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WO2001007475A1 - Novel peptides - Google Patents

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WO2001007475A1
WO2001007475A1 PCT/JP2000/004907 JP0004907W WO0107475A1 WO 2001007475 A1 WO2001007475 A1 WO 2001007475A1 JP 0004907 W JP0004907 W JP 0004907W WO 0107475 A1 WO0107475 A1 WO 0107475A1
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WO
WIPO (PCT)
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amino acid
peptide
compound
group
pharmaceutically acceptable
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2000/004907
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kenji Kangawa
Masayasu Kojima
Hiroshi Hosoda
Hisayuki Matsuo
Yoshiharu Minamitake
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Individual
Original Assignee
Individual
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Priority to DE60035502T priority patent/DE60035502T2/de
Priority to US09/959,577 priority patent/US7385026B1/en
Priority to AU60231/00A priority patent/AU784035B2/en
Priority to DK00946453T priority patent/DK1197496T3/da
Priority to BRPI0012688A priority patent/BRPI0012688B8/pt
Priority to JP2001512558A priority patent/JP3471780B2/ja
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a novel peptide having an action of increasing intracellular calcium concentration or an activity of inducing the secretion of growth hormone, characterized in that the amino acid in the peptide is modified.
  • the present invention also provides a method for obtaining and producing the novel peptide, a gene encoding the peptide and a precursor of the peptide, and production of the peptide and a precursor of the peptide using the gene. About the method.
  • the present invention relates to a structural analog of the novel modified peptide disclosed by the present invention, which binds to a growth hormone secretion-inducing compound receptor to increase intracellular calcium concentration or growth hormone secretion-inducing activity. And a method for producing the same.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition containing the peptide or the peptide analog as an active ingredient, a growth promoter for animals, or an antibody of the peptide or a method of using the same. Background art
  • GH Growth hormone
  • GHRH growth hormone-releasing hormone
  • somatostatin J. Kendrew, et al., Eds., The Encyclopedia of Molecular Biology (Blackwel 1 Science Ltd. , London, 1994), p.462].
  • GHRH growth hormone-releasing hormone
  • somatostatin J. Kendrew, et al., Eds., The Encyclopedia of Molecular Biology (Blackwel 1 Science Ltd. , London, 1994), p.462].
  • GH is not just a catalyst for growth, It also has the effects of promoting protein synthesis, stimulating the transfer of stored fat, and increasing the content of daricogen in muscle.A decrease in GH secretion causes dwarfism, and an excess secretion causes giantosis or acromegaly [ Ed. Yasugi Ryuichi et al., Iwanami Biology Dictionary, 4th Edition (Iwanami Shoten, Tokyo, 1997), p. 757].
  • GH Since human GH has been produced by genetic engineering technology, GH has been used in the treatment of dwarfism [J. 0. Jorgensen, Endocr. Rev. 12, 189 (1991)], as well as in other diseases. And various effects have been found [J. 0. Jorgensen, et al., Horm. Res. 42, 235 (1994)]. For example, activation of osteoblasts and bone remodeling in normal individuals [K. Brixen, et al., Miner. Res. 5, 609 (1990)], enhancement of muscle mass and strength in adults with GH deficiency [RC Cuneo, et al., J. Apl. Physiol.
  • GH recombinant GH
  • Administration of recombinant GH is effective in promoting growth in children and normalizing metabolic and functional deficits associated with GH deficiency in adults, but has dose-limiting side effects, inability to administer orally, and cost (BA Lefker, et al., In Growth Hormon Secretagogues in Clinical Practoce, BB Bercu and RF Walker, Eds. (Marcel Dekker, Inc., New York, 1998), p. 107-p.108].
  • Many adult patients cannot continue GH treatment due to side effects such as joint pain and carpal tunnel syndrome, which may be due to excessive sodium and fluid retention [E. Corpas, et al., Endocr. Rev. 14, 20 (1993)].
  • the pulsatility of GH secretion in vivo is basically established by the interaction of two regulatory factors derived from the hypothalamus: GHRH and somatosustin act on the pituitary gland to regulate GH secretion.
  • GHRH and somatosustin act on the pituitary gland to regulate GH secretion.
  • GHRH and somatosustin act on the pituitary gland to regulate GH secretion.
  • normal GH secretion patterns differ between day and night, and at night. More GH is released more frequently.
  • the amplitude of the GH release pulse is further regulated by various steroid hormones, neurotransmitters, feedback from GH and insulin-like growth factor, nutritional status, sleep and exercise [JS Strobl and MJ Thomas, Pharmacol Rev. 46, 1 (1994)].
  • GH secretion-inducing activity a number of compounds with GH secretion-inducing activity have been synthesized, and their structure-activity relationships, pharmacology, and clinical applications as growth hormone secretagogues (GHS) was energetically studied.
  • a peptide such as GHRP-6 (Growth Hormone-Releasing hexapeptide) was synthesized and developed as a therapeutic agent due to GH deficiency or reduction (CY Bowers, et al., Endocrinology 114, 1537-1545 (1984). )].
  • GHRP-6 Crowth Hormone-Releasing hexapeptide
  • these peptide compounds are not available intravenously.
  • This G protein-coupled system has a cell membrane seven-passage receptor, produces CAMP as a second messenger, and a cAMP system and inositol-1,4,5-triphosphate (IP3) diasylglycerol (DG) inositol Ruphospholipids are divided into signaling systems.
  • cAMP activates cAMP-dependent kinase (A-kinase), causing phosphorylation of serine-threonine residues of functional proteins and modifying their activity.
  • IP3 binds to the IP3 receptor on the endoplasmic reticulum and promotes the release of calcium ions
  • DG activates C kinase to promote the onset of actions such as hormones.
  • GHS synergistically affects GH secretion of GH and increases intracellular cAMP levels [K. Cheng, et al., Endocrinology 124, 2791-2798 (1989)], and binding of GHRH to receptor Yuichi Produces cAMP as a second messenger, whereas GHS causes an increase in intracellular calcium ion levels, suggesting that the mechanism of action of GHS is different from that of GHRH [J. Herrington and B. Hilie, Endocrinology 135, 1100-1108 (1994).], It was assumed that GHS binds to a different receptor than the GHRH receptor to which GHRH binds.
  • GHS receptor The receptor gene to which GHS binds was actually cloned, and the results of Northern analysis showed that GHS receptor (HIS-R) was expressed in the hypothalamus and pituitary gland. It has been shown that the amino acid sequence of R shows 90 or more identity [AD Howard, et al., Science 273, 974-977 (1996)]. However, an endogenous ligand that binds to GHS-R has not been isolated, and this GHS-R was Ophan Van Recept, whose ligand is unknown.
  • Fatty acids such as myristic acid, geranilic acid, palmitoyl acid, or pharmacosylic acid may bind to the amino terminus of the protein or to the side chains of the amino acid residues that constitute the protein.
  • the role of these fatty acids is that of these fatty acids. It consists in anchoring the modified protein to the cell membrane [J. Kendrew, et al., Eds., The Encyclopedia of Molecular Biology (Blackwell Science Ltd., London, 1994), p.616].
  • the fatty acid is bonded to the cysteine residue by an S-acyl bond
  • the fatty acid is bonded to the serine residue by a 0-acyl bond as in the endogenous GHS disclosed by the present invention.
  • a peptide is a compound in which a plurality of amino acids are linked by peptide bonds.
  • the amino acid also referred to as an amino acid residue
  • R ′ is a natural amino acid having a naturally occurring substituent, Including its D, L-optical isomers.
  • Natural amino acids may be replaced by modified amino acids (or expressed as modified amino acid residues).
  • the modified amino acids include not only the amino acids in which the substituents of the above general formula are further modified and their D, L-optical isomers, but also, for example, esters, ethers, thioesters, thioethers, etc. It also includes unnatural amino acids to which various substituents are bonded, with or without amide, carbamide or thiocarbamide. It also includes unnatural amino acids in which the amino group of the amino acid is substituted with a lower alkyl group.
  • a peptide analog refers to a compound in which at least one amino acid has been replaced with a non-amino acid compound in the peptide, and thus at least one bond of the substituted compound to the peptide analog is a peptide bond. Absent.
  • peptide-based compounds compounds in which the amino terminus and the Z-terminal or sulfoxyl terminus of these peptides and peptide analogs were modified were defined as derivatives, and the peptides, peptide analogs and derivatives thereof were collectively referred to as peptide-based compounds.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 at least the 4th to 10th amino acid sequences from the amino terminus refer to the following sequences.
  • the present inventors have noticed that binding of a ligand to GHS receptor Yuichi (GHS-R) causes a transient increase in intracellular calcium ion concentration using inositol phospholipid as a second messenger, Extracts of various organs or tissues were screened using the activity of increasing intracellular calcium ion concentration (Ca-elevating activity) in CH0 cells (CH0-GHSR62) in which was expressed. As a result, it was found that the extract of rat stomach had a strong Ca-elevating activity, and a substance having a Ca-elevating activity was purified from the extract using various types of chromatography, and the molecular weight of the substance was modified with fatty acids. 3,000 new peptides.
  • the novel peptide promotes specific secretion of GH from anterior pituitary cells, and the novel peptide is an endogenous ligand of GHS-R, that is, endogenous GH. It was found to be a secretagogue (endogenous GHS). That is, the first of the invention of the present application is to have an activity of increasing intracellular calcium ion concentration or an activity of inducing GH secretion, and endogenous GH secretion characterized by the fact that constituent amino acid residues are modified with fatty acids. It is a derivative peptide and a method for obtaining the peptide.
  • the present inventors analyzed the structure of the endogenous GH secretion inducing peptide in detail, and found that the peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the third serine side chain from the amino terminal. It was found that the hydroxyl group of the compound was acylated with a fatty acid. As in rats, purification and structural analysis of human GH secretion-inducing peptides from human gastric extracts with strong Ca-elevating activity were carried out in the same manner as rat-derived GH secretion-inducing peptides.
  • the derivatized peptide also had the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and it was found that the hydroxyl group of the third serine side chain from the amino terminal was acylated with a fatty acid. Comparing the amino acid sequences of rat and human-derived endogenous GH secretion-inducing peptides, they showed a high overall 89% identity.
  • the amino acid sequence from the amino terminus to the 10th amino acid and the amino acid sequence from the 13th to the 28th amino acid are identical in rat and human, but the 11th and 12th amino acids are lysine and alanine in the rat, They differ in that they are replaced by arginine and valine, respectively, in humans.
  • the endogenous GH secretion-inducing peptide derived from rat was cleaved with various proteases, and the Ca-enhancing activity of the purified peptide fragment was measured. It was the smallest peptide to have.
  • the core sequence essential for the expression of Ca-elevating activity was a sequence consisting of the four amino acids set forth in SEQ ID NO: 8.
  • humans, pigs, and non-rats Both the isolated endogenous GH secretion-inducing peptide (28 amino acids) and the endogenous GH secretion-inducing peptide (27-amino acid) in which one of these peptides has been deleted from glutamine have the following characteristics. A sequence consisting of 0 amino acids was conserved.
  • the second aspect of the present invention is that the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, more preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 is essential for the expression of Ca-elevating activity. It is a fatty acid-modified peptide contained as a core sequence.
  • an endogenous GH secretion-inducing peptide was also isolated from chicken, eel, and potato, and was found to have a core sequence consisting of 4 amino acids shown in SEQ ID NO: 8.
  • endogenous GH secretion-inducing peptides have been isolated from African alfalfa, rainbow trout, and dogs. From rainbow trout, darelin- 23 consisting of 23 amino acids and 120 darelin consisting of 20 amino acids were isolated.
  • amino acids at the terminal end of the lipoxyl group of ghrelin of pearl salmon, darellin-13 of rainbow trout and ghrelin-20 were amidated.
  • the present invention provides an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, preferably SEQ ID NO: 1.
  • a fatty acid comprising a peptide obtained by converting the amino acid residue serine at the third amino acid from the amino terminal of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9 to threonine as a core sequence essential for the expression of Ca elevating activity, more preferably It also relates to modified peptides.
  • the endogenous fatty acid-modified peptide having GH secretion-inducing activity or the fatty acid-modified peptide comprising the above core sequence disclosed by the present invention also provides a guideline for designing a compound having a Ca-elevating activity.
  • the third aspect of the present invention is to obtain a novel compound having a Ca-elevating activity by synthesizing a structurally similar compound of the fatty acid-modified peptide and confirming the Ca-elevating activity of the structurally similar compound. Therefore, it goes without saying that in the peptide or peptide analog having an activity to increase the intracellular calcium ion concentration, a compound in which the constituent amino acids are replaced with a modified amino acid or a non-amino acid compound also belongs to the present invention.
  • a cDNA encoding the endogenous GH secretion inducing peptide was obtained by a conventional method. As shown in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4 and 5, both rat and human cDNAs consist of 117 amino acids, and the sequence of 28 amino acids from the amino terminal to the 24th to 51st amino acids is endogenous in the rat and human. The amino acid sequence was identical to the amino acid sequence of the GH secretion inducing peptide.
  • the endogenous GH secretion-inducing peptide is synthesized as a precursor peptide consisting of 117 amino acids, a signal peptide consisting of 23 amino acids on the amino side is cleaved, and a further 56 amino acids on the carboxyl side are cleaved and removed. It was revealed that a fatty acid-modified peptide having GH secretion inducing activity was produced. In addition, a cDNA encoding a precursor of an endogenous GH secretion-inducing peptide consisting of 28 amino acids was also found in Busan.
  • a partial but partial cDNA encoding the precursor of the endogenous GH secretion-inducing peptide consisting of 27 amino acids was also found in the seaweed.
  • cDNAs encoding precursors of endogenous GH secretion-inducing peptides have been found in eel, African alfalfa and rainbow trout.
  • a cDNA encoding a precursor of darelin-123 consisting of 23 amino acids and a c-puffer encoding a precursor of ghrelin-120 consisting of 20 amino acids were isolated from dimouth.
  • the fourth aspect of the present invention is a cDNA which encodes a precursor of an endogenous GH secretion inducing peptide and a peptide which is a raw material for a fatty acid-modified peptide or a peptide analog having a Ca-elevating activity using the cDNA. It is a manufacturing method of.
  • the endogenous GH secretion-inducing peptide (Darelin) consisting of 28 amino acids from rat stomach extract, the peptide recovered as a minor fraction was analyzed. A peptide consisting of 27 amino acids (darellin-27) with one deletion of the fourth dalmin was found.
  • Ghrelin-27 has exactly the same Ca-elevating activity and GH secretion-inducing activity as dallelin consisting of 28 amino acids, and is an endogenous GH secretion-inducing peptide. Therefore, ghrelin-27 also belongs to the present invention.
  • the base sequence coding for glutamine at positions 13 and 14 of darelin is gca gca, which is the end of the exon where mRNA splicing (sp lici ng) occurs. This suggested that one of the two glutamine codons could produce cDNA with one missing.
  • a cDNA encoding a ghrelin-27 precursor peptide consisting of 27 amino acids was found.
  • rat and human ghrelin-27 peptide are synthesized as a precursor peptide consisting of 116 amino acids described in SEQ ID NO: 12 or 13, and a signal peptide consisting of 23 amino acid at the amino terminal side is obtained. After cleavage, 56 amino acids on the terminal side of lipoxyl were further cleaved and removed to produce a 27-amino acid-modified fatty acid peptide having GH secretion-inducing activity.
  • cDNA encoding the precursor of ghrelin-27 peptide was also found in bush and rice, and the presence of ghrelin-27 and its precursor was confirmed in these animals.
  • a ghrelin-27 peptide comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 10, 11, 17, and 22, and a ghrelin-27 precursor having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 12, 13, 19, and 23
  • cDNA coding for a body peptide and the precursor peptide having the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 14, 15, 21, and 24 also belong to the present invention.
  • the fatty acid-modified peptide having a Ca-elevating activity or the peptide-based compound such as a peptide analog having a Ca-elevating activity disclosed in the present invention may be used as a pharmaceutical composition for treating a disease caused by deficiency or decrease in GH. provide.
  • the pharmaceutical composition can be used for all diseases for which administration of GH is effective, and can overcome various side effects caused by administration of GH.
  • the pharmaceutical composition can also be used as an animal drug such as an animal growth promoter.
  • the peptide compound according to the present invention has an appetite-enhancing effect by intracerebroventricular administration and intravenous administration, it can be used as an appetite enhancer for treating anorexia or anorexia nervosa.
  • it since it has the effect of promoting exercise and gastric acid secretion, it may be used as a therapeutic agent for gastric functional diseases such as non-ulcer dyspepsia, sudden mild gastric atony, functional dyspepsia and reflux esophagitis. it can.
  • intravenous administration since intravenous administration has been shown to promote cell proliferation in bone marrow, duodenum and jejunum, it can be used as a protective agent for intestinal mucosa, a preventive agent for small intestinal mucosal damage during parenteral nutrition and a therapeutic agent for osteoporosis.
  • Antibodies prepared using the fatty acid-modified peptide having Ca-elevating activity disclosed in the present invention as an antigen, endogenous GH secretion-inducing peptide using the antibody And a measurement kit including the antibody also belong to the present invention.
  • the present invention also includes an Atssey method capable of differentially quantifying ghrelin and ghrelin from which a fatty acid has been eliminated, and a test kit combining an antibody against the amino acid-terminal peptide of ghrelin and an antibody against the peptide at the lipoxyl-terminal side. That is, the present invention provides a novel peptide hormone having a novel modified amino acid called acylated serine, and also provides a novel design guideline for a compound having a Ca-elevating activity using the structure of the peptide as a basic skeleton.
  • the elucidation of the mechanism of GH secretion induction by the fatty acid-modified peptide, GH releasing hormone and somatosustin disclosed in the present invention may be extended not only to the GH secretion induction mechanism but also to other hormone secretion control mechanisms. It is suggested.
  • the present invention discloses various functions of the fatty acid-modified peptide as a control factor for the circulatory system and the metabolic system, and the effects of the present invention extend to elucidation of a new biological control mechanism.
  • Acceptable salts
  • a peptide having an activity of increasing intracellular calcium ion concentration and an activity of inducing the secretion of growth hormone (a) constituent amino acids are modified or not modified, and (b) at least one amino acid is A non-amino acid compound substituted or unsubstituted peptide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
  • C or D which may be the same or different, (a) a modified amino acid, or (b) an amino acid having a hydrophobic side chain,
  • the amino acid has 1 or more carbon atoms on the ⁇ -carbon of the amino acid via an ester, ether, thioether, amide or disulfide bond, with or without (a) an alkylene group having 1 or more carbon atoms.
  • the modified amino acid is attached to the ⁇ -carbon of the amino acid via (a) an alkylene group having 1 or more carbon atoms, or not, through an ester, ether, thioester, thioether, disulfide, amide, carbamide or thiocarbamide.
  • the N-terminus is modified with a saturated or unsaturated alkyl or acyl group having 1 or more carbon atoms and / or the carboxyl group at the C-terminus has 0H or 0Z or NR2R3 (Z is a pharmaceutically acceptable cation or Lower branched or unbranched alkyl groups, R2 and R3 represent the same or different groups selected from the group consisting of H and lower branched or unbranched alkyl groups).
  • Z is a pharmaceutically acceptable cation or Lower branched or unbranched alkyl groups
  • R2 and R3 represent the same or different groups selected from the group consisting of H and lower branched or unbranched alkyl groups.
  • Amino terminal amino group is modified by introduction of a saturated or unsaturated alkyl or acyl group having 1 or more carbon atoms, and Z or carboxyl terminal carboxyl group is 0Z or NR2R3 (Z is pharmaceutically acceptable).
  • Z is pharmaceutically acceptable.
  • a pharmaceutical composition comprising the peptide compound or the pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of (1) to (32) as an active ingredient,
  • a pharmaceutical composition for treating a disease caused by growth hormone deficiency or decrease comprising the peptide compound or the pharmaceutically acceptable salt thereof according to any of (1) to (32) as an active ingredient;
  • a disease caused by growth hormone deficiency or decrease which comprises administering a pharmaceutical composition comprising the peptide compound or the pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of (1) to (32) as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition comprising a therapeutic agent for a disease not caused by growth hormone deficiency or decrease, and a peptide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to any of (1) to (32) is administered.
  • a method of treating a disease not caused by a deficiency or decrease in growth hormone comprising:
  • the base sequence is SEQ ID NO: 6, 7, 14, 15, 20, 20, 21, 24,
  • the DNA according to the above (40) which is one nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences according to 36, 37, 38 and 39,
  • the amino acid is one base sequence selected from the group consisting of the base sequences described in SEQ ID NOs: 6, 7, 14, 15, 20, 20, 21, 24, 36, 37, 38 and 39;
  • a vector containing a DNA encoding the amino acid sequence of the peptide compound according to any one of (1) to (32) is incorporated into an in vivo cell to increase the activity of increasing intracellular calcium ion concentration.
  • a vector containing a DNA encoding the amino acid sequence of the peptide compound according to any one of (1) to (32) is incorporated into a living cell to increase the intracellular calcium ion concentration.
  • a peptide-based compound characterized by having at least one amino acid of a peptide having an activity of increasing intracellular calcium ion concentration substituted by a modified amino acid and / or a non-amino acid compound, or a pharmaceutical compound thereof.
  • a peptide having an activity of increasing intracellular calcium ion concentration and an activity of inducing secretion of growth hormone (a) the constituent amino acids are modified or not modified, and (b) at least one amino acid is modified.
  • a non-amino acid compound substituted or unsubstituted peptide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof (a) the constituent amino acids are modified or not modified, and (b) at least one amino acid is modified.
  • amino acid non-amino acid compound, or none
  • C or D which may be the same or different, (a) a modified amino acid, (b) an amino acid having a hydrophobic side chain, or (c) an amino acid having a basic side chain,
  • the modified amino acid is attached to the ⁇ -carbon of the amino acid via (a) an alkylene group having 1 or more carbon atoms, or not, through an ester, ether, thioester, thioether, disulfide, amide, carbamide or thiocarbamide.
  • Fatty acid is added to the hydroxyl group or mercapto group of the amino acid side chain.
  • Amino terminal amino group is modified by introduction of a saturated or unsaturated alkyl or acyl group having 1 or more carbon atoms, and Z or carboxyl terminal carboxyl group is 0Z or NR2R3 (Z is pharmaceutically acceptable).
  • Z is pharmaceutically acceptable.
  • R2 and R3 are the same as each other selected from the group consisting of H and lower branched or unbranched alkyl groups; Or a different group), wherein the peptide-based compound according to any one of (1) to (16),
  • a peptide compound characterized by further introducing a basic group to the lipoxyl-terminal amide derivative of the peptide compound according to (1) to (16) or (18), (20) a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, the peptide compound or the pharmaceutically acceptable salt thereof according to any of (1) to (19);
  • a pharmaceutical composition for treating a disease caused by growth hormone deficiency or decrease comprising the peptide compound or the pharmaceutically acceptable salt thereof according to any of (1) to (19) above as an active ingredient.
  • a growth hormone comprising a therapeutic agent for a disease not caused by growth hormone deficiency or decrease, and a peptide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to any of (1) to (19).
  • a disease caused by a growth hormone deficiency or decrease which comprises administering a pharmaceutical composition containing the peptide compound or the pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of (1) to (19) as an active ingredient.
  • the base sequence is one base sequence selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 6, 7, 14, 15, 20, 21, and 24; (27) the DNA of the above,
  • (29) a base sequence encoding an amino acid in one base sequence selected from the group consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 6, 7, 14, 15, 20, 21, and 24;
  • a vector containing a DNA encoding the amino acid sequence of the peptide compound according to any one of the above (1) to (19) is incorporated into living cells, and has an activity to increase intracellular calcium ion concentration.
  • a vector having a DNA encoding the amino acid sequence of the peptide-based compound according to any one of (1) to (19) is replaced with a peptide having an amino acid sequence encoded by the DNA in the amino acid sequence.
  • a peptide-based compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof which has the activity of increasing intracellular calcium ion concentration, wherein at least one amino acid is substituted by a modified amino acid and / or a non-amino acid compound; Acceptable salt,
  • the peptide compound or the pharmaceutically acceptable salt thereof according to the above (1) which comprises an amino acid sequence in which at least one amino acid has been deleted, substituted and / or added,
  • an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having at least the 4th to 10th amino acid sequence from the amino terminal in the sequence and other than the 4th to 10th amino acid sequence from the amino terminal A peptide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the above (4), wherein at least one amino acid has a deletion, substitution, Z or addition amino acid sequence in the portion
  • the amino terminal is modified with a saturated or unsaturated alkyl or acyl group having 1 or more carbon atoms and / or the carboxyl group at the carboxyl terminal has 0H as 0Z or NR2R3 (Z is a pharmaceutically acceptable cation or a lower cation).
  • Z is a pharmaceutically acceptable cation or a lower cation.
  • a branched or unbranched alkyl group, R2 and R3 are the same or different groups selected from the group consisting of H and lower branched or unbranched alkyl groups).
  • the peptide-based compound according to any one of (1) to (15), (17) a pharmaceutical composition comprising the peptide compound or the pharmaceutically acceptable salt thereof according to any of (1) to (16) as an active ingredient;
  • a pharmaceutical composition for treating a disease caused by growth hormone deficiency or decrease comprising the peptide compound or the pharmaceutically acceptable salt thereof according to any of (1) to (16) as an active ingredient;
  • a pharmaceutical composition for treating a disease
  • a disease caused by deficiency or decrease of growth hormone which comprises administering a pharmaceutical composition containing the peptide compound or the pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of (1) to (16) as an active ingredient.
  • a method of treating the disease comprising:
  • the host may be prepared by a vector containing the DNA according to any one of (24) to (26). After transforming the cells, culturing the resulting transformed cells, collecting the target substance from the culture, and converting any amino acid Said method characterized in that it is chemically modified,
  • a host cell is transformed with a vector containing the DNA encoding the peptide compound according to any one of the above (4) to (6), and the resulting transformed cells are cultured.
  • Expression of peptides with modified amino acids can lead to growth hormone deficiency or Is a pharmaceutical composition for gene therapy for treating a disease not caused by reduction, and
  • a peptide-based compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof which has the activity of increasing intracellular calcium ion concentration, wherein at least one amino acid is substituted by a modified amino acid and / or a non-amino acid compound; Acceptable salt,
  • At least one amino acid in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 other than the sequence from the amino terminus to the seventh amino acid in the sequence has an amino acid sequence in which at least one amino acid is deleted, substituted, and / or added.
  • a precursor peptide compound of the peptide compound described in (3) (6) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, or at least a portion other than the amino acid from the amino terminal to the 28th amino acid in the sequence.
  • the amino acid sequence In the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 or in a portion other than the sequence from the amino terminal to the seventh amino acid in the sequence, the amino acid sequence has at least one amino acid deleted, substituted and / or added.
  • Previous (7) The peptide compound according to (8) or a derivative thereof and a pharmaceutically acceptable salt thereof,
  • Modification of the modified amino acid at the ⁇ -carbon of the amino acid (a) selected from the group consisting of esters, ethers, thioesters, thioethers, amides, or carbamides, with or without an alkyl chain having 1 or more carbon atoms And (b) a saturated or unsaturated alkyl chain having 1 or more carbon atoms, or (b) H or a saturated or unsaturated alkyl chain having 1 or more carbon atoms.
  • the amino terminal is modified with a saturated or unsaturated alkyl or acyl group having 1 or more carbon atoms and / or the lipoxyl terminal is 0Z or NR2R3 (Z is a pharmaceutically acceptable cation or a lower branched or unbranched chain.
  • Z is a pharmaceutically acceptable cation or a lower branched or unbranched chain.
  • R 2 and R 3 are the same or different from each other selected from the group consisting of H and lower branched or unbranched alkyl groups. 1) to (22), and (24) a growth hormone deficiency or decrease containing the peptide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to any of (1) to (6) as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for treating the resulting disease
  • a host cell is transformed with a vector containing the DNA according to (30).
  • the method comprising culturing the obtained transformed cells and collecting a target substance from the culture, and then chemically modifying any amino acid.
  • a host cell is transformed with a vector containing the DNA encoding the peptide compound according to any one of (7) to (13), and the resulting transformed cell is cultured to obtain a target from the culture.
  • At least one of the above-mentioned (1) to (6) which has an activity of incorporating a vector containing the DNA encoding the peptide compound according to any one of (1) to (6) into cells in a living body and increasing the intracellular calcium ion concentration.
  • a pharmaceutical composition for gene therapy for treating a disease not caused by growth hormone deficiency by expressing a peptide having a modified amino acid and (48) the above (1) to (1) 6) Producing a vector having a DNA encoding the peptide-based compound according to (1) as a peptide having an amino acid sequence encoded by the DNA as a peptide having a recognition sequence capable of modifying at least one amino acid in the amino acid sequence.
  • amino acids include all amino acids such as L-amino acids, D-amino acids, ⁇ -amino acids, 3-amino acids, one amino acids, natural amino acids, and synthetic amino acids.
  • a modified amino acid means an amino acid in which any group of the above amino acids is chemically modified.
  • a modified amino acid in which the ⁇ -carbon in the ⁇ -amino acid is chemically modified is preferable. That is, the modified amino acid is represented by the formula (1)
  • R 'and R may be H or an arbitrary substituent, that is, any one obtained by chemically modifying a natural amino acid. Any one of R' and R" One can be H.
  • an amino acid in which a substituent present on a natural amino acid is replaced with a natural amino acid or a corresponding non-existent D-amino acid is referred to as a modified amino acid.
  • substitutions include, for example, naturally occurring amino acids in the side chain
  • acyl group examples include groups formed by removing hydroxyl groups from organic carboxylic acids, organic sulfonic acids, and organic phosphoric acid compounds. More specifically, the organic carboxylic acids include fatty acids, and the number of carbon atoms is preferably 2 to 35, more preferably 6 to 18, and most preferably.
  • fatty acids include octanoic acid (preferably, power prillic acid), decanoic acid (preferably, power pric acid), Decanoic acid (preferably, lauric acid), monoene or polyene fatty acids thereof, and the like.
  • the organic sulfonic acid or organic phosphoric acid compound also preferably has 2 to 35 carbon atoms.
  • modified amino acid may be a group represented by R 'or R "above, for example, a group represented by the formula
  • n is an integer of 0 to 10
  • P is one C—O—, one O—C—, one O—,
  • H is a saturated or unsaturated alkyl group of C 5 , C 6 to C 2 . May be substituted with an aralkyl group of C? ⁇ 3 .
  • the bonding mode will be further described from the group consisting of esters, ethers, thioesters, thioethers, amides or carbamides, with or without an alkyl group having 1 or more carbon atoms.
  • the amino acid when the amino acid is serine, threonine, tyrosine or oxyproline, the amino acid has a hydroxyl group in a side chain.
  • the amino acid when the amino acid is a cysteine, the amino acid has a mercapto group in the side chain.
  • the amino acid When the amino acid is lysine, arginine, histidine, tributofan, proline or oxyproline, it has an amino group or imino group in the side chain.
  • hydroxyl group, mercapto group, amino group and imino group may be chemically modified. That is, the hydroxyl group or mercapto group may be etherified, esterified, thioether or thioesterified.
  • the imino group may be iminoetherified, iminothioetherified, or alkylated.
  • the amino group may be amidated, thioamidated or carbamidated.
  • the mercapto group may be disulfide-formed, the imino group may be amidated or thioamidated, and the amino group may be alkylated or thiocarbamidated.
  • Hydroxyl or mercapto groups so chemically modified are represented, for example, by the formula
  • - NH- C-NH may be represented in one Z 7, Jisurufui de of mercapto groups of the formula - S- S- Z 8
  • I 2 , z 3 , z 4 , z 5 , z 6 , z 7 and z 8 are substituents for any chemical modification, as long as they are not contrary to the spirit of the present invention.
  • substituents commonly used in the pharmaceutical field or for chemical modification for peptides are well known in the patent literature or academic literature. Substituents for such known modifications can be employed, and the chemical modification may be performed according to such conventionally known methods.
  • the above formula may be a hydrogen atom or a linear, branched or cyclic alkyl group, and such an alkyl group may be saturated or unsaturated.
  • the number of carbon atoms is usually Flip DOO preferably C 6 _ 2. It is.
  • z 2 , z 3 , z 4 , z 5 , z 6 , z 7 or z 8 may be a hydrogen atom or a linear, branched or cyclic alkyl group, wherein said alkyl group is saturated or unsaturated. It may be saturated.
  • the number of carbon atoms is usually ⁇ , preferably Ci- 6 .
  • the alkyl group represented by z 2 , z 3 , z 4 , z 5 , z 6 , z 7, or z 8 is, for example, usually a hydroxyl group, an amino group, a halogen, a nitro, or a —3 alkoxy group. It may be substituted with a substituent used for chemical modification of the peptide.
  • a substituent used for chemical modification of the peptide is, for example, usually a hydroxyl group, an amino group, a halogen, a nitro, or a —3 alkoxy group.
  • C 1 is a residue of a fatty acid Zi ⁇ c- OH, it is an example of an amino acid to which a fatty acid is bound.
  • the fatty acid may be, for example, saturated acid such as caprylic acid, capric acid, laric acid, butyric acid, caproic acid, pendecylic acid, palmitic acid, decanoic acid, nonadecanoic acid, behenic acid, montanic acid, or laccenic acid
  • Fatty acids for example, unsaturated fatty acids such as acrylic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, or aatearolic acid.
  • the unsaturated fatty acid may be a monoene or a polyene.
  • the modified amino acid is formed by substituting a group other than the amino group and the lipoxyl group constituting the peptide bond, which is bonded to the carbon of the ⁇ -amino acid to the ⁇ carbon, with a hydrogen atom or a saturated or unsaturated alkyl group. It may be an ⁇ -amino acid. Further, in the present invention, the modified amino acid may be an amino acid formed by substituting the amino group of the amino acid with a saturated or unsaturated alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the unnatural amino acid in the present invention has an amino group and a carboxyl group at both ends of the molecule, and includes, for example, NH 2- (CH 2 ) 3 CH (CH 2 0H) -C00H, NH 2- (CH 2 ) 4 -COOH, NH 2 -C (CH 3 ) 2- (CH 2 ) 3 -C00H, or NH 2 -CH (CH 3 )-(CH 2 ) 2 -CH (CH 3 ) -C00H .
  • These all have a molecular chain length equivalent to a peptide, but naturally include those having a molecular chain length equivalent to a peptide.
  • non-amino acid compound in the present invention examples include, for example, NH 2 -CH (CH 2 0H) -CH 3 , CH 3 -CH (R) _C00H, CH 3 -CH (R) -CH 3 (all Chain length is equivalent to peptide), or NH 2- (CH 2 ) 3 CH (CH 2 OH) -CH 3 , NH 2- (CH 2 ) 3 CH (R) -CH
  • R represents a side chain of a natural amino acid or a substituent of ⁇ -carbon of the above-mentioned modified amino acid.
  • FIG. 1 shows the purification of darelin from rat stomach extract.
  • a shows the results of gel filtration of the SP-III fraction prepared from 40 g rat stomach using Sepahdex G-50 (fine), which shows that the active fraction has a molecular weight of about 3,000 daltons.
  • b shows the results of the second CM-ion exchange HPLC. The active fraction eluted at 55 to 56 minutes was further purified by reverse phase HPLC.
  • FIG. 2 shows that an n-octanoyl modification in ghrelin was identified.
  • a is a diagram showing the results of reversed-phase HPLC analysis of 2 // g of natural darelin (upper), synthetic darelin and synthetic desacylated ghrelin (lower), respectively.
  • You. b is a diagram showing changes in intracellular calcium ion concentration in CH0-GHSR62 cells due to natural darelin (solid line), synthetic darelin (small broken line), and synthetic desaleylated darelin (large broken line).
  • FIG. 3 shows the specific interaction of ghrelin with CH0-GHSR62 cells. Samples were added at the points indicated by arrows in the figure.
  • a is a diagram showing changes in intracellular calcium ion concentration in CHO-GHSR62 cells by ghrelin, GHRP-6 and GRF (GHRH).
  • b Intracellular calcium ions in CHO-GHSR62 cells by darelin when (D-Lys-3] -GRP-6, a specific inhibitor of GHS-R, is added ( ⁇ ) or not added (Hata)
  • the figure shows the change in concentration, also showing the change in intracellular calcium ion concentration due to GRF (GHRH) (filled triangles).
  • FIG. 4 shows the amino acid sequences of rat and human ghrelin precursors and the results of examining the expression of these precursors in various tissues.
  • a Comparison of the amino acid sequences of rat and human ghrelin precursors. In the figure, the same amino acids are shaded, the dotted line is the signal peptide, the black triangle is the signal peptide cleavage point, and the triangle is the carboxyl terminal cleavage. Points and boxes indicate the mature darrellin moiety, and * indicates modification with n-octanoic acid.
  • (b) shows the results of Northern blot analysis of ghrelin expression in various rat tissues.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of dallelin on pituitary hormone secretion in vitro and in vivo.
  • a shows the change in fluorescence intensity due to the change in intracellular calcium ion concentration in the rat pituitary initial culture cells.
  • the solid line shows the case where darelin was added, and the broken line shows the case where desacylated darelin was added.
  • b is a graph showing the secretion of pituitary hormone by ghrelin. In the figure, the black bar shows the pituitary hormone concentration when ghrelin was added and the white bar shows the pituitary hormone concentration when dalelin was not added.
  • c is the pituitary gland in plasma after intravenous injection of ghrelin into male lads It is a figure which shows the time-dependent change of hormone concentration.
  • GH represents growth hormone
  • ACTH represents adrenocorticotropin
  • FSH represents folicul
  • LH represents rutenizing hormone
  • PRL prolactin
  • TSH thyroid-promoting hormone.
  • Figure 6 shows the increase in food consumption when darelin was administered intracerebroventricularly, and is shown in terms of the food intake (mean standard error of the soil) two hours after darelin administration. a indicates that the error range for the effect of ghrelin is less than 0.0001.
  • Figure 7 shows the effect of administration of a drug on gastric acid secretion in a urethane anesthesia rat, where A is the result of administration of rGhrelin and B is the result of administration of histamine. It is. Each symbol represents the average value of four rats, and the standard error is indicated by an error bar.
  • physiological saline (Saline) was administered.
  • Drug (Drug) was administered at the time of the arrow.
  • Fig. 8 shows the effect of rat ghrelin on gastric motility in urethane-anesthetized rats, where A is a typical gastric stomach when saline (Saline) and rat d'arelin (rGhrelin) were administered.
  • FIG. 6B shows a movement waveform
  • B is a diagram showing an average value in four rats and a standard error value.
  • Drug (Drug) was administered at the time of the arrow.
  • Figure 9 is a view showing the cross-reactivity of radio I Takeno mediation Si of the standard curve and an antibody
  • a is be a diagram showing inhibition by various Darerin binding to labeled Rattodarerin N-terminal antibodies in 125 1
  • b is Ru FIG der showing inhibition by various ghrelin binding to C-terminal antibody rat ghrelin labeled with 125 1.
  • the horizontal axis of the graph indicates the amount of various darelin added per reaction tube, and the vertical axis indicates the amount of rat darelin bound in the absence of various darelin (B 0 ) in the presence of various darelin (B). In percentage (%).
  • rat darelin ⁇
  • human darelin Oka
  • rat Ghrelin-27 mouth
  • defatty acid rat darellin V
  • GHS-R GHS receptor Yuichi
  • GHS-R-expressing cells include hypothalamus and pituitary gland, which are known to constantly express GHS-R, and cell lines derived from these tissues. -Transformed cells in which the R gene has been introduced and expressed in appropriate cells, for example, CH0 cells, are desirable.
  • a known method can be used to measure the intracellular calcium ion concentration.
  • a FLIPR Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular
  • Fluo-4 AM Fluo-4 AM
  • a known purification method can be used to produce the desired endogenous GHS peptide from extracts of tissues and organs in which a Ca-elevating activity has been confirmed.
  • a method for purifying peptides gel filtration, ion exchange, and reverse phase chromatography are used alone or in combination after fractionation by various fractionation methods. Is effective, but it is not always necessary to stick to the purification by the chromatography, and any means effective for purifying the peptide can be used.
  • isolating and purifying peptides from tissues and organs heat-treat the tissues and organs in boiling water to prevent the degradation of the target peptide by the action of protease present in the tissues and organs. It is desirable to inactivate protease. Heat treatment to remove tissues and organs with ice is also effective in extracting and purifying the target peptide.
  • a known method can be used to confirm the purified GH secretion-inducing activity of the peptide having a Ca-elevating activity in invitro and invivo.
  • GHS-R GH secreted in the cell culture
  • GH secreted in the cell culture is converted to radioimmunoassay using anti-GH antibody.
  • the secretion amount of the hormone can be measured.
  • the GH concentration in the serum after injecting a peptide having a Ca-elevating activity into the peripheral vein of the animal may be measured.
  • Another method is to determine the amino acid sequence by measuring the molecular weight of the fragment ionized by GC-MASS.
  • the modified amino acid is identified as “unknown amino acid”.
  • the modified amino acid is separated and purified, the structure of the modified amino acid is determined by a commonly used compound structure determination method, and the structure of the entire peptide can be known. Also, a method of chemically synthesizing a peptide having the amino acid sequence of the peptide obtained from the cDNA encoding the modified peptide, and estimating the structure of the modifying group from the molecular weight and physical properties of the synthetic unmodified peptide and the modified peptide There is also.
  • the amino acid sequence (core sequence) of the portion required for Ca-elevating activity in the determined peptide is determined by measuring the Ca-elevating activity of a peptide fragment produced by cleaving the peptide with a protease. You.
  • protease to be used a protease having high specificity for the amino acid sequence of the peptide to be cleaved may be used.However, even if the specificity is low, various peptide fragments can be produced from the peptide by reacting under conditions of partial decomposition. Can be prepared.
  • the core sequence essential for the Ca-elevating activity can be known.
  • the third serine from the amino terminus is acylated by fatty acid, but the peptide fragment having a part of the amino acid sequence of the endogenous GH secretion-inducing peptide and the peptide fragment Fatty acid-modified peptides in which a fatty acid is ester-linked to the side chain of serine can also be chemically synthesized.
  • the endogenous GH secretion-inducing peptide can be analyzed in detail by the synthetic peptide fragment. At the same time, by comparing the peptide fragments modified with various fatty acids, depending on the species, etc. c eg ⁇ African clawed frog, which can determine the type of fatty acid necessary for the Ca increasing activity, the endogenous GH secretion-inducing Bae flop In the tide, the third amino acid residue from the amino terminus is not serine but threonine, and such threonine is acylated by a fatty acid. However, such a peptide-based compound can also be synthesized. Can be analyzed.
  • a DNA having a nucleotide sequence deduced from the amino acid sequence of the endogenous GH secretion-inducing peptide is chemically synthesized, and a cDNA library prepared from mRNA of a cell in which the peptide is expressed is screened using the DNA as a probe. CDNA encoding the peptide can be obtained.
  • obtaining genomic DNA from cDNA can be performed by a commonly used method.
  • the amino acid sequence of the precursor polypeptide of the endogenous GH secretion-inducing peptide is determined.
  • the amino acid sequence of a part of the endogenous GH secretion inducing peptide which is one of the inventions of the present application, the amino acid sequence of the precursor polypeptide of the peptide, and the nucleotide sequence of the DNA encoding the polypeptide are described in the international application. Although disclosed in WO 98/42840, the peptide disclosed in the application is a peptide consisting of 14 amino acids having a motilin-like activity, and the Ca concentration increasing activity and GH secretion disclosed in the present invention. There is no description of the inducing activity.
  • the peptide compound according to the present invention has an activity of increasing intracellular calcium ion concentration.
  • at least one amino acid is substituted with a modified amino acid.
  • peptide compounds In the present invention, the above peptides, peptide analogs and peptide derivatives are collectively referred to as peptide compounds.
  • a plurality of amino acids may be substituted with a modified amino acid and / or a non-amino acid.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 one or more of the amino acids 1 to 10 from the amino terminal, preferably 1 to 4 or 1 to 5 from the amino terminal are usually modified amino acids and / or It is preferably substituted with a non-amino acid.
  • the first to fifth amino acids are substituted with a modified amino acid and Z. or a non-amino acid.
  • amino acids at positions other than the 4th to 4th positions preferably at positions other than the 1st to 6th positions, and more preferably at positions other than the 1st to 10th positions may be deleted or added.
  • the peptide-based compound of the present invention is preferably a peptide that has an activity of increasing intracellular calcium ion concentration and induces secretion of growth hormone in vivo, wherein at least one amino acid is a modified amino acid and / or a non-amino acid. It is a compound substituted by an acid compound.
  • the peptide compound of the present invention has an activity of increasing intracellular calcium ion concentration and an action of inducing growth hormone in vivo, and a peptide compound in which an amino acid in a peptide chain is substituted with a modified amino acid or a non-amino acid compound.
  • a compound in which the hydroxyl group of the third amino acid Ser in the peptide represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3 is acylated, and a second or fifth amino acid in the peptide represented by SEQ ID NO: 4 or 5 examples include a compound in which the hydroxyl group of the amino acid Ser is acylated or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • a compound in which the hydroxyl group of the third amino acid Ser in the peptide represented by SEQ ID NO: 10, 11, 16, or 17 is acylated, or a pharmacologically acceptable compound thereof Salts.
  • a compound in which the hydroxyl group of the third amino acid Ser in the peptide represented by SEQ ID NO: 29, 30 or 31 is acylated or a pharmacologically acceptable salt thereof Is mentioned.
  • the acyl group introduced into the hydroxyl group by the acylation in the present invention is, for example, a group formed by removing a hydroxyl group from an organic carboxylic acid, an organic sulfonic acid or an organic phosphoric acid compound.
  • examples of the organic carboxylic acid include fatty acids, and the number of carbon atoms is preferably about 2 to 35, more preferably about 6 to 18, and most preferably about 8 to 16.
  • fatty acids include octanoic acid (preferably, caprylic acid), decanoic acid (preferably, caprylic acid), dodecanoic acid (preferably, lauric acid), and monoene or polyene fatty acids thereof. And the like.
  • organic sulfonic acid and the organic phosphoric acid compound those having about 2 to 35 carbon atoms are preferable.
  • Any peptide-based compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in which the third Ser hydroxyl group is acylated is a preferred embodiment of the present invention.
  • the second of the present invention is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and more preferably the hydroxyl group of the third Ser in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • Any peptide-based compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof, including a fatty acid-modified peptide having an acylated is a preferred embodiment of the present invention.
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8 preferably the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and more preferably the third amino acid residue serine from the amino terminal of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9 was converted to threonine
  • Acceptable salts are also a preferred embodiment of the present invention.
  • a preferred embodiment of the present invention is a compound represented by the following general formula (2) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • X-AA 1 -AA2-AA3-Y (2) (wherein, X is a portion corresponding to the hydrogen atom of the amino group of the amino terminal amino acid, and is H or one or more saturated or unsaturated carbon atoms. Represents an alkyl or acyl group. Y is the moiety corresponding to the hydroxyl group of the ⁇ -lipoxyl group of the terminal amino acid, 0 ⁇ , 0 ⁇ or NR6R7 ( ⁇ is a pharmacologically acceptable cation or lower branched or unbranched chain) Represents an alkyl group, R6 or R7 represents ⁇ or a lower branched or unbranched alkyl group, and R6 and R7 may be the same or different.). ]
  • n 1 or 2, and and may be the same or different and represent hydrogen or a substituent.
  • substituents include: (1) a carbon atom bonded by a bonding mode selected from the group consisting of an ester, an ether, a thioester, a thioether, an amide and a carbamide, with or without an alkyl chain having 1 or more carbon atoms.
  • a bonding mode selected from the group consisting of an ester, an ether, a thioester, a thioether, an amide and a carbamide, with or without an alkyl chain having 1 or more carbon atoms.
  • a saturated or unsaturated alkyl chain of 1 or more (2) H or a saturated of 1 or more carbon atoms
  • side chain of a natural amino acid or
  • a saturated or unsaturated alkyl chain having 1 or more carbon atoms bonded by a disulfide or thiocarbamide bond via or not via an alkyl chain having 1 or more carbon atoms may be used.
  • AA 2 is the formula
  • AA 3 is the formula
  • saturated or unsaturated alkyl having 1 or more carbon atoms represented by X include methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, s-butyl, t-butyl, n-heptyl, and n-butyl.
  • Hexyl, n-decyl, bi D_ 2 such as nyl, propanyl or hexenyl. are preferred.
  • the Ashiru represented by X, formyl, Asechiru, propionyl, or Benzoiru carboxylic acids such Ashiru; or a group represented by the acid Ashiru of C 7 _ 13 and the like ⁇ or ' such as benzene sulfonyl Le naphthalenesulfonyl is For example, equation (2)
  • n is an integer from 0 to: 10
  • P is —C—O—, —O—C-, —0—,
  • P may also be —CO—.
  • P may be -S-S- or -NH-CS-.
  • H may be substituted with a saturated or unsaturated alkyl group of C 35 , an aryl group of C 2 o, and an aralkyl group of C 7 to C 13 .
  • the group represented by or may be a group in which ⁇ 3 is bonded to (CH 2 ) without intervening P.
  • Lower alkyl groups represented by 1, R6 or R7 include, for example, methyl, Echiru, n- propyl, i - propyl, n- heptyl, s- butyl, t - heptyl, i - heptyl, C of hexyl etc. n- pentyl or to n-, - 6 Al kill are preferred.
  • AA1 preferred embodiment (A) amino acid or peptide.
  • NH 2 _ (CH 2 ) 4 -C00H, NH 2 -C (CH 3 ) 2- (CH 2 ) 3 -C00H, or NH 2 -CH (CH 3 )-( CH 2 ) 2 -CH (CH 3 ) -C00H is also included.
  • AA2 amino acid
  • amino acid examples include Ser, homoSer, Cys, homoCys, Asp, Glu, Lys, Ala, VaK Leu, homoLeu, Ile, homol le, olnitine, aminoadipate, methionine, etyonin, butionin, and S-methylcysteine.
  • Ser is particularly preferred.
  • leucine, zoline, norleucine, homoleucine, homoisoleucine, naphthylalanines, tributofan, fenylalanine, cyclohexylalanine, etc. having a hydrophobic side chain, and i-methyl amino acids thereof are preferable.
  • Laginic acid, glutamic acid, adipic acid, lysine, orditin and the like, and their yV-methyl amino acids are preferred.
  • an acyl group, an alkyl group, an alkenyl group or an aralkyl group is bonded to the amino acid side chain of (b) through an ester, amide, disulfide, ether, thioether, thioester, carbamide or thiocarbamide bond. Further, an alkyl or aralkyl group may be bonded to the ⁇ -carbon of the amino acid.
  • Preferred embodiment of # 3 amino acid or peptide.
  • Phe or a peptide having an amino acid sequence from the fourth amino acid Phe to the 28th Arg from the amino terminus in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 3, or the amino acid on the terminal side of lipoxyl of the sequence is SEQ ID NO: 2
  • the amino acid may be an L-amino acid or a D-amino acid.
  • one to several amino acids are unnatural amino acids or non-amino acid units, for example,
  • each of the amino acids in the example of AA3 may have a substituent shown above.
  • AA3 when there are a plurality of, they may be the same or different.
  • R8 represents a saturated or unsaturated alkyl chain having 1 or more carbon atoms.
  • Such an alkyl chain may have the same meaning as the above-mentioned alkyl chain represented by X.
  • G Ala, Val, Leu, Homoleucine, Ile, Homoisoleucine, S-methylcysteine, methionine, ethionine, or butionin, whose side chain is an amino acid of an alkyl chain.
  • it may be a modified alkyl group represented by the formula (2).
  • the present invention provides an intracellular calcium ion concentration-increasing agent or GH secretion inducing agent comprising a partial peptide consisting of the amino acid sequence from the amino terminal to the 13th, 14th or 15th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 3.
  • Agents are also included as a preferred embodiment.
  • each amino acid unit constituting the partial peptide does not necessarily need to be chemically modified.
  • a preferred embodiment of the present invention is the following peptide compound.
  • the ghrelin derivative refers to a peptide compound obtained by partially modifying the chemical structure of natural ghrelin, and short-chain darellin is a deletion of some amino acids of natural darrelin consisting of 27 to 28 amino acids. Refers to peptides consisting of less than 27 or 28 amino acids.
  • the n-position amino acid residue indicates the n-th amino acid residue from the amino terminal.
  • the amino acid at the amino terminal of darelin or its short-chain ghrelin derivative may be any amino acid (the amino terminal amino acid is glycine in natural ghrelin) as long as the ⁇ -amino group of the amino acid is not protected.
  • Any of L may be used, but preferably alanine, valine, or aminoiso Butanoic acid and the like are preferred.
  • the residue at position 2 may be any amino acid (serine in the case of natural darelin), but is preferably alanine, serine, histidine, norvaline or a non-amino acid compound having a small side chain.
