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WO2000044714A1 - S-nitrosotioles como agentes para el tratamiento de disfunciones circulatorias - Google Patents

S-nitrosotioles como agentes para el tratamiento de disfunciones circulatorias Download PDF

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WO2000044714A1
WO2000044714A1 PCT/ES2000/000019 ES0000019W WO0044714A1 WO 2000044714 A1 WO2000044714 A1 WO 2000044714A1 ES 0000019 W ES0000019 W ES 0000019W WO 0044714 A1 WO0044714 A1 WO 0044714A1
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WO
WIPO (PCT)
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amino
glycine
radical
acetyl
nitrosothiols
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/ES2000/000019
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English (en)
French (fr)
Inventor
José Repolles Moliner
Eduardo Salas Perez-Rasilla
Francisco Pubill Coy
Juan Antonio Cerda Riudavets
Cristina Negrie Rofes
Lydia Cabeza Llorente
Alicia Ferrer Siso
Nuria Trias Adroher
Marcel.Li Carbo Banus
Jesús MURAT MORENO
Pedro Michelena Llaguno
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lacer SA
Original Assignee
Lacer SA
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Priority to IL14438100A priority patent/IL144381A/xx
Priority to AT00900518T priority patent/ATE249428T1/de
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    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to new S-nitrosothiols derived from penicillamine or glutathione, with vasodilatory and inhibitory action of platelet aggregation and, consequently, are useful for the preparation of medicaments for the treatment of disorders of the circulatory system, especially at the cardiovascular level.
  • nitric oxide nitric oxide
  • the compounds capable of releasing nitric oxide (NO) in the organism manifest in some cases some type of activity at the vascular system level, for example vasodilation or inhibition of platelet aggregation, which It makes it potentially beneficial for the treatment of different disorders related to circulatory system dysfunctions.
  • certain derivatives containing an S-nitrosothiol group since they are capable of releasing NO into the body, also show properties that are medically useful.
  • Radoms i et al., Br. J. Pharma col. (1992) 107, 745-749 describe the inhibitory activity of platelet activation of S-nitrosoglutathione (GSNO).
  • Patent application WO95 / 07691 describes the use of different S-nitrosothiols, particularly GSNO, in the treatment and prevention of platelet deposition and thrombus formation in the damaged vascular surface.
  • Patent application O93 / 09806 describes proteins or residues of S-nitrosated amino acids, capable of releasing NO, which manifest a relaxing activity of smooth muscles and an inhibitory effect on platelet aggregation.
  • the object of the invention are new S-nitrosothiol compounds, derivatives of penicillate or glutathione, which simultaneously have a potent vasodilator action and high efficacy as inhibitors of platelet aggregation.
  • the compounds object of the invention are S-nitrosothiols derived from penicillamine or glutathione, and their pharmaceutically acceptable salts, which correspond to the general formula (I)
  • a and B are phenyl groups or, together, make up the residue -CH 2 -Q-CH 2 - constituting a six-unit ring in which Q represents an oxygen or sulfur atom or an N-R 3 moiety, in which R 3 is hydrogen or a C ⁇ -C alkyl group;
  • R 1 is an acyl moiety, which may be a C 1 -C 5 aliphatic acyl or a glutamic acid moiety attached through its non-amino acid carboxyl;
  • R 2 is a hydroxyl group or a glycine residue linked by a peptide bond; so that when R 1 is an aliphatic acyl moiety R 2 is a hydroxyl group, and when R 1 is a glutamic acid residue R 2 is a glycine residue.
  • a and B have the values indicated above and R 4 is a C ⁇ ⁇ C 4 alkyl group, or its pharmaceutically acceptable salts.
  • the compounds object of the present invention can be obtained in different ways depending on their basic structure.
  • amino acid hydrochlorides which in turn can be obtained by known methods, for example those described in German patent applications DE-A-3023830 and DE-A-2801849, acylate amino acid nitrogen by conventional techniques, for example with an acid chloride, and as a final step the nitrous group is introduced into mercaptanic sulfur, also using conventional nitrosation techniques.
  • the tripeptide formation consists of the following steps: a) Anchoring of the C-terminal glycine (Gly) amino acid, in the form of derived tert-butoxycarbonyl (Boc), to a p-methylbenzylhydrylamine / polystyrene resin. b) Deprotection of the Boc group with trifluoroacetic acid and neutralization. c) Incorporation of the protected intermediate modified amino acid. d) Evaluation of the coupling reaction by ninhydrin (Kaiser, E. et al., Anal. Biochem., 34, 595 (1970)). e) Repeating the previous steps for the ⁇ -glutamic ( ⁇ -Glu) residue that is incorporated as Boc-derivative or protected benzyl
  • the tests carried out show that the new S-nitrosated compounds object of the invention have a vasodilator activity comparable, as a minimum, with that of the GSNO, and in some cases much higher, and also have an inhibitory effect of platelet aggregation that also turns out to be similar or superior to that of the GSNO, in some of the cases considerably higher.
  • the compounds object of the present invention can be used very effectively in the preparation of drugs with vasodilator and antithrombotic effect for the treatment of circulatory system dysfunctions, especially at the cardiovascular and coronary level. Therefore, the compounds of the general formula (I), as well as their pharmaceutically acceptable salts, can be used, by using conventional galenic techniques, to prepare medicaments that can be administered by different routes.
  • compositions such as tablets, capsules, syrups and suspensions.
  • parenterally in the form of solutions or emulsions, etc. can also be administered topically in the form of creams, ointments, ointments, etc., and also transdermally, for example by means of patches and dressings. They can also be applied directly to the rectum, in the form of suppositories.
  • the preparations may contain physiologically acceptable carriers, excipients, activators, chelating agents, stabilizers, etc. In the case of injectables, physiologically acceptable buffers, solubilizing or isotonic agents may be incorporated.
  • the daily dose may vary depending on the symptoms, the age, the body weight of the patients, the mode of administration, etc., and the normal daily dose for an adult can be between 0.1 and 500 mg, and can be administered in a single dose or divided into several doses per day.
  • the working frequency and the solvent used to carry out the spectrum are indicated in the 1 H-NMR spectra.
  • the position of the signals is indicated in ⁇ (ppm), using the solvent protons signal as a reference. 7.24 ppm for chloroform and 2.49 ppm for deuterated dimethylsulfoxide are taken as reference values.
  • the number of protons corresponding to each signal measured by electronic integration and the type of signal are indicated using the following abbreviations: s (singlet), d (doublet), t (triplet), dd (doublet doublet), sa (broad signal), se (complex signal), of D 2 0 (disappears when performing the spectrum after adding a few drops of deuterated water).
  • the 13 C-NMR spectra indicate the working frequency and the solvent used in each spectrum.
  • the position of the signals is indicated in ⁇ (ppm), using the solvent protons signal as a reference. 77.00 ppm for chloroform and 39.50 ppm for deuterated dimethylsulfoxide are taken as reference values.
  • Nuclear magnetic resonance experiments have also been performed using the APT (Attached Proton Test) pulse sequence.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Stage 1) 4.0 g are introduced into a 250 mL flask equipped with magnetic stirring. (17.6 mmol) of 2-amino-2- [4- (4- mercaptotetrahydropyran)] acetic acid hydrochloride, and 60 mL of 0.5N potassium hydroxide solution. Then add 3.07 g. (21.8 mmol) of anhydrous potassium carbonate and 60 mL of MeCN. The mixture is cooled with an ice bath and 1.42 mL (19.7 mmol) of acetyl chloride dissolved in 25 mL of MeCN is added dropwise. After the addition, 0.5N potassium hydroxide is added until pH 9-10. The mixture is stirred at room temperature for 2 hours.
  • Step 2 80 mg (0.34 mmol) of N-acetyl-2-amino-2- (4- (-mercaptotetrahydropyran)) acetic acid is dissolved in 4000 ⁇ L of MeOH. 500 ⁇ L of 1 N HC1 solution and 136 ⁇ L of 5M NaN0 2 solution are added. The resulting solution is treated for 1 minute in an ultrasonic bath and then 50 ⁇ L of 10 N NaOH solution and 14 ⁇ L are added. of H 2 0.
  • Stage 1 3.69 g are introduced into a 250 mL flask equipped with magnetic stirring. (13 mmol) of 2-amino-2- [4- (4-mercapto-l-methylpiperidin)] acetic acid dihydrochloride, and 30 mL of 0.5N potassium hydroxide solution. Then add 2.2 g. (16 mmol) of anhydrous potassium carbonate and 30 mL of MeCN. The mixture is cooled with an ice bath and 1.0 mL (14 mmol) of acetyl chloride dissolved in 10 mL of MeCN is added dropwise. After the addition, 0.5N potassium hydroxide is added until pH 9-10. The mixture is stirred at room temperature for 2 hours.
