ES2288151T3

ES2288151T3 - Nuevos peptidos.

Info

Publication number: ES2288151T3
Application number: ES00946453T
Authority: ES
Inventors: Kenji Kangawa; Masayasu Kojima; Hiroshi Hosoda; Hisayuki Matsuo; Yoshiharu Minamitake
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-07-23
Filing date: 2000-07-24
Publication date: 2008-01-01
Anticipated expiration: 2020-07-24
Also published as: JP4227857B2; DE60035502T2; CN100506844C; CY1107724T1; EP1197496A1; US7385026B1; KR100827973B1; ATE449174T1; JP3471780B2; US9573986B2; US20130172251A1; US9938332B2; KR20020026543A; BRPI0012688B8; EP1197496A4; CN101693736B; DE60043361D1; PT1795598E; US20090170763A1; WO2001007475A1

Abstract

Un compuesto de tipo péptido, (a) en el que el segundo o tercer resto aminoacídico del extremo amino es un aminoácido modificado en el que se ha introducido una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene de 1 a 35 átomos de carbono en el átomo de carbono alfa del aminoácido a través de un enlace éster, éter, tioéter, tioéster, amida, carbamida, tiocarbamida o disulfuro y a través o no de un grupo alquileno que contiene de 1 a 10 átomos de carbono, o en el que se ha introducido una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene de 1 a 20 átomos de carbono en el átomo de carbono alfa del aminoácido, donde H está unido al átomo de carbono alfa de dicho aminoácido modificado, (b) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en las secuencias de aminoácidos indicadas en las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 y 30, o una secuencia de aminoácidos en la que puede delecionarse, reemplazarse y/o añadirse al menos un aminoácido, en la que el segundo o tercer aminoácido del extremo amino se ha reemplazado por dicho aminoácido modificado, donde dicho al menos un aminoácido no se deleciona, reemplaza y/o añade al primer-cuarto aminoácido del extremo amino en dicha secuencia de aminoácidos, con la excepción de que el aminoácido 2 ó 3 del extremo amino se reemplaza por dicho aminoácido modificado, y (c) que tiene una actividad de aumentar la concentración de ion de calcio intracelular como resultado de la unión a un receptor de secretagogo de la hormona del crecimiento, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

Nuevos péptidos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un nuevo péptido que tiene la acción de aumentar la concentración de calcio intracelular o la actividad de inducir la secreción de hormona del crecimiento, teniendo el péptido un aminoácido modificado. Además, la presente invención se refiere a un método para obtener dicho nuevo péptido y a un método para producirlo, y a un método para producir dicho péptido o un precursor de dicho péptido por medio del uso de un gen que codifica dicho péptido o un precursor de dicho péptido. Además, en el presente documento se describe un análogo estructural del nuevo péptido modificado descrito en la presente invención, que se une a un receptor para un compuesto inductor de la secreción de hormona del crecimiento, presentando de esta manera la acción de aumentar la concentración de calcio intracelular o la actividad de inducir la secreción de hormona del crecimiento, así como un método para producirlo. Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica o un promotor del crecimiento para animales, que comprende dicho péptido o dicho análogo de péptido como un ingrediente activo, así como un anticuerpo contra dicho péptido o un método para utilizarlo.

Técnica Antecedente

La hormona del crecimiento (abreviada en lo sucesivo como GH) es una hormona proteica sintetizada en la adenohipófisis y promueve indirectamente el crecimiento del hueso y la diferenciación de adipocitos y condrocitos, y su secreción se promueve por la hormona de liberación de la hormona del crecimiento (GHRH) y se inhibe por la somatostatina [E J. Kendrew, et al. , Eds. , The Enciclopedia of Molecular Biology (Blackwell Science Ltd., London, 1994), p. 462]. La GH no solo tiene una acción promotora del crecimiento, sino que también tiene acciones tales como la promoción de la síntesis de proteínas en diversos tejidos, la estimulación de la transferencia de grasas depositadas y la elevación del contenido de glucógeno en músculos, y una reducción en la secreción de GH induce el enanismo, mientras que un exceso de la secreción de dicha hormona induce el gigantismo o la acromegalia [Iwanami's Dictionary of Biology, cuarta edición, editado por Ryuichi Yasugi, et al. (Iwanami Syoten, Tokyo, 1997), p. 757].

Desde que se ha producido la GH humana por ingeniería genética, la GH se usa no sólo para el tratamiento del enanismo [J. 0, Jorgensen, Endocr. Rev. 12, 189 (1991)], sino también para el tratamiento de otras enfermedades, y se han descubierto diversos efectos [J. O. Jorgensen, et al., Horm. Res. 42, 235 (1994)]. Por ejemplo, estos efectos incluyen la activación de la reconstitución de osteoblastos y de hueso en individuos normales [K. Brixen, et al., Miner. Res. 5, 609 (1990)], el aumento de la fuerza muscular y la cantidad muscular en adultos con deficiencia en GH [R. C. Cuneo, et al., J. Appl. Physiol. 70, 688 (1991)], la mejora de la motilidad en adultos con deficiencia en GH [R. C. Cuneo, et al., J. Appl. Physiol. 70, 695 (1991)], la curación de quemaduras graves en niños [D. N. Herndon, et al., Ann. Surg. 212, 424 (1990)], su uso combinado con gonadotropinas en la inducción de la ovulación [R. Homburg, et al., Clin. Endocrinol. (Oxf). 32, 781 (1990)], la prevención del trastorno metabólico por administración de prednisona [F. F. Horber y M, W. Haymond, J. Clin. Invest. 86, 265 (1990)], la promoción de la "educación" de las células T en trastornos inmunes graves [W. J. Murphy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 4481 (1992)] y el efecto de la inhibición de la reducción del peso corporal de individuos de edad avanzada y el efecto de aumento de tejidos adiposos y de prevención de la atrofia dérmica [D. Rudman, et al, N. Engl. J. Med. 323, 1 (1990)].

La administración de GH recombinante es eficaz para promover el crecimiento en niños y para la normalización de defectos en el metabolismo y funciones que acompañan a la deficiencia de GH en adultos, pero existen problemas asociados con que la GH tiene efectos secundarios que restringen la dosis, no puede administrarse por vía oral y es cara [B. A. Lefker, et al., en Growth Hormone Secretagogues in Clinical Practice, B. B. Bercu y R. F. Walker, Eds. (Marcel Dekker, Inc., New York, 1998), páginas 107-108]. Muchos pacientes adultos sufren efectos secundarios tales como artralgia y síndrome del túnel del carpo, que se considera atribuible a una acumulación de exceso de sodio y humor, de forma que la administración de GH no puede continuarse [E. Corpas, et al., Endocr. Rev. 14, 20 (1993)]. Estos efectos secundarios se correlacionan con un modelo no fisiológico de secreción de hormona por la administración de GH, y en la administración de GH, no puede imitarse la pulsatilidad de la secreción normal de GH [B. A. Lefker, et al., en Growth Hormone Secretagogues in Clinical Practice, B. B. Bercu y R. F. Walker, Eds. (Marcel Dekker, Inc., New York, 1998), páginas 107-108].

La pulsatilidad de la secreción de GH in vivo se establece básicamente por interacción entre dos factores reguladores derivados del hipotálamo; es decir, la GHRH y la somatostatina actúan sobre la glándula pituitaria regulando la secreción de GH [G. S. Tannenbaum y N. Ling, Endocrinology 115, 1952 (1984), R. G. Clark e I. C. Robinson, Endocrinology 122, 2675 (1988)]. El patrón normal de secreción de GH difiere durante el día y la noche, y durante la noche, se libera una mayor cantidad de GH con más frecuencia. La amplitud del pulso de liberación de GH se regula adicionalmente por retroalimentación por diversas hormonas esteroideas, neurotransmisores, GH y factores de crecimiento semejantes a insulina, por el estado nutricional, por el sueño y la motilidad [G. S. Strobl y M. J. Thomas, Pharmacol. Rev. 46, 1 (1994)].

Para solucionar los efectos secundarios producidos por la administración de GH, se sintetizó un gran número de compuestos que tenían una acción inductora de la secreción de GH, y como secretagogos de la hormona del crecimiento (GHS), se estudiaron extensivamente su correlación estructura-actividad, su farmacología y sus aplicaciones clínicas. En primer lugar, se sintetizaron péptidos tales como GHRP-6 (hexapéptido de liberación de la hormona del crecimiento) y se desarrollaron como agentes terapéuticos para tratar trastornos atribuibles a una deficiencia o reducción en GH [C. Y. Bowers, et al., Endocrinology 114, 1537-1545 (1984)]. Sin embargo, como estos compuestos peptídicos sólo pueden demostrar su efecto por medio de inyección intravenosa, se crearon compuestos no peptídicos que tenían bajo peso molecular que podían administrarse por vía oral [R. G. Smith, et al., Science 260, 1640-1643 (1993)], y algunos de ellos han avanzado a un ensayo clínico de fase II [A. A. Patchett, et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 92, 7001-7005 (1995)].

La serie de transferencia de información desde la recepción de señal de un receptor a la expresión funcional se denomina transducción de señales, y el sistema de transducción de señales acoplado con la proteína G continúa en el siguiente mecanismo [Iwanami's Dictionary of Biology, cuarta edición, por Ryuichi Yasugi, et al., páginas 555-556 (Iwanami Syoten, Tokyo, 1997)]. Este sistema acoplado a la proteína G tiene un receptor con siete dominios transmembrana que se divide en un sistema de AMPc para producir AMPc como segundo mensajero y ácido inositol-1,4,5-trifosfórico (IP3) y fosfolípido de diacil glicerol (DG) inositol como sistema de transducción de información. El AMPc activa una quinasa dependiente de AMPc (quinasa A), para producir la fosforilación de restos de seria y treonina en la proteína funcional para modificar su actividad. Por otra parte, el IP3 se une al receptor de IP3 en el retículo endoplásmico para promover la liberación de iones de calcio, mientras que el DG activa la quinasa C para promover la acción de hormonas, etc.

El mecanismo de aumentar la concentración de ion de calcio intracelular en el sistema de transducción de señales con IP3 o DG como segundo mensajero [J. Kendrew, et al., Eds., The Enciclopedia of Molecular Biology (Blackwell Science Ltd., London, 1994), p.136-137] es el siguiente: cuando un ligando se une al receptor, la fosfolipasa C se activa a través de la proteína G para convertir PIP2 en IP3. Por medio de IP3, los iones de calcio reunidos en el retículo endoplásmico (ER) como gránulos intracelulares se liberan en el citoplasma, aumentando de esta manera los niveles de iones de calcio en el citoplasma. Si en el citoplasma están presentes IP3 o iones de calcio, el calcio se incorpora de nuevo en el retículo endoplásmico reduciendo de esta manera los niveles de ion de calcio en el citoplasma. Es decir, la unión del ligando al receptor produce un aumento transitorio en los niveles de iones de calcio en el citoplasma.

Como GHS actúa sinérgicamente sobre la secreción de GH y el aumento de los niveles de AMPc intracelular por GHRH [K. Cheng, et al., Endocrinology 124, 2791-2798 (1989)] y la unión de GHRH al receptor induce la producción de AMPc como segundo mensajero mientras que GHS induce un aumento en la concentración de iones de calcio intracelular, se sugirió que el mecanismo de actuación de GHS es diferente del de GHRH [J. Herrington y B. Hille, Endocrinology 135, 1100-1108 (1994).], y se supuso que la GHS se unía a un receptor diferente del receptor de GHRH. Realmente se clonó un gen para un receptor al que se une GHS, y por los resultados del análisis de Northern, se descubrió que el receptor de GHS (GHS-R) se expresa en el hipotálamo y en la glándula pituitaria cerebral, y que hay una homología de 90% o mayor entre las secuencias de aminoácidos de los receptores de GHS de origen porcino y humano [A. D. Howard, et al., Science 273, 974-977 (1996)]. Sin embargo, no se ha aislado un ligando endógeno que se una a GHS-R, y este GHS-R era un receptor huérfano cuyo ligando no era evidente.

En algunos casos, ciertos ácidos grasos tales como el ácido mirístico, el ácido geránico, el palmitoil ácido o el farnesil ácido se unen al extremo amino de ciertas proteínas o a cadenas laterales de sus restos aminoacídicos, y el papel de estos ácidos grasos es anclar dicha proteína modificada con ácidos grasos a la membrana celular [J. Kendrew, et al., Eds., The Encyclopedia of Molecular Biology (Blackwell Science Ltd., London, 1994), p.616]. En dicha proteína modificada con ácidos grasos, el ácido graso se une a un resto de cisteína a través de un enlace S-acilo, y no se conoce ni un aminoácido que tenga un ácido graso unido a un resto de serina a través de un enlace O-acilo, tal como la GHS endógena descrita en la presente invención, ni ninguna proteína o péptido que contenga dicho aminoácido modificado con ácidos grasos. Tampoco se sabe que el péptido que contiene dicho aminoácido modificado con ácido graso funcione como ligando para ningún receptor.

Descripción de la invención

Antes de describir la presente invención con detalle, los términos son como se definen a continuación:

El término "péptido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de aminoácidos unidos entre sí a través de enlaces peptídicos. En este documento, el aminoácido (también denominado resto aminoacídico) incluye aminoácidos naturales representados por la fórmula: NH_{2}-CH(R')-COOH, donde R' es un grupo sustituyente natural, así como sus isómeros óptimos D, L, etc.

También hay un péptido en el que un cierto aminoácido natural se reemplaza por un aminoácido modificado (también denominado resto aminoacídico modificado). El aminoácido modificado incluye los aminoácidos de la fórmula anterior en la que el grupo sustituyente R' se modifica adicionalmente, sus isómeros ópticos D, L y aminoácidos no naturales donde, por ejemplo, varios grupos sustituyentes están unidos al grupo sustituyente R' de la fórmula anterior a través o no de un enlace éster, éter, tioéster, tioéter, amida, carbamida o tiocarbamida. El aminoácido modificado también incluye aminoácidos no naturales cuyos grupos amino se han reemplazado por grupos alquilo inferior.

La expresión "análogo peptídico" se refiere a un compuesto en el que al menos un aminoácido en un péptido se ha reemplazado por un compuesto no aminoacídico y, de esta manera, al menos un enlace de dicho compuesto sustituyente con el análogo peptídico no es un enlace peptídico.

Además, los compuestos derivados de estos péptidos y análogos peptídicos modificando el extremo amino y/o carboxilo de los mismos se denominan derivados. Y los péptidos, análogos peptídicos y derivados de los mismos se denominan colectivamente "compuestos de tipo péptido".

En la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 2, una secuencia de aminoácidos del 1^{er} al 4º aminoácido se denomina Gly Ser Ser Phe,

una secuencia de aminoácidos del 1^{er} al 5º aminoácido se denomina Gly Ser Ser Phe Leu,

una secuencia de aminoácidos del 1^{er} al 6º aminoácido se denomina Gly Ser Ser Phe Leu Ser,

una secuencia de aminoácidos del 1^{er} al 7º aminoácido se denomina Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro,

una secuencia de aminoácidos del 1^{er} al 8º aminoácido se denomina Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu,

una secuencia de aminoácidos del 1^{er} al 9º aminoácido se denomina Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His y

una secuencia de aminoácidos del 1^{er} al 10º aminoácido se denomina Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln.

Desde hace tiempo se desea el descubrimiento de un ligando endógeno (GHS endógeno) que se una al receptor de GHS presentando una actividad de aumento de la concentración de ion de calcio intracelular o para inducir la secreción de GH junto con un método para utilizarlo. Además, desde hace tiempo también se desea un compuesto que sea un análogo estructural de dicha GHS endógena y que tenga una actividad de aumento de la concentración de ion de calcio intracelular o de inducción de la secreción de GH. Además, se desea una composición farmacéutica o una composición para promover el crecimiento de animales, que comprenda dicho GHS endógeno o su análogo estructural que induce la secreción pulsátil de GH, eliminando de esta manera los efectos secundarios de la administración de GH, así como una aplicación terapéutica usando dicha composición.

Los presentes inventores centraron su atención en el hecho de que la unión del ligando al receptor de GHS (GHS-R) produce un aumento transitorio de la concentración de ion de calcio intracelular con fosfolípido de inositol como segundo mensajero, e investigaron extractos de diversos órganos y tejidos usando la actividad de aumento de la concentración de ion de calcio intracelular (actividad de liberación de Ca) como indicador en células CHO (CHO-GHSR62) que expresan GHS-R. Como resultado, los inventores descubrieron que los extractos de estómago de rata tienen una fuerte actividad de liberación de Ca y purificaron satisfactoriamente una sustancia con una fuerte actividad de liberación de Ca a partir de los extractos anteriores por diversos tipos de cromatografía, y descubrieron que dicha sustancia es un nuevo péptido modificado con ácido graso, que tiene un peso molecular de aproximadamente 3.000. Además, confirmaron que dicho nuevo péptido promueve la secreción específica de GH desde células de la pituitaria anterior, y descubrieron que dicho nuevo péptido es un ligando endógeno para GHS-R, es decir, un secretagogo endógeno de GH (GHS endógeno). Es decir, el primer aspecto de la presente invención se refiere a un péptido inductor de la secreción de GH endógena que tiene la actividad de aumentar la concentración de ion de calcio intracelular o la actividad de inducir la secreción de GH, donde cierto resto aminoacídico constituyente se ha modificado con un ácido graso, así como un método para preparar dicho péptido.

Los presentes inventores analizaron de forma precisa la estructura del péptido inductor de la secreción de GH endógena y descubrieron que dicho péptido es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 2, donde el grupo hidroxilo de cadena lateral de la tercera serina desde el extremo amino se ha acilado con un ácido graso. Además, también se purificó un péptido inductor de la secreción de GH de origen humano a partir de extracto de estómago humano que tenía una fuerte actividad de liberación de Ca similar a la del extracto de estómago de rata, y se analizó su estructura de la misma manera que para el péptido inductor de la secreción de GH procedente de rata, y como resultado los inventores descubrieron que el péptido inductor de la secreción de GH endógena de origen humano consiste en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 3, donde el grupo hidroxilo de la cadena lateral de la tercera serina del extremo amino se ha acilado con un ácido graso. La comparación entre las secuencias de aminoácidos de los péptidos inductores de la secreción de GH endógena procedentes de rata y humano reveló una homología de hasta 89% en conjunto.

Específicamente, los péptidos procedentes de rata y humano son idénticos en una secuencia de aminoácidos del primer al décimo aminoácido desde el extremo amino y en una secuencia de aminoácidos del 13º al 28º aminoácido desde el extremo amino, pero son diferentes en el 11º al 12º aminoácido que son lisina y alanina en el péptido de rata, y se reemplazan por arginina y valina en el péptido humano, respectivamente. El péptido inductor de la secreción de GH endógena procedente de rata se escindió con diversas proteasas, sus fragmentos peptídicos purificados se midieron con respecto a la actividad de liberación de Ca, y como resultado, un péptido que consistía en el primer al séptimo aminoácido desde el extremo amino era el péptido mínimo que tenía actividad de liberación de Ca.

Midiendo la actividad de liberación de Ca de péptidos sintetizados químicamente, los inventores descubrieron que la secuencia central esencial para inducir la actividad de liberación de Ca es una secuencia consistente en 4 aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 8. Además, la secuencia consistente en 10 aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 9 estaba conservada en los péptidos inductores de la secreción de GH endógena no procedentes de rata (consistiendo cada uno de 28 aminoácidos) separados de humano, porcino y bovino, así como en los péptidos inductores de la secreción de GH endógena (consistentes cada uno en 27 aminoácidos) donde una glutamina se había delecionado de los péptidos anteriores.

Es decir, el segundo aspecto de la presente invención se refiere a un péptido modificado con ácido graso que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 8, preferiblemente la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 1 y más preferiblemente la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 9 como secuencia central esencial para inducir la actividad de liberación de Ca.

También se aislaron péptidos inductores de la secreción de GH endógena a partir de pollo, anguila y rana, y se descubrió que estos péptidos tenía una secuencia central consistente en cuatro aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 8.

Además, también se aisló a partir de rana un péptido inductor de la secreción de GH endógena muy similar al péptido inductor de la secreción de GH endógena de rata.

Además, también se aislaron péptidos inductores de la secreción de GH endógena a partir de Xenopus laevis, trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) y perro. A partir de la trucha arco iris, se aislaron respectivamente grelina-23 consistente en 23 aminoácidos y grelina-20 consistente en 20 aminoácidos.

El aminoácido carboxilo-terminal de la grelina de anguila, la grelina-23 de trucha arco iris y la grelina 20 estaba amidado.

Como un resto aminoacídico en la tercera posición desde el extremo amino en el péptido inductor de la secreción de GH endógena de Xenopus laevis es treonina, la presente invención también se refiere a un péptido modificado con ácido graso, que contiene, como secuencia central esencial para presentar la actividad de liberación de Ca, un péptido en el que el tercer resto aminoacídico serina se reemplazó por treonina en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 8, preferiblemente la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 1 y más preferiblemente la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 9.

El péptido modificado con ácido graso endógeno que tiene actividad inductora de la secreción de GH, o el péptido modificado con ácido graso consistente en dicha secuencia central, descrito en la presente invención, también proporciona una pauta para diseñar un compuesto con actividad de liberación de Ca.

Es decir, en el tercer aspecto de la presente invención se obtiene un nuevo compuesto que tiene actividad de liberación de Ca sintetizando un análogo estructural de dicho péptido modificado con ácido graso confirmando la actividad de liberación de Ca del análogo estructural resultante. Por consiguiente, la presente invención también incluye un péptido o análogo peptídico como se define en las reivindicaciones, que tiene la actividad de aumentar la concentración de ion de calcio intracelular, donde un cierto aminoácido constituyente se ha reemplazado por un compuesto aminoacídico modificado o no aminoacídico.

Se obtuvo una ADNc que codificaba el péptido inductor de la secreción de GH endógena de la manera habitual. Cada uno de los ADNc de rata y humano consiste en 117 aminoácidos como se muestra en las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 4 y 5, y las secuencias de aminoácidos de los péptidos inductores de la secreción de GH endógena de rata y humano eran idénticas en una secuencia de 28 aminoácidos desde la 24ª a la 51ª posiciones desde el extremo amino, respectivamente. Es decir, se reveló que el péptido inductor de la secreción de GH endógena se sintetiza como un péptido precursor consistente en 117 aminoácidos, después se escinde un péptido señal consistente en los 23 aminoácidos amino-terminales y se escinden adicionalmente 56 aminoácidos carboxilo-terminales, con lo que se forma el péptido modificado con ácido graso que tiene actividad inductora de la secreción de GH. Además, también se encontró en cerdo un ADNc que codificaba un precursor del péptido inductor de la secreción de GH endógena consistente en 28 aminoácidos.

Además, se encontró en cerdo un ADNc que codificaba un precursor para el péptido inductor de la secreción de GH endógena consistente en 27 aminoácidos.

Además, se encontró en cerdo un ADNc parcial codificante de un precursor para el péptido inductor de la secreción de GH endógena consistente en 27 aminoácidos.

Además, también se encontró en anguila, Xenopus laevis y trucha arco iris un ADNc codificante de un precursor del péptido inductor de la secreción de GH endógena. A partir de trucha arco iris, se aislaron respectivamente un ADNc codificante de un precursor de grelina-23 consistente en 23 aminoácidos y un ADNc codificante de un precursor de grelina-20 de 20 aminoácidos.

Por consiguiente, el cuarto aspecto de la presente invención se basa en un método para producir un péptido como material de partida del péptido modificado con ácido graso o análogo peptídico que tiene actividad de liberación de Ca, que comprende el uso de un ADNc que codifica un precursor del péptido inductor de la secreción de GH endógena.

En la purificación del péptido inductor de la secreción de GH endógena (grelina) compuesto de 28 aminoácidos de extracto de estómago de rata, se analizó un péptido recuperado como una fracción minoritaria y, como resultado, se encontró un péptido consistente en 27 aminoácidos (grelina-27), que es un péptido de grelina a partir del cual se han delecionado la 13ª o 14ª glutamina. La grelina 27 tiene completamente la misma actividad de liberación de Ca y actividad inductora de la secreción de GH que la grelina consistente en 28 aminoácidos, y la grelina-27 es un péptido inductor de la secreción de GH endógena y, por lo tanto, la grelina-27 también se incluye dentro del alcance de la presente invención.

La secuencia de nucleótidos que codifica la 13ª y 14ª glutaminas de la grelina es gca gca, que es una secuencia de exón terminal que se someterá a corte y empalme de ARNm, lo que sugiere la posibilidad de formación de un ADNc a partir del cual se delecionó uno de los dos codones codificantes de restos de glutamina por diferentes cortes y empalmes. Realmente, se encontró un ADNc que codificaba un péptido precursor de grelina-27 consistente en 27 aminoácidos en la selección de bibliotecas de ADNc de rata y humano.

Es decir, se reveló que el péptido de la grelina-27 humana se sintetiza como un péptido precursor consistente en 116 aminoácidos indicados en la SEC ID Nº: 12 ó 13, posteriormente se escinde un péptido señal consistente en 23 aminoácidos amino-terminales y también se escinden adicionalmente 56 aminoácidos carboxilo-terminales, con lo que se forma un péptido modificado con ácido graso consistente en 27 aminoácidos que tiene una actividad inductora de la secreción de GH (grelina-27).

Además, se encontró un ADNc codificante de un precursor del péptido de la grelina-27 en cerdo y oveja, y se confirmó la presencia de grelina-27 y su precursor en estos animales.

Es decir, la presente invención también incluye el péptido de la grelina-27 como se define en las reivindicaciones, consistente en una secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 10, 11, 17 y 22. En el presente documento se describe un péptido precursor de grelina-27 que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en las SEC ID Nº: 12, 13, 19 y 23 y un ADNc que codifica dicho péptido precursor que comprende una secuencia de nucleótidos indicada en las SEC ID Nº: 14, 15, 21 y 24.

El péptido modificado con ácido graso que tiene actividad de liberación de Ca y el compuesto de tipo péptido, tal como el análogo peptídico que tiene actividad de liberación de Ca como se describen en la presente invención, también proporcionan una composición farmacéutica para tratar enfermedades atribuibles a un defecto o reducción en el nivel de GH. Dicha composición farmacéutica puede usarse para tratar cualquier enfermedad contra la cual es eficaz la administración de GH, y pueden evitarse diversos efectos secundarios producidos por la administración de GH. Además, dicha composición farmacéutica también puede usarse como fármaco animal, tal como agente promotor del crecimiento para animales.

Como el compuesto de tipo péptido de la presente invención tiene una acción promotora del apetito por medio de la administración al ventrículo y por medio de la administración intravenosa, puede usarse como agente promotor del apetito para tratar la pérdida de apetito o sitofobia. Además, el presente compuesto de tipo péptido tiene acción promotora de la motilidad del estómago y acción promotora de la secreción de ácido gástrico y, de esta manera, también puede usarse como agente para tratar enfermedades funcionales del estómago tales como indigestión no asociada con úlceras, atonía del estómago ligera súbita, indigestión funcional y esofagitis de reflujo. Además, el presente compuesto de tipo péptido presenta una acción promotora del crecimiento celular en médula ósea, duodeno y yeyuno por medio de la administración intravenosa, y por lo tanto puede usarse como agente para proteger la membrana mucosa del tracto intestinal, como un agente para prevenir daños en la membrana mucosa del intestino delgado durante la nutrición intravenosa y como un agente para tratar la osteoporosis.

La presente invención también incluye un anticuerpo como se define en las reivindicaciones preparado usando el péptido modificado con ácido graso que tiene actividad de liberación de Ca descrito en la presente invención como antígeno, un método para medir el péptido inductor de la secreción de GH endógena por medio del uso de dicho anticuerpo, y un kit de medición que comprende dicho anticuerpo.

Además, la presente invención incluye un método de ensayo para separar y cuantificar grelina modificada con un ácido graso y grelina a partir de la cual se eliminó el ácido graso, que comprende usar dos anticuerpos construidos contra péptidos N- y carboxilo-terminales de grelina, siendo el primer anticuerpo capaz de reconocer la tercera serina modificada con ácido graso, así como un kit de ensayo que comprende una combinación de los anticuerpos contra los péptidos N- y carboxilo-terminales de grelina.

Es decir, la presente invención proporciona una nueva hormona peptídica que tiene un nuevo aminoácido modificado, es decir, serina acilada, y también proporciona una pauta para el nuevo diseño de un compuesto con actividad de liberación de Ca con la estructura de dicho péptido como esqueleto fundamental.

Además, se sugiere que el esclarecimiento del mecanismo de inducción de la secreción de GH por el péptido modificado con ácido graso descrito en la presente invención o por la hormona de liberación de GH y somatostatina se puede extender no sólo al mecanismo de inducción de la secreción de GH, sino también al mecanismo de regulación de la secreción de otras hormonas. La presente invención describe diversas funciones del péptido modificado con ácido graso como factor regulador en el sistema circulatorio y el sistema metabólico, y el efecto de la presente invención se extiende al esclarecimiento de un nuevo mecanismo regulador biológico.

Específicamente, la presente invención se refiere a: (1) un compuesto de tipo péptido (a) en el que el segundo o tercer resto aminoacídico desde el extremo amino es un aminoácido modificado en el que se introduce una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene de 1 a 35 átomos de carbono en el átomo de carbono \alpha del aminoácido a través de un enlace éster, éter, tioéter, tioéster, amida, carbamida, tiocarbamida o disulfuro y a través o no de un grupo alquileno que contiene de 1 a 10 átomos de carbono, o en el que se introduce una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene de 1 a 20 átomos de carbono en el átomo de carbono \alpha del aminoácido, donde H está unido al átomo de carbono \alpha de dicho aminoácido modificado, (b) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en las secuencias de aminoácidos indicadas en las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 y 30, o una secuencia de aminoácidos en la que puede delecionarse, reemplazarse y/o añadirse al menos un aminoácido, donde el segundo o tercer aminoácido del extremo amino se reemplaza por dicho aminoácido modificado, donde dicho al menos un aminoácido no se ha delecionado, reemplazado y/o añadido en el primer a cuarto aminoácidos desde el extremo amino en dicha secuencia de aminoácidos con la excepción de que el aminoácido 2 ó 3 desde el extremo amino se reemplaza por dicho aminoácido modificado, y (c) que tiene una actividad de aumento de la concentración de ion de calcio intracelular como resultado de la unión a un receptor de secretagogo de la hormona del crecimiento, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(2) un compuesto de tipo péptido (a) en el que el segundo o tercer resto aminoacídico del extremo amino es un aminoácido modificado seleccionado entre (i) serina, treonina, tirosina u oxiprolina, en el que el grupo hidroxi de la cadena lateral se convierte en un grupo representado por -OCO-Z_{1}, -OCS-Z_{1} o -O-Z_{3}, o (ii) cisteína, donde el grupo mercapto de la cadena lateral se convierte en -SCO-Z_{1}, -SCS-Z_{1}, -S-Z_{3} o -S-S-Z_{8}, o (iii) lisina o arginina, donde el grupo amino de la cadena lateral se convierte en -NH-CO-Z_{2}, -NH-CS-C_{2}, -N(Z_{5})(Z_{6}), -NH-CO-NH-Z o -NH-CS-NH-Z_{7}, o (iv) histidina o triptófano, donde el grupo imino de la cadena lateral se convierte en un grupo representado por la fórmula:

1

en la que Z_{1} es hidrógeno o una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene de 1 a 50 átomos de carbono, Z_{2}, Z_{4}, Z_{6}, Z_{7} y Z_{8} son iguales o diferentes y representan H o una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene de 1 a 10 átomos de carbono, Z_{3} representa una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene de 1 a 10 átomos de carbono, Z_{5} representa una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene de 1 a 10 átomos de carbono, (b) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos indicadas en las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 y 30, o una secuencia de aminoácidos en la que puede delecionarse, reemplazarse y/o añadirse al menos un aminoácido, donde el segundo o tercer aminoácido desde el extremo amino se reemplaza por dicho aminoácido modificado, donde dicho al menos un aminoácido no se deleciona, reemplaza y/o añade en el primer a cuarto aminoácidos desde el extremo amino de dicha secuencia de aminoácidos con la excepción de que el aminoácido 2 ó 3 del extremo amino se reemplaza por dicho aminoácido modificado, y (c) que tiene una actividad de aumento de la concentración de ion de calcio intracelular como resultado de la unión al receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(3) El compuesto de tipo péptido de acuerdo con el punto (1) o (2), en el que el aminoácido modificado es (i) serina cuyo grupo hidroxi de la cadena lateral se convierte en un grupo representado por -OCO-Z_{1}, -OCS-Z_{1} o -O-Z_{3}, o (ii) cisteína cuyo grupo mercapto de la cadena lateral se convierte en -SCO-Z_{1}, -SCS-Z_{2}, -S-Z_{3} o -S-S-Z_{8}, donde Z_{1}, Z_{3} y Z_{8} tienen el mismo significado que se ha definido en el punto (2);

(4) Un compuesto de tipo péptido de acuerdo con el punto (1) o (2), en el que el aminoácido modificado es serina, treonina, tirosina u oxiprolina, donde el grupo hidroxi de la cadena lateral se convierte en un grupo representado por -OCO-Z_{1}, donde Z_{1} es H o una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene de 1 a 50 átomos de carbono, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(5) El compuesto de tipo péptido de acuerdo con el punto (1) o (2), en el que el aminoácido modificado es un resto aminoacídico en el que un ácido graso se une al grupo hidroxi de la cadena lateral mediante un enlace éster o al grupo mercapto de la cadena lateral mediante un enlace tioéster, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(6) El compuesto de tipo péptido de acuerdo con el punto (5), en el que el ácido graso contiene de 2 a 35 átomos de carbono, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(7) El compuesto de tipo péptido de acuerdo con el punto (6), en el que el ácido graso se selecciona entre ácidos grasos que contienen 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ó 18 átomos de carbono, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(8) El compuesto de tipo péptido de acuerdo con el punto (7), en el que el ácido graso se selecciona entre ácido octanoico, un ácido graso monoeno del mismo y un ácido graso polieno del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(9) El compuesto de tipo péptido de acuerdo con el punto (7), en el que el ácido graso se selecciona entre ácido decanoico, un ácido graso monoeno del mismo y un ácido graso polieno del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(10) Un compuesto de tipo péptido de acuerdo con el punto (1), que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos indicadas en las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 y 30, donde el grupo hidroxi de la cadena lateral de serina o treonina en la tercera posición desde el extremo amino en dicha secuencia de aminoácidos se acila con un grupo acilo que contiene de 2 a 35 átomos de carbono o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(11) Un compuesto de tipo péptido de acuerdo con el punto (1), que comprende una secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 1, 8 ó 9, o una secuencia de aminoácidos en la que la serina de la tercera posición del extremo amino en dicha secuencia de aminoácidos se convierte en treonina, donde el grupo hidroxi de la cadena lateral de serina o treonina en la tercera posición desde el extremo amino se acila con un grupo acilo que contiene de 2 a 35 átomos de carbono o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(12) Un compuesto de tipo péptido de acuerdo con el punto (1), que comprende una secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 3 u 11, donde el grupo hidroxi de la cadena lateral de serina en la tercera posición desde el extremo amino se acila con octanoílo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(13) Un compuesto de tipo péptido de acuerdo con el punto (1), que comprende una secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 3, donde el grupo hidroxi de la cadena lateral de la serina en la tercera posición desde el extremo amino se acila con n-octanoílo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(14) Un compuesto de tipo péptido de acuerdo con el punto (1), donde el compuesto tiene adicionalmente la actividad de inducir la secreción de la hormona del crecimiento;

(15) Un compuesto de tipo péptido de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (1) a (14), que comprende un aminoácido básico unido al extremo carboxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(16) El compuesto de tipo péptido de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (1) a (15), en el que el extremo amino se modifica con un alquilo saturado o insaturado o un grupo acilo que contiene uno o más átomos de carbono, y/o el grupo hidroxi en el grupo carboxilo en el extremo carboxilo es OZ o se reemplaza por NR2R3 donde Z es un catión farmacéuticamente aceptable o un grupo alquilo inferior lineal o ramificado, y R2 y R3 son iguales o diferentes y representan H o un grupo alquilo inferior lineal o ramificado, o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo;

(17) Un anticuerpo contra un compuesto de tipo péptido descrito en los puntos (1) a (16), que reconoce específicamente el péptido parcial del extremo amino que tiene el aminoácido modificado como se ha definido en uno cualquiera de los puntos (1) a (16), donde dicho péptido parcial del extremo amino es un péptido parcial del extremo amino del compuesto de tipo péptido descrito en los puntos (1) a (16);

(18) Un método para ensayar un compuesto de tipo péptido descrito en los puntos (1) a (16), que comprende el uso del anticuerpo descrito en el punto 17 para detectar el compuesto de tipo péptido descrito en los puntos (1) a (16);

(19) Un kit para detectar un compuesto de tipo péptido descrito en los puntos (1) a (16), que comprende el uso del anticuerpo descrito en el punto (17) para detectar el compuesto de tipo péptido descrito en los puntos (1) a (16);

(20) Un agente o una composición farmacéutica que comprende un compuesto de tipo péptido descrito en los puntos (1) a (16) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo como un ingrediente activo;

(21) Una composición farmacéutica de acuerdo con el punto (20) para el tratamiento de enfermedades atribuibles a un defecto o disminución del nivel de hormona del crecimiento;

(22) Una composición farmacéutica de acuerdo con el punto (20) para el tratamiento de enfermedades cardíacas;

(23) Un agente de acuerdo con el punto (20), que es un agente promotor del apetito;

(24) Un agente de acuerdo con el punto (20), que es un agente terapéutico para el tratamiento de enfermedades funcionales del estómago;

(25) Un agente de acuerdo con el punto (20) para proteger la túnica mucosa del intestino o para prevenir lesiones en la túnica mucosa del intestino delgado durante la nutrición intravenosa;

(26) Un agente de acuerdo con el punto (20), que es un agente terapéutico para el tratamiento de la osteoporosis;

(27) Un agente de acuerdo con el punto (20) para reducir la caquexia provocada por enfermedades crónicas;

(28) Un agente de acuerdo con el punto (20), que es un agente terapéutico para el tratamiento de insuficiencia pulmonar;

(29) Una composición farmacéutica, agente o agente terapéutico de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (20) a (28), que es para aplicación a animales distintos de seres humanos;

(30) Un método para producir un compuesto de tipo péptido descrito en los puntos (1) a (16), que comprende unir un éster activado del péptido amino-terminal que se obtiene por síntesis química, con un péptido carboxilo-terminal que se obtiene por tecnología de recombinación genética;

(31) Un método para producir un compuesto de tipo péptido descrito en los puntos (5)-(14) por tecnología de recombinación genética, que comprende el uso de células que tienen la actividad de acilación de serina de unir ácido octanoico a través de un enlace éster a un grupo hidroxi de la cadena lateral de serina en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 8.

