JP2001228146A

JP2001228146A - 疾患関連遺伝子の用途

Info

Publication number: JP2001228146A
Application number: JP2000371711A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Nakanishi; 淳中西; Shigeru Morita; 滋森田
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-12-07
Filing date: 2000-12-06
Publication date: 2001-08-24

Abstract

(57)【要約】【課題】疾患関連遺伝子産物の活性を阻害する化合物の
スクリーニング方法の提供など。【解決手段】疾患関連遺伝子産物の活性を阻害する化合
物のスクリーニング方法、該スクリーニング方法によっ
て得られる化合物など。【効果】配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一も
しくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質
を用いて、該タンパク質の活性を阻害する化合物を選択
することができる。選択された化合物は、例えば気管支
喘息、慢性閉塞性肺疾患などの疾病の予防・治療剤とし
て使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、疾患関連遺伝子の
用途に関する。さらに詳しくは、気管支喘息や慢性閉塞
性肺疾患などの診断マーカーとして有用な疾患関連遺伝
子産物を用いる薬剤のスクリーニング方法などに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】気管支喘息は気道の慢性炎症性疾患であ
り、気道狭窄を示し、発作性の呼吸困難、喘鳴、咳など
の症状が見られる。その発症と進展には気道上皮細胞、
肥満細胞、好酸球、Tリンパ球などの多くの細胞が関与
している。気管支喘息の最も重要な特徴の１つは、気道
が刺激に対して反応しやすいこと（気道過敏性）であ
る。この気道過敏性は、好酸球など気道に浸潤した細胞
から分泌される化学伝達物質による気道上皮の剥離を中
心とする気道の炎症に起因するが、さらに、遺伝因子や
環境因子も複雑に影響していると考えられている。外界
からの刺激（アレルゲン、排気物）やウイルス感染によ
り気道の炎症反応の引き金が引かれると、気道上皮細胞
や気管支周辺の毛細血管内皮細胞上にVCAM-1やICAM-1な
どの接着分子が発現し［ジャーナルオブアラジー
アンドクリニカルイムノロジー（Ｊ．Ａｌｌｅｒ
ｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、９６巻、９４
１項（１９９５）］、サイトカインや化学遊走物質が産
生される。気管支喘息の患者はＴｈ２型のヘルパーT細
胞の機能が亢進しており、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−
５、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦなどのＴｈ２型のサイト
カインやｅｏｔａｘｉｎ、ＲＡＮＴＥＳなどのケモカイ
ンの産生が増加する。ＩＬ−４やＩＬ−１３はＩｇＥの
産生誘導作用があり、ＩＬ−３やＩＬ−４は肥満細胞の
増殖誘導作用がある。さらに、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦ
などの作用により好酸球が分化増殖し、ｅｏｔａｘｉ
ｎ、ＲＡＮＴＥＳにより気道に浸潤してくる［アラジー
アンドアズマプロシーディング（Ａｌｌｅｒｇｙ
ＡｓｔｈｍａＰｒｏｃ．）、２０巻、１４１項（１
９９９）］。気管・気管支の粘膜を覆っている上皮細胞
は外界からの刺激が直接粘膜下組織に伝わるのを防ぐバ
リヤーの機能、分泌物や異物の排泄機能を持つだけでな
く、上皮由来平滑筋弛緩因子の分泌などによって気管の
収縮を制御している。気管支喘息患者の気道に浸潤して
きた好酸球は、活性化されＭＢＰ（主要塩基性蛋白）や
ＥＣＰ（好酸球陽イオン蛋白）などの細胞内の顆粒蛋白
を脱顆粒により放出する［コンプリヘンシブセラピー
（Ｃｏｍｐｒ．Ｔｈｅｒ．）、２０巻、６５１頁（１９
９４）］。これら顆粒蛋白の細胞傷害作用により上皮細
胞の剥離・損傷が起こる。上皮細胞の剥離は知覚神経末
端の露出、上皮透過性の亢進、上皮由来平滑筋弛緩因子
の喪失につながる。また、好酸球が産生するロイコトリ
エンＣ４（ＬＴＣ４）や血小板活性化因子（ＰＡＦ）は
気管支平滑筋の緊張を亢進する。以上のような変化が繰
り返されて慢性化すると、気管支壁が肥厚し、気道過敏
性につながると考えられる。以上のように、気道の炎症
に伴って上述したサイトカインや接着分子の遺伝子の発
現が上昇することが知られているが、肺・気管支の病変
部位に発現が限局し気道過敏性の成立と関連がある遺伝
子の変動を体系的に解析した報告はない。

【０００３】一方、クロライドトランスポーターなどの
アニオントランスポーターが気管支喘息などの疾患に関
与しているという報告も未だない。本発明で用いられる
ヒト由来ｃＤＮＡおよびタンパク質ならびにマウス由来
ｃＤＮＡおよびタンパク質は文献に記載されている［ネ
イチャー・ジェネティックス(Nature Genetics) 第１７
巻、４１１頁、1997年；プロシーディングスオブザ
ナショナルアカデミーオブサイエンシスユー
エスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ）第９６巻、９７２７頁、１９９９年］が、
ペンドレッド症候群（先天的に耳が聞こえない患者の10
%以上を占める）の原因遺伝子として報告されているの
みで、気管支喘息や慢性閉塞性肺疾患などとの関連に関
する記載は全くない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、気道過敏性
が亢進した肺・気管支において発現が上昇するタンパク
質の活性を阻害する化合物のスクリーニング方法、該ス
クリーニング方法で得られる化合物などを提供する。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、マウス喘息
モデルの肺・気管支において発現が顕著に増加する遺伝
子を見出した。この遺伝子の発現パターンを詳細に検討
した結果、気道過敏性の亢進や好酸球の浸潤に先立って
発現誘導されることを明らかにした。本発明者らは、こ
れらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発
明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、（１）配列番号：１
で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の
アミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプ
チドまたはその塩を用いることを特徴とする、配列番
号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に
同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部
分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物または
その塩のスクリーニング方法、（２）配列番号：１で表
されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が配
列番号：２で表されるアミノ酸配列である上記（１）記
載のスクリーニング方法、（３）配列番号：１で表され
るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸
配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまた
はその塩が、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同
一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有
するＤＮＡで形質転換された形質転換体の細胞膜上に発
現されたものである上記（１）記載のスクリーニング方
法、（４）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一
もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク
質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有するこ
とを特徴とする、配列番号：１で表されるアミノ酸配列
と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタ
ンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性
を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キッ
ト、（５）上記（１）記載のスクリーニング方法または
上記（４）記載のスクリーニング用キットを用いて得ら
れる、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もし
くは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質も
しくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する
化合物またはその塩、（６）上記（５）記載の化合物ま
たはその塩を含有してなる医薬、（７）気管支喘息また
は慢性閉塞性肺疾患の予防・治療剤である上記（６）記
載の医薬、（８）アニオントランスポーター阻害作用を
有する化合物またはその塩を含有してなる気管支喘息ま
たは慢性閉塞性肺疾患の予防・治療剤、（９）配列番
号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に
同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部
分ペプチドまたはその塩に対する抗体、（１０）上記
（９）記載の抗体を含有してなる診断薬、（１１）上記
（５）記載の化合物またはその塩を投与することを特徴
とする肺・胸部疾患の予防または治療方法、（１２）上
記（９）記載の抗体を使用することを特徴とする肺・胸
部疾患の診断方法などを提供する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明で用いられる配列番号：１
で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の
アミノ酸配列を有するタンパク質（以下、本発明のタン
パク質と称する場合もある）は、ヒトや温血動物（例え
ば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、
ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細
胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄
細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細
胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽
細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マ
クロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細
胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨
核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細
胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら
細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしく
はそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、
脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視
床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂
体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、
骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小
腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立
腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに
由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質で
あってもよい。

【０００８】配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表
されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０
％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましく
は約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好
ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列な
どが挙げられる。配列番号：１で表されるアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質とし
ては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と
実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表
されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質
の活性を有するタンパク質などが好ましい。実質的に同
質の活性としては、例えば、クロライド／イオダイドト
ランスポーター活性（クロライドトランスポーター活性
と称することもある）などのアニオントランスポーター
活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性
質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同
質であることを示す。したがって、例えばクロライド／
イオダイドトランスポーター活性などのアニオントラン
スポーター活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好
ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２
倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タ
ンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよ
い。例えば、クロライド／イオダイドトランスポーター
活性は、自体公知の方法、例えば、ネイチャー・ジェネ
ティックス（Nature Genetics）第２１巻、４４０頁、
１９９９年に記載の方法またはそれに準じる方法に従っ
て測定することができる。配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質としては、例えば、配列番号：２で表されるアミノ
酸配列を有するタンパク質などがあげられる。

【０００９】また、本発明で用いられるタンパク質とし
ては、例えば、配列番号：１または配列番号：２で表
されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましく
は、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さら
に好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したア
ミノ酸配列、配列番号：１または配列番号：２で表さ
れるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１
〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ま
しくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸
配列、配列番号：１または配列番号：２で表されるア
ミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０
個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは
数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配
列、配列番号：１または配列番号：２で表されるアミ
ノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０
個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは
数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され
たアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせたアミノ
酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも
含まれる。上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失また
は置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位
置としては、特に限定されないが、配列番号：１で表さ
れるアミノ酸配列と配列番号：２で表されるアミノ酸配
列に共通するアミノ酸残基以外の位置などがあげられ
る。

【００１０】本明細書におけるタンパク質は、ペプチド
標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端
がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で
表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめと
する、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端が通常
カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート
(−ＣＯＯ^-）であるか、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮ
Ｈ₂）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、
エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなど
のＣ_1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロ
ヘキシルなどのＣ_3-8シクロアルキル基、例えば、フェ
ニル、α−ナフチルなどのＣ_6-12アリール基、例えば、
ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_1-2アルキル
基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ
_1-2アルキル基などのＣ_7-14アラルキル基、ピバロイル
オキシメチル基などが用いられる。本発明で用いられる
タンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカル
ボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がア
ミド化またはエステル化されているものも本発明で用い
られるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとし
ては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられ
る。さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末
端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が
保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ _1-6
アルカノイルなどのＣ_1-6アシル基など）で保護されて
いるもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタ
ミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミ
ノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ
基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基な
ど）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基
などのＣ_1-6アルカノイル基などのＣ_1-6アシル基など）
で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆ
る糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例え
ば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するマウ
ス腎由来のタンパク質、配列番号：２で表されるアミノ
酸配列を有するヒト腎由来のタンパク質などがあげられ
る。

【００１１】本発明で用いられるタンパク質の部分ペプ
チドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質
の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明
で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであ
ればいずれのものでもよい。例えば、本発明で用いられ
るタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０
個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０
個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは
２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用
いられる。より具体的には、配列番号：１もしくは配列
番号：２で表されるアミノ酸配列中、１０９〜１１２番
目、１４９〜１８８番目、２３５〜２７３番目、３１４
〜３４８番目、４０７〜４２４番目または５１０〜７８
０番目のアミノ酸配列を含有するペプチドなどがあげら
れる。また、本発明で用いられる部分ペプチドは、その
アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜
１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミ
ノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２
個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは
１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）の
アミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１また
は２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好まし
くは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）
個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列
中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、
より好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミ
ノ酸で置換されていてもよい。

【００１２】また、本発明で用いられる部分ペプチドは
Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカル
ボキシレート（−ＣＯＯ^-）であるが、前記した本発明
で用いられるタンパク質のごとく、Ｃ末端がアミド（−
ＣＯＮＨ₂）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であっても
よい。さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、
前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｎ末
端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が
保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断さ
れ生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したも
の、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基
で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆ
る糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。本発
明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原と
しても用いることができる。

【００１３】本発明で用いられるタンパク質または部分
ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、
無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などと
の塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加
塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸
（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、
あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、
フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、
リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼ
ンスルホン酸）との塩などが用いられる。本発明で用い
られるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその
塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自
体公知のタンパク質の精製方法によって製造することも
できるし、タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換さ
れた形質転換体を培養することによっても製造すること
ができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造す
ることもできる。ヒトや哺乳動物の組織または細胞から
製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモ
ジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆
相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
などのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精
製単離することができる。

【００１４】本発明で用いられるタンパク質もしくは部
分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成に
は、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることがで
きる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル
樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルア
ルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、
ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセ
トアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−
（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチ
ル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフ
ェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを
挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミ
ノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的と
するタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法
に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタ
ンパク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さら
に高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実
施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそ
のアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に
関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬
を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよ
い。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジ
イソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３
−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用い
られる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤
（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミ
ノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物また
はＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとして
あらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に
添加することができる。

【００１５】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより
十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても
十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセ
チルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化
することによって、後の反応に影響を与えないようにす
ることができる。

【００１６】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソ
ボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキ
シカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキ
シカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホ
ルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニル
ホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。カル
ボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、
メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シク
ロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロ
オクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もし
くは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化
（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエス
テル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベン
ジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシ
ルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド
化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒ
ドラジド化などによって保護することができる。セリン
の水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によ
って保護することができる。このエステル化に適する基
としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ_1-6）ア
ルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジ
ルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭
酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル
化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒ
ドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。チロシンの
フェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚ
ｌ、Ｃｌ₂−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、
ｔ−ブチルなどが用いられる。ヒスチジンのイミダゾー
ルの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−
２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、
ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍ
ｏｃなどが用いられる。