  • Step 2) 50 mg (0.20 mmol) of the N-acetyl-2-amino-2- [4- (4-mercapto-l-methylpiperidin)] acetic acid are dissolved in 800 ⁇ L of solution
  • ⁇ -RMN (200 Mhz, D 2 0): 4.71 (1H, s, CH), 2.70-2.20 (8H, se, CH 2 ), 1.95 (3H, s., CH 3 -N), 1.71 (3H, s, CH 3 -CO).
  • Example 3 Obtaining N-acetyl-2-amino-3-benzyl-3-S-nitrosomercapto-4-phenylbutanoic acid (3).
  • Stage 1 2.0 g is introduced into a 100 mL flask equipped with magnetic stirring. (5.9 mmol) of 2-amino-3-benzyl-3-mercapto-4-phenylbutanoic acid, and 20 mL of 0.5N potassium hydroxide solution. Then add 1.0 g. (7.2 mmol) of anhydrous potassium carbonate and 20 mL of MeCN. The mixture is cooled with an ice bath and drop added to 0.5 mL (6.5 mmol) of acetyl chloride dissolved in 8 mL of MeCN. After the addition, 1N potassium hydroxide is added until pH 12-13. The mixture is stirred at room temperature for 2 hours.
  • Step 2) 0.62 g (1.8 mmol) of N-acetyl-2-amino-3-benzyl-3-mercapto-4-phenylbutanoic acid are dissolved in 25 mL of MeOH. 25 mL of 1 N HCl solution and a solution of 250 mg of NaN0 2 in 25 mL of H 2 are added. The resulting solution is stirred for 35 minutes at room temperature, filtered and washed. with water. After drying under reduced pressure in the presence of P 2 0 5 , 0.33 g of a solid are obtained.
  • Stage 1 In a 250 mL flask equipped with magnetic stirring, 5.8 g (25.5 mmol) of 2-amino-2- (4- (4- mercaptotetrahydropyran)) acetic acid hydrochloride, 4.7 g (25.5 mmol) of ⁇ are mixed -bromo-p-xylene and 100 mL of a H 2 0 / EtOH 3: 1 mixture. 11 mL of triethylamine are added, an argon atmosphere is created and the mixture is stirred for 18 h at room temperature. 50 mL more of H 2 0 / EtOH 3: 1 are added and stirred for a further 2 h.
  • the resulting suspension is filtered and washed with 100 mL of water and 50 mL of EtOH. A solid is obtained which is dried under reduced pressure. 300 mL of concentrated hydrochloric acid is added to the solid and the solvent is removed under reduced pressure. The same acid treatment is repeated a second time, obtaining a solid that is dried under reduced pressure. 1.59 g of the intermediate of interest are obtained.
  • TLC thin layer chromatography
  • the product is isolated by performing two consecutive extraction treatments with 50 mL of hexane.
  • Three extraction steps are then carried out with 60 mL of AcOEt each.
  • the AcOEt solution is dried with anhydrous MgSO 4 and, after removal of the solvent by evaporation, the product is redissolved in DCM and evaporated again. This step is repeated two more times, after which 1191 mg (3,015 mmol) of the protected N-Boc intermediate is obtained.
  • the tripeptide is prepared by solid phase synthesis techniques, starting from 1595 mg of a Boc-Gly-OCH 2 -Pam-resin (Neosystem, no. RP00801) substitution 0.63 mmol / g.
  • the work scale is 1,005 mmol.
  • ninhydrin test is positive in the last stage, it is then re-copied, repeating steps 5-8.
  • the coupling is made with 6 equivalents (eq) of DIEA, 3 eq. of Boc-amino acid and 3 eq. of activating agent, which in our case is PyAOp (7-azabenzotriazol-l-yl-oxitris (pyrrolidino) phosphonium hexafluorophosphate).
  • activating agent which in our case is PyAOp (7-azabenzotriazol-l-yl-oxitris (pyrrolidino) phosphonium hexafluorophosphate.
  • ⁇ -Glu Boc-Glu- ( ⁇ -OBzl) was used for the coupling of ⁇ -Glu.
  • the tripeptide is purified (in two batches) by preparative scale HPLC.
  • the system used is as follows:
  • a total of 227 mg (0.602 mmol) of the intermediate tripeptide are obtained which are characterized by: a) HPLC gradient of 5% to 45% MeCN in 20 min. The purity turns out to be 95% (220 nm). The minor peak at 8.4 min decreases in relative proportion, until extinguished, by gradually diluting the applied sample.
  • Step 4 At a solution of 14.2 mg (0.38 mmol) of the tripeptide obtained in step 3 in 800 ⁇ L of HCl 1N 76 ⁇ L of a 0.5N NaN0 2 solution is added. Stirring is maintained in an ultrasonic bath at room temperature for 1 minute. Then 80 ⁇ L of a solution of NaOH ION is added. The solution obtained is frozen and lyophilized.
  • the solid obtained is characterized by:
  • Example 5 Obtaining of N [N- ⁇ -L-glutamyl-2- amino-2- (4- (4-S-nitrosomercapto-l-ethylpiperidin)) acetylglycine (5).
  • Step 1) In a 100 mL flask equipped with magnetic stirring, 6.4 g (23 mmol) of di- 2-Amino-2- (4- (4-mercapto-l-methylpiperidin)) acetic acid hydrochloride, 4.3 g (23 mmol) of ⁇ -bromo-p-xylene and 40 mL of a H 2 0 / EtOH 1 mixture :one. 13 mL of triethylamine are added, an atmosphere of argon is created and the mixture is stirred for 42 h at room temperature. From the resulting solution, the solvent is removed under reduced pressure and 20 mL of absolute EtOH is added to the obtained crude.
  • Step 2 The 1016 mg (2,958 mmol) of the intermediate obtained in the previous stage is started and is proceeded in the manner already described in step 2 of example 4.
  • MS by Electrospray technique: (M + H + ) and ⁇ P 409.3
  • Step 3 The tripeptide intermediate is obtained, using the method described in step 3 of example 4, starting from 794 mg of the aforementioned resin.
  • the working scale is 0.5 mmol. Due to the difficulties of solubilization that the Boc-derivative presents, it is decided to use N-methylmorpholine as a base (3 equivalents) instead of DIEA in the coupling of said amino acid. After incorporation of ⁇ Glu, the tripeptide is assembled and the peptide-resin bond is cleaved by acidolysis as in the previous cases.
  • Step 4 Starting from 10.0 mg (0.026 mmol) of the tripeptide intermediate obtained in the previous stage, nitrosation is carried out, in the manner already described in step 4 of example 4, using 52 ⁇ L of NaN0 2 0.5 M.
  • the product obtained it is characterized by:
  • Example 6 Obtaining of N [N- ⁇ -L-glutamyl-2- amino-3-ben-cil-3- (4-methylbenzyl-S-nitrosomercapto) -4-phenylbutanoi1] glycine (6).
  • Stage 1 1.25 g (3.7mmol) of 2-amino-3-benzyl-3-mercapto-4- phenylbutanoic acid hydrochloride, 0.68 g (3.7 mmol) of ⁇ - are mixed in a 100 mL flask equipped with magnetic stirring. bromo-p-xylene and 40 mL of a H 2 0 / EtOH 1: 1 mixture. 1.6 mL of triethylamine are added and most of the suspended solid is dissolved. An atmosphere of argon is created and the mixture is stirred for 24 h at room temperature. Ethanol and part of triethylamine are removed under reduced pressure. The resulting aqueous suspension is filtered to obtain a white solid.
  • Example 7 In vitro vasodilation tests.
  • the different compounds are tested at five different concentrations, in a range of concentrations between 0.001 and 10 mM, using 6 to 9 arterial rings for each compound.
  • the results obtained are compared with those provided by S-nitrosoglutathione (GSNO), used as a reference product.
  • GSNO S-nitrosoglutathione
  • Table 1 The results are presented in Table 1 below, and are expressed in EC 50 (effective concentration 50), that is to say the concentration of each compound tested that produces a 50% vasodilation in the arterial ring previously contracted with 1 ⁇ M of norepinephrine .
  • Example 8 In vitro assays for inhibition of platelet aggregation.
