschlossen. Die Reste 588-602 haben die Sequenz LRKFKNSSYFPGKLR.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 812-830 der Bande 3, gemäss Numerierung von Tanner et al.. Reste 812-830 haben die Sequenz LFKPPKYHPDVPYVKRVKT.
In einer anderen Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 822-839 der Bande 3 (VPYVKRVKTWRMHLFTGI).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 538-554 der Bande 3 (SKLIKIFQDHPLQKTYN).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 853-870 der Bande 3.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 122-144 der Bande 3 (DLQETSLAGVANQLLDRFIFEDQ). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 812-827 der Bande 3 (LFKPPKYHPDVPYVKR).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 526-541 der Bande 3 (FLISLIFIYETFSKLI).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 549-566 der Bande 3 (LQKTYNYNVLMVPKPQGP).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 561-578 der Bande 3 (PKPQGPLPNTALLSLVLM).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 573-591 der Bande 3 (LSLVLMAGTFFFAMMLRKF).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 597-614 der Bande 3 (FPGKLRRVIGDFGVPISI).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 818-827 der Bande 3 (YHPDVPYVKR).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 818-823 der Bande 3 (YHPDVP).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 822-827 der Bande 3 (VPYVKR).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 804-811 der Bande 3 (QLFDRILL).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 828-834 der Bande 3 (VKTWRMH).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 534-540 der Bande 3 (YETFSKL).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 538-544 der Bande 3 (SKLIKIF).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 543-549 der Bande 3 (IFQDHPL).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der im erfindungsgemässen Verfahren nützliche Antikörper ein Antikörper gegen ein Peptid mit den Resten 547-553 der Bande 3 (PLQKTYN).
Antikörper gegen z. B. Peptide 122-144, 812-830, 812-827, 588-602, 822-839, 538-554 und 853-870 können gemäss bekannten Standardverfahren hergestellt werden unter Verwendung der Peptide, hergestellt gemäss Standardverfahren zur Peptidsynthese. Polyklonale und monoklonale Antikörper sind im vorliegenden Verfahren nützlich. Monoklonale Antikörper, einschliesslich Nager, Kaninchen, Human, humanisiert, CDRgrafted und chimäre Antikörper sind bevorzugt und können mit bekannten Verfahren hergestellt werden. Die Antikörperproduktion ist z. B. beschrieben von Burton et al. (1994), Adv. Immunol. 57: 191; Canerari et al. (1993), Int. J. Biol. Markers, 8: 147; Zaccolo et al. (1993), Int. J. Clin. Lab. Res., 23: 192; Potter et al. (1993), Intl. Rev. Immunol., 10: 103; Kalsi et al. (1992), Autoimmunity, 13: 249; und Harlow et al. Herausgeber, (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York.
Die oben genannten Antikörper sind in der Lage, Bande 3 in Gewebeproben von Alzheimer-Patienten von Bande 3 in Gewebeproben von normalen, dem Alter entsprechenden Objekten zu unterscheiden. Geeignete Quellen für Gewebeproben schliessen cerebralen Cortex, Blut, Blutfraktionen, rote Blutzellen, rote Blutzellmembranen und weisse Blutzellen ein. Blutproben sind besonders bevorzugt.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird ein Antikörper, der in der Lage ist, Bande 3 von Alzheimer von normaler Bande 3 zu unterscheiden, mit einer Gewebeprobe eines Patienten, der unter Verdacht steht, Alzheimer zu haben, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, so dass ein Antigen- Antikörper-Komplex gebildet wird. Bei einer entsprechenden Kontrollprobe wird der gleiche Antikörper mit einer im Alter übereinstimmenden Kontroll- Gewebeprobe unter den gleichen Bedingungen in Kontakt gebracht. Die erhaltenen Antikörper-Antigen-Komplexe werden dann verglichen. Ein statistisch signifikanter Anstieg der Antikörperreaktivität in der Probe des unter dem Verdacht der Alzheimer-Erkrankung stehenden Patienten, relativ zu der Kontrollprobe ist für die Anwesenheit der Erkrankung indikativ. Wenn keine Antikörperreaktivität in der Kontrollprobe beobachtet werden kann, ist weiterhin eine positive Reaktivität in der Probe des unter dem Verdacht der Alzheimer-Erkrankung stehenden Patienten indikativ für die Anwesenheit der Erkrankung.
