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WO2002027319A1 - Vorrichtung zum nachweis geladener makromoleküle - Google Patents

Vorrichtung zum nachweis geladener makromoleküle Download PDF

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WO2002027319A1
WO2002027319A1 PCT/DE2001/003660 DE0103660W WO0227319A1 WO 2002027319 A1 WO2002027319 A1 WO 2002027319A1 DE 0103660 W DE0103660 W DE 0103660W WO 0227319 A1 WO0227319 A1 WO 0227319A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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sensor surface
electrically conductive
insulator layer
drop
conductive structure
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/DE2001/003660
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English (en)
French (fr)
Inventor
Max Lemme
Margarete Odenthal
Wolfgang Henschel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SANTRON AG
Original Assignee
SANTRON AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SANTRON AG filed Critical SANTRON AG
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N27/4145—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS specially adapted for biomolecules, e.g. gate electrode with immobilised receptors

Definitions

  • the subject of the present patent application is a device for the detection of macromolecules in a sample solution according to the preamble of the main claim.
  • a variety of methods are known for the detection of macromolecules in a sample solution. Some of these methods are based on a specific reaction of the macromolecules to be detected with so-called capture molecules, this reaction having a high specificity for the macromolecules to be detected. Such is e.g. observed in a hybridization reaction of macromolecules that have a double-stranded equilibrium conformation. An example of this is e.g. the hybridization of a DNA sequence in which two complementary single strands combine to form a double-stranded molecule. Furthermore, a high specificity also occurs, for example, in antibody-antigen reactions.
  • the detection methods mentioned are usually based on the fact that the macromolecules to be detected are provided with suitable markings and are enriched at this interface by means of specific reactions with labeled detection molecules which are fixed at an interface and are therefore present in a concentration which is a detection of the marking make possible. For example, a stimulated light emission of the fluorescent markers from the interface can be observed or the radioactive radiation resulting from the decay of the radioactive markers can be monitored. be shown.
  • US Pat. No. 5,164,319 discloses a capacitive detection method for macromolecules in solution, which is based on the observation that many macromolecules are in dissociated form in solution and thus sometimes have a high charge (depending on the size of the macromolecule up to a few thousand elementary charges) can wear. Through a specific detection reaction with capture molecules fixed on a carrier surface, a strong accumulation of charged macromolecules on the carrier surface can be achieved, which can be detected with a capacitive measuring method.
  • the disclosure content of US Pat. No. 5,164,319 is hereby fully made the subject of the present patent application, and reference is also made explicitly to the documents mentioned in US Pat. No. 5,164,319.
  • a layer system consisting of a doped semiconductor and an insulator located thereon is used as the carrier.
  • the (electrically conductive) sample solution is in contact with the insulator.
  • the entire semiconductor / isolator / test solution system forms a capacitor whose capacitance can be detected using suitable measuring methods which are already known from the prior art.
  • suitable measuring methods which are already known from the prior art.
  • An example of this is the publication by Hewlett Packard, Application Note 322, Analysis of Semiconductor Capacitan ce characteristics, e.g. Called BS2. This also shows the CU characteristic curve (capacitance C versus applied voltage U) of such a capacitor consisting of a semiconductor / insulator / conductor transition.
  • the device known from US Pat. No. 5,164,319 for carrying out the capacitive measuring method mentioned works with sensor surfaces which are applied to the surface of a surface-oxidized, doped silicon carrier. Each sensor surface is provided with an individual electrode on the back. Such an electrode / semiconductor / insulator layer system is introduced with the conductive sample solution, which also contains an inert counter electrode.
  • the C-U characteristic of the aqueous condenser system formed in this way can be determined by means of suitable measuring methods, which can be found in detail in US Pat. No. 5,164,319.
  • This device has a number of disadvantages.
  • a large amount of sample solution is required to cover the entire array, which in many cases is not available.
  • the detection sensitivity achieved which is in the range of micromoles / liter of the macromolecules to be detected, is clearly too low to enable the device to be e.g. to be able to use in analytical medicine.
  • wet chemical work more precisely electro chemical work here. This makes simple use in a laboratory more difficult.
  • the device should be suitable for building an array. she should be easy to handle.
  • test solutions can be tested, which is in complete contrast to the prior art mentioned.
  • the pure solvent can be used as a test solution.
  • a mixture of solvent and the macromolecules to be detected can then be used as the sample solution.
  • any additive can be added to the pure solvent as a test solution, and any additive can also be added to a test solution composed of solvent and macromolecules. Different temperatures can be used. Overall, the measurement can therefore be made much more differentiated than is possible according to the prior art.
  • the sensor surface together with the part, the electrically conductive structure structure that is wetted by the drop of sample solution is referred to below as the wetting surface.
  • the sensor area together with the electrically conductive structure is referred to as the total area.
  • the wetting area is at most as large as the total area.
  • the entire surface is closed off in a ring shape, preferably designed by hydrophobes, of the region of the insulator layer surrounding the entire surface. At this point, the insulator layer is preferably also covered with a thick cover layer.
  • the fixation agent is located on the sensor surface.
  • a suitable agent which can be derived from the prior art for the respectively selected sample solution and holds on the insulator layer, is provided here.
  • the wetting area is limited by mechanical measures. This is to be understood in particular as a circumferential wall and overall a circumferential edge, by means of which the drop is forcibly delimited locally.
  • FIG. 1 is a perspective view of a sensor device according to the invention
  • FIG. 2 a representation corresponding to FIG. 1 of a total of seven sensors on a common substrate
  • FIG. 3 a perspective view like FIG. 1 of an individual sensor device, but now with a drop of a sample solution
  • n- or p-doped silicon cuboid serves as the semiconductor 1, the conductivity of which is typically set to 1 to 100 ohmmeter.
  • the thickness of the silicon cuboid is approximately 550 micrometers.
  • a full-surface metallic counter electrode 15 made of a typical electrode material is applied, e.g. a thermally vapor-deposited or sputtered, coherent Al film with a thickness of about 200 nm, the thickness of which is in any case sufficient to form metallic properties. It is connected to a connection of a measuring device 27.
  • An HP 4280 A device from Hewlett Packard is used.
  • the top of the silicon cuboid is oxidized to a depth of approximately 20 nm, so that a non-conductive SiO 2 insulator layer 3 is located on the surface of the silicon wafer.
  • the methods required for this are known from the prior art.
  • a metallic layer is applied to the entire surface of the insulator layer 3, which is then suitably structured using photolithographic methods, so that a conductive structure 7 forms on the surface of the insulator layer 3.
  • the metallic layer is, for example, an evaporated or sputtered aluminum, titanium, chromium, gold, silver or platinum film with a thickness that is at least sufficient to remove formation of metallic properties is considered. Typical film thicknesses are in the range of a few hundred nanometers.
  • Photolithographic methods are preferably used to structure the metallic layer, i.e. after the full-surface evaporation of a metal film made of aluminum with a thickness of 200 nm, application of a photoresist to the entire surface of this metal film, exposure of the photoresist through a suitably structured mask, removal of the exposed photoresist, subsequent etching of the exposed surface with an etching solution suitable for metal removal and, if appropriate, removal of the remaining photoresist.