【００１７】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニ
トロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロ
フェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ
−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕
などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたもの
としては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられ
る。保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ
−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気
流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンス
ルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオ
ロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジ
イソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリ
ジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモ
ニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸
処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温
度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソ
ール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、
パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタン
ジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカ
チオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンの
イミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロ
フェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリ
プトファンのインドール保護基として用いられるホルミ
ル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタ
ンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外
に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによる
アルカリ処理によっても除去される。

【００１８】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。タンパク質または部分ペプチドの
アミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カル
ボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化し
て保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖
を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端の
α−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質またはペ
プチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去し
たタンパク質またはペプチドとを製造し、これらのタン
パク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮
合させる。縮合反応の詳細については上記と同様であ
る。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチド
を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去
し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることがで
きる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精
製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥すること
で所望のタンパク質のアミド体を得ることができる。タ
ンパク質または部分ペプチドのエステル体を得るには、
例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基
を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした
後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にし
て、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得
ることができる。

【００１９】本発明で用いられる部分ペプチドまたはそ
の塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるい
は本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼ
で切断することによって製造することができる。ペプチ
ドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法
のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられ
る部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミ
ノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する
場合は保護基を脱離することにより目的の部分ペプチド
を製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱
離としては、例えば、以下の〜に記載された方法が
挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)
（1975年）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合
成、広川書店また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペ
プチドを精製単離することができる。上記方法で得られ
る部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法ある
いはそれに準じる方法によって適当な塩に変換すること
ができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法ある
いはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変
換することができる。

【００２０】本発明で用いられるタンパク質をコードす
るＤＮＡとしては、前述した本発明で用いられるタンパ
ク質をコードする塩基配列を含有するものであればいか
なるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮ
Ａ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、
合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用する
ベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミ
ド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前
記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分
を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Po
lymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称
する）によって増幅することもできる。本発明で用いら
れるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、
配列番号：３で表される塩基配列中、１〜２３４０番目
の塩基配列を含有するＤＮＡ、配列番号：４で表される
塩基配列中、１〜２３４０番目の塩基配列を含有するＤ
ＮＡ、または配列番号：３で表される塩基配列中、１〜
２３４０番目の塩基配列もしくは配列番号：４で表され
る塩基配列中、１〜２３４０番目の塩基配列とハイスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を
有し、本発明で用いられるタンパク質と実質的に同質の
性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何
れのものでもよい。

【００２１】配列番号：３で表される塩基配列中、１〜
２３４０番目の塩基配列もしくは配列番号：４で表され
る塩基配列中、１〜２３４０番目の塩基配列とハイスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡと
しては、例えば、配列番号：３で表される塩基配列中、
１〜２３４０番目の塩基配列または配列番号：４で表さ
れる塩基配列中、１〜２３４０番目の塩基配列と約５０
％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約
７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好まし
くは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同
性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ
る。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるい
はそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニ
ング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook etal.,
Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法
などに従って行なうことができる。また、市販のライブ
ラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法
に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイス
トリンジェントな条件に従って行なうことができる。ハ
イストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃
度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭ
で、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃
の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温
度が約６５℃の場合が最も好ましい。より具体的には、
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク
質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：３で表され
る塩基配列中、１〜２３４０番目の塩基配列を有するＤ
ＮＡなどが用いられる。また、配列番号：２で表される
アミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡと
しては、配列番号：４で表される塩基配列中、１〜２３
４０番目の塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。

【００２２】本発明で用いられる部分ペプチドをコード
するＤＮＡとしては、前述した本発明で用いられる部分
ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであれば
いかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲ
ノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃ
ＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリ
ー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。本発明で用いられる
部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配
列番号：３で表される塩基配列中、１〜２３４０番目の
塩基配列または配列番号：４で表される塩基配列中、１
〜２３４０番目の塩基配列を有するＤＮＡの一部分を有
するＤＮＡ、または配列番号：３で表される塩基配列
中、１〜２３４０番目の塩基配列または配列番号：４で
表される塩基配列中、１〜２３４０番目の塩基配列とハ
イストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基
配列を有し、本発明で用いられるタンパク質と実質的に
同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一
部分を有するＤＮＡなどがあげられる。配列番号：３で
表される塩基配列中、１〜２３４０番目の塩基配列また
は配列番号：４で表される塩基配列中、１〜２３４０番
目の塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは前記と同
意義を示す。ハイブリダイゼーションの方法およびハイ
ストリンジェントな条件は、それぞれ前記と同様な方法
および条件が用いられる。

【００２３】本発明で用いられるタンパク質または部分
ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニ
ングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明
のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードす
るＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタン
パク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮ
Ａプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、ま
たは適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタン
パク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片も
しくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダ
イゼーションによって選別することができる。ハイブリ
ダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クロ
ーニング（Molecular Cloning）２ｎｄ（J. Sambrook e
t al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載
の方法などに従って行なうことができる。また、市販の
ライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載
の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列
の変換は、公知のキット、例えば、Ｍｕｔａｎ^TM−ｓｕ
ｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓＫｍ（宝酒造（株））、Ｍｕ
ｔａｎ^TM−Ｋ（宝酒造（株））などを用いて、ＯＤＡ−
ＬＡＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕ
ｎｋｅｌ法などの自体公知の方法あるいはそれらに準じ
る方法に従って行なうことができる。クローン化された
タンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、
または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付
加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその
５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、ま
た３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧ
ＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始
コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプタ
ーを用いて付加することもできる。本発明のタンパク質
の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質
をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出
し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロ
モーターの下流に連結することにより製造することがで
きる。

【００２４】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐ
Ａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で
用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用い
る宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなる
ものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場
合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、Ｌ
ＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫ
プロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶ
（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモ
ーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア
属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモ
ーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、
ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主が
バチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、Ｓ
ＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主
が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプ
ロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター
などが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘ
ドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好まし
い。

【００２５】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏ^rと略称する場合がある、Ｇ４１８耐
性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイ
ニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マ
ーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含
まない培地によっても選択できる。また、必要に応じ
て、宿主に合ったシグナル配列をコードするＤＮＡを、
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの５’末端側に
付加する。シグナル配列としては、宿主がエシェリヒア
属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ
・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合
は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シ
グナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・
シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動
物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、
α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグ
ナル配列などがそれぞれ利用できる。このようにして構
築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有
するベクターを用いて、形質転換体を製造することがで
きる。

【００２６】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１
２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユー
エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０
巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・
アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９
巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecul
ar Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ
１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネテ
ィックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕な
どが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチ
ルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４
〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１
〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of
Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用
いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，Ａ
Ｈ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ
−１２、シゾサッカロマイセスポンベ（Schizosaccha
romyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３
６、ピキアパストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１
などが用いられる。

【００２７】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh Five^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mor
i N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞
としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ
２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In V
ivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫と
しては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以
下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ^-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２
０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細
胞などが用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換する
には、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，
２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７
(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができ
る。

【００２８】バチルス属菌を形質転換するには、例え
ば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，
１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうこと
ができる。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ
・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８）
などに記載の方法に従って行なうことができる。昆虫細
胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テ
クノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55 (1988)）など
に記載の方法に従って行なうことができる。動物細胞を
形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工
学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀
潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５
６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができ
る。このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを
含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得
ることができる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属
菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培
地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転
換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含
有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコー
ス、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源と
しては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーン
スチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大
豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無
機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素
ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。ま
た、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加しても
よい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。

【００２９】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエ
シェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約
３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加える
こともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通
気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質
転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホ
ールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０
５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培
地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ
・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳ
Ａ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。
培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は
通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要
に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞または昆
虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grac
e's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Natur
e）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の
添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨ
は約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通
常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や
撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養
する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛
血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２
２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジ
ー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ
１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・
メディカル・アソシエーション（The Journal of the A
merican Medical Association）１９９巻，５１９(１９
６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソ
サイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Proceeding ofthe Society for the Biological Medi
cine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐ
Ｈは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃
〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気
や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞
内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せ
しめることができる。

【００３０】上記培養物から本発明のタンパク質を分離
精製するには、例えば、下記の方法により行なうことが
できる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞か
ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ
る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変
性剤や、トリトンＸ−１００^TMなどの界面活性剤が含ま
れていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場
合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるい
は細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにし
て得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタン
パク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み
合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精
製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用す
る方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として
分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフ
ィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティーク
ロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、
逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利
用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用
する方法などが用いられる。

【００３１】かくして得られるタンパク質が遊離体で得
られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる
方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られ
た場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法に
より、遊離体または他の塩に変換することができる。な
お、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精
製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任
意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去する
こともできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプ
シン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダー
ゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いら
れる。かくして生成する本発明のタンパク質またはその
塩の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセ
イやウエスタンブロッティングなどにより測定すること
ができる。

【００３２】本発明で用いられるタンパク質もしくは部
分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明で用い
られるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を
認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体の何れであってもよい。本発明で用いられ
るタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以
下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタン
パク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明
のタンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または
抗血清の製造法に従って製造することができる。〔モノクローナル抗体の作製〕（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血
動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモッ
ト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げら
れるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モ
ノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免
疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められ
た個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種ま
たは異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することが
できる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標
識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結
合した標識剤の活性を測定することにより行なうことが
できる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミ
ルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1
975)〕に従い実施することができる。融合促進剤として
は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセン
ダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが
用いられる。

【００３３】骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄
腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられ
る。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細
胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、
ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）
が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、
好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベート
することにより効率よく細胞融合を実施できる。モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには
種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を
直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイク
ロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に
放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体
（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス
免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡ
を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する
方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着
させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性
物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結
合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げら
れる。モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいは
それに準じる方法に従って行なうことができる。通常Ｈ
ＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を
添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別お
よび育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できる
ものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１
〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含む
ＲＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含
むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリ
ドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬
（株））などを用いることができる。培養温度は、通常
２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間
は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間であ
る。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。

【００３４】（ｂ）モノクローナル抗体の精製モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例
えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アル
コール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換
体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ
過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロ
テインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結
合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行な
うことができる。

【００３５】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じ
る方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗
原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー
蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体
の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物
から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取し
て、抗体の分離精製を行なうことにより製造することが
できる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原
とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白
質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キ
ャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が
効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋
させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサ
イログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１
に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合で
カプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャ
リアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることが
できるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレ
イミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を
含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物
は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自
体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際
して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバ
ントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよ
い。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１
０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、上記の方
法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは
血液から採取することができる。抗血清中のポリクロー
ナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と
同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製
は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫
グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。

【００３６】本発明で用いられるタンパク質もしくはま
たは部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、アンチセ
ンスＤＮＡの説明においては、これらのＤＮＡを本発明
のＤＮＡと略記する）に相補的な、または実質的に相補
的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、本
発明のＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基
配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有する
ものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであっても
よい。本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列と
は、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すな
わち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは
部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以
上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９
５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。
特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発
明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配
列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖
と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好まし
くは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同
性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。アンチセ
ンスＤＮＡは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５
〜３０個程度の塩基から構成される。ヌクレアーゼなど
の加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス
ＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフ
ェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホス
ホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸
残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスＤ
ＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造するこ
とができる。

【００３７】以下に、本発明で用いられるタンパク質も
しくは部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタン
パク質と略記する場合がある）、本発明で用いられるタ
ンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以
下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明で
用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその
塩に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合が
ある）、およびアンチセンスＤＮＡの用途を説明する。

【００３８】本発明のタンパク質は喘息モデル動物の肺
・気管支において組織特異的に発現が上昇するので、疾
患マーカーとして利用することが出来る。すなわち、肺
・気道の炎症を伴う肺・胸部疾患における早期診断、症
状の重症度の判定、疾患進行の予測のためのマーカーと
して有用である。（１）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング本発明のタンパク質は肺・気道の炎症に先立ち発現が増
加するので、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合
物またはその塩は、気管支喘息や慢性閉塞性肺疾患など
肺・気道の炎症を伴う肺・胸部疾患の予防・治療剤など
の医薬として使用できる。したがって、本発明のタンパ
ク質は、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物ま
たはその塩のスクリーニングのための試薬として有用で
ある。すなわち、本発明は、（１）本発明のタンパク質
を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の活性
（例えば、クロライド／イオダイドトランスポーター活
性などのアニオントランスポーター活性）を阻害する化
合物もしくはその塩（以下、阻害剤と略記する場合があ
る）のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、
例えば、（２）（ｉ）本発明のタンパク質を産生する能
力を有する細胞にクロライドイオンを負荷した場合と
（ii）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞
と試験化合物の混合物にクロライドイオンを負荷した場
合との比較を行なうことを特徴とする阻害剤のスクリー
ニング方法を提供する。具体的には、上記スクリーニン
グ方法においては、例えば、（ｉ）と（ii）の場合にお
ける、本発明のタンパク質のクロライドトランスポータ
ー活性などのアニオントランスポーター活性を測定し
て、比較することを特徴とするものである。

【００３９】試験化合物としては、例えば、ペプチド、
タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産
物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙
げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよい
し、公知の化合物であってもよい。上記のスクリーニン
グ方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する
能力を有する細胞を、スクリーニングに適したバッファ
ーに浮遊または懸濁する。バッファーとしては、ｐＨ約
４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッフ
ァー、トリス−塩酸バッファーなどの、本発明のタンパ
ク質のクロライドトランスポーター活性などのアニオン
トランスポーター活性を阻害しないバッファーであれば
いずれでもよい。本発明のタンパク質を産生する能力を
有する細胞としては、例えば、前記した本発明のタンパ
ク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換
された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主として
は、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用い
られる。該スクリーニングには、例えば、前記の方法で
培養することによって、本発明のタンパク質が細胞膜上
に発現された形質転換体が好ましく用いられる。