Mit "statistisch signifikant" ist eine 10-60%-ige Differenz an Antikörperreaktivität in einer Probe eines unter dem Verdacht der Alzheimer-Erkrankung stehenden Patienten relativ zu einer Kontrollprobe und/oder positive Reaktivität in einer Probe eines Patienten mit Alzheimer- Erkrankung und keine Antikörperreaktivität in einer Kontrollprobe gemeint.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird ein Antikörper, der in der Lage ist, die Bande 3 bei Alzheimer von einer normalen Bande 3 zu unterscheiden, mit der Gewebeprobe eines Patienten, der möglicherweise eine Alzheimer-Erkrankung aufweist, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, wobei ein Antikörper-Antigen-Komplex gebildet wird. Herkömmliche Verfahren, wie sie dem Fachmann bekannt sind, werden dann angewandt, um die Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes nachzuweisen.
Standard-Immunoassayverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können zur Antikörperbindung, zum Nachweis und zur Quantifizierung in dem vorliegenden Verfahren verwendet werden. Geeignete Immunoassays schliessen Festphasen- und Assays in Lösung, Radioimmunoassays, Western-Blots, Immunosorbentassays mit Enzymen, Immunofluoreszenzassays, Chemilumineszenzassays und Biolumineszenzassays ein. Assays, Bedingungen und Nachweisverfahren sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Nachweis der Alzheimer-Erkrankung zur Verfügung, umfassend den Nachweis der Phosphorylierungsmenge des Bande 3-Proteins oder der Abbauprodukte davon in einer ersten Gewebeprobe bei einem Patienten mit Verdacht auf Alzheimer- Erkrankung, und Vergleichen der Phosphorylierungsmenge des Bande 3-Proteins oder der Abbauprodukte davon, mit der Phosphorylierungsmenge des Bande 3- Proteins oder der Abbauprodukte davon in einer zweiten Gewebeprobe eines Gesunden, wobei statistisch signifikante Abnahmen der Phosphorylierung in der ersten Gewebeprobe relativ zu der Kontrollprobe indikativ für Alzheimer-Erkrankung sind. Wenn keine Phosphorylierung in der Kontrollprobe beobachtet wird, ist weiterhin dann eine positive Reaktivität in der Probe des Patienten mit Verdacht auf Alzheimer-Erkrankung indikativ für das Vorhandensein der Krankheit.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Gewebeproben cerebraler Cortex, Blut oder eine Fraktion davon, rote Blutzellen oder rote Blutzellmembranen.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass Bande 3 und dessen Fragmente eine verringerte Phosphorylierung bei der Alzheimer- Erkrankung aufzeigen.
Nachweis und Bestimmung der Phosphorylierung der Bande 3 und deren Fragmente können untersucht werden mittels dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren. Die Phosphorylierung kann z. B. nachgewiesen werden durch Beobachtung der Verschiebung des Molekulargewichts bei einem SDS-PAGE-Gel oder durch Untersuchung der Reaktivität mit Antiphosphotyrosin-Antikörpern.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Phosphorylierung nachgewiesen durch Inkubieren einer homogenisierten Gewebeprobe mit markiertem Phosphat, bevorzugt in Form von γ³²P-ATP, unter Bedingungen, bei denen das Phosphat in der Bande 3 durch ³²P ausgetauscht wird, und Nachweis und Quantifizierung des ³²P, das in die Bande 3-Proteine aufgenommen wurde. ³²P-markierte Bande 3 kann durch Immunoassay mit Anti-Bande 3-Antikörpern wie oben beschrieben nachgewiesen werden. Genaue Verfahren zum Nachweis der Phosphorylierung werden unten in Beispiel 2 dargestellt. Gemäss der vorliegenden Erfindung ist eine statistisch signifikante Abnahme der Phosphorylierung der Bande 3 oder von deren Abbauprodukte in einer Gewebeprobe eines Patienten, der unter Alzheimer-Verdacht steht, relativ zu einer altersmässig gleichen Kontrollprobe indikativ für eine Alzheimer- Erkrankung.
Es wurde in der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass Bande 3 des Hirns bestimmten Veränderungen bei Alzheimer-Erkrankung unterliegt, wie Unterschieden im Glucose- und Anionentransport, und dass diese Veränderungen begleitet werden von Veränderungen im peripheren Blut, wie unten in Beispiel 7 gezeigt.
Abgesehen von dem Bande 3-Protein wurde ebenfalls gefunden, dass andere Proteine, die ebenfalls altern, zur Unterscheidung von Gewebe bei Alzheimer-Erkrankung von normalem Gewebe verwendet werden können. Ein Beispiel für solch ein Protein ist das Glucosetransportprotein. Zum Beispiel Leberglucosetransportprotein (HEPG2) und insulinreguliertes Glucosetransportprotein (IRGT) und dergleichen. Weiterhin wurde gefunden, dass es Fragmente oder antigene Bereiche dieser Glucosetransportproteine gibt, die mit einem Antikörper einen Komplex bilden, der Alzheimer-Gewebe von normalen Gewebe unterscheidet, z. B. HEPG2-Reste (QGGASQSDKTPEELFHP) und IRGT-Reste (MPSGFQQIGSEDG). Als weiteres Beispiel wird ein IRGT-antigener Bereich dargestellt durch die Sequenz SQQLSGINAVFYYST. Somit kann irgendeines dieser Proteine anstelle der Bande 3-Proteine oder Fragmenten bei den oben beschriebenen Verfahren zur Unterscheidung zwischen Alzheimer- Gewebe und normalem Gewebe erfindungsgemäss verwendet werden.
Die folgenden Beispiele stellen die Erfindung weiter dar.