  • Corresponding methods are also known from the prior art.
  • other structuring methods such as electron beam or ion beam exposure are also possible, the choice of the suitable structuring method depends primarily on the structure sizes to be achieved. Ion implantation is also suitable for producing the structure 7.
  • FIG. 1 shows a ring shape for the structure 7, the outside diameter of which is approximately 0.5 to 1 millimeter.
  • the ring width is approximately 100 to 300 micrometers, so that in the center of the ring structure there is a sensor surface 9 with a diameter of approximately 500 micrometers, in which the surface of the insulator layer 3 is freely accessible.
  • Capture molecules 17, which show a specific chemical reaction with the macromolecules to be detected, can now be applied to this sensor surface 9 by means of suitable method steps, which are also known from the prior art.
  • This can be, for example, the complementary sequence to a single-stranded polynucleotide sequence to be detected.
  • the capture molecules 17 are preferably chemically fixed on the surface of the insulator layer 3, for example by chemical reaction of specific chemical end Groups with a, preferably chemically absorbed, linker layer 19 applied to the sensor surface 9. Details on this are known from the prior art and are based primarily on the chemical properties of the insulator layer 3 and the available end groups of the capture molecules 17.
  • the Insulator layer 3 in the center of the electrically conductive structure 7, that is to say the sensor surface 9, together with the catcher molecules 17 applied or fixed thereon is referred to as the prepared sensor surface 9.
  • the electrically conductive (ring) structure 7 is connected to a connection surface 23 via a feed line 21.
  • the second connection line of the measuring device 27 for detecting changes in capacitance is connected to this connection area.
  • Terminal area 23 and feed line 21 are likewise produced photolithographically, preferably in one operation with the production of the electrically conductive structure 7.
  • FIG. 2 shows an array arrangement of the device according to the invention shown in FIG. 1, which can advantageously be produced by means of photolithographic processes.
  • An array arrangement can be used for the massively parallel analysis of individual drops of a sample solution for a large number of different macromolecules. A corresponding procedure is e.g. known from the detection of polynucleotide sequences by means of labeling with fluorescent dyes. Overall, the array arrangement can also be introduced into a sufficiently large volume of sample solution.
  • FIG. 3 shows the device according to the invention shown in FIG. 1 in contact with a drop of sample solution 5.
  • This drop has a defined volume of typically a few nanoliters. Drops of this size can be generated using standard pipetting methods.
  • the drop 5 is preferably produced using an automated positioning device positioned and deposited on the sensor surface 9.
  • a fixing means which essentially fixes the position of the drop 5 on the sensor surface 9.
  • the surface of the insulator layer 3 located outside the electrically conductive structure 7 can be removed by the targeted application of a hydrophobic monolayer, e.g. of OTS, hydrophobized so that a drop 5 of the sample solution applied to this area has a high contact angle, preferably greater than 45 °, in particular in the range of 90 ° and above.
  • the surface of the electrically conductive structure 7 is preferably metallic, which generally results in good wettability by aqueous solutions. Many clean metal surfaces, e.g. of precious metals, show complete wettability by water, characterized by a contact angle of 0 °.
  • the sensor surface 9 is preferably also hydrophilized by targeted application of a monolayer of suitable molecules, so that a low to vanishing contact angle of the sample solution is also formed on the sensor surface 9.
  • the surface of the electrically conductive structure 7 and the sensor surface 9 is thus made hydrophilic, whereas the surrounding free surface of the insulator layer 3 is made hydrophobic, ie there is a targeted wetting contrast between the electrically conductive structure 7 and the sensor surface 9 on the one hand and the free surface of the insulator layer 3 on the other hand set.
  • the drop 5 of the sample solution can largely be completely applied to the sensor surface 9 and the electrical rically conductive structure 7 are set.
  • the entirety of the wetting properties with the monolayers that may be applied to the surface of the insulator layer thus represents the fixing agent according to the invention in this embodiment.
  • the hydrophilic formation of the sensor surface 9 is preferably carried out before the capture molecules 17 are applied, but it can also be carried out afterwards.
  • the drop 5 can be fixed on the sensor surface 9 by means of a geometric “confinement”, ie for example the free surface of the insulator layer 3 is covered with a passivation layer 25 of great thickness (for example a few 100 nanometers PMMA (polymethyl methacrylate), which a covering of the surface of the insulator layer 3 with the sample solution due to a wall or an embankment (flank) is geometrically prevented or such a large distance between the drop and the semiconductor / insulator layer system that those parts of the drop 5 that are on the passivation layer 25 sit, no longer contribute to the capacitive measurement signal.
  • a geometric “confinement” ie for example the free surface of the insulator layer 3 is covered with a passivation layer 25 of great thickness (for example a few 100 nanometers PMMA (polymethyl methacrylate), which a covering of the surface of the insulator layer 3 with the sample solution due to a wall or an embankment (flank) is geometrically prevented or such
  • FIG. 4 finally shows a top view of an optical microscopy image of an array of phototrophotographically produced devices according to the invention, the structure of which corresponds to that of FIG. 1 (200 nm Al structure on 20 nm SiO 2 on 550 micrometers p-Si).
  • the fixing agent 13 is covered by the (optically visible) electrically conductive structure 7 and a (non-visible) hydrophilic coating on the inside. Ren the electrically conductive structure 7 in connection with the hydrophobic unbound surface (contact angle about 30 °) of the insulator layer 3 is formed.
  • the drop spreads out to the outer edge of the hydrophilic, electrically conductive structure 7, that is to say over the entire surface.
  • the measurement methods and measurement structures on which the invention is based were first verified by measurements with solvents of different pH values. There were no macromolecules in the solvent.
  • the surface potential of the isolator varies due to a shift in the protolysis balance.
  • the surface potential is determined by the following reactions:
  • the measurements were carried out in sodium hydrogen phosphate buffer (10 mm) at pH values of 5, 7 and 9 and a volume of 500 nL. In the voltage range from -5 V to 1 V, the capacitance was ner AC voltage with 20 mV amplitude and a frequency of 100 kHz measured.
  • the CU characteristic curves obtained for the doped semiconductor 1, insulator layer 3 made of SiO2 and buffered aqueous solution are shown in FIG. 5.
  • linearized plasmid 156 was isolated in a polylinker Hind III in a con- concentration of 10 ng / ⁇ l.
  • the primers 65 and 19 used for the synthesis were present in a working solution with a concentration of 10 ⁇ M.
  • the PCR reactions were carried out in a PTC 200 from MJ Research Inc.
  • Double-stranded PCR Double-stranded PCR:
  • the samples were transferred to QuixSep dialysis vials from Membrane Filtration Products, Inc.
  • the dialysis tubing from Roth used had a pore size of 25 to 50 angstroms. It was dialyzed twice in a 1000-fold volume of chromatography water for 1 hour each.
  • the concentrations were determined spectrophotometrically at a wavelength of 260 nm.