  • Residues 1 and 2 are ⁇ -amino acids corresponding to two amino acids, such as 5-aminopentanoic acid, 5-amino-15-dimethylpentanoic acid, and 2,5-diaminopentane shown in the examples. It may be an acid or the like.
  • the amino acid residues selected at positions 3 and 4 may be D-form or L-integrated, may be D- or L-methylamino acid, or may be any combination of these. Among them, a combination of L-form at the 3-position or a combination of L-form at both the 3- and 4-positions is preferable.
  • the configuration of the amino acid residues selected at positions 3 and 4 can be appropriately selected depending on the amino acid sequences at positions 1 and 2. That is, the amino acid sequence at positions 1 and 2 of natural ghrelin, Gly-Ser is preferably L-form at both positions 3 and 4, but in the case of other amino acid sequences such as Aib-His In positions 3 and 4, both may be D-forms.
  • the 1- and 2-positions are ⁇ -amino acids having a length corresponding to two residues, for example, aminoamino acid
  • the 3- and 4-positions may be either L-form or D-form.
  • the amino acid residues selected at the 3- and 4-positions are preferably D- or L-integrated leucine, valine, norleucine, homoleucine, homoiso-isocyanine, naphthylalanine, tributofan, fenylalanine, cyclohexylalanine, and These D- or L-TV-methyl amino acids are preferred.
  • the amino acid residue selected at the 3-position and the 4-position is more preferably an aromatic hydrophobic amino acid such as naphthylalanine, tributofan, phenylalanine and cyclohexylalanine among the above-mentioned hydrophobic amino acids.
  • an aromatic hydrophobic amino acid such as naphthylalanine, tributofan, phenylalanine and cyclohexylalanine among the above-mentioned hydrophobic amino acids.
  • a basic amino acid such as lysine, arginine or histidine is also preferable. Of these, lysine is preferred.
  • the darelin molecule With these basic amino acids, the darelin molecule becomes basic and the activity of increasing Ca is further improved.
  • the amino acid residues selected at positions 3 and 4 have a functional group that can be modified with an acyl group (such as an alkanyl group, an alkenonyl group or an arylalkalanyl group), an alkyl group, or an aralkyl group on the side chain.
  • an acyl group such as an alkanyl group, an alkenonyl group or an arylalkalanyl group
  • an alkyl group such as an alkanyl group, an alkenonyl group or an arylalkalanyl group
  • Serine, homoserine, threonine, cysteine, homocystine, aspartic acid, glutamic acid, adipic acid, lysine, orditin and the like are preferred.
  • the amino acids having reactivity on these side chains may be either D-form or L-form, and may be the corresponding D- or L-iV-methyl amino acid. It is preferable to use an L-isomer or a combination of L and the 3rd and 4th positions.
  • an amino group such as an aracanyl group (having a carbon number of 2 to 35, preferably 2 to 35, Is 6 to 18, more preferably 8 to 12), an alkenonyl group (having 2 to 35, preferably 6 to: 18, and more preferably 8 to 12), an arylalkyl group (benzoyl, Phenacetyl, phenylbutyryl, naphthoyl, naphthylacetyl, or naphthylpropionyl group; an alkyl group (having 2 to 35, preferably 6 to 18, and more preferably 8 to 12) carbon atoms; or an aralkyl group (Benzyl, phenyl, phenylpropyl, phenylbutyl, phenylpentyl, naphthylmethyl, etc.) .
  • an aracanyl group having a carbon number of 2 to 35, preferably 2 to 35, Is 6 to 18, more preferably 8 to 12
  • the above alkyl group and aralkyl group may be bonded to the ⁇ -carbon at the 3-position and the 4-position without the bond.
  • the amino acid residue at the 3-position preferably has a hydrophobic side chain
  • the amino acid agent at the 4-position is preferably a hydrophobic amino acid.
  • an ester, an ether, a thioether, an amide or a disulfide bond may be attached to the ⁇ -carbon of the amino acid via (a) an alkylene group having 1 or more carbon atoms or not.
  • Preferred is a modified amino acid having one or more saturated or unsaturated alkyl chains having one or more carbon atoms, or (b) a saturated or unsaturated alkyl chain having one or more carbon atoms. Modified amino acids into which one or more saturated alkyl chains have been introduced are more preferred.
  • the carboxyl group of the 4-position amino acid may be an alkylamide such as amide, methylamide or ethylamide, or an aralkylamide such as benzylamide, adamantaneamide or adamantanealkylamide.
  • a basic group such as an amino group or a guanidide group may be bonded to the alkylamide or the aralkylamide.
  • Such basic groups include, for example, _C0NH_CH 2 CH 2 — ⁇ 2 , one CONH—CH 2 NHCH 3 , —CONH—CH 2 CH 2 CH 2 —NH
  • —C (NH 2 ) NH, —C0NHCH 2 Ph—NH 2 and the like.
  • a basic amino acid such as arginine, lysine, histidine, etc. may be added to the lipoxyl group of the 4-position amino acid, and these basic amino acids may be D-, L- or racemic, or D_ or L-TV- Any of methylamino acids may be used.
  • the carboxylic group of these amino acids may be an alkyl amide or an aralkyl amide, as described above.
  • a basic group such as an amino group or a guanidide group may be bonded to the alkylamide or the aralkylamide. Examples of such a basic group include those described above.
  • the amino acid sequence from position 5 onward may be added to the amino acid at position 4 in any length up to position 28 from the isine at position 5 of human darelin and rat darelin.
  • Ghrelin (1-5), darelin (1-6), darelin (1-7), darelin (1-8), ghrelin (1-9), darelin (1-10), ghrelin (1-11) Is mentioned.
  • Ghrelin (m-n) refers to a peptide having an amino acid sequence from m-th to n-th from the amino terminus of darelin.
  • darelin (1-5) is more preferred.
  • the carboxyl terminus is preferably an alkylamide or aralkylamide as described above.
  • a basic group such as an amino group or a guanidide group may be further bound to the alkylamide or the aralkylamide. Examples of such a basic group include those described above.
  • arginine, lysine, histidine, etc. are added to the lipoxyl-terminal amino acid of the ghrelin derivative lacking the lipoxyl-terminal part in which any amino acid sequence from the 5th position to the 28th position is added to the ghrelin (1-4) carboxyl terminal.
  • Basic amino acids may be added.
  • These basic amino acids may be D-form, L-integral or racemic, or D- or L-TV-methyl amino acid.
  • carboxyl group of these basic amino acids may be alkylamide or aralkylamide as described above.
  • the alkylamide or aralkylamide may further bind a basic group such as an amino group or a guanidide group. Examples of such a basic group include those described above.
  • the dextrin-terminal amino acids of darelin (1-5), darelin (1-6), and darelin (1-7) are D-form, L-form, or Is the corresponding D- or L-T-methylamino acid.
  • amino acids such as arginine, lysine, histidine and the like may be added to the residues at positions 5, 6, and 7, and these amino acids may be in D-form, L-form, racemic form, or D-form. Or L-T-methyl amino acid.
  • carboxylic group of these basic amino acids may be alkylamide or aralkylamide as described above.
  • a basic group such as an amino group or a guanidide group may be further bound to the alkylamide or the aralkylamide.
  • Such basic groups include, for example, those described above.
  • the peptide compound according to the present invention may be an amide derivative in which an amino group is further bonded to the alkyl group or aralkyl group. This is one of preferred embodiments of the present invention. Specifically, for example, the case where the hydroxyl group is aminoethylamide can be mentioned.
  • the peptide-based compound according to the present invention in which the carboxyl terminal is an amide derivative or an amide derivative is a useful compound because it is resistant to enzymatic degradation by lipoxypeptides in vivo. .
  • the peptide-based compound according to the present invention containing an N-methylamino acid is also a useful compound in that it has enzyme resistance.
  • the peptide compound according to the present invention can be obtained by a conventional method. For example, they can be isolated from natural sources, as already mentioned above, or produced by recombinant DNA technology and / or chemical synthesis. Further, when a modification (for example, acylation) is required for an amino acid residue, the modification reaction can be performed by a method known per se. More specifically, the peptide compound of the present invention is obtained by culturing host cells transformed by an expression vector having a DNA encoding the peptide of the present invention, The peptide compound according to the present invention can be obtained by collecting the peptide.
  • a modification reaction such as acylation may be performed according to known means, if desired.
  • An enzyme such as lipase can be used for the acylation reaction.
  • Examples of the vector for incorporating the gene include Escherichia coli vector (pBR322, PUC18, pUC19, etc.), Bacillus subtilis vector (pUB110, pTP5, pC194, etc.), yeast vector (YEp type, YRp type, Yip type), or Examples include animal cell vectors (retrovirus, vaccinia virus, etc.), and any other vector can be used as long as it can stably retain the target gene in the host cell. .
  • the vector is introduced into a suitable host cell.
  • a method of incorporating a target gene into a plasmid or a method of introducing it into a host cell for example, the method described in Molecular Cloninng (Sambrook et al., 1989) can be used.
  • a promoter is connected upstream of the gene so as to function.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host cell used to express the target gene.
  • the host cell to be transformed is Escherichia
  • Bacillus is SP01 promoter, it can be used.
  • SP02 promoter, etc. the GAP promoter, PH05 promoter, ADH promoter, etc. can be used.
  • SV40-derived promoter, retrovirus-derived promoter, etc. can be used.
  • the host cell is transformed using the vector containing the target gene obtained as described above.
  • Host cells include bacteria (eg, Escherichia, Bacillus, etc.), yeasts (Saccharomyces, Pichia, Candida, etc.), and animal cells (CH0 cells, COS cells, etc.) Etc. can be used.
  • a liquid medium is suitable as a culture medium at the time of culturing, and it is particularly preferable that the medium contains a carbon source, a nitrogen source, and the like necessary for growth of the transformed cells to be cultured. If desired, vitamins, growth promoting factors, serum and the like can be added.
  • cells having processing / protease activity capable of cleaving a precursor polypeptide of the peptide at an appropriate position and having activity capable of acylating a serine residue in the peptide are required. desirable.
  • a host cell having such processing protease activity and serine acylation activity is transformed into a host cell with an expression vector containing cDNA encoding the precursor polypeptide, and the transformed cell is transformed into a Ca-elevating activity.
  • selection can be made by confirming that a fatty acid-modified peptide having GH secretion inducing activity is produced.
  • the peptide of the present invention is separated and purified from the culture by a conventional method.
  • a protein denaturant such as guanidine hydrochloride
  • the cells or cells are collected, suspended in a buffer containing a protein denaturant (such as guanidine hydrochloride), and the cells are sonicated. After disrupting the body or cells, centrifuge.
  • various methods taking into account the molecular weight, solubility, charge (isoelectric point), affinity, etc. of the target substance Separation and purification methods, such as chromatography, can be used in appropriate combination.
  • the peptide compound according to the present invention can be chemically synthesized by an ordinary method.
  • an amino acid having a protective group is condensed by a liquid phase method or a solid phase method, a peptide chain is extended, and all protective groups are removed with an acid.
  • the obtained crude product is purified by the above-mentioned purification method.
  • the side chain of the amino acid at the target position can be selectively acylated with an acylase or an acyltransferase.
  • Active ester of amino terminal peptide for example, (1) Boc-Gly-Ser (Bu) -Ser (RlO) -Osu, (2) Boc-Gly-Ser (Bu) -Ser (RlO) -Phe -Osu, or (3) Boc-Gly-Ser (Bu) -Ser (RlO) -Phe-Leu-Osu is chemically synthesized, and each is a carboxyl-terminal peptide produced by recombinant DNA technology (4) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR (5)
  • SPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR binds, that is, a peptide compound consisting of 28 amino acids by combining (1) and (4), (2) and (5), and (3) and (6) Get. More specifically, XXXXZ SPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR is expressed in Escherichia coli, the amino group is protected with Boc2 (0), and
  • Boc-XXXXZSPEHQRVQQRK (Boc) ESK (Boc) K (Boc) PPAK (Boc) LQPR is obtained.
  • the enzyme is cleaved with a selective enzyme at the terminal end of the amino acid Z and converted to NH 2 -SPEHQRVQQRK (Boc) ESK (Boc) K (Boc) PPAK (Boc) LQPR.
  • This compound and Boc-Gly-Ser (Bu) -Ser (RIO) -Phe-Leu-Osu BocGlySer (Bu) Ser (R10) FLSPEHQRVQQRK (Boc) ESK (Boc) K (Boc) PPAK (Boc) LQPR can be mixed with an aqueous solution to obtain the desired product. .
  • Boc represents / -butyloxycarponyl
  • Osu represents iV-hydroxysuccinimide in which the hydrogen of the hydroxyl group has been eliminated
  • Bu represents a butyl group
  • R10 represents the above-described substitution of the modified amino acid according to the present invention.
  • a pharmaceutically acceptable salt is preferable, for example, a salt with an inorganic base, a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, and a basic salt. Or salts with acidic amino acids.
  • the salt with an inorganic base include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts; and aluminum salts and ammonium salts. Is received.
  • Preferred examples of the salt with an organic base include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, ⁇ , ⁇ '-dibenzylethylene. Salts with diamine and the like.
  • salts with inorganic acids include, for example, salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • Suitable examples of salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, ⁇ - Examples thereof include salts with toluenesulfonic acid and the like.
  • Suitable examples of salts with basic amino acids include, for example, arginine, lysine
  • Examples of the salt with an acidic amino acid include salts with aspartic acid and glutamic acid.
  • sodium salt and potassium salt are most preferred.
  • the peptide compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof has low toxicity, has a GH secretion inducing effect, and is a pharmacologically acceptable carrier, excipient, or bulking agent as it is or known per se.
  • the dosage is 0.01 to 5 mg / kg / day, preferably 0.04 to: 1.5 mg / kg / day for intravenous injection in adults. It is desirable to administer this amount once to three times a day.
  • the peptide compound of the present invention is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier, and is orally or parenterally administered as a solid preparation such as tablets, capsules, granules and powders; or as a liquid preparation such as syrups and injections. Can be administered.
  • various organic or inorganic carrier materials commonly used as a drug substance can be used. Excipients, lubricants, binders, disintegrants in solid formulations; solvents in liquid formulations, Formulated as solubilizers, suspending agents, isotonic agents, buffers, soothing agents and the like.
  • pharmaceutical additives such as preservatives, antioxidants, coloring agents and sweeteners can also be used.
  • Preferred examples of the excipient include lactose, sucrose, D-mannitol, starch, crystalline cellulose, light caffeic anhydride and the like.
  • Preferable examples of the lubricant include magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloidal silica and the like.
  • Suitable examples of binders include, for example, crystalline cellulose, sucrose, D-mannitol, dextrin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropyl Mouth pill methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone and the like.
  • Preferable examples of the disintegrant include starch, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium and the like.
  • the solvent include water for injection, alcohol, propylene glycol, macrogol, sesame oil, corn oil and the like.
  • solubilizer examples include, for example, polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate and the like. No.
  • the suspending agent include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate;
  • surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate
  • hydrophilic polymers such as alcohol, polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and hydroxypropylcellulose.
  • Preferred examples of the tonicity agent include, for example, sodium chloride, glycerin, D-mannitol and the like.
  • buffers such as phosphate, acetate, carbonate, and citrate.
  • the soothing agent include benzyl alcohol and the like.
  • preservatives include, for example, paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • antioxidant include, for example, sulfite, ascorbic acid and the like.
  • the above pharmaceutical composition has an effect equal to or more than that of the administration of GH, and can also reduce various side effects caused by the administration of GH.
  • Applicable diseases or effects of the pharmaceutical composition may be associated with GH deficiency or reduction, e.g., dwarfism, activation of osteoblasts and bone remodeling in normal individuals, GH deficiency in adults Increased muscle mass and muscle strength in children, improved exercise performance in adults with GH deficiency, severe burn healing in children, combined use with gonand tropine to induce ovulation, prevention of abnormal protein metabolism by administration of prednisone, T cells in severe immunodeficiency These include, but are not limited to, promotion of “education”, senile weight loss, suppression of fat tissue enlargement and skin atrophy.
  • the pharmaceutical composition has an effect of increasing the pulsatile volume, and thus is used for the treatment of heart diseases such as heart failure. effective.
  • the effect of the pharmaceutical composition is not limited to humans. In other words, it has the same or higher effects as GH administration, such as promotion of animal growth and reduction of fat in meat.
  • an appetite enhancer for treating anorexia or anorexia nervosa can also be used as an appetite enhancer for treating anorexia or anorexia nervosa.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention has an effect of promoting gastric motility and gastric acid secretion, so that non-ulcer dysfunction, sudden mild gastric atony, functional It can also be used as a therapeutic agent for gastric dysfunction such as indigestion and reflux esophagitis.
  • the pharmaceutical composition according to the invention was shown to promote cell proliferation in bone marrow, duodenum and jejunum by intravenous administration, and can be used as a protective agent for intestinal mucosa, a preventive agent for mucosal damage to small intestine during parenteral nutrition, and a therapeutic agent for osteoporosis
  • the pharmaceutical composition is effective for treating the following diseases or improving the physical condition.
  • the antibody according to the present invention which uses a fatty acid-modified peptide having a Ca elevating activity or a GH secretion inducing activity as an antigen, can be obtained by a known method.
  • the antibody may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and a known method can be used for obtaining them.
  • Known methods can also be used for measuring the fatty acid-modified peptide using these antibodies and for preparing a measurement kit using the measuring method.
  • an antibody was prepared for a peptide on the amino terminal side of ghrelin and on the terminal side of lipoxyl, and the fact that the former specifically recognizes a fatty acid modifying serine at position 3 was used. Then, it can be used for the differential quantification of dallelin modified with fatty acid and ghrelin from which fatty acid has been eliminated.
  • the antibody against the amino terminal side or the peptide at the carboxyl terminal side of ghrelin can be obtained by a known method, and may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the side chain of the amino acid residue at position 3, preferably a fatty acid is It is also possible to produce an antibody that recognizes the amino acid and binds to the amino terminal peptide. Further, similarly, an antibody that specifically binds to a peptide having a modified amino acid in the peptide compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be produced.
  • an antibody that specifically recognizes the side chain of the modified amino acid an antibody that recognizes an amino acid other than the modified amino acid or and the non-amino acid compound, or a peptide that does not include them, preferably a peptide compound according to the present invention or ⁇ at the terminal end of the pharmaceutically acceptable salt
  • a test kit comprising a combination with an antibody against the peptide is also included in the present invention.
  • a peptide-based compound of the present invention having a modified amino acid preferably an acylated amino acid, or a pharmacologically acceptable salt thereof, and a peptide of the present invention having no modified amino acid
  • An Atsey method for separating and detecting a peptide compound or a pharmacologically acceptable salt thereof is also included in the present invention.
  • the above-mentioned Assay method includes, for example, (i) competitively reacting an antibody against the peptide compound or the like of the present invention with the test substance in the test wave and the labeled peptide compound or the like of the present invention.
  • Reacting, and measuring the ratio of the labeled peptide compound of the present invention bound to the antibody, and a method for quantifying the peptide compound of the present invention in a test solution and ii) After reacting the test wave with the antibody of the present invention insolubilized on the carrier and another labeled antibody of the present invention simultaneously or continuously, the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier or Z and A method for quantifying the protein or the like of the present invention in a test wave, which comprises measuring the activity of a labeling agent not captured on an insolubilized carrier.
  • one of the antibodies reacts with the amino terminal end of the protein of the present invention and the other antibody reacts with the terminal end of lipoxyl of the protein or the like of the present invention.
  • it is an antibody.
  • the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the compound (hereinafter sometimes referred to as an anti-protein antibody). Detection can also be performed.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the peptide compound or the like of the present invention using the above antibody is not particularly limited, and may be an antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of protein) in the test solution. Any measurement method may be used as long as the amount of the body is detected by chemical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. . For example, nephelometry, a competition method, an immunometric method, and a sandwich method are suitably used, but in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.
  • the labeling agent used in the assay method using a labeling substance in the assay method according to the present invention for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • radioisotope for example, 125 I, 131 I, 3 H, ' 4 C and the like are used.
  • a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • / 3-galactosidase, / 3-dalcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate or the like is used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the present invention will be described in detail with reference to examples. Especially molecular biology techniques Unless otherwise noted, it was by Molecular Cloninng (Sambrook et al., 1989).
  • Example 1 Preparation of GHS-R expressing cell line and measurement of Ca elevating activity
  • Rat GHS-R full-length cDNA was obtained by RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction) using rat brain cDNA as type III. Based on the known nucleotide sequence of rat GHS-R [K. K. Mckee, et al, Molecular Endocrinology 11, 415-423 (1997).], Sense and antisense primers having the following nucleotide sequences were synthesized.
  • Sense primer 5, -ATGTGGAACGCGACCCCCAGCGA-3 'Antisense primer: 5'-ACCCCCAATTGTTTCCAGACCCAT-3'
  • the amplified cDNA was ligated to a vector pcDNAIII (Invitrogen) to prepare an expression vector GHSR-pcDNAIII.
  • the expression vector was used to transform CH0 cells, and transformed cells stably expressing GHS-R were selected in a medium containing 1 ig / ml G418.
  • Cell lines CH0- GHSR62 The selected, 10-
  • rat stomach Forty g of fresh rat stomach was boiled for 5 minutes in 5 times the volume of boiling water to deactivate mixed proteases. After cooling, the boiled sample was adjusted to IMAcOH-20 mM HC1, and the peptide was extracted using a Polytron mixer. The extract was centrifuged at 11,000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was concentrated to about 40 ml on an evaporator. Acetone was added to the concentrated solution to a concentration of 66%, and acetone precipitation was performed. After the generated precipitate was removed, acetone in the supernatant was evaporated.
  • the supernatant is added to a 10 g Sep-PakC18 cartridge (Waters) equilibrated with 0.13 ⁇ 4 TFA (trifluoroacetic acid), washed with 10% CH 3 CN / 0.1% TFA, and then washed with 60% CH 3 CN / 0 Eluted with TFA. After evaporating the solvent of the eluate, lyophilization was performed. The sample was dissolved in 1M AcOH and adsorbed on SP-Sephadex C-25 (H + form) equilibrated with 1M AcOH.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Ghrelin consists of 28 amino acid residues consisting of the sequence of Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg (Xaa is an unidentified amino acid) It was a peptide.
  • Xaa is Ser from the base sequence of the rat cDNA, and it was found that Ser was modified in this peptide.
  • unmodified ghrelin in which the third serine from the amino terminal was not modified was chemically synthesized using a peptide synthesizer (ABI 433A, Applied Biosystems).
  • the elution time of unmodified synthetic ghrelin in reverse phase HPLC was significantly different from that of natural ghrelin (Fig. 2a), indicating that unmodified synthetic ghrelin was significantly more hydrophilic than natural ghrelin.
  • ghrelin was analyzed by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) to identify the modifying groups on serine 3.
  • the observed molecular weight of native darelin (3314.9 ⁇ 0.7) was 126 larger than the molecular weight of the unmodified darelin peptide obtained from the cDNA sequence (3188.5). From the above results, it was found that the hydroxyl group of serine 3 was modified with n-octanol (C8: 0) fatty acid in natural dallelin.
  • n-octanoyl (C8: 0) ghrelin peptide was chemically synthesized and the elution time was determined by reversed-phase HPLC.
  • the chemical synthesis of n-octyl (C8: 0) peptide was performed using a peptide synthesizer (ABI 433A, Applied Biosystems) to synthesize a peptide in which all functional groups except for the hydroxyl group of serine 3 were protected by the Fmoc solid phase method.
  • the hydroxyl group of serine 3 was acylated with n-octanoic acid and ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide in the presence of 4- (dimethylamino) pyridine.
  • the synthesized n-octanoyl peptide had the same elution time as the purified natural darellin (Fig. 2a).
  • the peptide fragments from the amino terminal to the fourth (Gly1-Phe4) which were obtained by treating synthetic n-octylphenol and natural ghrelin with chymotrypsin, showed the same elution time by reversed-phase HPLC. .
  • rat-derived natural ghrelin has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and has a structure in which the hydroxyl group of serine 3 is acylated with n-octanoic acid (caprylic acid) (FIG. 2c). It was concluded that there was.
  • human darelin was purified from human stomach extract, and its structure had the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the hydroxyl group of the third serine side chain from the amino terminal was n-octanoic acid (caprylic acid). It was found that the structure was simplified (Fig. 4a).
  • the structure of ghrelin derived from rat and human is the structure of the purified first peak fraction (elution time 55-56 minutes) of the active fractions in Fig. Lb.
  • the fatty acids modifying serine 3 were monoenoic acid (C8: l), ricopric acid (C10: 0) and its monoenoic acid (C10: l), and lauric acid (C12: 0) and its monoenoic acid (C12: l).
  • Example 3 chicken, red onion, and darelin of potato were purified from the stomach extract in the same manner as in Example 2, and the structural analysis was performed in the same manner as in Example 3. Its structure is such that chicken ghrelin has the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 25, penguin darellin has the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, and ghrelin ghrelin has the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 27. In each case, it was found that the hydroxyl group of the third serine side chain from the amino terminal was acylated with n-octanoic acid (force prillic acid).
  • African ghrelin has the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 28
  • rainbow trout ghrelin has the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 29 and 30
  • dog ghrelin has the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 31. It was found that each had a structure in which the hydroxyl group of the third serine side chain or threonine side chain from the amino terminus was acylated with n-octanoic acid (caprylic acid).
  • Natural ghrelin and n-octanol modified synthetic ghrelin had Ca-elevating activity, whereas unmodified synthetic ghrelin did not show significant Ca-elevating activity (Fig. 2b). Also, since n-octanoic acid or a mixture of n-octanoic acid and unmodified synthetic ghrelin did not show significant Ca-elevating activity, the n-octanoic acid group of natural ghrelin is important for Ca-elevating activity. There is I understood. Hereafter, dallelin means [0-n-octyl-serine 3] -ghrelin (Fig. 2c).
  • Ghrelin showed a higher intracellular calcium ion concentration (Ca-elevating activity) than GHRP-6 in CH0-GHSR62 cells, but GHRH (GH-releasing hormone, GRF in Fig. 3a) showed a Ca-elevating activity.
  • Fig. 3b Ca increasing activity of Darerin was observed from 10- 11 M, EC 5Q is 2. was 5 nM.
  • _GHRP-6 [RG Smith, et al., Science 260, 1640-1643 (1993)] 1 (in the presence of T 4 M)
  • Ghrelin suppresses the Ca-elevating activity, and at high concentrations of ghrelin, it returns to Ca-elevating activity in the absence of an antagonist (Fig. 3b).
  • Antisense primer 5'-AGTTGCAGAGGAGGCAGAAGCT-3 '
  • RT-PCR was performed on rat stomach-derived cDNA using the above two primers. As for the PCR conditions, one cycle was performed at 98 for 10 seconds, at 55 X for 30 seconds, and at 72 at 1 minute for 35 cycles. Using the amplified DNA fragment as a probe, a rat gastric cDNA library was screened. Screened recombinant phage approximately 2 x 10 5, co scratch rat-derived ghrelin To obtain a full-length cDNA.
  • Rat darelin cDNA was composed of the 501 bases shown in SEQ ID NO: 6, and encoded a ghrelin precursor (prepro-ghrelin) consisting of 117 amino acids (FIG. 4a). The amino-terminal 23 amino acid residues of the ghrelin precursor possessed the properties of a signal peptide.
  • Darrelin started with glycine 24, and the last two amino acids of mature ghrelin (Pro_Arg) were sequences that were cleaved by proteases.
  • a human stomach cDNA library was screened under low stringency conditions to obtain a full-length human ghrelin cDNA.
  • a human stomach cDNA library was prepared from human stomach poly (A) + RNA (Clontech) using a cDNA synthesis kit (Pharmacia).
  • the obtained full-length human ghrelin cDNA was composed of 511 bases shown in SEQ ID NO: 7, and encoded a human ghrelin precursor (prepro-ghrelin) consisting of 117 amino acids (FIG. 4a). Amino acid sequences of ghrelin precursors from rat and human showed 82.9% identity, indicating that ghrelin is highly conserved among species.
  • RNA isolated from various rat tissues was analyzed (Fig. 4b).
  • Nozzle blot analysis of rat tissue revealed a 0.62 kb darrelin precursor mRNA in the stomach.
  • Two faint bands were also observed in the ventricle (Ventricle), but these were 6.2 kb and 1.2 kb mRNAs, which were larger than those in the stomach, suggesting splicing of mRNA different from that in the stomach. . From the above results, it was found that the main expression site of ghrelin was in the stomach.
  • Example 6 Effect of darelin on pituitary hormone secretion
  • ghrelin has GH secretion-inducing activity in vitro and invivo I checked in.
  • an in vitro assay the effect of ghrelin on the initial cultured cells of the anterior pituitary was examined. Anterior pituitary glands were collected from 4-week-old male SD rats and dispersed by collagenase treatment. The cells were collected and DMEM (Dulbecco's modified Eagle's) containing 10 FCS (fetal fetal serum) and antibiotics was collected. The cells were washed twice with a medium and suspended in a DMEM medium to prepare early cultured cells of the anterior pituitary gland.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's
  • FCS fetal fetal serum
  • DH secretion-inducing activity of darelin was examined in vivo. After injecting 10 g of synthetic ghrelin into veins of male rats (250 g), blood was collected over time up to 60 minutes, and the concentration of pituitary hormone in plasma was measured by the above radioimmunoassay. . Of the pituitary hormones, only GH was released into the blood and peaked 5-10 minutes after intravenous injection of ghrelin. These results indicate that ghrelin released from the stomach into the blood acts on the anterior pituitary cells and releases GH into the blood. It was confirmed that ghrelin was a specific endogenous GH secretion inducer that had not been identified.
  • Example 7 Increased cardiac output in rats
  • the effects of acute administration of ghrelin on the cardiovascular system were examined using anesthetized rats. Using Wistar male rats (Cary) weighing 220-250 g, the rats were randomly divided into four groups (10, 1, 0.5, and 0.2 groups) to investigate the effects of acute administration of ghrelin on the cardiovascular system. . Dallerin was diluted with saline, and the dose per rat was adjusted to 10, 1, 0.5, and 0.2 ug, and the injection tube inserted into the right common vein for cardiac output measurement ( PE50) was administered from 120 1 acutely.
  • PE50 right common vein for cardiac output measurement
  • an infusion solution (physiological saline 100 1) was injected and the cardiac output was measured. The measurement was performed five times and the average value was used as the cardiac output. Mean blood pressure and cardiac output were measured before, and at 1, 5, 15, and 30 minutes after darelin administration. Peripheral vascular resistance was calculated by dividing mean blood pressure by cardiac output.
  • SEM 3.7 14.3 10.2 11.5 7.9 8.8
  • SEM represents the standard error of the mean (Standard Error Heans) ( Table 2).
  • SEM represents the standard error of the average value (Standard Error Heans). Increased cardiac output was observed at 1 minute and 5 minutes after administration in the darelin 1 g group (Table 1) and the darelin 10 g group (Table 2).
  • Example 8 From various sources Of ghrelin and ghrelin-27 in rice
  • Darrelin was purified from rat stomach extract by the method described in Example 2 using the Ca-elevating activity as an index.
  • the active fraction from secondary CM-HPLC (elution time 59 min in Fig.lb) was singly combined by reverse-phase HPLC using a // Bondasphere C-18 column (3.9 x 150 mm, Waters). Purified. Analysis of this fraction by electrospray mass spectrometry (ESI-MS) revealed a peak of molecular weight (3187.2 sq. 0.9), which was composed of 28 amino acids and was modified with octanoic acid (C8). It was about 126 smaller than natural ghrelin.
  • ESI-MS electrospray mass spectrometry
  • the amino acid sequence of this peptide was determined using a peptide sequencer (ABI 494, Applied Biosystems) and found to be Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala
  • the peptide was composed of 27 amino acid residues consisting of the sequence of Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys ProPro Ala Lys Leu Gin Pro Arg (Xaa is an unidentified amino acid). That is, it was composed of an amino acid sequence in which one glutamine at the thirteenth or fourteenth position from the amino terminus of darrellin consisting of 28 amino acids was deleted.
  • the Ca-elevating activity of this peptide was similar to that of 28 amino acid darelin, and was named darelin-27.
  • Human ghrelin-27 was isolated from the human stomach extract in the same manner as in the case of the rat, and it was confirmed that the extract was composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the peak fraction at 64-65 minutes was purified by the above secondary CM-HPLC and analyzed by electrospray ionization mass spectrometry (ES I-MS). As a result, the peak of molecular weight (3341.4, 0.9 soil) was obtained. Was observed. Since this fatty acid-modified peptide was composed of 28 amino acids, it was found that the third serine from the amino terminus of darelin (28 amino acids) was modified with decanoic acid (C10).
  • CDNA encoding the darelin 27 precursor was obtained by plaque hybridization using the rat stomach cDNA library prepared in Example 5 and the PCR-amplified DNA fragment prepared in Example 5 as a probe. Cloned. The nucleotide sequence of the cDNA was determined and confirmed to encode ghrelin-27 precursor. The obtained ghrelin-27 precursor cDNA had the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 and encoded a darelin-27 precursor consisting of 116 amino acids having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the human darrellin-27 precursor cDNA was cloned in exactly the same manner as described above, and the cDNA was obtained from a 116 amino acid consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 15 and having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13. Encoding a human ghrelin-27 precursor.
  • a cDNA encoding the precursor of ghrelin and ghrelin-27 derived from bushu was ligated to a plaque hybrid using the PCR-amplified DNA fragment described in Example 5 as a probe from the bushu cDNA library by the method described in Example 5. Issey Cloned with Yong.
  • the nucleotide sequence of the obtained cDNA clone was determined, and it was confirmed that the cDNA encodes the bushu-ghrelin precursor or bushu-ghrelin-27 precursor.
  • the obtained porcine darrellin precursor cDNA had the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 20 and encoded a darrellin precursor consisting of 118 amino acids having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18.
  • the ghrelin-27 precursor cDNA has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 and encodes a ghrelin-27 precursor consisting of 117 amino acids having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19.
  • busha d'allelin (28 amino acids) and busha ghrelin-27 (27 amino acids) consist of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 16 and 17, respectively.
  • a cDNA encoding a ghrelin precursor derived from persimmons, alfalfa or rainbow trout was prepared from various cDNA libraries by the method described in Example 5 using the PCR-amplified DNA fragment described in Example 5 as a probe. It was cloned by Lack Hybridization. The nucleotide sequence of the obtained cDNA clone was determined, and it was confirmed that it encodes a darelin precursor.
  • the obtained Perilla darrellin precursor cDNA comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 36
  • the African algae darrellin precursor cDNA comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 37
  • rainbow trout darrellin precursor The cDNA was composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 38 or 39.
  • the persimmon darrellin precursor has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32
  • the African algae darelin precursor has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33
  • the rainbow trout Ghrelin precursor is distributed It was found to have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 or 35. From rainbow trout, the amino acid sequence of the darelin-123 precursor shown in SEQ ID NO: 34 and the amino acid sequence of the darelin-120 precursor shown in SEQ ID NO: 35 were found.
  • ⁇ Si ghrelin precursor cDNA was cloned by PCR. That is, a stomach cDNA library was prepared using ghrelin derived from rat, human and pig and a synthetic DNA having a nucleotide sequence designed based on the amino acid sequence conserved in ghrelin-27 as a primer. PCR was performed as a template. The amplified DNA fragment had the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24, and encoded a part of the P. darrelin-27 precursor of SEQ ID NO: 23. Accordingly, P. dallelin-27 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In addition, DNA encoding the ghrelin (28 amino acid) precursor was not found in the DNA fragment amplified by the above PCR using the human stomach cDNA library 1 as type II.
  • the core amino acid sequence and modified fatty acid chains required for Ca-elevating activity are compared.
  • the optimal value of the length was determined.
  • the Ca-elevating activity was expressed as the concentration of ghrelin (EC50, nM) showing 50% of the maximum activity.
  • EC50, nM concentration of ghrelin showing 50% of the maximum activity.
  • Amino acid derivatives other than Fmoc- D Ser (C 8 H 17 ) and Fmoc-Ser (C 8 H 17 ) and synthetic reagents were purchased from PerkinElmer, Novabiochem or Watanabe Chemical.
  • a protected peptide derivative-resin was constructed by the Boc method or the Fmoc method, mainly using an Applied Biosystem 433A synthesizer manufactured by PerkinElmer.
  • the protected peptide resin obtained by the Boc method was deprotected with anhydrous hydrogen fluoride (HF) in the presence of p-cresol to release the peptide, which was then subjected to purification.
  • HF hydrous hydrogen fluoride
  • the protected peptide resin obtained by the Fmoc method was deprotected with trifluoroacetic acid (TFA) or diluted TFA containing various scavengers, and the released peptide was subjected to purification. Purification was performed by reverse phase HPLC using C4 or C18. The purity of the purified product was confirmed by reversed-phase HPLC, and the structure was confirmed by amino acid composition analysis and mass spectrometry.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • diluted TFA containing various scavengers various scavengers
  • the peptide of the present invention is produced by a usual peptide synthesis method.
  • books such as Chapter 2 and Chapter 3 (Tokyo Kagaku Dojin) of “Biochemical Experiment Course 1 Protein Chemistry” Volume 4 or “Development of Continuing Drugs 14 Peptide Synthesis” (Hirokawa Shoten) Can be produced by the method described in (1). Therefore, typical examples of the synthesis of the peptide of the present invention are shown below. Specifically, an example of the synthesis of an acylated peptide and an example of the synthesis of an alkylated peptide are shown.
  • dallelin derived from human hereinafter sometimes abbreviated as hGhrelin
  • rGhrelin dallelin derived from rat
  • trypsin chymotrypsin, or both enzymes in order
  • Ghrelin fragments (19Ghrelin (16-28), 20.hGhrel in (Table 15), 21.rGhrelin (Table 15), 23.hGhrel in (l-ll), 24.rGhrel in (ll 1), 25.
  • Ghrelin Table 10
  • Ghrelin (Table 4) was prepared, and those isolated by analytical HPLC were subjected to activity measurement. 41.
  • Rat Ghrelin is a natural product, 10. [Ser 3 (Butyryl)]-rGhrelin, 11. [Ser 3 (Hexanoyl)]-rGhrel in, 12. [Ser 3 (Decanoyl)] — rGhrelin, 13 [Ser 3 (Lauroyl)]-rGhrelin, 1.. [Ser 3 (Palmitoyl)]-rGhrelin was synthesized in the same manner as used for the synthesis of compound 1 hGhrelin and used for activity measurement.
  • DIPEA di isopropyl ethyl amine
  • TIPS tri isopropylsi lane
  • Boc-Gly Boc- Ser (Bzl), Boc-Ser (Ac), Boc-Ser (Prl), Boc-Glu (OBzl), Boc-His (Bom), Boc-Gin, Boc-Arg (Tos), Boc-Lys (Cl-Z) , Boc- Pro, Boc-Leu, Boc - Ala, Boc-Val, Boc-Phe, Boc-Cys (nC 8 H 17), Boc - Ape Boc-Ser (nC 8 H 17 )
  • the obtained protected peptide resin (1.3 g) was treated with iTFA-5% TIPS-methylene chloride solution (15 mL) for 30 minutes.
  • the peptide resin was collected by filtration, washed several times with methylene chloride (30 mL), and then washed with 5% DIEA (10 mL) and then with methylene chloride (30 mL).
  • de-Trt peptide resin (about 1.3 g) was swollen in NMP (10 mL), and octanoic acid (144.2 mg, 1.0 mmol) and DIPCI (126.2 mg, 1.0 mmol) were added in the presence of DMAP (61.1 mg, 0.5 tmol). Was added and reacted for 8 hours.
  • the resin was collected by filtration, washed with NMP and methylene chloride, and dried under reduced pressure to obtain about 1.2 g of a protected peptide resin in which the 3-chain serine side chain was octylylated.
  • Fmoc-amide resin (ABI, 403 mg, 0.25 mmol) with 20% piperazine for 20 minutes
  • Fmoc-amino acid introduction by HBTU / HOBt and de-Fmoc by piperazine were repeated sequentially.
  • Fmoc- Ser (Bu -Ser (Trt ) - Phe-Leu- Ser (Bu ') _ Pro-Glu (0Bu 1) - His (Boc) - tree
  • the fat was built.
  • Boc-Gly by DCC / HOBt the obtained protected peptide resin (about 550 mg) was treated with 1HTA-53 ⁇ 4TIPS-methylene chloride solution (10 mL) for 30 minutes.
  • the peptide resin was collected by filtration, washed with methylene chloride (30 m or several times, then with 5% DIEA (10 mL), and then with methylene chloride (30 mL). After swelling in NMP (10 mL), octanoic acid (144.2 mg, 1.0 mmol) and DIPCI (126.2 mg, 1 mmol) were added thereto in the presence of DMAP (61.1 mg, 0.5 ol), and reacted for 4 hours.
  • Protected rat ghrelin resin (4-28) was constructed from Boc-Arg (Tos) -Pam resin (0.75 g, 0.5 ol) with Boc Chemistry, and half of the amount was reduced to 1.4 g.
  • Boc-Ser (CO-CH 2 CH 3) -OH, Boc-Ser (Bz 1) -OH, condensed with Boc-Gly- OH.
  • HF p-cresol
  • Ether was added to the residue to obtain 671 mg of crude peptide. Dissolve this in 50% acetic acid (AcOH)
  • ESI-MS 3371.0 (theoretical 3370.9), amino acid composition ratio: Ser; 3.53 (4), Glx;
  • ESI-MS 3231.0 (theoretical 3230.7), amino acid composition ratio: Ser .; 3.50 (4), Glx; 5.90 (6), Gly; 0.98 (1), Ala; 2.00 (2), Leu; 2, Phe; 1.01 (1), Lys;
  • ESI-MS 3245.0 (theoretical 3242.8), amino acid composition ratio: Ser; 3.42 (4), Glx; 5.93 (6), Gly; 1.00 (1), Ala; 2.00 (2), Leu; 2, Phe; 1.10 ( 1), Lys; 4.97 (5), His; 0.99 (1), Arg; 1.99 (2), Pro; 3.83 (4)
  • ESI-MS 3377.0 (theoretical 3376.9), amino acid composition ratio: Ser; 3.06 (4), Glx; 5.92 (6), Gly; 0.93 (1), Ala; 0.98 (1), Val; 0.99 (1), Leu; 2, Phe; 1.13 (1), Lys; 4.03 (4), His; 1.08 (1), Arg; 3.00 (3), Pro; 3.76 (4)
  • ESI-MS 3369.0 (theoretical 3368.9), Amino acid composition ratio: Ser; 3.59 (4), Glx;
  • Amino acid composition ratio after hydrolysis for 2 hours at 150 Ser; 1.02 (2), Gly; 1.00 (1), Leu; ⁇ , Phe; 1.00 (1), His; 0.95 (1), Pro; 0.99 (1 )
  • Amino acid composition ratio after hydrolysis for 2 hours at 150 Ser; 1.04 (2), Gly; 1.00
  • the obtained peptide resin (550 mg) was washed with NMP, and in the presence of HOBt (135.1 mg, 1 mmol), DIPCI (126.2 mg, 1 mmol) and octanoic acid (144.2 mg, 1.0 mmol) was added and reacted for 4 hours.
  • the resin was collected by filtration, washed with NMP and methylene chloride, and dried under reduced pressure to obtain about 600 mg of a protected peptide resin in which the amino terminal Gly amino group was converted to octyl.
  • Trifluoroacetic acid 120 ml was added to the Boc-Ser (C 8 H17 ) (6.88 g, 21.7 tmol) under ice cooling, and the mixture was stirred at room temperature for 0.5 hour. After trifluoroacetic acid was distilled off under reduced pressure, the obtained residue was dissolved in getyl ether (120 ml), 4N hydrochloric acid-dioxane (22 ml) was added, and the mixture was stirred under ice-cooling for 1 hour. The precipitated crystals were collected by filtration, and 5.23 g (yield) of H-Ser (C 8 H 17 ) HC1 as colorless crystals were obtained.
  • Boc- NH- (CH 2) 4 -C0 -Ser (C 8 H 17) was obtained -Phe-Leu-Oxime resin 370 mg. It was suspended in about 5 mL of DMF, and benzylamine hydrochloride (180 mg, 1.25 mmol), triethylamine (173 L, 1.25 mmol), and 72 L (1.25 mmol) of acetic acid were added and stirred. After 24 hours, the resin was removed by filtration, the filtrate was distilled off under reduced pressure, and the protected Boc was precipitated with 10 mL of IN HC1. After washing with water and drying, 5 mL of TFA was added and reacted for 30 minutes to remove Boc.
  • ESI-MS M 3335.0 (theoretical 3334.8) Amino acid composition ratio: Ala; 1.00 (1), Arg; 2.96 (3), Glx; 5.92 (6), Gly; 1.00 (1), His; 1.01 (1), Leu; 2_ (2), Lys; 4.00 (4), Phe; 1.02 (1), Pro; 4.08 (4), Ser; 3.58 (4), Val; 0.98 (1)
  • the obtained protected peptide resin (550 mg) was treated with TFA (10 mL) for 30 minutes. The resin was removed by filtration, the filtrate was concentrated, and ether was added to the residue to precipitate, thereby obtaining 120 mg of a crude peptide. Dissolve the product in 10 mL of 5% acetic acid (AcOH), add to YMC-Pack-0DS-A (5 urn, 20 x 250 mm), and add 0.1% to 60% of acetonitrile in trifluoroacetic acid. Eluted with a linear gradient (flow rate: 10 mL / min) for 60 minutes. The desired fraction was collected and lyophilized to give 44 mg of the desired product.
  • AcOH 5% acetic acid
  • YMC-Pack-0DS-A 5 urn, 20 x 250 mm
  • 0.1% to 60% of acetonitrile in trifluoroacetic acid Eluted with a linear gradient (flow rate: 10 mL / min) for 60 minutes
  • Fmoc-Ser (Bu ')-Cys (Trt) -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-Glu (0Bu')-His (Boc) -Gln (Trt)- Arg (Pmc) -Val-Gln (Trt) -Gln (Trt) -Arg (Pmc) -Lys (Boc) -Glu (OBu ') -Ser (Bu 1 ) -Lys (Boc) -Lys (Boc) -Pro -Pro-Ala-Lys (Boc) -Leu-Gln (Trt) -Pro-Arg (Pmc) -HMP resin was constructed.
  • ESI-MS 3503.0 (theoretical 3503.1), amino acid composition ratio: Ser; 2.42 (3), Glx; 5.77 (6), Gly; 1.00 (1), Ala; 1.01 (1), Val; 0.94 (1), Leu;
  • reaction solution was washed several times with chloroform to remove excess 4,4'-dithiodipyridine and pyridone derivative.
  • the aqueous layer (10 mL) containing [thiopyridyl Cys 3 ] -hGhrelinO-28) was adjusted to pH 7.4 with 5% NH 3 water, and 2 mL of an acetonitrile solution of topanolthiol (4.5 mg, 34.2 ⁇ 1) was added. added.
  • reaction mixture After 1 hour, add the reaction mixture to YMC-PackODS-A (C18, 20 dragons x 250 mm), and in 0.13 ⁇ 4 trifluoroacetic acid, acetonitrile (60 min linear gradient from ⁇ to 54 (flow rate: lOmL / min) The desired fraction was collected and lyophilized to give 15 mg of the desired product.
  • ESI-MS 3391.0 (theoretical 3391.0), amino acid composition ratio: Ser; 2.76 (3), Glx; 5.81 (6), Gly; 0.99 (1), Ala; 1.01 (1), Val; 0.95 (1), Leu;
  • Fmoc- Ser (Bu l ) -As (OP is) -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-Glu (OBu ') -His (Boc)-Gln (Trt) -Arg (Pmc)-Vatro Gln (Trt)-Gln (Trt)-Arg (Pmc)-Lys (Boc)-Glu (0B u ') -Ser (Bu l ) -Lys (Boc) -Lys (Boc) -Pro-Pro-Ala-Lys (Boc) -Leu-Gln (Trt) -Pro-Arg (Pmc) -HMP resin was constructed.
  • the obtained protected peptide resin (1.3 g) was treated with 4FA-methylene chloride solution (15 mL) for 15 minutes.
  • the peptide resin was collected by filtration, washed several times with methylene chloride (30 mL), then 4% DIEA (10 mL), and then methylene chloride. (30 mL).
  • de-Pis peptide resin (about 1.3 g) was swollen in NMP (10 mL), and water-soluble carbodiimide hydrochloride (191.7 mg, l. ( ⁇ Mol), H0Bt (135.2 mg, 1.0 mmol), n-peptylamine (115.2 mg, 1.0 mmol) was added and reacted for 8 hours.
  • the resin was collected by filtration, washed with NMP and methylene chloride, and dried under reduced pressure to obtain about 1.2 g of a protected peptide resin in which the Asp side chain at position 3 was heptylamidated.
  • 88% TFA_5 phenol - 2% TIPS-5 deprotecting reagent consisting of 3 ⁇ 4 H 2 0 (10 mL) was added, followed by stirring at room temperature for 2 hours.
  • the resin was removed by filtration, the filtrate was concentrated, and ether was added to the residue to precipitate.
  • the precipitate was collected by filtration and dried to obtain about 550 mg of a crude peptide.
  • Fmoc-Arg (Pmc) -HMP-resin (ABI, 403 mg, 0.25 mmol) After treating Fmoc-Arg (Pmc) -HMP-resin (ABI, 403 mg, 0.25 mmol) with 20 piperazines for 20 minutes, Fmoc-amino acid introduction by HBTU / HOBt and piradine successively Repeat Fmoc removal and repeat Boc-Gly-Ser (tBu) -Lys (Mtt) -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-Glu (OBu ')-His (Boc) -Gln (Trt) -Arg ( Pmc) -Val-Gln (Trt) -Gln (Trt) -Arg (Pmc) -Lys (Boc) -Glu (OB u 1 )-Ser (Bu ')-Lys (Boc)-Lys (
  • the peptide resin was collected by filtration and washed several times with methylene chloride (30 mL). Washed with DIEA (10 mL) and then with methylene chloride (30 mL). The obtained de-Mttpeptide resin (about 300 mg) was swollen in NMP (2 mL), and in the presence of H0Bt (34 mg, 0.25 mmol), octanoic acid (401, 0.25 mmol), DCC (52 mg, (0.25 mmol) and reacted overnight.
  • the resin was collected by filtration, washed with NMP and methylene chloride, and dried under reduced pressure to obtain about 300 mg of a protected peptide resin having a 3-terminal lysine side chain octylylated. To this was, 88% TFA-5% phenol -. 23 ⁇ 4 TIPS- 5 deprotecting reagent consisting of 3 ⁇ 4 H 2 0 (5 mL) was added, followed by stirring at room temperature for 2 hours. The resin was removed by filtration, the filtrate was concentrated, and ether was added to the residue to form a precipitate. The precipitate was collected by filtration and dried to obtain about 234 mg of a crude peptide.
