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WO2000014226A1 - Nouvelle proteine et son procede de production - Google Patents

Nouvelle proteine et son procede de production Download PDF

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Publication number
WO2000014226A1
WO2000014226A1 PCT/JP1999/004765 JP9904765W WO0014226A1 WO 2000014226 A1 WO2000014226 A1 WO 2000014226A1 JP 9904765 W JP9904765 W JP 9904765W WO 0014226 A1 WO0014226 A1 WO 0014226A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
present
dna
cells
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1999/004765
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yasuaki Itoh
Kazuhiro Ogi
Hideyuki Tanaka
Chieko Kitada
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Priority to AU54478/99A priority Critical patent/AU5447899A/en
Priority to EP99940628A priority patent/EP1111046A4/en
Priority to CA002341326A priority patent/CA2341326A1/en
Publication of WO2000014226A1 publication Critical patent/WO2000014226A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to novel secretory proteins.
  • cytodynamics are secretory factors involved in the immune system and hematopoietic system. These include lymphokines, monoforceins, interferons, colony stimulating factors, and tumor necrosis factors.
  • Humoral factors such as peptide hormones and growth factors produced by endocrine tissues also play a very important role in maintaining homeostasis and growing. These are also being actively pursued for use as pharmaceuticals.
  • These proteinaceous factors important for living organisms have been discovered using biological activity as an index.
  • discoveries have been added using homology to known bioactive proteins as an index. Because complex organisms, especially mammals, are healthy, it is thought that there are many unknown proteinaceous factors with biological activity other than those that have been found so far.
  • an enormous number of novel genes have been found due to large-scale sequencing of cDNA libraries, etc., but the sequence information is fragmentary and inaccurate. It is not easy to select gene products.
  • the present invention includes a novel protein usable in biology, medicine, veterinary medicine and the like, a partial peptide thereof, or a salt thereof, a recombinant vector, a transformant, a method for producing the protein, the protein, and a partial peptide. And an antibody against the protein and the like.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, succeeded in discovering a cDNA having a novel nucleotide sequence that is frequently expressed in lung, trachea, stomach, and the like. They found that the protein encoded by them was a humoral factor that was actually secreted extracellularly. The present inventors have further studied based on these findings, and as a result, completed the present invention.
  • a protein or a salt thereof which comprises an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3,
  • the protein according to (1) or (2) which comprises the protein according to (1) or the partial peptide according to (2) or a salt thereof.
  • the protein of (1) or the partial peptide of (2) or a salt thereof which can be obtained by using the screening method of (5) or the screening kit of (6).
  • a pharmaceutical comprising a compound that promotes or inhibits the activity or a salt thereof,
  • (11) an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, the amino acid represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 About 50% or more (preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more) with the sequence.
  • the protein according to the above (1) which is an amino acid sequence having
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 is represented by (1) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 An amino acid sequence in which one or more (preferably about 1 to 30) amino acids have been deleted in the amino acid sequence to be deleted, (2) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 An amino acid sequence to which one or more (preferably about 1 to 30) amino acids have been added; 3 one or two amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3
  • the protein according to the above (1) which is an amino acid sequence in which the above (preferably about 1 to 30) amino acids are substituted with another amino acid, or an amino acid sequence obtained by combining them.
  • a digestive organ disease such as an immune disease, a respiratory disease such as a pulmonary dysfunction, a renal dysfunction, an infectious disease or a gastrointestinal dysfunction.
  • the present invention can be used not only for basic research such as molecular weight markers, tissue markers, chromosome mapping, genetic disease identification, primer and probe design, but also for cancer metastasis inhibition, cancer metastasis detection, and cell differentiation. It can be used for therapeutic or preventive purposes in the fields of regulation of proliferation, induction of cytotoxicity, regulation of angiogenesis, regulation of hematopoiesis, regulation of blood coagulation, infectious diseases, metabolic regulation, wound burn healing, anti-inflammation, gene therapy, etc. There is.
  • bronchial related diseases eg, bronchitis, influenza infection, bronchial asthma, upper respiratory tract, bronchiectasis, etc.
  • lung related diseases lung cancer, tuberculosis, pneumonia, emphysema, lung infarction, pulmonary infarction, pulmonary congestion, respiration Insufficiency, cystic pulmonary fibrosis, pulmonary sarcoidosis, pulmonary edema, pulmonary hypertension, pneumoconiosis, etc.
  • stomach-related diseases eg, Helicopaque Yuichi / H.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the protein of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of rat TGC-440 obtained in Example 3 and the deduced amino acid sequence.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence of mouse TGC-440 obtained in Example 4 and the nucleotide sequence. Shows the amino acid sequence deduced from.
  • FIG. 4 shows a restriction enzyme map of the animal cell expression vector pCAN618 obtained in Reference Example.
  • FIG. 5 shows the results of a Western plot performed in Example 7.
  • Control Culture supernatant of C0S7 cells transfected with pCAN618 (Opti-MEM medium containing 0.25 mM pABSF and 0.05 CHAPS was used).
  • Lane 1 transfection of pCAN618 / huTGC440, culture supernatant when using Opti-MEM medium.
  • Lane 2 culture supernatant obtained by transfecting pCAN618 / huTGC440 and using an OpU-MEM medium containing 0.25 mM pABSF.
  • Lane 3 Transfection of pCAN618 / huTGC440, culture supernatant when using Opti-MEM medium containing 0.05% CHAPS.
  • Lane 4 transfection of pCAN618 / huTGC440, culture supernatant when using Opti-MEM medium containing 0.25 mM pABSF and 0.053 ⁇ 4 CHAPS.
  • FIG. 6 shows the results of the Western blot performed in Example 8.
  • C0S7 Culture supernatant of C0S7 cells transfected with PDRL440H (using an Opti-MEM medium containing 0.25 mM pABSF and 0.05% CHAPS).
  • CHO (dhfr) culture supernatant of CHO (dhfr) cells without any transfection (using ⁇ medium containing 0.25 mpABSF and 0.05% CHAPS).
  • Lane 1 Transfection of PDRL440H and culture supernatant using ⁇ medium.
  • Lane 2 culture supernatant when PDRL440H was transfected and aMEM medium containing 0.25 InMpABSF was used.
  • Lane 3 PDRL440H transfected, culture supernatant when using MEM medium containing 0.05% CHAPS.
  • Lane 4 PDRL440H transfected, culture supernatant when ⁇ medium containing 0.25 mM pABSF and 0.05 HAPS was used.
  • FIG. 7 shows the results of the Western plot performed in Example 8.
  • C0S7 Culture supernatant of C0S7 cells transfected with PDRL440R (using an Opti-MEM medium containing 0.25 mM pABSF and 0.05% CHAPS).
  • CHO (dh fr) Culture supernatant of CHO (dhfr) cells without any transfection (using ⁇ medium containing 0.25 mM pABSF and 0.05% CHAPS).
  • Lane 1 Transfection of PDRL440R and culture supernatant using ⁇ MEM medium.
  • Lane 2 PDRL440R transfected, culture supernatant using aMEM medium containing 0.25 mM pABSF.
  • Lane 3 Culture supernatant when PDRL440R was transfected and MEM medium containing 0.05% CHAPS was used.
  • Lane 4 culture supernatant when PDRL440R was transfected and a MEM medium containing 0.25 mM pABSF and 0.05% CHAPS was used.
  • a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3 of the present invention is human Cells of warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chicks, egrets, bushes, hidges, squirrels, monkeys, etc.) , Bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells) , Mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells Or MashitsuHoso Vesicles
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 is represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, respectively.
  • the protein of the present invention since the protein of the present invention usually has a signal peptide, the protein can be efficiently secreted extracellularly.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3 of the present invention include, for example, the aforementioned SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: Has an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, and is substantially the same as a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 Proteins having the following properties are preferred.
  • Substantially the same properties include, for example, being secreted and acting as a humoral factor. Substantially the same means that those properties are qualitatively the same. Therefore, properties such as secretory action and solubility are equivalent (eg, about 0.1 to 10
  • Examples of the protein of the present invention include: (1) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 Or one or more (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably a number (1 to 5)) of amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 2 or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 (preferably about 1 to 30 amino acids, preferably 1 to 10 amino acids) An amino acid sequence to which about 1 amino acid is added, and more preferably a number (1 to 5) of amino acids; 3 1 or 2 or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 ( Preferably, about 1 to 30 amino acids, preferably about 1 to 10 amino acids, and more preferably about 1 to 5 amino acids are inserted.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 An amino acid sequence in which one or more (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably about 1 to 5) amino acids have been substituted with another amino acid; Or ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ so-called mucins such as proteins containing an amino acid sequence obtained by combining them are also included.
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited, but may be any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3. Examples include positions other than the amino acid sequence common to the amino acid sequences represented by the respective SEQ ID NOs.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) according to the convention of peptide labeling.
  • the protein of the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, usually has a carboxyl group (—COOH) or carboxylate (—COO) at the C-terminus, but has an amide at the C-terminus. (—CONH 2 ) or ester (one C ⁇ R).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, alkyl groups such as isopropyl or n _ butyl, Shikuropen chill, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example, phenyl, 2 Ariru groups such as ⁇ - naphthyl, for example, benzyl, in addition to C 7 _ Ararukiru group such as phenylene Lou C doctor 2 alkyl or ⁇ - naphthylmethyl Fei one Nafuchiru C _ 2 alkyl groups, such as such as phenethyl, oral Widely used as ester for A bivaloyloxymethyl group or the like is used.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminal, the protein of the present invention includes a carboxyl group amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the amino group at the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) is protected with a protecting group (eg, an acyl group such as formyl group or acetyl group, etc.).
  • a protecting group eg, an acyl group such as formyl group or acetyl group, etc.
  • Substituent on the side chain of amino acid in the molecule eg, --OH, --SH, amino group, benzimidazol-group, i Ndoru group, Guanijino group, etc.
  • a suitable protecting group e.g., protected by a formyl group, a C i _ 6 Ashiru group such as C i-6 Arukanoiru group such Asechi Le group
  • complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.
  • protein of the present invention examples include, for example, a human-derived protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a rat-derived protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 A mouse-derived protein having the amino acid sequence represented by is used.
  • the partial peptide of the protein of the present invention described above is preferably used, as long as it has the same properties as the protein of the present invention described above. May be.
  • Peptides having an amino acid sequence are used.
  • peptides for example, the same or substantially the same amino acid as the 23rd to 119th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 Peptides having a sequence and having substantially the same properties as the protein of the present invention are preferred.
  • the partial peptide of the present invention lacks one or more (preferably about 1 to 10 and more preferably number (1 to 5)) amino acids in its amino acid sequence, Alternatively, one or more (preferably, about 1 to 20, more preferably, about 1 to 10, and more preferably, about 1 to 5) amino acids are added to the amino acid sequence. Or 1 or 2 or more (preferably, about 1 to 20; more preferably, about 1 to 10; more preferably, about 1 to 5) amino acids are inserted into the amino acid sequence; Alternatively, one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence are replaced with other amino acids. May be.
  • the C-terminus of the present invention is normally force Rupokishiru group (one CO OH) or other carboxylate - is a (CO_ ⁇ -), C-terminal amide (- C_ ⁇ _NH 2) or an ester (an COOR).
  • the partial peptide of the present invention includes those in which the amino group of the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) is protected with a protecting group, and the glutamine residue generated by cleavage of the N-terminal side in vivo.
  • the amino acid in the molecule is protected by a suitable protecting group, or a complex peptide such as so-called sugar peptide to which a sugar chain is bound. .
  • the partial peptide of the present invention can be used as an antigen for producing an antibody, it is not necessary to have the activity of the protein of the present invention.
  • salts with physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases eg, alkali metal salts
  • acid addition salts that are chemically acceptable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, maleic acid) Acids, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, maleic acid
  • the protein, partial peptide or salt thereof of the present invention can be produced from the above-mentioned human or warm-blooded animal cell or tissue by a known method for purifying a protein, or contains a DNA encoding the protein described below. Transformants It can also be produced by culturing. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the resulting extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be performed by combining the above chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be usually used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzohydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, Hydroxymethyl methylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-1-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) Phenoxy resins and the like can be mentioned.
  • amino acids having a suitably protected amino group and side chain functional group are condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or an amide thereof.
  • carbodiimides are particularly preferable.
  • DCC dicyclobutadiene
  • ⁇ , ⁇ ′-diisopropylcarpoimide, ⁇ -ethyl- ⁇ ′-(3-dimethylaminoprolyl) carboimide, and the like are used.
  • Activation by these involves adding the protected amino acid directly to the resin along with a racemization inhibitor (eg, HOB HOOBt), or pre-activating the protected amino acid as a symmetric anhydride, HOB t ester or H00B ester. After performing, it can be added to the resin.
  • a racemization inhibitor eg, HOB HOOBt
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • Acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylvinylidone; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform; alcohols such as trifluoroethanol; Sulfoxides such as dimethylsulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 ° C. to 5 Ot.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include, for example, Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isopolnyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CutZ, Br-Z, a Damantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group can be, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.).
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • Alkyl esterification Alkyl esterification
  • aralkyl esterification eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-cyclobenzyl ester, benzhydryl esterification
  • phenacyl esterification benzyloxycarbonyl It can be protected by hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower groups such as an acetyl group.
  • a group derived from carbonic acid such as an arylo group such as a class (C ⁇ e) alkanoyl group and a benzoyl group, a benzyloxy carbonyl group and an ethoxycarbonyl group are used.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, and a ⁇ -butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz l, C l 2 - Bz l, 2 twelve Torobenjiru, Br @ - Z, t - butyl and the like.
  • imidazole protecting group for histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, BoTrt, Fnioc and the like are used.
  • activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (for example, phenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4- Esters with dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, lanitrophenol, H0NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOBt).
  • active esters for example, phenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4- Esters with dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, lanitrophenol, H0NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOBt.
  • a corresponding phosphoric amide is used as the activated amino group of the raw material.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or the like.
  • Acid treatment with trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and reduction with sodium in liquid ammonia are also used.
  • Can be The elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of about 120 ° C. to 40 ° C.
  • anisol for example, anisol, phenol, thioanisole, methcresol
  • a cation scavenger such as paracresol, dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is 1,2-ethanedithiol and 1,4-butane described above.
  • an amide form of a protein for example, first, after amidating and protecting the ⁇ -carboxyl group of the amino acid at the terminal end of the amino acid, a peptide (protein) chain is added to the amino group side with a desired chain length. After that, a protein was prepared by removing only the protecting group of the amino group at the ⁇ -terminus of the peptide chain, and a protein was obtained by removing only the protecting group of the carboxyl group at the C-terminus. Condensate in a mixed solvent. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude protein. The crude protein is purified using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
  • a protein ester for example, after condensing a carboxyl group of a carboxy-terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, a protein ester is obtained in the same manner as a protein amide. You can get
  • the partial peptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptide.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, it is possible to produce the desired peptide by condensing a partial peptide or amino acid that can constitute the partial peptide of the present invention with the remaining portion, and if the product has a protecting group, removing the protecting group. it can.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 5.
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods, for example, solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and the like.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto. It can be converted into a free form or another salt by an analogous method.
  • any DNA may be used as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention.
  • it may be any of genomic DNA, cDNA derived from the cells and tissues described above, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • amplification can be carried out directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a preparation of total RNA or mRNA fraction from the above-mentioned cells and tissues.
  • RT-PCR method Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • Examples of the DNA encoding the protein of the present invention include: (1) a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a base that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 under high stringency conditions DNA encoding a protein having a sequence and having substantially the same properties as the protein of the present invention (eg, secretory action, etc.), 2 DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: : A DNA having a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by 5 and encoding a protein having substantially the same properties as the protein of the present invention; 3 represented by SEQ ID NO: 6 That hybridizes under high stringent conditions to DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, or to the base sequence represented by SEQ ID NO: 6. It has a group arrangement, substantially the proteins of the present invention Any DNA may be used as long as it has a DNA encoding a protein having the same properties as that of the
  • Examples of DNAs that can hybridize under stringent conditions with the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 4 to 6 include, for example, any of SEQ ID NOs: 4 to 6 DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 60% or more, preferably about 70% or more, and more preferably about 80% or more with the base sequence represented by the above SEQ ID NO: is used.
  • Hybridization is performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). be able to.
  • a commercially available library it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed according to high stringent conditions.
  • High stringent conditions refer to, for example, a condition in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. .
  • the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes, for example, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Examples of the DNA encoding the protein having SEQ ID NO: 5 include DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, and the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is SEQ ID NO: 6.
  • DNA having the represented base sequence is used.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention. Further, any of genomic DNA, cDNA derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA may be used.
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide of the present invention include: (1) DNA having a partial nucleotide sequence of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4, No .: a DNA having the nucleotide sequence represented by 10 or a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 under high stringency conditions, and has substantially the same properties as the protein of the present invention.
  • a DNA having a partial base sequence of the encoding DNA is used. DNAs that can hybridize with the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 10 to 12 have the same significance as described
  • the hybridization method and the stringent conditions are the same as described above.
  • the DNA encoding the partial peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 includes, for example, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is, for example, a DNA encoding the protein having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11, and the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is SEQ ID NO: 12 DNA having a base sequence represented by
  • a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of the protein of the present invention was amplified by the PCR method or incorporated into an appropriate vector.
  • the DNA can be selected by hybridization with a DNA fragment encoding a part or the entire region of the protein of the present invention or a DNA fragment labeled with a synthetic DNA.
  • the hybridization can be performed according to, for example, the method described in Molecular 'Cloning (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • Molecular Cloning Molecular Cloning
  • Conversion of the DNA base sequence can be performed using PCR or a known kit, for example, Mutant TM -G (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutant TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc.
  • the method can be carried out according to a method known per se such as a method or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a target DNA fragment from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) placing the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by linking.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, PBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • Yeast-derived plasmids eg, pSH19, pSH15
  • bacteriophages such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • house animal cells When mainly used, SRa promoter overnight, SV40 promoter, HIV 'LTR promoter overnight, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • (Cytomegalovirus) Promoter SRa Promoter and the like.
  • the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, rec A promoter, ⁇ PL promoter-, lpp promoter, T7 promoter, etc., and if the host is Bacillus, SPOL
  • yeast such as a promoter, an SPO2 promoter, a penP promoter, etc., a PH05 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter and the like are preferable.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like, if desired.
  • the selection Ma one car, for example, dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin phosphorus resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r) And neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as "Ne 0"; G418 resistance).
  • dh fr dihydrofolate reductase
  • MTX metalhotrexate
  • Amp r ampicillin phosphorus resistant gene
  • Ne 0 neomycin resistance gene
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention. If the host is Escherichia, the PhoA signal sequence and ⁇ signal sequence are used. If the host is Bacillus, the ⁇ -amylase signal sequence and subtilisin signal sequence are used. In some cases, MF signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., and when the host is an animal cell, insulin signal sequence, ⁇ -interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. can be used.