BEISPIEL 1

Antigene Veränderungen in Bande 3 beim Altern und bei der Alzheimer- Erkrankung in Hirnproben wurden durch Antikörper gegen Bande 3 und dessen Peptid und Abbauprodukte nachgewiesen.
Polyklonale Antikörper gegen die folgenden Peptide wurden erhalten oder in Kaninchen mittels Standardverfahren generiert:
Bande 3 und Abbauprodukte (Bande 3 Brk);
cytoplasmatisches Peptid der Bande 3 (Cyto);
Reste 812-827 des COOH&supmin;Terminus der Bande 3 (R812-827) gealterte Bande 3 vor der Bildung von SCA (980);
Tunnelpeptid des Glucosetransportproteins (Gluc) Reste 469-485 (QGGASQSDKTPEELFHP); und
Reste 812-830 des COOH&supmin;Terminus der Bande 3 (R812-827).
Mittelalte (7 Monate alt) und alte (12 bis 13 Monate alte) Mäuse wurden durch Überstrecken getötet. Das Gehirn wurde unter aseptischen Bedingungen entfernt und in eiskalten Homogenisierungspuffer gegeben (5 mM Hepes, 0,32 M Sucrose, 5,0 mM Imidazol, 5,0 mM Benzamidin, 0,3 mM EGTA, 0,5 mM MgSO&sub4;, 0,5 mM ZnSO&sub4;, 5,0 mM Glycerophosphat, 2,0 mM Mercaptoethanol, 0,1 mg/ml Aprotinin (Sigma), 0,1 mg/ml Leupeptin (Sigma), 0,05 mg/ml Pepstatin A (Sigma), pH 8,0). Das Gehirn wurde 5 Minuten mit einem "Tissue Tearor" (Brinkman) homogenisiert und einer differenziellen Zentrifugation für 8 Minuten bei 4ºC und 5.000 U/min in einer Sorvall RC-5B-Zentrifuge unterworfen. Der Überstand wurde abdekantiert und auf Eis gestellt, während das verbliebene Pellet weiter im Homogenisierungspuffer homogenisiert und bei den gleichen Einstellung zentrifugiert wurde. Nach dreimaliger Wiederholung wurden die Überstände für 30 Minuten bei 4ºC und 20.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in Homogenisierungspuffer, 10 mM ATP und 20% ultrareinem Glycerin resuspendiert und bei -70ºC für Immunodot und Phosphorylierungsassay gelagert.
Der Immunoassay wurde zum Vergleich der Bande 3, der veränderten Bande 3 und der Abbauprodukte der Bande 3 bei jungen und alten Mäusen und bei der Kontrolle und bei Patienten mit Alzheimer-Erkrankung verwendet. Kontrollen, bei denen entweder Membranen oder Bande 3-Antikörper weggelassen wurden, wurden bestimmt und waren die gleichen. Die Kontrollwerte wurden von den experimentellen abgezogen. Alle zu vergleichenden Proben liefen zur gleichen Zeit. Nitrocellulosemembranen wurden mit Hirnhomogenatprotein bei Konzentrationen im Bereich von 2 ng bis 18 ug pro Well getüpfelt. Die Membranen wurden für 45 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet und für 60 Minuten in einem Tris-gepufferten Salzlösung-(TBS)-Tween-Puffer, enthaltend 50 mM Trisma (pH 7,4), 0,1% Tween und 6,0% fettfreie Trockenmilch (NFDM), blockiert. Die Membranen wurden dreimal gewaschen, jeweils 1 Minute in TBS-Tween (Biorad)-Puffer und 6 Stunden mit einem polyklonalen Antikörper inkubiert. Jede Membran wurde dann viermal für 4 Minuten in TBS gewaschen. Nach einer letzten Waschung mit TBS-Tween für 10 Minuten wurden die Gefässe gewechselt und jede Membran wurde in TBS-Tween mit 6,0% NFDM inkubiert. Nach 1 Stunde wurden die Membranen in 140 ul ¹²&sup5;I-Protein A (Amersham) und 100 ml TBS-Tween für 2 Stunden inkubiert. Die Membranen wurden viermal 5 Minuten jeweils in TBS- Tween gewaschen und dann zweimal für 30 Minuten. Die nassen Membranen wurden entlang der Gittermarkierung für die cpm-Bestimmung mit einem Gamma- Zähler (Beckman) geschnitten. Alle Bestimmungen wurden dreifach durchgeführt.
Die Ergebnisse der Immunoblotassays sind in Tabelle 1 dargestellt. TABELLE 1 Antigene Veränderung beim Altern und in AD-Hirn, nachgewiesen durch Antikörper gegen Bande 3 und dessen Abbauprodukte, gealterte Bande 3, synthetische Peptide der Bande 3, synthetisches SCA-Peptid oder ein Glucosetransportkanalpeptid (GLUC)
MA: mittleres Alter, C: im Alter übereinstimmende Kontrolle; AD: Alzheimer- Erkrankung; Ergebnisse dargestellt als cpm; *P ≤ 0,0001, +P ≤ 0,01, ND: nicht durchgeführt. Die Antikörper gegen synthetische Peptide der Bande 3 wurden reagiert mit Hirngewebe von jungen behandelten und unbehandelten Mäusen. CYTO, Antikörper gegen ein cytoplasmatisches Peptid der Bande 3, Reste 122-144; BD3-BRK: Antikörper, der Bande 3 und dessen Abbauprodukte erkennt; 980: Antikörper gegen gealterte Bande 3 vor der Bildung von SCA (SCA); 812-827 und 812-830: Antikörper gegen diese Peptidreste vom Carboxylende der Transportdomäne der Bande 3; GLUC: Antikörper gegen ein Kanalpeptid des Glucosetransportproteins.
Die Daten der Tabelle 1 zeigen, dass eine Zunahme im Bande 3-Abbau mit dem Alter assoziiert ist. Die Daten zeigen weiterhin, dass die Bindung der Antikörper 980 und 812-830 an Membranen der Alzheimer-Erkrankung signifikant erhöht ist, relativ zu der Bindung an normale Hirnmembranen. Diese Antikörper 980 und 812-830 unterscheiden Alzheimer-Erkrankung von normalem Hirngewebe.
Immunodots unter Verwendung der Antikörper Cyto, Bande 3 Brk, 980 und Gluc wurden ebenfalls auf rote Blutzellmembranen, erhalten aus Blutproben von Alzheimer-Patienten und normalen, altersentsprechenden Kontrollen, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 1A bis 1D grafisch dargestellt. Wie in Fig. 1C gezeigt, ist der Antikörper 980 ebenfalls in der Lage, zwischen Blutproben, erhalten von normalen und Alzheimer- Patienten, zu unterscheiden.

