JP2002348299A - Ｉｒａｐ結合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＩＲＡＰ結合タンパク質などの提供 【解決手段】 ＩＲＡＰ結合タンパク質、該タンパク質
を含有してなる医薬、該タンパク質とＩＲＡＰとの結合
を阻害する化合物のスクリーニング方法、該スクリーニ
ング方法によって得られる化合物など。 【効果】 本発明のタンパク質は、例えば低血糖症など
の疾病の予防・治療剤として有用である。また、本発明
のタンパク質は、本発明のタンパク質とＩＲＡＰ（insu
lin responsive aminopeptidase）またはＧＬＵＴ４（g
lucose transporter 4）との結合を阻害する化合物のス
クリーニングのための試薬として有用である。本発明の
タンパク質とＩＲＡＰまたはＧＬＵＴ４との結合を阻害
する化合物は、例えば高血糖症、糖尿病などの疾病の予
防・治療剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、インシュリン・レ
スポンシブ・アミノペプチダーゼ（ＩＲＡＰ）もしくは
グルコーストランスポーター４に結合するタンパク質ま
たはその塩、該タンパク質またはその塩などを用いた、
高血糖症または糖尿病の予防・治療剤のスクリーニング
方法、該スクリーニング方法で得られる化合物、該化合
物の使用などに関する。

【０００２】

【従来の技術】血糖値はインシュリンの作用により、骨
格筋ならびに脂肪組織におけるグルコースの取り込みに
より調節される。糖尿病はこの作用の低下が原因で高血
糖が持続することにより生じる。グルコースが細胞へ取
り込まれるためにはグルコーストランスポーター（糖輸
送担体）と呼ばれる膜タンパク質の介在が必要である。
グルコーストランスポーターには現在ＧＬＵＴ１−８の
８種類のものが知られているが（Bell et al.、J. Bio
l. Chem.、268、3352-3356、1993; Olson & Pessin、An
nu. Rev. Nutr. 16、235-256、1996; Ibberson et a
l.、J. Biol. Chem.、275、4607-4612、2000; Doege et
al.、J. Biol. Chem.、275、16275-16280）、これらの
うちインシュリンによる糖輸送活性に強く関わるのは、
骨格筋、脂肪組織での発現が主に見られるＧＬＵＴ４で
ある（Fukumoto et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A.、85、5434-5438、1988; Birnbaum et al.、Cell、5
7、305-315、1989）。通常、ＧＬＵＴ４は細胞内ではＧ
ＬＵＴ４小胞体と呼ばれる細胞内小胞に存在している
が、血糖上昇時は、インシュリンの作用によりこれが細
胞膜へ移行（トランスロケーション）されることにより
糖取り込みを促進すると考えられている（Bell et a
l.、Diabetes Care、13、198-208、1990; Czech et a
l.、Trens. Biochem. Sci.、17、197-201、1992）。こ
のＧＬＵＴ４小胞体移行の分子メカニズムを明らかにす
るためＧＬＵＴ４それ自身のみならずＧＬＵＴ４小胞体
を構成する他のタンパク質を同定することが行われてき
た。現在のところＧＬＵＴ４小胞体を構成する分子とし
て、ＶＭＡＰｓ（vesicle-assosiated membrane protei
ns; Cain et al.、J. Biol. Chem.、267、11681-1163
4、1992）、ＳＣＡＭＰｓ（secretory component-assac
itated membrane proteins; Thiodis et al、J. Biol.
Chem.、268、11691-11696、1993;Laurie et al.、J. Bi
ol. Chem、268、19110-19117、1993）、phosphatidylin
ositol 4-kinase（Del Vacchio & Pilch、J. Biol. Che
m、266、13278-13283、1991）、低分子量ＧＴＰ結合タ
ンパク質Ｒａｂ４（Cormont et al.、J. Biol. Chem.、
268、19491-19497、1993）等の他に、ＩＲＡＰ（insuli
n-responsive aminopeptidase; Kandror & Pilch、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA、91、8017-8021、1994、Kand
ror et al.、J. Biol. Chem. 269、30777-30780、199
4、Keller et al、J. Biol. Chem.、270、23612-2361
8、1995）が知られている。ＩＲＡＰはｇｐ１６０とも
呼ばれる一回膜貫通型の膜タンパク質で、細胞内オルガ
ネラではＧＬＵＴ４小胞体に局在している。タンパク質
構造的には、アミノ末端（Ｎ末端）の１０９アミノ酸が
細胞質内ドメインで、続いて２２アミノ酸の膜貫通ドメ
イン、さらにカルボキシ末端（Ｃ末端）の７８５アミノ
酸からなる細胞外ドメインから構成される（Kandror &
Pilch、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、91、8017-8021、
1994; Keller et al、J. Biol. Chem.、270、23612-236
18、1995）。細胞外ドメインは亜鉛依存性のプロテアー
ゼ（アミノペプチダーゼ）でありその活性が確認されて
いる（Kandror et al.、J. Biol. Chem. 269、30777-30
780、1994）。これらのドメインのうち、Ｎ末端側ドメ
イン（細胞質側ドメイン）に相当するペプチドを細胞内
へ注入するとＧＬＵＴ４小胞体の細胞表面への移行が生
じることから、ＧＬＵＴ４小胞体を細胞内へ引き留めて
いるための、ＩＲＡＰに結合するタンパク質の存在が予
想されている（Walters et al.、J. Biol. Chem、272、
23323-23327、1997）。本発明で得られたｃＤＮＡは既
に報告されているヒトのvery long chain acyl-CoA deh
ydrogenase（ＶＬＣＡＤ）の配列と一致するが（Anders
en et al.、Hum. Mol. Benet.、5、461-472、1996）、
このタンパク質がＩＲＡＰと結合していることを報じた
文献あるいは血糖調節に直接的に関与していることを報
じた文献は無い。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＶＬＣＡＤ
とＩＲＡＰのタンパク質間相互作用を応用した血糖低下
作用を有する化合物のスクリーニング方法、該スクリー
ニング方法で得られる化合物などを提供する。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、酵母two-hy
brid法（Fields & Strenglanz、Trens. Genet.、10、28
6-292、1994; Brent &Finley、Annu. Rev. Genet.、3
1、663-704、1997）を用いてヒト骨格筋由来ｃＤＮＡラ
イブラリーからＩＲＡＰ結合タンパク質としてＶＬＣＡ
Ｄをクローニングすることに成功した。本発明者らはさ
らに検討を重ね、本発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明は、（１）インシュリン
・レスポンシブ・アミノペプチダーゼもしくはグルコー
ストランスポーター４に結合する配列番号：１で表され
るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸
配列を含有するタンパク質またはその塩、（２）上記
（１）記載のタンパク質またはその塩を含有してなる医
薬、（３）上記（１）記載のタンパク質をコードするＤ
ＮＡを含有するＤＮＡを含有してなる医薬、（４）イン
シュリン・レスポンシブ・アミノペプチダーゼもしくは
グルコーストランスポーター４への結合剤である上記
（２）または（３）記載の医薬、（５）低血糖症予防・
治療剤である上記（２）または（３）記載の医薬、
（６）上記（１）記載のタンパク質をコードするＤＮＡ
を含有するＤＮＡを含有してなる診断剤、（７）非ヒト
哺乳動物に対して、上記（１）記載のタンパク質または
その塩の有効量を投与することを特徴とする低血糖症の
予防・治療方法、（８）低血糖症の予防・治療剤を製造
するための上記（１）記載のタンパク質またはその塩の
使用、（９）上記（１）記載のタンパク質をコードする
ＤＮＡの塩基配列に相補もしくは実質的に相補的な塩基
配列またはその一部を含有するアンチセンスＤＮＡを含
有してなる医薬、（１０）上記（１）記載のタンパク質
またはその塩に対する抗体を含有してなる医薬、（１
１）高血糖症または糖尿病の予防・治療剤である上記
（９）または（１０）記載の医薬、（１２）非ヒト哺乳
動物に対して、上記（１）記載のタンパク質またはその
塩に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする高
血糖症または糖尿病の予防・治療方法、（１３）高血糖
症または糖尿病の予防・治療剤を製造するための上記
（１）記載のタンパク質またはその塩に対する抗体の使
用、（１４）上記（１）記載のタンパク質またはその塩
に対する抗体を含有してなる診断剤、（１５）配列番
号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に
同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペ
プチド、またはその塩を用いることを特徴とする、血糖
増加作用または血糖低下作用を有する化合物またはその
塩のスクリーニング方法、（１６）配列番号：１で表さ
れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ
酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドを
コードするＤＮＡを含有するＤＮＡを用いることを特徴
とする、血糖増加作用または血糖低下作用を有する化合
物またはその塩のスクリーニング方法、（１７）配列番
号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に
同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペ
プチド、またはその塩を含有してなる、血糖増加作用ま
たは血糖低下作用を有する化合物またはその塩のスクリ
ーニング用キット、（１８）配列番号：１で表されるア
ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列
を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコード
するＤＮＡを含有するＤＮＡを含有してなる、血糖増加
作用または血糖低下作用を有する化合物またはその塩の
スクリーニングキット、（１９）上記（１５）もしくは
（１６）記載のスクリーニング方法または上記（１７）
もしくは（１８）記載のスクリーニング用キットを用い
て得られうる、血糖増加作用を有する化合物またはその
塩、（２０）上記（１９）記載の化合物またはその塩を
含有してなる医薬、（２１）低血糖症の予防・治療剤で
ある上記（２０）記載の医薬、（２２）上記（１５）も
しくは（１６）記載のスクリーニング方法または上記
（１７）もしくは（１８）記載のスクリーニング用キッ
トを用いて得られうる、血糖低下作用を有する化合物ま
たはその塩、（２３）上記（２２）記載の化合物または
その塩を含有してなる医薬、（２４）高血糖症または糖
尿病の予防・治療剤である上記（２３）記載の医薬、
（２５）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一も
しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク
質、その部分ペプチド、またはその塩を用いることを特
徴とする、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一
もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ
ク質、その部分ペプチド、またはその塩とインシュリン
・レスポンシブ・アミノペプチダーゼもしくはグルコー
ストランスポーター４との結合を促進または阻害する化
合物またはその塩のスクリーニング方法、（２６）配列
番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的
に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその
部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を用いること
を特徴とする上記（２５）記載のスクリーニング方法、
（２７）一方が固相に固定化された、配列番号：１で
表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
ミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、
またはその塩と標識したインシュリン・レスポンシブ
・アミノペプチダーゼもしくはグルコーストランスポー
ター４との複合体に、試験化合物を添加し、遊離物を検
出することを特徴とする上記（２５）記載のスクリーニ
ング方法、（２８）レポーター遺伝子結合ドメインを
融合させたインシュリン・レスポンシブ・アミノペプチ
ダーゼの細胞質側ドメインに相当する部分ペプチドもし
くはグルコーストランスポーター４の細胞質内ドメイン
に相当する部分ペプチドをコードするＤＮＡとレポー
ター遺伝子転写活性ドメインが融合した配列番号：１で
表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチ
ドをコードするＤＮＡで形質転換した細胞を試験化合物
の存在下および非存在下に培養し、それぞれの場合にお
けるレポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とす
る上記（２５）記載のスクリーニング方法、（２９）イ
ンシュリン・レスポンシブ・アミノペプチダーゼの細胞
質側ドメインに相当する部分ペプチドが配列番号：５で
表されるアミノ酸配列の第５５〜８２番目のアミノ酸配
列を含有する部分ペプチドで、グルコーストランスポー
ター４の細胞質内ドメインに相当する部分ペプチドが配
列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有する部分ペプ
チドである上記（２８）記載のスクリーニング方法、
（３０）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一も
しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク
質、その部分ペプチド、またはその塩を含有する、配列
番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的
に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分
ペプチド、またはその塩とインシュリン・レスポンシブ
・アミノペプチダーゼもしくはグルコーストランスポー
ター４との結合を阻害する化合物またはその塩のスクリ
ーニング用キット、（３１）上記（２５）〜（２９）記
載のスクリーニング方法、または上記（３０）記載のス
クリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：
１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一
のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチ
ド、またはその塩とインシュリン・レスポンシブ・アミ
ノペプチダーゼもしくはグルコーストランスポーター４
との結合を阻害する化合物またはその塩、（３２）上記
（３１）記載の化合物またはその塩を含有してなる医
薬、（３３）高血糖症または糖尿病の予防・治療剤であ
る上記（３２）記載の医薬、（３４）非ヒト哺乳動物に
対して、上記（３１）記載の化合物またはその塩の有効
量を投与することを特徴とする高血糖症または糖尿病の
予防・治療方法、（３５）高血糖症または糖尿病の予防
・治療剤を製造するための上記（３１）記載の化合物ま
たはその塩の使用、（３６）上記（２５）〜（２９）記
載のスクリーニング方法、または上記（３０）記載のス
クリーニング用キットを用いて得られる、配列番号：１
で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の
アミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチ
ド、またはその塩とインシュリン・レスポンシブ・アミ
ノペプチダーゼもしくはグルコーストランスポーター４
との結合を促進する化合物またはその塩、（３７）上記
（３６）記載の化合物またはその塩を含有してなる医
薬、（３８）低血糖症の予防・治療剤である上記（３
７）記載の医薬、（３９）非ヒト哺乳動物に対して、上
記（３６）記載の化合物またはその塩の有効量を投与す
ることを特徴とする低血糖症の予防・治療方法、（４
０）低血糖症の予防・治療剤を製造するための上記（３
６）記載の化合物またはその塩の使用、（４１）配列番
号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に
同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩
を用いることを特徴とする、当該タンパク質の発現を促
進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング
方法、（４２）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と
同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡの転写調節領域にレポータ
ー遺伝子を融合させたＤＮＡで形質転換した細胞を試験
化合物の存在下および非存在下に培養し、それぞれの場
合におけるレポーター遺伝子の発現を検出することを特
徴とする上記（４１）記載のスクリーニング方法、（４
３）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしく
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質ま
たはその塩を含有してなる、当該タンパク質の発現を促
進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング
用キット、（４４）上記（４１）または（４２）記載の
スクリーニング方法または上記（４３）記載のスクリー
ニング用キットを用いて得られうる、配列番号：１で表
されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有するタンパク質の発現を抑制する化合物
またはその塩、（４５）上記（４４）記載の化合物また
はその塩を含有してなる医薬、（４６）高血糖症または
糖尿病の予防・治療剤である上記（４５）記載の医薬、
（４７）上記（４１）または（４２）記載のスクリーニ
ング方法または上記（４３）記載のスクリーニング用キ
ットを用いて得られうる、配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するタンパク質の発現を促進する化合物またはその
塩、（４８）上記（４７）記載の化合物またはその塩を
含有してなる医薬、（４９）低血糖症の予防・治療剤で
ある上記（４８）記載の医薬、（５０）非ヒト哺乳動物
に対して、上記（４７）記載の化合物またはその塩の有
効量を投与することを特徴とする低血糖症の予防・治療
方法、（５１）低血糖症の予防・治療剤を製造するため
の上記（４７）記載の化合物またはその塩の使用などに
関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の配列番号：１で表される
アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配
列を有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質と称
することもある）は、ヒトやその他の温血動物（例え
ば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、
ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細
胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄
細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細
胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽
細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マ
クロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細
胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨
核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細
胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら
細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしく
はそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、
脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視
床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂
体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、
骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小
腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立
腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに
由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質で
あってもよい。

【０００７】配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表
されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０
％以上、より好ましくは、約９０％以上、さらに好まし
くは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが
挙げられる。本発明の配列番号：１で表されるアミノ酸
配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質
としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配
列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１
で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に
同質の性質を有するタンパク質などが好ましい。実質的
に同質の性質としては、例えば、ＩＲＡＰまたはＧＬＵ
Ｔ４への結合活性などが挙げられる。実質的に同質と
は、それらの性質が定性的に同質であることを示す。し
たがって、ＩＲＡＰまたはＧＬＵＴ４への結合活性が同
等であることが好ましいが、これらの性質の程度、タン
パク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
本発明の配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的
に同一のアミノ酸配列として、より具体的には、例え
ば、配列番号：９で表されるアミノ酸配列、配列番号：
１０で表されるアミノ酸配列、配列番号：１１で表され
るアミノ酸配列などがあげられる。