  • Solution medium here chromatography water (see dialysis)
  • this sequence carries fewer or more charges which, when adsorbed on the prepa- rated sensor surface 9 to a different degree of change in the amount of charge adsorbed and thus to different shifts in the CU characteristics, ie lead to changes in the capacity of the overall system at the operating point.
  • the capacitance of the capacitor system was measured by adding an AC voltage with an amplitude of 20 mV and a frequency of 100 kHz and the flat band potential was determined.
  • FIG. 6 shows, a clear and clearly distinguishable shift of the flat band potential by 16 mV between single and double stranded DNA could be demonstrated with identical DNA concentration and length.
  • a device according to the invention according to the above embodiment has sufficient accuracy to detect a total particle count of approximately 250 femtomoles in a drop of approximately 500 nanoliters.
  • An improvement in the measuring accuracy can also be achieved by measuring a sample solution on a first device according to the invention against a reference solution on a second device according to the invention, ie in FIG. 6 the relative position of the "ss" (single stranded) and "ds" ( double stranded) designated measurement points compared to the measurement point designated "H 2 O" is determined.
  • hydrophilic adhesion promoters are suitable as fixatives.
  • fixing agents are: silanes, in particular aminosilanes and epoxysilanes; Polyamines (poly-L-lysine); dextran; chitosan; Polymethacrylic acids; Poly (methacrylol oxypropyl (trimethyl ammonium)) or polyamides.
  • the silanes are hydrophobic, the other substances are hydrophilic.
  • Examples of the opposite, ie substances for finishing the surfaces in such a way that they do not accumulate, are: polystyrene; Polymethyl methacrylates; Polytetrafluoroethylene, polyfluoroethylene. Hydrophobic substances are particularly suitable for this equipment.

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Abstract

Die Vorrichtung zum Nachweis geladener Makromoleküle, insbesondere von Polynucleotidsequenzen, in einem elekt-risch leitfähigen Lösemittel basiert auf einer Kapazitätsmessung an einem Schichtsystem aus einer das Lösemittel aufweisenden Probelösung, einem Isolator und einem Halbleiter. Auf der Oberfläche des dotierten Halbleiters (1) befindet sich eine Isolatorschicht (3). Ein Teilbereich der Oberfläche der Isolatorschicht (3) ist als Sensorfläche (9) zur selektiven Anlagerung, der nachzuweisenden Makromoleküle ausgebildet. Auf die Sensorfläche (9) wird ein Tropfen (5) der Probelösung auf sie aufgebracht. Auf die Isolatorschicht (3) in unmittelbarer Nachbarschaft der Sensorfläche (9) befindet sich eine elektrisch leitfähige Struktur (7), die einen elektrischen Kontakt mit diesem Tropfen (5) herstellt. Auf die Sensorfläche (9) ist ein Fixierungsmittel (13) aufgebracht, welches dazu vorgesehen ist, die räumliche Lage des Tropfens (5) festzulegen. Die Sensorfläche (9) ist räumlich begrenzt und es ist eine Messvorrichtung (9) zur Erfassung von Kapazitätsänderungen des aus Halbleiter (1) / Isolatorschicht (3) / Sensorfläche (9) und Tropfen (5) gebildeten Kondensatorsystems vorgesehen.

Description

Bezeichnung: Vorrichtung zum Nachweis geladener Makromoleküle
Gegenstand der vorliegenden Patentanmeldung ist eine Vorrichtung zum Nachweis von Makromolekülen in einer Probelösung gemäß des Oberbegriffs des Hauptanspruchs.
Es sind vielfältige Verfahren zum Nachweis von Makromolekülen in einer Probelösung bekannt. Ein Teil dieser Verfahren basiert auf einer spezifischen Reaktion der nachzuweisenden Makromoleküle mit sogenannten Fängermolekülen, wobei diese Reaktion eine hohe Spezifität für die nachzuweisenden Makromoleküle aufweist. Eine solche wird z.B. bei einer Hybridisierungs- reaktion von Makromolekülen, die eine doppelsträngige Gleichgewichtskonformation aufweisen, beobachtet. Beispiel hierfür ist z.B. die Hybridisierung einer DNA-Sequenz, bei der sich zwei komplementäre Einzelstränge zu einem doppelsträngigen Molekül vereinigen. Weiterhin tritt eine hohe Spezifität beispielsweise auch bei Antikörper-Antigenreaktionen auf.
Die erwähnten Nachweisverfahren basieren in der Regel darauf, dass die nachzuweisenden Makromoleküle mit geeigneten Markierungen versehen werden und mittels spezifischer Reaktionen mit markierten Nachweismolekülen, die an einer Grenzfläche fixiert sind, an dieser Grenzfläche angereichert werden und damit in einer Konzentration vorliegen, die eine Erfassung der Markierung möglich machen. So kann z.B. eine stimulierte Lichtemission der fluoreszierenden Marker von der Grenzfläche beobachtet oder die vom Zerfall der radioaktiven Marker herrührende radioaktive Strahlung nachge- wiesen werden.
Eine derartige Markierung der nachzuweisenden Makromoleküle weist jedoch Nachteile auf. So müssen Verfahren zur Markierung der nachzuweisenden Makromoleküle entwickelt werden. Die Markierung darf die Moleküleigenschaften möglichst wenig verändern. Weiterhin macht die Markierung zusätzliche Arbeitsschritte im Rahmen des Nachweisverfahrens erforderlich. Neuere Nachweisverfahren konzentrieren sich darauf, intrinsische Moleküleigenschaften zum Nachweis zu verwenden, um eine Markierung überflüssig zu machen.
So ist aus der US 5, 164,319 ein kapazitives Nachweisverfahren für Makromoleküle in Lösung bekannt, welches auf der Beobachtung beruht, dass viele Makromoleküle in Lösung in dissoziierter Form vorliegen und damit teilweise eine hohe Ladung (je nach Größe des Makromoleküls bis zu einigen tausend Elementarladungen) tragen können. Durch eine spezifische Nachweisreaktion mit auf einer Trägeroberfläche fixierten Fängermolekülen kann eine starke Anreicherung von geladenen Makromolekülen an der Trägeroberfläche erzielt werden, welche mit einem kapazitiven Messverfahren nachgewiesen werden kann. Hiermit wird der Offenbarungsgehalt der US 5, 164,319 vollumfänglich zum Gegenstand der vorliegenden Patentanmeldung gemacht, weiterhin wird explizit auf die in der US 5, 164,319 genannten Dokumente Bezug genommen.
Dabei wird als Träger ein Schichtsystem aus einem dotierten Halbleiter und einem darauf befindlichen Isolator verwendet. Die (elektrisch leitfähige) Probelösung ist in Kontakt mit dem Isolator. Das Gesamtsystem Halbleiter / I- solator / Probelösung bildet einen Kondensator dessen Kapazität mit geeigneten Messverfahren erfasst werden kann, die aus dem Stand der Technik bereits bekannt sind. Beispielhaft hierfür sei die Veröffentlichung der Fa. Hewlett Packard, Application Note 322, Analysis of Semiconductor Capacitan- ce Characteristics, z. B. S.2, genannt. Hieraus ist auch die C-U-Kennlinie (Kapazität C über angelegter Spannung U) eines solchen aus einem Halbleiter / Isolator / Leiter - Übergang bestehenden Kondensators ersichtlich.
