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WO2001075149A2 - Biosensor, biosensor-array und verfahren zum ermitteln makromolekularer biopolymere mit einem biosensor - Google Patents

Biosensor, biosensor-array und verfahren zum ermitteln makromolekularer biopolymere mit einem biosensor Download PDF

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WO2001075149A2
WO2001075149A2 PCT/DE2001/001240 DE0101240W WO0175149A2 WO 2001075149 A2 WO2001075149 A2 WO 2001075149A2 DE 0101240 W DE0101240 W DE 0101240W WO 0175149 A2 WO0175149 A2 WO 0175149A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
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electrode
biosensor
electrodes
electrical potential
probe molecules
Prior art date
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Ceased
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PCT/DE2001/001240
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English (en)
French (fr)
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Inventor
Roland Thewes
Werner Weber
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Infineon Technologies AG
Original Assignee
Infineon Technologies AG
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Publication date
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Priority to US10/239,481 priority patent/US7223330B2/en
Priority to EP01927636A priority patent/EP1272849A2/de
Publication of WO2001075149A2 publication Critical patent/WO2001075149A2/de
Publication of WO2001075149A3 publication Critical patent/WO2001075149A3/de
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry

Definitions

  • the invention relates to a biosensor, a biosensor array and a method for determining macromolecular biopolymers using a biosensor
  • Such a biosensor such a biosensor array and such a method are known from [1] and [4].
  • the sensor 200 has two electrodes 201, 202 made of gold, which are embedded in an insulator layer 203 made of insulator material. Electrode connections 204, 205 are connected to the electrodes 201, 202, to which the electrical potential applied to the electrode 201, 202 can be supplied. The electrodes 201, 202 are arranged as planar electrodes. DNA probe molecules 206 are immobilized on each electrode 201, 202 (cf. FIG. 2a). The immobilization takes place according to the so-called gold-sulfur coupling.
  • the analyte to be examined for example an electrolyte 207, is applied to the electrodes 201, 202.
  • the electrolyte 207 contains DNA strands 208 with a sequence that is complementary to the sequence of the DNA probe molecules 206, these DNA strands 208 hybridize with the DNA probe molecules 206 (cf. FIG. 2b).
  • Hybridization of a DNA probe molecule 206 and a DNA strand 208 only takes place if the sequences of the respective DNA probe molecule 206 and the corresponding DNA strand 208 are complementary to one another. If this is not the case, no hybridization takes place.
  • a DNA probe molecule of a given sequence is only able to have a specific one, namely the DNA strand complementary sequence to bind, ie reindeer with him hybridization ⁇ .
  • the value of the impedance between the electrodes 201 and 202 changes, as can be seen from FIG. 2b.
  • This changed impedance is obtained by applying an alternating voltage with an amplitude of approximately 50 mV to the electrode connections 204, 205 and the resulting current is determined by means of a connected measuring device (not shown).
  • the capacitive component of the impedance between the electrodes 201, 202 decreases. This is due to the fact that both the DNA probe molecules 206 and the DNA strands 208, which may hybridize with the DNA probe molecules 206, do not are conductive and thus clearly shield the respective electrodes 201, 202 to a certain extent electrically.
  • Electrodes 201, 202 To improve the measurement accuracy, it is known from [4] to use a large number of electrode pairs 201, 202 and to connect them in parallel, these being clearly arranged with one another so that a so-called interdigital electrode 300 results.
  • the dimension of the electrodes and the distances between the electrodes are of the order of the length of the molecules to be detected, i.e. of DNA strands 208 or below, for example in the range of 200 nm and below.
  • a further procedure for examining the electrolyte with regard to the existence of a DNA strand with a predetermined sequence is known from [2].
  • the DNA strands are labeled with the desired sequence and their existence is determined on the basis of the reflective properties of the labeled molecules.
  • light in the visible wavelength range is radiated onto the electrolyte and that is marked by the electrolyte, in particular by the label to be detected.
  • DNA strand, reflected light is recorded. Due to the reflection behavior, ie in particular due to the errez- th, reflected light beams is determined whether or not the assigning after ⁇ DNA strand with the corresponding predetermined sequence indicative m the electrolyte is contained or not.
  • affinity chromatography cf. [3]
  • immobilized low-molecular molecules in particular ligands of high specificity and affinity
  • ligands of high specificity and affinity to isolate peptides and proteins, e.g. Enzymes to bind specifically in the analyte.
  • the reduct / oxidate recycling process hereinafter also referred to as the redox recycling process, is explained in more detail below with reference to FIGS. 4 a to 4 c.
  • FIG. A shows a biosensor 400 with a first electrode 401 and a second electrode 4C2, which are applied to a substrate 403 as an insulator layer.
  • a holding area designed as a holding layer 404, is applied to the first electrode 401 made of gold.
  • the Haltebe ⁇ rich used to immobilize DNA Sondenmolekulen 405 on the first electrode four hundred and first
  • the sensor 400 is treated with a solution 406 to be examined, e.g. an electrolyte, brought into contact in such a way that any DNA strands contained in the solution 406 to be examined can hybridize with the complementary sequence to the sequence of the DNA probe molecules 405.
  • a solution 406 to be examined e.g. an electrolyte
  • FIG. B shows the case where the DNA strand 407 to be detected is contained in the solution 406 to be examined and is hybridized to the DNA probe molecules 405.
  • the DNA strands 407 in the solution to be examined are marked with an enzyme 408, with which it is possible to cleave m partial molecules described below.
  • a significantly larger number of DNA probe molecules 405 is usually provided than the DNA strand 407 to be determined is contained in the solution 406 to be examined.
  • the biosensor 400 is rinsed, whereby the non-hybridized DNA strand is removed and the biosensor 400 from it investigating solution 406 is cleaned.
  • An electrically uncharged substance is added to this rinsing solution used for the rinsing or another solution specifically supplied in a further phase, which contains molecules which can be cleaved by the enzyme on the hybridized DNA strands 407, m a first partial muscle of a negative first electrical charge and m is a second sub-molecule of a positive second electrical charge.
  • the negatively charged partial molecules are drawn to the positively charged anode, as indicated by the arrow 411 in FIG. C.
  • the negatively charged first sub-molecules 410 are oxidized on the first electrode 401, which has a positive electrical potential as an anode, and are oxidized as sub-molecules 413 on the negatively charged cathode, i.e. pulled the second electrode 402 where they are reduced again.
  • the reduced sub-molecules 414 in turn migrate to the first electrode 401, i.e. to the anode.
  • the electrical parameter that is evaluated with this method is the change in the electrical current as a function of the time t, as shown in the diagram 500 m in FIG. 5.
  • the resulting curve profile 503 has an offset current I 0 ff Set 504 which is independent of the time profile.
  • the offset current I offset 504 is generated by parasitic An ⁇ parts due to the biosensor Gallidealitaten 400th
  • An essential cause for the offset current I 0 ff S e-504 is that the first electrode 401 is not completely covered with DNA probe molecules 405.
  • the first electrode 401 is completely covered with DNA probe molecules 405, there would only be a purely capacitive electrical one between the first electrode 401 and the electrically conductive solution 406 to be examined, due to the so-called double-layer capacity that is created by the immobilized DNA probe molecules 405 Coupling.
  • the incomplete coverage leads to parasitic current paths between the first electrode 401 and the solution 406 to be examined, which also have ohmic components, among other things.
  • the first electrode 401 in order to enable the oxide / reduct process, the first electrode 401 must not be completely covered with the DNA probe molecules 405 so that the electrically charged partial molecules, i.e. the negatively charged first partial molecules are attracted to the first electrode 401 at all.
  • the covering of the first electrode 401 with DNA probe molecules 405 should be as dense as possible.
  • both electrodes 401, 402 must always provide a sufficiently large amount of space for the oxidation / reduction process as part of the redox recycling process.
  • the invention is therefore based on the problem of determining macromolecular biopolymers with increased accuracy in the context of a redox recycling process.
  • the problem is solved by the biosensor, the biosensor array, and by the method for determining macromolecular biopolymers with a biosensor with the features according to the independent patent claims.
  • a biosensor has a first electrode which has a holding area for holding probe molecules which can bind macromolecular biopolymers. Furthermore, the biosensor has a second and a third electrode. The second electrode and the third electrode are designed in such a way that the reduction / oxidation process takes place in the context of a reduction / oxidation recycling process on the second electrode and on the third electrode.
  • the first electrode is covered with a considerably greater density of probe molecules, as a result of which the parasitic effects described above when the changing current is determined by the biosensor are avoided.
  • a biosensor array can have a large number of first electrodes, each of which has a holding area for holding probe molecules which can bind macromolecular biopolymers.
  • a large number of second electrodes and a large number of number of third electrodes provided.
  • Each of the second elec trodes ⁇ and the third electrodes are configured such that the Redukt ⁇ ons- / Ox ⁇ dat ⁇ ons process takes place as part of the redox R ecyclmg operation on the second electrodes and the third electrodes.
  • a biosensor In a method for determining macromolecular biopolymers with a biosensor, a biosensor is used with a first electrode that has a holding area for holding probe molecules that can bind macromolecular biopolymers, as well as a second electrode and a third electrode.
  • a solution to be examined is brought into contact with the biosensor.
  • the solution can contain the macromolecular biopolymers to be detected. If the macromolecular biopolymers are contained in the solution to be examined, they bind to the probe molecules immobilized on the holding area of the first electrode, which can each bind the macromolecular biopolymers.
  • the bound macromolecular biopolymers are or are labeled with an enzyme, for example after binding, for example after hybridization of the DNA strand.
  • the biosensor is rewound with a rinsing solution so that the solution to be examined and thus not hybridized, i.e. unbound macromolecular biopolymers are removed from the biosensor.
  • a further solution which can also be formed by adding a substance to the flush solution, is brought into contact with the biosensor.
  • the further solution contains molecules that can be cleaved by the enzyme on the macromolecular biopolymers.
  • one fissile molecule is split up into a first sub-molecule of a first charge and m second sub-molecule of a second electrical charge.
  • the first Molmolekul is oxidized at the third electrode or reduced and the Oxidized or reduced first Molekul is reduced at the second electrode or oxidized, so that a redox Recyc ⁇ lmg operation between the third electrode and the second electrode is carried out ,
  • the macromolecular biopolymers are determined, i.e. the course of the circulating current of the redox recycling process is determined, for example as in the prior art, and the number of bound macromolecular biopolymers on the first electrode is determined therefrom.
  • this means that such a biosensor provides both qualitative and quantitative information about the DNA content of a solution to be examined.
  • an enzyme of the class of the NADH-independent dehydrogenases or also an enzyme of the class of the phenol oxidases can be used as the enzyme.
  • the concentration of the reduction / oxidation process on the second electrode and the third electrode can be ensured, for example, by the first electrode having a first electrical potential, the second electrode having a second electrical potential and the third electrode having a third electrical potential ,
  • the third electrical potential can be selected such that during the redox recycling process, the reduction or oxidation takes place only at the second and third electrodes.
  • this is achieved in that the third electrical potential is greater than the first electrical potential and that the first electrical potential is greater than the second electrical potential.
  • the holding area of the first electrode can be coated with a material that can immobilize probe molecules.
  • the holding area can thus have, for example, one of the following materials:
  • the holding portion may be staltet both for holding ligand been ⁇ with which peptides or proteins can be bound and for maintaining DNA Sondenmolekulen with which DNA molecules can be bound.
  • the electrodes can be arranged in an interdigital electrode arrangement, as described for example in [4], the third electrode being arranged in each case between the first and the second electrode.
  • the electrodes are arranged in a circle concentrically around one another, the third electrode being arranged in each case between the first electrode and the second electrode.
  • first electrode and the second electrode and / or the third electrode can be arranged relative to one another in such a way that between the first electrode and the second electrode and / or third electrode there are essentially non-curved field lines between the first electrode and the second electrode and / or the electrical field generated by the third electrode.
  • Macromolecular biopolymers are, for example, proteins or peptides or DNA strands of a given sequence.
  • the macromolecular biopolymer can be labeled with the enzyme in advance.
  • the immobilized molecules are ligands, for example active substances with a possible binding activity, which the proteins or peptides to be detected are the j e election electrode tie on which the corresponding ligands are arranged.
  • Enzyme agonists or enzyme antagonists pharmaceuticals, sugars or antibodies or any molecule which has the ability to specifically bind proteins or peptides can be considered as ligands.
  • DNA strands of a given sequence are to be used as macromolecular biopolymers, which are to be detected by means of the biosensor, then DNA strands of a given sequence with DNA probe molecules with the sequence complementary to the sequence of the immobilized DNA strand can be used as Molecules are hybridized on the first electrode.
  • a probe molecule is understood to mean both a ligand and a DNA probe molecule.
  • the holding area can be designed to hold probe molecules with which peptides or proteins can be bound.
  • the holding area can be designed to hold DNA probe molecules with which DNA molecules can be bound.
  • FIG. 1 shows a sketch of a biosensor according to an exemplary embodiment of the invention
  • Figures 2a and 2b show a sketch of two planar, with the existence ⁇ to be detected or their DNA strands can Skinexi ⁇ tenz means of which an electrolyte (Figure 2a) (2b) can be detected;
  • FIG. 3 interdigital electrodes according to the prior art.
  • FIGS. 4a to 4c sketches of a biosensor according to the prior art, on the basis of which individual conditions are explained in the context of the redox recycling process;
  • Figure 5 shows a functional curve of a circulating current according to the
  • FIG. 6 shows an interdigital electrode arrangement according to an exemplary embodiment of the invention
  • FIG. 7 shows a biosensor according to an exemplary embodiment of the invention
  • FIG. 8 shows a cross section of a biosensor with two electrodes which are arranged as an interdigital electrode arrangement
  • FIGS. 9a to 9d cross-sectional views of an interdigital electrode in four process states in a manufacturing process of a biosensor according to an exemplary embodiment of the invention
  • FIGS. 10a to 10c cross-sectional views of a biosensor during individual method steps of the manufacturing method of an electrode of the biosensor according to a further exemplary embodiment of the invention
  • FIGS. 11a to 11c cross-sectional views of a biosensor during individual process steps in the manufacture lungsvon an electrode of the biosensor according to another exemplary embodiment of the invention
  • FIGS. 12a to 12c each show a cross section of a biosensor at different times during the manufacturing process according to a further exemplary embodiment of the invention.
  • FIG. 13 shows a plan view of a biosensor array according to an exemplary embodiment of the invention with cylindrical electrodes
  • FIG. 14 shows a plan view of a biosensor array according to an exemplary embodiment of the invention with cuboid electrodes
  • FIG. 15 shows a cross-sectional view of a biosensor according to a further exemplary embodiment of the invention.
  • FIG. 16 shows a cross-sectional view of a biosensor according to a further exemplary embodiment of the invention.
  • FIGS. 17a to 17g cross-sectional views of a biosensor during individual method steps of a manufacturing process according to a further exemplary embodiment of the invention.
  • FIG. 18 shows a further electrode arrangement according to a further exemplary embodiment of the invention.
  • FIG. 19 shows a plan view of a biosensor array according to an exemplary embodiment of the invention with cuboid electrodes, to which the electrodes are shown with the electrical potential assigned to them.
  • Fig. L shows a biosensor 100 according to an Ausbowungsbei ⁇ play of the invention.
