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CN1321131C - 猪Ghrelin衍生物及其编码基因与应用 - Google Patents

猪Ghrelin衍生物及其编码基因与应用 Download PDF

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CN1321131C CNB2003101129327A CN200310112932A CN1321131C CN 1321131 C CN1321131 C CN 1321131C CN B2003101129327 A CNB2003101129327 A CN B2003101129327A CN 200310112932 A CN200310112932 A CN 200310112932A CN 1321131 C CN1321131 C CN 1321131C
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Abstract

本发明公开了一种猪Ghrelin衍生物及其编码基因与应用。本发明所提供的猪Ghrelin衍生物，其氨基酸序列如SEQ ID №：1、SEQ ID №：3或SEQ ID №：4所示。本发明还提供了促进哺乳动物增重，提高饲料转化率，升高血清生长激素水平，改善机体组成，提高度肉率、纠正人类各种生长激素缺陷及促进生长激素分泌以及增加厌食人群及恶病质病人食欲的多肽药物和基因药物，上述多肽药物的活性成分为上述猪Ghrelin衍生物或其可溶性盐，上述基因药物的活性成分为上述猪Ghrelin衍生物的编码基因。本发明的猪Ghrelin衍生物及其编码基因与以其为活性成分的药物可用于畜禽生产、人类临床基因补充和替代治疗。

Description

猪Ghrelin衍生物及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中猪Ghrelin衍生物及其编码基因与应用，特别涉及猪Ghrelin衍生物及其编码基因与以其为活性成分的药物。
背景技术
生长激素(Growth hormone，GH)是一种促进合成代谢的激素，能够促进蛋白质合成、脂肪降解和骨骼生长，而且与免疫系统的调节有关。GH通路的调节表达对最佳线性生长(Optimal linear growth)是非常关键的，同时对稳定碳水化合物、蛋白质和脂肪代谢也很重要(AL.Carrel et al.，Endocrine，12，163-172，2000)。生长激素分泌细胞(Somatotroph cells)分泌GH取决于下丘脑调节肽、靶腺激素以及多种生长因子以旁分泌(Paracrine)或自分泌(Autocrine)的方式相互之间的作用，其中许多生长因子至今仍不清楚。GH从垂体生长激素分泌细胞(Somatotrophs)的脉冲式(pulsatile)释放至少受到两种下丘脑神经肽：生长激素释放激素(Growth hormone releasing-hormone，GHRH)与生长激素释放抑制激素(Somatostatin，SS)的调节(MF.Scanlon et al.，Hormone Research，46，149-154，1996)。而且，可能受一种内源性生长激素促释放肽Ghrelin(M.Kojima et al.，Nature，402，656-660，1999)调节。Ghrelin的分离称得上GH领域里程碑式的发现，它为更深入理解GH分泌及躯体生长(Somatic growth)调节机制提供了可能。
从本世纪70年代开始人们就陆续发现，许多人工合成的小分子肽和非肽类物质在体内和体外均可促进GH分泌(C.Bowers et al.，Endocrinology，106，663-667，1980)，并将这类人工合成的物质统称为生长激素促泌物(Growth hormonesecretagogues，GHSs)。根据GHSs在体内的促进GH分泌的信号传导机制与已知的GHRH不同，推测体内存在着GHS的相应受体(Growth hormone secretagoguesreceptor，GHS-R)。1996年AD.Howards等(Science，273，974-977，1996)成功分离到了单一编码GHS-R的cDNA，并证实GHS-R属于α螺旋7次跨膜的G蛋白耦联受体。基因比较分析显示GHS-R基因在人、猿、猪、牛、大鼠、小鼠中高度保守，人和猪GHS-R同源序列高达93％。1999年M.Kojima等(Nature，402，656-660，1999)报道了以建立的稳定表达GHS-R的CHO(Chinese hamster ovary)细胞株作为分析系统来寻找内源性GHS。通过对大鼠心、脑、肺、肾、胃肠等提取物的检测，发现大鼠胃组织提取物中GHS的活性最高。经过系列层析提纯，从中纯化出了由28个氨基酸组成的活性肽，并证明它是GHS-R的内源性配基(Ligand)，命名为Ghrelin(ghre在原欧语系就是生长的意思)。
Ghrelin成熟肽包括28个氨基酸残基，N端第三位丝氨酸残基的羟基被辛酰酯化，而且该辛酰酯化为其活性所必需。其氨基酸序列为：GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR。它强烈诱导CHO-GHSR62细胞[Ca2+]增加，50％兴奋浓度(EC50)为2.5×10-9mol/L，阈值浓度为10-11mol/L。大鼠Ghrelin前体含117个氨基酸残基，N-端23肽呈现分泌信号肽的特征，从24位甘氨酸残基开始，直接连接在信号肽之后。Ghrelin最末两个残基脯-精氨酸应是加工信号。人胃Ghrelin与大鼠Ghrelin之间仅有两个残基不同。从人胃提取物中纯化的Ghrelin，也证实其N端第三位丝氨酸残基也存在n-辛酰酯化修饰。Ghrelin诱导原代垂体细胞释放GH，释放GH的EC50为2.1×10-9mol/L，GHRH为0.6×10-9mol/L，且明显地存在剂量依赖模式。此外，发现Ghrelin特异性地刺激垂体GH的释放，而不影响其他激素的分泌。Northern印迹实验对大鼠组织分析表明，Ghrelin前体mRNA存在于胃中，原位杂交表明Ghrelin的mRNA存在于分泌胃酸腺体的颈部和基部。并证明Ghrelin细胞是内分泌腺细胞。健康人血浆中Ghrelin浓度为117±37.2pmol/L。推测很可能Ghrelin从胃产生或分泌后随血液循环作用于垂体。组化分析还发现Ghrelin免疫反应的神经元位于下丘脑弓形核中。另外，RT-PCR分析指出，GHS-R在心、肺、胰腺、肠和脂肪组织中表达，故认为Ghrelin可能具有多方面的作用，如在心血管系统和代谢中起作用。