Bei der spezifischen Nachweisreaktion der in der Probelösung gelösten und in Lösung dissozierten, nachzuweisenden Makromoleküle mit an der Isolatoroberfläche fixierten Fängermolekülen findet eine starke Anreicherung von Ladungen an der Isolatoroberfläche statt. Diese Anreicherung führt zu einer Verschiebung von Ladungsträgern im Halbleiter und damit zu einer Veränderung der Kapazität des aus Halbleiter / Isolator / Probelösung bestehenden Kondensators, welche erfasst werden kann. Es tritt eine Verschiebung der C-U-Kennlinie des Kondensators auf, die leicht detektiert werden kann, z.B. indem die Kapazität des Kondensators an einem geeignet gewählten Arbeitspunkt erfasst wird. Als Arbeitspunkt wird hierzu vorteilhaft ein Punkt hoher Steigung der C-U-Kennlinie gewählt. Hierzu wird in Rahmen der Ausführungsbeispiele genauer ausgeführt, Details können auch der US 5,164,319 entnommen werden.
Die zur Durchführung des genannten kapazitiven Messverfahrens aus der US 5, 164,319 bekannte Vorrichtung arbeitet mit Sensorflächen, die auf die Oberfläche eines oberflächlich oxidierten, dotierten Silizium-Trägers aufgebracht sind. Rückseitig ist jede Sensorfläche mit einer individuellen Elektrode versehen. Ein solches Elektrode /Halbleiter / Isolator-Schichtsystem wird die leitfähige Probelösung eingebracht, in der sich auch eine inerte Gegenelektrode befindet. Mittels geeigneter Messverfahren, die der US 5, 164,319 im Detail entnommen werden können, kann die C-U-Kennlinie des dergestalt gebildeten, wässrigen Kondensatorsystems bestimmt werden.
Um eine hohe Effizienz des Nachweisverfahrens zu erzielen, ist es aus dem Stand der Technik bekannt, das Verfahren mit einem Array von geeigneten Vorrichtungen gleichzeitig mit einer Vielzahl von verschiedenen Fängermole- külen an einer gemeinsam zu untersuchenden Probelösung durchzuführen. Hierzu ist aus der US 5164,319 ein Array o.g. Kondensatoren individuellen Sensorflächen bekannt, die alle jeweils rückseitige Elektroden aufweisen und elektrisch gegeneinander isoliert ausgeführt sind. Vorderseitig wird die gesamte Array-Oberfläche einheitlich von der Probelösung bedeckt und diese mittels einer für alle Kondensatoren gemeinsamen Gegenelektrode kontaktiert.
Diese Vorrichtung weist eine Reihe von Nachteilen auf. So ist zur Bedeckung der gesamten Arrays eine große Menge von Probelösung erforderlich, die in vielen Fällen nicht zur Verfügung steht. Die erzielte Nachweisempfindlichkeit, die im Bereich von Mikromol/ Liter der nachzuweisenden Makromoleküle liegt, ist deutlich zu gering, um die Vorrichtung z.B. in der analytischen Medizin einsetzen zu können. Weiterhin muss nasschemisch, hier genauer elektrochemisch gearbeitet werden. Dadurch wird ein einfacher Einsatz in einem Labor erschwert.
Die erwähnte relativ grosse Menge von Probelösungen wird für einen einzigen Versuch benötigt. Hierin liegt der Nachteil, dass individuelle Entwicklungen nicht im Einzelnen überprüft oder in nachfolgenden Messungen studiert werden können. Es hat sich gezeigt, dass es auf den einzelnen Sensor- flächen zu Anlagerungen verschiedenster Art kommen kann, die nicht einzeln studiert werden können. Eine Nullmessung ohne nachzuweisende Moleküle und nur mit dem Lösemittel benötigt eine gesamte Anordnung mit einem kompletten Array.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, eine Vorrichtung anzugeben, die gegenüber der vorbekannten Vorrichtung eine deutlich erhöhte Nachweisempfindlichkeit aufweist und zudem eine verringerte Menge von Probelösung für die Durchführung des Nachweisverfahrens benötigt. Schließlich soll die Vorrichtung zum Aufbau eines Arrays geeignet sein. Sie soll einfach handhabbar sein.
Gelöst wird diese Aufgabe durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Hauptanspruchs.
Mit dieser Vorrichtung und mit dem sich bei Benutzung der Vorrichtung einstellenden Verfahren kann gezielt mit einer sehr geringen Menge an Probelösungen gearbeitet werden. Es wird jeweils nur die Sensorfläche ein- schliesslich zumindest eines Teils der elektrisch leitfähigen Struktur benetzt. Jedenfalls ist eine grössere Benetzung nicht erforderlich. Dies bedeutet, dass die jeweilige Menge an Probelösungen sehr gering sein kann.
Auf diese Weise können unterschiedliche Probelösungen getestet werden, dies ist ganz im Gegensatz zum genannten Stand der Technik. Als Probelösung kann zunächst das reine Lösemittel eingesetzt werden. Dann kann als Probelösung eine Mischung aus Lösemittel und den nachzuweisenden Makromolekülen eingesetzt werden. Weiterhin kann als Probelösung dem reinen Lösemittel ein beliebiger Zusatz beigegeben werden, auch einer Probelösung aus Lösemittel und Makromolekülen kann ein beliebiger Zusatz beigegeben werden. Es kann mit unterschiedlichen Temperaturen gearbeitet werden. Insgesamt kann die Messung daher wesentlich differenzierter gemacht werden, als dies nach dem Stand der Technik möglich ist.
Die einzelnen Tropfen an Probelösung werden jeweils auf die Sensorflächen und die sich daran unmittelbar anschlies senden elektrisch leitfähigen Strukturen aufgebracht. Eine komplette Flüssigkeitszelle wie beim Stand der Technik ist nicht erforderlich. Damit entfallen auch alle elektrochemischen Massnahmen, die mit einer grösseren Flüssigkeitszelle als beim Stand der Technik verbunden sind.
Die Sensorfläche zusammen mit dem Teil, der elektrisch leitfähigen Struk- tur, die von dem Tropfen an Probelösung benetzt wird, wird im folgenden als Benetzungsfläche bezeichnet. Die Sensorfläche zusammen mit der elektrisch leitfähigen Struktur wird als Gesamtfläche bezeichnet. Die Benetzungsfläche ist höchstens so gross wie die Gesamtfläche. Die Gesamtfläche ist nach aus- sen hin ringförmig abgeschlossen, vorzugsweise durch Hydrophobe ausgestaltet des die Gesamtfläche umgebenden Bereichs der Isolatorschicht. Vorzugsweise ist die Isolatorschicht an dieser Stelle auch mit einer dicken Deckschicht abgedeckt.