  • the biosensor 100 includes three electrodes, a first electrode 101, a second electrode 102, and a third Elec trode ⁇ 103rd
  • the electrodes 101, 102, 103 are electrically insulated from one another by means of an insulator material as the insulator layer 104.
  • a holding region 105 is provided on the first electrode 101 for holding probe molecules which can bind macromolecular biopolymers.
  • the probe molecules 106 according to this exemplary embodiment are DNA probe molecules with which DNA strands can hybridize with a sequence complementary to the sequence of the DNA probe molecules.
  • the DNA probe molecules 106 are immobilized on the first electrode 101 made of gold by means of the known gold-sulfur coupling. If another material is used to bind the probe molecules, the material is provided with the corresponding coating material on which the probe molecules can be immobilized.
  • a first S tep a solution to be examined for example an electrolyte
  • the macromolecular biopolymers that may be detected ie the DNA strands that can be hybridized by the DNA probe molecules
  • the biosensor 100 ie in particular with the first electrode 101 with the DNA Probe molecules 106 contacted.
  • This is done in such a way that any DNA strands contained in the solution to be examined can hybridize with the DNA probe molecules.
  • the biosensor 100 is rinsed using a rinsing solution, not shown, i.e. the non-hybridized DNA strands and the solution to be examined are removed.
  • a further solution 109 is brought into contact with the biosensor 100, in particular with the first electrode 101.
  • Fig.l shows the biosensor 100 in the state in which already
  • DNA strands 107 are hybridized with the DNA probe molecules 106.
  • the hybridized DNA strands 107 are each labeled with an enzyme 108 with which the molecules explained in the further solution 109 can be cleaved.
  • enzyme 108 can be, for example
  • Tyrosinase • or related enzymes can be used.
  • low molecular weight enzymes can ensure the highest conversion efficiency and therefore the highest sensitivity.
  • the further solution 109 thus contains molecules 110 which can be cleaved by the enzyme 108, a first sub-molecule 111 with a negative electrical charge and m a second sub-molecule with a positive electrical charge.
  • An electrical potential is applied to each of the electrodes 101, 102, 103.
  • a first electrical potential V (E1) is thus applied to the first electrode 101, a second electrical potential V (E2) to the second electrode 102 and a third electrical potential V (E3) to the third electrode 103.
  • ⁇ is a dependent on the Vorzei ⁇ surfaces of the charge, each of the following potential gradient of the elec- trical potentials to the electrodes 101, 102 , 103 laid out in such a way that:
  • the third electrode 103 has a positive electrical potential V (E3), then the third electrode 103 has the greatest electrical potential of the electrodes 101, 102, 103 of the biosensor 100.
  • the first electrode 101 is now no longer used both as a holding electrode for holding the probe molecules and as a measuring electrode for oxidizing or reducing the respective partial molecules.
  • the third electrode 103 now clearly performs the function of the electrode on which the oxidation or reduction of the partial molecules generated takes place.
  • a n of the third electrode 103 is carried out an oxidation of the nega ⁇ tively charged partial molecules 111 and the oxidized first partial molecules 112 are drawn to the second electrode 102, since this is the smallest electrical potential V (E2) of all electron trodes 101, 102, 103 in the biosensor 100.
  • the oxidized sub-molecules are reduced at the second electrode 102 and the reduced sub-molecules 113 are in turn pulled towards the third electrode 103, where again oxidation takes place.
  • the electrodes can be arranged on an biosensor 600 as interdigital electrodes, the third electrode 603 being arranged between the first electrode 601 and the second electrode 602.
  • the first electrodes 601, the second electrodes 602 and the third electrodes 603 are each connected in parallel and coupled to a first electrical connection 604, a second electrical connection 605 and a third electrical connection 606, respectively.
  • the invention is not limited to the determination of DNA strands, but that macromolecular biopolymers can be determined in general, and in the event that proteins or peptides are to be determined, the probe molecules are designed as ligands which are associated with can bind to proteins or peptides.
  • the biosensor 100, 600 can also be used in a biosensor array with a large number of such biosensors.
  • Each point that forms an element of the biosensor array as an electrode has the property described above. It is only necessary to ensure that the first electrode, to which probe molecules are immobilized or can be immobilized, are electrically shielded from the split submolecules.
  • a different number of electrodes which according to the exemplary embodiment from FIG. 1 correspond to the first electrode 101, the second electrode 102 and the third electrode 103, can be distributed in different densities via a biosensor, provided that the shielding The first electrode is guaranteed by the split submolecules as part of the redox recycling process.
  • the measurement can also be carried out as a function of locally varying electrode potentials. Different density distributions of the functionally different electrodes are also possible in the context of a biosensor array.
  • the biosensor chip 700 has a first electrode 701 and a second electrode 702, which are arranged on an insulator layer 703 in such a way that the first electrode 701 and the second electrode 702 are electrically insulated from one another.
  • the first electrode 701 is coupled to a first electrical connection 704, and the second electrode 702 is coupled to a second electrical connection 705.
  • the electrodes 701, 702 have a cuboid structure, with a first electrode surface 706 of the first electrode 701 and a first electrode surface 707 of the second electrode 702 being oriented essentially parallel to one another.
  • the electrodes 701, 702 have side walls 706, 707 which are essentially perpendicular with respect to the surface 708 of the insulator layer 703 and which form the first electrode surface 706 of the first electrode 701 or the first electrode surface 707 of the second electrode 702 ,
  • a field line course m t field lines 709 is generated by the electrode surfaces 706, 707 which are oriented essentially parallel to one another and which are essentially uncurved between the surfaces 706, 707.
  • Curved field lines 710 result only between a second electrode surface 711 of the first electrode 701 and a second electrode surface 712 of the second electrode 702, which each form the upper surfaces for the electrodes 701, 702, and an edge region 713 between the electrodes 701, 702.
  • the first electrode surfaces 706, 707 of the electrodes 701, 702 are holding regions for holding probe molecules, which can bind macromolecular biopolymers, which are to be detected by means of the biosensor 700.
  • the electrodes 701, 702 are made of gold.
  • Covalent connections are made between the electrodes and the probe molecules, the sulfur being present to form a gold-sulfur coupling in the form of a sulfide or a thiol.
  • DNA probe molecules are used as probe molecules, such sulfur functionalities are part of a modified nucleotide, which by means of phosphoramidite chemistry during an automated DNA synthesis process at the 3 'end or at the 5' end of the DNA to be immobilized - Strangs is installed.
  • the DNA probe molecule is thus immobilized at its 3 'end or at its 5' end.
  • the sulfur functionalities are formed by one end of an alkyl linker or an alkylene linker, the other end of which has a chemical functionality suitable for the covalent connection of the ligand, for example a hydroxyl radical, an acetoxy radical or one Succinimidyl ester residue.
  • the electrodes i.e. In particular, the holding areas are covered with an electrolyte 714, generally with a solution to be examined, during the measuring insert.
  • the solution 714 to be examined contains the macromolecular biopolymers to be recorded, for example DNA strands to be recorded with a predetermined sequence, which olecules on the electrodes with the immobilized DNA probes can hybridize, the DNA strands hybridize with the DNA probe molecules.
  • the solution 714 to be examined does not contain any DNA strands with the sequence complementary to the sequence of the DNA probe molecules, then no DNA strands from the solution 714 to be examined can hybridize with the DNA probe molecules on the electrodes 701, 702.
  • a redox recycling process will be started between the electrodes 701, 702 and the number of labeled hybridized DNA strands, generally the labeled bound macromolecular biopolymers, will be determined.
  • FIG. 8 shows a biosensor 800 with a further electrode configuration according to a further exemplary embodiment of the invention.
  • the biosensor 800 has two electrodes 701, 702 which are applied to the insulator layer 703.
  • the two electrodes according to the biosensor 800 shown in FIG. 8 are arranged as a plurality of alternately arranged, parallel-connected electrodes in the form of the known interdigital electrode arrangement.
  • FIG. 8 also shows a schematic electrical equivalent circuit diagram which shows the representation of the biosensor 800.
  • Fig.9a shows a silicon substrate 900 as it is produced for known CMO ⁇ processes.
  • an insulator layer 901 which also serves as a passivation layer, is of sufficient thickness, according to the exemplary embodiment, in a thickness of 500 n, by means of a CVD -Procedure applied.
  • the insulator layer 901 can be made from silicon oxide SiO or silicon nitride Si 3 N ⁇ .
  • the interdigital arrangement of the biosensor 800 according to the exemplary embodiment shown above is defined by means of photolithography on the insulator layer 901.
  • the insulator layer 901 produces steps 902, i.e. etched, according to the exemplary embodiment, a minimum height 903 of approximately 100 nm.
  • steps 902 i.e. etched, according to the exemplary embodiment, a minimum height 903 of approximately 100 nm.
  • the height 903 of the steps 902 uss must be sufficiently large for a subsequent self-locking process for forming the metal electrode.
  • a vapor deposition method or a sputtering method can also be used to apply the insulator layer 901.
  • Em angle 906 of the S tufenflanken measured to the surface of the insulator layer 901 should be in accordance with the exemplary embodiment of degree at least 50th
  • the thickness of approximately 10 nm made of titanium is deposited onto the step-shaped insulator layer 901.
  • the auxiliary layer 904 can have tungsten and / or nickel-chromium and / or molybdenum.
  • a metal layer 907 made of gold grows up porously at the edges 905 of the steps 902 in such a way that it is possible, in a further method step, to pass one column at each step 908 m to etch the gold layer 907 applied over the entire surface.
  • the gold layer 907 for the biosensor 800 is applied.
  • the gold layer has a thickness of approximately 500 nm to approximately 2000 nm.
  • the thickness of the gold layer 907 it can only be ensured that the thickness of the gold layer 907 is sufficient so that the gold layer 907 grows porous and columnar.
  • openings 908 m are etched through the gold layer 907, so that gaps form.
  • the gaps 908 are formed depending on the duration of the etching process.
  • the duration of the etching process is the base width, i.e. determines the distance 909 between the gold electrodes 910, 911 that are formed.
  • the wet etching is ended.
  • the etching takes place much faster in the direction parallel to the surface of the insulator layer 901 than in the direction perpendicular to the surface of the insulator layer 901.
  • noble metals such as platinum, titanium or silver can also be used, since these materials can also have holding areas or can be coated with a suitable material for holding immobilized DNA probe molecules or in general for holding probe molecules, and have columnar growth on vapor deposition.
  • the structure according to this exemplary embodiment has the particular advantage that the self-adjusting opening of the gold layer 907 over the edges 905 means that the distance between the electrodes 910, 911 is not tied to a minimal resolution of the manufacturing process, ie the distance 909 Zvi ⁇ rule the electrodes 910, 911 can be kept very narrow.
  • the result of this method is the biosensor 800 according to the exemplary embodiment shown in FIG. 8 with the corresponding metal electrodes.
  • a substrate 1001 is assumed, for example a silicon substrate wafer (cf. FIG. 10 a), on which a metallization 1002 is already provided as an electrical connection, wherein an etch stop layer 1003 made of silicon nitride Si 3 N 4 is already applied to the substrate 1001.
  • a metal layer 1004, in accordance with the exemplary embodiment a gold layer 1004, is applied to the substrate by means of a vapor deposition process.
  • a sputtering process or a CVD process can be used to apply the gold layer 1004 to the etch stop layer 1003.
  • the metal layer 1004 comprises the metal from which the electrode to be formed is to be formed.
  • an electrically insulating auxiliary layer 1005 made of silicon oxide SiO : is applied by means of a CVD method (alternatively by means of a vapor deposition method or a sputtering method).
  • a lacquer structure is formed from a lacquer layer 1006, for example a cuboid structure, which corresponds to the shape of the electrode to be formed.
  • a lacquer structure is produced by means of photolithography, the structure of which corresponds to the electrodes to be formed, which form the biosensor array.
  • the lacquer layer 1006 After application of the lacquer layer 1006 and the corresponding exposure, which specifies the corresponding lacquer structures, the lacquer layer in the not "developed", i.e. unexposed areas, for example by means of ashing or wet chemical removal.
  • the auxiliary layer 1005 is also removed in the areas not protected by the photoresist layer 1006 by means of a wet etching process or a dry etching process.
  • a further metal layer 1007 is used as an electrode layer in such a way that the side surfaces 1008, 1009 of the remaining auxiliary layer 1005 are covered with the electrode material, according to the exemplary embodiment with gold (see Fig.10b).
  • the application can take place by means of a CVD method or a sputtering method, or S with an ion metal plasma process.
  • a spacer etching is carried out, in which the desired structure of the electrode 1010 is formed by targeted overetching of the metal layers 1004, 1007.
  • the electrode 1010 thus has the spacers 1011, 1012 not etched away in the etching step of the etching of the metal layers 1004, 1007 and the part of the first metal layer 1004 which is arranged directly below the remaining auxiliary layer 1005 and which has not been etched away by means of the etching process.
  • the electrode 1010 is connected to the electrical connection, i.e. the metallization 1002 electrically coupled.
  • the auxiliary layer 1005 made of silicon oxide can, if required, be removed by further etching, for example in plasma or wet-chemical, by means of a method in which selectivity for the etching stop layer 1003 is given.
  • auxiliary layer 1005 consists of silicon oxide and the etching stop layer 1003 has silicon nitride.
  • Spacers 1011, 1012 and the surface 1014 of the etch stop layer 1003 are thus determined by the steepness of the flanks of the remaining auxiliary layer 1005, ie in particular the steepness of the lacquered flanks 1015, 1016 of the structured lacquer layer 1006.
  • 11a to 11c show a further possibility for producing an electrode with essentially vertical walls.
  • a substrate 1101 is assumed, on which a metallization 1102 is already provided for the electrical connection of the electrode of the biosensor to be formed.
  • a metal layer 1103 as an electrode layer is evaporated on the substrate 1101 made of silicon, the metal layer 1103 having the material to be used for the electrode, gold according to this exemplary embodiment.
  • the metal layer 1103 can also be applied to the substrate 1101 by means of a sputtering process or by means of a CVD process.
  • a photoresist layer 1104 is applied to the metal layer 1103 and structured by means of photclithography technology in such a way that a lacquer structure is formed which, after developing and removing the developed areas, corresponds to the lateral dimensions of the electrode to be formed or, in general, of the biosensor array to be formed.
  • the thickness of the photoresist layer 1104 essentially corresponds to the height of the electrodes to be produced.
  • the material is removed according to this embodiment by means of physical. Sputter removal.
  • the electrode material from the metal layer 1103 is sputtered in a redeposition process onto the substantially vertical side walls 1105, 1106 of the structured lacquer elements, which have not been removed after the developed lacquer structure has been incinerated, where it is no longer exposed to any further sputter attack.
  • Redeposition of electrode material on the lacquer structure protects the lacquer structure from further removal.
  • side layers 1107, 1108 are formed on the side walls 1105, 1106 of the lacquer structure from the electrode material, according to the exemplary embodiment from gold.
  • the side layers 1107, 1108 are electrically coupled to a non-removed part 1109 of the metal layer 1103, which is located immediately below the rest of the lacquer structure 1106, and also to the metallization 1103 (cf. FIG. 11b).
  • the lacquer structure 1106, i.e. the photoresist, which is located in the volume formed by the side layers 1107, 1108 and the remaining metal layer 1109, is removed by ashing or by wet chemical means.