作为GHSs受体(GHS-R)的一种内源配体(Ligand)，Ghrelin最初是在大鼠胃内分泌细胞中发现的。Ghrelin成熟肽由28个氨基酸组成，在其N-端第三位丝氨酸(Ser3)羟基上有一个特殊的辛酰酯化翻译后修饰，此位置的翻译后修饰是其生物功能所必需的。辛酰化也并非是其唯一有功能的翻译后修饰，其它类型的酰酯化也是有功能的，去掉辛酰酯化或在第三位以外的其它丝氨酸上进行辛酰酯化修饰的Ghrelin是没有生物功能的。蛋白或多肽酰酯化较为少见，而辛酰酯化绝无仅有。多肽序列比较研究也显示，在已公布序列的哺乳动物中，Ghrelin N-端前7位氨基酸是高度保守的，并且都存在N-端第三位丝氨酸翻译后酰酯化修饰现象。
体外研究已表明，N-端可能是Ghrelin生物功能活性“核心”(Active core)，前4-5个氨基酸即具有与全长Ghrelin相似的生物学效应(MA.Bednarek et al.，J.Med.Chem，43，4370-4376，2000；M.Matsumoto et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun，287，142-146，2001)。体内和体外实验均已证实，Ghrelin具有明显的促进GH释放作用，静脉、脑室及腹腔给予Ghrelin均可升高血中GH水平。Ghrelin也能刺激人体GH释放(K.Takaya et al.，The Journal of Clinical Endocrinology& Metabolism，85，4908-491，2000；V.Tolle et al.，euroendocrinology，73，54-61，2001)。而且，令人振奋的是，按相同的分子比计算，Ghrelin促进GH释放的作用明显大于GHRH(M.Pombo et al.，Hormone Research 55(Suppl 1)，11-16，2001)。Ghrelin也与人工合成的GHSs一样，Ghrelin与GHRH也具有相加作用，协同刺激GH分泌。Ghrelin可能通过与GHRH不同的机制更有效调节GH释放，是体内调节GH释放的又一个重要因素，详细的机制有待阐明。但已有的证据已经表明Ghrelin发挥促GH分泌作用可能依赖于一个完整的GHRH系统(CY.Bowers et al.，TheJournal of Clinical Endocrinology & Metabolism，86，1464-1469，2001；J.Kamegai et al.，Endocrinology，142，4154-4157，2001；GS.Tannebaum et al.，Endocrinology，144，967-974，2003)。此外，Ghrelin也参与能量代谢(M.Tscho¨pet al.，Nature，407，908-913，2000；TL.Horvath et al.，Endocrinology，142，4163-4169，2001；DE.Cummings et al.，The New England Journal of Medicine，346，1623-1630，2002)。由于Ghrelin在血液中的半衰期较短，以前在体内研究Ghrelin促进GH分泌活性需要反复皮下、静脉或脑室内注射合成的Ghrelin或其类似物(M.Tscho¨pet al.，Nature，407，908-913，2000；M.Nakazato et al，Nature，409，194-198，2001)。
基因药物(Gene medicines)也称为DNA药物，它是将具有治疗意义的基因重组进真核表达载体，直接转移动物或人的细胞，表达出具有治疗作用的多肽或蛋白质，从而达到治疗疾病或调节动物生长，泌乳等性能的一种新方法(马大龙生物技术药物北京科技出版社2001)。基因药物不同于一般的基因治疗，基因转移的细胞不仅要在细胞内表达出治疗的蛋白质，而且表达的蛋白质还要释放出细胞，进入系统循环才能发挥作用。它与传统的提取，合成和蛋白质工程类药物不同，它不需要在体外合成和表达蛋白质，也不需要在体外分离和纯化，而是把人体能合成蛋白质和多肽的“工厂”—重组的基因-植入体内，让细胞自己去合成、分离和纯化蛋白质，并且自行释放入血液循环，在局部或远隔部位发挥其功能，而达到防治疾病及调节生长，泌乳等目的。它不需要“原料”，体内可以自行提供基因转录、表达所需要的条件，细胞自身可以进行合成、分离和纯化，并分泌出来；基因在细胞内，可以接受体内各种转录因子、调控因素和内外环境的调节；它不断生产、不断释放、不断利用。因此，一次植入基因可以长期有效，无需每天用药，具有高效，长效，生理，经济，实用的优势。它是对既往传统药物的一个挑战，被称为医药产业的第四次革命，成为21世纪国际生物高技术和医药产业的一个重要发展。基因药物与蛋白质类药物的区别如表1所示。基因药物主要有细胞因子、活性多肽及其受体的基因，此外，还包括反义核酸、DNA疫苗和基因转录调控的药物等。
表1.多肽药物与基因药物的比较
    多肽药物   基因药物
    产物质粒宿主细胞转染生产工艺纯化成本稳定性保存半衰期用法疗效副作用     多肽-蛋白质原核表达载体无信号肽大肠杆菌、酵母(体外)易复杂复杂较昂贵不稳定难短长期注射短高   基因真核表达载体信号肽人体细胞(体内)难较简单较简单较经济稳定易长一次性注射持久低