Auf der Sensorfläche befindet sich das Fixierungsmittel. Hier ist ein geeignetes, aus dem Stand der Technik für die jeweils gewählte Probelösung ableitbares Mittel, das auf der Isolatorschicht hält, vorgesehen.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird die Benetzungsfläche durch mechanische Massnahmen begrenzt. Hierunter ist insbesondere ein umlaufender Wall und insgesamt ein umlaufender Rand zu verstehen, durch den der Tropfen zwangsweise örtlich begrenzt wird.
Weitere Merkmale und Vorteile ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie den nun folgenden Ausführungsbeispielen, die anhand der Zeichnung erläutert werden In dieser zeigen:
Fig. 1 : eine perspektivische Darstellung einer Sensorvorrichtung nach der Erfindung,
Fig. 2: eine Darstellung entsprechend Figur 1 von insgesamt sieben Sensoren auf einem gemeinsamen Substrat,
Fig. 3: eine perspektivische Darstellung wie Figur 1 einer einzelnen Sensorvorrichtung, jedoch nunmehr mit einem Tropfen einer Probelösung,
Fig. 4: eine Wiedergabe eines optischen Mikroskopiebildes eines Arrays photolithographisch hergestellter, erfindungsgemässer Nachweisvorrichtungen in Aufsicht, gezeigt ist ein Ausschnitt, Fig. 5: ein Diagramm für die Abhängigkeit der Kapazität C in pF von der Spannung U in V und
Fig. 6: ein Diagramm für drei Messpunkte für die Flachbandspannung Ufb in V bei drei unterschiedlichen Probelösungen, nämlich einmal reines Wasser, einmal Einzelstrang-DNA ss im Lösemittel Wasser und einmal Doppelstrang-DNA ds im Lösemittel Wasser.
Im Rahmen des Ausführungsbeispiels gem. Figur 1 wurde eine Vorrichtung mit dem folgenden Aufbau realisiert:
Als Halbleiter 1 dient ein n- oder p-dotierter Silizium-Quader, dessen Leitfähigkeit typisch auf 1 bis 100 Ohmmeter eingestellt ist. Die Dicke des Silizium-Quaders beträgt etwa 550 Mikrometer. Rückseitig eine vollflächige metallische Gegenelektrode 15 aus einem typischen Elektrodenmaterial aufgebracht ist, z.B. ein thermisch aufgedampfter oder aufgesputterter, zusammenhängender Al-Film mit einer Dicke von etwa 200 nm, dessen Dicke jedenfalls zur Ausbildung metallischer Eigenschaften ausreicht. Er ist mit einem Anschluss einer Messvorrichtung 27 verbunden. Es wird ein Gerät HP 4280 A der Firma Hewlett Packard verwendet.
Der Silizium-Quader ist oberseitig bis zu einer Tiefe ca. 20 nm oxidiert, so dass sich an der Oberfläche des Silizium- Wafers eine nichtleitende Siθ2- Isolatorschicht 3 befindet. Die hierzu benötigten Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Auf die Isolatorschicht 3 wird oberseitig vollflächig eine metallische Schicht aufgebracht, die anschliessend mittels photolithographischer Methoden geeignet strukturiert wird, so dass sich auf der Oberfläche der Isolatorschicht 3 eine leitfähige Struktur 7 ausbildet. Als metallische Schicht kommt z.B. ein aufgedampfter oder aufgesputterter Aluminium-, Titan-, Chrom-, Gold-, Silber oder Platinfilm mit einer Dicke, die mindestens ausreichend zur Aus- bildung metallischer Eigenschaften ist, in Betracht. Typische Filmdicken liegen im Bereich von einigen hundert Nanometern.
Zur Strukturierung der metallischen Schicht werden vorzugsweise photolithographische Verfahren eingesetzt, d.h. nach dem vollflächigen Aufdampfen eines Metallfilms aus Aluminium einer Dicke von 200 nm Aufbringen eines Photolackes auf die gesamte Oberfläche dieses Metallfilms, Belichten des Photolackes durch eine geeignet strukturierte Maske, Entfernen des belichteten Photolackes, nachfolgendes Ätzen der freigelegten Oberfläche mit zum Metallabtrag geeigneter Ätzlösung und gegebenenfalls Entfernen des restlichen Photolackes. Entsprechende Verfahren sind ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt. Alternativ hierzu kommen auch andere Strukturie- rungsverfahren wie Elektronenstrahl- oder Ionenstrahlbelichtung in Frage, die Wahl des geeigneten Strukturierungsverfahren richtet sich in erster Linie nach den zu erzielenden Strukturgrößen. Auch Ionenimplantation ist geeignet zur Herstellung der Struktur 7.
In Figur 1 ist eine Ringform für die Struktur 7 gezeigt, deren Aussendurch- messer etwa 0,5 bis 1 Millimeter beträgt. Die Ringbreite beträgt etwa 100 bis 300 Mikrometer, so dass sich im Zentrum der Ringstruktur eine Sensorflä- che 9 mit einem Durchmesser von etwa 500 Mikrometern befindet, in der die Oberfläche der Isolator Schicht 3 frei zugänglich ist.
Auf diese Sensorfläche 9 können nunmehr mittels geeigneter Verfahrensschritte, die ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt sind, Fängermoleküle 17 aufgebracht werden (siehe Figur 4), die eine spezifische chemische Reaktion mit den nachzuweisenden Makromolekülen zeigen. Hierbei kann es sich zum Beispiel um die komplementäre Sequenz zu einer einzelsträngig vorliegenden, nachzuweisenden Polynucleotidsequenz handeln. Die Fängermoleküle 17 sind vorzugsweise an der Oberfläche der Isolatorschicht 3 chemisch fixiert, z.B. durch chemische Reaktion spezifischer chemischer End- gruppen mit einer auf die Sensorfläche 9 aufgebrachten, vorzugsweise che- misorbierten, Linkerschicht 19. Einzelheiten hierzu sind aus dem Stand der Technik bekannt und richten sich in erster Linie nach den chemischen Eigenschaften der Isolatorschicht 3 und den zur Verfügung stehenden Endgruppen der Fängermoleküle 17. Die Isolatorschicht 3 im Zentrum der elektrisch leitfähigen Struktur 7, also die Sensorfläche 9, gemeinsam mit den darauf aufgebrachten bzw. fixierten Fängermolekülen 17 wird als präparierte Sensorfläche 9 bezeichnet.
Im Aussenbereich ist die elektrisch leitfähige (Ring-) Struktur 7 über eine Zuleitung 21 mit einer Anschlussfläche 23 verbunden. An diese Anschlussfläche ist die zweite Anschlussleitung der Messvorrichtung 27 zur Erfassung von Kapazitätsänderungen angeschlossen. Anschlussfläche 23 und Zuleitung 21 sind ebenfalls photolithographisch hergestellt, vorzugsweise in einem Arbeitsgang mit der Herstellung der elektrisch leitfähigen Struktur 7.