  • FIGS. 12a to 12c show a further exemplary embodiment of the invention with cylindrical electrodes protruding perpendicularly on the substrate.
  • Electrodes which are arranged essentially vertically on a substrate 1201 made of silicon oxide, a metal layer 1202 is applied as an electrode layer made of the desired electrode material, according to the exemplary embodiment made of gold, by means of a vapor deposition method.
  • a photoresist layer is applied to the metal layer 1202 and the photoresist layer is exposed by means of a mask such that the cylindrical structure 1203 shown in FIG. 12a results on the metal layer 1202 after removal of the unexposed areas.
  • the cylindrical structure 1203 has a photoresist torus 1204 and a cylindrical photoresist ring 1205 which is arranged concentrically around the photoresist torus 1204.
  • the photoresist between the photoresist torus 1204 and the photoresist ring 1205 is removed, for example by means of welding or wet-chemical means.
  • a metal layer 1206 is applied around the photoresist torus 1204 by means of a redeposition process.
  • an inner metal layer 1207 forms around the photoresist ring 1205 (cf. FIG. 12b).
  • the structured photoresist material is removed by ashing or wet-chemical so that two cylindrical electrodes 1208, 1209 are formed.
  • the substrate 1201 is removed so far, for example by means of a plasma etching process that is selective with respect to the electrode material, that the metallizations in the substrate are exposed and electrically couple with the cylindrical electrodes.
  • the inner cylindrical electrode 1208 is thus electrically coupled to a first electrical connection 1210 and the outer cylindrical electrode 1209 is electrically coupled to a second electrical connection 1211.
  • the remaining metal layer 1202 which has not yet been removed by the sputtering between the cylindrical electrodes 1208, 1209, is removed in a last step by means of a sputter etching process.
  • the metal layer 1202 is also removed in this way.
  • the metallizations for the electrical connections 1210, 1211 are already provided in the substrate 1201 at the beginning of the method according to this exemplary embodiment.
  • FIG. 13 shows a top view of a biosensor array 1300, in which cylindrical electrodes 1301, 1302 are contained.
  • Each first electrode 1301 has a positive electrical potential. Every second electrode 1302 of the biosensor array 1300 has a negative electrical potential with respect to the respective adjacent first electrode 1301.
  • the electrodes 1301, 1302 are arranged in rows 1303 and columns 1304.
  • first electrodes 1301 and the second electrodes 1302 are arranged alternately, i.e. a second electrode 1302 is arranged directly next to a first electrode 1301, a row 1303 or a column 1304, and a first electrode 1301 is arranged next to a second electrode 1302, respectively in a row 1303 or a column 1304.
  • FIG. 14 shows a further exemplary embodiment of a biosensor array 1400 with a multiplicity of cuboid electrodes 1401, 1402.
  • the arrangement of the cuboid electrodes 1401, 1402 corresponds to the arrangement of the cylindrical electrodes 1301, 1302, as has been shown in FIG. 13 and was explained above.
  • the first electrode 701 is applied to the insulator layer 703 and is electrically coupled to the first electrical connection 704.
  • the second electrode 702 is likewise applied to the insulator layer 703 and is electrically coupled to the second electrical connection 705.
  • the second electrode in accordance with this exemplary embodiment has a different shape than the previously described second electrode.
  • the first electrode is a planar electrode and the second electrode is T-shaped.
  • Each T-shaped second electrode has a first leg
  • the second electrode 702 has second legs 1502 arranged perpendicular to the first leg 1501, which are at least partially arranged above the surface 1503 of the respective first electrode 701.
  • a plurality of first electrodes 701 and a plurality of second electrodes 702 are connected in parallel, so that due to the T-shaped structure of the second electrode tro d e 7 0 2 em forms cavity 1504, which is formed by two juxtaposed second electrodes 702, a first electrode 701 and the insulator layer 703.
  • an opening 1505 is provided for each cavity 1504, which opening is sufficiently large so that when an electrolyte 1506 is applied to the biosensor 1500, the electrolyte and possibly the solution 1506 to be examined, for example an electrolyte , contained DNA strand can pass through the opening 1505 into the cavity 1504.
  • DNA probe molecules 1509 are immobilized on holding areas on the first and second electrodes and can hybridize with the corresponding DNA strands of a predetermined sequence to be detected.
  • Holding the DNA probe molecules 1509 are provided when applying an electric field between the first electrode 701 and the second electrode 702 from essentially uncurved field lines.
  • FIG. 16 shows a biosensor 1600 according to a further exemplary embodiment of the invention.
  • the biosensor 1600 essentially corresponds to the biosensor 1500 explained above and shown in FIG. 15 with the difference that on the side walls of the first leg 1501 the second electrode 702 no holding areas with immobilized DNA probe molecules 1509 are provided, but rather that the surface 1601 of the first legs 1501 of the second electrode 702 are covered with insulator material of the insulator layer 703 or a further insulating layer.
  • 17a to 17g show individual method steps for producing the first electrode 701 and the second electrode 702 m of the biosensors 1500, 1600.
  • a structure m is etched into the insulator layer 703 using a mask layer, for example made of photoresist, the shape of which corresponds to the first electrode 701 to be formed.
  • a layer of the desired electrode material is applied over the entire surface of the insulator layer 703 in such a way that the previously etched structure 1701 (cf. FIG. 17 a) is at least completely filled, the structure 1701 also overfilling can be (see Fig.17b).
  • the electrode material 1702, preferably gold, located outside the prefabricated structure 1701 is removed by means of a chemical-mechanical polishing method (cf. FIG. 17c). N ac h completion of the chemical mechanical polishing method is thus the first electrode 701 in the insulator layer flush ⁇ embedded 703rd
  • Electrode material 1702 outside, i.e. between the further second electrodes 702 or between the first electrodes 701 is removed completely.
  • a cover layer 1703 for example made of silicon nitride, can be applied to the first electrode 701 by means of a suitable coating method such as, for example, a CVD method, a sputtering method or a vapor deposition method (cf. FIG. 17d).
  • a suitable coating method such as, for example, a CVD method, a sputtering method or a vapor deposition method (cf. FIG. 17d).
  • Fig. 17e shows several first electrodes 1701 made of gold, which are embedded next to one another in the insulator layer 703 and the cover layer 1703 located thereon.
  • a second electrode layer 1704 is applied to the cover layer 1703.
  • the desired openings 1705 are formed and the second electrode layer 1704 is etched by means of a dry etching process in a downstream plasma in such a way that the desired cavity 1504 is formed in accordance with the biosensors 1500, 1600 shown in FIG. 15 or FIG. 16 (cf. FIG. 17g).
  • the top layer 1703 is not absolutely necessary, but is advantageous in order to protect the first electrodes 701 from etching when the cavity 1504 is formed.
  • the T-shaped structure of the second electrode 702 can be formed by another insulator layer by means of a C-VD method, or other suitable coating method is formed on the first insulator layer or in existence of the top layer 1703 of the top layer 1703, after forming the first electrode 701 according to the above beschrie ⁇ surrounded method. Subsequently, corresponding trenches are formed in the cover layer 1703 and are used to receive the first leg 1501 of the T-shaped structure of the second electrode 702.
  • trenches are filled with the electrode material gold and according to the Damascene method, the electrode material which has formed in the trench and above the second insulator layer is removed by means of chemical mechanical polishing, to a predetermined height, that of the height of the second leg 1502 corresponds to the T-shaped second electrode 702.
  • the opening 1505 is formed between the second electrodes 702 by means of photolithography and then the insulator material is at least partially removed from the volume which is to be formed as a cavity 1504 by means of a dry etching process in a downstream plasma.
  • electrodes can be coated with materials in the holding regions, for example with silicon monoxide or silicon dioxide, which can form a covalent connection with the min, acetoxy, isocyanate, alkysilane residues shown above for immobilizing probe molecules, this variant in particular for immobilizing of ligands.
  • FIG. 18 shows a further electrode arrangement 1800 with a plurality of circular first electrodes 1801, on each of which a holding area for immobilizing probe molecules is contained, Circular second electrodes 1802,
  • the electrodes are alternately arranged concentrically around one another such that a third electrode is arranged between the first electrode and the second electrode.
  • the electrodes can be configured both as planar electrodes and as cylindrical electrodes with essentially vertical side walls, which are produced according to the method described above.
  • FIG. 19 shows a plan view of a biosensor array 1900 in accordance with a further exemplary embodiment of the invention with cylindrical electrodes 1901, 1902, 1903, in which the electrodes are shown with the electrical potential assigned to them.
  • the first electrical potential VI is applied to each first electrode 1901.
  • the second electrical potential V2 is applied to every second electrode 1902.
  • the third electrical potential V3 is applied to every third electrode 1903, in the same manner as has been explained in connection with the exemplary embodiments described above.
  • biosensor array 1900 can also have cuboid electrodes.
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Abstract

Der Biosensor weist drei Elektroden auf, wobei die erste Elektrode eines Haltebereichs zum Halten von Sondenmolekülen aufweist, die makromolekulare Biopolymere binden können. Die zweite Elektrode und die dritte Elektrode sind derart ausgestaltet, dass dere Redox-Prozess im Rahmen eines Redox-Recycling-Vorgangs an der zweiten Elektrode und an der dritten Elektrode erfolgt.

Description

Beschreibung
Biosensor, Biosensor-Array und Verfahren zum Ermitteln makromolekularer Biopolymere mit einem Biosensor
Die Erfindung betrifft einen Biosensor, ein Biosensor-Array sowie ein Verfahren zum Ermitteln makromolekularer Biopolymere mit einem Biosensor
Ein solcher Biosensor, eine solches Biosensor-Array sowie ein solches Verfahren sind aus [1] und [4] bekannt.
Fig.2a und Fig.2b zeigen einen solchen Sensor, wie er in [1] und [4] beschrieben ist. Der Sensor 200 weist zwei Elektroden 201, 202 aus Gold auf, die in einer Isolatorschicht 203 aus Isolatormaterial eingebettet sind. An die Elektroden 201, 202 sind Elektroden-Anschlüsse 204, 205 angeschlossen, an denen das an der Elektrode 201, 202 anliegende elektrische Potential zugeführt werden kann. Die Elektroden 201, 202 sind als Planarelektroden angeordnet. Auf jeder Elektrode 201, 202 sind DNA-Sondenmoleküle 206 immobilisiert (vgl. Fig.2a) . Die Immobilisierung erfolgt gemäß der sogenannten Gold-Schwefel- Kopplung. Auf den Elektroden 201, 202 ist das zu untersuchende Analyt, beispielsweise ein Elektrolyt 207, aufgebracht.
Sind in dem Elektrolyt 207 DNA-Stränge 208 mit einer Sequenz enthalten, die zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle 206 komplementär ist, so hybridisieren diese DNA-Stränge 208 mit den DNA-Sondenmolekülen 206 (vgl. Fig.2b) .
Eine Hybridisierung eines DNA-Sondenmoleküls 206 und eines DNA-Strangs 208 findet nur dann statt, wenn die Sequenzen des jeweiligen DNA-Sondenmoleküls 206 und des entsprechenden DNA- Strangs 208 zueinander komplementär sind. Ist dies nicht der Fall, so findet keine Hybridisierung statt. Somit ist ein DNA-Sondenmolekül einer vorgegebenen Sequenz jeweils nur in der Lage einen bestimmten, nämlich den DNA-Strang mit jeweils komplementärer Sequenz zu binden, d.h. mit ihm zu hybridisie¬ ren.
Findet eine Hybridisierung statt, so verändert sich, wie aus Fig.2b ersichtlich, der Wert der Impedanz zwischen den Elektroden 201 und 202. Diese veränderte Impedanz wird durch Anlegen einer Wechselspannung mit einer Amplitude von ungefähr 50 mV an die Elektroden-Anschlüsse 204, 205 und dem dadurch resultierenden Strom mittels eines angeschlossenen Messgeräts (nicht dargestellt) bestimmt.
Im Falle einer Hybridisierung verringert sich der kapazitive Anteil der Impedanz zwischen den Elektroden 201, 202. Dies ist darauf zurückzuführen, dass sowohl die DNA-Sondenmoleküle 206 als auch die DNA-Stränge 208, die eventuell mit den DNA- Sondenmolekülen 206 hybridisieren, nicht-leitend sind und somit anschaulich die jeweilige Elektrode 201, 202 in gewissem Maße elektrisch abschirmen.
Zur Verbesserung der Messgenauigkeit ist es aus [4] bekannt, eine Vielzahl von Elektrodenpaaren 201, 202 zu verwenden und diese parallel zu schalten, wobei diese anschaulich miteinander verzahnt angeordnet sind, so dass sich eine sogenannte Interdigitalelektrode 300 ergibt. Die Abmessung der Elektro- den und der Abstände zwischen den Elektroden liegen in der Größenordnung der Länge der zu detektierenden Moleküle, d.h. der DNA-Stränge 208 oder darunter, beispielsweise im Bereich von 200 nm und darunter.
Aus [2] ist eine weitere Vorgehensweise zum Untersuchen des Elektrolyts hinsichtlich der Existenz eines DNA-Strangs mit vorgegebener Sequenz bekannt. Bei dieser Vorgehensweise werden die DNA-Stränge mit der gewünschten Sequenz markiert und aufgrund der Reflexionseigenschaften der markierten Moleküle wird deren Existenz bestimmt. Hierzu wird Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich auf das Elektrolyt gestrahlt und das von dem Elektrolyt, insbesondere von dem nachzuweisenden markier- ten DNA-Strang, reflektierte Licht wird erfasst. Aufgrund des Reflexionsverhaltens, d.h. insbesondere aufgrund der erfass- ten, reflektierten Lichtstrahlen wird bestimmt, ob der nach¬ zuweisende DNA-Strang mit der entsprechend vorgegebenen Se- quenz m dem Elektrolyt enthalten ist oder nicht.
Diese Vorgehensweise ist sehr aufwendig, αa eine sehr genau Kenntnis über das Reflexionsverhalten des entsprechenden DNA- Strangs erforderlich ist und weiterhin eine Markierung der DNA-Strange vor Beginn des Verfahrens notwendig ist. Weiterhin ist eine sehr genaue Justierung des Erfassungsmittels zum Erfassen der reflektierten Lichtstrahlen erforderlich, damit die reflektierten Lichtstrahlen überhaupt erfasst werden können .
Somit ist diese Vorgehensweise teuer, kompliziert sowie gegen Storeinflusse sehr empfindlich, wodurch das Messergebnis sehr leicht verfälscht werden kann.
Ferner ist es aus der Äffinitatschromatographie (vgl. [3]) bekannt, immobilisierte niedermolekulare Molek le, insbesondere Liganden hoher Spezifitat und Affinitat, zu verwenden, um Peptide und Proteine, z.B. Enzyme, im Analyt spezifisch zu binden.
Weiterhin sind Grundlagen über ein Reduktιons-/Oxιdatιons- Recyclmg-Verfahren zum Erfassen makromolekularer Biopolymere aus [5] und [6] bekannt.
Das Reduktιons-/Oxιdatιons-Recyclmg-Verfahren, im weiteren auch als Redox-Recyclmg-Verfahren bezeichnet, wird im weiteren anhand der Fig.4a bis Fig.4c naher erläutert.