利用直接的质粒DNA注射方法异位表达GHRH或其蛋白酶抵抗的氨基酸替代衍生物促进小鼠或猪生长(R.Draghia-Akli et al(Natute Biotechnology，15，1285-1289，1997；Nature Biotechnology，17，1179-1183，1999；FASEB Journal，17，526-528，2003)早有报道，那么探索应用基因药物手段异位表达Ghrelin或其衍生物及Ghrelin联合GHRH，或许能够找到一种比应用GHRH更有效、更生理、更经济地促进畜禽生长，提高饲料转化率，增加廋肉率，提高产乳量，促进优质、高产畜禽产品生产的方法。对于基因药物，Ghrelin及其衍生物cDNA可以锚定(Target)到外周器官，在那里多肽被合成加工、分泌，最后，转运到全身循环，并且在血液循环中是有生物活性的。骨骼肌是体内理想的直接质粒DNA转染的靶组织，质粒DNA可以在肌肉内长时间显著水平表达(HL.Davis et al.，Human Gene Therapy，4，151-159，1993；SK.Tripathy et al.，Proceedings of the National AcademySciences USA，93，10876-10880，1996)。基因药物是一种替代治疗，不同于经典的基因治疗，如肿瘤，它不象基因治疗那样需要100％的细胞都植入进基因才能抑制肿瘤的生长。有人指出，主要2％-5％的肌肉细胞转染进基因，其表达蛋白质可以通过自分泌和旁分泌和循环分泌即可达到治疗的目的。基因药物也不同于基因工程和多肽类药物，它是一种持续起作用的因素，一次注射，可以长期有效，并可重复应用。因此，它并不要求能整合进基因组，终身表达。这样不仅可以增加基因药物的安全性，还提高了基因药物应用的灵活性。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种猪Ghrelin衍生物及其编码基因。
本发明所提供的猪Ghrelin衍生物，它为至少包括GSSF或GSWF氨基酸残基序列的由猪Ghrelin衍生的多肽。
其中，所述猪Ghrelin衍生物优选为至少包括GSSFLSP或GSWFLSP氨基酸残基序列的由猪Ghrelin衍生的多肽。
上述猪Ghrelin衍生物可由常规方法合成。
所述GSSF和GSSFLSP中的第2个丝氨酸为辛酰酯化的丝氨酸；为使所述猪Ghrelin衍生物分泌到血液循环，所述猪Ghrelin衍生物的N端还连接有信号肽/引导肽序列，所述信号肽/引导肽可为猪Ghrelin或人生长激素释放激素(hGHRH)信号肽/引导肽，优选为猪Ghrelin信号肽/引导肽。
为增强所述猪Ghrelin衍生物的生物活性，可在所述猪Ghrelin衍生物的C末端添加一个碱性氨基酸，如赖氨酸。
所述猪Ghrelin衍生物优选为序列表中的SEQ ID №：1、SEQ ID №：2、SEQ ID№：3、SEQ ID №：4、SEQ ID №：5、SEQ ID №：6或SEQ ID №：7。
SEQ ID №：1由52个氨基酸残基组成，自N端第1至第24位氨基酸残基序列为猪Ghrelin信号肽序列，自N端第25至第52位氨基酸残基序列为猪Ghrelin序列；SEQ ID №：2由52个氨基酸残基组成，自N端第1至第24位氨基酸残基序列为猪Ghrelin信号肽序列，自N端第25至第52位氨基酸残基序列为除第27位氨基酸残基是色氨酸残基外其余为猪Ghrelin序列；SEQ ID №：3由32个氨基酸残基组成，自N端第1至第24位氨基酸残基序列为猪Ghrelin信号肽序列，自N端第25至第31位氨基酸残基序列为猪Ghrelin的自N端第1至第7位氨基酸残基序列序列，自N端第32位氨基酸残基为赖氨酸残基；SEQ ID №：4由32个氨基酸残基组成，自N端第1至第24位氨基酸残基序列为猪Ghrelin信号肽序列，自N端第25至第31位氨基酸残基序列为除第27位氨基酸残基是色氨酸残基外其余为猪Ghrelin的自N端第1至第7位氨基酸残基序列，自N端第32位氨基酸残基为赖氨酸残基；SEQ ID №：5由59个氨基酸残基组成，自N端第1至第31位氨基酸残基序列为人GHRH信号肽序列，自N端第32至第59位氨基酸残基序列为猪Ghrelin序列；SEQ ID №：6由59个氨基酸残基组成，自N端第1至第31位氨基酸残基序列为人GHRH信号肽序列，自N端第32至第59位氨基酸残基序列为除第34位氨基酸残基是色氨酸残基外其余为猪Ghrelin序列；SEQ ID №：7由39个氨基酸残基组成，自N端第1至第31位氨基酸残基序列为人GHRH信号肽序列，自N端第32至第38位氨基酸残基序列为除第34位氨基酸残基为色氨酸残基外其余为猪Ghrelin的自N端第1至第7位氨基酸残基序列，自N端第39位氨基酸残基为赖氨酸残基。
编码上述猪Ghrelin衍生物的基因也属于本发明的保护范围，含有编码上述猪Ghrelin衍生物的基因的表达载体和细胞系也属于本发明的保护范围，如表达载体pGEM-wt-sGhln(含有序列表中的SEQ ID №：1编码序列)、pGEM-mt-sGhln(含有序列表中的SEQ ID №：2编码序列)、pGEM-tmt-sGhln(含有序列表中的SEQ ID№：4编码序列)、pGEM-twt-sGhln(含有序列表中的SEQ ID №：3编码序列)、pGEM-wt-hGhln(含有序列表中的SEQ ID №：5编码序列)、pGEM-mt-hGhln(含有序列表中的SEQ ID №：6编码序列)、pGEM-tmt-hGhln(含有序列表中的SEQ ID№：7编码序列)。
本发明的另一个目的是提供一种促进哺乳动物增重，提高饲料转化率，升高血清生长激素水平，改善机体组成，提高廋肉率、纠正人类各种生长激素缺陷及促进生长激素分泌以及增加厌食人群及恶病质病人食欲的多肽药物，该药物的活性成分为上述猪Ghrelin衍生物或其可溶性盐。
本发明的再一个目的是提供一种促进哺乳动物增重，提高饲料转化率，升高血清生长激素水平，改善机体组成，提高廋肉率、纠正人类各种生长激素缺陷及促进生长激素分泌以及增加厌食人群及恶病质病人食欲的基因药物，该药物的活性成分为上述猪Ghrelin衍生物的编码基因。
上述多肽药物可通过注射进行给药；上述基因药物可通过注射含有上述基因的表达载体进行给药。
本发明的猪Ghrelin衍生物及其编码基因与以其为活性成分的药物将在促进哺乳动物增重，提高饲料转化率，升高血清生长激素水平，改善机体组成，提高廋肉率、纠正人类各种生长激素缺陷及促进生长激素分泌以及增加厌食人群及恶病质病人食欲等方面发挥重要作用，可用于畜禽生产、人类临床基因补充和替代治疗。
附图说明