BEISPIEL 2

Das folgende Beispiel zeigt, dass sich die Bande 3-Phosphorylierung bei Alzheimer-Erkrankung gegenüber normalen Kontrollen mit entsprechendem Alter verändert. Die Phosphorylierung wurde durch Quantifizieren der Menge an ³²P-Bindung an Bande 3 in Membranen von lysierten Zellen unter Verwendung einer SDS-PAGE verglichen.
Die Phosphorylierungsreaktion wurde durchgeführt durch Vermischen von 100 ug Hirnhomogenat in 50 ul Homogenisierungspuffer mit 70 ul 200 mM Tris- HCl, pH 7,6, enthaltend Proteinkinase A-Inhibitor mit einer Endkonzentration von 100 ug/ml (Sigma), 200 mM MgSO&sub4;, 2 mM Ethylendinitrilo-tetraessigsäure-Dinatriumsalz (EDTA), 0,138 mM 2-Mercaptoethanol und γ³²P ATP, 0,15 mM (37 GBq/mmol) (ICN), und Inkubieren für 12 Minuten bei 37ºC. Am Ende der Phosphorylierungsreaktion wurden die Proben mit 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 6,8), enthaltend 40% Glycerin und 25 mM EDTA, verdünnt. 50 ug einer jeden Probe (75 ul) wurden auf ein 6 bis 23% Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE)-Gel geladen und konnten für 2 Stunden bis auf 2 cm vom unteren Gel aus gesehen laufen. Bande 3 wurde identifiziert durch Antikörper/Alkaliphosphatase-Färbung mit einem Immunoblot (Western-Blot). Ein Western-Blot wurde auf einer mikroporösen Polyvinylidendifluorid-Membran (PVDF: Millipore) bei 28 Amp for 22 Stunden durchgeführt. Nach Beendigung des Transfers wurde die Membran dreimal für jeweils 15 Minuten in einer Tris-Puffer-Salzlösung (TBS), enthaltend 50 mM Trisma-Base, 3% Fischgelatine, 0,1% Tween 20, gewaschen und anschliessend für 1 Stunde mit einem polyklonalen Antikörper gegen Bande 3-Peptidrest 812-827, verdünnt in TBS, inkubiert. Die PVDF- Membran wurde dann dreimal 5 Minuten in TBS gewaschen und für 1 Stunde in 50 ul Ziege-Anti-Kaninchen-alkalischer Phosphatase (Zymed), 0,1% Magnesium- und Zinkchlorid, verdünnt in TBS, inkubiert. Die Membran wurde wieder dreimal für jeweils 5 Minuten in 50 mM Tris (pH 7,4), 0,1% Tween 20 gewaschen. Die markierten Antikörper gegen Bande 3 wurden identifiziert durch Inkubieren der Membran in 2,5%- Diethanolamin, 0,3% 5-Brom-4-chlor- 3-indolyl-β-D-galactosid, 0,7% p-Nitroblau-tetrazoliumchlorid, bis die Farbe gerade beginnt, sich zu entwickeln. Radioaktiv phosphorylierte Proteine wurden identifiziert durch Belichten der Membran in einer Belichtungspluskassette bei -70ºC für 24 Stunden.
Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass die Phosphorylierung bei älteren Mäusehirnen im Vergleich zu mittelalten und jungen Mäusehirnen erniedrigt war (Fig. 2). Weiterhin war die Phosphorylierung der Bande 3 und Fragmenten davon bei Alzheimer-Erkrankung gegenüber Kontrollen im Vergleichsalter erniedrigt (Fig. 3). Die unterschiedliche Bande 3- Phosphorylierung, beobachtet bei der Alzheimer-Erkrankung, tritt an Tyrosinresten auf.
Die Phosphorylierung der Bande 3 wurde ebenfalls durch Quantifizieren der Menge an ³²P-Bindung an Bande 3 in den Membranen von lysierten Blutzellen unter Verwendung von SDS-PAGE verglichen, wie für Hirngewebe beschrieben. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass die Phosphorylierung bei roten Blutzellen bei Alzheimer-Erkrankung erniedrigt ist im Vergleich zu Kontrollen mit vergleichbarem Alter (Fig. 4).
Wie bei den Ergebnissen beim Hirn, ist die Erniedrigung der Phosphorylierung der Bande 3/Bindung von ³²P an rote Blutzellen aufgrund einer erhöhten Phosphorylierung in vivo (d. h. innerhalb des Moleküls), so dass weniger Stellen für ³²P-Markierung übrig blieben. Fig. 4A zeigt die Bindung von Anti-Phosphotyrosin-Antikörpern an Bande 3 in Frontal- Gyrushirnmembranen oder mittelalten RBC-Membranen aus AD und Kontrollen.