Fig. a zeigt einen Biosensor 400 mit einer ersten Elektrode 401 und einer zweiten Elektrode 4C2, die aαf einem Substrat 403 als Isolatorschicht aufgeoracht sind. Auf der ersten Elektrode 401 aus Gold ist ein Haltebereich, ausgestaltet als Halteschicht 404, aufgebracht. Der Haltebe¬ reich dient zum Immobilisieren von DNA-Sondenmolekulen 405 auf der ersten Elektrode 401.
Auf der zweiten Elektrode ist kein solcher Haltebereich vorgesehen.
Sollen mittels des Biosensors 400 DNA-Strange mit einer Se- quenz, die komplementär ist zu der Sequenz der DNA-Sondenmolekule 405 erfasst werden, so wird der Sensor 400 mit einer zu untersuchenden Losung 406, z.B. einem Elektrolyt, m Kontakt gebracht derart, dass in der zu untersuchenden Losung 406 eventuell enthaltene DNA-Strange mit der komplementären Sequenz zu der Sequenz der DNA-Sondenmolekule 405 hybridisieren können.
Fig. b zeigt den Fall, dass m der zu untersuchenden Losung 406 die zu erfassenden DNA-Strange 407 enthalten sind und an die DNA-Sondenmolekule 405 hybridisiert sind.
Die DNA-Strange 407 in der zu untersuchenden Losung sind mit einem Enzym 408 markiert, mit dem es möglich ist, im weiteren beschriebene Molekule m Teilmolekule zu spalten.
Üblicherweise ist eine erheblich größere Anzahl von DNA- Sondenmolekulen 405 vorgesehen, als zu ermittelnde DNA- Strange 407 in der zu untersuchenden Losung 406 enthalten sind.
Nachdem die m der zu untersuchenden Losung 406 eventuell enthaltenen DNA-Strange 407 m t dem Enzym 408 mit den immobilisierten DNA-Sondenmolekulen hybnαisiert sind, erfolgt eine Spulung des Biosensors 400, wodurch die nicht hybridisierten DNA-Strange entfernt werden und der Biosensor 400 von der zu untersuchenden Losung 406 gereinigt wird. Dieser zur Spulung verwendeten Spullosung oder m einer weiteren Phase eigens zugefuhrten weiteren Losung wird eine elektrisch ungeladene Substanz beigegeben, die Molekule enthält, die durch das Enzym an den hybridisierten DNA-Strangen 407 gespalten werden kann, m ein erstes Teilmclekul einer negativen ersten elektrischen Ladung und m ein zweites Teil- molekul einer positiven zweiten elektrischen Ladung.
Die negativ geladenen Teilmolekule werden, wie m Fig.4c ge- zeigt ist, zu der positiv geladenen Anode gezogen, wie durch den Pfeil 411 m Fig. c angedeutet ist.
Die negativ geladenen ersten Teilmolekule 410 werden an der ersten Elektrode 401, die als Anode ein positives elektri- sches Potential aufweist, oxidiert und werden als oxidierte Teilmoleküle 413 an die negativ geladene Katode, d.h. die zweite Elektrode 402 gezogen, wo sie wieder reduziert werden.
Die reduzierten Teilmoleküle 414 wiederum wandern zu der er- sten Elektrode 401, d.h. zu der Anode.
Auf diese Weise wird ein elektrischer Kreisstrom generiert, der proportional ist zu der Anzahl der jeweils durch die Enzyme 408 erzeugten Ladungsträger.
Der elektrische Parameter, der bei dieser Methode ausgewertet dl wird, ist die Änderung des elektrischen Stroms —- als Funket tion der Zeit t, wie dies m dem Diagramm 500 m Fig.5 dargestellt ist.
Fig.5 zeigt die Funktion des elektrischen Stroms 501 abhangig von der Zeit 502. Der sich ergebende Kurvenverlauf 503 weist einen Offsetstrom I0ffSet 504 auf, der unabhängig ist vom zeitlichen Verlauf. Der Offsetstrom loffset 504 wird erzeugt durch parasitäre An¬ teile aufgrund von Nichtidealitaten des Biosensors 400.
Eine wesentlicne Ursache für den Offsetstrom I0ffSe- 504 liegt darin, dass die Bedeckung der ersten Elektrode 401 mit DNA- Sondenmolekulen 405 nicht vollständig dicht erfolgt.
Im Falle einer vollständig dichten Bedeckung der ersten Elektrode 401 mit DNA-Sondenmolekulen 405 ergäbe sich aufgrund der sogenannten Doppelschichtkapazitat, die durch die immobilisierten DNA-Sondenmolekule 405 entsteht, zwischen der ersten Elektrode 401 und der elektrisch leitenden zu untersuchenden Losung 406 nur eine rein kapazitive elektrische Kopplung.
Die nicht vollständige Bedeckung fuhrt jedoch zu parasitären Strompfaden zwischen der ersten Elektrode 401 und der zu untersuchenden Losung 406, die unter anderem auch ohmsche Anteile aufweisen.
Um jedoch den Oxιdatιons-/Reduktιons-Prozess zu ermöglichen, darf die Bedeckung der ersten Elektrode 401 mit dem DNA- Sondenmolekulen 405 nicht vollständig sein, damit die elektrisch geladenen Teilmolekule, d.h. die negativ geladenen er- sten Teilmolekule zu der ersten Elektrode 401 überhaupt angezogen werden.
Um andererseits eine möglichst große Sensitivitat eines solchen Biosensors zu erreichen, verbunden mit geringen parasi- taren Effekten, sollte die Bedeckung der ersten Elektrode 401 mit DNA-Sondenr.olekulen 405 möglichst dicht sein.
Um eine hohe Reproduzierbarkeit der mit einem solchen Biosensor 400 bestimmten Messwerte zu erreichen, müssen beide Elek- troden 401, 402 stets ein hinreichend großes Flachenangebot für den Oxιdatιons-/Reduktιons-Prozess m Rahmen des Redox- Recyclmg-Vorgangs bereitstellen. Bei dem Biosensor gemäß den? Stand der Technik, ergibt sich somit eine gewisse Messunsicherheit beim Ermitteln der DNA- Strange m einer zu untersuchenden Losung.
Somit liegt der Erfindung das Problem zugrunde, im Rahmen eines Redox-Recyclmg-Vorgangs makromolekulare Biopolymere mit erhöhter Genauigkeit zu ermitteln.
Das Problem wird durch den Biosensor, das Biosensor-Array, sowie durch das Verfahren zum Ermitteln makromolekularer Biopolymere mit einem Biosensor mit den Merkmalen gemäß den unabhängigen Patentansprüchen gelost.
Ein Biosensor weist eine erste Elektrode auf, die einen Haltebereich zum Halten von Sondenmolekulen aufweist, die makromolekulare Biopolymere binden können. Ferner weist der Biosensor eine zweite und eine dritte Elektrode auf. Die zweite Elektrode und die dritte Elektrode sind derart ausgestaltet, dass der Reduktιons-/Oxιdatιons-Prozess im Rahmen eines Re- duktιons-/Oxιdatιons-Recyclmg-Vorgangs an der zweiten Elektrode und an der dritten Elektrode erfolgt.
Auf diese Weise wird erreicht, dass der Reduktιons-/Oxιda- tions-Prozess nicht mehr an der ersten Elektrode, die mit den Sondenmolekulen bedeckt ist, erfolgen muss.
Auf diese Weise wird eine Bedeckung der ersten Elektrode mit einer erheblich größeren Dichte von Sondenmolekulen errnog- licht, wodurch die oben beschriebenen parasitären Effekte beim Ermitteln des sich ändernden Stroms durch den Biosensor vermieden werden.
Ein Biosensor-Array kann eine Vielzahl erster Elektroαen, die jeweils einen Haltebereich zum Halten von Sondenmolekulen aufweisen, die makromolekulare Biopolymere binden können. Ferner sind eine Vielzahl zweiter Elektroden und eine Viel- zahl dritter Elektroden vorgesehen. Jeweils die zweiten Elek¬ troden und die dritten Elektroden sind derart ausgestaltet, dass der Reduktιons-/Oxιdatιons-Prozess im Rahmen des Redox- Recyclmg-Vorgangs an den zweiten Elektroden und an den drit- ten Elektroden erfolgt.
Bei einem Verfahren zum Ermitteln makromolekularer Biopolymere mit einem Biosensor, wird ein Biosensor verwendet mit einer ersten Elektrode, die einen Haltebereich zum Halten von Sondenmolekulen aufweist, die makromolekulare Biopolymere binden können, sowie eine zweite Elektrode und eine dritte Elektrode.
Eine zu untersuchenden Losung wird mit dem Biosensor in Kon- takt gebracht. Die Losung kann die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthalten. Sind in der zu untersuchenden Losung die makromolekularen Biopolymere enthalten, so binden diese an die auf dem Haltebereich der ersten Elektrode immobilisierten Sondenmolekulen, die jeweils die makromolekularen Biopolymere binden können. Die gebundenen makromolekularen Biopolymere sind oder werden, beispielsweise nach erfolgter Bindung, beispielsweise nach erfolgter Hybridisierung der DNA-Strange, mit einem Enzym markiert.
Der Biosensor wird m einem weiteren Schritt mit einer Spullosung gespult, so dass die zu untersuchende Losung und damit nicht hybridisierte, d.h. nicht gebundene makromolekulare Biopolymere von dem Biosensor entfernt werden.
In einem weiteren Schritt wird eine weitere Losung, die auch durch Zugabe einer Substanz zu der Spullosung gebildet werden kann, mit dem Biosensor m Kontakt gebracht.
Die weitere Losung enthalt Molekule, die durch das Enzym an den makromolekularen Biopolymeren gespaltet werden können. Jeweils ein spaltbares Molekül wird ein erstes Teilmolekul einer ersten Ladung und m zweites Teilmolekul einer zweiten elektrischen Ladung aufgespaltet. Das erste Teilmolekul wird an der dritten Elektrode oxidiert oder reduziert und das oxi- dierte oder reduzierte erste Teilmolekul wird an der zweiten Elektrode reduziert bzw. oxidiert, so dass ein Redox-Recyc¬ lmg-Vorgang zwischen der dritten Elektrode und der zweiten Elektrode durchgeführt wird.
Abhangig von dem Redox-Recyclmg-Vorgang werden die makromolekularen Biopolymere ermittelt, d.h. es wird, beispielsweise wie im Stand der Technik, der Verlauf des Kreisstroms des Re- dox-Recyclmg-Vorgangs ermittelt und daraus wird die Anzahl der gebundenen makromolekularen Biopolymere auf der ersten Elektrode bestimmt.
Hybridisieren viele mit dem Enzym markierte oder noch zu markierende DNA-Strange mit den immobilisierten DNA-Sonden- molekulen einem kleinen Bereich, so sind entsprechend vie- le dieser Enzyme an diesem Bereich konzentriert und die An- stiegsrate des erzeugten Kreisstroms ist hoher als in einem anderen Bereich, wo weniger mit dem Enzym markierte DNA- Strange hybridisiert sind. Durch Vergleichen der Anstiegsra- ten zwischen verschiedenen Bereichen des Biosensors kann er- mittelt werden, nicht nur ob DNA-Strange m der zu untersuchenden Losung mit den DNA-Sondenmolekulen einer vorgegebenen Sequenz hybridisieren, sondern auch wie gut, d.h. mit welcher Effizienz, die Hybridisierung gegenüber anderen DNA-Sondenmolekulen erfolgt.
Mit anderen Worten ausgedruckt bedeutet dies, dass ein solcher Biosensor qualitative als auch quantitative Informationen über den DNA-Inhalt einer zu untersuchenden Losung liefert. Als Enzym kann beispielsweise ein Enzym der Klasse der NADH- unabhangigen Dehydrogenasen oder auch ein Enzym der Klasse der Phenoloxidasen verwendet werden.
Die Konzentration des Reduktιons-/Oxιdatιons-Prozesses an der zweiten Elektrode und der dritten Elektrode kann beispielsweise dadurch gewahrleistet werden, dass die erste Elektrode e n erstes elektrisches Potential aufweist, die zweite Elektrode ein zweites elektrisches Potential aufweist und die dritte Elektrode ein drittes elektriscnes Potential aufweist. Das dritte elektrische Potential kann diesem Fall derart gewählt werden, dass wahrend des Redox-Recyclmg-Vorgangs die Reduktion oder Oxidation nur an der zweiten und an der dritten Elektrode erfolgt.
Gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung wird dies dadurch erreicht, dass das dritte elektrische Potential großer ist als das erste elektrische Potential und dass das erste elektrische Potential großer ist als das zweite elektrische Potenti- al.
Der Haltebereich der ersten Elektrode kann mit einem Material beschichtet sein, das Sondenmolekule immobilisieren kann.
Der Haltebereich kann somit beispielsweise eines der folgenden Mateπale aufweisen:
• Hydroxylreste,
• Epoxidreste,
• Minreste, • Acetoxyreste,
• Isocyanatreste,
• Succinimidylesterreste,
• Thiolreste,
• Gold, • Silber,
• Platin,
• Titan. Der Haltebereich kann sowohl zum Halten von Liganden ausge¬ staltet sein, mit denen Peptide oder Proteine gebunden werden können als auch zum Halten von DNA-Sondenmolekulen, mit denen DNA-Moleküle gebunden werden können.
Die Elektroden können in einer Interdigitalelektrodenanord- nung, wie beispielsweise in [4] beschrieben, angeordnet sein, wobei die dritte Elektrode jeweils zwischen der ersten und der zweiten Elektrode angeordnet ist.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung sind die Elektroden kreisförmig konzentrisch umeinander angeordnet, wobei die dritte Elektrode jeweils zwischen der ersten Elek- trode und der zweiten Elektrode angeordnet ist.
Ferner können die erste Elektrode und die zweite Elektrode und/oder die dritte Elektrode derart relativ zueinander angeordnet sein, dass sie zwischen der ersten Elektrode und der zweiten Elektrode und/oder dritten Elektrode im wesentlichen ungekrümmte Feldlinien eines zwischen der ersten Elektrode und der zweiten Elektrode und/oder der dritten Elektrode erzeugten elektrischen Feldes ausbilden können.
Unter makromolekularen Biopolymeren sind beispielsweise Proteine oder Peptide oder auch DNA-Stränge einer jeweils vorgegebenen Sequenz zu verstehen.
Unabhängig davon, welche Art von makromolekularem Biopolymer in der zu untersuchenden Lösung erfasst werden soll kann das makromolekularem Biopolymer im voraus mit dem Enzym markiert werden.
Sollen als makromolekulare Biopolymere Proteine oder Peptide erfasst werden, so sind die immobilisierten Moleküle Liganden, beispielsweise Wirkstoffe mit einer möglichen Bindungsaktivität, die die zu erfassenden Proteine oder Peptide an die jeweilige Elektrode binden, auf der die entsprechenden Liganden angeordnet sind.
Als Liganden kommen Enzymagonisten oder Enzymantagonisten, Pharmazeutika, Zucker ooer Antikörper oder irgendein Molekül Betracht, das die Fähigkeit besitzt, Proteine oder Peptide spezifisch zu binden.