图1为猪Ghrelin及其衍生物cDNA pT-wt-sGhln或pT-wt-hGhln载体构建示意图
图2为肌原特异表达载体框架的构建示意图
图3为猪Ghrelin及其衍生物cDNA肌原表达载体构建示意图
图4为生产基因药物的流程图
图5为大鼠左侧股四头肌质粒DNA单一剂量注射后增重效果
图6为大鼠左侧股四头肌质粒DNA单一剂量注射后增重效果
图7为Q sepharoae XL质粒DNA纯化过程
图8为质粒pGEM-tmt-sGhln DNA经Q Sepharose QL纯化后的电泳图
图9为青年大鼠左侧股四头肌质粒DNA单一剂量注射后增重效果
图10为青年大鼠直接肌内注射质粒DNA后放射免疫测定血清
图11为质粒DNA注射后30天，RT-PCR检测pGEM-wt-sGhln，pGEM-tmt-sGhln编码基因表达结果
具体实施方式
实施例1、猪Ghrelin成熟肽及其衍生物肌原表达载体的构建
1、猪Ghrelin及其衍生物cDNA克隆
猪Ghrelin及其衍生物cDNA pT-wt-sGhln或pT-wt-hGhln载体构建过程如图1所示，具体步骤如下：
根据Gene Bank已公布的猪Ghrelin(GeneBank登陆号：No.AB035704)以及人GHRH(hGHRH)前体cDNA序列(GeneBank登陆号：no.NM_021081)，合成3条寡核苷酸单链和6条引物(上海生工)，寡核苷酸链与引物序列如表2所示。寡核苷酸单链序列1包括猪Ghrelin信号肽和成熟肽前28bp cDNA序列(正义)，其中包括一个碱基突变(Ghrelin成熟肽第5位氨基酸，亮氨酸(Leu)密码子由TTG→TTA)以构成限制酶Afl II识别序列(CTTAAG)；寡核苷酸单链序列2包括人GHRH信号肽和猪Ghrelin成熟肽前20bp cDNA序列(正义)，其中也包括一个碱基突变(Ghrelin成熟肽第5位氨基酸，亮氨酸(Leu)密码子由TTG→TTA)以构成限制酶Afl II识别序列(CTTAAG)；寡核苷酸单链序列3包括猪Ghrelin成熟肽前84bp cDNA序列(反义)，前面含有12个碱基包括TAG转录终止密码子，限制酶Spe I识别序列(ACTAGT)及3个酶切保护碱基CGT。其中包括一个碱基突变(Ghrelin成熟肽第5位氨基酸，亮氨酸(Leu)反义密码子由CAA→TAA)以构成限制酶Afl II识别序列(CTTAAG)。首先，序列1与序列3退火，补齐，然后以引物1和3作PCR扩增，扩增产物克隆到测序载体pMD-18-T(Takara)形成pT-wt-sGhln；其次，以pT-wt-sGhln作为模版，以引物4和5作PCR扩增，PCR产物插入到pT-wt-sGhln的Sac I/Afl II位点产生pT-mt-sGhln；最后，以Sac I/AflII双酶切pT-mt-sGhln，回收小片段，以引物4和6扩增小片段，PCR产物插入到pT-mt-sGhln的Sac I/SpeI位点形成pT-tmt-sGhln。以Sac I/Afl II双酶切pT-wt-sGhln，回收小片段，插入到pT-tmt-sGhln的Sac I/Afl II位点形成pT-twt-sGhln。在序列2与序列3之间，依次用引物对2和3、4和5及4和6作上述同样的操作产生相应的pT-wt-hGhln、pT-mt-hGhln及pT-tmt-hGhln。
表2.寡核苷酸序列与引物
寡核苷酸序列与引物   序列(5’to 3’)     正义/反义
寡核苷酸序列1寡核苷酸序列2寡核苷酸序列3引物1引物2引物3引物4引物5引物6   ATGCCCTCCACGGGGACCATTTGCAGCCTGCTGCTCCTCAGCGTGCTCCTCATGGCAGACTTGGCCATGGCGGGCTCCAGCTT CTTAAGCCCCGAACACCATGCCACTCTGGGTGTTCTTCTTTGTGATCCTCACCCTCAGCAACAGCTCCCACTGCTCCCCACCTCCCCCTTTGACCCTCAGGATGCGGCGGGGCTCCAGCTT CTTAAGCCCGCA ACTAGTCTACCGGGGCTTCAGTTTGGCTGCTGGCTTCTTGGACTCCTTTCTCTGCTGCACTTTCTGGTGTTCGGGG CTTAAGAAGCTGGAGCCATGCCCTCCACGGGGACCATTTATGCCACTCTGGGTGTTCTTCTTTGCA ACTAGTCTACCGGGGCTTCTTC GAGCTCGGTACCCGGGGGG CTTAAGAACCAGGAGCGCA ACTAGTCTACTTGGGGCTTAA     正义正义反义正义正义反义正义反义反义
注：下划线代表限制酶Afl II、Spe I与Sac I识别序列。引物5包含将丝氨酸反义密码子替代为反义色氨酸密码子(GCT→CCA)，引物6将在Ghrelin短肽C-末端添加一个赖氨酸反义密码子(CTT)。
退火反应总体积20μl，正义链、反义链各2.5μM，lmMdNTP，TagDNA聚合酶0.25U/μl，反应条件：94℃，4min；58℃，40s；72℃，1min；一个循环。上述所有PCR反应条件都是相同的：首先94℃，变性5min，然后，60℃退火30s，72℃延伸30s，94℃变性30s，共30个循环。
2、肌肉特异表达载体构建
骨骼肌α-actin5’已经证明能够在体内外驱动多个报告基因的表达，而且是肌肉组织特异的。
源于pGEM-5zf(为Promega的pGEM-T Vector)的质粒DNA骨架pGEM-A5f3f的构建过程如图2所示：pGEM-A5f3f含有一个2857bp Nco I/Mlu I片段，其中包括1910bp猪骨骼肌α-actin(SKA)5’侧翼、第一外显子和第一内含子。pGEM还有一个613bp Sac I/NsiI片段的人GH(hGH)cDNA3’非翻译区。质粒DNA骨架pGEM的5’侧翼与3’侧翼均是通过PCR的方法从基因组中扩增得到。pGEM-A5f3f表达载体骨架已经申请专利保护，专利公开号：CN1432577A。为了构建猪Ghrelin及其衍生物变体cDNA肌原表达载体，如图3所示，首先对pGEM-A5f3f进行Mlu I单酶切，然后用Klenow Fragment(Takara)补齐，回收大片段，再进行Spe I单酶切。野生型Ghrelin及其衍生物cDNA通过PCR从相应的pT-Ghlns构建体中扩增，然后插入到载体的平端Mlu I/Spe I产生相应的pGEM-wt-sGhln、pGEM-mt-sGhln、pGEM-twt-sGhln、pGEM-tmt-sGhln和pGEM-wt-hGhln、pGEM-mt-hGhln、pGEM-tmt-hGhln。酶切后，补齐反应条件：94℃，5分钟；68℃，15分钟；PCR反应条件同上。含hGHRH cDNA的载体pGEM-wt-hGHRH已经申请中国专利，专利公开号：CN1432577A。所有表达载体的目的基因序列均经过测序验证。pGEM-Ghlns系列表达载体构建图及其编码的Ghrelin、Ghrelin衍生物及hGHRH的氨基酸序列如表3所示。