【０００８】また、本発明のタンパク質としては、例え
ば、配列番号：１、配列番号：９、配列番号：１０ま
たは配列番号：１１で表されるアミノ酸配列中の１また
は２個以上（好ましくは、１〜２５個程度、好ましくは
１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）の
アミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１、配
列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表
されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、
１〜２５個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好
ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ
酸配列、配列番号：１、配列番号：９、配列番号：１
０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列に１ま
たは２個以上（好ましくは、１〜２５個程度、好ましく
は１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）
のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、配列番号：
１、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１
１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ま
しくは、１〜２５個程度、好ましくは１〜１０個程度、
さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のア
ミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組
み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのい
わゆるムテインも含まれる。

【０００９】本明細書におけるタンパク質は、ペプチド
標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端
がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で
表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめと
する、本発明のタンパク質は、Ｃ末端が通常カルボキシ
ル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯＯ
⁻）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ_２）または
エステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステ
ルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−
プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ_１−６ア
ルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルな
どのＣ_３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α
−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール基、例えば、ベン
ジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル基
もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ
_１−２アルキル基などのＣ_７−１４アラルキル基、ピバ
ロイルオキシメチル基などが用いられる。

【００１０】本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボ
キシル基（またはカルボキシレート）を有している場
合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されて
いるものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合の
エステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルな
どが用いられる。さらに、本発明のタンパク質には、Ｎ
末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基
が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ
_１−６アルカノイルなどのＣ_１−６アシル基など）で保
護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端
のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子
内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−Ｓ
Ｈ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニ
ジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、ア
セチル基などのＣ_１−６アルカノイル基などのＣ_１−６
アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が
結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質な
ども含まれる。本発明のタンパク質の具体例としては、
例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有する
ヒト骨格筋由来のタンパク質、即ち、文献記載のＶＬＣ
ＡＤ（Andersen et al.、Hum. Mol. Benet.、5、461-47
2、1996）などがあげられる。

【００１１】本発明のタンパク質の部分ペプチド（以
下、本発明の部分ペプチドと略記する場合もある）とし
ては、前記した本発明のタンパク質の部分ペプチドであ
って、好ましくは、前記した本発明のタンパク質と同様
の性質を有するものであればいずれのものでもよい。例
えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少
なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好
ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最
も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプ
チドなどが用いられる。特に好ましくは、本発明のタン
パク質のＣ末端から連続した２００個以上６５５個未満
（さらに好ましくは、２００個以上６２０個未満）のア
ミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するペプチドが用
いられる。また、本発明の部分ペプチドは、そのアミノ
酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個
程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が
欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上
（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数
（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミ
ノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜１０個
程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が
挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個
以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数
（１〜５）個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換さ
れていてもよい。本発明の部分ペプチドとして、より具
体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末
端から第３６番目（Ａｌａ）〜第６５５番目（Ｐｈｅ）
で表されるアミノ酸配列を含有してなる部分ペプチドな
どがあげられる。

【００１２】また、本発明の部分ペプチドはＣ末端が通
常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレー
ト（−ＣＯＯ⁻）であるが、前記した本発明のタンパク
質タンパク質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮ
Ｈ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明の
タンパク質タンパク質と同様に、Ｎ末端のアミノ酸残基
（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護され
ているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタ
ミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミ
ノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されている
もの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなど
の複合ペプチドなども含まれる。本発明の部分ペプチド
は抗体作成のための抗原としても用いることができ、ま
た本発明のタンパク質とＩＲＡＰまたはＧＬＵＴ４との
結合を阻害する化合物のスクリーニングに用いることも
できる。

【００１３】本発明のタンパク質または部分ペプチドの
塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有
機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用い
られ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし
い。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩
酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機
酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ
レイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などが用いられる。本発明のタンパク質、部
分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトやその他の温
血動物の細胞または組織から公知のタンパク質の精製方
法によって製造することもできるし、それらのタンパク
質またはペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転
換体を培養することによっても製造することができる。
また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもで
きる。ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞から本
発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩を製
造する場合、ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞
をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、得られ
た抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせる
ことにより精製単離することができる。

【００１４】本発明のタンパク質、部分ペプチドもしく
はそのアミド体、またはその塩の合成には、通常市販の
タンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのよう
な樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキ
シメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチ
ル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、
４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４
−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル
樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジ
メトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹
脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ
アミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができ
る。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基
を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質ま
たはペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従
い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパ
ク質またはペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除
去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形
成反応を実施し、目的のタンパク質、ペプチドまたはそ
れらのアミド体を取得する。

【００１５】上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、
タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いるこ
とができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボ
ジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピ
ルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチル
アミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。こ
れらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、Ｈ
ＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂
に添加するかまたは、対応する酸無水物またはＨＯＢｔ
エステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ
保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加するこ
とができる。

【００１６】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより
十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても
十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセ
チルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化
することによって、後の反応に影響を与えないようにす
ることができる。

【００１７】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソ
ボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキ
シカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキ
シカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホ
ルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニル
ホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。カル
ボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、
メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シク
ロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロ
オクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もし
くは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化
（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエス
テル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベン
ジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシ
ルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド
化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒ
ドラジド化などによって保護することができる。セリン
の水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によ
って保護することができる。このエステル化に適する基
としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ_１−６）
アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベン
ジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの
炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテ
ル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラ
ヒドロピラニル基、t-ブチル基などである。チロシンの
フェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚ
ｌ、Ｃｌ_２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、
ｔ−ブチルなどが用いられる。ヒスチジンのイミダゾー
ルの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−
２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、
ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍ
ｏｃなどが用いられる。

【００１８】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニ
トロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロ
フェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ
−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕
などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたもの
としては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられ
る。保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ
−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気
流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンス
ルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオ
ロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジ
イソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリ
ジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモ
ニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸
処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温
度で行われるが、酸処理においては、例えば、アニソー
ル、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パ
ラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジ
チオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチ
オン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイ
ミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフ
ェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプ
トファンのインドール保護基として用いられるホルミル
基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタン
ジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、
希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアル
カリ処理によっても除去される。

【００１９】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。目的とするタンパク質もしくはペ
プチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、ま
ず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をア
ミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパ
ク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖の
Ｎ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質
もしくはペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基の
みを除去したタンパク質もしくはペプチドとを製造し、
この両タンパク質またはペプチドを上記したような混合
溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と
同様である。縮合により得られた保護タンパク質もしく
はペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護
基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得る
ことができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知
の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥
することで所望のタンパク質もしくはペプチドのアミド
体を得ることができる。目的とするタンパク質もしくは
ペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ
末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール
類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質もし
くはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク
質もしくはペプチドのエステル体を得ることができる。

【００２０】本発明の部分ペプチドまたはその塩は、公
知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のタン
パク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製
造することができる。ペプチドの合成法としては、例え
ば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。
すなわち、本発明の部分ペプチドを構成し得る部分ペプ
チドもしくはアミノ酸と残余部分（ペプチドもしくはア
ミノ酸）とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は
保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造する
ことができる。公知の縮合方法や保護基の脱離として
は、例えば、以下の〜に記載された方法が挙げられ
る。 M. BodanszkyおよびM.A. Ondetti、ペプチド・シンセ
シス（Peptide Synthesis）、Interscience Publisher
s、New York（１９６６年） SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド（The Peptid
e）、Academic Press、New York（１９６５年） 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善（株）
（1975年） 矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 １、タン
パク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年） 矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド
合成、広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて本発明のタンパク質または
ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得ら
れるタンパク質またはペプチドが遊離体である場合は、
公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩
に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、
公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体ま
たは他の塩に変換することができる。

【００２１】本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと
しては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基
配列を含有するものであればいかなるものであってもよ
い。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、
前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組
織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれで
もよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリ
オファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなど
いずれであってもよい。また、前記した細胞・組織より
totalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用い
て直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain React
ion（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅
することもできる。

【００２２】本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと
しては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列を含
有するＤＮＡ、または配列番号：２で表される塩基配列
を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズする塩基配列を有し、本発明のタンパク質と
実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡであれば何れのものでもよい。配列番号：２で表さ
れる塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな
条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例え
ば、配列番号：２で表される塩基配列と約７０％以上、
好ましくは約９９％以上の相同性を有する塩基配列を含
有するＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーショ
ンは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、
モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２n
d（J. Sambrook et al.、Cold Spring Harbor Lab. Pre
ss、1989）に記載の方法などに従って行なうことができ
る。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の
使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って
行なうことができる。ハイストリンジェントな条件と
は、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ま
しくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好
ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウ
ム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ま
しい。より具体的には、配列番号：１で表されるアミノ
酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡとして
は、配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡな
どが用いられる。

【００２３】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列の
一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：２で表される
塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件
下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のタン
パク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコー
ドするＤＮＡの一部分を有するＤＮＡなどが用いられ
る。配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡと
ハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。

【００２４】本発明のタンパク質、部分ペプチド（以
下、これらを単に本発明のタンパク質と略記することも
ある）をコードするＤＮＡのクローニングの手段として
は、本発明のタンパク質の部分塩基配列を有する合成Ｄ
ＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、
または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタ
ンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片
もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリ
ダイゼーションによって選別することができる。ハイブ
リダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・ク
ローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook e
t al.、Cold Spring Harbor Lab. Press、1989）に記載
の方法などに従って行なうことができる。また、市販の
ライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載
の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列
の置換は、公知のキット、例えば、Mutan^TM-G（宝酒
造）、Mutan^TM-K（宝酒造）などを用いて、Gapped dupl
ex法やKunkel法などの公知の方法あるいはそれらに準じ
る方法に従って行なうことができる。クローン化された
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそ
のまま、または所望により制限酵素で消化したり、リン
カーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡ
はその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有
し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡ
Ａ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの
翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡ
アダプターを用いて付加することもできる。本発明のタ
ンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタ
ンパク質をコードするＤＮＡ、例えばｃＤＮＡから目的
とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適
当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結するこ
とにより製造することができる。

【００２５】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイル
ス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐ
Ａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で
用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用い
る宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなる
ものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場
合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、Ｌ
ＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫ
プロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶ
（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモ
ーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア
属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモ
ーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Ｌプロモーター、
ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主が
バチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、Ｓ
ＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主
が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプ
ロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター
などが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘ
ドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好まし
い。

【００２６】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
^ｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏ^ｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐
性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイ
ニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マ
ーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含
まない培地によっても選択できる。また、必要に応じ
て、宿主に合ったシグナル配列をコードするＤＮＡを、
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの５’端末側に
付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Ｐｈ
ｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、
宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シ
グナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主
が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２
・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、
インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・
シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などのシグナル
配列がそれぞれ利用できる。このようにして構築された
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベク
ターを用いて、形質転換体を製造することができる。

【００２７】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１
２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユー
エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、６０巻、１
６０(１９６８)〕、ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッ
ズ・リサーチ、（Nucleic Acids Research）、９巻、３
０９(１９８１)〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー（Journal of MolecularBiol
ogy）〕、１２０巻、５１７(１９７８)〕、ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、４
１巻、４５９(１９６９)〕、Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics）、３９巻、４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・
サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジー
ン、２４巻、２５５(１９８３)〕、２０７−２１〔ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Bioch
emistry）、９５巻、８７(１９８４)〕などが用いられ
る。酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２、ＡＨ２２
Ｒ⁻、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１
２、Ｙ１９０、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizo
saccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２
０３６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ
７１などが用いられる。

【００２８】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh Five^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mor
i N細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞
としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ
２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In V
ivo）、13、213-217、(1977)）などが用いられる。昆虫
としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前
田ら、ネイチャー（Nature）、３１５巻、５９２(１９
８５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ
−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ
（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャ
イニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ⁻）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２
０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細
胞などが用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換する
には、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、６９巻、
２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ）、１７巻、
１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうこ
とができる。

【００２９】バチルス属菌を形質転換するには、例え
ば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス（Molecular ＆ General Genetics）、１６８巻、
１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうこと
ができる。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ
・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y）、１９４巻、１８２−１８７（１９９１）、プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA）、７５巻、１９２９（１９７８）
などに記載の方法に従って行なうことができる。昆虫細
胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テ
クノロジー（Bio/Technology）、6、47-55（1988））な
どに記載の方法に従って行なうことができる。動物細胞
を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞
工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）
（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology）、５２巻、
４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことが
できる。このようにして、本発明のタンパク質をコード
するＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形
質転換体を得ることができる。宿主がエシェリヒア属
菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養
に使用される培地としては液体培地が適当であり、その
中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無
機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例え
ば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖な
ど、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸
塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、
肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または
有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、
リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げ
られる。また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを
添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。

【００３０】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller）、ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics）、４３１−
４３３、Cold Spring Harbor Laboratory、New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエ
シェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約
３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加える
こともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通
気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質
転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホ
ールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.ら、
プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA）、７７巻、４５０５(１９
８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitt
er, G. A.ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８１巻、
５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約
５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜
３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や
撹拌を加える。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転
換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Med
ium（Grace, T.C.C.、ネイチャー（Nature）、195、788
（1962））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適
宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２
〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃
で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培
地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含む
ＭＥＭ培地〔サイエンス（Science）、１２２巻、５０
１(１９５２)〕、ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virolo
gy）、８巻、３９６(１９５９)〕、ＲＰＭＩ １６４０
培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル
・アソシエーション（The Journal of the American Me
dical Association）１９９巻、５１９(１９６７)〕、
１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ
・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceedi
ng ofthe Society for the Biological Medicine）、７
３巻、１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６
〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃
で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を
加える。以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞
膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめるこ
とができる。

【００３１】上記培養物から本発明のタンパク質を分離
精製するには、例えば、下記の方法により行なうことが
できる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞か
ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ
る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク
質変性剤や、トリトンＸ−１００^ＴＭなどの界面活性剤
が含まれていてもよい。培養液中に本発明のタンパク質
が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体
あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このよ
うにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれ
る本発明のタンパク質の精製は、公知の分離・精製法を
適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知
の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解
度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、
およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法など
の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロ
マトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィ
ニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用
する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水
性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点
の差を利用する方法などが用いられる。

【００３２】このようにして得られる本発明のタンパク
質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそ
れに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に
塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる
方法により、遊離体または他の塩に変換することができ
る。なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前ま
たは精製後に適当なタンパク修飾酵素を作用させること
により、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的
に除去することもできる。タンパク修飾酵素としては、
例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエン
ドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼ
などが用いられる。このようにして生成する本発明のタ
ンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノ
アッセイやウエスタンブロッティングなどにより測定す
ることができる。

【００３３】本発明のタンパク質、部分ペプチドまたは
その塩に対する抗体は、本発明のタンパク質またはその
塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明のタン
パク質、部分ペプチドまたはその塩（以下、これらを単
に本発明のタンパク質と略記することもある）に対する
抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、公知の
抗体または抗血清の製造法に従って製造することができ
る。

【００３４】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血
動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモッ
ト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げら
れるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モ
ノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免
疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められ
た個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種ま
たは異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することが
できる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標
識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結
合した標識剤の活性を測定することにより行なうことが
できる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミ
ルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、256、495
（1975）〕に従い実施することができる。融合促進剤と
しては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や
センダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥ
Ｇが用いられる。

【００３５】骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄
腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられ
る。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細
胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、
ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）
が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、
好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベート
することにより効率よく細胞融合を実施できる。モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには
種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を
直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイク
ロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に
放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体
（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス
免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡ
を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する
方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着
させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性
物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結
合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げら
れる。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれ
に準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ
（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加
した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および
育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるもの
ならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２
０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰ
ＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧ
ＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドー
マ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬
（株））などを用いることができる。培養温度は、通常
２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間
は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間であ
る。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。