  • a transformant can be produced using the vector.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia coli Escherichia coli K 12 ⁇ DH 1 [Procedures of the National Academy of Sciences] Proc. Natl. Acad. Sci. US A), 60, 160 (1968)], JM 103 [Nucleic Acids Research, (Nucleic Acids Research), 9, 309 (198 1)], J A221 [Journal of Molecular Biology], 120, 51 7 (1978)], ⁇ 10 1 [Journal of Molecular Biology 41, 459 (1969)] and C600 [Genetics, 39, 440 (1954)].
  • Bacillus spp. include, for example, Bacillus subtilis MI 114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95] , 87 (198 4)].
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NC YC 1913, NC YC 2036 And Pichia pastoris KM71.
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from the larvae of night moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and egg derived from Trichoplusia ni egg High Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • the virus is BmNPV
  • a cell line derived from silkworm Boombyxmori N cell; BmN cell
  • Sf cells examples include Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like. Is used. As insects, for example, silkworm larvae and the like are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cells COS-7 (COS 7), Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CH ⁇ cells), dh fr gene deficient Chinese Hams Yuichi cell CHO (hereinafter CHO (dhfr —) Cells), mouse L cells, mouse AtT—20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, etc. are used.
  • Transformation of Escherichia bacteria can be performed, for example, by the procedure described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69. Vol., 2110 (1972) and Gene, Vol. 17, 107 (1982).
  • Transformation of Bacillus sp. Can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, 11 (1799).
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • Transformation of animal cells can be performed, for example, by the methods described in Cell Engineering Separate Volume 8 New Cell Engineering Experimental Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973). It can be performed according to the method.
  • a liquid medium is suitable as a medium used for the cultivation. It contains carbon sources, nitrogen sources, minerals, etc. necessary for growing. Examples of carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn chips, peptone, zein, meat extract, soybean meal, and potatoes. Examples of inorganic or organic substances and inorganic substances such as an extract include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride, and the like. Also, yeast, vitamins, growth promoting factors, etc. may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Examples of a medium for culturing Escherichia bacteria include, for example, M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Exps. Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • a drug such as 33-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently if necessary.
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours.
  • the host is yeast
  • Burkholder's minimum medium Bostian, KL et al., Processings of the National Academy of Cultures] Proctl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] and SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Procagings ⁇ The National Academy ⁇ ⁇ Sciences ⁇ Ob The Us (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (1984)).
  • the pH of the medium is adjusted to about 5-8.
  • the cultivation is usually performed at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the culture medium When culturing an insect cell or a transformant whose host is an insect, the culture medium was immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TC, Nature, 195, 788 (1962)). Those to which additives such as serum are appropriately added are used. Culture Preferably, the pH of the ground is adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952) ], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association] 99, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] Are used.
  • the pH is about 6-8. Cultivation is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the protein of the present invention can be produced on the cell membrane of the transformant.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to sonication, lysozyme and / or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • a protein modifier such as urea or hydrochloric guanidine in the buffers may contain a surfactant such as Triton X- 1 00 TM.
  • Purification of the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be performed by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Method mainly utilizing the difference in molecular weight of ion exchange chromatography Methods that use differences in charge, such as luffy, methods that use specific affinity, such as affinity chromatography, methods that use differences in hydrophobicity, such as reversed-phase high-performance liquid chromatography, and isoelectric focusing
  • a method that uses the difference between isoelectric points, such as a method, is used.
  • the protein thus obtained when the protein thus obtained is obtained as a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained as a salt, a method known per se or It can be converted to a free form or other salts by a method analogous thereto.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the thus produced protein of the present invention or a salt thereof can be measured by, for example, enzyme blotting using a specific antibody.
  • the antibody against the protein, partial peptide or salt thereof of the present invention may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein, partial peptide or salt thereof of the present invention.
  • Antibodies against the protein, partial peptide or a salt thereof of the present invention are obtained by using the protein of the present invention as an antigen, and It can be produced according to a known antibody or antiserum production method.
  • the protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site capable of producing an antibody upon administration.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • mice and rats including monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Koehler and Mils Yuin (Nature, 256, 495 (1975)).
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • PEG polyethylene glycol
  • myeloma cells include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, but P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) used and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is used at a concentration of about 10 to 80%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by adding the mixture and incubating at 20 to 40, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes.
  • Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, a culture medium is added directly to a solid phase (eg, a microplate) on which a protein antigen is adsorbed or together with a carrier, and then the supernatant is added.
  • Monoclonal antibody bound to solid phase with anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme (anti-mouse immunoglobulin antibody is used when cells used for cell fusion are mouse) or protein A
  • a monoclonal antibody bound to a solid phase is prepared by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, adding a protein labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like. Examples include a method for detecting a null antibody.
  • Selection of monoclonal antibodies is performed according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as the hybridoma can grow.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, and GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )
  • GIT containing 1 to 10% fetal bovine serum
  • a serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by methods known per se, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)) Absorption and desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen binding Solid phase or specific purification method of collecting antibody only with an active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the bond to obtain the antibody) Can do it.
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)
  • Absorption and desorption method eg, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen binding Solid phase or specific purification method of collecting antibody only with an active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the bond to obtain the antibody) Can do
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immunizing antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting the antibody-containing substance against the antibody and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier-protein and the mixing ratio of carrier-hapten are different from those of hapten immunized by cross-linking with carrier.
  • Any antibody may be cross-linked at any ratio as long as it can be efficiently produced.
  • serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc. in a weight ratio of about 0.1 to 1 hapten per hapten.
  • a method of coupling at a rate of about 20, preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • an active ester reagent containing a daltaraldehyde, a carbodiimide, a maleimide active ester, a thiol group or a dithioviridyl group is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the dose is usually given about every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention (hereinafter, these DNAs are abbreviated to the DNA of the present invention in the description of antisense DNA).
  • Any antisense DNA having a base sequence complementary to or substantially complementary to the DNA of the present invention and having an action capable of suppressing the expression of the DNA may be used. It may be DNA.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, about 70% of the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). % Or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • the base sequence of the portion encoding the N-terminal portion of the protein of the present invention for example, a base sequence near the start codon, etc.
  • a complementary strand of about 70% or more for example, an antisense DNA having a homology of preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is suitable.
  • These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like. Can be.
  • the protein of the present invention usually has a signal peptide, it is efficiently secreted extracellularly and has an important biological activity as a humoral factor for signal transduction, self-defense, and the like.
  • the protein of the present invention may be abbreviated as the protein of the present invention, etc.
  • the DNA encoding the protein or the partial peptide of the present invention hereinafter, the DNA of the present invention
  • Antibodies against the protein, partial peptide or salt thereof of the present invention hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention
  • uses of antisense DNA hereinafter, the DNA encoding the protein or the partial peptide of the present invention, etc.
  • the protein of the present invention is expressed in a tissue-specific manner, it can be used as a tissue marker. That is, it is useful as a marker for detecting tissue differentiation, disease state, metastasis of cancer, and the like. It can also be used for sorting corresponding receptors, ligands, binding proteins, etc. Further, it can be used as a panel for high-throughput screening known per se to examine biological activity. It can also be used for genetic disease research by performing chromosome mapping.
  • the protein of the present invention exists as a humoral factor in a living body, the protein of the present invention or the DNA of the present invention has an abnormality or is defective, or the expression level is abnormally reduced or If so, various illnesses may develop, such as, for example, immune disorders, Teng dysfunction, tunnel dysfunction, infections or gastrointestinal disorders. Therefore, the protein and the like of the present invention and the DNA of the present invention are used as medicines for treating and preventing various diseases such as, for example, immune diseases, lung dysfunction, kidney dysfunction, infectious diseases and gastrointestinal disorders. be able to.
  • the protein and the like of the present invention and the DNA of the present invention include, for example, trachea and bronchial-related diseases (eg, bronchitis, influenza infection, bronchial asthma, upper respiratory tract inflammation, bronchiectasis, etc.) Lung-related diseases (lung cancer, tuberculosis, pneumonia, emphysema, pulmonary infarction, pulmonary congestion, respiratory failure, cystic pulmonary fibrosis, pulmonary sarcoidosis, pulmonary edema, pulmonary hypertension, pneumoconiosis, etc.), stomach-related diseases (eg, Helicobacter H.
  • bronchial-related diseases eg, bronchitis, influenza infection, bronchial asthma, upper respiratory tract inflammation, bronchiectasis, etc.
  • Lung-related diseases lung cancer, tuberculosis, pneumonia, emphysema, pulmonary infarction, pulmonary congestion, respiratory failure, cystic pulmonary
  • pylori infection peptic ulcer, gastric cancer, gastric atony, gastritis, Mallory-Wise syndrome, gastric dilatation, gastric secretion abnormality,
  • Tory's disease giant hypertrophic gastritis
  • gastric tetany gastric tetany
  • torso disease gastric vertigo
  • gastrointestinal neuropathy etc.
  • Diabetes indigestion, maintenance of intestinal microflora, etc. Can be used.
  • the protein of the present invention or the like which is deficient. Therefore, in some patients, the information transmission in cells is not sufficiently or normally performed.
  • oral inserting the DNA of the present invention into cells and expressing the protein or the like of the present invention, the cells are then administered to the patient.
  • the role of the protein or the like of the present invention in the patient can be sufficiently or normally exerted by transplantation or (8) by administering the protein or the like of the present invention to the patient.
  • the DNA of the present invention When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, the DNA may be used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus-associated virus vector, and the like. It can be administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means.
  • the DNA of the present invention may be administered as such or with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting uptake, and administered via a catheter such as a gene gun ⁇ hydrogel catheter. it can.
  • the protein or the like of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, it is purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more. It is preferred to use
  • the protein or the like of the present invention can be used, for example, as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, orally or water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections such as sterile solutions or suspensions.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • a liquid carrier such as oil and fat can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.). such as an alcohol (e.g., such as Etano Lumpur), polyalcohol (e.g., propylene glycol, polyethylene grayed recall), nonionic surfactants (e.g., polysorbate 8 0 TM, etc. HC ⁇ -5 0) etc. You may use together.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • a buffer eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • a soothing agent eg, benzalkonidum chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • a stabilizer eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the vector into which the DNA of the present invention has been inserted is also formulated in the same manner as described above, and is usually used parenterally.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, horses, cats, cats). , Dogs, monkeys, chimpanzees, etc.).
  • warm-blooded animals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, horses, cats, cats). , Dogs, monkeys, chimpanzees, etc.
  • the dosage of the protein or the like of the present invention depends on the target disease, the administration target, the administration route, and the like.
  • the protein or the like of the present invention is orally administered for the purpose of treating an immune disease, generally, in an adult (as 6 Ok), about 1 mg of the protein or the like is used per day.
  • the single dose of the protein or the like varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the protein or the like of the present invention is administered in the form of an injection to an adult ( (With a body weight of 60 kg), the protein, etc., is about 110 mg / day, preferably about 1200 mg / day, more preferably about 110 mg / day. Is conveniently administered by injecting it into the affected area. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the protein or the like of the present invention exists as a humoral factor in a living body (especially lung, trachea, stomach, kidney, etc.), a compound or a salt thereof which promotes the function of the protein or the like of the present invention may be used, for example, in immunization. It can be used as a medicine for treating or preventing diseases, pulmonary dysfunction, Teng dysfunction, infectious disease or gastrointestinal dysfunction).
  • the compound or its salt that inhibits the function of the protein or the like of the present invention can be used as a medicament such as an agent for treating or preventing a disease caused by excessive production of the protein or the like of the present invention.
  • the protein or the like of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the function of the protein or the like of the present invention.
  • the present invention provides a compound of the present invention characterized by using the protein of the present invention, a partial peptide thereof, or a salt thereof, or a compound or a salt thereof which promotes the function of the protein, the partial peptide, or a salt thereof (hereinafter, referred to as “the compound”).
  • the compound A method for screening a compound that inhibits the function of the protein of the present invention, a partial peptide thereof, or a salt thereof (hereinafter may be abbreviated as an inhibitor).
  • the screening kit of the present invention contains the protein, partial peptide or a salt thereof of the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts It is a compound selected from liquids, plasma, and the like, and is a compound that promotes or inhibits the function of the protein and the like of the present invention.
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • a compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be carried out according to a conventional method.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-mentioned pharmaceuticals containing the protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or in warm-blooded animals (eg mice, rats, puppies, higgs, pigs, puppies, puppies, birds, cats, dogs, monkeys). , Chimpanzees, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, target of administration, route of administration, and the like.
  • a compound that promotes the function of the protein or the like of the present invention for the purpose of treating inflammatory diseases When the compound is orally administered, generally in adults (assuming a body weight of 60 kg), the compound is used in an amount of about 0.1 to 10 Omg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 10 Omg per day.
  • Administer 2 Omg When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc., for example, a compound that promotes the function of the protein or the like of the present invention for the purpose of treating an inflammatory disease.
  • the compound is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 20 mg per day. It is convenient to administer about 1 to 1 Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • a compound that inhibits the function of the protein or the like of the present invention is orally administered, generally, in an adult (assuming a body weight of 6 O kg), the compound is used in an amount of about 0.1 to 10 Omg per day, preferably About 1.0-50mg, more preferably about 1.0-20m g.
  • the single dose of the compound varies depending on the subject of administration, the disease to be treated, and the like, but the compound that inhibits the function of the protein or the like of the present invention is usually administered in the form of an injection to an adult (60%). iv), about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 2 Omg, and more preferably about 0.1 to 1 Omg of the compound per day Conveniently for administration. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • An antibody against the protein or the like of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) can specifically recognize the protein or the like of the present invention. Can be used for quantification, particularly quantification by sandwich immunoassay.
  • the antibody of the present invention is allowed to competitively react with a test solution and a labeled protein of the present invention, and the ratio of the labeled protein of the present invention bound to the antibody is measured.
  • a method for quantifying the protein or the like of the present invention in a test solution
  • the monoclonal protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein or the like of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and detection by tissue staining or the like can be performed. You can do it.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein or the like of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen, or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of protein) in the test solution. Any method may be used as long as it is a method for detecting the amount of the compound by chemical or physical means and calculating the amount from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of the antigen. For example, nephrometry, competitive methods, The mnometric method and the sandwich method are suitably used, but it is particularly preferable to use the sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measuring method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. Radioisotopes, if example embodiment, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C] used.
  • the above-mentioned enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, / 3-galactosidase, / 3-dalcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, and malate dehydrogenase are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, or the like is used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • a test wave is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is an antibody having different binding sites for the protein and the like of the present invention. It is preferably used. That is, the first order
  • the antibody used in the primary and secondary reactions is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein or the like of the present invention, the antibody used in the primary reaction is preferably the C-terminal Other than the above, for example, an antibody that recognizes the N-terminal is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • a competition method after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (BZF separation) The amount of labeling of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test wave is quantified.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • B / F separation is performed using a polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody or a solid phase antibody is used as the first antibody.
  • an immobilization method using a soluble first antibody and an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. After reacting the antigen with an excess amount of the labeled antibody, the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • the amount of insoluble sediment resulting from the antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the measurement system for the protein of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews and written documents.
  • the protein and the like of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • the concentration of the protein or the like of the present invention is reduced by quantifying the concentration of the protein or the like of the present invention using the antibody of the present invention, for example, an immune disease, a pulmonary dysfunction, or a kidney function is detected. It can be diagnosed as a disease, such as a disorder, an infectious disease or a gastrointestinal disorder, or is likely to be affected in the future.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention or the like present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detection of the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells It can be used for such purposes.
  • the DNA of the present invention can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bushes, horses, cats, cats, dogs) by using them as probes. , Monkeys, chimpanzees, etc.) can detect abnormalities (genetic abnormalities) in the DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or its partial peptide, for example, damage to the DNA or mRNA, sudden mutation or It is useful as a diagnostic agent for genes such as decreased expression, increased DNA or mRNA or excessive expression.
  • abnormalities genetic abnormalities
  • a decrease in expression is detected by Northern hybridization or when a mutation in DN ⁇ is detected by PCR-SSCP method, for example, immune disease, lung dysfunction, kidney dysfunction, infectious disease Alternatively, it can be diagnosed that there is a high possibility of a disease such as a gastrointestinal disorder.
  • Antisense DNA that can complementarily bind to the DNA of the present invention and suppress the expression of the DNA can suppress the function of the protein or the like of the present invention or the DNA of the present invention in vivo.
  • it can be used as an agent for treating or preventing a disease caused by overexpression of the protein of the present invention.
  • the above-mentioned antisense DNA is used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, it can be carried out in the same manner as the above-mentioned therapeutic and / or preventive agent for various diseases containing DNA of the present invention.
  • the antisense DNA when used, the antisense DNA is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like. Therefore, it can be implemented.
  • the antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and can be administered by using a gene gun or a catheter such as Hyde-mouth gel catheter.
  • the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of expression thereof.
  • the antibody of the present invention having an activity of neutralizing the activity of the protein or the like of the present invention can be used, for example, in combination with a drug such as a therapeutic or prophylactic agent for a disease caused by overexpression of the protein of the present invention. Can be used.
  • the prophylactic agent for treating the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention can be used directly as a liquid or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form, in humans or mammals (eg, rats, porch egrets, higgies, bushus, Can be administered orally or parenterally to mice, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • mammals eg, rats, porch egrets, higgies, bushus, Can be administered orally or parenterally to mice, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose varies depending on the administration subject, target disease, symptoms, administration route, and the like.
  • the dose of the antibody of the present invention in a single dose is usually about 0.01 to 2 Omg Z kg body weight, preferably 1 to 1 O mg Z kg body weight, more preferably 0.1 to 5 mg Z kg body weight is administered by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day. It is convenient. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent dose can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased accordingly.
  • the antibodies of the present invention can be administered by themselves or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the above administration contains the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules) ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of pharmaceuticals.
  • a carrier for example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, etc. are used.
  • Injections are in the form of intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, etc. Is included.
  • Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents and the like are used, and suitable solubilizing agents, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propyle Glycol, polyethylene glycol) and nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 ipolyoxyethylene (5 Omol) adduct of hydrogenated castor oil).
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, Propyle Glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HCO-50 ipolyoxyethylene (5 Omol) adduct of hydrogenated castor oil.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection is usually filled in an appropriate ampoul
  • each dosage unit dosage form is 5 to 500 mg, especially for injections.
  • the antibody contains 5 to 100 mg, and other dosage forms contain 10 to 25 Omg of the above antibody.
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • the present invention may be abbreviated as a DNA encoding the exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof include unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells.