  • ESI-MS 3371.0 (theoretical 3370.9), amino acid composition ratio: Asx; 0.99 (1), Ser; 2.70 (3), Glx; 5.87 (6), Gly; 1.01 (1), Ala; 1.01 (1), Val ; 0.94 (1), Leu; 2, Phe; 1.00 (1), Lys; 4.02 (4), His; 1.00 (1), Arg; 2.98 (3), Pro; 3.84 (4)
  • ESI-MS 3370.0 (theoretical 3369.9), amino acid composition ratio: Asx; 0.88 (1), Ser; 2.95 (3), Glx; 5.97 (6), Gly; 1.21 (1), Ala; 1.03 (1), Val;
  • ESI-MS M 3355.0 (theoretical 3355.0) Amino acid composition ratio: Ala; 1.01 (1), Arg; 2.91 (3), Glx; 5.95 (6), Gly; 1.01 (1), His; 0.91
  • ESI-MS M 3412.0 (theoretical value 3412.0) Amino acid composition ratio: Ala: 1.05 (1), Arg; 3.05 (3), Glx; 6.02 (6), Gly; 1.00 (1), His; 1.00
  • ESI-MS M 3343.0 (theoretical 3343.9), amino acid composition ratio: Ala; 1.00 (1), Arg; 3.03 (3), Glx; 5.94 (6), Gly; 1.01 (1), His; 1.01 (1) , Leu;
  • ESI-MS M 3305.0 (theoretical 3304.8), amino acid composition ratio: Ala; 0.99 (1), Arg; 2.96 (3), Glx; 5.86 (6), Gly; 1.00 (1), His; 1.00 (1) , Leu; 2 (2), Lys; 3.98 (4), Phe; 2.01 (2), Pro; 3.99 (4), Ser; 2.67 (3), Val; 0.98 (1)
  • ESI-MS M 3411.0 (theoretical 3410.9), amino acid composition ratio: Ala; 1.02 (1), Arg; 3.01 (3), Glx; 5.92 (6), Gly; 1.01 (1), His + Cha; 2.01 ( 1 + 1), Leu; 2 (2), Lys; 4.02 (4), Phe; 1.01 (1), Pro; 4.03 (4), Ser; 2.72 (3), Val; 0.97 (1)
  • ESI-MS M 3354.0 (theoretical 3354.9), amino acid composition ratio: Ala; 1.00 (1), Arg; 2.95 (3), Glx; 5.87 (6), Gly; 1.02 (1), His; 1.01 (1) , Leu; 2 (2), Lys; 3.98 (4), Phe; 1.01 (1), Pro; 3.94 (4), Ser; 2.73 (3), Val; 0.97 (1), al;. D. (1 )
  • ESI-MS M 3355.0 (theoretical 3354.9), amino acid composition ratio: Ala; 1.02 (1), Arg; 2.95 (3), Glx; 5.96 (6), Gly; 1.00 (1), His; 0.92 (1) , Leu; 2 (2), Lys; 3.94 (4), Phe; 0.99 (1), Pro; 4.02 (4), Ser; 2.91 (3), Val; 0.98 (1), Nal; ND (2)
  • ESI-MS M 3270.0 (theoretical 3270.8), amino acid composition ratio: Ala; 0.98 (1), Arg; 2.96 (3), Glx; 5.87 (6), Gly; 0.99 (1), His; 1.01 (1) 0.98 (1), Leu; 2 (2), Lys; 3.97 (4), Phe; 1.00 (1), Pro; 3.97 (4), Ser; 2.65 (3), Val; 0.98 (1)
  • ESI-MS M 3286.0 (theoretical 3285.8), amino acid composition ratio: Ala; 1.02 (1), Arg; 2.94 (3), Glx; 5.95 (6), Gly; 0.99 (1), His; 0.92 (1) , Leu; 2 (2), Lys; 4.92 (5), Phe; 0.99 (1), Pro; 4.02 (4), Ser; 2.91 (4), Val; 0.99 (1)
  • ESI-MS M 3270.0 (theoretical 3270.8), amino acid composition ratio: Ala; 1.01 (1), Arg; 2.98 (3), Glx; 5.92 (6), Gly; 1.02 (1), His; 1.01 (1) , Leu; 2 (2), Lys; 4.01 (4), Phe; 1.01 (1), Pro; 4.01 (4), Ser; 2.71 (3), Val; 0.98 (1), Nle; ND (1)
  • ESI-MS M 3256.0 (theoretical 3256.8), amino acid composition ratio: Ala; 0.98 (1), Arg; 2.96 (3), Glx; 5.84 (6), Gly; 1.00 (1), His; 1.01 (1) , Leu; 2 (2), Lys; 3.97 (4), Phe; 0.99 (1), Pro; 3.94 (4), Ser; 2.64 (3), Val; 1.97 (2)
  • Example 11 Activity comparison of ghrelin derivative peptide compounds The Ca-elevating activity of the ghrelin derivative peptide-based compound synthesized in Example 10 and the natural darelin peptide was measured by the method described in Example 1.
  • a striking structural feature of ghrelin is the octanoyl group at the 3-position serine hydroxyl group.
  • the position of the amino acid modified with the octyl group is particularly preferably the 3-position in the ghrelin molecule.
  • Rat darelin The intracellular calcium-increasing activity of the desoctanoyl derivative from which the octanol group of the 3-position serine side chain is removed decreases from 2.6 nM of the octanoyl derivative to 3,500 nM. It is clear that the octanoyl group plays a very important role in the expression of the activity.
  • n.t. indicates that the test was not performed.
  • fatty acid chain length on activity is EC 5 at the acetyl group (C2). Values 780 nM, EC 5 "value blanking evening Noiru group (C4) becomes increasingly noticeable and 280 nM, EC 5. Value further rises 16 nM and C a rising activity Kisano I le group (C7) to The EC 5 value was 1.5 nM for the octanol group (dalelin) and the Ca-elevating activity peaked, and the EC 5 5 was 1.7 nM for the decanoyl group (C10) and the Ca-elevating activity was ghrelin. equally held, EC 5 o values at more lauroyl group (C12) 2. 4 nM and, Even with palmitoyl group ( C16 ), EC 5Q value is 6.5 nM, even if fatty acid chain length is extended
  • 3-phenylpropyl acid HO- CO- CH 2 CH 2 Ph
  • 3-position arsenide Togurerin derivative serine hydroxyl in to an ester bond
  • unsaturated fatty acids As 3-octenoic acid (CH 3 (CH 2 ) 3 CH-CH-CH 2 C00H), and as a representative example of a branched fatty acid, 4 _methylpentanoic acid ((CH 3 ) 2 CH-CH 2 CH 2 C0 2 H ) was esterified with a human darrellin derivative to evaluate its activity.
  • a chemically stable ghrelin derivative can be produced by converting a chemically unstable ester bond into a more stable ether or thioether bond. However, it is needless to say that the activity is maintained.
  • the EC 5D values of the octylated ethers and thioethers of serine or cysteine at position 3 where chemical stability can be expected are maintained at 1.2 nM and 5.4 nM, respectively. It turned out that it need not be an acyl group.
  • Ser (Bzl) at position 3 (derivative of benzylated serine at position 3 of human darrellin (_CH 2 Ph)) or Cys (Trt) [substitute serine at position 3 of human darrellin with cysteine and tritylated 3 )
  • the ghrelin substituted with also has an E ( ⁇ value of 7.6 nM and 20 nM, respectively, and maintains Ca-elevating activity. (Table 13, compounds 67 and 68).
  • Table 8 shows the activities of the short-chain derivatives having a carboxylic acid at the carboxyl terminal and the short-chain derivatives having amidated lipoxyl terminals.
  • Dallerin (1-3) amide had relatively low Ca-elevating activity (EC 50 > 10,000 nM) o Dallerin (1-4) with extended fenilalanine had an EC 50 value of 480 nM and its carboxyl Terminal amide is 160 nM and Ca increasing activity Became remarkable.
  • the Darerin (1 9) 5. EC 5C value from 38 nM by amidation 4 nM and C a rising activity about 7 times, ghrelin (1- 4) In The EC 50 values from 480 nM The activity to increase Ca at 160 nM was increased about 3-fold. Further, sagging phosphorus (1 one 9) In 9 of basic residues dripping phosphorus (1- 8) histidine residues were removed amide amides, EC 50 values are 13 nM next C a rising activity from 5. 4 nM reduced, on the one hand, the acidic amino acid at a position 8 Darerin that glutamate removal (1 7) amide, EC 5 conversely. The value increased from 13 nM to 2.6 nM, and the Ca increasing activity increased.
  • N a of the blocked amines Amino terminal - Asechiru - Natsuta activity is relatively weak ghrelin (1 -10). (EC 5 > 10,000 nM). Also I mentioned above sea urchin, [New alpha - Okutanoiru, serine 3] - Ghrelin (1-9) amide from that activity has decreased relatively weak (Table 1 Compound 6) (EC 5 ()> 10, 000 ⁇ ), It is preferable that the amino group at the amino terminal is not blocked in the expression of the Ca elevating activity.
  • Position serine residue from the results - NH-CH (CH 2 0H ) - CO- is the partial structure of Aminopentan acid - since it can be replaced with a CH 2 -CH 2 _CO-, at least 2-position serine residue of Gurerinamino terminal It plays the role of a spacer that keeps the amino group at a certain distance from the 3-octanoyl group.
  • the activity was maintained by the substitution of 5-aminopentanoic acid because the basicity of the amino terminal was increased by the introduction of the alkylamine structure.
  • the dalysine residue at the amino terminal has its amino group, imparts basicity to the amino terminal of the darelin molecule, and expresses the activity of darelin. Preferably, it is not blocked.
  • the serine residue at position 2 is considered to play a spacer-like role of keeping the amino group at the amino terminal at a certain distance from the amino group at position 3, so amino acids having relatively small bulky side chains can be used. It may be replaced with a non-amino acid compound. That is, in the darelin molecule, the amino group at the amino terminal is used as a base point. The position of the ctanoyl group is defined, and this positional relationship forms part of the ghrelin active structure.
  • the amino acid side chain at the 2-position amino acid is preferably an amino acid residue having a relatively small side chain and not restricting the degree of freedom of neighboring residues, such as serine, alanine, and norparin, rather than a bulky structure.
  • EC 5 of a derivative having an aromatic hydrophobic amino acid such as tributophan, cyclohexylalanine, and naphthylalanine in the 3-position The values were 31 nM, 19 nM and 8.2 nM, respectively, and the Ca-elevating activity was retained. Surprisingly, introduction of fenilalanine to position 3 had somewhat lower C a -elevating activity, Even when Ser (Bzl) or Cys (Trityl) with increased hydrophobicity was introduced at the 3-position, the Ca-elevating activity was similarly maintained. It was confirmed that.
  • C a is generally lower, though somewhat lower than when an aromatic amino acid is introduced. Elevating activity was retained.

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Description

明 細 書 新規ペプチド 技術分野
本発明は、ぺプチド中のアミノ酸が修飾されていることを特徴とした、 細胞内カルシウム濃度を上昇させる作用あるいは成長ホルモンの分泌誘 導活性を有する新規ペプチドに関する。 本願発明はまた、 当該新規ぺプ チドの取得方法及び製造方法、 該ぺプチド及び該ぺプチドの前駆体をコ —ドする遺伝子、 及び当該遺伝子を用いた該ペプチド及び該ペプチドの 前駆体の製造方法に関する。 さらに本願発明は、 本願発明により開示さ れた新規修飾ペプチドの構造類似体で、 成長ホルモン分泌誘導化合物の レセプ夕一に結合して細胞内カルシウム濃度を上昇させる作用あるいは 成長ホルモンの分泌誘導活性を有するペプチド類縁体及びその製造方法 に関する。 本願発明はまた、 該ペプチド若しくは該ペプチド類縁体を有 効成分とする医薬用組成物、 動物用成長促進剤、 又は該ペプチドの抗体 若しくはその利用方法に関する。 背景技術
成長ホルモン （growth hormone、 以下単に GHと略称する） は、 下垂体 前葉で合成されるタンパク質ホルモンで、 骨の成長及び脂肪細胞や軟骨 細胞の分化を間接的に促進し、 その分泌は、 成長ホルモン放出ホルモン (GHRH; growth hormone-releasing hormone) で促進され、 ソマ卜ス夕 チン （somatostatin) で阻害される [J. Kendrew, et al. , Eds. , The Encyclopedia of Molecular Biology (Blackwel 1 Science Ltd. , London, 1994), p.462 ] 。 GH は単に成長を促すだけではなく、 各種組織での夕 ンパク質合成の促進、 貯蔵脂肪の移動の刺激及び筋肉中のダリコーゲン 含量の上昇などの作用もあり、 GH分泌の低下は小人症を、 過剰分泌は巨 人症又は末端肥大症を惹起する [八杉龍一ら編， 岩波生物学辞典第 4版 (岩波書店， 東京， 1997)， 757頁] 。
ヒト GHが遺伝子組換え技術によって生産されるようになって以来、 GH は上記小人症の治療 [J. 0. Jorgensen, Endocr. Rev. 12, 189 (1991)] だけでなく、 他の疾患の治療にも用いられ、 様々な効果が見いだされた [J. 0. Jorgensen, et al. , Horm. Res. 42， 235 (1994)] 。 例えば、 正 常人での骨芽細胞及び骨再構成の活性化 [ K. Brixen, et al., Miner. Res. 5, 609 (1990)] 、 GH欠乏症成人での筋肉量及び筋力の増強 [R. C. Cuneo, et al.， J. Ap l. Physiol. 70, 688 (1991)] 、 GH 欠乏症成人 での運動能力の向上 [ R. C. Cuneo, et al. , J. Appl. Physiol. 70, 695 (1991)]、 小児の重度火傷治癒 [D. N. Herndon, et al. , Ann. Surg. 212, 424 (1990)]、排卵誘発におけるゴナンドトロピンとの併用 [R. Homburg, et al. , Clin. Endocrinol. (Oxf). 32, 781 (1990)]、 プレドニゾン投 与によるタンパク質代謝異常の予防 [F. F. Horber and M. W. Haymond, J. Clin. Invest. 86， 265 (1990)]、 重度免疫不全症における T細胞 「教 育」 の促進 [W. J. Murphy, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 4481 (1992)]、 老人性の体重減少、 脂肪組織拡大及び皮膚萎縮を抑 制する効果 [D. Rudman, et al, N. Engl. J. Med. 323, l' (1990)] など がある。
小児の成長促進、及び成人の GH欠乏に伴う代謝や機能の欠損の正常化 に、組換え GHの投与は効果的ではあるが、用量限定的な副作用があるこ と、 経口投与ができないこと及びコスト面で問題がある [B. A. Lefker, et al. , in Growth Hormon Secretagogues in Clinical Practoce, B. B. Bercu and R. F. Walker, Eds. (Marcel Dekker, Inc. , New York, 1998), p. 107-p.108 ] 。 多くの成人患者は、 過剰なナトリウムと体液の貯留に よると思われる関節痛や手根管症候群のような副作用のため、 GH投与を 継続することができない [E. Corpas, et al. , Endocr. Rev. 14, 20 (1993)]。 これらの副作用は、 GH投与によるホルモン分泌の非生理的な パターンと関係しており、 GH の投与では正常な GH 分泌の拍動性 (pulsatility) をまねることができない [ B. A. Lefker, et al. , in Growth Hormon Secretagogues in Clinical Practoce, B. B. Bercu and R. F. Walker, Eds. (Marcel Dekker, Inc. , New York, 1998), p. 107-p. 108] 。
生体内での GH分泌の拍動性は、基本的には視床下部由来の 2つの制御 因子の相互作用によって確立される、すなわち GHRHとソマトス夕チンが 下垂体に作用して GH 分泌を制御している [G. S. Tannenbaum and N. Ling, Endocrinology 115, 1952 (1984), R. G. Clark and I. C. Robinson, Endocrinology 122, 2675 (1988)], 正常な GH分泌のパ夕一ンは昼夜で 異なり、 夜間に、 より多くの GHがより頻繁に放出される。 GHの放出パ ルスの振幅は、 種々のステロイド ·ホルモン、 神経伝達物質、 GHとイン シュリン様成長因子によるフィードバック、 栄養状態、 睡眠及び運動に よって、 さらに調節される [J. S. Strobl and M. J. Thomas, Pharmacol. Rev. 46, 1 (1994)] 。
上に記載した GH投与に伴う副作用を克服するために、 GH分泌誘導活 性を有する化合物が数多く合成され、 GH 分泌誘導物質 （GHS; growth hormone secretagogue) としてその構造活性相関、 薬理学、 臨床応用が 精力的に研究された。 まず、 GHRP-6 (Growth Hormone-Releasing hexapeptide) などのペプチドが合成され、 GH の欠損乃至は低下に起因 する治療薬として開発された [C. Y. Bowers, et al. , Endocrinology 114, 1537-1545 (1984)] 。 しかし、 これらのペプチド化合物は静脈注射でし か効果を発揮できないので、 経口投与可能な低分子量の非ペプチド系化 合物が開発され [R. G. Smith, et al. , Science 260, 1640-1643 (1993)]、 第二相臨床試験の段階にまで進んでいるものもある [A. A. Patchett, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92, 7001-7005 (1995)] 。 細胞における、 レセプターのシグナル受容から機能発現に至るまでの 一連の情報伝達をシグナル伝達 （signal transduction) というが、 G夕 ンパク質と共役したシグナル伝達系は以下のような機構で進行する [ 八杉龍一ら編， 岩波生物学辞典第 4版 （岩波書店， 東京， 1997)， 555-556頁]。この Gタンパク質共役系は細胞膜 7回貫通型レセプターを もち、 CAMPをセカンドメッセンジャーとして産生する cAMP系とイノシ トール- 1, 4, 5-三リン酸 （IP3) ゃジァシルグリセロール （DG) イノシト 一ルリン脂質情報伝達系に分けられる。 cAMPは cAMP依存性のキナーゼ (A キナーゼ） を活性化し、 機能タンパク質のセリンゃトレオニン残基 のリン酸化を起こし、 活性を修飾する。 一方、 IP3は小胞体上の IP3受 容体と結合し、 カルシウムイオンの遊離を促し、 DGは Cキナーゼを活性 化してホルモンなどの作用発現を促す。
IP3や DGをセカンドメッセンジャーとするシグナル伝達系で、細胞内 カルシウムイオン濃度が上昇する機構は以下の如くである [J. Kendrew, et al. , Eds. , The Encyclopedia of Molecular Biology (Blackwel 1 Science Ltd., London, 1994), p.136-137] 。 レセプ夕一ヘリガンドが 結合すると、 Gタンパク質を介してホスホリパーゼ Cが活性化されて、 PIP2から IP3が生成する。 IP3は細胞内顆粒である ERなどの小胞体に貯 蔵されているカルシウムイオンを細胞質に放出させ、 細胞質中のカルシ ゥムイオン濃度が上昇する。 IP3 もしくはカルシウムイオンがさらに細 胞質に存在すると、 カルシウムは再び小胞体に取り込まれ、 細胞質中の カルシウムイオン濃度は低下する。 すなわち、 レセプターへのリガンド の結合は、細胞質中のカルシウムイオン濃度の一過性の上昇をもたらす。
GHSは GHRHによる GHの分泌及び細胞内 cAMPレベルの上昇に協奏的に 作用すること [K. Cheng, et al. , Endocrinology 124, 2791-2798 (1989)]、及び GHRHのレセプ夕一への結合は cAMPをセカンドメッセンジ ヤーとして産生するのに対して、 GHS は細胞内カルシウムイオン濃度の 上昇をもたらすことから、 GHSの作用機作は GHRHのそれとは異なるこ とが示唆され [J. Herrington and B. Hi lie, Endocrinology 135, 1100-1108 (1994). ] 、 GHSは GHRHが結合する GHRHレセプタ一とは異な るレセプ夕一に結合することが想定された。 実際に GHSが結合するレセ プター遺伝子がクローニングされ、 ノザン解析の結果から GHSレセプ夕 一 (GHS-R) は視床下部及び脳下垂体で発現していること、 及びブタとヒ ト由来の GHS-Rのアミノ酸配列が 90 以上の同一性を示すことがわかつ た [A. D. Howard, et al. , Science 273， 974-977 (1996)] 。 しかし、 GHS-Rに結合する内在性のリガンドは単離されておらず、 この GHS- Rは リガンドが不明なォ一ファン · レセプ夕一であった。
タンパク質のァミノ末端又はタンパク質を構成するアミノ酸残基の側 鎖に、 ミリスチン酸、 ゲラニル酸、 パルミトイル酸、 又はフアルネシル 酸などの脂肪酸が結合することがあるが、 これらの脂肪酸の役割はこれ らの脂肪酸修飾タンパク質を細胞膜にアンカーリング（anchoring)する ことにある [J. Kendrew, et al. , Eds. , The Encyclopedia of Molecular Biology (Blackwell Science Ltd. , London, 1994), p.616] 。 これらの 脂肪酸修飾タンパク質において、脂肪酸はシスティン残基に S-ァシル結 合で結合しており、 本願発明によって開示された内在性の GHSのように セリン残基に 0-ァシル結合で脂肪酸が結合したアミノ酸、 この脂肪酸修 飾アミノ酸を含むタンパク質及びペプチドは全く知られていなかった。 また、 脂肪酸で修飾されたアミノ酸を含むペプチドが、 いかなるレセプ 夕一のリガンドとして機能することも知られていなかった。 発明の開示
本発明を詳細に説明するに先立ち、 用語を以下のように定義する。 ペプチドとは、 複数のアミノ酸がペプチド結合で連なった化合物のこ とをいう。 ここでアミノ酸（又はアミノ酸残基とも表現する）とは、 アミ ノ酸の一般式； NH2-CH (R' ) -C00H において、 R'が天然に存在する置換基 を有する天然アミノ酸の他、 その D, L-光学異性体等を含む。
天然アミノ酸が修飾アミノ酸（又は修飾アミノ酸残基と表現する）で置 換されている場合もある。 修飾アミノ酸は、 上記一般式の置換基 がさ らに修飾されたアミノ酸及びその D, L-光学異性体ばかりではなく、例え ば上記一般式の置換基 R'において、エステル、エーテル、チォエステル、 チォエーテル、 アミド、 カルバミド又はチォカルバミド等を介して又は 介さずに、 様々な置換基が結合した非天然アミノ酸も含む。 また、 アミ ノ酸のアミノ基に低級アルキル基が置換されている非天然アミノ酸も含 まれる。
ぺプチド類縁体とは、 ぺプチドにおいて少なくとも 1つのアミノ酸が 非アミノ酸化合物で置換された化合物のことをいい、 従って当該置換化 合物のぺプチド類縁体への少なくとも 1つの結合はべプチド結合ではな い。
また、 これらペプチド及びペプチド類縁体のアミノ末端及び Z又は力 ルポキシル末端が修飾された化合物を誘導体とし、 ペプチド、 ペプチド 類縁体及びそれらの誘導体を総称してペプチド系化合物とした。
配列番号 2記載のァミノ酸配列において少なくともァミノ末端から 4 番目乃至 1 0番目までのアミノ酸配列とは、 以下に掲げる配列をいう。
G l y Ser Ser Phe、 Gly Ser Ser Phe Leu、
Gly Ser Ser Phe Leu Ser、
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro,
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu、
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His, 又は、
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln。
GHS レセプ夕一に結合して細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる か、又は GH分泌を誘導する活性を有する内在性のリガンド、すなわち内 在性 GHSの発見及び利用方法が所望されていた。さらに、当該内在性 GHS の構造類似体で、 細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させるか、 又は GH 分泌誘導活性を有する化合物が望まれていた。 また、 当該内在性 GHS又 はその構造類似化合物を含有し、 GHの拍動的な分泌を誘導することによ つて GH 投与による副作用のない医薬組成物あるいは動物の成長を促進 するための組成物、及び当該組成物を用いた治療方法が所望されていた。 本願発明者らは、 GHSレセプ夕一 （GHS-R) へのリガンドの結合がイノ シトールリン脂質をセカンドメッセンジャーとして細胞内カルシウムィ オン濃度の一過性の上昇をもたらすことに着目し、 GHS-R を発現させた CH0 細胞 （CH0- GHSR62) において細胞内カルシウムイオン濃度を上昇さ せる活性 （Ca上昇活性） を指標に、 各種臓器又は組織の抽出物をスクリ 一二ングした。その結果、 ラット胃の抽出物に強い Ca上昇活性があるこ とを見いだし、当該抽出物より各種クロマトグラフィーを用いて Ca上昇 活性を有する物質を精製して、 該物質が脂肪酸で修飾された分子量約 3, 000 の新規ペプチドであることを見いだした。 さらに当該新規べプチ ドが、下垂体前葉細胞からの GHの特異的な分泌を促進することを確認し て、 該新規ペプチドが GHS- R の内在性のリガンド、 すなわち内在性 GH 分泌誘導物質 （内在性 GHS) であることを見出した。 すなわち、 本願発 明の第一は、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性又は GH分泌 誘導活性を有し、 構成アミノ酸残基が脂肪酸で修飾されていることを特 徴とする内在性の GH分泌誘導ペプチド、及び該ペプチドの取得方法であ る。
本願発明者らは、該内在性 GH分泌誘導べプチドの構造を詳細に解析し、 該ぺプチドが配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるぺプチドであり、 ァミノ末端から 3番目のセリン側鎖の水酸基が脂肪酸でァシル化されて いることを見出した。 またラットと同様、強い Ca上昇活性が存在するヒ ト胃抽出物中からも、ラット由来の GH分泌誘導べプチドと同様の方法で 精製及び構造解析を行った結果、ヒト由来の内在性 GH分泌誘導べプチド も配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなり、 ァミノ末端から 3番目の セリン側鎖の水酸基が脂肪酸でァシル化されていることがわかった。 ラ ット及びヒト由来の内在性 GH 分泌誘導ペプチドのアミノ酸配列を比較 すると全体で 89 %の高い同一性を示した。
より詳しくは、ラットとヒトではアミノ末端から 10番目までのァミノ 酸配列及び 13〜28番目のアミノ酸配列は同一であるが、 1 1番目と 12番 目のアミノ酸がラットでリジン、 ァラニンであり、 ヒトでこれらがそれ ぞれアルギニン、 バリンに置換されている点で相違している。 ラット由 来の内在性 GH分泌誘導べプチドを各種プロテア一ゼで切断し、精製した ペプチド断片の Ca上昇活性を測定した結果、アミノ末端から 7番目まで のアミノ酸配列からなるペプチドが Ca 上昇活性を有する最小のぺプチ ドであった。
さらに、化学合成したペプチドの Ca上昇活性の測定などから、 Ca上昇 活性発現に必須のコァ配列は配列番号 8に記載の 4アミノ酸からなる配 列であることがわかった。 また、 ラット以外のヒト、 ブタ、 ゥシから分 離した内在性 GH分泌誘導ペプチド （28アミノ酸）およびこれらのぺプチ ドから 1つグルタミンが欠失した内在性 GH分泌誘導べプチド（27ァミノ 酸） のいずれにおいても、 配列番号 9に記載の 1 0アミノ酸からなる配 列が保存されていた。
すなわち、 本願発明の第 2は、 配列番号 8に記載のアミノ酸配列、 望 ましくは配列番号 1に記載のアミノ酸配列、 より望ましくは配列番号 9 に記載のアミノ酸配列を Ca上昇活性発現に必須のコア配列として含む脂 肪酸修飾ペプチドである。
なお、 ニヮトリ、 ゥナギ、 力エルからも内在性 GH分泌誘導ペプチドが 単離され、 配列番号 8に記載の 4アミノ酸からなるコア配列を有してい ることがわかった。
一方、 力エルからもラッ卜の内在性 GH分泌誘導ペプチドと非常に類似 性の高い内在性 GH分泌誘導べプチドが単離された。
さらに、 アフリカッメガエル、 ニジマス、 ィヌからも内在性 GH分泌誘 導ペプチドが単離された。 なお、 ニジマスからは、 2 3アミノ酸からな るダレリン— 2 3と、 2 0アミノ酸からなるダレリン一 2 0とが単離さ れた。
なお、 ゥナギのグレリン、 ニジマスのダレリン一 2 3およびグレリン — 2 0の力ルポキシル基末端のアミノ酸はアミド化されていた。
また、 アフリカッメガエルの内在性 GH分泌誘導ペプチドはァミノ末端 から 3番目のアミノ酸残基がトレォニンであったことから、 本発明は、 配列番号 8に記載のアミノ酸配列、 望ましくは配列番号 1に記載のアミ ノ酸配列、 より望ましくは配列番号 9に記載のァミノ酸配列のァミノ末 端から 3番目のアミノ酸残基セリンをトレオニンに変換したペプチドを Ca上昇活性発現に必須のコア配列として含む脂肪酸修飾ペプチドにも関 する。 本願発明によって開示された GH 分泌誘導活性をもつ内在性脂肪酸修 飾ペプチド又は上記コア配列からなる脂肪酸修飾ペプチドは、 Ca上昇活 性を有する化合物の設計指針も提供する。
すなわち、 本発明の第三は、 当該脂肪酸修飾ペプチドの構造類似化合 物を合成し、該構造類似化合物の Ca上昇活性を確認することにより、 Ca 上昇活性を有する新規化合物を取得することである。 従って、 細胞内力 ルシゥムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド又はペプチド類 縁体において、 構成アミノ酸が修飾アミノ酸又は非アミノ酸化合物で置 換された化合物も本願発明に属することはいうまでもない。
内在性 GH分泌誘導べプチドをコ一ドする CDNAを常法により取得した。 配列番号 4及び 5に記載したアミノ酸配列に示された如く、 ラット及び ヒトの cDNAはいずれも 1 17アミノ酸からなり、 アミノ末端から 24番目 ないし 51番目まで 28アミノ酸の配列がラット及びヒトの内在性 GH分泌 誘導ペプチドのアミノ酸配列と各々一致した。すなわち、 内在性 GH分泌 誘導ペプチドは 117アミノ酸からなる前駆体ペプチドとして合成され、 ァミノ末端側の 23アミノ酸からなるシグナルべプチドが切断を受け、さ らにカルポキシル末端側の 56アミノ酸が切断除去されて GH分泌誘導活 性をもつ脂肪酸修飾ペプチドが生成することが明らかになった。 また、 ブ夕からも 28アミノ酸からなる内在性 GH分泌誘導べプチドの前駆体を コードする cDNAが見いだされた。
さらに、 ブ夕からも 27アミノ酸からなる内在性 GH分泌誘導ペプチド の前駆体をコードする cDNAが見いだされた。
また、 ゥシからも 27アミノ酸からなる内在性 GH分泌誘導ペプチドの 前駆体をコードする cDNAが部分的であるが見いだされた。
またさらに、 ゥナギ、 アフリカッメガエル、 ニジマスからも内在性 GH 分泌誘導ペプチドの前駆体をコードする cDNAが見いだされた。なお、二 ジマスからは、 2 3アミノ酸からなるダレリン一 2 3の前駆体をコード する cDNAと、 2 0アミノ酸からなるグレリン一 2 0の前駆体をコ一ドす る c飄とが単離された。
従って、本願発明の第 4は、 内在性 GH分泌誘導ペプチドの前駆体をコ ―ドする cDNA及び当該 cDNAを用いた Ca上昇活性を有する脂肪酸修飾べ プチド又はべプチド類縁体の原料となるぺプチドの製造方法である。 ラット胃抽出物から 28アミノ酸で構成される内在性 GH分泌誘導ぺプ チド （ダレリン） を精製する際に、 マイナー画分として回収されるぺプ チドを解析したところ、 ダレリンの 1 3番目若しくは 1 4番目のダル夕 ミンが 1つ欠失した 27 アミノ酸からなるペプチド （ダレリン- 27) を見 いだした。 グレリン- 27は 28アミノ酸からなるダレリンと全く同様の Ca 上昇活性および GH分泌誘導活性を有しており、 内在性の GH分泌誘導べ プチドであるから、 該グレリン -27も本発明に属する。
ダレリンの 1 3番目および 1 4番目のグルタミンをコ一ドしている塩 基配列は、 gca gcaであり mRNAのスプライシング （sp l i c i ng) が起こる ェクソンの末端の配列であり、 異つたスプライシングが起こることによ り、 2つのグルタミンのコドンのうち 1つが脱落した cDNAが生成する可 能性が示唆された。 実際にラット及びヒ卜の cDNAライブラリーを探索し たところ、 2 7アミノ酸からなるグレリン- 27の前駆体ペプチドをコ一ド する cDNAが見つかった。
すなわち、 ラットおよびヒトのグレリン -27ぺプチドは、配列番号 1 2 又は 1 3に記載した 1 1 6 アミノ酸からなる前駆体ペプチドとして合成さ れ、ァミノ末端側の 23ァミノ酸からなるシグナルべプチドが切断を受け、 さらに力ルポキシル末端側の 56アミノ酸が切断除去されて 27アミノ酸 からなる GH分泌誘導活性をもつ脂肪酸修飾べプチドとして生成すること が明らかになった。 また、ブ夕およびゥシからもグレリン- 27ペプチドの前駆体をコ一ドす る cDNAが見いだされ、 これらの動物においてもグレリン -27およびその 前駆体の存在が確認された。
すなわち、 配列番号 1 0， 1 1 , 1 7および 2 2記載のアミノ酸配列 からなるグレリン- 27ペプチド、 及び配列番号 1 2、 1 3、 1 9および 2 3記載のアミノ酸配列を有するグレリン- 27前駆体べプチド、並びに配列 番号 1 4、 1 5、 2 1、 および 2 4に記載の塩基配列を有する該前駆体 ペプチドをコ一ドする cDNAも本発明に属することはいうまでもない。 本願発明で開示された Ca 上昇活性を有する脂肪酸修飾ペプチド又は Ca上昇活性を有するぺプチド類縁体等のぺプチド系化合物は、 GHの欠損 又は低下に起因する疾患を治療するための医薬組成物も提供する。 該医 薬組成物は GH の投与が有効である全ての疾患に用いることができ、 GH の投与によって生じる様々な副作用を克服することができる。 また、 該 医薬組成物は動物の成長促進剤などの動物用薬剤としても用いることが できる。
本発明に係るペプチド系化合物は脳室内投与および静脈内投与によつ て食欲増進作用があることから、 食欲不振や拒食症を治療するための食 欲増進剤として用いることができる。 また、 運動および胃酸分泌を促進 する作用があることから、 非潰瘍性消化不良、 突発性軽症胃アトニー、 機能性消化不良および逆流性食道炎等の胃機能性疾患の治療剤として用 いることもできる。 さらに、 静脈内投与により骨髄、 十二指腸および空 腸において細胞増殖促進作用が認められれたことから、腸管粘膜保護剤、 経静脈栄養時の小腸粘膜障害予防剤及び骨粗鬆症治療剤として用いるこ ともできる。
本願発明で開示された Ca 上昇活性を有する脂肪酸修飾ペプチドを抗 原として調製された抗体、当該抗体を用いた内在性 GH分泌誘導べプチド の測定方法、 及び該抗体を具備した測定キットも本願発明に属する。 また、 グレリンのァミノ末端側及び力ルポキシル末端側のペプチドに 対する抗体を作成し、 前者が 3位セリンを修飾している脂肪酸を特異的 に認識することを利用して、 脂肪酸で修飾されたグレリンと脂肪酸が脱 離したグレリンとを分別定量することができるアツセィ方法、 およびグ レリンのァミノ末端側ペプチドに対する抗体と力ルポキシル末端側のぺ プチドに対する抗体とを組み合わせた検査キットも本願発明に属する。 すなわち本願発明は、 ァシル化セリンという新規修飾アミノ酸を有す る新規ペプチドホルモンを提供し、 又当該ペプチドの構造を基本骨格と する Ca上昇活性有する化合物の新規設計指針をも提供する。
さらに、 本願発明によって開示された脂肪酸修飾ペプチド、 GH放出ホ ルモン及びソマトス夕チンによる GH分泌誘導機構の解明は、 単に GH分 泌誘導機構に限らず他のホルモン分泌制御機構にも敷衍することが示唆 される。 本願発明は、 脂肪酸修飾ペプチドの循環器系および代謝系の制 御因子としての多様な機能を開示するものであり、 本願発明の効果は新 しい生体制御機構の解明にも及ぶものである。
具体的には本発明は
( 1 ) 細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するぺプチ ドの少なくともひとつのアミノ酸が、 修飾アミノ酸及び/又は非ァミノ 酸化合物により置換されていることを特徴とするペプチド系化合物又は その薬学的に許容される塩、
( 2 ) ( a )配列番号 2記載のアミノ酸配列又は（b ) 当該配列において 少なくともァミノ末端から 4番目乃至 1 0番目までのアミノ酸配列を有 し、 かつ該アミノ酸配列以外の部分において、 少なくともひとつのアミ ノ酸が欠失、 置換及び 又は付加されたアミノ酸配列を含む前記 （ 1 ) 記載のぺプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、 (3) 配列番号 3、 4、 5、 8、 9、 1 0、 1 1、 1 2、 1 3、 1 6、 1 7、 1 8、 1 9、 22および 23記載のアミノ酸配列からなる群から 選択されるひとつのアミノ酸配列を有する前記 （2) 記載のペプチド系 化合物又はその薬学的に許容される塩、
(4) 配列番号 25、 26、 2 9、 30、 3 1、 32、 34および 3 5 記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を 有する前記 （2) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される
« 、
(5)細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモン の分泌を誘導する活性を有するペプチドの （a) 構成アミノ酸が修飾され ているか又はされていない、 かつ （b) 少なくともひとつのアミノ酸が非 アミノ酸化合物により置換されているか又はされていないべプチド系化 合物又はその薬学的に許容される塩、
(6) 配列番号 27、 28および 33記載のアミノ酸配列を有する前記 (1) 又は （5) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される ri、
(7) (a) 配列番号 2記載のアミノ酸配列又は （b) 当該配列において 少なくともァミノ末端から 4番目乃至 1 0番目までのアミノ酸配列を有 し、 かつアミノ末端から 4番目乃至 1 0番目までのアミノ酸配列以外の 部分において、 少なくともひとつのアミノ酸が欠失、 置換及び Z又は付 加されたアミノ酸配列を含む前記 （5) 記載のペプチド系化合物又はそ の薬学的に許容される塩、
( 8 ) 配列番号 3、 4、 5、 8、 9、 1 0、 1 1、 1 2、 1 3、 1 6、 1 7、 1 8、 1 9、 22および 23記載のアミノ酸配列からなる群から 選択されるひとつのアミノ酸配列を有する前記 （7) 記載のペプチド系 化合物又はその薬学的に許容される塩、 (9) 配列番号 25、 26、 29、 30、 3 1、 32、 34および 3 5 記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を 有する前記 （7) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される
•ϋ、
(1 0) ァミノ末端の 1番目から 4番目に至るまでのアミノ酸配列に相 当する部分が、 下記の式で表される前記 （ 1) 又は （5) 記載のぺプチ ド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
A-B-C-D-
Α ; アミノ酸、 非アミノ酸化合物、 又はなし、
Β ; アミノ酸、 非アミノ酸化合物、 又はなし、
(ただし、 Α+Βの分子鎖長がジペプチド相当長ある、）
C又は D；同一であっても異なっていてもよく、 （a)修飾されたァ ミノ酸、 又は （b) 疎水性側鎖を有するアミノ酸、
を表す、
( 1 1) じが、 アミノ酸の α炭素に、 （a) 炭素数 1以上のアルキレン基 を介して又は介さず、 エステル、 エーテル、 チォエーテル、 アミドまた はジスルフィ ド結合を介して炭素数が 1若しくは複数の飽和若しくは不 飽和アルキル鎖、 又は （b) 炭素数 1以上の飽和若しくは不飽和アルキ ル鎖を導入した修飾ァミノ酸であり、 Dが疎水性側鎖を有するァミノ酸 であることを特徴とする前記 （ 1 0) に記載のペプチド系化合物又はそ の薬学的に許容される塩、
(1 2) 配列番号 2、 3、 9、 1 0、 1 1、 1 6、 1 7、 22、 25、 26、 27、 28、 29、 30および 3 1記載のアミノ酸配列からなる 群から選択されるひとつのアミノ酸配列において、 ァミノ末端の 1番目 から 4番目に至るまでのアミノ酸配列に相当する部分が前記 （1 0) ま たは （1 1) に記載のペプチド系化合物であるペプチド系化合物又はそ の薬学的に許容される塩、
( 1 3) 修飾されたアミノ酸がアミノ末端から 3番目のアミノ酸である 前記 （1)、 （2)、 （3)、 （5)、 (7) または （8) 記載のペプチド系化 合物又はその薬学的に許容される塩、
(14) 修飾されたアミノ酸におけるアミノ酸がセリン又はシスティン であることを特徴とする前記 （1 3) 記載のペプチド系化合物又はその 薬学的に許容される塩、
(1 5)アミノ酸の α炭素に、 （a)炭素数 1以上のアルキレン基を介し て又は介さず、 エステル、 エーテル、 チォエステル、 チォエーテル、 ァ ミド又はカルバミド結合を介して炭素数が 1若しくは複数の飽和若しく は不飽和アルキル鎖、 又は （b) H又は炭素数 1以上の飽和若しくは不 飽和アルキル鎖を導入した修飾アミノ酸を含有する前記 （ 1 )、 （2)、
(3)、 （5)、 (7) または （8) 記載のペプチド系化合物又はその薬学 的に許容される塩、
( 1 6)修飾アミノ酸が、 アミノ酸の α炭素に、 （a) 炭素数 1以上のァ ルキレン基を介して又は介さず、 エステル、 ェ一テル、 チォエステル、 チォエーテル、 ジスルフィ ド、 アミド、 カルバミド又はチォカルバミド 結合を介して炭素数が 1若しくは複数の飽和若しくは不飽和アルキル鎖， 又は （b) 炭素数 1以上の飽和若しくは不飽和アルキル鎖を導入したァ ミノ酸である前記（ 1)、 （2)、 （4)、 （5)、 （6)、 （7)、 （9)、 ( 1 0) または（ 1 2)記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、 ( 1 7 )エステル結合により修飾された修飾アミノ酸を有する前記（ 1、 2、 3、 5、 7または 8記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容 される塩、
(18) アミノ酸の側鎖の官能基がエステル結合を形成することにより 修飾された修飾アミノ酸を有する前記 （ 1)、 （2)、 （4)、 （5)、 （6)、 (7)、 （9)、 （1 0)、 ( 1 1) または （ 1 2) 記載のペプチド系化合物 又はその薬学的に許容される塩、
( 1 9) アミノ酸の側鎖の水酸基に脂肪酸がエステル結合したアミノ酸 を有する前記 （1 7) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容さ れる塩、
(20) 脂肪酸が、 アミノ酸の側鎖の水酸基にエステル結合又はメルカ ブト基にチォエステル結合したアミノ酸を有する前記 （1 8) 記載のぺ プチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(2 1)炭素数が 2乃至 35である脂肪酸が結合したアミノ酸を有する前 記 （ 1 9) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(22) 脂肪酸が炭素数 2乃至 35である前記 （20) のペプチド系化合 物又はその薬学的に許容される塩、
(23) 炭素数が 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 14、 1 6および 1 8 の脂肪酸からなる群から選ばれた脂肪酸が結合したアミノ酸を有する前 記 （2 1) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(24) 脂肪酸が炭素数 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 14、 1 6および 1 8の脂肪酸からなる群から選ばれた脂肪酸である前記 （22) 記載のぺ プチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(2 5) 結合した脂肪酸がオクタン酸 （octanoic acid), 又はそのモノ ェン脂肪酸若しくはそのポリェン脂肪酸である前記 （23) 記載のぺプ チド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(26) 脂肪酸がオクタン酸 （octanoic acid), 又はそのモノエン脂肪 酸若しくはそのポリェン脂肪酸である前記 （24) 記載のペプチド系化 合物又はその薬学的に許容される塩、
( 27 ) 結合した脂肪酸がデカン酸 （decanoic acid), 又はそのモノェ ン脂肪酸若しくはそのポリェン脂肪酸である前記 （23) 記載のぺプチ ド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(28) 脂肪酸がデカン酸 （decanoic acid), 又はそのモノエン脂肪酸 若しくはそのポリェン脂肪酸である前記 （24) 記載のペプチド系化合 物又はその薬学的に許容される塩、
(29) 前記 （1) 乃至 （28) 記載のペプチド系化合物のカルボキシ ル末端に、 更に塩基性アミノ酸が結合していることを特徴とするぺプチ ド系化合物、
(30) N末端が炭素数 1以上の飽和あるいは不飽和アルキル又はァシ ル基により修飾され及び/又は C末端のカルボキシル基の 0Hが 0Z又は NR2R3 (Zは薬学的に許容し得る陽イオン又は低級の分枝鎖又は非分枝鎖 アルキル基、 R2及び R3は H及び低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基 からなる群から選択される互いに同一又は異なる基を示す） であること を特徴とする前記 （ 1), (2), (3)， （5)， （7)， （8)， （1 3)， (1 4)， （1 5)， （1 7)， （ 1 9)， （2 1)， (23), (25), (27) 項記 載のペプチド系化合物、
(3 1) ァミノ末端のアミノ基が、 炭素数 1以上の飽和あるいは不飽和 アルキル基又はァシル基の導入により修飾され及び Z又はカルボキシル 末端のカルボキシル基の 0Hが 0Z又は NR2R3(Zは薬学的に許容し得る陽 イオン又は低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基を示し、 R2及び R3は H 及び低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基からなる群から選択される互 いに同一又は異なる基を示す、）であることを特徴とする前記（ 1)，（2)， (4)， (5), (6), (7)， （9), ( 1 0)， （1 1)， （1 2)， （1 6)， (1 8)， （20)， (22), (24)， （26)， (28), (29) 項記載のぺプ チド系化合物、