  • the compounds are tested at four different concentrations, using 5 to 23 donors of different platelets. The results obtained are compared with those provided by S-nitrosoglutathione (GSNO), used as a reference product.
  • GSNO S-nitrosoglutathione
  • IC 50 50 inhibitory concentration
  • Example 5 (5) The compound obtained in Example 5 (5) is tested in vitro to verify its ability to increase intraplaquetary levels of cGMP in a human washed platelet preparation.
  • the compound is tested at four different concentrations, using 5 different platelet donors.
  • the data obtained are compared with those provided by the GSNO (reference product) and with the baseline values.
  • the results obtained, which are shown in table 3, are expressed in pmol / 10 9 platelets.
  • Compound 5 increases the intra-platelet levels of GMP in a manner similar to that of the reference GSNO. It is noteworthy that for values close to IC 5 or, compound 5 induces levels of cGMP lower than GSNO when concentrations near their IC 50 are used .
  • Example 10 In vitro assay of blockage inhibition of platelet aggregation. The methodology followed in the essays is substantially coincident with that described in the bibliographic references cited in Example 8, completed with the reference:
  • the ODQ is tested in vitro to block the inhibition of platelet aggregation in a human washed platelet preparation achieved by the compounds obtained.
  • the compound obtained in example 5 (5) is tested at three different concentrations, in the presence or absence of ODQ (1 ⁇ M), using 5 different platelet donors. The results obtained are compared with those provided by the reference product (GSNO) and with the values in the absence of ODQ. The results obtained, which are shown in Tables 4 and 5, are expressed as a percentage of inhibition on maximum aggregation.
  • the ODQ (1 ⁇ M) is able to block the inhibitory effect of GSNO and compound 5 when the IC 50 dose of the compounds is used. At doses higher than those of IC 50 , the inhibitory effect of aggregation is better blocked in the case of compound 5 than in the case of the reference compound.

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Abstract

Se describen nuevos S-nitrosotioles derivados de la penicilamina o el glutatión que responden a la fórmula general (I) en la que: A y B son grupos fenilo o bien, conjuntamente, conforman el resto -CH2-Q-CH2- constituyendo un anillo de seis unidades en el que Q representa un átomo de oxígeno o de azufre o un resto N-R3, en el que R3 es hidrógeno o un grupo alquilo C¿1?-C4; R?1¿ es un resto acilo, que puede ser un acilo alifático C¿1?-C5 o un resto de ácido glutámico unido por medio de su carboxilo no aminoacídico; R?2¿ es un grupo hidroxilo o un resto de glicina unido mediante un enlace peptídico; de manera que cuando R1 es un resto acilo alifático R2 es un grupo hidroxilo, y cuando R1 es un resto de ácido glutámico R2 es un resto de glicina. Los nuevos compuestos presentan actividad vasodilatadora e inhibidora de la agregación de las plaquetas, lo que los hace útiles para el tratamiento de disfunciones del sistema circulatorio, especialmente a nivel cardiovascular.

Description

D E S C R I P C I Ó N
S-NITROSOTIOLES COMO AGENTES PARA EL TRATAMIENTO DE DISFUNCIONES CIRCULATORIAS
Campo de la técnica
La presente invención se refiere a nuevos S-nitrosotioles derivados de la penicilamina o el glutatión, con acción vasodilatadora e inhibidora de la agregación plaquetaria y que, en consecuencia, resultan útiles para la preparación de medicamentos destinados al tratamiento de trastornos del sistema circulatorio, especialmente a nivel cardiovascular.
Estado de la técnica anterior
Resulta bien conocido el hecho de que los compuestos capaces de liberar en el organismo óxido nítrico (NO) manifiestan en muchos casos algún tipo de actividad a nivel del sistema vascular, por ejem- pío vasodilatación o inhibición de la agregación de las plaquetas, que los hace potencialmente beneficiosos para el tratamiento de diferentes trastornos relacionados con disfunciones del sistema circulatorio. Se ha descrito también que determinados derivados que contienen un grupo S-nitrosotiol, dado que son capaces de liberar NO en el organismo, manifiestan también propiedades aprovechables desde el punto de vista médico. Asi, Radoms i et al., Br . J. Pharma col . (1992) 107, 745-749, describen la actividad inhibidora de la activación de las plaquetas del S-nitrosoglutatión (GSNO) . Golino et al, Circula tion Research, 71, No 6 (1992), describen la actividad inhibidora de la activación de las plaquetas de la S-nitrosocisteina, asignándole un efecto antitrombótico. Smith et al., Meth . Find. Exp . Clin . Pharma - col . (1994), 16, 5, describen que el GSNO produce un fuerte efecto relajante sobre las arterias. En la solicitud de patente W095/12394 se describe el uso de S-nitrosoaductos de péptidos, entre ellos la S- nitroso-N-acetilpenicilamina (SNAP) , como agentes protectores contra las inflamaciones vasculares de origen traumático. En la solicitud de patente WO95/07691 se describe el uso de diferentes S- nitrosotioles, particularmente el GSNO, en el tratamiento y prevención de la deposición de las plaquetas y la formación de trombos en la superficie vascular dañada. En la solicitud de patente O93/09806 se describen proteínas o residuos de aminoácidos S-nitrosados, capaces de liberar NO, que manifiestan una actividad relajante de la musculatura lisa y un efecto inhibitorio sobre la agrega- ción plaquetaria.
En la patente europea EP-B1-412699 se describen S-nitrosotioles que responden a la fórmula general
Figure imgf000004_0001
y su empleo como agentes terapéuticos para las enfermedades cardiovasculares, en particular, como agentes antihipertensivos y para el tratamiento de la angina pectoris. Si bien el número de posibles compuestos asignables a dicha fórmula general es enorme, mientras que en la descripción sólo se encuentran descritos explícitamente unas decenas de productos, y únicamente se aportan datos sobre su acción vasodilatadora, sin mencionar ningún efecto relacionado con la actividad de las plaquetas.
Los S-nitrosotioles descritos en los documentos mencionados no resuelven por si solos todos los complejos problemas que plantea el tratamiento de los trastornos vasculares, especialmente a nivel cardiovascular, siendo necesario el desarrollo de nuevos principios activos que manifiesten acciones más potentes y eficaces.
Objeto de la invención El objeto de la invención son unos nuevos compuestos S-nitrosotioles, derivados de la penici- lamina o el glutatión, que presentan, simultáneamente, una potente acción vasodilatadora y una elevada eficacia como inhibidores de la agregación plaquetaria.
Es también objeto de la presente invención el uso de los nuevos compuestos en la preparación de medicamentos para el tratamiento de trastornos relacionados con disfunciones del sistema circulatorio, especialmente a nivel cardiovascular.
Descripción de la invención
Los compuestos objeto de la invención son S-nitrosotioles derivados de la penicilamina o del glutatión, y sus sales farmacéuticamente aceptables, que responden a la fórmula general (I)
Figure imgf000006_0001
en la que :
A y B son grupos fenilo o bien, conjuntamente, conforman el resto -CH2-Q-CH2- constituyendo un anillo de seis unidades en el que Q representa un átomo de oxigeno o de azufre o un resto N- R3, en el que R3 es hidrógeno o un grupo alquilo Cι-C ;
R1 es un resto acilo, que puede ser un acilo alifático C1-C5 o un resto de ácido glutámico unido por medio de su carboxilo no aminoaci- dico;
R2 es un grupo hidroxilo o un resto de glicina unido mediante un enlace peptidico; de manera que cuando R1 es un resto acilo alifático R2 es un grupo hidroxilo, y cuando R1 es un resto de ácido glutámico R2 es un resto de glicina.
Por tanto, los compuestos objeto de la invención resultan asignables a las fórmulas generales (II) o (III)
Figure imgf000006_0002
en las que A y B tienen los valores indicados anteriormente y R4 es un grupo alquilo Cι~C4, o a sus sales farmacéuticamente aceptables.
Ejemplos concretos de compuestos preferidos que forman parte del objeto de la presente invención son los siguientes:
Acido N-acetil-2-amino-2- [4- (4-S-nitrosomercaptote- trahidropiran) ] acético (1).
Figure imgf000007_0001
Acido N-acetil-2-amino-2- [ 4- ( 4-S-nitrosomercapto-l- metilpi-peridin ) ] acético (2 ) .
H3C
O
SNO OH
H3C ' N H
O
Acido N-acetil-2-amino-3-bencil-3-S-nitrosomercapto- 4-fe-nilbutanoico (3) .