BEISPIEL 3

Das folgende Beispiel zeigt in vitro-Studien mit Antikörpern, die zwischen Alzheimer-Erkrankung und Kontroll-Hirngewebe unterscheiden.
Hirngewebe wurde erhalten von Dr. J. Rogers, Sun City Research, Phoenix, Arizona, und von Dr. Bosman, Department of Biochemistry, Medizinische Fakultät der Universität Nijmwegen, Holland.
Der Immunodotassay mit Antikörpern gegen Bande 3, wie oben beschrieben, wurde durchgeführt wie in den Beispielen gezeigt und wie von Cover et al. (1996), Life Sci., 58: 655-664, beschrieben. Nitrocellulosemembranen wurden mit homogenisiertem Hirnprotein mit Konzentrationen von 2 ng und 18 ug pro Well betüpfelt. Die Membranen wurden getrocknet, blockiert und für 6 Stunden mit polyklonalem Antikörper gegen Bande 3 inkubiert. Die Membranen wurden gewaschen und in 140 ul (0,14 uCl/ml) 1251-Protein A (spezifische Aktivität: 37 MBq; 0,100 mCi/ml; Amersham) in 100 ml TGS-Tween for 2 Stunden inkubiert. Die gewaschenen Membranen wurden unter Verwendung eines Gamma-Zählers (Beckman) entlang ihrer Gitterlinien zur cpm-Bestimmung geschnitten.
Die Ergebnisse der Immunodotassays sind in Fig. 5 und 6 gezeigt. Fig. 5 zeigt, dass der Antikörper 980 zwischen Alzheimer-Erkrankung und normalen Hirnmembranen unterscheiden kann. Fig. 6 zeigt die Bindung von Antikörpern gegen Bande 3 und gegen gealterte Bande 3. Antikörper 980 erkennt ein Hauptanionentransportsegment der Bande 3 (ANION 2; Kay (1990) FASEB J., 5: 109-115). ANION 2, Reste 588-602, ist ein internes Segment der Bande 3, an die der Antikörper 980 stark bindet. Fig. 6 zeigt ebenfalls eine geringe Bindung des Antikörpers 980 an COOH, aber nicht an ANION 1. Die Antikörper 980-Erkennung von ANION 2 legt nahe, dass die Änderung der Bande 3, die der Bildung von SCA vorangeht, in oder in der Nähe von ANION 2, Reste 588-602, erfolgt.

BEISPIEL 4

Das folgende Beispiel zeigt, dass Antikörper gegen Bande 3 zwischen Alzheimer-Erkrankung und Kontroll-Temporalcortex und zwischen Alzheimer- Erkrankung und Kontrollroten Blutzellen unterscheidet.
Antikörper gegen synthetische Peptide der Bande 3 unterscheiden Bande 3-Proteine in Hirnmembranen von Normalen von denen von AD-Patienten. Einer von diesen, ein Antikörper gegen Bande 3·synthetisches Peptid pep-COOH weist ein Triplett im Bereich von 60.000-70.000 Dalton im Gehirn von Patienten mit AD, aber nicht. von Kontrollen im gleichen Alter nach (siehe Saitoh et al. (1992), Ann. NY Acad. Sci., 67480-192). Antikörper gegen pep-COOH wurden zur immunohistochemischen Analyse von AD und normalem Temporalcortex verwendet. Pep-COOH&supmin;Antikörper wurden verwendet, da COOH eine Komponente von alterndem Zellantigen ist. Pep-COOH&supmin;Antikörper färbt Neuronen in normalem Cortex nur schwach. Nur einige grössere Neuronen waren stark positiv. Bei AD ist die Zahl von mit Antikörpern gegen pep-COOH markierten Neuronen auf bis zu 260% erhöht (p ≤ 0,01). Aufgrund des 50%-igen neuronalen Verlusts bei AD im Vergleich zu Kontrollen (p ≤ 0,002), war der Anteil an Neuronen, die pep-COOH&supmin;positiv waren, auf 540% erhöht. In AD wurden Antikörper gegen pep-COOH&supmin;markierte Glialzellen gefunden, die sich um die Plaques befanden. Dies legt nahe, dass die Bande 3 in normalen Neuronen in vorwiegend ungeschnittenem Zustand vorkommt und dass der Abbau von Bande 3 bei AD erfolgt, so dass eine Bindung von Antikörper gegen pep-COOH erfolgen kann.
Fig. 7A zeigt, dass es einen signifikanten Unterschied in der Bindung zu AD und Kontrollhirnen bei einer Anzahl von Antikörpern gegen Bande 3, einschliesslich AD-BD3 und COOH, gibt, diese erkennen Peptidabbauprodukte der Bande 3 und gealterter Bande 3 (p ≤ 0,001).
Zusätzlich zur Unterscheidung von AD- von Normalhirn unterscheiden einige Anti-Peptid-Antikörper AD- von Normal-RBC. Seren wurden auf Antikörper gegen Bande 3, Reste 538-554, 588-602, 812-827, unter Verwendung einer ELISA gescreent. Diese synthetischen Peptide duplizieren Schlüsselsequenzen von relevanten Teilen des Bande 3-Moleküls [Kudrycki & Shull (1989), J. Biol. Chem., 264: 8185-8194], der ELISA wurde im wesentlichen wie von Bennet & Kay (1981), Exp. Hematol., 9: 297-307, beschrieben, durchgeführt. Peroxidase-konjugiertes Ziege-Anti-Maus-Immunglobulin wurde als zweiter Antikörper verwendet. Peptid-Antigene wurden in 0,2 M Carbonat- Puffer mit 1 mg/ml gelöst und 100 ug pro Well wurden zur Beschichtung der Platten verwendet. Nach dem Trocknen über Nacht bei 37ºC wurden die Platten dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0,5% Tween 20 (PBST), gewaschen und anschliessend mit Blockierungspuffer, 0,01% Gelatine (Schweinehaut) in PBST für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Schüttler gequericht. Die Platten wurden dann dreimal mit PBST gewaschen und für 1 Stunde mit Mausserum, seriell verdünnt mit Blockierungspuffer mit einer Anfangsverdünnung von 1 : 40 bis zu einer Endverdünnung von 1 : 5, inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und für 1 Stunde mit Meerrettichperoxidasekonjugiertem Ziege-Anti-Maus-IgG und IgM (schwere und leichte Kette) (Caltag) bei einer Verdünnung von 1 : 6400 im Blockierungspuffer inkubiert. Nach Waschen mit PBST wurden 0,03% 2-2' ANZO-bis(3-ethylbenzthiazolin-6- sulfonsäure)-Diammoniumsalz in 0,1 M Citratpuffer (pH 4,0) mit 0,01% H&sub2;O&sub2; zu den Wells gegeben. Die Platten wurden bei 405 nm in einem BioRad 3559- Mikroplatten-Lesegerät (BioRad Laboratories, Richmond, CA) nach 30 Minuten gelesen.
Der "Dot-Blot"/Tmmunodotassay wurde verwendet, um Bande 3, gealterte Bande 3, Anti-Peptid-Antikörper und Bande 3-Abbauprodukte in roten Blutzellen von Individuen mit AD und Kontrollen entsprechenden Alters zu vergleichen. Es bestand ein signifikanter Unterschied zwischen roten Blutzellmembranen von Patienten mit AD und den Ehegatten, die als Kontrolle verwendet wurden, wenn sie mit dem folgenden Antikörper reagierten: AD-BD3 (p ≤ 0,04) (Fig. 7A).
Es bestand auch signifikante Unterschiede zwischen roten Blutzellmembranen von Patienten mit Alzheimer-Erkränkung und den Ehegatten, die als Kontrolle verwendet wurden, wenn sie mit den folgenden Antikörpern reagierten: BD3-BRK (p ≤ 0,01), einem Glucosekanalprotein (p ≤ 0,05) und pep-CYTO. Somit treten die gleichen Bande 3-Veränderungen in Erythrozyten und Hirn auf (Fig. 7B bis 7C).