  • the stage of embryo development in non-human mammal development (more preferably, the stage of single cell or fertilized egg cell and Before the 8-cell stage, the desired DNA can be transferred by the calcium phosphate method, electric pulse method, lipofection method, agglutination method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, etc. it can.
  • exogenous DNA of the present invention intended for somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like can be transferred by the DNA transfer method and used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • the DNA transgenic animal of the present invention can also be produced by fusing the cells with the above-mentioned germ cells by a cell fusion method known per se.
  • mice for example, Japanese lions, bushes, higgies, goats, egrets, dogs, cats, guinea pigs, eighteen mussels, mice, rats and the like are used.
  • a rat eg, Wistar, SD, etc.
  • Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
  • mutant DNA of the present invention those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition or deletion of a base, substitution with another base, etc.
  • the DNA in which the occurrence has occurred is used, and also includes the abnormal DNA.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest.
  • various mammals having the DNA of the present invention having high homology to the human DNA can be used.
  • DNA constructs in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters capable of expressing DNA derived from a product (eg, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.) )
  • a product eg, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.
  • a target mammal for example, a mouse fertilized egg
  • Examples of the expression vector of the protein of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as ⁇ phage, a retrovirus such as Moroni leukemia virus, a vaccinia virus or a baculovirus. Animal viruses and the like are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • promoters that regulate DNA expression include, for example, DNs derived from viruses (eg, Simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.). Promoters 2 Promoters derived from various mammals (human, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), for example, albumin, insulin II, human brakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase , Glial fibrillary acidic protein, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor
  • the vector preferably has a sequence (generally called terminator) that terminates transcription of the messenger RNA of interest in a mammal having DN ⁇ metastasis, and is, for example, derived from viruses and various mammals.
  • the sequence of each DNA can be used, and preferably, Simian virus SV40 or the like is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of the eukaryotic DNA, etc. are located 5 'upstream of the promoter region and the promoter region. Linkage between the translation regions or 3 ′ downstream of the translation region is also possible depending on the purpose.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the above promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer means that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germ cells and somatic cells Means that.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and should be subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. Can be done.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germ cells of the animal after DNA transfer It means that all progeny of the animal have the exogenous DNA of the present invention in excess of all of their germinal and somatic cells.
  • the progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention has a high level of expression of the normal DNA of the present invention, and eventually promotes the function of endogenous normal DNA, thereby finally improving the protein of the present invention. It may develop hyperfunction and can be used as a model animal for the disease. For example, using the normal DNA transgenic animal of the present invention to elucidate the pathological mechanism of the hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. Is possible.
  • the non-human mammal having the foreign abnormal DNA of the present invention should be subcultured in a normal breeding environment as an animal carrying the DNA after confirming that the foreign DNA is stably maintained by mating. Can be done.
  • the desired exogenous DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a source.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the animal produced after the transfer of the DNA means that the offspring of the animal produced have the abnormal DNA of the present invention in all of the germinal cells and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that inherits the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, all offspring can be bred to have the DNA.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention has high expression of the abnormal DNA of the present invention. Inhibition of the function of endogenous normal DNA may eventually result in a functionally inactive refractory of the protein of the present invention, which can be used as a disease model animal .
  • a functionally inactive refractory of the protein of the present invention which can be used as a disease model animal .
  • using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit the function of the normal protein by the abnormal protein of the present invention in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention (dominant negative activity). Action).
  • the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used in a therapeutic drug screening test for a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention. Is also available.
  • the mutant protein of the present invention can be isolated and purified, and its antibodies can be produced. Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to examine clinical symptoms of a disease related to the protein of the present invention, including a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention. More detailed pathological findings in each organ of the disease model related to the protein of the present invention can be obtained, which will contribute to the development of new treatment methods and the research and treatment of secondary diseases caused by the disease. it can.
  • each organ is removed from the DNA-transferred animal of the present invention, and after shredding, With any proteolytic enzyme, it is possible to obtain free DNA transfer cells, culture them, or systematize the cultured cells.
  • the protein of the present invention can be identified, its relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or its signal transduction mechanism can be examined, and its abnormality can be examined. It is an effective research material for elucidation.
  • the above-described test method was used. It is possible to provide an effective and rapid screening method of the therapeutic agent for the disease by using a quantitative method and the like.
  • the DNA transgenic animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention it is possible to examine and develop a method for treating a DNA associated with the protein of the present invention.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the DNA is inactivated by introducing a repo overnight gene (eg, a / 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene is controlled under the control of the promoter for DNA of the present invention.
  • a repo overnight gene eg, a / 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli
  • test compound is administered to the animal described in (7) to enhance the promoter activity of the DNA of the present invention, which is characterized by detecting expression of a reporter gene. Or a method of screening for a compound or a salt thereof that inhibits the compound.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are artificially mutated to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal to suppress the DNA expression ability, Alternatively, by substantially losing the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA, the DNA has substantially no ability to express the protein of the present invention (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention).
  • Non-human mammalian embryonic stem cells hereinafter abbreviated as ES cells).
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by, for example, shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon by these mutations.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated, and its exon portion is a drug resistance gene represented by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or IacZ (
  • a drug resistance gene represented by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or IacZ (
  • the resulting A DNA strand having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene (hereinafter abbreviated as an evening getter vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, a homologous recombination method.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used, or according to the known method of Evans and Kaufma. May be newly established.
  • mouse ES cells currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, an alternative pure immunological and genetically for example an object such as a background to obtain a bright et kana ES cells, C 578 Mr / 6 Mausu Ya Rei_57 8 / hybridization 6 egg collection number of lack of the 08 eight / / 2 Nyori improved 80? 1 Mouse (C57BLZ6 and DBAZ2 can be used satisfactorily.
  • the BDFi mouse has the advantage of large number of eggs collected and the robustness of eggs.
  • the ES cells obtained using this method can be used to replace the genetic background of C57BLZ6 mice by back-crossing with C57BLZ6 mice when a disease model mouse is created. Can be advantageously used in that it is possible.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used.However, it is more efficient to collect embryos at the 8-cell stage and culture them up to blastocysts. Many early embryos can be obtained.
  • male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • a method of determining the sex of ES cells for example, a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR can be mentioned.
  • this method conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, since suffices ES cell number of about 1 colony (about 50), culture
  • the primary selection of ES cells in the initial stage can be performed by gender discrimination, and the selection of male cells at an early stage greatly reduces the labor required in the initial culture.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good proliferative properties, but they must be carefully subcultured because they tend to lose their ability to generate individuals.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts
  • a carbon dioxide incubator in the presence of LIF (1—1000 OU / ml) (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or Incubate at about 37 with 5% oxygen, 5% carbon dioxide, 90% air, etc., and at the time of subculture, for example, trypsin ZEDTA solution (usually 0.001-0.5% trypsin / 0.5%).
  • a single cell is prepared by treating with 1-5 mM EDTA (preferably about 0.1% trypsin Z 1 mM EDTA), and the cells are seeded on a freshly prepared feeder cell. Such passage is usually performed every 11 to 13 days. At this time, it is desirable to observe the cells, and if morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
  • 1-5 mM EDTA preferably about 0.1% trypsin Z 1 mM EDTA
  • ES cells can be transformed into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions. It is possible to differentiate [MJ Evans and MH Kaufman, Nature 292, 154, 1981; GR Martin Proceedings of National, 'Academy' of Science ', Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of emblemology, and experimental morphology, 87, 27, 1985.
  • the DNA-deficient cells of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention are useful in the cell biology of the protein of the present invention in the mouth of in vivo.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA amount of the animal using a known method and indirectly comparing the expression levels. .
  • non-human mammal those similar to the aforementioned can be used.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be obtained, for example, by introducing the evening-getting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or mouse egg cell,
  • the DNA sequence in which the DNA of the present invention has been inactivated undergoes homologous recombination by gene homologous recombination to replace the DNA sequence of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, thereby obtaining the DNA sequence of the present invention.
  • the cells in which the DNA of the present invention has been knocked out are subjected to Southern hybridization analysis using a DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe or a DNA sequence on a gettering vector, and It can be determined by analysis by PCR using the DNA sequence of the mouse-derived neighboring region other than the DNA of the present invention used as the primer as a primer.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell is used, the cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is used at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage non-human cell line.
  • the chimeric embryo is injected into a mammalian embryo or a blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially altered DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual.
  • the individuals obtained in this manner are usually individuals deficient in the hetero-expression of the protein of the present invention, and mated with individuals deficient in the hetero-expression of the protein of the present invention.
  • a homozygous deficient individual can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into a nucleus of an egg cell by a microinjection method. Compared to a transgenic non-human mammal, it can be obtained by selecting a gene having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
  • the germline can be obtained and maintained according to a standard method. That is, by mating male and female animals having the inactivated DNA, homozygous animals having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained.
  • the obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and a plurality of homozygotes are obtained.
  • homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, a disease caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. Since it can be a model, it is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is resistant to diseases (eg, immune disease, lung dysfunction, kidney dysfunction, infectious disease or gastrointestinal dysfunction) caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention. It can be used for screening for compounds that have therapeutic and prophylactic effects.
  • diseases eg, immune disease, lung dysfunction, kidney dysfunction, infectious disease or gastrointestinal dysfunction
  • the present invention is characterized in that a test compound is administered to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and changes in the animal are observed and measured.
  • a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic or preventive effect on a disease caused by the disease is provided.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include the same ones as described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with a non-treated control animal, and changes in the organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal are used as indicators.
  • the test compound can be tested for its therapeutic and prophylactic effects.
  • test compound for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is subjected to glucose tolerance treatment, and tested before or after glucose tolerance treatment.
  • the compound is administered, and the blood glucose level and weight change of the animal are measured over time.
  • the compound obtained by using the screening method of the present invention is a compound selected from the test compounds described above, and is a disease caused by a deficiency or damage of the protein or the like of the present invention (eg, an immune disease, a pulmonary dysfunction) It has a therapeutic / preventive effect on Teng dysfunction, infectious disease or gastrointestinal disorders, etc., and can be used as a drug such as a safe and low-toxic therapeutic / prophylactic agent for the disease. Further, a compound derived from the compound obtained by the above-mentioned screening can be used in the same manner.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) and bases (eg, alkali metal).
  • a physiologically acceptable acid addition salt is preferred.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the drug containing the protein of the present invention described above.
  • the preparations thus obtained are safe and low toxic, so Can be administered to mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, bush, horses, horses, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the target of administration, the administration route, and the like.
  • the compound when administered for the purpose of treating an inflammatory disease, it is generally required for an adult (body weight). 60 mg), the compound is administered at about 0.1 to 10 Omg per day, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 Omg.
  • the single dose of the compound when administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound is usually administered in the form of an injection to an adult (6O O).
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the present invention provides a test compound administered to a non-human mammal deficient in expression of a DNA of the present invention, and detects or inhibits the expression of a reporter gene.
  • a method for screening a compound or a salt thereof is provided.
  • the non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene.
  • a reporter gene which can be expressed under the control of the promoter for the DNA of the present invention is used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • the same gene as described above is used, and a 3-galactosidase gene (1 acZ), a soluble alkaline phosphatase gene or a luciferase gene is preferable.
  • the repo overnight gene supports the promoter of the DNA of the present invention. Since it is under the control of the promoter, the activity of the promoter can be detected by tracing the expression of the substance encoded by the reporter gene.
  • a tissue that originally expresses the protein of the present invention may / 3-galactosidase is expressed instead of the protein of the present invention. Therefore, for example, by staining with a reagent that serves as a substrate for a galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3,- ⁇ -pindolyl-i3-galactopyranoside (X-gal), it is easy to carry out staining.
  • a reagent that serves as a substrate for a galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3,- ⁇ -pindolyl-i3-galactopyranoside (X-gal)
  • X-gal 5-bromo-4-chloro-3,- ⁇ -pindolyl-i3-galactopyranoside
  • the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with daltaraldehyde, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X_ga1 at room temperature or at room temperature. After reacting for about 30 minutes to 1 hour at around 7 ° C, the / 3-galactosidase reaction can be stopped by washing the tissue sample with an ImM EDTA / PBS solution, and color development can be observed. . Further, mR NA encoding 1 a c Z may be detected according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity against DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids). Salts are used, especially the physiologically acceptable acid addition salts.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid
  • the compound of the present invention that promotes the activity of a promoter against DNA or a salt thereof can promote the expression of the protein of the present invention and promote the function of the protein. It is useful as a drug for safe and low toxic therapeutic and prophylactic agents for diseases such as organ dysfunction, infectious diseases and gastrointestinal disorders. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bushus, dogs, dogs, cats, dogs). , Monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the target of administration, the administration route, and the like.
  • a compound that promotes the promoter activity of the DNA of the present invention for the purpose of treating an inflammatory disease is orally administered.
  • the compound When administered, generally in adults (assuming a body weight of 6 O kg), the compound should be administered in an amount of about 0,0; ⁇ 10 Omg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.For example, it promotes promoter activity on the DNA of the present invention for the purpose of treating inflammatory diseases.
  • the compound When the compound is administered to an adult (as 6 O kg), usually in the form of an injection, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 20 mg per day. It is convenient to administer about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the compound of the present invention that inhibits the promoter activity against DNA when orally administered, generally, in an adult (assuming a body weight of 60 kg), the compound is used in an amount of about 0.1 to 10 per day. Omg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc., but the compound that inhibits the promoter activity of DNA of the present invention is usually administered to an adult (60 kg) in the form of an injection. ),
  • the compound is administered by intravenous injection at a rate of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day. It is convenient. For other animals, converted to 6 O kg Amount can be administered.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention. It can greatly contribute to the investigation or prevention of various diseases caused by insufficient expression of DNA.
  • Trt Trityl
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • FIG 1 shows the amino acid sequence of the human-derived protein of the present invention.
  • 1 shows the amino acid sequence of the rat-derived protein of the present invention.
  • FIG. 1 shows an amino acid sequence of a mouse-derived protein of the present invention.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the rat-derived protein of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Sequence number corresponds to the 23rd to 119th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by 1.
  • Sequence number corresponds to the 23rd to 119th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by 2.
  • 1 shows the amino acid sequence of a partial peptide of the mouse-derived protein of the present invention. Sequence number: corresponds to the 23rd to 119th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by 3.
  • the transformant Escherichia coli XL 1—Blue MRF '/ pDRL44OH obtained in Example 6 described below was used on August 26, 1998 by the Ministry of International Trade and Industry Deposited with the National Institute of Technology (NI BH) under the deposit number FERM BP-6476 and deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the deposit number IF ⁇ 16192 since July 31, 1998.
  • NI BH National Institute of Technology
  • IFO Fermentation Research Institute
  • the transformant Escherichia coii XL1-Blue MRF '/ pDRL440M obtained in Example 4 described below has been used for the purpose of (NI BH) and a deposit number FERM BP-6477 from the Fermentation Research Institute (IFO) on July 31, 1998 under the deposit number IF ⁇ 16193.
  • the transformant Escherichia coli XL 1 -B 1 ue MRF 'ZpDRL440R obtained in Example 6 described below was produced on August 26, 1998 by the Ministry of International Trade and Industry It has been deposited with the Institute of Fermentation (NIBH) under the deposit number FERM BP-6478 as of July 31, 1998 under the deposit number IF ⁇ 16194 at the Institute of Fermentation (IFO).
  • the plasmid pBK / CMV (4512 bp) (Stratagene) having a neomycin resistance gene downstream of the SV40 early gene promoter was digested with Bsu36I (New England Biolabs) and the resulting 1.6 kbp was obtained. Fragment The DNA polymerase I Klenow fragment (Takara Shuzo) treatment was performed to obtain a blunt-ended fragment containing the neomycin resistance gene. This fragment was ligated with a plasmid obtained by digesting pME18S (341 1p) with Smal (Takara Shuzo) to obtain pME18S / Ne0 (5040 bp).
  • This fragment was ligated with a 4.2 kbp fragment obtained by double digestion of pME18S / Neo with HindII and EcoRI, and the animal cell expression vector pCAN616 (5969 bp) was ligated. Obtained. Furthermore, pCAN616 was digested with XhoI (Takara Shuzo) and self-closure was performed to obtain pCAN617 (5585 bp), an animal cell expression vector from which the stuiier region was removed from the multiple cloning site.
  • a clone encoding a signal sequence for secretion and a processing site was selected from EST data supplied by SmithKline Beecham (SB). The method is to translate the DNA sequence of the EST into an amino acid sequence, and to clone in the same frame with a class of hydrophobic amino acids (Leu, Ile, Val, Phe, Ala, etc.) after Met and in the same frame.
  • a clone having a processing site (ArgArg, LysArg, LysLys) was selected, and HGS: 105111 was found as a clone satisfying these conditions.
  • HGS 105111 was found as a clone satisfying these conditions.
  • it is an EST sequence there are usually deletions, insertions, misreadings, etc. in the database sequence, so the sequence was confirmed by the following method.
  • the mRNA of this clone was found to be expressed in limited tissues such as human lung, trachea, and stomach, and it was revealed that this clone was an organ-specific expression product.
  • the size of the mRNA is short, about 0.8 kb and 0.6 kb.
  • the cDNA fragment of TGC-440 contains almost the entire length of the mRNA, and the coding region of the protein may be other than that shown in Figure 1. It turned out that there was not.
  • Example 3 Obtaining rat cDNA
  • Hybridization was performed in 5xSSPE, 5xDenhardt's solution, 0.5% SDS at 65: overnight, and washing was performed at 0.5xSS 0.USDS at 50 ° C. Since multiple positive plaques were obtained by autoradiography (-80 ° C, 18 hours), single-black isolation was performed, phage DNA was digested with BsiWI, and the resulting inserted cDNA was obtained. Fragments! It was subcloned into the Acc651 site of DUC118. As a result of determining the nucleotide sequence of the cDNA fragment, it was found that rat TGC-440 consisting of 119 amino acids as many as humans was encoded.
  • the lung was removed from the C57BL / 6N mouse, and poly (A) + RNA was obtained in the same manner as described in Example 3. This was transformed into type III, and mouse cDNA was obtained using 3'-RACE.
  • primer M440-OF GCCTTTAAGAACCAACAGACAG; SEQ ID NO: 13
  • 3′-RACE was performed according to a standard method.
  • the cDNA fragment (0.7 kb) was cloned into the Sr fl site of the pCR-Scripi A immediately (STRATAGENE) of the closing vector to obtain PDRL440M (E. coli XL1-Blue MRF '/ pDRL440M).
  • a peptide (human) consisting of the amino acid sequence from position 110 to position 119 of the present protein represented by SEQ ID NO: 1; and a peptide from position 110 to position 110 of the present protein (rat) represented by SEQ ID NO: 2 Peptides consisting of the amino acid sequence up to the 119th amino acid sequence were each chemically synthesized by a method known per se. After 1 mg of these peptides and 4 mg of cyclosiglobin were combined by the maleimide method, 100 g of the antigenic peptide was subcutaneously subcutaneously applied to 2 herons (SPF, New Zealand White) together with FCA (complete Freund's adjuvant). Injections were made for primary immunization.