C6 5
C6H5
SNO
OH
H C
O
N [N-γ-L-glutamil-2-amino-2- ( 4 - ( 4 -S-nitrosomer- capto) tetrahi-dropiran) ) acetil]glicina ( 4 ) .
Figure imgf000008_0001
N [N-γ-L-glutamil-2-amino-2- (4- (4-S-nitrosomercapto- 1-metil-piperidin) ) acetiljglicina (5) .
Figure imgf000008_0002
N [N-γ-L-glutamil-2-amino-3-bencil-3- (4-metilbencil- S-nitro-somercapto) -4-f enilbutanoil]glicina (6) .
Figure imgf000008_0003
Para el experto resulta obvio que los compuestos objeto de la presente invención presentan centros quirales y que ello permite distinguir entre los posibles isómeros y/o las mezclas de los mismos, debiendo entenderse que forman parte del objeto de la invención tanto las mezclas de isómeros como los isómeros puros, que pueden ser obtenidos a partir de dichas mezclas mediante el empleo de técnicas con- vencionales, bien conocidas por el experto, o mediante síntesis asimétricas también al alcance de dicho experto.
Los compuestos objeto de la presente invención pueden obtenerse de diferentes maneras en función de su estructura básica.
Asi, los compuestos asignables a la fórmula general (II) pueden obtenerse de acuerdo con la secuencia de etapas que se representa en el siguiente esquema.
Figure imgf000009_0001
Es decir, partiendo de los clorhidratos de los aminoácidos, que a su vez pueden ser obtenidos mediante métodos conocidos, por ejemplo los descri- tos en las solicitudes de patente alemanas DE-A- 3023830 y DE-A-2801849, se procede a acilar el nitrógeno aminoacidico mediante técnicas convencionales, por ejemplo con un cloruro de ácido, y como etapa final se introduce el grupo nitroso en el azu- fre mercaptánico, también utilizando técnicas de ni- trosación convencionales.
Por su parte, los compuestos asignables a la fórmula general (III), se pueden obtener mediante la secuencia de etapas que se representa en el siguiente esquema.
Figure imgf000010_0001
(III)
Es decir, se parte de los mismos clorhidratos de aminoácidos que en el caso anterior y se protege el grupo mercaptano mediante la formación de un tioéter de p-metilbencilo . A continuación se protege el nitrógeno aminoacidico mediante la conocida técnica Boc y luego se forma el tripéptido con los restos de ácido glutámico y glicina (aminoácido C- terminal), en fase sólida, mediante técnicas bien conocidas por el experto y descritas, por ejemplo, por: Barany, G. et al., The Peptides, 2,1, Gross, E. Meienhofer, Eds.Academic Press, NY (1980); Stewart, J.M. et al., Solid Phase Peptide Syn thesis, Freeman, San Francisco, CA (1969); Bodanszky, M. Et al., Peptide Syn thesis, 2nd ed., Wiley, NY (1976).
La formación del tripéptido consta de las siguientes etapas: a) Anclaje del aminoácido C-terminal glicina (Gly) , en forma de terc-butoxicarbonil (Boc) derivado, a una resina de p- metilbencilhidrilamina/poliestireno. b) Desprotección del grupo Boc con ácido tri- fluoroacético y neutralización. c) Incorporación del aminoácido modificado intermedio protegido. d) Evaluación de la reacción de acoplamiento mediante ninhidrina (Kaiser, E. et al., Anal . Biochem . , 34, 595 (1970)). e) Repetición de las etapas anteriores para el residuo de γ-glutámico (γ-Glu) que se incor- pora como Boc-derivado O bencil protegido
(Boc-Glu-OBzl) . f) Acidolisis con HF anhidro para desproteger el tripéptido y liberarlo de la resina. g) Purificación y caracterización de los pro- ductos finales.
Una vez formado el tripéptido se procede, como etapa final, a la nitrosación del grupo mercaptano ya liberado de su grupo protector.
Los ensayos efectuados muestran que los nuevos compuestos S-nitrosados objeto de la invención poseen una actividad vasodilatadora comparable, como inimo, con la del GSNO, y en algunos casos muy superior, y además presentan un efecto inhibidor de la agregación plaquetaria que también resulta ser similar o superior al propio del GSNO, en alguno de los casos considerablemente superior.
Ello hace que los compuestos objeto de la presente invención puedan ser utilizados de manera muy eficaz en la preparación de medicamentos con efecto vasodilatador y antitrombótico para el tratamiento de disfunciones del sistema circulatorio, especialmente a nivel cardiovascular y coronario. Por ello, los compuestos de la fórmula general (I), asi como sus sales farmacéuticamente aceptables, pueden ser utilizados, mediante el empleo de las técnicas galénicas convencionales, para preparar medicamentos que pueden ser administrados por diferentes vias .
A modo de ejemplo se puede señalar que por via oral pueden administrarse en forma de preparados farmacéuticos tales como comprimidos, cápsulas, jarabes y suspensiones. Por via parenteral en forma de soluciones o emulsiones, etc. Pueden administrarse también por via tópica en forma de cremas, pomadas, ungüentos, etc., y también por via trans- dérmica, por ejemplo por medio de parches y apósi- tos. También pueden aplicarse directamente al recto, en forma de supositorios. Las preparaciones pueden contener transportadores aceptables fisiológicamente, excipientes, activadores, agentes quelantes, estabilizadores, etc. En el caso de inyectables pueden incorporarse tampones fisiológicamente aceptables, agentes solubilizantes o isotónicos. La dosis diaria puede variar dependiendo de la sintoma- tologia, de la edad, del peso corporal de los pacientes, del modo de administración, etc., y la do- sis normal diaria para una persona adulta puede estar comprendida entre 0,1 y 500 mg, pudiendo ser administrada en una sola dosis o dividida en varias tomas al dia.
En los ejemplos que se exponen en esta de- scripción se detallan los procedimientos apropiados para obtener varios de los compuestos asignables a la fórmula general (I) . A la vista de dichos ejemplos, para el experto en la materia resulta evidente y directa la manera de obtener los compuestos no ejemplificados expresamente, mediante la aplicación de modificaciones de los métodos expuestos, propias del conocimiento común general de los expertos en la materia .
Asi pues, los ejemplos que se exponen a continuación no deben ser interpretados en el sentido de limitar el alcance de la presente invención, sino como una explicación adicional, más detallada, que facilite al experto en la materia una mejor comprensión de la misma.
Ejemplos
En los ejemplos que siguen a continuación se utilizan las siguientes abreviaturas: AcOEt acetato de etilo AcOH ácido acético Boc terc-butoxicarbonilo Bzl bencilo
DCC diciclohexilcarbodiimida DCM diclorometano DIEA N-etildiisopropilamina DIP-CI sonda introducción directa-ionización química
DMF dimetilformamida
DMSO-de dimetilsulfóxido hexadeuterado
EDTA Na2 ácido etilendiaminotetraacético sal sódica
EtOH alcohol etílico
EtOEt éter etílico
FAB bombardeo átomos rápidos
CGMP Guanosina 3 ',5' monofosfato cíclico
HPLC cromatografía liquida de alta resolu- ción
MeCN acetonitrilo MeOH alcohol metílico
MS espectrometría de masas
ODQ [1H- [1,2,4] oxadizol [4-3a] quinoxalin- 1-ona]
PyAOP hexafluorofosfato de 7-azabenzotria- zol-1-il-oxitris (pirrolidino) fos- fonio tBuOH alcohol terc-butilico TFA ácido trifluoroacético Los clorhidratos de los aminoácidos de partida se sintetizan según los procedimientos descritos en las solicitudes de patente alemanas DE-A- 3023830 y DE-A-2801849.
Los espectros de resonancia magnética nu- clear han sido realizados en un aparato Varian Gem- ini-200.
En los espectros de 1H-RMN se indica la frecuencia de trabajo y el disolvente utilizado para llevar a cabo el espectro. La posición de las señales se indica en δ (ppm) , utilizando como referencia la señal de los protones del disolvente. Se toman como valores de referencia 7.24 ppm para el cloroformo y 2.49 ppm para el dimetilsulfóxido deu- terado. Entre paréntesis se indica el número de pro- tones correspondientes a cada señal medidos por integración electrónica y el tipo de señal usando las siguientes abreviaturas: s (singulete) , d (doblete), t (triplete) , dd (doblete de dobletes), sa (señal ancha), se (señal compleja), d.e. D20 (desaparece al realizar el espectro tras añadir unas gotas de agua deuterada) .