Figur 2 zeigt eine Array-Anordnung der aus Fig. 1 ersichtlichen erfindungsgemäßen Vorrichtung, die vorteilhaft mittels photolithographischer Verfahren hergestellt werden kann. Eine Array-Anordnung kann zur massivparallelen Analyse einzelner Tropfen einer Probelösung auf eine Vielzahl verschiedener Makromoleküle eingesetzt werden. Eine entsprechende Verfahrensweise ist z.B. aus dem Nachweis von Polynucleotidsequenzen mittels Markierung mit Fluoreszenzfarb Stoffen bekannt. Die Arrayanordnung kann insgesamt auch in ein ausreichend grosses Volumen an Probelösung eingebracht werden.
Fig. 3 zeigt die aus Fig. 1 ersichtliche erfindungsgemäße Vorrichtung in Kontakt mit einem Tropfen Probelösung 5. Dieser Tropfen weist ein definiertes Volumen von typisch einigen Nanolitern auf. Tropfen dieser Größe können mittels gängiger Pipettierungsverfahren erzeugt werden. Vorzugsweise wird der Tropfen 5 mittels einer automatisierten Positionierungsvorrichtung auf der Sensorfläche 9 positioniert und abgesetzt.
Um eine genaue Positionierung des Tropfens 5 auf der Sensorfläche 9 zu erhalten, ist ein Fixierungsmittel vorgesehen, welches die Lage des Tropfens 5 im wesentlichen auf die Sensorfläche 9 festlegt. Im diskutierten Ausführungsbeispiel ist die ausserhalb der elektrisch leitfähigen Struktur 7 gelegene Oberfläche der Isolatorschicht 3 durch gezieltes Aufbringen einer hydrophoben Monoschicht, z.B. von OTS, hydrophobisiert, so dass ein auf diesen Bereich aufgebrachter Tropfen 5 der Probelösung einen hohen Kontaktwinkel, vorzugsweise von größer als 45° aufweist, insbesondere im Bereich von 90° und darüber.
Die Oberfläche der elektrisch leitfähigen Struktur 7 ist vorzugsweise metallisch, wodurch sich im allgemeinen eine gute Benetzbarkeit durch wässrige Lösungen ergibt. Viele saubere Metalloberflächen, z.B. von Edelmetallen, zeigen vollständige Benetzbarkeit durch Wasser, gekennzeichnet durch einen Kontaktwinkel von 0°.
Die Sensorfläche 9 wird vorzugsweise ebenfalls durch gezieltes Aufbringen einer Monoschicht geeigneter Moleküle hydrophilisiert, so dass sich auch auf der Sensorfläche 9 ein niedriger bis verschwindender Kontaktwinkel der Probelösung ausbildet. Insgesamt wird also die Oberfläche der elektrisch leitfähigen Struktur 7 und der Sensorfläche 9 hydrophil ausgeführt, wohingegen die umgebene freie Oberfläche der Isolator schicht 3 hydrophobisiert wird, d.h. es wird gezielt ein Benetzungskontrast zwischen elektrisch leitfähiger Struktur 7 und Sensorfläche 9 einerseits und freier Oberfläche der Isolatorschicht 3 andererseits eingestellt. Sofern das Volumen des aufgebrachten Tropfens eine bestimmte, von der Geometrie und den Benetzungseigen- schaften der erfindungsgemäßen Vorrichtung abhängenden Wert nicht überschreitet, kann mittels des diskutierten Benetzungskontrasts der Tropfen 5 der Probelösung weitgehend vollständig auf die Sensorfläche 9 und die elekt- risch leitfähige Struktur 7 festgelegt werden. Die Gesamtheit der Benet- zungseigenschaften mit den dazu ggf. auf die Oberfläche der Isolatorschicht aufzubringenden Monoschichten stellt damit in dieser Ausführung das erfindungsgemäße Fixierungsmittel dar. Die hydrophile Ausbildung der Sensorfläche 9 erfolgt vorzugsweise vor dem Aufbringen der Fängermoleküle 17, sie kann aber auch danach erfolgen.
Alternativ hierzu kann beispielsweise eine Festlegung des Tropfens 5 auf die Sensorfläche 9 mittels eines geometrischen „confinements" geschehen, d.h. es wird beispielsweise die freie Oberfläche der Isolator schicht 3 mit einer Passivierungsschicht 25 großer Dicke (z.B. einige 100 Nanometer PMMA (Polymethylmethacrylat) bedeckt, die eine Bedeckung der Oberfläche der I- solatorschicht 3 mit der Probelösung aufgrund eines Walls oder einer Böschung (Flanke) geometrisch verhindert bzw. einen so grossen Abstand zwischen Tropfen und Halbleiter / Isolator - Schichtsystem herstellt, dass diejenigen Teile des Tropfens 5, die auf der Passivierungsschicht 25 sitzen, nicht mehr zum kapazitiven Messsignal beitragen.
Ein derartiges confinement wird in der Ausführung nach Figur 1 schon dadurch erreicht, dass sich die Sensorfläche 9 innerhalb der Struktur 7 befindet, die eine gewisse Dicke aufweist. Der Rand dieser Struktur bildet daher eine Flanke, die umläuft und die den Tropfen 5 schon zwangsläufig festhält. Es genügt schon der elektrische Kontakt dieser Seitenfläche der Struktur 7 mit dem Tropfen 5, um die elektrische Kontaktierung herzustellen.
Figur 4 zeigt schliesslich ein optisches Mikroskopiebild eines Arrays photo- lothographisch hergestellter erfindungsgemäßer Vorrichtungen in Aufsicht, deren Struktur derjenigen aus Fig. 1 entspricht (200 nm AI-Struktur auf 20 nm SiO2 auf 550 Mikrometer p-Si). In dieser experimentellen Realisierung wird das Fixierungsmittel 13 durch die (optisch sichtbare) elektrisch leitfähige Struktur 7 sowie eine (nicht sichtbare) hydrophile Beschichtung im Inne- ren der elektrisch leitfähigen Strutur 7 in Verbindung mit der hydrophoben ungebundenen Oberfläche (Kontaktwinkel etwa 30°) der Isolatorschicht 3 gebildet. Wird ein Tropfen 5 wässriger Probelösung auf die gezeigte Struktur gesetzt, so breitet sich der Tropfen bis an die äußere Berandung der hydrophilen elektrisch leitfähigen Struktur 7, also auf der Gesamtfläche, aus. Dabei wird das Innere der elektrisch leitfähigen Struktur 7, welches als Sensorfläche 9 ausgebildet ist, vollständig vom Tropfen 5 bedeckt.
Vorabmessungen an Leerstrukturen
Die der Erfindung zugrunde liegenden Messverfahren und Messstrukturen wurden zunächst durch Messungen mit Lösemitteln unterschiedlicher pH- Werte verifiziert. Dabei waren keine Makromoleküle im Lösemittel enthalten.