表3.与表达载体相对应的编码猪Ghrelin及其衍生物多肽结构
表达载体 结构
pGEM-wt-sGhlnpGEM-mt-sGhlnpGEM-twt-sGhln MPSTGTICSLLLLSVLLMADLAMA*GSSFLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR(SEQ ID №：1)MPSTGTICSLLLLSVLLMADLAMA*GSWFLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR(SEQ ID №：2)MPSTGTICSLLLLSVLLMADLAMA*GSSFLSPK(SEQ ID №：3)
pGEM-tmt-sGhlnpGEM-wt-hGhlnpGEM-mt-hGhlnpGEM-tmt-hGhln MPSTGTICSLLLLSVLLMADLAMA*GSWFLSPK(SEQ ID №：4)MPLWVFFFVILTLSNSSHCSPPPPLTLRMRR*GSSFLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR(SEQ ID №：5)MPLWVFFFVILTLSNSSHCSPPPPLTLRMRR*GSWFLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR(SEQ ID №：6)MPLWVFFFVILTLSNSSHCSPPPPLTLRMRR*GSWFLSPK(SEQ ID №：7)
注：pGEM-wt-sGhln、pGEM-mt-sGhln、pGEM-tmt-sGhln和pGEM-twt-sGhln携带的是猪Ghrelin自身的信号肽，而pGEM-wt-hGhln、pGEM-mt-hGhln、pGEM-tmt-hGhln连接的是人GHRH信号肽。载体pGEM-wt-sGhln、pGEM-wt-hGhln编码的是猪Ghrelin成熟肽；载体pGEM-mt-sGhln、pGEM-mt-hGhln编码的是猪GhrelinN-端第三位丝氨酸突变为色氨酸的突变体；而载体pGEM-tmt-sGhln、pGEM-tmt-hGhln编码的是仅包括猪GhrelinN-端前7位氨基酸的Ghrelin短肽衍生物，其中包括第三位丝氨酸突变为色氨酸，并且，在C-末端添加了一个碱性氨基酸，赖氨酸(K)。*前为信号肽氨基酸序列，而载体pGEM-twt-sGhln是仅编码猪GhrelinN-端前7位氨基酸的Ghrelin短肽，仅在C-末端添加了一个碱性氨基酸，赖氨酸(K)。
实施例2、生产基因药物
生产基因药物的程序如图4所示，具体过程如下：
样品的准备按照《分子克隆》质粒DNA大规模提取操作：将实施例1中制备的pGEM-wt-sGhln、pGEM-mt-sGhln、pGEM-tmt-sGhln、pGEM-twt-sGhln、pGEM-wt-hGhln、pGEM-mt-hGhln和pGEM-tmt-hGhln分别按常规方法导入DH5α。然后在37℃，200转/分培养宿主菌至对数生长期。然后按照图4所示的流程操作，其中，CaCL2作为沉淀剂，钙离子被用来降低干净的裂解液中RNA、染色体DNA和开环质粒；利用KTA explorer系统(Pharmacia Biotech Uppsala，Sweden)平台，用Q Sepharose XL进行的分离过程如表4所示：
表4.质粒DNA分离步骤、程序和条件
纯化程序   平衡  上样   RNA洗脱   质粒洗脱     清洗
柱体积(CV)缓冲液   5CV0.5MKACPh5.5  Xml+5CV   3CV25mMTris-HCl，0.75M NaCl，pH8.0 5CV25mMTris-HCl，0.5M NaCl，pH8.0   5CV50mM磷酸盐1MNaCLpH10.00     5CV0.5MNaOH2MNaCL
注：CV＝柱体积X＝澄清裂解液的体积
经过阴离子交换之后，质粒样品中超螺旋DNA和杂质所能达到的目标纯度如表5所示。纯化的质粒DNA不含所有细菌染色体DNA、RNA、蛋白和内毒素等污染物。纯化后的表达载体经测序验证正确。
表5.质粒制备过程中超螺旋和杂质的目标含量
含量   目标
超螺旋(Supercoied plasmid)RNA染色体DNA内毒素(Endotoxins)   ＞95％核酸＜2％核酸＜1％质粒100EU/mg质粒
实施例3、动物实验
猪Ghrelin及其衍生物肌原表达载体的构建如实施例1所述。质粒DNA(基因药物)按照科学出版社《分子克隆》碱裂解法大量制备，并经聚乙二醇(PEG)纯化。
雄性SPF级Wistar大鼠分别注射200μg pGEM-wt-sGhln、pGEM-mt-sGhln和pGEM-twt-sGhln，以pGEM-A5f3f空载体为对照。质粒注射后，Ghrelin、Ghrelin丝氨酸(Ser3)替代突变体和Ghrelin短肽变体分泌到血液循环。促生长效果如图5所示：肌内注射pGEM-wt-sGhln促进大鼠生长约4周多，累积增重高峰分别出现在注射后21天，累积增重平均比对照组高于9.3％(139.06±13.15vs.127.24±13.58，p＜0.26)，表明骨骼肌似能对在此表达的Ghrelin行使翻译后修饰机制，因为已经证明去掉辛酰化的Ghrelin是没有功能的；注射pGEM-twt-sGhln也能显著促进大鼠增重，累积增重高峰分别出现在注射后14天，平均比对照组高于12.3％(107.62±7.15vs.95.79±9.67，p＜0.05)，表明Ghrelin短肽衍生物能够模拟全长Ghrelin生物学效应；而注射pGEM-mt-sGhln促生长效果相对短暂，累积增重高峰分别出现在注射后7天，累积增重平均比对照组高于6.3％(49.66±4.54vs.46.75±4.56，p＜0.37)，表明Ghrelin丝氨酸Ser3)替代为色氨酸Trp3)突变体也能促进生长，但效果不理想。图5中结果表示为平均数(Mean)±标准误(Standard error，SE)；注射pGEM-wt-sGhln(n＝18)，pGEM-mt-sGhln(n＝18)，pGEM-twt-sGhln(n＝18)，年龄相似的对照动物(n＝18)；注射后14天观察到pGEM-twt-sGhln相对于对照组增重显著*p≤0.05。