BEISPIEL 5

Das folgende Beispiel zeigt, dass Anti-SCA-monoklonale Antikörper zwischen Alzheimer-Erkrankung und Kontroll-Hirngewebe unterscheiden können.
Natürlich vorkommende B-Zellen in peripherem Blut von normalen Spendern, die Antikörper gegen SCA-Peptid ANION 1 und COOH herstellen, wurden mit Maus-P3X63-AG8.653-Myelomazellinie fusioniert, um Heterohybridome herzustellen. Eine Anzahl von Heterohybridomen, die gegen Erythrozyten-SCA gescreent wurden, unterschieden AD von Kontroll-Hirn (Fig. 8 und 9) und AD von Kontroll-Erythrozyten (siehe unten). Einige dieser Monoklonalen zeigten erhöhte Bindung zu AD-Gewebe, während andere eine erhöhte Bindung zu Kontrollgewebe zeigten.
Dies legt nahe, dass (a) AD-Gewebe einige Antigen-Bereiche oder Kombinationen von Bereichen, die in normalem Gewebe enthalten sind, fehlen und (b) AD-Gewebe einige zusätzliche Antigen-Bereiche oder Kombinationen erworben hat, die normalem Gewebe fehlen. Dies zeigt, dass normale humane B-Zellen Antikörper gegen SCA produzieren. Diese Antikörper benötigen T-Zellen-Hilfe, welches nahelegt, dass die altersbedingte Abnahme der Immunfunktion zur AD beitragen kann. Zusätzlich legt die Tatsache, dass B-Zellen von normalen Menschen Antikörper herstellen, die zwischen AD-Bande 3 und der von Kontrollen unterscheiden können, nahe, dass Veränderungen bei AD vorliegen, die die Erkennung durch ein gesundes Immunsystem initiieren, und andere, die blocken. Dies unterstützt eine immunologische und/oder Autoimmunkomponente gegenüber AD.

BEISPIEL 6

Dieses Beispiel zeigt dass Antikörper gegen Bande 3 und synthetische Peptide der Bande 3 zwischen Alzheimer-Erkrankung und normalem Kontroll- Hirn in Gewebeschnitten unterscheiden kann.
Immunoelektronenmikroskopie wurde auf geätzten Schnitten von AD und Kontroll-Hirngewebe, reagiert mit Anti-Peptid-Antikörper oder Präimmun- Kaninchenserum, durchgeführt. Antikörperbindung wurde mit Protein Akonjugierten Goldkolloiden dargestellt (Fig. 10). Antikörper gegen pep-COOH und ein Glucosetransportkanalprotein, reagiert mit AD aber nicht mit Kontroll-Hirngewebe. Normales Kaninchenserum reagiert nicht mit AD oder Kontrollgewebe.