( 32) 前記 （30) または （3 1) 記載のペプチド系化合物の力ルポ キシル末端アミド誘導体に、 更に塩基性基を導入したことを特徴とする ぺプチド系化合物、
(33) 前記 （ 1) 乃至 （32) 記載のペプチド系化合物又はその薬学 的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物、
(34) 前記 （ 1) 乃至 （32) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的 に許容される塩を有効成分とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因す る疾患を治療するための医薬組成物、
(35)成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、 前記 （1) 乃至 （32) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容 される塩を含有することからなる成長ホルモンの欠損又は減少に起因し ない疾患を治療するための医薬組成物、
(36) ヒト以外の動物に適用するための前記 （33) 乃至 （3 5) 記 載の医薬組成物、
(37) 前記 （ 1) 乃至 （32) 記載のペプチド系化合物又はその薬学 的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物を投与することからなる 成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法、
(38)成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、 前記 （1) 乃至 （32) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容 される塩を含有する医薬組成物を投与することからなる成長ホルモンの 欠損又は減少に起因しない疾患の治療方法、
( 39) ヒト以外の動物に適用するための前記 （3 7) 又は （38) 記載 の治療方法、
(40) 前記 （ 1) 乃至 （32) 記載のペプチド系化合物のアミノ酸配 列をコードする DNAであって、当該 DNAがコ一ドするアミノ酸配列中に、 少なくともひとつのァミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチド をコードする塩基配列を有する当該 DNA、
(4 1) 塩基配列が、 配列番号 6、 7、 14、 1 5、 20、 2 1、 24、 36、 37、 38および 39記載の塩基配列からなる群から選ばれた一 つの塩基配列である前記 （40) 記載の DNA、
(42) 塩基配列が、 配列番号 6、 7、 14、 1 5、 20、 2 1、 24、 36、 37、 38および 39記載の塩基配列からなる群から選ばれた一 つの塩基配列中、 アミノ酸をコードしている塩基配列である前記（40) 記載の DNA、
(43) 前記 （40) 乃至 （42) 記載の DNAを有するベクター、 (44) 前記 （43) 記載のベクターを含有する細胞、
(45)前記（40) 乃至（42)記載の DNAを有するベクタ一を有し、 且つ当該 DNAにコードされるアミノ酸配列を有するぺプチド系化合物が、 当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されたべプチ ド系化合物として産生することができる細胞、
(46)前記（1)乃至（32)記載のペプチド系化合物に対する抗体、 (47) 前記 （46) 記載の抗体を用いて前記 （ 1) 乃至 （32) 記載 のペプチド系化合物を検出することを特徴とする前記（1) 乃至（32) 記載のぺプチド系化合物のアツセィ方法、
(48) 前記 （46) 記載の抗体を用いて前記 （1) 乃至 （32) 記載の ペプチド系化合物を検出することを特徴とする前記 （1) 乃至 （32) 記 載のペプチド系化合物の検出用キット、
( 49) 前記 （1) 乃至 （32) 記載のペプチド系化合物を遺伝子組換 え技術を用いて製造する方法において、 前記 （40) 乃至 （42) 記載 の DNAを含有するべクタ一により、 当該べプチド中の少なくともひとつ のアミノ酸の側鎖を修飾することができる宿主細胞を形質転換し、 得ら れた形質転換細胞を培養して培養物から目的のペプチド系化合物を採取 することからなる前記 （1) 乃至 （32) 記載のペプチド系化合物の製 造方法、 (50) 前記 （ 1) 乃至 （32) 記載のペプチド系化合物を遺伝子組換 え技術を用いて製造する方法において、 前記 （40) 乃至 （42) 記載 の DNAを含有するベクターにより宿主細胞を形質転換し、 得られた形質 転換細胞を培養して培養物から目的物質を採取後、 任意のアミノ酸を化 学的に修飾することを特徴とする前記 （1) 乃至 （32) 記載のぺプチ ド系化合物の製造方法、
(5 1) 前記 （ 1 9) 乃至 （28) 記載のペプチド系化合物を遺伝子組 換え技術を用いて製造する方法において、 脂肪酸をアミノ酸の側鎖の水 酸基にエステル結合又はメルカプト基にチォエステル結合させる活性を 有する細胞を用いることを特徴とする前記 （ 1 9) 乃至 （28) 記載の ぺプチド系化合物の製造方法、
(52) 配列番号 8記載のアミノ酸配列中のセリンの側鎖の水酸基に脂 肪酸をエステル結合させるセリンァシル化活性を有する細胞を用いるこ とを特徴とする前記 （1 9) 乃至 （28) 記載のペプチド系化合物の製 造方法、
(53) 配列番号 28記載のアミノ酸配列中のトレォニンの側鎖の水酸 基に脂肪酸をエステル結合させるァシル化活性を有する細胞を用いるこ とを特徴とする前記 （1 9) 乃至 （28) 記載のペプチド系化合物の製 造方法、
( 54) 前記 （1) 乃至 （32) 記載のペプチド系化合物のアミノ酸配 列をコ一ドする DNAを含有するべクタ一を生体内細胞に組み込み、 細胞 内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する少なくともひとつ の修飾されたアミノ酸を有するペプチドを発現することにより、 成長ホ ルモンの欠損又は減少に起因する疾患を治療するための遺伝子治療用医 薬組成物、
(55) 前記 （1) 乃至 （32) 記載のペプチド系化合物のアミノ酸配 列をコードする DNAを有するベクタ一を、 当該 DNAにコードされるアミ ノ酸配列を有するぺプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつの ァミノ酸が修飾されうる認識配列を有するぺプチドとして産生すること ができる生体内の細胞に組み込むことにより、 成長ホルモンの分泌を誘 導する活性を有するぺプチドを発現させることを特徴とする成長ホルモ ンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法、
( 5 6 ) 前記 （ 1 ) 乃至 （3 2 ) 記載のペプチド系化合物のアミノ酸配 列をコ一ドする DNAを含有するべクタ一を生体内細胞に組み込み、 細胞 内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する、 少なくともひと つの修飾されたアミノ酸を有するペプチドを発現することにより成長ホ ルモンの欠損又は減少に起因しない疾患を治療するための遺伝子治療用 医薬組成物、 および
( 5 7 ) 前記 （ 1 ) 乃至 （3 2 ) 記載のペプチド系化合物のアミノ酸配 列をコードする DNAを有するベクターを、 当該 DNAにコードされるアミ ノ酸配列を有するペプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつの ァミノ酸が修飾されうる認識配列を有するぺプチドとして産生すること ができる生体内の細胞に組み込むことにより、 成長ホルモンの分泌を誘 導する活性を有するぺプチドを発現させることを特徴とする成長ホルモ ンの欠損又は減少に起因しない疾患の治療方法、
に関する。
また具体的には、 本発明は、
( 1 ) 細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するぺプチ ドの少なくともひとつのアミノ酸が、 修飾アミノ酸及び 又は非ァミノ 酸化合物により置換されていることを特徴とするペプチド系化合物又は その薬学的に許容される塩、
( 2 ) ( a ) 配列番号 2記載のアミノ酸配列又は（b ) 当該配列において 少なくともァミノ末端から 4番目乃至 10番目までのアミノ酸配列を有 し、 かつ該アミノ酸配列以外の部分において、 少なくともひとつのアミ ノ酸が欠失、 置換及び/又は付加されたアミノ酸配列を含む前記 （1) 記載のぺプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(3) 配列番号 3、 4、 5 , 8、 9、 10、 1 1、 12、 13、 16、 17、 18、 19、 22、 23、 25及び 26記載のアミノ酸配列から なる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を有する前記 （2) 記載の ぺプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(4)細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモン の分泌を誘導する活性を有するペプチドの （a)構成アミノ酸が修飾され ているか又はされていない、 かつ （b) 少なくともひとつのアミノ酸が非 アミノ酸化合物により置換されているか又はされていないべプチド系化 合物又はその薬学的に許容される塩、
(5) 配列番号 27記載のアミノ酸配列を有する前記 （1) 又は （4) 記載のぺプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(6) (a)配列番号 2記載のアミノ酸配列又は（b) 当該配列において 少なくともァミノ末端から 4番目乃至 10番目までのアミノ酸配列を有 し、 かつアミノ末端から 4番目乃至 10番目までのアミノ酸配列以外の 部分において、 少なくともひとつのアミノ酸が欠失、 置換及び Z又は付 加されたアミノ酸配列を含む前記 （4) 記載のペプチド系化合物又はそ の薬学的に許容される塩、
( 7 ) 配列番号 3、 4、 5、 8、 9、 10、 1 1、 12、 13、 16、 17、 18、 19、 22、 23、 25及び 26記載のアミノ酸配列から なる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を有する前記 （6) 記載の ぺプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(8) ァミノ末端の 1番目から 4番目に至るまでのアミノ酸配列に相当 する部分が、 下記の式で表される前記 （ 1) 又は （4) 記載のペプチド 系化合物又はその薬学的に許容される塩、
A-B-C-D-
A ; アミノ酸、 非アミノ酸化合物、 又はなし、
B ; アミノ酸、 非アミノ酸化合物、 又はなし、
(ただし、 A+Bの分子鎖長がジペプチド相当長ある、）
C又は D；同一であっても異なっていてもよく、 （ a)修飾されたァ ミノ酸、 （b) 疎水性側鎖を有するアミノ酸、 又は （c) 塩基性側鎖を有 するアミノ酸、
を表す、
(9) 配列番号 2、 3、 8、 9、 1 0、 1 1、 1 6、 1 7、 22、 2 5 及び 26記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのァミノ 酸配列において、 ァミノ末端の 1番目から 4番目に至るまでのアミノ酸 配列に相当する部分が前記 （8) に記載のペプチド系化合物であるぺプ チド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(1 0)修飾アミノ酸が、 アミノ酸の α炭素に、 （a) 炭素数 1以上のァ ルキレン基を介して又は介さず、 エステル、 エーテル、 チォエステル、 チォェ一テル、 ジスルフィ ド、 アミド、 カルバミド又はチォカルバミド 結合を介して炭素数が 1若しくは複数の飽和若しくは不飽和アルキル鎖、 又は （b) 炭素数 1以上の飽和若しくは不飽和アルキル鎖を導入したァ ミノ酸である前記 （1) 乃至 （9) 記載のペプチド系化合物又はその薬 学的に許容される塩、
(1 1) アミノ酸の側鎖の官能基がエステル結合を形成することにより 修飾された修飾アミノ酸を有する前記 （ 1) 乃至 （ 1 0) 記載のぺプチ ド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
( 1 2) アミノ酸の側鎖の水酸基又はメルカプト基に、 脂肪酸がエステ ル結合したアミノ酸を有する前記 （ 1 1) 記載のペプチド系化合物又は その薬学的に許容される塩、
( 1 3) 脂肪酸が炭素数 2乃至 3 5である前記 （1 2) 記載のペプチド系 化合物又はその薬学的に許容される塩、
(14) 脂肪酸が炭素数 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 14、 1 6および 1 8の脂肪酸からなる群から選ばれた脂肪酸である前記 （ 1 2) 記載のぺ プチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
( 1 5) 脂肪酸がオクタン酸 （octanoic acid), 又はそのモノエン脂肪 酸若しくはそのポリェン脂肪酸である前記 （1 2) 記載のペプチド系化 合物又はその薬学的に許容される塩、
( 1 6) 脂肪酸がデカン酸 （decanoic acid), 又はそのモノエン脂肪酸 若しくはそのポリェン脂肪酸である前記 （1 2) 記載のペプチド系化合 物又はその薬学的に許容される塩、
( 1 7) ァミノ末端のアミノ基が、 炭素数 1以上の飽和あるいは不飽和 アルキル基又はァシル基の導入により修飾され及び Z又はカルボキシル 末端のカルボキシル基の 0Hが 0Z又は NR2R3(Zは薬学的に許容し得る陽 イオン又は低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基を示し、 R2及び R3は H 及び低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基からなる群から選択される互 いに同一又は異なる基を示す、） であることを特徴とする前記 （ 1) 乃至 ( 1 6) 記載のペプチド系化合物、
( 1 8) 前記 （1) 乃至 （ 1 6) 記載のペプチド系化合物のカルボキシ ル末端に、 更に塩基性アミノ酸が結合していることを特徴とするぺプチ ド系化合物、
( 1 9) 前記 （1) 乃至 （1 6)、 又は （ 1 8) 記載のペプチド系化合物 の力ルポキシル末端アミド誘導体に、 更に塩基性基を導入したことを特 徵とするペプチド系化合物、 (20) 前記 （ 1) 乃至 （ 1 9) 記載のペプチド系化合物又はその薬学 的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物、
(2 1) 前記 （ 1) 乃至 （1 9) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的 に許容される塩を有効成分とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因す る疾患を治療するための医薬組成物、
(22)成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、 前記 （1) 乃至 （ 1 9) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容 される塩を含有することからなる成長ホルモンの欠損又は減少に起因し ない疾患を治療するための医薬組成物、
(23) ヒト以外の動物に適用するための前記 （20) 乃至 （22) 記 載の医薬組成物、
(24) 前記 （ 1) 乃至 （ 1 9) 記載のペプチド系化合物又はその薬学 的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物を投与することからなる 成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法、
(25)成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、 前記 （1) 乃至 （ 1 9) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容 される塩を含有する医薬組成物を投与することからなる成長ホルモンの 欠損又は減少に起因しない疾患の治療方法、
(26) ヒト以外の動物に適用するための前記 （24) 又は （2 5) 記載 の治療方法、
(27) 前記 （ 1) 乃至 （1 9) 記載のペプチド系化合物のアミノ酸配 列をコ一ドする DNAであって、当該 DNAがコ一ドするアミノ酸配列中に、 少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するペプチド をコ一ドする塩基配列を有する当該 DNA、
( 28) 塩基配列が、 配列番号 6、 7、 14、 1 5、 20、 2 1および 24記載の塩基配列からなる群から選ばれた一つの塩基配列である前記 (2 7) 記載の DNA、
(2 9) 塩基配列が、 配列番号 6、 7、 14、 1 5、 20、 2 1および 24記載の塩基配列からなる群から選ばれた一つの塩基配列中、 ァミノ 酸をコードしている塩基配列である前記 （27) 記載の DNA、
(30) 前記 （27) 乃至 （29) 記載の DNAを有するベクター、 (3 1) 前記 （30) 記載のベクターを含有する細胞、
(32) 前記（27) 乃至（29)記載の DNAを有するベクターを有し、 且つ当該 DNAにコードされるアミノ酸配列を有するぺプチド系化合物が、 当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されたべプチ ド系化合物として産生することができる細胞、
(33) 前記（1) 乃至（1 9)記載のペプチド系化合物に対する抗体、 (34) 前記 （33) 記載の抗体を用いて前記 （1) 乃至 （ 1 9) 記載 のペプチド系化合物を検出することを特徴とする前記（1) 乃至 （1 9) 記載のぺプチド系化合物のアツセィ方法、
(35) 前記 （33) 記載の抗体を用いて前記 （ 1) 乃至 （ 1 9) 記載の ペプチド系化合物を検出することを特徴とする前記 （ 1) 乃至 （ 1 9) 記 載のペプチド系化合物の検出用キット、
(36) 前記 （1) 乃至 （1 9) 記載のペプチド系化合物を遺伝子組換 え技術を用いて製造する方法において、 前記 （27) 乃至 （29) 記載 の DNAを含有するべクタ一により、 当該ペプチド中の少なくともひとつ のアミノ酸の側鎖を修飾することができる宿主細胞を形質転換し、 得ら れた形質転換細胞を培養して培養物から目的のぺプチド系化合物を採取 することからなる前記 （ 1) 乃至 （ 1 9) 記載のペプチド系化合物の製 造方法、
( 37 ) 前記 （1) 乃至 （1 9) 記載のペプチド系化合物を遺伝子組換 え技術を用いて製造する方法において、 前記 （27) 乃至 （29) 記載 の DNAを含有するべクタ一により宿主細胞を形質転換し、 得られた形質 転換細胞を培養して培養物から目的物質を採取後、 任意のアミノ酸を化 学的に修飾することを特徴とする前記 （ 1) 乃至 （1 9) 記載のぺプチ ド系化合物の製造方法、
(38) 前記 （1 2) 乃至 （ 1 6) 記載のペプチド系化合物を遺伝子組 換え技術を用いて製造する方法において、 アミノ酸の側鎖の水酸基又は メルカプ卜基に、 脂肪酸をエステル結合させる活性を有する細胞を用い ることを特徴とする前記 （ 1 2) 乃至 （16) 記載のペプチド系化合物 の製造方法、
(39) 配列番号 8記載のアミノ酸配列中のセリンの側鎖の水酸基に脂 肪酸をエステル結合させるセリンァシル化活性を有する細胞を用いるこ とを特徴とする前記 （ 1 2) 乃至 （ 1 6) 記載のペプチド系化合物の製 造方法、
(40) 前記 （ 1) 乃至 （ 1 9) 記載のペプチド系化合物のアミノ酸配 列をコードする DNAを含有するべクタ一を生体内細胞に組み込み、 細胞 内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する少なくともひとつ の修飾されたアミノ酸を有するペプチドを発現することにより、 成長ホ ルモンの欠損又は減少に起因する疾患を治療するための遺伝子治療用医 薬組成物、
(4 1) 前記 （1) 乃至 （ 1 9) 記載のペプチド系化合物のアミノ酸配 列をコードする DNAを有するベクターを、 当該 DNAにコードされるアミ ノ酸配列を有するぺプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつの ァミノ酸が修飾されうる認識配列を有するぺプチドとして産生すること ができる生体内の細胞に組み込むことにより、 成長ホルモンの分泌を誘 導する活性を有するペプチドを発現させることを特徴とする成長ホルモ ンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法、 (42) 前記 （ 1) 乃至 （ 1 9) 記載のペプチド系化合物のアミノ酸配 列をコードする DNAを含有するベクターを生体内細胞に組み込み、 細胞 内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する、 少なくともひと つの修飾されたアミノ酸を有するぺプチドを発現することにより成長ホ ルモンの欠損又は減少に起因しない疾患を治療するための遺伝子治療用 医薬組成物、 および、
(43) 前記 （ 1) 乃至 （ 1 9) 記載のペプチド系化合物のアミノ酸配 列をコードする DNAを有するベクターを、 当該 DNAにコードされるアミ ノ酸配列を有するぺプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつの ァミノ酸が修飾されうる認識配列を有するぺプチドとして産生すること ができる生体内の細胞に組み込むことにより、 成長ホルモンの分泌を誘 導する活性を有するペプチドを発現させることを特徴とする成長ホルモ ンの欠損又は減少に起因しない疾患の治療方法、
にも関する。
また、 具体的には、 本発明は
(1) 細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有し、 少なく ともひとつのアミノ酸が、 修飾アミノ酸及び 又は非アミノ酸化合物に より置換されたことを特徴とするぺプチド系化合物又はその薬学的に許 容される塩、
(2) 配列番号 2記載のアミノ酸配列、 又は当該配列において少なくと もァミノ末端から 4番目乃至 1 0番目までのアミノ酸配列を有し、 かつ ァミノ末端から 4番目乃至 1 0番目までのアミノ酸配列以外の部分にお いて、 少なくともひとつのアミノ酸が欠失、 置換及び 又は付加された アミノ酸配列を含む前記 （ 1) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的 に許容される塩、
(3) 配列番号 3、 4、 5、 8、 9、 1 0、 1 1、 1 2、 1 3、 1 6、 1 7、 18、 1 9、 22および 23記載のアミノ酸配列からなる群から 選択されるひとつのアミノ酸配列を有する前記 （2) 記載のペプチド系 化合物又はその薬学的に許容される塩、
(4) 細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモ ンの分泌を誘導する活性を有し、 （a)構成アミノ酸が修飾されているか 又はされていない、 かつ （b) 少なくともひとつのアミノ酸が非ァミノ 酸化合物により置換されているか又はされていないべプチド系化合物又 はその薬学的に許容される塩、
(5) 配列番号 2記載のアミノ酸配列、 又は当該配列において少なくと もァミノ末端から 4番目乃至 1 0番目までのアミノ酸配列を有し、 かつ ァミノ末端から 4番目乃至 1 0番目までのアミノ酸配列以外の部分にお いて、 少なくともひとつのアミノ酸が欠失、 置換及び Z又は付加された アミノ酸配列を含む前記 （4) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的 に許容される塩、
(6) 配列番号 3、 4、 5、 8、 9、 1 0、 1 1、 1 2、 1 3、 1 6、 1 7、 1 8、 19、 22および 2 3記載のアミノ酸配列からなる群から 選択されるひとつのアミノ酸配列を有する前記 （4) 乃至 （5) 記載の ぺプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(7) 修飾されたアミノ酸がァミノ末端から 3番目のアミノ酸である前 記 （1) 乃至 （6) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容され る 、
(8) 修飾されたアミノ酸におけるアミノ酸がセリン又はシスティンで あることを特徴とする前記 （7) 記載のペプチド系化合物又はその薬学 的に許容される塩、
(9)アミノ酸の α炭素に、 （a)炭素数 1以上のアルキレン基を介して 又は介さず、 エステル、 エーテル、 チォエステル、 チォエーテル、 アミ ド又はカルバミド結合を介して炭素数が 1若しくは複数の飽和若しくは 不飽和アルキル鎖、 又は （b) H又は炭素数 1以上の飽和若しくは不飽 和アルキル鎖を導入した修飾アミノ酸を含有する前記 （1) 乃至 （6) 記載のぺプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
( 1 0)エステル結合により修飾された修飾アミノ酸を有する前記（1) 乃至 （6) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
( 1 1) 脂肪酸が結合じたアミノ酸を有する前記 （ 1 0) 記載のぺプチ ド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(1 2) 炭素数が 2乃至 35である脂肪酸が結合したアミノ酸を有する 前記 （1 1) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(1 3) 炭素数が 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 14、 1 6および 1 8 の脂肪酸からなる群から選ばれた脂肪酸が結合したアミノ酸を有する前 記 （1 2) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
( 14) 結合した脂肪酸がオクタン酸 （octanoic acid), 又はそのモノ ェン脂肪酸若しくはそのポリェン脂肪酸である前記 （1 3) 記載のぺプ チド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
( 1 5) 結合した脂肪酸がデカン酸 （decanoic acid), 又はそのモノェ ン脂肪酸若しくはそのポリェン脂肪酸である前記 （ 1 3) 記載のぺプチ ド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(16) ァミノ末端が炭素数 1以上の飽和あるいは不飽和アルキル又は ァシル基により修飾され及び 又はカルボキシル末端のカルボキシル基 の 0Hが 0Z又は NR2R3(Zは薬学的に許容し得る陽イオン又は低級の分枝 鎖又は非分枝鎖アルキル基、 R2及び R3は H及び低級の分枝鎖又は非分 枝鎖アルキル基からなる群から選択される互いに同一又は異なる基を示 す） であることを特徴とする前記 （1) 乃至 （1 5) 項記載のペプチド 系化合物、 ( 1 7) 前記 （1) 乃至 （1 6) 記載のペプチド系化合物又はその薬学 的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物、
(18) 前記 （ 1) 乃至 （1 6) 記載のペプチド系化合物又はその薬学 的に許容される塩を有効成分とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因 する疾患を治療するための医薬組成物、
( 1 9)成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、 前記 （1) 乃至 （ 1 6) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容 される塩を含有することからなる当該疾患を治療するための医薬組成物、
(20) ヒト以外の動物に適用するための前記 （1 7) 乃至 （1 9) 記 載の医薬組成物、
(2 1) 前記 （ 1) 乃至 （16) 記載のペプチド系化合物又はその薬学 的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物を投与することからなる 成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法、
(22)成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、 前記 （1) 乃至 （ 1 6) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容 される塩を含有する医薬組成物を投与することからなる当該疾患の治療 方法、
(23) ヒ卜以外の動物に適用するための前記 （2 1) 乃至 （22) 記 載の治療方法、
(24) 前記 （ 1) 乃至 （ 16) 記載のペプチド系化合物に係る DNAで あって、 当該 DNAの塩基配列中に、 少なくともひとつのアミノ酸が修飾 されうる認識配列を有するペプチドをコードする塩基配列を有する当該 DNA、
(25) 配列番号 6、 7、 14、 1 5、 20、 2 1および 24記載の塩 基配列からなる群から選ばれた一つの塩基配列を有する前記 （24) 記 載の DNA、 (26) 配列番号 6、 7、 14、 1 5、 20、 2 1および 24記載の塩 基配列からなる群から選ばれた一つの塩基配列のうち、 アミノ酸をコー ドしている部分の配列を有する前記 （24) 記載の D 、
(27) 前記 （24) 乃至 （26) 記載の DNAを有するベクター、 (28) 前記 （27) 記載のベクターを含有する細胞、
(29)前記（24) 乃至（26)記載の DNAを有するベクタ一を有し、 且つ当該 DNAにコ一ドされるアミノ酸配列を有するぺプチド系化合物が， 当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されたべプチ ド系化合物として産生することができる細胞、
(30)前記（1) 乃至（1 6)記載のペプチド系化合物に対する抗体、
(3 1) 前記 （30) 記載の抗体を用いて前記 （1) 乃至 （1 6) 記載 のペプチド系化合物を同定することを特徴とする当該べプチド系化合物 のアツセィ方法、
(32) 前記 （30) 記載の抗体を用いて前記 （1) 乃至 （1 6) 記載 のペプチド系化合物を検出することを特徴とする当該べプチド系化合物 の検出用キット、
(33) 前記 （ 1) 乃至 （1 6) 記載のペプチド系化合物を遺伝子組換 え技術を用いて製造する方法において、 前記 （24) 乃至 （26) 記載 の DNAを含有するべクタ一により、 当該べプチド中の少なくともひとつ のアミノ酸の側鎖を修飾することができる宿主細胞を形質転換し、 得ら れた形質転換細胞を培養して培養物から目的のぺプチド系化合物を採取 することからなる当該方法、
(34) 前記 （1) 乃至 （ 1 6) 記載のペプチド系化合物を遺伝子組換 え技術を用いて製造する方法において、 前記 （24) 乃至 （26) 記載 の DNAを含有するべクタ一により宿主細胞を形質転換し、 得られた形質 転換細胞を培養して培養物から目的物質を採取後、 任意のアミノ酸を化 学的に修飾することを特徴とする当該方法、
(35) 前記 （1 1) 乃至 （1 5) 記載のペプチド系化合物を遺伝子組 換え技術を用いて製造する方法において、 配列番号 8記載のアミノ酸配 列中のセリン残基に脂肪酸が結合したぺプチドとして産生することがで きる細胞を用いることを特徴とする製造方法、
(36) 前記 （4) 乃至 （6) 記載のペプチド系化合物をコードする DNA を含有するべクタ一により宿主細胞を形質転換し、 得られた形質転換細 胞を培養して培養物から目的物質を採取することを特徴とする、 細胞内 のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモンの分泌を誘 導する活性を有するぺプチド系化合物の製造方法、
(37) 前記 （1) 乃至 （1 6) 記載のペプチド系化合物をコードする DNA を含有するべクタ一を生体内細胞に組み込み、 細胞内のカルシウム イオン濃度を上昇させる活性を有する少なくともひとつの修飾されたァ ミノ酸を有するペプチドを発現することにより、 成長ホルモンの欠損又 は減少に起因する疾患を治療するための遺伝子治療用医薬組成物、
(38) 前記 （1) 乃至 （1 6) 記載のペプチド系化合物をコードする DNAを有するベクターを、 当該 DNAにコードされるアミノ酸配列を有す るべプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾 されうる認識配列を有するペプチドとして産生することができる生体内 の細胞に組み込むことにより、 成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有 するペプチドを発現させることを特徴とする成長ホルモンの欠損又は減 少に起因する疾患の治療方法、
(39) 前記 （1) 乃至 （1 6) 記載のペプチド系化合物をコードする DNA を含有するべクタ一を生体内細胞に組み込み、 細胞内のカルシウム イオン濃度を上昇させる活性を有する、 少なくともひとつの修飾された アミノ酸を有するペプチドを発現することにより成長ホルモンの欠損又 は減少に起因しない疾患を治療するための遺伝子治療用医薬組成物、 お よび、
(40) 前記 （ 1) 乃至 （ 1 6) 記載のペプチド系化合物をコードする DNAを有するベクターを、 当該 DNAにコ一ドされるアミノ酸配列を有す るべプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾 されうる認識配列を有するぺプチドとして産生することができる生体内 の細胞に組み込むことにより、 成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有 するぺプチドを発現させることを特徴とする成長ホルモンの欠損又は減 少に起因しない疾患の治療方法、
にも関する。
また、 具体的には、 本発明は、
(1) 細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有し、 少なく ともひとつのアミノ酸が、 修飾アミノ酸及び 又は非アミノ酸化合物に より置換されたことを特徴とするぺプチド系化合物又はその薬学的に許 容される塩、
(2) 配列番号 1記載のアミノ酸配列を有する前記 （1) 記載のぺプチ ド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(3)配列番号 2記載のアミノ酸配列、又は当該配列中の ァミノ末端か ら 7番目のアミノ酸迄の配列以外の部分において、 少なくともひとつの アミノ酸が欠失、 置換及び 又は付加されたアミノ酸配列を有する前記 ( 1 ) 記載のぺプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(4) 配列番号 3記載のアミノ酸配列、 又は当該配列中のアミノ末端か ら 7番目のアミノ酸迄の配列以外の部分において、 少なくともひとつの アミノ酸が欠失、 置換及び 又は付加されたアミノ酸配列を有する前記 ( 1) 記載のペプチド類縁体又はそれらの誘導体並びにそれらの薬学的 に許容される塩、 (5)配列番号 4記載のアミノ酸配列、又は当該配列中の ァミノ末端か ら 28番目のアミノ酸迄のアミノ酸以外の部分において、少なくともひと つのアミノ酸が欠失、 置換及び 又は付加されたアミノ酸配列を有する 前記 （3) 記載のペプチド系化合物の前駆体ペプチド系化合物、 (6) 配列番号 5記載のアミノ酸配列、 又は当該配列中のアミノ末端か ら 28番目のアミノ酸迄のアミノ酸以外の部分において、少なくともひと つのアミノ酸が欠失、 置換及び 又は付加されたアミノ酸配列を有する 前記 （4) 記載のペプチド系化合物の前駆体ペプチド系化合物、
(7) 細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモ ンの分泌を誘導する活性を有するぺプチド系化合物又はその薬学的に許 容される塩、
(8) 細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモ ンの分泌を誘導する活性を有し、 少なくともひとつのアミノ酸が非アミ ノ酸化合物により置換された前記 （7) 記載のペプチド系化合物又はそ の薬学的に許容される塩、
(9) 配列番号 1記載のアミノ酸配列を有する前記 （7) 乃至 （8) 記 載のぺプチド系化合物又はそれらの誘導体並びにそれらの薬学的に許容 される塩、
(1 0)配列番号 2記載のアミノ酸配列、又は当該配列中の ァミノ末端 から 7番目のアミノ酸迄の配列以外の部分において、 少なくともひとつ のアミノ酸が欠失、 置換及びノ又は付加されたァミノ酸配列を有する前 記 （7) 乃至 （8) 記載のペプチド系化合物又はそれらの誘導体並びに それらの薬学的に許容される塩、
( 1 1)配列番号 3記載のアミノ酸配列、又は当該配列中の ァミノ末端 から 7番目のアミノ酸迄の配列以外の部分において、 少なくともひとつ のアミノ酸が欠失、 置換及び 又は付加されたアミノ酸配列を有する前 記 （7) 乃至 （8) 記載のペプチド系化合物又はそれらの誘導体並びに それらの薬学的に許容される塩、
(1 2)配列番号 4記載のアミノ酸配列、又は当該配列中の ァミノ末端 から 28番目のアミノ酸迄のアミノ酸以外の部分において、少なくともひ とつのアミノ酸が欠失、 置換及び 又は付加されたアミノ酸配列を有す る前記 （ 1 0) 記載のペプチド系化合物の前駆体ペプチド系化合物、
( 1 3) 配列番号 5記載のアミノ酸配列、 又は当該配列中のアミノ末端 から 28番目のアミノ酸迄のアミノ酸以外の部分において、少なくともひ とつのアミノ酸が欠失、 置換及びノ又は付加されたアミノ酸配列を有す る前記 （ 1 1) 記載のペプチド系化合物の前駆体ペプチド系化合物、
( 14) 修飾されたアミノ酸がァミノ末端から 3番目アミノ酸である前 記 （1) 乃至 （6) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容され る塩、
( 1 5) 修飾されたアミノ酸におけるアミノ酸がセリン又はシスティン であることを特徴とする前記 （ 14) 記載のペプチド系化合物又はその 薬学的に許容される塩、
( 1 6)修飾アミノ酸における修飾が、アミノ酸の α炭素において、 （a) 炭素数 1以上のアルキル鎖を介して又は介さず、 エステル、 エーテル、 チォエステル、 チォエーテル、 アミド又はカルバミドからなる群から選 択される結合様式で結合する炭素数が 1若しくは複数の飽和若しくは不 飽和アルキル鎖、 又は （b) H又は炭素数 1以上の飽和若くは不飽和ァ ルキル鎖を示す前記 （1) 乃至 （6) 記載のペプチド系化合物又はその 薬学的に許容される塩、
( 1 7)エステル結合により修飾された修飾アミノ酸を有する前記（ 1 ) 記載のぺプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
( 1 8) 脂肪酸が結合したアミノ酸を有する前記 （ 1 7) 記載のぺプチ ド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
( 1 9) 炭素数が 2乃至 35である脂肪酸が結合したアミノ酸を有する 前記 （1 8) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩、 (20) 結合した脂肪酸が力プリル酸 （caprylic acid), 又はそのモノ ェン脂肪酸若しくはそのポリェン脂肪酸である前記 （1 8) 記載のぺプ チド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(2 1) 結合した脂肪酸が力プリン酸 （capric acid), 又はそのモノェ ン脂肪酸若しくはそのポリェン脂肪酸である前記 （ 1 8) 記載のぺプチ ド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(22) 結合した脂肪酸がラウリン酸 （lauric acid), 又はそのモノ ェン脂肪酸若しくはそのポリェン脂肪酸である前記 （1 8) 記載のぺプ チド系化合物又はその薬学的に許容される塩、
(23) ァミノ末端が炭素数 1以上の飽和あるいは不飽和アルキル又は ァシル基により修飾され及び 又は力ルポキシル末端が 0Z又は NR2R3(Z は薬学的に許容し得る陽イオン又は低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル 基、 R2及び R3は H及び低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基からなる 群から選択される互いに同一又は異なる基を示す） により修飾されたこ とを特徴とする前記 （1) 乃至 （22) 項記載のペプチド系化合物、 (24) 前記 （1) 乃至 （6) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的 に許容される塩を有効成分とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因す る疾患を治療するための医薬組成物、
(25)成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、 前記 （1) 乃至 （6) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容さ れる塩を含有することからなる当該疾患を治療するための医薬組成物、 (26 ) ヒ卜以外の動物に適用するための前記 （24) 乃至 （2 5) 記 載の医薬組成物、 (2 7) 前記 （1) 乃至 （6) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的 に許容される塩を有効成分とする医薬組成物を投与することからなる成 長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法、
(2 8)成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、 前記 （1) 乃至 （6) 記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容さ れる塩を含有する医薬組成物を投与することからなる当該疾患の治療方 法、
(2 9) ヒト以外の動物に適用するための前記 （2 7) 乃至 （2 8) 記 載の治療方法、
(30) 前記 （1) 乃至 （6) 記載のペプチド系化合物に係る DNAであ つて、 当該 DNA配列中に、 少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる 認識配列を有するペプチドをコードする MA配列を有する当該 DNA、
(3 1) 配列番号 6記載の DNA配列を有する前記 （3 0) 記載の c DNA (NCR含む）
(3 2)配列番号 6記載の DNA配列における 3 1 番目から 3 8 1番目ま での DNA配列を有する前記 （3 0) 記載の c DNA (NCR含まない）、 (3 3) 配列番号 7記載の DNA配列を有する前記 （3 0) 記載の c DNA (NCR含む）、
(34) 配列番号 7記載の DNA配列における 34番目から 3 8 5番目ま での DNA配列を有する前記 （3 0) 記載の c DNA (NCR含まない）、
(3 5) 前記 （3 0) 乃至 （34) 記載の DNAを有するベクタ一、 (3 6) 前記 （3 5) 記載のベクタ一を含有する細胞、
(3 7)前記（3 0) 乃至（34)記載の DNAを有するベクターを有し、 且つ当該 DNAにコードされるアミノ酸配列を有するぺプチド系化合物が、 当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識 配列を有するペプチド系化合物として産生することができる細胞、 (38) 前記（1)乃至（23)記載のペプチド系化合物に対する抗体、 (39) 前記 （38) 記載の抗体を用いて前記 （1) 乃至 （23) 記載 のペプチド系化合物を同定することを特徴とする当該べプチド系化合物 のアツセィ方法、
(40) 前記 （38) 記載の抗体を用いて前記 （1) 乃至 （23) 記載 のべプチド系化合物を検出することを特徴とする当該べプチド系化合物 の検出用キット、
(41) 前記 （ 1) 乃至 （6) 記載のペプチド系化合物を遺伝子組換え 技術を用いて製造する方法において、 前記 （30) 記載の DNAを含有す るベクターにより、 当該ペプチド中の少なくともひとつのアミノ酸の側 鎖を修飾することができる宿主細胞を形質転換し、 得られた形質転換細 胞を培養して培養物から目的のペプチド系化合物を採取することからな る当該方法、
(42) 前記 （ 1) 乃至 （6) 記載のペプチド系化合物を遺伝子組換え 技術を用いて製造する方法において、 前記 （30) 記載の DNAを含有す るべクタ一により宿主細胞を形質転換し、 得られた形質転換細胞を培養 して培養物から目的物質を採取後、 任意のアミノ酸を化学的に修飾する ことを特徴とする当該方法、
(43) 前記 （1 8) 乃至 （22) 記載のペプチド系化合物を遺伝子組 換え技術を用いて製造する方法において、 配列番号 1記載のアミノ酸配 列中のセリン残基に脂肪酸が結合したペプチドとして産生することがで きる細胞を用いることを特徴とする製造方法、
(44) 前記 （7) 乃至 （1 3) 記載のペプチド系化合物をコードする DNA を含有するべクタ一により宿主細胞を形質転換し、 得られた形質転 換細胞を培養して培養物から目的物質を採取することを特徴とする、 細 胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモンの分泌 を誘導する活性を有するぺプチド系化合物の製造方法、
( 4 5 ) 前記 （1 ) 乃至 （6 ) 記載のペプチド系化合物をコードする DNA を含有するべクタ一を生体内細胞に組み込み、 細胞内のカルシウムィォ ン濃度を上昇させる活性を有する、 少なくともひとつの修飾されたアミ ノ酸を有するペプチドを発現することにより成長ホルモンの欠損又は減 少に起因する疾患を治療するための遺伝子治療用医薬組成物、
( 4 6 ) 前記 （ 1 ) 乃至 （6 ) 記載のペプチド系化合物をコードする DNA を有するベクタ一を、 当該 DNAにコ一ドされるアミノ酸配列を有するぺ プチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾され うる認識配列を有するぺプチドとして産生することができる生体内の細 胞に組み込むことにより、 成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有する ことをペプチドを発現させることを特徴とする成長ホルモンの欠損又は 減少に起因する疾患の治療方法、
( 4 7 ) 前記 （1 ) 乃至 （6 ) 記載のペプチド系化合物をコードする DNA を含有するべクタ一を生体内細胞に組み込み、 細胞内のカルシウムィォ ン濃度を上昇させる活性を有する、 少なくともひとつの修飾されたアミ ノ酸を有するぺプチドを発現することにより成長ホルモンの欠損又は減 少に起因しない疾患を治療するための遺伝子治療用医薬組成物、および、 ( 4 8 ) 前記 （1 ) 乃至 （6 ) 記載のペプチド系化合物をコードする DNA を有するベクターを、 当該 DNAにコードされるアミノ酸配列を有するぺ プチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾され うる認識配列を有するぺプチドとして産生することができる生体内の細 胞に組み込むことにより、 成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有する ことをペプチドを発現させることを特徵とする成長ホルモンの欠損又は 減少に起因しない疾患の治療方法、
にも関する。 本発明において、 アミノ酸とは L—アミノ酸、 D—アミノ酸、 α—アミ ノ酸、 ）3—アミノ酸、 ァ一アミノ酸、 天然アミノ酸、 合成アミノ酸等あ らゆるアミノ酸を含む。
本発明において修飾アミノ酸とは、 上記アミノ酸の任意の基が化学修 飾されているアミノ酸を意味する。 特に、 α—アミノ酸における α炭素 が化学修飾されている修飾アミノ酸が好ましい。 すなわち、 修飾アミノ 酸は、 α—アミノ酸を式 （ 1 )
R'
Η2Ν— C一 COOH
I で表したとき、 R'、 R"は H又は任意の置換基でよくて、 要するに天然ァ ミノ酸を化学修飾したものならどのようなものでもよい。 なお、 R'、 R" のいずれか一方は Hでもよい。
R'、 R"で示される置換基としては、 天然のアミノ酸に存在する置換基 を、 天然のアミノ酸又はそれに対応する D—アミノ酸に存在しない置換 分で置き換えたアミノ酸を修飾アミノ酸と称す。
そのような置換分として、 例えば天然に存在するアミノ酸が側鎖に—
0H、 — SH、 — NH—又は— NH 2を含む場合、 これらをァシル化して形成さ れる基が好適な例として挙げられる。
そのためのァシル基としては、 例えば有機カルボン酸、 有機スルホン 酸、有機リン酸化合物から水酸基を除去して形成される基が挙げられる。 有機カルボン酸としてはより具体的には、 脂肪酸が挙げられ、 その炭 素数は好ましくは 2〜 3 5、 より好ましくは 6〜 1 8、 最も好ましくは
8〜1 6である。 そのような脂肪酸としては、 具体的には、 オクタン酸 (好ましくは、 力プリル酸）、 デカン酸 （好ましくは、 力プリン酸）、 ド デカン酸 （好ましくは、 ラウリル酸）、 それらのモノエン又はポリェン脂 肪酸等が挙げられる。
有機スルホン酸または有機リン酸化合物についても、 その炭素数は 2 〜 3 5のものが好ましい。
又、さらに修飾アミノ酸は上記の R'又は 及び R"で示される基を例え ば式
一 (CH2) P - Q
O O II II
(式中， nは 0〜10の整数、 Pは一 C— O—、 一 O-C―、 一 O—、
O S O
II II II
-C-S-, 一 C— S—、 — S— C一、 一 S—、 _CO— NH—、
O
II
—NH— C—又は一 CO— NH— CO—、 Qは H又は C,_ 35 、
好ましくは — 20のアルキル） で置き換えたアミノ酸であってもよい。 さらに Pは— CO—でもよい。 さらに、 Pは— S— S―、 又は一 NH— C S—であってもよい。 又上 記全ての— NH—において、 Hが C 5の飽和又は不飽和アルキル基、 C6~2。のァリール基、 C?^^ 3のァラルキル基で置換されていてもよい。
a—アミノ酸を上記式（ 1)で表した場合に、 R'又は R"を上記の一（C H2)n— P— Qで置き換えた修飾アミノ酸は好ましい実施の態様である c 特にアミノ酸がセリンの a炭素に上記の式の—（CH2)n— P― Qで示 される置換基が結合した式
(CH2)n -P-Q
H2N— C-COOH H (式中、 n、 Pまたは Qは上記定義に同じ。）
で示される修飾セリンが好ましい。
炭素数 1以上のアルキル基を介して又は介さずエステル、 エーテル、 チォエステル、 チォエーテル、 アミド又はカルバミドからなる群から結 合様式についてさらに説明する。
例えば、 アミノ酸がセリン、 トレォニン、 チロシン又はォキシプロリ ンである場合は、 そのアミノ酸は側鎖に水酸基を有する。 アミノ酸がシ スティンである場合は、 そのアミノ酸は側鎖にメルカプト基を有する。 アミノ酸がリジン、 アルギニン、 ヒスチジン、 トリブトファン、 プロリ ン又はォキシプロリンである場合は、 側鎖にアミノ基又はイミノ基を有 する。
これらの水酸基、 メルカプト基、 アミノ基、 イミノ基は化学修飾され ていてもよい。 すなわち水酸基又はメルカプト基はエーテル化、 エステ ル化、 チォエーテルか又はチォエステル化されていてもよい。 イミノ基 はィミノエーテル化、 イミノチォエーテル化、 アルキル化されていても よい。 アミノ基はアミド化、 チオアミド化又はカルバミド化されていて もよい。
また、 メルカプト基はジスルフイ ド化されていてもよく、 イミノ基は アミド化、 又はチォアミド化されていてもよく、 アミノ基はアルキル化 又はチォカルバミド化されていてもよい。
そのように化学修飾された水酸基又はメルカプト基は例えば式
ド化されたアミノ基又はィ
Figure imgf000046_0001
S II
— N— C— Z2 で表わすことができ、 エーテル化された水酸基又はメルカプト基は式、 一 0— z3 、 又は
— s一 z3 で表わすことができ、 ィミノエーテル化又はィミノチォエーテル化され たィミノ基としては式 N 又は
o
Figure imgf000047_0001
で表わすことができ、 アルキル化されたアミノ基として式
Figure imgf000047_0002
で表すことができ、 アルキル化されたイミノ基として式
Ν で表わすことができ、 カルバミド化又はチォカルバミド化されたィミノ 基として式
0
II ュ
一 NH— C一 NH - Z7 又は
S II
— NH— C— NH一 Z7 で表わすことができ、 ジスルフイ ド化されたメルカプト基は、 式 — S— S— Z 8
表わすことができる。
上記式中、 Iい z2、 z3、 z4、 z5、 z6、 z7及び z8は本発明の精神に反しな い限り、 どのような化学修飾のための置換基であってもよいが、 医薬品 分野で常用されるあるいはべプチドのための化学修飾のための置換基が 特許文献上又は学術文献上もよく知られているので、 本発明においても そのような自体公知の修飾のための置換基を採用することができ、 かつ 化学修飾はそのような従来公知の方法に従って行われてよい。
上記式において、 は水素原子又は直鎖状、 分枝状もしくは環状のァ ルキル基であってよく、 かかるアルキル基は飽和であってもよく、 不飽 和であってもよい。 炭素数は通常はじト 好ましくは C 6 _2。である。
z2、 z3、 z4、 z5、 z6、 z 7又は z 8は水素原子又は直鎖状、 分枝状もしく は環状のアルキル基であってよく、 かかるアルキル基は飽和又は不飽和 であってよい。 炭素数は通常じト^、 好ましくは C i— 6である。
かかる Iい z2、 z3、 z4、 z5、 z6、 z 7又は z 8で表されるアルキル基は、 例えば、 水酸基、 アミノ基、 ハロゲン、 ニトロ、 — 3のアルコキシ基 等通常べプチドの化学修飾に使われる置換基で置換されていてもよい。 上記において、
0 o
II II
一 C一 が脂肪酸 Zi ^^c— OH の残基である場合は、 脂肪酸が結合したアミノ酸の一例である。 その場 合の脂肪酸としては、 例えば力プリル酸、 力プリン酸、 ララリン酸、 酪 酸、 カブロン酸、 ゥンデシル酸、 パルミチン酸、 デカン酸、 ノナデカン 酸、 ベヘン酸、 モンタン酸、 若しくはラクセン酸などの飽和脂肪酸、 例 えばアクリル酸、 ォレイン酸、 リノール酸、 リノレン酸、 若しくはァァ テアロール酸などの不飽和脂肪酸が挙げられる。 不飽和脂肪酸はモノエ ンであってもよいし、 ポリェンであってもよい。
又さらに、 修飾アミノ酸は α—アミノ酸の炭素に α炭素に結合する、 ペプチド結合を構成する力ルポキシル基とアミノ基以外の基を水素原子 又は飽和又は不飽和アルキル基で置換することにより形成される α—ァ ミノ酸であってもよい。 又さらに、 本発明において修飾アミノ酸は、 アミノ酸のァミノ基に炭 素数 1乃至 6の飽和又は不飽和アルキル基で置換することにより形成さ れるアミノ酸であってもよい。
本発明における非天然アミノ酸としては、 ァミノ基とカルボキシル基 を分子の両端に有するものであって、例えば、 NH2-(CH2) 3CH(CH20H)- C00H、 NH2- (CH2)4- COOH 、 NH2- C(CH3) 2- (CH2) 3-C00H、 又は NH2- CH(CH3)-(CH2) 2 - CH(CH3)- C00H等が挙げられる。 これらはいずれも、 分子鎖長がジぺプ チド相当長であるが、分子鎖長がぺプチド相当長のものも当然含まれる。
また、 本発明における非アミノ酸化合物としては、 例えば、 NH2 - CH(CH20H)- CH3、 CH3- CH(R)_C00H, CH3- CH(R)-CH3 (いずれも、 分子鎖長 がペプチド相当長）、又は NH2- (CH2)3CH(CH2OH)-CH3、 NH2-(CH2)3CH(R)-CH
3 (いずれも、 分子鎖長がジペプチド相当長） 等も含まれる。