实施例4、动物实验
猪Ghrelin或其衍生物肌原表达载体的构建如实施例1所述。质粒DNA按照科学出版社《分子克隆》碱裂解法大量制备，并经聚乙二醇(PEG)纯化。
雄性SPF级Wistar大鼠分别注射200μg pGEM-wt-hGhln、pGEM-tmt-sGhln、pGEM-tmt-hGhln或联合注射pGEM-wt-sGhln & pGEM-wt-hGHRH(含有100μgpGEM-wt-sGhln和100μg pGEM-wt-hGHRH)，以pGEM-A5f3f空载体为对照。质粒注射后，Ghrelin、Ghrelin短肽衍生物及GHRH分泌到血液循环。促生长效果如图6所示：pGEM-tmt-sGhln和pGEM-wt-sGhln & pGEM-wt-hGHRH联合注射组能够强力刺激正常大鼠生长3周多，最佳刺激效果出现在注射后14天，平均累积增重分别比对照组高19％与15％(79.84±4.29g，versus66.96±4.57g，p＜O.05；76.71±4.17 versus 66.96±4.57g，p＜O.05)。并且，质粒DNA注射组没有组织肥大(Orgamegaly)及相关病理改变。相比之下，pGEM-wt-hGhln及pGEM-tmt-hGhln注射组的增重效果在同样的时间段还不如对照组。结果表明：在基因药物中，Ghrelin短肽衍生物能够模拟全长Ghrelin生物学效应，具有最强刺激生长效果；在基因药物方法上，Ghrelin与GHRH在此系统中具有协同刺激生长的作用；在直接质粒DNA注射方法中，Ghrelin本身的信号肽/导肽的效果优于hGHRH的信号肽/导肽。图6中结果表示为平均数(Mean)±标准误(Standard error，SE)；注射pGEM-wt-hGhln(n=＝8)，pGEM-tmt-hGhln(n＝16)，pGEM-tmt-sGhln(n＝16)及pGEM-wt-sGhln& pGEM-wt-hG HRH联合注射(n＝16)，年龄相似的对照动物(n＝16)；注射后14天观察到pGEM-tmt-sGhln和pGEM-wt-hGhln & pGEM-wt-hGHRH联合注射组相对于对照组增重显著*p≤0.05。
实施例5、分析目的基因表达
为了进一步验证载体pGEM-wt-sGhln和pGEM-tmt-sGhln的促生长效力和增强基因导入效率，首先，利用安玛西亚公司提供的Q Sepharose xL阴离子交换柱在KTA纯化平台对注射质粒DNA进行了纯化(柱体积5ml，样品20ml)，以除去细菌染色体DNA、RNA、蛋白和内毒素等杂质，富集超螺旋DNA供基因药物使用，减少质粒注射用量。阴离子交换柱Q Sepharose XL对注射质粒DNA进行纯化的结果如图7所示，纯化后的质粒pGEM-tmt-sGhln DNA的电泳如图8所示，图8中，数字代表接收的管数，表明富集了超螺旋DNA，降低了染色体DNA，RNA、蛋白的干扰，特别是内毒素含量基本基本满足SDA要求的标准。纯化后的吸光度值如表6所示：
表6.纯化后的质粒DNA吸光度值
   质粒DNA    OD260   OD280   OD260/Od280   质粒含量(mg/ml)
   pGEM-wt-sGhln    0.366   0.200   1.83    0.92
 pGEM-tmt-sGhln   0.440 0.246  1.79 1.10
在质粒DNA注射前3天，率先在将来质粒DNA注射部位注射了100ul 0.75％布比卡因以促进肌肉细胞对质粒DNA的摄取，提高基因转移效率。
雄性SPF级SD(Sprague Dawley)大鼠左侧股四头肌分别注射pGEM-wt-sGhln或pGEM-tmt-sGhln，150μg质粒DNA/只，对照组注射pGEM-A5f3f空载体。动物常规饲养，自由采食和饮水。称重：1次/5天；采血/采组织样：动物麻醉后心脏取血1ml，4℃过夜，离心制备血清，-70℃冻存，以备检测GH水平(RIA)，1次/10天，10只/组/次。取血后处死大鼠，采集注射部位组织样，液氮保存。
大鼠GH(rGH)血清浓度检测依然采用由NHPP，NIDDK，USDA，USA提供的试剂盒通过放射免疫法(Radioimmunoassay，RIA)测定(中国农科院原子能所标记室)。数据以大鼠GH-RP-2作为标准(效力2IU/mg)，表示为ng/ml，试剂的敏感性为0.1ng/ml。为了避免测定间的误差，一次实验测定得到的所有实验样品。每个样品设置一个重复。
利用RT-PCR分析了质粒DNA注射后30天注射组目的基因表达情况。肌肉组织总RNA提取及cDNA第一链的合成按照试剂盒说明书操作(Gibco)。设计特异寡核苷酸引物扩增pGEM-wt-sGhln 168bp片段5’-ATGCCCTCCACGGGGACCATTT-3’(正义)，5’-GCAACTAGTCTAC CGGGGCTTC-3’(反义)或扩增pGEM-tmt-sGhln 108bp片段5’-ATGCCCTC CACGGGGACCATTT-3’(正义)，5’-GCAACTAGTCTACTTGGGGCTTAA-3’(反义)。反应条件：94℃，30s，60℃退火30s，72℃30s，25μl体系，30个循环。数据采用SAS软件之一般线形模型(GLM)分析。数值表示为平均数(Mean)±标准误(Standard error，SE)，用Ducan’s多重比较之方差分析评价质粒注射组与对照组体重、增重、平均日增重、血清GH水平及血清GH水平变化之间的统计显著性差异。P＜0.05，差异显著。