【００３６】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例え
ば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコ
ール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体
（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過
法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテ
インＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合
を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なう
ことができる。

【００３７】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に
従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タン
パク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク
質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製
造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から
本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗
体の分離精製を行なうことにより製造することができ
る。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキ
ャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータン
パク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比
は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して
抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率
で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンや
ウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプ
テン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の
割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテン
とキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いる
ことができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミ
ド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリ
ジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮
合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位
にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。
投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイント
アジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与し
てもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約
３〜１０回程度行われる。ポリクローナル抗体は、上記
の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好まし
くは血液から採取することができる。抗血清中のポリク
ローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測
定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離
精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の
免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができ
る。

【００３８】本発明のタンパク質、部分ペプチドをコー
ドするＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡ
と略記することもある）に相補的な、または実質的に相
補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、
本発明のＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩
基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有す
るものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであって
もよい。本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列と
は、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すな
わち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは
部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以
上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９
５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。
特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発
明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配
列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖
と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好まし
くは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同
性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらの
アンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用
いて製造することができる。

【００３９】以下に、本発明のタンパク質、部分ペプチ
ドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略記する
場合がある）、本発明のタンパク質、部分ペプチドをコ
ードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合
がある）、本発明のタンパク質、部分ペプチドまたはそ
の塩に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合
がある）、およびアンチセンスＤＮＡの用途を説明す
る。

【００４０】（１）本発明のタンパク質が関与する各種
疾病の予防・治療剤 本発明のタンパク質は、ＩＲＡＰと結合することにより
ＧＬＵＴ４小胞体（ＧＬＵＴ４、ＩＲＡＰ、ＶＡＭＰ
ｓ、ＳＣＡＭＰｓ、Ｒａｂ４などのタンパク質が局在し
ている小胞体）を細胞内にとどめ、血中の糖の筋肉細胞
および脂肪細胞への取込みを抑制することにより血糖値
を上昇させる。よって、本発明のタンパク質または本発
明のＤＮＡは低血糖症などの種々の疾患の予防・治療薬
などの医薬として使用することが出来る。例えば、生体
内において本発明のタンパク質などが減少あるいは欠損
しているために、生体の恒常性維持または生体防御機構
が十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる場合
に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で
本発明のタンパク質を発現させることによって、（ロ）
細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパク質を
発現させた後に、該細胞を患者に移植することによっ
て、または（ハ）本発明のタンパク質を該患者に投与す
ることなどによって、該患者における本発明のタンパク
質の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることがで
きる。本発明のＤＮＡを上記の予防・治療剤として使用
する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベ
クター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソ
シエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに
挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に
投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのまま
で、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に
認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロ
ゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与でき
る。本発明のタンパク質を上記の予防・治療剤として使
用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以
上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９
％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。

【００４１】本発明のタンパク質は、例えば、必要に応
じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マ
イクロカプセル剤などとして経口的に、あるいはエアロ
ゾル化して吸入剤の形で、あるいは水もしくはそれ以外
の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液
剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、
本発明のタンパク質を生理学的に認められる担体、香味
剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などと
ともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量
形態で混和することによって製造することができる。こ
れら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な
用量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル
剤などに混和することができる添加剤としては、例え
ば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビア
ゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形
剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのよう
な膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、
ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパー
ミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤など
が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合に
は、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を
含有することができる。注射のための無菌組成物は注射
用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油な
どのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させる
などの通常の製剤製造法に従って処方することができ
る。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブ
ドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソ
ルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）
などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコー
ル（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例え
ば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールな
ど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート
８０^TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油
性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げら
れ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、
リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化
剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインな
ど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチ
レングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアル
コール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合して
もよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに
充填される。本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上
記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。

【００４２】このようにして得られる製剤は、安全で低
毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他の温血動物
（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ト
リ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チ
ンパンジーなど）に対して投与することができる。本発
明のタンパク質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与
ルートなどにより差異はあるが、例えば、低血糖症の治
療目的で本発明のタンパク質を経口投与する場合、一般
的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該
タンパク質を約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約
１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ
投与する。非経口的に投与する場合は、該タンパク質の
１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なる
が、例えば、低血糖症の治療目的で本発明のタンパク質
を注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する
場合、一日につき該タンパク質を約０．０１〜３０ｍｇ
程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好まし
くは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することによ
り投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０
ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。

【００４３】（２）結合阻害物質のスクリーニング 本発明のタンパク質はＩＲＡＰの細胞質側ドメインに結
合し、ＧＬＵＴ４小胞体を細胞内に留め、血中の糖の筋
肉細胞および脂肪細胞への取込みを抑制する。したがっ
て、本発明のタンパク質とＩＲＡＰとの結合を阻害する
化合物、好ましくは本発明のタンパク質とＩＲＡＰの細
胞質側ドメインとの結合を阻害する化合物は、血中の糖
の筋肉細胞および脂肪細胞への取込みを促進し、血糖値
を低下させることができ、例えば、高血糖症、糖尿病
（例、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病等）、耐糖
能不全［ＩＧＴ（Impaired Glucose Tolerance）］、
糖尿病性合併症［例、神経障害、腎症、網膜症、白内
障、大血管障害、骨減少症、糖尿病性高浸透圧昏睡、感
染症（例、呼吸器感染症、尿路感染症、消化器感染症、
皮膚軟部組織感染症、下肢感染症等）、糖尿病性壊疽、
口腔乾燥症、聴覚の低下、脳血管障害、末梢血行障害
等］などの予防・治療剤；および耐糖能不全から糖尿病
への移行抑制剤などの医薬として有用である。糖尿病の
判定基準については、１９９９年に日本糖尿病学会から
新たな判定基準が報告されている。この報告によれば、
糖尿病とは、空腹時血糖値（静脈血漿におけるグルコー
ス濃度）が１２６ｍｇ／ｄｌ以上、７５ｇ経口ブドウ糖
負荷試験（７５ｇＯＧＴＴ）２時間値（静脈血漿におけ
るグルコース濃度）が２００ｍｇ／ｄｌ以上、随時血糖
値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が２００ｍｇ／
ｄｌ以上のいずれかを示す状態である。また、上記糖尿
病に該当せず、かつ、「空腹時血糖値（静脈血漿におけ
るグルコース濃度）が１１０ｍｇ／ｄｌ未満または７５
ｇ経口ブドウ糖負荷試験（７５ｇＯＧＴＴ）２時間値
（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１４０ｍｇ／ｄ
ｌ未満を示す状態」（正常型）でない状態を、「境界
型」と呼ぶ。また、糖尿病の判定基準については、１９
９７年にＡＤＡ（米国糖尿病学会）から、１９９８年に
ＷＨＯから、新たな判定基準が報告されている。これら
の報告によれば、糖尿病とは、空腹時血糖値（静脈血漿
におけるグルコース濃度）が１２６ｍｇ／ｄｌ以上であ
り、かつ、７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験２時間値（静脈
血漿におけるグルコース濃度）が２００ｍｇ／ｄｌ以上
を示す状態である。また、上記報告によれば、耐糖能不
全とは、空腹時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃
度）が１２６ｍｇ／ｄｌ未満であり、かつ、７５ｇ経口
ブドウ糖負荷試験２時間値（静脈血漿におけるグルコー
ス濃度）が１４０ｍｇ／ｄｌ以上２００ｍｇ／ｄｌ未満
を示す状態である。さらに、ＡＤＡの報告によれば、空
腹時血糖値（静脈血漿におけるグルコース濃度）が１１
０ｍｇ／ｄｌ以上１２６ｍｇ／ｄｌ未満の状態をＩＦＧ
（Impaired Fasting Glucose）と呼ぶ。一方、ＷＨＯの
報告によれば、該ＩＦＧ（Impaired Fasting Glucose）
のうち、７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験２時間値（静脈血
漿におけるグルコース濃度）が１４０ｍｇ／ｄｌ未満で
ある状態をＩＦＧ（Impaired Fasting Glycemia）と呼
ぶ。本発明のタンパク質とＩＲＡＰとの結合を阻害する
化合物は、上記した新たな判定基準により決定される糖
尿病、境界型、耐糖能異常、ＩＦＧ（Impaired Fasting
Glucose）およびＩＦＧ（Impaired Fasting Glycemi
a）の予防・治療剤としても用いられる。さらに、本発
明のタンパク質とＩＲＡＰとの結合を阻害する化合物
は、境界型、耐糖能異常、ＩＦＧ（Impaired Fasting G
lucose）またはＩＦＧ（Impaired Fasting Glycemia）
から糖尿病への進展を防止することもできる。本発明の
タンパク質とＩＲＡＰとの結合を阻害する化合物として
は、例えば、式：

【化１】 または

【化２】 で表される化合物等が挙げられる。また、本発明のタン
パク質はＧＬＵＴ４の細胞質内ドメイン（ＧＬＵＴ４の
アミノ酸番号４６８〜５１０；配列番号：７）にも結合
し、ＧＬＵＴ４小胞体を細胞内に留めることにより、血
中の糖の筋肉細胞および脂肪細胞への取込みを抑制す
る。したがって、本発明のタンパク質とＧＬＵＴ４との
結合を阻害する化合物、好ましくは本発明のタンパク質
とＧＬＵＴ４の細胞質内ドメインとの結合を阻害する化
合物は、本発明のタンパク質とＩＲＡＰとの結合を阻害
する化合物と同様に、例えば高血糖症、糖尿病などの疾
病に対する予防・治療剤などの医薬として有用である。

【００４４】本発明のスクリーニング方法には、本発明
のタンパク質が用いられ、さらにＩＲＡＰもしくはＩＲ
ＡＰの細胞質側ドメインに相当するペプチドまたはＧＬ
ＵＴ４もしくはＧＬＵＴ４の細胞質内ドメインに相当す
るペプチドが用いられてもよい。また、本発明のスクリ
ーニング方法は、本発明のタンパク質を産生する能力を
有する細胞（好ましくは、本発明のタンパク質コードす
るＤＮＡで形質転換された形質転換体（例、酵母、動物
細胞などの細胞））が用いられてもよい。該形質転換体
は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡおよびＩＲ
ＡＰまたはＩＲＡＰの細胞質側ドメインに相当するペプ
チドをコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体、
あるいは本発明のタンパク質をコードするＤＮＡおよび
ＧＬＵＴ４またはＧＬＵＴ４の細胞質内ドメインに相当
するペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された形質
転換体であってもよい。 （２−１）In vitro結合試験によるスクリーニング 本発明のタンパク質を本発明のタンパク質に対する抗体
を用いて固相（例、ＥＩＡプレート）に固定化するか、
あるいは本発明のタンパク質をＴａｇタンパク質（例、
Ｈｉｓ−Ｔａｇ、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランス
フェラーゼ）等）と融合させた後、固相に固定化する。
本発明のタンパク質として本発明の部分ペプチドを用い
る場合には、好ましくはＩＲＡＰまたはＧＬＵＴ４との
結合活性を有する部分ペプチド（配列番号：１のアミノ
酸番号３６〜６５５など）が用いられる。タンパク質の
固相への固定に際しては、Ｈｉｓ−Ｔａｇであればニッ
ケル、ＧＳＴであればグルタチオンが用いられる。これ
に、ＩＲＡＰもしくはＩＲＡＰの細胞質側ドメインに相
当する部分ペプチド（配列番号：５で表されるアミノ酸
配列またはその部分配列、好ましくは配列番号：５のア
ミノ酸番号５５〜８２）またはＧＬＵＴ４もしくはＧＬ
ＵＴ４の細胞質内ドメインに相当する部分ペプチド（配
列番号：７）をビオチンなどで標識したものを加えて結
合させる。この複合体に試験化合物を添加し、本発明の
タンパク質とＩＲＡＰまたはＧＬＵＴ４との結合の阻害
の結果として遊離したＩＲＡＰもしくはＩＲＡＰ部分ペ
プチドまたはＧＬＵＴ４もしくはＧＬＵＴ４部分ペプチ
ドを、ビオチンなどの標識体を検出する市販のキットま
たは公知の抗ＩＲＡＰ抗体もしくは市販の抗ＧＬＵＴ４
抗体を用いて、検出、定量する。ＩＲＡＰもしくはＩＲ
ＡＰ部分ペプチドまたはＧＬＵＴ４もしくはＧＬＵＴ４
部分ペプチドを遊離させる化合物を、本発明のタンパク
質とＩＲＡＰもしくはＧＬＵＴ４との結合を阻害する化
合物（以下、結合阻害剤と略称する場合がある）として
選択する。また、ＩＲＡＰもしくはＩＲＡＰ細胞質側ド
メインに相当する部分ペプチド（配列番号：５で表され
るアミノ酸配列またはその部分配列、好ましくは配列番
号：５のアミノ酸番号５５〜８２）またはＧＬＵＴ４も
しくはＧＬＵＴ４の細胞質内ドメインに相当する部分ペ
プチド（配列番号：７）を固相に固定化し、これに本発
明のタンパク質を結合させる。ＩＲＡＰもしくはＩＲＡ
Ｐ部分ペプチドまたはＧＬＵＴ４もしくはＧＬＵＴ４部
分ペプチドを固相へ固定化する際には、例えばビオチン
で標識されたＩＲＡＰもしくはＩＲＡＰ部分ペプチドま
たはＧＬＵＴ４もしくはＧＬＵＴ４部分ペプチドとアビ
ジンで標識された固相（例、プレート）が好ましく用い
られる。この複合体に試験化合物を添加し、遊離する本
発明のタンパク質を本発明のタンパク質に対する抗体ま
たはＴａｇタンパク質に対する抗体で検出、定量する。
この方法において、本発明のタンパク質はＴａｇタンパ
ク質と融合させた本発明のタンパク質を用いてもよく、
その際には、遊離する本発明のタンパク質を本発明のタ
ンパク質に対する抗体で検出、定量してもよく、またＴ
ａｇタンパク質に対する抗体で検出、定量してもよい。
本発明のタンパク質を遊離させる化合物を、結合阻害剤
として選択する。選択された化合物は、抗ＩＲＡＰ抗
体、抗ＧＬＵＴ４抗体、本発明のタンパク質に対する抗
体またはＴａｇに対する抗体を用いた免疫沈降法等の公
知の方法により、その阻害活性を確認することができ
る。該免疫沈降法では、選択された化合物によって本発
明のタンパク質とＩＲＡＰもしくはＧＬＵＴ４との結合
が阻害されることにより遊離する本発明のタンパク質ま
たはＩＲＡＰもしくはＧＬＵＴ４を本発明のタンパク質
に対する抗体、Ｔａｇタンパク質に対する抗体、ＩＲＡ
Ｐに対する抗体またはＧＬＵＴ４に対する抗体によって
検出する。

【００４５】（２−２）Two-Hybrid法によるスクリーニ
ング （２−２−１）酵母two-hybrid法によるスクリーニング 酵母（例、Saccharomyces cerevisiae、より好ましくは
S. cerevisiae Y190株）においてレポーター遺伝子結合
ドメインを融合させた上記ＩＲＡＰ細胞質側ドメインに
相当する部分ペプチドもしくは上記ＧＬＵＴ４細胞質内
ドメインに相当する部分ペプチドをコードするＤＮＡと
レポーター遺伝子転写活性ドメインが融合した本発明の
タンパク質をコードするＤＮＡを発現させると、two-hy
bridの作用により、レポーター遺伝子であるβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子とヒスチジン合成系遺伝子ＨＩＳ３の
表現形が発現する。この酵母株を試験化合物の存在下、
一定時間培養し、酵母株のβ−ガラクトシダーゼ活性を
減少させるか、あるいは酵母株をヒスチジン要求性に転
換させる化合物を選択する。該酵母株は、上記した宿主
が酵母である形質転換体の培養と同様に培養できる。β
−ガラクトシダーゼの活性はＸ−Ｇａｌ（5-bromo-4-ch
loro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside）、ＯＮＰＧ
（o-nitrophenyl β-D-galactopyranoside）あるいはＣ
ＰＲＧ（chlorophenyl red-β-D-galactopyranoside）
を基質として公知の方法に従って測定することができ
る。ＨＩＳ３表現形の発現はヒスチジン欠損の最小培地
で酵母を培養することにより測定することができる。選
択された化合物のうち、細胞毒性のある化合物ならびに
レポーター遺伝子産物との相互作用等でレポーター遺伝
子産物自身の活性を阻害する化合物は擬陽性化合物とし
て除外できる。