ここで、 R は、 天然アミノ酸の側鎖又は上述した修飾アミノ酸の α炭 素の置換基を表す。 図面の簡単な説明
第 1図は、 ダレリ ンのラッ ト胃抽出物からの精製を示す図で、
CHO-GHSR62 細胞における細胞内カルシウムイオン濃度の上昇による蛍 光強度の変化は黒棒で示してある。 a は、 40 g ラット胃より調製した SP-III画分の Sepahdex G- 50(fine)によるゲル濾過の結果を示す図で、 活性画分が分子量約 3, 000ダルトンであることを示している。 bは、 2 回目の CM-イオン交換 HPLCの結果を示す図で、 55〜56分に溶出される活 性画分は、 逆相 HPLCでさらに精製した。
第 2図は、 グレリンにおける n-ォクタノィル修飾を同定したことを示 す。 aは、 天然型ダレリン （上段）、 及び合成ダレリンと合成脱ァシル化 グレリン （下段）、 各々 2 //gを逆相 HPLCで分析した結果を示す図であ る。 bは、 天然型ダレリン （実線）、 合成ダレリン （小破線） 及び合成脱 ァシル化ダレリン （大破線） による、 CH0-GHSR62細胞における細胞内力 ルシゥムイオン濃度の変化を示す図である。
第 3図は、グレリンの CH0-GHSR62細胞に対する特異的な相互作用を示 す図で、図中、矢印で示した点で試料を添加した。 aは、グレリン、 GHRP-6 および GRF (GHRH) による CHO-GHSR62細胞における細胞内カルシウムィ オン濃度の変化を示した図である。 b は、 GHS- R の特異的阻害剤である [D-Lys-3] - GRP-6 を添加 （〇） あるいは非添加 （秦） 時の、 ダレリンに よる CHO- GHSR62 細胞における細胞内カルシウムイオン濃度の変化を示 した図で、 GRF (GHRH) による細胞内カルシウムイオン濃度の変化 （黒三 角） も示してある。
第 4図は、 ラットおよびヒト由来のグレリン前駆体のアミノ酸配列、 およびこれら前駆体の各種組織での発現を調べた結果を示す図である。 a は、 ラットおよびヒト由来のグレリン前駆体のアミノ酸配列を比較した 図で、 図中、 同一アミノ酸は網掛け、 点線はシグナルペプチド、 黒三角 はシグナルペプチドの切断点、 三角はカルボキシル末端側の切断点、 ボ ックスは成熟型ダレリン部分、 *は n-オクタン酸による修飾を示す。 b は、 ラット各種組織におけるグレリンの発現をノザンブロッ卜によって 解析した結果を示す図である。
第 5図は、 in vitroおよび in vivoにおけるダレリンの下垂体ホルモン 分泌に及ぼす効果を示す図である。 a は、 ラッ卜下垂体初期培養細胞に おける細胞内カルシウムイオン濃度の変化による蛍光強度の変化を示し た図で、 実線はダレリン、 破線は脱ァシル化ダレリンを添加した場合を 示す。 b は、 グレリンによる下垂体ホルモンの分泌を示す図で、 図中、 黒棒はグレリン添加時、 白棒はダレリン非添加時の下垂体ホルモン濃度 を示す。 c は、 雄ラッドにグレリンを静脈注射した後の血漿中の下垂体 ホルモン濃度の経時変化を示す図である。 図 bおよび図 c中で、 GHは 成長ホルモン、 ACTHはァドレノコルティコトロピン、 FSHはフォリク ル、 LHはルテナイジングホルモン、 PRLはプロラクチン、 TSHはチロ ィド促進ホルモンを表す。
第 6図は、 ダレリンを脳室内投与した時の食用増進を示す図で、 ダレ リン投与後 2時間の摂餌量 （平均値土標準誤差） で示してある。 a はグ レリンの効果についての誤差範囲が 0. 0001 未満であることを示してい る。
第 7図は、 ウレタン麻酔ラッ卜での薬剤投与による胃酸分泌への効果 を示す図で、 Aはラッ トダレリ ン （rGhre l i n)、 Bはヒスタミ ン (Hi s t ami ne)を投与した場合の結果である。各シンボルは 4例のラットに おける平均値を表し、 標準誤差をエラーバーで示した。 対照として生理 食塩水 （Sa l i ne)を投与した。 矢印の時点で薬剤 （Drug)を投与した。 第 8図は、 ウレタン麻酔ラットでの胃運動に及ぼすラットグレリンの 作用を示す図で、 Aは生理食塩水（Sa l i ne)およびラッ トダレリン (rGhre l in)を投与したときの典型的な胃運動波形を示し、 Bは 4例のラ ットにおける平均値を標準誤差値とともに示した図である。 矢印の時点 で薬剤 （Drug)を投与した。
第 9図は、 ラジオィムノアツセィの標準曲線および抗体の交差反応性 を示す図で、 aは1251で標識したラットダレリンの N端側抗体への結合 の各種ダレリンによる阻害を示す図であり、 bは 1251で標識したラット グレリンの C端側抗体への結合の各種グレリンによる阻害を示す図であ る。 グラフの横軸は、 各種ダレリンの反応チューブあたりの添加量を示 し、 縦軸は各種ダレリン非存在下でのラットダレリンの結合量 （B0) に 対する各種ダレリン存在下での結合量 （B) の百分率 （％) で示した。 図中のシンボルは、 ラットダレリン （〇）、 ヒトダレリン （翁）、 ラット グレリン- 27(口）、 [Ser3(decanoyl)]_ラットグレリン（◊)、 [Ser3(hexanoyl)]_ ラットグレリン （△) および脱脂肪酸ラットダレリン （V) を示す。 発明を実施するための最良の形態
GHSレセプ夕一（GHS-R)の内在性リガンドとなるペプチドについては、
GHS-R を発現している細胞に各種臓器又は組織の抽出物を添加し、 細胞 内カルシウムイオン濃度を測定することにより、 当該内在性リガンドの 臓器 ·組織間での分布を知ることができる。
GHS-Rを発現している細胞としては、 恒常的に GHS- Rを発現している ことが知られている視床下部及び脳下垂体、 及びそれらの組織由来の細 胞株があるが、 GHS- R遺伝子を適当な細胞、 例えば CH0細胞に導入，発 現させた形質転換細胞が望ましい。
本願発明の内在性 GHSぺプチドにおいては、 該ぺプチドが発現してい る視床下部及び脳下垂体ではなく、 消化器系の臓器である胃の抽出物に 強い Ca上昇活性が認められた。従って、 目的のォ一ファン ·レセプ夕一 の内在性リガンドを見いだすためには、 該レセプ夕一が発現している組 織 ·臓器ばかりではなく、 他の組織 ·臓器も広く探索することが必要で ある。
細胞内カルシウムイオン濃度の測定法は公知の方法が利用できるが、 望ましくは、 カルシウムイオン濃度変化による Fluo- 4 AM (Molecular Probe 社）の蛍光強度の変化を利用した FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular Devices社)がよい。
Ca上昇活性が確認された組織 ·臓器の抽出物から、 目的の内在性 GHS ペプチドを生成するためには、 公知の精製方法を用いることができる。 ペプチドの精製法としては、 各種分画法による分画後、 ゲル濾過、 ィ オン交換及び逆相クロマトグラフィーを、 単独又は組み合わせて用いる が有効であるが、 必ずしも該クロマトグラフィーによる精製にこだわる 必要はなく、ぺプチドの精製に有効である手段は何でも利用可能である。 また、 組織 ·臓器よりペプチドを単離 '精製する際には、 組織 '臓器 に存在するプロテア一ゼの作用による目的ペプチドの分解を防止するた めに、 組織 ·臓器を沸騰水中で熱処理することによりプロテア一ゼを失 活させることが望ましい。 熱処理し組織 ·臓器を氷冷除去することも、 目的ペプチドの抽出 ·精製に効果がある。
精製された Ca上昇活性を有するぺプチドが、 i n v i t ro 及び i n v i vo で GH分泌誘導活性を確認するためには、公知の方法を利用することがで きる。
例えば i n v i t roでは、 GHを分泌して GHS- Rの発現も確認されている 脳下垂体細胞に添加して、 細胞培養液中に分泌される GHを、 抗 GH抗体 を用いたラジオィムノアッセィによって測定することができる。 また上 記ラジオィムノアッセィ法において、抗 GH抗体の代わりに他のホルモン に対する抗体を用いれば、 該ホルモンの分泌量も測定できる。
i n v i voでの GH分泌誘導活性を確認するためには、 Ca上昇活性を有す るペプチドを動物の末梢静脈に注射した後の血清中の GH 濃度を測定す ればよい。
精製されたべプチドの構造解析には、 公知の方法が使用可能である。 ペプチドのアミノ酸配列を決定するためには、 エドマン分解法により 力ルポキシル末端より逐次アミノ酸残基を遊離して、 該遊離アミノ酸を 高速液体クロマトグラフィー（HPLC)によってアミノ酸を同定する方法、 及び該方法を自動化したアミノ酸シーケンサーによる方法がある。
また、 GC- MASS によってイオン化したフラグメントの分子量を測定す ることにより、 アミノ酸配列を決定する方法もある。
本願発明の 1つである修飾アミノ酸を含有するべプチドの場合は、 上 記アミノ酸配列を決定する際に修飾アミノ酸が 「未知アミノ酸」 と同定 される。
この場合、 当該修飾ペプチドをアミノ酸単位に分解後、 修飾アミノ酸 を分離 ·精製して、 常用される化合物構造決定法によって修飾アミノ酸 を構造決定し、 ペプチド全体の構造を知ることができる。 また、 修飾べ プチドをコードする cDNA から得られる該ペプチドのアミノ酸配列を有 するペプチドを化学合成し、 当該合成非修飾べプチドと修飾べプチドの 分子量や物性等から修飾基の構造を推定する方法もある。
構造決定されたべプチド中での、 Ca上昇活性に必要な部分のアミノ酸 配列 （コア配列） は、 該ペプチドをプロテアーゼで切断して生成するべ プチド断片の Ca上昇活性を測定することによって明らかにされる。
用いられるプロテアーゼは、 切断するべプチドのアミノ酸配列に特異 性の高いプロテア一ゼを用いてよいが、 特異性が低くても部分分解の条 件で反応させることにより該ペプチドから様々なペプチド断片が調製で きる。
このようにして調製されたペプチド断片の Ca 上昇活性を測定するこ とにより、 Ca上昇活性に必須のコア配列を知ることができる。
内在性 GH分泌誘導べプチドは、ァミノ末端から 3番目のセリンが脂肪 酸によりァシル化されているが、内在性 GH分泌誘導べプチドのアミノ酸 配列の一部をもったペプチド断片および当該ペプチド断片のセリンの側 鎖に脂肪酸がエステル結合した脂肪酸修飾ペプチドは化学的に合成する こともできる。
該合成ペプチド断片により内在性 GH 分泌誘導ペプチドについて詳細 に解析できる。 同時に、 種々の脂肪酸で修飾したペプチド断片を比較す ることにより、 Ca上昇活性に必要な脂肪酸の種類を決めることができる c 例えばァフリカツメガエルなど種によっては、内在性 GH分泌誘導ぺプ チドは、 ァミノ末端から 3番目アミノ酸残基がセリンではなく トレオニ ンであり、 かかるトレオニンが脂肪酸によりァシル化されているが、 か かるべプチド系化合物についても合成することもでき、 該化合物を詳細 に解析できる。
また、脊椎動物における GH分泌誘導活性を有するペプチドのアミノ酸 配列を比較することにより、 脊椎動物で広く保存されている領域を見い だし、該領域のアミノ酸配列から GH分泌誘導活性に必須のコア配列を見 いだすことができる。
内在性 GH 分泌誘導ペプチドのアミノ酸配列から推定される塩基配列 を持つ DNAを化学合成し、 該 DNAをプローブとして該ペプチドが発現し ている細胞の mRNAから作製した cDNAライブラリ一をスクリーニングし て、 当該べプチドをコードする cDNAを取得することができる。
しかし、 アミノ酸に対応するコドンは縮重しており、 ペプチドのアミ ノ酸配列から推定される塩基配列が多くなり、 このような多種類の塩基 配列からる合成 DNAをプローブとしたスクリ一ニグが困難になることが ある。
そのような場合で、 当該ペプチドのアミノ酸配列と一致する配列が、 配列データべ一スにおいて公開された発現 DNA 断片 （EST ; Expres s ed Sequence Tag) の塩基配列から想定されるアミノ酸配列にある場合は、 該 ESTの塩基配列の一部からなる DNAを合成して、上記 cDNAライブラリ —のスクリーニングに用いることもできる。
また、 cDNAからゲノム DNAを取得することは、 常用される方法で行う ことができる。
このようにして取得された cDNAの塩基配列から、 内在性 GH分泌誘導 ペプチドの前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列が明らかにされる。
当該アミノ酸配列を解析することにより、 シグナルペプチド、 内在性 GH分泌誘導ペプチド及びその他のぺプチド部分、及びこれらのぺプチド の切断点が明らかになり、内在性 GH分泌誘導べプチドの生成機構が明ら かになる。
なお、本願発明の 1つである内在性 GH分泌誘導べプチドの一部のアミ ノ酸配列、 当該ペプチドの前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列及び該ポ リペプチドをコードする DNAの塩基配列が、 国際出願公開 W0 98/42840 において開示されているが、 該出願で開示されたべプチドはモチリン (mo t i l i n) 様活性を有する 14アミノ酸からなるペプチドであり、 本願 発明で開示された Ca濃度上昇活性や GH分泌誘導活性については記載が ない。
本願発明に係るぺプチド系化合物とは、 細胞内のカルシウムイオン濃 度を上昇させる活性を有し、 次式 （2 ) で示される構造において、 少な くとも 1つアミノ酸が修飾アミノ酸で置換されているペプチド、 又は少 なくとも 1つのアミノ酸が非アミノ酸で置換されたペプチド類縁体、 及 びそれらのアミノ末端及び/又はカルボキシル末端が修飾されたべプチ ド誘導体をいう。
本発明において、 上記のペプチド、 ペプチド類縁体及びペプチド誘導 体をべプチド系化合物と総称する。
また、 当該ペプチド系化合物において、 複数のアミノ酸が修飾アミノ 酸及び 又は非アミノ酸で置換されてもよい。 本発明においては、 配列 番号 2で表されるアミノ酸配列において、 通常アミノ末端から 1〜 1 0 番目、 好ましくはァミノ末端から 1〜4又は 1〜 5番目のアミノ酸の 1 又は複数が修飾アミノ酸及び 又は非アミノ酸で置換されているのが好 適である。 中でも、 1〜 5番目のアミノ酸が修飾アミノ酸及び Z.又は非 アミノ酸で置換されているのが好適である。
又、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 ァミノ末端から 1 〜4番目以外の部分で、 好ましくは 1〜 6番目以外の部分で、 より好ま しくは 1〜 1 0番目以外の部分でのアミノ酸の 1又は複数が欠失又は付 加されていてもよい。
本発明のペプチド系化合物は好ましくは細胞内のカルシウムイオン濃 度を上昇させる活性及び生体内で成長ホルモンの分泌を誘導するべプチ ドであって、 少なくとも一つのアミノ酸が修飾アミノ酸及び 又は非ァ ミノ酸化合物により置換された化合物である。
すなわち、 本発明におけるペプチド系化合物は、 細胞内カルシウムィ オン濃度上昇活性又は 及び生体内成長ホルモン分泌誘導作用を有し、 ペプチド鎖においてアミノ酸が修飾アミノ酸又は 及び非アミノ酸化合 物で置換されたべプチド系化合物である。
そのような化合物の具体例として配列番号 1、 2又は 3が示すぺプチ ドにおいて第 3番目のアミノ酸 Serの水酸基がァシル化された化合物、 配列番号 4又は 5が示すぺプチドにおいて第 2 5番目アミノ酸 Serの水 酸基がァシル化された化合物又はその薬理学的に許容される塩が挙げら れる。
また、 他の具体例としては、 配列番号 1 0、 1 1、 1 6又は 1 7が示 すべプチドにおいて第 3番目のアミノ酸 Serの水酸基がァシル化された 化合物又はその薬理学的に許容される塩が挙げられる。
さらに他の具体例としては、 配列番号 2 2、 2 5、 2 6又は 2 7が示 すべプチドにおいて第 3番目のアミノ酸 Serの水酸基がァシル化された 化合物又はその薬理学的に許容される塩が挙げられる。
またさらに他の具体例としては、 配列番号 2 9、 3 0又は 3 1が示す ぺプチドにおいて第 3番目のアミノ酸 Serの水酸基がァシル化された化 合物又はその薬理学的に許容される塩が挙げられる。
また、 配列番号 2 8が示すペプチドにおいて第 3番目のアミノ酸 Thr の水酸基がァシル化された化合物又はその薬理学的に許容される塩が挙 げられる。
本発明におけるァシル化によって水酸基に導入されるァシル基は例え ば有機カルボン酸、 有機スルホン酸、 有機リン酸化合物から水酸基を除 去して形成される基である。
有機カルボン酸としてはより具体的には、 脂肪酸が挙げられ、 その炭 素数は好ましくは 2〜3 5程度、 より好ましくは 6〜 1 8程度、 最も好 ましくは 8〜 1 6程度である。そのような脂肪酸としては、具体的には、 オクタン酸 （好ましくは、 力プリル酸）、 デカン酸 （好ましくは、 カプリ ン酸）、 ドデカン酸 （好ましくは、 ラウリル酸）、 それらのモノエン又は ポリエン脂肪酸等が挙げられる。
有機スルホン酸、 有機リン酸化合物として、 その炭素数が 2〜3 5程 度のものが好ましい。
第 3番目の Serの水酸基がァシル化されている配列番号 1のアミノ酸 配列を含む、 いかなるペプチド系化合物又はその薬理学的に許容される 塩も本発明における好ましい実施の態様である。
すなわち、 本願発明の第 2は、 配列番号 8に記載のアミノ酸配列、 望 ましくは配列番号 1に記載のアミノ酸配列、 より望ましくは配列番号 9 に記載のアミノ酸配列において第 3番目の Ser の水酸基がァシル化され ている脂肪酸修飾ペプチド含む、 いかなるペプチド系化合物又はその薬 理学的に許容される塩も本発明における好ましい実施の態様である。 また、 配列番号 8に記載のアミノ酸配列、 望ましくは配列番号 1に記 載のアミノ酸配列、 より望ましくは配列番号 9に記載のアミノ酸配列の ァミノ末端から 3番目のアミノ酸残基セリンをトレオニンに変換したァ ミノ酸配列において第 3番目の Thr の水酸基がァシル化されている脂肪 酸修飾べプチド含む、 いかなるペプチド系化合物又はその薬理学的に許 容される塩も本発明における好ましい実施の態様である。
さらに又、 本発明の好ましい実施の態様は下記一般式 （2) で表され る化合物又はその薬理学的に許容される塩である。
X-AA 1 -AA2 -AA 3 -Y (2) 〔式中、 X は、 ァミノ末端アミノ酸のァミノ基の水素原子に相当する部 分で、 H又は炭素数が 1 又は複数の飽和又は不飽和アルキル又はァシル 基を表す。 Y は力ルポキシル末端アミノ酸の α—力ルポキシル基の水酸 基に相当する部分で、 0Η、 0Ζ又は NR6R7 (Ζは薬理学的に許容し得る陽 イオン又は低級の分枝鎖もしくは非分枝鎖アルキル基を表し、 R6又は R7 は Η又は低級の分枝鎖もしくは非分枝鎖アルキル基を表し、 R6と R7と は同一又は異なっていてもよい。） を表す。〕
ここで、 ΑΑ 1は、 式
Figure imgf000059_0001
(式中、 nは 1又は 2を表し， と は、 同一であっても異なってい てもよく、 水素又は置換基を表す。）
で表される。
ただし、 nが 2のときは、 その二つの置換基 > は同一であってもよい し異なっていてもよい。 又、 R,， についても同様である。
置換基の具体例としては、 （ 1 )炭素数 1以上のアルキル鎖を介し又は 介せず、 エステル、 エーテル、 チォエステル、 チォエーテル、 アミド又 はカルバミドからなる群から選択される結合様式で結合する炭素数 1以 上の飽和もしくは不飽和アルキル鎖、 （2) H又は炭素数 1以上の飽和も しくは不飽和アルキル鎖、 又は （3) 天然アミノ酸の側鎖等が挙げられ る。
また、 炭素数 1以上のアルキル鎖を介し又は介せず、 ジスルフイ ド又 はチォカルバミド結合で結合する炭素数 1以上の飽和もしくは不飽和ァ ルキル鎖であってもよい。
AA 2は、 式
—— ——
Figure imgf000060_0001
(式中、 と ' は前記と同意義。 は、 H又は炭素数 1乃至 6の飽和 或いは不飽和アルキル基を表す。）
又は、 — CH2— CH (R 2) — CH2—、 或いは— CH2— CH (R x) -CO- (Riは前記と同意義） を表す。
AA 3は、 式
Figure imgf000060_0002
(式中、 mは 1以上の整数を表し， R,、 R,' 又は は、 前記と同意義。） ただし > Πιが 2以上の整数のときは、 その二つの置換基、 R,は同一であつ てもよいし異なっていてもよい。 又 ， R2についても同様である。
Xで示される炭素数が 1 以上の飽和又は不飽和アルキルとしては具体 的にはメチル、 ェチル、 n—プロピル、 i—プロピル、 n—プチル、 s —ブチル、 tーブチル、 n—ヘプチル、 n—へキシル、 n—デシル、 ビ ニル、 プロパニル又はへキセニル等の d_2。のアルキルが好ましい。
X で示されるァシルとしては、 ホルミル、 ァセチル、 プロピオニル、 若しくはベンゾィル等の カルボン酸ァシル；又はベンゼンスルホ 二ルナフタレンスルホニル等の C7_13のスルホン酸ァシルが挙げられる < 又は ' で示される基は例えば式（2)
一 (CH2) n-P-Q (2)
o o
II II
(式中、 nは 0〜： 10の整数、 Pは— C— O—、 — O— C一、 — 0—、
O S O II II II
一 C一 S—、 — C一 S—、 一 S— C―、 一 S—、 -CO-NH-,
— NH— C O—又は— CO— NH— CO—を表し、 Qは H又は上記した Xで 示される C i— 2 0のアルキルを表す。）
で示される基が好ましい。 さらに Pは— CO—でもよい。
さらに、 Pは一 S— S—、又は—NH— C S—であってもよい。また、 上記全ての— NH—において、 Hが C卜35の飽和又は不飽和アルキル基， C 2 oのァリール基で、 C7〜13のァラルキル基で置換されていてもよ い。
より好ましくは、 Pは
O O O
II II II
一 C一 O—、 一 C一、 一 O—、 一 S—、 — S— S—、 — C一 S―、
S II
- CO-NH-, 一 NH— CO—又は— NH— C一である。 また、 又は で示される基は、 Pを介さずに一 （CH2) „に<3が 結合している基であってもよい。
1、 R6又は R7で示される低級のアルキル基としては、 例えばメチル、 ェチル、 n—プロピル、 i —プロピル、 n—プチル、 s—ブチル、 t — プチル、 i —プチル、 n—ペンチル又は n—へキシル等の C,— 6のアル キルが好ましい。
次に、 本願発明に係るペプチド化合物の好ましい態様を以下に示す。
( 1 ) AA1の好ましい態様；（ァ） アミノ酸又はペプチド。 例えば、 Ser、 Gly-Ser又は- NH- (CH2) 3CH(CH2OH) CO- ( 2アミノ酸残基間のぺプチド結合 部分が- (CH2)2-である場合）等が挙げられる。 （ィ）一級ァミン。例えば、 -NH-(CH2)3CH(CH2OH) CH2- ( 2ァミ ノ酸残基間のぺプチ ド結合部分が -（CH2)「である場合）、 -NH-(CH2)3CH(R,)CH2- ( 2アミノ酸残基間のぺプチ ド結合部分が- (CH2) 2-である場合） 〔 R, は前記と 同意義。〕、 -NH-CH (CH20H) CH2-等が挙げられる。
また、 （ァ） アミノ酸又はペプチドとして、 NH2_(CH2) 4-C00H 、 NH2 -C (CH3) 2 - (CH2) 3 - C00H、又は NH 2 -CH (CH3) - (CH2) 2 - CH (CH3) -C00Hも挙げら れる。
( 2) AA2の好ましい態様；（ァ） アミノ酸。例えば、 Ser、 homoSer, Cys、 homoCys、 Asp, Glu、 Lys、 Ala, VaK Leu、 homoLeu, Ile、 homol le, ォ ルニチン、 アミノアジピン酸、 メチォニン、 ェチォニン、 ブチォニン、 又は S—メチルシスティン等が挙げられるが、 特に Ser が好ましい。 (ィ） アミノ酸残基以外の構造； - CH2-CH(R1)- CO- 、 -CH2-CH(R,)-CH2- 等が挙げられる （R,は前記と同意義。）。
特に、 （a) 疎水性側鎖を有するロイシン、 ゾ リン、 ノルロイシン、 ホ モロイシン、ホモイソロイシン、ナフチルァラニン類、 トリブトファン、 フエ二ルァラニン、 シクロへキシルァラニン等、 あるいは、 これらの i - メチルアミノ酸が好ましい。 また （b) 側鎖にァシル基、 アルキル基、 アルケニル基あるいはァラルキル基で修飾が可能な官能基を有する、 セ リン、 ホモセリン、 卜レオニン、 システィン、 ホモシスティン、 ァスパ ラギン酸、 グルタミン酸、 アジピン酸、 リジン、 オル二チンなど、 およ びこれらの yV-メチルアミノ酸が好ましい。
これら （b) のアミノ酸側鎖に、 エステル、 アミド、 ジスルフイ ド、 エーテル、 チォエーテル、 チォエステル， カルバミドまたはチォカルバ ミド結合を介し、 ァシル基、 アルキル基、 アルケニル基あるいはァラル キル基が結合する。 また、 アミノ酸の α炭素にアルキル、 ァラルキル基 が結合してもよい。
(3) ΑΑ3の好ましい態様；アミノ酸又はペプチド。 例えば、 Phe又は 配列番号 1又は 3記載のアミノ酸配列においてアミノ末端から 4番目の Pheから 28番目の Argまでのアミノ酸配列を有するぺプチド若くは当該 配列の力ルポキシル末端側のアミノ酸が、 配列番号 2又は 3記載のアミ ノ酸配列においてアミノ末端から 5番目の Leuまで 1つずつ欠失したぺ プチド。
例えば、
Phe Leu,
Phe Leu Ser、
Phe Leu Ser Pro,
Phe Leu Ser Pro Glu、
Phe Leu Ser Pro Glu His、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gin,
Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Arg,
Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala,
Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gln、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin,
Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg,
Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys, Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu,
Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser, Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys、 Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys, Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro,
Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys
Pro
Pro,
Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro
Pro Ala,
Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro
Pro Ala Lys,
Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro
Pro Ala Lys Leu,
Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro
Pro Ala Lys Leu Gin,
Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro
Pro Ala Lys Leu Gin Pro, 又は、
Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg、
が AA3の例として挙げられる。
又さらに、 AA3の例示において、 アミノ酸は L-アミノ酸でも D-ァミノ 酸でもよいことはいうまでもない。 又、 AA3 の上記例示において、 例え ば 1〜数個のアミノ酸（好ましくはアミノ酸配列の約 3分の 1程度まで） は、 非天然アミノ酸又は非アミノ酸単位、 例えば
-NH- (CH2)3CH(CH2OH) - -NH- (CH2)3CH(CH20H)C0- -NH-CH(CH20H) CH2- -NH- (CH2)3CH(R,)CH2-
-CH2-CH(R,) -CO-, 又は
-CH2-CH(R,) -CH2- (上記式中 は前記と同意義）
で置き換えられてもよい。 上記式で示される基が AA3に複数個あり、 し かも で示される基が複数個ある時、 それらは同一又は異なる。
又、 さらに、 AA3の例示における各アミノ酸のいずれも上記 で示さ れる置換基を有してよい。 AA3 で示される基において、 が複数個存在 する時は、 それらは同一であっても異なっていてもよい。
以下にペプチドを構成するアミノ酸が側鎖に水酸基、 メルカプ卜基、 イミノ基又はアミノ基を有する場合の当該側鎖の好ましい例を示す。 な お、以下の R8は炭素数 1以上の飽和又は不飽和アルキル鎖を示す。かか るアルキル鎖は Xで示される上記のアルキル鎖と同意義でよい。
ァ） Serの側鎖； -CH2-0-C0-R8又は- CH2- 0- R8、
ィ） homoSerの側鎖； - CH2-CH2- 0- C0-R8又は- CH2-CH2-0- R8、
ゥ） Cysの側鎖； -CH2-S-C0-R8又は- CH2- S- R8、
ェ） homoCysの側鎖； -CH2- CH2- S- CO- R8又は- CH2- CH2_S- R8、 ォ） Aspの側鎖； -CH2-C00-R8又は _CH2- CO-NH- R8、
力） G l uの側鎖； -CH2-CH2- C00-R8又は- CH2-CH2-C0- NH-R8
キ） Lysの側鎖； - (CH2) 4-NH-C0_R8、
ク ） ア ミ ノ ア ジ ピ ン 酸 の 側 鎖 ； -CH2-CH2- CH2-C00 - R8 又 は - CH2-CH2- CH2- CO- NH- R8、
ケ） オル二チンの側鎖； - (CH2) 3-NH- CO- R8
コ）側鎖がアルキル鎖のアミノ酸である A l a、 Va l、 Leu, ホモロイシン、 I l e、 ホモイソロイシン、 S —メチルシスティン、 メチォニン、 ェチォ二 ン、 又はブチォニン等についても同様にアルキル基が上記のように式 ( 2 ) で示される修飾されたアルキル基であってよい。
又、 さらに本発明は、 配列番号 2又は 3のアミノ酸配列において、 ァ ミノ末端から 1 3、 14又は 1 5番目までのアミノ酸からなる部分ペプチド を含有する細胞内カルシウムイオン濃度上昇剤もしくは GH 分泌誘導剤 も、 好ましい実施の態様として含むものである。 この場合の部分べプチ ドを構成する各アミノ酸単位は必ずしも化学修飾されている必要はない。 さらに又、本発明の好ましい実施の態様は下記のペプチド系化合物であ る。
なお、 グレリン誘導体とは天然型グレリンの化学構造を一部改変したぺ プチド系化合物のことをいい、短鎖ダレリンとは 27ないし 28アミノ酸か らなる天然型ダレリンの一部のアミノ酸が欠失して、 27ないし 28よりも 少ないアミノ酸からなるペプチドのことをいう。 また、 n位のアミノ酸残 基とはァミノ末端から n番目のァミノ酸残基のことを示す。
ダレリン、 あるいはその短鎖グレリン誘導体のァミノ末端アミノ酸は、 該アミノ酸の αァミノ基が保護されていなければ、 いずれのアミノ酸 （天 然型グレリンではアミノ末端アミノ酸はグリシン）でもよく、また D—体、 L一体のいずれでもよいが、 好ましくは、 ァラニン、 バリン、 ァミノイソ ブタン酸などが好適である。
2位残基は、 いずれのアミノ酸 （天然型ダレリンではセリン） でもよい が、 好ましくは小さな側鎖を有するァラニン、 セリン、 ヒスチジン、 ノル バリンあるいは非アミノ酸化合物等が好適である。
1位と 2位残基は、 アミノ酸 2残基に相当する δ—アミノ酸、 例えば実 施例で示した 5—ァミノペンタン酸や、 5—ァミノ一 5—ジメチルペン夕 ン酸、 2、 5—ジァミノペンタン酸等であってもよい。
3位と 4位に選ばれるアミノ酸残基は、 D—体、 L一体いずれでもよく、 D—あるいは L一 ―メチルアミノ酸であってもよく、 これらのいずれの 組み合わせであってもよい。 中でも、 3位が L—体、 または 3位、 4位と も L—体の組み合わせが好ましい。
3位と 4位に選ばれるアミノ酸残基の立体配置は、 1位および 2位のァ ミノ酸配列により適宜選択できる。 即ち、 天然のグレリンの 1位と 2位の アミノ酸配列、 Gly- Serは 3位と 4位ともに L—体であることが好ましい が、 他のアミノ酸配列、 例えば、 Aib- Hi s等のの場合は 3、 4位がともに D -体であってもよい。 また、 1、 2位が 2残基相当長の δ—アミノ酸、 例えばァミノペンタン酸である場合は、 3、 4位は L -体， D -体のいずれ であってもよい。
3位と 4位に選ばれるアミノ酸残基は、 好ましくは、 D—体あるいは L 一体のロイシン、 バリン、 ノルロイシン、 ホモロイシン、 ホモイソ口イシ ン、 ナフチルァラニン類、 トリブトファン、 フエ二ルァラニン、 シクロへ キシルァラニン、 およびこれらの D―、 あるいは L— TV—メチルアミノ酸 が好適である。
特に、 3位と 4位に選ばれるアミノ酸残基は、 上記疎水性アミノ酸の中 でも、例えば、ナフチルァラニン類、 トリブトファン、フエ二ルァラニン、 シクロへキシルァラニンなどの芳香族の疎水性アミノ酸がより好ましい。 また、 3位と 4位に選ばれるアミノ酸残基としては、 リジン、 アルギニ ンまたはヒスチジンなどの塩基性アミノ酸も好ましい。なかでもリジンが 好ましい。
これら塩基性アミノ酸により、 ダレリン分子が塩基性となり、 C a上昇活 性がより向上する。
3位と 4位に選ばれるアミノ酸残基は、側鎖にァシル基（アルカニル基、 アルケノニル基もしくはァリールアルカニル基など）、 アルキル基、 また はァラルキル基で修飾が可能な官能基を有する、 セリン、 ホモセリン、 ト レオニン、システィン、ホモシスティン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、 アジピン酸、 リジン、 オル二チンなどが好適である。
これらの側鎖に反応性を有するアミノ酸は、 D—体または L—体のいず れでもよく、対応する D—あるいは L— iV—メチルアミノ酸であってもよ いが、 中でも、 3位が L—体、 または 3位、 4位とも L一体の組み合わせ が好ましい。
また、 アミノ酸側鎖に、 力ルバメイト、 チォカルバメイト、 エステル、 アミド、 ジスルフィ ド、 エーテル、 チォェ一テルもしくはチォエステル結 合等を介し、 ァシル基、 例えばァラカニル基 （炭素数が 2〜3 5、 好まし くは 6〜 1 8、 より好ましくは 8〜 1 2 )、 アルケノニル基 （炭素数が 2 〜 3 5、 好ましくは 6〜： 1 8、 より好ましくは 8〜 1 2 )、 ァリールアル 力ニル基 （ベンゾィル、 フエナセチル、 フエ二ルブチリル、 ナフトイル、 ナフチルァセチルもしくはナフチルプロピオニル基など）；アルキル基（炭 素数が 2〜 3 5、 好ましくは 6〜 1 8、 より好ましくは 8〜 1 2 ) ； また は、 ァラルキル基 （ベンジル、 フエネチル、 フエニルプロピル、 フエニル ブチル、フエ二ルペンチル、ナフチルメチル基等）が結合していてもよい。 また、 結合を介さずに、 3位と 4位の α炭素に上記のアルキル基、 ァラル キル基が結合してもよい。 3位と 4位に選ばれるアミノ酸残基の組み合わせとしては、 3位のアミ ノ酸残基が疎水性の側鎖を有し、 4位のアミノ酸剤が疎水性アミノ酸であ ることが好ましい。
疎水性の側鎖を有する 3位のアミノ酸残基としては、アミノ酸の α炭素 に、 （a ) 炭素数 1以上のアルキレン基を介して又は介さず、 エステル、 エーテル、 チォエーテル、 アミドまたはジスルフィ ド結合を介して炭素数 が 1若しくは複数の飽和若しくは不飽和アルキル鎖、 又は （b ) 炭素数 1 以上の飽和若しくは不飽和アルキル鎖を導入した修飾アミノ酸が好まし レ 特に、 アミノ酸の α炭素に炭素数 1以上の飽和アルキル鎖を導入した 修飾アミノ酸がより好ましい。
4位アミノ酸のカルボキシル基が、 アミド、 メチルアミドもしくはェチ ルアミド等のアルキルアミド、 またはべンジルアミド、 ァダマンタンアミ ドもしくはァダマンタンアルキルアミ ド等のァラルキルアミドであって もよい。
また、 アルキルアミド、 あるいはァラルキルアミドに、 アミノ基または グァニジド基などの塩基性基を結合してもよい。かかる塩基性基としては、 例えば、 _ C0NH_ CH2CH2— ΝΗ2、 一 CONH— CH2NHCH3, — CONH— CH2CH2CH2— NH
- C (NH2) = NH、 ― C0NHCH2Ph - NH2などが挙げられる。
4位アミノ酸の力ルポキシル基に、 アルギニン、 リジン、 ヒスチジン などの塩基性アミノ酸を付加してもよく、 これら塩基性アミノ酸は D— 体、 L—体もしくはラセミ体、 または D _もしくは L— TV—メチルアミ ノ酸のいずれであってもよい。
これらのアミノ酸の力ルポキシル基は、 上述のように、 アルキルアミ ドまたはァラルキルアミドであってよい。 さらに、 アルキルアミドある いはァラルキルアミドに、 アミノ基、 グァニジド基など塩基性基を結合 してもよい。 かかる塩基性基としては、 上述のものなどが挙げられる。 5位以降のアミノ酸配列は、 ヒトダレリン、 ラットダレリンの 5位口 イシンを基点に 2 8位まで、 いずれの長さの配列が 4位のアミノ酸に付 加してもよい。
好ましくはグレリン （1— 5)、 ダレリン （1— 6)， ダレリン （1— 7), ダレリン （1— 8), グレリン （1— 9)， ダレリン （1— 10)、 グレリン （1 -11) が挙げられる。 なお、 グレリン （m-n) とは、 ダレリンのァミノ 末端から m番目より n番目までのアミノ酸配列を有するペプチドを示す。 とくに、 ダレリン （1— 5) がより好ましい。
そのカルボキシル末端は、 上述のようなアルキルアミド、 またはァラ ルキルアミドであるのが好ましい。
また、 アルキルアミドまたはァラルキルアミドに、 さらにアミノ基ま たはグァニジド基などの塩基性基を結合させてもよい。 かかる塩基性基 としては、 上述のものなどが挙げられる。
また、 5位以降から 2 8位までのいずれかのアミノ酸配列をグレリン ( 1 - 4)カルボキシル末端部に付加した力ルポキシル末端部欠損グレリ ン誘導体の力ルポキシル末端アミノ酸にアルギニン、 リジン、 ヒスチジン などの塩基性アミノ酸を付加してもよい。
これら塩基性アミノ酸は D—体、 L一体もしくはラセミ体、 又は D—も しくは L— TV—メチルアミノ酸であってもよい。
また、 これらの塩基性アミノ酸のカルボキシル基が、 上述のようにアル キルアミド、 またはァラルキルアミドであってもよい。 アルキルアミドま たはァラルキルアミドは、 さらにアミノ基またはグァニジド基などの塩基 性基を結合してもよい。 かかる塩基性基としては、 上述のものなどが挙げ られる。
とくに好ましい態様としては、 ダレリン （1— 5)、 ダレリン （1— 6)， ダレリン （1— 7) の力ルポキシル末端アミノ酸は、 D—体、 L—体、 又 は対応する D—もしくは L一 T —メチルアミノ酸である場合が挙げられ る。
また、 5， 6， 7位の残基にアルギニン、 リジン、 ヒスチジンなどの塩 基性アミノ酸を付加してもよく、 これらのアミノ酸は D—体、 L—体ある いはラセミ体、 又は D―、 あるいは L— T —メチルアミノ酸であってもよ い。
また、 これらの塩基性アミノ酸の力ルポキシル基が、 上述のようなアル キルアミド、 またはァラルキルアミドであってもよい。 アルキルアミドま たはァラルキルアミドに、 さらにアミノ基またはグァニジド基などの塩基 性基を結合してもよい。 かかる塩基性基としては、 例えば、 上述のものな どが挙げられる。
本発明に係るペプチド化合物は、 上記のように、 カルボキシル末端がァ ルキルアミドまたはァラルキルアミドである場合、該アルキル基またはァ ラルキル基にさらにァミノ基が結合しているアミド誘導体であってもよ く、 本発明における好ましい態様の一つである。 具体的には、 例えば、 力 ルポキシル末端がアミノエチルアミドである場合があげられる。
上記のように、カルボキシル末端がアミド体またはアミド誘導体である 本発明に係るぺプチド系化合物は、生体内で力ルポキシぺプチダ一ゼ類に よる酵素分解に抵抗することからも有用な化合物である。
同様に、 N-メチルアミノ酸を含む本発明に係るぺプチド系化合物も酵素 抵抗性を有する点で有用な化合物である。
本発明に係るぺプチド系化合物は常法により得ることができる。 例え ば、 既に上述のように天然の原料から単離されるか、 又は組換え D N A 技術及び/または化学的合成によって製造することができる。 更にアミ ノ酸残基に修飾 （例えば、 ァシル化） が必要な場合は自体公知の手段に 従って修飾反応を施すことができる。 本発明に係るぺプチド系化合物は、 より具体的には本願発明に係るぺ プチドをコ一ドする DN Aを有する発現べクタ一により形質転換された 宿主細胞を培養し、 当該培養物から目的のぺプチドを採取することによ り本発明に係るぺプチド系化合物を得ることもできる。
当該宿主細胞を選択することにより、 当該細胞内において目的のぺプ チドにァシル化等の修飾がされた化合物を得ることができる。 また、 当 該ペプチドが修飾されていない場合は、 所望により公知の手段に従って ァシル化等の修飾反応を行えばよい。 ァシル化反応にはリパーゼ等の酵 素を用いることもできる。
遺伝子を組み込むベクターとしては、例えば大腸菌のベクター（pBR322、 PUC18, pUC19等）、 枯草菌のべクタ一 （pUB110、 pTP5, pC194等）、 酵母 のベクター （YEp型、 YRp型、 Yip型）、 又は動物細胞のベクタ一 （レト ロウィルス、 ワクシニアウィルス等） 等が挙げられるが、 その他のもの であっても、宿主細胞内で安定に目的遺伝子を保持できるものであれば、 いずれをも用いることができる。 当該ベクターは、 適当な宿主細胞に導 入される。 目的の遺伝子をプラスミドに組み込む方法や宿主細胞への導 入方法としては、 例えば、 Molecular Cloninng (Sambrook et al. , 1989) に記載された方法が利用できる。
上記プラスミドにおいて目的のぺプチド遺伝子を発現させるために、 当該遺伝子の上流にはプロモー夕一を機能するように接続させる。
本願発明において用いられるプロモーターとしては、 目的遺伝子の発 現に用いる宿主細胞に対応して適切なプロモーターであればいかなるも のでもよい。 例えば、 形質転換する宿主細胞が Escherichia属の場合は lacプロモータ一、 trpプロモータ一， lppプロモーター、 APLプロモ一 夕一， recA プロモ一夕一等を用いることができ、 Bacillus 属の場合は SP01プロモータ一、 SP02プロモーター等を用いることができ、酵母の場 合は GAPプロモータ一， PH05プロモ一夕一、 ADHプロモーター等を用い ることができ、 動物細胞の場合は、 SV40由来プロモーター、 レトロウイ ルス由来プロモーター等を用いることができる。
上記のようにして得られた目的遺伝子を含有するべクタ一を用いて宿 主細胞を形質転換する。 宿主細胞としては細菌 （例えば、 Es cher i ch i a 属、 Bac i l l us属等）、酵母（Saccharomyces属、 P i ch i a属、 Cand i da属等）、 動物細胞 （CH0細胞、 COS細胞等） 等を用いることができる。 培養時の培 地としては液体培地が適当であり、 当該培地中には培養する形質転換細 胞の生育に必要な炭素源、 窒素源等が含まれることが特に好ましい。 所 望によりビタミン類、成長促進因子、血清などを添加することができる。 脂肪酸修飾ペプチドを直接製造するためには、 該ペプチドの前駆体ポ リペプチドを適切な位置で切断できるプロセッシング ·プロテアーゼ活 性を有し、 当該ペプチド中のセリン残基をァシル化できる活性を有する 細胞が望ましい。 このようなプロセッシング ·プロテアーゼ活性および セリンァシル化活性を有する宿主細胞は、 当該前駆体ポリペプチドをコ 一ドする cDNAを含む発現べクタ一で宿主細胞を形質転換し、該形質転換 細胞が Ca上昇活性又は GH分泌誘導活性を有する脂肪酸修飾べプチドを 産生することを確認することにより、 選抜できる。
培養後、培養物から本発明に係るペプチドを常法により分離精製する。 例えば、 培養菌体又は細胞から目的物質を抽出するには、 培養後、 菌体 又は細胞を集め、 これをタンパク質変性剤 （塩酸グァニジンなど） を含 む緩衝液に懸濁し、 超音波などにより菌体又は細胞を破砕した後、 遠心 分離を行う。次に上清から目的物質を精製するには、目的物質の分子量、 溶解度、 荷電 （等電点）、 親和性等を考慮して、 ゲル濾過、 限外濾過、 透 析、 SDS-PAGE、 各種クロマトグラフィーなどの分離精製方法を適宜組み 合わせて行うことができる。 本発明に係るぺプチド化合物は常法により化学合成することができる 例えば、保護基の付いたアミノ酸を液相法及び 又は固相法により縮合、 ペプチド鎖を延長させ、 酸で全保護基を除去し、 得られた粗生成物を上 記の精製方法で精製することにより得られる。 ァシル化酵素又はァシル 基転移酵素で選択的に目的位置にあるアミノ酸の側鎖をァシル化するこ ともできる。
ぺプチドの製造法は従来既に種々の方法が充分に確立されていて、 本 発明のペプチド系化合物の製造もそのような自体公知の方法に従って容 易に製造できる。 例えば古典的なペプチド合成法に従ってもよいし、 固 相法に従ってもよい。
以下に、 組換え DNA技術と化学合成を併用した本発明に係るペプチド 化合物の製法について例を挙げて述べる。
ァ ミ ノ 末端部ペプチ ドの活性エステル、 例えば、 （ 1 ) Boc-Gly-Ser (Bu) -Ser (RlO)-Osu, (2) Boc-Gly-Ser (Bu)-Ser (RlO)-Phe - Osu、 又は (3) Boc-Gly- Ser(Bu)- Ser(RlO)- Phe- Leu- Osu を化学合成 し、 各々、 組換え DNA技術により生産したカルボキシル末端部ペプチド で あ る （ 4 ) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR ( 5 )
LSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR, 又は （6) SPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR とを 結合、 即ち、 （1) と （4)、 (2) と （5) 及び （3) と （6) を結合さ せて、 28個のアミノ酸からなるペプチド化合物を得る。 より具体的に は、 XXXXZ SPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR を大腸菌で発現させ、 Boc2(0)でァ ミ ノ 基 を 保 護 し 、
Boc-XXXXZSPEHQRVQQRK (Boc) ESK (Boc) K (Boc) PPAK (Boc) LQPRを得る。次に アミ ノ酸 Z の力ルポキシル末端に選択的な酵素で切り 出し、 NH2-SPEHQRVQQRK (Boc) ESK (Boc) K (Boc) PPAK (Boc) LQPR に変換する。 この 化合物と Boc-Gly-Ser (Bu)-Ser (RIO) -Phe-Leu-Osu を中性から弱アル力 リ 水 溶 液 中 で 混 合 し 、 得 ら れ る BocGlySer (Bu) Ser (R10) FLSPEHQRVQQRK (Boc) ESK (Boc) K (Boc) PPAK (Boc) LQPRをトリフルォロ酢酸処理すれば目的物が得られる。
上記アミノ酸の一文字標記は、 1997年 12月 10日、 株式会社二ユート ンプレス発行の 「細胞の分子生物学第 3版」 の記載に従った。
また、 Bocは /-ブチルォキシカルポニルを表し、 Osuは iV—ヒドロキ シサクシンィミドの水酸基の水素が脱離したものを表し、 Buはブチル基 を表し、 R10は上述した本発明に係る修飾アミノ酸の置換基を表す。 本願発明のぺプチド系化合物の塩としては薬学的に許容される塩が好 ましく、 例えば無機塩基との塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機 酸との塩、 塩基性又は酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム 塩などのアル力リ金属塩；カルシウム塩、 マグネシウム塩などのアル力 リ土類金属塩；ならびにアルミニウム塩、 アンモニゥム塩などが挙げら れる。
有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン、 トリ ェチルァミン、 ピリジン、 ピコリン、 エタノールァミン、 ジエタノール ァミン、 トリエタノールァミン、 ジシクロへキシルァミン、 Ν, Ν ' -ジべ ンジルエチレンジァミンなどとの塩が挙げられる。
無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸などとの塩が挙げられる。
有機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 トリフルォロ 酢酸、 フマール酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク 酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 Ρ-トルエンス ルホン酸などとの塩が挙げられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジ ン、 オル二チンなどとの塩が挙げられ、 酸性アミノ酸との塩の好適な例 としては、 例えばァスパラギン酸、 グルタミン酸などとの塩が挙げられ る。
これらの塩の中でもナトリゥム塩、 力リゥム塩が最も好ましい。
本願発明のぺプチド系化合物又はその薬理学的に許容しうる塩は毒性 が低く、 GH分泌誘導作用を有し、 そのままもしくは自体公知の薬理学的 に許容しうる担体、賦形剤、増量剤などと混合して哺乳動物（例、 ヒト、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 ゥシ、 ゥマ、 ブ夕、 サル等） に 対して用いることができる。 投与量は成人に静脈注射する場合 1日 0 . 0 1〜 5 mg/kgであり、好ましくは 0 . 0 4〜： I . 5 mg/kgである。 この量 を 1日 1回〜 3回投与するのが望ましい。 本願発明のペプチド系化合物 は、 薬学的に許容される担体と配合し、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散 剤などの固形製剤；又はシロップ剤、 注射剤などの液状製剤として経口 又は非経口的に投与することができる。
薬学的に許容される担体としては、 製剤素材として慣用の各種有機あ るいは無機担体物質が用いられ、 固形製剤における賦形剤、 滑沢剤、 結 合剤、 崩壊剤；液状製剤における溶剤、 溶解補助剤、 懸濁化剤、 等張化 剤、 緩衝剤、 無痛化剤などとして配合される。
また必要に応じて、 防腐剤、 抗酸化剤、 着色剤、 甘味剤などの製剤添 加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、 例えば乳糖、 白糖、 D -マンニトール、 デ ンプン、 結晶セルロース、 軽質無水ケィ酸などが挙げられる。 滑沢剤の 好適な例としては、 例えばステアリン酸マグネシウム、 ステアリン酸力 ルシゥム、 タルク、 コロイドシリカなどが挙げられる。
結合剤の好適な例としては、 例えば結晶セルロース、 白糖、 D -マンニ トール、 デキストリン、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ヒドロキシプ 口ピルメチルセルロース、 ポリビニルピロリ ドンなどが挙げられる。 崩壊剤の好適な例としては、 例えばデンプン、 カルボキシメチルセル ロース、 カルボキシメチルセルロースカルシウム、 クロスカルメロース ナトリゥム、 カルボキシメチルスターチナトリゥムなどが挙げられる。 溶剤の好適な例としては、 例えば注射用水、 アルコール、 プロピレン グリコール、マクロゴール、ゴマ油、 トウモロコシ油などが挙げられる。 溶解補助剤の好適な例としては、 例えばポリエチレングリコール、 プ ロピレンダリコール、 D -マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、 トリスァミノメタン、 コレステロール、 トリエタノールァミン、 炭酸ナ トリウム、 クェン酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、 例えばステアリルトリエタノールァミ ン、ラウリル硫酸ナトリウム、 ラウリルアミノプロピオン酸、 レシチン、 塩化ベンザルコニゥム、 塩化べンゼトニゥム、 モノステアリン酸グリセ リンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、 ポリビニルピロ リドン、 カルポキシメチルセルロースナトリウム、 メチルセルロース、 ヒドロキシメチルセルロース、 ヒドロキシェチルセルロース、 ヒドロキ シプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、 例えば塩化ナトリウム、 グリセリン、 D -マンニトールなどが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、 例えばリン酸塩、 酢酸塩、 炭酸塩、 クェ ン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、 例えばべンジルアルコ一ルなどが挙げ られる。
防腐剤の好適な例としては、 例えばパラォキシ安息香酸エステル類、 クロロブ夕ノール、 ベンジルアルコール、 フエネチルアルコール、 デヒ ドロ酢酸、 ソルビン酸などが挙げられる。 抗酸化剤の好適な例としては、 例えば亜硫酸塩、 ァスコルビン酸など が挙げられる。
上記医薬組成物は、 GHの投与による効果と同等以上の効果をもたらし， GHの投与によって起こる様々な副作用も低減できる。
当該医薬組成物の適用可能な疾患又はその効果は、 GH欠損又は低下が 関係するものとして、 例えば、 小人症、 正常人での骨芽細胞及び骨再構 成の活性化、 GH欠乏症成人での筋肉量及び筋力の増強 、 GH欠乏症成人 での運動能力の向上、 小児の重度火傷治癒、 排卵誘発におけるゴナンド トロピンとの併用、プレドニゾン投与によるタンパク質代謝異常の予防、 重度免疫不全症における T細胞 「教育」 の促進、 老人性の体重減少、 脂 肪組織拡大及び皮膚萎縮を抑制する効果などが挙げられるが、 これらに 限定されるものではない。
また、 GH欠損又は低下と直接関係しない疾患又は効果としては、 例え ば実施例 7に記載したように、 当該医薬組成物は拍動量の増加効果があ るから、 心不全等の心疾患の治療に効果がある。
当該医薬組成物の効果はヒトには限らない。 すなわち、 動物の成長促 進、 食肉中の脂身の低減等、 GH投与と同等以上の効果がある。
また、 例えば実施例 1 3に記載したように、 本発明に係る医薬組成物 は脳室内投与および静脈内投与によって食欲増進作用があることから、 食欲不振や拒食症を治療するための食欲増進剤として用いることもでき る。
さらに、 例えば実施例 1 4に記載したように、 本発明に係る医薬組成 物は胃運動および胃酸分泌を促進する作用があることから、 非潰瘍性消 化不良、 突発性軽症胃アトニー、 機能性消化不良および逆流性食道炎等 の胃機能性疾患の治療剤として用いることもできる。
加えて、 例えば実施例 1 5に記載したように、 本発明に係る医薬組成 物は静脈内投与により、 骨髄、 十二指腸および空腸において細胞増殖促 進作用が認められたことから、 腸管粘膜保護剤、 経静脈栄養時の小腸粘 膜障害予防剤及び骨粗鬆症治療剤として用いることができる
また上記医薬組成物は以下のような疾患の治療又は身体状態の改善に 効果がある。
例えば、 高齢者における成長ホルモン放出の刺激処置、 糖質コルチコ イドの異化副作用の予防、 ォステオポロ一シスの予防と治療、 免疫系の 刺激、 損傷治癒の促進、 骨折修復の促進、 成長遅滞の治療、 成長遅滞に 起因する腎不全もしくは機能不全の治療、 成長ホルモン欠損児童を含む 生理学的不足状態および慢性疾患に関連した不足状態の治療、 肥満およ び肥満に関連した成長遅滞の治療、 プラーダーーヴィリ症候群および夕 —ナ一症候群に関連した成長遅滞の治療、 火傷患者の回復の促進および 入院の削減、 子宮内発育遅滞、 骨格形成異常、 高コルチコイド症および クッシング症候群の治療、 拍動性成長ホルモン放出の誘導、 ストレス患 者における成長ホルモンの代用、 骨軟骨形成異常、 ヌーナン症候群、 精 神分裂病、 うつ病、 アルツハイマー病、 遅延損傷治癒および心理社会的 剥奪の治療、 肺機能不全および呼吸器依存症の治療、 大手術後のタンパ ク質異化反応の減衰、 癌やエイズ （AIDS) のような慢性疾患によるタン パク損失および悪液質の減少、 塍島細胞症を含む高ィンスリン血症の治 療、 排卵誘発のためのアジュバント療法、 胸腺の発育を刺激するためお よび加齢に伴う胸腺機能の衰退を防ぐため、 免疫抑制患者の治療、 筋肉 強度、 運動性の向上、 高齢者における皮膚の厚さ、 代謝恒常性、 腎恒常 性の維持、 骨芽細胞、 骨再造形および軟骨成長の刺激等が挙げられる。 また動物においても以下のような効果が期待される。 例えば、 動物の 成長の速度増加、 動物の乳生産もしくは獣毛生産増加、 ペット動物にお ける免疫系の刺激、 ペット動物における高齢疾患の治療、 家畜の成長促 進並びにヒッジにおける増毛などが挙げられる。