质粒注射后，Ghrelin、其短肽衍生物分泌到血液循环。pGEM-wt-sGhln、pGEM-tmt-sGhln注射组能够强力刺激正常大鼠生长3周多，增重效果如图9所示，最佳刺激效果分别出现在注射后15与20天，平均累积增重分别比对照组高11％与21％(145.61±2.37g，versus 131.76±4.56g；207.81±9.01 versus 171.75±5.62g，p＜0.05)。动物处死后，数量分割各器官(心、肺、肝、脾、脑、肾胃、睾丸等)，表明注射质粒后各器官一致生长，注射组没有组织肥大(Orgamegaly)与相关病理病变。屠体重量分析也表明，质粒DNA注射组胴体重量优于对照组。图9中，结果表示为平均数(Mean)±平均标准误(Standard error)；注射pGEM-wt-sGhln(n＝10)，pGEM-tmt-sGhln(n＝10)，年龄相似的对照动物(n＝10)；注射后20天观察到pGEM-tmt-sGhln相对于对照组增重显著，*p≤0.05。
质粒DNA注射后10、20、30天，分别采集了质粒DNA注射组与对照组动物的血样。血清GH放射免疫测定结果如图10所示，表明相对于对照组，pGEM-tmt-sGhln注射组血清GH水平显著上升，在注射后20天达到峰值(73.04±17.02ng/ml Vs.39.94±14.44ng/ml，n＝10，p＜0.043)，注射后30天回到基础水平。在相同的时间段，pGEM-wt-sGhln注射组血清GH水平也高于对照组动物。结果显示，利用肌肉特异的表达载体异位表达Ghrelin或其短肽衍生物能够诱导GH释放，升高血清GH水平。图10中，结果表示为平均数(Mean)平均标准误(Standard error，SE)，注射pGEM-wt-sGhln(n＝10)，pGEM-tmt-sGhln(n＝10)，年龄相似的对照(n＝10)。注射后20天，质粒pGEM-tmt-sGhln DNA注射组血清GH水平的改变显著高于对照组，*p≤0.05。
质粒DNA注射后，分别在注射后3、7、10、14、20、30天采集了注射部位肌肉，然后提取了肌肉组织总RNA，总RNA经DNase I处理以消除质粒。设计特异引物利用RT-PCR技术分析了目的基因表达情况。结果如图11所示，表明基本上在质粒DNA注射后的整个实验过程中采集的注射部位肌肉组织中，都检测到预期的目的基因的表达。至少说明目的基因在质粒DNA注射后能维持表达1个月。图11中，Gln1代表pGEM-wt-sGhln，数字表示质粒DNA注射后天数；Gln5表示pGEM-tmt-sGhln注射后30天；—，未加反转录酶；M，分子量标记(Marker，PBR322)。
实施例6、多肽药物的动物实验
雄性SPF级Wistar大鼠皮下分别注射固相合成的表7中的猪Ghrelin衍生物，100mg/kg，2次/天，对照组注射生理盐水，每组注射18只。用Ducan’s多重比较方差分析评价猪Ghrelin衍生物注射组与对照组平均日增重之间的显著性差异。其促生长效果如表7所示，表明Ghrelin突变体，短肽及短肽变体能够促进大鼠生长，增重效果明显。表7中，结果表示为平均数(Mean)±平均标准误(Standard error，SE)，*p≤0.05，表示差异显著。
表7.多肽药物的效果(#表示酰酯化)
猪Ghrelin衍生物 注射3天后平均增重 注射5天后平均增重 注射7天后平均增重 注射10天后平均增重
N端第3位氨基酸残基为色氨酸的猪Ghrelin 24.3±1.13g 41.2±2.14g 58.6±3.24g 84.6±5.19g
 GSSF  22.1±0.98g  37.3±1.93g  51.3±2.43g  75.3±4.15g
 GS#SF  22.8±1.03g  39.2±2.03g  55.1±3.10g  79.5±4.02g
 GSWF  23.2±1.01g  38.8±1.87g  54.9±3.69g  79.3±3.95g
 GSSFLSPK  22.7±1.20g  38.1±1.74g  52.3±2.89g  76.0±4.34g
 GS#SFLSPK  24.6±1.15g  41.7±2.10g*  59.6±3.13g*  83.5±4.21g*
 GSWFLSPK  23.8±1.17g  41.0±1.79g*  58.9±3.27g*  84.3±4.43g*
 对照  22.3±1.12g  37.5±1.65g  52.2±2.24g  75.4±4.32g
序列表
<160>7
<210>1
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
Met Pro Ser Thr Gly Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Val Leu
1               5                   10                  15
Leu Met Ala Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu
            20                  25                  30
His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys
        35                  40                  45
Leu Lys Pro Arg
    50
<210>2
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
Met Pro Ser Thr Gly Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Val Leu
1               5                   10                  15