【００４０】アニオントランスポーター活性は、自体公
知の方法に従って測定することができる。より具体的に
は、クロライドトランスポーター活性は、自体公知の方
法、例えば、ネイチャー・ジェネティックス(Nature Ge
netics) 第２１巻、４４０頁、1999年に記載の方法ある
いはそれに準じる方法に従って測定することができる。
例えば、上記（ii）の場合におけるクロライドトランス
ポーター活性が上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以
上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以
上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質の活性
（例、クロライドトランスポーター活性などのアニオン
トランスポーター活性）を阻害する化合物として選択す
ることができる。

【００４１】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたは
その塩、または本発明で用いられるタンパク質もしくは
部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するも
のである。

【００４２】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから
選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の活性
（例、クロライドトランスポーター活性などのアニオン
トランスポーター活性）を阻害する化合物である。該化
合物の塩としては、前記した本発明で用いられるタンパ
ク質の塩と同様のものが用いられる。本発明で用いられ
るタンパク質の活性を阻害する化合物、すなわちクロラ
イドトランスポーターなどのアニオントランスポーター
活性を阻害する作用を有する化合物は、例えば、気管支
喘息や慢性閉塞性肺疾患など肺・気道の炎症を伴う肺・
胸部疾患の疾病に対する予防・治療剤などの医薬として
有用である。

【００４３】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の予防
・治療剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化
し、経口的または非経口的に投与することができる。例
えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプ
セル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができ
る。このようにして得られる製剤は安全で低毒性である
ので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、
ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネ
コ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与する
ことができる。該化合物またはその塩の投与量は、その
作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異
はあるが、例えば、気管支喘息治療の目的で本発明のタ
ンパク質の活性を阻害する化合物を経口投与する場合、
一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日
につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約
１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ
投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回
投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、
例えば、気管支喘息治療の目的で本発明のタンパク質の
活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋ
ｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約
０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍ
ｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈
注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合
も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができ
る。

【００４４】（２）本発明のタンパク質、その部分ペプ
チドまたはその塩の定量本発明のタンパク質に対する抗体（以下、本発明の抗体
と略記する場合がある）は、本発明のタンパク質を特異
的に認識することができるので、被検液中の本発明のタ
ンパク質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定
量などに使用することができる。すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発
明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合し
た標識化された本発明のタンパク質の割合を測定するこ
とを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量
法、および（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の
抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時ある
いは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の
活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタ
ンパク質の定量法を提供する。上記（ii）の定量法にお
いては、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認
識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質のＣ端
部に反応する抗体であることが望ましい。

【００４５】また、本発明のタンパク質に対するモノク
ローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称
する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を
行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともで
きる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いても
よく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')₂ 、Ｆａｂ'、あるい
はＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本
発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきも
のではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質
量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の
量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知
量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算
出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよ
い。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリッ
ク法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感
度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるの
が特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる
標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光
物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素とし
ては、例えば、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴
Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活
性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダ
ーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用い
られる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミ
ン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられ
る。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノー
ル誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられ
る。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオ
チン−アビジン系を用いることもできる。

【００４６】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵
素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用
いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキス
トラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレ
ン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、ある
いはガラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては
不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応
させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノ
クローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化
担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の
本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反
応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行な
ってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤
および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができ
る。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、
固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず
しも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等
の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本
発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定
法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明
のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合す
る部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわ
ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例え
ば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質
のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体
は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗
体が用いられる。

【００４７】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原
(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し
（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被
検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として
可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコー
ル、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、お
よび、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるい
は、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相
化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリ
ック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の
標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離
するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗
体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化
抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。
次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量
を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるい
は溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。

【００４８】これら個々の免疫学的測定法を本発明の定
量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一
般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参
照することができる。例えば、入江寛編「ラジオイム
ノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編
「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭
和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第
２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年
発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochem
ical Techniques(Part A))、同書 Vol. 73(Immunochem
ical Techniques(Part B))、同書 Vol. 74(Immunochem
ical Techniques(Part C))、同書 Vol. 84(Immunochem
ical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、
同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Mono
clonal Antibodies and General Immunoassay Method
s))、同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part
I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodie
s))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照する
ことができる。以上のようにして、本発明の抗体を用い
ることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量す
ることができる。さらには、本発明の抗体を用いて本発
明のタンパク質の濃度を定量することによって、体液、
組織、細胞などの被検体中の本発明のタンパク質の濃度
の増加が検出された場合、例えば、気管支喘息や慢性閉
塞性肺疾患など肺・気道の炎症を伴う肺・胸部疾患など
の疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断
することができる。また、本発明の抗体は、体液、組
織、細胞（気管支上皮細胞など）などの被検体中に存在
する本発明のタンパク質を検出するために使用すること
ができる。また、本発明のタンパク質を精製するために
使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明
のタンパク質の検出、被検細胞内における本発明のタン
パク質の挙動の分析などのために使用することができ
る。

【００４９】（３）遺伝子診断剤本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用するこ
とにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウ
ス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードす
るＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出す
ることができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡ
の損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたは
ｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤と
して有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子
診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼー
ションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomic
s），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロ
シージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceeding
s ofthe Natinal Academy of Sciences of the United
States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０
頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現過
多が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡ
の突然変異が検出された場合は、例えば、気管支喘息や
慢性閉塞性肺疾患など肺・気道の炎症を伴う肺・胸部疾
患などの疾病である可能性が高いと診断することができ
る。

【００５０】（４）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑
制することができるアンチセンスＤＮＡは低毒性であ
り、生体内における本発明のタンパク質または本発明の
ＤＮＡの活性を抑制することができるので、例えば、気
管支喘息や慢性閉塞性肺疾患など肺・気道の炎症を伴う
肺・胸部疾患などの予防・治療剤として使用することが
できる。上記アンチセンスＤＮＡを上記の予防・治療剤
として使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化
し、投与することができる。例えば、該アンチセンスＤ
ＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるい
はレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、
アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなど
の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従ってヒト
または哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、
ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非
経口的に投与することができる。該アンチセンスＤＮＡ
は、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤など
の生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子
銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによっ
て投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤とし
て気管内に局所投与することもできる。該アンチセンス
ＤＮＡの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートな
どにより差異はあるが、例えば、気管支喘息の治療の目
的で本発明のアンチセンスＤＮＡを吸入剤として気管内
に局所投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）に
おいては、一日につき該アンチセンスＤＮＡを約０．１
〜１００ｍｇ投与する。さらに、該アンチセンスＤＮＡ
は、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発
現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプロー
ブとして使用することもできる。

【００５１】（５）本発明の抗体を含有する医薬本発明のタンパク質の活性を中和する作用を有する本発
明の抗体は低毒性であり、気管支喘息や慢性閉塞性肺疾
患など肺・気道の炎症を伴う肺・胸部疾患などの疾患に
対する予防・治療剤として使用することができる。本発
明の抗体を含有する上記疾患の予防・治療剤は、そのま
ま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、
ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的また
は非経口的に投与することができる。投与量は、投与対
象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なる
が、例えば、成人の気管支喘息の治療のために使用する
場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.０１
〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍ
ｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／
ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１
〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合であ
る。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ず
る量を投与することができる。症状が特に重い場合に
は、その症状に応じて増量してもよい。本発明の抗体
は、それ自体または適当な医薬組成物として投与するこ
とができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記
抗体と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦
形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または
非経口投与に適する剤形として提供される。すなわち、
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または
液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーテ
ィング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤
（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁
剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法に
よって製造され、製剤分野において通常用いられる担
体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例え
ば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、
蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。

【００５２】非経口投与のための組成物としては、例え
ば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射
剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤
などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方
法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射
剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁
または乳化することによって調製する。注射用の水性液
としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補
助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、
例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコー
ル（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、
ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of
hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。
油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いら
れ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通
常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられ
る坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に
混合することによって調製される。上記の経口用または
非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するよ
うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。
かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル
剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞ
れの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ
注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２
５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ま
しくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有し
てもよい。

【００５３】（６）ＤＮＡ転移動物本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）または
その変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する
場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。すな
わち、本発明は、（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはそ
の変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、（２）非ヒト哺
乳動物がゲッ歯動物である第（１)記載の動物、（３）ゲ
ッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動
物、および（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異
ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベ
クターを提供するものである。本発明の外来性ＤＮＡま
たはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本
発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精
卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対し
て、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生
の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の
段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム
法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイ
クロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡ
Ｅ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移
することによって作出することができる。また、該ＤＮ
Ａ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞など
に目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培
養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これ
ら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により
融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出す
ることもできる。

【００５４】非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、
ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモッ
ト、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。な
かでも、病態動物モデル系の作成の面から個体発生およ
び生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ
歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７
ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６
Ｃ３Ｆ_１系統，ＢＤＦ_１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ_１系統，ＢＡ
ＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例え
ば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。哺乳動
物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動
物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが
挙げられる。本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動
物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん
哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩
基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、
具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換など
が生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含
まれる。該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパ
ク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発
明のタンパク質の機能（活性）を抑制するタンパク質を
発現させるＤＮＡなどが用いられる。本発明の外来性Ｄ
ＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの
哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを
対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細
胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡ
コンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例
えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相
同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例え
ば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラ
ット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プ
ロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤ
ＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動
物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェ
クションすることによって本発明のＤＮＡを高発現する
ＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。

【００５５】本発明のタンパク質の発現ベクターとして
は、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミ
ド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリ
オファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィ
ルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなど
の動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由
来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由
来のプラスミドなどが好ましく用いられる。上記のＤＮ
Ａ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、
ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイル
ス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイ
ルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモ
ーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、
モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の
プロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、
ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、
エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸
性タンパク質ク、グルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およ
びＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリック
ＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジス
トロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、
心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキ
ナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリ
ウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓ
ｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩ
およびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビタ
ー、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レ
ニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダ
ーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−
１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシ
ン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロ
ブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（Ｖ
ＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビ
ン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケ
ファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用
いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサ
イトメガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖
延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよ
びニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。

【００５６】上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物にお
いて目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する
配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有しているこ
とが好ましく、例えば、ウィルス由来および各種哺乳動
物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましく
は、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネターなどが用
いられる。その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高
発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、
エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部など
をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻
訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結すること
も目的により可能である。正常な本発明のタンパク質の
翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサ
ギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マ
ウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞
由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリー
よりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または腎
臓、甲状腺細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製さ
れた相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。ま
た、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より
得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発
法により変異した翻訳領域を作製することができる。該
翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンスト
ラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望に
より転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学
的手法により作製することができる。受精卵細胞段階に
おける本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の
胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保さ
れる。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本
発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代
がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明
の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外
来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽
細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有
する。

【００５７】本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非
ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持
することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼
育環境で継代飼育することが出来る。受精卵細胞段階に
おける本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の
胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確
保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において
本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動
物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発
明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発
明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はそ
の胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡ
を過剰に有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つ
ホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配す
ることによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するよ
うに繁殖継代することができる。本発明の正常ＤＮＡを
有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現
させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進する
ことにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を
発症することがあり、その病態モデル動物として利用す
ることができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物
を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明
のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこ
れらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能であ
る。また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳
動物は、本発明のタンパク質の発現過多症状を有するこ
とから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する治
療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。

【００５８】一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する
非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保
持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼
育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とす
る外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科とし
て用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンス
トラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製する
ことができる。受精卵細胞段階における本発明の異常Ｄ
ＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の
全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出
動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在する
ことは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細
胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味す
る。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の
子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異
常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持
つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配
することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように
繁殖継代することができる。本発明の異常ＤＮＡを有す
る非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させ
られており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害すること
により最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応
症となることがあり、その病態モデル動物として利用す
ることができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物
を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の
病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行な
うことが可能である。また、具体的な利用可能性として
は、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパ
ク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパ
ク質による正常タンパク質の機能阻害（dominant negat
ive作用）を解明するモデルとなる。また、本発明の外
来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、本発明のタンパ
ク質の発現過多症状を有することから、本発明のタンパ
ク質の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニン
グ試験にも利用可能である。

【００５９】また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動
物のその他の利用可能性として、例えば、組織培養のための細胞源としての使用、本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲ
ＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現された
タンパク質組織を分析することによる、本発明のタンパ
ク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質
との関連性についての解析、ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により
培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織から
の細胞の機能の研究、上記記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高
めるような薬剤のスクリーニング、および本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作
製などが考えられる。さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタ
ンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタ
ンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることがで
き、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの
各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新し
い治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患
の研究および治療に貢献することができる。また、本発
明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、ト
リプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤ
ＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系
統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタン
パク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは
増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機
構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発
明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究
材料となる。さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用い
て、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、
本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行
なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、
有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供す
ることが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物ま
たは本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発
明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、
開発することが可能である。

【００６０】（７）ノックアウト動物本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳
動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳
動物を提供する。すなわち、本発明は、（１）本発明の
ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不
活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、（３）ネオマ
イシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、（４）非
ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹
細胞、（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載
の胚幹細胞、（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該
ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、（７）該ＤＮＡがレポ
ーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポー
ター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制
御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記
載の非ヒト哺乳動物、（９）ゲッ歯動物がマウスである
第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および（１０）第
（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポータ
ー遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤ
ＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化
合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。