In Abhängigkeit von der Protonenkonzentration (pH = - log aH+ mit a = Aktivität) variiert das Oberflächenpotential des Isolators durch eine Verschiebung des Protolysegleichgewichtes. Für den vorliegenden Fall einer Isolatorschicht 3 aus Siθ2 wird das Oberflächenpotential durch die folgenden Reaktionen bestimmt:
SiOH + H+ ^ SiOH2 + SiOH + OH- <-> SiO- + H2O Anlagerungen oder Abspaltungen der Protonen von endständigen OH- Gruppen des Oxides bewirken eine Aufladung der Oberfläche, damit verbunden eine Verschiebung des Flachbandpotentials. Mit Hilfe der Nernst'schen Gleichung lässt sich die pH-Abhängigkeit des Flachbandpotentials zu 59 mV/ pH bestimmen:
E = E0 + 0,059 log aH,
Die Messungen wurden in Natriumhydrogenphosphatpuffer (lOmM) bei pH- Werten von 5 , 7 und 9 und einem Volumen von 500 nL durchgeführt. Im Spannungsbereich von -5 V bis 1 V wurde die Kapazität durch Addition ei- ner Wechselspannung mit 20 mV Amplitude und einer Frequenz von 100 kHz gemessen. Die erhaltenen C-U-Kennlinien des aus dotiertem Halbleiter 1 , Isolatorschicht 3 aus SiO2 und gepufferter wässriger Lösung sind in Fig. 5 dargestellt.
Alle Messungen zeigen eine deutliche Verschiebung der gesamten Kennlinie gegenüber der Referenzmessung auf einer unbenetzten, trockenen Struktur. Dabei wird eine geringe Streubreite der einzelnen Messungen beobachtet. Auch innerhalb der Messreihe ist ein Gang der Flachbandspannung in Abhängigkeit vom pH-Wert deutlich erkennbar.
Damit ist gezeigt, dass eine Veränderung der Oberflächenladung im Bereich der Sensorfläche 9 zu einer Verschiebung der gesamten C-U-Kennlinie des o.g. Kondensatorsystems führt. Wählt man einen Arbeitspunkt fester Spannung auf der Flanke der C-U-Kennlinie, insbesondere den dort zu beobachtenden Wendepunkt, und beobachtet die Veränderung der Kapazität durch Adsorption geladener Makromoleküle auf der Sensorfläche 9, so lässt sich eine hohe Nachweisempfindlichkeit durch einfache Messung der Kapazitätsänderung des Gesamtsystems erzielen. Innerhalb gewisser adsorbierter Ladungsmengen, d.h. Partikelzahl der nachzuweisenden Makromoleküle kann sich ein linearer oder quadratischer Zusammenhang zwischen Partikelzahl und Kapaziätsänderung ergeben.
Nukleinsäuren- Vorbereitung:
Herstellung der Nukleinsäuren:
Ausgehend von einer Insertsequenz +1 bis 646, die im Polylinker des Plas- mids pl56 inseriert war, wurde einzelsträngige und doppelstrangige DNA en- zymatisch hergestellt. Als Matritze für eine Einzelstrang- bzw. Doppelstrang- PCR wurde im Polylinker Hind III lineraisiertes Plasmid 156 in einer Kon- zentration von 10 ng / μl eingesetzt. Die verwendeteten Primer 65 und 19 für die Synthese lagen in einer Arbeitslösung mit einer Konzentration von 10 μM vor.
Die PCR-Reaktionen wurden in einem PTC 200 von MJ Research Inc. durchgeführt.
Einzelstrang-PCR:
Ansatz: PCR- Programm
5 μl Matrizen-DNA (p 156) 95°C
2 μl Primer 65 [10 μM] 30" 94°C
10 μl 10-fach Taq-Polymerase Puffer 30" 64°C
Figure imgf000016_0001
5 μl dNTP [1 mM] r 72°C
77,8 μl H2O 5^ 72°C
0,2 μl Taq-Polymerase (5 U / μl)
Doppelstrangstrang- PCR:
Ansatz: PCR-Programm
2,5 μl Matrizen-DNA (p 156) 95°C
2 μl Primer 65 [10 μM] 30" 94°C
30 x
2 μl Primer 19 30" 64°C >
10 μl 10-fach Taq-Polymerase Puffer r 72°C
5 μl dNTP [1 mM] 5~ 72°C
77,8 μl H2O
0,2 μl Taq-Polymerase (5 U / μl) Aufreinigung der Nukleinsäuren:
10 Ansätze der Einzelstrang- bzw. der Doppelstrang- PCR wurden nach der Amplifikation vereinigt und entweder einer Phenol/ Choroform-Extraktion mit anschließender Ammonium-acetat-Fällung oder einer Aufreinigung mit dem Wizzard -Purification Kit (Promega) unterzogen. Die Nukleinsäuren wurden in Chromatographie- Wasser der Firma Merck aufgenommen.
Dialyse:
Die Proben wurden in QuixSep-Dialysier-Gefäße der Firma Membrane Filtration Products, Inc. überführt. Der verwendetete Dialysierschlauch der Firma Roth hatte eine Porengröße von 25 bis 50 Angström. Es wurde zweimal im 1000-fachen Volumen Chromatographie-Wasser für jeweils 1 Stunde dialysiert.
Konzentrationsbestimmung und Kontrolle der Nukleinsäuren:
Die Konzentrationen wurden spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt.
Aliquots der Proben wurden zur Überprüfung der Reinheit von Doppelsträngen bzw. Einzelsträngen in einer Submarin-Agarose-Gelelektrophorese bei konstanter Spannung von 80 Volt aufgetrennt und ihr Laufverhalten unter einem UV-Transillumunator dokumentiert.
Ebenfalls wurden zur Kontrolle der Reinheit der Proben Schmelzkurven in einem GeneAmp 5700 der Firma Perkin Eimer Biosystems durchgeführt. Hierzu wurde SYBR-Green-Lösung der Firma FMC Bioproducts zu den Ali- quots der Proben in einer Verdünnung 1: 10000 zugeführt und das Tempe- raturprofil von 95°C bis Raumtemperatur aufgezeichnet.
Konzentrationen der C/U-gemessenen Proben
Einzelstrang-DNA Doppelstrang-DNA (Hybrid)
a. 7,5 ng /μl = 50 fmol / μl a. 15 ng / μl = 50 fmol / μl
b. 75 ng / μl = 500 fmol / μl b. 150 ng / μl = 500 fmol / μl
Es wurden zw. 100 nl und 500 nl in die C/U-Messungen eingesetzt.
Lösungsmedium: hier Chromatographie-Wasser (siehe Dialyse)
Messungen mit DNA-haltiger Probelösung
Zur Messung des Hybridisierungszustandes (Einzel- bzw. Doppelstrang) von DNA- Lösungen wurde eine 5*10"7 molare DNA- Lösung in H2O mit der oben beschriebenen DNA-Sequenz von 409 Basen bzw. Basenparen verwendet. Bei einem verwendeten Volumen von nur 500 nL pro Messung wurden damit lediglich 250 fmol DNA auf die erfindungsgemässe Vorrichtung aufgebracht.