【００４６】（２−２−２）動物細胞two-hybrid法によ
るスクリーニング 動物細胞（例、チャイニーズハムスターオバリー（ＣＨ
Ｏ）細胞）にレポーター遺伝子として、例えばクロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺
伝子またはホタルルシフェラーゼ遺伝子を導入する。レ
ポーター遺伝子の転写調節領域は、例えば動物細胞で機
能するプロモーター（例、アデノウイルスＥ１ｂ由来の
最小プロモーター（ＴＡＴＡ ｂｏｘ）など）の下流
に、例えばＧＡＬ１の転写活性配列（ＵＡＳ）を結合し
たものを用い、酵母two-hybridシステムのＧＡＬ４−Ｇ
ＡＬ１の転写調節系を動物細胞内に導入し、動物細胞内
でレポーター遺伝子の発現が誘導されるようにする。こ
れにＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメインに融合された上記Ｉ
ＲＡＰ細胞質側ドメインに相当する部分ペプチドもしく
は上記ＧＬＵＴ４細胞質内ドメインに相当する部分ペプ
チドをコードするＤＮＡと、例えば単純ヘルペスウイル
ス由来ＶＰ１６タンパク質をコードするＤＮＡに融合し
た本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを発現させる
と、two-hybridの作用によりレポーター遺伝子が発現さ
れる動物細胞株が得られる。この細胞株を試験化合物の
存在下、一定時間培養し、レポーター遺伝子産物の活性
を測定し、活性を低下させる化合物を選択する。該動物
細胞株は、上記した宿主が動物細胞である形質転換体の
培養と同様に培養できる。ＣＡＴ、ルシフェラーゼなど
のレポーター遺伝子産物の活性は公知の方法に従って、
市販のキットを用いて測定できる。選択された化合物の
うち、細胞毒性のある化合物ならびにレポーター遺伝子
産物との相互作用等でレポーター遺伝子産物自身の活性
を阻害する化合物を擬陽性化合物として除外できる。

【００４７】（３）本発明のタンパク質の発現を促進ま
たは抑制する化合物のスクリーニング 本発明のＤＮＡの転写調節領域をクローニングし、これ
にレポーター遺伝子（例、β−ガラクトシダーゼ、ホタ
ルルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（ＣＡＴ）等）を融合し、動物細胞
（例、ＣＨＯ細胞）に導入する。この細胞株を試験化合
物の存在下、一定時間培養し、レポーター遺伝子産物の
産生量を上昇または低下させる化合物を選択する。該動
物細胞株は、上記した宿主が動物細胞である形質転換体
の培養と同様に培養できる。レポーター遺伝子産物の産
生量の上昇または低下は、例えば、培養液中のレポータ
ー遺伝子産物の活性を測定することによって判定するこ
とができる。選択された化合物のうち、細胞毒性のある
化合物ならびにレポーター遺伝子産物との相互作用等で
レポーター遺伝子産物自身の活性を上昇または低下させ
る化合物を擬陽性化合物として除外できる。

【００４８】試験化合物としては、例えば、ペプチド、
タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生
産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが
挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよい
し、公知の化合物であってもよい。本発明のタンパク質
の発現を抑制する化合物としては、上記スクリーニング
で得られる本発明のタンパク質の発現を抑制する化合
物、上記したアンチセンスＤＮＡ、後述の本発明のＤＮ
Ａに対するプロモーター活性を阻害する化合物などがあ
げられる。本発明のタンパク質の発現を促進する化合物
としては、上記スクリーニングで得られる本発明のタン
パク質の発現を促進する化合物、後述の本発明のＤＮＡ
に対するプロモーター活性を促進する化合物などがあげ
られる。

【００４９】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明のタンパク質を含有し、さらにＩＲＡＰもしくはＩＲ
ＡＰの細胞質側ドメインに相当するペプチドまたはＧＬ
ＵＴ４もしくはＧＬＵＴ４の細胞質内ドメインに相当す
るペプチドを含有していてもよい。また、本発明のスク
リーニング用キットは、本発明のタンパク質を産生する
能力を有する細胞（好ましくは、本発明のタンパク質を
コードするＤＮＡで形質転換された形質転換体（例、酵
母、動物細胞などの細胞））を含有する。該形質転換体
は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡおよびＩＲ
ＡＰまたはＩＲＡＰの細胞質側ドメインに相当するペプ
チドをコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体、
あるいは本発明のタンパク質をコードするＤＮＡおよび
ＧＬＵＴ４またはＧＬＵＴ４の細胞質内ドメインに相当
するペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された形質
転換体であってもよい。

【００５０】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク
質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから
選ばれた化合物であり、例えば、本発明のタンパク質と
ＩＲＡＰまたはＧＬＵＴ４との結合阻害する化合物、本
発明のタンパク質の発現を促進または抑制する化合物な
どがあげられる。該化合物の塩としては、前記した本発
明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。本発明
のタンパク質とＩＲＡＰもしくはＧＬＵＴ４との結合を
阻害する化合物または本発明のタンパク質の発現を抑制
する化合物は、例えば、高血糖症、糖尿病などの疾病に
対する予防・治療剤などの医薬として有用である。本発
明のタンパク質の発現を促進する化合物は、例えば、低
血糖症などの疾病に対する予防・治療剤などの医薬とし
て有用である。

【００５１】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に
従って製剤化することができる。例えば、前記した本発
明のタンパク質を含有する医薬と同様にして、錠剤、カ
プセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性
溶液、懸濁液剤などに製剤化し、経口的または非経口的
に投与することができる。このようにして得られる製剤
は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他
の温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツ
ジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チン
パンジーなど）に対して投与することができる。該化合
物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与
対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、糖
尿病治療の目的で本発明のタンパク質とＩＲＡＰもしく
はＧＬＵＴ４との結合を阻害する化合物または本発明の
タンパク質の発現を抑制する化合物を経口投与する場
合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、
一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましく
は約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０
ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の
１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なる
が、例えば、糖尿病治療の目的で本発明のタンパク質と
ＩＲＡＰもしくはＧＬＵＴ４との結合を阻害する化合物
または本発明のタンパク質の発現を抑制する化合物を注
射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場
合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、
好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約
０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好
都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算
した量を投与することができる。例えば、低血糖症治療
の目的で本発明のタンパク質の発現を促進する化合物を
経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとし
て）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１０
０ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましく
は約１．０〜２０ｍｇ投与する。例えば、低血糖症治療
の目的で本発明のタンパク質の発現を促進する化合物を
注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場
合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、
好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約
０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好
都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算
した量を投与することができる。

【００５２】（４）本発明のタンパク質の定量 本発明のタンパク質に対する抗体（以下、本発明の抗体
と略記する場合がある）は、本発明のタンパク質を特異
的に認識することができるので、被検液中の本発明のタ
ンパク質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定
量などに使用することができる。すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発
明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合し
た標識化された本発明のタンパク質の割合を測定するこ
とを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量
法、および（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明
の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あ
るいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤
の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明の
タンパク質の定量法を提供する。上記（ｉｉ）の定量法
においては、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部
を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質の
Ｃ端部に反応する抗体であることが望ましい。

【００５３】また、本発明のタンパク質に対するモノク
ローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称
する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を
行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともで
きる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いても
よく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')_２、Ｆａｂ'、あるい
はＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本
発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきもの
ではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質
量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の
量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知
量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算
出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよ
い。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリッ
ク法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感
度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるの
が特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる
標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光
物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素とし
ては、例えば、〔^１２５Ｉ〕、〔^１３１Ｉ〕、
〔^３Ｈ〕、〔^１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素とし
ては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、
β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素
酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フ
ルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートな
どが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノー
ル、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど
が用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との
結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。

【００５４】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵
素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用
いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキス
トラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレ
ン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、ある
いはガラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては
不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応
させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノ
クローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化
担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の
本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反
応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行な
ってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤
および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができ
る。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、
固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず
しも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等
の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本
発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定
法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明
のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合す
る部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわ
ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例え
ば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質
のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体
は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗
体が用いられる。

【００５５】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原
(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し
（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ、Ｆいずれかの標識量を測定し、被
検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として
可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコー
ル、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、お
よび、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるい
は、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相
化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリ
ック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の
標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離
するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗
体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化
抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。
次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量
を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるい
は溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。

【００５６】これら個々の免疫学的測定法を本発明の定
量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一
般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参
照することができる。例えば、入江 寛編「ラジオイム
ノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編
「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭
和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第
２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年
発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70（Immunoc
hemical Techniques（Part A））、同書 Vol. 73（Immu
nochemical Techniques（Part B））、同書 Vol. 74（I
mmunochemical Techniques（Part C））、同書 Vol. 84
（Immunochemical Techniques（Part D:Selected Immun
oassays））、同書 Vol. 92（Immunochemical Techniqu
es（Part E:Monoclonal Antibodies and General Immun
oassay Methods））、同書 Vol. 121（Immunochemical
Techniques（Part I:Hybridoma Technology and Monocl
onal Antibodies））（以上、アカデミックプレス社発
行）などを参照することができる。以上のようにして、
本発明の抗体を用いることによって、本発明のタンパク
質を感度良く定量することができる。さらには、本発明
の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量するこ
とによって、（１）本発明のタンパク質の濃度の増加が
検出された場合、例えば、高血糖症または糖尿病などの
疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断す
ることができ、また（２）本発明のタンパク質の濃度の
減少が検出された場合、例えば、低血糖症などの疾病で
ある、または将来罹患する可能性が高いと診断すること
ができる。また、本発明の抗体は、体液や組織などの被
検体中に存在する本発明のタンパク質を検出するために
使用することができる。また、本発明のタンパク質を精
製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分
画中の本発明のタンパク質の検出、被検細胞内における
本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用する
ことができる。

【００５７】（５）遺伝子診断剤 本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用するこ
とにより、ヒトまたはその他の温血動物（例えば、ラッ
ト、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーな
ど）における本発明のタンパク質をコードするＤＮＡま
たはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することがで
きるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突
然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの
増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用で
ある。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例
えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ
−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics）、第５巻、８
７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイ
ズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of theNational
Academy of Sciences of the USA）、第８６巻、２７
６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施する
ことができる。例えば、ノーザンハイブリダイゼーショ
ンにより発現過多が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ
法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例え
ば、高血糖症または糖尿病、あるいは低血糖症などの疾
病である可能性が高いと診断することができる。

【００５８】（６）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬 本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑
制することができるアンチセンスＤＮＡは、生体内にお
ける本発明のタンパク質の産生を抑制することができる
ので、上記の本発明のタンパク質の発現を抑制する化合
物と同様に、例えば、高血糖症または糖尿病などの予防
・治療剤として使用することができる。上記アンチセン
スＤＮＡを上記の予防・治療剤として使用する場合、前
記した本発明のＤＮＡを含有する各種の予防・治療剤と
同様にして実施することができる。例えば、該アンチセ
ンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独
あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベク
ター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクタ
ーなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従っ
て実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そ
のままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理
学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハ
イドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与
できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管
内に投与することもできる。さらに、該アンチセンスＤ
ＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やそ
の発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプ
ローブとして使用することもできる。

【００５９】（７）本発明の抗体を含有する医薬 本発明のタンパク質の活性を中和する作用を有する本発
明の抗体は、高血糖症、糖尿病などの疾患に対する医薬
（予防・治療剤）として使用することができる。本発明
の抗体を含有する上記疾患の予防・治療剤は、そのまま
液剤として、または適当な剤形の医薬組成物として、ヒ
トまたはその他の温血動物（例、ラット、ウサギ、ヒツ
ジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口
的または非経口的に投与することができる。投与量は、
投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても
異なるが、例えば、成人の糖尿病の予防・治療のために
使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常
０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜
１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５
ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは
１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合
である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに
準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合
には、その症状に応じて増量してもよい。本発明の抗体
は、それ自体または適当な医薬組成物として投与するこ
とができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、本発
明の抗体と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしく
は賦形剤とを含むものである。このような組成物は、経
口または非経口投与に適する剤形として提供される。す
なわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固
体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィル
ムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプ
セル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳
剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は公知の方
法によって製造され、製剤分野において通常用いられる
担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例
えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷ
ん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられ
る。

【００６０】非経口投与のための組成物としては、例え
ば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射
剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤
などの剤形を包含する。かかる注射剤は、公知の方法に
従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に
用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁また
は乳化することによって調製する。注射用の水性液とし
ては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬
を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例え
ば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール
（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、
ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of
hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。
油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いら
れ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通
常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられ
る坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に
混合することによって調製される。上記の経口用または
非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するよ
うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。
かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル
剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞ
れの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ
注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２
５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ま
しくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有し
てもよい。

【００６１】（８）ＤＮＡ転移動物 本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）または
その変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する
場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。すな
わち、本発明は、（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはそ
の変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、（２）非ヒト哺
乳動物がゲッ歯動物である第（１)記載の動物、（３）ゲ
ッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動
物、および（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異
ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベ
クターを提供するものである。本発明の外来性ＤＮＡま
たはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本
発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精
卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対し
て、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生
の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の
段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム
法、電気パルス法、リポフェクション法、マイクロイン
ジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキ
ストラン法、レトロウイルス法などにより目的とするＤ
ＮＡを転移することによって作出することができる。ま
た、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組
織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移
し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さ
らに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法
により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を
作出することもできる。

【００６２】非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、
ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモッ
ト、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。な
かでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生およ
び生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ
歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７
ＢＬ／６系統、ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６
Ｃ３Ｆ_１系統、ＢＤＦ_１系統、Ｂ６Ｄ２Ｆ_１系統、ＢＡ
ＬＢ／ｃ系統、ＩＣＲ系統など）またはラット（例え
ば、Ｗｉｓｔａｒ、ＳＤなど）などが好ましい。哺乳動
物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動
物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが
挙げられる。本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動
物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん
哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩
基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、
具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換など
が生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含
まれる。該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパ
ク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発
明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させ
るＤＮＡなどが用いられる。本発明の外来性ＤＮＡは、
対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物
由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物
に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現
させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンスト
ラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本
発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高
い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサ
ギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マ
ウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモータ
ーの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコン
ストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精
卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクション
することによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転
移哺乳動物を作出することができる。

【００６３】本発明のタンパク質の発現ベクターとして
は、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミ
ド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリ
オファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィ
ルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなど
の動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由
来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由
来のプラスミドなどが好ましく用いられる。上記のＤＮ
Ａ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、
ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイル
ス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイ
ルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモ
ーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、
モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の
プロモーター、例えば、アルブミン、インシュリンＩ
Ｉ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチ
ン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維
性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１、Ｋ１０およ
びＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリック
ＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジス
トロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、
心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキ
ナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリ
ウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓ
ｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩ
およびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビタ
ー、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レ
ニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダ
ーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−
１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシ
ン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロ
ブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（Ｖ
ＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビ
ン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケ
ファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用
いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサ
イトメガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖
延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよ
びニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。

【００６４】上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物にお
いて目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する
配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有しているこ
とが好ましく、例えば、ウィルス由来および各種哺乳動
物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましく
は、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネターなどが用
いられる。その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高
発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、
エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部など
をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻
訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも
目的により可能である。正常な本発明のタンパク質の翻
訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、
イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス
など）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来
ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーより
ゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、
腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方
法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得するこ
とが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞
または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を
点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製するこ
とができる。該翻訳領域は転移動物において発現しうる
ＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下
流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通
常の遺伝子工学的手法により作製することができる。受
精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、
対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在す
るように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細
胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、
作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞の
すべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味す
る。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の
子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外
来性ＤＮＡを有する。