BEISPIEL 7

Dieses Beispiel zeigt die Unterschiede, beobachtet bei Glucose- und Anionentransport zwischen 10 Individuen mit Alzheimer-Erkrankung und 10 Kontrollen im entsprechenden Alter.
Anionen- und Glucosetransportunterschiede können in peripherem Blut durch allgemein bekannte Verfahren nachgewiesen werden. Messungen der Sulfataufnahme können z. B. durchgeführt werden bei mittelalten Erythrozyten nach Trennung mit Percoll-Gradienten, wie von Cover et al. (1996), Life Sciences, 58: 655-664, beschrieben. Erythrozyten wurden intensiv in Influxpuffer gewaschen (300 mM Sucrose, 10 mM Trisma, pH 7,0), um externes und intrazelluläres Chlorid zu entfernen. Nachdem die Zellen in Influxpuffer resuspendiert wurden, wurden 2 · 108 Zellen in Borsilicat-Kulturröhrchen gegeben, für den Assay, der in dreifacher Form durchgeführt wurde, bei fünf Sulfat (Substrat)-Konzentrationen. Vor Zugabe entsprechender Substratkonzentrationen wurden die Zellen für 10 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach entsprechenden Zeitintervallen wurden 100 ul Substratcocktail (400 mM K&sub2;SO&sub4;, 0,25 mCi Na&sub2;³&sup5;SO&sub4;) oder eine der fünf entsprechenden seriellen Verdünnungen (200, 100, 50 und 25 mM K&sub2;SO&sub4;) zu dem entsprechenden Zellsuspensionsröhrchen gegeben, so dass die Endsubstratkonzentrationen 40, 20, 10, 5 bzw. 2,5 mM betrugen. Nach Inkubieren bei 37ºC für genau 5 Minuten wurden 0,5 ml der Zellsuspension extrahiert und zu 9,0 ml eiskaltem Waschpuffer gegeben (1,15 KCl, 10 mM MOPS, pH 7,4). Die Zellen wurden anschliessend dreimal mit Waschpuffer gewaschen, zentrifugiert und alle Überstände verworfen. Die Zellpellets wurden mit 0,8 ml 10%-iger Trichloressigsäure deproteiniert, zentrifugiert und 600 ul des Überstandes aus jedem Röhrchen wurden zu 5,0 ml Opti-Fluor-Szintillationscocktail zur Bestimmung der β-Emission gegeben. Die Sulfataufnahmeraten wurden als nmol/108 Zellen/min ausgedrückt.
Die Messungen zur Aufnahme der D-Glucose wurden mit mittelalten mit Percollgradienten getrennten, peripheren Erythrozyten durchgeführt. Die Erythrozyten wurden intensiv mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) zum Entfernen von externer und intrazellulärer Glucose gewaschen. Nachdem die Zellen in Phosphatpuffer resuspendiert worden waren, wurden 2 · 108 Zellen in Borsilicat-Kulturröhrchen gegeben und auf Eis für den Assay, der jeweils dreimal bei fünf D-Glucose (Substrat)-Konzentrationen durchgeführt wurde, gegeben. Bei entsprechenden Zeitintervallen wurden 100 ul des Substratcocktails (20 mM D-Glucose, 0,3 mci D-3H-Glucose) oder eine der vier entsprechenden seriellen Verdünnungen (10, 5, 2,5 und 1,25 mM D-Glucose) zu den entsprechenden Zellsuspensionsröhrchen gegeben, so dass die Endsubstratkonzentrationen 2, 1, 0,5, 0,25 bzw. 0,125 mM betrugen. Nach Inkubation bei 0ºC für exakt 5 Minuten wurden 0,5 ml der Zellsuspension extrahiert und zu 9,0 ml eiskaltem Stopp-Puffer (20 mM Phosphatpuffer, 0,1 mM Phloretin, pH 7,4) gegeben. Die Zellen wurden anschliessend dreimal mit Stopp-Puffer gewaschen, zentrifugiert und der gesamte Überstand verworfen. Die Zellpellets wurden mit 0,8 ml 10%-iger Trichloressigsäure deproteiniert, zentrifugiert und 600 ul des Überstandes eines jeden Röhrchens wurden zu 5,0 ml Opti-Fluor-Szintillationscocktail zur Bestimmung der β-Emission gegeben. D-Glucose-Aufnahmeraten wurden ausgedrückt als pmol/108 Zellen/min.
Die Anionen- und Glucosetransporte der Erythrozyten von AD-Patienten waren konsistent geringer als die von entsprechenden Kontrolläufen beim selben Experiment. Aufgrund der kleinen Probengrösse und der Variabilität zwischen den Individuen wurden die Daten als Patiententransport relativ zu der Kontrolle analysiert, welche normalerweise der Ehepartner war. Unterschiede im Vmax und Km des Glucosetransports waren statistisch signifikant (p ≤ 0,04 bzw. 0,03; Tabelle 2). Anionentransportunterschiede waren ebenfalls statistisch signifikant für Vmax (p ≤ 0,001) und Km (p ≤ 0,04; Tabelle 2).
Die Sulfataufnahmerate in Erythrozyten, Hirn und Lymphozyten nahm mit dem Alter ab (d. h. der Anionentransport nahm ab). Insbesondere der Anionentransport durch Milzlymphozyten nahm mit dem Alter um 24% ab (p ≤ 0,005 für mittelalte im Vergleich zu alten Mäusen; 30% für junge im Vergleich zu alten Mäusen, p ≤ 0,001). Siehe Beispiel 10.
Somit zeigen RBC von Individuen mit Alzheimer-Erkrankung verringerte Wirksamkeit beim Anionen- und Glucosetransport und eine Verringerung in der Zahl der Anionen- und Glucosebindungsstellen (Km) im Vergleich zu den Ehepartnern und Kontrollen im entsprechenden Alter. Der Anionentransport in den Lymphozyten nahm mit dem Alter ebenfalls ab. TABELLE 2
¹ Vmax, mmol/108 Zellen/min. Km, mM 2 Vmax, mmol/108 Zellen; Km, mM
³ Die statistische Analyse (p-Wert) basierte auf dem Vergleichswert von Patienten-Transport zu Kontroll-Transport für jedes Experiment. Die Kontrolle war normalerweise der Ehepartner, um Umwelteinflüsse zu kompensieren.

BEISPIEL 8

Dieses Beispiel zeigt, dass Anti-SCA-monoklonale Antikörper unterscheiden können zwischen roten Blutzellen bei Alzheimer-Erkrankung und Kontrollen. Eine Zahl von Heterohybridomen, wie in Beispiel 5 beschrieben, unterscheiden Alzheimer-Erkrankung von Kontroll-Erythrozyten (Fig. 11) Einige monoklonale Antikörper reagierten mit Alzheimer-Erkrankung, während andere mit Kontrollen roter Blutzellen reagierten.