  • SPF New Zealand White
  • a primer designed to amplify the open reading frame of human TGC-440, H440-EF (GACGAATTCCCACCATGAAAGTTCTAATCTCTTCCCTCCT; SEQ ID NO:
  • H440-ER GACTCGAGCGGCCGCTACAAAGGCAGAGCAAAGCTTCTTA; SEQ ID NO:
  • PCR 15 was synthesized by a method known per se, and PCR was carried out using the plasmid lng described in Example 1 for type I.
  • the PCR was performed using TakaraExTaq (Takara Shuzo) at 25 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 1 minute in a thermal cycle 7-GeneAmp PCR System 2400 (PERK IN ELMER) 25 times.
  • the obtained PCR fragment was digested with EcoRI and NotI, and subcloned into the EcoRI and NotI sites of pCA'618, an expression vector for animal cells, to obtain pCAN618 / huTGC440.
  • H440-0F TGCACCGTCGACCACCATGAAAGTTCTAATCTCTTCCCTCCTCCTGT; SEQ ID NO: 16
  • H440-OR CGCTCAGTCGACCTACAAAGGCAGAGCAAAGCTTCTTAGCTGACATTGTTT; SEQ ID NO: 17
  • the PCR was performed using Pfu DNA Polymerase (STRATAGENE) in a GeneAmp PCR System 2400 (PERK IN ELMER) at 96 ° C for 45 seconds, at 45 ° C for 45 seconds, and at 72 ° C for 1 minute 25 times.
  • the obtained PCR fragment was digested with SalI, cloned into the Sail site of animal cell expression vector PA11 (also called pAKKOl.11), and the cDNA was inserted into the PDRL440H promoter in the forward direction.
  • E. coli XL1-BlueMRF '/ pDRL440H primers designed to amplify the open reading frame of rat TGC-440, R440-0F, SEQ ID NO: 18) and R440-OR (CAGAGTGTCGACACTATAAGGGCAGGGCGAAGC; SEQ ID NO: 19) were synthesized by a method known per se. Then, PCR was performed using the plasmid lng described in Example 3 for type I.
  • PCR conditions were as follows: Pfu DNA Polymerase (STRATAGENE) was used, and the temperature was set at 96 ° C for 45 seconds on a Samarucycla GeneArap PCR System 2400 (PERK IN ELMER). 54 45 seconds, 72 ° C for 1 minute were repeated 25 times.
  • the resulting PCR fragment was digested with SalI, cloned into the Sail site of animal cell expression vector PA11 (also called pAKKOl.11), and PDRL440R, in which the cDNA was inserted in the forward direction with respect to the promoter, was used. (Escherichia coli XU-Blue MRF '/ pDRL440R).
  • Example 7 Expression of human TGC-440 cDNA in C0S7 cells
  • C0S7 cells were usually cultured in DMEM medium (GIBC0-BRL) containing 10% FCS (fetal fetal serum).
  • C0S7 cells (1.5 ⁇ 10 s cells / well) were cultured in a 6-well plate for 24 hours, washed twice with OpU-MEM medium (GIBCO-BRL), and used for introduction of the expression plasmid.
  • OpU-MEM medium (GIBCO-BRL)
  • the FCS was added to 10%, and the cells were cultured for another 19 hours. Then, the medium was changed to 1 Opti-MEM medium (Gibco-BRL), (2) 0.25 mM ABSF (sum).
  • Opti-MEM medium (Gibco-BRL) containing (Kako Pure Chemicals)
  • Opti-MEM medium (Gibco-BRL) containing 0.05% CHAPS (Dojindo)
  • the culture was further performed for 48 hours in place of Opti-MEM medium (Gibco-BRL) containing (Dojindo).
  • Culture supernatant and cells were collected separately and used for Western blot analysis. 500 minutes of the culture supernatant was concentrated to 501 using a microcon 3 (Ami con) having a molecular weight of 3,000 cut (10-fold concentration). The cells were washed with physiological saline, added with 200 1 of Lae ⁇ li sample buffer, and heated at 95 ° C for 2 minutes to obtain a cell extract. The concentrated culture supernatant and the cell extract were electrophoresed on an SDS polyacrylamide gel (18%, TEFC0), and transferred to a nitrocell membrane (Hybond ECL, Amersham).
  • SDS polyacrylamide gel 18%, TEFC0
  • Block Ace ZTBS-T (0.93 ⁇ 4 aCU 20 mM Tris-HCl (pH 7) .5) was reacted with anti-TCC-440 antiserum diluted 2000-fold with 0.053 ⁇ 4 Tween20) for 2 hours at room temperature. After washing 5 times with TBS-T, it was reacted with anti-horskin IgG antibody (Amersham) labeled with horseradish peroxidase (HRP) diluted 4000 times with 10% Block Ace / TBS-T for 1 hour at room temperature. .
  • CH0 (dhfr ) (ATCC) cultured cells were carried out in a MEM (Gibco-BRL) using a medium 5% C0 2 vapor below 37 ° C containing 10% FCS (Hyclone).
  • the human and rat TGC440 expression plasmids (human: pDRL440H, rat: PDRL440R) prepared in Example 6 were each Transfection was performed using the calcium phosphate method. After 12 hours, the medium was replaced with a MEM medium containing 10 ° FCS, and two days later, the medium was replaced with a selection medium (a MEM without ribonucleotide and deoxyribonucleotide (Gico-BRL) containing 10% dialyzed serum (Hyclone)).
  • a MEM medium containing 10 ° FCS
  • a selection medium a MEM without ribonucleotide and deoxyribonucleotide (Gico-BRL) containing 10% dialyzed serum (Hyclone)
  • the medium was replaced with a selection medium every three days, and cells into which the expression plasmid was integrated were selected.
  • colonies that grew on the plate were cloned into 12 clones each of human and rat, and plated on 12-well plates. Next, these clones were spread on a 6-well plate and cultured until confluent.
  • the culture supernatant is transferred to an eppendorf sample tube, centrifuged to remove floating cells, concentrated to 1/10 using centricon-3 (Amicon), and the SDS-PAGE sample containing the same amount of DTT
  • the buffer was added, SDS-PAGE was performed, and the expression level was estimated by Western blotting.
  • Western blotting was performed by diluting the primary antibody with the anti-TCC440 antiserum obtained in Example 5 1/200, and using the secondary antibody with HRP-labeled anti-Egret IgG anti-serum. (1/2000, Amersham), and color development was performed using ECL western blotting kit (Amersham).
  • TGC440 protein of the same molecular weight as expressed using COS-7 cells was secreted and expressed in the medium. It was confirmed that # 5, 9, and 10 clones were most expressed in human TGC440 protein-expressing CH0 cells, and # 4 and 9 clones were expressed in rat TGC440 protein-expressing CH0 cells. Further, these clones were spread on a 96-well plate, and single gel clones were obtained by the limiting dilution method.
  • the protein of the present invention and DNA encoding the same can be used, for example, as a therapeutic / prophylactic agent for diseases such as immune diseases, lung dysfunction, kidney dysfunction, infectious diseases and gastrointestinal disorders. Further, the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound that promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention or a salt thereof. Furthermore, since an antibody against the protein of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention, it can be used for quantification of the protein of the present invention in a test solution.

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Description

明細書 新規タンパク質およびその製造法 技術分野
本発明は新規な分泌性タンパク質に関する。 背景技術
生体は、 細胞間または組織間で、 互いに情報伝達をすることにより、 発生、 分化、 増殖、 恒常性の維持などの統合の取れた調節を行っている。 多くの場合、 タンパク性因子がそれらの仲立ちをしている。 例えば、 免疫系、 造血系に関与す る分泌性因子 （液性因子） が数多く見いだされていて、 それらはサイト力インと 呼ばれている。 リンホカイン、 モノ力イン、 インターフェロン、 コロニー刺激因 子、 腫瘍壊死因子などがこれらに含まれる。
これらについて、 疾病との関係や医薬としての利用方法が盛んに研究されてい る。 また、 内分泌組織から生産られるペプチドホルモンや増殖因子などの液性因 子も、 恒常性の維持や成長に大変重要な役割を果たしている。 これらについても 医薬としての利用方法が盛んに追求されている。 これらの生体にとつて重要な夕 ンパク性因子は、 これまで生物活性を指標にして発見されてきた。 また、 既知の 生理活性タンパク質に対するホモロジ一を指標にして、 発見の追加がなされてき ている。 複雑な生物、 とりわけ、 哺乳動物が健康体であるために、 これまで見つ かっているもの以外にも生理活性を有する多くの未知のタンパク性因子が存在し ていると考えられている。 近年、 c D NAライブラリーの大規模シ一ケンシング などにより、 膨大な数の新規な遺伝子が見つかつてきつつあるが、 配列情報が断 片的で不正確なため、 これらの中から全く新しい有用遺伝子産物を選び出すこと は容易ではない。 コンピュータを使った情報処理技術の助けを借り、 D NAの配 列情報から見出されてきた新規な遺伝子産物を、 生物学、 医学、 獣医学などに役 立てようとする試みが行われつつある （トレンズ イン バイオテクノロジー (Trends in Bi otechnbol ogy) , 1 4巻、 2 9 4— 2 9 8頁、 1 9 9 6年） 。 しか しながら、 本当に有用遺伝子産物を発見するためには、 情報処理技術だけでは分 からず、 より詳細な解析と実験が必要であった。
発明の開示
本発明は、 生物学、 医学、 獣医学などに利用可能な新規タンパク質、 その部 分ペプチド、 またはそれらの塩、 組換えベクター、 形質転換体、 該タンパク質の 製造法、 該タンパク、 部分ペプチドを含有する医薬、 および該タンパク質などに 対する抗体を提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 肺、 気 管、 胃、 などで多く発現している新規な塩基配列を有する CDNAを発見するこ とに成功し、 それにコードされる蛋白質が実際に細胞外に分泌される液性因子で あることを見出した。 本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに検討を重 ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 1、 配列番号： 2もしくは配列番号： 3で表わされるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタン パク質またはその塩、
(2) 上記 （1) 記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
(3) 上記 （1) 記載のタンパク質または上記 （2) 記載の部分ペプチドをコ一 ドする D N Aを含有する組換えべク夕一で形質転換された形質転換体を培養し、 該タンパク質または該部分ペプチドを生成せしめることを特徴とする、上記に） 記載のタンパク質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法、
(4) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまた はその塩に対する抗体、
(5) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまた はその塩を用いることを特徴とする、 上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記
(2) 記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物また はその塩のスクリーニング方法、
(6) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまた はその塩を含有してなる、 上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記 （2) 記載 の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩の スクリーニング用キッ卜、
(7) 上記 （5) 記載のスクリーニング方法または上記 （6) 記載のスクリ一二 ング用キットを用いて得られうる、上記（1)記載のタンパク質もしくは上記（2) 記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその ίππ.、
(8) 上記 （5) 記載のスクリーニング方法または上記 （6) 記載のスクリー二 ング用キットを用いて得られうる、上記（1)記載のタンパク質もしくは上記（2) 記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその 塩を含有してなる医薬、
(9) 上記 （4) 記載の抗体を含有してなる診断剤、
(10) 上記 （4) 記載の抗体を含有してなる医薬などを提供する。
さらには、 本発明は、
(11) 配列番号： 1、 配列番号： 2または配列番号： 3で表わされるアミノ酸 配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、 配列番号： 1、 配列番号： 2または配列 番号： 3で表わされるアミノ酸配列と約 50%以上 （好ましくは約 60%以上、 さらに好ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 80%以上、 特に好ましくは 約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上） の相同性を有するアミノ酸配列で ある上記 （1) 記載のタンパク質、
(12) 配列番号： 1、 配列番号： 2または配列番号： 3で表わされるアミノ酸 配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、 ①配列番号： 1、 配列番号： 2または配 列番号： 3で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 30個程度） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 1、 配列番号： 2または配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましく は、 1〜30個程度） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1、 配 列番号： 2または配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜30個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたァミノ 酸配列、 または④それらを組み合わせたアミノ酸配列である上記 （1) 記載の夕 ンパク質、 (13) 配列番号： 1、 配列番号： 2または配列番号： 3で表わされるアミノ酸 配列の第 23番目〜第 1 19番目のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含有す る上記 （2) 記載のペプチド、
(14) 上記 （1〉 記載のタンパク質または上記 （2) 記載の部分ペプチドをコ ードする DNAを含有する組換えベクター、
(15) 上記 （14) 記載の組換えべクタ一で形質転換させた形質転換体、
(16) 免疫疾患、 肺機能障害などの呼吸器疾患、 塍臓機能障害、 感染症または 胃腸障害などの消化器疾患の治療 ·予防剤である上記 （10) 記載の医薬、 など を提供する。
さらに本発明は、 分子量マーカー、 組織マーカ一、 染色体マッピング、 遺伝病 の同定、 プライマー、 プローブの設計などの基礎研究に利用できるのみならず、 がん転移阻害、 がん転移の検出、 細胞の分化増殖の調節、 サイト力インの誘導、 血管新生調節、 造血調節、 血液凝固調節、 感染症、 代謝調節、 創傷火傷治癒、 抗 炎症、 遺伝子治療などの分野で、 治療または予防目的で、 利用できる可能性があ る。 さらには、 気管，気管支関連疾患 （例、 気管支炎、 インフルエンザ感染症、 気管支喘息、 上気道炎、 気管支拡張症など） 、 肺関連疾患 （肺がん、 結核、 肺炎、 肺気腫、 肺梗塞、 肺鬱血、 呼吸不全、 嚢胞性肺繊維症、 肺サルコィドーシス、 肺 水腫、 肺性高血圧、 塵肺など） 、 胃関連疾患 （例、 へリコパク夕一 · ピロリ感染 症、 消化性潰瘍、 胃がん、 胃アトニー、 胃炎、 マロリーワイズ症候群、 胃拡張、 胃液分泌異常、 メネトリエ病 （巨大肥厚性胃炎） 、 胃テタ二一、 トルソー病 （胃 性めまい） 、 胃腸神経症など） 、 糖尿病、 消化不良、 腸内細菌叢の維持、 などの 疾病に対する治療または予防目的で利用できる可能性がある。 図面の簡単な説明
図 1は実施例 1で得られた本発明のタンパク質をコードする DN Aの塩基配列 および該塩基配列から推定されるァミノ酸配列を示す。
図 2は実施例 3で得られたラット T G C - 440の塩基配列および該塩基配列 力 推定されるアミノ酸配列を示す。
図 3は実施例 4で得られたマウス T GC-440の塩基配列および該塩基配列 から推定されるァミノ酸配列を示す。
図 4は参考例で得られた動物細胞発現ベクター p CAN 618の制限酵素地図 を示す。
図 5は実施例 7で行われたウェスタンプロットの結果を示す。
Control :pCAN618をトランスフエクトした C0S7細胞の培養上清（0.25mM pABSF および 0.05 CHAPSを含む Opt i- MEM培地を用いた。 ) 。
レーン 1 ： pCAN618/huTGC440をトランスフエクトし、 Opt i- MEM培地を用いた 場合の培養上清。
レーン 2 ： pCAN618/huTGC440をトランスフエクトし、 0.25mM pABSFを含む OpU- MEM培地を用いた場合の培養上清。
レーン 3 ： pCAN618/huTGC440をトランスフエク 卜し、 0.05% CHAPSを含む Opti -MEM培地を用いた場合の培養上清。
レーン 4 ： pCAN618/huTGC440をトランスフエクトし、 0.25mM pABSFおよび 0.05¾ CHAPSを含む Opt i-MEM培地を用いた場合の培養上清。
図 6は実施例 8で行われたウエスタンブロットの結果を示す。
C0S7： PDRL440Hをトランスフエクトした C0S7細胞の培養上清 （0.25mM pABSF および 0.05% CHAPSを含む Opti- MEM培地を用いた。 ) 。
Marker：分卞量マ一力一
# 5 ： # 5クローン
# 9 ： # 9クローン
# 10 ： # 10クローン
CHO(dhfr) ：何もトランスフエクトしていない CHO(dhfr)細胞の培養上清 (0.25m pABSFおよび 0.05% CHAPSを含む αΜΕΜ培地を用いた。 ) 。
レーン 1 ： PDRL440Hをトランスフエクトし、 αΜΕΜ培地を用いた場合の培養上 清。
レーン 2 ： PDRL440Hをトランスフエクトし、 0.25InMpABSFを含むaMEM培地を 用いた場合の培養上清。
レーン 3 ： PDRL440Hをトランスフエクトし、 0.05% CHAPSを含むひ MEM培地を 用いた場合の培養上清。 レーン 4 ： PDRL440Hをトランスフエクトし、 0. 25mM pABSFおよび 0. 05 HAPS を含む αΜΕΜ培地を用いた場合の培養上清。
図 7は実施例 8で行われたウエスタンプロットの結果を示す。
C0S7： PDRL440Rをトランスフエク卜した C0S7細胞の培養上清 （0. 25mM pABSF および 0. 05% CHAPSを含む Opt i-MEM培地を用いた。 ） 。
Marker：分子量マ一カー
# 4 ： # 4クロ一ン
# 9 ： # 9クローン
CHO (dh fr) ：何もトランスフエクトしていない CHO (dhf r)細胞の培養上清 (0. 25mM pABSFおよび 0. 05% CHAPSを含む αΜΕΜ培地を用いた。 ） 。
レーン 1 ： PDRL440Rをトランスフエクトし、 α MEM培地を用いた場合の培養上 清。
レーン 2 ： PDRL440Rをトランスフエクトし、 0. 25mM pABSFを含むaMEM培地を 用いた場合の培養上清。
レーン 3 ： PDRL440Rをトランスフエクトし、 0. 05% CHAPSを含むひ MEM培地を 用いた場合の培養上清。
レーン 4 ： PDRL440Rをトランスフエクトし、 0. 25mM pABSFおよび 0. 05% CHAPS を含む a MEM培地を用いた場合の培養上清。 発明を実施するための最良の形態
本発明の配列番号： 1、 配列番号： 2または配列番号： 3で表わされるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質 （以下、 本発明のタンパク質と称する） は、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラッ ト、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例え ば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 滕臓 0細胞、 骨髄細胞、 メサンギ ゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 もしくは間質細 胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） もしくはそれ らの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 降臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 唾液腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 軟骨、 関節、 骨格筋などに由来するタンパク質で あってもよく、 組換えタンパク質であってもよく、 合成タンパク質であってもよ い。
配列番号： 1、 配列番号： 2または配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列としては、 それぞれ配列番号： 1、 配列番号： 2ま たは配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、好ましくは約 6 0 % 以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ま しくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配 列などが挙げられる。
また、 本発明のタンパク質は、 通常シグナルペプチドを有しているので、 タン パク質を効率よく細胞外に分泌させることができる。
本発明の配列番号： 1、 配列番号： 2または配列番号： 3で表わされるァミノ 酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質としては、 例えば、 前 記の配列番号： 1、 配列番号： 2または配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列 と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1、 配列番号： 2または配列 番号： 3で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の性質を 有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の性質としては、 例えば、 分泌され液性因子として作用すること などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が定性的に同質であること を示す。 したがって、 分泌作用や溶解度などの性質が同等 （例、 約 0 . 1〜 1 0
0倍、 好ましくは約 0 . 5〜 1 0倍、 より好ましくは 0 . 5〜2倍） であること が好ましいが、 これらの性質の程度、 タンパク質の分子量などの量的要素は異な つていてもよい。
また、 本発明のタンパク質としては、 例えば、 ①配列番号： 1、 配列番号： 2 または配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましく は、 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 1、 配列番号： 2または 配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 3 0個程度、 好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） の アミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1、 配列番号： 2または配列番 号： 3で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個 程度、 好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のァミノ 酸が挿入されたアミノ酸配列、 ④配列番号： 1、 配列番号： 2または配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程 度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸 が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または⑤それらを組み合わせたアミ ノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムティンも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その挿入、 欠失または置換の位置としては、特に限定されないが、配列番号： 1、配列番号： 2および配列番号： 3のそれぞれの配列番号で表わされるアミノ酸配列に共通す るアミノ酸配列以外の位置などが挙げられる。
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端（ァ ミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号： 1で表わさ れるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、 本発明のタンパク質は、 C末端が通常カルボキシル基（― C O O H)またはカルボキシレート（—C O O一） であるが、 C末端がアミド （― C O NH 2) またはエステル （一 C〇〇R) であ つてもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピルもしくは n _ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロペン チル、 シクロへキシルなどの C 3 _ 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α— ナフチルなどの 2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二 ルー Cい 2アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどのひ一ナフチルー C _ 2 アルキル基などの C 7 _ ァラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用される ビバロイルォキシメチル基などが用いられる。
本発明のタンパク質が C末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレ一卜） を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているもの も本発明のタンパク質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記し た C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のタンパク質には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残 基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの アル力 ノィルなどの ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断されて 生成する N末端のダル夕ミン残基がピ口グルタミン酸化したもの、 分子内のアミ ノ酸の側鎖上の置換基 （例えば— OH、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾ ル基、 ィ ンドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチ ル基などの C i— 6アルカノィル基などの C i _ 6ァシル基など）で保護されているも の、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども 含まれる。
本発明のタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるァ ミノ酸配列を有するヒト由来のタンパク質、 配列番号： 2で表わされるアミノ酸 配列を有するラット由来のタンパク質、 配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列 を有するマウス由来のタンパク質などが用いられる。
本発明の夕ンパク質の部分べプチドとしては、 前記した本発明の夕ンパク質の 部分ペプチドであって、 好ましくは、 前記した本発明のタンパク質と同様の性質 を有するものであればいずれのものでもよい。 例えば、 本発明のタンパク質の構 成アミノ酸配列のうち少なくとも 5個以上、 好ましくは 2 0個以上、 さらに好ま しくは 3 0個以上、 より好ましくは 5 0個以上、 最も好ましくは 8 0個以上のァ ミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
これらペプチドの中でも、 例えば、 配列番号： 1、 配列番号： 2または配列番 号： 3で表わされるアミノ酸配列の第 2 3番目〜第 1 1 9番目のアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 本発明のタンパク質と実質的 に同質の性質を有するぺプチドなどが好ましい。