本願発明による Ca上昇活性又は GH分泌誘導活性を有する脂肪酸修飾 ペプチドを抗原とする抗体は、 公知の方法により取得できる。 当該抗体 は、モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体のいずれでもよく、 それらの取得についても公知の方法が利用できる。 また、 これらの抗体 を用いた脂肪酸修飾ペプチドの測定方法および当該測定法を利用した測 定キッ卜の作成も公知の方法が利用できる。
また、 実施例 1 7に記載したように、 グレリンのアミノ末端側及び力 ルポキシル末端側のペプチドに対する抗体を作成し、 前者が 3位セリン を修飾している脂肪酸を特異的に認識することを利用して、 脂肪酸で修 飾されたダレリンと脂肪酸が脱離したグレリンを分別定量することに用 いることもできる。
該グレリンのァミノ末端側に対する抗体またはカルボキシル末端側の ペプチドに対する抗体は、 公知の方法により取得でき、 モノクローナル 抗体あるいはポリクローナル抗体のいずれでもよい。
同様にして、 ァミノ末端の 3番目に修飾アミノ酸を有する本発明に係 るペプチド系化合物またはその薬理学的に許容される塩において、 3位 のアミノ酸残基の側鎖、 好ましくは脂肪酸を特異的に認識し、 アミノ末 端側のペプチドに結合する抗体を作ることもできる。 さらに、 同様にし て、 本発明に係るペプチド系化合物またはその薬理学的に許容される塩 において修飾アミノ酸を有するペプチドに特異的に結合する抗体を作る こともできる。
上記のように、 修飾アミノ酸の側鎖を特異的に認識する抗体と、 修飾 アミノ酸または および非アミノ酸化合物以外のアミノ酸またはそれら を含まないペプチドを認識する抗体、 好ましくは本発明に係るペプチド 系化合物またはその薬理学的に許容される塩の力ルポキシル末端側のぺ プチドに対する抗体とを組み合わせてなる検査キットも本発明に含まれ る。
また、 該検査キットを用いて、 修飾アミノ酸、 好ましくはァシル化さ れたアミノ酸を有する本発明に係るペプチド系化合物またはその薬理学 的に許容される塩と、 修飾アミノ酸を有しない本発明に係るペプチド系 化合物またはその薬理学的に許容される塩とを分離検出するアツセィ方 法も本発明に含まれる。
上記アツセィ方法または検査キットについて、 具体的態様を以下に述 ベる。 ただし、 本発明は以下の態様に限られない。
すなわち、 上記アツセィ方法としては、 例えば （ i ) 本発明のぺプチ ド系化合物等に対する抗体と、 被検波中の被検物質と標識化された本発 明のペプチド系化合物等とを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識 化された本発明のぺプチド系化合物等の割合を測定することを特徴とす る被検液中の本発明に係るペプチド系化合物等の定量法、 および （i i ) 被検波と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された別の本発 明の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標 識剤の活性または Zおよび不溶化担体上に捕捉されなかった標識剤の活 性を測定することを特徴とする被検波中の本発明のタンパク質等の定量 法が挙げられる。 上記 （ i ) および （i i ) の定量法においては、 一方の 抗体が本発明のタンパク質等のアミノ末端側を認識する抗体で、 他方の 抗体が本発明のタンパク質等の力ルポキシル末端側に反応する抗体であ ることが好ましい。
また、 本発明のペプチド系化合物等のアツセィ方法として、 該化合物 に対するモノクローナル抗体 （以下、 抗タンパク質抗体と称する場合が ある） を用いて本発明のタンパク質等の定量を行なえるほか、 組織染色 等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分 子の F ( a b ' ) 2、 F a b ' , あるいは F a b画分を用いてもよい。
上記抗体を用いる本発明のぺプチド系化合物等の定量法は、 特に制限 されるべきものではなく、 被測定液中の抗原量（例えば、 タンパク質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物 理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製 した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いても よい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィムノメトリック法およびサ ンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサ ンドィツチ法を用いるのが特に好ましい。
本発明にかかるアツセィ方法のうち標識物質を用いる測定法に用いら れる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元素、 酵素、 蛍光物質、 発光 物質などが用いられる。
放射性同位元素としては、 例えば、 125 I 、 131 I , 3Hまたは'4 Cなどが 用いられる。
上記酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 /3—ガラクトシダーゼ、 /3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ一 ゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。
蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソ チオシァネ一トなどが用いられる。
発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフ エリン、 ルシゲニンなどが用いられる。
さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン—アビジン系 を用いることもできる。 以下実施例に従って、 発明の詳細を述べる。 分子生物学的手法は特に 断らない限り、 Molecular Cloninng (Sambrooket al. , 1989) に依った。 実施例 1. GHS- R発現細胞株の作製と Ca上昇活性の測定
GH分泌誘導因子 （GHS) が GHSレセプ夕一 （GHS- R) に結合することに よって生ずる細胞内カルシウムイオン濃度の上昇 （Ca上昇活性） をアツ セィするために、 以下のようにしてラット GHS-Rを発現している細胞株 を作製した。 ラット GHS-Rの全長 cDNAは、 ラット脳由来の cDNAを铸型 にして、 RT-PCR (逆転写酵素—ポリメラーゼチェインリアクション） に よって取得した。 公知のラット GHS-Rの塩基配列 [K. K. Mckee, et al, Molecular Endocrinology 11, 415-423 (1997). ] から、 以下の塩基配列 からなるセンスおよびアンチセンスプライマーを合成した。
センスプライマ一： 5， -ATGTGGAACGCGACCCCCAGCGA-3 ' アンチセンスプライマ一： 5' -ACCCCCAATTGTTTCCAGACCCAT-3 ' 増幅された cDNAをベクター pcDNAIII (Invi trogen社） につなぎ、 発 現ベクター GHSR-pcDNAIII を作製した。 当該発現べクタ一で CH0細胞を 形質転換し、 GHS- Rを安定に発現している形質転換細胞を 1 ig/mlの G418 を含有する培地で選択した。選択された細胞株 CH0- GHSR62は、 10—|()〜 10一9 Mの GHRP- 6 (Growth Hormone-Releasing hexapeptide) に応答した。 細 胞内カルシウムイオン濃度の変化 （Ca 上昇活性） は、 FLIPR システム (Molecular Device社） で測定した。 測定前に、 4 x 104の CHO- GHSR62 細胞を壁面が黒い 96穴マイクロプレート （Corning社） に植え、 12〜15 時間培養した。 細胞を 4 //Mの蛍光色素 Fluo4 (Molecular Probe社） と 1 時間保持し、 20 mM Hepes (〔 2- hydroxyethyl〕 -pi erazine-vV- 〔2- ethanesulfonic acid]) と 2.5 mM プロベネシドを含む Hank' s BSS(Hank' s Balanced Salt Solut ion)で 4回洗浄し、 試料を添加し て蛍光の変化を測定することによって、 Ca上昇活性をアツセィした。 実施例 2. 内在性 GH分泌誘導べプチドの精製
実施例 1に記載した CH0-GHSR62 細胞用いて、 ラッ ト由来の各種組 織 ·臓器について、 Ca上昇活性を調査した結果、 ラット胃由来のぺプチ ド抽出物が 0.5 mg相当でも強い Ca上昇活性を有することがわかった。 そこで、 数種類のクロマトグラフィーを用いて、 ラット胃抽出物から以 下の方法で Ca上昇活性を有するぺプチドを精製した。
新鮮なラッ卜の胃 40 gを、 混在するプロテアーゼを失活するために、 5倍量の沸騰水中で 5分間煮沸した。冷却後、煮沸した試料を IMAcOH - 20 mM HC1 に調整し、 ポリトロン · ミキサーを用いてペプチドを抽出した。 抽出液を 11, 000 rpm、 30分間遠心し、 上清をエバポレー夕一で約 40 ml に濃縮した。 濃縮液にアセトンを 66%になるように添加して、 アセトン 沈殿を行い、 生じた沈殿を除去した後、 上清のアセトンを蒸発させた。 上清を、 0.1¾ TFA (トリフルォロ酢酸） で平衡化した 10 gの Sep- PakC18 カートリッジ （Waters 社製） に加え、 10%CH3CN/0.1% TFA で洗浄後、 60%CH3CN/0. TFAで溶出した。 溶出液の溶媒を蒸発後、 凍結乾燥を行 つた。試料を 1M AcOHに溶解して、 1M AcOHで平衡化した SP-Sephadex C-25 (H+型）に吸着させた。 1MAC0H、 2Mピリジンおよび 2Mピリジン- AcOH ( H 5.0)で段階的に溶出することによって、 SP-I、 SP- IIおよび SP-IIIの 3 つの画分を、 それぞれ得た。 SP- III画分を Sephadex G- 50ゲル濾過カラ ムに掛け、 各々の画分の一部について CH0- GHSR62細胞を用いた Ca上昇 活性のアツセィを行った。 Sephadex G-50 カラムクロマトグラフィーの 結果を第 la図に示したが、 分子量約 3, 000に相当する活性画分 （第 la 図中、 フラクション 43-48) を、 TSKCM-2SWカラム （4.6 x 250 mm、 Tosoh 社製） を用い pH 6.4で、 CM-イオン交換による HPLC (高速液体クロマト グラフィ一）で分画した。 CM- HPLCでの活性画分を、 同一カラムを用い、 H 4.8で二次 CM-HPLCで分画した （第 lb図）。 活性画分 （第 lb図中、 溶出時間 55-56分）を、 j Bondasphere C- 18カラム（3.9 x 150 、 Waters 社製） を用いた逆相 HPLCで単一にまで精製した。 40 gのラッ卜から 16 の Ca上昇活性を有するペプチドを精製し、 ダレリン （ghrelin) と 命名した。 実施例 3. ダレリンの構造解析
精製したラット由来のグレリンのアミノ酸配列をべプチド · シーゲン サ一 （ABI 494、 Applied Biosysytems社） で決定した。 グレリンは、 Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala Gin Gin Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gin Pro Arg (Xaaは未同定アミノ酸） の 配列からなる 28アミノ酸残基で構成されるべプチドであった。 Xaaはラ ット cDNAの塩基配列から Serであり、当該べプチドにおいては Serが何 らかの修飾を受けていることがわかった。
そこで、 ァミノ末端から 3番目のセリンが修飾されていない非修飾グ レリンをペプチド合成機 （ABI 433A、 Appl ied Biosys tems社） で化学合 成した。非修飾合成グレリンの逆相 HPLCでの溶出時間は、天然型グレリ ンと大きく異なっていた （第 2a図） ので、 非修飾合成グレリンは天然型 グレリンよりも著しく親水性であることがわかった。
以上の結果から、天然型グレリンのァミノ末端から 3番目のセリン（セ リン 3) は疎水性の残基で修飾されていることがわかった。
セリン 3の修飾基を明らかにするために、 精製したグレリンを電子ス プレーイオン化マス分析機 （ESI- MS) 分析した。 観測された天然型ダレ リンの分子量 （3314.9±0.7) は、 cDNA の塩基配列から得られた非修飾 ダレリンペプチドの分子量 （3188.5) よりも 126大きかった。 以上の結 果から、 天然型ダレリンはセリン 3の水酸基が n-ォク夕ノィル （C8:0) 脂肪酸で修飾されているとわかった。 このことを確認するために、 n-ォクタノィル （C8:0) グレリンべプチ ドを化学合成して、 逆相 HPLC での溶出時間を調べた。 n-ォク夕ノィル (C8:0) ペプチドの化学合成は、 セリン 3の水酸基以外の全ての官能基 を保護したペプチドをペプチド合成機 （ABI 433A、 Applied Biosystems 社） を用いて Fmoc固相法で合成し、 セリン 3の水酸基を 4- (ジメチルァ ミノ）ピリジンの存在下で、 n -オクタン酸とェチル -3-(3-ジメチルァミノ プロピル）カルポジイミドでァシル化して合成した。 合成した n-ォクタ ノィルぺプチドは精製した天然型ダレリンと同一の溶出時間であった (第 2a図）。 さらに、 合成 n-ォク夕ノィルペプチドおよび天然型グレリ ンをキモトリブシン処理によって得られる、 ァミノ末端から 4番目まで のペプチド断片 （Gly 1- Phe 4) は、 逆相 HPLCで同一の溶出時間を示 した。
以上の結果から、 ラット由来の天然型グレリンは配列番号 2に記載の アミノ酸配列を有し、 セリン 3の水酸基が n-オクタン酸 （力プリル酸） でァシル化された構造 （第 2c図） であると結論された。
また、 ヒトダレリンをヒト胃抽出物から精製し、 その構造が配列番号 3に記載したアミノ酸配列を有し、 ァミノ末端から 3番目のセリン側鎖 の水酸基が n-オクタン酸 （力プリル酸） でァシル化された構造であるこ とがわかった （第 4a図）。
なお、上記ラット及びヒト由来のグレリンの構造は、第 lb図中の活性 画分のうち最初のピーク画分 （溶出時間 55-56分） 精製したものの構造 であるが、第 lb図の他の活性画分についても精製後、上記と同様の方法 で構造解析を行った結果、 セリン 3を修飾している脂肪酸は力プリル酸 (C8:0) 以外に、 力プリル酸のモノエン酸 （C8:l)、 力プリン酸 （C10:0) およびそのモノエン酸 （C10:l)、 およびラウリル酸 （C12:0) およびその モノエン酸 （C12:l) があることがわかった。 ， また、 ニヮトリ、 ゥナギ及び力エルのダレリンを実施例 2と同様にし て胃抽出物から精製し、 さらに実施例 3と同様にして構造解析した。 そ の構造は、ニヮトリのグレリンは配列番号 2 5に記載したアミノ酸配列、 ゥナギのダレリンは配列番号 2 6に記載したアミノ酸配列、 力エルのグ レリンは配列番号 2 7に記載したアミノ酸配列を有し、 いずれもァミノ 末端から 3番目のセリン側鎖の水酸基が n-オクタン酸 （力プリル酸） で ァシル化された構造であることがわかった。
さらに、 アフリカッメガエル、 ニジマス及びィヌのダレリンを実施例 2と同様にして胃抽出物から精製し、 さらに実施例 3と同様にして構造 解析した。
その構造は、 アフリカッメガエルのグレリンは配列番号 2 8に記載し たアミノ酸配列、 ニジマスのグレリンは配列番号 2 9および 3 0に記載 したアミノ酸配列、 ィヌのグレリンは配列番号 3 1に記載したアミノ酸 配列を有し、 いずれもアミノ末端から 3番目のセリン側鎖またはトレオ ニン側鎖の水酸基が n -オクタン酸 （力プリル酸） でァシル化された構造 であることがわかった。
なお、 ニジマスからは、 配列番号 2 9に記載した 2 3アミノ酸残基か らなるダレリンー 2 3と、 配列番号 3 0に記載した 2 0アミノ酸残基か らなるグレリン一 2 3とが得られた。 実施例 4 . ダレリンの Ca上昇活性
天然型グレリンおよび n-ォク夕ノィル修飾合成グレリンは Ca上昇活 性を有していたが、非修飾合成グレリンは Ca上昇活性を顕著には示さな かった （第 2b図）。 また、 n-オクタン酸又は n-オクタン酸と非修飾合成 グレリンの混合物は Ca上昇活性を顕著には示さなかったことから、天然 型グレリンの n-オクタン酸基は Ca上昇活性に重要なの構造であること がわかった。 以後、 ダレリンとは [0-n-ォク夕ノィル-セリン 3] -グレリ ン （第 2c図） のことを示す。
グレリンは、 CH0- GHSR62細胞において、 GHRP-6よりも高い細胞内カル シゥムイオン濃度を上昇させる活性 （Ca 上昇活性） を示したが、 GHRH (GH放出ホルモン、第 3a図では GRF)は Ca上昇活性を示さなかった（第 3b 図）。 ダレリンの Ca上昇活性は 10—11 Mから認められ、 EC5Qは 2. 5nM であった。 GHS-Rの特異的アン夕ゴニストである [D-Lys 3] _GHRP-6 [ R. G. Smi th, e t al. , Sc i ence 260, 1640-1643 (1993) ] 1 (T4 Mの存在下で、 グレリンによる Ca上昇活性は抑制され、高濃度のグレリンで、 アンタゴ ニスト非存在下での Ca上昇活性に 0復する （第 3b図）。以上の結果は、 グレリンの Ca上昇活性が GHS- Rの特異的アン夕ゴニストによって拮抗的 に阻害されることを示している。 実施例 5 . グレリン前駆体 cDNAとその各種臓器での発現
グレリンのアミノ酸配列は公知のいかなるべプチドのアミノ酸配列と も相同性を示さなかったが、 GenBank データべ一スをホモロジ一検索し たところ、 ラット EST (Expressed Sequence Tag) 配列の 1つ （GenBank 受理番号 AI 549172) に同一の配列が認められた。 この EST配列を基に以 下の PCRプライマ一を合成した。
センスプライマー： 5 ' - TTGAGCCCAGAGCACCAGAAA- 3 '
アンチセンスプライマー： 5 ' -AGTTGCAGAGGAGGCAGAAGCT-3 '
ラット胃由来の cDNAを铸型に上記の 2つプライマ一を用いて RT- PCR を行った。 PCRの条件は、 1サイクルが 98 で 10秒間、 55 Xで 30秒 間、 72 でで 1分間を、 35サイクル行った。 増幅された DNA断片をプロ —ブとして、 ラット胃 cDNAライブラリーをスクリーニングした。 約 2 x 105の組換えファージをスクリーニングして、ラット由来グレリンをコ一 ドする全長 cDNAを取得した。
ラットダレリン cDNAは、配列番号 6に記載した 501塩基からなり、 117 アミノ酸 （第 4a図） からなるグレリン前駆体 （prepro- ghrelin) をコー ドしていた。グレリン前駆体のアミノ末端の 23アミノ酸残基はシグナル ペプチドの性質を備えていた。 ダレリンはグリシン 24から始まり、成熟 型グレリンの最後の 2つのアミノ酸（Pro_Arg) は、 プロテアーゼによる 切断を受ける配列であった。
ラットグレリン cDNAを用いて、低ストリンジェント条件でヒト胃 cDNA ライブラリーをスクリーニングして、全長ヒトグレリン cDNAを取得した。 ヒト胃 cDNAライブラリ一は、 ヒト胃 poly(A)+RNA (Clontech社） から、 cDNA合成キット （Pharmacia社） を用いて作製した。 取得した全長ヒト グレリン cDNAは、 配列番号 7に記載した 511塩基からなり、 117ァミノ 酸 （第 4a図） からなるヒトグレリン前駆体 （prepro- ghrelin) をコード していた。 ラットおよびヒト由来のグレリン前駆体のアミノ酸配列は、 82.9%の同一性を示し、グレリンは生物種間で高度に保存されていること が判明した。
グレリンの組織間分布を知るために、 ラットの種々の組織から単離さ れた poly(A)+RNAを解析した （第 4b図）。 ラット組織のノザ一ンブロッ ト解析によって、 0.62 kbのダレリン前駆体 mRNAが胃に認められた。 心 室 （Ventricle) にも 2本のかすかなバンドが認められたが、 これらは 6.2 kbおよび 1.2kbの mRNAで、 胃での mRNAよりも大きく、 胃とは異な つた mRNAのスプライシングが推定された。以上の結果からグレリンの主 な発現部位は胃であることがわかった。 実施例 6. ダレリンの下垂体ホルモン分泌への効果
グレリンが GH分泌誘導活性を有しているかを invitroおよび invivo で調べた。 まず in vitroでのアツセィとして、 下垂体前葉の初期培養細 胞へのグレリンの効果を調べた。 4週令の雄 SDラットから下垂体前葉を 採取し、 コラゲナ一ゼ処理で分散させた後、 細胞を集め、 10 FCS (ゥシ 胎児血清） と抗生物質を含む DMEM (Dulbecco' s modified Eagle' s Medium) 培地で 2回洗浄し、 DMEM培地に懸濁して、 下垂体前葉初期培養 細胞を調製した。 5 X 104 の細胞を、 ポリ- D-リジンでコートした 96穴 の細胞培養プレートに植え、 3〜4 日培養した。 培養液を 0.1 ml の試料 を含有する DMEM培地と交換し、 37 で 15分間保持した。 培養液の一部 を採取して、 ラジオィムノアッセィによって、 培養液中の各種下垂体ホ ルモンの濃度を測定した。 下垂体ホルモンのうち、 GH、 FSH、 LH、 PRL、 TSH は Biotrak/Amersham 社製のキッ トを用い、 ACTH は Peninsula Laboratories社製の高感度 EIAキットを用いた。
グレリンを下垂体前葉初期培養細胞に添加すると細胞内カルシウムィ オン濃度の上昇が認められ、 非修飾合成ダレリンでも弱いながらも Ca 上昇活性が認められた （第 5a図）。 この結果は、 ダレリン及び非修飾合 成ダレリンが下垂体細胞に直接作用することを示している。 次に、 下垂 体前葉初期培養細胞を用いてダレリンが GH 分泌誘導活性を調べたとこ ろ、 10— 6Mのダレリンの添加により、 培養液中の GH濃度だけが濃度依存 的に増加し、 他の下垂体ホルモン （FSH、 LH、 PRL、 TSH) の濃度増加は認 められなかった （第 5b図）。
ダレリンの GH分泌誘導活性を in vivoで調べた。 合成グレリン 10 gを雄ラット （250 g) の静脈に注射後、 60分まで経時的に血液を採取し て、 血漿中の下垂体ホルモンの濃度を上記ラジオィムノアッセィによつ て測定した。 下垂体ホルモンの内、 GHだけが血液中に放出され、 グレリ ンの静脈注射後 5〜10分で最高値に達した。 この結果から、 胃から血液 中に放出されたグレリンが下垂体前葉細胞に作用し、血液中に GHを放出 することがわかり、グレリンが未同定だった特異的な内在性 GH分泌誘導 物質であることが確認された。 実施例 7. ラットでの心拍出量増加
麻酔下ラットを用いて心血管系に及ぼすグレリン急性投与の効果を調 ベた。 体重 220-250gの Wistar系雄性ラット （ケアリー） を用い、 心血 管系に及ぼすグレリン急性投与の効果を検討するためラットを無作為に 4群 （10， 1, 0.5， 0.2 投与群） に分けた。 ダレリンは生理食塩水 で希釈し、 ラット 1匹あたりの投与量を、 10、 1、 0.5、 0.2 ug に調整 して、 心拍出量測定のため右総類静脈に挿入したインジェクションチュ ーブ （PE50) から 120 1 急性投与した。
動力学的指標として全身血圧、 心拍出量を測定し、 さらに末梢血管抵抗 値を算出した。 ラットをペントバルビタールで麻酔後、 背位に固定した。 平均血圧測定のために、右大腿動脈にへパリンで満たしたポリエチレン力 ニューレ （PE50) を挿入した。 心拍出量の測定は熱希釈式心拍出量計 (CARDI0THERM500R) を用いて測定した。 右総類静脈に生理食塩水で満た したインジェクションチューブ （PE50) を挿入し、 右心室内で留置した。 右総類動脈からマイクロカテーテルを挿入し、 大動脈起始部に留置した。 注入液は室温 （25T ) の生理食塩水 100 / 1 を用いた。 熱希釈式心拍出量 計の MEASUREスィッチを押すと同時に注入液 （生理食塩水 100 1 ) を注入 し、 心拍出量を測定した。 測定は 5回行いその平均値を心拍出量とした。 平均血圧および心泊出量は、 ダレリン投与前、 投与後 1、 5、 15、 30分の値 を測定した。 末梢血管抵抗は平均血圧を心拍出量で除して算出した。
第 1表 体重 ダレリン l//g投与後の心拍出量 （ml/m in/kg)
(g) 0分 1分 5分 15分 30分 平均 230 347 382 367 341 338
SEM 3.7 14.3 10.2 11.5 7.9 8.8 表中、 S EMは平均値の標準誤差（Standard Error Heans) を表す ( 第 2表
Figure imgf000092_0001
表中、 S EMは平均値の標準誤差（Standard Error Heans) を表す。 ダレリン 1 g投与群 （第 1表） 及びダレリン 10 g投与群 （第 2表） お いて、 投与後 1分及び 5分で、 心拍出量の増加が認められた 実施例 8. 各種起源からのグレリンおよびグレリン- 27の単離
ラット胃抽出物から実施例 2に記載した方法で Ca 上昇活性を指標に ダレリンを精製した。 二次 CM-HPLCでの活性画分 （第 lb図中、 溶出時間 59分） を、 //Bondasphere C-18カラム （3.9 x 150 mm, Waters社製） を用いた逆相 HPLCで単一にまで精製した。この画分を電子スプレーィォ ン化マス分析機 （ESI- MS) 分析した結果、 分子量 （3187.2土 0.9) のピー クが観測されたが、 この値は 28アミノ酸からなりオクタン酸（C8)修飾 された天然型グレリンよりも約 126小さかった。 このペプチドのァミノ 酸配列をペプチド ·シーケンサー （ABI 494、 Applied Biosysytems社） で決定したところ、 Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gin Lys Ala G i n Arg Lys G l u Se r Lys Lys P ro P ro Al a Lys Leu G i n P r o Arg (Xaa は未同定アミノ酸）の配列からなる 27アミノ酸残基で構成されるべプチ ドであった。 すなわち、 28アミノ酸で構成されるダレリンのアミノ末端 から 13番目又は 14番目のグルタミンが 1つ欠失したアミン酸配列から なっていた。 このペプチドの Ca上昇活性は、 実施例 9に示すように 28 アミノ酸のダレリンと同様であることから、 ダレリン- 27 と命名した。 ヒトの胃抽出物からも、 ラットの場合と同様にヒト · グレリン- 27 を単 離し、配列番号 1 1記載のアミノ酸配列からなることを確認した。なお、 上記二次 CM-HPLCで 64-65分にあるピーク画分を精製し、 電子スプレー イオン化マス分析機 （ES I - MS) 分析した結果、 分子量 （3341. 4土 0. 9) の ピークが観測された。この脂肪酸修飾ペプチドは 28アミノ酸からなるこ とから、 ダレリン （28アミノ酸） のァミノ末端から 3番目のセリンがデ カン酸 （C 10) で修飾されたものであることがわかった。
ダレリン 27前駆体をコ一ドする cDNAを、 実施例 5で作成したラット 胃 cDNAライブラリ一から、 実施例 5で作成した PCR増幅 DNA断片をプロ —ブとした、プラークハイブリダィゼ一ションでクローニングした。 cDNA の塩基配列を決定し、 グレリン -27前駆体をコ一ドすることを確認した。 得られたグレリン- 27前駆体 cDNAは、 配列番号 1 4記載の塩基配列から なり、 配列番号 1 2記載のアミノ酸配列を有する 1 1 6 アミノ酸からなる ダレリン- 27前駆体をコードしていた。 また、 上記と全く同様の方法でヒ ト ·ダレリン- 27前駆体 cDNAをクローニングし、 配列番号 1 5記載の塩 基配列からなり、 配列番号 1 3記載のアミノ酸配列を有する 1 1 6 ァミノ 酸からなるヒト · グレリン -27前駆体をコードしていることがわかった。 ブ夕由来のグレリンおよびグレリン -27の前駆体をコードする cDNAを、 ブ夕 cDNAライブラリ一から実施例 5に記載の方法によって、 実施例 5に 記載の PCR増幅 DNA断片をプローブとしたプラークハイブリダィゼ一シ ヨンでクローニングした。 得られた cDNA クローンの塩基配列を決定し、 ブ夕 ·グレリン前駆体又はブ夕 ·グレリン- 27前駆体をコードしているこ とを確認した。 得られたブタ ·ダレリン前駆体 cDNAは、 配列番号 2 0記 載の塩基配列からなり、 配列番号 1 8記載のアミノ酸配列を有する 1 1 8 アミノ酸からなるダレリン前駆体をコードしていた。 また、 ブ夕 ' グレ リン- 27前駆体 cDNAは、 配列番号 2 1記載の塩基配列からなり、 配列番 号 1 9記載のアミノ酸配列を有する 1 1 7アミノ酸からなるグレリン -27前 駆体をコードしていた。 従って、 ブ夕 · ダレリン （28アミノ酸） 及びブ 夕 · グレリン -27 ( 27 アミノ酸） は、 各々、 配列番号 1 6および 1 7記 載のアミノ酸配列からなっている。
ゥナギ、 アフリカッメガエルまたはニジマス由来のグレリンの前駆体 をコードする cDNAを、 各種の cDNAライブラリーから実施例 5に記載の 方法によって、 実施例 5に記載の PCR増幅 DNA断片をプローブとしたプ ラ一クハイプリダイゼーションでクローニングした。 得られた cDNAク口 ーンの塩基配列を決定し、 ダレリン前駆体をコードしていることを確認 した。
得られたゥナギ ·ダレリン前駆体 cDNAは、 配列番号 3 6記載の塩基配 列からなり、 アフリカッメガエル ·ダレリン前駆体 cDNAは、 配列番号 3 7記載の塩基配列からなり、 ニジマス ·ダレリン前駆体 cDNAは、 配列番 号 3 8または 3 9記載の塩基配列からなっていた。
なお、 ニジマスからは、 配列番号 3 8に記載したダレリン— 2 3前駆 体をコードする cDNAと、 配列番号 3 9に記載したグレリン— 2 0前駆体 をコードする cDNAとが得られた。
上記 cDNAの塩基配列から、 ゥナギ ·ダレリン前駆体は、 配列番号 3 2 記載のアミノ酸配列を有し、 アフリカッメガエル · ダレリン前駆体は配 列番号 3 3記載のアミノ酸配列を有し、 ニジマス · グレリン前駆体は配 列番号 3 4または 3 5記載のアミノ酸配列を有することがわかった。 なお、 ニジマスからは、 配列番号 3 4に記載したダレリン一 2 3前駆 体のアミノ酸配列と、 配列番号 3 5に記載したダレリン一 2 0前駆体の アミノ酸配列とがわかった。
ゥシ ·グレリン前駆体 cDNAは PCR法によってクローニングした。 すな わち、 ラット、 ヒトおよびブタ由来のグレリン及びグレリン- 27で保存さ れているアミノ酸配列を基に設計した塩基配列を有する合成 DNA をブラ イマ一として、 ゥシ胃 cDNAライブラリーを铸型として PCRを行った。 増 幅された DNA断片は配列番号 2 4記載の塩基配列を有しており、 配列番 号 2 3記載のゥシ ·ダレリン- 27前駆体の一部をコードしていた。従って ゥシ ·ダレリン- 27は配列番号 2 2記載のアミノ酸配列を有している。 ま た、 ゥシ胃 cDNAライブラリ一を铸型とする上記 PCRで増幅された DNA断 片中には、グレリン（28アミノ酸）前駆体をコードする DNAはなかった。
ラット、 ヒトおよびブ夕由来のグレリン、 及びラット、 ヒト、 ブ夕お よびゥシ由来のグレリン- 27のアミノ酸は、 非常によく似ており、特にァ ミノ末端から 1 0番目までのアミノ酸配列は、 上記 7種のグレリンで完 全に一致していた。 実施例 9 . 各種グレリン誘導体の活性比較
ラットおよびヒト由来のグレリンを各種プロテア一ゼによる部分分解 したべプチド断片、 又は化学合成したぺプチドの Ca上昇活性を比較する ことにより、 Ca上昇活性に必要なコア ·アミノ酸配列および修飾脂肪酸 の鎖長の最適値を求めた。 Ca上昇活性は最大値の 5 0 %の活性を示すグ レリンの濃度 （EC50， nM) で表した。 従って、 EC50の値が低い程、 活性 が高いことになる。
第 3表 各種グレリン誘導体の活性比較 起源配列番号 アミノ酸 脂肪酸修飾 Ca上昇活性 備考
(EC50 nM)
ヒ卜 3 1-28 Acyl (C 8) 2 6
Figure imgf000096_0001
グレ >
ヒ卜 3 1一 IS Acyl (C 8) 7 n
ヒ卜 3 1-11 Acyl (C 8) 15 ラッ卜 2 Acyl (C 8) 9 妖 SI し V
ラッ卜 2 1-15 Acyl (C 8) 8.6
ラッ卜 2 1-11 Acyl (C 8) 15
ラッ卜 2 -in Acyl (C 8) q
ラッ卜 2 1 Acyl (C 8)
フッ 卜 Δ Acy 1 inn
ラッド 2 Acyl (C ： 8) AQf\
ラッ卜 2 16-28 Acyl (C 8) 〉10000 ラッ卜 2 (1-12) + Acyl (C 8) 2.8 グレリン- 27
(14-28) ラッ卜 2 1-28 Acyl (C 16) 3.1
ラッ卜 2 1-28 Acyl (C 10) 2.6
ラッド 2 1-28 Acyl (C 6) 16
ラッド 2 1-28 Acyl (C 4) 280
ラッド 2 1-28 Acyl (C 2) 780 ダレリンの Ca上昇活性は、 ァミノ末端側に存在する。 アミノ末端から 4番目のアミノ酸までのべプチドで十分な Ca上昇活性はあるが、 ァミノ 末端から 1 0番目のアミノ酸までのべプチドであれば、 天然型グレリン に近い、 強い Ca上昇活性がある。 また修飾脂肪酸の鎖長について、 C : 2 (ァセチル基） であっても十分活性はあるが、 C : 8 (ォクタノィル基） で Ca上昇活性が最高になり、 その後脂肪酸の炭素数が C： 10 (デカノィ ル基）、 C : 16と増加しても強い Ca上昇活性は変化しない。 すなわち、 7 ミノ末端から 3番目のセリンを修飾している脂肪酸は、 炭素数 8以上で あれば Ca上昇活性が最も強くなる。 実施例 10. 各種グレリン誘導体化合物の合成
( 1 ) ペプチド誘導体合成
Fmoc-DSer (C8H17)および Fmoc-Ser (C8H17)以外のアミノ酸誘導体と合成 試薬をパーキンエルマ一社、 ノバビオケム社あるいは渡辺化学株式会社 より購入した。 ぺプチド鎖の延長は主にパーキンエルマ一社製アプライ ドバイオシステム 433A 合成機を使用し、 Boc法、 あるいは Fmoc法にて 保護べプチド誘導体-樹脂を構築した。 Boc法にて得られた保護べプチド 樹脂は、 p—クレゾール存在下、 無水弗化水素 （HF) で脱保護してぺプチ ドを遊離させ、 精製に供した。 Fmoc法で得られた保護ペプチド樹脂はト リフルォロ酢酸 （TFA)、 あるいは種々のスカベンジャーを含む希釈 TFA で脱保護し、遊離したぺプチドを精製に供した。精製は、 C4あるいは C18 を用いた逆相 HPLCにて実施した。 精製品は、 逆相 HPLCにてその純度を 確認し、 アミノ酸組成分析および質量分析にて構造を確認した。
本発明品のペプチドは通常のペプチド合成法によって製造される。 例 えば、 「生化学実験講座 1タンパク質の化学」第 4巻の第 2章、第 3章（東 京化学同人）、あるいは「続医薬品の開発 1 4 ペプチド合成」 （廣川書店） 等の成書に記載されている方法によって製造が可能である。 従って、 本 発明品のペプチドの代表的な合成例を以下に示した。 具体的には、 ァシ ル化ペプチドの合成例とアルキル化ペプチドの合成例を示した。 また、 ヒト由来のダレリン （以下、 hGhrelinと略すこともある） あるいはラッ ト由来のダレリン （以下、 rGhrelin と略すこともある） をトリプシン、 あるいはキモトリブシン、 あるいは両酵素を順番に作用させて、 以下の グレ リ ン断片 （ 19· Ghrelin(16-28) , 20. hGhrel in (卜 15) 、 21. rGhrelin (卜 15) 、 23. hGhrel in(l-ll) 、 24. rGhrel in(l-l 1) 、 25. Ghrelin (卜 10)、 26. Ghrelin (卜 9)、 27. Ghrelin (卜 8)、 30. Ghrelin (卜 4)) を調製し、 分析用 HPLC で単離したものを活性測定に供した。 41. | - Acety]-GhrelinU- 10)は、 常法に従い Ghrel in(l-10)を T -ァセチル サクシンイミド処理して調製した。 化合物番号 2. rat Ghrelinは天然物 を使用、 10. [Ser3(Butyryl)]-rGhrelin, 11. [Ser3(Hexanoyl)]-rGhrel in, 12. [Ser3 (Decanoyl) ]— rGhrelin、 13. [Ser3 (Lauroyl) ]-rGhrelin, 1 . [Ser3 (Palmitoyl) ]-rGhrelinは、 化合物 1 hGhrel inの合成に用い たのと同様の方法で合成し、 活性測定に供した。
〔主な略号〕
HMP樹脂； 4-hydroxymethyl-phenoxymethyl樹脂
Fmocアミド榭脂； 4_(2 , 4 -dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl) phenoxyacet ami do-ethyl樹脂
PAM樹脂； phenylacetoamidomethyl樹脂
HBTU； 2-(lH-benzotriazole-l-yl)-l, 1, 3, 3-tetramethyluronium
Hexaf luorophosphate
TBTU； 2-(lH-bezotriazole-l-yl)-l, 1, 3, 3-tetramethyluronium tetraf luoroborate
HOBt； 1-hydroxybezotr iazole
DCC； dicyclohexylcarbodi imide
DIPCI； di isopropylcarbodi imide
TFA； trif luoroacetic acid
DIPEA； di isopropyl ethyl amine
TIPS； tri isopropylsi lane
Fmoc； f luoreny 1 met hoxycar bony 1
Boc； /-butyloxycarbonyl
Trt； trityl
Bu1； /-butyl Pmc； 2, 2, 5, 7, 8-pentamethylchroman-6-sul f onyl
Pr 1 ； propionyl
PhPrl ； phenylpropionyl
Bz 1 ； benzyl
Bom； benzyloxymethyl
Tos； toluenesul f onyl
Cl-Z； 2-chloro-benzyloxycarbonyl
Pis； 2 - phenyl isopropyl
Mtt ； 4-methyltrityl
DMF； N, ^-dimethyl formamide
NMP； iV-methyl yrrol idone
DMAP； 4-d ime thy 1 ami nopyri dine
HOSu； ^-hydroxysuccini imide
Adod； 2-aminododecanoic acid
Aib ; 2-aminoisobutyl ic acid
Ape； 5-aminopentanoic acid
Cha； cyclohexylalanine
Dap； 2, 3-diaminopropionic acid
Nal ； naphtylalanine
Nle； nor leucine
〔合成に使用した保護アミノ酸〕
Fmoc法：
Boc-Gly, Fmoc-Gly, Fmoc-Ser (Bu1), Fmoc-Ser (Trt), Fmoc-Glu(OBu'), Fmoc-His (Boc), Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Arg(Pmc), Fmoc-Lys (Boc), Fmoc - Pro, Fmoc - Leu, Fmoc - Ala, Fmoc-Val, Fmoc-Phe, Fmoc-DPhe, Fmoc-Ser (/?-C8H17), Fmoc-DSer (/?- C8H17)， Fmoc-Cys (/z-C8H17) ， Fmoc-Asp(OPis), Fmoc-Ser (Bzl), Fmoc-Cys (Trt), Fmoc-Dap(Octanoyl), Fmoc-2-LNal, Fmoc-2-DNal, Fmoc-Nle, Fmoc-Lys (Mt t), Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Asp(0-C7H15)
Boc法：
Boc-Gly, Boc- Ser (Bzl), Boc-Ser (Ac), Boc-Ser (Prl), Boc- Glu(OBzl), Boc-His(Bom), Boc- Gin, Boc-Arg(Tos), Boc-Lys (Cl-Z), Boc- Pro, Boc-Leu, Boc - Ala, Boc-Val, Boc-Phe, Boc-Cys (n-C8H17) ， Boc - Ape Boc-Ser (n-C8H17)
〔使用した機器〕
(a) 分析用 HPLCシステム
機器；島津 LC-10Aシステム
カラム； YMC PROTEIN - RP ( 4.6 ππηφ χ 150 mm)
カラム温度； 40で
溶出液； 0. トリフルォロ酢酸中、 ァセトニトリル濃度を 2 0分間で 0% から 50%に直線的に変化させた。
流速； 1 mL/分
検出； UV(210 nm)
注入量； 10~100 n 1
(b) 分取用 HPL Cシステム
機器； Waters 600 Multisolvent Delivery System
カラム； YMC-Pack-ODS- A (5 /m, 20 mm x 250 mm)
YMC-Pack- PROTEIN- RP (5 m, C4， 10 mm x 250mm)
YMC- Pack PR0TEIN-RP (5 urn, C4, 20 mm x 250mm)
YMC PROTEIN- RP ( 4.6 ιηηιφ x 150 mm)
溶出液； 0. トリフルォロ酢酸中、 適宜ァセトニトリル濃度を直線的に 変化させた。 流速； 10mL/分（内径 20腿カラム用）、 3mL/分 （内径 10 nunカラム用）、 lmL/分 （内径 4.6 關カラム用）
検出； 210 nm, 260 nm
注入； 10~2000 K 2000 以上はポンプにより注入した。
(c) 質量分析機
機器； フィニガン MAT TSQ700
イオン源； ESI
恢出ィ ンモ一ド ； positive
スプレー電圧； 4.5kV
キヤピラリー温度； 250で
移動相； 0.2%酢酸 · メ夕ノ一ル混液 （1 : 1)
流速； 0.2 mL/分
スキャン範囲； m/z 300~1， 500
(d) アミノ酸配列分析
機器；パーキンエルマ一社製 アプライ ドバイオシステム 477A、 492 型シークェンサ一
( e ) アミノ酸組成分析
機器； 日立製作所製 い 8500型アミノ酸分析機計
試料； とくに記載のないものは、 封管中、 6M塩酸で 110で、 24時間加水 分解した。
(2) ァシルセリンまたはァシルトレオニンを有する誘導体の合成例 (Fmoc法、 力ルポキシル末端カルボン酸）
化合物 1 hGhrelin : GSS (CO-C7Hl5) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR Fmoc- Arg(Pmc)- HMP_樹脂 （ABI社製、 03 mg, 0.25 mmol) を 20%ピペラ ジンで 20分間処理したのち、順次 HBTU/HOBtによる Fmoc-アミノ酸導入 と ピ ペ ラ ジ ン に よ る 脱 Fmoc を 繰 り 返 し 、 Fmoc- Ser(Bu1)- Ser (Trt) -Phe-Leu- Ser(tBu)- Pro- Glu(OBu')- His (Boc) -G ln(Trt) - Arg (Pmc) -Val-Gln(Trt)-Gln(Trt) -Arg (Pmc) -Lys (Boc) - G 1 u (OBu ') -Ser (Bul) -Lys (Boc) -Lys (Boc) -Pro-Pro-Ala-Lys (Boc) -Leu-Gin (Tr t) - Pro- Arg(Pmc)-樹脂を構築した。 最後に DCC/HOBtにて Boc- Glyを導入し たのち、 得られた保護ペプチド樹脂 （1.3 g )を i TFA-5%TIPS-塩化メチ レン溶液 （15 mL) で 30分間処理した。 ペプチド樹脂をろ取し、 塩化メ チレン（30 mL)で数回洗浄した後、 5% DIEA(lOmL), ついで塩化メチレン (30mL)で洗浄した。 得られた脱 Trtペプチド樹脂（約 1.3g) を NMP (10 mL)に膨潤させ、 DMAP(61.1 mg， 0.5腿 ol)存在下、 オクタン酸 （144.2 mg, 1.0 mmol)、 DIPCI (126.2 mg, 1.0 關 ol) を加え 8時間反応させた。 樹 脂をろ取し、 NMP、 塩化メチレンで洗浄し減圧下乾燥して、 3位セリン側 鎖がォク夕ノィル化された保護ペプチド樹脂 約 1.2gを得た。 このもの に、 88% TFA-5%フエノール- 2 TIPS- 5%H20からなる脱保護試薬（10mL) を加え、 室温で 2時間攪拌した。 樹脂をろ去し、 ろ液を濃縮後、 残さに エーテルを加え沈殿とした。 沈殿をろ取、 乾燥し、 粗ペプチド約 550 mg を得た。 本品 200 mgを水 10 mLに溶かし、 YMC- Pack PROTEIN- RP (C4， 20 mm x 250mm)に添加し、 0.1 トリフルォロ酢酸中、 ァセトニトリル 0%か ら 54¾までの 60分間直線グラジェント（流速： 10 mL/min)で溶出させた。 目的画分を分取後、 凍結乾燥し、 120 mg の目的物を得た。
(3) ァシルセリンまたはァシルトレオニンを有する誘導体の合成例 (Fmoc法、 カルボキシル末端アミド体）
化合物 3 Ghrelin(l-9)-NH2; GSS (C0-C7H15) FLSPEH-NH2
Fmoc—アミド樹脂 （ABI社製、 403 mg, 0.25 mmol) を 20%ピぺラジン で 20分間処理したのち、順次 HBTU/HOBtによる Fmoc-アミノ酸導入とピ ペ ラ ジ ン よ る 脱 Fmoc を 繰 り 返 し 、 Fmoc- Ser (Bu -Ser (Trt)- Phe-Leu- Ser (Bu')_Pro-Glu(0Bu1)- His (Boc) -樹 脂を構築した。最後に DCC/HOBtにて Boc-Glyを導入したのち、得られた 保護ペプチド樹脂 （約 550 mg)を 1HTA-5¾TIPS-塩化メチレン溶液 （10 mL) で 30 分間処理した。 ペプチド樹脂をろ取し、 塩化メチレン（30mい で数回洗浄した後、 5%DIEA(10mL)、 ついで塩化メチレン（30mL)で洗浄し た。 得られた脱 Trtペプチド樹脂 （約 750 mg) を NMP (10 mL)に膨潤さ せ、 DMAP(61.1 mg, 0.5蘭 ol)存在下、 オクタン酸（144.2 mg, 1. Ommol), DIPCI (126.2 mg, 1 mmol)を加え 4時間反応させた。樹脂をろ取し、 NMP、 塩化メチレンで洗浄し減圧下乾燥して、 3 位セリン側鎖がォクタノィル 化された保護ペプチド樹脂 約 800 mgを得た。 このものに、 TFAU0 mL) を加え、 室温で 30分間攪拌した。 樹脂をろ去し、 ろ液を濃縮後、 残さに エーテルを加え沈殿とした。 沈殿をろ取、 乾燥し、 粗ペプチド 250 mg を得た。本品約 200 mgを 30%酢酸水 10 mLに溶かし、 YMC-Pack PR0TEIN-RP (C4, 20 龍 X 250mm)に添加し、 0. トリフルォロ酢酸中、 ァセトニト リル 0%から 54%までの 60分間直線グラジェント （流速： 10 mL/min) で 溶出させた。 目的画分を分取後、 凍結乾燥し、 150 mg の目的物を得た。
(4) ァシルセリンまたはァシルトレオニンを有する誘導体の合成例 (Boc法）
化合物 9 [Ser3(Propionyl)]-rGhrelin(l-28)；
GSS (CO-CH2CH3) FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR
Boc- Arg(Tos)- Pamレジン（0.75 g， 0.5 簡 ol)より、 保護ラットグレリ ン樹脂 （4— 28) を Boc Chemistryで構築後、 その半量 1.4 gに、
Boc-Ser(CO-CH2CH3)-OH, Boc-Ser (Bz 1) -OH, Boc- Gly- OHを縮合した。 得 られた樹脂 1.5 gを HF: p—クレゾール（8.5 mL： 1.5 mL)で 0 で、 一時間 処理後、 HFを減圧下留去した。 残さにエーテルを加え 671 mgの粗べプチ ドを得た。 このものを 50%酢酸 （AcOH) に溶かし、 分取用カラム
YMC-Pack-0DS-A (5 am, 20 mm x 250 mm)に添加し、 10 mL/minで 0.1% TFA を含む溶液でァセトニトリル濃度を 7 5分間で 0から 9 5 %まで変化さ せて溶出した。 目的物を含む画分を凍結乾燥して粗ペプチドを 135.8 mg 得た。 この一部 0.5 mgを YMC-A- 302カラム （C18, 4.6 mm x 150 mm) に添 加し、 流速 1 mL/minでァセトニトリル濃度を 1 5 %から 1 9 %まで変化 させて溶出した。 この精製操作を繰り返し、 目的とする画分を合わせ目 的物 0.41 mgを得た。
以下のァシルセリンまたはァシルトレオニンを有するぺプチド誘導体 は、 上記化合物 3または化合物 9の製造方法と同様にして製造した。 以下にァシルセリンまたはァシルトレオニンを有するぺプチド誘導体 の質量分析、 アミノ酸組成分析結果をまとめた。
化合物 1. hGhrelin
ESI- MS 3371.0 (理論値 3370.9), アミノ酸組成比： Ser； 3.53 (4), Glx;
5.91 (6), Gly ； 1.02 (1), Ala; 1.00 (1), Val； 0.96 (1), Leu; 2, Phe;
1.06 (1), Lys; 3.90 (4), His; 0.97(1), Arg; 2.87 (3), Pro; 3.87 (4) 化合物 3. Ghrelin(l-9)-amide
ESI- MS [M+H] ; 1085.7 (理論値 1085.2)， アミノ酸組成比： Ser : 2· 45 (3)，
Glx; 0.98 (1), Gly ； 0.99 (1), Leu; 1, Phe; 0.99 (1), His; 1.08 (1),
Pro; 0.97 (1)
化合物 4. [Ser2(Octanoyl), Ser3]- Ghrel in (卜 9)- amide
ESI-MS [M+H] ; 1085.8 (理論値 1085.2)， アミノ酸組成比： Ser; 2.46 (3),
Glx; 0.98 (1)， Gly； 0.99 (1), Leu;上， Phe; 1.01 (1), His; 1.09 (1),
Pro; 0.97 (1)
化合物 5. [Ser2 (Octanoyl)] -Ghrel in (1-9) -amide
ESI-MS [M+H] ; 1211.7 (理論値 1211· 4), アミノ酸組成比： Ser; 2.48 (3), Glx; 1.00 (1), Gly； 1.01 (1), Leu;上， Phe; 1.00 (1), His; 1.11 (1),
Pro; 0.98 (1)
化合物 8. [Ser3 (Acetyl) ]-rGhrelin
ESI-MS 3231.0 (理論値 3230.7), アミノ酸組成比： Ser.; 3.50 (4)， Glx; 5.90 (6), Gly ； 0.98 (1), Ala; 2.00 (2)， Leu; 2, Phe; 1.01 (1), Lys;
4.97 (5), His; 0.99 (1), Arg; 1.99 (2)， Pro; 3.99 (4)
化合物 9. [Ser3 (Propionyl) ]-rGhrelin
ESI-MS 3245.0 (理論値 3242.8), アミノ酸組成比： Ser; 3.42 (4)， Glx; 5.93 (6), Gly ； 1.00 (1)， Ala; 2.00 (2), Leu; 2, Phe; 1.10 (1)， Lys; 4.97 (5), His; 0.99 (1), Arg; 1.99 (2), Pro; 3.83 (4)
化合物 15. [Ser3 (3-Phenylpropionyl) ]-hGhrelin
ESI-MS 3377.0 (理論値 3376.9) ， アミノ酸酸組成比： Ser； 3.06 (4)， Glx; 5.92 (6), Gly ； 0.93 (1), Ala; 0.98 (1), Val； 0.99 (1), Leu; 2, Phe; 1.13 (1), Lys; 4.03 (4), His; 1.08 (1)， Arg; 3.00 (3)， Pro; 3.76 (4)
化合物 16. [Ser3 (3- Octenoyl) ]- hGhrelin
ESI-MS 3369.0 (理論値 3368.9), アミノ酸組成比： Ser; 3.59 (4), Glx;
5.91 (6), Gly ； 1.00 (1)， Ala; 1.02 (1), Val； 0.99 (1), Leu; 2, Phe; 1.15 (1), Lys; 3.97 (4)， His; 0.98 (1), Arg; 2.93 (3), Pro; 3.88 (4) 化合物 28. Ghrelin(l-8)-amide
ESI-MS [M+H] 948.5 (理論値 948.1) , アミノ酸組成比： Ser； 2· 45 (3)，
Glx; 0.97 (1), Gly ； 0.99 (1), Leu; 上， Phe; 1.00 (1), Pro; 0.97 (1) 化合物 29. Ghrelin(l-7)-amide
ESI-MS [M+H] 819.6 (理論値 819.0) ， アミノ酸組成比： Ser; 2.52 (3),
Gly ； 1.01 (1), Leu; 丄， Phe; 1.02 (1), Pro; 1.09 (1)
化合物 30. Ghrelin(l-6)-amide
ESI-MS [M+H]； 722.4 (理論値 721.8)， アミノ酸組成比： Ser; 2.47 (3),
Gly ； 0.99 (1), Leu; 丄， Phe; 1.00 (1)
化合物 31. Ghrelin (卜 5)
ESI-MS [M+H] 636.5 (理論値 635.8) , アミノ酸組成比： Ser; 1.78 (2),
Gly ； 0.99 (1)， Leu; 丄， Phe; 1.02 (1)
化合物 32. Ghrelin(l-5)-amide ESI-MS [M+H] 635.4 (理論値 634.8) , アミノ酸組成比： Ser; 1.67 (2),
Gly ； 1.01 (1), Leu; 上， Phe; 1.01 (1),
化合物 33 - 2. Ghrelin(l-4)-amide
ESI-MS [M+H] 522.2 (理論値 521.6) ， アミノ酸組成比： Ser; 1.65 (2), Gly ； 0.99 (1), Phe; 丄
化合物 34. Ghrelin(l-3)-amide
ESI-MS [M+H] 375.2 (理論値 374.4) アミノ酸組成比： Ser; 1.66 (2),
Gly ； 丄
化合物 35. [Lys8]-Ghrel in (1-8) -amide
ESI-MS [M+H] 947.9 (理論値 947.1)， アミノ酸組成比： Ser; 2.70 (3),
Gly ； 1.00 (1), Leu; 丄, Phe; 1.00(1)， Lys; 0.99 (1), Pro； 1.00 (1) 化合物 36. [Arg8]- Ghrelin (卜 8)- amide
ESI-MS [M+H] 975.8 (理論値 975.2)， アミノ酸組成比： Ser; 2.70 (3),
Gly ； 1.00 (1), Leu; 丄， Phe; 1.01 (1), Arg; 0.99 (1), Pro； 1.00 (1) 化合物 37. [Lys6]-Ghrelin(l-6)-amide
ESI-MS [M+H] 763.6 (理論値 762.9)， アミノ酸組成比： Ser: 1.80 (2),
Gly ； 1.00 (1), Leu; 丄， Phe; 1.01 (1), Lys; 1.00 (1)
化合物 38. [Lys5]- Ghrelin (卜 5)- amide
ESI-MS [M+H] 650.5 (理論値 649.8)， アミノ酸組成比： Ser; 1.79 (2)， Gly ； 0.99 (1), Phe; 丄， Lys; 0.99 (1)
化合物 39. [DPhe4, Lys5]- Ghrelin (卜 5)- amide
ESI-MS [M+H] 650.5 (理論値 649.8)， アミノ酸組成比： Ser; 1.79 (2),