En los espectros de 13C-RMN se indica la frecuencia de trabajo y el disolvente utilizado en cada espectro. La posición de las señales se indica en δ (ppm) , utilizando como referencia la señal de los protones del disolvente. Se toman como valores de referencia 77.00 ppm para el cloroformo y 39.50 ppm para el dimetilsulfóxido deuterado. También se han realizado experimentos de resonancia magnética nuclear usando la secuencia de pulsos APT (Attached Protón Test) .
Cuando se realizan análisis por HPLC para determinar la pureza de algunas muestras, las cóndiciones utilizadas son las siguientes: A-Gradiente general
Columna: RP-C18, Symmetry 150x3,9 , 5μ, 100 A Fase móvil: H20+H3P04 0.1%/CH3CN + 5% H20 + 0.1% H3P04 Temperatura: ambiente Flujo 1 mL/min
Volumen inyección: 10 μL B-Isocrático
Columna : RP-C18 , Symmetry 150x3 , 9 mm, 5μ, 100 A Fase móvil : 50 % de H20+H3P04 0 . 1 % y 50 % de CH3CN
+ 5% H20 + 0 . 1% H3PO-1 Temperatura : ambiente Fluj o 1 mL/min
Volumen inyección: 10 μL En la preparación de los tripéptidos se emplean técnicas de cromatografía preparativa y HPLC para purificar el crudo y la identidad del producto se confirma por espectrometría de masas y el análisis de aminoácidos. La pureza de los tripépti- dos se analiza mediante HPLC en las siguientes condiciones: columna de tipo C18 Nucleosil, 250 x 4 mm, 120 A, 10 μm; flujo de 1 mL/min; eluyentes A = H0 ( +0.045% TFA) y B = CH3CN (+0.036% TFA) . Los espectros de ultravioleta (UV) se han registrado en un espectrofotómetro Shimadzu UV-160A. Para cada uno de los compuestos se indica la longitud de onda (λ) expresada en nm, y la absortividad molar (ε) de cada una de ellas expresada en cm"1 mol" 1 L.
En la cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) se ha utilizado un detector de ultravioleta de fotodiodos de Hewlett-Packard 1040 A.
Ejemplo 1. Obtención del ácido N-acetil-2-amino- 2- [4- (4-S-nitrosomercaptotetrahidropi- ran) ] acético (1) .
Figure imgf000016_0001
Etapa 1) En un matraz de 250 mL provisto de agitación magnética se introducen 4.0 g. (17.6 mmol) del clorhidrato del ácido 2-amino-2- [4- (4- mercaptotetrahidropiran) ] acético, y 60 mL de disolución de hidróxido potásico 0.5N. A continuación de añaden 3.07 g. (21.8 mmol) de carbonato potásico anhidro y 60 mL de MeCN . La mezcla se enfria con un baño de hielo y se adiciona gota a gota 1.42 mL (19.7 mmol) de cloruro de acetilo disuelto en 25 mL de MeCN. Finalizada la adición se añade hidróxido potásico 0.5N hasta pH 9-10. Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación se añade ácido clorhídrico 2N hasta pH=6 y se elimina el disolvente a presión reducida. El sólido obtenido se seca a vacio sobre pentóxido de fósforo. Se suspende en 150 mL de EtOH absoluto y se agita a temperatura ambiente. El residuo insoluble se filtra y se lava con EtOH absoluto. Se elimina el disolvente a presión reducida. Se obtienen 3.98 g de crudo del producto intermedio, ácido N- acetil-2- amino-2- [4- (4-mercaptotetrahidropiran) ] acético, que se somete a varias cromatografías preparativas de fase reversa para obtener 80 mg de producto del 90% de pureza (HPLC gradiente A, λ=205 nm) .
J -RMN (200 Mhz, DMSO-d6) : 7.40 (1H, d, J=10Hz,
NH), 4.13 (1H, d, J=10Hz, CH) , 3.75-3.50 (4H, s.c,
CH2) , 1.90-1.80 (4H, s.c., CH2) , 1.65 (3H, s, CH3) . 13C-RMN (50 Mhz, DMSO-d6) : 171.50 (CO-N) , 168.90
(CO) , 63.69 (CH2), 63.27 (CH2) , 62.80 (CH) , 49.18
(C) , 37.58 (CH2) . 36.12 (CH2) , 23.01 (CH3) .
Etapa 2) Se disuelven 80 mg (0.34 mmol) del ácido N- acetil-2-amino-2- (4- ( -mercaptotetrahidropiran) ) acético en 4000 μL de MeOH. Se añaden 500 μL de disolución de HC1 1 N y 136 μL de disolución de NaN02 5 M. Se trata la disolución resultante durante 1 minuto en un baño de ultrasonidos y se añaden a continuación 50 μL de disolución de NaOH 10 N y 14 μL de H20.
De la disolución resultante se separa una alícuota A de 470 μL y al resto se le añade agua abundante, se congela y se liofiliza para obtener 190 mg de un sólido B higroscópico ligeramente humedecido .
HPLC (gradiente A) : λ 220 nm: pureza fracción A 68% λ 339 nm: pureza fracción A 95%
RMN fracción B:
Jl-RMN (200 Mhz, DMSO-d6) : 8.00-7.50 (1H, s.c., NH) , 4.50-4.00 (1H, s.c., CH) , 3.80-3.40 (4H, s.c., CH2) , 2.40-1.80 (4H, s.c., CH2) , 1.88 (3H, s, CH3) .
13C-RMN (50 Mhz, DMSO-d6) : 173.00 (CO) , 169.52 (CO) , 67.69(CH2-0) , 63.45 (CH) , 53.78 (C) , 32.17 (CH2), 22.80 (CH3) .
Ejemplo 2 Obtención del ácido N-acetil-2-amino- 2- [4- (4-S-nitrosomercapto-l- metilpiperidin) ] acético (2) .
Figure imgf000018_0001
Etapa 1) En un matraz de 250 mL provisto de agitación magnética se introducen 3.69 g. (13 mmol) del diclorhidrato del ácido 2-amino-2- [4- (4-mercapto-l- metilpiperidin) ] acético, y 30 mL de disolución de hidróxido potásico 0.5N. A continuación de añaden 2.2 g. (16 mmol) de carbonato potásico anhidro y 30 mL de MeCN. La mezcla se enfria con un baño de hielo y se adiciona gota a gota 1.0 mL (14 mmol) de cloruro de acetilo disuelto en 10 mL de MeCN. Finalizada la adición se añade hidróxido potásico 0.5N hasta pH 9-10. Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación se añade ácido clorhídrico 2N hasta pH=6 y se elimina el disolvente a presión reducida. El sólido obtenido se seca a vacio sobre pentóxido de fósforo. Se suspende en 100 mL de EtOH absoluto y se agita a temperatura ambiente. El residuo insoluble se filtra y se lava con EtOH absoluto. Se elimina el disolvente a presión reducida. Se obtienen 2.8 g de crudo del producto intermedio, ácido N- acetil-2-amino-2- [4- (4- mercapto-1-metilpiperidin) ] acético, que se somete a varias cromatografías preparativas de fase reversa para obtener 0.5 g de producto del 99% de pureza (HPLC gradiente A, λ=210 nm) .
XH-RMN (200 Mhz, DMS0-d6) : 8.35 (1H, d, J=10Hz, NH) , 4.43 (1H, d, J=10Hz, CH) , 3.35-3.00 (4H, s.c., CH2), 2.70 (3H, s, CH3) , 2.20-1.90 (4H, s.c., CH2) , 1.85 (3H, s, CH3) .
13C-RMN (50 Mhz, DMSO-d6) : 170.55 (CO-N) , 170.05
(CO) , 61.77 (CH), 49.33 (CH2) , 49.28 (CH2) , 46.38 (C) , 42.26 (CH3) , 33.05 (CH2) , 33.14 (CH2) , 22.42 (CH3) •
Etapa 2) Se disuelven 50 mg (0.20 mmol) del ácido N- acetil-2-amino-2- [4- ( 4-mercapto-l- metilpiperidin) ] acético en 800 μL de disolución de
HC1 1 N .Se añaden 80 μL de disolución de NaN02 5 M. Se trata la disolución resultante durante 1 minuto en un baño de ultrasonidos y se añaden a continuación 80 μL de disolución de NaOH 10 N y 40 μL de H20.