En la presente invención, el aminoácido incluye todos los aminoácidos tales como L-aminoácidos, D-aminoácidos, \alpha-aminoácidos, \beta-aminoácidos, \gamma-aminoácidos, aminoácidos naturales y aminoácidos sintéticos o similares.

En la presente invención, el aminoácido modificado se refiere a un aminoácido en el que un grupo arbitrario del mismo está modificado químicamente. En particular, se prefiere un aminoácido modificado químicamente en el átomo de carbono \alpha en un \alpha-aminoácido. Es decir, cuando el \alpha-aminoácido se representa por la fórmula (1):

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2

R' y R'' en el aminoácido modificado químicamente pueden ser H o un grupo como se define en las reivindicaciones; en resumen, el aminoácido modificado puede ser un aminoácido natural modificado químicamente. R' o R'' es H.

Un aminoácido en el que como grupo sustituyente representado por R' y R'', un grupo sustituyente presente en el aminoácido natural se reemplaza por un grupo sustituyente no presente en el aminoácido natural o en su D-aminoácido correspondiente, se denomina aminoácido modificado.

Cuando el aminoácido natural contiene, por ejemplo, -OH, -SH, -NH o -NH_{2} como grupo sustituyente en una cadena lateral del mismo, se dice que un ejemplo preferido del grupo sustituyente mencionado anteriormente es un grupo formado por acilación de dicho grupo sustituyente.

El grupo acilo incluye, por ejemplo, grupos formados retirando un grupo hidroxilo de un ácido carboxílico orgánico, ácido sulfónico orgánico y ácido fosfórico orgánico.

El ácido carboxílico orgánico incluye, por ejemplo, ácidos grasos, y el número de átomos de carbono del mismo es preferiblemente de 2 a 35, más preferiblemente de 6 a 18 y aún más preferiblemente de 8 a 16. Estos ácidos grasos incluyen, por ejemplo, ácido octanoico (preferiblemente ácido caprílico), ácido decanoico (preferiblemente ácido cáprico) y ácido dodecanoico (preferiblemente ácido láurico), así como ácidos grasos monoeno y polieno de los mismos.

En el ácido sulfónico orgánico o ácido fosfórico orgánico, el número de átomos de carbono del mismo es preferiblemente de 2 a 35.

Además, el aminoácido modificado puede ser un aminoácido en el que el grupo representado por R' y/o R'' se reemplaza, por ejemplo, por:

-(CH_{2})_{n} - P - Q

(donde n es un número entero de 0 a 10, P es -CO-O-, -O-CO-, -O-, -CO-S-, -CS-S-, -S-CO-, -S-, -CO-NH-, -NH-CO- o -CO-NH-CO-, Q es H o alquilo C_{1-35}, preferiblemente C_{1-20}). Además, P puede ser -CO-.

Además, P puede ser -S-S- o -NH-CS-. En cada -NH- descrito anteriormente, H puede reemplazarse por un grupo alquilo C_{1-35} saturado o insaturado, un grupo arilo C_{6-20} o un grupo aralquilo C_{7-13}.

En el caso en el que el \alpha-aminoácido se representa por la fórmula (1) anterior, el aminoácido modificado en el que R' o R'' se reemplaza por el grupo anterior -(CH_{2})_{n}-P-Q es una realización preferida. En particular, dicho aminoácido modificado es preferiblemente serina modificada en la que un grupo sustituyente representado por la fórmula anterior -(CH_{2})_{n}-P-Q está unido al carbono \alpha de serina, como se muestra en la fórmula:

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3

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en la que n, P y Q tienen los mismos significados que se han definido anteriormente.

El modo de enlace seleccionado entre el grupo que consiste en éster, éter, tioéster, tioéter, amida y carbamida a través o no de un grupo alquilo que contiene uno o más átomos de carbono se describe con más detalle.

Por ejemplo, si el aminoácido es serina, treonina, tirosina u oxiprolina, el aminoácido tiene un grupo hidroxilo en la cadena lateral. Si el aminoácido es cisteína, el aminoácido tiene un grupo mercapto en la cadena lateral. Si el aminoácido es lisina, arginina, histidina, triptófano, prolina u oxiprolina, tiene un grupo amino o un grupo imino en la cadena lateral.

El grupo hidroxilo, grupo mercapto, grupo amino y grupo imino descritos anteriormente pueden haberse modificado químicamente. Es decir, el grupo hidroxilo o el grupo mercapto puede estar eterificado, esterificado, tioeterificado o tioesterificado. El grupo imino puede haberse iminoeterificado, iminotioeterificado o alquilado. El grupo amino puede haberse amidado, tioamidado o carbamidado.

Además, el grupo mercapto puede haberse disulfurado, el grupo imino puede haberse amidado o tioamidado y el grupo amino puede haberse alquilado o tiocarbamidado.

El grupo hidroxilo o grupo mercapto modificado químicamente de esta manera puede representarse, por ejemplo, por:

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4

\newpage

El grupo amino o grupo imino amidado o tioamidado puede representarse por:

5

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El grupo hidroxilo o grupo mercapto eterificado puede representarse por:

100

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El grupo imino iminoeterificado o iminotioeterificado puede representarse por;

101

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El grupo amino alquilado puede representarse por:

102

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El grupo imino alquilado puede representarse por:

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103

El grupo imino carbamidado o tiocarbamidado puede representarse por:

6

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El grupo mercapto disulfurado puede representarse por: -S-S-Z_{8}

En las fórmulas anteriores, Z_{1}, Z_{2}, Z_{3}, Z_{4}, Z_{5}, Z_{6}, Z_{7} y Z_{8} pueden ser cualquier grupo sustituyente para la modificación química siempre que no vayan en contra del espíritu de la presente invención, pero como los grupos sustituyentes usados convencionalmente en un campo farmacéutico o para la modificación química de péptidos son bien conocidos en la bibliografía de patente o en la bibliografía científica, pueden usarse estos grupos sustituyentes conocidos para la modificación y, de acuerdo con tales métodos conocidos, puede realizarse la modificación química en la presente invención.

En las fórmulas anteriores, Z_{1} puede ser un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de cadena lineal, ramificada o cíclica, y dicho grupo alquilo puede estar saturado o insaturado. El número de átomos de carbono del mismo es normalmente C_{1-50}, preferiblemente C_{6-20}.

Z_{2}, Z_{3}, Z_{4}, Z_{5}, Z_{6,} Z_{7} o Z_{8} pueden ser un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de cadena lineal, ramificada o cíclica, y este grupo alquilo puede estar saturado o insaturado. El número de átomos de carbono del mismo es normalmente C_{1-10}, preferiblemente C_{1-6}.

Los grupos alquilo representados por Z_{1}, Z_{2}, Z_{3}, Z_{4}, Z_{5}, Z_{6}, Z_{7} o Z_{8} pueden estar sustituidos con grupos sustituyentes tales como un grupo hidroxilo, grupo amino, halógeno, grupo nitro y grupo alcoxi C_{1-3}, que se usan convencionalmente para la modificación química de péptidos.

En lo anterior, si Z_{1}-CO- es un resto del ácido graso Z_{1}-COOH, esto es un ejemplo del aminoácido al que se ha unido un ácido graso. El ácido graso en este caso incluye, por ejemplo, un ácido graso saturado tal como ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido butírico, ácido caproico, ácido undecílico, ácido palmítico, ácido decanoico, ácido nonadecanoico, ácido behénico, ácido montánico, ácido lacérico y un ácido graso insaturado tal como ácido acrílico, ácido oleico, ácido linólico, ácido linolénico y ácido aatearólico. El ácido graso insaturado puede ser un monoeno o un polieno.

Además, el aminoácido modificado también puede ser un \alpha-aminoácido formado reemplazando un grupo (excluyendo un grupo carboxilo y un grupo amino que constituye un enlace peptídico) de unión al átomo de carbono \alpha del \alpha-aminoácido por un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo saturado o insaturado.

En la presente invención, el aminoácido modificado también puede ser un aminoácido formado introduciendo un grupo alquilo C_{1-6} saturado o insaturado en el grupo amino del aminoácido.

El aminoácido no natural de la presente invención es el que tiene un grupo amino y un grupo carboxilo en los dos extremos de la molécula, e incluye por ejemplo NH_{2}-(CH_{2})_{3}CH(CH_{2}OH)-COOH, NH_{2}-(CH_{2})_{4}-COOH, NH_{2}-C(CH_{3})_{2}-(CH_{2})_{3}-COOH y NH_{2}-CH(CH_{3})-(CH_{2})_{2}-CH(CH_{3})-COOH. La longitud de su cadena molecular corresponde a la longitud de un dipéptido, pero el aminoácido no natural de la presente invención también incluye los que tienen la longitud de un péptido.

Además, el compuesto no aminoacídico de la presente invención incluye, por ejemplo, NH_{2}-CH(CH_{2}OH)-CH_{3}, CH_{3}-CH(R)-COOH, CH_{3}-CH(R)-CH_{3} donde la longitud de la molécula corresponde a la longitud de un péptido, o NH_{2}-(CH_{2})_{3}CH(CH_{2}OH)-CH_{3} y NH_{2}-(CH_{2})_{3}CH(R)-CH_{3} donde la longitud de la molécula corresponde a la longitud de un dipéptido.

Aquí, R representa un grupo sustituyente en una cadena lateral del aminoácido natural o en el carbono \alpha del aminoácido modificado mencionado anteriormente.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra la purificación de grelina a partir de extracto de estómago de rata, y el cambio de intensidad de fluorescencia por un aumento de la concentración de ion de calcio intracelular en células CHO-GHSR62 se muestra por la barra negra. La Fig. 1a muestra un perfil de exclusión molecular de Sephadex G-50 (fina) de una fracción de SP-III preparada a partir de 40 g de estómago de rata, para indicar que el peso molecular de las fracciones activas es de aproximadamente 3.000 Dalton. La Fig. 1b es un gráfico que muestra un perfil en la HPLC de intercambio iónico de CM secundaria y las fracciones activas eluidas a tiempos de retención de 55 a 56 minutos se purificaron adicionalmente por HPLC de fase inversa.

La Fig. 2 demuestra que se identificó la modificación de grelina con N-octanoílo. La Fig. 2a muestra el resultado del análisis de 2 \mug de grelina natural (superior) y grelina sintética y grelina desacilada sintética (inferior) por HPLC de fase inversa. La Fig. 2b es un gráfico que muestra cambios en la concentración de ion de calcio intracelular en células CHO-CHSR62 por grelina natural (línea continua), grelina sintética (línea de trazos cortos) y grelina desacilada sintética (línea de trazos largos).

La Fig. 3 es un gráfico que muestra la interacción específica de la grelina con células CHO-GHSR62, y la grelina se añadió en el momento indicado por la punta de flecha. La Fig. 3a es un gráfico que muestra cambios en la concentración de ion de calcio intracelular en células CHO-GHSR62 por grelina, GHRP-6 y GRF (GHRH), respectivamente. La Fig. b es un gráfico que muestra cambios en la concentración de ion de calcio intracelular en células CHO-GHSR62 por grelina en presencia (\medcirc) o en ausencia (\medbullet) de [D-Lys-3]-GRP-6, y también se muestra un cambio en la concentración de ion de calcio intracelular por GRF (GHRH) (triángulo negro).

La Fig. 4 muestra las secuencias de aminoácidos de precursores de grelina procedentes de rata y de ser humano, así como el resultado del análisis de expresión de estos precursores en diversos tejidos. La Fig. 4a muestra la comparación entre las secuencias de aminoácidos de precursores de grelina procedentes de rata y de ser humano, donde el mismo aminoácido está sombreado, el péptido señal está indicado por la línea de trazos, el sitio de escisión del péptido señal está indicado por el triángulo sombreado, el sitio de escisión en el lado del extremo carboxilo está indicado por el triángulo, el resto de grelina maduro está en un recuadro y la modificación con ácido n-octanoico está indicada por *. La Fig. 4b muestra el resultado de análisis de la expresión de grelina en una amplia diversidad de tejidos de rata por transferencia de Northern.

La Fig. 5 es un gráfico que muestra el efecto de la grelina in vitro e in vivo sobre la secreción de hormonas de la pituitaria. La Fig. 5a es un gráfico que muestra el cambio en intensidad de fluorescencia por un cambio en la concentración de ion de calcio intracelular en células cultivadas de pituitaria de rata en una fase inicial, donde el cambio tras la adición de grelina se indica por la línea continua y el cambio tras la adición de grelina desacilada por la línea de trazos. La Fig. 5b es un gráfico que muestra la secreción de hormonas de la pituitaria, donde la barra negra y la barra blanca muestran las concentraciones de niveles de hormona de la pituitaria en presencia y ausencia de grelina, respectivamente. La Fig. 5c es un gráfico que muestra la evolución a lo largo del tiempo de la concentración de hormona de la pituitaria en plasma después de inyectar grelina por vía intravenosa a ratas macho. En las Fig. 5b y 5c, GH es hormona del crecimiento, ACTH es adrenocorticotropina, FSH es hormona estimuladora del folículo, LH es hormona luteinizante, PRL es prolactina y TSH es hormona estimuladora del tiroides.

La Fig. 6 muestra la promoción del apetito tras la administración de grelina en el ventrículo, mostrándose la cantidad de alimento consumido (media \pm error típico) durante 2 horas después de la administración de grelina. La Fig. 6a demuestra que el intervalo de error para el efecto de la grelina es menor de 0,0001.

La Fig. 7 muestra el efecto de un fármaco administrado a ratas anestesiadas con uretano sobre la secreción de ácido gástrico, mostrando A y B los resultados de la administración de grelina de rata (rGrelina) e histamina, respectivamente. Cada símbolo indica un valor medio de 4 ratas, y el error típico se muestra por una barra de error. Como control, se administró solución fisiológica salina. El fármaco se administró en el momento indicado por la punta de
flecha.

La Fig. 8 es un gráfico que muestra la acción de la grelina de rata sobre la motilidad del estómago en ratas anestesiadas con uretano. La Fig. 8A muestra ondas típicas de motilidad del estómago tras la administración de solución fisiológica salina y grelina de rata (rGrelina), y la Fig. B es un gráfico que muestra un valor medio de 4 ratas junto con el error típico. El fármaco se administró en el momento indicado por la punta de flecha.

La Fig. 9 es un gráfico que muestra una curva patrón en radioinmunoensayos y la reactividad cruzada con anticuerpo. La Fig. 9a es un gráfico que muestra la inhibición de la unión, por diversas grelinas, de grelina de rata marcada con ^{125}I a un anticuerpo contra un fragmento de grelina amino-terminal, y la Fig. 9b es un gráfico que muestra la inhibición de la unión, por diversas grelinas, de grelina de rata marcada con ^{125}I a un anticuerpo contra un fragmento de grelina carboxilo-terminal. En las abscisas se muestra la cantidad de diversas grelinas/tubo de reacción, mientras que en las ordenadas se muestra la relación (%) entre la cantidad (B) de grelina de rata unida en presencia de diversas grelinas y la cantidad de la misma (B_{0}) en ausencia de las diversas grelinas. Los símbolos de los gráficos son los siguientes: grelina de rata (\medcirc); grelina humana (\medbullet); grelina de rata-27 (\Box); [Ser3(decanoil)]-grelina de rata (\lozenge); [Ser3(hexanoil)]-grelina de rata (\triangle); y grelina de rata sin ácidos grasos (\blacktriangledown).

Mejor modo para realizar la invención

Para que un péptido sirva como ligando endógeno para el receptor de GHS (GHS-R), la distribución del ligando endógeno en órganos o tejidos puede conocerse añadiendo un extracto de diversos órganos o tejidos a células que expresan GHS-R y midiendo la concentración de ion de calcio intracelular.

Las células que expresan GHS-R incluyen cepas derivadas del hipotálamo y de la glándula pituitaria que se sabe que expresan GHS-R de manera constante y sus tejidos, pero preferiblemente son células adecuadas, tales como células CHO, transformadas en las que se ha introducido el gen GHS-R, y que expresan el gen.

La fuerte actividad de liberación de Ca del péptido GHS endógeno de la presente invención no se encontró en el hipotálamo ni en la glándula pituitaria que expresan el péptido, sino en un extracto de estómago como órgano del sistema digestivo. Por lo tanto, es necesario examinar no sólo los tejidos y órganos que expresan dicho receptor, sino también una amplia diversidad de tejidos y órganos distintos para encontrar el ligando endógeno deseado para el receptor huérfano.

La concentración de ion de calcio intracelular puede medirse por cualquier método conocido en la técnica, preferiblemente por medio de FLIPR (Lector de Placas de Imágenes Fluorescentes, Molecular Devices Co., Ltd.) utilizando el cambio en la intensidad de fluorescencia de Fluo-4 AM (Molecular Probe Co., Ltd.) producido por un cambio en la concentración de iones de calcio.

Para obtener el péptido GHS endógeno deseado a partir de tejidos y órganos que se ha confirmado que presentan la actividad de liberación de Ca, puede usarse cualquier método de purificación conocido en la técnica.

Como método de purificación del péptido, es eficaz usar individualmente o en combinación técnicas cromatográficas de exclusión molecular, de intercambio iónico y de fase inversa después de una amplia diversidad de métodos de fraccionamiento, o usar dichas técnicas por separado, pero es posible usar no sólo estas técnicas cromatográficas, sino también cualquier medio eficaz para la purificación del péptido.

Para el aislamiento y purificación del péptido a partir de los tejidos y órganos, se desea la inactivación de las proteasas en los tejidos y órganos por tratamiento térmico en agua hirviendo para prevenir la degradación del péptido deseado por la acción de las proteasas. También son eficaces el tratamiento térmico y la eliminación de los tejidos y órganos con refrigeración en hielo para la extracción y purificación del péptido deseado.

Para confirmar que el péptido purificado que tiene la actividad de liberación de Ca tiene actividad inductora de la secreción de GH in vitro e in vivo, puede utilizarse un método conocido.

Por ejemplo, la GH secretada en un medio de cultivo de células de glándula pituitaria que se ha confirmado que secretan GH y expresan GHS-R puede medirse in vitro en radioinmunoensayos añadiendo anticuerpo anti-GH a las células. Usando un anticuerpo contra otra hormona en lugar del anticuerpo anti-GH en radioinmunoensayos, también puede medirse la cantidad de dicha hormona secretada.

Además, la actividad inductora de la secreción de GH in vivo puede confirmarse inyectado el péptido que tiene actividad de liberación de Ca en una vena periférica de un animal y después midiendo la concentración de GH en suero.

Para analizar la estructura del péptido purificado, puede usarse un método conocido.

Para determinar la secuencia de aminoácidos del péptido, existe un método en el que se liberan secuencialmente restos aminoacídicos del extremo carboxilo por degradación de Edman, seguido de la identificación de los aminoácidos liberados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), así como una versión automática de este método por un secuenciador de aminoácidos.

También existe un método para determinar la secuencia de aminoácidos midiendo los pesos moleculares de fragmentos ionizados por GC-MASS.

En el caso del péptido que contiene aminoácidos modificados en un aspecto de la presente invención, el aminoácido modificado se identifica como "aminoácido desconocido" tras la determinación de la secuencia de aminoácidos.

En este caso, el péptido modificado se descompone en unidades de aminoácidos de las cuales se separa y purifica el aminoácido modificado, y la estructura del aminoácido modificado se determina de una manera habitual para determinar la estructura del compuesto, con lo que puede conocerse la estructura entera del péptido. Como alternativa, existe un método en el que el péptido se obtiene a partir de un ADNc que codifica el péptido modificado, después se sintetiza químicamente un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos del péptido resultante y las propiedades físicas y el peso molecular del péptido no modificado sintético se comparan con las del péptido modificado para estimar la estructura del grupo modificado.

Una secuencia de aminoácidos parcial (secuencia central) que, en el péptido determinado estructuralmente de esta manera, es esencial para la actividad de liberación de Ca se revela midiendo la actividad de liberación de Ca de cada fragmento peptídico formado por escisión de dicho péptido con una proteasa.

La proteasa usada será una proteasa muy específica para la secuencia de aminoácidos del péptido a escindir, pero también puede usarse una proteasa poco específica en condiciones de digestión parcial para preparar diversos fragmentos peptídicos a partir de dicho péptido.

Midiendo la actividad de liberación de Ca de cada fragmento peptídico preparado de esta manera, puede conocerse una secuencia central esencial para la actividad de liberación de Ca.

En el péptido inductor de la secreción de GH endógena, la tercera serina del extremo amino se ha acilado con un ácido graso, y también es posible sintetizar químicamente un fragmento peptídico que tenga una parte de la secuencia de aminoácidos del péptido inductor de la secreción de GH endógena, así como un péptido modificado con ácido graso que comprende un ácido graso unido a través de un enlace éster a la cadena lateral de serina en dicho fragmento peptídico.

Usando dicho fragmento peptídico, puede analizarse con detalle el péptido inductor de la secreción de GH endógena. Simultáneamente, el tipo de ácido graso necesario para la actividad de liberación de Ca puede determinarse comparando los fragmentos peptídicos modificados con diversos ácidos grasos.

Por ejemplo, en el péptido inductor de la secreción de GH endógena procedente de algunas especies de Xenopus laevis, un resto aminoacídico en la tercera posición desde el extremo amino no es serina sino treonina, y dicha treonina se ha acilado con un ácido graso, pudiendo también sintetizarse este compuesto de tipo péptido y pudiendo analizarse dicho compuesto con detalle.

Comparando las secuencias de aminoácidos de los péptidos que tienen una actividad de inducción de la secreción de GH en vertebrados, puede encontrarse una región ampliamente conservada en vertebrados, y partir de la secuencia de aminoácidos de dicha región, puede encontrarse una secuencia central esencial para la actividad inductora de la secreción de GH.

Se sintetiza químicamente un ADN con una secuencia de nucleótidos deducida a partir de la secuencia de aminoácidos del péptido inductor de la secreción de GH endógena y este ADN se usa como sonda para investigar una biblioteca de ADNc preparada a partir de ARNm en células que expresan dicho péptido, con lo que puede obtenerse un ADNc que codifica dicho péptido.

Sin embargo, un codón correspondiente a un aminoácido está degenerado aumentando de esta manera el número de secuencias de nucleótidos deducidas a partir de la secuencia de aminoácidos del péptido, de forma que la selección por medio del uso de un cierto ADN sintético consistente en diversos tipos de estas secuencias de nucleótidos como sonda puede ser difícil.

En este caso, si una secuencia de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de dicho péptido está presente en secuencias de aminoácidos deducidas a partir de la secuencia de nucleótidos de una secuencia marcadora expresada (EST) descrita en una base de datos de secuencias, puede sintetizarse un ADN consistente en una parte de la secuencia de nucleótidos de EST y usarse para investigar la biblioteca de ADNc anterior.

Además, puede obtenerse un ADN genómico de la manera habitual a partir del ADNc.

A partir de la secuencia de nucleótidos del ADNc obtenido de esta manera, se revela la secuencia de aminoácidos de un polipéptido precursor del péptido inductor de la secreción de GH endógena.

Analizando dicha secuencia de aminoácidos, se revelan el péptido señal, el péptido inductor de la secreción de GH endógena, otros restos peptídicos y sitios de escisión de estos péptidos, revelándose de esta manera el mecanismo de formación del péptido de inducción de la secreción de GH endógena.

En la descripción de la Solicitud de Patente Internacional WO 98/42840 se describen otros aspectos de la presente invención, es decir, una secuencia de aminoácidos parcial del péptido inductor de la secreción de GH endógena, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido precursor de dicho péptido y la secuencia de nucleótidos de un ADN que codifica dicho polipéptido, pero el péptido descrito en este documento es un péptido consistente en 14 aminoácidos que tiene una actividad de tipo motilina, y no hay ninguna descripción en el documento mencionado de la actividad de aumento de la concentración de Ca y la actividad de inducción de la secreción de GH descrita en la presente invención.

El compuesto de tipo péptido de la presente invención se refiere a un péptido que tiene la actividad de aumentar la concentración de ion de calcio intracelular, que se representa por la fórmula (2) presentada más adelante donde al menos un aminoácido se reemplaza por un aminoácido modificado; un análogo peptídico del mismo donde al menos un aminoácido se reemplaza por un no aminoácido; y un derivado peptídico del mismo donde se ha modificado el extremo amino y/o el extremo carboxilo.

En la presente invención, el péptido, análogo peptídico y derivado peptídico descrito anteriormente se denominan colectivamente compuesto de tipo péptido.

En el compuesto de tipo péptido, una pluralidad de aminoácidos pueden reemplazarse por aminoácidos modificados y/o no aminoácidos. En la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 2, en la presente invención es preferible que normalmente uno o más aminoácidos del 1^{er} al 10º aminoácido desde el extremo amino, preferiblemente del 1^{er} al 4º aminoácido o del 1^{er} al 5º aminoácido desde el extremo amino se reemplacen por aminoácidos modificados y/o no aminoácidos.

En la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 2, pueden añadirse o delecionarse uno o más aminoácidos fuera del 1^{er} al 4º aminoácido, preferiblemente del 1^{er} al 6º aminoácido y más preferiblemente del 1^{er} al 10º aminoácido desde el extremo amino.

El compuesto de tipo péptido de la presente invención preferiblemente es un compuesto peptídico que tiene la actividad de aumentar la concentración de ion de calcio intracelular e induce la secreción de hormona del crecimiento in vivo, donde al menos un aminoácido se ha reemplazado por un aminoácido modificado y/o un compuesto no aminoacídico.

Es decir, el compuesto de tipo péptido de la presente invención es un compuesto de tipo péptido que tiene la actividad de aumentar la concentración de ion de calcio intracelular y/o la acción de inducir la secreción de hormona del crecimiento in vivo, donde un aminoácido de la cadena peptídica se ha reemplazado por un aminoácido modificado y/o un compuesto no aminoacídico.

Los ejemplos del compuesto incluyen los compuestos en los que en el péptido mostrado en la SEC ID Nº: 1, 2 ó 3, un grupo hidroxilo del aminoácido Ser 3 está acilado, los compuestos en los que en el péptido mostrado en la SEC ID Nº: 4 ó 5, un grupo hidroxilo del 25º aminoácido Ser está acilado, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Otros ejemplos incluyen los compuestos en los que en el péptido mostrado en la SEC ID Nº: 10, 11, 16 ó 17, un grupo hidroxilo del aminoácido Ser 3 está acilado, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Otros ejemplos incluyen los compuestos en los que, en el péptido mostrado en la SEC ID Nº: 22, 25, 26 ó 27, un grupo hidroxilo del aminoácido Ser 3 está acilado, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Otros ejemplos incluyen los compuestos en los que, en el péptido mostrado en la SEC ID Nº: 29 ó 30, un grupo hidroxilo del aminoácido Ser 3 está acilado, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Otros ejemplos incluyen los compuestos en los que, en el péptido mostrado en la SEC ID Nº: 28, un grupo hidroxilo del aminoácido Thr 3 está acilado, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

El grupo acilo introducido en un grupo hidroxilo por acilación en la presente invención es un grupo formado retirando un grupo hidroxilo, por ejemplo, de un ácido carboxílico orgánico, un ácido sulfónico orgánico o un ácido fosfórico orgánico.

El ácido carboxílico orgánico incluye, por ejemplo, ácidos grasos, y el número de átomos de carbono del mismo, preferiblemente, es de aproximadamente 2 a 35, más preferiblemente de aproximadamente 6 a 18, y aún más preferiblemente de aproximadamente 8 a 16. Estos ácidos grasos incluyen, por ejemplo, ácido octanoico (preferiblemente ácido caprílico), ácido decanoico (preferiblemente ácido cáprico), y ácido dodecanoico (preferiblemente ácido laurílico [sic: ácido láurico]), así como sus ácidos grasos monoeno o polieno.

En el ácido sulfónico orgánico o el ácido fosfórico orgánico, el número de átomos de carbono es preferiblemente de aproximadamente 2 a 35.

También son realizaciones preferidas de la presente invención compuestos de tipo péptido o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, que incluyen la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 1, donde un grupo hidroxilo de la 3ª Ser está acilado.

Es decir, en el segundo aspecto de la presente invención, también son realizaciones preferidas de la presente invención cualquier compuesto de tipo péptido o sales farmacéuticamente aceptables del mismo, incluyendo péptidos modificados con ácidos grasos, en el que un grupo hidroxilo de la 3ª Ser está acilado en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 8, preferiblemente la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 1 y más preferiblemente la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 9.

Además, también son realizaciones preferidas de la presente invención cualquier compuesto peptídico o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, incluyendo péptidos modificados con ácidos grasos, en el que un grupo hidroxilo de la Thr 3 está acilado en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 8, preferiblemente la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 1 y más preferiblemente una secuencia de aminoácidos en la que, en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 9, el resto aminoacídico serina en la 3ª posición desde el extremo amino se convierte en treonina.

Además, en el presente documento se describe un compuesto o sales farmacéuticamente aceptables representadas por la fórmula (2):

(2)X-AA1-AA2-AA3-Y

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en la que X es un resto que corresponde a un átomo de hidrógeno en un grupo amino del aminoácido amino-terminal y representa H o un grupo alquilo o acilo saturado o insaturado que contiene uno o más átomos de carbono; Y es un resto que corresponde a un grupo hidroxilo en un grupo \alpha-carboxilo del aminoácido carboxilo-terminal y representa OH, OZ o NR6R7, con lo cual Z es un catión farmacéuticamente aceptable o un grupo alquilo inferior lineal o ramificado; y R6 y R7 pueden ser iguales o diferentes y representan H o un grupo alquilo inferior lineal o ramificado.

Aquí, AA1 representa:

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donde n es 1 ó 2, R_{1} y R_{1}' pueden ser iguales o diferentes y representan hidrógeno o un grupo sustituyente, con la condición de que cuando n es 2, los dos grupos sustituyentes R_{1} pueden ser iguales o diferentes; esto también se aplica a R_{1}'.

Los ejemplos del grupo sustituyente incluyen (1) una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene uno o más átomos de carbono que se une, en un modo de enlace seleccionado entre el grupo que consiste en éster, éter, tioéster, tioéter, amida y carbamida a través o no de una cadena alquilo que contiene uno o más átomos de carbono, (2) H o una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene uno o más átomos de carbono, y (3) una cadena lateral de un aminoácido natural.

Además, el grupo sustituyente puede ser una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene uno o más átomos de carbono, que se une a través de un enlace disulfuro o tiocarbamida a través o no de una cadena alquilo que contiene uno o más átomos de carbono.

AA2 representa:

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donde R_{1} y R_{1}' tienen los mismos significados que se han definido anteriormente, y R_{2} representa H o un grupo alquilo saturado o insaturado que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, o AA2 representa -CH_{2}-CH(R_{1})-CH_{2}- o -CH_{2}-CH(R_{1})-CO- con lo que R_{1} tiene el mismo significado que se ha definido anteriormente.