ここで、 「実質的に同質の性質」 とは、 前記と同意義を示す。 また、 本発明の部分ペプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠 失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0個 程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のァ ミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 2 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数（ 1 ~ 5 ) 個）のアミノ酸が挿入され、 または、そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上（好 ましくは、 1〜 1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜 5個程 度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常力ルポキシル基 （一 C O OH) ま たはカルボキシレート （― C O〇—） であるが、 C末端がアミド （― C〇NH 2) またはエステル （一 C O O R) であってもよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン 残基） のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生 成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖 上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわ ゆる糖べプチドなどの複合べプチドなども含まれる。
本発明の部分べプチドは抗体作成のための抗原として用いることができるので、 必ずしも本発明の夕ンパク質が有する活性を有する必要はない。
本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩としては、 生理学的に許 容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩が 用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩とし ては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あ るいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コ ハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベ ンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩は、 前述したヒトゃ温血 動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造するこ ともできるし、 後述するタンパク質をコードする D NAを含有する形質転換体を 培養することによつても製造することができる。 また、 後述のペプチド合成法に 準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマ トグラフィ一、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み 合わせることにより精製単離することができる。
本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩、 またはそれらのアミド 体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。 そのよ うな樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズ ヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一べンジルォキシベンジルアルコー ル樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4—ヒドロキシメチル メチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、 4— (2' , 4' - ジメトキシフエ二ル一ヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4— (2' , 4' -ジメト キシフェニル一 Fmocァミノェチル） フエノキシ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 ひーァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で 縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種保護基を 除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフイド結合形成反応を実施し、 目的 のタンパク質またはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 DCC、 Ν, Ν' -ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν-ェチル - Ν' - (3- ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これらによる活性 化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HOB HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接 樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物または HOB tエステルあるいは H00B〖エステ ルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することが できる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N , N—ジメチルァセトアミド， N—メチルビ 口リドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのエーテ ル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約一 2 0 °C〜 5 O tの範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテ ストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を 繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分 な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未 反応ァミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えないように することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 Boc、 t 一ペンチルォキシカル ボニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォキシカルボ二 ル、 C卜 Z、 Br- Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフルォロアセチル、 フタ ロイル、 ホルミル、 2 _ニトロフエニルスルフエニル、 ジフエニルホスフイノチ オイル、 Fmocなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 tーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロヘプ チル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状ァ ルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4— ニトロべンジルエステル、 4—メトキシベンジルエステル、 4一クロ口べンジル エステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキ シカルボニルヒドラジド化、 t一ブトキシカルボニルヒドラジド化、 トリチルヒ ドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級 （C ^ e ) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシ カルポニル基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いら れる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒド ロビラニル基、 ί -ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz l、 C l 2- Bz l、 2 一二トロベンジル、 Br- Z、 t —ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、例えば、 Tos、 4 -メトキシ -2， 3, 6- トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 Bo Tr t、 Fniocなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペン夕クロ口フエノール、 2， 4, 5- トリクロ口フエノール、 2， 4-ジニトロフエノール、 シァノメチルアルコール、 ラニトロフエノール、 H0NB、 N-ヒドロキシスクシミド、 N-ヒドロキシフタルイミ ド、 HOBt) とのエステル〕 などが用いられる。 原料のァミノ基の活性化されたも のとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d -炭素など の触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタン スルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれら の混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウム による還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 °C 〜4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソ一ル、 フエ ノール、 チオア二ソ一ル、 メタクレゾール、 パラクレゾール、 ジメチルスルフィ ド、 1， 4-ブタンジチオール、 1, 2 -エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤 の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基として用いられる 2, 4 -ジニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、 トリブトファン のインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1, 2-エタンジチオール、 1, 4 -ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナト リゥム溶液、 希アンモニアなどによるアル力リ処理によっても除去される。 原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 力ルポキシ末 端アミノ酸の α—カルボキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にぺプ チド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の Ν末端のひ ーァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質と C末端のカルボキシル基の保護基 のみを除去したタンパク質とを製造し、 この両タンパク質を上記したような混合 溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により 得られた保護タンパク質を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗夕ンパク質を得ることができる。 この粗夕ンパク質は既知の各種精製手 段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド 体を得ることができる。
タンパク質のエステル体を得るには、 例えば、 カルポキシ末端アミノ酸のひ一 カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 タン パク質のアミド体と同様にして、 所望のタンパク質のエステル体を得ることがで さる。
本発明の部分べプチドまたはその塩は、 自体公知のぺプチドの合成法に従って、 あるいは本発明のタンパク質を適当なぺプチダーゼで切断することによって製造 することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成 法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明の部分ペプチドを構成し得る部分 ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場 合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することができる。 公知 の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の①〜⑤に記載された方法が 挙げられる。
① M. Bodanszky および M. A. Ondet t i , ペプチド · シンセシス （Pept ide Synthes i s) , Intersc ience Publ i shers, New York (1966年)
② Schroederおよび Luebke、ザ'ペプチド（The Pept i de) , Academi c Press, New York (1965年) ③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトダラ フィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明の部分ぺプ チドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチドが遊離体で ある場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換する ことができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方 法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のタンパク質をコードする DNAとしては、 前述した本発明のタンパク 質をコ一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNA、 合成 DNAのいずれ でもよい。
ライブラリーに使用するべクタ一は、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 '組織より total RNAまたは mR NA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T- P C R法と略称する) によって増幅することもできる。
本発明のタンパク質をコードする DNAとしては、 例えば、 ①配列番号： 4で 表わされる塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 4で表わされる塩基配 列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 本発 明のタンパク質と実質的に同質の性質 （例、 分泌作用など） を有するタンパク質 をコードする DNA、 ②配列番号： 5で表わされる塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 5で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハ イブリダィズする塩基配列を有し、 本発明のタンパク質と実質的に同質の性質を 有るタンパク質をコードする DNA、 ③配列番号： 6で表わされる塩基配列を含 有する DNA、 または配列番号： 6で表わされる塩基配列とハイストリンジェン トな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 本発明のタンパク質と実質的 に同質の性質を有するタンパク質をコ一ドする DNAなどを有し、 本発明のタン パク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする DN Aであれば何 れのものでもよい。
配列番号： 4〜配列番号： 6のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列とハ イストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 それぞれ配列番号： 4〜配列番号： 6のいずれかの配列番号で表わされる塩基配 列と約 60%以上、 好ましくは約 70%以上、 さらに好ましくは約 80%以上の 相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ば、 モレキュラー 'クロ一ニング（Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrooket al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことが できる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の 方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条 件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 19〜40m M、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70 °C、 好ましくは約 60 〜65 °Cの条件を示す。
より具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質 をコードする DNAとしては、 配列番号： 4で表わされる塩基配列を有する DN Aなどが、 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコード する DNAとしては、 配列番号： 5で表わされる塩基配列を有する DNAなどが、 配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DN A としては、 配列番号： 6で表わされる塩基配列を有する DNAなどが用いられる。 本発明の部分ペプチドをコードする DN Aとしては、 前述した本発明の部分べ プチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよ い。 また、 ゲノム DNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNA、 合成 DNAのい ずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 ①配列番号： 4 で表わされる塩基配列を有する DN Aの部分塩基配列を有する DNA、 配列番 号： 10で表わされる塩基配列を有する DNA、 または配列番号： 10で表わさ れる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を 有し、 本発明のタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードす る DNAの部分塩基配列を有する DNA、 ②配列番号： 5で表わされる塩基配列 を有する DNAの部分塩基配列を有する DNA、 配列番号： 1 1で表わされる塩 基配列を有する DNA、 または配列番号： 1 1で表わされる塩基配列とハイスト リンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 本発明の実質的に 同質の性質を有するタンパク質をコードする DN Aの部分塩基配列を有する DN A、 ③配列番号： 6で表わされる塩基配列を有する DN Aの部分塩基配列を有す る DNA、 配列番号： 12で表わされる塩基配列を有する DNA、 または配列番 号： 12で表わされる塩基配列とハイストリンジェン卜な条件下で八イブリダィ ズする塩基配列を有し、 本発明のタンパク質と実質的に同質の性質を有するタン パク質をコードする D N Aの部分塩基配列を有する D N Aなどが用いられる。 配列番号： 10〜配列番号： 12のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列 とハイブリダィズできる DNAは、 前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーシヨンの方法および八ィストリンジェントな条件は前記と同 様のものが用いられる。
具体的には、 配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを コードする DNAとしては、 配列番号： 10で表わされる塩基配列を有する DN Aなどが、 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコード する DNAとしては、 配列番号： 1 1で表わされる塩基配列を有する DNAなど が、 配列番号： 9で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする D NAとしては、 配列番号： 12で表わされる塩基配列を有する DNAなどが用い られる。
本発明のタンパク質または部分ペプチド （以下、 これらタンパク質等をコード する DNAのクローニングおよび発現の説明においては、 これらタンパク質等を 単に本発明のタンパク質と略記する） を完全にコードする DN Aのクロ一ニング の手段としては、 本発明のタンパク質の部分塩基配列を有する合成 DN Aプライ マーを用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なベクターに組み込んだ DN Aを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードする DN A断片もし くは合成 D N Aを用いて標識したものとのハイブリダイゼーシヨンによつて選別 することができる。 ハイブリダィゼ一シヨンの方法は、 例えば、 モレキュラー ' クロ一ニング (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販 のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なう ことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 PCRや公知のキット、 例えば、 Mutant™- G (宝 酒造 (株) )、 Mutant™- K (宝酒造 (株) )などを用いて、 Gu卯 ed duplex法や Kimkel 法などの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができ る。
クローン化されたタンパク質をコードする DN Aは目的によりそのまま、 また は所望により制限酵素で消化したり、 リンカーを付加したりして使用することが できる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 ま た 3 ' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有して いてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAァ ダプタ一を用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質を コードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を 適当な発現べクタ一中のプロモーターの下流に連結することにより製造すること ができる。
ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 PBR322, pBR 32 5, pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 10， pTP 5, p C 194) 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19， p SH 15) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— l l、 pXTl、 p R c/CMV、 pRc/RSV、 p cDNA I ZNe oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRaプロモ一夕一、 SV40プロモーター、 H I V ' LTRプロモ一夕一、 CMVプロモーター、 HSV-TKプロモーターなどが挙げ られる。
これらのうち、 (サイトメガロウィルス） プロモー夕一、 SRaプロモ —ターなどを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモー夕一、 r e c Aプロモータ一、 λ PLプロモ一夕 ―、 l p pプロモーター、 T 7プロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌である 場合は、 SPOlプロモーター、 SPO 2プロモーター、 p e nPプロモーター など、 宿主が酵母である場合は、 PH05プロモータ一、 PGKプロモータ一、 GAPプロモータ一、 ADHプロモータ一などが好ましい。 宿主が昆虫細胞であ る場合は、 ボリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーターなどが好ましい。 発現べクタ一には、 以上の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マ一カーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amprと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne 0「と略称する場合がある、 G41 8耐性） 等が挙げられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて d h f r遺伝子 を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によ つても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N 端末側に付加する。宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA ·シグナル配列、 ΟπιρΑ·シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミラーゼ · シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である場合は、 MF · シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場 合には、 インシュリン ·シグナル配列、 α—インターフェロン ·シグナル配列、 抗体分子 · シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DN Αを含有する ベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、例えば、ェシエリヒア 'コリ（Escherichia coli) K 12 · DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー · ォブ 'サイェンシィズ 'ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. US A) , 60巻， 160 (1968)〕 ， J M 1 03 〔ヌクイレック 'ァシッズ · リ サーチ， （Nucleic Acids Research) , 9巻， 309 (198 1)〕 ， J A221 〔ジャ——ナ レ ·才ブ' ·モレキユラ—— ·ノヾィォロジ '—— (Journal of Molecular Biology) 〕 ， 120巻， 51 7 (1978)〕 ， ΗΒ 10 1 〔ジャーナル ·ォブ · モレキュラー 'バイオロジー， 41巻， 459 (1 969)〕 ， C 600 〔ジエネ ティックス （Genetics) , 39巻， 440 (1 954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス （Bacillus subtilis) M I 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1 983)〕 ， 207— 21 〔ジャーナル · ォブ 'バイオケミストリー （Journal of Biochemistry) , 95巻， 87 (198 4)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R―， NA 87 - 1 1 A, DKD— 5D, 20 B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) NC Y C 19 13， NC YC 2036、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) KM 7 1などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell ； S f細胞) 、 Trichoplusia niの中腸 由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High FiveTM細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNPVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyxmori N細胞； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 2 1細胞（以上、 Vaughn, J. L.ら、イン'ヴイボ（In Vivo) , 13, 213-217, (1977)) などが用いられる。 昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー (Nature) ， 3 1 5巻， 592 (1 985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7 (COS 7) , Vero, チヤィ ニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CH〇細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損 チャイニーズハムス夕一細胞 CHO (以下、 CHO (d h f r— ) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス A t T— 20, マウスミエローマ細胞， ラット GH3, ヒ ト FL細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、例えば、 プロシージングズ ·ォブ'ザ' ナショナル 'アカデミー'ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ一（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69巻， 2 1 10 ( 1972 )やジーン （Gene) , 1 7巻， 107 ( 1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー ·アンド ·ジエネラ リレ ·ジエネティックス (Molecular & General Genetics) ， 168巻， 1 1 1 (1 979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ'イン'ェンザィモロジ一（Methods inEnzymology) , 194巻， 182— 187 ( 1991 ) 、 プロシ一ジングズ' ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーェ スェ一 （Pro Natl. Acad. Sci. USA) ， 75巻， 1 929 (1 978) など に記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ Zテクノロジー (Bio/Technology) , 6, 47-55 (1988)) などに記載の方法に従って行なうことがで さる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコール. 263— 267 ( 1995) (秀潤社発行）、 ヴイロロジー（Virology)， 52巻， 456 (1973)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、 タンパク質をコードする DNAを含有する発現ベクターで形 質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチ一プ' リカ一、 ペプトン、 力 ゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機 物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシ ゥムなどが挙げられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加して もよい。 培地の pHは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M9培地 〔ミラー （Miller) , ジャーナル ·ォブ ·ェクスペリメンッ · イン 'モレキュラー 'ジェ不ティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics) ， 431—433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 19 72〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモータ一を効率よく働かせるために、 例えば、 3 3—インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシェリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜 43 で約 3〜 24時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行な レ 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ 一ルダ一（Burkholder)最小培地〔Bostian, K. L. ら、 プロシ一ジングズ ·ォブ · ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ 'ユーエスェ一 (Pro atl. Acad. Sci. USA) , 77巻， 4505 (1 980)〕 や 0. 5% カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter, G. A. ら、 プロシージングズ ·ォブ · ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ♦サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 81卷， 5330 (1984) ) が挙げら れる。 培地の pHは約 5〜8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20°C〜3 5°Cで約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Insect Medium (Grace, T. C. ，ネィチヤ一 (Nature) , 195, 788 (1962)) に非動化した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培 地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 °Cで約 3〜 5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) , 1 22巻， 5 0 1 (1 952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジ一 （Virology) ， 8巻， 396 (1 959)〕 ， RPMI 1640培地 〔ジャーナル 'ォブ ·ザ ·アメリカン 'メデ ィカリレ ·ァソシエーション (The Journal of the American Medical Association) 1 99巻， 51 9 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシージング ·ォブ ·ザ ·ソサ イエティ ·フォー ·ザ'バイオロジカル ·メディスン （Proceedingof the Society for the Biological Medicine) , 73巻， 1 ( 1950)〕 などが用いられる。 p Hは約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 30°C〜40°Cで約 1 5〜60 時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞膜に本発明のタンパク質を生成せしめる ことができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法 により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したの ち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリトン X— 1 00TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌さ れる場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを 分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の 精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 こ れらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する 方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および SDS—ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグ ラフィ一などの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグラフィーな どの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水 性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法など が用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の方法あ るいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場 合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に 変換することができる。
なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当な蛋白修 飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的 に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモト リプシン、 アルギニルエンドべプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダー ゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質またはその塩の存在は、 特異抗体を用い たェンザィムィムノアツセィゃ Wes tern bl o t t i ngなどにより測定することができ る。
本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、 本発明 のタンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体であれば、 ポリ クローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 抗体の説明にお いては、 これらタンパク質等を単に本発明のタンパク質と略記する） に対する抗 体は、 本発明のタンパク質を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血清の製 造法に従つて製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位に それ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を 高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投 与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜 1 0回程度行われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウ ス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるカ^ マウスおよびラッ卜が好 ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓 またはりンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物 の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマ を調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化タ ンパク質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定する ことにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミ ルス夕インの方法 〔ネィチヤ一 （Nature)、 256、 495 (1975)) に従い実施するこ とができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは P E Gが用いられる。 骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 S P 2/0, AP— 1な どの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用 いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1 〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG6000) が 10〜 80 %程度の濃度で添加され、 20〜 40 、 好ましくは 30〜 37 °C で 1〜 10分間ィンキュベ一トすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固 相 （例、 マイクロプレート） に八イブリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物 質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマ ウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを 加え、 固相に結合したモノクロ一ナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロブリン抗 体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 放 射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合したモノクロ一ナ ル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行 なうことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地として は、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例 えば、 1〜2 0 %、好ましくは 1 0〜2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） ある いはハイプリドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） など を用いることができる。 培養温度は、 通常2 0〜4 0 °〇、 好ましくは約 3 7 °Cで ある。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養 は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体 価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫グロブリン の分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 ィ オン交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合 固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体の みを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうことが できる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従 つて製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （タンパク質抗原） 自体、 あるい はそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製 造法と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のタンパク質に対 する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造することが できる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体 に関し、 キャリア一蛋白質の種類およびキャリア一とハプテンとの混合比は、 キ ャリア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの 様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミンや ゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1 〜20、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバン卜や不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜10回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ一ナ ル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことがで さる。
本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードする DN A (以下、 アンチセ ンス DNAの説明においては、 これらの DNAを本発明の DNAと略記する） に 相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンス DN Aとして は、 本発明の DNAに相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列を有し、 該 D N Aの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、 いずれのアンチセンス DN Aであってもよい。
本発明の DNAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の DNAに 相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の DNAの相補鎖） の全塩基配列あるいは 部分塩基配列と約 70%以上、好ましくは約 80%以上、より好ましくは約 90% 以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。 特に、 本発明の DNAの相補鎖の全塩基配列うち、 本発明のタンパク質の N末端 部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列など） の 相補鎖と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチセンス DNAが好適である。 これらのアンチセンス DN Aは、 公知の DN A合成装置などを用いて製造するこ とができる。
本発明のタンパク質は、 通常シグナルペプチドを有するため、 細胞外に効率よ く分泌され、 液性因子として、 シグナル伝達や自己防衛などのための重要な生物 活性を有する。
以下に、 本発明のタンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発明 のタンパク質等と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質または部分べプチ ドをコードする D N A (以下、 本発明の D N Aと略記する場合がある） 、 本発明 のタンパク質、 部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体 （以下、 本発明の抗 体と略記する場合がある） 、 およびアンチセンス D NAの用途を説明する。
( 1 ) 本発明のタンパク質は、 組織特異的に発現しているため、 組織マ一カーと して使用することができる。 すなわち組織の分化、 病態、 癌の転移などの検出の ためのマーカーとして有用である。 また、 対応するレセプター、 リガンド、 結合 タンパク質などの分取にも利用できる。 さらに、 自体公知のハイスループットス クリーニングのためのパネルにして、 生物活性を調べるのに利用できる。 また、 染色体マッピングを行い、 遺伝病の研究にも利用できる。
( 2 ) 本発明のタンパク質が関与する各種疾病の治療 ·予防剤
本発明のタンパク質などは、 生体内で液性因子として存在するため、 本発明の 夕ンパク質などまたは本発明の D N Aなどに異常があったり、 欠損している場合 あるいは発現量が異常に減少または高進している場合、 例えば、 免疫疾患、 滕機 能障害、 隧臓機能障害、 感染症または胃腸障害などの種々の疾病が発症する。 したがって、 本発明のタンパク質等および本発明の D N Aは、 例えば、 免疫疾 患、肺機能障害、塍臓機能障害、感染症または胃腸障害などの種々の疾病の治療 · 予防剤などの医薬として使用することができる。
より具体的には、 本発明のタンパク質等および本発明の D N Aは、 例えば、 気 管，気管支関連疾患 （例、 気管支炎、 インフルエンザ感染症、 気管支喘息、 上気 道炎、 気管支拡張症など） 、 肺関連疾患 （肺がん、 結核、 肺炎、 肺気腫、 肺梗塞、 肺鬱血、 呼吸不全、 嚢胞性肺繊維症、 肺サルコイドーシス、 肺水腫、 肺性高血圧、 塵肺など） 、 胃関連疾患 （例、 ヘリコバクタ一· ピロリ感染症、 消化性潰瘍、 胃 がん、 胃アトニー、 胃炎、 マロリーワイズ症候群、 胃拡張、 胃液分泌異常、 メネ トリェ病 （巨大肥厚性胃炎） 、 胃テタニー、 トルソー病 （胃性めまい） 、 胃腸神 経症など） 糖尿病、 消化不良、 腸内細菌叢の維持、 などの疾病の治療 ·予防剤な どの医薬として使用することができる。
例えば、 生体内において本発明のタンパク質などが減少あるレ ^は欠損している ために、 細胞における情報伝達が十分に、 あるいは正常に発揮されない患者がい る場合に、 （ィ） 本発明の D N Aを該患者に投与し、 生体内で本発明のタンパク 質等を発現させることによって、 （口） 細胞に本発明の D N Aを挿入し、 本発明 のタンパク質等を発現させた後に、 該細胞を患者に移植することによって、 また は （八） 本発明のタンパク質等を該患者に投与することなどによって、 該患者に おける本発明のタンパク質等の役割を十分に、 あるいは正常に発揮させることが できる。
本発明の D N Aを上記の治療 ·予防剤として使用する場合は、 該 D N Aを単独 あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァ ソシェ一テツドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常套手段 に従って、 ヒトまたは温血動物に投与することができる。 本発明の D NAは、 そ のままで、 あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体と ともに製剤化し、 遺伝子銃ゃ八ィドロゲルカテーテルのようなカテーテルによつ て投与できる。
本発明のタンパク質等を上記の治療 ·予防剤として使用する場合は、 少なくと も 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さらに好ましく は 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のタンパク質等は、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル 剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしく はそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射 剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 本発明のタンパク質等を生理学的に認 められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などととも に一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって 製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当 な容量が得られるようにするものである。 錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を 含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 ェタノ ールなど） 、 ポリアルコール （例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレング リコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート 8 0 TM、 H C 〇ー 5 0など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆 油などが挙げられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールな どと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム 緩衝液など） 、 無痛化剤（例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合して もよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。
本発明の D N Aが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、 通常、 非経 口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ 夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与すること ができる。
本発明のタンパク質等の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 免疫疾患の治療目的で本発明のタンパク質等を経口投 与する場合、 一般的に成人 （6 O k として） においては、 一日につき該タンパ ク質等を約 l m g〜： L 0 0 0 m g、 好ましくは約 1 0 5 0 0 m g、 より好まし くは約 1 0 2 0 O m g投与する。 非経口的に投与する場合は、 該タンパク質等 の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 免疫疾患 の治療目的で本発明のタンパク質等を注射剤の形で成人 （体重 6 0 k gとして） に投与する場合、 一日につき該タンパク質等を約 1 1 0 0 O m g程度、 好まし くは約 1 2 0 0 m g程度、 より好ましくは約 1 0 1 0 0 m g程度を患部に注 射することにより投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当た りに換算した量を投与することができる。
( 3 ) 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質等は生体内 （特に肺、 気管、 胃、 塍臓など） で液性因子と して存在するため、 本発明のタンパク質等の機能を促進する化合物またはその塩 は、 例えば、 免疫疾患、 肺機能障害、 滕臓機能障害、 感染症または胃腸障害など の治療 ·予防剤などの医薬として使用できる） 。
一方、 本発明のタンパク質等の機能を阻害する化合物またはその塩は、 本発明 のタンパク質等の産生過剰に起因する疾患の治療 ·予防剤などの医薬として使用 できる。
したがって、 本発明のタンパク質等は、 本発明のタンパク質等の機能を促進ま たは阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用であ る。
すなわち、 本発明は、 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの 塩を用いることを特徴とする本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれ らの塩の機能を促進する化合物もしくはその塩 （以下、 促進剤と略記する場合が ある） 、 または本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の機能 を阻害する化合物 （以下、 阻害剤と略記する場合がある） のスクリーニング方法 を提供する。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明のタンパク質、 部分ペプチドまた はそれらの塩を含有するものである。 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などか ら選ばれた化合物であり、 本発明の夕ンパク質等の機能を促進または阻害する化 合物である。
該化合物の塩としては、 前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用い られる。
本発明のスクリ一ニング方法またはスクリ一ニング用キットを用いて得られる 化合物を上述の治療 ·予防剤として使用する場合、 常套手段に従って実施するこ とができる。 例えば、 前記した本発明のタンパク質等を含有する医薬と同様にし て、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁 液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ルー トなどにより差異はあるが、 例えば、 炎症性疾患治療の目的で本発明のタンパク 質等の機能を促進する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kg として） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜 2 Omg投与する。 非経口的に投 与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異な るが、 例えば、 炎症性疾患治療の目的で本発明のタンパク質等の機能を促進する 化合物を注射剤の形で通常成人 （6 O kgとして） に投与する場合、 一日につき 該化合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 よ り好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。 一方、 本発明のタンパク質等の機能を阻害する化合物を経口投与する場合、 一 般的に成人 （体重 6 O kgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜 10 Omg, 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20m g投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対 象疾患などによっても異なるが、 本発明のタンパク質等の機能を阻害する化合物 を注射剤の形で通常成人 （60 kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合 物を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ま しくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他 の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
(3) 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の定量
本発明のタンパク質等に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合があ る） は、 本発明のタンパク質等を特異的に認識することができるので、 被検液中 の本発明のタンパク質等の定量、 特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに 使用することができる。
すなわち、 本発明は、
( i) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明のタンパク質等とを競 合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質等の割合を 測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質等の定量法、 および
(ii) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検波中の本発明のタンパク質等の定量法を提供す る。
また、 本発明のタンパク質等に対するモノクロ一ナル抗体 （以下、 本発明のモ ノクローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明の夕ンパク質等の定量を 行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F(ab')2 、 F ab'、 あ るいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質等の定量法は、 特に制限されるべき ものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 こ れを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法で あれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィ ムノメトリック法およびサンドィツチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の 点で、 後述するサンドィツチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが用いられる。 上記酵素 としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 /3—ガラクトシダ一 ゼ、 /3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リン ゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミ ン、 フルォレツセンイソチオシァネ一卜などが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用い られる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を 用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常夕 ンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる 方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不 溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 ある いはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検波を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクロ一ナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより 被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応 は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なって もよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 ま た、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体 に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等 の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質等の測定法においては、 1 次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明のタンパ ク質等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反 応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明のタンパク質等の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノク口一ナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリ一などに用いることができる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原（F ) と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し （B Z F分離） 、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被検波中の抗原量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B / F分離をポリエチレングリコ —ル、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として 固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体とし て固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレ一ザ一の散乱を利用するレーザ一ネフロメトリーな どが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質等の測定系を構 築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを 参照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ〕 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ〕 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治 ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免 疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫 測定法」 （第 3版） (医学書院、昭和 62年発行）、 rMethods in ENZYMOLOGYj Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)) 、 同書 Vol. 73(1删 nochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 7 (Immunochemical Techniques (Part C))、 同書 Vol. 84(Imm画 chemical Techniques (Part D:Selected Immunoassays)) 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)) 、 同 書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I :Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、 ァカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク質 等を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質等の濃度を定量すること によって、 本発明のタンパク質等の濃度の減少が検出された場合、 例えば、 免疫 疾患、 肺機能障害、 塍臓機能障害、 感染症または胃腸障害などの疾病である、 ま たは将来罹患する可能性が高いと診断することが、できる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパ ク質等を検出するために使用することができる。 また、 本発明のタンパク質等を 精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のタンパ ク質等の検出、 被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのため に使用することができる。
(5) 遺伝子診断剤
本発明の DN Aは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 ラッ卜、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明のタンパク 質またはその部分ペプチドをコードする DNAまたは mRNAの異常 （遺伝子異 常） を検出することができるので、 例えば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突 然変異あるいは発現低下や、 該 D N Aまたは m R N Aの増加あるいは発現過多な どの遺伝子診断剤として有用である。
本発明の DN Aを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザンハ イブリダィゼーシヨンや PC R— S S CP法 （ゲノミックス （Genomics) , 第 5 巻， 874〜879頁 （ 1989年） 、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナ ル 'アカデミー'ォブ 'サイェンシィズ'ォブ'ユーエスエー（Proceedings of the Nat inal Academy of Sciences of the United States of America) ， 弟 86¾=, 2766〜 2770頁 （1989年） ） などにより実施することができる。
例えば、 ノーザンハイブリダィゼーションにより発現低下が検出された場合や PCR— S S CP法により DN Αの突然変異が検出された場合は、 例えば、 免疫 疾患、 肺機能障害、 塍臓機能障害、 感染症または胃腸障害などの疾病である可能 性が高いと診断することができる。
(6) アンチセンス DNAを含有する医薬
本発明の D N Aに相補的に結合し、 該 D N Aの発現を抑制することができるァ ンチセンス DN Aは、 生体内における本発明のタンパク質等または本発明の DN Aの機能を抑制することができるので、 例えば、 本発明のタンパク質などの発現 過多に起因する疾患の治療 ·予防剤として使用することができる。
上記アンチセンス DN Aを上記の治療 '予防剤として使用する場合、 前記した 本発明の DN Aを含有する各種疾病の治療 ·予防剤と同様にして実施することが できる。
例えば、 該アンチセンス DNAを用いる場合、 該アンチセンス DNAを単独あ るいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクタ一、 アデノウイルスァソ シエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常套手段に 従って実施することができる。 該アンチセンス DN Aは、 そのままで、 あるいは 摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺 伝子銃やハイド口ゲル力テーテルのようなカテーテルによつて投与できる。
さらに、 該アンチセンス DNAは、 組織や細胞における本発明の DNAの存在 やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用す ることもできる。
(7) 本発明の抗体を含有する医薬