Leu Met Ala Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Trp Phe Leu Ser Pro Glu
            20                  25                  30
His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys
        35                  40                  45
Leu Lys Pro Arg
    50
<210>3
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
Met Pro Ser Thr Gly Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Val Leu
1               5                   10                  15
Leu Met Ala Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Lys
            20                  25                  30
<210>4
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
Met Pro Ser Thr Gly Thr Ile Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Val Leu
1               5                   10                  15
Leu Met Ala Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Trp Phe Leu Ser Pro Lys
            20                  25                  30
<210>5
<211>59
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
Met Pro Leu Trp Val Phe Phe Phe Val Ile Leu Thr Leu Ser Asn Ser
1               5                   10                  15
Ser His Cys Ser Pro Pro Pro Pro Leu Thr Leu Arg Met Arg Arg Gly
            20                  25                  30
Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys Glu
        35                  40                  45
Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg
    50                  55
<210>6
<211>59
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
Met Pro Leu Trp Val Phe Phe Phe Val Ile Leu Thr Leu Ser Asn Ser
1               5                   10                  15
Ser His Cys Ser Pro Pro Pro Pro Leu Thr Leu Arg Met Arg Arg Gly
            20                  25                  30
Ser Trp Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys Glu
        35                  40                   45
Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg
    50                  55
<210>7
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
Met Pro Leu Trp Val Phe Phe Phe Val Ile Leu Thr Leu Ser Asn Ser
1               5                   10                  15
Ser His Cys Ser Pro Pro Pro Pro Leu Thr Leu Arg Met Arg Arg Gly
            20                  25                  30
Ser Trp Phe Leu Ser Pro Lys
        35

Claims (6)

1、猪Ghrelin衍生物，其氨基酸序列如SEQ ID №：1、SEQ ID №：3或SEQ ID№：4所示。
2、编码权利要求1所述猪Ghrelin衍生物的基因。
3、含有权利要求2所述基因的表达载体。
4、含有权利要求2所述基因的转基因细胞系。
5、一种通过调节GH的释放从而具有促进哺乳动物增重功能的基因药物，它的活性成分为编码猪Ghrelin衍生物的基因；所述猪Ghrelin衍生物的氨基酸序列如SEQ ID№：1、SEQ ID №：3或SEQ ID №：4所示。
6、一种通过调节GH的释放从而具有促进哺乳动物增重功能的多肽药物，它的活性成分为猪Ghrelin衍生物或其可溶性盐；所述猪Ghrelin衍生物的氨基酸序列如SEQID №：1、SEQ ID №：3或SEQ ID №：4所示。
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