AA3 representa:

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donde m es un número entero de 1 o más, y R_{1}, R_{1}' y R_{2} tienen los mismos significados que se han definido anteriormente, con la condición de que cuando m es un número entero de 2 o más, los dos grupos sustituyentes R_{1} puedan ser iguales o diferentes; esto también se aplica a R_{1}' y R_{2}.

El alquilo saturado o insaturado que contiene uno o más átomos de carbono, que se representa por X, es preferiblemente alquilo C_{1-20} tal como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo, t-butilo, n-heptilo, n-hexilo, n-decilo, vinilo, propanilo o hexenilo.

El acilo representado por X incluye acilo de ácido carboxílico C_{1-10} tal como formilo, acetilo, propionilo o benzoílo, o acilo de ácido sulfónico C_{7-13} tal como bencenosulfonil naftaleno sulfonilo o similares.

El grupo representado por R_{1} o R_{1}' es preferiblemente un grupo representado, por ejemplo, por la fórmula (2):

(2)-(CH_{2})_{n} - P - Q

(en la que n es un número entero de 0 a 10, P es -CO-O-, -O-CO-, -O-, -CO-S-, -CS-S-, -S-CO-, -S-, -CO-NH-, -NH-CO- o -CO-NH-CO-, Q es H o alquilo C_{1-20} representado por X descrito anteriormente). Además, P también puede ser -CO-.

Más preferiblemente, P es: -CO-O-, -CO-, -O-, -S-, -S-S-, -CO-S-, -CO-NH-, -NH-CO- o -NH-CS-.

El grupo representado por R_{1} o R_{1}' puede ser un grupo que tiene Q unido directamente a -(CH_{2})_{n}, no a través de P.

Se prefiere que el grupo alquilo inferior representado por Z, R_{6} o R_{7} sea alquilo C_{1-6} tal como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo, t-butilo, i-butilo, n-pentilo o n-hexilo.

En lo sucesivo, se describen realizaciones preferidas de los compuestos peptídicos de acuerdo con la presente invención.

(1) Realizaciones preferidas de AA1: (A) aminoácidos o péptidos tales como Ser, Gly-Ser o -NH-(CH_{2})_{3}CH(CH_{2}OH)CO- donde un resto de enlace peptídico entre dos restos aminoacídicos es -(CH_{2})_{2}- y (B) aminas primarias, por ejemplo -NH-(CH_{2})_{3}CH(CH_{2}OH)CH_{2}- donde un resto de enlace peptídico entre dos aminoácidos es -(CH_{2})_{2}-;
-NH-(CH_{2})_{3}CH(R_{1})CH_{2}- donde un resto de enlace peptídico entre dos aminoácidos es -(CH_{2})_{2}-, donde R_{1} tiene los mismos significados que se han definido anteriormente; y -NH-CH(CH_{2}OH)CH_{2}-.

Como aminoácidos o péptidos (A), también pueden darse como ejemplos NH_{2}-(CH_{2})_{4}-COOH, NH_{2}-C(CH_{3})_{2}-(CH_{2})_{3}-COOH y NH_{2}-CH(CH_{3})-(CH_{2})_{2}-CH(CH_{3})-COOH.

(2) Realizaciones preferidas de AA2: (A) aminoácidos tales como Ser, homoSer, Cys, homoCys, Asp, Glu, Lys, Ala, Val, Leu, homoLeu, Ile, homoIle, ornitina, ácido aminoadípico, metionina, etionina, butionina y S-metilcisteína, entre los que se prefiere particularmente Ser, y (B) estructuras distintas de restos aminoacídicos; por ejemplo, pueden mencionarse -CH_{2}-CH(R_{1})-CO-, -CH_{2}-CH(R_{1})-CH_{2}-, etc. donde R_{1} tiene los mismos significados que se han definido anteriormente.

En particular, se prefieren aminoácidos (a) con una cadena lateral hidrófoba, tales como leucina, valina, norleucina, homoleucina, homoisoleucina, naftil alanina o sus análogos, triptófano, fenilalanina, ciclohexilalanina etc. o N-metilaminoácidos de los mismos. Además, se prefieren aminoácidos (b) con una cadena lateral que tiene un grupo funcional que puede modificarse con un grupo acilo, grupo alquilo, grupo alquenilo o grupo aralquilo, tales como serina, homoserina, treonina, cisteína, homocisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido adípico, lisina, ornitina etc. y N-metilaminoácidos de los mismos.

Un grupo acilo, grupo alquilo, grupo alquenilo o grupo aralquilo etc. se unen a las cadenas laterales de los aminoácidos (b) a través de un enlace éster, amida, disulfuro, éter, tioéter, tioéster, carbamida o tiocarbamida. Además, un grupo alquilo o aralquilo puede unirse al carbono \alpha del aminoácido.

(3) Realizaciones preferidas de AA3: Aminoácidos o péptidos tales como Phe o un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos desde la 4ª Phe a la 28º Arg del extremo amino de la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 2 ó 3, o péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos en la que en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 2 ó 3, un aminoácido se deleciona secuencialmente partiendo del aminoácido del extremo carboxilo hasta la 5ª Leu del extremo amino. Por ejemplo, AA3 incluye:

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Por supuesto, los aminoácidos ejemplificados como AA3 pueden ser L-aminoácidos o D-aminoácidos. Además, en las secuencias de aminoácidos ejemplificadas como AA3, pueden reemplazarse de uno a varios aminoácidos (preferiblemente hasta aproximadamente 1/3 de la secuencia de aminoácidos) por unidades de aminoácidos no naturales o unidades que no son aminoácidos, por ejemplo:

-NH-(CH_{2})_{3}CH(CH_{2}OH)-

-NH-(CH_{2})_{3}CH(CH_{2}OH)CO-

-NH-CH(CH_{2}OH)CH_{2}-

-NH-(CH_{2})_{3}CH(R_{1})CH_{2}-

-CH_{2}-CH(R_{1})-CO-, o

-CH_{2}-CH(R_{1})-CH_{2}-

donde R_{1} tiene los mismos significados que se han definido anteriormente. Cuando AA3 contiene una pluralidad de grupos representados por las fórmulas anteriores y una pluralidad de grupos representados por R_{1}, estos grupos son iguales o diferentes.

Además, cualquier aminoácido ejemplificado como AA3 puede tener grupos sustituyentes representados por R_{1} como se ha descrito anteriormente. Cuando está presente una pluralidad de grupos R_{1} en un grupo representado por AA3, estos grupos R_{1} pueden ser iguales o diferentes.

Cuando los aminoácidos que constituyen el péptido tienen un grupo hidroxilo, grupo mercapto, grupo imino o grupo amino en sus cadenas laterales, los ejemplos preferidos de tales cadenas laterales son los mostrados a continuación. En los siguientes ejemplos, R_{8} es un grupo alquilo saturado o insaturado que contiene uno o más átomos de carbono. Tal cadena alquilo puede tener los mismos significados que se han definido para la cadena alquilo descrita anteriormente mostrada por X.

A) Cadena lateral de Ser; -CH_{2}-O-CO-R8 o -CH_{2}-O-R8,

B) Cadena lateral de homoSer; -CH_{2}-CH_{2}-O-CO-R8 o -CH_{2}-CH_{2}-O-R8,

C) Cadena lateral de Cys; -CH_{2}-S-CO-R8 o -CH_{2}-S-R8,

D) Cadena lateral de homoCys; -CH_{2}-CH_{2}-S-CO-R8 o -CH_{2}-CH_{2}-S-R8,

E) Cadena lateral de Asp; -CH_{2}-COO-R8 o -CH_{2}-CO-NH-R8,

F) Cadena lateral de Glu; -CH_{2}-CH_{2}-COO-R8 o -CH_{2}-CH_{2}-CO-NH-R8

G) Cadena lateral de Lys; - (CH_{2})_{4}-NH-CO-R8,

H) Cadena lateral de ácido aminoadípico; -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-COO-R8 o CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CO-NH-R8,

I) Cadena lateral de ornitina; - (CH_{2})_{3}-NH-CO-R8,

J) Una cadena lateral alquilo en un aminoácido tal como Ala, Val, Leu, homoleucina, Ile, homoisoleucina, S-metil cisteína, metionina, etionina o butionina puede ser un grupo alquilo modificado mostrado en la fórmula (2) como se ha descrito anteriormente.

Además, la presente invención incluye, como realizaciones preferidas, un agente para aumentar la concentración de ion de calcio intracelular o un agente para inducir la secreción de GH, como se define en las reivindicaciones, que comprende un péptido parcial que consiste en los aminoácidos desde el extremo amino al 13º, 14º o 15º aminoácido de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 ó 3, como se define en las reivindicaciones. En este caso, no siempre es necesario que las unidades de aminoácidos respectivas que constituyen el péptido parcial estén modificadas químicamente, con la excepción del segundo o tercer aminoácido desde el extremo amino.

Además, una realización preferida de la presente invención es el siguiente compuesto de tipo péptido.

Un derivado de grelina se refiere a un compuesto de tipo péptido en el que la estructura química de la grelina natural está parcialmente modificada, y grelina de cadena corta se refiere a un péptido que consiste en menos de 27 ó 28 aminoácidos, que procede de la grelina natural de 27 a 28 aminoácidos por deleción de algunos de los aminoácidos. Además, un resto aminoacídico en la posición n se refiere a un resto aminoacídico en la posición n desde el extremo amino.

El aminoácido del extremo amino de la grelina o su derivado de grelina de cadena corta puede ser cualquier aminoácido (el aminoácido del extremo amino de la grelina natural es glicina), siempre que el grupo \alpha-amino de dicho aminoácido no esté protegido, o puede ser un D- o L-aminoácido, pero preferiblemente es alanina, valina, ácido aminoisobutanoico o ácido butanoico.

El 2º resto puede ser cualquier aminoácido (por ejemplo, serina en la grelina natural), preferiblemente un aminoácido que tiene una cadena lateral pequeña, tal como alanina, serina, histidina, norvalina o un compuesto no aminoací-
dico.

El 1^{er} y 2º restos pueden ser un \delta-aminoácido correspondiente a dos aminoácidos, por ejemplo, ácido 5-aminopentanoico, ácido 5-amino-5-dimetilpentanoico, ácido 2,5-diaminopentanoico, etc., ejemplificados en los Ejemplos.

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Los restos aminoacídicos seleccionados en la 3ª y 4ª posiciones pueden ser D- o L-aminoácidos, D- o L-N-metilaminoácidos, o una combinación de estos aminoácidos. En particular, es preferible que el aminoácido de la 3ª posición sea un L-aminoácido o los dos aminoácidos de la 3ª y 4ª posiciones sean L-aminoácidos.

La configuración estérica de los restos aminoacídicos seleccionados en la 3ª y 4ª posiciones puede seleccionarse de manera adecuada dependiendo de la secuencia de aminoácidos en la 1ª y 2ª posiciones. Es decir, los restos de la 3ª y 4ª posiciones son preferiblemente L-aminoácidos en el caso de la secuencia de aminoácidos Gly-Ser en la 1ª y 2ª posiciones de la grelina natural, mientras que los restos de la 3ª y 4ª posiciones pueden ser D-aminoácidos en el caso de otra secuencia de aminoácidos tal como Aib-His. Además, si los restos de la 1ª y 2ª posiciones son un \delta-aminoácido (por ejemplo, ácido aminopentanoico) que tiene una longitud de 2 aminoácidos, los restos de la 3ª y 4ª posiciones pueden ser L- o D-aminoácidos.

Los restos aminoacídicos seleccionados en la 3ª y 4ª posiciones son preferiblemente D- o L-aminoácidos tales como leucina, valina, norleucina, homoleucina, homoisoleucina, naftil alanina y sus homólogos, triptófano, fenilalanina y ciclohexil alanina o D- o L-N-metilaminoácidos de los mismos.

Más preferiblemente, los restos aminoacídicos seleccionados entre los aminoácidos hidrófobos descritos anteriormente en la 3ª y 4ª posiciones son aminoácidos hidrófobos aromáticos tales como naftil alanina y sus homólogos, triptófano,fenilalanina y ciclohexil alanina.

Además, los restos aminoacídicos seleccionados en la 3ª y 4ª posiciones son preferiblemente aminoácidos básicos tales como lisina, arginina e histidina. Especialmente, se prefiere lisina.

La molécula de grelina es básica por estos aminoácidos básicos, mejorando adicionalmente de esta manera la actividad de liberación de Ca.

Los restos aminoacídicos seleccionados en la 3ª y 4ª posiciones son preferiblemente los que tienen grupos funcionales en sus cadenas laterales, que pueden modificarse con un grupo acilo (grupo alcanilo, grupo alquenonilo o grupo aril alcanilo), un grupo alquilo o un grupo aralquilo, y los ejemplos preferidos de tales restos aminoacídicos incluyen serina, homoserina, treonina, cisteína, homocisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido adípico, lisina, ornitina, etc.

Los aminoácidos que tienen estas cadenas laterales reactivas pueden ser D- o L-aminoácidos o sus D- o L-N-metil aminoácidos correspondientes, pero se prefiere particularmente que el resto de la 3ª posición sea un L-aminoácido o los restos de la 3ª y 4ª posiciones sean L-aminoácidos.

Además, a las cadenas laterales de estos aminoácidos puede unirse un grupo acilo tal como un grupo alcanilo (el número de átomos de carbono del mismo es de 2 a 35, preferiblemente de 6 a 18, y más preferiblemente de 8 a 12), un grupo alquenonilo (el número de átomos de carbono del mismo es de 2 a 35, preferiblemente de 6 a 18, y más preferiblemente de 8 a 12), un grupo aril alcanilo (grupo benzoílo, fenacetilo, fenil butirilo, naftoílo, naftil acetilo o naftil propionilo, etc.), un grupo alquilo (el número de átomos de carbono del mismo es de 2 a 35, preferiblemente de 6 a 18, más preferiblemente de 8 a 12), o un grupo aralquilo (grupo bencilo, fenetilo, fenil propilo, fenil butilo, fenil pentilo, naftil metilo, etc.) a través de un enlace carbamato, tiocarbamato, éster, amida, disulfuro, éter, tioéter o tioéster. Además, los grupos alquilo y aralquilo mencionados anteriormente pueden unirse de una manera distinta que a través de un enlace a los átomos de carbono \alpha de los aminoácidos de la 3ª y 4ª posiciones.

La combinación de restos aminoacídicos seleccionados en la 3ª y 4ª posiciones es preferiblemente una combinación de un aminoácido que tiene una cadena lateral hidrófoba como resto aminoacídico de la 3ª posición y un aminoácido hidrófobo como resto aminoacídico de la 4ª posición.

El resto aminoacídico de la 3ª posición que tiene una cadena lateral hidrófoba preferiblemente es un aminoácido modificado en cuyo carbono \alpha (a) se introdujo una cadena alquilo saturada o insaturada que contenía uno o más átomos de carbono a través o no de un grupo alquileno que contenía uno o más átomos de carbono y a través de un enlace éster, éter, tioéter, amida o disulfuro, o (b) se introdujo una cadena alquilo saturada o insaturada que contenía uno o más átomos de carbono. En particular, es más preferido un aminoácido modificado en cuyo carbono \alpha se introdujo una cadena alquilo saturada que contenía uno o más átomos de carbono.

El grupo carboxilo del aminoácido de la 4ª posición puede ser una amida, una alquil amida (por ejemplo, metil amida o etil amida), o una aralquil amida (por ejemplo, bencil amida, adamantano amida o adamantano alquil amida).

Además, un grupo básico tal como un grupo amino o un grupo guanidino puede unirse al alquilo o aralquilamida. El grupo básico incluye, por ejemplo, -CONH-CH_{2}CH_{2}-NH_{2}, -CONH-CH_{2}NHCH_{3}, -CONH-CH_{2}CH_{2}CH_{2}-NH-C(NH_{2})=NH y -CONHCH_{2}Ph-NH_{2}.

Puede añadirse un aminoácido básico tal como arginina, lisina e histidina al grupo carboxilo del aminoácido de la 4ª posición, y este aminoácido básico puede ser un D- o L-aminoácido, un racemato o un D- o L-N-metilamino-
ácido.

El grupo carboxilo del aminoácido puede ser un alquilo o aralquil amida como se ha descrito anteriormente. Además, puede añadirse un grupo básico tal como un grupo amino o un grupo guanidino al alquilo o aralquil amida. El grupo básico incluye los que se han ejemplificado anteriormente.

Como secuencia de aminoácidos del aminoácido de la 5ª posición y los aminoácidos siguientes, puede añadirse al aminoácido en la 4ª posición una secuencia de cualquier longitud consistente en leucina en la 5ª posición y los aminoácidos posteriores hasta el aminoácido de la 28ª posición en grelina humana o de rata.

Tales secuencias de aminoácidos son preferiblemente grelina (1-5), grelina (1-6), grelina (1-7), grelina (1-8), grelina (1-9), grelina (1-10) y grelina (1-11), donde grelina (m-n) se refiere a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos en las posiciones m a n desde el extremo amino de la grelina. En particular, se prefiere la grelina (1-5).

El extremo carboxilo del mismo es preferiblemente un alquilo o aralquil amida como se ha descrito anteriormente.

Además, un grupo básico tal como un grupo amino o un grupo guanidino puede unirse al alquilo o aralquil amida. El grupo básico incluye los ejemplificados anteriormente.

Además, un aminoácido básico tal como arginina, lisina e histidina puede añadirse al aminoácido del extremo carboxilo de un derivado de grelina delecionado en el extremo carboxilo en el que se añadió una secuencia de aminoácidos de cualquier longitud consistente en los aminoácidos desde el aminoácido de la 5ª posición hasta el aminoácido de la 28ª posición al extremo carboxilo de la grelina (1-4).

Este aminoácido básico puede ser un D- o L- aminoácido, un racemato o D- o L-N-metil aminoácido.

El grupo carboxilo del aminoácido básico puede ser un alquilo o aralquil amida como se ha descrito anteriormente. Además, un grupo básico tal como un grupo amino o guanidino puede unirse al alquilo o aralquil amida. El grupo básico incluye los ejemplificados anteriormente.

En una realización particularmente preferida, el aminoácido del extremo carboxilo de la grelina (1-5), grelina (1-6) y grelina (1-7) es un D- o L-aminoácido o su D- o L-N-metil aminoácido correspondiente.

Además, pueden añadirse aminoácidos básicos tales como arginina, lisina e histidina a los restos de la 5ª, 6ª y 7ª posiciones, y estos aminoácidos básicos pueden ser D- o L-aminoácidos, racematos o D- o L-N-metil aminoácidos.

El grupo carboxilo de dicho aminoácido básico puede ser un alquilo o aralquil amida como se ha descrito anteriormente. Además, un grupo básico tal como un grupo amino o un grupo guanidino puede unirse al alquilo o aralquil amida. El grupo básico incluye los ejemplificados anteriormente.

En una realización preferida de la presente invención, el compuesto peptídico de la presente invención en el caso en el que el extremo carboxilo es un alquilo o aralquil amida como se ha descrito anteriormente puede ser un derivado de amida en el que un grupo amino se une adicionalmente al grupo alquilo o aralquilo. Específicamente, puede mencionarse un compuesto peptídico en el que el extremo carboxilo es, por ejemplo, aminoetil amida.

El compuesto de tipo péptido de la presente invención en el que el extremo carboxilo es una amida o un derivado de amida como se ha descrito anteriormente, es un compuesto útil debido a su resistencia a la descomposición por enzimas tales como carboxipeptidasas in vivo.

De forma similar, el compuesto de tipo péptido de la presente invención que incluye N-metil aminoácidos también es un compuesto útil debido a su resistencia a enzimas.

El compuesto de tipo péptido de la presente invención puede obtenerse de una manera habitual. Por ejemplo, puede aislarse a partir de una fuente natural como se ha mencionado anteriormente o puede producirse por tecnología de ADN recombinante y/o síntesis química. Además, cuando se necesita una modificación (por ejemplo, acilación) en los restos aminoacídicos, el compuesto peptídico puede someterse a una reacción de modificación por métodos bien conocidos en la técnica.

Específicamente, el compuesto de tipo péptido de la presente invención puede obtenerse cultivando células hospedadoras transformadas con un vector de expresión que lleva un ADN que codifica el péptido de la presente invención y después recuperando el péptido deseado a partir del cultivo.

Seleccionando las células hospedadoras, puede obtenerse un compuesto que tenga el péptido deseado modificado, por ejemplo, por acilación en las células. Cuando dicho péptido no está modificado, puede realizarse una reacción de modificación tal como acilación cuando sea necesario por métodos bien conocidos en la técnica. Para la reacción de acilación, también pueden usarse enzimas tales como lipasas.

El vector en el que se va a integrar el gen incluye, por ejemplo, vectores de E. coli (pBR322, pUC18, pUC19 etc.), vectores de Bacillus subtilis (pUB110, pTP5, pC194 etc.), vectores de levaduras (tipo YEp, tipo YRp, tipo YIp), o vectores de células animales (retrovirus, virus vaccinia etc.), pero también puede usarse cualquier otro vector capaz de mantener la estabilidad génica deseada en células hospedadoras. El vector se introduce en células hospedadoras adecuadas. Para integrar el gen deseado en un plásmido e introducir el plásmido en células hospedadoras, pueden usarse métodos descritos en Molecular Cloning (Sambrook et al., 1989).

Para expresar el gen del péptido deseado en el plásmido anterior, un promotor se une operativamente cadena arriba de dicho gen.

El promotor usado en la presente invención puede ser cualquier promotor adecuado compatible con las células hospedadoras usadas para la expresión del gen deseado. Por ejemplo, puede usarse el promotor lac, el promotor trp, el promotor lpp, el promotor \lambdaPL, el promotor recA etc. en el género Escherichia como célula hospedadora a transformar; puede usarse el promotor SP01, el promotor SP02 etc. en el género Bacillus; puede usarse el promotor GAP, el promotor PH05, el promotor ADH etc. en levaduras; y puede usarse el promotor derivado de SV40, el promotor derivado de retrovirus etc. en células animales.

El vector que contiene el gen deseado obtenido de esta manera se usa para transformar células hospedadoras. Las células hospedadoras incluyen microorganismos (por ejemplo, el género Escherichia, el género Bacillus etc.), levaduras (el género Saccharomyces, el género Pichia, el género Candida etc.), células animales (células CHO, células COS, etc.) etc. El medio para el cultivo preferiblemente es un medio líquido y, de una manera particularmente preferida, el medio contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, etc. necesaria para el crecimiento de las células transformadas a cultivar. Si se desea, pueden añadirse vitaminas, promotores del crecimiento, suero, etc.

Para producir directamente el péptido modificado con ácido graso, las células preferiblemente son las que tienen la actividad de una proteasa de procesamiento capaz de cortar un sitio adecuado en un polipéptido precursor de dicho péptido y la actividad de acilar el resto de serina en dicho péptido. Pueden obtenerse células hospedadoras que tengan esta actividad proteasa de procesamiento y actividad de acilación de serina transformando células hospedadoras con un vector de expresión que contiene un ADNc que codifica dicho polipéptido precursor y después seleccionando las células transformadas confirmando si producen o no el péptido modificado con ácido graso que tiene una actividad de liberación de Ca o una actividad de inducción de la secreción de GH.

Después del cultivo, el péptido de la presente invención se separa y se purifica del cultivo de la manera habitual. Para extraer el producto deseado de los microorganismos o las células cultivadas, por ejemplo, se recogen los microorganismos o las células después del cultivo y se suspenden en un tampón que contiene un desnaturalizante de proteínas (por ejemplo, hidrocloruro de guanidina) y los microorganismos o las células se rompen por sonicación etc. y después se centrifugan. Para purificar el producto deseado del sobrenadante, pueden combinarse convenientemente métodos de separación y purificación tales como exclusión molecular, ultrafiltración, diálisis, SDS-PAGE y diversas técnicas cromatográficas teniendo en cuenta el peso molecular, solubilidad, carga (punto isoeléctrico), afinidad, etc. del producto deseado.

El compuesto peptídico de la presente invención puede sintetizarse químicamente de una manera habitual. Por ejemplo, aminoácidos que tienen grupos protectores se condensan por un método en fase líquida y/o un método en fase sólida para extender la cadena peptídica, después se retiran todos los grupos protectores de dichos aminoácidos por un ácido, y el producto bruto resultante se purifica por las técnicas de purificación anteriores para dar el compuesto peptídico deseado. Un resto aminoacídico en el sitio deseado puede acilarse selectivamente por una acilasa o acil transferasa.

Se han establecido bien varios métodos para la producción de péptidos, y el compuesto de tipo péptido de la presente invención también puede producirse fácilmente por estos métodos conocidos. Por ejemplo, el compuesto de tipo péptido puede sintetizarse por el método clásico de síntesis de péptidos o por el método en fase sólida.

En lo sucesivo, se describe un proceso para producir el compuesto peptídico de la presente invención por una combinación de tecnología de ADN recombinante y síntesis química haciendo referencia a los ejemplos.

Se sintetizan químicamente ésteres activos de péptidos amino-terminales, por ejemplo, (1) Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(R10)-Osu, (2) Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(R10)-Phe-Osu, y (3) Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(R10)-Phe-Leu-Osu, y después se unen a péptidos carboxilo-terminales producidos por tecnología de ADN recombinante, es decir, (4) FLSPEHQRVQQ
RKESKKPPAKLQPR, (5) LSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR, y (6) SPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR, respectivamente; es decir, (1) se une a (4), (2) a (5), y (3) a (6), con lo que se obtienen respectivamente compuestos peptídicos que consisten, cada uno, en 28 aminoácidos. Específicamente, XXXXZSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR se expresa en E. coli seguido de protección sus grupos amino con Boc2(O) para dar Boc-XXXX2SPEHQRVQQRK(Boc)ESK(Boc)K(Boc)PPAK(Boc)LQPR. Después, el péptido resultante se convierte en NH_{2}-SPEHQRVQQRK(Boc)ESK(Boc)K(Boc)PPAK(Boc)LQPR por escisión con una enzima selectiva por el extremo carboxilo del aminoácido Z. Este compuesto se mezcla con Boc-Gly-Ser(Bu)-Ser(R10)-Phe-Leu-Osu en una solución acuosa de neutra a débilmente alcalina, y el BocGlySer(Bu)Ser(R10)FLSPEHQRVQQRK(Boc)ESK(Boc)K(Boc)PPAK(Boc)LQPR resultante se trata con ácido trifluoroacético, con lo que puede obtenerse el producto deseado.

La notación de una letra anterior de los aminoácidos está de acuerdo con la descripción en Cellular Molecular Biology, 3ª edición, publicada el 10 de diciembre de 1997 por Newton Press Co., Ltd.

Además, Boc representa t-butiloxicarbonilo, Osu representa un resto derivado de N-hidroxisuccinimida por la eliminación de hidrógeno del grupo hidroxilo, Bu representa un grupo butilo y R10 representa el grupo sustituyente del aminoácido modificado de acuerdo con la presente invención.

Las sales del compuesto de tipo péptido de la presente invención preferiblemente son sales farmacéuticamente aceptables, incluyendo, por ejemplo, sales con bases inorgánicas, sales con bases orgánicas, sales con ácidos inorgánicos, sales con ácidos orgánicos y sales como aminoácidos básicos o ácidos.

Los ejemplos preferidos de las sales con bases inorgánicas incluyen sales de metales alcalinos tales como sales de sodio, sales de potasio, etc.; sales de metales alcalinotérreos tales como sales de calcio, sales de magnesio, etc.; y sales de aluminio, sales de amonio, etc.

Los ejemplos preferidos de las sales con bases orgánicas incluyen sales con trimetilamina, trietilamina, piridina, picolina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, diciclohexil amina, N,N'-dibenciletilendiamina, etc.

Los ejemplos preferidos de las sales con ácidos inorgánicos incluyen sales con ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, etc.

Los ejemplos preferidos de las sales con ácidos orgánicos incluyen sales con ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico, ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, etc.

Los ejemplos preferidos de las sales con aminoácidos básicos incluyen sales con arginina, lisina, ornitina, etc., y los ejemplos adecuados de las sales con aminoácidos ácidos incluyen sales con ácido aspártico, ácido glutámico, etc.

Entre estas sales, las más preferidas son las sales de sodio y las sales de potasio.

El compuesto de tipo péptido de la presente invención o las sales farmacéuticamente aceptables del mismo presentan baja toxicidad y tienen una acción de inducción de la secreción de GH, y pueden administrarse como tales o después de mezclarse con soportes, excipientes o vehículos potenciadores farmacéuticamente aceptables conocidos etc., a un mamífero (por ejemplo, un ser humano, ratón, rata, conejo, perro, gato, oveja, caballo, cerdo, mono, etc.). En el caso de la inyección intravenosa en un adulto, la dosis diaria es de 0,01 a 5 mg/kg, preferiblemente de 0,04 a 1,5 mg/kg. Esta dosis se administra deseablemente de una a tres veces al día. El compuesto de tipo péptido de la presente invención se mezcla con vehículos farmacéuticamente aceptables y puede administrarse por vía oral o parenteral en forma de preparaciones farmacéuticas sólidas tales como comprimidos, cápsulas, granulados, polvos, etc., o como preparaciones farmacéuticas líquidas tales como jarabes, inyecciones, etc.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen una gran diversidad de vehículos orgánicos o inorgánicos que se usan habitualmente como materiales farmacéuticos, y éstos se componen como vehículos, lubricantes, aglutinantes o disgregantes en preparaciones farmacéuticas sólidas o como disolventes, adyuvantes, agentes de suspensión, agentes para conferir isotonicidad, tampones y agentes suavizantes en preparaciones farmacéuticas líquidas.

Cuando sea necesario, también pueden usarse aditivos farmacéuticos tales como conservantes, antioxidantes, agentes colorantes, edulcorantes, etc.

Los ejemplos preferidos de los vehículos incluyen, por ejemplo, lactosa, azúcar blanca, D-manitol, almidón, celulosa cristalina, ácido silícico anhidro ligero, etc. Los ejemplos preferidos de los lubricantes incluyen estearato de magnesio, estearato cálcico, talco, sílice coloidal, etc.

Los ejemplos preferidos de los aglutinantes incluyen celulosa cristalina, azúcar blanca, D-manitol, dextrina, hidroxipropil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, polivinil pirrolidona etc.

Los ejemplos preferidos del disgregante incluyen almidón, carboximetil celulosa, carboximetil celulosa cálcica, croscalomelosa sódica, carboximetil almidón sódico etc.

Los ejemplos preferidos de los disolventes incluyen agua para inyección, alcohol, propilenglicol, macrogol, aceite de sésamo, aceite de maíz, etc.

Los ejemplos preferidos de los solubilizantes incluyen polietilenglicol, propilenglicol, D-manitol, benzoato de bencilo, etanol, trisaminometano, colesterol, trietanolamina, carbonato sódico, citrato sódico etc.

Los ejemplos preferidos del agente de suspensión incluyen tensioactivos tales como estearil trietanolamina, lauril sulfato sódico, ácido lauril aminopropiónico, lecitina, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio y monoestearato de glicerina, y polímeros hidrófilos tales como alcohol polivinílico, polivinil pirrolidona, carboximetil celulosa sódica, metil celulosa, hidroximetil celulosa, hidroxietil celulosa e hidroxipropil celulosa.

Los ejemplos preferidos de los agentes que confieren isotonicidad incluyen cloruro sódico, glicerina, D-manitol etc.

Los ejemplos preferidos de los tampones incluyen soluciones tampón tales como fosfatos, acetatos, carbonatos, citratos etc.

Los ejemplos preferidos de los agentes calmantes incluyen alcohol bencílico, etc.

Los ejemplos preferidos de los conservantes incluyen p-oxiesterbenzoatos, clorobutanol, alcohol bencílico, alcohol fenetílico, ácido deshidroacético, ácido sórbico etc.

Los ejemplos preferidos de los antioxidantes incluyen sulfitos, ácido ascórbico, etc.

La composición farmacéutica anterior produce un efecto aproximadamente igual o superior al efecto de la GH tras la administración y puede reducir varios efectos secundarios producidos por la administración de GH.

Como enfermedades atribuibles a la deficiencia o reducción de los niveles de GH, las enfermedades a las que puede aplicarse la composición farmacéutica o los efectos de la composición farmacéutica incluyen, pero sin limitación, activación de osteoblastos y reconstitución del hueso en personas con enanismo y seres humanos normales, aumento de la fuerza muscular y cantidad muscular en adultos con deficiencia de GH, mejora de la motilidad en adultos con deficiencia de GH, curación de quemaduras graves en niños, su uso combinado con gonadotropinas en la inducción de la ovulación, prevención de anomalías en el metabolismo de proteínas por medio de la administración de prednisona, promoción de la "educación" de las células T en trastornos inmunes graves, el efecto de inhibir la reducción del peso corporal en individuos de edad avanzada y el efecto de aumentar el tejido adiposo y prevenir la atrofia dérmica.

Además, las enfermedades o efectos no correlacionados directamente con la deficiencia o reducción de los niveles de GH incluyen, por ejemplo, el efecto de aumentar el flujo pulsátil como se muestra en el Ejemplo 7, y de esta manera es eficaz para el tratamiento de enfermedades cardíacas tales como insuficiencia cardíaca, etc.

El efecto de la composición farmacéutica no se restringe a seres humanos. Es decir, tiene un efecto sobre la promoción del crecimiento para animales, la reducción de grasa en carne, etc., que es igual o mayor que el de la GH administrada.

Por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo 13, la composición farmacéutica de la presente invención presenta una acción de promoción del apetito tras la administración en el ventrículo o la administración intravenosa, de manera que puede usarse como promotor del apetito para tratar la anorexia o sitofobia.

Además, como se muestra en el Ejemplo 14, la composición farmacéutica de la presente invención tiene una acción promotora de la motilidad del estómago y de la secreción de ácido gástrico, y de esta manera también puede usarse como agente para tratar enfermedades funcionales del estómago tales como dispepsia sin diabrosis, atonía del estómago ligera súbita, dispepsia funcional y esofagitis de reflujo.

Además, como se muestra, por ejemplo, en el Ejemplo 15, la composición farmacéutica de la presente invención presenta una acción promotora del crecimiento celular en médula ósea, duodeno y yeyuno por medio de administración intravenosa y, de esta manera, puede usarse como agente para proteger la túnica mucosa del intestino delgado, un agente para prevenir lesiones en la túnica mucosa del intestino delgado durante la nutrición intravenosa y un agente para tratar la osteoporosis.

Además, la composición farmacéutica descrita anteriormente tiene un efecto para tratar las enfermedades o para mejorar las situaciones físicas descritas más adelante.