Werden als makromolekulare Biopolymere DNA-Strange einer vor- gegebenen Sequenz verwendet, die mittels des Biosensors erfasst werden sollen, so können mittels des Biosensors DNA- Strange einer vorgegebenen Sequenz mit DNA-Sondenmolekulen mit der zu der Sequenz der immobilisierten DNA-Strange komplementären Sequenz als Molekule auf der ersten Elektrode hy- bπdisiert werden.
Im Rahmen dieser Beschreibung ist unter einem Sondenmolekul sowohl ein Ligand als auch e n DNA-Sondenmolekul zu verstehen.
Der Haltebereich kann zum Halten von Sondenmolekulen ausgestaltet sein, mit denen Peptide oder Proteine gebunden werden können.
Alternativ kann der Halteoereich zum Halten von DNA-Sondenmolekulen ausgestaltet sein, mit denen DNA-Molekule gebunden werden können.
Ein Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung ist den Figuren dar- gestellt und wird im weiteren naher erläutert.
Es zeigen
Figur 1 eine Skizze eines Biosensors gemäß einem Ausfuhrungs- beispiel der Erfindung; Figuren 2a und 2b eine Skizze zweier Planarelektroden, mit¬ tels derer die Existenz zu erfassender DNA-Strange einem Elektrolyt (Figur 2a) bzw. deren Nichtexi≤tenz (Figur 2b) nachgewiesen werden können;
Figur 3 Interdigitalelektroden gemäß dem Stand der Technik.
Figuren 4a bis 4c Skizzen eines Biosensors gemäß dem Stand der Technik, anhand derer einzelne Zustande im Rahmen des Redox-Recyclmg-Vorgangs erläutert werden;
Figur 5 ein Funktionsverlauf eines Kreisstroms gemäß dem
Stand der Technik im Rahmen eines Redox-Recyclmg- Vorgangs;
Figur 6 eine Interdigitalelektrodenanordnung gemäß einem Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung;
Figur 7 einen Biosensor gemäß einem Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung;
Figur 8 einen Querschnitt eines Biosensors mit zwei Elektroden, die als Interdigitalelektrodenanordnung angeordnet sind;
Figuren 9a bis 9d Querschnittsansichten einer Interdigitale- lektrode m vier Verfahrenszustanden m einem Herstellungsverfahren eines Biosensors gemäß einem Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung;
Figuren 10a bis 10c Querschnittsansichten eines Biosensors wahrend einzelner Verfahrensschritte des Herstellungsverfahrens einer Elektrode des Biosensors gemäß einem weiteren Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung;
Figuren 11a bis 11c Querschnittsansichten eines Biosensors wahrend einzelner Verfahrensschritte des Herstel- lungsverfahrens einer Elektrode des Biosensors gemäß einem weiteren Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung;
Figuren 12a bis 12c jeweils einen Querschnitt eines Biosen- sors zu verschiedenen Zeitpunkten wahrend des Herstellungsverfahrens gemäß einem weiteren Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung;
Figur 13 eine Draufsicht eines Biosensor-Arrays gemäß einem Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung mit zyl oerformi- gen Elektroden;
Figur 14 eine Draufsicht eines Biosensor-Arrays gemäß einem Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung mit quaderformigen Elektroden;
Figur 15 eine Querschnittsansicht eines Biosensors gemäß einem weiteren Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung;
Figur 16 eine Querschnittsansicht eines Biosensors gemäß einem weiteren Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung; und
Figuren 17a bis 17g Querschnittsansichten eines Biosensors wahrend einzelner Verfahrensschritte eines Herstel- lungsverfanrens gemäß einem weiteren Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung;
Figur 18 eine weitere Elektrodenanordnung gemäß einem weiteren Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung;
Figur 19 eine Draufsicht eines Biosensor-Arrays gemäß einem Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung mit quaderformigen Elektroden, denen die Elektroden rrit dem jeweils ihnen zugeordnetem elektrischen Potential dargestellt sind. Fig.l zeigt einen Biosensor 100 gemäß einem Ausfuhrungsbei¬ spiel der Erfindung.
Der Biosensor 100 weist drei Elektroden auf, eine erste Elek- trode 101, eine zweite Elektrode 102 sowie eine dritte Elek¬ trode 103.
Die Elektroden 101, 102, 103 sind mittels einem Isolatormate- rial als Isolatorschicht 104 elektrisch voneinander isoliert.
Auf der ersten Elektrode 101 ist ein Haltebereich 105 vorgesehen zum Halten von Sondenmolekulen, die makromolekulare Biopolymere binden können.
Die Sondenmolekule 106 gemäß diesem Ausfuhrungsbeispiel, die an dem Haltebereich immobilisiert sind, sind DNA- Sondenmolekule, mit denen DNA-Strange mit zu der Sequenz der DNA-Sondenmolekule komplementärer Sequenz hybridisieren können.
Die DNA-Sondenmolekule 106 werden mittels der bekannten Gold- Schwefel-Koppelung an die erste Elektrode 101 aus Gold immobilisiert. Bei Verwenden eines anderen Materials zum Binden der Sondenmolekule wird das Material mit dem entsprechenden Beschichtungsmaterial versehen, auf dem die Sondenmolekule immobilisiert werden können.
Wahrend der Immobilisierung der DNA-Sondenmolekule auf der ersten Elektrode 101 werden an die Elektroden unterschiedli- ehe elektrische Potentiale angelegt, so dass ein elektrisches Feld zwischen den Elektroden entsteht derart, dass eine Immobilisierung der DNA-Sondenmolekule nur an der ersten Elektrode 101 möglich ist und an der zweiten Elektrode 102 und/oder an oer dritten Elektrode 103 verhindert wird.
In analoger Weise zu dem Verfahren gemäß dem Stand der Technik, wie er oben beschrieben woroen ist, wird einem ersten Schritt eine zu untersuchende Lösung, beispielsweise ein Elektrolyt, mit dem eventuell zu erfassenden makromolekularen Biopolymeren, d.h. den DNA-Strängen, die von den DNA- Sondenmolekülen hybridisiert werden können, mit dem Biosensor 100, d.h. insbesondere mit der ersten Elektrode 101 mit den DNA-Sondenmolekülen 106 in Kontakt gebracht. Dies erfolgt derart, dass eventuelle in der zu untersuchenden Lösung enthaltene DNA-Stränge mit den DNA-Sondenmolekülen hybridisieren können.
Nach erfolgter Hybridisierung wird der Biosensor 100 mittels einer nicht dargestellten Spüllösung gespült, d.h. die nicht hybridisierten DNA-Stränge sowie die zu untersuchende Lösung werden entfernt.
In einem weiteren Schritt wird eine weitere Lösung 109 mit dem Biosensor 100 insbesondere mit der ersten Elektrode 101 in Kontakt gebracht.
Fig.l zeigt den Biosensor 100 in dem Zustand, in dem schon
DNA-Stränge 107 mit den DNA-Sondenmolekülen 106 hybridisiert sind. Die hybridisierten DNA-Stränge 107 sind jeweils mit einem Enzym 108 markiert, mit dem im weiteren erläuterte Moleküle in der weiteren Lösung 109 gespaltet werden können.
Als Enzym 108 können gemäß diesem Ausführungsbeispiel beispielsweise
• a-Galactosidase,
• b-Galactosidase, • b-Glucosidase,
• a-Mannosidase,
• Alkaline Phosphatase,
• Acidic Phosphatase,
• Oligosaccharide Dehydrogenase, • Glucose Dehydrogenase,
• Laccase,
• Tyrosinase, • oder artverwandte Enzyme verwendet werden.
Es ist anzumerken, dass niedermolekulare Enzyme die höchste Umsatzeffizienz und daher auch die höchste Empfindlichkeit gewährleisten können.
In der weiteren Losung 109 sind somit Molekule 110 enthalten, die durch das Enzym 108 gespalten werden können ein erstes Teilmolekul 111 mit negativer elektrischer Ladung und m ein zweites Teilmolekul mit positiver elektrischer Ladung.
Als das spaltbare Molekül 110 können vor allem beispielsweise
• p-Ammophenyl-hexopyranoside, • p-Aminophenyl-phosphate,
• p-Nitrophenyl-hexopyranoside,
• p-Nitrophenyl-phosphate, oder
• geeignete Derivate von a) Diaminen, b) Catecholam en, c) Fe(CN)|-, d) Ferrocen, e) Dicarboxylsaure, f) Ferrocenlysm, g) Osmiumbipyπdyl-NH, oder h) PEG-Ferrocen2 verwendet werden.
An die Elektroden 101, 102, 103 wird jeweils ein elektrisches Potential angelegt.
Somit wird an die erste Elektrode 101 ein erstes elektrisches Potential V(E1) angelegt, an die zweite Elektrode 102 ein zweites elektrisches Potential V(E2) und an die dritte Elek- trode 103 ein drittes elektrisches Potential V (E3) . Wahrend der eigentlichen Messphase, die grundsätzlich analog der Vorgehensweise aus dem Stand der Technik, wie oben be¬ schrieben wurde, erfolgt, wird ein abhangig von dem Vorzei¬ chen der Ladung, jeweils folgendes Potentialgefalle der elek- trischen Potentiale an die Elektroden 101, 102, 103 angelegt derart, dass gilt:
V(E3) > V(E1) > V(E2) .
Weist beispielsweise die dritte Elektrode 103 ein positives elektrisches Potential V(E3) auf, so weist die dritte Elektrode 103 das größte elektrische Potential der Elektroden 101, 102, 103 des Biosensors 100 auf.
Dies bewirkt, dass die erzeugten ersten Teilmoleküle 111 mit negativer Ladung aufgrund des größten elektrischen Potentials V(E3), das an der dritten Elektrode 103 anliegt, zu der positiv geladenen dritten Elektrode 103 gezogen wird und nicht mehr, wie gemäß dem Stand der Technik, zu der ersten Elektro- de 101.
Die erste Elektrode 101 wird erfindungsgemäß nunmehr nicht mehr sowohl als Halte-Elektrode zum Halten der Sondenmolekule und als Messelektrode zum Oxidieren oder Reduzieren der e- weiligen Teilmoleküle verwendet.
Die Funktion der Elektrode, an der die Oxidation bzw. Reduktion der erzeugten Teilmoleküle stattfindet, übernimmt nunmehr anschaulich die dritte Elektrode 103.
Anschaulich bedeutet dies, dass mittels der dritten Elektrode 103 die erste Elektrode 101 von den gespaltenen Teilmolekulen abgeschirmt wird.
Auf diese Weise kann die Bedeckung der ersten Elektrode mit den DNA-Sondenmolekulen 106 erheblich erhöht werden. An der dritten Elektrode 103 erfolgt eine Oxidation der nega¬ tiv geladenen Teilmoleküle 111 und die oxidierten ersten Teilmoleküle 112 werden zu der zweiten Elektrode 102 gezogen, da diese das kleinste elektrische Potential V(E2) aller Elek- troden 101, 102, 103 in dem Biosensor 100 aufweist.
An der zweiten Elektrode 102 erfolgt eine Reduktion der oxidierten Teilmoleküle und die reduzierten Teilmoleküle 113 werden wiederum an die dritte Elektrode 103 gezogen, wo wie- derum eine Oxidation erfolgt.
Auf diese Weise ergibt sich wiederum ein Kreisstrom, der auf bekannte Weise erfasst wird, wodurch sich ein Verlauf des Kreisstroms über die Zeit ergibt, aus der wiederum die Anzahl der hybridisierten DNA-Stränge 107 mit dem Enzym 108 als Markierung ermittelt werden kann aufgrund der Proportionalität des Kreisstroms zu der Anzahl der durch das Enzym 108 erzeugte Ladungsträger.
Eine alternative Ausführungsform zu dem Biosensor 100 ist in Fig.6 dargestellt. Die Elektroden können an einem Biosensor 600 gemäß einem zweiten Ausfuhrungsbeispiel als Interdigita- lelektroden angeordnet sein, wobei jeweils zwischen der ersten Elektrode 601 und der zweiten Elektrode 602 die dritte Elektrode 603 angeordnet ist.
Die ersten Elektroden 601, die zweiten Elektroden 602 und die dritten Elektroden 603 sind jeweils parallel geschaltet und mit einem ersten elektrischen Anschluss 604, einem zweiten elektrischen Anschluss 605 bzw. einem dritten elektrischen Anschluss 606 gekoppelt.
Anschaulich bedeutet dies, dass auch bei der Interdigitale- lektrodenanordnung 600 die erste Elektrode 601, auf der je- weils der Haltebereich zum Halten der Sondenmolekule angeordnet ist, hinsichtlich des Redox-Recycling-Vorgangs abgeschirmt wird. Weiterhin ist darauf hinzuweisen, dass die Erfindung nicht auf das Ermitteln von DNA-Strängen beschränkt ist, sondern dass allgemein makromolekulare Biopolymere ermittelt werden können, wobei für den Fall, dass Proteine oder Peptide ermittelt werden sollen, die Sondenmolekule als Liganden ausgestaltet sind, die mit den Proteinen oder Peptiden binden können.
Der Biosensor 100, 600 kann ferner in einem Biosensor-Array mit einer Vielzahl solcher Biosensoren eingesetzt werden.
Jeder Punkt, der als Elektrode ein Element des Biosensor- Arrays bildet, besitzt die oben beschriebene Eigenschaft. Es ist lediglich zu gewährleisten, dass die erste Elektrode, an der jeweils Sondenmoleküle immobilisiert sind bzw. immobilisierbar sind, elektrisch von den gespalteten Teilmolekülen abgeschirmt werden.
Somit ist auch ersichtlich, dass auch eine unterschiedliche Anzahl von Elektroden, die gemäß dem Ausführungsbeispiel aus Fig.l der ersten Elektrode 101, der zweiten Elektrode 102 und der dritten Elektrode 103 entsprechen, unterschiedlich dicht über einen Biosensor verteilt sein kann, soweit die Abschir- mung der ersten Elektrode von den gespalteten Teilmolekülen im Rahmen des Redox-Recycling-Vorgangs gewährleistet ist.
Bei einem Biosensor-Array kann die Messung ferner als Funktion örtlich variierender Elektrodenpotentiale durchgeführt werden. Auch im Rahmen eines Biosensor-Arrays sind unterschiedliche Dichteverteilungen der funktional unterschiedlichen Elektroden möglich.
Fig.7 zeigt einen Biosensorchip 700 mit einer weiteren Elek- trodenkonfiguration. Der Biosensorchip 700 weist eine erste Elektrode 701 und eine zweite Elektrode 702 auf, die auf einer Isolatorschicht 703 derart angeordnet sind, dass die erste Elektrode 701 und die zweite Elektrode 702 voneinander elektrisch isoliert sind.
Die erste Elektrode 701 ist mit einem ersten elektrischen Anschluss 704 gekoppelt, und die zweite Elektrode 702 ist mit einem zweiten elektrischen Anschluss 705 gekoppelt.
Die Elektroden 701, 702 weisen eine quaderformige Struktur auf, wobei sich eine erste Elektrodenflache 706 der ersten Elektrode 701 und eine erste Elektrodenflache 707 der zweiten Elektrode 702 im wesentlichen parallel zueinander ausgerichtet gegenüberstehen.
Dies wird dadurch erreicht, dass gemäß diesem Ausfuhrungsbeispiel die Elektroden 701, 702 im wesentlichen bezüglich der Oberflache 708 der Isolatorschicht 703 senkrechte Seitenwande 706, 707 aufweisen, welche die erste Elektrodenflache 706 der ersten Elektrode 701 bzw. die erste Elektrodenflache 707 der zweiten Elektrode 702 bilden.