De la disolución resultante se separa una alícuota A de 100 μL y el resto se congela y se lio- filiza para obtener 79 mg de un sólido B. HPLC (gradiente A) : λ 230 nm: pureza fracción A 90%; pureza fracción B 93% λ 334 nm: pureza fracción A 98%; pureza fracción B 98%
RMN fracción B:
^-RMN (200 Mhz, D20) : 4.71 (1H, s, CH) , 2.70- 2.20 (8H, se, CH2), 1.95 (3H, s., CH3-N) , 1.71 (3H, s, CH3-CO) .
13C-RMN (50 Mhz, D20 ) : 172.51 (CO) , 171.52
(CO) , 61.08 (CH) , 58.18 (C) , 48.09 (CH2-N) , 48.01
(CH2-N) , 42.18 (CH3-N) , 30.44 (CH2) , 29.85 (CH2) , 20.17 (CH3-CO) .
Ejemplo 3. - Obtención del ácido N-acetil-2-amino- 3-bencil-3-S-nitrosomercapto-4- fenilbutanoico (3) .
Figure imgf000020_0001
Etapa 1) En un matraz de 100 mL provisto de agitación magnética se introducen 2.0 g. (5.9 mmol) del ácido 2-amino-3-bencil-3-mercapto-4-fenilbutanoico, y 20 mL de disolución de hidróxido potásico 0.5N. A continuación de añaden 1.0 g. (7.2 mmol) de carbonato potásico anhidro y 20 mL de MeCN. La mezcla se enfria con un baño de hielo y se adiciona gota a gota 0.5 mL (6.5 mmol) de cloruro de acetilo disuelto en 8 mL de MeCN. Finalizada la adición se añade hidróxido potásico 1N hasta pH 12-13. Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación se añade ácido clorhídrico 2N hasta pH=6 y se elimina el disolvente a presión reducida. El crudo obtenido se suspende en 100 mL de EtOH absoluto y se agita a temperatura ambiente. El residuo insoluble se filtra y se lava con EtOH absoluto. Se elimina el disolvente a presión reducida. El residuo se recristaliza de agua. La parte insoluble se filtra y se descarta. El filtrado se congela y se lio- filiza. Se obtienen 1.64 g del producto intermedio, N-acetil-2-amino-3-bencil-3-mercapto-4- fenilbutanoico. Rendimiento: 81%.
^-RMN (200 Mhz, DMSO-d6) : 7.68 (1H, d, J=8Hz, NH) , 7.35-7.05 (10H, se, CHar) , 4.36 (1H, d, J=8Hz, CH) , 3.42-3.02 (2H, se, CH2-Car) , 2.95-2.55 (2H, se, CH2), 1.82 (3H, s, CH3)
13C-RMN (50 Mhz, DMSO-d6) : 172.94 (CO-N) , 169.08
(CO), 138.55 (Car), 138.16 (Car) , 132.36 (2CHar) ,
131.89 (2CHar) , 127.78 (2CHar) , 127.53 (2CHar) , 126.44 (CHar) , 126.26 (CHar) , 60.16 (CH) , 55.62 (C) , 43.70
(CH2), 42.94 (CH2) , 23.14 (CH3) .
Etapa 2) Se disuelven 0.62 g (1.8 mmol) del ácido N- acetil-2-amino-3-bencil-3-mercapto-4-fenilbutanoico en 25 mL de MeOH . Se añaden 25 mL de disolución de HCl 1 N y una disolución de 250 mg de NaN02 en 25 mL de H20. Se agita la disolución resultante durante 35 minutos a temperatura ambiente, se filtra y se lava con agua. Tras secar a presión reducida en presencia de P205 se obtienen 0.33 g de un sólido.
HPLC (isocrático B) : λ 220 nm: pureza 91% λ 342 nm: pureza 100%
XH-RMN (200 Mhz, DMSO-d6) : 8.77 (1H, d, J=10Hz, NH) , 7.28-7.00 (10H, se, CHar) , 5.33 (1H, d, J=10Hz, CH) , 4.12-3.90 (2H, se, CH2) , 3.88-3.38 (2H, se, CH2), 1.86 (3H, s, CH3)
13C-RMN (50 Mhz, DMSO-d6) : 171.55 (CO-N) , 169.67
(CO-O) , 135.51 (Car) , 135.27 (Car) , 131.52 (CHar) ,
131.41 (CHar) . 128.15 (CHar) , 128.05 (CHar) , 127.04 (CHar) , 65.13 (CH), 56.11 (CH) , 40.91 (CH2) , 40.15
(CH2) , 22.29 (CH3) .
Ejemplo 4. - Obtención de N[N-γ- -L-glutamil- -2- amino-2- (4 -(4-S- -nitrosomercap- to) tetrahi dropiran) ) ace- Jil]glicina
Figure imgf000022_0001
Etapa 1 ) En un matraz de 250 mL provisto de agitación magnética se mezclan 5.8 g (25.5 mmol) de clorhidrato del ácido 2-amino-2- (4- (4- mercaptotetrahidropiran) ) acético, 4.7 g (25.5 mmol) de α-bromo-p-xileno y 100 mL de una mezcla H20/EtOH 3:1. Se añaden 11 mL de trietilamina, se crea una atmósfera de argón y se agita la mezcla durante 18 h a temperatura ambiente. Se añaden 50 mL más de H20/EtOH 3:1 y se agita durante 2 h más. La suspensión resultante se filtra y se lava con 100 mL de agua y 50 mL de EtOH. Se obtiene un sólido que se seca a presión reducida. Se añaden 300 mL de ácido clorhídrico concentrado sobre el sólido y se elimina el disolvente a presión reducida. Se repite el mismo tratamiento ácido una segunda vez, obteniendo un sólido que se seca a presión reducida. Se obtienen 1.59 g del producto intermedio de interés.
XH-RMN (200 Mhz, DMSO-d6) : 8.80-8.30 (3H, sa, H3N+), 7.26 (2H, d, J=8 Hz, CHar) , 7.12 (2H, d, J=8 Hz, CHar) , 4.03 (1H, s, CH-N) , 3.85-3.55 (6H, se, CH2-Car. CH2-0) , 2.26 (3H, s, CH3) , 2.05-1.08 (4H, se, CH2) .
13C-RMN (50 Mhz, DMSO-d6) : 168.98 (CO) , 136.64
(Car), 133.80 (Car), 129.55 (CHar), 129.29 (CHar),
62.36 (CH2-0) , 59.85 (CH-N), 49.15(C) 32.03 (CH2) , 31.19 (CH2), 30.84 (CH2) , 20.69 (CH3) .
Etapa 2) Se suspenden 1004 mg del clorhidrato del ácido 2-amino-2- (4- (4- (p-metilbencilmercapto) tetra- hidropiran) ) acético (3.029 mmol) en 20 mi de tBuOH/H20 2:1 y se adiciona NaOH al 5% hasta pH=9. A continuación se añaden 3 equivalentes de Boc20 y se deja reaccionar por espacio de 30 min, transcurridos los cuales se ajusta de nuevo el pH a 9. La reacción se prolonga 30 min más y se vuelve a corregir el pH. Se comprueba que la reacción se ha completado por cromatografía en capa fina (CCF) comparando con el aminoácido de partida.
El producto se aisla realizando dos tratamientos consecutivos de extracción con 50 mL de hexano. La fase acuosa se acidifica con HCl 1N hasta pH=2. A continuación se realizan tres etapas de extracción con 60 mL de AcOEt cada una. La solución de AcOEt se seca con MgS04 anhidro y, tras la eliminación del disolvente por evaporación, se redisuelve el producto en DCM y se vuelve a evaporar. Esta etapa se repite dos veces más, tras las cuales se obtienen 1191 mg (3.015 mmol) del producto intermedio N-Boc protegido.
El producto se caracteriza por: a) CCF, con CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5 como fase móvil. El Rf=0.48, no observándose señal del producto de partida . b) HPLC en gradiente de 10% a 100% de MeCN en 30 min + isocrático al 100% de MeCN durante 5 min. La pureza resultante es del 96 % (220nm) . c) Espectrometría de masas (MS) por técnica FAB:
Mcalculado=395, (M+H+) experimental=396.0 d) RMN (CDC13) : 7.18 (2H, d, J=8 Hz) 7.09 (2H, d,
J=8 Hz), 5.54 (1H, d, J= 11.2 Hz), 4.44 (1H, d,
J=8.3 Hz), 3.69 (1H, d, J=11.2 Hz), 3.57 (1H, d, J=11.2 Hz), 3.75-3.98 (4H, sa) , 2.32 (3H, s), 1.26-2.19 (4H, sa) , 1.46 (9H, s).