Por ejemplo, puede usarse para el tratamiento estimulador para liberar hormonas del crecimiento en ancianos, la prevención de efectos secundarios catabólicos sobre los niveles de azúcar de los corticoides, la prevención y tratamiento de la osteoporosis, la estimulación del sistema inmune, la promoción de curación de lesiones, la promoción de reparación de huesos rotos, el tratamiento del retraso del crecimiento, el tratamiento de la insuficiencia renal o la insuficiencia funcional atribuible a un retraso del crecimiento, el tratamiento de estados de insuficiencia correlacionados con estados de insuficiencia fisiológica incluyendo niños con deficiencia de hormonas del crecimiento y enfermedades crónicas, el tratamiento de la obesidad y el retraso del crecimiento correlacionado con la obesidad, el tratamiento del retraso del crecimiento correlacionado con el síndrome Plauda-Villi y el síndrome de Taner, la promoción de la recuperación de pacientes con quemaduras y la reducción en la hospitalización, el tratamiento del retraso del crecimiento intrauterino, malformaciones esqueléticas, enfermedad por exceso de corticoides y síndrome de Cusshing, la inducción de la liberación de hormona del crecimiento pulsátil, el reemplazo de hormona del crecimiento en pacientes con estrés, malformación del cartílago, síndrome de Noonan, esquizofrenia, depresión, enfermedad de Alzheimer, curación del retraso de la reparación de lesiones y privación psicosocial, el tratamiento de la insuficiencia pulmonar y dependencia de órganos respiratorios, reducción de la reacción catabólica de proteínas después una operación mayor, reducción de pérdida de proteínas y caquexia producida por enfermedades crónicas tales como as cáncer y SIDA, el tratamiento de hiperinsulinemia incluyendo nesidioblastosis de páncreas, terapia coadyuvante para la inducción de la ovulación, y tratamiento de pacientes con represión inmune, mejora de la fuerza y motilidad muscular, mantenimiento del espesor de la piel en ancianos, homeostasis metabólica y renal, estimulación de osteoblastos, formación de hueso nuevo y estimulación del crecimiento del cartílago, y para estimular el crecimiento del timo y prevenir el deterioro en funciones tímicas que acompañan al envejecimiento.

Además, también se pueden esperar los siguientes efectos en animales. Por ejemplo, se menciona un aumento en la velocidad de crecimiento del animal, un aumento en la producción de leche y piel en animales, estimulación del sistema inmune en animales domésticos, tratamiento de enfermedades producidas por una edad avanzada en animales domésticos, promoción del crecimiento de animales domésticos y un aumento de la lana en ovejas.

Un anticuerpo cuyo antígeno es un péptido modificado con ácido graso de la presente invención que tiene actividad de liberación de Ca o actividad inductora de la secreción de GH puede obtenerse por un método conocido en la técnica. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, y puede obtenerse por un método conocido en la técnica. Además, un método para medir el péptido modificado con ácido graso usando dicho anticuerpo y un kit de medición usando dicho método de medición, también pueden hacer uso de un método conocido en la técnica.

Como se describe en el Ejemplo 17, se preparan respectivamente anticuerpos contra péptidos amino- y carboxilo-terminales de la grelina, y como el primero reconoce la serina modificada con ácido graso en la 3ª posición, los dos anticuerpos pueden usarse para separar y cuantificar la grelina modificada con un ácido graso y la grelina de la que se eliminó el ácido graso.

Los anticuerpos contra péptidos amino- y carboxilo-terminales de la grelina pueden obtenerse de un método conocido, y pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales.

En el caso del presente compuesto de tipo péptido que tiene un aminoácido modificado en la 3ª posición desde el extremo amino o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, también puede producirse de la misma manera un anticuerpo que reconoce específicamente una cadena lateral del 3^{er} resto aminoacídico (preferiblemente un ácido graso) y se une a un péptido parcial amino-terminal del compuesto de tipo péptido. Además, en el caso del compuesto de tipo péptido de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, también puede producirse de la misma manera un anticuerpo que se une específicamente al péptido que tiene un aminoácido modificado.

La presente invención también incluye un kit de examen que comprende una combinación de un anticuerpo que reconoce específicamente una cadena lateral del aminoácido modificado y un anticuerpo que reconoce aminoácidos (o un péptido), excluyendo el aminoácido modificado y/o un compuesto no aminoacídico, preferiblemente un anticuerpo contra un péptido parcial carboxilo-terminal del compuesto de tipo péptido de la presente invención o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se ha descrito anteriormente.

Además, la presente invención incluye un método de ensayo en el que el compuesto de tipo péptido de la presente invención que tiene un aminoácido modificado, preferiblemente un aminoácido acilado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el compuesto de tipo péptido de la presente invención que no contiene un aminoácido modificado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se separan y detectan mediante el uso de dicho kit de examen.

En lo sucesivo, el método de ensayo y el kit de examen descritos anteriormente se describen haciendo referencia a sus realizaciones que, sin embargo, no pretenden limitar la presente invención.

Es decir, el método de ensayo incluye, por ejemplo, (i) un método para cuantificar el compuesto de tipo péptido etc. de la presente invención en una solución de ensayo, que comprende permitir que un material de ensayo en una solución de ensayo y el compuesto de tipo péptido etc. de la presente invención marcado reaccionen competitivamente con un anticuerpo contra el compuesto de tipo péptido etc. de la presente invención, y después determinar la relación del compuesto de tipo péptido etc. de la presente invención marcado unido a dicho anticuerpo, y (ii) un método para cuantificar las proteínas etc. de la presente invención en una solución de ensayo, que comprende permitir que una solución de ensayo reaccione con el anticuerpo de la presente invención insolubilizado en un vehículo y otro anticuerpo marcado de la presente invención simultánea o sucesivamente y después medir la actividad del agente marcador en el vehículo de insolubilización y/o la actividad del agente marcador no capturado en el vehículo de insolubilización. En los métodos de cuantificación (i) y (ii), es preferible que un anticuerpo sea un anticuerpo que reconoce una región amino-terminal de la proteína etc. de la presente invención, mientras que el otro anticuerpo es un anticuerpo que reacciona con una región carboxilo-terminal de la proteína etc. de la presente invención.

En el método de ensayo del compuesto de tipo péptido etc. de la presente invención, el anticuerpo monoclonal contra dicho compuesto (también denominado en lo sucesivo anticuerpo anti-proteína) puede usarse no sólo para cuantificar la proteína etc. de la presente invención, sino también para detectarla por tinción de tejidos, etc.

Para estos fines, puede usarse la propia molécula de anticuerpo o una fracción F(ab')_{2}, Fab' o Fab de la molécula de anticuerpo.

El método para cuantificar el compuesto de tipo péptido etc. de la presente invención mediante el uso de dicho anticuerpo no se limita particularmente siempre que el método comprenda detectar la cantidad del anticuerpo correspondiente a la cantidad del antígeno (por ejemplo, la cantidad de la proteína), el antígeno o un conjugado de antígeno-anticuerpo en una solución de ensayo, por medios químicos o físicos, y calcularla basándose en una curva patrón preparada usando soluciones patrón que contienen cantidades conocidas del antígeno. Por ejemplo, preferiblemente se usan nefelometría, el método competitivo, el método inmunométrico y el método de tipo sándwich, pero se prefiere particularmente el método de tipo sándwich descrito más adelante con respecto a la sensibilidad y especificidad.

En relación con el método de medición usando un marcador en el método de ensayo de la presente invención, el marcador incluye, por ejemplo, un radioisótopo, una enzima, un material fluorescente y un material luminiscente.

El radioisótopo incluye, por ejemplo, ^{125}I, ^{131}I, ^{3}H, ^{14}C etc.

La enzima preferiblemente es una enzima estable con alta actividad específica, que incluye, por ejemplo, \beta-galactosidasa, \beta-glucosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa y malato deshidrogenasa.

El material fluorescente incluye, por ejemplo, fluorescamina e isocianato de fluoresceína.

El material luminiscente incluye, por ejemplo, luminol, derivados de luminol, luciferina y lucigenina.

Además, para unir el marcador al anticuerpo o antígeno puede usarse un sistema de biotina-avidina.

En lo sucesivo, la presente invención se describe con más detalle haciendo referencia a los ejemplos. A menos que se especifique ora cosa, los medios de manipulación genética estaban de acuerdo con Molecular Cloning (Sambrook et al., 1989).

Ejemplo 1 Creación de una cepa celular que expresa GHS-R y medición de la actividad de liberación de Ca

Para ensayar un aumento en la concentración de ion de calcio intracelular (actividad de liberación de Ca) que se produce tras la unión de un secretagogo de GH (GHS) al receptor de GHS (GHS-R), se creó una cepa celular que expresaba GHS-R de rata de la siguiente manera. Se obtuvo un ADNc de longitud completa de GHS-R de rata por RT-FCR (transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa) donde se usó como plantilla un ADNc derivado de cerebro de rata. A partir de la secuencia de nucleótidos del GHS-R de rata conocido [K. K. Mckee, et al., Molecular Endocrinology 11, 415-423 (1997)], se sintetizaron cebadores con sentido y antisentido consistentes en las siguientes secuencias de nucleótidos.

Cebador con sentido:	5'-ATGTGGAACGCGACCCCCAGCGA-3'

Cebador antisentido:	5'-ACCCCCAATTGTTTCCAGACCCAT-3'

El ADNc amplificado se unió al vector pcDNAIII (Invitrogen) para construir el vector de expresión GHSR-pcDNAIII. Se transformaron células CHO por medio del vector de expresión y se seleccionaron las células transformadas que expresaban de manera estable GHS-R en un medio que contenía 1 \mug/ml deG418. La cepa de células seleccionada CHO-GHSR62 respondía a GHRP-6 (hexapéptido de liberación de hormona del crecimiento) 10^{-10} a 10^{-9} M. Se midió el cambio en la concentración de ion de calcio intracelular (actividad de liberación de Ca) por un sistema FLIPR (Molecular Device). Antes de esta medición, se pusieron 4 x 10^{4} células CHO-GHSR62 en una microplaca de 96 pocillos con pocillos negros (Corning Co., Ltd) y se cultivaron durante 12 a 15 horas. Después, las células se incubaron con una concentración 4 \muM de colorante fluorescente Fluo4 (Molecular Probe Co., Ltd) durante 1 hora y se lavaron cuatro veces con BSS de Hank (Solución Salina Equilibrada de Hank) que contenía Hepes ([N-2-hidroxietil]-piperazina-N-[ácido 2-etanosulfónico]) 20 mM y probenecid 2,5 mM, y se ensayó la actividad de liberación de Ca añadiendo una muestra y midiendo un cambio en la fluorescencia.

Ejemplo 2 Purificación de un péptido inductor de la secreción de GH endógena

Usando las células CHO-GHSR62 descritas en el Ejemplo 1, se examinaron una gran diversidad de tejidos y órganos procedentes de rata para comprobar su actividad de liberación de Ca, y como resultado, se descubrió que un extracto peptídico derivado de estómago de rata tiene una fuerte actividad de liberación de Ca incluso en una pequeña cantidad de 0,5 mg. Por consiguiente, se purificó un péptido que tenía la actividad de liberación de Ca a partir de extracto de estómago de rata por varios tipos de cromatografía.

Se hirvieron 40 g de estómago de rata fresco durante 5 minutos en agua en ebullición 5 veces para inactivar las proteasas presentes. Después de enfriarse, la muestra hervida se puso en AcOH 1 M-HCl 20 mM, seguido de extracción del péptido por un mezclador Polytron. El extracto se centrifugó a 11.000 rpm durante 30 min, y el sobrenadante se concentró en aproximadamente 40 ml en un evaporador. El concentrado se precipitó con acetona añadiendo acetona a una concentración de 66%, y después de retirar los precipitados formados, se evaporó la acetona en el sobrenadante. El sobrenadante se aplicó a un cartucho de 10 g Sep-Pak C18 (Waters Co., Ltd) previamente equilibrado con TFA (ácido trifluoroacético) al 0,1%, se lavó con CH_{3}CN al 10%/TFA al 0,1% y después se eluyó con CH_{3}CN al 60%/TFA al 0,1%. Después de evaporar el disolvente del eluato, la muestra se liofilizó. La muestra liofilizada se disolvió en AcOH 1 M y se absorbió en SP-Sephadex C-25 (tipo H^{+}) previamente equilibrada con AcOH 1 M. La muestra se eluyó por etapas con AcOH 1 M, después con piridina 2 M, y finalmente con piridina 2 M-AcOH (pH 5,0), con lo que se obtuvieron, respectivamente, 3 fracciones, es decir, SP-I, SP-II y SP-III. La fracción SP-III se aplicó a una columna de exclusión molecular Sephadex G-50, y se ensayó una alícuota de cada fracción con respecto a la actividad de liberación de Ca mediante el uso de las células CHO-GHSR62. En la Fig. 1a se muestra un perfil de cromatografía en columna en Sephadex G-50, y las fracciones activas (fracciones 43 a 48 en Fig. 1a) que tenían pesos moleculares de aproximadamente 3.000 se fraccionaron por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) por intercambio iónico CM en una columna TSK CM-2SW (4,6 x 250 mm, Tosoh Corp.) a pH 6,4. Las fracciones activas por CM-HPLC se fraccionaron secundariamente por CM-HPLC en la misma columna a pH 4,8 (Fig. 1b). Las fracciones activas (tiempo de elución de 55 a 56 minutos en la Fig. 1b) se purificaron hasta la homogeneidad por HPLC de fase inversa en una columna \muBondasphere C-18 (3,9 x 150 mm, Waters Co., Ltd). A partir de 40 g de estómago de rata, se purificaron 16 \mug de péptido que tenía actividad de liberación de Ca y este péptido se denominó
grelina.

Ejemplo 3 Análisis estructural de grelina

La secuencia de aminoácidos de la grelina derivada de rata se determinó por medio de un secuenciador de péptidos (ABI 494, Applied Biosystems Co., Ltd). La grelina era un péptido compuesto por 28 restos aminoacídicos consistente en la siguiente secuencia: Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg, donde Xaa es un aminoácido no identificado. Basándose en la secuencia de nucleótidos del ADNc de rata, se estimó que Xaa era Ser, indicando una cierta modificación en Ser en el péptido.

Por consiguiente, se sintetizó químicamente grelina no modificada en la serina en la 3ª posición desde el extremo amino por un sintetizador de péptidos (ABI 433A, Applied Biosystems Co., Ltd). Como el tiempo de elución de la grelina sintética no modificada en HPLC de fase inversa era significativamente diferente del de la grelina natural (Fig. 2a), se descubrió que la grelina sintética no modificada era significativamente más hidrófila que la grelina natural.

A partir de los resultados anteriores se descubrió que, en la grelina natural, la serina en la 3ª posición desde el extremo amino (3ª serina) se había modificado con un resto hidrófobo.

Para revelar el grupo de modificación en la 3ª serina, la grelina purificada se analizó por espectrometría de masas de ionización de electronebulización (ESI-MS). El peso molecular encontrado (3314,9 \pm 0,7) de la grelina natural fue mayor en aproximadamente 126 que el peso molecular (3188,5) del péptido de grelina no modificada, que se estimó a partir de la secuencia de nucleótidos del ADNc. A partir del resultado anterior, se descubrió que el grupo hidroxilo de la 3ª serina de la grelina natural se ha modificado con ácido graso n-octanoílo (C8 : 0).

Para confirmar esto, se sintetizó químicamente el péptido de n-octanoil (C8 : 0) grelina y se examinó su tiempo de elución en HPLC de fase inversa. En la síntesis química del n-octanoil (C8 : 0) péptido, se sintetizó el péptido en el que todos los grupos funcionales excepto el grupo hidroxilo de la 3ª serina estaban protegidos por el método en fase sólida Fmoc usando un sintetizador de péptidos (ABI 433A, Applied Biosystems Co., Ltd), y después se obtuvo el péptido deseado por acilación del grupo hidroxilo de la 3ª serina con ácido n-octanoico y etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida en presencia de 4-(dimetilamino)piridina. El n-octanoil péptido sintético indicó el mismo tiempo de elución que la grelina natural purificada (Fig. 2a). Además, el n-octanoil péptido sintético y un fragmento peptídico en las posiciones 1 a 4 desde el extremo amino (Gly 1 - Phe 4) que se obtuvo por tratamiento de la grelina natural con quimotripsina mostró el mismo tiempo de retención en HPLC de fase inversa.

A partir del resultado anterior, se concluyó que la grelina natural derivada de rata tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 2, donde el grupo hidroxilo de la 3ª serina se ha acilado con ácido n-octanoico (ácido caprílico) (Fig. 2c).

Además, se purificó grelina humana a partir de extracto de estómago humano y se descubrió que su estructura tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 3, donde el grupo hidroxilo de la cadena lateral de la 3ª serina se ha acilado con ácido n-octanoico (ácido caprílico) (Fig. 4a).

Las estructuras de las grelinas derivadas de rata y humano se determinaron usando las purificadas como fracciones de primer pico (tiempo de elución de 55 a 56 minutos) de las fracciones activas de la Fig. 1b, y después de la purificación, también se analizó la estructura de las otras fracciones activas de la Fig. 1b de la misma manera, indicando la presencia no sólo de ácido caprílico (C8 : 0), sino también de su ácido monoeno (C8 : 1), ácido cáprico (C10 : 0) y su ácido monoeno (C10 : 1), y ácido láurico (C12 : 0) y su ácido monoeno (C12 : 1) como ácido graso de modificación en la 3ª serina.

Además, se purificaron grelinas de pollo, anguila y rana a partir de extractos de estómago de la misma manera que en el Ejemplo 2 y se analizaron sus estructuras de la misma manera que en el Ejemplo 3. Se descubrió que la grelina de pollo tenía la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 25, la grelina de anguila tenía la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 26, y la grelina de rana tenía la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 27, y en todas las grelinas, el grupo hidroxilo de la cadena lateral de la 3ª serina se había acilado con ácido n-octanoico (ácido caprílico).

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Además, se purificaron grelinas de rana (Xenopus laevis), pez (trucha arco iris) y perro a partir de extractos de estómago de la misma manera que en el Ejemplo 2 y se analizaron sus estructuras de la misma manera que en el Ejemplo 3.

Se descubrió que la grelina de rana tenía la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 28, la grelina de trucha arco iris tenía la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 29 y 30, y la grelina de perro tenía la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 31, y en todas las grelinas, el grupo hidroxilo de la cadena lateral de la 3ª serina o treonina se ha acilado con ácido n-octanoico (ácido caprílico).

A partir de la trucha arco iris, se obtuvieron la grelina-23 que consiste en 23 restos aminoacídicos mostrados en la SEC ID Nº: 29 y la grelina-20 que consiste en 20 restos aminoacídicos mostrados en la SEC ID Nº: 30.

Ejemplo 4 Actividad de liberación de Ca de la grelina

La grelina natural y la grelina sintética modificada con n-octanoílo tenían actividad de liberación de Ca, pero la grelina sintética no modificada no mostraba una actividad de liberación de Ca significativa (Fig. 2b). Además, como el ácido n-octanoico o una mezcla de ácido n-octanoico y la grelina sintética no modificada no mostraba una actividad de liberación de Ca significativa, se descubrió que el resto de ácido n-octanoico de la grelina natural constituye una estructura importante para la actividad de liberación de Ca. En lo sucesivo, grelina se refiere a [O-n-octanoil-serina 3]-grelina (Fig. 2c).

En células CHO-GHSR62, la grelina presentó una mayor actividad de aumento de la concentración de ion de calcio intracelular (actividad de liberación de Ca) que la conseguida por GHRP-6, mientras que la GHRH (hormona de liberación de GH, expresada como GRF en la Fig. 3a) no presentó la actividad de liberación de Ca (Fig. 3b). La actividad de liberación de Ca de la grelina se reconoció a una concentración de 10^{-11} M o mayor, y su valor de CE_{50} fue de 2,5 nM. La actividad de liberación de Ca de la grelina se inhibió en presencia de un antagonista específico a una concentración 10^{-4} M ([D-Lys 3]-GHRP-6) para GHS-R [R.G. Smith, et al., Science 260, 1640-1643 (1993)], y la actividad de liberación de Ca se restauró a una alta concentración de grelina en ausencia del antagonista (Fig. 3b). El resultado anterior indica que la actividad de liberación de Ca de la grelina se inhibe de manera antagonista por el antagonista específico para GHS-R.

Ejemplo 5 Un ADNc para un precursor de grelina y su expresión en diversos órganos

La secuencia de aminoácidos de la grelina no tenía ninguna homología con las secuencias de aminoácidos de ningún péptido conocido, pero como resultado del examen de homología en la base de datos del GenBank, se encontró la misma secuencia en una secuencia EST (etiqueta de secuencia expresada) de rata (Nº de aceptación del GenBank. AI549172). Basándose en esta secuencia EST, se sintetizaron los siguientes cebadores de PCR:

Cebador con sentido:	5'-TTGAGCCCAGAGCACCAGAAA-3'

Cebador antisentido:	5'-AGTTGCAGAGGAGGCAGAAGCT-3'

Estos dos cebadores se usaron en RT-PCR, donde como plantilla se usó ADNc derivado de estómago de rata. Las condiciones de PCR utilizaron 35 ciclos consistiendo cada uno en 98ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto. El fragmento de ADN amplificado se usó como sonda para la selección de una biblioteca de ADNc de estómago de rata. Realizando la selección en aproximadamente 2 x 10^{5} fagos recombinantes, se obtuvo un ADNc de longitud completa que codificaba la grelina derivada de rata.

El ADNc de grelina de rata estaba compuesto por 501 bases mostradas en la SEC ID Nº: 6, que codificaban un precursor de grelina (prepro-grelina) consistente en 117 aminoácidos (Fig. 4a). Los 23 restos aminoacídicos amino-terminales del precursor de grelina tenían propiedades similares a las de un péptido señal. La grelina empieza a partir de la glicina 24, y los dos últimos aminoácidos (Pro-Arg) en la grelina madura formaban una secuencia que experimentó escisión con una proteasa.

Usando el ADNc de grelina de rata, se seleccionó una biblioteca de ADNc de estómago humano en condiciones de baja rigurosidad para obtener un ADNc de grelina humana de longitud completa. La biblioteca de ADNc de estómago humano se preparó a partir de poli(A)^{+}ARN gástrico humano (Clontech Co., Ltd) por medio del uso de un kit de síntesis de ADNc (Pharmacia Co., Ltd). El ADNc de grelina humana de longitud completa obtenido de esta manera estaba compuesto por 511 bases mostradas en la SEC ID Nº: 7, que codificaban una precursor de grelina humana (prepro-grelina) consistente en 117 aminoácidos (Fig. 4a). La homología a nivel de la secuencia de aminoácidos entre los precursores de grelina derivados de rata y de humano fue de 82,9%, revelando que las grelinas están muy conservadas entre especies.

Para conocer la distribución de la grelina en los tejidos, se analizó el poli(A)^{+}ARN aislado de diversos tejidos de rata (Fig. 4b). Por análisis de transferencia de Northern de los tejidos de rata, se reconoció el ARNm precursor de grelina de 0,62 kb en estómago. También se reconocieron en ventrículo dos bandas débiles, y éstas eran de ARNm de 6,2 kb y 1,2 kb, que eran mayores que el ARNm de estómago, sugiriendo de esta manera diferentes empalmes de ARNm del existente en estómago. Por los resultados anteriores, se descubrió que un sitio de expresión importante para la grelina es el estómago.

Ejemplo 6 Efecto de la grelina sobre la secreción de hormonas de la pituitaria

Se examinó in vitro e in vivo si la grelina tiene actividad inductora de la secreción de GH o no. En primer lugar, se examinó el efecto de la grelina sobre células cultivadas primarias de la pituitaria anterior para un ensayo in vitro. Se recogieron pituitarias anteriores a partir de ratas SD macho de cuatro semanas de edad y se dispersaron por tratamiento con colagenasa, y las células se recogieron, se lavaron dos veces con medio DMEM (Medio de Eagle modificado por Dulbecco) que contenía FCS (suero bovino fetal) al 10% y un antibiótico, y se suspendieron en medio DMEM para preparar las células cultivadas primarias de la pituitaria anterior. Las 5 x 10^{4} células se inocularon en una placa de cultivo de células de 96 pocillos recubierta con poli-D-lisina, y se cultivaron durante 3 a 4 días. El medio de cultivo se cambió por medio DMEM que contenía 0,1 ml de muestra y se mantuvo a 37ºC durante 15 minutos. Se recogió una alícuota del medio de cultivo y se midió por radioinmunoensayo para determinar las concentraciones de diversas hormonas de la pituitaria en el medio de cultivo. Entre las hormonas de la pituitaria se midieron GH, FSH, LH, PRL y TSH usando un kit producido por Biotrak/Amersham Co., Ltd, y la ACTH se midió usando un kit de EIA de alta sensibilidad producido por Peninsula Laboratories.

Cuando se añadió grelina a células cultivadas primarias de la pituitaria anterior, se reconoció un aumento en la concentración de ion de calcio intracelular, mientras que la grelina sintética no modificada también mostró una actividad de liberación de Ca ligeramente aumentada (Fig. 5a). Este resultado indica que tanto la grelina como la grelina no modificada actúan directamente sobre células de la pituitaria. Después, se examinó la actividad inductora de la secreción de GH de la grelina usando las células cultivadas primarias de la pituitaria anterior, y por medio de la adición de grelina 10^{-6} M, la concentración de GH en el cultivo aumentó dependiendo de la concentración, pero no se observó ningún aumento en las concentraciones de otras hormonas de la pituitaria (FSH, LH, PRL, TSH) (Fig. 5b).

La actividad inductora de la secreción de GH de la grelina se examinó in vivo. Después de inyectar 10 \mug de grelina sintética por vía intravenosa en una rata macho (250 g), se recogió sangre periódicamente durante hasta 60 minutos para medir la concentración de hormonas de la pituitaria en plasma por radioinmunoensayo. Entre las hormonas de la pituitaria sólo se liberó GH en la sangre y alcanzó el nivel máximo en un periodo de 5 a 10 minutos después de la inyección intravenosa de grelina. A partir de este resultado, se descubrió que la grelina liberada desde el estómago a la sangre actúa sobre células de la pituitaria anterior y libera GH en la sangre, y se confirmó que la grelina es una sustancia inductora de la secreción de GH endógena específica no identificada.

Ejemplo 7 Aumento del rendimiento cardíaco en rata

Se examinó el efecto de la administración aguda de grelina sobre el sistema cardiovascular en una rata anestesiada. Se dividieron ratas Wistar macho (Carerie) que pesaban cada una de 220 a 250 g, aleatoriamente, en 4 grupos (como grupos que recibieron 10, 1, 0,5, y 0,2 \mug de grelina respectivamente) para examinar el efecto de la administración aguda de grelina sobre el sistema cardiovascular. La grelina se diluyó con solución fisiológica salina y después se preparó una dosis de 10, 1, 0,5 ó 0,2 \mug/rata, y se administraron rápidamente 120 \mul a través de un tubo de inyección(PE50) que se había insertado en la vena yugular común derecha para medir el rendimiento cardíaco.

Como indicador dinámico, se midieron la presión sanguínea sistémica y el rendimiento cardíaco, y se calculó la resistencia vascular periférica. Las ratas se anestesiaron con pentobarbital y se fijaron en posición dorsal. Para medir la presión sanguínea media, se insertó una cánula de polietileno (PE50) rellena con heparina en la arteria femoral derecha. El rendimiento cardíaco se midió usando un medidor del rendimiento cardíaco de tipo de dilución térmica (CARDIOTHER M500R). Se insertó un tubo de inyección (PE50) relleno con solución fisiológica salina en la vena yugular común derecha en la rata y quedó retenido en el ventrículo derecho. Se insertó un microcatéter desde la vena yugular común derecha de la rata y quedo retenido en la parte de inicio de la aorta.

La infusión usó 100 \mul de solución fisiológica salina a temperatura ambiente (25ºC). Presionando un conmutador de MEDIDA (MEASURE) del medidor del rendimiento cardíaco de tipo de dilución térmica y simultáneamente inyectando la infusión (100 \mul de solución fisiológica salina), se inició la medición del rendimiento cardíaco. El rendimiento cardíaco se midió cinco veces para determinar el rendimiento cardíaco medio. La presión sanguínea media y el rendimiento cardíaco se determinaron 1, 5, 15 y 30 minutos antes y después de la administración de grelina. La resistencia vascular periférica se determinó dividiendo la presión sanguínea media por el rendimiento cardíaco.

TABLA 1

10

En la tabla, SEM es el error típico de la media.

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TABLA 2

11

En la tabla, SEM es el error típico de la media.

En el grupo que recibió 1 \mug de grelina (Tabla 1) y el grupo que recibió 10 \mug de grelina (Tabla 2), se reconoció un aumento en el rendimiento cardíaco en 1 a 5 minutos después de la administración.

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Ejemplo 8 Aislamiento de grelina y grelina-27 de diversos orígenes

A partir de extracto de estómago de rata, se purificó grelina usando la actividad de liberación de Ca como indicador en el método descrito en el Ejemplo 2. La fracción activa (tiempo de elución de 59 minutos en la Fig. 1b) en la CM-HPLC secundaria se purificó hasta la homogeneidad por HPLC de fase inversa en una columna \muBondasphere C-18 (3,9 x 150 mm, producida por Waters Co., Ltd). Esta fracción se analizó por espectrometría de masas con ionización por electronebulización (ESI-MS), indicando un pico del peso molecular (3187,2 \pm 0,9) que era menor en aproximadamente 126 que el de la grelina natural modificada con ácido octanoico (C8) consistente en 28 aminoácidos. La determinación de la secuencia de aminoácidos de este péptido por un secuenciador de péptidos (ABI 494, fabricado por Applied Biosystems Co., Ltd) reveló que es un péptido compuesto de los siguientes 27 restos aminoacídicos: Gly Ser Xaa Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg (Xaa es un aminoácido no identificado). Es decir, este péptido estaba compuesto por una secuencia de aminoácidos en la que en la grelina consistente en 28 aminoácidos, se había delecionado la 13ª o 14ª glutamina. Como la actividad de liberación de Ca de este péptido era similar a la de la grelina de 28 aminoácidos como se muestra en el Ejemplo 9, este péptido se denominó grelina-27. A partir de extracto de estómago humano, se aisló grelina-27 humana de la misma manera que la grelina de rata, y se confirmó que consistía en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 11. Se purificaron fracciones de picos con tiempos de retención de 64 a 65 minutos en CM-HPLC secundaria y se analizaron por espectrometría de masas con ionización por electronebulización (ESI-MS), indicando un pico con el peso molecular (3341,4 \pm 0,9). Como este péptido modificado con ácido graso estaba compuesto por 28 aminoácidos, se reveló que era un péptido en el que en la grelina (28 aminoácidos), la tercera serina se había modificado con ácido decanoico (C10).

A partir de la biblioteca de ADNc de estómago de rata preparada en el Ejemplo 5, se clonó un ADNc codificante de un precursor de grelina-27 por hibridación en placa donde el fragmento de ADN amplificado por PCR preparado en el Ejemplo 5 se usó como sonda. Se determinó la secuencia de nucleótidos del ADNc y se confirmó que codificaba el precursor de grelina-27. El ADNc resultante para el precursor de grelina-27 de rata estaba compuesto por la secuencia de nucleótidos indicada en la SEC ID Nº: 14, que codificaba el precursor de grelina-27 que tenía la secuencia de aminoácidos (116 aminoácidos) indicada en la SEC ID Nº: 12. También se clonó un ADNc para el precursor de grelina-27 humana de la misma manera que se ha descrito anteriormente, y reveló que consistía en la secuencia de nucleótidos indicada en la SEC ID Nº: 15, que codificaba el precursor de grelina-27 humana que tenía la secuencia de aminoácidos (116 aminoácidos) indicada en la SEC ID Nº: 13.

Se clonó un ADNc que codificaba un precursor de grelina o grelina-27 de origen porcino a partir de una biblioteca de ADNc porcina por el método descrito en el Ejemplo 5 por hibridación en placa, donde se usó como sonda el fragmento de ADN amplificado por PCR descrito en el Ejemplo 5. Se determinó la secuencia de nucleótidos del clon de ADNc resultante y se confirmó que codificaba un precursor de grelina porcina o un precursor de grelina-27 porcina. El ADNc resultante para el precursor de grelina porcina estaba compuesto por la secuencia de nucleótidos indicada en la SEC ID Nº: 20, que codificaba un precursor de grelina que tenía la secuencia de aminoácidos (118 aminoácidos) indicada en la SEC ID Nº: 18. El ADNc para el precursor de grelina-27 porcina estaba compuesto por la secuencia de nucleótidos indicada en la SEC ID Nº: 21, que codificaba el precursor de grelina-27 que tenía la secuencia de aminoácidos (117 aminoácidos) indicada en la SEC ID Nº: 19. Por consiguiente, la grelina porcina (28 aminoácidos) y la grelina-27 porcina (27 aminoácidos) están compuestas por las secuencias de aminoácidos indicadas en las SEC ID Nº: 16 y 17, respectivamente.

Se clonó un ADNc codificante de un precursor de grelina derivado de anguila, Xenopus laevis o trucha arco iris a partir de diversas bibliotecas de ADNc por el método descrito en el Ejemplo 5 por hibridación en placa, donde se usó como sonda el fragmento de ADN amplificado por PCR descrito en el Ejemplo 5. Se determinó la secuencia de nucleótidos del clon de ADNc resultante y se confirmó que codificaba el precursor de grelina.

El ADNc resultante para el precursor de grelina de anguila estaba compuesto por los nucleótidos indicados en la SEC ID Nº: 36, el ADNc para el precursor de grelina de rana estaba compuesto por los nucleótidos indicados en la SEC ID Nº: 37, y el ADNc para el precursor de grelina de trucha arco iris estaba compuesto por los nucleótidos indicados en la SEC ID Nº: 38 ó 39.

En el caso de la trucha arco iris, se obtuvieron el ADNc codificante del precursor de la grelina-23 indicado en la SEC ID Nº: 38 y el ADNc codificante del precursor de grelina-20 indicado en la en SEC ID Nº: 39.

A partir de las secuencias de nucleótidos de los ADNc anteriores, se descubrió que el precursor de grelina de anguila tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 32, el precursor de grelina de rana tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 33, y el precursor de grelina de trucha arco iris tiene la secuencia de aminoácidos indicada en las SEC ID Nº: 34 ó 35.

A partir de la trucha arco iris, se encontraron la secuencia de aminoácidos del precursor de la grelina-23 indicada en la SEC ID Nº: 34 y la secuencia de aminoácidos del precursor de la grelina-20 de la SEC ID Nº: 35.

Se clonó un ADNc para un precursor de grelina bovina por el método de PCR. Es decir, se realizó una PCR donde se usó como cebador un ADN sintético que tenía secuencias de nucleótidos diseñadas basándose en las secuencias de aminoácidos conservadas entre las grelinas y grelinas-27 procedentes de rata, humana y porcina y donde se usó como plantilla una biblioteca de ADNc de estómago bovino. El fragmento de ADN amplificado de esta manera tenía la secuencia de nucleótidos indicada en la SEC ID Nº: 24, que codificaba una parte del precursor de la grelina-27 bovina indicado en la SEC ID Nº: 23. Por consiguiente, la grelina-27 bovina tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 22. En el fragmento de ADN amplificado por la PCR anterior usando la biblioteca de ADNc de estómago bovino como plantilla, no hubo ningún ADN que codificara un precursor de grelina (28 aminoácidos).