【００６１】本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺
乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明
のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの
発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしてい
る本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させること
により、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能
を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称す
ることがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ
細胞と略記する）をいう。非ヒト哺乳動物としては、前
記と同様のものが用いられる。本発明のＤＮＡに人為的
に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手
法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡ
を挿入または置換させることによって行なうことができ
る。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠
をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を
破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製
すればよい。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺
乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細
胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の
具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が
有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネ
オマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を
代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレ
ポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能
を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に
遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ
付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲ
ＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子
を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖
（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例
えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得ら
れたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近
傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼ
ーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤ
ＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本
発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマー
としたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥ
Ｓ細胞を選別することにより得ることができる。

【００６２】また、相同組換え法等により本発明のＤＮ
Ａを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述
のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知
EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでも
よい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的
には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的
背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免
疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなど
の目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／
６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善し
たＢＤＦ_１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ
_１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤ
Ｆ_１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であると
いう利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つ
ので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウ
スを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロ
スすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに
代えることが可能である点で有利に用い得る。また、Ｅ
Ｓ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚
盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤
胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚
を取得することができる。また、雌雄いずれのＥＳ細胞
を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キ
メラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手
間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行な
うことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法として
は、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の
遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例として挙げる
ことができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析
をするのに約１０^６個の細胞数を要していたのに対し
て、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むの
で、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを
雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の
選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削
減できる。

【００６３】また、第二次セレクションとしては、例え
ば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により
行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常
数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の
関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウト
した後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ
＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ま
しい。このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その
増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすい
ので、注意深く継代培養することが必要である。例え
ば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上
でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養
器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５
％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養
するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプ
シン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシ
ン／０.１−５ｍＭＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％ト
リプシン／１ｍＭＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、
新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などが
とられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なう
が、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が
見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望ま
れる。ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るま
で単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊
培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々
のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J.
Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292
巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディング
ス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第7
8巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschmanら、ジャーナ
ル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメン
タル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発
明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現
不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の
細胞生物学的検討において有用である。本発明のＤＮＡ
発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知
方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較するこ
とにより、正常動物と区別することが可能である。該非
ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられ
る。

【００６４】本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティン
グベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入
し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤ
ＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えに
より、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の
本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることに
より、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができ
る。本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発
明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブと
したサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッ
ティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティング
ベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の
近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法に
よる解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹
細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明
のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、そ
の細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動
物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠
させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された
動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変
異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成さ
れるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部
が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキ
メラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体
群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤ
ＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コート
カラーの判定等により選別することにより得られる。こ
のようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク
質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質の
ヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本
発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができ
る。卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマ
イクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入すること
によりターゲッティングベクターを染色体内に導入した
トランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、
これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、
遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のある
ものを選択することにより得られる。

【００６５】このようにして本発明のＤＮＡがノックア
ウトされている個体は、交配により得られた動物個体も
該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常
の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。さらに、
生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよ
い。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を
交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両
方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホ
モザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，
ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することに
より効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物
の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有する
ホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代
する。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物
胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を
作出する上で、非常に有用である。また、本発明のＤＮ
Ａ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質によ
り誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明
のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病の
モデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治
療法の検討に有用である。

【００６６】（７ａ）本発明のＤＮＡに対するプロモー
ターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニン
グ方法本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、
試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出す
ることを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモータ
ーの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のス
クリーニング方法を提供する。上記スクリーニング方法
において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物とし
ては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入す
ることにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発
明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる
ものが用いられる。試験化合物としては、前記と同様の
ものが挙げられる。レポーター遺伝子としては、前記と
同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子
またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。本発明
のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮ
Ａ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本
発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在する
ので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレ
ースすることにより、プロモーターの活性を検出するこ
とができる。

【００６７】例えば、本発明のタンパク質をコードする
ＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明
のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の
代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例
えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラク
トシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することによ
り、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発
現状態を観察することができる。具体的には、本発明の
タンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルア
ルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢ
Ｓ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または
３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組
織標本を１ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄すること
によって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色
を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコー
ドするｍＲＮＡを検出してもよい。

【００６８】上記スクリーニング方法を用いて得られる
化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれ
た化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター
活性を促進または阻害する化合物である。該スクリーニ
ング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、
無機酸）や塩基（例、有機酸）などとの塩が用いられ、
とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。こ
の様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リ
ン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例
えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン
酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安
息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との
塩などが用いられる。本発明のＤＮＡに対するプロモー
ター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタ
ンパク質の発現を阻害し、該タンパク質の活性を阻害す
ることができるので、例えば、気管支喘息や慢性閉塞性
肺疾患など肺・気道の炎症を伴う肺・胸部疾患などの疾
病に対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬とし
て有用である。さらに、上記スクリーニングで得られた
化合物から誘導される化合物も同様に用いることができ
る。

【００６９】該スクリーニング方法で得られた化合物ま
たはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパ
ク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造する
ことができる。このようにして得られる製剤は、安全で
低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例え
ば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与
することができる。該化合物またはその塩の投与量は、
対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はある
が、例えば、気管支喘息の治療目的で本発明のＤＮＡに
対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与す
る場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）において
は、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ま
しくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜
２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合
物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異
なるが、例えば、気管支喘息の治療目的で本発明のＤＮ
Ａに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤
の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一
日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好まし
くは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１
〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合で
ある。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量
を投与することができる。このように、本発明のＤＮＡ
発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプ
ロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはそ
の塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発
明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明また
は予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有す
るＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパク質をコー
ドする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入して
いわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を
作成すれば、特異的にそのタンパク質を合成させ、その
生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記
プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合さ
せ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発
明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に
促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系
として使用できる。また該プロモーター部分を解析する
ことにより新たなシスエレメントやそれに結合する転写
因子を見つけることも可能である。

【００７０】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＭ：ＡまたはＣＷ：ＡまたはＴＹ：ＴまたはＣＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウムＧｌｙ：グリシンＡｌａ：アラニンＶａｌ：バリンＬｅｕ：ロイシンＩｌｅ：イソロイシンＳｅｒ：セリンＴｈｒ：スレオニンＣｙｓ：システインＭｅｔ：メチオニンＧｌｕ：グルタミン酸Ａｓｐ：アスパラギン酸Ｌｙｓ：リジンＡｒｇ：アルギニンＨｉｓ：ヒスチジンＰｈｅ：フェニルアラニンＴｙｒ：チロシンＴｒｐ：トリプトファンＰｒｏ：プロリンＡｓｎ：アスパラギンＧｌｎ：グルタミンｐＧｌｕ：ピログルタミン酸

【００７１】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。Ｍｅ：メチルＥｔ：エチルＢｕ：ブチルＰｈ：フェニルＴＣ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミドＴｏｓ：ｐ−トルエンスルフォニルＣＨＯ：ホルミルＢｚｌ：ベンジルＣｌ₂−Ｂｚｌ：２，６−ジクロロベンジルＢｏｍ：ベンジルオキシメチルＺ：ベンジルオキシカルボニルＣｌ−Ｚ：２−クロロベンジルオキシカルボニルＢｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニルＢｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニルＤＮＰ：ジニトロフェニルＴｒｔ：トリチルＢｕｍ：ｔ−ブトキシメチルＦｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニルＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンズトリアゾールＨＯＯＢｔ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジンＨＯＮＢ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３− ジカルボキシイミドＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド

【００７２】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。〔配列番号：１〕本発明のマウス腎由来タンパク質（成
熟体）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：２〕本発明のヒト腎由来タンパク質（成熟
体）のアミノ酸配列を示す。〔配列番号：３〕配列番号：１で表わされるアミノ酸配
列を有する本発明のマウス腎由来タンパク質（成熟体）
をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：４〕配列番号：２で表わされるアミノ酸配
列を有する本発明のヒト腎由来タンパク質（成熟体）を
コードするＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：５〕実施例１で取得したクローン６−１５
ｃＤＮＡ断片の塩基配列を示す。〔配列番号：６〕実施例１で用いられたプライマーＰＲ
１の塩基配列を示す。〔配列番号：７〕実施例１で用いられたプライマーＰＲ
２の塩基配列を示す。〔配列番号：８〕実施例１で用いられたプローブＰＲ３
の塩基配列を示す。〔配列番号：９〕実施例１で用いられたプライマーＰＲ
４の塩基配列を示す。〔配列番号：１０〕実施例１で取得したマウスＰｅｎｄ
ｒｉｎのｃＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：１１〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ５の塩基配列を示す。〔配列番号：１２〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ６の塩基配列を示す。〔配列番号：１３〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ７の塩基配列を示す。〔配列番号：１４〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ８の塩基配列を示す。〔配列番号：１５〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ９の塩基配列を示す。〔配列番号：１６〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ１０の塩基配列を示す。〔配列番号：１７〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ１１の塩基配列を示す。〔配列番号：１８〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ１２の塩基配列を示す。〔配列番号：１９〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ１３の塩基配列を示す。〔配列番号：２０〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ１４の塩基配列を示す。〔配列番号：２１〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ１５の塩基配列を示す。〔配列番号：２２〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ１６の塩基配列を示す。〔配列番号：２３〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ１７の塩基配列を示す。〔配列番号：２４〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ１８の塩基配列を示す。〔配列番号：２５〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ１９の塩基配列を示す。〔配列番号：２６〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ２０の塩基配列を示す。〔配列番号：２７〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ２１の塩基配列を示す。〔配列番号：２８〕実施例１で用いられたプライマーＰ
Ｒ２２の塩基配列を示す。〔配列番号：２９〕実施例３で取得したヒトＰｅｎｄｒ
ｉｎのｃＤＮＡの塩基配列を示す。

【００７３】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではな
い。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュ
ラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ）に記載されている方法に従った。実施例３で得ら
れたプラスミドｐｃＤＮＡ−ｈＰＤＳを保持する形質転
換体Escherichia coli DH5α/pcDNA-hPDSは１９９９年
９月２０日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所（ＮＩＢＨ）に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６８７
９として、また１９９９年８月２４日から財団法人発酵
研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ１６３１３として寄
託されている。実施例１で得られた、配列番号：１０で
表される塩基配列を有するｃＤＮＡを含有するプラスミ
ドｐＣＭＶＳ２−ｍＰＤＳを保持する形質転換体Escher
ichiacoli JM109/pCMVS2-mPDSは１９９９年９月２０日
からＮＩＢＨに受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６８８０とし
て、また１９９９年８月２４日からＩＦＯに受託番号Ｉ
ＦＯ１６３１４として寄託されている。

【００７４】実施例１気道過敏性亢進モデルマウスで発現が増加する遺伝子と
してのＰｅｎｄｒｉｎ遺伝子のクローニング（１）気道過敏性亢進モデルマウスとそのステロイド投
与群、及び正常マウスの肺・気管支で発現量の異なるｍ
ＲＮＡのサブトラクションによる濃縮気道過敏性亢進モデルマウスはＢＡＬＢ／ｃマウス（オ
ス、６週齢）に２０μｇＯＶＡ（オボアルブミン）、
２ｍｇアラム含有生理食塩水を４００μｌ腹腔内注射
し、１週後に１０μｇＯＶＡ、１ｍｇアラム含有生理
食塩水を２００μｌ腹腔注射することで感作を行った
後、さらに１週間後より７日間連続して１／２濃度のＰ
ＢＳに溶解させた５％ＯＶＡ溶液を無麻酔自発呼吸下で
２５分間吸入させることにより作製した。ステロイド投
与群はＯＶＡ吸入１時間前にデキサメサゾンを１ｍｇ／
ｋｇ腹腔内投与することにより作製した。エアロゾル
化は超音波ネブライザー（ソニックライザー３０５、
ＡＴＯＭメディカル）を用いて行った。気道過敏性の亢
進は、最終抗原吸入の２４時間後にアセチルコリン（６
２．５−２０００μｇ／ｋｇ）による気道狭窄反応をＫ
ｏｎｚｅｔｔ−Ｒｏｓｓｌｅｒ法を用いて測定すること
により判定した。また気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）
は、マウスをペントバルビタール麻酔による致死後、気
管カニューレを挿入し、０．５ｍｌのＰＢＳで３回洗浄
を行うことにより調製した。次にサイトスピン（７００
ｒｐｍ、１ｍｉｎ）により塗抹標本を作製し、Ｄｉｆ
ｆ−Ｑｕｉｃｋ染色後検鏡し、マクロファージ、好酸
球、好中球、リンパ球およびその他の細胞の割合を計算
した。サンプルとして用いたｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡは
正常マウス肺・気管支および気道過敏性亢進モデルマウ
ス肺・気管支及びそのデキサメサゾン投与群よりＩＳＯ
ＧＥＮ（和光純薬社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、さ
らにオリゴ−ｄＴセルロースカラム（ファルマシア社
製）を通して調製した。これらのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮ
Ａそれぞれ２μｇを出発材料として、ＰＣＲ−ｓｅｌｅ
ｃｔｃＤＮＡサブトラクションキット（クロンテック
社製）を用いたサブトラクションにより気道過敏性亢進
モデルマウス肺・気管支で特異的に発現しているｃＤＮ
Ａ断片（ｃＤＮＡの一部をＰＣＲで増幅した断片）を収
集した。得られたＰＣＲ断片の両端に付加しているサブ
トラクションのためのアダプターの配列を制限酵素Ｒｓ
ａＩで消化することにより除去し、平滑末端のＤＮＡ断
片にした後、この断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔ
ｏｒ（ノバゲン社製）にサブクローニングした。サブ
クローニングされたｃＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列を解
読し、明らかとなった塩基配列をもとに公のデータベー
スであるＧｅｎｅｂｌｅデータベースを用いてｂｌａｓ
ｔＮによるホモロジー検索を行った。その結果、調べた
１２０クローンのうち１０クローンは全て公知のヒトＰ
ｅｎｄｒｉｎ遺伝子［ネイチャージェネティックス（Ｎ
ａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ）１７巻、４１１頁、
（１９９７）］と８０％以上の相同性のある新規なＤＮ
Ａ塩基配列を有していた。