Wird ein elektrisches Feld zwischen der ersten Elektrode 701 und der zweiten Elektrode 702 angelegt, so wird durch die sich im wesentlichen parallel zueinander ausgerichteten Elektrodenflachen 706, 707 ein Feldl ienverlauf m t Feldlinien 709 erzeugt, die zwischen den Oberflachen 706, 707 im wesentlichen ungekrummt sind.
Gekrümmte Feldlinien 710 ergeben sich lediglich zwischen einer zweiten Elektrodenflache 711 der ersten Elektrode 701 und einer zweiten Elektrodenflache 712 der zweiten Elektrode 702, die jeweils für die Elektroden 701, 702 die oberen Oberflachen bilden, sowie einem Randbereich 713 zwischen den Elektroden 701, 702. Die ersten Elektrodenflachen 706, 707 der Elektroden 701, 702 sind als Haltebereiche zum Halten von Sondenmolekulen, die makromolekulare Biopolymere, die mittels des Biosensors 700 zu erfassen sind, binden können.
Die Elektroden 701, 702 sind gemäß diesem Ausfuhrungsbeispiel aus Gold hergestellt.
Es werden kovalente Verbindungen zwischen den Elektroden und den Sondenmolekulen hergestellt, wobei der Schwefel zum Bilden einer Gold-Schwefel-Kopplung n Form eines Sulfids oder eines Thiols vorhanden ist.
Für den Fall, dass als Sondenmolekule DNA-Sondenmolekule ver- wendet werden, sind solche Schwefelfunktionalitaten Teil eines modifizierten Nukleotids, das mittels der Phosphoramidit- chemie wahrend eines automatisierten DNA-Syntheseverfahrens am 3 '-Ende oder am 5 '-Ende des zu immobilisierenden DNA- Strangs eingebaut wird. Das DNA-Sondenmolekul wird somit an seinem 3 ' -Ende oder an seinem 5 '-Ende immobilisiert.
Für den Fall, dass als Sondenmolekule Liganden verwendet werden, werden die Schwefelfunktionalitaten durch ein Ende eines Alkyllinkers oder eines Alkylenl kers gebildet, dessen ande- res Ende eine für die kovalente Verbindung des Liganden geeignete chemische Funktionalität aufweist, beispielsweise einen Hydroxylrest, einen Acetoxyrest oder einen Succinimidyle- sterrest .
Die Elektroden, d.h. insbesondere die Haltebereiche werden beim Messeinsatz mit einem Elektrolyt 714, allgemein mit einer zu untersuchenden Losung, bedeckt.
Befinden sich der zu untersuchenden Losung 714 die zu er- fassenden makromolekularen Biopolymere, beispielsweise zu erfassende DNA-Strange mit einer vorgegebenen Sequenz, die mit den immobilisierten DNA-Sonden olekulen auf den Elektroden hybridisieren können, so hybridisieren die DNA-Strange mit den DNA-Sondenmolekulen.
Sind der zu untersuchenden Losung 714 keine DNA-Strange mit der zu der Sequenz der DNA-Sondenmolekulen komplementären Sequenz enthalten, so können keine DNA-Strangen aus der zu untersuchenden Losung 714 mit den DNA-Sondenmolekulen auf den Elektroden 701, 702 hybridisieren.
Zwischen den Elektroden 701, 702 wird, wie oben erläutert wurde, em Redox-Recyclmg-Vorgang gestartet werden und dadurch die Anzahl der markierten hybridisierten DNA-Strange, allgemein der markierten gebundenen makromolekularen Biopolymere ermittelt werden.
Fig.8 zeigt einen Biosensor 800 mit einer weiteren Elektro- denkonflguration gemäß einem weiteren Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung.
Bei dem Biosensor 800 sind gleicher Weise wie bei dem Biosensor 700 gemäß dem m Fig.7 gezeigten Ausfuhrungsbeispiel zwei Elektroden 701, 702 vorgesehen, die auf der Isolator- schicht 703 aufgebracht sind.
Im Unterschied zu dem Biosensor 700 mit lediglich zwei quaderformigen Elektroden sind die zwei Elektroden gemäß dem in Fig.8 dargestellten Biosensor 800 als eine Vielzahl von jeweils abwechselnd angeordneten, parallel geschalteten Elektroden m Form der bekannten Interdigitalelektrodenanoronung angeordnet.
Fig.8 zeigt zur weiteren Veranschaulichung ferner em schema- tisches elektrisches Ersatzscnaltbild, das die Darstellung des Biosensors 800 eingezeichnet ist.
Da sich zwischen den im wesentlicnen sich parallel gegenüberstehenden Elektrodenflachen 706, 707 der Elektroden 701, 702, wie m Fig.7 dargestellt wurde, im wesentlichen ungekrummte Feldlinien bezuglich der Oberflache 708 der Isolatorschicht 703 ergeben, überwiegt der Anteil der durch die ungekrümmten Feldlinien erzeugten ersten Kapazität 802 und des ersten Leitwerts 803 verglichen mit der zweiten Kapazit t 804 und des zweiten Leitwerts 805, die durch die gekrümmten Feldlinien 710 erzeugt werden.
Dieser erheblich größerer Anteil der ersten Kapazität 802 und des ersten Leitwerts 803 an dem Gesamtleitwert, der sich aus der Summe der ersten Kapazität 802 und der zweiten Kapazität
804 sowie des ersten Leitwerts 803 und des zweiten Leitwerts
805 ergeben, fuhrt dazu, dass die Sensitivitat des Biosensors 800 bei Änderung des Zustandes des Biosensors 800, d.h. bei Hybridisierung von DNA-Strangen der zu untersuchenden Losung 714 mit auf den Haltebereichen auf den Elektrodenflachen 706, 707 immobilisierten DNA-Sondenmolekulen 801 erheblich erhöht wird.
Somit ist anschaulich bei gleichen lateralen Abmessungen der Elektroden 701, 702 und bei gleichen Abmessungen des zuvor eingeführten aktiven Bereichs, d.h. bei gleicher Flache der Haltebereiche auf den Elektrodenflachen em wesentlich größerer Anteil von Feldlinien eines angelegten elektrischen Fel- des zwischen den Elektroden 701, 702 dem Volumen enthalten, m dem die Hybridisierung stattfindet, wenn die zu erfassenden DNA-Strange m der zu untersuchenden Losung 714 enthalten sind als bei einer Planarelektrodenanoronung.
In anderen Worten bedeutet dies, dass die Kapazität der er- fmdungsgemäßen Anordnung pro Chipflache deutlich großer ist als die Kapazität pro Chipflache bei einer Planareiektroden- anordnung.
Im weiteren werden einige Alternativenmoglichkeiten zur Herstellung einer quaderformigen Sensorelektrode mit im wesentlichen senkrechten Seltenwanden erläutert. Erstes Verfahren zum Herstellen von Metallelektroden mit im wesentlichen senkrechten Seltenwanden, die Sondenmolekule immobilisieren können
Fig.9a zeigt em Siliziumsubstrat 900, wie es für bekannte CMOΞ-Prozesse hergestellt wird.
Auf dem Siliziumsubstrat 900, dem sich bereits integrierte Schaltungen und/oder elektrische Anschlüsse für die zu bildenden Elektroden befinden, wird eine Isolatorschicht 901, die auch als Passivierungsschicht dient, m ausreichender Dicke, gemäß dem Ausfuhrungsbeispiel in einer Dicke von 500 n , mittels eines CVD-Verfahrens aufgebracht.
Die Isolatorschicht 901 kann aus Siliziumoxid SιO_ oder Sili- ziumnitrid Sι3N<ι hergestellt sein.
Die Interdigitalanordnung des Biosensors 800 gemäß dem oben dargestellten Ausfuhrungsbeispiel wird mittels Photolithogra- phie auf der Isolatorschicht 901 definiert.
Anschließend werden mittels eines Trockenatzverfahrens, z.B. dem Reactive Ion Etchmg (RIE) , m der Isolatorschicht 901 Stufen 902 erzeugt, d.h. geatzt, gemäß dem Ausfuhrungsbeispiel einer Mindesthohe 903 von ungefähr 100 nm.
Die Hohe 903 der Stufen 902 uss ausreichend groß sein für einen anschließenden selbst ustierenden Prozess zum Bilden der Metallelektrode.
Es ist darauf hinzuweisen, dass zum Auftragen der Isolatorschicht 901 alternativ auch em Aufdampfverfahren oder e Sputterverfahren eingesetzt werden kann.
Bei der Strukturierung der Stufen 902 ist zu beachten, dass die Flanken der Stufen 902 ausreichend steil sind, so dass sie hinreichend scharfe Kanten 905 bilden. Em Winkel 906 der Stufenflanken gemessen zur Oberflache der Isolatorschicht 901 sollte gemäß dem Ausfuhrungsbeispiel mindestens 50 grad betragen.
In einem weiteren Schritt wird eine Hilfsschicht 904
(vgl. Fig.9b) der Dicke von ungefähr 10 nm aus Titan auf die stufenförmige Isolatorschicht 901 aufgedampft.
Die Hilfsschicht 904 kann Wolfram, und/oder Nickel-Chrom, und/oder Molybdän aufweisen.
Es ist zu gewährleisten, dass die einem weiteren Schritt aufgetragene Metallschicht, gemäß dem Ausfuhrungsbeispiel ei- ne Metallschicht 907 aus Gold, an den Kanten 905 der Stufen 902 derart porös aufwachst, dass es möglich ist, m einem weiteren Verfahrensschπtt an den Stufenubergangen jeweils eine Spalte 908 m die ganzflachig aufgetragene Goldschicht 907 zu atzen.
In einem weiteren Verfahrensschritt wird die Goldschicht 907 für den Biosensor 800 aufgebracht.
Gemäß dem Ausfuhrungsbeispiel weist die Goldschicht eine Dik- ke von ungefähr 500 nm bis ungefähr 2000 nm auf.
Es ist hinsichtlich der Dicke der Goldschicht 907 lediglich zu gewahrleisten, dass die Dicke der Goldschicht 907 ausreichend ist, so dass die Goldschicht 907 porös kolumnar auf- wachst.
In einem weiteren Schritt werden Offnungen 908 m die Goldschicht 907 geatzt, so dass sich Spalten ausbilden.
Zum Nassatzen der Offnungen wird eine Atzlosung aus 7,5 σ Super Strip 100™ (Markenname der Firma Lea Ronal GmbH, Deutschland) und 20 g KCN m 1000 ml Wasser H_0 verwendet. Durch das kolumnare Wachstum des Goldes, allgemein des Me¬ talls, wahrend des Aufdampfens auf die Haftschicht 904 wird em anisotroper Atzangriff erzielt, so dass der Oberflachen- abtrag des Goldes ungefähr im Verhältnis 1:3 erfolgt.
Durch das Atzen der Goldschicht 907 werden die Spalten 908 abhangig von der Zeitdauer des Atzvorgangs gebildet.
Dies bedeutet, dass die Zeitdauer des Atzprozesses die Basis- breite, d.h. den Abstand 909 zwischen den sich ausbildenden Goldelektroden 910, 911 bestimmt.
Nachdem die Metallelektroden eine ausreichende Breite aufwei- sen und der Abstand 909 zwischen den sich bildenden Goloelek- troden 910, 911 erreicht sind, wird das Nassatzen beendet.
Es ist anzumerken, dass aufgrund des porösen Aufdampfens das Atzen m zu der Oberflache der Isolatorschicht 901 parallelen Richtung wesentlich schneller erfolgt als in zu der Oberflache der Isolatorschicht 901 senkrechten Richtung.
Es ist darauf hinzuweisen, dass alternativ zu einer Goldschicht auch andere Edelmetalle, wie beispielsweise Platin, Titan oder Silber verwendet werden können, da diese Materialien ebenfalls Haltebereiche aufweisen können bzw. mit einem geeigneten Material beschichtet werden können zum Halten von immobilisierten DNA-Sondenmolekulen oder allgemein zum Halten von Sondenmolekulen, und ein kolumnares Wachstum beim Auf- dampfen aufweisen.
Für den Fall, dass die Haftschicht 904 m den geöffneten Spalten 912 zwischen den Metallelektroden 910, 911 entfernt werden soll, erfolgt dies ebenfalls selbstjustierend, indem man die Goldelektroden 910, 911 als Atzmaske verwendet. Gegenüber den bekannten Interdigitalelektroden weist die Struktur gemäß diesem Ausfuhrungsbeispiel insbesondere den Vorteil auf, dass durch das selbstjustierende Öffnen der Goldschicht 907 über den Kanten 905 der Abstand zwischen den Elektroden 910, 911 nicht an eine minimale Auflösung des Her- stellungsprozesses gebunden ist, d.h. der Abstand 909 zwi¬ schen den Elektroden 910, 911 kann sehr schmal gehalten werden .
Somit ergibt sich gemäß diesem Verfahren der Biosensor 800 gemäß dem in Fig.8 dargestellten Ausführungsbeispiel mit den entsprechenden Metallelektroden.
Zweites Verfahren zur Herstellung von Metallelektroden mit im wesentlichen senkrechten Seitenwänden, die Sondenmolekule immobilisieren können
Bei dem in den Fig.10a bis Fig.10c dargestellten Herstel- lungsverfahren wird von einem Substrat 1001 ausgegangen, beispielsweise von einem Silizium-Substrat-Wafer (vgl. Fig.10a), auf dem bereits eine Metallisierung 1002 als elektrischer Anschluss vorgesehen ist, wobei auf dem Substrat 1001 schon eine Ätzstoppschicht 1003 aus Siliziumnitrid Si3N4 aufgebracht ist.
Auf dem Substrat wird eine Metallschicht 1004, gemäß dem Ausfuhrungsbeispiel eine Goldschicht 1004 aufgebracht mittels eines Aufdampfverfahrens .
Alternativ kann ein Sputterverfahren oder ein CVD-Verfahren zum Aufbringen der Goldschicht 1004 auf die Ätzstoppschicht 1003 eingesetzt werden.
Allgemein weist die Metallschicht 1004 das Metall auf, aus dem die zu bildende Elektrode gebildet werden soll. Auf der Goldschicht 1004 wird eine elektrisch isolierende Hilfsschicht 1005 aus Siliziumoxid SiO: mittels eines CVD- Verfahrens (alternativ mittels eines Aufdampfverf hrens oder eines Sputterverfahrens) aufgebracht.
Durch Einsatz der Photolithσgraphie-Technologie wird eine Lackstruktur aus einer Lackschicht 1006 gebildet, beispielsweise eine quaderformige Struktur, welche der Form der zu bildenden Elektrode entspricht.
Soll ein im weiteren beschriebenes Biosensor-Array mit einer Vielzahl von Elektroden erzeugt werden, wird mittels der Photolithographie eine Lackstruktur erzeugt, die in ihrer Form der zu bildenden Elektroden entsprechen, die das Biosensor- Array bilden.
In anderen Worten ausgedrückt bedeutet dies, dass die lateralen Abmessungen der gebildeten Lackstruktur den Abmessungen der zu erzeugenden Sensorelektrode entsprechen.