【００６５】本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非
ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持
することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼
育環境で継代飼育することが出来る。受精卵細胞段階に
おける本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の
胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確
保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において
本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動
物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発
明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発
明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はそ
の胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡ
を過剰に有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つ
ホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配す
ることによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するよ
うに繁殖継代することができる。本発明の正常ＤＮＡを
有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現
させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進する
ことにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を
発症することがあり、その病態モデル動物として利用す
ることができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物
を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明
のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこ
れらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能であ
る。また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳
動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有す
ることから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対す
る予防・治療薬のスクリーニング試験にも利用可能であ
る。

【００６６】一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する
非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保
持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼
育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とす
る外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科とし
て用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンス
トラク卜は、通常の遺伝子工学的手法によって作製する
ことができる。受精卵細胞段階における本発明の異常Ｄ
ＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の
全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出
動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在する
ことは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細
胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味す
る。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の
子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異
常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持
つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配
することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように
繁殖継代することができる。本発明の異常ＤＮＡを有す
る非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させ
られており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害すること
により最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応
症となることがあり、その病態モデル動物として利用す
ることができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物
を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の
病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行な
うことが可能である。また、具体的な利用可能性として
は、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパ
ク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパ
ク質による正常タンパク質の機能阻害（dominant negat
ive作用）を解明するモデルとなる。また、本発明の外
来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明
のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタ
ンパク質の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリー
ニング試験にも利用可能である。

【００６７】また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動
物のその他の利用可能性として、例えば、 組織培養のための細胞源としての使用、 本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲ
ＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現された
タンパク質組織を分析することによる、本発明のタンパ
ク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質
との関連性についての解析、 ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により
培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織から
の細胞の機能の研究、 上記記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高
めるような薬剤のスクリーニング、および 本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作
製などが考えられる。 さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタ
ンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタ
ンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることがで
き、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの
各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新し
い治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患
の研究および治療に貢献することができる。また、本発
明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、ト
リプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤ
ＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系
統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタン
パク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは
増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機
構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発
明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究
材料となる。さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用い
て、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、
本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行
なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、
有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供す
ることが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物ま
たは本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発
明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、
開発することが可能である。

【００６８】（９）ノックアウト動物 本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳
動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳
動物を提供する。すなわち、本発明は、（１）本発明の
ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡが薬剤耐性遺伝子（例、ネオマイシン耐
性遺伝子）またはレポーター遺伝子（例、大腸菌由来の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不
活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、（３）ネオマ
イシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、（４）非
ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹
細胞、（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載
の胚幹細胞、（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該
ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、（７）該ＤＮＡが薬剤
耐性遺伝子（例、ネオマイシン耐性遺伝子）またはレポ
ーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポー
ター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制
御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記
載の非ヒト哺乳動物、（９）ゲッ歯動物がマウスである
第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および（１０）第
（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、薬剤耐性
遺伝子またはレポーター遺伝子の発現を検出することを
特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を
促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニン
グ方法を提供する。

【００６９】本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺
乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明
のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの
発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしてい
る本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させること
により、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能
を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称す
ることがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ
細胞と略記する）をいう。非ヒト哺乳動物としては、前
記と同様のものが用いられる。本発明のＤＮＡに人為的
に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手
法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡ
を挿入または置換させることによって行なうことができ
る。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠
をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を
破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製
すればよい。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺
乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細
胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の
具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が
有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネ
オマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を
代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレ
ポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能
を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に
遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌ
ｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャ
ーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺
伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮ
Ａ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）
を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入
し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるい
はその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブ
リダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクタ
ー上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使
用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプ
ライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノック
アウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができ
る。

【００７０】また、相同組換え法等により本発明のＤＮ
Ａを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述
のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知
のEvansとKaufmanの方法に準じて新しく樹立したもので
もよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般
的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学
的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で
免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するな
どの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ
／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善
したＢＤＦ_１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２との
Ｆ_１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。Ｂ
ＤＦ_１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫である
という利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持
つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマ
ウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバックク
ロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウス
に代えることが可能である点で有利に用い得る。また、
ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の
胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚
盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期
胚を取得することができる。また、雌雄いずれのＥＳ細
胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列
キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の
手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行
なうことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法として
は、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の
遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例として挙げる
ことができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析
をするのに約１０^６個の細胞数を要していたのに対し
て、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むの
で、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを
雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の
選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削
減できる。

【００７１】また、第二次セレクションとしては、例え
ば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により
行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常
数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の
関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウト
した後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ
＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ま
しい。このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その
増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすい
ので、注意深く継代培養することが必要である。例え
ば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上
でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス
培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気また
は５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で
培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、ト
リプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリ
プシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１
％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化
し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法な
どがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行
なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細
胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが
望まれる。ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至
るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで
浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの
種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M.
J. Evans及びM. H. Kaufman、ネイチャー（Nature）第
292巻、154頁、1981年；G. R. Martin、プロシージング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C.Doetschman
ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エ
クスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、19
85年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明
のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明の
タンパク質の細胞生物学的検討において有用である。本
発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲ
ＮＡ量を公知の方法を用いて測定して間接的にその発現
量を比較することにより、正常動物と区別することが可
能である。該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のも
のが用いられる。

【００７２】本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティン
グベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入
し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤ
ＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えに
より、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の
本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることに
より、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができ
る。本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発
明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブと
したサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッ
ティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティング
ベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の
近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法に
よる解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹
細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明
のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、そ
の細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動
物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠
させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された
動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変
異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成さ
れるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部
が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキ
メラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体
群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤ
ＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コート
カラーの判定等により選別することにより得られる。こ
のようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク
質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質の
ヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本
発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができ
る。卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマ
イクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入すること
によりターゲッティングベクターを染色体内に導入した
トランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、
これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、
遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のある
ものを選択することにより得られる。

【００７３】このようにして本発明のＤＮＡがノックア
ウトされている個体は、交配により得られた動物個体も
該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常
の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。さらに、
生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよ
い。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を
交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両
方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホ
モザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１、
ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することに
より効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物
の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有する
ホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代
する。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物
胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を
作出する上で、非常に有用である。また、本発明のＤＮ
Ａ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質によ
り誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明
のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病の
モデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治
療法の検討に有用である。

【００７４】（１０）本発明のＤＮＡの欠損や損傷など
に起因する疾病に対して予防・治療効果を有する化合物
のスクリーニング方法 本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤ
ＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病（例、低血糖症な
ど）に対して予防・治療効果を有する化合物のスクリー
ニングに用いることができる。すなわち、本発明は、本
発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投
与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とす
る、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に
対して予防・治療効果を有する化合物またはその塩のス
クリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法に
おいて用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動
物としては、前記と同様のものが挙げられる。試験化合
物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチ
ド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植
物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これ
ら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合
物であってもよい。具体的には、本発明のＤＮＡ発現不
全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対
照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状な
どの変化を指標として試験化合物の予防・治療効果を試
験することができる。試験動物を試験化合物で処理する
方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用い
られ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせ
て適宜選択することができる。また、試験化合物の投与
量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜
選択することができる。

【００７５】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物
であり、本発明のタンパク質の発現低下などによって引
き起こされる疾患（例、低血糖症など）に対して予防・
治療効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な
予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導
される化合物も同様に用いることができる。該スクリー
ニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよ
く、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸
（例、無機酸、有機酸）や塩基（例アルカリ金属）など
との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付
加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸
（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、
あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、
フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、
リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼ
ンスルホン酸）との塩などが用いられる。該スクリーニ
ング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬
は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様
にして製造することができる。このようにして得られる
製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは
温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサ
ギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルな
ど）に対して投与することができる。該化合物またはそ
の塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなど
により差異はあるが、例えば、低血糖症の治療目的で該
化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋ
ｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１
〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好
ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与
する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾
患などによっても異なるが、例えば、低血糖症の治療目
的で該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとし
て）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１
〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、
より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射によ
り投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０
ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。

【００７６】（１１）本発明のＤＮＡに対するプロモー
ターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニン
グ方法 本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、
試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出す
ることを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモータ
ーの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のス
クリーニング方法を提供する。上記スクリーニング方法
において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物とし
ては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入す
ることにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発
明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる
ものが用いられる。試験化合物としては、前記と同様の
ものが挙げられる。レポーター遺伝子としては、前記と
同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子
またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。本発明
のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮ
Ａ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本
発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在する
ので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレ
ースすることにより、プロモーターの活性を検出するこ
とができる。

【００７７】例えば、本発明のタンパク質をコードする
ＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明
のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の
代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例
えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラク
トシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することによ
り、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発
現状態を観察することができる。具体的には、本発明の
タンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルア
ルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢ
Ｓ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または
３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組
織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄すること
によって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色
を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコー
ドするｍＲＮＡを検出してもよい。

【００７８】上記スクリーニング方法を用いて得られる
化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれ
た化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター
活性を促進または阻害する化合物である。該スクリーニ
ング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、
無機酸）や塩基（例、有機酸）などとの塩が用いられ、
とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。こ
の様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リ
ン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例
えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン
酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安
息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との
塩などが用いられる。本発明のＤＮＡに対するプロモー
ター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のタ
ンパク質の発現を促進し、該タンパク質の活性を促進す
ることができるので、例えば、低血糖症などの疾病に対
する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として有用
である。一方、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活
性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク
質の発現を阻害し、該タンパク質の活性を阻害すること
ができるので、例えば、高血糖症、糖尿病などの疾病に
対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として有
用である。さらに、上記スクリーニングで得られた化合
物から誘導される化合物も同様に用いることができる。

【００７９】該スクリーニング方法で得られた化合物ま
たはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパ
ク質を含有する医薬と同様にして製造することができ
る。このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であ
るので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、ラッ
ト、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウ
シ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与するこ
とができる。該化合物またはその塩の投与量は、対象疾
患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例
えば、糖尿病の治療目的で本発明のＤＮＡに対するプロ
モーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一
般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日に
つき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約
１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ
投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回
投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、
例えば、糖尿病の治療目的で本発明のＤＮＡに対するプ
ロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成
人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化
合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１
〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程
度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動
物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与するこ
とができる。一方、例えば、低血糖症の治療目的で本発
明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物
を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとし
て）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１０
０ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましく
は約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場
合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患など
によっても異なるが、例えば、低血糖症の治療目的で本
発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合
物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与す
る場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程
度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましく
は約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するの
が好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。このように、本発
明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡ
に対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合
物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用で
あり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原
因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献すること
ができる。また、本発明のタンパク質のプロモーター領
域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパ
ク質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞
に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移
入動物）を作成すれば、特異的にそのタンパク質を合成
させ、その生体での作用を検討することも可能となる。
さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子
を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれ
ば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を
特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物
の探索系として使用できる。また該プロモーター部分を
解析することにより新たなシスエレメントやそれに結合
する転写因子を見つけることも可能である。

【００８０】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸

【００８１】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキ
サミド基 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｃｌ_２−Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニ
ル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニ
ル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェニル Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカル
ボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ
−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-
ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド

【００８２】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕ヒトＭＤ２５（ＶＬＣＡＤ）のアミノ
酸配列を示す。 〔配列番号：２〕ヒトＭＤ２５（ＶＬＣＡＤ）遺伝子
（ｃＤＮＡ）の塩基配列を示す。 〔配列番号：３〕実施例１で用いたプライマーの塩基配
列を示す。 〔配列番号：４〕実施例１で用いたプライマーの塩基配
列を示す。 〔配列番号：５〕ＩＲＡＰのＮ末端１０９個のアミノ酸
残基のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：６〕ＩＲＡＰのＮ末端１０９個のアミノ酸
残基のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示
す。 〔配列番号：７〕ＧＬＵＴ４の４６８〜５１０番目のア
ミノ酸残基のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号：８〕ＧＬＵＴ４の４６８〜５１０番目のア
ミノ酸残基のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配
列を示す。 〔配列番号：９〕ラットＶＬＣＡＤのアミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：１０〕マウスＶＬＣＡＤのアミノ酸配列を
示す。 〔配列番号：１１〕ウシＶＬＣＡＤのアミノ酸配列を示
す。後述の実施例１で得られたＭＤ２５のｃＤＮＡ塩基
配列（配列番号：２）を含有するプラスミドｐＴＢ２１
２４を保持する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escher
ichia coli）ＤＨ５α／ｐＴＢ２１２４は、２０００年
９月４日から茨城県つくば市東１丁目１番１号 中央第
６ 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セ
ンター（旧 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所（ＮＩＢＨ））に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７２９
０として、２０００年８月２４日から大阪府大阪市淀川
区十三本町２丁目１７−８５ 財団法人・発酵研究所
（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６４６９として寄託さ
れている。

【００８３】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではな
い。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular cloning）に記載され
ている方法に従った。

【００８４】実施例１ 酵母two-hybrid法によるＩＲＡ
Ｐ結合タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング Insulin responsive aminopeptidase (ＩＲＡＰ)に結合
するタンパク質をコードするｃＤＮＡは酵母two-hybrid
法によりクローニングした。酵母two-hybrid法は、基本
的にはClontech社製のMATCHMAKER two-hybrid systemを
用いて行った。ＩＲＡＰのアミノ酸残基５５から８２番
目のポリペプチド（Keller et al、 J. Biol. Chem.、
270、 23612-23618、 1995；配列番号：５のアミノ酸番
号５５〜８２）をコードするＤＮＡ断片を化学合成し、
これをＡＤＨ１プロモーター支配下でＧＡＬ４−ＤＮＡ
結合ドメイン（ＧＡＬ４−ＢＤ）を発現するプラスミド
ｐＧＢＴ９（Clontech社製）に融合させる形で挿入し、
これをｂａｉｔベクター、ｐＢａｉｔ−２とした。スク
リーニングするｃＤＮＡライブラリーはClontech社製の
ヒト骨格筋由来ｃＤＮＡライブラリーを用いた。このラ
イブラリーは、ＡＤＨ１プロモーター支配下でＧＡＬ４
転写活性化ドメイン（ＧＡＬ４−ＡＤ）に融合した形
で、ライブラリーｃＤＮＡが酵母内で発現されるように
構築されている。宿主酵母にはSaccharomyces cerevisi
ae Y190を用いた。この酵母株は、レポーター遺伝子と
してＧＡＬ１のＴＡＴＡ ｂｏｘとＵＡＳ（upstream ac
tivating sequences）に制御下にあるβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）とヒスチジン合成系遺伝子（Ｈ
ＩＳ３）をその染色体上に保持している。S. cerevisia
e Y190にｐＢａｉｔ−２（ＴＲＰ１マーカー）とヒト骨
格筋由来ｃＤＮＡライブラリープラスミド（ＬＥＵ２マ
ーカー）を導入し、両方のプラスミドを持ち、かつtwo-
hybridのレポーター遺伝子の一つであるＨＩＳ３を発現
している形質転換体酵母を最小培地である６０ｍＭ ３
−アミノトリアゾール添加ならびにトリプトファン、ロ
イシン、ヒスチジン非添加SD培地で選択した。選択され
た形質転換体コロニーをナイロン膜にレプリカ法で移
し、液体窒素による凍結・融解で酵母細胞壁を破砕した
後、Ｘ−Ｇａｌ（5-bromo-4-chloro-β-D-galactosid
e）で染色を行い、β−ガラクトシダーゼ活性を呈する
株を一次候補株とした。上記の手法で１０^７個以上のラ
イブラリーｃＤＮＡをスクリーニングし、１２クローン
の候補遺伝子を取得した。これらの酵母からザイモリエ
ース（生化学工業社製）を用いて細胞抽出液を調製し、
そのＤＮＡ画分を用いてロイシン要求性の大腸菌である
Escherichia coli ＨＢ１０１を形質転換した。形質転
換された大腸菌をロイシン不含Ｍ９培地に塗布し、ライ
ブラリープラスミド（ＬＥＵ２マーカー）を有する大腸
菌株を選択し、これらからプラスミドを抽出した。抽出
されたライブラリープラスミドとＩＲＡＰ ｂａｉｔベ
クターであるｐＢａｉｔ−２を用いて、再びS. cerevis
iae Y190を形質転換し、得られた形質転換体のヒスチジ
ン要求性ならびにβ−ガラクトシダーゼ活性を検査し、
再現性を示す５クローンを得た。これらのなかからβ−
ガラクトシダーゼ活性の強いクローン（ＭＤ２５株）を
選択した。ＭＤ２５の塩基配列はヒトvery-long chain
acyl-CoA dehydrogenase（Genbank D43682; 以下ＶＬＣ
ＡＤと称する）の一部と完全に一致した。一致した部分
はＶＬＣＡＤの全長６５５アミノ酸（配列番号：１）の
うち３６番目のアミノ酸から下流側であった。ＶＬＣＡ
ＤのＮ末端を含むｃＤＮＡ配列はヒト骨格筋ｃＤＮＡラ
イブラリーを鋳型とするpolymerase chain reaction
（ＰＣＲ）で得た。このＰＣＲに用いたプライマー配列
を以下に示す。 （１）5’-AGAGATTCGGAGATGCAGGCGGCT-3’ （配列番
号：３） （２）5’-AGGGTAATGCCCACGCCAAGGTCA-3’ （配列番
号：４） このＰＣＲ断片と酵母two-hybrid法によりクローニング
したＶＬＣＡＤの部分断片を制限酵素ＳｐｈＩの部分で
つなぎ合わせ、全長ＭＤ２５ ｃＤＮＡとした（ｐＴＢ
２１２４）。ＭＤ２５のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号：
２）ならびにアミノ酸配列（配列番号：１）を図１〜３
に示す。