【００７５】（２）気道過敏性亢進モデルマウスでのク
ローン６−１５ｃＤＮＡ断片の組織分布の解析そこで最も長いｃＤＮＡ断片を有していたクローン６−
１５（配列番号：５）を[α−³²Ｐ]ｄＣＴＰとＢｃａＢ
ＥＳＴＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ（宝酒造社製）を用
いて標識しプローブとした。一方、正常および気道過敏
性亢進モデルマウスから各組織（肺・心臓・肝臓・腎臓
・脳・胸腺・脾臓・小腸・大腸・胃）を摘出し、ＩＳＯ
ＧＥＮ（和光純薬社製）を用いて全ＲＮＡを調製した。
この全ＲＮＡからオリゴ−ｄＴセルロースカラム（ファ
ルマシア社製）を通してｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを調製
した。このｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ０．５μｇを２．
２Ｍホルマリンを含む１．１％アガロースゲル電気泳動
にかけた後、ナイロンメンブレンフィルター（ハイボン
ドＮ＋、アマシャムファルマシアバイオテク社製）にキ
ャピラリーブロッティングにより１８時間ブロッティン
グした。紫外線処理によりこのナイロンメンブレンフィ
ルター上にＲＮＡを固定した後、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙ
ｂＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＳｏｌｕｔｉｏｎ
（クロンテック社製）中６５℃でプレハイブリダイゼー
ションを行った。ハイブリダイゼーションは標識プロー
ブを含むＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＨｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎＳｏｌｕｔｉｏｎ中６５℃、２時間で行った。
フィルターは最終的に０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
液中５０℃で洗浄し、検出はＢＡＳ−２０００（フジフ
ィルム社製）を用いて行った。その結果、クローン６−
１５ｃＤＮＡは正常マウスでは腎臓にのみ発現がみられ
た。気道過敏性亢進モデルマウスでは肺においてクロー
ン６−１５ｃＤＮＡの顕著な発現が認められ、気道過敏
性亢進に伴い発現が強く誘導されることが判明した。ま
た、気道過敏性亢進モデルマウスの腎臓においてもクロ
ーン６−１５ｃＤＮＡの発現が認められたが、気道過敏
性亢進による発現の変動は認められなかった（図１）。

【００７６】（３）クローン６−１５ｃＤＮＡ断片の完
全長ｃＤＮＡの単離マウス腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（ギブコビーアー
ルエル社製）を鋳型として、ヒトＰｅｎｄｒｉｎ遺伝子
が属するアニオントランスポーター遺伝子ファミリーの
共通配列（ＰＲ１：配列番号：６）を５’−プライマ
ー、クローン６−１５ｃＤＮＡ断片の５’側配列（ＰＲ
２：配列番号：７）を３’−プライマーとしてｄｅｇｅ
ｎｅｒａｔｅｄＰＣＲを行った。反応はＴａｋａｒａ
ＥＸＴａｑ（宝酒造社製）を用いてサーマルサイ
クラーＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７０
０（パーキンエルマー社製）にて行い、最初９８℃で１
分間反応させた後で９８℃で１０秒、６０℃で１分、７
２℃で３分を１反応サイクルとして３０サイクル繰り返
し、最後は７２℃で１０分間反応させた。増幅されたＤ
ＮＡ断片（1.7ｋｂｐ）はｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＴＶｅ
ｃｔｏｒにクローニングした。さらにサイクルシークエ
ンス反応を行い、蛍光ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭＴＭ３７７、パーキンエルマー社製）で得
られた反応物の塩基配列を決定した。続いて増幅された
ＤＮＡ断片（1.7ｋｂｐ）の塩基配列よりプローブとし
て合成オリゴヌクレオチド（配列番号：８）を作製し、
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。プロ
ーブはＴｄＴ、ビオチン−１４−ｄＣＴＰ（ギブコビー
アールエル社製）を用いて３’末端をビオチン化するこ
とで標識し、ジーントラッパーポジティブ選択システム
（ギブコビーアールエル社製）添付のマニュアルに従
い、ハイブリダイゼーションしたｃＤＮＡを大腸菌ＤＨ
１０Ｂ株に導入して形質転換株を得た。さらに、２本の
オリゴヌクレオチド（ＰＲ３：配列番号：８、ＰＲ４：
配列番号：９）をプライマーとして、コロニーＰＣＲに
より形質転換株のスクリーニングを行い、0.8ｋｂｐの
断片が増幅されたコロニー（３株）を陽性クローンとし
て選択した。選択した大腸菌を培養後、ＤＮＡを抽出し、
サイクルシークエンス反応を行い、蛍光ＤＮＡシークエ
ンサー（ＡＢＩＰＲＩＳＭＴＭ３７７、パーキンエ
ルマー社製）で各ｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
さらに決定した各塩基配列をもとにアラインメントをと
った。その結果、最も長いｃＤＮＡ断片は３１０３個の
塩基配列を有していた（配列番号：１０）。このｃＤＮ
Ａ断片には７８０個のアミノ酸からなるＰｅｎｄｒｉｎ
タンパク質がコードされていた（配列番号：１）。この
マウス由来Ｐｅｎｄｒｉｎタンパク質はヒトＰｅｎｄｒ
ｉｎとは塩基レベルで８４％、アミノ酸レベルで８７％
の相同性を有していた（図２、図３）。またＧｅｎｅ
ｂｌｅデータベースを用いてｂｌａｓｔＮによるホモ
ロジー検索を行った結果、該ｃＤＮＡは、ヒトＰｅｎｄ
ｒｉｎとの極めて高い相同性よりマウスＰｅｎｄｒｉｎ
であると推察された。配列番号：１０で表される塩基配
列を有するｃＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドをｐＣ
ＭＶＳ２−ｍＰＤＳと名付けた。

【００７７】実施例２気道過敏性亢進モデルマウスでのマウスＰｅｎｄｒｉｎ
遺伝子発現の経時変化の解析上記、実施例１で説明した気道過敏性モデルマウスを用
いて、ＯＶＡ吸入前、ＯＶＡ吸入後２、３、４、５、
６、７日目における気道過敏性亢進および肺胞洗浄液中
への浸潤細胞数を実施例１と同様にして測定した（図
４、図５）。また、ＯＶＡ吸入前、ＯＶＡ吸入後１、
２、３、５、７日目の肺を摘出し、実施例１−（２）と
同様にしてノーザンブロット解析を行った（図６）。そ
の結果、気道過敏性の亢進および肺胞洗浄液中への好酸
球の浸潤はＯＶＡ吸入後４日目から誘導されるのに対
し、マウスＰｅｎｄｒｉｎ遺伝子の発現はＯＶＡ吸入後
２日目から顕著に誘導された。すなわち、マウスＰｅｎ
ｄｒｉｎ遺伝子の発現は気道過敏性の亢進および好酸球
の浸潤に先立って起こり、気道炎症の結果としてマウス
Ｐｅｎｄｒｉｎ遺伝子が発現してきたのではなく、マウ
スＰｅｎｄｒｉｎ遺伝子の発現誘導が気道過敏性の亢進
および肺胞洗浄液中への好酸球の浸潤を引き起こした可
能性を示唆する。

【００７８】実施例３ヒトＰｅｎｄｒｉｎ遺伝子を動物細胞で発現させるため
のベクターの構築ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社製）を
鋳型としてＰｅｎｄｒｉｎ遺伝子５’−非翻訳領域（Ｐ
Ｒ５：配列番号：１１）と３’−非翻訳領域（ＰＲ６：
配列番号：１２）の２種のプライマーＤＮＡを用いてＰ
ＣＲを行い、Ｐｅｎｄｒｉｎ全長遺伝子を取得した（配
列番号：２９）。反応は、ＴａｋａｒａＥＸＴａｑ
（宝酒造社製）を用いてサーマルサイクラーＧｅｎｅ
ＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（パーキンエル
マー社製）にて、最初９８℃で１分間反応させた後、９
８℃で１０秒、６０℃で１分、７２℃で３分を１反応サ
イクルとして３０サイクル繰り返し、最後は７２℃で１
０分間反応させた。得られたＰｅｎｄｒｉｎ全長遺伝子
ＤＮＡ断片はｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔｏｒにク
ローニングした。さらに合成プライマー（ＰＲ５−２
２：配列番号：１１−２８）を用いてサイクルシークエ
ンス反応を行い、蛍光ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭＴＭ３７７、パーキンエルマー社製）で得
られた反応物の塩基配列を確認した。続いて、ヒトＰｅ
ｎｄｒｉｎ遺伝子を挿入したｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅ
ｃｔｏｒをKpnI-ApaIで消化し、得られたＰｅｎｄｒｉ
ｎ遺伝子を含む２．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を、同じくKp
nI-ApaIで消化したｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入し、サイトメガロウイル
スエンハンサー/プロモーター下流にヒトＰｅｎｄｒｉ
ｎ遺伝子を有し、選択マーカーとしてネオマイシン耐性
遺伝子を有するプラスミドｐｃＤＮＡ−ｈＰＤＳを構築
した。

【００７９】

【発明の効果】本発明で用いられるタンパク質およびそ
れをコードするＤＮＡは、例えば、気管支喘息、慢性閉
塞性肺疾患の診断マーカーとして有用である。また、本
発明で用いられるタンパク質は、本発明で用いられるタ
ンパク質の活性を促進もしくは阻害する化合物またはそ
の塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
さらに、本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害す
る化合物またはその塩、本発明で用いられるタンパク質
の活性を阻害する中和抗体は、例えば、気管支喘息、慢
性閉塞性肺疾患などの疾病の治療・予防剤として使用す
ることができる。さらに、本発明で用いられるタンパク
質に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質を特
異的に認識することができるので、被検液中の本発明で
用いられるタンパク質の定量などに使用することができ
る。