Los aminoácidos de las grelinas de rata, humana y porcina y las grelinas-27 de rata, humana, porcina y bovina eran muy similares, y en particular, las secuencias de aminoácidos del 1^{er} al 10º aminoácidos en las 7 grelinas descritas anteriormente eran completamente idénticas entre sí.

Ejemplo 9 Comparación de actividad entre diversos derivados de grelina

Se examinaron fragmentos peptídicos obtenidos por digestión parcial de las grelinas de rata y humana por diversas proteasas, o péptidos sintetizados químicamente, con respecto a su actividad de liberación de Ca para determinar la secuencia de aminoácidos central y la longitud de cadena óptima del ácido graso de modificación necesario para la actividad de liberación de Ca. La actividad de liberación de Ca de la grelina se expresó en términos de la concentración de grelina (CE_{50}, nM) a la que se consigue 50% de la actividad máxima. Por consiguiente, los valores de CE_{50} inferiores son indicativos de mayor actividad.

TABLA 3 Comparación de la actividad entre diversos derivados de grelina

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12

La actividad de liberación de Ca de la grelina está presente en el lado del extremo amino. Un péptido desde el extremo amino al 4º aminoácido tiene suficiente actividad de liberación de Ca y un péptido desde el extremo amino al décimo aminoácido muestra una fuerte actividad de liberación de Ca parecida a la de la grelina natural. Cuando la longitud de la cadena del ácido graso de modificación es C : 2 (grupo acetilo), se produce una actividad suficiente, y cuando la longitud de la cadena es C : 8 (grupo octanoílo), se consigue una actividad máxima de liberación de Ca, incluso si el número de átomos de carbono del ácido graso se aumenta adicionalmente a C : 10 (grupo decanoílo) o a C : 16, no cambia la fuerte actividad de liberación de Ca. Es decir, cuando el ácido graso para modificar la tercera serina desde el extremo amino contiene 8 o más átomos de carbono, se consigue la mayor actividad de liberación
de Ca.

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Ejemplo 10 Síntesis de diversos derivados de grelina (1) Síntesis de derivados peptídicos

Se adquirieron derivados de aminoácidos distintos de Fmoc-^{D}Ser (C_{8}H_{17}) y Fmoc-Ser (C_{8}H_{17}), y reactivos de síntesis, en Perkin Elmer, Novabiochem or Watanabe Kagaku Co., Ltd. La extensión de la cadena peptídica se realizó principalmente usando un sintetizador Applied Biosystem 433A producido por Perkin Elmer, y se construyó un derivado de péptido protegido-resina por el método Boc o Fmoc. La resina con péptido protegido obtenida por el método Boc se desprotegió con fluoruro de hidrógeno anhidro (HF) en presencia de p-cresol, liberando de esta manera el péptido, que después se purificó. La resina con el péptido protegido obtenida por el método Fmoc se desprotegió con ácido trifluoroacético (TFA) o TFA diluido que contenía diversos eliminadores, y se purificó el péptido liberado. La purificación se realizó en HPLC de fase inversa en una columna C4 o C18. La pureza del producto purificado se confirmó por HPLC de fase inversa y su estructura se confirmó por el análisis de la composición de aminoácidos y espectrometría de masas.

El péptido de la presente invención se produce por un método de síntesis de péptidos convencional. Por ejemplo, puede producirse por un método descrito en el capítulo 2 y 3 de "Biochemical Experimental Course 1", Protein Chemistry IV (Tokyo Kagaku Dojin) o en "Development of Medicines, a second series", Vol. 14, Peptide Synthesis (Hirokawa Shoten Co., Ltd). Por consiguiente, a continuación se muestran ejemplos típicos del péptido de la presente invención. Específicamente, a continuación se ejemplifican síntesis de péptidos acilados o alquilados. Además, se hizo reaccionar grelina de origen humano (que puede abreviarse en lo sucesivo como hGrelina) o grelina procedente de rata (que puede abreviarse en lo sucesivo como rGrelina) con tripsina o quimiotripsina o las dos enzimas sucesivamente para dar los siguientes fragmentos de grelina: 19. Grelina (16-28), 20. hGrelina (1-15), 21. rGrelina (1-15), 23. hGrelina (1-11), 24. rGrelina (1-11), 25. Grelina (1-10), 26. Grelina (1-9), 27. Grelina (1-8), y 30. Grelina (1-4). Después, estos fragmentos se aislaron por HPLC analítica y se midió su actividad. 41. La [N-Acetil]-Grelina (1-10) se preparó de la manera habitual tratando Grelina (1-10) con N-acetilsuccinimida. El compuesto nº 2 (grelina de rata) hizo uso de un material natural y 10. [Ser^{3}(Butiril)]-rGrelina, 11. [Ser^{3}(Hexanoil)]-rGrelina, 12. [Ser^{3}(Decanoil)]-rGrelina, 13. [Ser^{3}(Lauroil)]-rGrelina y 14. [Ser^{3}(Palmitoil)]-rGrelina se sintetizaron de la misma manera que en la síntesis del compuesto 1 (hGrelina) y después se midió su actividad.

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Abreviaturas principales

resina HMP; resina de 4-hidroximetil-fenoximetilo

resina de Fmoc-amida; resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)fenoxiacetamido-etilo

resina PAM; resina de fenilacetoamidometilo

HBTU; hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio

TBTU; tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio

HOBt; 1-hidroxibenzotriazol

DCC; diciclohexilcarbodiimida

DIPCI; diisopropilcarbodiimida

TFA; ácido trifluoroacético

DIPEA; diisopropiletilamina

TIPS; triisopropilsilano

Fmoc; fluorenilmetoxicarbonilo

Boc; t-butiloxicarbonilo

Trt; tritilo

Bu^{t}; t-butilo

Pmc; 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo

Prl; propionilo

PhPrl; fenilpropionilo

Bzl; bencilo

Bom; benciloximetilo

Tos; toluenosulfonilo

Cl-Z; 2-cloro-benciloxicarbonilo

Pis; 2-fenilisopropilo

Mtt; 4-metiltritilo

DMF; N,N-dimetilformamida

NMP; N-metilpirrolidona

DMAP; 4-dimetilaminopiridina

HOSu; N-hidroxisuccinimida

Adod; ácido 2-aminododecanoico

Aib; ácido 2-aminoisobutílico

Ape; ácido 5-aminopentanoico

Cha; ciclohexilalanina

Dap; ácido 2,3-diaminopropiónico

Nal; naftilalanina

Nle; norleucina

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Aminoácidos de protección usados en la síntesis Método Fmoc:

Boc-Gly, Fmoc-Gly, Fmoc-Ser (Bu^{t}), Fmoc-Ser (Trt), Fmoc-Glu (OBu^{t}), Fmoc-His (Boc), Fmoc-Gln (Trt), Fmoc-Arg (Pmc), Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Pro, Fmoc-Leu, Fmoc-Ala, Fmoc-Val, Fmoc-Phe, Fmoc-^{D}Phe, Fmoc-Ser (n-C_{8}H_{17}), Fmoc-^{D}Ser (n-C_{8}H_{17}), Fmoc-Cys (n-C_{8}H_{17}), Fmoc-Asp (OPis), Fmoc-Ser (Bzl), Fmoc-Cys (Trt), Fmoc-Dap (Octanoílo), Fmoc-2 -^{L}Nal, Fmoc- 2-^{D}Nal, Fmoc-Nle, Fmoc-Lys (Mtt), Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Asp (O-C_{7}H_{15})

Método Boc:

Boc-Gly, Boc-Ser (Bzl), Boc-Ser (Ac), Boc-Ser (Prl), Boc-Glu (OBzl), Boc-His (Bom), Boc-Gln, Boc-Arg (Tos), Boc-Lys (Cl-Z), Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Ala, Boc-Val, Boc-Phe, Boc-Cys (n-C_{8}H_{17}),Boc-Ape, Boc-Ser (n-C_{8}H_{17})

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Unidades usadas (a) Sistema de HPLC analítica

\quad: Unidad: Sistema Shimadzu LC-10A

\quad: Columna: YMC PROTEIN-RP (4,6 mm \phi x 150 mm)

\quad: Temperatura de la columna: 40ºC

\quad: Eluyente: Un gradiente lineal de acetonitrilo de 0 a 50% durante 20 minutos en ácido trifluoroacético al 0,1%

\quad: Caudal: 1 ml/min.

\quad: Detección: UV (210 nm)

\quad: Volumen de inyección: de 10 a 100 \mul

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(b) Sistema de HPLC Preparativa

\quad: Unidad: Sistema de Liberación Multidisolvente Waters 600

Columnas:: YMC-Pack-ODS-A (5 \mum, 20 mm x 250 mm)

\quad: YMC-Pack-PROTEIN-RP (5 \mum, C4, 10 mm x 250 mm)

\quad: YMC-Pack PROTEIN-RP (5 \mum, C4, 20 mm x 250 mm)

\quad: YMC PROTEIN-RP (4,6 mm \phi x 150 mm)

\quad: Eluyente: Un gradiente lineal adecuado de concentración de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,1%

\quad: Caudal: 10 ml/min. (para la columna de un diámetro interno de 20 mm), 3 ml/min. (para la columna de un diámetro interno de 10 mm), 1 ml/min. (para la columna de un diámetro interno de 4,6 mm)

\quad: Detección: 210 nm, 260 nm

\quad: Inyección: de 10 a 2000 \mul (se inyectaron 2000 \mul o más mediante una bomba)

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(c) Espectrómetro de masas

\quad: Unidad: Finigan MAT TSQ700

\quad: Fuente de iones: ESI

\quad: Modo de ion de detección: Positivo

\quad: Voltaje de nebulización: 4,5 kV

\quad: Temperatura de Capilaridad: 250ºC

\quad: Fase móvil: Una mezcla de ácido acético al 0,2% y metanol (1:1)

\quad: Caudal: 0,2 ml/min.

\quad: Intervalo de exploración: m/z de 300 a 1.500

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(d) Análisis de la secuencia de aminoácidos

\quad: Unidad: secuenciador Applied Biosystem 477A, modelo 492 fabricado por Perkin Elmer

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(e) Análisis de la composición de aminoácidos

\quad: Unidad: analizador de aminoácidos modelo L-8500 fabricado por Hitachi, Co., Ltd.

\quad: Muestra: A menos que se especifique otra cosa, la muestra se hidrolizó con HCl 6 M a 110ºC durante 24 horas en un tubo cerrado herméticamente.

(2) Ejemplo de síntesis de un derivado que tiene acil serina o acil treonina (método Fmoc, derivados de amida de extremo carboxilo)

Compuesto 1

hGrelina: GSS(CO-C_{7}H_{15})FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR

Se trató Fmoc-Arg(Pmc)-resina HMP (403 mg, 0,25 mmol, ABI Co., Ltd) con piperazina al 20% durante 20 minutos y se sometió repetidamente a introducción de Fmoc-aminoácido por HBTU/HOBt y eliminación de Fmoc con piperazina secuencialmente para construir Fmoc-Ser(Bu^{t})-Ser(Trt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBu^{t})-His(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OBu^{t})-Ser(Bu^{t})-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys
(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-resina. Después de que se introdujera finalmente Boc-Gly por DCC/HOBt, la resina peptídica protegida resultante (1,3 g) se trató con una solución de TFA al 1%-TIPS al 5%-cloruro de metileno (15 ml) durante 30 minutos. La resina-péptido se filtró, se lavó varias veces con cloruro de metileno (30 ml) y se lavó con DIEA al 5% (10 ml) y después con cloruro de metileno (30 ml). La resina-péptido des-Trt resultante (aproximadamente 1,3 g) se hinchó con NMP (10 ml), se añadieron ácido octanoico (144,2 mg, 1,0 mmol) y DIPCI (126,2 mg, 1,0 mmol) en presencia de DMAP (61,1 mg, 0,5 mmol) y se dejó reaccionar durante 8 horas. La resina se recuperó por filtración y se lavó con NMP y después con cloruro de metileno, seguido de secado al vacío para dar aproximadamente 1,2 g de resina-péptido protegido, donde la cadena lateral de la 3ª serina estaba octanoilada. A este producto se le añadió un reactivo de desprotección (10 ml) consistente en 88% de TFA-5% de fenol-2% de TIPS-5% de H_{2}O, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La resina se retiró por filtración y el filtrado se concentró seguido de la adición de éter a los residuos resultantes para formar precipitados. Los precipitados se recuperaron por filtración y se secaron para dar aproximadamente 550 mg de péptido bruto. Se disolvieron 200 mg de este producto en 10 ml de agua y la mezcla se aplicó a YMC-Pack PROTEIN-RP (C4, 20 mm x 250 mm) y se eluyó con un gradiente lineal (caudal: 10 ml/min) durante 60 minutos de acetonitrilo de 0 a 54% en ácido trifluoroacético al 0,1%. Las fracciones deseadas se recogieron y se liofilizaron para dar aproximadamente 120 mg del producto deseado.

(3) Ejemplo de síntesis de un derivado que tiene acil serina o acil treonina (método Fmoc, compuestos de amida carboxilo-terminales)

Compuesto 3

Grelina (1-9)-NH_{2}; GSS(CO-C_{7}H_{15})FLSPEH-NH_{2}

Se trató Fmoc-amida-resina (403 mg, 0,25 mmol, ABI Co., Ltd) con piperazina al 20% durante 20 minutos y se sometió repetidamente a introducción de Fmoc-aminoácido por HBTU/HOBt y eliminación de Fmoc con piperazina secuencialmente para construir resina Fmoc-Ser(Bu^{t})-Ser(Trt)-Phe-Leu-Ser(Bu^{t})-Pro-Glu(OBu^{t})-His(Boc). Después de que se introdujera finalmente Boc-Gly por DCC/HOBt, la resina-péptido protegido resultante (aproximadamente 550 mg) se trató con solución de TFA al 1%-TIPS al 5%-cloruro de metileno (10 ml) durante 30 minutos. La resina-péptido se recuperó por filtración, se lavó varias veces con cloruro de metileno (30 ml) y se lavó con DIEA al 5% (10 ml) y después con cloruro de metileno (30 ml). La resina-péptido des-Trt resultante (aproximadamente 750 mg) se hinchó con NMP (10 ml), se añadieron ácido octanoico (144,2 mg, 1,0 mmol) y DIPCl (126,2 mg, 1 mmol) en presencia de DMAP (61,1 mg, 0,5 mmol) y la mezcla se dejó reaccionar durante 4 horas. La resina se recuperó por filtración y se lavó con NMP y después con cloruro de metileno, seguido de secado al vacío para dar aproximadamente 800 mg de resina-péptido protegido donde la cadena lateral de la 3ª serina estaba octanoilada. A este producto se le añadió TFA (10 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La resina se retiró por filtración y el filtrado se concentró seguido de adición de éter a los residuos resultantes para formar precipitados. Los precipitados se recuperaron por filtración y se secaron para dar aproximadamente 250 mg de péptido bruto. Se disolvieron aproximadamente 200 mg de este producto en 10 ml de ácido acético acuoso al 30% y la mezcla se aplicó a YMC-Pack PROTEIN-RP (C4, 20 mm x 250 mm) y se eluyó con un gradiente lineal (caudal: 10 ml/min) durante 60 minutos de acetonitrilo de 0 a 54% en ácido trifluoroacético al 0,1%. Las fracciones deseadas se recogieron y se liofilizaron para dar aproximadamente 150 mg del producto deseado.

(4) Ejemplo de síntesis de un derivado que tiene acil serina o acil treonina (método Boc)

Compuesto 9

[Ser^{3}(Propionil)]-rGrelina (1-28); GSS(CO-CH_{2}CH_{3})FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR

Se construyó resina-grelina de rata (4-28) protegida a partir de resina Boc-Arg (Tos)-Pam (0,75 g, 0,5 mmol) por medio de la química de Boc, y se condensaron Boc-Ser(CO-CH_{2}CH_{3})-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH y Boc-Gly-OH con una mitad (1,4 g) de la resina. La resina resultante, 1,5 g, se trató con una mezcla de HF y p-cresol (8,5 ml:1,5 ml) a 0ºC durante 1 hora y el HF se evaporó. Se añadió éter a los residuos, con lo que se obtuvieron 671 mg de péptido bruto. Esta muestra se disolvió en ácido acético (AcOH) al 50% y se aplicó a una columna preparativa YMC-Pack-ODS-A (5 \mum, 20 mm x 250 mm) y se eluyó a una velocidad de 10 ml/min mediante un gradiente de una concentración de acetonitrilo de 0 a 95% en solución de TFA al 0,1% durante 75 minutos. Las fracciones que contenían el producto deseado se liofilizaron para dar 135,8 mg de péptido bruto. Una parte (0,5 mg) de este producto se aplicó a una columna YMC-A-302 (C18, 4,6 mm \phi x 150 mm) y se eluyó a un caudal de 1 ml/min. mediante un gradiente de acetonitrilo a una concentración de 15 a 19%. Este procedimiento de purificación se repitió y las fracciones deseadas se combinaron para dar 0,41 mg del producto deseado.

Los siguientes derivados de péptidos que tienen acil serina o acil treonina se produjeron de la misma manera que en la producción del Compuesto 3 ó 9 descrito anteriormente.

A continuación se resumen los resultados de la espectrometría de masas y del análisis de la composición de aminoácidos de los derivados de péptidos que tienen acil serina o acil treonina.

Compuesto 1

hGrelina

ESI-MS 3371,0 (valor teórico: 3370,9), composición de aminoácidos: Ser; 3,53 (A), Glx; 5,91 (6), Gly; 1,02 (1), Ala; 1,00 (1), Val; 0,96 (1), Leu; 2, Phe; 1,06 (1), Lys; 3,90 (4), His; 0,97 (1), Arg; 2,87 (3), Pro; 3,87 (4)

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Compuesto 3

Grelina (1-9)-amida

ESI-MS [M+H]; 1085,7 (valor teórico: 1085,2), composición de aminoácidos: Ser; 2,45 (3), Glx; 0,98 (1), Gly; 0,99 (1), Leu; 1, Phe; 0,99 (1), His; 1,08 (1), Pro; 0,97 (1) Compuesto 4. [Ser^{2}(Octanoil), Ser^{3}]-Grelina (1-9)-amida

ESI-MS [M+H]; 1085,8 (valor teórico: 1085,2), composición de aminoácidos: Ser; 2,46 (3), Glx; 0,98 (1), Gly; 0,99 (1), Leu; 1, Phe; 1,01 (1), His; 1,09 (1), Pro; 0,97 (1)

Compuesto 5

[Ser^{2}(Octanoil)]-Grelina (1-9)-amida

ESI-MS [M+H]; 1211,7 (valor teórico: 1211,4), composición de aminoácidos: Ser; 2,48 (3), Glx; 1,00 (1), Gly; 1,01 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), His; 1,11 (1), Pro; 0,98 (1) Compuesto 8. [Ser^{3}(Acetil)]-rGrelina

ESI-MS 3231,0 (valor teórico: 3230,7), composición de aminoácidos: Ser; 3,50 (4), Glx; 5,90 (6), Gly; 0,98 (1), Ala; 2,00 (2), Leu; 2, Phe; 1,01 (1), Lys; 4,97 (5), His; 0,99 (1), Arg; 1,99 (2), Pro; 3,99 (4)

Compuesto 9

[Ser^{3}(Propionil)3-rGrelina

ESI-MS 3245,0 (valor teórico: 3242,8), composición de aminoácidos: Ser; 3,42 (4), Glx; 5,93 (6), Gly; 1,00 (1), Ala; 2,00 (2), Leu; 2, Phe; 1,10 (1), Lys; 4,97 (5), His; 0,99 (1), Arg; 1,99 (2), Pro; 3,83 (4)

Compuesto 15

[Ser^{3} (3-Fenilpropionil)]-hGrelina

ESI-MS 3377,0 (valor teórico: 3376,9), composición de aminoácidos: Ser; 3,06 (4), Glx; 5,92 (6), Gly; 0,93 (1), Ala; 0,98 (1), Val; 0,99 (1), Leu; 2, Phe; 1,13 (1), Lys; 4,03 (4), His; 1,08 (1), Arg; 3,00 (3), Pro; 3,76 (4)

Compuesto 16

[Ser^{3}(3-Octenoil)]-hGrelina

ESI-MS 3369,0 (valor teórico: 3368,9), composición de aminoácidos: Ser; 3,59 (4), Glx; 5,91 (6), Gly; 1,00 (1), Ala; 1,02 (1), Val; 0,99 (1), Leu; 2, Phe; 1,15 (1), Lys; 3,97 (4), His; 0,98 (1), Arg; 2,93 (3), Pro; 3,88 (4)

Compuesto 28

Grelina (1-8)-amida

ESI-MS [M+H] 948,5 (valor teórico: 948,1), composición de aminoácidos: Ser; 2,45 (3), Glx; 0,97 (1), Gly; 0,99 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Pro; 0,97 (1)

Compuesto 29

Grelina (1-7)-amida

ESI-MS [M+H] 819,6 (valor teórico: 819,0), composición de aminoácidos: Ser; 2,52 (3), Gly; 1,01 (1), Leu; 1, Phe; 1,02 (1), Pro; 1,09 (1)

Compuesto 30

Grelina (1-6)-amida

ESI-MS [M+H]; 722,4 (valor teórico: 721,8), composición de aminoácidos: Ser; 2,47 (3), Gly; 0,99 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1)

Compuesto 31

Grelina (1-5)

ESI-MS [M+H] 636,5 (valor teórico: 635,8), composición de aminoácidos: Ser; 1,78 (2), Gly; 0,99 (1), Leu; 1, Phe; 1,02 (1)

Compuesto 32

Grelina (1-5)-amida

ESI-MS [M+H] 635,4 (valor teórico: 634,8), composición de aminoácidos: Ser; 1,67 (2), Gly; 1,01 (1), Leu; 1, Phe; 1,01 (1)

Compuesto 33-2

Grelina (1-4)-amida

ESI-MS [M+H] 522,2 (valor teórico: 521,6), composición de aminoácidos: Ser; 1,65 (2), Gly; 0,99 (1), Phe; 1

Compuesto 34

Grelina (1-3)-amida

ESI-MS [M+H] 375,2 (valor teórico: 374,4), composición de aminoácidos: Ser; 1,66 (2), Gly; 1

Compuesto 35

[Lys^{8}]-Grelina (1-8)-amida

ESI-MS [M+H] 947,9 (valor teórico: 947,1), composición de aminoácidos: Ser; 2,70 (3), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Lys; 0,99 (1), Pro; 1,00 (1)

Compuesto 36

[Arg^{8}]-Grelina (1-8)-amida

ESI-MS [M+H] 975,8 (valor teórico: 975,2), composición de aminoácidos; Ser; 2,70 (3), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,01 (1), Arg; 0,99 (1), Pro; 1,00 (1)

Compuesto 37

[Lys^{6}]-Grelina (1-6)-amida

ESI-MS [M+H] 763,6 (valor teórico: 762,9), composición de aminoácidos: Ser; 1,80 (2), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,01 (1), Lys; 1,00 (1)

Compuesto 38

[Lys^{5}]-Grelina (1-5)-amida

ESI-MS [M+H] 650,5 (valor teórico: 649,8), composición de aminoácidos; Ser; 1,79 (2), Gly; 0,99 (1), Phe; 1, Lys; 0,99 (1)

Compuesto 39

[^{D}Phe^{4}, Lys^{5}]-Grelina (1-5)-amida

ESI-MS [M+H] 650-5 (valor teórico: 649,8), composición de aminoácidos Ser; 1,79 (2), Gly; 0,99 (1), Phe; 1, Lys; 0,99 (1)

Compuesto 40

[N-Aminopentanoil]-Grelina (3-7)-amida

ESI-MS [M+H] 774,7 (valor teórico: 774,0), composición de aminoácidos: Ser; 1,80 (2), Leu; 1, Phe; 1,01 (1), Pro; 1,00 (1)

Compuesto 43

[N-Glicil]-Grelina (3-7)-amida

ESI-MS [M+H]; 732,7 (valor teórico: 731,9), composición de aminoácidos: Ser; 1,80 (2), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,01 (1), Pro; 1,00 (1)

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Compuesto 44

[Leu^{2}]-Grelina (1-7)-amida

ESI-MS [M+H]; 845,7 (valor teórico: 845,1), composición de aminoácidos: Ser; 1,80 (2), Gly; 1,01 (1), Leu; 2, Phe; 1,02 (1), Pro; 0,99 (1)

Compuesto 45

[His^{2}]-Grelina (1-7)-amida

ESI-MS [M+H]; 869,7 (valor teórico: 869,0), composición de aminoácidos después de la hidrólisis con ácido propiónico-ácido clorhídrico (50/50) a 150ºC durante 2 horas: Ser; 1,02 (2), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), His; 0,95 (1), Pro; 0,99 (1)

Compuesto 46

[Lys^{2}]-Grelina (1-7)-amida

ESI-MS [M+H]; 860,7 (valor teórico: 860,1), composición de aminoácidos después de la hidrólisis con ácido propiónico-ácido clorhídrico (50/50) a 150ºC durante 2 horas: Ser; 1,04 (2), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Lys; 1,00 (1), Pro; 1,00 (1)

Compuesto 47

[Gly^{2}]-Grelina (1-7)-amida

ESI-MS [M+H]; 789,5 (valor teórico: 788,9), composición de aminoácidos después de la hidrólisis con ácido propiónico-ácido clorhídrico (50/50) a 150ºC durante 2 horas: Ser; 1,14 (2), Gly; 2,01 (2), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Pro; 1,00 (1)

Compuesto 59

[Thr^{3}(Octanoil)]-hGrelina

ESI-MS M; 3384,0 (valor teórico: 3384,9), composición de aminoácidos: Ala; 1,02 (1) Arg; 2,99 (3), Glx; 5,91 (6), Gly; 1,02 (1), His; 1,00 (1), Leu; 2, (2), Lys; 4,05 (4), Phe; 1,00 (1), Pro; 4,06 (4), Ser; 2,66 (3), Thr; 0,94 (1), Val; 0,96 (1)

Compuesto 60

[Leu^{2}, Thr^{3}(Octanoil)]-hGrelina

ESI-MS M; 3410,0 (valor teórico: 3411,0), composición de aminoácidos: Ala; 1,01 (1), Arg; 2,95 (3), Glx; 5,92 (6), Gly; 1,01 (1), His; 1,01 (1), Leu; 3 (3), Lys; 4,02 (4), Phe; 1,01 (1), Pro; 4,00 (4), Ser; 1,81 (2), Thr; 0,96 (1), Val; 0,97 (1)

Compuesto 69

[Ser^{3}(4-Metilpentanoil)]-hGrelina

ESI-MS M; 3343,0 (valor teórico: 3342,9), composición de aminoácidos Ala; 1,00 (1), Arg; 2,97 (3), Glx; 5,86 (6), Gly; 1,02 (1), His; 1,01 (1), Leu; 2, Lys; 4,00 (4), Phe; 1,01 (1), Pro; 3,99 (4), Ser; 3,54 (4), Val; 0,98 (1)

Compuesto 75

[Lys^{7}]-Grelina (1-7)-amida

ESI-MS [M+H]; 850,5 (valor teórico: 850,0), composición de aminoácidos: Ser; 2,67 (3), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Lys; 1,00 (1)

(5) Ejemplo de síntesis de un derivado acilado amino-terminal

Compuesto 6

[N-Octanoil, Ser^{3}]-Grelina (1-9)-amida; C_{7}H_{15}CO-GSSFLSPEH-NH_{2}

Se trató resina-Fmoc-amida (403 mg, 0,25 mmol, ABX Co., Ltd) con piperazina al 20% durante 20 minutos y se sometió repetidamente a introducción de Fmoc-aminoácido con HBTU/HOBt y eliminación de Fmoc con piperazina secuencialmente para construir Fmoc-Gly-Ser(Bu^{t})-Ser(Bu^{t})-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBu^{t})-His(Boc)-resina. Después del tratamiento con piperazina, la resina-péptido resultante (550 mg) se lavó con NMP, se añadieron DIPCl (126,2 mg, 1 mmol) y ácido octanoico (144,2 mg, 1,0 mmol) en presencia de HOBt (135,1 mg, 1 mmol) y la mezcla se dejó reaccionar durante 4 horas. La resina se recuperó por filtración, se lavó con NMP y después con cloruro de metileno y se secó al vacío para dar aproximadamente 600 mg de resina-péptido protegido donde el grupo amino de la Gly amino-terminal estaba octanoilado. Este producto se desprotegió con TFA (10 ml) (tratamiento durante 30 minutos) para dar 200 mg de péptido bruto. Toda la muestra se aplicó a YMC-Pack PROTEIN-RP (5 \mum, C4, 20 mm x 250 mm) y se eluyó con un gradiente lineal (caudal: 10 ml/min) durante 60 minutos de acetonitrilo de 0 a 54% en ácido trifluoroacético al 0,1%. Se obtuvieron aproximadamente 180 mg del producto deseado.

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Valores medidos: ESI-MS [M+H]; 1085,6 (valor teórico: 1085,2), composición de aminoácidos: Ser; 2,47 (3), Glx; 0,98 (1), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,02 (1), His; 1,09 (1), Pro; 0,96 (1)

(6) Ejemplo de síntesis de un derivado que contiene serina que tiene una cadena lateral alquilo

Compuesto 50

[Ser^{3}(Octil)]-Grelina (1-7)-amida

GSS(C_{8}H_{17})FLSP-NH_{2}

Fmoc-Ser (C_{8}H_{17})

Con refrigeración en hielo, se añadió hidruro sódico (3,19 g, 133 mmol) a una solución de Boc-Ser (12,3 g, 53,9 mmol) en DMF (300 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Se añadió yoduro de octano (11,0 ml, 60,9 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Después de que a la solución de reacción se le añadiera gota a gota agua (40 ml) con refrigeración con hielo, el disolvente se evaporó al vacío. Los residuos resultantes se purificaron aplicándolos a cromatografía en columna de gel de sílice (gel; Art9385, Merck Co., Ltd, eluyente: diclorometano:metanol:ácido acético = 120:10:1), para dar 6,88 g de Boc-Ser (C_{8}H_{17}) (rendimiento, 36,2%) en forma de un material oleoso amarillo pálido. A este producto, Boc-Ser (C_{8}H_{17}) (6,88 g, 21,7 mmol), se le añadió ácido trifluoroacético (120 ml) con refrigeración sobre hielo y se agitó durante 0,5 horas a temperatura ambiente. Después de que se evaporara el ácido trifluoroacético, los residuos resultantes se disolvieron en éter dietílico (120 ml), se añadió HCl 4 N-dioxano (22 ml) y la mezcla se agitó durante 1 hora con refrigeración en hielo. Los cristales precipitados se recuperaron por filtración para dar 5,23 g de H-Ser (C_{8}H_{17})\cdotHCl
(rendimiento, 96,3%) en forma de cristales incoloros. Después de que se añadiera trietilamina (1,40 ml, 10 mmol) a una suspensión (50 ml) de este producto H-Ser (C_{8}H_{17})\cdotHCl (2,54 g, 10,0 mmol) en hidrogenocarbonato sódico al 10%, se añadió gota a gota una solución de Fmoc-Osu (5,00 g, 14,8 mmol) en 1,2-dimetoxietano (20 ml) durante un periodo de 10 minutos y se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Los materiales insolubles se retiraron por filtración, después al filtrado se le añadió diclorometano y la fase orgánica se separó y se lavó con una solución al 13% de NaCl. La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro y el disolvente se evaporó. Los residuos resultantes se purificaron aplicándolos a cromatografía en columna en gel de sílice (gel; BW-30Q, Fuji Silicia Co., Ltd, eluyente: diclorometano:metanol = 93:7), para dar 2,75 g de Fmoc-Ser (C_{8}H_{17}) (rendimiento: 62,6%) en forma de cristales incoloros. Rf = 0,45 (CHCl_{3}:MeOH = 9:1, Gel de Sílice 60F_{254}, MERCK Co., Ltd). Fmoc-^{D}Ser (C_{8}H_{17}) : Rf = 0,45 (CHCl_{3}:MeOH = 9:1, Gel de Sílice 60F_{254}, MERCK Co., Ltd).

Se trató Fmoc-amida-resina (400 mg, 0,25 mmol, ABI Co., Ltd) con piperazina al 20% durante 20 minutos y se sometió repetidamente a introducción de Fmoc-aminoácido con HBTU/HOBt y eliminación de Fmoc con piperazina secuencialmente para construir Fmoc-Ser(Bu^{t})-Ser(C_{8}H_{17})-Phe-Leu-Ser(Bu^{t})-Pro-resina. Después de que se introdujera finalmente Boc-Gly por DCC/HOBt, una parte (250 mg) de la resina-péptido protegido resultante se trató con TFA (10 ml) durante 30 minutos. La resina se retiró por filtración y el filtrado se concentró seguido de adición de éter a los residuos resultantes para dar aproximadamente 120 mg del péptido bruto en forma de precipitados. Este producto se disolvió en AcOH al 5% (10 ml), se aplicó a YMC-Pack-ODS-A (5 \mum, 20 mm x 250 mm) y se eluyó con un gradiente lineal (caudal: 10 ml/min) durante 60 minutos de acetonitrilo de 0 a 60% en ácido trifluoroacético al 0,1%. Las fracciones deseadas se recogieron y se liofilizaron para dar aproximadamente 40 mg del producto deseado.

Compuesto 84

[N-Aminopentanoil, Ser^{3}(Octil)]-Grelina (3-5)-bencil amida

H-Ape-Ser(C_{8}H_{17})-Phe-Leu-NH-CH_{2}-Ph

Se puso resina de oxima (230 mg/0,25 mmol, Novabiochem Co., Ltd) en un recipiente de reacción equipado con un filtro de vidrio y Boc-Leu-OH \cdot H_{2}O (190 mg, 0,75 mmol) disuelto previamente en cloruro de metileno (DCM), se secó sobre MgSO_{4}, se añadieron DCC (160 mg, 0,75 mmol) y 5 ml de DCM y la mezcla se agitó durante una noche. El producto de reacción se lavó varias veces con una cantidad adecuada de DCM, DCM/EtOH (1:1) y DCM en este orden. Después de la introducción de Leu, <1> se añadieron 10 ml de TFA al 25%/DCM, la mezcla se agitó durante 30 minutos y la resina se lavó varias veces con DCM, alcohol isopropílico (iPrOH), DCM y DMF en este orden, y <2> una solución preparada disolviendo 0,75 mmol (3 equivalentes) de Boc-aminoácido, 0,75 mmol (3 equivalentes) de TBTU y 0,75 mmol (3 equivalentes) de HOBt y después añadiendo 1,25 mmol (5 equivalentes) de DIPEA en 5 ml de DMF en un matraz Erlenmeyer se introdujo en el recipiente de reacción y la mezcla se agitó durante 1 hora; esta operación se realizó repetidamente para condensar secuencialmente los aminoácidos. Finalmente, se obtuvo resina Boc-NH-(CH_{2})_{4}-CO-Ser(C_{8}H_{17})-Phe-Leu-Oxima, 370 mg. La resina se suspendió en aproximadamente 5 ml de DMF, se añadieron hidrocloruro de bencilamina (180 mg, 1,25 mmol), trietilamina (173 \mul, 1,25 mmol) y ácido acético (72 \mul, 1,25 mmol) y la mezcla se agitó. Después de 24 horas, la resina se retiró por filtración, el filtrado se evaporó, y el péptido protegido con Boc resultante se precipitó en 10 ml de HCl 1 N. Este producto se lavó con agua y se secó, se añadieron 5 ml de TFA y se hizo reaccionar durante 30 minutos eliminando de esta manera el Boc. El TFA se evaporó y el producto se precipitó con éter (Et_{2}O), por lo que se obtuvo el producto deseado [N-Aminopentanoil, Ser^{3}(Octil)]-Grelina (3-5)-bencilamida, 110 mg. Los compuestos 82, 83 y 85 se sintetizaron de la misma manera.