【００８５】実施例２ β−ガラクトシダーゼ活性の測
定による結合活性の確認 ＭＤ２５のＩＲＡＰへの結合を定量的に確認するためＣ
ＰＲＧ（chlorophenolred-β-D-galactopyranoside）を
基質としたβ−ガラクトシダーゼ活性の測定を行った。
Ｂａｉｔとｐｒｅｙの両方のベクターを保持した酵母を
液体培養し、細胞を回収後、液体窒素による凍結・融解
で細胞壁を破砕した。この破砕された細胞の懸濁液にＣ
ＰＲＧを添加し、それらのサンプルの５７８ｎｍの吸光
度をβ−ガラクトシダーゼ活性として測定した。β−ガ
ラクトシダーゼの活性の単位は１分間に１個の酵母細胞
が１μｍｏｌのＣＰＲＧをchlorophenol redとD-galact
osideに加水分解する酵素活性を１単位とした。Ｂａｉ
ｔ配列にはＩＲＡＰ（５５−８２；配列番号：５のアミ
ノ酸番号５５〜８２）を、またｐｒｅｙ配列としてはＭ
Ｄ２５ ｃＤＮＡ配列のうち酵母two-hybrid法で直接単
離された配列（図１〜３の塩基番号１１８より３’側に
相当する配列）を用いた。さらに、ネガティブコントロ
ールとしてＧＡＬ４−ＢＤにｂａｉｔとする配列の融合
されていないものを発現するベクターｐＧＢＴ９を用い
た。これらの配列を持つプラスミドを用いてS. cerevis
iae Y190を形質転換し、再構築された酵母形質転換株の
β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。ＭＤ２５ ｃＤ
ＮＡを有する形質転換株はＩＲＡＰ（５５−８２）をｂ
ａｉｔとしたとき約１１単位のβ−ガラクトシダーゼ活
性を呈した。一方、ＧＡＬ４−ＢＤのみでｂａｉｔ配列
を持たないタンパク質に対しては殆ど結合活性を示さな
かった。なお、ｐｒｅｙ配列であるＭＤ２５ ｃＤＮＡ
を持たない株を用いた実験でのβ−ガラクトシダーゼ活
性の値は検出限界以下であった（図４）。

【００８６】実施例３ ヒスチジン非要求性試験 親株であるS. cerevisiae Y190は本来ヒスチジン要求性
の株であるが、ｂａｉｔとｐｒｅｙが結合した場合はレ
ポーター遺伝子の一つであるＨＩＳ３が発現するので、
酵母株はヒスチジン非要求性となる。ｂａｉｔとしてＩ
ＲＡＰを、またｐｒｅｙとしてＭＤ２５を導入した株は
４０ｍＭ ３−アミノトリアゾール添加ならびにトリプ
トファン、ロイシン、ヒスチジン非添加ＳＤ培地（最小
培地）で生育した。このことからＩＲＡＰとＭＤ２５は
結合することが確認された。

【００８７】実施例４ ＭＤ２５ ｍＲＮＡのヒト組織
における発現分布 ＭＤ２５ ｍＲＮＡのヒト組織における発現分布をノー
ザンブロッティングにより検出した。すなわち、ヒト各
組織のpoly (A)⁺ RNA（各２μｇ）に対しＭＤ２５ ｃＤ
ＮＡ（配列番号：３の塩基番４７９−２０４９）をプロ
ーブとしてノーザンブロッティングを行った。ヒトの各
組織のｍＲＮＡを転写されたナイロン膜はClontech社製
のMTN blot (human 12 lane)を用いた。^３２Ｐで標識し
たＭＤ２５ ｃＤＮＡプローブをストリンジェントな条
件でハイブリダイズならびに洗浄し、イメージアナライ
ザーＢＡＳ２０００ＩＩ（富士フィルム社製）で検出し
た。図５に示すように、ＭＤ２５ ｍＲＮＡは約２．４
ｋｂの長さで心臓、骨格筋、腎臓、肝臓で強く発現して
いることが認められた。

【００８８】

【発明の効果】本発明のタンパク質は心臓、骨格筋、腎
臓、肝臓で強い発現がみられる。本発明のタンパク質は
ＩＲＡＰと結合することにより、血糖値を上昇させるこ
とから、低血糖症の予防・治療剤として有用である。ま
た、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質とＩＲ
ＡＰまたはＧＬＵＴ４との結合を阻害するスクリーニン
グ方法に用いることができる。本発明のタンパク質とＩ
ＲＡＰもしくはＧＬＵＴ４との結合を阻害する化合物は
高血糖症、糖尿病などの疾病の予防・治療剤として有用
である。