【００８０】

【配列表】［SEQUENCE LISTING］ <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Use of Disease-Related Gene <130> B00336 <150> JP 11-347573 <151> 1999-12-07 <160> 29 <210> 1 <211> 780 <212> PRT <213> Mouse <400> 1 Met Ala Ala Arg Gly Gly Arg Ser Glu Pro Pro Gln Leu Ala Glu Tyr 5 10 15 Ser Cys Ser Tyr Thr Val Ser Arg Pro Val Tyr Ser Glu Leu Ala Phe 20 25 30 Gln Gln Gln Arg Glu Arg Arg Leu Pro Glu Arg Arg Thr Leu Arg Asp 35 40 45 Ser Leu Ala Arg Ser Cys Ser Cys Ser Arg Lys Arg Ala Phe Gly Val 50 55 60 Val Lys Thr Leu Leu Pro Ile Leu Asp Trp Leu Pro Lys Tyr Arg Val 65 70 75 80 Lys Glu Trp Leu Leu Ser Asp Ile Ile Ser Gly Val Ser Thr Gly Leu 85 90 95 Val Gly Thr Leu Gln Gly Met Ala Tyr Ala Leu Leu Ala Ala Val Pro 100 105 110 Val Gln Phe Gly Leu Tyr Ser Ala Phe Phe Pro Ile Leu Thr Tyr Phe 115 120 125 Val Phe Gly Thr Ser Arg His Ile Ser Val Gly Pro Phe Pro Val Val 130 135 140 Ser Leu Met Val Gly Ser Val Val Leu Ser Met Ala Pro Asp Asp His 145 150 155 160 Phe Leu Val Pro Ser Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asn Ser Thr Thr Leu 165 170 175 Asp Thr Gly Thr Arg Asp Ala Ala Arg Val Leu Leu Ala Ser Thr Leu 180 185 190 Thr Leu Leu Val Gly Ile Ile Gln Leu Val Phe Gly Gly Leu Gln Ile 195 200 205 Gly Phe Ile Val Arg Tyr Leu Ala Asp Pro Leu Val Gly Gly Phe Thr 210 215 220 Thr Ala Ala Ala Phe Gln Val Leu Val Ser Gln Leu Lys Ile Val Leu 225 230 235 240 Asn Val Ser Thr Lys Asn Tyr Asn Gly Ile Leu Ser Ile Ile Tyr Thr 245 250 255 Leu Ile Glu Ile Phe Gln Asn Ile Gly Asp Thr Asn Ile Ala Asp Phe 260 265 270 Ile Ala Gly Leu Leu Thr Ile Ile Val Cys Met Ala Val Lys Glu Leu 275 280 285 Asn Asp Arg Phe Lys His Arg Ile Pro Val Pro Ile Pro Ile Glu Val 290 295 300 Ile Val Thr Ile Ile Ala Thr Ala Ile Ser Tyr Gly Ala Asn Leu Glu 305 310 315 320 Lys Asn Tyr Asn Ala Gly Ile Val Lys Ser Ile Pro Ser Gly Phe Leu 325 330 335 Pro Pro Val Leu Pro Ser Val Gly Leu Phe Ser Asp Met Leu Ala Ala 340 345 350 Ser Phe Ser Ile Ala Val Val Ala Tyr Ala Ile Ala Val Ser Val Gly 355 360 365 Lys Val Tyr Ala Thr Lys His Asp Tyr Val Ile Asp Gly Asn Gln Glu 370 375 380 Phe Ile Ala Phe Gly Ile Ser Asn Val Phe Ser Gly Phe Phe Ser Cys 385 390 395 400 Phe Val Ala Thr Thr Ala Leu Ser Arg Thr Ala Val Gln Glu Ser Thr 405 410 415 Gly Gly Lys Thr Gln Val Ala Gly Leu Ile Ser Ala Val Ile Val Met 420 425 430 Val Ala Ile Val Ala Leu Gly Arg Leu Leu Glu Pro Leu Gln Lys Ser 435 440 445 Val Leu Ala Ala Val Val Ile Ala Asn Leu Lys Gly Met Phe Met Gln 450 455 460 Val Cys Asp Val Pro Arg Leu Trp Lys Gln Asn Lys Thr Asp Ala Val 465 470 475 480 Ile Trp Val Phe Thr Cys Ile Met Ser Ile Ile Leu Gly Leu Asp Leu 485 490 495 Gly Leu Leu Ala Gly Leu Leu Phe Ala Leu Leu Thr Val Val Leu Arg 500 505 510 Val Gln Phe Pro Ser Trp Asn Gly Leu Gly Ser Val Pro Ser Thr Asp 515 520 525 Ile Tyr Lys Ser Ile Thr His Tyr Lys Asn Leu Glu Glu Pro Glu Gly 530 535 540 Val Lys Ile Leu Arg Phe Ser Ser Pro Ile Phe Tyr Gly Asn Val Asp 545 550 555 560 Gly Phe Lys Lys Cys Ile Asn Ser Thr Val Gly Phe Asp Ala Ile Arg 565 570 575 Val Tyr Asn Lys Arg Leu Lys Ala Leu Arg Arg Ile Gln Lys Leu Ile 580 585 590 Lys Lys Gly Gln Leu Arg Ala Thr Lys Asn Gly Ile Ile Ser Asp Ile 595 600 605 Gly Ser Ser Asn Asn Ala Phe Glu Pro Asp Glu Asp Val Glu Glu Pro 610 615 620 Glu Glu Leu Asn Ile Pro Thr Lys Glu Ile Glu Ile Gln Val Asp Trp 625 630 635 640 Asn Ser Glu Leu Pro Val Lys Val Asn Val Pro Lys Val Pro Ile His 645 650 655 Ser Leu Val Leu Asp Cys Gly Ala Val Ser Phe Leu Asp Val Val Gly 660 665 670 Val Arg Ser Leu Arg Met Ile Val Lys Glu Phe Gln Arg Ile Asp Val 675 680 685 Asn Val Tyr Phe Ala Leu Leu Gln Asp Asp Val Leu Glu Lys Met Glu 690 695 700 Gln Cys Gly Phe Phe Asp Asp Asn Ile Arg Lys Asp Arg Phe Phe Leu 705 710 715 720 Thr Val His Asp Ala Ile Leu His Leu Gln Asn Gln Val Lys Ser Arg 725 730 735 Glu Gly Gln Asp Ser Leu Leu Glu Thr Val Ala Arg Ile Arg Asp Cys 740 745 750 Lys Asp Pro Leu Asp Leu Met Glu Ala Glu Met Asn Ala Glu Glu Leu 755 760 765 Asp Val Gln Asp Glu Ala Met Arg Arg Leu Ala Ser 770 775 780 <210> 2 <211> 780 <212> PRT <213> Human <400> 2 Met Ala Ala Pro Gly Gly Arg Ser Glu Pro Pro Gln Leu Pro Glu Tyr 5 10 15 Ser Cys Ser Tyr Met Val Ser Arg Pro Val Tyr Ser Glu Leu Ala Phe 20 25 30 Gln Gln Gln His Glu Arg Arg Leu Gln Glu Arg Lys Thr Leu Arg Glu 35 40 45 Ser Leu Ala Lys Cys Cys Ser Cys Ser Arg Lys Arg Ala Phe Gly Val 50 55 60 Leu Lys Thr Leu Val Pro Ile Leu Glu Trp Leu Pro Lys Tyr Arg Val 65 70 75 80 Lys Glu Trp Leu Leu Ser Asp Val Ile Ser Gly Val Ser Thr Gly Leu 85 90 95 Val Ala Thr Leu Gln Gly Met Ala Tyr Ala Leu Leu Ala Ala Val Pro 100 105 110 Val Gly Tyr Gly Leu Tyr Ser Ala Phe Phe Pro Ile Leu Thr Tyr Phe 115 120 125 Ile Phe Gly Thr Ser Arg His Ile Ser Val Gly Pro Phe Pro Val Val 130 135 140 Ser Leu Met Val Gly Ser Val Val Leu Ser Met Ala Pro Asp Glu His 145 150 155 160 Phe Leu Val Ser Ser Ser Asn Gly Thr Val Leu Asn Thr Thr Met Ile 165 170 175 Asp Thr Ala Ala Arg Asp Thr Ala Arg Val Leu Ile Ala Ser Ala Leu 180 185 190 Thr Leu Leu Val Gly Ile Ile Gln Leu Ile Phe Gly Gly Leu Gln Ile 195 200 205 Gly Phe Ile Val Arg Tyr Leu Ala Asp Pro Leu Val Gly Gly Phe Thr 210 215 220 Thr Ala Ala Ala Phe Gln Val Leu Val Ser Gln Leu Lys Ile Val Leu 225 230 235 240 Asn Val Ser Thr Lys Asn Tyr Asn Gly Val Leu Ser Ile Ile Tyr Thr 245 250 255 Leu Val Glu Ile Phe Gln Asn Ile Gly Asp Thr Asn Leu Ala Asp Phe 260 265 270 Thr Ala Gly Leu Leu Thr Ile Val Val Cys Met Ala Val Lys Glu Leu 275 280 285 Asn Asp Arg Phe Arg His Lys Ile Pro Val Pro Ile Pro Ile Glu Val 290 295 300 Ile Val Thr Ile Ile Ala Thr Ala Ile Ser Tyr Gly Ala Asn Leu Glu 305 310 315 320 Lys Asn Tyr Asn Ala Gly Ile Val Lys Ser Ile Pro Arg Gly Phe Leu 325 330 335 Pro Pro Glu Leu Pro Pro Val Ser Leu Phe Ser Glu Met Leu Ala Ala 340 345 350 Ser Phe Ser Ile Ala Val Val Ala Tyr Ala Ile Ala Val Ser Val Gly 355 360 365 Lys Val Tyr Ala Thr Lys Tyr Asp Tyr Thr Ile Asp Gly Asn Gln Glu 370 375 380 Phe Ile Ala Phe Gly Ile Ser Asn Ile Phe Ser Gly Phe Phe Ser Cys 385 390 395 400 Phe Val Ala Thr Thr Ala Leu Ser Arg Thr Ala Val Gln Glu Ser Thr 405 410 415 Gly Gly Lys Thr Gln Val Ala Gly Ile Ile Ser Ala Ala Ile Val Met 420 425 430 Ile Ala Ile Leu Ala Leu Gly Lys Leu Leu Glu Pro Leu Gln Lys Ser 435 440 445 Val Leu Ala Ala Val Val Ile Ala Asn Leu Lys Gly Met Phe Met Gln 450 455 460 Leu Cys Asp Ile Pro Arg Leu Trp Arg Gln Asn Lys Ile Asp Ala Val 465 470 475 480 Ile Trp Val Phe Thr Cys Ile Val Ser Ile Ile Leu Gly Leu Asp Leu 485 490 495 Gly Leu Leu Ala Gly Leu Ile Phe Gly Leu Leu Thr Val Val Leu Arg 500 505 510 Val Gln Phe Pro Ser Trp Asn Gly Leu Gly Ser Ile Pro Ser Thr Asp 515 520 525 Ile Tyr Lys Ser Thr Lys Asn Tyr Lys Asn Ile Glu Glu Pro Gln Gly 530 535 540 Val Lys Ile Leu Arg Phe Ser Ser Pro Ile Phe Tyr Gly Asn Val Asp 545 550 555 560 Gly Phe Lys Lys Cys Ile Lys Ser Thr Val Gly Phe Asp Ala Ile Arg 565 570 575 Val Tyr Asn Lys Arg Leu Lys Ala Leu Arg Lys Ile Gln Lys Leu Ile 580 585 590 Lys Ser Gly Gln Leu Arg Ala Thr Lys Asn Gly Ile Ile Ser Asp Ala 595 600 605 Val Ser Thr Asn Asn Ala Phe Glu Pro Asp Glu Asp Ile Glu Asp Leu 610 615 620 Glu Glu Leu Asp Ile Pro Thr Lys Glu Ile Glu Ile Gln Val Asp Trp 625 630 635 640 Asn Ser Glu Leu Pro Val Lys Val Asn Val Pro Lys Val Pro Ile His 645 650 655 Ser Leu Val Leu Asp Cys Gly Ala Ile Ser Phe Leu Asp Val Val Gly 660 665 670 Val Arg Ser Leu Arg Val Ile Val Lys Glu Phe Gln Arg Ile Asp Val 675 680 685 Asn Val Tyr Phe Ala Ser Leu Gln Asp Tyr Val Ile Glu Lys Leu Glu 690 695 700 Gln Cys Gly Phe Phe Asp Asp Asn Ile Arg Lys Asp Thr Phe Phe Leu 705 710 715 720 Thr Val His Asp Ala Ile Leu Tyr Leu Gln Asn Gln Val Lys Ser Gln 725 730 735 Glu Gly Gln Gly Ser Ile Leu Glu Thr Ile Thr Leu Ile Gln Asp Cys 740 745 750 Lys Asp Thr Leu Glu Leu Ile Glu Thr Glu Leu Thr Glu Glu Glu Leu 755 760 765 Asp Val Gln Asp Glu Ala Met Arg Thr Leu Ala Ser 770 775 780 <210> 3 <211> 2343 <212> DNA <213> Mouse <400> 3 ATGGCAGCGC GGGGCGGCAG GTCGGAGCCG CCGCAGCTCG CCGAGTACAG CTGCAGTTAC 60 ACGGTGTCGC GGCCGGTGTA CAGCGAGCTC GCCTTCCAGC AGCAGCGCGA GCGGCGCCTG 120 CCTGAGCGCA GGACGCTGCG GGACAGCCTG GCGCGGAGCT GCAGTTGCTC AAGAAAGAGA 180 GCCTTTGGTG TGGTAAAGAC TCTCCTGCCC ATTCTGGACT GGCTCCCAAA ATACCGAGTC 240 AAGGAATGGC TCCTCAGTGA CATCATCTCC GGAGTTAGCA CTGGGCTGGT GGGTACCCTG 300 CAAGGGATGG CTTATGCCCT GCTGGCAGCA GTACCTGTTC AGTTCGGTCT CTACTCTGCC 360 TTTTTCCCTA TCCTGACGTA TTTTGTGTTC GGAACATCAA GACACATCTC AGTTGGCCCT 420 TTCCCCGTGG TCAGTTTAAT GGTGGGATCT GTTGTTCTGA GCATGGCTCC AGATGACCAC 480 TTTCTTGTGC CCAGCGGTAA CGGAAGTGCA TTGAACTCGA CCACGTTAGA CACTGGAACC 540 AGAGATGCGG CCCGAGTGTT GCTTGCAAGC ACACTCACTC TTCTAGTTGG AATCATACAG 600 CTGGTGTTTG GAGGTTTGCA GATTGGATTC ATAGTGAGGT ACTTGGCAGA CCCCTTGGTT 660 GGCGGATTCA CAACCGCTGC AGCCTTCCAA GTACTGGTCT CACAGCTAAA GATCGTGCTC 720 AATGTTTCAA CCAAAAACTA CAACGGCATC CTCTCCATTA TCTACACACT AATTGAGATT 780 TTTCAAAATA TCGGTGACAC CAATATTGCC GATTTCATCG CTGGGCTGCT GACCATCATC 840 GTCTGTATGG CTGTTAAGGA ACTAAATGAT CGATTTAAAC ACAGAATCCC GGTGCCCATT 900 CCTATAGAAG TGATTGTGAC AATAATTGCT ACTGCCATTT CCTATGGGGC CAACTTGGAA 960 AAGAACTACA ATGCTGGCAT TGTTAAGTCC ATCCCAAGTG GGTTCTTGCC TCCTGTCCTG 1020 CCATCTGTGG GCCTGTTTTC GGACATGTTG GCTGCATCCT TTTCCATTGC TGTGGTGGCT 1080 TACGCTATTG CAGTGTCTGT AGGAAAAGTC TACGCCACCA AGCATGACTA TGTCATCGAT 1140 GGGAACCAGG AATTCATTGC CTTTGGGATA AGCAACGTCT TCTCTGGATT TTTCTCCTGT 1200 TTTGTGGCTA CCACTGCTCT GTCTCGAACG GCTGTCCAGG AGAGCACCGG GGGGAAGACA 1260 CAGGTGGCTG GCCTCATCTC AGCTGTGATT GTGATGGTTG CCATCGTTGC CTTGGGGAGG 1320 CTTCTGGAAC CCTTGCAGAA GTCAGTCTTG GCGGCCGTTG TCATTGCCAA CCTGAAAGGG 1380 ATGTTTATGC AGGTGTGTGA CGTTCCTCGT CTGTGGAAGC AGAATAAGAC TGATGCTGTT 1440 ATCTGGGTGT TTACATGCAT AATGTCCATC ATTCTGGGGC TGGACCTCGG CTTGCTAGCT 1500 GGCCTTTTAT TTGCACTACT GACTGTGGTC CTGAGAGTTC AGTTCCCTTC ATGGAATGGC 1560 CTTGGAAGTG TCCCCAGCAC AGACATCTAC AAAAGCATCA CACATTATAA AAACCTTGAA 1620 GAGCCTGAAG GGGTGAAGAT CCTGAGATTT TCCAGTCCCA TTTTTTACGG CAATGTCGAT 1680 GGTTTTAAAA AATGTATCAA TTCAACGGTT GGATTTGATG CCATTAGAGT ATATAATAAG 1740 AGGCTGAAAG CACTGAGAAG AATACAGAAA CTCATCAAAA AAGGACAACT CAGGGCAACC 1800 AAGAACGGGA TCATAAGTGA TATTGGCTCA TCAAATAATG CCTTCGAGCC TGATGAAGAT 1860 GTGGAAGAGC CAGAGGAACT TAATATCCCA ACCAAAGAAA TTGAGATTCA AGTGGACTGG 1920 AACTCCGAAC TCCCGGTGAA AGTGAATGTC CCAAAGGTGC CAATCCACAG CCTGGTGCTG 1980 GATTGCGGAG CTGTATCCTT CCTGGATGTG GTAGGAGTGA GGTCATTGCG AATGATTGTC 2040 AAAGAATTTC AGAGAATTGA TGTGAATGTG TACTTTGCTC TGCTTCAAGA TGATGTGTTA 2100 GAAAAGATGG AGCAGTGTGG GTTCTTTGAT GACAACATTA GAAAGGACAG ATTCTTTCTG 2160 ACGGTTCATG ATGCAATCCT CCATCTGCAG AATCAGGTCA AATCCAGAGA AGGCCAGGAT 2220 TCCCTGCTAG AGACGGTCGC TCGCATTCGG GACTGTAAAG ACCCTCTTGA TCTGATGGAG 2280 GCAGAGATGA ATGCAGAAGA GCTCGATGTT CAGGATGAGG CCATGCGTAG ACTTGCTTCC 2340 TGA 2343 <210> 4 <211> 2343 <212> DNA <213> Human <400> 4 ATGGCAGCGC CAGGCGGCAG GTCGGAGCCG CCGCAGCTCC CCGAGTACAG CTGCAGCTAC 60 ATGGTGTCGC GGCCGGTCTA CAGCGAGCTC GCTTTCCAGC AACAGCACGA GCGGCGCCTG 120 CAGGAGCGCA AGACGCTGCG GGAGAGCCTG GCCAAGTGCT GCAGTTGTTC AAGAAAGAGA 180 GCCTTTGGTG TGCTAAAGAC TCTTGTGCCC ATCTTGGAGT GGCTCCCCAA ATACCGAGTC 240 AAGGAATGGC TGCTTAGTGA CGTCATTTCG GGAGTTAGTA CTGGGCTAGT GGCCACGCTG 300 CAAGGGATGG CATATGCCCT ACTAGCTGCA GTTCCTGTCG GATATGGTCT CTACTCTGCT 360 TTTTTCCCTA TCCTGACATA CTTTATCTTT GGAACATCAA GACATATCTC AGTTGGACCT 420 TTTCCAGTGG TGAGTTTAAT GGTGGGATCT GTTGTTCTGA GCATGGCCCC CGACGAACAC 480 TTTCTCGTAT CCAGCAGCAA TGGAACTGTA TTAAATACTA CTATGATAGA CACTGCAGCT 540 AGAGATACAG CTAGAGTCCT GATTGCCAGT GCCCTGACTC TGCTGGTTGG AATTATACAG 600 TTGATATTTG GTGGCTTGCA GATTGGATTC ATAGTGAGGT