Los siguientes derivados peptídicos que tienen alquil serina, excepto los Compuestos 82 a 85, se produjeron de la misma manera que en la producción del Compuesto 50 descrito anteriormente.

Los resultados de la espectrometría de masas y el análisis de composición de aminoácidos de los derivados peptídicos que tienen alquil serina se resumen a continuación.

Compuesto 17

[Ser^{3}(Octil)]-hGrelina

ESI-MS; 3357,0 (valor teórico: 3356,9), composición de aminoácidos Ser; 2,92 (3 + 1), Glx; 5,94 (6), Gly; 1,00 (1), Ala; 0,98 (1), Val; 0,99 (1), Leu; 2, Phe; 1,13 (1), Lys; 4,04 (4), His; 1,09 (1), Arg; 3,01 (3), Pro; 3,89 (4)

Compuesto 50

[Ser^{3}(Octil)]-Grelina (1-7)-amida

ESI-MS [M+H]; 805,5 (valor teórico: 805,0), composición de aminoácidos después de la hidrólisis con ácido propiónico\cdotácido clorhídrico (50/50) a 150ºC durante 2 horas: Ser; 0,86 (2 + 1), Gly; 1,01 (1), Leu; 1, Phe; 1,06 (1), Pro; 0,95 (1)

Compuesto 51

[Ser^{3}(Octil), ^{D}Phe^{4}]-Grelina (1-7)-amida

ESI-MS [M+H]; 805,4 (valor teórico: 805,0), composición de aminoácidos después de la hidrólisis con ácido propiónico\cdotácido clorhídrico (50/50) a 150ºC durante 2 horas: Ser; 0,97 (2 + 1), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,05 (1), Pro; 1,16 (1)

Compuesto 52

[^{D}Ser^{3}(Octil)]-Grelina (1-7)-amida

ESI-MS [M+H]; 805,4 (valor teórico: 805,0), composición de aminoácidos después de la hidrólisis con ácido propiónico\cdotácido clorhídrico (50/50) a 150ºC durante 2 horas: Ser; 1,51 (2+1), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Pro; 1,00 (1)

Compuesto 53

[^{D}Ser^{3}(Octil), ^{D}Phe^{4}]-Grelina (1-7)-amida

ESI-MS [M+H]; 805,5 (valor teórico: 805,0), composición de aminoácidos después de la hidrólisis con ácido propiónico\cdotácido clorhídrico (50/50) a 150ºC durante 2 horas: Ser; 1,51 (2+1), Gly; 1,00 (1), Leu; 1, Phe; 1,00 (1), Pro; 1,01 (1)

Compuesto 67

[Ser^{3}(Bzl)]-hGrelina

ESI-MSM; 3335,0 (valor teórico: 3334,8), composición de aminoácidos: Ala; 1,00 (1), Arg; 2,96 (3), Glx; 5,92 (6), Gly; 1,00 (1), His; 1,01 (1), Leu; 2(2), Lys; 4,00 (4), Phe; 1,02 (1), Pro; 4,08 (4), Ser; 3,58 (4), Val; 0,98 (1)

Compuesto 76

[N-Aminopentanoil, Ser^{3}(Octil), Lys^{5}] -Grelina (3-5)-amida

ESI-MS [M+H]; 591,5 (valor teórico: 590,8), composición de aminoácidos: Ser; 0,45 (1), Phe; 1, Lys; 1,00 (1)

Compuesto 77

[N-Aminopentanoil, ^{D}Ser^{3}(Octil), ^{D}Phe^{4}, Lys^{5}]-Grelina (3-5)-amida

ESI-MS [M+H]; 591,5 (valor teórico: 590,8), composición de aminoácidos Ser; 0,45 (1), Phe; 1, Lys; 1,01 (1)

Compuesto 78

[Aib^{1}, His^{2}, Ser^{3}(Octil), Lys^{5}]-Grelina (1-5)-amida

ESI-MS [M+H]; 714,6 (valor teórico: 713,9), composición de aminoácidos: Ser; 0,45 (1), Phe; 1, His; 1,01 (1), Lys; 1,00 (1)

Compuesto 79

[Aib^{1}, His^{2}, ^{D}Ser^{3}(Octil), ^{D}Phe^{4}, Lys^{5}]-Grelina (1-5)-amida

ESI-MS [M+H]; 714,5 (valor teórico: 713,9), composición de aminoácidos: Ser; 0,44 (1), Phe; 1, His; 1,00 (1), Lys; 1,01 (1)

Compuesto 81

[N-Aminopentanoil, Ser^{3}(Octil)]-Grelina (3-5)-amida

ESI-MS [M+H]; 576,5 (valor teórico: 575,8), composición de aminoácidos: Ser; 0,49 (1), Leu; 2, Phe; 0,99 (1)

Compuesto 82

[N-Aminopentanoil, Ser^{3}(Octil)]-Grelina (3-5)-metilamida

ESI-MS [M+H]; 590,6 (valor teórico: 589,8), composición de aminoácidos: Ser; 0,49 (1), Leu; 1, Phe; 0,99 (1)

Compuesto 83

[N-Aminopentanoil, Ser^{3}(Octil)]-Grelina (3-5)-etilamida

ESI-MS [M+H]; 604,3 (valor teórico: 603,8), composición de aminoácidos: Ser; 0,50 (1), Leu; 1, Phe; 0,99 (1)

Compuesto 84

[N-Aminopentanoil, Ser^{3}(Octil)]-Grelina (3-5)-bencilamida

ESI-MS [M+H]; 666,5 (valor teórico: 665,9), composición de aminoácidos: Ser; 0,46 (1), Leu; 1, Phe; 0,98 (1)

Compuesto 85

[N-Aminopentanoil, Ser^{3}(Octil)]-Grelina (3-5)-aminoetilamida

ESI-MS [M+H]; 619,6 (valor teórico: 618,9), composición de aminoácidos: Ser; 0,47 (1), Leu; 1, Phe; 0,99 (1)

(7) Ejemplo de síntesis de un derivado que contiene cisteína que tiene una cadena lateral alquilo

Compuesto 48

[Cys^{3}(Octil)]-Grelina (1-7)-NH_{2}

GSC(C_{8}H_{17})FLSP-NH_{2}

Se trató Fmoc-amida-resina (403 mg, 0,25 mmol, ABI Co., Ltd) con piperazina al 20% durante 20 minutos y se sometió repetidamente a introducción de Fmoc-aminoácido con HBTU/HOBt y eliminación de Fmoc con piperazina secuencialmente para construir Fmoc-Ser(Bu^{t})-Cys(C_{8}H_{17})-Phe-Leu-Ser(Bu^{t})-Pro-resina. Después de que se introdujera finalmente Boc-Gly con DCC/HOBt, la resina-péptido protegido resultante (550 mg) se trató con TFA (10 ml) durante 30 minutos. La resina se retiró por filtración y el filtrado se concentró seguido de adición de éter a los residuos resultantes para dar aproximadamente 120 mg del péptido bruto en forma de precipitados. Este producto se disolvió en 10 ml de ácido acético al 5%, se aplicó a YMC-Pack-ODS-A (5 \mul, 20 mm x 250 mm) y se eluyó con un gradiente lineal (caudal: 10 ml/min) durante 60 minutos de acetonitrilo de 0 a 60% en ácido trifluoroacético al 0,1%. Las fracciones deseadas se recogieron y se liofilizaron para dar aproximadamente 44 mg del producto deseado.

Compuesto 68

[Cys^{3}(Trt)]-hGrelina

GSC(C-Ph_{3})FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR

Se trató Fmoc-Arg(Pmc)-resina (403 mg, 0,25 mmol, ABI Co., Ltd) con piperazina al 20% durante 20 minutos y se sometió repetidamente a introducción de Fmac-aminoácido con HBTU/HOBt y eliminación de Fmoc con piperazina secuencialmente para construir Fmoc-Ser(Bu^{t})-Cys(Trt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBu^{t})-His(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OBu^{t})-Ser(Bu^{t})-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-
Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-HMP-resina. Después de que se introdujera finalmente Boc-Gly con DCC/HOBt, se recuperó la resina-péptido protegido resultante (1,4 g). Se añadió TFA (15 ml) a una parte (400 mg) de la resina resultante y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La resina se retiró por filtración y el filtrado se concentró seguido de la adición de éter a los residuos resultantes para formar precipitados. Se disolvieron aproximadamente 90 mg de los precipitados en 40 ml de agua, después la mezcla se aplicó a YMC-PackPROTEIN-RP (C4, 20 mm x 250 mm) y se eluyó con un gradiente lineal (caudal; 10 ml/min) durante 60 minutos de acetonitrilo de 0 a 54% en ácido trifluoroacético al 0,1%. Las fracciones deseadas se recogieron y se liofilizaron para dar aproximadamente 60 mg del producto deseado.

Los siguientes derivados peptídicos que tienen alquil cisteína se produjeron de la misma manera que en la producción del Compuesto 48 ó 68 descrita anteriormente.

Los resultados de la espectrometría de masas y el análisis de composición de aminoácidos de los derivados peptídicos que tienen alquil cisteína se resumen a continuación.

Compuesto 18

[Cys^{3}(Octil)]-rGrelina

ESI-MS; 3317,0 (valor teórico: 3316,9), composición de aminoácidos: Ser; 2,69 (3), Glx; 5,90 (6), Gly; 1,00 (1), Ala; 1,99 (2), Leu; 2, Phe; 1,02 (1), Lys; 4,97 (5), His; 0,99 (1), Arg; 1,98 (2), Pro; 3,87 (4)

Compuesto 48

[Cys^{3} (Octil)]-Grelina (1-7)-amida

ESI-MS [M+H]; 821,7 (valor teórico: 821,1), composición de aminoácidos después de la hidrólisis con ácido propiónico\cdotácido clorhídrico (50/50) a 150ºC durante 2 horas; Ser; 0,60 (2), Gly; 1,08 (1), Leu; 1, Phe; 1,06 (1), Pro; 0,96 (1)

Compuesto 49

[Cys^{3}(Octil), ^{D}Phe^{4}]-Grelina (1-7)-amida

ESI-MS [M+H]; 821,6 (valor teórico: 821,1), composición de aminoácidos después de la hidrólisis con ácido propiónico\cdotácido clorhídrico (50/50) a 150ºC durante 2 horas: Ser; 0,58 (2), Gly; 1,02 (1), Leu; 1, Phe; 1,06 (1), Pro; 0,97 (1)

Compuesto 68

[Cys^{3}(Trt)]-hGrelina

ESI-MS 3503,0 (valor teórico: 3503,1), composición de aminoácidos: Ser; 2,42 (3), Glx_{;} 5,77 (6), Gly; 1,00 (1), Ala; 1,01 (1), Val; 0,94 (1), Leu; 2, Phe; 0,99 (1), Lys; 3,94 (4), His; 0,99 (1), Arg; 2,92 (3), Pro; 3,81 (4)

(8) Ejemplo de síntesis de un derivado peptídico que contiene N-metilaminoácidos

Compuesto 86

[N-Aminopentanoil, Ser^{3}(Octil), MePhe^{4}, MeLeu^{5}]-Grelina (3-5)-amida

NH_{2}-(CH_{2})_{4}-CO-Ser(C_{8}H_{17})-MePhe-MeLeu-NH_{2}

Se puso Fmoc-amida-resina (0,40 g, 0,25 mmol) en un recipiente de reacción equipado con un filtro de vidrio, se añadieron 15 ml de piperidina al 20% en NMP y la mezcla se agitó durante 20 minutos, retirando de esta manera el grupo Fmoc. Después, se añadieron 15 ml de NMP, 1,0 mmol (4 equivalentes) de Fmoc-MeLeu-OH, 1,0 mmol (4 equivalentes) de TBTU, 1,0 mmol (4 equivalentes) de HOBt y 1,0 mmol (4 equivalentes) de DIPEA y la mezcla se agitó durante 1 hora para condensar el Fmoc-MeLeu. Después, la cadena peptídica se prolongó realizando repetidamente la retirada del grupo Fmoc con piperidina al 20% y condensación de Fmoc-aminoácido (3 equivalentes) por hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfonio (3 equivalentes) en presencia de 2,25 mmol (9 equivalentes) de DIPEA. La conclusión de la reacción de condensación se confirmó por desprotección de una pequeña cantidad de la resina con TFA y examinándola por HPLC y espectrometría de masas (MS). Después de que se obtuviera Boc-NH-(CH_{2})_{4}-CO-Ser(O-C_{8}H_{17})-MePhe-MeLeu-resina, esta resina se trató con TFA durante 30 minutos, por lo que la resina se escindió para desproteger el péptido. Después de que se evaporara el TFA, el péptido se lavó con éter (Et_{2}O) para dar 120 mg de NH_{2}-(CH_{2})_{4}-CO-Ser(C_{8}H_{17})-MePhe-MeLeu-NH_{2}. Este producto se aplicó a YMC-Pack ODS-A (C18, 20 mm x 250 mm) y se eluyó con un gradiente lineal (caudal; 10 ml/min) durante 60 minutos de acetonitrilo de 0 a 54% en ácido trifluoroacético al 0,1%. Las fracciones deseadas se recogieron y se liofilizaron para dar 70 mg del producto deseado. Después de que se hidrolizara este derivado con ácido propiónico\cdotHCl (50/50) a 150ºC durante 2 horas, la cantidad del péptido se cuantificó usando la proporción de área de los picos de ácido aminopentanoico detectada en el analizador de aminoácidos con la de 10 nmol de ácido aminopentanoico como patrón.

ESI-MS [M+H]; 604,5 (valor teórico: 603,8), aminoácidos detectados después de la hidrólisis con ácido propió-
nico\cdotHCl (50/50) a 150ºC durante 2 horas: Ser, Ape.

(9) Síntesis de un derivado de disulfuro mixto

Compuesto 57

[Cys^{3}(S-Heptil)]-hGrelina

GSC(S-C_{7}H_{15})FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR

Un reactivo de desprotección (15 ml) que consiste en TFA al 88%-fenol al 5%-TIPS al 2%-H_{2}O al 5% se añadió a una resina HMP-péptido protegido (1 g) obtenida por síntesis de la misma manera que en la producción del Compuesto 68, y después se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La resina se retiró por filtración y el filtrado se concentró seguido de adición de éter a los residuos resultantes, por lo que se obtuvieron aproximadamente 550 mg de polvo de [Cys^{3}]-hGrelina en bruto. Este producto se aplicó a YMC-PackODS-A (C18, 20 mm x 250 mm) y se eluyó con un gradiente lineal (caudal: 10 ml/min) durante 60 minutos de acetonitrilo de 0 a 54% en ácido trifluoroacético al 0,1%. Las fracciones deseadas se recogieron y se liofilizaron para dar 300 mg de [Cys^{3}]-hGrelina (1-28). 40 mg (11,4 \mumol) de este producto se disolvieron en agua (20 ml), se añadió una solución de 1 ml de 4,4'-ditiodipiridina (7,5 mg, 34,2 \mumol) en acetonitrilo y la mezcla se dejó durante 1 hora. Después de que se confirmara la finalización de la reacción, la solución de reacción se lavó varias veces con cloroformo para retirar el exceso del derivado de 4,4'-ditiodipiridina y piridona. La capa acuosa (10 ml) que contenía [tiopiridil Cys^{3}]-hGrelina (1-28) se ajustó a un valor de pH de 7,4 con NH_{3} ac. al 5% y se añadió una solución de 1-heptano [sic.] tiol (4,5 mg, 34,2 \mumol) en 2 ml de acetonitrilo. Después de 1 hora, la solución de reacción se aplicó a YMC-Pack ODS-A (C18, 20 mm x 250 mm) y se eluyó con un gradiente lineal (caudal: 10 ml/min) durante 60 minutos de acetonitrilo de 0 a 54% en ácido trifluoroacético al 0,1%. Las fracciones deseadas se recogieron y se liofilizaron para dar 15 mg del producto deseado.

Compuesto 57

[Cys^{3}(S-Heptil)]-hGrelina

ESI-MS 3391,0 (valor teórico: 3391,0), composición de aminoácidos: Ser; 2,76 (3), Glx; 5,81 (6), Gly; 0,99 (1), Ala; 1,01 (1), Val; 0,95 (1), Leu; 2, Phe; 0,99 (1), Lys; 3,95 (4), His; 0,99 (1), Arg; 2,93 (3), Pro; 3,84 (4)

(10) Ejemplos de síntesis de un derivado que tiene una amida en una cadena lateral en la posición 3 y un éster en la dirección inversa

Compuesto 55

[Asp^{3}(NH-Heptil)]-hGrelina

GSD(NH-C_{7}H_{15})FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR

Se trató resina Fmoc-Arg(Pmc)-HMP (403 mg, 0,25 mmol, ABI Co., Ltd) con piperazina al 20% durante 20 minutos y se sometió repetidamente a la introducción de Fmoc-aminoácido con HBTU/HOBt y eliminación de Fmoc con piperazina secuencialmente para construir Fmoc-Ser(Bu^{t})-Asp(OPis)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBu^{t})-His(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OBu^{t})-Ser(Bu^{t})-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-resina HMP. Después de que se introdujera finalmente Boc-Gly con DCC/HOBt, la resina-péptido protegido resultante (1,3 g) se trató con una solución (15 ml) de TFA al 4%-cloruro de metileno durante 15 minutos. El péptido-resina se recuperó por filtración, se lavó varias veces con cloruro de metileno (30 ml), y se lavó con DIEA al 4% (10 ml) y después con cloruro de metileno (30 ml).

La resina-péptido des-Pis resultante (aproximadamente 1,3 g) se hinchó con NMP (10 ml), se añadieron hidrocloruro de carbodiimida soluble en agua (191,7 mg, 1,0 mmol), HOBt (135,2 mg, 1,0 mmol) y n-heptilamina (115,2 mg, 1,0 mmol) y la mezcla se dejó reaccionar durante 8 horas.

La resina se recuperó por filtración, se lavó con NMP y cloruro de metileno y se secó al vacío para dar aproximadamente 1,2 g de resina-péptido protegido donde el resto Asp 3 estaba heptilamidado. Se añadió un reactivo de desprotección (10 ml) que consistía en TFA al 88%-fenol al 5%-TIPS al 2%-H_{2}O al 5% y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La resina se retiró por filtración y el filtrado se concentró seguido de adición de éter a los residuos resultantes para formar precipitados. Los precipitados se recuperaron por filtración y se secaron para dar aproximadamente 550 mg de péptido bruto.

Se disolvieron 200 mg de este producto en 10 ml de agua y la mezcla se aplicó a YMC-Pack PROTEIN-RP (C4, 20 mm x 250 mm) y se eluyó con un gradiente lineal (caudal: 10 ml/min) durante 60 minutos de acetonitrilo de 0 a 54% en ácido trifluoroacético al 0,1%. Las fracciones deseadas se recogieron y se liofilizaron para dar aproximadamente 120 mg del producto deseado.

Compuesto 61

[Lys^{3}(Octanoil)]-hGrelina

GSK(CO-C_{7}H_{15})FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR

Se trató Fmoc-Arg(Pmc)-resina HMP (403 mg, 0,25 mmol, un producto de ABI Co., Ltd) con piperazina al 20% durante 20 minutos y se sometió repetidamente a introducción de Fmoc-aminoácido con HBTU/HOBt y eliminación de Fmoc con piperazina secuencialmente para construir Boc-Gly-Ser(tBu)-Lys(Mtt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OBu^{t})-His(Boc)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Glu(OBu^{t})-Ser(Bu^{t})-Lys(Boc)-Lys
(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pmc)-resina HMP. Se trataron aproximadamente 300 mg de la resina-péptido protegido resultante con una solución (15 ml) de TFA al 1%-TIPS al 5%-cloruro de metileno durante 60 minutos.

La resina-péptido se recuperó por filtración y se lavó varias veces con cloruro de metileno (30 ml), se lavó con DIEA al 10% (10 ml) y después con cloruro de metileno (30 ml). La resina-péptido des-Mtt resultante (aproximadamente 300 mg) se hinchó con NMP (2 ml), se añadieron ácido octanoico (40 \mul, 0,25 mmol) y DCC (52 mg, 0,25 mmol) en presencia de HOBt (34 mg, 0,25 mmol) y se dejó reaccionar durante una noche.

La resina se recuperó por filtración, se lavó con NMP y después con cloruro de metileno y se secó al vacío para dar aproximadamente 300 mg de resina-péptido protegido donde el 3^{er} resto de lisina estaba octanoilado. Se añadió un reactivo de desprotección (5 ml) que consistía en TFA al 88%-fenol al 5%-TIPS al 2%-H_{2}O al 5% y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La resina se retiró por filtración y el filtrado se concentró seguido de adición de éter a los residuos resultantes para formar precipitados. Los precipitados se separaron por filtración y se secaron para dar aproximadamente 234 mg de péptido bruto.

Este producto se disolvió en 6 ml de ácido acético, se aplicó a YMC-Pack ODS-A (5 \mum, 20 mm x 250 mm) y se eluyó con un gradiente lineal (caudal: 10 ml/min) durante 60 minutos de acetonitrilo de 0 a 60% en ácido trifluoroacético al 0,1%. Las fracciones deseadas se recogieron y se liofilizaron para dar aproximadamente 100 mg de polvo. Este producto se disolvió en 2 ml de ácido acético al 50%, se aplicó a YMC-Pack PROTEIN-RP (5 \mum, C4, 20 mm x 250 mm) y se eluyó con un gradiente lineal (caudal: 10 ml/min) durante 60 minutos de acetonitrilo de 0 a 60% en ácido trifluoroacético al 0,1%. Las fracciones deseadas se recogieron y se liofilizaron para dar aproximadamente 52 mg de polvo.

Los siguientes compuestos se produjeron de la misma manera que en la preparación del Compuesto 55 ó 61 descrita anteriormente.

Los resultados de la espectrometría de masas y el análisis de la composición de aminoácidos de los derivados peptídicos sintetizados por el método convencional Fmoc se resumen a continuación.

Compuesto 54

[Asp^{3}(O-Heptil)]-hGrelina (1-28)

ESI-MS 3371,0 (valor teórico: 3370,9), composición de aminoácidos: Asx; 0,99 (1), Ser; 2,70 (3), Glx; 5,87 (6), Gly; 1,01 (1), Ala; 1,01 (1), Val; 0,94 (1), Leu; 2, Phe; 1,00 (1), Lys; 4,02 (4), His; 1,00 (1), Arg; 2,98 (3), Pro; 3,84 (4)

Compuesto 55

[Asp^{3}(NH-Heptil)]-hGrelina (1-28)

ESI-MS 3370,0 (valor teórico: 3369,9), composición de aminoácidos: Asx; 0,88 (1), Ser; 2,95 (3), Glx; 5,97 (6), Gly; 1,21 (1), Ala; 1,03 (1), Val; 0,98 (1), Leu; 2, Phe; 1,00 (1), Lys; 3,94 (4), His; 0,92 (1), Arg; 2,91 (3), Pro; 3,99 (4)

Compuesto 56

[Dap^{3}(Octanoil)]-hGrelina

ESI-MS M; 3370,0 (valor teórico: 3369,9), composición de aminoácidos: Ala; 1,02 (1), Arg; 2,94 (3), Glx; 5,94 (6), Gly; 1,00 (1), His; 0,91 (1), Leu; 2(2), Lys; 3,93 (4), Phe; 0,99 (1), Pro; 4,01 (4), Ser; 2,88 (3), Val; 0,98 (1), Dap; N.D.

Compuesto 58

[Adod^{3}]-hGrelina (1-28)

ESI-MS M; 3355,0 (valor teórico: 3355,0), composición de aminoácidos: Ala; 1,01 (1), Arg; 2,91 (3), Glx; 5,95 (6), Gly; 1,01 (1), His; 0,91 (1), Leu; 2(2), Lys; 3,94 (4), Phe; 0,99 (1), Pro; 4,02 (4), Ser; 2,88 (3), Val; 0,96 (1)

Compuesto 61

[Lys^{3} (Octanoil)]-hGrelina

ESI-MS M; 3412,0 (valor teórico: 3412,0), composición de aminoácidos; Ala; 1,05 (1), Arg; 3,05 (3), Glx; 6,02 (6), Gly; 1,00 (1), His; 1,00 (1). Leu; 2(2), Lys; 5,11 (5), Phe; 0,97 (1), Pro; 4,20 (4), Ser; 2,68 (3), Val; 1,00 (1)

Compuesto 62

[Trp^{3}]-hGrelina

ESI-MS M; 3343,0 (valor teórico: 3343,9), composición de aminoácidos: Ala; 1,00 (1), Arg; 3,03 (3), Glx; 5,94 (6), Gly; 1,01 (1), His; 1,01 (1), Leu; 2(2), Lys; 4,00 (4), Phe; 0,99 (1), Pro; 3,96 (4), Ser; 2,60 (3), Trp; N.D., Val; 0,98 (1)

Compuesto 63

[Phe^{3}]-hGrelina

ESI-MS M; 3305,0 (valor teórico: 3304,8), composición de aminoácidos: Ala; 0,99 (1), Arg; 2,96 (3), Glx; 5,86 (6), Gly; 1,00 (1), His; 1,00 (1), Leu; 2(2), Lys; 3,98 (4), Phe; 2,01 (2), Pro; 3,99 (4), Ser; 2,67 (3), Val; 0,98 (1)

Compuesto 64

[Cha^{3}] -hGrelina

ESI-MS M; 3411,0 (valor teórico: 3410,9), composición de aminoácidos: Ala; 1,02 (1), Arg; 3,01 (3), Glx; 5,92 (6), Gly; 1,01 (1), His+Cha; 2,01 (1+1), Leu; 2(2), Lys; 4,02 (4), Phe; 1,01 (1), Pro; 4,03 (4), Ser; 2,72 (3), Val; 0,97 (1)

Compuesto 65

[2-^{L}NaI^{3}]-hGrelina

ESI-MS M; 3354,0 (valor teórico: 3354,9), composición de aminoácidos: Ala; 1,00 (1), Arg; 2,95 (3), Glx; 5,87 (6), Gly; 1,02 (1), His; 1,01 (1), Leu; 2(2), Lys; 3,98 (4), Phe; 1,01 (1), Pro; 3,94 (4), Ser; 2,73 (3), Val; 0,97 (1), Nal; N.D. (1)

Compuesto 66

[2-^{D}NaI^{3}]-hGrelina

ESI-MS M; 3355,0 (valor teórico: 3354,9), composición de aminoácidos: Ala; 1,02 (1), Arg; 2,95 (3), Glx; 5,96 (6), Gly; 1,00 (1), His; 0,92 (1), Leu; 2(2), Lys; 3,94 (4), Phe; 0,99 (1), Pro; 4,02 (4), Ser; 2,91 (3), Val; 0,98 (1), Nal; N.D. (2)

Compuesto 70

[Leu^{3}]-hGrelina

ESI-MS M; 3270,0 (valor teórico: 3270,8), composición de aminoácidos: Ala; 0,99 (1), Arg; 2,95 (3), Glx; 5,88 (6), Gly; 1,01 (1), His; 1,00 (1), Leu; 3(3), Lys; 3,96 (4), Phe; 1,00 (1), Pro; 3,89 (4), Ser; 2,65 (3), Val; 0,97 (1)

Compuesto 71

[Ile^{3}]-hGrelina

ESI-MS M; 3270,0 (valor teórico: 3270,8), composición de aminoácidos: Ala; 0,98 (1), Arg; 2,96 (3), Glx; 5,87 (6), Gly; 0,99 (1), His; 1,01 (1), Ile; 0,98 (1), Leu; 2(2), Lys; 3,97 (4), Phe; 1,00 (1), Pro; 3,97 (4), Ser; 2,65 (3), Val; 0,98 (1)

Compuesto 72

[Lys^{3}(Octanoil)]-hGrelina

ESI-MS M; 3286,0 (valor teórico: 3285,8), composición de aminoácidos: Ala; 1,02 (1), Arg; 2,94 (3), Glx; 5,95 (6), Gly; 0,99 (1), His; 0,92 (1), Leu; 2(2), Lys; 4,92 (5), Phe; 0,99 (1), Pro; 4,02 (4), Ser; 2,91 (4), Val; 0,99 (1)

Compuesto 73

[Nle^{3}]-hGrelina

ESI-MS M; 3270,0 (valor teórico: 3270,8), composición de aminoácidos: Ala; 1,01 (1), Arg; 2,98 (3), Glx; 5,92 (6), Gly; 1,02 (1), His; 1,01 (1), Leu; 2(2), Lys; 4,01 (4), Phe; 1,01 (1), Pro; 4,01 (4), Ser; 2,71 (3), Val; 0,98 (1), Nle; N.D. (1)

Compuesto 74

[Val^{3}]-hGrelina

ESI-MS M; 3256,0 (valor teórico: 3256,8), composición de aminoácidos: Ala; 0,98 (1), Arg; 2,96 (3), Glx; 5,84 (6), Gly; 1,00 (1), His; 1,01 (1), Leu; 2(2), Lys; 3,97 (4), Phe; 0,99 (1), Pro; 3,94 (4), Ser; 2,64 (3), Val; 1,97 (2)

Compuesto 80

[Aib^{1}, His^{2}, ^{D}Nal^{3}, ^{D}Phe^{4}, Lys^{5}]-Grelina (1-5)-amida; Ipamorelina

ESI-MS [M+H]; 712,5 (valor teórico: 711,9), composición de aminoácidos: Phe; 1, His; 1,00 (1), Lys; 1,00 (1)

Ejemplo 11 Comparación de actividad entre compuestos de tipo péptido derivados de grelina

Las actividades de liberación de Ca de los compuestos de tipo péptido derivados de grelina sintetizados en el Ejemplo 10 y el péptido de grelina natural se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 1.

(1) Modificación de una cadena lateral de la 3ª serina A. Posición del grupo octanoílo

La característica estructural significativa de la grelina recae en el grupo octanoílo del grupo hidroxilo de la 3ª serina. En primer lugar, se examinó si era o no ventajoso para presentar la actividad que la posición de la serina a octanoilar fuera la 3ª posición. En este examen, se usó como indicador la actividad de liberación de Ca intracelular en células CHO que expresan el receptor de GSH de rata.

Basándose en la grelina (1-9) amida (un derivado de grelina de cadena corta) cuyo valor de CE_{50} se mantenía a 5,4 nM, se sintetizaron [serina^{2} (octanoil), serina^{3}]-grelina (1-9) amida, [serina^{2} (octanoil)]-grelina (1-9) amida y [N^{\alpha}-octanoil, serina^{3}]-grelina (1-9) amida, y se examinó su actividad de liberación de Ca intracelular.

Los resultados se resumen en la Tabla 4

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Actividad del derivado de grelina 1

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13

La actividad se redujo a aproximadamente 1/200 por transferencia de un grupo octanoílo desde la 3ª serina a la 2ª serina en grelina humana (CE_{50} = 1.100 nM).

El derivado que tiene grupos octanoílo tanto en la 2ª como en la 3ª posición también mostró una actividad reducida (CE_{50} = 1.400 nM).

Además, la actividad se había debilitado relativamente por N-octanoilación sólo en el grupo amino del extremo amino (CE_{50} >10.000 nM).

A partir de estos resultados, se reveló que la posición del aminoácido modificado con un grupo octanoílo es particular y preferiblemente la 3ª posición en la molécula de grelina.

B. Longitud de cadena de un ácido graso

La actividad de liberación de Ca intracelular del derivado des-octanoílo obtenido a partir de grelina de rata por eliminación del grupo octanoílo de la cadena lateral de la 3ª serina fue de 3.500 nM en comparación con la actividad (2,6 nM) de la grelina octanoilada, y por lo tanto es evidente que el grupo octanoílo de la cadena lateral de la 3ª serina juega un papel muy importante en la expresión de la actividad.

Por consiguiente, se examinó la relación entre la actividad y el número de átomos de carbono en el grupo acilo de la cadena lateral de serina en la grelina de rata usando diversos ácidos grasos saturados. Es decir, se determinaron las actividades de liberación de Ca intracelular de los derivados de grelina donde el grupo hidroxilo de la 3ª serina se había acilado con un grupo acetilo (CH_{3}CO-), un grupo propionilo (CH_{3}CH_{2}CO-), un grupo butirilo (CH_{3}(CH_{2})_{2}CO-), un grupo hexanoílo (CH_{3}(CH_{2})_{4}CO-), un grupo decanoílo (CH_{3}(CH_{2})_{8}CO-), un grupo lauroílo (CH_{3}(CH_{2})_{10}CO-) y un grupo palmitoílo (CH_{3}(CH_{2})_{14}CO-).

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Actividad del derivado de grelina 2

14

En la tabla, "n.e." indica que la muestra no se ensayó.

La influencia de la longitud de la cadena del ácido graso sobre la actividad se ha hecho cada vez más significativa con un valor de CE_{50} de 780 nM para los derivados de grelina que tienen un grupo acetilo (C2) y un valor de CE_{50} de 280 nM para los derivados de grelina que tienen un grupo butanoílo (C4), y los derivados de grelina que tenían el grupo hexanoílo (C7) provocaron un aumento adicional en la actividad de liberación de Ca (valor de CE_{50}, 16 nM), y el grupo octanoílo de la grelina permitió que la actividad de liberación de Ca alcanzara un pico (valor de CE_{50}, 1,5 nM). Incluso los derivados de grelina que tenían el grupo decanoílo (C10) mantenían una actividad de liberación de Ca similar (valor de CE_{50}, 1,7 nM) a la de la grelina, y además el valor de CE_{50} era de 2,4 nM para los derivados de grelina que tenían un grupo lauroílo (C12) y de 6,5 nM para los derivados de grelina que tenían un grupo palmitoílo (C16), indicando de este modo que la actividad de liberación de Ca se mantenía incluso si se aumentaba la longitud de la cadena de ácido graso.