Nach Aufbringen der Lackschicht 1006 und der entsprechenden Belichtung, die die entsprechenden Lackstrukturen vorgibt, wird die Lackschicht in den nicht "entwickelten", d.h. nicht belichteten Bereichen beispielsweise mittels Veraschen oder nasschemisch entfernt.
Auch wird die Hilfsschicht 1005 in den nicht durch die Photolackschicht 1006 geschützten Bereichen mittels eines Nassätz- verfahrens oder Trockenätzverfahrens entfernt.
In einem weiteren Schritt wird nach Entfernen der Lackschicht 1006 über der übrig gebliebenen Hilfsschicht 1005 eine weitere Metallschicht 1007 als Elektrodenschicht derart konform aufgebraucht, dass die Seitenflächen 1008, 1009 der restli- chen Hilfsschicht 1005 mit dem Elektrodenmaterial, gemäß dem Ausführungsbeispiel mit Gold, bedeckt sind (vgl. Fig.10b). Das Aufbringen kann mittels eines CVD-Verfahrens oder eines Sputterverfahrens oder mit einem Ion-Metal-Plasma-Verfahren erfolgen.
In einem letzten Schritt (vgl. Fig.10c) wird eine Spacer- Ätzung durchgeführt, bei der durch gezieltes Überätzen der Metallschichten 1004, 1007 die gewünschte Struktur der Elektrode 1010 gebildet wird.
Die Elektrode 1010 weist somit die nicht in dem Ätzschritt des Ätzens der Metallschichten 1004, 1007 weggeätzten Spacer 1011, 1012 auf sowie den unmittelbar unter der restlichen Hilfsschicht 1005 angeordneten Teil der ersten Metallschicht 1004, der mittels des Atzverfahrens nicht weggeätzt worden ist.
Die Elektrode 1010 ist mit dem elektrischen Anschluss, d.h. der Metallisierung 1002 elektrisch gekoppelt.
Die Hilfsschicht 1005 aus Siliziumoxid kann bei Bedarf durch eine weitere Ätzung, beispielsweise im Plasma oder nasschemisch, mittels eines Verfahrens entfernt werden, bei dem Selektivität zur Ätzstoppschicht 1003 gegeben ist.
Diese ist beispielsweise gewährleistet, wenn die Hilfsschicht 1005 aus Siliziumoxid besteht und die Ätzstoppschicht 1003 Siliziumnitrid aufweist.
Die Steilheit der Wände der Elektrode in dem Biosensorchip 700, 800, repräsentiert durch den Winkel 1013 zwischen den
Spacer 1011, 1012 und der Oberfläche 1014 der Ätzstoppschicht 1003, wird somit durch die Steilheit Flanken der restlichen Hilfsschicht 1005, d.h. insbesondere der Steilheit der Lackflanken 1015, 1016 der strukturierten Lackschicht 1006 be- stimmt. Drittes Verfahren zur Herstellung von Metallelektroden mit im wesentlichen senkrechten Sei enwanden, die Sondenmolekule immobilisieren können
In den Fig.11a bis Fig.11c ist eine weitere Möglichkeit zum Herstellen einer Elektrode mit im wesentlichen senkrechten Wanden dargestellt.
Wiederum wird wie bei dem zweiten Beispiel zum Herstellen ei- ner Elektrode dargestellt, von einem Substrat 1101 ausgegangen, auf dem bereits eine Metallisierung 1102 für den elektrischen Anschluss der zu bildenden Elektrode des Biosensors vorgesehen ist.
Auf dem Substrat 1101 aus Silizium wird eine Metallschicht 1103 als Elektrodenschicht aufgedampft, wobei die Metallschicht 1103 das für die Elektrode zu verwendende Material aufweist, gemäß diesem Ausfuhrungsbeispiel Gold.
Alternativ zu dem Aufdampfen der Metallschicht 1103 kann die Metallschicht 1103 auch mittels eines Sputterverfahrens oder mittels eines CVD-Verfahrens auf dem Substrat 1101 aufgebracht werden.
Auf der Metallschicht 1103 wird eine Photolackschicht 1104 aufgebracht und mittels Photclithographie-Technologie derart strukturiert, dass eine Lackstruktur entsteht, die nach Entwickeln und Entfernen der entwickelten Bereiche den lateralen Abmessungen der zu bildenden Elektrode bzw. allgemein des zu bildenden Biosensor-Arrays entspricht.
Die Dicke der Photolackschicht 1104 entspricht im wesentlichen der Hohe der zu erzeugenden Elektroden.
Bei einer Strukturierung einem Plasma mit Prozessgasen, die zu keiner Reaktion des Elektrodenmateπals fuhren können, insbesondere in einem Inertgas-Plasma, beispielsweise mit Ar- gon als Prozessgas, erfolgt der Abtrag des Materials gemäß diesem Ausführungsbeispiel mittels physikalischer. Sputter- Abtrag.
Dabei wird das Elektrodenmaterial aus der Metallschicht 1103 in einem Redepositionsprozess an die im wesentlichen senkrechten Seitenwände 1105, 1106 der strukturierten, nach Veraschen der entwickelten Lackstruktur nicht entfernten Lackelemente gesputtert, wo es keinem weiteren Sputterangriff mehr ausgesetzt ist.
Eine Redeposition von Elektrodenmaterial auf die Lackstruktur schützt die Lackstruktur vor weiterem Abtrag.
Aufgrund des Sputterns bilden sich an den Seitenwänden 1105, 1106 der Lackstruktur Seitenschichten 1107, 1108 aus dem Elektrodenmaterial, gemäß dem Ausführungsbeispiel aus Gold.
Die Seitenschichten 1107, 1108 sind elektrisch mit einem nicht entfernten Teil 1109 der Metallschicht 1103, der sich unmittelbar unterhalb der restlichen Lackstruktur 1106 befindet, gekoppelt sowie ferner mit der Metallisierung 1103 (vgl. Fig.11b) .
In einem letzten Schritt (vgl. Fig.11c) wird die Lackstruktur 1106, d.h. der Photolack, der sich in dem durch die Seitenschichten 1107, 1108 sowie die übrig gebliebene Metallschicht 1109 gebildeten Volumen befindet, mittels Veraschen oder nasschemisch entfernt.
Ergebnis ist die in Fig.11c dargestellte Elektrodenstruktur 1110, die gebildet wird mit den Seitenwänden 1107, 1108 sowie dem nicht entfernten Teil 1109, der den Boden der Ξlektroden- struktur bildet und mit der Metallisierung 1103 elektrisch gekoppelt ist. Wie auch im vorangegangenen dargestellten Herstellungsverfah¬ ren wird die Steilheit der Seitenwände 1107, 1108 der gebildeten Elektrode bei diesem Verfahren durch die Steilheit der Lackflanken 1105, 1106 bestimmt.
In den Fig.12a bis Fig.12c ist ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung mit zylinderförmigen, auf dem Substrat senkrecht hervortretenden Elektroden dargestellt.
Zur Herstellung des Biosensors 1200 mit zylinderförmigen
Elektroden, die im wesentlichen senkrecht auf einem Substrat 1201 aus Siliziumoxid angeordnet sind, wird eine Metallschicht 1202 als Elektrodenschicht aus dem gewünschten Elektrodenmaterial, gemäß dem Ausführungsbeispiel aus Gold, mit- tels aufgebracht eines Aufdampf-Verfahrens.
Auf der Metallschicht 1202 wird eine Photolackschicht aufgebracht und die Photolackschicht wird mittels einer Maske belichtet derart, dass sich nach Entfernen der nicht belichte- ten Bereiche die in Fig.12a dargestellte zylinderförmige Struktur 1203 auf der Metallschicht 1202 ergibt.
Die zylinderförmige Struktur 1203 weist einen Photoresist- Torus 1204 sowie ein zylinderförmiger Photoresist-Ring 1205 auf, die konzentrisch um den Photoresist-Torus 1204 angeordnet ist.
Zwischen dem Photoresist-Torus 1204 und dem Photoresist-Ring 1205 wird der Photolack entfernt, beispielsweise mittels Ve- raschens oder nasschemisch.
Durch Einsatz eines Sputterverfahrens wird, wie im Zusammenhang mit dem oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung einer Elektrode, mittels eines Redepositionsprozess, eine Me- tallschicht 1206 um den Photolack-Torus 1204 aufgetragen. In gleicher Weise bildet sich eine innere Metallschicht 1207 um den Photoresist-Ring 1205 (vgl. Fig.12b).
In einem weiteren Schritt wird das strukturierte Photolack- Material mittels Veraschen oder nasschemisch entfernt, so dass zwei zylinderförmige Elektroden 1208, 1209 gebildet werden.
Das Substrat 1201 wird in einem letzten Schritt so weit ent- fernt, beispielsweise mittels eines zu dem Elektrodenmaterial selektiven Plasma-Ätzprozesses, dass die Metallisierungen in dem Substrat freigelegt sind und mit den zylinderförmigen Elektroden elektrisch koppeln.
Die innere zylinderförmige Elektrode 1208 ist somit mit einem ersten elektrischen Anschluss 1210 elektrisch gekoppelt und die äußere zylinderförmige Elektrode 1209 ist elektrisch gekoppelt mit einem zweiten elektrischen Anschluss 1211.
Die restliche Metallschicht 1202, die durch das Sputtern zwischen den zylinderförmigen Elektroden 1208, 1209 noch nicht entfernt wurde, wird in einem letzten Schritt mittels eines Sputter-Ätzprozesses entfernt. Ebenso wird die Metallschicht 1202 auf diese Weise entfernt.
Es ist in diesem Zusammenhang anzumerken, dass auch gemäß diesem Ausfuhrungsbeispiel die Metallisierungen für die elektrischen Anschlüsse 1210, 1211 in dem Substrat 1201 zu Beginn des Verfahrens schon vorgesehen sind.
Fig.13 zeigt eine Draufsicht eines Biosensor-Arrays 1300, in dem zylinderförmige Elektroden 1301, 1302 enthalten sind.
Jede erste Elektrode 1301 weist ein positives elektrisches Potential auf. Jede zweite Elektrode 1302 des Biosensor-Arrays 1300 weist e bezüglich der jeweiligen benachbarten ersten Elektrode 1301 negatives elektrisches Potential auf.
Die Elektroden 1301, 1302 sind Zeilen 1303 und Spalten 1304 angeordnet.
In jeder Zeile 1303 und jeder Spalte 1304 sind jeweils die ersten Elektroden 1301 und die zweiten Elektroden 1302 alter- nierend angeordnet, d.h. jeweils unmittelbar neben einer ersten Elektrode 1301 ist einer Zeile 1303 oder einer Spalte 1304 eine zweite Elektrode 1302 angeordnet und neben einer zweiten Elektrode 1302 ist jeweils m einer Zeile 1303 oder einer Spalte 1304 eine erste Elektrode 1301 angeordnet.
Auf diese Weise ist sichergestellt, dass zwischen den einzelnen Elektroden e elektrisches Feld erzeugt werden kann mit m Richtung der Hohe der Zylinderelektroden 1301, 1302 im wesentlichen ungekrümmten Feldlinien.
Auf den Elektroden ist jeweils, wie oben dargestellt, eine große Anzahl DNA-Sondenmolekule immobilisiert.
Wird nun em eine zu untersuchende Losung (nicht dargestellt) auf das Biosensor-Array 1300 aufgebracht, so hybridisieren die DNA-Strange mit den auf den Elektroden immobilisierten, dazu komplementären DNA-Sondenmolekulen.
Auf diese Weise kann mittels des oben beschriebenen Redox- Recycling-Vorgangs wiederum die Existenz oder Nicht-Existenz von DNA-Strangen einer vorgegebenen Sequenz einer zu untersuchenden Losung mittels des Biosensor-Arrays 1300 erfasst werden.
Fig.14 zeigt em weiteres Ausfuhrungsbeispiel eines Biosensor-Arrays 1400 mit einer Vielzahl quaderformiger Elektroden 1401, 1402. Die Anordnung der quaderformigen Elektroden 1401, 1402 ist entsprechend der Anordnung der zylinderförmigen Elektroden 1301, 1302, wie sie in Fig.13 dargestellt worden ist und oben erläutert wurde.
Fig.15 zeigt eine Elektrodenanordnung eines Biosensorchips
1500 gemäß einem weiteren Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung.
Auf der Isolatorschicht 703 ist die erste Elektrode 701 aufgebracht und mit dem ersten elektrischen Anschluss 704 elektrisch gekoppelt.
Die zweite Elektrode 702 ist ebenfalls auf der isolator- schicht 703 aufgebracht und mit dem zweiten elektrischen Anschluss 705 elektrisch gekoppelt.
Wie in Fig.15 gezeigt ist, weist die zweite Elektrode gemäß diesem Ausführungsbeispiel gegenüber der vorangegangenen be- schriebenen zweite Elektrode eine unterschiedliche Form auf.
Die erste Elektrode ist, wie aus Fig.15 ersichtlich, eine Planarelektrode und die zweite Elektrode ist T-förmig ausgestaltet.
Jede T-förmige zweite Elektrode weist einen ersten Schenkel
1501 auf, der im wesentlichen senkrecht zu der Oberfläche 1507 der Isolatorschicht 903 angeordnet.
Weiterhin weist die zweite Elektrode 702 senkrecht zu dem ersten Schenkel 1501 angeordnete zweite Schenkel 1502 auf, die zumindest teilweise über der Oberfläche 1503 der jeweiligen ersten Elektrode 701 angeordnet sind.
Wie Fig.15 zu entnehmen ist, sind mehrere erste Elektroden 701 und mehrere zweite Elektroden 702 parallelgeschaltet, so dass sich aufgrund der T-förmigen Struktur der zweiten Elek- trode 702 em Hohlraum 1504 ausbildet, der gebildet wird durch zwei neben einander angeordnete zweite Elektroden 702, eine erste Elektrode 701 sowie die Isolatorschicht 703.
Die einzelnen ersten und zweiten Elektroden 701, 702 sind mittels der Isolatorschicht 703 voneinander elektrisch isoliert.
Zwischen den einzelnen zweiten Schenkeln 1502 der zweiten Elektrode 702 ist für jeden Hohlraum 1504 eine Öffnung 1505 vorgesehen, die ausreichend groß ist, so dass bei Aufbringen eines Elektrolyts 1506 auf den Biosensor 1500 das Elektrolyt und eventuell m der zu untersuchenden Losung 1506, beispielsweise einem Elektrolyt, enthaltene DNA-Strange durch die Öffnung 1505 in den Hohlraum 1504 gelangen können.
Auf Haltebereichen an den ersten und zweiten Elektroden sind DNA-Sondenmolekule 1509 immobilisiert, die mit den entsprechenden zu erfassenden DNA-Strangen vorgegebener Sequenz hy- bridisieren können.
Wie Fig.15 zu entnehmen ist, bilden sich aufgrund der einander gegenüberliegenden, im wesentlichen parallel zueinander ausgerichteten Oberflachen der zweiten Elektrode 1508 bzw. der ersten Elektrode 1503, an denen die Haltebereiche zum
Halten der DNA-Sondenmoleküle 1509 vorgesehen sind, bei Anlegen eines elektrischen Feldes zwischen der ersten Elektrode 701 und der zweiten Elektrode 702 im wesentlichen ungekrummte Feldlinien aus.
Fig.16 zeigt einen Biosensor 1600 gemäß einem weiteren Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung.