ACTTGGCAGA TCCTTTGGTT 660 GGTGGCTTCA CAACAGCTGC TGCCTTCCAA GTGCTGGTCT CACAGCTAAA GATTGTCCTC 720 AATGTTTCAA CCAAAAACTA CAATGGAGTT CTCTCTATTA TCTATACGCT GGTTGAGATT 780 TTTCAAAATA TTGGTGATAC CAATCTTGCT GATTTCACTG CTGGATTGCT CACCATTGTC 840 GTCTGTATGG CAGTTAAGGA ATTAAATGAT CGGTTTAGAC ACAAAATCCC AGTCCCTATT 900 CCTATAGAAG TAATTGTGAC GATAATTGCT ACTGCCATTT CATATGGAGC CAACCTGGAA 960 AAAAATTACA ATGCTGGCAT TGTTAAATCC ATCCCAAGGG GGTTTTTGCC TCCTGAACTT 1020 CCACCTGTGA GCTTGTTCTC GGAGATGCTG GCTGCATCAT TTTCCATCGC TGTGGTGGCT 1080 TATGCTATTG CAGTGTCAGT AGGAAAAGTA TATGCCACCA AGTATGATTA CACCATCGAT 1140 GGGAACCAGG AATTCATTGC CTTTGGGATC AGCAACATCT TCTCAGGATT CTTCTCTTGT 1200 TTTGTGGCCA CCACTGCTCT TTCCCGCACG GCCGTCCAGG AGAGCACTGG AGGAAAGACA 1260 CAGGTTGCTG GCATCATCTC TGCTGCGATT GTGATGATCG CCATTCTTGC CCTGGGGAAG 1320 CTTCTGGAAC CCTTGCAGAA GTCGGTCTTG GCAGCTGTTG TAATTGCCAA CCTGAAAGGG 1380 ATGTTTATGC AGCTGTGTGA CATTCCTCGT CTGTGGAGAC AGAATAAGAT TGATGCTGTT 1440 ATCTGGGTGT TTACGTGTAT AGTGTCCATC ATTCTGGGGC TGGATCTCGG TTTACTAGCT 1500 GGCCTTATAT TTGGACTGTT GACTGTGGTC CTGAGAGTTC AGTTTCCTTC TTGGAATGGC 1560 CTTGGAAGCA TCCCTAGCAC AGATATCTAC AAAAGTACCA AGAATTACAA AAACATTGAA 1620 GAACCTCAAG GAGTGAAGAT TCTTAGATTT TCCAGTCCTA TTTTCTATGG CAATGTCGAT 1680 GGTTTTAAAA AATGTATCAA GTCCACAGTT GGATTTGATG CCATTAGAGT ATATAATAAG 1740 AGGCTGAAAG CGCTGAGGAA AATACAGAAA CTAATAAAAA GTGGACAATT AAGAGCAACA 1800 AAGAATGGCA TCATAAGTGA TGCTGTTTCA ACAAATAATG CTTTTGAGCC TGATGAGGAT 1860 ATTGAAGATC TGGAGGAACT TGATATCCCA ACCAAGGAAA TAGAGATTCA AGTGGATTGG 1920 AACTCTGAGC TTCCAGTCAA AGTGAACGTT CCCAAAGTGC CAATCCATAG CCTTGTGCTT 1980 GACTGTGGAG CTATATCTTT CCTGGACGTT GTTGGAGTGA GATCACTGCG GGTGATTGTC 2040 AAAGAATTCC AAAGAATTGA TGTGAATGTG TATTTTGCAT CACTTCAAGA TTATGTGATA 2100 GAAAAGCTGG AGCAATGCGG GTTCTTTGAC GACAACATTA GAAAGGACAC ATTCTTTTTG 2160 ACGGTCCATG ATGCTATACT CTATCTACAG AACCAAGTGA AATCTCAAGA GGGTCAAGGT 2220 TCCATTTTAG AAACGATCAC TCTCATTCAG GATTGTAAAG ATACCCTTGA ATTAATAGAA 2280 ACAGAGCTGA CGGAAGAAGA ACTTGATGTC CAGGATGAGG CTATGCGTAC ACTTGCATCC 2340 TGA 2343 <210> 5 <211> 440 <212> DNA <213> Mouse <400> 5 CTTTGCTCTG CTTCAAGATG ATGTGTTAGA AAAGATGGAG CAGTGTGGGT TCTTTGATGA 60 CAACATTAGA AAGGACAGAT TCTTTCTGAC GGTTCATGAT GCAATCCTCC ATCTGCAGAA 120 CCAGGTCAAA TCCAGAGAAG GCCAGGATTC CCTGCTAGAG ACGGTCGCTC GCATTCGGGA 180 CTGTAAAGAC CCTCTTGATC TGATGGAGGC AGAGATGAAT GCAGAAGAGC TCGATGTTCA 240 GGATGAGGCC ATGCGTAGAC TTGCTTCCTG AGAGAGGACT GCTAGACAGA ACTGGCTGTC 300 AGCCCAGTCT CTACAAGTGT TTTCTGCACT GACTGTTTCT TTGCACTTCA GCAGCCATCC 360 GCTTACTGTT ACGTTGAAAT ATAATACAGT CTGAACTTCT TAGCACACAC AAGAAACTTT 420 GTTGTTCTGA TCTTTAATGC 440 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 GGWACMTCMM GMCAYATCTC 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 AACCCACACT GCTCCATCTT TTCT 24 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 GGCTCCAGAT GACCACTTTC 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 GAGACAGAGC AGTGGTAGCC 20 <210> 10 <211> 3104 <212> DNA <213> Mouse <400> 10 GGCAGAACTC CGGAGCCCAA ACAGGTGGCC GGCCGCAGGG ACAGTTTGTT GCCAGCGCCG 60 AGGACTGCGG GACGCGGACC GGCTTTCCGA AGTCGCTGCC ACAGGTGGCA CCCGAGGCTG 120 CTCCCAGGTG CCCGCCGCGG GCCGTTTGCT CGCTCCGCGT TTCCGAACGT CATCCCTCGT 180 CGCATCCCCT CCAGGCCGGC GGTCCTCGGG TACGCAGGCC ATGGCAGCGC GGGGCGGCAG 240 GTCGGAGCCG CCGCAGCTCG CCGAGTACAG CTGCAGTTAC ACGGTGTCGC GGCCGGTGTA 300 CAGCGAGCTC GCCTTCCAGC AGCAGCGCGA GCGGCGCCTG CCTGAGCGCA GGACGCTGCG 360 GGACAGCCTG GCGCGGAGCT GCAGTTGCTC AAGAAAGAGA GCCTTTGGTG TGGTAAAGAC 420 TCTCCTGCCC ATTCTGGACT GGCTCCCAAA ATACCGAGTC AAGGAATGGC TCCTCAGTGA 480 CATCATCTCC GGAGTTAGCA CTGGGCTGGT GGGTACCCTG CAAGGGATGG CTTATGCCCT 540 GCTGGCAGCA GTACCTGTTC AGTTCGGTCT CTACTCTGCC TTTTTCCCTA TCCTGACGTA 600 TTTTGTGTTC GGAACATCAA GACACATCTC AGTTGGCCCT TTCCCCGTGG TCAGTTTAAT 660 GGTGGGATCT GTTGTTCTGA GCATGGCTCC AGATGACCAC TTTCTTGTGC CCAGCGGTAA 720 CGGAAGTGCA TTGAACTCGA CCACGTTAGA CACTGGAACC AGAGATGCGG CCCGAGTGTT 780 GCTTGCAAGC ACACTCACTC TTCTAGTTGG AATCATACAG CTGGTGTTTG GAGGTTTGCA 840 GATTGGATTC ATAGTGAGGT ACTTGGCAGA CCCCTTGGTT GGCGGATTCA CAACCGCTGC 900 AGCCTTCCAA GTACTGGTCT CACAGCTAAA GATCGTGCTC AATGTTTCAA CCAAAAACTA 960 CAACGGCATC CTCTCCATTA TCTACACACT AATTGAGATT TTTCAAAATA TCGGTGACAC 1020 CAATATTGCC GATTTCATCG CTGGGCTGCT GACCATCATC GTCTGTATGG CTGTTAAGGA 1080 ACTAAATGAT CGATTTAAAC ACAGAATCCC GGTGCCCATT CCTATAGAAG TGATTGTGAC 1140 AATAATTGCT ACTGCCATTT CCTATGGGGC CAACTTGGAA AAGAACTACA ATGCTGGCAT 1200 TGTTAAGTCC ATCCCAAGTG GGTTCTTGCC TCCTGTCCTG CCATCTGTGG GCCTGTTTTC 1260 GGACATGTTG GCTGCATCCT TTTCCATTGC TGTGGTGGCT TACGCTATTG CAGTGTCTGT 1320 AGGAAAAGTC TACGCCACCA AGCATGACTA TGTCATCGAT GGGAACCAGG AATTCATTGC 1380 CTTTGGGATA AGCAACGTCT TCTCTGGATT TTTCTCCTGT TTTGTGGCTA CCACTGCTCT 1440 GTCTCGAACG GCTGTCCAGG AGAGCACCGG GGGGAAGACA CAGGTGGCTG GCCTCATCTC 1500 AGCTGTGATT GTGATGGTTG CCATCGTTGC CTTGGGGAGG CTTCTGGAAC CCTTGCAGAA 1560 GTCAGTCTTG GCGGCCGTTG TCATTGCCAA CCTGAAAGGG ATGTTTATGC AGGTGTGTGA 1620 CGTTCCTCGT CTGTGGAAGC AGAATAAGAC TGATGCTGTT ATCTGGGTGT TTACATGCAT 1680 AATGTCCATC ATTCTGGGGC TGGACCTCGG CTTGCTAGCT GGCCTTTTAT TTGCACTACT 1740 GACTGTGGTC CTGAGAGTTC AGTTCCCTTC ATGGAATGGC CTTGGAAGTG TCCCCAGCAC 1800 AGACATCTAC AAAAGCATCA CACATTATAA AAACCTTGAA GAGCCTGAAG GGGTGAAGAT 1860 CCTGAGATTT TCCAGTCCCA TTTTTTACGG CAATGTCGAT GGTTTTAAAA AATGTATCAA 1920 TTCAACGGTT GGATTTGATG CCATTAGAGT ATATAATAAG AGGCTGAAAG CACTGAGAAG 1980 AATACAGAAA CTCATCAAAA AAGGACAACT CAGGGCAACC AAGAACGGGA TCATAAGTGA 2040 TATTGGCTCA TCAAATAATG CCTTCGAGCC TGATGAAGAT GTGGAAGAGC CAGAGGAACT 2100 TAATATCCCA ACCAAAGAAA TTGAGATTCA AGTGGACTGG AACTCCGAAC TCCCGGTGAA 2160 AGTGAATGTC CCAAAGGTGC CAATCCACAG CCTGGTGCTG GATTGCGGAG CTGTATCCTT 2220 CCTGGATGTG GTAGGAGTGA GGTCATTGCG AATGATTGTC AAAGAATTTC AGAGAATTGA 2280 TGTGAATGTG TACTTTGCTC TGCTTCAAGA TGATGTGTTA GAAAAGATGG AGCAGTGTGG 2340 GTTCTTTGAT GACAACATTA GAAAGGACAG ATTCTTTCTG ACGGTTCATG ATGCAATCCT 2400 CCATCTGCAG AATCAGGTCA AATCCAGAGA AGGCCAGGAT TCCCTGCTAG AGACGGTCGC 2460 TCGCATTCGG GACTGTAAAG ACCCTCTTGA TCTGATGGAG GCAGAGATGA ATGCAGAAGA 2520 GCTCGATGTT CAGGATGAGG CCATGCGTAG ACTTGCTTCC TGAGAGAGGA CTGCTAGACA 2580 GAACCTGGCT GTCAGCCCAG TCTCTGCAAG TGTTTTCTGC ACTGACTGTT TCTTTGCACT 2640 TCAGCAGCCA TCCGCTTACT GTTACGTTGA AATATAATAC AGTCTGAAGC TTCTTAGGCA 2700 CCACACAAGA AACACTTGTT GTTTCTGATG CTTTAATGCA GAAACAAGCA GCTTAGCTGC 2760 AAAATATCCA AAACCAGGAG AATTAGCCCT GAGAATTAGC AATGTTCGGA TGTGCTGCAG 2820 TGACTCACTA TGTGCTGCTG TGACACACTG TGTGCTGGAT GCCAAAGCAG GTTTGCTGTC 2880 TGAGCCCATA AGGGTTCCAT CTGTCTCTGT TAGGCTGGCC CAACAGCTTC TATGGGCAGG 2940 TGAGTTAGGA AGGACTAATC ACAGAGATTC CTGACTGACT CTGAAATCCA TGTGTTGTGT 3000 TGACCACAGT GAGAAGAAGG ATAAGGTAGA ATTACTGTGT ACTCATTAAT GAACTTTAAA 3060 GAAAATAAAA CCAATCTTTT AAAAAATGAA AAAAAAAAAA AAAA 3104 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 AAGGTGTCTG TTGCTCCGTA AA 22 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 TTGGGTCAGC ACTCACTCTA ACT 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 GACGTCATTT CGGGAGTTAG 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 GGCTTGCAGA TTGGATTCAT 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 CCTCCTGAAC TTCCACCTGT 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 AGTCCAAATA TAAGGCCAGC 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 AGCTCAGAGT TCCAATCCAC 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 GTGTACGCAT AGCCTCATCC 20 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 TATAAAGGCA GCGGAAGGGT AGTC 24 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 CGCTGCCAAA TCGTCTGAAT AAT 23 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 GGCCACAAAA CAAGAGAAGA ATCC 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 TAAGGCCAGC TAGTAAACCG AGAT 24 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 CTAACTCCCG AAATGACGTC 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 ATGAATCCAA TCTGCAAGCC 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 ACAGGTGGAA GTTCAGGAGG 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 GCTGGCCTTA TATTTGGACT 20 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 GTGGATTGGA ACTCTGAGCT T 21 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 GGATGAGGCT ATGCGTACAC 20 <210> 29 <211> 2782 <212> DNA <213> Human <400> 29 AAGGTGTCTG TTGCTCCGTA AATAAAACGT CCCACTGCCT TCTGAGAGCG CTATAAAGGC 60 AGCGGAAGGG TAGTCCGCGG GGCATTCCGG GCGGGGCGCG AGCAGAGACA GGTCATGGCA 120 GCGCCAGGCG GCAGGTCGGA GCCGCCGCAG CTCCCCGAGT ACAGCTGCAG CTACATGGTG 180 TCGCGGCCGG TCTACAGCGA GCTCGCTTTC CAGCAACAGC ACGAGCGGCG CCTGCAGGAG 240 CGCAAGACGC TGCGGGAGAG CCTGGCCAAG TGCTGCAGTT GTTCAAGAAA GAGAGCCTTT 300 GGTGTGCTAA AGACTCTTGT GCCCATCTTG GAGTGGCTCC CCAAATACCG AGTCAAGGAA 360 TGGCTGCTTA GTGACGTCAT TTCGGGAGTT AGTACTGGGC TAGTGGCCAC GCTGCAAGGG 420 ATGGCATATG CCCTACTAGC TGCAGTTCCT GTCGGATATG GTCTCTACTC TGCTTTTTTC 480 CCTATCCTGA CATACTTTAT CTTTGGAACA TCAAGACATA TCTCAGTTGG ACCTTTTCCA 540 GTGGTGAGTT TAATGGTGGG ATCTGTTGTT CTGAGCATGG CCCCCGACGA ACACTTTCTC 600 GTATCCAGCA GCAATGGAAC TGTATTAAAT ACTACTATGA TAGACACTGC AGCTAGAGAT 660 ACAGCTAGAG TCCTGATTGC CAGTGCCCTG ACTCTGCTGG TTGGAATTAT ACAGTTGATA 720 TTTGGTGGCT TGCAGATTGG ATTCATAGTG AGGTACTTGG CAGATCCTTT GGTTGGTGGC 780 TTCACAACAG CTGCTGCCTT CCAAGTGCTG GTCTCACAGC TAAAGATTGT CCTCAATGTT 840 TCAACCAAAA ACTACAATGG AGTTCTCTCT ATTATCTATA CGCTGGTTGA GATTTTTCAA 900 AATATTGGTG ATACCAATCT TGCTGATTTC ACTGCTGGAT TGCTCACCAT TGTCGTCTGT 960 ATGGCAGTTA AGGAATTAAA TGATCGGTTT AGACACAAAA TCCCAGTCCC TATTCCTATA 1020 GAAGTAATTG TGACGATAAT TGCTACTGCC ATTTCATATG GAGCCAACCT GGAAAAAAAT 1080 TACAATGCTG GCATTGTTAA ATCCATCCCA AGGGGGTTTT TGCCTCCTGA ACTTCCACCT 1140 GTGAGCTTGT TCTCGGAGAT GCTGGCTGCA TCATTTTCCA TCGCTGTGGT GGCTTATGCT 1200 ATTGCAGTGT CAGTAGGAAA AGTATATGCC ACCAAGTATG ATTACACCAT CGATGGGAAC 1260 CAGGAATTCA TTGCCTTTGG GATCAGCAAC ATCTTCTCAG GATTCTTCTC TTGTTTTGTG 1320 GCCACCACTG CTCTTTCCCG CACGGCCGTC CAGGAGAGCA CTGGAGGAAA GACACAGGTT 1380 GCTGGCATCA TCTCTGCTGC GATTGTGATG ATCGCCATTC TTGCCCTGGG GAAGCTTCTG 1440 GAACCCTTGC AGAAGTCGGT CTTGGCAGCT GTTGTAATTG CCAACCTGAA AGGGATGTTT 1500 ATGCAGCTGT GTGACATTCC TCGTCTGTGG AGACAGAATA AGATTGATGC TGTTATCTGG 1560 GTGTTTACGT GTATAGTGTC CATCATTCTG GGGCTGGATC TCGGTTTACT AGCTGGCCTT 1620 ATATTTGGAC TGTTGACTGT GGTCCTGAGA GTTCAGTTTC CTTCTTGGAA TGGCCTTGGA 1680 AGCATCCCTA GCACAGATAT CTACAAAAGT ACCAAGAATT ACAAAAACAT TGAAGAACCT 1740 CAAGGAGTGA AGATTCTTAG ATTTTCCAGT CCTATTTTCT ATGGCAATGT CGATGGTTTT 1800 AAAAAATGTA TCAAGTCCAC AGTTGGATTT GATGCCATTA GAGTATATAA TAAGAGGCTG 1860 AAAGCGCTGA GGAAAATACA GAAACTAATA AAAAGTGGAC AATTAAGAGC AACAAAGAAT 1920 GGCATCATAA GTGATGCTGT TTCAACAAAT AATGCTTTTG AGCCTGATGA GGATATTGAA 1980 GATCTGGAGG AACTTGATAT CCCAACCAAG GAAATAGAGA TTCAAGTGGA TTGGAACTCT 2040 GAGCTTCCAG TCAAAGTGAA CGTTCCCAAA GTGCCAATCC ATAGCCTTGT GCTTGACTGT 2100 GGAGCTATAT CTTTCCTGGA CGTTGTTGGA GTGAGATCAC TGCGGGTGAT TGTCAAAGAA 2160 TTCCAAAGAA TTGATGTGAA TGTGTATTTT GCATCACTTC AAGATTATGT GATAGAAAAG 2220 CTGGAGCAAT GCGGGTTCTT TGACGACAAC ATTAGAAAGG ACACATTCTT TTTGACGGTC 2280 CATGATGCTA TACTCTATCT ACAGAACCAA GTGAAATCTC AAGAGGGTCA AGGTTCCATT 2340 TTAGAAACGA TCACTCTCAT TCAGGATTGT AAAGATACCC TTGAATTAAT AGAAACAGAG 2400 CTGACGGAAG AAGAACTTGA TGTCCAGGAT GAGGCTATGC GTACACTTGC ATCCTGAAAG 2460 TGGGTTCGGG AGGTCTCTAT GAGCAAGGAA TACAAGACAA AACTTCCTCA ATGCATTGAC 2520 TATTTCTTCA GACTCAAAAC ACTCATTCTT TTTTCTATTA AGCCATTGAA AGAGAAGCAC 2580 TAAGACTGCT TCTAGGCTTT ATTTATAAAA TAAACACCTT ATCCCTAACA TGGGCAAAAT 2640 GGCTAGAATT ATTCAGACGA TTTGGCAGCG TCCAGGGTAA GCTGGTGTTA TAATACGCTG 2700 CTGATCTACA TCACAGATTT GCTAATAATG TTCACGTGGG CCCTGGCATA TCTCTGTTCA 2760 GTTAGAGTGA GTGCTGACCC AA 2782