【００８９】

〔SEQUENCE LISTING〕

<110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> IRAP Binding Protein <130> P2001-144 <150> JP 2000-254263 <151> 2000-08-21 <150> JP 2000-276633 <151> 2000-09-07 <160> 11 <210> 1 <211> 655 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Gln Ala Ala Arg Met Ala Ala Ser Leu Gly Arg Gln Leu Leu Arg 1 5 10 15 Leu Gly Gly Gly Ser Ser Arg Leu Thr Ala Leu Leu Gly Gln Pro Arg 20 25 30 Pro Gly Pro Ala Arg Arg Pro Tyr Ala Gly Gly Ala Ala Gln Leu Ala 35 40 45 Leu Asp Lys Ser Asp Ser His Pro Ser Asp Ala Leu Thr Arg Lys Lys 50 55 60 Pro Ala Lys Ala Glu Ser Lys Ser Phe Ala Val Gly Met Phe Lys Gly 65 70 75 80 Gln Leu Thr Thr Asp Gln Val Phe Pro Tyr Pro Ser Val Leu Asn Glu 85 90 95 Glu Gln Thr Gln Phe Leu Lys Glu Leu Val Glu Pro Val Ser Arg Phe 100 105 110 Phe Glu Glu Val Asn Asp Pro Ala Lys Asn Asp Ala Leu Glu Met Val 115 120 125 Glu Glu Thr Thr Trp Gln Gly Leu Lys Glu Leu Gly Ala Phe Gly Leu 130 135 140 Gln Val Pro Ser Glu Leu Gly Gly Val Gly Leu Cys Asn Thr Gln Tyr 145 150 155 160 Ala Arg Leu Val Glu Ile Val Gly Met His Asp Leu Gly Val Gly Ile 165 170 175 Thr Leu Gly Ala His Gln Ser Ile Gly Phe Lys Gly Ile Leu Leu Phe 180 185 190 Gly Thr Lys Ala Gln Lys Glu Lys Tyr Leu Pro Lys Leu Ala Ser Gly 195 200 205 Glu Thr Val Ala Ala Phe Cys Leu Thr Glu Pro Ser Ser Gly Ser Asp 210 215 220 Ala Ala Ser Ile Arg Thr Ser Ala Val Pro Ser Pro Cys Gly Lys Tyr 225 230 235 240 Tyr Thr Leu Asn Gly Ser Lys Leu Trp Ile Ser Asn Gly Gly Leu Ala 245 250 255 Asp Ile Phe Thr Val Phe Ala Lys Thr Pro Val Thr Asp Pro Ala Thr 260 265 270 Gly Ala Val Lys Glu Lys Ile Thr Ala Phe Val Val Glu Arg Gly Phe 275 280 285 Gly Gly Ile Thr His Gly Pro Pro Glu Lys Lys Met Gly Ile Lys Ala 290 295 300 Ser Asn Thr Ala Glu Val Phe Phe Asp Gly Val Arg Val Pro Ser Glu 305 310 315 320 Asn Val Leu Gly Glu Val Gly Ser Gly Phe Lys Val Ala Met His Ile 325 330 335 Leu Asn Asn Gly Arg Phe Gly Met Ala Ala Ala Leu Ala Gly Thr Met 340 345 350 Arg Gly Ile Ile Ala Lys Ala Val Asp His Ala Thr Asn Arg Thr Gln 355 360 365 Phe Gly Glu Lys Ile His Asn Phe Gly Leu Ile Gln Glu Lys Leu Ala 370 375 380 Arg Met Val Met Leu Gln Tyr Val Thr Glu Ser Met Ala Tyr Met Val 385 390 395 400 Ser Ala Asn Met Asp Gln Gly Ala Thr Asp Phe Gln Ile Glu Ala Ala 405 410 415 Ile Ser Lys Ile Phe Gly Ser Glu Ala Ala Trp Lys Val Thr Asp Glu 420 425 430 Cys Ile Gln Ile Met Gly Gly Met Gly Phe Met Lys Glu Pro Gly Val 435 440 445 Glu Arg Val Leu Arg Asp Leu Arg Ile Phe Arg Ile Phe Glu Gly Thr 450 455 460 Asn Asp Ile Leu Arg Leu Phe Val Ala Leu Gln Gly Cys Met Asp Lys 465 470 475 480 Gly Lys Glu Leu Ser Gly Leu Gly Ser Ala Leu Lys Asn Pro Phe Gly 485 490 495 Asn Ala Gly Leu Leu Leu Gly Glu Ala Gly Lys Gln Leu Arg Arg Arg 500 505 510 Ala Gly Leu Gly Ser Gly Leu Ser Leu Ser Gly Leu Val His Pro Glu 515 520 525 Leu Ser Arg Ser Gly Glu Leu Ala Val Arg Ala Leu Glu Gln Phe Ala 530 535 540 Thr Val Val Glu Ala Lys Leu Ile Lys His Lys Lys Gly Ile Val Asn 545 550 555 560 Glu Gln Phe Leu Leu Gln Arg Leu Ala Asp Gly Ala Ile Asp Leu Tyr 565 570 575 Ala Met Val Val Val Leu Ser Arg Ala Ser Arg Ser Leu Ser Glu Gly 580 585 590 His Pro Thr Ala Gln His Glu Lys Met Leu Cys Asp Thr Trp Cys Ile 595 600 605 Glu Ala Ala Ala Arg Ile Arg Glu Gly Met Ala Ala Leu Gln Ser Asp 610 615 620 Pro Trp Gln Gln Glu Leu Tyr Arg Asn Phe Lys Ser Ile Ser Lys Ala 625 630 635 640 Leu Val Glu Arg Gly Gly Val Val Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe 645 650 655 <210> 2 <211> 1965 <212> DNA <213> Human <400> 2 ATGCAGGCGG CTCGGATGGC CGCGAGCTTG GGGCGGCAGC TGCTGAGGCT CGGGGGCGGA 60 AGCTCGCGGC TCACGGCGCT CCTGGGGCAG CCCCGGCCCG GCCCTGCCCG GCGGCCCTAT 120 GCCGGGGGTG CCGCTCAGCT GGCTCTGGAC AAGTCAGATT CCCACCCCTC TGACGCTCTG 180 ACCAGGAAAA AACCGGCCAA GGCGGAATCT AAGTCCTTTG CTGTGGGAAT GTTCAAAGGC 240 CAGCTCACCA CAGATCAGGT GTTCCCATAC CCGTCCGTGC TCAACGAAGA GCAGACACAG 300 TTTCTTAAAG AGCTGGTGGA GCCTGTGTCC CGTTTCTTCG AGGAAGTGAA CGATCCCGCC 360 AAGAATGACG CTCTGGAGAT GGTGGAGGAG ACCACTTGGC AGGGCCTCAA GGAGCTGGGG 420 GCCTTTGGTC TGCAAGTGCC CAGTGAGCTG GGTGGTGTGG GCCTTTGCAA CACCCAGTAC 480 GCCCGTTTGG TGGAGATCGT GGGCATGCAT GACCTTGGCG TGGGCATTAC CCTGGGGGCC 540 CATCAGAGCA TCGGTTTCAA AGGCATCCTG CTCTTTGGCA CAAAGGCCCA GAAAGAAAAA 600 TACCTCCCCA AGCTGGCATC TGGGGAGACT GTGGCCGCTT TCTGTCTAAC CGAGCCCTCA 660 AGCGGGTCAG ATGCAGCCTC CATCCGAACC TCTGCTGTGC CCAGCCCCTG TGGAAAATAC 720 TATACCCTCA ATGGAAGCAA GCTTTGGATC AGTAATGGGG GCCTAGCAGA CATCTTCACG 780 GTCTTTGCCA AGACACCAGT TACAGATCCA GCCACAGGAG CCGTGAAGGA GAAGATCACA 840 GCTTTTGTGG TGGAGAGGGG CTTCGGGGGC ATTACCCATG GGCCCCCTGA GAAGAAGATG 900 GGCATCAAGG CTTCAAACAC AGCAGAGGTG TTCTTTGATG GAGTACGGGT GCCATCGGAG 960 AACGTGCTGG GTGAGGTTGG GAGTGGCTTC AAGGTTGCCA TGCACATCCT CAACAATGGA 1020 AGGTTTGGCA TGGCTGCGGC CCTGGCAGGT ACCATGAGAG GCATCATTGC TAAGGCGGTA 1080 GATCATGCCA CTAATCGTAC CCAGTTTGGG GAGAAAATTC ACAACTTTGG GCTGATCCAG 1140 GAGAAGCTGG CACGGATGGT TATGCTGCAG TATGTAACTG AGTCCATGGC TTACATGGTG 1200 AGTGCTAACA TGGACCAGGG AGCCACGGAC TTCCAGATAG AGGCCGCCAT CAGCAAAATC 1260 TTTGGCTCGG AGGCAGCCTG GAAGGTGACA GATGAATGCA TCCAAATCAT GGGGGGTATG 1320 GGCTTCATGA AGGAACCTGG AGTAGAGCGT GTGCTCCGAG ATCTTCGCAT CTTCCGGATC 1380 TTTGAGGGGA CAAATGACAT TCTTCGGCTG TTTGTGGCTC TGCAGGGCTG TATGGACAAA 1440 GGAAAGGAGC TCTCTGGGCT TGGCAGTGCT CTAAAGAATC CCTTTGGGAA TGCTGGCCTC 1500 CTGCTAGGAG AGGCAGGCAA ACAGCTGAGG CGGCGGGCAG GGCTGGGCAG CGGCCTGAGT 1560 CTCAGCGGAC TTGTCCACCC GGAGTTGAGT CGGAGTGGCG AGCTGGCAGT ACGGGCTCTG 1620 GAGCAGTTTG CCACTGTGGT GGAGGCCAAG CTGATAAAAC ACAAGAAGGG GATTGTCAAT 1680 GAACAGTTTC TGCTGCAGCG GCTGGCAGAC GGGGCCATCG ACCTCTATGC CATGGTGGTG 1740 GTTCTCTCGA GGGCCTCAAG ATCCCTGAGT GAGGGCCACC CCACGGCCCA GCATGAGAAA 1800 ATGCTCTGTG ACACCTGGTG TATCGAGGCT GCAGCTCGGA TCCGAGAGGG CATGGCCGCC 1860 CTGCAGTCTG ACCCCTGGCA GCAAGAGCTC TACCGCAACT TCAAAAGCAT CTCCAAGGCC 1920 TTGGTGGAGC GGGGTGGTGT GGTCACCAGC AACCCACTTG GCTTC 1965 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 AGAGATTCGG AGATGCAGGC GGCT 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 AGGGTAATGC CCACGCCAAG GTCA 24 <210> 5 <211> 109 <212> PRT <213> Human <400> 5 Met Glu Thr Phe Thr Asn Asp Arg Leu Gln Leu Pro Arg Asn Met Ile 1 5 10 15 Glu Asn Ser Met Phe Glu Glu Glu Pro Asp Val Val Asp Leu Ala Lys 20 25 30 Glu Pro Cys Leu His Pro Leu Glu Pro Asp Glu Val Glu Tyr Glu Pro 35 40 45 Arg Gly Ser Arg Leu Leu Val Arg Gly Leu Gly Glu His Glu Met Asp 50 55 60 Glu Asp Glu Glu Asp Tyr Glu Ser Ser Ala Lys Leu Leu Gly Met Ser 65 70 75 80 Phe Met Asn Arg Ser Ser Gly Leu Arg Asn Ser Ala Thr Gly Tyr Arg 85 90 95 Gln Ser Pro Asp Gly Thr Cys Ser Val Pro Ser Ala Arg 100 105 <210> 6 <211> 327 <212> DNA <213> Human <400> 6 ATGGAGACCT TTACCAATGA TCGACTTCAG CTTCCAAGGA ATATGATTGA AAACAGCATG 60 TTTGAAGAAG AACCAGATGT GGTAGATTTA GCCAAAGAAC CTTGTTTACA TCCTCTGGAA 120 CCTGATGAAG TTGAATATGA GCCCCGAGGT TCGAGGCTTC TGGTGAGAGG TCTTGGTGAG 180 CATGAGATGG ATGAGGATGA AGAGGATTAT GAGTCATCTG CCAAGCTGCT GGGCATGTCC 240 TTCATGAACA GAAGCTCAGG CCTTCGGAAC AGTGCAACAG GCTACAGGCA GAGTCCAGAT 300 GGGACTTGTT CAGTACCCTC TGCCAGG 327 <210> 7 <211> 43 <212> PRT <213> Human <400> 7 Lys Val Pro Glu Thr Arg Gly Arg Thr Phe Asp Gln Ile Ser Ala Ala 1 5 10 15 Phe Arg Arg Thr Pro Ser Leu Leu Glu Gln Glu Val Lys Pro Ser Thr 20 25 30 Glu Leu Glu Tyr Leu Gly Pro Asp Glu Asn Asp 35 40 <210> 8 <211> 129 <212> DNA <213> Human <400> 8 AAAGTGCCTG AAACCAGAGG CCGGACGTTT GACCAGATCT CAGCTGCCTT CCGACGGACA 60 CCTTCCCTTT TAGAGCAGGA GGTGAAACCC AGTACAGAAC TTGAATACTT AGGGCCAGAT 120 GAGAATGAC 129 <210> 9 <211> 653 <212> PRT <213> Rat <400> 9 Met Gln Ser Ala Arg Met Thr Pro Ser Val Gly Arg Gln Leu Leu Arg 1 5 10 15 Leu Gly Ala Arg Ser Ser Arg Ser Ala Ala Leu Gln Gly Gln Pro Arg 20 25 30 Pro Thr Ser Ala Gln Arg Leu Tyr Ala Ser Glu Ala Thr Gln Ala Val 35 40 45 Leu Glu Lys Pro Glu Thr Leu Ser Ser Asp Ala Ser Thr Arg Glu Lys 50 55 60 Pro Ala Arg Ala Glu Ser Lys Ser Phe Ala Val Gly Met Phe Lys Gly 65 70 75 80 Gln Leu Thr Thr Asp Gln Val Phe Pro Tyr Pro Ser Val Leu Asn Glu 85 90 95 Gly Gln Thr Gln Phe Leu Lys Glu Leu Val Gly Pro Val Ala Arg Phe 100 105 110 Phe Glu Glu Val Asn Asp Pro Ala Lys Asn Asp Ser Leu Glu Lys Val 115 120 125 Glu Glu Asp Thr Leu Gln Gly Leu Lys Glu Leu Gly Ala Phe Gly Leu 130 135 140 Gln Val Pro Ser Glu Leu Gly Gly Leu Gly Leu Ser Asn Thr Gln Tyr 145 150 155 160 Ala Arg Leu Ala Glu Ile Val Gly Met His Asp Leu Gly Val Ser Val 165 170 175 Thr Leu Gly Ala His Gln Ser Ile Gly Phe Lys Gly Ile Leu Leu Tyr 180 185 190 Gly Thr Lys Ala Gln Lys Glu Lys Tyr Leu Pro Arg Val Ala Ser Gly 195 200 205 Gln Ala Leu Ala Ala Phe Cys Leu Thr Glu Pro Ser Ser Gly Ser Asp 210 215 220 Val Ala Ser Ile Arg Ser Ser Ala Val Pro Ser Pro Cys Gly Lys Tyr 225 230 235 240 Tyr Thr Leu Asn Gly Ser Lys Ile Trp Ile Ser Asn Gly Gly Leu Ala 245 250 255 Asp Ile Phe Thr Val Phe Ala Lys Thr Pro Ile Lys Asp Ala Ala Thr 260 265 270 Gly Ala Val Lys Glu Lys Ile Thr Ala Phe Val Val Glu Arg Ser Phe 275 280 285 Gly Gly Val Thr His Gly Leu Pro Glu Lys Lys Met Gly Ile Lys Ala 290 295 300 Ser Asn Thr Ser Glu Val Tyr Phe Asp Gly Val Lys Val Pro Ala Glu 305 310 315 320 Asn Val Leu Gly Glu Val Gly Asp Gly Phe Lys Val Ala Val Asn Ile 325 330 335 Leu Asn Asn Gly Arg Phe Gly Met Ala Ala Thr Leu Ala Gly Thr Met 340 345 350 Lys Ala Ile Ile Ala Lys Ala Val Asp His Ala Thr Asn Arg Thr Gln 355 360 365 Phe Gly Asp Lys Ile His Asn Phe Gly Val Ile Gln Glu Lys Leu Ala 370 375 380 Arg Met Ala Ile Leu Gln Tyr Val Thr Glu Ser Met Ala Tyr Met Leu 385 390 395 400 Ser Ala Asn Met Asp Gln Gly Phe Lys Asp Phe Gln Ile Glu Ala Ala 405 410 415 Ile Ser Lys Ile Phe Gly Ser Glu Ala Ala Trp Lys Val Thr Asp Glu 420 425 430 Cys Ile Gln Ile Met Gly Gly Met Gly Phe Met Lys Glu Pro Gly Val 435 440 445 Glu Arg Val Leu Arg Asp Ile Arg Ile Phe Arg Ile Phe Glu Gly Thr 450 455 460 Asn Asp Ile Leu Arg Leu Phe Val Ala Leu Gln Gly Cys Met Asp Lys 465 470 475 480 Gly Lys Glu Leu Thr Gly Leu Gly Asn Ala Leu Lys Asn Pro Leu Gly 485 490 495 Asn Val Gly Leu Leu Ile Gly Glu Ala Ser Lys Gln Leu Arg Arg Arg 500 505 510 Thr Gly Ile Gly Ser Gly Leu Ser Leu Ser Gly Ile Val His Pro Glu 515 520 525 Leu Ser Arg Ser Gly Glu Leu Ala Val Gln Ala Leu Glu Gln Phe Ala 530 535 540 Thr Val Val Glu Ala Lys Leu Met Lys His Lys Lys Gly Ile Val Asn 545 550 555 560 Glu Gln Phe Leu Leu Gln Arg Leu Ala Asp Gly Ala Ile Asp Leu Tyr 565 570 575 Ala Met Val Val Val Leu Ser Arg Ala Ser Arg Ser Leu Ser Glu Gly 580 585 590 Tyr Pro Thr Ala Gln His Glu Lys Met Leu Cys Asp Ser Trp Cys Ile 595 600 605 Glu Ala Ala Thr Arg Ile Arg Glu Asn Met Ala Ser Leu Gln Ser Asn 610 615 620 Pro Gln Gln Gln Glu Leu Phe Arg Asn Phe Arg Ser Ile Ser Lys Ala 625 630 635 640 Met Val Glu Asn Gly Gly Leu Val Thr Ser Asn Pro Leu 645 650 653 <210> 10 <211> 655 <212> PRT <213> Mouse <400> 10 Met Gln Ser Ala Arg Met Thr Pro Ser Val Gly Arg Gln Leu Leu Arg 1 5 10 15 Leu Gly Ala Arg Ser Ser Arg Ser Thr Thr Val Leu Gln Gly Gln Pro 20 25 30 Arg Pro Ile Ser Ala Gln Arg Leu Tyr Ala Arg Glu Ala Thr Gln Ala 35 40 45 Val Leu Asp Lys Pro Glu Thr Leu Ser Ser Asp Ala Ser Thr Arg Glu 50 55 60 Lys Pro Ala Arg Ala Glu Ser Lys Ser Phe Ala Val Gly Met Phe Lys 65 70 75 80 Gly Gln Leu Thr Ile Asp Gln Val Phe Pro Tyr Pro Ser Val Leu Ser 85 90 95 Glu Glu Gln Ala Gln Phe Leu Lys Glu Leu Val Gly Pro Val Ala Arg 100 105 110 Phe Phe Glu Glu Val Asn Asp Pro Ala Lys Asn Asp Ala Leu Glu Lys 115 120 125 Val Glu Asp Asp Thr Leu Gln Gly Leu Lys Glu Leu Gly Ala Phe Gly 130 135 140 Leu Gln Val Pro Ser Glu Leu Gly Gly Leu Gly Leu Ser Asn Thr Gln 145 150 155 160 Tyr Ala Arg Leu Ala Glu Ile Val Gly Met His Asp Leu Gly Val Ser 165 170 175 Val Thr Leu Gly Ala His Gln Ser Ile Gly Phe Lys Gly Ile Leu Leu 180 185 190 Tyr Gly Thr Lys Ala Gln Arg Glu Lys Tyr Leu Pro Arg Val Ala Ser 195 200 205 Gly Gln Ala Leu Ala Ala Phe Cys Leu Thr Glu Pro Ser Ser Gly Ser 210 215 220 Asp Val Ala Ser Ile Arg Ser Ser Ala Ile Pro Ser Pro Cys Gly Lys 225 230 235 240 Tyr Tyr Thr Leu Asn Gly Ser Lys Ile Trp Ile Ser Asn Gly Gly Leu 245 250 255 Ala Asp Ile Phe Thr Val Phe Ala Lys Thr Pro Ile Lys Asp Ala Ala 260 265 270 Thr Gly Ala Val Lys Glu Lys Ile Thr Ala Phe Val Val Glu Arg Ser 275 280 285 Phe Gly Gly Val Thr His Gly Leu Pro Glu Lys Lys Met Gly Ile Lys 290 295 300 Ala Ser Asn Thr Ser Glu Val Tyr Phe Asp Gly Val Lys Val Pro Ser 305 310 315 320 Glu Asn Val Leu Gly Glu Val Gly Asp Gly Phe Lys Val Ala Val Asn 325 330 335 Ile Leu Asn Asn Gly Arg Phe Gly Met Ala Ala Thr Leu Ala Gly Thr 340 345 350 Met Lys Ser Leu Ile Ala Lys Ala Val Asp His Ala Thr Asn Arg Thr 355 360 365 Gln Phe Gly Asp Lys Ile His Asn Phe Gly Val Ile Gln Glu Lys Leu 370 375 380 Ala Arg Met Ala Ile Leu Gln Tyr Val Thr Glu Ser Met Ala Tyr Met 385 390 395 400 Leu Ser Ala Asn Met Asp Gln Gly Phe Lys Asp Phe Gln Ile Glu Ala 405 410 415 Ala Ile Ser Lys Ile Phe Cys Ser Glu Ala Ala Trp Lys Val Ala Asp 420 425 430 Glu Cys Ile Gln Ile Met Gly Gly Met Gly Phe Met Lys Glu Pro Gly 435 440 445 Val Glu Arg Val Leu Arg Asp Ile Arg Ile Phe Arg Ile Phe Glu Gly 450 455 460 Ala Asn Asp Ile Leu Arg Leu Phe Val Ala Leu Gln Gly Cys Met Asp 465 470 475 480 Lys Gly Lys Glu Leu Thr Gly Leu Gly Asn Ala Leu Lys Asn Pro Phe 485 490 495 Gly Asn Val Gly Leu Leu Met Gly Glu Ala Gly Lys Gln Leu Arg Arg 500 505 510 Arg Thr Gly Ile Gly Ser Gly Leu Ser Leu Ser Gly Ile Val His Pro 515 520 525 Glu Leu Ser Arg Ser Gly Glu Leu Ala Val Gln Ala Leu Asp Gln Phe 530 535 540 Ala Thr Val Val Glu Ala Lys Leu Val Lys His Lys Lys Gly Ile Val 545 550 555 560 Asn Glu Gln Phe Leu Leu Gln Arg Leu Ala Asp Gly Ala Ile Asp Leu 565 570 575 Tyr Ala Met Val Val Val Leu Ser Arg Ala Ser Arg Ser Leu Ser Glu 580 585 590 Gly Tyr Pro Thr Ala Gln His Glu Lys Met Leu Cys Asp Ser Trp Cys 595 600 605 Ile Glu Ala Ala Thr Arg Ile Arg Glu Asn Met Ala Ser Leu Gln Ser 610 615 620 Ser Pro Gln His Gln Glu Leu Phe Arg Asn Phe Arg Ser Ile Ser Lys 625 630 635 640 Ala Met Val Glu Asn Gly Gly Leu Val Thr Gly Asn Pro Leu Gly 645 650 655 <210> 11 <211> 655 <212> PRT <213> Bovine <400> 11 Met Gln Ala Ala Arg Met Thr Ala Ser Leu Gly Arg Thr Leu Leu Arg 1 5 10 15 Leu Arg Gly Val Ser Ser Trp Pro Gly Glu Leu Leu Gly Gln Pro Arg 20 25 30 Pro Gly Pro Ala Pro Arg Pro Tyr Ala Ser Gly Val Ala Gln Ala Ala 35 40 45 Val Asp Gln Ser Asp Ser Gln Pro Ser Glu Ala Ser Thr Arg Glu Lys 50 55 60 Arg Ala Asn Ser Val Ser Lys Ser Phe Ala Val Gly Thr Phe Lys Gly 65 70 75 80 Gln Leu Thr Thr Asp Gln Val Phe Pro Tyr Pro Ser Val Leu Asn Glu 85 90 95 Asp Gln Thr Gln Phe Leu Lys Glu Leu Val Gly Pro Val Thr Arg Phe 100 105 110 Phe Glu Glu Val Asn Asp Ala Ala Lys Asn Asp Met Leu Glu Arg Val 115 120 125 Glu Glu Thr Thr Met Gln Gly Leu Lys Glu Leu Gly Ala Phe Gly Leu 130 135 140 Gln Val Pro Asn Glu Leu Gly Gly Val Gly Leu Cys Asn Thr Gln Tyr 145 150 155 160 Ala Arg Leu Val Glu Ile Val Gly Met Tyr Asp Leu Gly Val Gly Ile 165 170 175 Val Leu Gly Ala His Gln Ser Ile Gly Phe Lys Gly Ile Leu Leu Phe 180 185 190 Gly Thr Lys Ala Gln Lys Glu Lys Tyr Leu Pro Lys Leu Ala Ser Gly 195 200 205 Glu Thr Ile Ala Ala Phe Cys Leu Thr Glu Pro Ser Ser Gly Ser Asp 210 215 220 Ala Ala Ser Ile Arg Ser Ser Ala Val Pro Ser Pro Cys Gly Lys Tyr 225 230 235 240 Tyr Thr Leu Asn Gly Ser Lys Ile Trp Ile Ser Asn Gly Gly Leu Ala 245 250 255 Asp Ile Phe Thr Val Phe Ala Lys Thr Pro Val Thr Asp Thr Ala Thr 260 265 270 Gly Ala Val Lys Glu Lys Ile Thr Ala Phe Val Val Glu Arg Ser Phe 275 280 285 Gly Gly Val Thr His Gly Pro Pro Glu Lys Lys Met Gly Ile Lys Ala 290 295 300 Ser Asn Thr Ala Glu Val Tyr Phe Asp Gly Val Arg Val Pro Ala Glu 305 310 315 320 Asn Val Leu Gly Glu Val Gly Gly Gly Phe Lys Val Ala Met His Ile 325 330 335 Leu Asn Asn Gly Arg Phe Gly Met Ala Ala Ala Leu Ala Gly Thr Met 340 345 350 Lys Gly Ile Ile Ala Lys Ala Val Asp His Ala Ala Asn Arg Thr Gln 355 360 365 Phe Gly Glu Lys Ile His Asn Phe Gly Leu Ile Gln Glu Lys Leu Ala 370 375 380 Arg Met Ala Met Leu Gln Tyr Val Thr Glu Ser Met Ala Tyr Met Val 385 390 395 400 Ser Ala Asn Met Asp Gln Gly Ser Thr Asp Phe Gln Ile Glu Ala Ala 405 410 415 Ile Ser Lys Ile Phe Gly Ser Glu Ala Ala Trp Lys Val Thr Asp Glu 420 425 430 Cys Ile Gln Ile Met Gly Gly Met Gly Phe Met Lys Glu Pro Gly Val 435 440 445 Glu Arg Val Leu Arg Asp Leu Arg Ile Phe Arg Ile Phe Glu Gly Thr 450 455 460 Asn Asp Ile Leu Arg Leu Phe Val Ala Leu Gln Gly Cys Met Asp Lys 465 470 475 480 Gly Lys Glu Leu Ser Gly Leu Gly Asn Ala Leu Lys Asn Pro Phe Gly 485 490 495 Asn Ala Gly Leu Leu Leu Gly Glu Ala Gly Lys Gln Leu Arg Arg Arg 500 505 510 Ala Gly Leu Gly Ser Gly Leu Ser Leu Ser Gly Ile Val His Gln Glu 515 520 525 Leu Ser Arg Ser Gly Glu Leu Ala Val Gln Ala Leu Glu Gln Phe Ala 530 535 540 Thr Val Val Glu Ala Lys Leu Ile Lys His Lys Lys Asp Ile Ile Asn 545 550 555 560 Glu Gln Phe Leu Leu Gln Arg Leu Ala Asp Ser Ala Ile Asp Leu Tyr 565 570 575 Ala Met Val Val Val Leu Ser Arg Ala Ser Arg Ser Leu Ser Glu Gly 580 585 590 His Pro Thr Ala Gln His Glu Lys Met Leu Cys Asp Ser Trp Cys Ile 595 600 605 Glu Ala Ala Ala Arg Ile Arg Glu Asn Met Thr Ala Leu Gln Ser Asp 610 615 620 Pro Gln Gln Gln Glu Leu Phe Arg Asn Phe Lys Ser Ile Ser Lys Ala 625 630 635 640 Leu Val Glu Arg Gly Gly Val Val Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe 645 650 655