Der Biosensor 1600 gemäß einem weiteren Ausfuhrungsbeispiel entspricht im wesentlichen dem oben erläuterten und in Fig.15 gezeigten Biosensor 1500 mit dem Unterschied, dass an Seiten- wanden des ersten Schenkels 1501 der zweiten Elektrode 702 keine Haltebereiche mit immobilisierten DNA-Sondenmolekulen 1509 vorgesehen sind, sondern dass die Oberflache 1601 der ersten Schenkel 1501 der zweiten Elektrode 702 mit Isolator- material der Isolatorschicht 703 oder einer weiteren lsolie- renden Schicht bedeckt sind.
Gemäß dem m Fig.16 gezeigten Ausfuhrungsoeispiel sind Haltebereiche auf der ersten und auf der zweiten Elektrode 701, 702 demnach lediglich an unmittelbar sich gegenüberliegenden Oberflachen der Elektroden, d.h. an der Oberflache 1602 des zweiten Schenkels der zweiten Elektrode 702, und an der Oberflache 1603 der ersten Elektrode 701.
In den Fig.17a bis Fig.17g sind einzelne Verfahrensschritte zum Herstellen der ersten Elektrode 701 und der zweiten Elektrode 702 m den Biosensoren 1500, 1600 dargestellt.
In die Isolatorschicht 703 als Substrat, gemäß dem Ausfuhrungsbeispiel aus Siliziumoxid wird unter Verwendung einer Maskenschicht, beispielsweise aus Photolack, eine Struktur m die Isolatorschicht 703 geatzt, deren Form der zu bildenden ersten Elektrode 701 entspricht.
Nach Entfernen der Maskenschicht durch Veraschen oder durch em nasschemisches Verfahren wird ganzflachig eine Schicht aus dem gewünschten Elektrodenmateπal auf der Isolatorschicht 703 aufgebracht derart, dass die zuvor geatzte Struktur 1701 (vgl. Fig.17a) zumindest vollständig gefüllt ist, wobei die Struktur 1701 auch überfüllt sein kann (vgl. Fig.17b) .
In einem weiteren Schritt wird mittels eines chemisch- mechanischen Polierverfahrens (vgl. Fig.17c) das außerhalb der vorgefertigten Struktur 1701 sich befindende Elektroden- material 1702, vorzugsweise Gold, entfernt. Nach Beendigung des chemisch-mechanischen Polierverfahrens ist somit die erste Elektrode 701 bündig in die Isolator¬ schicht 703 eingebettet.
Elektrodenmaterial 1702 außerhalb, d.h. zwischen den weiteren zweiten Elektroden 702 bzw. zwischen den ersten Elektroden 701 ist restfrei entfernt.
Auf die erste Elektrode 701 kann ferner eine Deckschicht 1703 beispielsweise aus Siliziumnitrid aufgebracht werden mittels eines geeigneten Beschichtungsverfahrens wie beispielsweise einem CVD-Verfahren, einem Sputterverfahren oder einem Aufdampfverfahren (vgl. Fig.l7d).
Fig.l7e zeigt mehrere erste Elektroden 1701 aus Gold, die nebeneinander in die Isolatorschicht 703 eingebettet sind und die darauf sich befindende Deckschicht 1703.
In einem weiteren Schritt (vgl. Fig.l7f) wird auf der Deck- schicht 1703 eine zweite Elektrodenschicht 1704 aufgebracht.
Nach erfolgter Maskierung, in der die gewünschte Öffnung zwischen den zweiten Elektroden berücksichtigt ist, die aus der zweiten Elektrodenschicht 1704 gebildet werden soll, werden die gewünschten Öffnungen 1705 gebildet und mittels eines Trockenätzverfahrens in einem Downstream-Plasma wird die zweite Elektrodenschicht 1704 geätzt derart, dass der gewünschte Hohlraum 1504 gemäß der in Fig.15 oder Fig.16 dargestellten Biosensoren 1500, 1600 gebildet wird (vgl. Fig.17g).
Es ist in diesem Zusammenhang anzumerken, dass die Deckschicht 1703 nicht unbedingt erforderlich ist, jedoch vorteilhaft ist, um die ersten Elektroden 701 vor Anätzung bei der Bildung des Hohlraums 1504 zu schützen.
In einer alternativen Ausführungsform kann die T-förmige Struktur der zweiten Elektrode 702 gebildet werden, indem nach Bilden der ersten Elektrode 701 gemäß dem oben beschrie¬ benen Verfahren eine weitere Isolatorschicht mittels eines CVD-Verfahrens oder eines anderen geeigneten Beschichtungs- verfahrens auf die erste Isolatorschicht oder, bei Existenz der Deckschicht 1703 auf der Deckschicht 1703 gebildet wird. Anschließend werden m der Deckschicht 1703 entsprechende Graben gebildet, die zur Aufnahme des ersten Schenkels 1501 der T-formigen Struktur der zweiten Elektrode 702 dienen. Diese Graben werden mit dem Elektrodenmateπal Gold gefüllt und gemäß dem Damascene-Verfahren wird mittels eines chemisch-mechanischen Polierens das Elektrodenmatenal entfernt, das sich m dem Graben und oberhalb der zweiten Isolatorschicht gebildet hat, bis auf eine vorgegebene Hohe, die der Hohe der zweiten Schenkel 1502 der T-formigen zweiten Elek- trode 702 entspricht.
Mittels Photolithographie wird die Öffnung 1505 zwischen den zweiten Elektroden 702 gebildet und anschließend wird das Isolatormaterial mittels eines Trockenatzverfahrens in einem Downstream-Plasma aus dem Volumen, das als Hohlraum 1504 ausgebildet werden soll, zumindest teilweise entfernt.
Weiterhin ist darauf hinzuweisen, dass die oben beschriebenen Ausführungsformen nicht auf eine Elektrode besenrankt ist, deren Haltebereich mittels Gold realisiert ist. Es können alternativ Elektroden mit Materialien m den Halteoereichen beschichtet sein, beispielsweise mit Siliziummonoxid oder Sili- ziumdioxid, die mit den oben dargestellten Min-, Acetoxy-, Isocyanat-, Alkysilanresten eine kovalente Verbindung bilden können zum immobilisieren von Sondenmolekulen, dieser Variante insbesondere zum immobilisieren von Liganden.
Fig.18 zeigt eine weitere Elektrodenanordnung 1800 mit mehreren • kreisförmigen ersten Elektroden 1801, auf denen jeweils e Haltebereich zum Immobilisieren von Sondenmolekulen enthalten ist, • kreisförmigen zweiten Elektroden 1802,
• kreisförmigen dritten Elektroden 1803.
Die Elektroden sind abwechselnd derart konzentrisch umeinan- der angeordnet, dass jeweils eine dritte Elektrode zwischen der ersten Elektrode und der zweiten Elektrode angeordnet ist .
Die Elektroden können sowohl als Planarelektroden als auch als zylinderförmige Elektroden mit im wesentlichen senkrechten Seitenwänden ausgestaltet sein, die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Fig.19 zeigt eine Draufsicht eines Biosensor-Arrays 1900 ge- maß einem weiteren Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung mit zylinderförmigen Elektroden 1901, 1902, 1903, in denen die Elektroden mit dem jeweils ihnen zugeordnetem elektrischen Potential dargestellt sind.
An jede erste Elektrode 1901 ist das erste elektrische Potential VI angelegt. An jede zweite Elektrode 1902 ist das zweite elektrische Potential V2 angelegt. An jede dritte Elektrode 1903 ist das dritte elektrische Potential V3 angelegt, in der gleichen Weise, wie dies im Zusammenhang mit den oben be- schriebenen Ausführungsbeispielen erläutert worden ist.
Alternativ oder zusätzlich kann das Biosensor-Array 1900 auch quaderformige Elektrode aufweisen. In diesem Dokument sind folgende Veröffentlichungen zitiert:
[1] R. Hintsche et al . , Microbiosensors Using Electrodes Made in Si-Technology, Frontiers in Biosensorics , Fundamental Aspects, edited by F. W. Scheller et al . , Dirk Hauser Verlag, Basel, S. 267 - 283, 1997
[2] N.L. Thompson, B.C. Lagerholm, Total Internal Reflection Fluoresence: Applications in Cellular Biophysics, Current Opinion in Biotechnology, Vol. 8, S. 58 - 64, 1997
[3] P. Cuatrecasas, Affinity Chromatography of Macromole- cules, Advances in Enzymology, Vol. 36, S. 29 - 89, 1972
[4] P. van Gerwen, Nanoscaled Interdigitated Electrode Arrays for Biochemical Sensors, IEEE, International Conference on Solid-State Sensors and Actuators, Chicago, S.907 - 910, 16. - 19. Juni 1997
[5] M. Paeschke et al, Voltammetric Multichannel Measurements Using Silicon Fabricated Microelectrode Arrays, Electroanalysis, Vol. 7, Nr. 1, S. 1 - 8, 1996
[6] R. Hintsche et al, Microbiosensors using electrodes made in Si-technology, Frontiers in Biosensorics, Fundamental Aspects, edited by F. W. Scheller et al, Birkhauser Verlag, Basel, Schweiz, 1997

Claims

Patentansprüche
1. Biosensor mit
• einer ersten Elektrode, die einen Haltebereich zum Halten von Sondenmolekulen aufweist, die makromolekulare Biopolymere binden können,
• einer zweiten Elektrode,
• einer dritten Elektrode,
• wobei die zweite Elektrode und die dritte Elektrode der- art ausgestaltet sind, dass der Reduktions-
/Oxidationsprozess im Rahmen eines Reduktions- /Oxidations-Recyclmg-Vorgangs an der zweiten Elektrode und an der dritten Elektrode erfolgt.
2. Biosensor nach Anspruch 1,
• bei dem die erste Elektrode em erstes elektrisches Potential aufweist,
• bei dem die zweite Elektrode em zweites elektrisches Potential aufweist, • bei dem die dritte Elektrode em drittes elektrisches Potential aufweist,
• wobei das dritte elektrische Potential derart gewählt wird, dass wahrend des Reduktιons-/Oxιdatιons-Recyclmg- Vorgangs die Reduktion oder Oxidation nur an der zweiten Elektrode und an der dritten Elektrode erfolgt.
3. Biosensor nach Anspruch 2,
• bei dem das dritte elektrische Potential großer ist als das erste elektrische Potential, und • bei dem das erste elektrische Potential großer ist als das zweite elektrische Potential.
4. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Haltebereich der ersten Elektrode mit einem Mate- rial beschichtet ist, das Sondenmolekule immooilisieren kann.
5. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem der Haltebereich der ersten Elektrode zum Halten von Liganden ausgestaltet ist, mit denen Peptide oder Proteine gebunden werden können.
6. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem der Haltebereich der ersten Elektrode zum Halten von DNA-Sondenmolekulen ausgestaltet ist, mit denen DNÄ-Molekule gebunden werden können.
7. Biosensor nach einer: der Ansprüche 1 bis 6, bei dem der erste Haltebereich und der zweite Haltebereich zumindest eines der folgenden Materialien aufweist:
Hydroxylreste,
Epoxidreste,
Minreste,
Acetoxyreste,
Isσcyanatreste,
Succinimidylesterreste,
Thiolreste,
Gold,
Silber,
Platin,
Titan.
8. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die Elektroden einer Interdigitalelektrodenanord- nung angeordnet sind, wobei die dritte Elektrode jeweils zwischen der ersten Elektrode und der zweiten Elektrode angeordnet ist.
9. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die Elektroden kreisförmig konzentrisch umeinander angeordnet sind, wobei die dritte Elektrode jeweils zwischen der ersten Elektrode und der zweiten Elektrode angeordnet
10. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die erste Elektrode und die zweite Elektrode und/oder die dritte Elektrode derart relativ zueinander angeordnet sind, dass sich zwischen der ersten Elektrode und der zweiten Elektrode und/oder der dritten Elektrode im wesentlichen un- gekrümmte Feldlinien eines zwischen der ersten Elektrode und der zweiten Elektrode und/oder der dritten Elektrode erzeugten elektrischen Feldes ausbilden können.
11. Biosensor-Array mit • einer Vielzahl erster Elektroden, die einen Haltebereich zum Halten von Sondenmolekülen aufweisen, die makromolekulare Biopolymere binden können,
• einer Vielzahl zweiter Elektroden,
• einer Vielzahl dritter Elektroden, • wobei die zweiten Elektroden und die dritten Elektroden derart ausgestaltet sind, dass der Reduktions- /Oxidationsprozess im Rahmen eines Reduktions- /Oxidations-Recycling-Vorgangs an den zweiten Elektroden und an den dritten Elektroden erfolgt.
12. Verfahren zum Ermitteln makromolekularer Biopolymere mit einem Biosensor, der aufweist:
• eine erste Elektrode, die einen Haltebereich zum Halten von Sondenmolekülen aufweist, die makromolekulare Biopo- lymere binden können,
• eine zweite Elektrode,
• eine dritte Elektrode, a) bei dem eine zu untersuchende Lösung mit dem Biosensor in Kontakt gebracht wird, wobei die Lösung die zu erfassen- den makromolekularen Biopolymere enthalten kann, b) bei dem in der zu untersuchenden Lösung enthaltene zu erfassende makromolekulare Biopolymere an Sondenmoleküle auf der ersten Elektrode gebunden werden, wobei die gebundenen makromolekularen Biopolymere mit einem Enzym markiert sind, c) bei dem der Biosensor mit einer Spüilösung gespült wird, so dass die zu untersuchende Lösung entfernt wird, d) bei dem eine weitere Losung mit durch das Enzym spaltba¬ ren Molekülen mit dem Biosensor in Kontakt gebracht wird, e) bei dem jeweils em spaltbares Molek l jeweils in em er¬ stes Teilmolekul einer ersten Ladung und in e zweites Teilmolekul einer zweiten Ladung aufgespaltet wird, f) bei dem das erste Teilmolekul an der dritten Elektrode oxidiert oder reduziert wird, und g) bei dem das oxidierte oder reduzierte erste Teilmolekul an der zweiten Elektrode reduziert bzw. oxidiert wird, so dass em Reduktιons-/Oxιdatιons-Recyclmg-Vorgang zwischen der dritten Elektrode und der zweiten Elektrode durchgeführt wird, h) bei dem abhangig von dem Reduktιons-/Oxιdatιons-
Recyclmg-Vorgang die makromolekularen Biopolymere ermit- telt werden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem als Enzym em Enzym der folgenden Klassen verwendet wird: • NADH-unabhangige Dehydrogenase,
• Phenoloxidase,
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13,
• bei dem an die erste Elektrode em erstes elektrisches Potential angelegt wird,
• bei dem an die zweite Elektrode em zweites elektrisches Potential angelegt wird,
• bei dem an die dritte Elektrode em drittes elektrisches Potential angelegt wird, • wobei das dritte elektrische Potential derart gewählt wird, dass wahrend des Reduktιons-/Oxιdatιons-Recyclιng- Verfahrens die Reduktion oder Oxidation nur an der zweiten Elektrode und an der dritten Elektrode erfolgt.
15. Verfanren nach Anspruch 14,
• bei dem das dritte elektπscne Potential großer gewählt wird als das erste elektrische Potential, und bei dem das erste elektrische Potential größer gewählt wird als das zweite elektrische Potential.
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