Etapa 3) El tripéptido se prepara por técnicas de síntesis en fase sólida, partiendo de 1595 mg de una Boc-Gly-OCH2-Pam-resina (Neosystem, n° ref. RP00801) de sustitución 0.63 mmol/g. La escala de trabajo es de 1.005 mmol.
El protocolo general para la adición de los restantes aminoácidos es el siguiente:
1) Se hincha la resina con 5 lavados de 0.5 min con DCM.
2) Desprotección del grupo Boc con TFA al 40% en DCM, lxl min + 1x20 min. 3) Lavados con DCM, 5x 0.5 min.
4) Test de ninhidrina .
5) Lavados con DMF, 3x1 min.
6) Acoplamiento por espacio de 1.5 horas.
7) Lavados con DMF, 3x1 min. 8) Lavados con DCM, 5x 0.5 min. 9) Test de ninhidrina.
En caso de que el test de ninhidrina resulte positivo en la última etapa, se procede a rea- copiar, repitiendo los pasos 5-8. El acoplamiento se realiza con 6 equivalentes (eq) de DIEA, 3 eq. de Boc-aminoácido y 3 eq. de agente activante, que en nuestro caso es PyAOp (hexafluorofosfato de 7-azabenzotriazol-l-il-oxitris (pirrolidino) fosfonio) . Para el acoplamiento de γ-Glu se utilizó Boc-Glu- (α-OBzl) .
Finalizado el ensamblaje de la secuencia, la peptidilresina resultante se somete a acidolisis con HF/p-cresol (9:1) durante 1 hora a O'C. Tras la evaporación, el residuo sólido se extrae con éter anhidro y a continuación se aisla el péptido por extracción con AcOH 10%. Una vez reducido el volumen por evaporación, el crudo se liofiliza y se caracteriza por: a) HPLC en gradiente de 5% a 65% de MeCN en 30 min. b) MS por técnica Electrospray:Mcaιc=377 , (M+H+)exP=378.2
Se cuantifica el péptido contenido en el crudo por análisis de aminoácidos: m=329 mg (0.873 mmol) . En todas las cuantificaciones peptidicas se utiliza el análisis de aminoácidos, añadiendo un patrón externo de lie (Isoleucina) a la muestra a hidrolizar .
Se procede a la purificación del tripéptido (en dos lotes) mediante HPLC a escala preparativa. El sistema utilizado es el siguiente:
-Columna: C18 Nucleosil, 200x20 mm, 120 Á, 10 μm .
-Eluyentes : A=H20 ( +0 . 1 TFA) B=MeCN (+0. 1 TFA)
-Gradiente: Isocrático 0% B durante 40 min + gradiente de 0% a 10% B en 40 min. -Flujo: 25 ml/min.
Se obtienen en total 227 mg (0.602 mmol) del tripéptido intermedio que se caracterizan por: a) HPLC en gradiente de 5% a 45% de MeCN en 20 min. La pureza resulta ser del 95 % (220 nm) . El pico minoritario a 8.4 min disminuye en proporción relativa, hasta extinguirse, al diluir progresivamente la muestra aplicada.
Por dicho motivo se concluye, que corresponde a agregación del tripéptido (y no a oxidación) y por tanto se considera como producto válido. b) MS por técnica Electrospray: Mcaιc=377 (M+Hτ)exP=378.2
Etapa 4) A una disolución de 14.2 mg (0.38 mmol) del tripéptido obtenido en la etapa 3 en 800 μL de HCl 1N se le añaden 76 μL de una disolución de NaN02 0.5M. Se mantiene la agitación en baño de ultrasonidos a temperatura ambiente durante 1 minuto. A continuación se adicionan 80 μL de una disolución de NaOH ION . La disolución obtenida se congela y se liofiliza. El sólido obtenido se caracteriza por:
Jl-RMN (200 Mhz, DMSO-d6) : 8.90-8.50 (2H, sa, NH) , 5.35 (1H, d, J=10 Hz, CH) , 4.10-3.00 (3H, se, CH2, CH) , 1.95-1.65 (4H, se, 2CH2 ) .
13C-RMN (50 Mhz , DMSO-d6) : 172.18 (CO-N) , 171.21 (CO-N) , 168.40 (CO-O) , 63.03 (CH2) , 62.31 (C) , 59.56 (CH) , 53.19 (CH) , 41.20 (CH2) , 32.94 (CH2), 31.71 (CH2), 31.41(CH2), 27.12 (CH2) .
HPLC (Método A): λ 220nm (pureza 94%); λ 334nm (pureza 95%)
UV: λ 346 nm ε(H20) 502 errf1 mol"1 L
Ejemplo 5. - Obtención de N [N-γ-L-glutamil-2- amino-2- (4- (4-S-nitrosomercapto-l- etilpiperidin) ) acetiljglicina (5) .
Figure imgf000027_0001
Etapa 1) En un matraz de 100 mL provisto de agitación magnética se mezclan 6.4 g (23 mmol) de di- clorhidrato del ácido 2-amino-2- (4- (4-mercapto-l- metilpiperidin) ) acético, 4.3 g (23 mmol) de α- bromo-p-xileno y 40 mL de una mezcla H20/EtOH 1:1. Se añaden 13 mL de trietilamina, se crea una atmós- fera de argón y se agita la mezcla durante 42 h a temperatura ambiente. De la disolución resultante se elimina el disolvente a presión reducida y al crudo obtenido se le añaden 20 mL de EtOH absoluto. Se obtiene un sólido que se filtra y se lava con EtOH ab- soluto y EtOEt sucesivamente. Se seca a presión reducida. Se obtienen 2.11 g del producto intermedio, clorhidrato del ácido 2-amino-2- (4- (4- (p-metilben- cilmercapto) -1-metilpiperidin) ) acético. Rendimiento: 29.6. El espectro NMR se registra en D20 y se toma como referencia 4.75 ppm para HDO.
XH-RMN (200 Mhz, D20) : 7.28 (2H, d, J=8 Hz, CHar) , 7.15 (2H, d, J=8 Hz, Char) , 3.64-3.74 (2H, se, CH2-Car) , 3.62 (1H, s, CH-N), 3.4-3.1 (4H, se, , CH2-N) , 2.76 (3H, s, CH3-N) , 2.24 (3H, s, CH3) , 2.15- 1.92 (4H, se, CH2) .
13C-RMN (50 Mhz,D20): 173.15 (CO) , 141.00 (Car) , 136.39 (Car), 132.58 (CHar) , 131.95 (CHar) , 63.57 (CH-N), 52.48 (CH2)+, 50.65(C), 45.66 (CH3-N) , 34.05 (CH2), 32.35 (CH2) , 31.28 (CH2) , 22.77 (CH3) .
Etapa 2) Se parte de 1016 mg (2.958 mmol) del intermedio obtenido en la etapa anterior y se procede de la manera ya descrita en la etapa 2 del ejemplo 4. Se obtienen 1016 mg (2.490 mmol) del intermedio N- Boc protegido que se caracteriza por: a) CCF (fase móvil CHCI3/MeOH/AcOH 85:10:5). Rf= 0.32, sin observarse señal del producto de partida . b) HPLC en gradiente de 10% a 100% de MeCN en 30 min. La pureza es del 96% (220 nm) . c) MS por técnica FAB: Mcalc=408 (M+H+) eχP=408.9 d) MS por técnica Electrospray: (M+H+) eχP=409.3
Etapa 3) El intermedio tripéptido se obtiene, utilizando el método descrito en la etapa 3 del ejemplo 4, partiendo de 794 mg de la resina ya mencionada. La escala de trabajo es de 0.5 mmol. Debido a las dificultades de solubilización que presenta el Boc-derivado se opta por utilizar N-metilmorfolina como base (3 equivalentes) en lugar de DIEA en el acoplamiento del mencionado aminoácido. Después de la incorporación de γGlu, el tripéptido queda ensam- blado y se procede a la escisión del enlace péptido-resina por acidolisis al igual que en los casos anteriores. Se obtiene finalmente un crudo en AcOH 10% que se liofiliza y se cuantifica posteriormente, obteniendo un resultado de 137 mg (0.351 mmol) del tripéptido intermedio, que se caracteriza por : a) HPLC, gradiente isocrático 0% durante 10 min
+ 5%-»65% de MeCN en 30 min. Se constata que el producto inyectado en disolución acé- tica elue con el frente, asi pues, se hace necesario liofilizar alícuotas para eliminar este ácido y redisolver el liofilizado en HCl lmM. De esta forma puede observarse cro- matográficamente el péptido, que elue a 6.8 min en el gradiente utilizado. b) MS por técnica Electrospray: Mcalc=390 (M+H+)exP=391.2
Se procede entonces a la purificación del crudo, mediante HPLC a escala preparativa con los parámetros ya descritos en el ejemplo 4. Se aplica también un isocrático al 0% de B durante 40 min seguido de un gradiente de 0% a 10% de B en 40 min. De esta forma se obtiene la cantidad de 107 mg (0.274 mmol) de producto, caracterizado mediante: a) HPLC en gradiente de 0% a 0% en 10 min mas 0% a 30% en 20 min. La pureza es del 94% (220 nm) . Se comprueba que el pico adicional a 8.0 min corresponde también en este caso a agre- gación, asignándose por ello como producto correcto. b) MS por técnica Electrospray : Mcalc=390 (M+H+)exP=391.1
Etapa 4) Partiendo de 10.0 mg (0.026 mmol) del intermedio tripéptido obtenido en la etapa anterior, se efectúa la nitrosación, de la manera ya descrita en la etapa 4 del ejemplo 4, utilizando 52 μL de NaN02 0.5 M. El producto obtenido se caracteriza por:
13C-RMN (50 Mhz , DMSO-d6) : 171.57 (CO-N), 170.99 (CO-N), 170.76 (CO-N), 168.20 (CO-O) , 60.23 (C), 59.53 (CH), 51.57 (CH) , 49.02 (CH2) , 42.20 (CH3) , 41.59 (CH2), 30.49 (CH2) , 29.75(CH2), 29.31(CH2), 26.05 (CH2)
HPLC (Método B) : λ 220 nm (pureza 74%); λ 334 nm (pureza 88% ) .