本発明の夕ンパク質等の活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、 例えば、 本発明のタンパク質などの発現過多に起因する疾患の治療 ·予防剤などの医薬と して使用することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療 '予防剤は、 そのまま液剤として、 ま たは適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的に 投与することができる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなど によっても異なるが、 例えば、 、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0 . 0 1〜2 O m g Z k g体重程度、好ましくは 0 . 1〜1 O m g Z k g体重程度、 さらに好ま しくは 0. l〜5 m g Z k g体重程度を、 1日 1〜5回程度、好ましくは 1日 1〜 3回程度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投与および経 口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い場合に は、 その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することができ る。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記またはその塩と薬理学的に許容さ れ得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口 または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散 剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などが あげられる。 かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤分野におい て通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシ ゥムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤などの 剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体 またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸濁 または乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理 食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な溶解補 助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレ ングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソル ベー卜 80、 HCO— 50 ipolyoxyethylene ( 5 Omol) adduct of hydrogenated castor oil) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆 油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールな どを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合 することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形とし ては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示され、 そ れぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 とりわけ注射剤では 5〜 10 0mg、 その他の剤形では 10〜25 Omgの上記抗体が含有されていることが 好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。
(8) DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のタンパク質等をコードする DN A (以下、 本発明 の外来性 DN Aと略記する） またはその変異 DN A (本発明の外来性変異 DNA と略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒト哺乳動物、
(2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1)記載の動物、
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物において 発現しうる組換えべクタ一を提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生におけ る胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リポフエクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキス トラン法などにより目的とする DN Aを転移することによって作出することがで きる。 また、 該 DN A転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目 的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用するこ ともでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により 融合させることにより本発明の DN A転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 八ムス夕一、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 ま た、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C 57B LZ6系統， DBA 2系統など、 交雑系として、 B6C3F 系統， BDF 系統, B6D2Fi系統， BALBZc系統， I CR系統など） またはラット （例えば、 W i s t a r, SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えべクタ一における 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒ卜哺乳動物の他にヒ卜などが挙げられる。
本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DNA ではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。
本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DNAの塩基配列に変異 （例えば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への置 換などが生じた DN Aなどが用いられ、 また、 異常 DN Aも含まれる。
該異常 DNAとしては、 異常な本発明のタンパク質を 現させる DNAを意味 し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させ る DN Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DN Aは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳 動物由来のものであってもよい。 本発明の DN Aを対象動物に転移させるにあた つては、 該 DN Aを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した DN Aコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒト D N Aを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の DN Aを有する各種哺乳動 物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスな ど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明のヒト DN Aを結合した DNAコンストラクト （例、 ベクターなど） を対象哺乳動物の受精 卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明 の DN Aを高発現する DN A転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草 菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのパクテリオファ ージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルスまた はバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由 来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好 ましく用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモ一夕一としては、例えば、①ウィルス（例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウイ ルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DN Αのプロモーター、 ②各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモーター、 例えば、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロ ブラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋クレアチン キナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質ク、 グルタチオン S—トランスフェラ一 ゼ、 血小板由来成長因子 |3、 ケラチン K 1 , 1 0ぉょび1：1 4、 コラ一ゲン I 型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク質キナーゼ /3 Iサブユニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、 心房ナトリウム利尿 性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略される） 、 ナト リウムカリウムアデノシン 3リン酸化酵素 （Na， K-ATP a s e) 、 ニュー 口フィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタ口プロティナーゼ 1組織インヒビ夕一、 MHCクラス I抗原 （H— 2 L) 、 H— r a s、 レニン、 ド一パミン )3—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダーゼ （TPO) 、 ポリペプチド 鎖延長因子 l a (EF- 1 )、 βァクチン、 αおよび /3ミオシン重鎖、 ミオシン 軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タンパク質、 チログロブリン、 Thy— 1、 免疫 グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグ ロビン、 トロポニン C、 平滑筋ひァクチン、 プレブ口エンケフアリン A、 バソプ レシンなどのプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発現すること が可能なサイトメガロウィルスプロモーター、 ヒトポリペプチド鎖延長因子 1 α (EF- 1 α) のプロモータ一、 ヒトおよびニヮトリ 3ァクチンプロモーターな どが好適である。
上記べクタ一は、 DN Α転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー RN Aの転写を終結する配列 （一般にターミネタ一と呼ばれる） を有していることが 好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DNAの配列を用 いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40夕一ミネタ一などが 用いられる。
その他、 目的とする外来性 DN Aをさらに高発現させる目的で各 DN Aのスプ ライシングシグナル、 ェンハンサ一領域、 真核 DN Aのイントロンの一部などを プロモーター領域の 5' 上流、 プロモータ一領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3' 下流 に連結することも目的により可能である。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、 前記 のプロモータ一の下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の DN A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動 物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 DNAが存在することは、 作出動物の後 代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持 することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを有する。
本発明の外来性正常 DNAを転移させた非ヒ卜哺乳動物は、 交配により外来性 DNAを安定に保持することを確認して、 該 DNA保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D N A転移後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 DNAが過剰に存在することは、 作出 動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 DN Aを過 剰に有することを意味する。 本発明の外来性 DNAを受け継いだこの種の動物の 子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 DN Aを過剰に有する。 導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄 の動物を交配することによりすべての子孫が該 DN Aを過剰に有するように繁殖 継代することができる。
本発明の正常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 DNAが高発現 させられており、 内在性の正常 DN Aの機能を促進することにより最終的に本発 明の夕ンパク質の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物として 利用することができる。 例えば、 本発明の正常 DN A転移動物を用いて、 本発明 のタンパク質の機能亢進症や、 本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の 解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 本発明の外来性正常 DNAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の 夕ンパク質の増加症状を有することから、 本発明の夕ンパク質に関連する疾患に 対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 DN Aを安定に保持することを確認して該 DN A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 DN Aを前述のプラス ミドに組み込んで原科として用いることができる。 プロモーターとの DNAコン ストラク卜は、 通常の DNA工学的手法によって作製することができる。 受精卵 細胞段階における本発明の異常 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 DN A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明の異常 DN Aが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有することを意味する。 本発明 の外来性 DN Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明の異常 DN Aを有する。 導入 DN Aを相同染色体の両方に持つホ モザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫 が該 DN Aを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 DNAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動物と して利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A転移動物を用いて、 本 発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療 方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正 常タンパク質の機能阻害 （dominant negat ive作用） を解明するモデルとなる。 また、 本発明の外来異常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の夕 ンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質の機能不活性型不応 症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の D N A転移動物のその他の利用可能性として、 例 えば、
①組織培養のための細胞源としての使用、
②本発明の D NA転移動物の組織中の D NAもしくは R NAを直接分析するか、 または D N Aにより発現されたタンパク質組織を分析することによる、 本発明の タンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との関連性につい ての解析、
③ D N Aを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用し て、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
④上記③記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリ 一二ング、 および
⑤本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製など力考えられる。 さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症などを含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べるこ とができ、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるよ り詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患によ る二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の D N A転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 どのタンパク質分解酵素により、 遊離した DNA転移細胞の取得、 その培養また はその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明のタンパク 質産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 またはそれ らにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、 本 発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、 本発明の DN A転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうた めに、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療薬のス クリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DN A転移動物ま たは本発明の外来性 DN A発現ベクターを用いて、 本発明のタンパク質が関連す る疾患の DN A治療法を検討、 開発することが可能である。
(9) ノックアウト動物
本発明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本 発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の ]3—ガラクトシダ一ゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化された第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(5) ゲッ歯動物がマウスである第 （4) 項記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DNAが不活性化された該 DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
(7) 該 DNAがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の /3—ガラクトシダーゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 （6) 項記載の非ヒ卜哺乳動物、
(8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、
(9) ゲッ歯動物がマウスである第 （8) 項記載の非ヒト哺乳動物、 および
(10) 第 （7) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発 現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモーター活性を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【0060】
本発明の DNAが不活性化された非ヒ卜哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺乳 動物が有する本発明の DN Aに人為的に変異を加えることにより、 DNAの発現 能を抑制するか、 もしくは該 DNAがコードしている本発明のタンパク質の活性 を実質的に喪失させることにより、 DN Aが実質的に本発明の夕ンパク質の発現 能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがある） 非ヒト 哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DN Aに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的 手法により該 DNA配列の一部又は全部の削除、 他 DNAを挿入または置換させ ることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読 み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壊することに より本発明のノックアウト DNAを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D N A不活性化 ES細胞または本発明のノックアウト ES細胞と略記する） の具体 例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNAを単離 し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子 を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいは I a c Z (|3—ガラク卜シダーゼ遺伝子）、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラ一ゼ遺伝子） を代表とす るレポーター遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能を破壊するか、 ある いはェキソン間のィントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DNA配列 （例え ば、 poly A付加シグナルなど） を挿入し、 完全なメッセンジャー RN Aを合成で きなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊するように構築した D N A配列 を有する DNA鎖 (以下、 夕一ゲッティングベクターと略記する） を、 例えば相 同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた E S細胞について本発明の D N A上あるいはその近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼ ーション解析あるいは夕一ゲッティングベクタ一上の D N A配列と夕一ゲッティ ングベクタ一作製に使用した本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列をブラ イマ一とした PC R法により解析し、 本発明のノックアウト ES細胞を選別する ことにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞とし ては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 Evans と Kaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細 胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免疫学的 背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明 らかな ES細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 578し/6マゥスゃ〇57 8 /6の採卵数の少なさを08八//2との交雑にょり改善した80?1マゥス (C 57 BLZ6と DBAZ2との F を用いて樹立したものなども良好に用 いうる。 BDFiマウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという利点に 加えて、 C 57 BLZ6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた E S細 胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57 BLZ 6マウスとバッククロスす ることでその遺伝的背景を C 57 BLZ 6マウスに代えることが可能である点で 有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、一般には受精後 3. 5日目の胚盤胞を使用する が、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よ く多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生殖 系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するため にもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例として挙げることができる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要して いたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むので、 培養初 期における ES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であ り、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減で さる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染色 体数の確認等により行うことができる。 得られる ES細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発 生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例え ば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1— 1000 OU/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気ま たは 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90 %空気） で約 37 で培養するなどの方法で 培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZEDTA溶液 （通常 0. 00 1— 0. 5 %トリプシン/ 0. 1— 5 mM E D T A、好ましくは約 0. 1 %トリプシン Z 1 mM EDTA)処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダ一細胞上に播種 する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1一 3日毎に行なうが、 この 際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞 は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々 のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufman, ネイチヤー （Nature) 第 292巻、 154頁、 1981年； G. R. Martin プロシーディン グス ·ォブ ·ナショナル 'アカデミー 'ォブ ·サイエンス 'ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 第 78巻、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジ ヤーナル ·ォブ ·ェンブリオロジ一 ·アンド ·ェクスペリメンタル ·モルフォロ ジー、 第 87巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の E S細胞を分化させて得られる本発明 の D N A発現不全細胞は、 インビト口における本発明の夕ンパク質の細胞生物学 的検討において有用である。
本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRN A量を公知方法を 用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別する ことが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製し た夕ーゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導 入により夕一ゲッティングベクタ一の本発明の D N Aが不活性化された D N A配 列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の 本発明の D NAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の D NAを ノックアウトさせることができる。
本発明の D N Aがノックアウトされた細胞は、 本発明の D N A上またはその近 傍の D N A配列をプロ一ブとしたサザンハイプリダイゼーション解析または夕一 ゲッティングベクター上の D NA配列と、 夕一ゲッティングベクターに使用した マウス由来の本発明の D NA以外の近傍領域の D N A配列とをプライマ一とした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた 場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D N Aが不活性化された細胞株をク ローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚ま たは胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮 に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D NA座をもつ細胞と人為的に変 異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。 該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D NA座をもつ場合、 この ようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての 組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 このように して得られた個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発 明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で D N A溶液を注入することによりターゲッティングベクタ一を染色体内に導入 した卜ランスジエニック非ヒ卜哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジ エニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D N A座に 変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D N Aがノックアウトされている個体は、 交配により 得られた動物個体も該 D N Aがノックアウトされていることを確認して通常の飼 育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D N Aを 相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザィゴ ート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1 , ホモザィゴ一ト複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の 雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴ一トおよびへテ ロザィゴート動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D NA 発現不全非ヒ卜哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のタンパク質により 誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活性の 不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明及 び治療法の検討に有用である。
( 9 a ) 本発明の D NAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効 果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D N Aの欠損や損傷など に起因する疾病 （例、 免疫疾患、 肺機能障害、 脬臓機能障害、 感染症または胃腸 障害など） に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いるこ とができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を 投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D N Aの欠 損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物またはその 塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳 動物としては、 前記と同様のものが挙げられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などが 挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であつ てもよい。
具体的には、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変化を指 標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注射 などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選択す ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質な どにあわせて適宜選択することができる。
例えば、 隧臓機能障害に対して治療，予防効果を有する化合物をスクリ一ニン グする場合、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に糖負荷処置を行ない、 糖 負荷処置前または処置後に試験化合物を投与し、 該動物の血糖値および体重変化 などを経時的に測定する。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物 から選ばれた化合物であり、 本発明のタンパク質等の欠損や損傷などによって引 き起こされる疾患 （例、 免疫疾患、 肺機能障害、 滕臓機能障害、 感染症または胃 腸障害など） に対して治療 ·予防効果を有するので、 該疾患に対する安全で低毒 性な治療 ·予防剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記スクリ 一二ングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。 該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例アル カリ金属） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好 ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水 素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フ マル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 篠酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 炎症性疾患の治療目的で該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0 2 Omg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 炎症性疾患の治療目的で該化合物を 注射剤の形で通常成人 （6 O kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合物 を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好まし くは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の 動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