BEISPIEL 9

Dieses Beispiel zeigt, dass Serum-Autoantikörper gegen Bande 3- Peptide 588-602 und 822-839 in Alzheimer-Patienten im Vergleich zu den Kontrollen leicht erhöht sind.
Natürlich vorkommende Autoantikörper wurden gegenüber altersbedingtem Zellantigen in Humanserum mit einem ELISA während des Alterns quantifiziert, um zu bestimmen, ob diese Antikörper mit AD zunehmen. Natürlich vorkommende Autoantikörper können ebenfalls nachgewiesen oder quantifiziert werden durch Reaktion mit bekanntem Gewebe von Alzheimer-Erkrankung, z. B. Hirn.
Serum-Autoantikörper gegen Bande 3-Peptide 588-602 und 822-839 waren bei AD-Patienten im Vergleich zu Kontrollen erhöht (two-tailed t test p ≤ 0,06; Fig. 12). Es wird angenommen, dass die Signifikanz zunimmt, wenn die Probengrösse zunimmt. Diese Bande 3-Reste liegen in Anionentransport/Bindungsregionen. Dies ist konsistent mit den Änderungen dieser Region bei AD, da diese als im Antigen unterschiedliche durch das Patientenimmunsystem erkannt wird. Dies ist konsistent mit der beobachteten Abnahme beim Anionentransport (Beispiel 7). Auftreten von Autoantikörpern gegen 588-602- Region ist konsistent mit den Daten, die aufzeigen, dass dieses eine "dem Altern zugängliche Stelle" ist.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Alzheimer-Erkrankung, umfassend:

(a) In-Kontakt-Bringen einer Blutprobe oder einer Fraktion davon, roten Blutzellen, roten Blutzellmembranen oder weissen Blutzellen, enthaltend Bande 3 aus einem Patienten, der unter dem Verdacht steht, Alzheimer-Erkrankung zu haben, mit einem Antikörper, der die Bande 3 von Alzheimer von einer normalen Bande 3 unter Bedingungen unterscheidet, die dazu führen, einen Komplex zwischen diesem Antikörper und Bande 3 zu bilden;

(b) Nachweis des Komplexes;

(c) In-Kontakt-Bringen einer Blutprobe oder einer Fraktion davon, roten Blutzellen, roten Blutzellmembranen oder weissen Blutzellen, enthaltend Bande 3 von einem Gesunden, mit einem Antikörper, der Bande 3 der Alzheimer-Erkrankung von einer normalen Bande 3 unterscheidet, und Inkubieren für eine ausreichende Zeit, so dass sich ein Komplex zwischen dem Antikörper und Bande 3 bilden kann, wenn überhaupt; und

(d) Vergleichen der Menge an in Schritt (b) gebildetem Komplex mit dem in Schritt (c) gebildeten Komplex, eine statistisch erhöhte Menge an in Schritt (b) gebildetem Komplex relativ zu Schritt (c) zeigt das Vorhandensein von Alzheimer-Erkrankung an.

2. Verfahren zum Nachweis der Alzheimer-Erkrankung, umfassend

(a) In-Kontakt-Bringen einer Blutprobe oder einer Fraktion davon, roten Blutzellen, roten Blutzellmembranen oder weissen Blutzellen, enthaltend Bande 3 eines Patienten, der unter dem Verdacht steht, eine Alzheimer-Erkrankung zu haben, mit einem Antikörper der Bande 3 der Alzheimer-Erkrankung von einer normalen Bande 3 unter Bedingungen unterscheidet, die einen Komplex mit diesem Antikörper und Bande 3 ausbilden können; und

(b) Nachweis des Komplexes.

3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper der Antikörper 980 ist.

4. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper der Antikörper AD-BD3 ist.

5. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper mit den Peptiden 812-827 der Bande 3 komplexiert.

6. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper mit den Peptiden 812-830 der Bande 3 komplexiert.

7. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper mit den Peptiden 822-839 der Bande 3 komplexiert.

8. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper mit den Peptiden 853-870 der Bande 3 komplexiert.

9. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper mit den Peptiden 538-554 der Bande 3 komplexiert.

10. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper mit den Peptiden 588-602 der Bande 3 komplexiert.

11. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper mit den Peptiden 469-485 der Bande 3 komplexiert.

12. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper mit einer Mischung von Peptiden 538-554 und 812-827 der Bande 3 komplexiert.

13. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper mit einer Mischung der Peptide 588-602 und 812-827 der Bande 3 komplexiert.

14. Verfahren zum Nachweis der Alzheimer-Erkrankung, umfassend

(a) Bestimmung der Menge der Phosphorylierung des Proteins der Bande 3 oder der Abbauprodukte davon in einer ersten Gewebeprobe eines Patienten, der unter dem Verdacht steht, Alzheimer-Erkrankung zu haben,; und

(b) Vergleichen der Menge dieser Phosphorylierung des Proteins der Bande 3 oder der Abbauprodukte davon mit der Menge an Phosphorylierung des Proteins der Bande 3 oder der Abbauprodukte davon in einer zweiten Gewebeprobe eines Kontroll-Gesunden; wobei statistisch erniedrigte Phosphorylierung in der ersten Probe indikativ ist für eine Alzheimer- Erkrankung.

15. Verfahren gemäss Anspruch 14, wobei die Gewebeprobe Gehirngewebe, Blut oder eine Fraktion davon, rote Blutzellen, rote Blutzellmembranen oder weisse Blutzellen ist.