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２で示した性状および気道過敏性亢進モ
デルマウスでのＰｅｎｄｒｉｎ遺伝子産物（ｍＲＮＡ）
の組織分布を示す。図中、Lu、H、Li、Ki、Br、Th、S
p、SI、LIおよびStはそれぞれ、肺、心臓、肝臓、腎
臓、脳、胸腺、脾臓、小腸、大腸および胃を示す。

【図２】ヒトＰｅｎｄｒｉｎ遺伝子とマウスＰｅｎｄｒ
ｉｎ遺伝子の塩基配列の比較を示す。

【図３】ヒトＰｅｎｄｒｉｎタンパク質とマウスＰｅｎ
ｄｒｉｎタンパク質のアミノ酸配列の比較を示す。

【図４】実施例３で示した気道過敏性亢進の経時変化を
示す。アセチルコリン（Ａｃｈ）は５００μｇ／ｋｇを
使用した。＊＊：ｐ＜０．０１（Dunnett Test）

【図５】実施例３で示した肺胞洗浄液中の浸潤細胞数の
経時変化を示す。図中、Ｍφ、Ｅｏｓ、ＮｅｕおよびＬ
ｙｍはそれぞれ、マクロファージ、好酸球、好中球およ
びリンパ球を示す。

【図６】実施例３で示した気道過敏性亢進モデルマウス
でのＰｅｎｄｒｉｎ遺伝子産物（ｍＲＮＡ）の経時変化
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 11/00 Ａ６１Ｐ 11/06 11/06 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＧ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/02 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同
一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いるこ
とを特徴とする、配列番号：１で表されるアミノ酸配列
と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタ
ンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性
を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２】配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列が配列番号：２で表されるア
ミノ酸配列である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同
一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が、配列番
号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に
同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分
ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡで形質転
換された形質転換体の細胞膜上に発現されたものである
請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同
一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する
ことを特徴とする、配列番号：１で表されるアミノ酸配
列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する
タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活
性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キ
ット。
【請求項５】請求項１記載のスクリーニング方法または
請求項４記載のスクリーニング用キットを用いて得られ
る、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしく
は実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もし
くはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化
合物またはその塩。
【請求項６】請求項５記載の化合物またはその塩を含有
してなる医薬。
【請求項７】気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の予防
・治療剤である請求項６記載の医薬。
【請求項８】アニオントランスポーター阻害作用を有す
る化合物またはその塩を含有してなる気管支喘息または
慢性閉塞性肺疾患の予防・治療剤。
【請求項９】配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同
一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗
体。
【請求項１０】請求項９記載の抗体を含有してなる診断
薬。
【請求項１１】請求項５記載の化合物またはその塩を投
与することを特徴とする肺・胸部疾患の予防または治療
方法。
【請求項１２】請求項９記載の抗体を使用することを特
徴とする肺・胸部疾患の診断方法。