Gly ； 0.99 (1), Phe; 丄， Lys; 0.99 (1)
化合物 40. [ -Aminopentanoyl]-Ghrel in (3-7) -amide
ESI-MS [M+H] 774.7 (理論値 774.0)， アミノ酸組成比： Ser; 1.80 (2),
Leu; 上， Phe; 1.01 (1), Pro; 1.00 (1)
化合物 43. |jV-Glycyl]-Ghrelin(3-7)- amide
ESI-MS [M+H]； 732.7 (理論値 731.9), アミノ酸組成比： Ser; 1.80 (2),
Gly ； 1.00 (1)， Leu; 丄， Phe; 1.01 (1), Pro; 1.00 (1)
化合物 44. [Leu2]-Ghrelin(l-7)-amide
ESI-MS [M+H]； 845.7 (理論値 845.1)， アミノ酸組成比： Ser: 1.80 (2), Gly ； 1.01 (1), Leu; 2, Phe; 1.02 (1), Pro; 0.99 (1)
化合物 45. [His2]- Ghrelin (卜 7)— amide
ESI- MS [M+H]； 869.7 (理論値 869.0)， プロピオン酸 ·塩酸（50/50)で
150で， 2時間加水分解後のアミノ酸組成比： Ser; 1.02 (2), Gly ； 1.00 (1), Leu; 丄， Phe; 1.00 (1), His; 0.95 (1), Pro; 0.99 (1)
化合物 46. [Lys2] -Ghrelin(l-7)-amide
ESI- MS [M+H] : 860.7 (理論値 860.1)， プロピオン酸 ·塩酸（50/50)で
150で， 2時間加水分解後のアミノ酸組成比： Ser; 1.04 (2), Gly ； 1.00
(1) , Leu; 丄. Phe; 1.00 (1), Lys; 1.00 (1), Pro; 1.00 (1)
化合物 47. [Gly2]- Ghrelin (卜 7)- amide
ESI- MS [M+H]； 789.5 (理論値 788.9)， プロピオン酸 ·塩酸（50/50)で
150で， 2時間加水分解後のアミノ酸組成比： Ser; 1.14 (2), Gly ； 2.01
(2) , Leu; 丄， Phe; 1.00 (1), Pro; 1.00 (1)
化合物 59. [Thr3 (0ctanoyl)]-hGhrelin
ESI-MS M; 3384.0 (理論値 3384.9) アミノ酸組成比 ： Ala ： 1.02
(1) , Arg ； 2.99 (3) , Glx ； 5.91 (6) , Gly ； 1.02 (1) , His ； 1.00 (1) , Leu ； 2 (2) , Lys ； 4.05 (4) , Phe ； 1.00 (1) , Pro ； 4.06 (4) , Ser ； 2.66 (3) , Thr;0.94 (1) , Val ； 0.96 (1)
化合物 60. [Leu2, Thr3 (Octanoyl)j-hGhrel in
ESI-MS M; 3410.0 (理論値 3411.0) アミノ酸組成比 ： Ala ： 1.01
(1) , Arg ； 2.95 (3) , Glx ； 5.92 (6) , Gly ； 1.01 (1) , His ； 1.01 (1) , Leu ； 3 (3) , Lys ； 4.02 (4) , Phe ； 1.01 (1) , Pro ； 4.00 (4) , Ser ； 1.81 (2) , Thr;0.96 (1) , Val ； 0.97 (1)
化合物 69. [Ser3(4-Methylpentanoyl)]-hGhrelin
ESI-MS M; 3343.0 (理論値 3342.9) アミノ酸組成比： Ala ； 1.00 (1) , Arg； 2.97 (3) , Glx； 5.86 (6) , Gly； 1.02 (1) , His ； 1.01 (1) , Leu； 2, Lys ； 4.00 (4) , Phe ； 1.01 (1) ， Pro ； 3.99 (4) , Ser ； 3.54 (4) , Val ； 0.98 (1) 化合物 75. [Lys7]- Ghrelin (卜 7)- amide
ESI-MS [M+H]； 850.5 (理論値 850.0), アミノ酸組成比： Ser; 2.67 (3)， Gly ； 1.00 (1), Leu; 丄， Phe; 1.00 (1), Lys; 1.00 (1)
(5) ァミノ末端ァシル化誘導体の合成例
化合物 6. O-Octanoyl, Ser3]-Ghrel in(l-9)-amide;
C7H15CO-GSSFLSPEH-NH2
Fmoc-アミド樹脂 （ABI社製、 403 mg, 0.25 mmol) を 20%ピぺラジンで 20分間処理したのち、 順次 HBTU/HOBtによる Fmoc-アミノ酸導入とピぺ ラ ジ ン に よ る 脱 Fmoc を 繰 り 返 し 、 Fmoc-Gly-Ser (Bul) -Ser (Bu1) -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-Glu (0Bul) -Hi s (Boc )-樹脂を構築した。 ピぺラジン処理後、 得られたペプチド樹脂 （550 mg) を NMPで洗浄し、 HOBt (135.1 mg, 1 mmol)存在下、 DIPCI ( 126.2 mg, 1 mmol) とオクタン酸 （144.2 mg, 1.0 mmol) を加え 4時間反応させた。 樹脂を ろ取し、 NMP、 塩化メチレンで洗浄し減圧下乾燥して、 ァミノ末端 Gly ァミノ基がォク夕ノィル化された保護ペプチド樹脂 約 600 mgを得た。
TFAU0 mL)で脱保護し （30分間処理）、 粗ペプチド 200 mgを得た。 全 量を YMC- Pack PROTEIN- RP (5 C4, 20 mm x 250蘭）に添加し、 0.1% トリフルォロ酢酸中、 ァセトニトリル 0%から 54 までの 60分間直線グ ラジェント （流速： 10 mL/mL) で溶出させた。 約 180 mgの目的物を得た。 測定値 ESI- MS [M+H]; 1085.6 (理論値 1085.2)、アミノ酸組成比： Ser； 2.47 (3)， Glx; 0.98 (1)， Gly； 1.00 (1), Leu;上， Phe; 1.02 (1)， His; 1.09 (1), Pro; 0.96 (1)
(6) 側鎖アルキルセリンを含む誘導体の合成例
化合物 50. [Ser3 (Octyl)] -Ghrelin (1-7) -amide; GSS(C8H17)FLSP-NH2 Fmoc-Ser (C8H17)
氷冷下、 Boc - Ser (12.3 g, 53.9 mmol)の DMF (300 ml)溶液に水素化ナ トリウム（3.19g, 133mmol)を加え、室温で 1.5時間攪拌した。この中に、 ヨウ化オクタン（11. Oml, 60.9mmol)を加え、室温で 1 6時間攪拌した。 氷冷下、 反応液に水（40ml)を滴下した後、 溶媒を減圧留去した。 得られ た残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （ゲル； Merck 社製 Art9385、 溶出溶媒； ジクロロメタン： メタノール：酢酸 =120： 10： 1) に付して精製し、 Boc- Ser(C8H17)を淡黄色油状物として 6.88 g (収率
36.2 )得た。 この Boc- Ser(C8Hl7) (6.88 g, 21.7 腿 ol)に氷冷下、 トリ フルォロ酢酸（120 ml)を加え、 室温で 0.5時間攪拌した。 トリフルォロ 酢酸を減圧留去した後、 得られた残査をジェチルエーテル（120 ml)に溶 解し、 4N塩酸-ジォキサン（22 ml)を加え、 氷冷下、 1時間攪拌した。 析 出した結晶をろ取し、 H- Ser(C8H17) · HC1を無色結晶として 5.23 g (収率
96.3 )得た。 この H-Ser(C8H17) · HC1 (2.54 g, 10.0 mmol)の 10 %炭酸 水素ナトリウム（50 ml)懸濁液にトリェチルァミン（1.40 ml, 10 mmol) を加えた後、 この中に Fmoc- 0Su(5.00 g, 14· 8 龍 ol)の 1, 2-ジメトキシ ェタン（20 ml)溶液を 10分間かけて滴下し、 室温で 1 6時間攪拌した。 不溶物をろ過し、ろ液にジクロロメタンを加え有機層を分離した後、 13% 食塩水で洗浄した。 無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、 溶媒を減圧留去 した。 得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （ゲル；富 士シリシァ社製 BW- 300、 溶出溶媒； ジクロロメタン： メタノール =93： 7) に付して精製し、 Fmoc- Ser(C8H17)を無色結晶として 2.75 g (収率 62.6 ^得た。 Rf=0. 5 (CHCl3:Me0H=9:l， Silica gel 60F254, MERCK) Fmoc-DSer (C8H17) ： Rf=0.45 (CHCl3:Me0H=9 : 1, Silica gel 60F254, MERCK) Fmoc-アミド樹脂 （ABI社製、 400 mg， 0.25 mmol) を 20 ピペラジンで 20分間処理したのち、順次 HBTU/HOBtによる Fmoc-アミノ酸導入とピペラジ ン に よ る 脱 Fmoc を 繰 り 返 し 、 Fmoc-Ser (Bul) -Ser (C8H17) -Phe-Leu-Ser (Bul) -Pro 樹脂を構築した。 最後 に DCC/HOBtにて Boc- Glyを導入したのち、得られた保護べプチド樹脂 か ら 250 mgをとり TFA (10 mL) で 30分間処理した。 樹脂をろ去し、 ろ液 を濃縮後、 残さにエーテルを加え沈殿とし粗ペプチド約 120 mgを得た。 本品を 5% Ac0H(10 mL)に溶かし、 YMC- Pack_0DS- A (5 m, 20 mm x 250 mm)に添加し、 0.1 トリフルォロ酢酸中、 ァセトニトリル 0%から 60%ま での 60分間直線グラジェント （流速： 10 inL/min) で溶出させた。 目的 画分を分取後、 凍結乾燥し、 40 mg の目的物を得た。
化合物 84. [^-Aminopentanoyl, Ser3(0ctyl)] -Ghrel in (3-5) -benzyl amide；
H-Ape-Ser (CgH17) -Phe-Leu-NH-CH2-Ph
ォキシム樹脂 （230 mg/0.25 mmoK Novabiochem 製） をグラスフィル ター付反応容器に入れ、 予め塩化メチレン（DCM)に溶かし、 MgS04で乾燥 した Boc- Leu - 0H · H20 (190 mg, 0.75 mmol)、 DCC (160 mg, 0.75 mmol)、 および DCM 5mL を加え、 終夜振盪した。 適量の DCM、 DCM I Et0H=l:l、 DCMで順次数回ずつ洗浄した。 Leu導入後は、 ① 25% TFA / DCM lOmLを 加え 30分振盪した後、 DCM、 ィソプロピルアルコール（iPr0H)、 DCM, DMF でそれぞれ数回洗浄する、 ② 三角フラスコ中で Bocアミノ酸 0.75顏 ol (3当量）、 TBTU 0.75随 ol (3当量）、 HOBt 0.75 mmol (3当量） を DMF 5 mLに溶解し、 DIPEA 1.25 mmol (5当量） を加え攪拌したものを反応容 器に入れ 1時間振盪する、 という操作を繰り返し、 順次アミノ酸を縮合 した。 最終的に Boc- NH-(CH2) 4-C0 -Ser(C8H17) -Phe-Leu-Oxime 樹脂 370 mg を得た。 DMF 約 5mL 中に懸濁させ、 ベンジルァミン塩酸塩（180 mg, 1.25mmol), トリェチルァミン（173 L, 1.25mmol)、 酢酸 72 L (1.25 mmol) を加え攪拌した。 24 時間後、 樹脂を濾去し、 濾液を減圧留去し、 IN HC1 10mLで Boc保護体を析出させた。 水洗、 乾燥後、 TFA 5mLを加え 30分反応させ脱 Bocを行った。 TFAを減圧留去し、 エーテル （Et20) で 沈殿させ、 目的物 [V-Aminopentanoyl, Ser3(Octyl)]-Ghrel in(3-5) -benzylamide 110 mgを得た。 同様の方法で化合物 82、 83, 85 を合成 した。 以下のアルキルセリンを有するペプチド誘導体は、 化合物 8 2〜8 5 を除き、 上記化合物 50の製造方法と同様にして製造した。
以下にアルキルセリンを有するぺプチド誘導体の質量分析、 アミノ酸 組成分析結果をまとめた。
化合物 17. [Ser3(Octyl)]-hGhrelin
ESI - MS； 3357.0 (理論値； 3356.9)、 アミノ酸組成比： Ser: 2.92 (3+1), Glx; 5.94 (6)， Gly ； 1.00 (1), Ala; 0.98 (1), Val; 0.99 (1)， Leu;
2, Phe; 1.13 (1), Lys; 4.04 (4), His; 1.09 (1), Arg; 3.01 (3)， Pro;
3.89 (4)
化合物 50. [Ser3 (Octyl)]-Ghrel in (1-7) -amide
ESI -MS [M+H]； 805.5 (理論値 805.0) 、 プロピオン酸 ·塩酸（50/50) で 150で， 2時間加水分解後のアミノ酸組成比： Ser; 0.86 (2+1), Gly ； 1.01 (1), Leu; 丄， Phe; 1.06 (1), Pro; 0.95 (1)
化合物 51. [Ser3(0ctyl)， DPhe4]-Ghrel in(l-7)-amide
ESI- MS [M+H]； 805.4 (理論値 805.0) 、 プロピオン酸 ·塩酸（50/50) で 150で， 2時間加水分解後のアミノ酸組成比： Ser; 0.97 (2+1), Gly ； 1.00 (1), Leu; 丄， Phe; 1.05 (1), Pro; 1.16 (1)
化合物 52. [DSer3(0ctyl)]-Ghrel in (1-7) -amide
ESI-MS [M+H]； 805.4 (理論値 805· 0) 、 プロピオン酸 ·塩酸（50/50) で 150で， 2時間加水分解後のアミノ酸組成比： Ser; 1.51 (2+1)， Gly ； 1.00 (1), Leu; 丄， Phe; 1.00 (1)， Pro; 1.00 (1)
化合物 53. [D Ser3(0ctyl), DPhe4] -Ghrel in (1-7) -amide
ESI-MS [M+H]； 805.5 (理論値 805.0) 、 プロピオン酸 ·塩酸（50/50) で 150 ， 2時間加水分解後のアミノ酸組成比： Ser: 1.51 (2+1), Gly ； 1.00 (1), Leu; 丄， Phe; 1.00 (1), Pro; 1.01 (1)
化合物 67. [Ser3 (Bzl)]-hGhrel in
ESI- MS M; 3335.0 (理論値 3334.8) アミノ酸組成比 ： Ala ； 1.00 (1), Arg ； 2.96 (3), Glx ； 5.92 (6)， Gly ； 1.00 (1), His ； 1.01 (1), Leu ； 2_(2), Lys ； 4.00 (4), Phe ； 1.02 (1), Pro ； 4.08 (4), Ser ； 3.58 (4), Val ； 0.98 (1)
化合物 76. [V-Aminopentanoyl, Ser (0ctyl), Lys5]-Ghrel in(3-5) -amide
ESI-MS [M+H] : 591.5 (理論値 590.8), アミノ酸組成比： Ser; 0.45 (1), Phe; 丄， Lys; 1.00 (1)
化合物 77. [V-Aminopentanoyl, DSer3(0ctyl), DPhe4, Lys5] -Ghrel in (3-5) -amide
ESI-MS [M+H]； 591.5 (理論値 590.8), アミノ酸組成比： Ser; 0.45 (1), Phe; 上， Lys; 1.01 (1)
化合物 78. [Aib1, His2, Ser3(0ctyl)， Lys5] -Ghrel in(l-5)-amide ESI-MS [M+H]； 714.6 (理論値 713.9), アミノ酸組成比： Ser; 0.45 (1), Phe; 丄， His; 1.01 (1), Lys; 1.00 (1)
化合物 79. [Aib1, His2, DSer3(0ctyl), DPhe4, Lys5]- Ghrel in (卜 5) -amide
ESI-MS [M+H]； 714.5 (理論値 713.9)， アミノ酸組成比： Ser; 0.44 (1), Phe; 上， His; 1.00 (1), Lys; 1.01 (1)
化合物 81. C^-Aminopentanoyl, Ser3 (Octyl)] -Ghrel in (3-5) -amide ESI-MS [M+H] ; 576.5 (理論値 575.8), アミノ酸組成比： Ser； 0.49 (1) , Leu; 丄， Phe; 0.99 (1)
化合物 82. O- Aminopentanoyl, Ser3(0ctyl)] - Ghrel in(3-5) -Diethylamide
ESI- MS [M+H]； 590.6 (理論値 589.8), アミノ酸組成比： Ser; 0.49 (1) , Leu; 丄， Phe; 0.99 (1)
化合物 83. O- Aminopentanoyl, Ser3(0ctyl)]-Ghrelin(3-5)
-ethylamide
ESI-MS [M+H] ; 604.3 (理論値 603.8), アミノ酸組成比： Ser； 0.50 (1) , Leu; 丄， Phe; 0.99 (1)
化合物 84. [iV-Aminopentanoyl, Ser3(0ctyl)]-Ghrel in(3-5)
-benzylamide
ESI-MS [M+H] ; 666.5 (理論値 665.9), アミノ酸組成比： Ser; 0.46 (1) , Leu; 丄， Phe; 0.98 (1)
化合物 85. [^-Aminopentanoyl, Ser3(0ctyl)]-Ghrel in(3-5)
-am inoethyl amide
ESI-MS [M+H] ; 619.6 (理論値 618.9), アミノ酸組成比： Ser ; 0· 47 (1) , Leu; 丄， Phe; 0.99 (1)
(7) 側鎖アルキルシスティンを含む誘導体の合成例
化合物 48. [Cys3 (Oc ty 1) ] -Ghre 1 i n (1-7) -NH2； GSC(C8HI7)FLSP-NH2 Fmoc-アミ ド樹脂 （ABI社製、 403 mg, 0.25 mmol) を 20%ピぺラジンで 20分間処理したのち、 順次 HBTU/HOBtによる Fmoc -アミノ酸導入とピぺ ラ ジ ン に よ る 脱 Fmoc を 繰 り 返 し 、 Fmoc- Ser (Bul) -Cys (C8H17) -Phe- Leu-Ser(Bul) -Pro 樹脂を構築した。 最後 に DCC/HOBt にて Boc-Gly を導入したのち、 得られた保護ペプチド樹脂 (550 mg)を TFA (10 mL) で 30分間処理しした。 樹脂をろ去し、 ろ液を 濃縮後、 残さにエーテルを加え沈殿とし粗ペプチド 120 mgを得た。 本品 を 5%酢酸 （AcOH) 10 mLに溶かし、 YMC- Pack- 0DS- A (5 urn, 20匪 x 250 mm)に添加し、 0. トリフルォロ酢酸中、 ァセトニトリル 0%から 60%ま での 60分間直線グラジェント （流速： 10 mL/min) で溶出させた。 目的 画分を分取後、 凍結乾燥し、 44 mg の目的物を得た。
化合物 68. [Cys3(Trt)]-hGhrelin;
GSC (C-Ph3) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
Fmoc- Arg(Pmc)-HMP-樹脂 （ABI社製、 403 mg， 0.25 mmol) を 20%ピペラ ジンで 20分間処理したのち、 順次 HBTU/HOBt による Fmoc-アミノ酸導入と ピ ぺ ラ ジ ン に よ る 脱 Fmoc を 繰 り 返 し 、 Fmoc-Ser(Bu')-Cys(Trt)-Phe-Leu-Ser (tBu)-Pro-Glu(0Bu')-His(Boc)-G ln(Trt)-Arg (Pmc) -Val-Gln(Trt)-Gln (Trt)-Arg (Pmc) -Lys (Boc) -Glu (OBu ') -Ser (Bu1) -Lys (Boc) -Lys (Boc) -Pro-Pro- Al a- Lys (Boc) -Leu-Gln(Trt)- Pro-Arg(Pmc)-HMP樹脂を構築した。 最後に DCC/HOBt にて Boc-Glyを導 入したのち、 得られた保護べフチド樹脂 （1.4 g )を得た。 このうち 400 mgに TFA(15mL)を加え、 室温で 1時間攪拌した。 ろ過して樹脂を除き、 ろ液を濃縮した後、 エーテルを加え沈殿とした。 約 90 mgを水 40 mLに 溶かし、 YMC- Pack PROTEIN-RP (C4, 20 mm x 250龍）に添加し、 0. ト リフルォロ酢酸中、ァセトニトリル 0¾から 54%までの 60分間直線グラジ ェント （流速： 10 mL/min) で溶出させた。 目的画分を分取後、 凍結乾燥 し、 60 mg の目的物を得た。 以下のアルキルシスティンを有するペプチド誘導体は、 上記化合物 4 8または化合物 68の製造方法と同様にして製造した。
以下にアルキルシスティンを有するぺプチド誘導体の質量分析、ァミノ 酸組成分析結果をまとめた。
化合物 18. CCys3 (Octyl) ]-rGhrelin
ESI - MS ； 3317.0 (理論値； 3316.9)、 アミノ酸組成比： Ser; 2.69 (3), Glx; 5.90 (6), Gly ； 1.00 (1), Ala; 1.99 (2)， Leu; 2， Phe; 1.02 (1), Lys; 4.97 (5), His; 0.99 (1), Arg; 1.98 (2), Pro; 3.87 (4) 化合物 48. [Cys3 (0ctyl)]-Ghrelin(l-7)-amide
ESI-MS [M+H]； 821.7 (理論値 821.1) 、 プロピオン酸 ·塩酸（50/50) で 150 、 2時間加水分解後アミノ酸組成比： Ser; 0.60 (2), Gly ； 1.08 (1), Leu; 丄， Phe; 1.06 (1), Pro; 0.96 (1)
化合物 49. [Cys3 (Octyl), DPhe4]- Ghrel in (卜 7)- amide
ESI-MS [M+H]； 821.6 (理論値 821.1) 、 プロピオン酸 ·塩酸（50/50) で 150T：、 2時間加水分解後のアミノ酸組成比： Ser; 0.58 (2), Gly； 1.02 (1), Leu; 丄， Phe; 1.06 (1), Pro; 0.97 (1)
化合物 68. [Cys (Trt)]-hGhrelin
ESI-MS 3503.0 (理論値 3503.1) , アミノ酸酸組成比： Ser； 2.42 (3), Glx; 5.77 (6), Gly ； 1.00 (1), Ala; 1.01 (1), Val; 0.94 (1), Leu;
2, Phe; 0.99 (1), Lys; 3.94 (4), His; 0.99 (1), Arg; 2.92 (3)， Pro;
3.81 (4)
(8) N-メチルアミノ酸を含むペプチド誘導体の合成例
化 合 物 86. [jV-Aminopentanoyl, Ser3(0ctyl), MePhe4, MeLeu5] -Ghrel in (3-5) -amide； H2- (CH2) 4- CO- Ser (C8H17) -MePhe-MeLeu- NH2 Fmoc-アミド樹脂 （0.40 g， 0.25 mmol) をグラスフィルタ一付反応容 器に入れ、 20% ピぺリジン / NMP 15mLを加え 20分振盪し、 Fmoc基を除 去した。 その後、 NMP 15mL、 Fmoc-MeLeu-OH 1.0 mmol (4当量）、 TBTU 1.0 mmol (4当量）、 HOBt 1.0 mmol (4当量）、 DIPEA 1.0 mmol (4当量） を 加え 1時間振盪し、 Fmoc- MeLeuを縮合した。 その後、 20%ピぺリジンに よ る Fmoc 基の除去と DIPEA 2.25 mmol ( 9 当量） 存在下、 Bromo-tr is-pyrrol idino-phosphonium hexaf luorophosphate (3当量) による Fmoc-アミノ酸 縮合 （3当量） を繰り返し、 ペプチド鎖を延長し た。 縮合反応の終了を、 少量の樹脂を TFAで脱保護し、 HPLCおよび質量 分析（MS)により確認した。 Boc-NH- (CH2) 4- CO-Ser ( - C8HI7) - MePhe-MeLeu- 樹脂を得た後、これを TFAで 30分処理して切り出しおよび脱保護を行い、 TFA を 減 圧 留 去 、 エ ー テ ル （ Et20 ) で 洗 浄 し 、 NH2- (CH2) 4-C0-Ser (C8H17) -MePhe-MeLeu-NH2 120 mg を得た。 これを YMC-Pack ODS-A (CI 8, 20 mm x 250mm)に添加し、 0.1% トリフルォロ酢 酸中、 ァセトニトリル 0 から 54 までの 60分間直線グラジェント （流 速： 10mL/min) で溶出させた。 目的画分を分取後、 凍結乾燥し、 70 mgの 目的物を得た。 本誘導体をプロピオン酸 ·塩酸（50/50)で 150で、 2時間 加水分解して、 アミノ酸分析機上で検出されたァミノペンタン酸のピー ク面積を、 ァミノペンタン酸 10 nmolに対応する面積比からペプチド量 を定量した。
ESI-MS [M+H]； 604.5 (理論値 603.8) 、 プロピオン酸 ·塩酸（50/50) で 15(TC、 2時間加水分解後の検出アミノ酸： Ser、 Ape
(9) 混合ジスルフィ ド誘導体の合成
化合物 57· [Cys3(S-Heptyl)]-hGhrelin;
GSC (S-C7HI5) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
化合物 58 の化合物 3の製造方法に従った合成で得られた保護べプチ ド- HMP樹脂 （1 g) に 88% TFA- 5 フエノール- 2% TIPS- 5 ¾ H20からな る脱保護試薬（15mいを加え、 室温で 2時間攪拌した。 樹脂をろ去し、 ろ 液を濃縮後、残さにエーテルを加え、粗 [Cys3]_hGhrelin粉末を約 550 mg を得た。 これを YMC-Pack 0DS-A (C18, 20腿 x 250mm)に添加し、 0.1% ト リフルォロ酢酸中、ァセトニトリル（^から 54%までの 60分間直線グラジ ェント （流速： 10 mL/min) で溶出させた。 目的画分を分取後、 凍結乾燥 し、 300 mg の [Cys3] - hGhrelin (卜 28)を得た。 そのうち 40 mg (11.4 mol) を水 （20 mL) に溶解し、 4,4' -ジチォジピリジン （7.5 mg, 34.2 mol) のァセトニトリル溶液 lmLを加え、 1時間放置した。 反応終了を 確認した後、 反応液をクロ口ホルムで数回洗浄し、 過剰の 4,4' -ジチォ ジ ピ リ ジン と ピ リ ド ン誘導体を除いた。 [チォピ リ ジル Cys3]-hGhrelinO-28)を含む水層 （10 mL) を 5%NH3水で pHを 7.4 とし て、 卜ぺプ夕ンチオール （4.5 mg、 34.2 ΠΙΟ1) のァセトニトリル溶液 2mLを加えた。 1時間後、 反応液を YMC-PackODS- A (C18, 20龍 x 250 mm) に添加し、 0.1¾ トリフルォロ酢酸中、 ァセトニトリル（^から 54 までの 60分間直線グラジェント （流速： lOmL/min) で溶出させた。 目的画分を 分取、 凍結乾燥して 15 mg の目的物を得た。
化合物 57. [Cys3(S- Heptyl)]- hGhrelin
ESI- MS 3391.0 (理論値 3391.0), アミノ酸酸組成比： Ser； 2.76 (3)， Glx; 5.81 (6), Gly ； 0.99 (1), Ala; 1.01 (1), Val; 0.95 (1), Leu;
2, Phe; 0.99 (1), Lys; 3.95 (4), His; 0.99 (1), Arg; 2.93 (3), Pro;
3.84 (4)
(1 0) 3位側鎖にアミド、 逆方向のエステルを有する誘導体の合成例 化合物 55. [Asp3(NH-Heptyl)]-hGhrelin；
GSD (NH-C7H15) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
Fmoc- Arg(Pmc)- HMP-樹脂 (ABI社製、 403 mg, 0.25 mmol) を 20%ピペラ ジンで 20分間処理したのち、順次 HBTU/HOBtによる Fmoc-アミノ酸導入 と ピ ペ ラ ジ ン に よ る 脱 Fmoc を 繰 り 返 し 、 Fmoc- Ser (Bul) -As (OP is) -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-Glu(OBu') -Hi s (Boc) - Gln(Trt)- Arg(Pmc)- Va卜 Gln(Trt)- Gln(Trt)- Arg(Pmc)- Lys(Boc)- Glu(0B u') -Ser (Bul) -Lys (Boc) -Lys (Boc) -Pro- Pro-Ala - Lys (Boc) -Leu-Gln(Trt) -Pro- Arg (Pmc)- HMP樹脂を構築した。最後に DCC/HOBtにて Boc-Glyを導 入したのち、 得られた保護ペプチド樹脂 （1.3 g )を 4 FA-塩化メチレ ン溶液 （15 mL) で 15分間処理した。 ペプチド樹脂をろ取し、 塩化メチ レン（30 mL)で数回洗浄した後、 4% DIEA(10mL)、 ついで塩化メチレン (30mL)で洗浄した。
得られた脱 Pisペプチド樹脂 （約 1.3g) を NMP (10mL)に膨潤させ、 水溶性カルポジイミド塩酸塩（191.7 mg, l.(^mol)、 H0Bt (135.2 mg, 1.0 mmol), n-ぺプチルァミン （115.2 mg, 1.0 mmol) を加え、 8時間反応さ せた。
樹脂をろ取し、 NMP、 塩化メチレンで洗浄し減圧下乾燥して、 3位 Asp 側鎖がヘプチルアミド化された保護ペプチド樹脂 約 1.2gを得た。 この ものに、 88% TFA_5 フエノール- 2% TIPS- 5 ¾ H20 からなる脱保護試薬 (10 mL)を加え、 室温で 2時間攪拌した。 樹脂をろ去し、 ろ液を濃縮後、 残さにエーテルを加え沈殿とした。 沈殿をろ取、 乾燥し、 粗ペプチド約 550 mgを得た。
本品 200 mgを水 10 mLに溶かし、 YMC_Pack PROTEIN- RP (C4, 20 mm x 250關）に添加し、 0.1¾ トリフルォロ酢酸中、 ァセトニトリル 0%から 54% までの 60分間直線グラジェント （流速： lOmL/min) で溶出させた。 目的 画分を分取後、 凍結乾燥し、 120 mg の目的物を得た。
化合物 61. [Lys3(0ctanoyl)]-hGhrelin；
GSK (CO-C7H15) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
Fmoc-Arg(Pmc)-HMP-樹脂 （ABI社製、 403 mg, 0.25 mmol) を 20 ピペラジ ンで 20分間処理したのち、順次 HBTU/HOBtによる Fmoc-アミノ酸導入とピぺ ラ ジ ン に よ る 脱 Fmoc を 繰 り 返 し Boc-Gly-Ser(tBu)-Lys(Mtt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBu')-His(Boc) -Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OB u1)- Ser(Bu')- Lys(Boc)- Lys(Boc)- Pro- Pro- Ala-Lys(Boc)-Leu- Gln(Trt)- P ro- Arg(Pmc)- HMP樹脂を構築した。 約 300mgの保護ペプチド樹脂を 1¾TFA-5%TIPS-塩化メチレン溶液 （15 mL) で 60分間処理した。
ペプチド樹脂をろ取し、 塩化メチレン（30 mL)で数回洗浄した後、 10% DIEA(lOmL), ついで塩化メチレン（30mL)で洗浄した。 得られた脱 Mttぺプ チド樹脂 （約 300m g) を NMP (2 mL)に膨潤させ、 H0Bt(34 mg, 0.25 mmol) 存在下、 オクタン酸 （40 1, 0.25 mmol), DCC (52 mg, 0.25 mmol) を加 え一晩反応させた。
樹脂をろ取し、 NMP、 塩化メチレンで洗浄し減圧下乾燥して、 3位リジン 側鎖がォク夕ノィル化された保護ペプチド樹脂 約 300mgを得た。 このもの に、 88% TFA- 5%フエノール- 2¾ TIPS- 5 ¾ H20からなる脱保護試薬（5 mL) を加え.、 室温で 2時間攪拌した。 樹脂をろ去し、 ろ液を濃縮後、 残さにェ —テルを加え沈殿とした。 沈殿をろ取、 乾燥し、 粗ペプチド約 234mgを得 た。
本品を酢酸 6 mLに溶かし、 YMC- Pack 0DS-A (5 urn, 20 mm x 250 mm) に添加し、 0. トリフルォロ酢酸中、 ァセトニトリル 0%から 60%までの 60 分間直線グラジェント （流速： 10mL/min) で溶出させた。 目的画分を分取 後、 凍結乾燥し、 100 mgのパウダーを得た。 この物を 2m lの 50% 酢酸 の溶かし、 YMC- Pack PR0TEIN-RP (5 Aim, C4， 20 mm x 250mm) に添加し、 0.1¾ トリフルォロ酢酸中、 ァセトニトリル 0¾から 60 までの 60分間直線グ ラジェント （流速： 10mL/min) で溶出させた。 目的画分を分取後、 凍結乾 燥し、 52mg のパウダーを得た。 以下の化合物は、 上記化合物 55または化合物 6 1の製造方法と同様 にして製造した。
その他、 Fmoc常法で合成したペプチド誘導体の質量分析、 アミノ酸組 成分析結果をまとめた。
化合物 54. [Asp3(0-Heptyl)]-hGhrelin(l-28)
ESI-MS 3371.0 (理論値 3370.9), アミノ酸酸組成比： Asx； 0.99 (1), Ser; 2.70 (3), Glx; 5.87 (6), Gly ； 1.01 (1), Ala; 1.01 (1), Val； 0.94 (1), Leu; 2, Phe; 1.00 (1), Lys; 4.02 (4), His; 1.00 (1), Arg; 2.98 (3), Pro; 3.84 (4)
化合物 55. [Asp3(NH-Heptyl)]-hGhrelin(l-28)
ESI- MS 3370.0 (理論値 3369.9), アミノ酸酸組成比： Asx； 0.88 (1), Ser; 2.95 (3), Glx; 5.97 (6), Gly ； 1.21 (1)， Ala; 1.03 (1), Val;
0.98 (1), Leu; 2, Phe; 1.00 (1), Lys; 3.94 (4), His; 0.92 (1), Arg; 2.91 (3), Pro; 3.99 (4)
化合物 56. [Dap3(Octanoyl)]-hGhrelin
ESI-MS M; 3370.0 (理論値 3369.9) アミノ酸組成比 ： Ala ； 1.02 (1) , Arg ； 2.94 (3) , Glx ； 5.94 (6) ， Gly ； 1.00 (1) , His ； 0.91
(1) , Leu ； 2 (2) , Lys ； 3.93 (4) , Phe ； 0.99 (1) , Pro ； 4.01 (4) , Ser ； 2.88 (3) , Val ； 0.98 (1) , Dap ； N. D.
化合物 58. [Adod3]-hGhrelin(l-28)
ESI-MS M; 3355.0 (理論値 3355.0) アミノ酸組成比 ： Ala ； 1.01 (1) , Arg ； 2.91 (3) , Glx ； 5.95 (6) , Gly ； 1.01 (1) , His ； 0.91
(1) ,Leu ； 2 (2) , Lys ； 3.94 (4) , Phe ； 0.99 (1) , Pro ； 4.02 (4) , Ser ； 2.88 (3) , Val ； 0.96 (1)
化合物 61. [Lys3 (OctanoyDJ-hGhrelin
ESI-MS M; 3412.0 (理論値 3412.0) アミノ酸組成比 ： Ala ： 1.05 (1) , Arg ； 3.05 (3) , Glx ； 6.02 (6) , Gly ； 1.00 (1) , His ； 1.00
(1) , Leu ； 2 (2) , Lys ； 5.11 (5) , Phe ； 0.97 (1) , Pro ； 4.20 (4) , Ser ； 2.68 (3) , Val ； 1.00 (1)
化合物 62. [Trp3]-hGhrelin
ESI-MS M; 3343.0 (理論値 3343.9)， アミノ酸組成比： Ala ； 1.00 (1), Arg ； 3.03 (3), Glx ； 5.94 (6), Gly ； 1.01 (1), His ； 1.01(1)， Leu ；
2 (2)， Lys ； 4.00 (4), Phe ； 0.99 (1), Pro ； 3.96 (4), Ser ； 2.60 (3), Trp ； N. D. , Val ； 0.98 (1)
化合物 63. [Phe3]- hGhrelin
ESI-MS M; 3305.0 (理論値 3304.8), アミノ酸組成比： Ala ； 0.99 (1), Arg； 2.96 (3)， Glx ； 5.86 (6) ， Gly； 1.00 (1) , His ； 1.00 (1), Leu ； 2 (2), Lys ； 3.98 (4), Phe ； 2.01 (2), Pro ； 3.99 (4), Ser ； 2.67 (3), Val ； 0.98 (1)
化合物 64. [Cha3]-hGhrelin
ESI-MS M; 3411.0 (理論値 3410.9)， アミノ酸組成比： Ala ； 1.02 (1), Arg； 3.01 (3), Glx ； 5.92 (6), Gly ； 1.01 (1), His +Cha; 2.01 (1 + 1), Leu ； 2 (2), Lys ； 4.02 (4)， Phe ； 1.01 (1)， Pro ； 4.03 (4), Ser ； 2.72 (3), Val ； 0.97 (1)
化合物 65. [2- LNal3]- hGhrelin
ESI-MS M; 3354.0 (理論値 3354.9)， アミノ酸組成比： Ala ； 1.00 (1), Arg； 2.95 (3), Glx ； 5.87 (6), Gly ； 1.02 (1), His ； 1.01 (1), Leu ； 2 (2), Lys ； 3.98 (4)， Phe ； 1.01 (1), Pro ； 3.94 (4), Ser ； 2.73 (3), Val ； 0.97 (1)， al ； . D. (1)
化合物 66. [2- DNal 3]- hGhrelin
ESI-MS M; 3355.0 (理論値 3354.9), アミノ酸組成比： Ala ； 1.02 (1), Arg； 2.95 (3), Glx ； 5.96 (6), Gly ； 1.00 (1), His ； 0.92 (1), Leu ； 2 (2), Lys ； 3.94 (4)， Phe ； 0.99 (1)， Pro ； 4.02 (4), Ser ； 2.91 (3), Val ； 0.98 (1), Nal ； N. D. (2)
化合物 70. [Leu3]- hGhrelin
ESI-MS M; 3270.0 (理論値 3270.8), アミノ酸組成比： Ala ； 0.99 (1), Arg； 2.95 (3), Glx ； 5.88 (6), Gly ； 1.01 (1), His ； 1.00 (1), Leu ； 3 (3)， Lys ； 3.96 (4), Phe ； 1.00 (1), Pro ； 3.89 (4), Ser ； 2.65 (3), Val ； 0.97 (1) 化合物 71. [lie3]- hGhrelin
ESI-MS M; 3270.0 (理論値 3270.8), アミノ酸組成比： Ala ； 0.98 (1), Arg ； 2.96 (3), Glx ； 5.87 (6), Gly ； 0.99 (1), His ； 1.01 (1), lie ； 0.98 (1), Leu ； 2 (2), Lys ； 3.97 (4), Phe ； 1.00 (1), Pro ； 3.97 (4), Ser ； 2.65 (3), Val ； 0.98 (1)
化合物 72. [Lys3 (Octanoyl)]-hGhrelin
ESI-MS M; 3286.0 (理論値 3285.8), アミノ酸組成比： Ala ； 1.02 (1), Arg ； 2.94 (3), Glx ； 5.95 (6), Gly ； 0.99 (1), His ； 0.92 (1), Leu ； 2 (2), Lys ； 4.92 (5), Phe ； 0.99 (1), Pro ； 4.02 (4), Ser ； 2.91 (4), Val ； 0.99 (1)
化合物 73. [Nle3]- hGhrelin
ESI-MS M; 3270.0 (理論値 3270.8), アミノ酸組成比： Ala ； 1.01 (1), Arg ； 2.98 (3), Glx ； 5.92 (6)， Gly ； 1.02 (1), His ； 1.01 (1)， Leu ； 2 (2), Lys ； 4.01 (4), Phe ； 1.01 (1)， Pro ； 4.01 (4), Ser ； 2.71 (3)， Val ； 0.98 (1), Nle ； N. D. (1)
化合物 74. [Val3]- hGhrelin
ESI-MS M; 3256.0 (理論値 3256.8)， アミノ酸組成比 ： Ala ； 0.98 (1), Arg ； 2.96 (3), Glx ； 5.84 (6), Gly ； 1.00 (1), His ； 1.01 (1), Leu ； 2 (2), Lys ； 3.97 (4), Phe ； 0.99 (1), Pro ； 3.94 (4), Ser ； 2.64 (3), Val ； 1.97 (2)
化合物 80. [Aib1, His2, DNal3, DPhe4, Lys5]-Ghrel in (卜 5)- amide; Ipamorel in
ESI-MS [M+H]； 712.5 (理論値 711.9)， アミノ酸組成比： Phe； 丄， His; 1.00 (1), Lys; 1.00 (1) 実施例 11 グレリン誘導体ペプチド系化合物の活性比較 実施例 10 において合成したグレリン誘導体ペプチド系化合物および 天然型ダレリンペプチドについて、 実施例 1に示した方法によって Ca 上昇活性を測定した。
( 1) 3位セリン側鎖の修飾
ァ. ォクタノィル基の位置
グレリンの著しい構造上の特徴は 3位セリン水酸基のォクタノィル基 である。 まず、 ォク夕ノィル化されるセリンの位置が 3位であることが 活性発現に有利であるかどうかを調べた。 ラット GSHレセプ夕一を発現 させた CH0細胞を用い、 細胞内カルシウム上昇作用を指標とした。
その EC5。値が 5.4 nMに保持された短鎖グレリン誘導体であるグレリ ン （ 1— 9) アミドをもとに、 [セリン2 (ォクタノィル） ， セリン3]- ダレリン （ 1— 9) アミド、 [セリン2 (ォクタノィル） ] -ダレリン （ 1
— 9)アミド、 および [Na—ォクタノィル，セリン3] -ダレリン（ 1— 9) アミドを合成し、 細胞内カルシウム上昇活性を検討した。 結果を第 4表にまとめた。
第 4表
グレリン誘導体の活性
Figure imgf000124_0001
ヒトグレリンのォクタノィル基を 3位から 2位セリンに移すと活性は 約 1/200に低下した （EC5。=1 , 100 nM)。
2位と 3位の両方にォクタノィル基を有する誘導体も同様に活性が低 下した (EC50=1, 400 nM) 0
また、 ァミノ末端アミノ基のみを N—ォクタノィル化すると活性は比 較的弱くなつた (EC50> 10, 000 nM) o
これらの結果から、 ォク夕ノィル基で修飾されたアミノ酸の位置はグ レリン分子において 3位が特に好ましいことが判明した。
ィ. 脂肪酸鎖長
ラットダレリン 3位セリン側鎖のォク夕ノィル基を除去したデス—ォ クタノィル体の細胞内カルシウム上昇活性はォクタノィル体の 2. 6 nM から 3, 500 nMに低下することから、 3位セリン側鎖のォクタノィル基は 活性発現に極めて重要な役割を果たしていることは明らかである。
そこで、 種々の飽和脂肪酸を用い、 ラットダレリンにおけるセリン側 鎖ァシル基の炭素数と活性の関係を調べた。即ち、ァセチル基（CH3C0-)、 プロピオニル基 （CH3CH2CO-)、 プチリル基 （CH3 (CH2) 2C0-)、 へキサノィ ル基 （CH3 (CH2) 4C0-)、 デカノィル基 （CH3 (CH2) 8C0-)、 ラウロイル基 （CH3 (CH2) 1()C0-)、 及びパルミトイル基 (CH3 (CH2) 14C0- ) で 3位セリン水酸基 をァシル化したグレリン誘導体の細胞内カルシウム上昇活性を求めた。 結果を第 5表にまとめた。
第 5表
グレリン誘導体の活性 2
Figure imgf000125_0001
表中、 n . t .は試験を行っていないことを示す。
脂肪酸鎖長の活性への影響は、 ァセチル基 （C2) で EC5。値が 780 nM, ブ夕ノィル基 （C4) で EC5„値が 280 nM と次第に顕著となり、 へキサノ ィル基 （C7) で EC5。値が 16 nMと C a上昇活性がさらに上昇し、 ォクタ ノィル基 （ダレリン） で EC5。値が 1. 5 nM と C a上昇活性がピークに達 した。 デカノィル基 （C10) でも EC5„が 1. 7 nMと C a上昇活性はグレリ ンと同等に保持され、 さらにラウロイル基 （C12) で EC5o値が 2. 4 nM、 パルミトイル基 （C 1 6) でも EC5Q値が 6. 5 nMと脂肪酸鎖長を延ばしても
C a上昇活性が保持された。
ゥ. 種々のァシル基置換
飽和脂肪酸に替え、 3—フエニルプロピオン酸 （HO- CO- CH2CH2Ph) を 芳香族脂肪酸の代表例として 3位セリン水酸基にエステル結合させたヒ トグレリン誘導体、 および不飽和脂肪酸の代表例として 3—ォクテン酸 (CH3 (CH2) 3CH-CH- CH2 C00H)、 分枝状脂肪酸の代表例として 4 _メチル ペンタン酸 （（CH3) 2CH-CH2CH2C02H) をエステル結合させたヒトダレリン 誘導体を作成し活性を評価した。
ェ. アルキル基への置換
化学的に不安定なエステル結合をより安定なエーテル、 チォエーテル 結合などに変換すれば化学的に安定なグレリン誘導体の作成が可能であ る。 しかしながら、 活性が保持されることが前提であることは言うまで もない。
そこで、 ヒトダレリンの 3位セリンをォクチル （C8H17) 化したヒトグ レリンのエーテル誘導体、 およびラットグレリンの 3位セリンをシステ インに置換し、 同様にォクチル化したラットグレリンのチォエーテル体 の活性を調べた。
また、 ヒトダレリンの 3位セリンをベンジル化（-CH2Ph) した誘導体、 およびヒトダレリンの 3位セリンをシスティンに置換しトリチル化 (-C (Ph) 3) した誘導体を作成した。
結果を第 6表にまとめた。 なお、 ヒトダレリンの 3位セリンをべンジ ル化（-CH2Ph)した誘導体、 およびヒトダレリンの 3位セリンをシスティ ンに置換しトリチル化（- C (Ph) 3)した誘導体の C a上昇活性については、 第 1 3表に化合物 67、 68として結果を記載した。 また、 4—メチルペン タン酸 （（CH3) 2CH_CH2CH2C02H) を 3位セリン水酸基にエステル結合させ たヒトグレリン誘導体の C a上昇活性についても、第 1 3表に化合物 69 として結果を記載した。
第 6表
グレリン誘導体の活性 3
Figure imgf000127_0001
不飽和脂肪酸である 3—ォクテノィル基を 3位のセリンの側鎖に導入 しても、 ォク夕ノィル基と同等の C a上昇活性（EC5Q=1.7nM) であった。 興味深いことにフエニルプロピオニル基の導入でも、 EC5。=1.4 nMとじ a上昇活性が保持され、 また、分枝状脂肪酸で C6に相当する 4一メチル ペン夕ノィル基を導入しても、 EC5fl値が 4.4nMであり、 C a上昇活性が 保持された （第 1 3表、 化合物 69) ことより、 3位セリン側鎖のァシル 基は必ずしも直鎖アルカノィル基である必要がないことが明らかになつ た。
さらに、 化学的安定性が期待できる 3位セリンあるいはシスティンを ォクチル化したエーテルおよびチォエーテル体の EC5D値が、それぞれ 1.2 nM、 5.4 nMに保持されたことより、 3位アミノ酸残基側鎖は必ずしもァ シル基である必要はないことが明らかになった。
また、 3 位を Ser(Bzl) 〔ヒトダレリンの 3位セリンをベンジル化 (_CH2Ph)した誘導体〕、 あるいは Cys(Trt) 〔ヒトダレリンの 3位セリン をシスティンに置換しトリチル化 （_C(Ph)3) した誘導体〕 に置換したグ レリンも、 E (^値がそれぞれ 7.6 nM、 20 nMであり、 C a上昇活性が保 持された （第 1 3表、 化合物 67、 68)。
(2) 活性領域の検索
カルボキシル末端部を含むグレリン （ 1 6— 28) に細胞内 C a上昇 活性が比較的低い （EC5。〉10， 000 nM) こと、 一方で、 ァミノ末端部を含 むヒトダレリン （1— 1 5) とラットヒトダレリン （1— 1 5) の EC50 値がそれぞれ 7. OnM、 8.6 nMと細胞内 C a上昇活性が保持されたことか ら、 グレリンの活性部位はァミノ末端部分に存在することが明らかとな つた （第 7表）。
第 7表
グレリン誘導体の活性 4
Figure imgf000128_0001
また、 ダレリン （ 1一 1 5) において、 ヒト型とラット型の活性がほ ぼ同等であることから、 1 1位と 1 2位のアミノ酸残基 （ヒトではーァ ルギニル—バリル—、 ラットでは—リジルーァラニル—） はこれらのァ ミノ酸に限られない。
このようなヒトダレリン、 あるいはラットグレリンで得られた構造活 性相関の結果は、 それぞれラットグレリンあるいはヒトグレリンに適用 できる。 また、 14位のグルタミンを除去した [デス-グルタミン14]-ラットグ レリンに、 ラットダレリンと等しい C a上昇活性 （EC5。=1.5 nM) が認め られたことより、 グレリン分子の中央部のアミノ酸が欠損していてもよ い。
(3) ペプチド鎖長とカルボキシル末端への塩基性基の導入 活性が比較的強くみられたダレリン （ 1— 1 5) をもとに、 適宜カル ボキシル末端側アミノ酸残基を欠損させた誘導体を作成し活性を評価し た。
カルボキシル末端がカルボン酸である短鎖誘導体と力ルポキシル末端 がアミド化された短鎖誘導体の活性を第 8表に示した。
第 8表
ダレリン誘導体の活性 5
Figure imgf000130_0001
ダレリン （ 1 — 3 ) アミ ドの C a上昇活性は比較的低かった （EC50 >10, 000 nM)o フエ二ルァラニンを延ばしたダレリン （ 1— 4) では EC50 値が 480 nM、 そのカルボキシル末端アミド体が 160 nMと C a上昇活性 が顕著となった。
さらにロイシンアミドを付加したダレリン （ 1— 5 ) アミド体の活性 は、 （ 1— 4 ) アミド体のさらに約 2 6倍上昇し（EC5()=6. 2 nM)、 天然品 と同レベルの C a上昇活性を示した。
最も強い C a上昇活性は、 ダレリン （ 1— 7 ) アミド体においてみら れ、 その EC5Q値は 2. 6 nMと天然品とほぼ同等であった。
以上の結果から、 グレリン活性発現のために必須な構造的要因はアミ ノ末端部 4残基の配列に集約されるが、 5位にロイシンなどの残基が付 加されることで、 グレリン受容体への親和性、 あるいはシグナルトラン スダクシヨンが劇的に向上するため、 5位にロイシンなどの残基が付加 されることが好ましい。
また、 上記結果から明らかなように、 カルボキシル末端カルボン酸を アミド化することにより C a上昇活性が上昇する傾向がみられた。
例えば、 ダレリン （ 1— 9 ) では、 アミド化することで EC5C値が 38 nM から 5. 4 nM と C a上昇活性が約 7倍、 グレリン （ 1— 4 ) では EC50値 が 480 nMから 160 nMと C a上昇活性が約 3倍に上昇した。 また、 ダレ リン （1 一 9 ) アミドの 9位塩基性残基ヒスチジン残基を除去したダレ リン （1— 8 ) アミドでは、 EC50値が 5. 4 nMから 13 nMとなり C a上昇 活性が低下し、 一方で、 酸性アミノ酸である 8位グルタミン酸を除去し たダレリン （ 1— 7 ) アミドでは、 逆に EC5。値が 13 nMから 2. 6 nMと なり C a上昇活性が上昇した。
アミド化の効果の一つはカルボン酸の負電荷の中和であり、 上記の結 果は、 短鎖誘導体において力ルポキシル末端アミノ酸の塩基性が活性上 昇に大きく寄与することを示すものである。
この結果を踏まえ、 高い活性が得られたダレリン （1— 7 ) アミドを 中心に、 力ルポキシル末端部に塩基性を付与した誘導体を作成し、 活性 を調べた。
結果を第 9表に示した。
第 9表
グレリン誘導体の活性 6
Figure imgf000132_0001
ダレリン（ 1— 5)のカルボキシル末端部にリジンを導入した [リジン 6]—ダレリン （ 1— 6) アミドの EC5„値は、 4.8 から 12 nM となり、 C a上昇活性は若干低下したが、 ダレリン （ 1— 4) では、 カルボキシ ル末端にリジンを付加することで、 EC5。値が 480 nMから 10 nMとなり、 C a上昇活性が約 50倍上昇した。 また、 グレリン （1— 7) のカルボキ シル末端部にアルギニンあるいはリジンを付加したアミド誘導体の活性 は、 グレリン （ 1— 7) アミド （EC5。=2.6 nM) と比べ、 いずれも 1.1 nM と極めて強い細胞内カルシウム上昇活性を示した。
以上、 ほとんどのケースにおいて、 カルボキシル末端部における酸性 のマスキングおよび塩基性基を導入することで、 活性が上昇することが 明らかになった。
(4) ァミノ末端グリシンと 2位セリン残基
活性が認められたグレリン （ 1— 7) アミド （EC5。=2.6 nM) 〔第 8表 化合物 2 9〕、 あるいはグレリン （1— 9) アミド （EC5。=5.4 nM) 〔第 4 表 化合物 3〕 をもとに、 ァミ 末端グリシンと 2位セリンの活性への 影響を調べた。
結果を第 1 0表にまとめた。
第 1 0表
グレリン誘導体の活性 7
Figure imgf000133_0001
ァミノ末端のアミノ基をブロックした Na—ァセチル―グレリン （ 1 -10) の活性が比較的弱くなつた。 （EC5。〉10， 000 nM)。 また前述したよ うに、 [Να—ォクタノィル，セリン3]-グレリン （ 1— 9) アミド（第 1 表 化合物 6)の活性も比較的弱くなつたことから （EC5()>10, 000 ηΜ)、 ァミノ末端のアミノ基がブロックされていないことが C a上昇活性発現 において好ましい。
一方で、 ァミノ末端のグリシンと 2位セリンを、 2残基長に相当する 5—ァミノ一 /3ペンタン酸 （NH2- (CH2)4- C0- ) で置換した、 Na—ァミノ ペン夕ノィルーダレリン （3— 7 ) アミドの C a上昇活性はほぼ保持さ れたこと （EC5。=3. 4 nM)、 および 2位セリンを欠損させた [Ν α—グリシ ル]—ダレリン（3— 7 )アミドの C a上昇活性が低下すること（EC5Q=380 nM)、 ァミノ末端にチロシン残基を付与した 1 -チロシル] -ラットグレリ ンの C a上昇活性がに低下すること（EC5()= 1 20 nM)などから、 より強い活 性を得るために好ましいァミノ末端アミノ基の位置は、 3位のォクタノ ィルセリン残基からアミノ酸残基で 2残基相当分、 ァミノ末端方向に存 在することが好ましい。
また、 ダレリン （ 1— 7 ) アミドにおいて、 2位セリンをロイシン、 グリシン、 ヒスチジン、 リジンに置換した誘導体の EC5。値は、 それぞれ 42 nM, 78 nM、 35 nM, 24 nMとなり、 グレリン （1— 7 ) アミドと比べ、 C a上昇活性がやや低下した。
本結果から 位セリン残基- NH-CH (CH20H) - CO-がァミノペンタン酸の 部分構造- CH2-CH2_CO-に置き換えることができることから、 少なくとも 2位セリン残基はグレリンァミノ末端のアミノ基を 3位ォクタノィル基 から一定の距離を保つスぺーサ一的な役割を果たしている。 また、 5— ァミノペンタン酸の置換で活性が保持されたのは、 アルキルアミン構造 の導入によってァミノ末端の塩基性が上昇したからでもある。
以上まとめると、 ァミノ末端部のダリシン残基はそのアミノ基をもつ て、 ダレリン分子のァミノ末端に塩基性を与え、 ダレリンの活性を発現 せしめていると考えられるため、 ァミノ末端部のアミノ基はブロックさ れていないことが好ましい。