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＶＬＣＡＤ（ＭＤ２５）遺伝子（ｃＤＮ
Ａ）の塩基配列ならびに予想されるアミノ酸配列を示
す。（図２へ続く）

【図２】ヒトＶＬＣＡＤ（ＭＤ２５）遺伝子（ｃＤＮ
Ａ）の塩基配列ならびに予想されるアミノ酸配列を示
す。（図１の続き、図３へ続く）

【図３】ヒトＶＬＣＡＤ（ＭＤ２５）遺伝子（ｃＤＮ
Ａ）の塩基配列ならびに予想されるアミノ酸配列を示
す。

【図４】β−ガラクトシダーゼ活性の定量によるＩＲＡ
ＰとＶＬＣＡＤの相互作用を示す。図中、ｂａｉｔの−
はＧＡＬ４−ＤＮＡＢＤ配列のみを、ＩＲＡＰはこれに
ＩＲＡＰ（５５−８２）を融合させた配列を示す。ま
た、ｐｒｅｙの−はｐｒｅｙベクターなしのコントロー
ルを、ＭＤ２５はＧＡＬ４−ＡＤにＶＬＣＡＤの１１８
番目の塩基以降を融合した配列を示す。ＩＲＡＰ／ＭＤ
２５では有意にβ−ガラクトシダーゼ活性が認められ
る。結果の値はβガラクトシダーゼ活性単位（平均値±
標準偏差）である。

【図５】ＭＤ２５ ｍＲＮＡの組織分布を示す。図中、b
rainは脳、heartは心臓、skeletal muscleは骨格筋、co
lonは結腸、thymusは胸腺、spleenは脾臓、kidneyは腎
臓、liverは肝臓、small intestineは小腸、placentaは
胎盤、lungは肺、leulocyuteは白血球を示す。なお、Ｒ
ＮＡのサイズ（ｋｂ）は左端に表示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８６ 45/00 Ａ６１Ｐ 3/10 ４Ｈ０４５ 48/00 5/48 Ａ６１Ｐ 3/10 5/50 5/48 43/00 １１１ 5/50 Ｃ１２Ｑ 1/02 43/00 １１１ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/02 33/50 37/64 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA07 CA11 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA11 4B063 QA01 QA08 QA18 QQ05 QQ13 QQ30 QR15 QR33 QR57 QR60 QR62 QR74 QR80 QS05 QS36 QX02 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 CA53 CA56 DC32 NA14 ZC022 ZC202 ZC352 4C085 AA13 AA14 BB11 BB22 DD62 DD63 EE01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZC02 ZC19 ZC20 ZC35 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA00 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (51)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 インシュリン・レスポンシブ・アミノペ
   プチダーゼもしくはグルコーストランスポーター４に結
   合する配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もし
   くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質
   またはその塩。
2. 【請求項２】 請求項１記載のタンパク質またはその塩
   を含有してなる医薬。
3. 【請求項３】 請求項１記載のタンパク質をコードする
   ＤＮＡを含有するＤＮＡを含有してなる医薬。
4. 【請求項４】 インシュリン・レスポンシブ・アミノペ
   プチダーゼもしくはグルコーストランスポーター４への
   結合剤である請求項２または３記載の医薬。
5. 【請求項５】 低血糖症予防・治療剤である請求項２ま
   たは３記載の医薬。
6. 【請求項６】 請求項１記載のタンパク質をコードする
   ＤＮＡを含有するＤＮＡを含有してなる診断剤。
7. 【請求項７】 非ヒト哺乳動物に対して、請求項１記載
   のタンパク質またはその塩の有効量を投与することを特
   徴とする低血糖症の予防・治療方法。
8. 【請求項８】 低血糖症の予防・治療剤を製造するため
   の請求項１記載のタンパク質またはその塩の使用。
9. 【請求項９】 請求項１記載のタンパク質をコードする
   ＤＮＡの塩基配列に相補もしくは実質的に相補的な塩基
   配列またはその一部を含有するアンチセンスＤＮＡを含
   有してなる医薬。
10. 【請求項１０】 請求項１記載のタンパク質またはその
    塩に対する抗体を含有してなる医薬。
11. 【請求項１１】 高血糖症または糖尿病の予防・治療剤
    である請求項９または１０記載の医薬。
12. 【請求項１２】 非ヒト哺乳動物に対して、請求項１記
    載のタンパク質またはその塩に対する抗体の有効量を投
    与することを特徴とする高血糖症または糖尿病の予防・
    治療方法。
13. 【請求項１３】 高血糖症または糖尿病の予防・治療剤
    を製造するための請求項１記載のタンパク質またはその
    塩に対する抗体の使用。
14. 【請求項１４】 請求項１記載のタンパク質またはその
    塩に対する抗体を含有してなる診断剤。
15. 【請求項１５】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列
    と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
    タンパク質、その部分ペプチド、またはその塩を用いる
    ことを特徴とする、血糖増加作用または血糖低下作用を
    有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
16. 【請求項１６】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列
    と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
    タンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ
    を含有するＤＮＡを用いることを特徴とする、血糖増加
    作用または血糖低下作用を有する化合物またはその塩の
    スクリーニング方法。
17. 【請求項１７】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列
    と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
    タンパク質、その部分ペプチド、またはその塩を含有し
    てなる、血糖増加作用または血糖低下作用を有する化合
    物またはその塩のスクリーニング用キット。
18. 【請求項１８】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列
    と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
    タンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ
    を含有するＤＮＡを含有してなる、血糖増加作用または
    血糖低下作用を有する化合物またはその塩のスクリーニ
    ングキット。
19. 【請求項１９】 請求項１５もしくは１６記載のスクリ
    ーニング方法または請求項１７もしくは１８記載のスク
    リーニング用キットを用いて得られうる、血糖増加作用
    を有する化合物またはその塩。
20. 【請求項２０】 請求項１９記載の化合物またはその塩
    を含有してなる医薬。
21. 【請求項２１】 低血糖症の予防・治療剤である請求項
    ２０記載の医薬。
22. 【請求項２２】 請求項１５もしくは１６記載のスクリ
    ーニング方法または請求項１７もしくは１８記載のスク
    リーニング用キットを用いて得られうる、血糖低下作用
    を有する化合物またはその塩。
23. 【請求項２３】 請求項２２記載の化合物またはその塩
    を含有してなる医薬。
24. 【請求項２４】 高血糖症または糖尿病の予防・治療剤
    である請求項２３記載の医薬。
25. 【請求項２５】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列
    と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
    タンパク質、その部分ペプチド、またはその塩を用いる
    ことを特徴とする、配列番号：１で表されるアミノ酸配
    列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
    るタンパク質、その部分ペプチド、またはその塩とイン
    シュリン・レスポンシブ・アミノペプチダーゼもしくは
    グルコーストランスポーター４との結合を促進または阻
    害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
26. 【請求項２６】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列
    と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
    タンパク質またはその部分ペプチドを産生する能力を有
    する細胞を用いることを特徴とする請求項２５記載のス
    クリーニング方法。
27. 【請求項２７】 一方が固相に固定化された、配列番
    号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に
    同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペ
    プチド、またはその塩と標識したインシュリン・レス
    ポンシブ・アミノペプチダーゼもしくはグルコーストラ
    ンスポーター４との複合体に、試験化合物を添加し、遊
    離物を検出することを特徴とする請求項２５記載のスク
    リーニング方法。
28. 【請求項２８】 レポーター遺伝子結合ドメインを融
    合させたインシュリン・レスポンシブ・アミノペプチダ
    ーゼの細胞質側ドメインに相当する部分ペプチドもしく
    はグルコーストランスポーター４の細胞質内ドメインに
    相当する部分ペプチドをコードするＤＮＡとレポータ
    ー遺伝子転写活性ドメインが融合した配列番号：１で表
    されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ
    ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド
    をコードするＤＮＡで形質転換した細胞を試験化合物の
    存在下および非存在下に培養し、それぞれの場合におけ
    るレポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする
    請求項２５記載のスクリーニング方法。
29. 【請求項２９】 インシュリン・レスポンシブ・アミノ
    ペプチダーゼの細胞質側ドメインに相当する部分ペプチ
    ドが配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第５５〜８
    ２番目のアミノ酸配列を含有する部分ペプチドで、グル
    コーストランスポーター４の細胞質内ドメインに相当す
    る部分ペプチドが配列番号：７で表されるアミノ酸配列
    を含有する部分ペプチドである請求項２８記載のスクリ
    ーニング方法。
30. 【請求項３０】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列
    と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
    タンパク質、その部分ペプチド、またはその塩を含有す
    る、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしく
    は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、
    その部分ペプチド、またはその塩とインシュリン・レス
    ポンシブ・アミノペプチダーゼもしくはグルコーストラ
    ンスポーター４との結合を阻害する化合物またはその塩
    のスクリーニング用キット。
31. 【請求項３１】 請求項２５〜２９記載のスクリーニン
    グ方法、または請求項３０記載のスクリーニング用キッ
    トを用いて得られうる、配列番号：１で表されるアミノ
    酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含
    有するタンパク質、その部分ペプチド、またはその塩と
    インシュリン・レスポンシブ・アミノペプチダーゼもし
    くはグルコーストランスポーター４との結合を阻害する
    化合物またはその塩。
32. 【請求項３２】 請求項３１記載の化合物またはその塩
    を含有してなる医薬。
33. 【請求項３３】 高血糖症または糖尿病の予防・治療剤
    である請求項３２記載の医薬。
34. 【請求項３４】 非ヒト哺乳動物に対して、請求項３１
    記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特
    徴とする高血糖症または糖尿病の予防・治療方法。
35. 【請求項３５】 高血糖症または糖尿病の予防・治療剤
    を製造するための請求項３１記載の化合物またはその塩
    の使用。
36. 【請求項３６】 請求項２５〜２９記載のスクリーニン
    グ方法、または請求項３０記載のスクリーニング用キッ
    トを用いて得られる、配列番号：１で表されるアミノ酸
    配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有
    するタンパク質、その部分ペプチド、またはその塩とイ
    ンシュリン・レスポンシブ・アミノペプチダーゼもしく
    はグルコーストランスポーター４との結合を促進する化
    合物またはその塩。
37. 【請求項３７】 請求項３６記載の化合物またはその塩
    を含有してなる医薬。
38. 【請求項３８】 低血糖症の予防・治療剤である請求項
    ３７記載の医薬。
39. 【請求項３９】 非ヒト哺乳動物に対して、請求項３６
    記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特
    徴とする低血糖症の予防・治療方法。
40. 【請求項４０】 低血糖症の予防・治療剤を製造するた
    めの請求項３６記載の化合物またはその塩の使用。
41. 【請求項４１】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列
    と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
    タンパク質またはその塩を用いることを特徴とする、当
    該タンパク質の発現を促進または抑制する化合物または
    その塩のスクリーニング方法。
42. 【請求項４２】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列
    と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
    タンパク質をコードするＤＮＡの転写調節領域にレポー
    ター遺伝子を融合させたＤＮＡで形質転換した細胞を試
    験化合物の存在下および非存在下に培養し、それぞれの
    場合におけるレポーター遺伝子の発現を検出することを
    特徴とする請求項４１記載のスクリーニング方法。
43. 【請求項４３】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列
    と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
    タンパク質またはその塩を含有してなる、当該タンパク
    質の発現を促進または抑制する化合物またはその塩のス
    クリーニング用キット。
44. 【請求項４４】 請求項４１または４２記載のスクリー
    ニング方法または請求項４３記載のスクリーニング用キ
    ットを用いて得られうる、配列番号：１で表されるアミ
    ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を
    含有するタンパク質の発現を抑制する化合物またはその
    塩。
45. 【請求項４５】 請求項４４記載の化合物またはその塩
    を含有してなる医薬。
46. 【請求項４６】 高血糖症または糖尿病の予防・治療剤
    である請求項４５記載の医薬。
47. 【請求項４７】 請求項４１または４２記載のスクリー
    ニング方法または請求項４３記載のスクリーニング用キ
    ットを用いて得られうる、配列番号：１で表されるアミ
    ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を
    含有するタンパク質の発現を促進する化合物またはその
    塩。
48. 【請求項４８】 請求項４７記載の化合物またはその塩
    を含有してなる医薬。
49. 【請求項４９】 低血糖症の予防・治療剤である請求項
    ４８記載の医薬。
50. 【請求項５０】 非ヒト哺乳動物に対して、請求項４７
    記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特
    徴とする低血糖症の予防・治療方法。
51. 【請求項５１】 低血糖症の予防・治療剤を製造するた
    めの請求項４７記載の化合物またはその塩の使用。