Aufgrund der Tatsache, dass die nachzuweisenden Makromoleküle, hier die o.g. Polynucleotidsequenzen in Lösung dissozieren und damit geladen sind, tritt an der präparierten Sensorfläche 9 eine Adsorption der dissozierten Po- lynucloetidsequenzen an der Isolatoroberfläche auf. Je nach Vorliegen einer einzelsträngigen oder doppelsträngigen Polynucleotidsequenz trägt diese Sequenz weniger oder mehr Ladungen, die bei einer Adsorption auf der präpa- rierten Sensorfläche 9 zu einer unterschiedlich starken Veränderung der adsorbierten Ladungsmenge und damit zu unterschiedlichen Verschiebungen der C-U-Kennlinien, d.h. Veränderungen der Kapazität des Gesamtsystems am Arbeitspunkt führen.
Im Spannungsbereich von -5 V bis 1 V wurde die Kapazität des Kondensatorsystems durch Addition einer Wechselspannung mit 20 mV Amplitude und einer Frequenz von 100 kHz gemessen und das Flachbandpotential bestimmt.
Wie Figur 6 zeigt, konnte eine eindeutige und gut unterscheidbare Verschiebung des Flachbandpotentials um 16 mV zwischen Einzel- und Doppelstrang-DNA bei identischer DNA-Konzentration und -Länge nachgewiesen werden.
Damit ist nachgewiesen, dass eine erfindungsgemäße Vorrichtung gemäß o- benstehenden Ausführungsbeispiels eine ausreichende Genauigkeit aufweist, um eine Gesamtpartikelzahl von ca. 250 Femtomol in einem Tropfen von ca. 500 Nanolitern nachzuweisen.
Eine Verbesserung der Messgenauigkeit kann noch erzielt werden, indem eine Probelösung auf einer ersten erfindungsgemäßen Vorrichtung gegen eine Referenzlösung auf einer zweiten erfindungsgemäßen Vorrichtung gemessen wird, d.h. in Fig. 6 die relative Lage der mit „ss" (single stranded) und „ds" (double stranded) bezeichneten Meßpunkte gegenüber dem mit „H2O" bezeichneten Meßpunkt bestimmt wird.
Hierzu hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, in einer Wheatstone- Brücke eine erste erfindungsgemässe Vorrichtung und eine zweite erfin- dungsgemässe Vorrichtung anzuordnen und nur die Änderungen zwischen beiden zu erfassen. Als Fixierungsmittel kommen insbesondere hydrophile Haftvermittler in Betracht. Beispiele für Fixierungsmittel sind: Silane, insbesondere Aminosilane und Epoxysilane; Polyamine (Poly-L-Lysin); Dextran; Chitosan; Polymethac- rylsäuren; Poly(methacrylol oxypropyl (trimethyl ammonium)) oder Polyamide. Davon sind die Silane hydrophob, die anderen Substanzen hydrophil.
Beispiele für das Gegenteil, also Substanzen für die Ausrüstung der Oberflächen so, dass keine Anlagerung stattfindet, sind: Polystyrol; Polymethyl- methacrylate; Polytetrafluorethylen, Polyfluorethylen. Für diese Ausrüstung eignen sich insbesondere hydrophobe Substanzen.

Claims

Bezeichnung: Vorrichtung zum Nachweis geladener Makromoleküle
Patentansprüche
1) Vorrichtung zum Nachweis geladener Makromoleküle, insbesondere von Polynucleotidsequenzen, in einem elektrisch leitfähigen Lösemittel, basierend auf einer Kapazitätsmessung an einem Schichtsystem aus einer das Lösemittel aufweisenden Probelösung, einem Isolator und einem Halbleiter, bestehend aus einem flächenhaft ausgedehnten dotierten Halbleiter (1), auf dessen eine Oberfläche sich eine Isolatorschicht (3) befindet, wobei weiterhin ein Teilbereich der Oberfläche der Isolator Schicht (3) als Sensorfläche (9) zur selektiven Anlagerung, insbesondere Adsorption o- der Bindung der nachzuweisenden Makromoleküle ausgebildet ist, dadurch gekennzeichnet, dass: a) die Sensorfläche (9) dazu vorgesehen ist, dass ein Tropfen (5) der Probelösung auf sie aufgebracht wird, b) auf die Isolatorschicht (3) in unmittelbarer Nachbarschaft der Sensorfläche (9) eine elektrisch leitfähige Struktur (7) aufgebracht ist, welche dazu vorgesehen ist, einen elektrischen Kontakt mit diesem Tropfen (5) herzustellen, c) auf die Sensorfläche (9) ein Fixierungsmittel (13) aufgebracht ist, welches dazu vorgesehen ist, die räumliche Lage des Tropfens (5) festzulegen, d) die Sensorfläche (9) räumlich begrenzt ist e) und eine Messvorrichtung (9) zur Erfassung von Kapazitätsänderun- gen des aus Halbleiter (1) / Isolatorschicht (3) / Sensorfläche (9) und Tropfen (5) gebildeten Kondensatorsystems vorgesehen ist, welche durch Anlagerung, insbesondere Adsorption und Bindung von geladenen Makromolekülen an der Sensorfläche (9) verursacht werden.
2) Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fixierungsmittel (13) durch einen definierten Benetzungskontrast für das Lösemittel der Probelösung zwischen einerseits Isolatorschicht (3) und andererseits Sensorfläche (9) sowie ggf. elektrisch leitfähiger Struktur (7) gebildet wird.
3) Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fixierungsmittel (13) die räumliche Lage des Tropfens (5) auf der Sensorfläche (9) durch geometrische Begrenzung festlegt.
4) Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrisch leitfähige Struktur (7), die Sensorfläche (9) ringförmig umschließt.
5) Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrisch leitfähige Struktur (7) in Dünnschichttechnik auf die Isolatorschicht (3) aufgebracht ist, vorzugsweise in Form eines strukturierten Metallfilms.
6) Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probelösung die Sensorfläche (9) benetzt, vorzugsweise vollständig benetzt.
7) Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probelösung die Oberfläche der elektrisch leitfähigen Struktur (7) benetzt, vorzugsweise vollständig benetzt. 8) Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die außerhalb der Sensorfläche (9) und der elektrisch leitfähigen Struktur (7) liegende Oberfläche so ausgebildet ist, dass sie von der Probelösung unvollständig benetzt, vorzugsweise positiv nicht benetzt wird.
9) Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass auf die außerhalb der Sensorfläche (9) und der elektrisch leitfähigen Struktur (7) liegende Oberfläche der Isolatorschicht (3) eine Deckschicht (11) aufgebracht ist, deren Dicke größer ist als die Dicke der Isolator Schicht (3), vorzugsweise mindestens 5 mal größer.
10) Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Sensorfläche (9) Fängermoleküle (13) verankert, insbesondere chemisor- biert sind, an die die nachzuweisenden geladenen Makromoleküle spezifisch binden können.
11) Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zum Nachweis von im Gleichgewicht doppelsträngigen Makromolekülen vorgesehen ist, wobei die Fängermoleküle (13) durch Einzelstränge der nachzuweisenden Makromoleküle gebildet werden.
12) Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrisch leitfähige Struktur (7) eine Anschlussfläche (13) für eine elektrische Zuleitung aufweist.
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