C. Sustitución de diversos grupos acilo

Se prepararon derivados de grelina humana uniendo ácido 3-fenilpropiónico (HO-CO-CH_{2}CH_{2}Ph) como ejemplo típico de ácido graso aromático, ácido 3-octenoico (CH_{3}(CH_{2})_{3}CH=CH-CH_{2}COH) como ejemplo típico de ácido graso insaturado o ácido 4-metilpentanoico ((CH_{3})_{2}CH-CH_{2}CH_{2}CO_{2}H) como ejemplo típico de ácido graso ramificado, en lugar de ácido graso saturado, a través de un enlace éster al grupo hidroxilo de la 3ª serina, y se examinó su actividad.

D. Conversión en grupos alquilo

Convirtiendo el enlace éster químicamente inestable en un enlace éter o tioéter químicamente estable o similar, pueden formarse derivados de grelina químicamente estables. Sin embargo, sobra decir que el propósito para esta conversión es el mantenimiento de la actividad.

Por lo tanto, se examinaron un derivado éter de grelina humana donde la 3ª serina estaba octanoilada (C_{6}H_{17}) y un derivado tioéter de grelina de rata donde la 3ª serina se había reemplazado por cisteína y estaba octilada, para determinar su actividad.

Además, se prepararon un derivado de grelina humana en el que la 3ª serina estaba bencilada (-CH_{2}Ph) y un derivado de grelina humana en el que la 3ª serina se había reemplazado por cisteína y estaba tritiada (-C(Ph)_{3}).

Los resultados se resumen en la Tabla 6. Las actividades de liberación de Ca del derivado de grelina humana en el que la 3ª serina estaba bencilada (-CH_{2}Ph) y el derivado de grelina humana en el que la 3ª serina se había reemplazado por cisteína y estaba tritiada (-C(Ph)_{3}) se muestran como los Compuestos 67 y 68, respectivamente, en la Tabla 13. La actividad de liberación de Ca del derivado de grelina humana en el que se unió ácido 4-metil pentanoico
((CH_{3})_{2}CH-CH_{2}CH_{2}CO_{2}H) a través de un enlace éster al grupo hidroxilo de la 3ª serina también se muestra como la del Compuesto 69 en la Tabla 13.

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TABLA 6 Actividad del derivado de grelina 3

15

La introducción del grupo 3-octenoílo como un ejemplo de ácido graso insaturado en la cadena lateral de la 3ª serina produjo una actividad de liberación de Ca similar (CE_{50} = 1,7 nM) a la actividad de los derivados de grelina que tienen un grupo octanoílo.

De manera interesante, incluso cuando se introdujo un grupo fenil propionilo, la actividad de liberación de Ca se mantuvo elevada (CE_{50} = 1,4 nM), e incluso cuando se introdujo un grupo 4-metilpentanoílo (C6) como un ejemplo de ácido graso ramificado, el valor de CE_{50} fue de 4,4 nM, indicando que la actividad de liberación de Ca se mantenía (Compuesto 69 de la Tabla 13), y revelando de esta manera que no siempre es necesario que el grupo acilo de la cadena lateral de la 3ª serina sea un grupo alcanoílo de cadena lineal.

Además, los valores de CE_{50} de los derivados de éter y tioéter que se espera que sean químicamente estables, donde la 3ª serina o la 3ª cisteína estaban octanoiladas, se mantuvieron a 1,2 nM y 5,4 nM, respectivamente, revelando de esta manera que no siempre es necesario que la cadena lateral del resto aminoacídico de la 3ª posición sea un grupo acilo.

Además, los valores de CE_{50} de las grelinas en las que el resto aminoacídico de la 3ª posición se reemplazó por Ser(Bzl) [es decir, el derivado de grelina humana en el que la 3ª serina estaba bencilada (-CH_{2}Ph)] o con Cys(Trt) [es decir, el derivado de grelina humana en el que la 3ª serina estaba reemplazada por cisteína y tritilada (-C(Ph)_{3})] eran de 7,6 nM y 20 nM, respectivamente, indicado de esta manera que la actividad de liberación de Ca se mantenía (Compuestos 67 y 68 de la Tabla 13).

(2) Determinación de la región activa

La actividad de liberación de Ca intracelular de grelina (16-28) que contenía la región carboxilo-terminal original era relativamente baja (CE_{50} >10.000 nM), mientras que los valores de CE_{50} de la grelina humana (1-15) y de la grelina de rata (1-15) que contenían la región amino-terminal original eran de 7,0 nM y 8,6 nM, respectivamente, indicando de esta manera que la actividad de liberación de Ca intracelular se mantenía, y por lo tanto revelando que el sitio activo de la grelina está presente en la región amino-terminal (Tabla 7).

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TABLA 7 Actividad del derivado de grelina 4

16

Además, debido a que las actividades de las grelinas humana y de rata (1-15) eran prácticamente iguales, los restos aminoacídicos de las posiciones 11 y 12 (arginil-valil- en la humana y -lisil-aranil- en la de rata) no se limitan a estos aminoácidos.

Los resultados de la correlación entre la estructura y la actividad, obtenidos usando grelina humana o de rata, pueden aplicarse a las grelinas de rata y humana, respectivamente.

Además, la [des-glutamina^{14}]-grelina de rata preparada retirando la 14ª glutamina de la grelina mostraba una actividad de liberación de Ca (CE_{50} > 1,5 nM) similar a la de la grelina de rata, indicando que el aminoácido situado en el medio de la molécula de grelina puede delecionarse.

(3) Longitud de la cadena peptídica e introducción de un grupo básico en el extremo carboxilo

Basándose en la grelina (1-15) que se descubrió que tenía una actividad relativamente fuerte, se preparó un derivado delecionando de manera adecuada restos aminoacídicos del extremo carboxilo de la grelina (1-15), y se evaluó su actividad.

En la Tabla 8 se presentan las actividades de los derivados de cadena corta que tienen un ácido carboxílico en el extremo carboxilo y los derivados de cadena corta amidados en el extremo carboxilo.

TABLA 8 Actividad del derivado de grelina 5

18

La actividad de liberación de Ca de la grelina (1-3) amida era relativamente baja (CE_{50} >10.000 nM). El valor de CE_{50} de grelina (1-4) que era grelina (1-3) a la que se había añadido fenilalanina era de 480 nM y el valor de CE_{50} del derivado amida carboxilo-terminal de la misma era de 160 nM, revelando de esta manera que tenía una actividad de liberación de Ca significativa.

Además, la actividad de grelina (1-5) amida, que era grelina (1-4) a la que se le había añadido leucina amida era aproximadamente 26 veces (CE_{50} = 6,2 nM) más alta que la de la grelina (1-4) amida, mostrando de esta manera una actividad de liberación de Ca al mismo nivel que la de la grelina natural.

La mayor actividad de liberación de Ca se encontró en la grelina (1-7) amida, y su valor de CE_{50} era casi equivalente al de la grelina natural.

Según el resultado anterior, el factor estructural esencial para expresar la actividad de la grelina podría atribuirse a la secuencia de los 4 restos amino-terminales, pero debido a su afinidad por el receptor de grelina o a que la transducción de señales se mejora espectacularmente por la adición de un resto tal como leucina en la 5ª posición, preferiblemente se añade un resto tal como leucina en la 5ª posición.

Como es evidente por el resultado anterior, la actividad de liberación de Ca tendía a aumentar por amidación del ácido carboxílico carboxilo-terminal.

Por ejemplo, la actividad de liberación de Ca (CE_{50} = 5,4 nM) de la grelina (1 - 9) después de la amidación era aproximadamente 7 veces mayor que la actividad (CE_{50} = 38 nM) antes de la amidación, y la actividad de liberación de Ca (CE_{50} = 160 nM) de la grelina (1-4) después de la amidación era aproximadamente 3 veces mayor que la actividad (CE_{50} = 480 nM) antes de la amidación. Además, la actividad de liberación de Ca (CE_{50} = 13 nM) de la grelina (1-8) amida producida a partir de la grelina (1-9) amida retirando el resto 9 de histidina básico era menor que la actividad (CE_{50} = 5,4) de la grelina (1-9) amida, mientras que la actividad de liberación de Ca (CE_{50} = 2,6 nM) de la grelina (1-7) amida producida retirando el ácido glutámico 8 como aminoácido ácido era mayor que la actividad (CE_{50} = 13 nM) antes de la eliminación.

Un efecto de la amidación es neutralizar la carga negativa del ácido carboxílico, y el resultado anterior indica que la basicidad del aminoácido carboxilo-terminal en el derivado de cadena corta contribuye significativamente al aumento de actividad.

Basándose en este resultado, se prepararon derivados dotados de basicidad en el extremo carboxilo, que son similares a la grelina (1-7) amida que muestra alta actividad, y se examino su actividad.

Los resultados se muestran en la Tabla 9.

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TABLA 9 Actividad de derivado de grelina 6

20

La actividad de liberación de Ca (CE_{50} = 12 nM) de la [lisina^{6}]-grelina (1-6) amida que tenía lisina añadida en el extremo carboxilo de grelina (1-5) era ligeramente menor que la actividad (CE_{50} = 4,8 nM) de la grelina (1-5), mientras que la actividad de liberación de Ca (CE_{50} = 10 nM) de la grelina (1-4) que tenía lisina añadida en el extremo carboxilo era aproximadamente 50 veces mayor que la actividad (CE_{50} = 480 nM) antes de la adición. Además, la actividad de liberación de Ca (CE_{50} = 1,1 nM), respectivamente, del derivado de amida que tenía arginina o lisina añadida en el extremo carboxilo de la grelina (1-7) era mucho mas fuerte que la actividad (CE_{50} = 2,6 nM) de la grelina (1-7)
amida.

Se reveló que en casi todos los casos, la actividad aumenta enmascarando la acidez en el extremo carboxilo y por la introducción de un grupo básico.

(4) Glicina amino-terminal y 2º resto de serina

Basándose en la grelina (1-7) amida (CE_{50} = 2,6 nM) [Compuesto 29 en la Tabla 8) o la grelina (1-9) amida (CE_{50} = 5,4 nM) [Compuesto 3 en la Tabla 4] que se descubrió que tenían actividad, se examinó la influencia sobre la actividad de la glicina amino-terminal y la 2ª serina.

Los resultados del resumen en la Tabla 10.

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TABLA 10 Actividad del derivado de grelina 7

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22

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La actividad de N^{\alpha}-acetil-grelina (1-10) donde el grupo amino-terminal de la grelina (1-10) estaba bloqueado era relativamente baja (CE_{50} > 10.000 nM). Como se ha descrito anteriormente, la actividad de la [N^{\alpha}-octanoil, serina^{3}]-grelina (1-9) amida (Compuesto 6 de la Tabla 1) también era relativamente baja (CE_{50} > 10.000 nM), y de esta manera el grupo amino del extremo amino preferiblemente no está bloqueado para expresar la actividad de liberación de Ca.

Por otra parte, la actividad de liberación de Ca de la N^{\alpha}-aminopentanoil-grelina (3-7) amida donde la glicina amino-terminal y la 2ª serina se reemplazaron por ácido-5-amino-n-pentanoico (NH_{2-}(CH_{2})_{4}-CO-) con una longitud de 2 restos casi se mantuvo (CE_{50} = 3,4 nM), la actividad de liberación de Ca de la [N^{\alpha}-glicil]-grelina (3-7) amida de la cual se había eliminado la 2ª serina era menor (CE_{50} = 380 nM), y la actividad de liberación de Ca de la [N-Tirosil]-grelina de rata que tenía un resto de tirosina añadido en el extremo amino de la grelina de rata era menor (CE_{50} = 120 nM), de forma que es preferible, para obtener una actividad más fuerte, que el grupo amino-terminal esté presente en una posición de una longitud de 2 restos desde el 3^{er} resto de serina con octanoílo hasta el extremo amino.

Además, los valores de CE_{50} de los derivados de grelina (1-7) amida donde la 2ª serina se había reemplazado por leucina, glicina, histidina y lisina fueron 42 nM, 78 nM, 24 nM y 35 nM respectivamente, lo que indica una actividad de liberación de Ca ligeramente menor que la de la grelina (1-7) amida.

Como este resultado indica que el 2º resto de serina (-NH-CH(CH_{2}OH)-CO-) puede reemplazarse por la estructura parcial -CH_{2}-CH_{2}-CO- del ácido aminopentanoico, el 2º resto de serina actúa al menos como un espaciador para separar el grupo amino del extremo amino de la grelina una distancia predeterminada desde el 3^{er} grupo octanoílo. La razón de que la actividad se mantuviera por el reemplazo del 2º resto de serina por ácido 5-aminopentanoico es que la basicidad del extremo amino aumentaba introduciendo su estructura de alquilamina.

En resumen, se considera que el grupo amino del resto de glicina amino-terminal confiere basicidad al extremo amino de la molécula de grelina, expresando de esta manera la actividad de la grelina y, por lo tanto, el grupo amino en el extremo amino preferiblemente no esta bloqueado.

Además, se considera que el 2º resto de serina actúa como espaciador para separar el grupo amino en el extremo amino una distancia predeterminada desde el 3^{er} grupo octanoílo, y por lo tanto el 2º resto de serina puede reemplazarse por un aminoácido o un compuesto no aminoacídico con una cadena lateral relativamente menos voluminosa. Es decir, la posición del grupo octanoílo en la molécula de grelina se define con respecto al grupo amino del extremo amino, y esta relación posicional constituye una parte de la estructura activa de la grelina.

Es decir, la cadena lateral del 2º aminoácido preferiblemente es relativamente menos voluminosa, tal como ocurre en la serina, alanina y norvalina, en lugar de un aminoácido que tiene una estructura voluminosa, y como 2º aminoácido se prefiere un resto aminoacídico que no restrinja la flexibilidad de los restos vecinos. Además, como la actividad de liberación de Ca de la N^{\alpha}-aminopentanoil-grelina (3-7) amida casi se mantiene (CE_{50} = 3,4 nM), la 2ª serina puede reemplazarse por un compuesto no aminoacídico.

(5) Actividad óptica del 3^{er} y 4º restos aminoacídicos

Basándose en la estructura de la grelina (1-7) amida, se prepararon derivados en los que la 3ª L-serina y la 4ª L-fenilalanina se habían reemplazado por los L-aminoácidos correspondientes, y se examinó la influencia que tiene la configuración del 3^{er} y 4º aminoácidos sobre la actividad de liberación de Ca. Específicamente, basándose en la [Serina^{3} (octil)]-grelina (1-7) amida (CE_{50} = 5,8 nM) [Compuesto 50 en la Tabla 11] y la [cisteína^{3} (octil)]-grelina
(1-7) amida (CE_{50} = 7,4 nM) [Compuesto 48 en Tabla 11] que mantenían una buena actividad, se prepararon sus derivados en los que se había reemplazado la 3ª serina y la 4ª fenilalanina por los L o D aminoácidos correspondientes.

Los resultados se resumen en la Tabla 11. A partir de estos resultados, tanto el 3^{er} como el 4º aminoácido son preferiblemente L-aminoácidos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 11 Actividad del derivado de grelina 8

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(6) Modo de unión de una cadena lateral en la 3ª posición

Se prepararon derivados de grelina en los que el enlace éster original se reemplazó por un éster en la dirección inversa (Compuesto nº 54), una amida (Compuestos nº 55 y 56), un disulfuro (Compuesto nº 57) y metileno (Compuesto nº 58) de tal forma que la cadena lateral en la 3ª posición tuvo la misma longitud que la de la cadena de grelina (-CH_{2}-O-CO-C_{7}H_{15}). Además, se prepararon derivados de éster con impedimento estérico en el átomo de carbono-\beta del aminoácido en la 3ª posición (Compuestos nº 59 y 60) y un derivado amida en el que se habían extendido 3 unidades de metileno (Compuesto nº 61). Los resultados se resumen en la Tabla 12.

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TABLA 12 Actividad del derivado de grelina 9

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La actividad del Compuesto 58, donde la cadena lateral en la tercera posición se había reemplazado por unidades de metileno exclusivamente, mostró la mayor actividad (valor de CE_{50} = 1 nM o menor). La actividad de otros derivados varió dependiendo del tipo de enlace, pero se confirmó que el modo de unión de una cadena lateral del aminoácido 3 no ejerce una influencia significativa sobre la actividad.

(7) Hidrofobia de una cadena lateral en la 3ª posición

Se prepararon derivados en los que en grupo 3 de Ser (octanoílo) se había reemplazado por un aminoácido hidrófobo del que la mayor parte era un aminoácido natural, y se examinó su actividad. Los resultados se resumen en la Tabla 13.

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TABLA 13 Actividad de derivados de grelina 10

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Los valores de CE_{50} de los derivados que tenían un aminoácido hidrófobo aromático tal como triptófano, ciclohexil alanina o naftil alanina en la 3ª posición fueron 31 nM, 19 nM y 8,2 nM respectivamente, lo que indica que se mantuvo la actividad de liberación de Ca. Inesperadamente, cuando se introdujo fenil alanina en la 3ª posición, la actividad de liberación de Ca era ligeramente baja, pero incluso cuando se introdujo el aminoácido Ser (Bzl) o Cys (Tritilo) más hidrófobo en la 3ª posición, la actividad de liberación de Ca se mantuvo en un nivel similar, y de esta forma se confirmó que la hidrofobia de la cadena lateral en la 3ª posición es más preferible para expresar la actividad.

Por una parte, cuando se introdujo un aminoácido hidrófobo alifático tal como leucina, isoleucina, norleucina o valina en la 3ª posición, generalmente se mantuvo la actividad de liberación de Ca de los derivados, pero ligeramente por debajo de la de los derivados que introducen el aminoácido aromático. La actividad del Compuesto 73 que tenía norleucina en la 3ª posición era CE_{50} = 2.800 nM, mientras que la actividad de la 6-amino-norleucina (lisina; Compuesto 72) que tenía un grupo amino añadido a una cadena lateral de norleucina aumentó a 120 nM en términos de los valores de CE_{50}, de forma que se confirmó que similar a la basicidad del extremo carboxilo descrita anteriormente, también es preferible la basicidad de una cadena lateral en la 3ª posición.

(8) Derivados de grelina de cadena corta

Como se ha descrito anteriormente, se descubrió que un fragmento de grelina de los aminoácidos amino-terminales 1 a 4 muestra una actividad significativa y esta actividad se aumenta adicionalmente añadiendo leucina en la 5ª posición a dicho fragmento; el 3^{er} resto aminoacídico preferiblemente es el que tiene una cadena lateral hidrófoba; la actividad aumenta introduciendo un resto básico; y los restos aminoacídicos 1 y 2 pueden remplazarse por un compuesto no aminoacídico con una longitud de 2 restos, tal como un \delta-aminoácido. Basándose en estos resultados, se prepararon diversos derivados de grelina de cadena corta basados en la región amino-terminal (1-5) como se muestran en los Compuesto nº 76 a 87 en las Tablas 14 y 15, y se examinaron sus actividades. Los resultados se resumen en las Tablas 14 y 15.

El Compuesto 80 es conocido (Ipamorerin; K. Raum et al., Eur. J. of Endocrinol., 139: 552-561, 1998).

TABLA 14 Actividad del derivado de grelina 11

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Como la actividad de liberación de Ca del Compuesto 80 conocido era elevada (2,5 nM), también se examinó la actividad del Compuesto 79 derivado del Compuesto 80 reemplazando 2-D-naftil alanina en la 3ª posición por D-octil serina, y como resultado, su valor de CE_{50} fue 38 nM, lo que indica que se mantenía la actividad. El Compuesto 77 que tenía D-octil serina y D-fenil alanina en la 3ª y 4ª posiciones, que tiene la misma estructura de aminoácidos que el Compuesto 79 con la excepción de los aminoácidos 1 y 2, mostró una actividad menor (1.600 nM), y estos resultados indican que la secuencia o estructura de los aminoácidos 1 y 2 también afecta a la configuración estérica de las cadenas laterales del 3^{er} y 4ª aminoácidos importantes para presentar la actividad.

Es decir, en el caso en el que los aminoácidos 1 y 2 se reemplazaran por ácido aminopentanoico, la actividad se mantuvo a 34 nM incluso si la 2-D-naftil alanina en la 3ª posición y la D-fenil alanina en la 4ª posición se reemplazaban por sus L-aminoácidos correspondientes (Compuesto 78), y de esta manera la secuencia de aminoácidos (Gly-Ser) en la 1ª a 2ª posiciones en la grelina requiere la configuración L para los aminoácidos 3 y 4, pero incluso si los aminoácidos 3 y 4 tienen la configuración D, la actividad se hace significativa introduciendo otra secuencia de aminoácidos tal como Aib-His. También se confirmó que independientemente de la configuración L o D en la 3ª y 4ª posiciones, la actividad se expresa por introducción de acido aminopentanoico en la 1ª y 2ª posiciones.

TABLA 15 Actividad del derivado de grelina 12

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Usando [N-Aminopentanoil, Ser^{3}(Octil)]-Grelina (3-5) basándose en la región amino-terminal (1-5) de la grelina, se examinó la correlación entre la actividad y la estructura en la región carboxilo-terminal. La actividad de sus derivados donde la leucina carboxilo-terminal en la 5ª posición se había modificado con amida, metilamida, etilamida o bencilamida se mantuvo, pero tendía a reducirse como se muestra por los valores de CE_{50} de 11 nM, 12 nM, 22 nM y 98 nM, respectivamente. Por otra parte, reemplazando etilamida por aminoetilamida, la actividad aumentó como se muestra por un valor de CE_{50} de 3,5 nM, revelando de esta manera que es preferible impartir basicidad al extremo carboxilo de la molécula de grelina.

Estos diversos derivados de amida carboxilo-terminales son compuestos útiles debido a su resistencia in vivo a la descomposición con carboxi peptidasas. El Compuesto 86 (CE_{50} = 86 nM) que contenía N-metilaminoácido también es un compuesto útil debido a su resistencia a las enzimas.

Ejemplo 12 Actividad de liberación de GH de derivados de grelina en rata (1) Actividad de liberación de GH de diversos derivados de grelina de cadena larga en rata

Se administraron 18 nmol/kg del Compuesto 17 ([Ser^{3}(Octil)]-hGrelina), 30 nmol/kg del Compuesto 18 ([Cys^{3}(Octil)]-rGrelina), 100 nmol/kg del Compuesto 65 ([2-^{L}Nal^{3}]-hGrelina), o 18 nmol/kg del Compuesto 15 ([Ser^{3}(3-Fenilpropinil)]-hGrelina) rápidamente y por vía intravenosa en ratas IGS-SD (de aproximadamente 7 semanas de edad) con anestesia con Nembutal para cada muestra (n=3). Quince minutos después de la administración, se recogió el plasma y la concentración de GH en plasma se midió por radioinmunoensayo (Biotrak/Amersham). Por separado, se administró albúmina de suero bovino (BSA)-solución fisiológica salina al 0,2%, 6 nmol/kg de rGrelina y hGrelina, u 80 nmol/kg de Ipamorelina (Compuesto 80) en otras ratas como control, respectivamente, y se compararon las concentraciones de GH en plasma en 15 minutos después de la administración (para cada muestra n=3).

Los resultados se muestran en la Tabla 13. El Compuesto 17 (Ser^{3}(Octil)]-hGrelina), el Compuesto 18 ([Cys^{3}(Octil)]-rGrelina) y el Compuesto 15 ([Ser^{3}(3-PhPrl)]-hGrelina) presentaron una fuerte actividad de liberación de GH y la actividad de liberación de GH de [2-^{L}Nal^{3}]-hGrelina mostró una buena correlación con la actividad de liberación de Ca intracelular.

TABLA 16 Actividad de liberación de GH de diversos derivados de grelina de cadena larga

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(2) Cambio de GH en plasma por la administración de [Cys^{3}(Octil)]-grelina de rata

Después de administrar el Compuesto 18 ([Cys(Octil)]-grelina de rata) por vía intravenosa en una dosis de 5 \mug/cabeza en ratas macho de la cepa Wistar (de aproximadamente 260 a 280 g) con anestesia con Nembutal, se midió la GH liberada en la sangre. También se administraron solución fisiológica salina como control y grelina de rata (5 \mug/cabeza) y se compararon con el Compuesto 18.

Como se muestra en las Tablas 17 a 19, la actividad de promotora de la secreción de GH de [Cys^{3}(Octil)]-grelina de rata fue equivalente a la de la grelina natural (es decir, la C_{max} de la GH secretada fue de aproximadamente 1.100 ng/ml para las dos grelinas) y además el tiempo de secreción tendía a prolongarse. La actividad de liberación de Ca intracelular del Compuesto 18 fue de 5,4 nM en términos de CE_{50}.

TABLA 17 Cambio del nivel de GH en plasma por medio de la administración de [Cys^{3}(Octil)]-grelina de rata

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TABLA 18 Cambio del nivel de GH en plasma por la administración de solución fisiológica salina

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TABLA 19 Cambio del nivel de GH en plasma por la administración de grelina de rata

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Ejemplo 13 Acción de aumento del apetito de la grelina (1) Acción de aumento del apetito por medio de la administración en el ventrículo

Se administró solución fisiológica salina que contenía grelina de rata a diversas concentraciones a las 8:45 a.m. en ventrículos cerebrales de ratas macho de la cepa Wistar (de 16 a 20 animales por grupo), que pesaban de 300 a 325 g. Como control, se administró solución fisiológica salina sin grelina en los ventrículos. Después de la administración, se dejó que las ratas se alimentaran ad libitum y se midió la cantidad de pienso tomado durante las 2 horas posteriores a la administración. Como se muestra en la Fig. 6, se observó un aumento en la cantidad de pienso consumido en las ratas que recibieron 50 pmol de grelina por vía intracerebroventricular, y se observó un aumento dependiente de la dosis en la cantidad de pienso consumido en las ratas que recibieron 200 pmol y 500 pmol de grelina, pero la cantidad de pienso consumido se redujo en las ratas que recibieron 2 nmol de grelina. Habitualmente, las ratas toman el pienso por la noche, de forma que por la mañana, la rata tiene el estómago lleno y rara vez consume pienso (véase la rata que recibió solución fisiológica salina como control en la Fig.6), y por lo tanto el aumento en la cantidad de pienso consumido por la administración de grelina dentro del ventrículo cerebral indica que la grelina tiene una acción de aumento del apetito.

(2) Acción de aumento del apetito por medio de la administración intravenosa

Se administraron por vía intravenosa 50 \mug/kg de grelina de rata en las venas de la cola en ratas SD (Sprague-Dawley) macho de 9 meses de edad (5 animales) y ratas Wistar (4 animales), y se midió la cantidad de pienso consumido durante las 2 horas posteriores a la administración (evaluado durante 16:00 a 19:00 p.m.). Como se muestra en la tabla 20, la cantidad de pienso consumido aumentó evidentemente por medio de la administración intravenosa de grelina, en comparación con la cantidad de pienso consumido y sin la administración de grelina de rata, que se determinó usando el mismo animal a la misma hora otro día. Es decir, se demostró que la grelina tiene una acción de aumento del apetito incluso por medio de la administración intravenosa

TABLA 20

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Ejemplo 14 Aumento de las funciones gástricas por grelina

Para examinar el efecto de la grelina sobre las funciones gástricas, se realizó el siguiente experimento. Se dejaron en ayunas durante 20 horas o más ratas de la cepa SD macho (de 7 a 8 semanas de edad, que pesaban de 200 a 280 g) y después se usaron en el experimento. Las ratas se anestesiaron por medio de la administración intraperitoneal de uretano (1,25 g/kg) y se mantuvieron calientes usando una manta calefactora y una luz calefactora. Se insertó una cánula traqueal y se realizó una ligadura en el esófago con hilo de seda, y cada rata se sometió a la siguiente operación para medir la secreción de ácido gástrico o la motilidad gástrica. En el experimento usando el animal consciente, la rata se sometió a la operación para medir la secreción de ácido gástrico o la motilidad gástrica con anestesia ligera por inhalación de éter.

En el experimento para la secreción de ácido gástrico con anestesia con uretano, la operación se realizó de acuerdo con el método propuesto por Ohno et al. [Ohno, T., et al., Jpn. J. Pharmacol. 43, 429-439 (1987)]. En resumen, se realizó una incisión en el abdomen en posición supina y se expusieron el estómago y el duodeno. Se insertó un tubo de polietileno en la parte frontal del estómago para preparar una fístula estomacal aguda. Se insertó otro tubo de polietileno en el estómago después de escindir el duodeno y la parte circundante del píloro se ligó y fijó. El interior del estómago se sometió a infusión con solución fisiológica salina que se ajustó a pH 7,0 en un depósito y se calentó a 37ºC. El caudal fue de 1,0 ml/min. El líquido de infusión se ajustó a pH 7,0 por valoración con NaOH 100 mM usando una unidad de fijación del pH (Hiranuma, Comitite-8). Después de confirmar que una cantidad básica de secreción de ácido gástrico era estable, se administró vía por intravenosa el agente químico de ensayo y se midió la velocidad de secreción de ácido gástrico a intervalos de 5 minutos. En cada grupo se usaron 4 ratas.

En el experimento durante la excitación, la rata se sometió a la misma operación con anestesia ligera por inhalación de éter y después se realizó un corte pequeño en el costado, y se extrajo el tubo de infusión del cuerpo. El estómago expuesto y el duodeno se pusieron de nuevo en el abdomen y el sitio escindido se saturó, y el animal se dejó en ayunas mientras reposaba sobre la parte dorsal en una jaula de sujeción de ratas de tipo Ballman, y después de confirmar que la rata se había recuperado de la anestesia, se sometió al experimento. El esófago estaba ligado, pero no se había insertado una cánula traqueal.

En el experimento para medir la motilidad del estómago con anestesia con uretano se usó un método de globo miniaturizado de acuerdo con el método propuesto por Takeuchi & Nobuhara [Takeuchi, K. y Nobuhara, Y., Digestive Diseases and Sciences 30, 1181-1188 (1985)]. Es decir, un globo relleno con agua y un catéter de soporte se insertaron en el estómago después de escindir la parte frontal del estómago. Se fijó en una glándula de la línea del estómago y un extremo del catéter se conectó a un transductor de presión (LPU-0.1-350-0-II, de Nihon Kohoden Corporation). Después de confirmar que la motilidad gástrica era estable, se administró por vía intravenosa el agente químico de ensayo acumulativamente a intervalos de 60 minutos. Para la motilidad gástrica, se midieron a intervalos de 10 minutos la amplitud de la presión interna en el estómago y el número de reacciones de contracción en la motilidad de contracción con una amplitud de 20 cm de H_{2}O o más. En cada grupo se usaron cuatro animales. En el experimento que usa animales conscientes, la rata se sometió a la misma operación con anestesia ligera por inhalación de éter y después se suturar el sitio de las escisión, el animal se dejó en ayunas en la posición boca abajo en una jaula de sujeción de ratas de tipo Ballman. Después de confirmarse que la rata se había recuperado de la anestesia, el animal se sometió al experimento.

Se disolvieron grelina de rata y dihidrocloruro de histamina en solución fisiológica salina y se administraron en una dosis de 1 ml/kg en la vena de la cola. Para examinar si la acción del nervio vago está implicada en la acción de la grelina, se administró por vía subcutánea sulfato de atropina 30 minutos antes de la administración de grelina, o se cortaron bilateralmente haces cervicales del nervio vago. Para examinar la implicación del receptor de histamina H_{2} en la acción de la grelina, se administró por vía subcutánea famotidina (Gaster®, producida por Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.) 30 minutos antes de la administración de grelina. Los resultados se muestran en media \pm error típico. El análisis estadístico se realizó usando ensayos de comparación múltiple de Dunnett. Un valor P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Como se muestra en la Fig. 7A y en la Tabla 21, la secreción del ácido gástrico se promovió de una manera dependiente de la dosis tras la administración intravenosa de grelina de rata en una dosis de 0,8 a 20 \mug/kg en la rata con anestesia con uretano.

En la rata anestesiada, apenas se observó una motilidad espontánea del estómago antes de la administración de grelina. Cuando a las ratas se le administró por vía intravenosa grelina en una dosis de 0,8 a 20 \mug/kg en este estado, se promovieron tanto la amplitud como la frecuencia de la motilidad gástrica como se muestra en la Fig. 8A y B y en la Tabla 21. Estas reacciones se observaron inmediatamente después de la administración de grelina de rata. Por medio de la administración de 20 \mug/kg, la secreción de ácido gástrico aumentó y alcanzó el nivel máximo en 20 minutos y se redujo gradualmente durante los 90 minutos posteriores a la administración. Como se muestra en la Fig. 7A y B, la reacción máxima en la acción de promoción de la secreción de ácido gástrico por la administración de 20 \mug/kg de grelina de rata fue casi comparable con la reacción inducida por la administración intravenosa de 3 mg/kg de histamina. La acción de promoción de la amplitud de motilidad gástrica alcanzó la reacción máxima en 10 minutos a cualquier dosis, y por medio de la administración de 20 \mug/kg de grelina, la acción se redujo gradualmente hasta 50 minutos después de la administración.

Además, como se muestra en la Tabla 21, la acción de promoción de la secreción gástrica inducida por la administración de 20 \mug/kg de grelina de rata se inhibió casi completamente por el pretratamiento con atropina o vasotomía cervical bilateral, pero esta acción no se vio afectada por el pretratamiento de la administración subcutánea de 1 mg/kg de famotidina, es decir, un antagonista del receptor de histamina H_{2}. Además, la acción de promoción de la motilidad gástrica inducida por la administración de grelina de rata se inhibió completamente por pretratamiento con atropina o vagotomía cervical bilateral. Por estos resultados, se confirmó que la acción de promoción de la grelina sobre las funciones gástricas no se realiza a través de un mecanismo histaminérgico, sino por la activación del sistema del nervio vago.

Por medio de la administración intravenosa de grelina de rata (4 y 20 \mug/kg), se promovió la secreción de ácido gástrico en la rata consciente de la misma manera que en la rata con anestesia con uretano. En comparación con la rata con anestesia, la rata consciente tuvo una motilidad gástrica espontánea antes de la administración del agente químico de ensayo, e incluso en este estado por medio de la administración de 0,8 a 20 \mug/kg de grelina de rata a la rata, la motilidad gástrica se promovió junto con su amplitud y frecuencia. A partir del resultado anterior, se confirmó que por medio de la administración intravenosa de grelina, se produce la promoción de la secreción de ácido gástrico y la promoción de motilidad gástrica no sólo en la rata anestesiada, sino también en la rata consciente.