(9 b) 本発明の DNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合 物をスクリーニング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプ 口モーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ一ニング方 法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物と しては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明の D N Aがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝 子が本発明の D N Aに対するプロモ一夕一の制御下で発現しうるものが用いられ る。
試験化合物としては、 前記と同様のものが挙げられる。
レポ一夕一遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 3—ガラクトシダ ーゼ遺伝子 （ 1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフ ェラ一ゼ遺伝子などが好適である。
本発明の DN Aをレポーター遺伝子で置換された本発明の DN A発現不全非ヒ ト哺乳動物では、 レポ一夕一遺伝子が本発明の D N Aに対するプロモーターの支 配下に存在するので、 レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースする ことにより、 プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、 本発明のタンパク質をコードする D N A領域の一部を大腸菌由来の i3 一ガラクトシダ一ゼ遺伝子 （ 1 a c Z ) で置換している場合、 本来、 本発明の夕 ンパク質の発現する組織で、 本発明のタンパク質の代わりに /3—ガラクトシダ一 ゼが発現する。 従って、 例えば、 5—ブロモー 4—クロ口— 3—^ Γンドリル— i3 —ガラクトピラノシド （X—g a l ) のような 一ガラクトシダーゼの基質とな る試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明のタンパク質の動物生体内に おける発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明のタンパク質欠損 マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理 食塩液 （P B S ) で洗浄後、 X _ g a 1を含む染色液で、 室温または 3 7 °C付近 で、約 3 0分ないし 1時間反応させた後、組織標本を I mM E D T A/ P B S溶 液で洗浄することによって、 /3—ガラクトシダーゼ反応を停止させ、 呈色を観察 すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mR N Aを検出してもよ い。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試 験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性 を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸） や塩基 （例、 有機酸） な どとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この 様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレ イン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスル ホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を促進する化合物またはその塩は、 本発明のタンパク質の発現を促進し、 該タンパク質の機能を促進することができ るので、 例えば、 免疫疾患、 肺機能障害、 蹉臓機能障害、 感染症または胃腸障害 などの疾病に対する安全で低毒性な治療 ·予防剤などの医薬として有用である。 さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に 用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造すること ができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 炎症性疾患の治療目的で本発明の DNAに対するプロ モーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O k gとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. ；！〜 10 Omg、 好ましくは 約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に 投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異 なるが、 例えば、 炎症性疾患の治療目的で本発明の DNAに対するプロモー夕一 活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人 （6 O kgとして） に投与する場 合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与する のが好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与する ことができる。
一方、 例えば、 本発明の DN Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物を 経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O kgとして） においては、 一日につ き該化合物を約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好まし くは約 1. 0~20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回 投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 本発明の DNAに対する プロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人 （60 k gとして） に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは 約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜 1 Omg程度を静脈注射に より投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算した 量を投与することができる。
このように、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の DNAに対 するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリー二 ングする上で極めて有用であり、 本発明の DN A発現不全に起因する各種疾患の 原因究明または予防 ·治療薬の開発に大きく貢献することができる。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC- I UB Commision on Biochemical Nomenclature による田各号あるい は当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミ ノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものと する。
DNA デォキシリボ核酸
c DNA 相補的デォキシリボ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C
RNA リボ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸
d ATP デォキシアデノシン三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
d GTP デォキシグアノシン三リン酸
d CTP デォキシシチジン三リン酸
ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
Va 1 パリン
Leu ロイシン I 1 e
S e r セリン
Th r スレオニン
C y s
Me t メチォニン
G 1 u ダル夕ミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
Ar g アルギニン
H i s ヒスチジン
P h e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
Tr p トリプトファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン
G 1 n ダル夕ミン
p G 1 u ピログルタミン酸
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
Me メチル基
E t ェチル基
Bu ブチル基
Ph フエニル基
TC チアゾリジン— 4 (R) —カルポキサミド基
To s p—トルエンスルフォニル
CHO ホルミル
B z 1
Cl2-Bzl ： 2, 6—ジクロロべンジル
Bom ベンジルォキシメチル z ：ベンジルォキシカルボニル
C 1 - Z ： 2
B r -Z ： 2
Figure imgf000059_0001
B 0 c ： t一ブトキシカルポニル
DNP ：ジニトロフエニル
T r t ： トリチル
Bum ： t一ブトキシメチル
Fmo c ： N— 9—フルォレニルメトキシカルボニル
HOB t ： 1ーヒドロキシベンズトリアゾ一ル
HOOB t ： 3, 4—ジヒドロ一 3—ヒドロキシ一 4—ォキソ一
1, 2, 3—ベンゾトリアジン
HONB ： 1-ヒドロキシ -5-ノルボルネン -2, 3-ジカルボキシイミド
DCC ： N, N' ージシクロへキシルカルポジイミド
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
本発明のヒト由来タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
本発明のラット由来タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3〕
本発明のマウス由来タンパク質のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 4〕
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のヒト由来タンパク質 をコ一ドする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のラット由来タンパク 質をコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
配列番号： 3で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のマウス由来タンパク 質をコードする DN Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 7〕
本発明のヒト由来タンパク質の部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番 号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 23番目〜第 1 19番目のアミノ酸配列に 相当する。
〔配列番号： 8〕
本発明のラット由来タンパク質の部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番 号： 2で表わされるアミノ酸配列の第 23番目〜第 1 19番目のアミノ酸配列に 相当する。
〔配列番号： 9〕
本発明のマウス由来タンパク質の部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番 号： 3で表わされるアミノ酸配列の第 23番目〜第 1 19番目のアミノ酸配列に 相当する。
〔配列番号： 10〕
配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列を有する本発明の部分ペプチドをコー ドする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 11〕
配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列を有する本発明の部分ペプチドをコー ドする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 12〕
配列番号： 9で表わされるアミノ酸配列を有する本発明の部分ペプチドをコー ドする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 13〕
実施例 4で用いられたプライマー M 440 _OFの塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
実施例 6で用いられたプライマー H 440— EFの塩基配列を示す。
〔配列番号： 15〕
実施例 6で用いられたプライマー H 440 _ERの塩基配列を示す。
〔配列番号： 16〕
実施例 6で用いられたプライマー H 440— OFの塩基配列を示す。 〔配列番号： 17〕
実施例 6で用いられたプライマー H 440— ORの塩基配列を示す。
〔配列番号： 18〕
実施例 6で用いられたプライマー R 440— OFの塩基配列を示す。
〔配列番号： 19〕
実施例 6で用いられたプライマー R440— ORの塩基配列を示す。
後述の実施例 6で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia col i) XL 1— B l ue MRF' /pDRL44 OHは、平成 10年 8月 26日から通 商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託番号 FERM BP— 6476として、 平成 10年 7月 31日から財団法人 ·発酵研究所 （ I F O) に寄託番号 I F〇 16192として寄託されている。
後述の実施例 4で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coii) XL 1— B l ue MRF' /pDRL440Mは、平成 10年 8月 26日から通 商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託番号 FERM BP— 6477として、 平成 10年 7月 31日から財団法人 ·発酵研究所 ( I F O) に寄託番号 I F〇 16193として寄託されている。
後述の実施例 6で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia col i) XL 1 -B 1 u e MRF' ZpDRL440Rは、平成 10年 8月 26日力 ら通 商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託番号 FERM BP— 6478として、 平成 10年 7月 31日から財団法人 ·発酵研究所 （I F O) に寄託番号 I F〇 16194として寄託されている。
以下に、 参考例と実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明 はそれに限定されるものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モ レキユラ一.クロ—ニング （Molecular cloning) に記載されている方法に従った。 参考例 1 動物細胞発現ベクター p C AN 618の構築
S V 40初期遺伝子プロモーターの下流にネオマイシン耐性遺伝子を持つプ ラスミド pBK/CMV (4512 b p) (ストラタジーン社） を B s u 36 I (ニューイングランドバイオラブズ社） で消化し、 得られた 1. 6 kbp断片を DNAポリメラ一ゼ I Klenow fragment (宝酒造） 処理し、 ネオマイシン耐性遺 伝子を含む平滑末端化した断片を得た。 この断片を pME 18 S (341 1 p) を Sma l (宝酒造） 消化したプラスミドと ligationし、 pME 18 S/Ne o (5040 bp) を得た。 次に、 サイトメガロウィルスの極初期遺伝子ェンハン サ一の下流に ]3—ァクチンプロモ一夕一を持つ p CXN 2の H i n c I I部位に H i n d I I Iリンカー （宝酒造） を導入したプラスミド H i n d I I I (宝酒 造） 、 Ec oR I (宝酒造） 二重消化し、 サイトメガロウィルスの極初期遺伝子 ェンハンサ一の下流に) 3—ァクチンプロモ一夕一を含む 1. 7 kb断片を得た。 この断片を pME 18 S/Ne oを H i nd i I I、 Ec oR I二重消化して得 られる 4. 2 k b p断片と ligationし、動物細胞発現べクタ一 p CAN 616 (5 969 b p) を得た。 さらに、 pCAN616をXho I (宝酒造） 消化した後 自己閉環させ、マルチクローニング部位から stuiier領域を取り除いた動物細胞発 現べクタ一 p CAN 617 (5585 b p) を得た。 一方で、 p CAN 616を Ec oR I、 Xh o I二重消化した 5. 6 kb断片に、 Ec oR I— S a l I— Xh o I部位を含む 17me rの合成オリゴヌクレオチドを】 igationし、 最終的 に動物細胞発現ベクター PCAN618 (5595 bp) を得た （図 4) 。 実施例 1 データベースからのクローンの選択と塩基配列の解析
スミスクラインビーチャム （SB) 社から供給されている E STデ一夕べ一 スの中から分泌のためのシグナル配列とプロセシング部位をコードするクローン を選択した。 方法は、 ESTのDNA配列から、 アミノ酸配列に翻訳し、 Metの後 に疎水性アミノ酸 （Leu、 Ile、 Val、 Phe、 Alaなど） のクラス夕一を有するクロ一 ンで、 かつ、 同一フレーム内にプロセシング部位 （ArgArg、 LysArg、 LysLys) を 有するクローンを選択し、 これらの条件を満たすクローンとして HGS: 105111を発 見した。 ただし、 EST配列であるため、 データベースの配列の中に通常欠失、 挿入、 読み間違いなどがあるため、 以下の方法で、 配列の確認を行った。 本クロ —ンを TGC- 440として SB社から取り寄せ、 プラスミド DNAを EcoRIと Xholで消 化した後、 1.2%ァガロースゲル電気泳動で、挿入 DNA断片の大きさを解析した 結果、 0.85kbの cDNA断片であることが判明した。 さらに、 T7プライマーと T3ブラ イマ一を用いて、 挿入 DN A断片の塩基配列を蛍光 DNAシークェンサ一 （PERKIN ELMER: ABI PRISM 377 DNA Sequencer) で解析した。 本 DNA配列とそれから予 想されるアミノ酸配列を図 1に示す。 タンパク質をコードする領域は、 図 1の配 列の 220番目から 576番目であることが判明した。 実施例 2 発現部位の解析
実施例 1に記載の挿入 DN A断片 （EcoRI- Xhol 0.85kb断片） 20ngと [ひ - 32P]dCTP (Amersham： 6000Ci/mmol) 5 x 1を用いて Mul Upr ime DNA label ing system (Amersham: RPN.1601Y)の方法で DNAプロ一ブを作製した。 このプローブを用い て、 ヒトマルチティッシュノーザンブロット （CL0NTECH社： #7759-1、 #7760-1) に対して、 ノ一ザンブロット解析を行つた。 ハイブリダイズ及び洗浄の条件は、 ヒトマルチティッシュノーザンブロッ卜に添付のマニュアルに従って行い、 検出 は、 BAS- 2000 (フジフィルム） を用いて行った。 その結果、 本クローンの mRNAは、 ヒトの肺、 気管、 胃など限定された組織で発現していることが判明し、 臓器特異 的な発現産物であることが明らかとなった。 また、 mRNAの大きさは、 約 0.8kbと 0.6kbで短く、 TGC-440の cDNA断片が mRNAのほぼ全長を含んでいて、 タンパク質の コード領域は、 図 1に示した領域以外にはあり得ないことも判明した。 実施例 3 ラット cDNAの取得
SDラット 2匹から肺を摘出し、自体公知の塩酸グァニジン法で RNAを抽出し た後、 ol igo(dT) cellurose column (Amersham)を用いて 19_agの poly(A)+RNAを得 た。 この を铸型に用いて、 SUPERSCRIPTTM choice system (GIBC0 BRL) の方 法で cDNAを合成し、 EcoRIアダプターを付加した。 該 cDNA断片 200ngを λ gtllの EcoRI部位へ挿入し、 In vitro packagingによりファージライブラリーを作製した。 実施例 2に記載の方法で DNAプローブを作製し、プラークハイブリダィゼ一シヨン を行った。 ハイブリダィゼーシヨンは、 5xSSPE、 5xDenhardt' s溶液、 0.5%SDSにて、 65 :で一晩行い、 洗浄は、 0.5xSS 0. USDSにて、 50°Cで行った。 オートラジオ グラフィー （- 80°C、 18時間） で陽性プラークが複数得られたので、 シングルブラ ークアイソレーションを行い、 ファージ DNAを BsiWIで消化後、 得られた挿入 cDNA 断片を！ DUC 1 18の Ac c 651部位にサブクローニングした。 該 cDNA断片の塩基配列を決 定した結果、 ヒトと同数の 1 1 9アミノ酸からなるラット TGC- 440がコードされてい ることが判明した。得られた配列は、 コーディング領域でヒトと 7 （DNAレベル） と 63% (アミノ酸レベル） の相同性を有していた。 また、 N末端には、 22アミノ酸 からなる典型的なシグナル配列が存在していた。ラット TGC-440の塩基配列とそれ から予想されるァミノ酸配列を図 2に示した。 実施例 4 マウス cDNAの取得
C57BL/6Nマウスから肺を摘出し、実施例 3に記載と同様の方法で po l y (A) +RNA を得た。 これを铸型にして 3' -RACEを用い、 マウス cDNAを取得した。 オープンリー ディ ングフ レームが増幅されるように設計したプライマー、 M440 - OF (GCCTTTAAGAACCAACAGACAG；配列番号: 1 3 ) を用い、 定法に従って 3' -RACEを行 つた。 該 cDNA断片 (0. 7kb) をクロ一ニングベクタ一 pCR-Sc r i p i A即 (STRATAGENE) の Sr f l部位へクローニングし、 PDRL440Mを得た (大腸菌 XL1 - B l ue MRF' /pDRL440M) 。 該 cDNA断片の塩基配列を決定した結果、ヒトゃラッ卜と同数の 1 1 9アミノ酸からな るマウス TGC- 440の一次構造が判明した。 N末端には、 22アミノ酸からなる典型的 なシグナル配列が存在していた。マウス TGC- 440の塩基配列とそれから予想される アミノ酸配列を図 3に示した。 実施例 5 抗 TGC-440抗血清の調製
配列番号： 1で表される本タンパク質の 1 10番目から 1 19番目までのアミノ酸 配列からなるペプチド （ヒト） 、並びに配列番号： 2で表される本タンパク質（ラ ット） の 1 10番目から 1 1 9番目までのアミノ酸配列からなるペプチドをそれぞれ自 体公知の方法により化学合成した。 これらのペプチド 1 mgとゥシサイログロプリ ン 4 mgをそれぞれマレイミド法により結合させた後、 抗原ペプチド 100 g相当量 を FCA (完全フロイントアジュバント） とともにゥサギ （SPF、 ニュージーランド ホワイト） 2羽ずつに皮下注射し、 一次免疫とした。 以降 2週間おきに 3回追加 免疫を行った。 2回目以降は、 FCAの代わりに FIA (不完全フロイントアジュバン ト） を使用した。 最終免疫の 1週間後に耳静脈から採血し、 公知の方法により、 血清画分を取得し抗 TGC-440抗血清とした。 実施例 6 TGC- 440発現プラスミドの構築
ヒト TGC- 440のオープンリーディングフレームが増幅されるように設計した プライマー、 H440- EF (GACGAATTCCCACCATGAAAGTTCTAATCTCTTCCCTCCT；配列番号：
14 ) 及び、 H440-ER (GACTCGAGCGGCCGCTACAAAGGCAGAGCAAAGCTTCTTA；配列番号：
15) を自体公知の方法で合成し、実施例 1に記載のプラスミド lngを铸型に用い て PCRを行った。 PCRの条件は、 TakaraExTaq (宝酒造） を用い、 サーマルサイク 7-GeneAmp PCR System 2400 (PERK IN ELMER) にて、 95°C、 30秒、 68°C1分を 25 回繰り返した。 得られた PCR断片を EcoRIと Not Iで消化し、 動物細胞用発現べクタ 一 pCA'618の EcoRI、 Not I部位へサブクローニングを行い、 pCAN618/huTGC440を得 た。
また、ヒト TGC- 440のオープンリーディングフレームが増幅されるように設計した プライマ一、
H440-0F (TGCACCGTCGACCACCATGAAAGTTCTAATCTCTTCCCTCCTCCTGT；配列番号： 16) 及び、 H440-OR (CGCTCAGTCGACCTACAAAGGCAGAGCAAAGCTTCTTAGCTGACATTGTTT；配列 番号： 1 7) を自体公知の方法で合成し、 実施例 1に記載のプラスミド lngを铸型 に用いて、 PCRを行った。 PCRの条件は、 Pfu DNA Polymerase (STRATAGENE) を用 レ 、 サ一マルサイクラ一 GeneAmpPCRSystem2400 (PERK IN ELMER) にて、 96°C 45 秒、 54で 45秒、 72°C 1分を 25回繰り返した。 得られた PCR断片を Sal Iで消化し、 動物細胞用発現べクタ一 PA卜 11 (別名 pAKKOl.11)の Sail部位へクローニングを行 レ 、 cDNAがプロモーターに対して順方向に挿入された PDRL440Hを得た （大腸菌 XLl-BlueMRF'/pDRL440H) 。 更に、 ラット TGC- 440のオープンリーディングフレー ムが増幅されるように設計したプライマー、 R440 - 0F 列番号 : 1 8)及び、 R440-OR (CAGAGTGTCGACACTATAAGGGCAGGGCGAAGC；配列番号： 19)を自体公知の方法で合成し、実施例 3に記載のプラスミド lngを铸型に用い て、 PCRを行った。 PCRの条件は、 Pfu DNA Polymerase (STRATAGENE) を用い、 サ —マルサイクラ一 GeneArap PCR System 2400 (PERK IN ELMER) にて、 96°C 45秒、 54 45秒、 72°C 1分を 25回繰り返した。 得られた PCR断片を Sal Iで消化し、 動物 細胞用発現べクタ一 PA卜 11 (別名 pAKKOl.11) の Sail部位へクローニングを行い、 cDNAがプロモーターに対して順方向に挿入された PDRL440Rを得た （大腸菌 XU - Blue MRF' /pDRL440R) 。 実施例 7 ヒト TGC-440 cDNAの C0S7細胞での発現
C0S7細胞の培養は、通常 10%FCS (ゥシ胎児血清） を含む DMEM培地（GIBC0-BRL) を用いて行った。 C0S7細胞 （1.5x10s cells/well) を 6穴プレートで 24時間培 養し、 OpU-MEM培地 （GIBCO- BRL) で 2回洗って発現プラスミドの導入に用いた。 実施例 6で得られた発現プラスミド （pCAN618/huTGC440) を 1 wel 1当たり 1 g と、 LipofectAMINE Reagent (GIBCO - BRL) を 1 wel 1当たり 10 1を用いて仕様書に 従って Opt i-MEM無血清培地を用いて C0S7細胞に導入した。 発現プラスミドを導入 してから 5時間後に FCSが 10%になるように加え、 さらに 19時間培養し、 その後、 培地を① Opt i- MEM培地 ( Gibco- BRL )、 (2)0.25mM ABSF (和光純薬 )を含む Opti- MEM培地（ Gibco- BRL )、 ③ 0.05% CHAPS ( 同仁化学 ）を含む Opti- MEM培地 (Gibco-BRL), または④ 0· 25mM ABSF ( 和光純薬 ) と 0.05¾ CHAPS ( 同仁化学 ) を含む Opti- MEM培地（Gibco-BRL)に代えて、 さらに 48時間培養した。 培養上清 と、 細胞を別々に回収し、 Western blot解析に用いた。 培養上清 500 1分を分子 量 3000カットのマイクロコン 3 (Ami con) を用いて 50 1まで濃縮した （ 10倍濃 縮） 。 また、 細胞は、 生理食塩水で洗浄した後、 Lae删 liのサンプルバッファーを 200 1加えて、 95°Cで 2分加熱し細胞抽出液を得た。 濃縮後の培養上清と細胞抽 出液を SDSポリアクリルアミドゲル （18%、 TEFC0)で電気泳動し、 ニトロセル口一 スメンブラン （Hybond ECL、 Amersham) に移した。 メンブランをブロッキング液 (50%ブロックエース (雪印乳業) 、 0.9¾ NaCK 20mM Tris-HCl (pH7.5) ) で 1 時間ブロッキングした後、 10 ブロックエース ZTBS- T (0.9¾ aCU 20mM Tris-HCl (pH7.5) 、 0.05¾ Tween20) で 2000倍希釈した抗 TGC- 440抗血清と室温で 2時間反 応させた。 TBS-Tで 5回洗浄後、 10%ブロックエース/ TBS-Tで 4000倍希釈したホー スラディッシュパ一ォキシダーゼ （HRP) で標識された抗ゥサギ IgG抗体 (Amersham)と室温で 1時間反応させた。これを TBS- Tで 5回洗浄した後、 ECL- plus Western blotting detection reagent (Amersham) を用レ て、 ィ匕学発光させ、 Superfilm ECL (Amersham) を用いて検出した。 その結果、 図 5に示すように、 細胞抽出液からは、 約 1.3kDaと 1. lkDaの産物が検出された。 また、 培養上清から は、 約 1. lkDaの産物が検出され、 TGC-440が、 細胞外に分泌され、 液性因子として 存在することが判明した。 実施例 8 ヒトおよびラット TGC 440 タンパクを構成的に大量に分泌発現する CH0 細胞株の樹立
CH0( dhfr") ( ATCC ) 細胞の培養は 10% FCS ( Hyclone ) を含む a MEM ( Gibco-BRL ) 培地を用いて 5%C02 気相下 37°Cで行った。
CH0( dhfr) ( ATCC ) 細胞を 10 cm プレートにまき、 24 時間培養を行った後、 実施例 6 で作製したヒ卜およびラット TGC440 発現プラスミド （ヒト： pDRL440H、 ラット： PDRL440R) それぞれ \Q g をリン酸カルシウム法を用いてトランスフ ェクションを行った。 12 時間後に 10¾FCSを含むひ MEM培地に培地交換を行い、 さらに 2 日後に選択培地 （ 10%透析血清 （Hyclone ) を含む a MEM without ribonucleotide and deoxyribonucleot ide ( Gi co-BRL ) ) に培地交換した。 以 降 3 日ごとに選択培地に培地交換し、発現プラスミドが組み込まれた細胞を選択 した。選択培地に変えてから 9 日目後にプレート上に生育したコロニーをヒト、 ラットそれぞれ 12 クローンづっクローニングし、 12 well プレートにまいた。 次にこれらのクローンを 6well プレートにまきコンフルェントになるまで培 養を行った後、 1ml の ① a MEM培地（ Gibco - BRL )、 ② 0.25mM ABSF (和光純 薬）を含むひ ME 培地（ Gibco-BRL )、 ③ 0.05% CHAPS ( 同仁化学 )を含むひ MEM 培地（ Gibco-BRL ), または④ 0.25mM ABSF ( 和光純薬） と 0.05% CHAPS ( 同 仁化学）を含むひ MEM培地（Gibco- BRL)に培地交換を行ない、 さらに 24 時間培 養を続けた。培養上清は eppendorf サンプルチューブに移して遠心し、浮いてい る細胞を除去した後、 centricon- 3 (Ami con ) を用いて 1/10 にまで濃縮し、 同 量の DTT を含む SDS-PAGE サンプル buffer を加え、 SDS- PAGE にかけ、 Western blotting によって発現量を見積もった。 Western blotting は一次抗体に実施例 5 で得た抗 TGC440 抗血清 1/200 希釈、 二次抗体に HRP 標識抗 ゥサギ IgG抗 体 ( 1/2000, Amersham ) 用い、 発色は ECL wes tern bl ot t ing ki t ( Amersham ) を用いて行った。
その結果、 図 6 (ヒト TGC 440 タンパク） 、 および図 7 (ラット TGC 440 タン パク） に示すように、 COS- 7 細胞を用いて発現させたものと同じ分子量の TGC440 タンパクが培地中に分泌発現されていることが確認され、 ヒト TGC 440 タンパク 発現 CH0 細胞では #5, 9, 10 クローンが、 ラット TGC 440 タンパク発現 CH0 細 胞では #4, 9 クローンが発現量が最も多いことが分かった。 さらにこれらのクロ ーンについて 96-wel l プレートにまき限界希釈法によって s ingl e cel l クロ —ンを得た。 産業上の利用可能性
本発明のタンパク質およびそれをコードする D N Aは、 例えば、 免疫疾患、 肺 機能障害、 塍臓機能障害、 感染症または胃腸障害などの疾病の治療 ·予防剤とし て使用することができる。 また、 本発明のタンパク質は、 本発明のタンパク質の 活性を促進もしくは阻害する化合物またはその塩のスクリ一二ングのための試薬 として有用である。 さらに、 本発明のタンパク質に対する抗体は、 本発明のタン パク質を特異的に認識することができるので、 被検液中の本発明のタンパク質の 定量などに使用することができる。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号： 1、 配列番号： 2もしくは配列番号： 3で表わされるアミノ酸配 列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパ ク質またはその塩。
2 . 請求項 1記載のタンパク質の部分べプチドまたはその塩。
3 . 請求項 1記載のタンパク質または請求項 2記載の部分ペプチドをコードする D N Aを含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を培養し、 該タン パク質または該部分ペプチドを生成せしめることを特徴とする、 請求項 1記載の タンパク質もしくは請求項 2記載の部分べプチドまたはその塩の製造法。
4 . 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 2記載の部分べプチドまたはその 塩に対する抗体。
5 . 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 2記載の部分べプチドまたはその 塩を用いることを特徴とする、 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 2記載 の部分べプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩の スクリーニング方法。
6 . 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 2記載の部分べプチドまたはその 塩を含有してなる、 請求項 1記載の夕ンパク質もしくは請求項 2記載の部分ぺプ チドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリー二 ング用キット。
7 . 請求項 5記載のスクリーニング方法または請求項 6記載のスクリーニング用 キットを用いて得られうる、 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 2記載の 部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩。
8 . 請求項 5記載のスクリーニング方法または請求項 6記載のスクリーニング用 キットを用いて得られうる、 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 2記載の 部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩を含 有してなる医薬。
9 . 請求項 4記載の抗体を含有してなる診断剤。
1 0 . 請求項 4記載の抗体を含有してなる医薬。
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