また 2位セリン残基はァミノ末端アミノ基を 3位ォク夕ノィル基から 一定の距離を保つスぺーサー的な役割を果たしていると考えられるため、 比較的嵩の小さい側鎖を有するアミノ酸や非アミノ酸化合物で置き換え てもよい。 即ち、 ダレリン分子においてァミノ末端アミノ基を基点にォ クタノィル基の位置が規定されており、 この位置関係がグレリン活性構 造の一部を形成している。
すなわち、 2 位アミノ酸側鎖は嵩高い構造よりは、 むしろセリン、 ァ ラニン、 ノルパリンのように、 側鎖が比較的小さく、 近隣残基の自由度 を束縛しないアミノ酸残基が好ましい。 加えて、 N a—ァミノペンタノ ィルーダレリン （3— 7 ) アミ ドの C a上昇活性が、 ほぼ保持された (EC5。=3. 4 nM) ことから、 2位セリンは非アミノ酸化合物に置換可能で ある。
( 5 ) 3位、 および 4位アミノ酸残基の光学活性
ダレリン （ 1 一 7 ) アミドの構造をもとに、 3位セリンと 4位フエ二 ルァラニンをそれぞれ L—体から D—体に変換した誘導体を作成し、 3 位と 4位アミノ酸の光学活性の活性に及ぼす影響を検討した。 具体的に は、 良好な活性が保持された [セリン3 (ォクチル） ] -ダレリン （1— 7 ) アミド （EC5。=5. 8 nM) 〔第 1 1表 化合物 5 0〕、 あるいは [システィン3 (ォクチル） ] -ダレリン （1— 7 ) アミド （EC50=7. 4 nM) 〔第 1 1表 化 合物 4 8〕 をもとに 3位セリンと 4位フエ二ルァラニンを、 それぞれ対 応する L一体、 D—体に置き換えた誘導体を作成した。
結果を第 1 1表にまとめた。 該結果より、 3位と 4位のアミノ酸はと もに L一体であることが好ましい。
第 1 1表
グレリン誘導体の活性 8
Figure imgf000136_0001
( 6 ) 3位側鎖の結合様式
3位の側鎖鎖長がダレリン鎖長（_CH2- 0- CO-C^ 5)と同じになるように、 本来のエステル結合を、 逆方向のエステル （化合物番号 54)、 アミド （化 合物番号 55， 56)、 ジスルフイ ド （化合物番号 57)、 メチレン （化合物番 号 58) に置換した誘導体を作成した。 あわせて、 /3炭素上に立体障害を もつエステル誘導体 （化合物番号 59、 60)、 メチレンが 3ユニット分延び た形のアミド誘導体 （化合物番号 61 ) を作成した。 結果を第 1 2表にま とめた。
第 1 2表
グレリン誘導体の活性 9
Figure imgf000137_0001
3位側鎖をすベてメチレン基に置きかえた化合物 58 の活性が最も強 く、 EC5„値は 1 nM以下であった。 その他、 結合の種類によって活性の高 低は多少みられるものの、 3位アミノ酸側鎖に結合様式は活性に大きな 影響を与えないことが確認された。
( 7 ) 3位側鎖の疎水性
3位の Ser (Oc t anoyl)基を、 天然アミノ酸を中心に、 疎水性アミノ酸で 置換した誘導体を作成し、 それらの活性を調べた。 結果を第 1 3表にまと めた。 第 1 3表
ダレリン誘導体の活性 1 0
Figure imgf000138_0001
3位にトリブトファン、 シクロへキシルァラニン、 ナフチルァラニン のような芳香族性の疎水性アミノ酸を有する誘導体の EC5。値は、 それぞ れ 31 nM, 19 nM, 8. 2 nMであり、 C a上昇活性は保持された。 意外にも フエ二ルァラニンを 3位に導入すると幾分 C a上昇活性は低かったが、 疎水性を上昇させた Ser(Bzl), Cys(Trityl)を 3位に導入しても、 同様 に C a上昇活性は保持されたことから、 3位側鎖の疎水性は活性発現に より好ましいことが確認された。
一方、 3位にロイシン、 イソロイシン、 ノルロイシン、 バリンのよう な脂肪族性の疎水性アミノ酸を導入すると、 芳香族性アミノ酸を導入し た場合と比べ、幾分低目ではあるが、全般に C a上昇活性は保持された。 ノルロイシンを 3位に有する化合物 73の活性が EC5()= 2, 800 nMである のに対し、 ノルロイシン側鎖にァミノ基が付加した 6 -ァミノ-ノルロイ シン （リジン；化合物 72) の活性は EC5„値が 120 nMと上昇しているこ とは、 前述した力ルポキシル基末端において塩基性であることが好まし いのと同様に、 3位側鎖においても塩基性の付与が好ましいことが確認 された。
(8) 短鎖グレリン誘導体
ダレリンの活性はァミノ末端部 1— 4で顕著に発現し、 5 位に口イシ ンを付加することで増強されること、 3 位アミノ酸残基は疎水性側鎖を 有するものが好適であること、 塩基性残基の導 λが活性を上昇させるこ と、 及び 1位と 2位のアミノ酸残基は δ—アミノ酸などの 2残基相当長 の非アミノ酸化合物で置換されうることなどの結果から、 第 14または 1 5表の化合物番号 76から 87に示すように、 ァミノ末端部 （ 1一 5 ) 配列を基本にした種々の短鎖グレリン誘導体を作成してそれらの活性を 調べた。 結果を第 1 4または 1 5表にまとめた。
なお化合物 80 は既知である （Ipamorerin； K. Raum ら、 Eur. J. of Endocrinol. , 139巻、 552〜561へ。-シ'、 1998年）。 第 1 4表
グレリン誘導体の活性
Figure imgf000140_0001
既知である化合物 80の C a上昇活性が 2. 5 nMと高かったことから、 化合物 80における 3位の 2-D-ナフチルァラニンを D-ォクチルセリンに 置換した化合物 79の活性を調べたところ、 EC5()値は 38 nMであり、 活性 は保持された。 1位と 2位のアミノ酸構造が異なるが、 化合物 79と同様 に D-ォクチルセリンと D-フエ二ルァラニンを 3位と 4位に有する化合物 77の活性が 1 , 600 nMに低下したことを併せて考えると、 1位と 2位に対 応するアミノ酸の配列または構造が、 活性発現に重要な 3位と 4位のァ ミノ酸側鎖の立体配置にも影響を与えている。
即ち、 1， 2位をァミノペンタン酸に置換した場合、 3位の 2- D-ナフチ ルァラニンと 4位 D-フエ二ルァラニンを、それぞれ対応する L-アミノ酸 に置換しても活性は 34 nMに保持された （化合物 78) ことなどから、 グ レリンの 1位と 2位のアミノ酸配列、 Gly-Serは 3位と 4位に L—立体配 置を要求するが、他のアミノ酸配列、例えば、 Aib-His等の導入により 3， 4位が!)-立体配置でも活性が顕著となる。 または、 1， 2位にアミノペン タン酸を導入することで 3， 4位は L- , D-いずれの立体配置でも活性発 現がみられることが確認された。
第 1 5表
グレリン誘導体の活性 1 2
Figure imgf000141_0001
ダ レ リ ンのァ ミ ノ 末端部 （ 1 — 5 ) 配列を基本 に した [^-Aminopentanoyl, Ser3(0ctyl)]-Ghrel in(3- 5)を用い、 カルボキシル 基末端部の構造活性相関を調べた。 5位ロイシンの力ルポキシル基末端 をアミド、 メチルアミド、 ェチルアミド、 ベンジルアミドで修飾したと ころ、 活性は保持されたが、 EC5。の値がそれぞれ、 11 nM, 12 nM, 22 nM, 98 nM と次第に低下する傾向が見られた。 一方、 ェチルアミドをァミノ ェチルアミ ドとすることで、 EC5Qが 3.5 nM と活性は上昇したことより、 グレリン分子において力ルポキシル基末端部に塩基性を付与することが 好ましいことがわかった。
これら種々のカルボキシル末端アミド誘導体は、 生体内でカルポキシ ぺプチダーゼ類による酵素分解に抵抗することからも有用な化合物であ る。 同様に、 N-メチルアミノ酸を含む化合物 86 (EC50= 86 nM) も酵素 抵抗性を有する点で有用な化合物である。 実施例 1 2 ラットにおけるダレリン誘導体の GH放出活性
( 1) ラッ卜における各種長鎖ダレリン誘導体の GH放出活性
ネンブタール麻酔下の IGS-SD 系ラット （約 7 週齢） に化合物 17 ; CSer3(0ctyl)]-hGhrelin を 18 nmol/kg 、 ィ匕 合 物 18 ； [Cys3 (Octyl)]- rGhrelinを 30 nmol/kg,化合物 65; [2-LNal3]-hGhrel inを 100 nmol/kg, あるいは化合物 15； [Ser3(3-Phenylpropinyl)]- hGhrelinを 18 nmol/kgを急速静脈内投与した （各 n=3)。 投与 15分後に血漿を採取 , し、 GH濃度をラジオィムノアツセィ法（Biotrak/Amersham社） にて測定 した。 コント口-ルとして、 0.2¾ゥシ血清アルブミン （BSA) -生理食塩液、 と それぞれ 6 nmol/kgの rGhrelin, hGhrelin, 80 nmol/kgの Ipamorel in (化 合物 80)を投与し、 投与後 15分の血漿中 GH濃度を比較した （各 n=3)。 結果を第 1 3表に示した。 化合物 17 ; [Ser3(0ctyl)]-hGhrelin、 化合 物 18 ； [Cys3 (0ctyl)]-rGhrel in お よ び 化 合 物 15 ； [Ser3(3-PhPrl)]-hGhrelin はいずれも強い GH 放出活性を示し、 [2-LNal3]-hGhrelinの GH放出活性も細胞内 Ca上昇活性と良い相関が見 られた。
第 1 6表
各種長鎖ダレリン誘導体の GH放出活性
Figure imgf000143_0001
(2) [Cys3(0ctyl)]-rat Ghrein投与による血漿中 GH濃度推移 ネンブタール麻酔下の Wistar系ラット雄（約 260—280 g)に、化合物 18； [Cys(Octyl)]- rat Ghrelin を 5// g/head静脈内投与したときの、 血中 に放出される GHを測定した。コントロールとして生理食塩水、および rat Ghrelin (5/ι g/head) を投与し、 本品と比較した。
第 1 7〜 1 9表に示すように、 [Cys3(0ctyl)]- rat Ghreinの GH分泌促 進活性は、 分泌された GHの Cmaxが天然型ラットグレリンと同等 （ともに 約 1， 100 ng/ml) であり、 さらに分泌時間を延長させる傾向を示した。 本 品の細胞内 Ca上昇活性は EC5fl値で 5.4 nMであった。
第 1 7表
[Cys3(Octyl)]-rat Ghrein投与による血漿中 GH濃度推移
[Cys(C18) 3] 時間
-ラットク'レリン (分）
5 g/head 0 5 10 15 20 30 60 血漿中 個体 1 377 338 687 927 900 469 98
GH濃 個体 2 101 294 258 300 358 245 86 度 個体 3 59 476 949 1229 1417 704 133
(ng/mL個体 4 33 530 959 1451 1299 800 220
) 個体 5 32 613 1060 1561 1359 726 122 平均 120 450 783 1093 1067 589 132 土標準偏差 ±146 ±133 ±324 土 506 土 445 ±229 ±53 第 1 8表
生理食塩液投与による血漿中 GH濃度推移
生理食塩液 時間 (分）
0 5 10 15 20 30 60 血漿中 個体 1 0 88 129 133 116 107 430
GH濃 個体 2 204 122 118 134 128 69 36 度 個体 3 77 0 0 0 0 0 11
(ng/mL個体 4 0 0 0 0 48 27 110
) 個体 5 0 0 0 0 0 0 210 平均 56 42 49 53 58 41 159 土標準偏差 ±89 ±58 ±67 ±73 ±61 ±47 ±170
第 1 9表
ラットグレリン投与による血漿中 GH濃度推移
ラツ卜ク レリン 時間 (分）
5 g/head 0 5 10 15 20 30 60 血漿中 個体 1 143 186 425 405 215 56 3
GH濃 個体 1 10 1396 2028 1566 876 242 27 度 個体 3 838 163 443 681 419 120 36
(ng/mL 個体 4 348 556 1387 1469 1293 663 100
) 個体 5 0 875 1380 1009 1414 452 20 平均 268 635 1 133 1026 843 306 37 土標準偏差 ± 348 士 517 ± 690 土 498 土 525 ± 250 ± 37 実施例 1 3 ダレリンの食欲増進作用
( 1 ) 脳室内投与による食欲増進作用
各種濃度のラットグレリンを溶解した生理食塩水を、 体重が 300 gか ら 325 gの雄ウィスター （Wistar) 系ラット （一群は 16から 20頭） に、 朝 8時 45分に脳室内投与した。対照は、 グレリンを含まない生理食塩水 を脳室内投与した。 投与後は自由に摂餌させ、 投与後 2時間の摂餌量を 測定した。 第 6図に示すように、 50 pmol の脳室内投与で摂餌量の増加 が認められ、 200 pmolおよび 500 pmolでは投与量依存的に摂餌量の増 加が認められたが、 2 nmolの投与では摂餌量の増加は低下した。 通常ラ ットは夜間に摂餌するから、 朝は満腹で殆ど摂餌しないが （第 6図で対 照とした生理食塩水を参照）、グレリンの脳室内投与によって食餌量が増 加したことは、 ダレリンに食欲増進作用があることを示している。
( 2 ) 静脈内投与による食欲増進作用
9ヶ月齢、 雌の SD (Sprague-Dawl ey) 系ラット （5頭） および ウイ スター 系ラット （4頭） に、 ラットグレリン 50 ; g/kgを尾静脈内投与 し、 投与後 2時間の摂餌量を測定した （夕方 16 : 00〜 19 : 00に評価）。 第 2 0表に示したように、 別の日の同時刻、 同一個体について調べたラ ットグレリン非投与時の摂餌量に比べて、 グレリンの静脈内投与によつ て、 摂餌量が明らかに増加した。 すなわち、 ダレリンの静脈内投与によ つても、 食欲増進作用があることが示された。
第 2 0表
Figure imgf000146_0001
実施例 1 4 . グレリンによる胃機能の亢進
グレリン投与による、 胃機能への効果を調べるために以下のような実 験を行った。 雄性の SD系ラット （体重 200〜280g、 7〜8週齢） を実験 の 20時間以上前から絶食して用いた。 ラットはウレタン （1.25 g/kg) の 腹腔内投与により麻酔し、 加温パッドおよび加温ライトを用いて保温し た。 気管内力ニューレを揷管し、 さらに食道を絹糸にて結紮して、 下記 の胃酸分泌あるいは胃運動測定用の手術を施した。 覚醒下の実験は、 ェ 一テル吸入による軽度麻酔下に下記の胃酸分泌あるいは胃運動測定用の 手術を施した。
ウレタン麻酔下での胃酸分泌の実験は、 Ohnoらの方法 〖0hno, T. , e t a l . , Jpn. J. Pharmacol. 43, 429-439 ( 1 987) ] に従って手術を行つ た。 つまり、 仰臥位に腹部を正中切開し、 胃および十二指腸を露出させ た。 ポリエチレンチューブを前胃部から揷管し急性胃瘻を作製した。 も う 1本のポリエチレンチューブを十二指腸部の切開により胃内に挿入し， 幽門部周囲を結紮して固定した。胃内をリザーバー内で pH 7.0に調整し、 37 に加温した生理食塩水で灌流した。流速は l.O ml/minとした。 pH固 定装置 （Hiranuma, Comitite-8) と 100 mMの NaOH液を用いて灌流液が pH7.0 になるように滴定した。 基礎胃酸分泌量が安定していることを確 認した後、被験薬を静脈内投与し、胃酸分泌速度を 5分間隔で測定した。 各群 4例の動物を用いた。
覚醒下の実験では、 エーテル吸入による軽度麻酔下に同様の手術を施 した後に、 側腹部に小切開を加えて灌流用チューブを体外に導出した。 露出した胃および十二指腸を腹腔内に収め、 切開部を縫合し、 ポールマ ン型のラット用固定ケージ内に動物を伏臥位に拘束し、 麻酔から覚醒し たことを確認して実験に供した。 なお、 食道を結紮したが、 気管カニュ ーレは挿入しなかった。
ウレタン麻酔下での胃運動測定実験は、 Takeuch i & Nobuhara の方法 [ Takeuch i , K. and Nobuhar a, Y. , Diges t i ve Diseases and Sciences 1 181 - 1 1 88 (1 985) ]に従って、 ミニチュアバルーン法を用いた。 すなわ ち、 水を充填したバルーンと支持用カテーテルを前胃部切開にて胃の中 に挿入した。 胃の腺部分に横たわるように固定し、 カテーテルの一端を 圧トランス ·デューサー （日本光電株式会社製、 LPU-0.卜 350-0- 1 1 ) に 接続した。 胃運動が安定していることを確認した後、被験薬を 60分間隔 で累積的に静脈内投与した。 胃運動は 20 cmH20 以上の振幅を持つ収縮 運動の胃内圧振幅と収縮反応数を 10分間隔で測定した。各群 4例の動物 を用いた。 覚醒下の実験では、 エーテル吸入による軽度麻酔下に同様の 手術を施した後に切開部を縫合し、 ポールマン型のラット用固定ケージ 内に動物を伏臥位に拘束し、 麻酔から覚醒したことを確認して実験に供 した。
ラットグレリンおよびヒスタミン 2塩酸塩は生理食塩水に溶解し、 尾 静脈内に 1 ml/kgの容量で投与した。 ダレリンの作用に迷走神経活動が 関与するか否かを調べるために、グレリンの投与 30分前に硫酸アトロピ ンを皮下投与するか、 あるいは類部迷走神経束を両側性に切断した。 さ らにグレリンの作用におけるヒスタミン H2受容体の関与を調べるため には、 グレリンの投与 30分前にファモチジン （ガス夕一 ®、 山之内製薬 株式会社製） を皮下投与した。 結果は平均値土標準誤差値で表した。 統 計学的解析は Dunnettの多重比較法を用いて行った。 P値 <0.05 を統計 学的有意と判定した。
第 7 A図および第 2 1表に示すように、 ウレタン麻酔下においてラッ トグレリンを 0. 8〜20 i g/kgの用量で静脈内投与すると、 用量依存的に 胃酸分泌が促進した。
麻酔下では、 ダレリン投与前には胃の自発運動はほとんど認められな い。 その状態でラットグレリンを 0. 8〜20 g/kgの用量で静脈内投与す ると、 第 8 A、 B図および第 2 1表に示すように、 胃運動の振幅及び頻 度ともに亢進した。 これらの反応はラットダレリンの投与後、 速やかに 認められた。 20 ^ g/kgの投与時は、 胃酸分泌は増大し、 20分以内に最大 値に達した後、投与後 90分までには徐々に減衰した。 ラットグレリンの 20 // g/kgによる胃酸分泌促進作用の最大反応の大きさは、 第 7 A、 B図 に示すように、 ヒスタミン 3 mg/kgを静脈内投与したときに惹起される 反応にほぼ匹敵するものであった。 胃運動の振幅に対する亢進作用は、 各用量とも 10分以内に最大反応に達し、 20 / g/kg投与時は 50分後まで に徐々に減衰した。 さらに、第 2 1表に示すように、 ラットグレリンの 20 g/kg投与で惹 起される胃酸分泌促進作用はアト口ピンあるは両側類部迷走神経切除術 の前処置によってほぼ完全に抑制され、 ヒスタミン H2受容体拮抗薬であ るファモチジンを 1 mg/kg皮下投与する前処置では全く影響されなかつ た。 また、 ラットグレリン投与で惹起される胃運動亢進作用もアトロピ ンあるは両側類部迷走神経切除術の前処置によって完全に抑制された。 このことから、 ダレリンの胃機能亢進作用は、 ヒスタミン系機序による ものではなく、 迷走神経系を活性化すことによるものであることが確認 された。
一方、 覚醒下ラットにおいても、 上記ウレタン麻酔下と同様に、 ラッ トグレリン （4および 20 g/kg) を静脈内投与すると胃酸分泌が促進し た。 また、 覚醒下ラットでは麻酔下に比べて被験薬投与前から胃の自発 運動が発生しており、 その状態にラットグレリンを 0. 8〜20 g/kgの用 量で静脈内投与しても、 胃運動は振幅および頻度ともに亢進した。 以上 の結果から、 ウレタン麻酔下及び覚醒下のいずれにおいても、 グレリン の静脈内投与によって胃酸分泌の促進および胃運動の亢進が起こること が確かめられた。
第 21表
Figure imgf000150_0001
表中の記号は、 以下を示す c
* 1 p < 0. 0 1 * 2 p < 0. 0 5 * 3 ρ< 0. 0
NT 未試験 実施例 1 5. グレリンおよびグレリン誘導体の細胞増殖促進作用 グレリン投与による細胞増殖促進作用を調べるために以下の実験を行 つた。 ラットグレリンあるいはチォエーテル型ラットグレリン （化合物 18 [Cys3 (octyl)]- hGhrelin) 20/zg/kgを ウィスター系雄性ラット（7.5 週齢） の尾静脈内に投与した。 投与 17 時間後に 3H-チミジン (3H-thymidine) を尾静脈内投与し、 その 1 時間後に十二指腸、 空腸お よび骨髄を摘出した。 これら組織中の 腿 画分への 3H-チミジンの 取 込み量を測定し、 グレリンおよびグレリン誘導体の細胞増殖促進作用を 調べた。 組織を細切後にポリ トロンホモジェナイザーでホモジェネート し、 その遠心上清をトリクロ口酢酸で沈澱させ、 DNA 画分を取得した。 DNA 画分の放射能を液体シンチレーションカウン夕一にて測定した。 第 2 2表に示すように、 ラットグレリンあるいはチォェ一テル型ラッ トグレリンの静脈内投与により、 これらの組織中あるいは臓器中の DNA への 3H-チミジン取込みが促進したことから、 ダレリンは十二指腸、 空 腸および骨髄での細胞増殖促進作用を示すことが確認された。
グレリン静脈内投与後の細胞増殖促進作用のタイムコースは、 GHRH (成 長ホルモン放出ホルモン） 投与によるものと同様であり、 ダレリンの細 胞増殖促進作用は主に下垂体から分泌される GH (成長ホルモン） を介す るものと考えられた。 GH分泌調節を生理的な因子であるグレリンに担わ せることは生体調節にとって無理がなく、 GH で問題となっている副作 用も少ないと考えられた。
第 2 2表
Figure imgf000151_0001
数値は比較例（生理食塩水投与群）の 3例の平均値を基準とした時の 放射能の取り込み量の比率 （％) で示した。 実施例 1 6 抗グレリン抗体によるグレリンの定量
ラットグレリンのァミノ末端側および力ルポキシル末端側のペプチド を抗原として作成された抗体を用い、 ラジオィムノアッセィ （RI A) によ つて各種生体組織中のグレリンを定量した。 [C-Cys] -ラットグレリン [卜 1 1 ] (ラットグレリンのァミノ末端側の 1 から 1 1番目までのアミノ酸配列を有するペプチドの力ルポキシル末端 にシスティンが結合したぺプチド） および [C-Cys] -ラッ トグレリン [13-28] (ラットグレリンのァミノ末端側の 13から 28番目までのァミノ 酸配列を有するペプチドのカルボキシル末端にシスティンが結合したぺ プチド） を抗原として、 ゥサギを免役して N端側抗体 （抗 [C-Cys] -ラッ トグレリン [1 -1 1]抗体） と C端側抗体 （抗 [C- Cys] -ラッ トダレリン [13- 28]抗体） を作成した。
第 9 a図に示すように、 放射能標識したラットグレリンと N端側抗体 の結合において、 ラットグレリンの I C50 (半阻害量） は、 反応液あたり 3. 1 fmo lであった。 この N端側抗体は、 化学合成したヒトグレリンおよ びラットダレリンと 100 %交差反応性を示したが、 3位のセリンが n-へ キサノィル基で修飾された n-へキサノィル ·ラットグレリンおよび 3位 のセリンが n-デカノィルで修飾された n-デカノィル ·ラットグレリンと は、各々、 0 . 3 %および 2 0 %しか交差反応性を示さなかった。 また、 N端側抗体は脂肪酸を脱離したダレリンとは全く反応しなかった。
ラットダレリン （2 8アミノ酸）、 ヒトダレリン （2 8アミノ酸） およ びヒトゃラットなどから見出されたダレリン -27 ( 27 アミノ酸からなる ダレリン） に対して、 N端側抗体は同等の親和性を示した。 従って、 N 端側抗体は 3位セリンが n-ォク夕ノィル基で修飾された天然型グレリ ンを特異的に認識することが確認された。
第 9 b図に示すように、 放射能標識したラットグレリンの C端側抗体 に対する結合において、 n-ォク夕ノィル基で修飾された天然型ラットグ レリンおよび n-ォク夕ノィル基が脱離したラットグレリンの IC50は、 反応液あたり 44 imo lで同等であった。 すなわち、 脂肪酸修飾されたグ レリンにも脂肪酸が脱離したグレリンにも同等の親和性を示すことが確 認された。
以上の結果を基に、 生体内各組織に存在するダレリンについて、 N端 側抗体によって 3位セリンが n-ォク夕ノィル基で修飾されたグレリン を定量し、 C端側抗体によって脂肪酸修飾されたグレリンおよび脂肪酸 が脱離したグレリンの両方を定量することができることが判った。 第 2 3表は、 実際に生体各組織の脂肪酸修飾されたグレリンの含量、 および脂肪酸修飾されたダレリンと脂肪酸が脱離したグレリン両方の含 量を調べた結果である。
第 2 3表
Figure imgf000153_0001
表中、 C— R I Aは、 C端側抗体を用いたラジオィムノアッセィ法によ る定量結果を表し、 N— R I Aは、 N端側抗体を用いたラジオィムノア ッセィ法による定量結果を表す。
また、 表中の数値は、 「値土標準偏差」 を表す。 実施例 1 7 半合成法による ratGhrelin(l- 28)の製造
合成スキーム
rGhrelin(6-28)と Ghrelin (卜 7)を、それぞれ遺伝子工学的手法と化学 合成法によって調製し、両 Ghrelin断片から rGhrelinを製造した例を示 す。
具体的には、 /3- galactosidase97S と rGhrelin(6- 28)の間に V8プロ テアーゼと KexII プロテアーゼの切断部位を有するアミノ酸配列 ( -QFE-SRHRR- ) を 有 す る 融 合 蛋 白 質 、 β -ga 1 ac t os i dase97S- (QFE-SRHRR) - rGhrel in (6-28)を大腸菌で発現させ た。本融合タンパク質を V8プロテアーゼ処理し、 SRHRR_rGhrelin(6-28) を切り出した。 次に、 SRHRR- rGhrelin(6- 28)の全アミノ基を Boc基で保 護した後、 KexII プロテアーゼ処理し、 新たに 6位 Serのァミノ末端ァ ミノ基が遊離した [Lys(Boc)ll l6 19'2()'24]-rGhrelin(6-28)を得た。 本保護 断片と化学合成法で得られた [TP- Boc]- rGhrelin (卜 5)-0Su とをフラグ メント縮合し、 得られた [Lys(Boc)ll l6 l9'2()'24]- rGhrelin を酸処理する ことで rGhrelinを製造した。
本実施例では rGhrelinの半合成例を示したが、ヒト型も本方法で合成 できる。
また、 本実施例ではフラグメント縮合を （1一 5) と （6— 28) で実施し たが、 例えば化学合成したアミノ末部断片（1— 2) , (1-3), あるいは（1 -7) と、 それぞれ 28位から 3位までの随意の長さを有する Ghrelinの カルボキシル末部断片との融合蛋白質を遺伝子工学的に作成した力ルポ キシル末部断片 （3— 28)、 （4一 28)、 あるいは （8— 28) との縮合などが 可能である。 化学合成の工数を軽減する場合、 （1— 2) と （3— 28) ある いは （1— 3) と （4— 28) での縮合が有利である。 また、 縮合によるラセ ミ化を完全に防止する観点からは 7位 Proを利用した（1一 7)と（8— 28) の縮合が特に好ましい。 発現べクタ一 pG97s rGRの構築と Ghrelin(6- 28)融合蛋白質の発現 rat Ghrelinの cDNA遺伝子配列に基づき、 アミノ酸配列 QFE- SRHRRを プレプロ領域に持つ rGhrelin(6- 28)の DNA断片を、全合成オリゴマ一を 用いてァニ—リング法により得た。
この DNA断片を pG97SnPPH34(特開平 9 - 2 9 6 0 0 0)に挿入するた め、 まず pG97SnPPH34を Sailおよび Smal処理により、 ヒト副甲状腺ホ ルモン前駆体遺伝子を欠失させた。 このものをアル力リホスファタ一ゼ 処理後、 先に Sail処理、 kinase処理を施した rGhrelin誘導体遺伝子断 片と T4 リガ一ゼにより連結させた。 連結したプラスミドを大腸菌 DH5 α株に形質転換し、 プラスミド pG97s rGRを得た。
得られた pG97s rGRを大腸菌 Μ25(ΟΛ 7 株に形質転換を行い、 得られ た形質転換株を 200mlの Terrific Bloth液体培地 （1.2% トリプトン、 2.4¾酵母エキス、 0. ^グルコース） 3本に接種し、 37でで振盪培養した。 菌体濃度が OD66。=0.8 になった時点でイソプロピル 卜チォ - /3- D-ガラ ク トビラノシド （ IPTG) を最終濃度 2mM になるように添加し、 rGhrelin(6-28)融合蛋白質を発現させた。 さらに 4時間培養後、 遠心分 離し、 菌体を回収した。 ラット Ghrelin(6-28)融合蛋白質の構成を以下 に示す。
ラット Ghrelin6- 28 融合蛋白質： （ 3— galactosidase-97S)— QFE— SRHRR— rGhrelin(6- 28) rGhrelin6-28 融 合 蛋 白 質 の プ ロ セ ッ シ ン グ と [SRHRR]- rGhrelin(6- 28)の精製
得られた菌体 20mlを TEバッファーに懸濁後、 French Pressにて菌体 破碎した。その後、 3000rpm、 15分の遠心分離で封入体を回収し、 10ml TE バッファー、 脱イオン水で再度懸濁し、 遠心分離することで封入体を洗 浄した。 OD66。の値が 50.0になるように封入体を脱イオン水で希釈し， Tris-HCl (pH8.2) を終濃度 50mMになるように加え、 尿素 （終濃度 3.5M) により封入体を溶解させた。 3(TCに保温した本溶液に、 rV8 プロテア一 ゼ誘導体 V8D5 (以下 V8D5と記す） （特開平 9- 47291) を終濃度 10/zg/ml になるよう添加し、 30 で 20分酵素処理を行った。 3%酢酸 （AcOH) を添 加して反応を停止させた。
切り出された [SRHRR]-rGhrelin(6-28)を含む V8D5 酵素反応停止液に 1.5倍量の脱イオン水を加え、 5NNa0Hを用いて pH5.0に調整し、 ）3ガラ クトシダーゼ誘導体断片を沈殿、 5000rpmで 10分間遠心分離して除去し た。
[SRHRR]- rGhrelin(6_28)を含む上清を、 0. TFAで平衡化した TSK- 0DS 80Tsカラム（粒径 20μπι、 50 mml. D. x 100mm, T0S0H社製）に添加した。 バッファー A [ 0.8ml/min, ァセトニトリル、 0.1 FA] 100%からバッ ファ一 B [ 50%ァセトニトリル、 0.0955KTFA ] 100%の濃度勾配を 5カラム 容量で完了するプロ グラムで溶出を行った。 目的ペプチ ド [SRHRR]-rGhrelin(6- 28)を含む画分を分取した (約 50mg)。
[Boc-SRHRR] - [Lys (Boc) "· ι6' 19' 20' 24] -rGhrel in (6-28)の調製
約 50 mg (15 mol) の [SRHRR] -rGhrel in (6- 28)を含む 50%ァセトニ トリル水溶液に、二炭酸ジ -t-ブチルを 6当量モル（19.2 mg, 6 x 15/zmol) 加え、 トリェチルァミンにて PH9に調整し、 室温で 15分放置した。 反応 液に終濃度 0.5¾になるように酢酸を添加し、 ァセトニトリルを留去した 後、 0.1% TFA を含 む 10%ァ セ ト ニ ト リ リレで平衡化 し た EMPORE-Octyl (C8)HD 4mm/lml cartridge に添加し、 平衡化液で洗浄後、 0.095% TFA を 含 む 90% ァ セ ト ニ ト リ ル で [Boc- SRHRR]- [Lys(Boc)11'16 ' 2 Q'"]-rGhrelin(6- 28)を溶出した。 ァセトニトリルを留 去し、 約 30 mgの目的物を含む溶液を 6mL得た。
質量分析の結果、 Boc 化前 （測定分子量 = 3 3 9 6、 理論上分子量 = 3 3 98) に比べ Boc化後では分子量が 500多くなつたもの （測定分子 量 3 3 9 5) と、 600 多くなつたもの （測定分子量 = 3 9 9 5) の 2種 類が主に見られた。
Kex2プロテア一ゼによる [Lys(Boc) i6 l9'2°'24]- rGhrelin(6-28)の切り 出しと精製
得られた [Boc-SRHRR]_[Lys(Boc)ll l6 l9'2° "]_rGhrelin(6-28)水溶液 (30mg, 6mL)に塩化カルシウム溶液、 Tris- HC1 H8.2 をそれぞれ終濃度
0.3mM, 20mMになるように添加した。 Kex2プロテアーゼ （特開平 1 0— 2 2 98 84) 溶液を lxlO5 uni t/mlになるように添加後、 30 、 60分 間プロテア一ゼ処理した。
HPLC上、 [Boc-SRHRR]― [Lys (Boc) "■ '6' 19' 20' 24] -rGhre 1 in (6-28)のピーク が消失し、 [Lys (Boc) "· 16' '9' 20' 24] - rGhrel in (6-28)のピークがより疎水性 側に現われ、 Boc- SRHRRに対応する親水性のピークが観察された。
原料消失を確認後、 反応液を酢酸水で PH3.5に調整し、 1%酢酸を含む
1. (^ァセトニトリルで平衡化した逆相クロマトカラム 0DS-80Ts(l.66cc カラム容積、 粒径 20um, T0S0H社製）に添加した。 平衡化液で 5カラム容 積で洗浄後、 酢酸を含む 1.0 ァセトニトリルから 90. (^ァセトニトリ ルへの濃度勾配を 5 カラム容積にて完了するプログラムを行い、 [Lys(Boc)11 16 l9'2()'24]- rGhrelin(6-28)を溶出させた。 主画分を凍結乾燥 し、 目的とする保護ペプチドを 6.2mg得た。 フラグメント縮合と脱保護
Ghrelin (卜 5) (190 mg, 0.0301 mmol, 化合物 3 1 )のトリフルォロェ 夕ノール （TFE) 溶液（6.00 ml)にトリエチルァミン（51.0 1, 0.366 匪 ol)、 二炭酸ジ- 1-ブチル（78· 0 mg, 0.0356 mmol)の TFE溶液（4.00 ml) を加え、 室温で 13時間攪拌した。 溶媒を減圧下留去し、 得られた残査に エーテル（20.0 ml) を加え、 r-Boc]- rGhrel in (卜 5)を 180.5 mg得 た。
次に、 [^a-Boc]- rGhrel in(l-5) (22.0 mg, 0.0301 mmol)の DMF (1.00 ml)溶液に H0Su(5.20 mg, 0.0452 mmol)を加えた後、 — 30で浴中 DIPCI (7.30 fi 1, 0.0466 mmol)を加えた。 — 30で浴で 1時間、 室温で 18時間 攪拌した後、溶媒を減圧下留去し、得られた残査をェ一テルで粉末とし、 Oa_Boc]- rGhrel in (卜 5)のサクシンイ ミ ドエステル体 T -Boc]- rGhrelin(l-5)-0Suを 14.1 mg得た。
次 に 、 リ コ ン ビ ナ ン ト 法 に よ り 調 製 し た [Lys (Boc) "· 16· 19· 2°· 24] -rGhrel in (6-28) (6.10 mg, 2.18 mo 1)の DMF (0.6 ml)溶液に、 C^a-Boc]- rGhrelin(l-5)-OSu(3.3 mg, 3.96 1)、 トリ ェチルァミン（2.5 H 1, 17.9 mol)を加え室温で 24時間攪拌した。 溶 媒を減圧下留去し、 得られた残査に氷冷下、 直接 TFA(2.00 ml)を加え、 室温で 1.5時間攪拌した。 TFAを減圧下留去した後、 残査にエーテルを 加え rGhrelin(l-28)を含む粗ペプチド 6.2 mgを得た。
本品を 5%酢酸 （AcOH) 2 mlに溶かし、 YMC-Pack- 0DS-A (5 am, 20 mm x 250 mm)に添加し、 0.1% トリフルォロ酢酸中、 ァセトニトリル 0¾から 95 までの 60分間直線グラジェント （流速： 10 ml/min) で溶出させた。 目的画分を分取後凍結乾燥し、 更に YMC-Pack PROTEIN-RP (C4, 10 mm x 250腿）に添加し、 0. トリフルォロ酢酸中、 ァセトニトリル 7.5%から 21.3%までの 30分間直線グラジェント（流速： 4.7 ml/min)で溶出させた。 目的画分を分取後、 凍結乾燥し、 更に YMC-Pack PROTEIN- RP (C4, 10 mm x 250mm)に添加し、 0.1% トリフルォロ酢酸中、 ァセトニトリル 7.5%か 21.3 までの 30分間直線グラジェント（流速： 4.7ml/min)で溶出させた。 目的画分を分取後、 凍結乾燥し、 rGhrelin(l-28)を 2.1 mg 得た。 rGhrelin(l-28)を 2.1 mg得た。 このものは、 分析用 HPLCにおいて標準 品の rGhrelin(l- 28)と保持時間が一致し、細胞内カルシウム上昇活性は EC5。=1.5nMと天然品と同等であった。
ESI-MS 3315.0 (理論値 3314.8), アミノ酸組成比： Ser; 3.74 (4), Glx; 5.69 (6), Gly ； 1.18 (1), Ala; 2.05 (2), Leu; 2, Phe; 0.98 (1), Lys; 4.98 (5)， His; 1.03(1), Arg; 1.96 (2), Pro; 4.01 (4)
化合物 8 7 [Dleu5]-rGhrelin(l-28)
また、 Boc]-rGhrelin(l- 5)のサクシンイミドエステル化、 あるい はフラグメント縮合時の副反応物として、 [Dleu5]_rGhrelin(l_28)が 0.8 mg得られた。 このものの細胞内カルシウム上昇活性は EC5C=220 nMであ つた。
ESI-MS 3315.0 (理論値 3314.8), アミノ酸組成比： Ser; 3.80 (4), Glx; 5.92 (6), Gly ； 1.23 (1), Ala; 2.07 (2), Leu; 2, Phe; 0.97 (1), Lys; 4.92 (5), His; 1.02(1), Arg; 1.97 (2), Pro; 4.11 (4)
D20/DC1 加水分解後のロイシンの GC- MS 分析 ： L-Leu: 1.17(1), D-Leu;0.83 (1) 産業上の利用可能性
本発明の新べプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩は、 人又 は動物に投与することによって GHの分泌を誘導し、実質的な副作用を伴 うことなく、小児の成長促進及び成人の GH欠乏により代謝機能の欠損を 改善する医薬として、そしてその抗体は GH欠乏により疾病の診断にさら には学術分野の研究ツールとして優れた作用効果を奏する。

Claims

請求の範囲
1. 細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するぺプチ ドの少なくともひとつのアミノ酸が、 修飾アミノ酸及び 又は非ァミノ 酸化合物により置換されていることを特徴とするぺプチド系化合物又は その薬学的に許容される塩。
2. (a) 配列番号 2記載のアミノ酸配列又は （b) 当該配列におい て少なくともアミノ末端から 4番目乃至 1 0番目までのアミノ酸配列を 有し、 かつ該アミノ酸配列以外の部分において、 少なくともひとつのァ ミノ酸が欠失、 置換及び 又は付加されたアミノ酸配列を含む請求の範 囲第 1項記載のぺプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
3. 配列番号 3、 4、 5、 8、 9、 1 0、 1 1、 1 2、 1 3、 1 6、 1 7、 1 8、 1 9、 22および 23記載のアミノ酸配列からなる群から 選択されるひとつのアミノ酸配列を有する請求の範囲第 2項記載のぺプ チド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
4. 配列番号 25、 26、 29、 30、 3 1、 32、 34および 3 5 記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を 有する請求の範囲第 2項記載のぺプチド系化合物又はその薬学的に許容 される塩。
5. 細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモン の分泌を誘導する活性を有するペプチドの （a) 構成アミノ酸が修飾され ているか又はされていない、 かつ （b) 少なくともひとつのアミノ酸が非 アミノ酸化合物により置換されているか又はされていないべプチド系化 合物又はその薬学的に許容される塩。
6. 配列番号 27、 28および 33記載のアミノ酸配列を有する請求 の範囲第 1又は 5項記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容され る塩。
7. (a) 配列番号 2記載のアミノ酸配列又は （b) 当該配列におい て少なくともアミノ末端から 4番目乃至 1 0番目までのアミノ酸配列を 有し、 かつアミノ末端から 4番目乃至 1 0番目までのアミノ酸配列以外 の部分において、 少なくともひとつのアミノ酸が欠失、 置換及び Z又は 付加されたアミノ酸配列を含む請求の範囲第 5項記載のペプチド系化合 物又はその薬学的に許容される塩。
8. 配列番号 3、 4、 5、 8、 9、 1 0、 1 1、 1 2、 1 3、 1 6、 1 7、 1 8、 1 9、 22および 23記載のアミノ酸配列からなる群から 選択されるひとつのアミノ酸配列を有する請求の範囲第 7項記載のぺプ チド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
9. 配列番号 25、 26、 29、 30、 3 1、 32、 34および 35 記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるひとつのアミノ酸配列を 有する請求の範囲第 7項記載のぺプチド系化合物又はその薬学的に許容 される塩。
1 0. ァミノ末端の 1番目から 4番目に至るまでのアミノ酸配列に相 当する部分が、 下記の式で表される請求の範囲第 1又は 5項記載のぺプ チド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
A-B-C-D- A；アミノ酸、 非アミノ酸化合物、 又はなし、
B ; アミノ酸、 非アミノ酸化合物、 又はなし、
(ただし、 A+Bの分子鎖長がジペプチド相当長ある。）
C又は D；同一であっても異なっていてもよく、 （a)修飾されたァ ミノ酸、 （>b) 疎水性側鎖を有するアミノ酸、 又は （c) 塩基性側鎖を有 するアミノ酸、
を表す。
1 1. Cが、 アミノ酸の α炭素に、 （a) 炭素数 1以上のアルキレン基 を介して又は介さず、 エステル、 エーテル、 チォエーテル、 アミドまた はジスルフィ ド結合を介して炭素数が 1若しくは複数の飽和若しくは不 飽和アルキル鎖、 又は （b) 炭素数 1以上の飽和若しくは不飽和アルキ ル鎖を導入した修飾アミノ酸であり、 Dが疎水性側鎖を有するアミノ酸 であることを特徴とする請求の範囲第 1 0項に記載のペプチド系化合物 又はその薬学的に許容される塩。
1 2. 配列番号 2、 3、 9、 1 0、 1 1、 1 6、 1 7、 22、 25、 26、 27、 28、 29、 30および 3 1記載のアミノ酸配列からなる 群から選択されるひとつのアミノ酸配列において、 ァミノ末端の 1番目 から 4番目に至るまでのアミノ酸配列に相当する部分が請求の範囲第 1 0または 1 1項に記載のぺプチド系化合物であるべプチド系化合物又は その薬学的に許容される塩。
1 3. 修飾されたアミノ酸がァミノ末端から 3番目のアミノ酸である 請求の範囲第 1、 2、 3、 5、 7または 8項記載のペプチド系化合物又 はその薬学的に許容される塩。
14. 修飾されたアミノ酸におけるアミノ酸がセリン又はシスティン であることを特徴とする請求の範囲第 1 3項記載のペプチド系化合物又 はその薬学的に許容される塩。
1 5. アミノ酸の α炭素に、 （a)炭素数 1以上のアルキレン基を介し て又は介さず、 エステル、 エーテル、 チォエステル、 チォエーテル、 ァ ミド又はカルバミド結合を介して炭素数が 1若しくは複数の飽和若しく は不飽和アルキル鎖、 又は （b) H又は炭素数 1以上の飽和若しくは不 飽和アルキル鎖を導入した修飾アミノ酸を含有する請求の範囲第 1、 2、 3、 5、 7または 8項記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容さ れる塩。
1 6. 修飾アミノ酸が、 アミノ酸の α炭素に、 （a) 炭素数 1以上のァ ルキレン基を介して又は介さず、 エステル、 エーテル、 チォエステル、 チォエーテル、 ジスルフィ ド、 アミド、 カルバミド又はチォカルバミド 結合を介して炭素数が 1若しくは複数の飽和若しくは不飽和アルキル鎖、 又は （b) 炭素数 1以上の飽和若しくは不飽和アルキル鎖を導入したァ ミノ酸である請求の範囲第 1、 2、 4、 5、 6、 7、 9、 1 0または 1 2項記載のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
1 7. エステル結合により修飾された修飾アミノ酸を有する請求の範 囲第 1、 2、 3、 5、 7または 8項記載のペプチド系化合物又はその薬 学的に許容される塩。
1 8. アミノ酸の側鎖の官能基がエステル結合を形成することにより 修飾された修飾アミノ酸を有する請求の範囲第 1、 2、 4、 5、 6、 7、
9、 1 0、 1 1または 1 2項記載のペプチド系化合物又はその薬学的に 許容される塩。
1 9. ' アミノ酸の側鎖の水酸基に脂肪酸がエステル結合したアミノ酸 を有する請求の範囲第 1 7項記載のぺプチド系化合物又はその薬学的に 許容される塩。
20. 脂肪酸が、 アミノ酸の側鎖の水酸基にエステル結合又はメルカ ブト基にチォエステル結合したアミノ酸を有する請求の範囲第 1 8項記 載のぺプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
2 1. 炭素数が 2乃至 35である脂肪酸が結合したアミノ酸を有する請 求の範囲第 1 9項記載のぺプチド系化合物又はその薬学的に許容される
22. 脂肪酸が炭素数 2乃至 3 5である請求の範囲第 20項のペプチド 系化合物又はその薬学的に許容される塩。
2 3. 炭素数が 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 14、 1 6および 1 8 の脂肪酸からなる群から選ばれた脂肪酸が結合したアミノ酸を有する請 求の範囲第 2 1項記載のぺプチド系化合物又はその薬学的に許容される
24. 脂肪酸が炭素数 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 14、 1 6および 1 8の脂肪酸からなる群から選ばれた脂肪酸である請求の範囲第 2 2項 記載のぺプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
25. 結合した脂肪酸がオクタン酸 （octanoic acid), 又はそのモノ ェン脂肪酸若しくはそのポリェン脂肪酸である請求の範囲第 23項記載 のペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
26. 脂肪酸がオクタン酸 （octanoic acid)、 又はそのモノエン脂肪 酸若しくはそのポリェン脂肪酸である請求の範囲第 24項記載のぺプチ ド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
27. 結合した脂肪酸がデカン酸 （decanoic acid), 又はそのモノェ ン脂肪酸若しくはそのポリェン脂肪酸である請求の範囲第 23項記載の ペプチド系化合物又はその薬学的に許容される塩。
28. 脂肪酸がデカン酸 （decanoic acid)、 又はそのモノエン脂肪酸 若しくはそのポリェン脂肪酸である請求の範囲第 24項記載のぺプチド 系化合物又はその薬学的に許容される塩。
29. 請求の範囲第 1乃至 28項記載のペプチド系化合物のカルボキ シル末端に、 更に塩基性アミノ酸が結合していることを特徴とするぺプ チド系化合物。
30. ァミノ末端が炭素数 1以上の飽和あるいは不飽和アルキル又は ァシル基により修飾され及び 又は力ルポキシル末端のカルボキシル基 の 0Hが 0Z又は NR2R3(Zは薬学的に許容し得る陽イオン又は低級の分枝 鎖又は非分枝鎖アルキル基、 R2及び R3は H及び低級の分枝鎖又は非分 枝鎖アルキル基からなる群から選択される互いに同一又は異なる基を示 す） であることを特徴とする請求の範囲第 1， 2， 3， 5, 7， 8， 1 3， 14， 1 5， 1 7， 1 9， 2 1, 23， 2 5， 27項記載のぺプチ ド系化合物。
3 1. ァミノ末端のアミノ基が、 炭素数 1以上の飽和あるいは不飽和 アルキル基又はァシル基の導入により修飾され及び Z又はカルボキシル 末端のカルボキシル基の 0Hが 0Z又は NR2R3(Zは薬学的に許容し得る陽 イオン又は低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基を示し、 R2及び R3は H 及び低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基からなる群から選択される互 いに同一又は異なる基を示す。）であることを特徴とする請求の範囲第 1， 2 , 4, 5， 6， 7， 9， 1 0， 1 1， 1 2， 1 6， 1 8， 20， 22，
24， 26， 28， 29項記載のペプチド系化合物。
32. 請求の範囲第 30または 3 1項記載のペプチド系化合物のカル ポキシル末端アミド誘導体に、 更に塩基性基を導入したことを特徴とす るべプチド系化合物。
33. 請求の範囲第 1乃至 3 2項記載のペプチド系化合物又はその薬 学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物。
34. 請求の範囲第 1乃至 32項記載のペプチド系化合物又はその薬学 的に許容される塩を有効成分とする成長ホルモンの欠損又は減少に起因 する疾患を治療するための医薬組成物。
3 5. 成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、 請求の範囲第 1乃至 32項記載のぺプチド系化合物又はその薬学的に許 容される塩を含有することからなる成長ホルモンの欠損又は減少に起因 しない疾患を治療するための医薬組成物。
36. ヒト以外の動物に適用するための請求の範囲第 33乃至 3 5項 記載の医薬組成物。
37. 請求の範囲第 1乃至 32項記載のペプチド系化合物又はその薬 学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物を投与することからな る成長ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法。
3 8 . 成長ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患に係る治療剤と、 請求の範囲第 1乃至 3 2項記載のぺプチド系化合物又はその薬学的に許 容される塩を含有する医薬組成物を投与することからなる成長ホルモン の欠損又は減少に起因しない疾患の治療方法。
3 9 . ヒト以外の動物に適用するための請求の範囲第 3 7又は 3 8項記 載の治療方法。
4 0 . 請求の範囲第 1乃至 3 2項記載のペプチド系化合物のアミノ酸 配列をコードする DNAであって、 当該 DNAがコードするアミノ酸配列中 に、 少なくともひとつのアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するぺプ チドをコードする塩基配列を有する当該 DNA。
4 1 . 塩基配列が、 配列番号 6、 7、 1 4、 1 5、 2 0、 2 1、 2 4、
3 6、 3 7、 3 8および 3 9記載の塩基配列からなる群から選ばれた一 つの塩基配列である請求の範囲第 4 0項記載の DM。
4 2 . 塩基配列が、 配列番号 6、 7、 1 4、 1 5、 2 0、 2 1、 2 4、
3 6、 3 7、 3 8および 3 9記載の塩基配列からなる群から選ばれた一 つの塩基配列中、 アミノ酸をコードしている塩基配列である請求の範囲 第 4 0項記載の DNA。
4 3 . 請求の範囲第 4 0乃至 4 2項記載の DMを有するベクタ一。
4 4 . 請求の範囲第 4 3項記載のベクタ一を含有する細胞。
4 5 . 請求の範囲第 4 0乃至 4 2項記載の DNAを有するベクタ一を有 し、 且つ当該 DNAにコードされるアミノ酸配列を有するぺプチド系化合 物が、 当該アミノ酸配列中の少なくともひとつのアミノ酸が修飾された ぺプチド系化合物として産生することができる細胞。
4 6 . 請求の範囲第 1乃至 3 2項記載のペプチド系化合物に対する抗 体。
4 7 . 請求の範囲第 4 6項記載の抗体を用いて請求の範囲第 1乃至 3 2項記載のぺプチド系化合物を検出することを特徴とする請求の範囲第 1乃至 3 2項記載のぺプチド系化合物のアツセィ方法。
4 8 . 請求の範囲第 4 6項記載の抗体を用いて請求の範囲第 1乃至 3 2 項記載のぺプチド系化合物を検出することを特徴とする請求の範囲第 1 乃至 3 2項記載のペプチド系化合物の検出用キット。
4 9 . 請求の範囲第 1乃至 3 2項記載のペプチド系化合物を遺伝子組 換え技術を用いて製造する方法において、 請求の範囲第 4 0乃至 4 2項 記載の DNAを含有するベクターにより、 当該べプチド中の少なくともひ とつのアミノ酸の側鎖を修飾することができる宿主細胞を形質転換し、 得られた形質転換細胞を培養して培養物から目的のペプチド系化合物を 採取することからなる請求の範囲第 1乃至 3 2項記載のぺプチド系化合 物の製造方法。
5 0 . 請求の範囲第 1乃至 3 2項記載のペプチド系化合物を遺伝子組 換え技術を用いて製造する方法において、 請求の範囲第 4 0乃至 4 2項 記載の DNAを含有するべクタ一により宿主細胞を形質転換し、 得られた 形質転換細胞を培養して培養物から目的物質を採取後、 任意のアミノ酸 を化学的に修飾することを特徴とする請求の範囲第 1乃至 3 2項記載の ぺプチド系化合物の製造方法。
5 1 . 請求の範囲第 1 9乃至 2 8項記載のペプチド系化合物を遺伝子 組換え技術を用いて製造する方法において、 脂肪酸をアミノ酸の側鎖の 水酸基にエステル結合又はメルカプト基にチォエステル結合させる活性 を有する細胞を用いることを特徴とする請求の範囲第 1 9乃至 2 8項記 載のぺプチド系化合物の製造方法。
5 2 . 配列番号 8記載のアミノ酸配列中のセリンの側鎖の水酸基に脂 肪酸をエステル結合させるセリンァシル化活性を有する細胞を用いるこ とを特徴とする請求の範囲第 1 9乃至 2 8項記載のペプチド系化合物の 製造方法。
5 3 . 配列番号 2 8記載のアミノ酸配列中のトレオニンの側鎖の水酸 基に脂肪酸をエステル結合させるァシル化活性を有する細胞を用いるこ とを特徴とする請求の範囲第 1 9乃至 2 8項記載のペプチド系化合物の 製造方法。
5 4 . 請求の範囲第 1乃至 3 2項記載のペプチド系化合物のアミノ酸 配列をコードする DNAを含有するベクターを生体内細胞に組み込み、 細 胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する少なくともひと つの修飾されたアミノ酸を有するぺプチドを発現することにより、 成長 ホルモンの欠損又は減少に起因する疾患を治療するための遺伝子治療用 医薬組成物。
5 5 . 請求の範囲第 1乃至 3 2項記載のペプチド系化合物のアミノ酸 配列をコードする DNAを有するベクターを、 当該 DNAにコードされるァ ミノ酸配列を有するぺプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつ のアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するぺプチドとして産生するこ とができる生体内の細胞に組み込むことにより、 成長ホルモンの分泌を 誘導する活性を有するペプチドを発現させることを特徴とする成長ホル モンの欠損又は減少に起因する疾患の治療方法。
5 6 . 請求の範囲第 1乃至 3 2項記載のペプチド系化合物のアミノ酸 配列をコードする DNAを含有するベクターを生体内細胞に組み込み、 細 胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する、 少なくともひ とつの修飾されたアミノ酸を有するぺプチドを発現することにより成長 ホルモンの欠損又は減少に起因しない疾患を治療するための遺伝子治療 用医薬組成物。
5 7 . 請求の範囲第 1乃至 3 2項記載のペプチド系化合物のアミノ酸 配列をコードする DNAを有するベクターを、 当該 DMにコードされるァ ミノ酸配列を有するペプチドが当該アミノ酸配列中の少なくともひとつ のアミノ酸が修飾されうる認識配列を有するぺプチドとして産生するこ とができる生体内の細胞に組み込むことにより、 成長ホルモンの分泌を 誘導する活性を有するぺプチドを発現させることを特徴とする成長ホル モンの欠損又は減少に起因しない疾患の治療方法。
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