TABLA 21

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Ejemplo 15 Acción de la grelina y derivados de grelina de promoción del crecimiento celular

Para examinar la acción de la grelina administrada sobre la promoción del crecimiento celular, se realizó el siguiente experimento. Se administraron 20 \mug/kg de grelina de rata o grelina de rata de tipo tioéter (Compuesto 18 [Cys^{3}(octil)]-hGrelina) en venas de la cola de ratas Wistar macho (de 7,5 semanas de edad) respectivamente. Diecisiete horas después de la administración, se administró ^{3}H-timidina en las venas de la cola y una hora después se escindieron el duodeno, el yeyuno y la médula ósea. Se midió la incorporación de ^{3}H-timidina a las fracciones de ADN de estos tejidos para examinar la acción de promoción del crecimiento celular de la grelina y de los derivados de grelina. Los tejidos se cortaron en secciones finas y se homogeneizaron usando un homogeneizador Polytron y, después de la centrifugación, el sobrenadante se precipitó con ácido tricloroacético para dar una fracción de ADN. La radiactividad de la fracción de ADN se midió por un contador de centelleo de líquidos.

Como se muestra en la Tabla 22, la incorporación de ^{3}H-timidina en estos tejidos u órganos aumentó por medio de la administración intravenosa de grelina de rata o grelina de rata de tipo tioéter, y de esta manera se confirmó que la grelina presenta una acción de promoción del crecimiento celular en el duodeno, yeyuno y médula ósea.

La evolución a lo largo del tiempo de la acción promotora del crecimiento de las células después de la administración intravenosa de grelina fue similar a la observada después de la administración de GHRH (hormona de liberación de la hormona del crecimiento), de forma que se consideró que la acción de promoción del crecimiento celular de la grelina se realiza a través de la GH (hormona del crecimiento) secretada principalmente por la pituitaria. Se consideró que la regulación de la secreción de GH por grelina como factor fisiológico es razonable para la regulación del organismo, y hay menos efectos adversos que se podrían producir por la administración de GH.

TABLA 22

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Los valores numéricos muestran la relación (%) de incorporación del radioisótopo con respecto a la media (por triplicado) del ejemplo comparativo (es decir, el grupo que recibió solución fisiológica salina).

Ejemplo 16 Cuantificación de grelina por anticuerpo anti-grelina

Usando anticuerpos inducidos contra péptidos de grelina de rata amino- y carboxilo-terminales como antígenos, se cuantificó la grelina en diversos tejidos vivos por radioinmunoensayo (RIA).

Se inmunizaron conejos con [C-Cys]-grelina de rata [1-11] (péptido de grelina de rata de aminoácidos 1 a 11 desde el extremo amino que tiene cisteína unida a su extremo carboxilo) y [C-Cys]-grelina de rata [13-28] (péptido de grelina de rata de los aminoácidos 13 a 28 desde el extremo amino que tiene cisterna unida a su extremo carboxilo) como antígenos, para formar el anticuerpo amino-terminal (anti-antígeno [C-Cys]-grelina de rata [1-11]) y el anticuerpo carboxilo-terminal (anti-antígeno [C-Cys]-grelina de rata [13-28]) respectivamente.

Como se muestra en la Fig. 9A, la CI_{50} (concentración inhibidora de 50%) de la grelina de rata fue de 3,1 fmol en la unión entre la grelina de rata marcada con radioisótopo y el anticuerpo amino-terminal. Este anticuerpo amino-terminal, aunque muestra una reactividad cruzada de 100% con la grelina de rata y la grelina humana sintetizada químicamente, mostró sólo una reactividad cruzada de 0,3% con n-hexanoil-grelina de rata donde la tercera serina se había modificado con un grupo n-hexanoílo y una reactividad cruzada de 20% con n-decanoil-grelina de rata donde la 3ª serina se había modificado con un grupo n-decanoílo. Además, el anticuerpo amino-terminal no reaccionaba con la grelina de la que se retiró el ácido graso.

El anticuerpo amino-terminal mostró una afinidad similar por grelina de rata (28 aminoácidos), grelina humana (28 aminoácidos), y grelina-27 (grelina consistente en 27 aminoácidos) encontrada en humano y rata. Por consiguiente, se confirmó que el anticuerpo amino-terminal reconoce específicamente la grelina natural en la que la 3ª serina se modificó con un grupo N-octanoílo.

Como se muestra en la Fig. 9b, la grelina de rata natural modificada con un grupo n-octanoílo y la grelina de rata modificada por eliminación del n-octanoílo de la grelina de rata natural, mostró un valor de CI_{50} similar de 44 fmol en la unión entre la grelina de rata marcada con radioisótopo y el anticuerpo carboxilo-terminal. Es decir, se confirmó que el anticuerpo carboxilo-terminal tiene la misma afinidad por la grelina modificada con ácido graso y por la grelina de la que se retiró el ácido graso.

Estos resultados revelaron que, con respecto a las grelinas que se producen en diversos tejidos en un cuerpo vivo, la grelina en la que la tercera serina se había modificado con un grupo n-octanoílo puede cuantificarse por el anticuerpo amino-terminal, mientras que tanto la grelina modificada con ácido graso como la grelina de la que se retiró el ácido graso pueden cuantificarse por el anticuerpo carboxilo-terminal.

La Tabla 23 muestra el resultado del examen del contenido de la grelina modificada con ácido graso y el contenido de grelina modificada con ácido graso y grelina de la que se retiró el ácido graso en diversos tejidos en un cuerpo vivo.

TABLA 23

41

En la tabla, C-RIA indica el resultado de la cuantificación por radioinmunoensayo usando el anticuerpo carboxilo-terminal, mientras que N-RIA indica el resultado de la cuantificación por el anticuerpo amino-terminal.

Los valores numéricos de la tabla indican "media \pm desviación típica"

Ejemplo 17 Producción de grelina de rata (1-28) por un método de semisíntesis Esquema de síntesis

En este ejemplo, se produjo rGrelina a partir de fragmentos de rGrelina (6-28) y Grelina (1-7) previamente preparados por un método de ingeniería genética y síntesis química respectivamente, como se indica a continuación.

Específicamente, se expresó en E. coli \beta-galactosidasa 97S-(QFE-SRHRR)-rGrelina (6-28), es decir, una proteína de fusión de \beta-galactosidasa 97S y -rGrelina (6-28) entre las cuales había una secuencia de aminoácidos (-QFE-SRHRR-) que tiene un sitio escindido por la proteasa V8 y la proteasa KexII. Esta proteína de fusión se trató con la proteasa V8, para cortar la SRHRR rGrelina (6-28). Después, todos los grupos amino de la SRHRR rGrelina (6-28) se protegieron con grupos Boc, y el péptido resultante se trató con proteasa KexII para dar [Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGrelina (6-28) a partir de la cual se había aislado el grupo amino-terminal de Ser 6. Este fragmento protegido se condesó con [N^{\alpha}-Boc]-rGrelina (1-5)-Osu obtenido por síntesis química y la [Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGrelina resultante se trató con un ácido, con lo que se produjo rGrelina.

En este ejemplo se describió la semisíntesis de rGrelina, pero también puede sintetizarse hGrelina por este método.

Además, en este ejemplo, el fragmento (1-5) se condensó con el fragmento (6-28), pero pueden condensarse respectivamente fragmentos amino-terminales sintetizados químicamente (1-2), (1-3) y (1-7) con fragmentos carboxilo-terminales (3-28), (4-28) y (8-28) de una longitud arbitraria consistente en los aminoácidos en la 28ª posición hasta la 3ª posición construidos por medios de ingeniería genética, para producir grelina como una proteína de fusión. Para reducir el número de etapas de la síntesis química, es ventajosa la condensación (1-2) y (3-28) o entre (1-3) y (4-28). Desde el punto de vista de la prevención completa de la racemización producida por condensación, es particularmente preferida la condensación entre (1-7) y (8-28) usando Pro 7.

Construcción del vector de expresión pG97s rGR y expresión de grelina (6-28) como una proteína de fusión

Basándose en la secuencia de nucleótidos del ADNc de grelina de rata, se obtuvo un fragmento de ADN para rGrelina (6-28) que tenía la secuencia de aminoácidos QFE-SRHRR en la región prepro por templado usando un oligómero sintético total.

Para insertar este fragmento de ADN en pG97SnPPH34 (JP-A 9-296000), se trató pG97SnPPH34 con SalI y Smal delecionando de este modo su gen precursor de hormona paratiroidea humana. El producto se trató con fosfatasa alcalina y se ligó por ligasa de T4 al fragmento génico derivado de rGrelina previamente tratado con SalI y quinasa. El plásmido ligado se utilizó para transformar la cepa DH5\alpha de E. coli para dar plásmido pG97s rGR.

El plásmido resultante pG97s rGR se utilizó para transformar E. coli M25 (ompT) y el transformante resultante se cultivó en tres placas que contenían cada una 200 ml de medio líquido de caldo Terrific (1,2% de triptona, 2,4% de extracto de levadura, 0,4% de glucosa) y se cultivó con agitación a 37ºC. Cuando la concentración (DO_{660}) de la célula bacteriana alcanzó 0,8, se añadió isopropil 1-tio-\beta-D-galactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 2 mM, para expresar la proteína de fusión de rGrelina (6-28). Además, la célula bacteriana se cultivó durante 4 horas y después se recogió por centrifugación. La estructura de la proteína de fusión rGrelina (6-28) es la siguiente: proteína de fusión de rGrelina 6-28: (\beta-galactosidasa-97S)-QFE-SRHRR rGrelina (6-28).

Procesamiento de la proteína de fusión de rGrelina 6-28 y purificación de [SRHRR]-rGrelina (6-28)

Se suspendieron 20 ml de la célula bacteriana resultante en tampón TE y la célula bacteriana se rompió por una prensa French. Posteriormente, se recogieron los cuerpos de inclusión por centrifugación a 3000 rpm durante 15 minutos, se suspendieron de nuevo en 10 ml de tampón TE y agua desionizada y se centrifugaron, con lo que se lavaron los cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión se diluyeron con agua desionizada de tal forma que su DO_{660} se redujo a 50,0, y se añadió Tris-HCl (pH 8,2) a una concentración final de 50 mM, y los cuerpos de inclusión se disolvieron en urea (concentración final: 3,5 M). A esta solución mantenida a 30ºC se le añadieron derivado de proteasa rV8 V8D5 (abreviado en lo sucesivo como V8D5) (documento JP-A9-47291) a una concentración final de 10 \mug/ml y la solución se trató con la enzima a 30ºC durante 20 minutos. La reacción se terminó añadiendo ácido acético al 3% (AcOH):

Se añadió un exceso de 1,5 veces de agua desionizada a la solución terminada con reacción de enzima V8D5 que contenía [SRHRR]-rGrelina (6-28), y después esta solución se ajustó a pH 5,0 con NaOH 5 N, para precipitar el fragmento de derivado de \beta-galactosidasa que después se retiró por centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos.

El sobrenadante que contenía [SRHRR]-rGrelina (6-28) se aplicó a una columna TSK-ODS 80Ts (diámetro de partículas de resina de 20 \mum, 50 mm de D.I. x 100 mm, TOSOH Co., Ltd.) previamente equilibrada con TFA al 0,1%. El péptido deseado se eluyó por un gradiente lineal de 100% de tampón A [0,8 ml/min., acetonitrilo al 1%, TFA al 0,1%] a 100% de tampón B [acetonitrilo al 50% TFA al 0,095%], que se programó para terminar en un volumen de 5 columnas.
Se recogieron las fracciones que contenían el péptido deseado [SRHRR]-rGrelina (6-28) (aproximadamente 50 mg) .

Purificación de [Boc-SRHRR]-[Lys(Boc)^{11,16, 19,20,24}]-rGrelina (6-28)

Se añadieron 6 equivalentes mol (19,2 mg, 6 x 15 \mumol) de bicarbonato de di-t-butilo a una solución acuosa de acetonitrilo al 50% que contenía aproximadamente 50 mg (15 \mumol) de [SRHRR]-rGrelina (6-28), y después se ajustó a pH 9 con trietilamina y se dejó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadió ácido acético a una concentración final de 0,5% a la solución de reacción y después de evaporar el acetonitrilo, la solución se añadió a un cartucho EMPORE-Octil (C8) HD 4 mm/1 ml previamente equilibrado con acetonitrilo al 10% que contenía TFA al 0,1%, y después de lavar la columna con la solución de equilibrio [Boc-SRHRR]-[Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGrelina (6-28), se eluyó con acetonitrilo al 90% que contenía TFA al 0,095%. El acetonitrilo se evaporó y se obtuvieron 6 ml de solución que contenía aproximadamente 30 mg del péptido deseado.

La espectrometría de masas indicó principalmente dos péptidos cuyo peso molecular después de la modificación con Boc fue mayor en 500 (peso molecular determinado 3895) o en 600 (peso molecular determinado 3995), que el peso molecular (peso molecular determinado = 3396, peso molecular teórico = 3999) antes de la modificación con Boc.

Escisión de [Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGrelina (6-28) por proteasa Kex2 y purificación de la misma

Se añadieron soluciones de cloruro cálcico y Tris-HCl, pH 8,2, a concentraciones finales de 0,3 mM y 20 mM respectivamente a la solución acuosa resultante de [Boc-SRHRR]-[Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGrelina (6-28) (30 mg, 6 ml). Después se añadió a la misma una solución de proteasa Kex2 (documento JP-A- 10-229884) a una concentración de
1 x 10^{5} unidades/ml, y la muestra se trató con la proteasa a 30ºC durante 60 minutos.

En la HPLC, desapareció un pico de [Boc-SRHRR]-[Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGrelina (6, 28), se desplazó un pico de [Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGrelina (6, 28) hacia el lado de hidrofobia, y se observó un pico de un fragmento hidrófilo correspondiente a Boc-SRHRR.

Después de confirmar la desaparición del material de partida, la solución de reacción se ajustó a pH 3,5 con ácido acético acuoso y se aplicó a una columna de cromatografía de fase inversa ODS-80Ts (volumen de columna de 1,66 cc, diámetro de partículas de resina 20 \mum, TOSOH Co., Ltd.) previamente equilibrada con acetonitrilo al 1,0% que contenía ácido acético al 1%. Después de lavar la columna con la solución de equilibrio en un volumen de 5 columnas, se eluyó [Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGrelina (6-28) por un gradiente lineal de acetonitrilo al 1,0 a acetonitrilo al 90,0%, conteniendo cada uno ácido acético al 1%, que se programó para terminar en un volumen de 5 columnas. Las fracciones principales se liofilizaron para dar 6,2 mg del péptido protegido deseado.

Condensación y desprotección del fragmento

Se añadieron respectivamente trietilamina (51,0 \mul,0,366 mmol) y una solución de bicarbonato de di-t-butilo (78,0 mg, 0,0356 mmol) en TFE (4,00 ml) a una solución de Grelina (1-5) (190 mg, 0,0301 mmol, Compuesto 31) en trifluoroetanol (TFE) (6,00 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 13 horas. El disolvente se evaporó, y se añadió éter (20,0 ml) a los residuos resultantes, con lo que se obtuvieron 180,5 mg de [N^{\alpha}-Boc] -rGrelina (1-5).

Después se añadió HOSu (5,20 mg, 0,0452 mmol) a una solución de [N^{\alpha}-Boc]-rGrelina (1-5) (22,0 mg, 0,0301 mmol) en DMF (1,00 ml), y se añadió DIPCI (7,30 \mul, 0,0466 mmol) en un baño a -30ºC. Después, la mezcla se agitó en el baño a -30ºC durante 1 hora y posteriormente a temperatura ambiente durante 18 horas, se evaporó el disolvente y los residuos resultantes se convirtieron en un polvo con éter para dar 14,1 mg de [N^{\alpha}-Boc]-rGrelina (1-5)-OSu como un éster de succinimida de [N^{\alpha}-Boc]-rGrelina (1-5).

Después, se añadieron [N^{\alpha}-Boc]-rGrelina (1-5)-OSu (3,3 mg, 3,96 \mumol) y trietilamina (2,5 \mul, 17,9 \mumol) a una solución en DMF (0,6 ml) de [Lys(Boc)^{11,16,19,20,24}]-rGrelina (6-28) (6,10 mg, 2,18 \mumol) preparada por el método recombinante y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente se evaporó y se añadió TFA (2,00 ml) directamente a los residuos resultantes con refrigeración en hielo y se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El TFA se evaporó, y se añadió éter a los residuos, con lo que se obtuvieron 6,2 mg de péptido bruto que contenía Grelina (1-28).

Este producto se disolvió en 2 ml de ácido acético (AcOH) al 5% y se aplicó a YMC-Pack-ODS-A (5 \mum, 20 mm x 250 mm) y se eluyó por un gradiente lineal (caudal: 10 ml/min) de acetonitrilo al 0-95% en ácido trifluoroacético al 0,1% durante 60 minutos. Las fracciones deseadas se recogieron, se liofilizaron, se aplicaron a YMC-Pack PROTEIN-RP (C4, 10 mm x 250 mm) y se eluyeron por un gradiente lineal (caudal: 4,7 ml/min.) de acetonitrilo al 7,5-21,3% en ácido trifluoroacético al 0,1% durante 30 minutos.

Las fracciones deseadas se recogieron, liofilizaron y aplicaron a YMC-Pack PROTEIN-RP (C4, 10 mm x 250 mm) y se eluyeron por un gradiente lineal (caudal: 4,7 ml/min.) de acetonitrilo al 7,5-21,3% en ácido trifluoroacético al 0,1% durante 30 minutos. Las fracciones deseadas se recogieron y se liofilizaron para dar 2,1 mg de rGrelina (1-28). Este producto mostró un tiempo de retención de acuerdo con el de la rGrelina (1-28) convencional en HPLC analítica, y tuvo una actividad de liberación de Ca intracelular de CE_{50} = 1,5 nM que fue equivalente a la grelina
natural.

ESI-MS 3315,0 (teórico: 3314,8), composición de aminoácidos: Ser; 3,74 (4), Glx; 5,69 (6), Gly; 1,18 (1) , Ala; 2,05 (2), Leu; 2, Phe; 0,98 (1), Lys; 4,98 (5), His; 1,03 (1), Arg; 1,96 (2), Pro; 4,01 (4)

Compuesto 87

[^{D}leu^{5}]-rGrelina (1-28)

Como subproducto en la esterificación con succinimida de [N^{\alpha}-Boc]-rGrelina (1-5) o la condensación de los fragmentos, se obtuvieron 0,8 mg de [^{D}leu^{5}]-rGrelina (1-28). Su actividad de liberación de Ca intracelular fue CE_{50} = 220 nM.

ESI-MS 3315,0 (teórico: 3314,8), composición de aminoácidos Ser; 3,80 (4), Glx; 5,92 (6), Gly; 1,23 (1), Ala; 2,07 (2), Leu; 2, Phe; 0,97 (1), Lys; 4,92 (5), His; 1,02 (1), Arg; 1,97 (2), Pro; 4,11 (4)

Análisis por GC-MS de leucina después de la hidrólisis en D_{2}O/DCl: L-Leu; 1,17 (1), D-Leu; 0,83 (1).

Aplicabilidad industrial

Por medio de la administración del nuevo compuesto de tipo péptido de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en seres humanos o animales, se demuestra un excelente efecto de trabajo como preparación farmacéutica para promover el crecimiento de niños y mejorar los defectos de funciones metabólicas producidas por deficiencia de GH, induciendo la secreción de GH sin producir efectos secundarios sustanciales, y su anticuerpo demuestra un excelente efecto de trabajo como agente para el diagnóstico de enfermedades atribuibles a una deficiencia de GH y como herramienta de investigación en el campo de la ciencia.

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<110> KANGAWA, kenji

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<120> Nuevos Péptidos

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<130> DS03F216 (EP)

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<150> JP 1999/210002

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<151> 23-7-1999

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<150> JP 1999/338841

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<151> 29-11-1999

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP 2000/126623

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<151> 26-4-2000

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<160> 39

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<210> 1

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Secuencia de aminoácidos para una región central de péptidos endógenos de secretagogo de hormona

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del crecimiento

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<400> 1

400

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<210> 2

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<211> 28

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<223> Secuencia de aminoácidos para péptidos endógenos de rata de secretagogo de hormona del crecimiento

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<400> 2

401

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<210> 3

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<211> 28

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<223> Secuencia de aminoácidos para péptidos endógenos humanos de secretagogo de hormona del crecimiento

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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402

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<210> 4

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<211> 117

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<223> Secuencia de aminoácidos para una prepro-forma de péptidos endógenos de péptidos de rata de secretagogo

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del hormona del crecimiento

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<400> 4

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106

107

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<210> 5

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<211> 117

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<223> Secuencia de aminoácidos para la prepro-forma de péptidos endógenos humanos de secretagogo de

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hormona del crecimiento

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<400> 5

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108

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<210> 6

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<211> 501

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<212> ADNc

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<213> Rattus norvegicus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (31)...(381)

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<223> Secuencia de bases de ADNc que codifica la prepro-forma de péptidos endógenos de rata de secretagogo

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de hormona del crecimiento

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\newpage

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<400> 6

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109

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<210> 7

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<211> 511

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<212> ADN

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<220>

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<221> CDS

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<222> (34)...(384)

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<213> Homo sapiens

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<223> Secuencia de bases de ADNc que codifica la prepro-forma de péptidos endógenos humanos de secretagogo

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de hormona del crecimiento

\hfill

\newpage

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<400> 7

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110

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<210> 8

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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del crecimiento

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<400> 8

403

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<210> 9

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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del crecimiento

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<400> 9

404

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<210> 10

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<211> 27

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<223> Secuencia de aminoácidos para péptidos endógenos de rata (27 aminoácidos) de secretagogo de hormona

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\hskip-.1em\dddseqskip

del crecimiento

\hfill

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<400> 10

405

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<210> 11

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<211> 27

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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del crecimiento

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<400> 11

406

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<210> 12

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<211> 116

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos para una prepro-forma de péptidos endógenos de rata (27 aminoácidos)

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

de secretagogo de hormona del crecimiento

\hfill

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos para una prepro-forma de péptidos endógenos humanos (27 aminoácidos)

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

de secretagogo de hormona del crecimiento

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 498

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADNc

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)...(378)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de bases de ADNc que codifica la prepro-forma de péptidos endógenos de rata (27 aminoácidos)

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

de secretagogo de hormona del crecimiento

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

113

114

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 508

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (34)...(381)

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de bases de ADNc que codifica la prepro-forma de péptidos endógenos humanos (27 aminoácidos)

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

de secretagogo de hormona del crecimiento

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

115

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa (cerdo)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos para péptidos endógenos porcinos de secretagogo de hormona del crecimiento

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

407

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa (cerdo)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos para péptidos endógenos porcinos (27 aminoácidos) de secretagogo de hormona

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

del crecimiento

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

408

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa (cerdo)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos para la prepro-forma de péptidos endógenos porcinos de secretagogo de

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

hormona del crecimiento

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

117

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa (cerdo)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos para la prepro-forma de péptidos endógenos porcinos (27 aminoácidos) de secretagogo de hormona del crecimiento.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 494

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(362)

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa (cerdo)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de bases de ADNc que codifica la prepro-forma de péptidos endógenos porcinos de secretagogo

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

de hormona del crecimiento

\hfill

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 491

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)...(359)

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa (cerdo)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de bases de ADNc que codifica la prepro-forma de péptidos endógenos porcinos (27 aminoácidos)

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

de secretagogo de hormona del crecimiento

\hfill

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos para péptidos endógenos bovinos (27 aminoácidos) de secretagogo de hormona

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

del crecimiento

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

409

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos parcial para una prepro-forma de péptidos endógenos bovinos (27 aminoácidos)

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

de secretagogo de hormona del crecimiento

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(267)

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de bases de ADNc que codifica la prepro-forma de péptidos endógenos bovinos (27 aminoácidos)

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

de secretagogo de hormona del crecimiento

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

122

123

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Gallus domesticus

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos para péptidos endógenos de pollo de secretagogo de hormona del crecimiento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

411

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anguilla japonica

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> AMIDACIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos para péptidos endógenos de anguila de secretagogo de hormona del crecimiento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

412

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rana cafesbeiana

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos para péptidos endógenos de rana de secretagogo de hormona del crecimiento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

413

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevis

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos para péptidos endógenos de rana (Xenopus laevis) de secretagogo de hormona del crecimiento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

414

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> AMIDACIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos para péptidos endógenos de trucha arco iris (23 aminoácidos) de secretagogo

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

de hormona del crecimiento

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

415

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> AMIDACIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos para péptidos endógenos de trucha arco iris (20 aminoácidos) de secretagogo

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

de hormona del crecimiento

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

416

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos para péptidos endógenos de perro de secretagogo de hormona del crecimiento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

417

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anguilla japonica

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos para la prepro-forma de péptidos endógenos de anguila de secretagogo

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

de hormona del crecimiento

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

124

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevis

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos de péptidos endógenos de rana (Xenopus laevis) de secretagogo de hormona

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

del crecimiento

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

125

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos para la prepro-forma de péptidos endógenos de trucha arco iris (23 aminoácidos)

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

de secretagogo de hormona del crecimiento

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

126

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos para la prepro-forma de péptidos endógenos de trucha arco iris (20 aminoácidos)

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

de secretagogo de hormona del crecimiento

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 503

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (66)...(389)

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Anguilla japonica

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de bases de ADNc que codifica la prepro-forma de péptidos endógenos de anguila de secretagogo

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

de hormona del crecimiento

\hfill

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 484

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (47)...(388)

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevis

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de bases de ADNc que codifica la prepro-forma de péptidos endógenos de rana (Xenopus laevis) de secretagogo de hormona del crecimiento

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 462

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)...(257)

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de bases de ADNc que codifica la prepro-forma de péptidos endógenos de trucha arco iris (23 aminoácidos) de secretagogo de hormona del crecimiento

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 453

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)...(308)

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de bases de ADNc que codifica la prepro-forma de péptidos endógenos de trucha arco iris (20 aminoácidos) de secretagogo de hormona del crecimiento

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

131

Claims

1. Un compuesto de tipo péptido,

(a) en el que el segundo o tercer resto aminoacídico del extremo amino es un aminoácido modificado en el que se ha introducido una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene de 1 a 35 átomos de carbono en el átomo de carbono \alpha del aminoácido a través de un enlace éster, éter, tioéter, tioéster, amida, carbamida, tiocarbamida o disulfuro y a través o no de un grupo alquileno que contiene de 1 a 10 átomos de carbono, o en el que se ha introducido una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene de 1 a 20 átomos de carbono en el átomo de carbono \alpha del aminoácido, donde H está unido al átomo de carbono \alpha de dicho aminoácido modificado,

(b) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en las secuencias de aminoácidos indicadas en las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 y 30, o una secuencia de aminoácidos en la que puede delecionarse, reemplazarse y/o añadirse al menos un aminoácido, en la que el segundo o tercer aminoácido del extremo amino se ha reemplazado por dicho aminoácido modificado, donde dicho al menos un aminoácido no se deleciona, reemplaza y/o añade al primer-cuarto aminoácido del extremo amino en dicha secuencia de aminoácidos, con la excepción de que el aminoácido 2 ó 3 del extremo amino se reemplaza por dicho aminoácido modificado, y

(c) que tiene una actividad de aumentar la concentración de ion de calcio intracelular como resultado de la unión a un receptor de secretagogo de la hormona del crecimiento,

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. Un compuesto de tipo péptido,

(a) en el que el segundo o tercer resto aminoacídico del extremo amino es un aminoácido modificado seleccionado entre (i) serina, treonina, tirosina u oxiprolina, en el que el grupo hidroxi de la cadena lateral se convierte en un grupo representado por -OCO-Z_{1}, -OCS-Z_{1} o -O-Z_{3}, o (ii) cisteína en la que el grupo mercapto de la cadena lateral se convierte en -SCO-Z_{1}, -SCS-Z_{1}, -S-Z_{3} o -S-S-Z_{8}, o (iii) lisina o arginina, en la que el grupo amino de la cadena lateral se convierte en -NH-CO-Z_{2}, -NH-CS-Z_{2}, -N(Z_{5})(Z_{6}), -NH-CO-NH-Z_{7} o -NH-CS-NH-Z_{7}, o (iv) histidina o triptófano, donde el grupo imino de la cadena lateral se convierte en un grupo representado por la formula:

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en la que Z_{1} es hidrógeno o una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene de 1 a 50 átomos de carbono, Z_{2}, Z_{4}, Z_{6}, Z_{7} y Z_{8} son iguales o diferentes y representan H o una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene de 1 a 10 átomos de carbono, Z_{3} representa una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene de 1 a 10 átomos de carbono y Z_{5} representa una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene de 1 a 10 átomos de carbono

(b) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en las secuencias de aminoácidos indicadas en las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 y 30, o una secuencia de aminoácidos en la que puede delecionarse, reemplazarse y/o añadirse al menos un aminoácido, en la que el segundo o tercer aminoácido desde el extremo amino se ha reemplazado por dicho aminoácido modificado, donde dicho al menos un aminoácido no se deleciona, reemplaza y/o añade al primer-cuarto aminoácido desde el extremo amino en dicha secuencia de aminoácidos, con la excepción de que el aminoácido 2 ó 3 desde el extremo amino se reemplaza por dicho aminoácido modificado, y

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

3. El compuesto de tipo péptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el aminoácido modificado es (i) serina cuyo grupo hidroxi de cadena lateral se convierte en un grupo representado por -OCO-Z_{1}, -OCS-Z_{1} o -O-Z_{3}, o (ii) cisteína cuyo grupo mercapto de la cadena lateral se convierte en -SCO-Z_{1}, -SCS-Z_{1}, -S-Z_{3} o -S-S-Z_{8}, donde Z_{1}, Z_{3} y Z_{8} tienen los mismos significados que se han definido en la reivindicación 2.

4. Un compuesto de tipo péptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el aminoácido modificado es serina, treonina, tirosina u oxiprolina, en el que el grupo hidroxi de la cadena lateral se convierte en un grupo representado por -OCO-Z_{1} donde Z_{1} es H o una cadena alquilo saturada o insaturada que contiene de 1 a 50 átomos de carbono, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

5. El compuesto de tipo péptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el aminoácido modificado es un resto aminoacídico en el que un ácido graso está unido al grupo hidroxi de la cadena lateral a través de un enlace éster o al grupo mercapto de la cadena lateral a través de un enlace tioéster, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

6. El compuesto de tipo péptido de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el ácido graso contiene de 2 a 35 átomos de carbono, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

7. El compuesto de tipo péptido de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el ácido graso se selecciona entre ácidos grasos que contienen 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ó 18 átomos de carbono, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

8. El compuesto de tipo péptido de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el ácido graso se selecciona entre ácido octanoico, un ácido graso monoeno del mismo y un ácido graso polieno del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

9. El compuesto de tipo péptido de acuerdo con la reivindicación 7, donde el ácido graso se selecciona entre ácido decanoico, un ácido graso monoeno del mismo y un ácido graso polieno del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

10. Un compuesto de tipo péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos indicadas en las SEC ID Nº: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 16, 17, 22, 25, 26, 27, 28, 29 y 30, en la que el grupo hidroxi de la cadena lateral de serina o treonina en la tercera posición desde el extremo amino en dicha secuencia de aminoácidos se acila con un grupo acilo que contiene de 2 a 35 átomos de carbono o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

11. Un compuesto de tipo péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 1, 8 ó 9, o una secuencia de aminoácidos en la que la serina en la tercera posición del extremo amino de dicha secuencia de aminoácidos se convierte en treonina, donde dicho grupo hidroxi de la cadena lateral de serina o treonina en la tercera posición desde el extremo amino se acila con un grupo acilo que contiene de 2 a 35 átomos de carbono o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

12. Un compuesto de tipo péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID NO: 3 u 11, en la que el grupo hidroxi de la cadena lateral de serina en la tercera posición desde el extremo amino se acila con octanoílo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

13. Un compuesto de tipo péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 3 en la que el grupo hidroxi de la cadena lateral de la serina en la tercera posición desde el extremo amino se acila con n-octanoílo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

14. Un compuesto de tipo péptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde el compuesto tiene además una actividad de inducir la secreción de hormona del crecimiento.

15. Un compuesto de tipo péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende un aminoácido básico unido al extremo carboxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

16. El compuesto de tipo péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el extremo amino se modifica con un grupo alquilo saturado o insaturado o un grupo acilo que contiene uno o más átomos de carbono, y/o el grupo hidroxi del grupo carboxilo en el extremo carboxi es OZ o se reemplaza por NR2R3 donde Z es un catión farmacéuticamente aceptable o un grupo alquilo inferior lineal o ramificado, y R2 y R3 son iguales o diferentes
y representan H o un grupo alquilo inferior lineal o ramificado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

17. Un anticuerpo contra un compuesto de tipo péptido descrito en las reivindicaciones 1 a 16, que reconoce específicamente el péptido parcial amino-terminal que tiene el aminoácido modificado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde dicho péptido parcial amino-terminal es un péptido parcial amino-terminal del compuesto de tipo péptido descrito en las reivindicaciones 1 a 16.

18. Un método in vitro para ensayar un compuesto de tipo péptido descrito en las reivindicaciones 1 a 16, que comprende usar el anticuerpo descrito en la reivindicación 17 para detectar el compuesto de tipo péptido descrito en las reivindicaciones 1 a 16.

19. Un kit para detectar un compuesto de tipo péptido descrito en las reivindicaciones 1 a 16, que comprende el anticuerpo descrito en la reivindicación 17.

20. Un agente o una composición farmacéutica que comprende un compuesto de tipo péptido descrito en las reivindicaciones 1 a 16 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo como ingrediente activo.

21. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20 para el tratamiento de enfermedades atribuibles a un defecto o reducción de hormona del crecimiento.

22. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20 para el tratamiento de enfermedades cardíacas.

23. Un agente de acuerdo con la reivindicación 20, que es un agente para promover el apetito.

24. Un agente de acuerdo con la reivindicación 20, que es un agente terapéutico para el tratamiento de enfermedades funcionales del estómago.

25. Un agente de acuerdo con la reivindicación 20 para proteger a la mucosa de la túnica del intestino o para prevenir lesiones en la mucosa de la túnica del intestino delgado durante la nutrición intravenosa.

26. Un agente de acuerdo con la reivindicación 20, que es un agente terapéutico para el tratamiento de la osteoporosis.

27. Un agente de acuerdo con la reivindicación 20 para reducir la caquexia producida por enfermedades crónicas.

28. Un agente de acuerdo con la reivindicación 20, que es un agente terapéutico para el tratamiento de la insuficiencia pulmonar.

29. Una composición farmacéutica, agente o agente terapéutico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 28 para aplicación a animales distintos de seres humanos.

30. Un método para producir un compuesto de tipo péptido descrito en las reivindicaciones 1 a 16, que comprende unir un éster activado del péptido amino-terminal que se obtiene por síntesis química, a un péptido carboxilo-terminal que se obtiene por tecnología de recombinación genética.

31. Un método para producir un compuesto de tipo péptido descrito en las reivindicaciones 5-14 por tecnología de recombinación genética, que comprende usar células que tienen la actividad de acilación de serina de unir ácido octanoico a través de un enlace éster a un grupo hidroxi de la cadena lateral de serina en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 8.