UV: λ 346 nm ε(H20) 198 cm"1 mol-1 L
Ejemplo 6.- Obtención de N [N-γ-L-glutamil-2- amino-3-ben-cil-3- ( 4-metilbencil-S- nitrosomercapto) -4- fenilbutanoi1]glicina (6) .
Figure imgf000031_0001
Etapa 1) En un matraz de 100 mL provisto de agitación magnética se mezclan 1.25 g (3.7mmol) de clorhidrato del ácido 2-amino-3-bencil-3-mercapto-4- fenilbutanoico , 0.68 g (3.7 mmol) de α-bromo-p- xileno y 40 mL de una mezcla H20/EtOH 1:1. Se añaden 1.6 mL de trietilamina y se disuelve la mayor parte del sólido en suspensión. Se crea una atmósfera de argón y se agita la mezcla durante 24 h a temperatura ambiente. Se elimina el etanol y parte de la trietilamina a presión reducida. La suspensión acuosa resultante se filtra obteniéndose un sólido blanco. Se purifica mediante cromatografía de columna en fase reversa con CH3CN-H20. Se añaden 100 mL de MeOH-ácido clorhídrico concentrado 1:1 sobre el sólido obtenido y se elimina el disolvente a presión. Se obtienen 0.5 g del producto intermedio, clorhidrato del ácido 2-amino-3-bencil-3- (4- metilbencilmercapto) -4-fenilbutanóico . XH-RMN (200 Mhz, DMSO-d6) : 8.95-8.50 (3H, sa, H3N+), 7.45-7.25 (10H, se, CHar) , 7.08 (2H, d, J=10 Hz, CHar) , 6.98 (2H, d, J=10 Hz, CHar) , 4.05 (1H, s, CH-N), 3.55-3.0 (4H, se, CH2-C6H5 ,CH2-Car), 2.90- 2.60 (2H, se, CH2), 2.20 (3H, s, CH3) . 13C-RMN ( 50 Mhz , DMSO-d6 ) : 168 . 70 ( CO ) , 136 . 53
(Car), 136.00 (Car), 134.94 (Car), 132.50 (Car),
131.18 (CHar) , 129.169 (CHar) , 128.90 (CHar) , 128.26
(CHar) , 128.02 (CHar) , 127.07 (CHar) , 57.06 (CH-N), 53.64(C) 42.22 (CH2) , 41.65 (CH2) , 31.90 (CH2_S), 20.48 (CH3) -
Etapa 2) Se parte de dos fracciones del intermedio obtenido en la etapa anterior (180 mg del 83% de pureza y 530 mg del 94% de pureza) y se procede de la manera ya descrita en la etapa 2 del ejemplo 4. Se obtienen 733 mg (1.45 mmol) del intermedio N-Boc protegido que se caracteriza por: a) CCF (CHCl3-MeOH-HOAc 85:10:5), Rf=0.63. b) HPLC Gradiente de 10% a 100% MeCN, 30 min, iso- crático 100%, 5 min, pureza: 91% (220 nm) c) EM-MALDI-TOF (Espectro de masas) : Matriz de ácido dihidroxibenzoico, «,^¿=505 (M+H+)exp=528.585 (M+Na) d) RMN: Se confirma la presencia del grupo Boc.
Etapa 3) El intermedio tripéptido se obtiene, utilizando el método descrito en la etapa 3 del ejemplo 4, partiendo de 0.43 mmol de la resina ya mencionada. Tras la etapa de escisión acidolitica se aisla un crudo que contiene 14.4 mg (29.96 μmol) de intermedio tripéptido que se caracteriza por: a) HPLC analítica gradiente de 5% a 65% en 30 min, pureza aproximada 95%. b) EM-electrospray Mcalc=487 (M+H+) , Mexp=488.3
Etapa 4) Partiendo de 5.7 mg (0.012 mmol) del inter¬ medio tripéptido obtenido en la etapa anterior, se efectúa la nitrosación, de la manera ya descrita en la etapa 4 del ejemplo 4, utilizando 24 μL de NaN02 0.5 M. El producto obtenido se caracteriza por:
HPLC (Método A) : λ 220 nm pureza 68%; λ 334 nm pureza 86%. UV: λ 345 nm ε(H20) 368 cm"1 mol"1 L.
Ejemplo 7. - Ensayos in vitro de vasodilatación.
La metodología seguida en los ensayos es substancialmente coincidente con la descrita en las siguientes referencias bibliográficas:
* Furchgot, R.F. "Methods in nitric oxide re- search". Feelisch & Stamler eds . John Wiley &Sons, Chichester, England, pp 567-581.
* Trongvanichnam, K, et al. Jpn J. Pharmacol. 1996; 71:167-173.
* Salas, E., et al. Eur. J. Pharmacol. 1994; 258:47-55.
Los diferentes compuestos se ensayan a cinco concentraciones diferentes, en un rango de concentraciones comprendido entre 0,001 y 10 mM, utilizando de 6 a 9 anillos arteriales para cada compuesto. Los resultados obtenidos se comparan con los proporcionados por el S-nitrosoglutatión (GSNO) , usado como producto de referencia. Los resultados se exponen a continuación en la tabla 1, y se expresan en CE50 (concentración efectiva 50), es decir la concentración de cada compuesto ensayado que produce una vasodilatación de un 50% en el anillo arterial previamente contraído con 1 μM de norepinefriña .
Tabla 1.- Ensayos de vasodilatación
Compuesto CE50 μM (media ± SD)
GSNO 1.56 ± 0.55
Producto obtenido en el ejemplo 1 0.375 ± 0.05
Producto obtenido en el ejemplo 2 0.024 ± 0.003
Producto obtenido en el ejemplo 3 0.63 ± 0.21
Producto obtenido en el ejemplo 4 1.73 ± 0.27
Producto obtenido en el ejemplo 5 1.89 ± 0.82
Como se observa en la tabla, todos los compuestos ensayados manifiestan una potente actividad vasodilatadora, similar o superior a la del pro- ducto de referencia GSNO, siendo de destacar que el compuesto 2 muestra una actividad vasodilatadora muy superior a la de dicho producto de referencia.
Ejemplo 8. - Ensayos in vitro de inhibición de la agregación de las plaquetas.
La metodología seguida en los ensayos es substancialmente coincidente con la descrita en las siguientes referencias bibliográficas:
Loscalzo J, et al. En: Methods in nitric oxide research (Feelisch M, Stamler JS, eds . ) John iley & Sons, Chichester, Eng- land, pp 583-591.
Radomski MW, et al. Br J Pharmacol
1987;92:181-187.
Salas E, et al. Br J Pharmacol
1994;112:1071-1076.
Los compuestos se ensayan a cuatro concen- traciones distintas, utilizando de 5 a 23 donantes de plaquetas diferentes. Los resultados obtenidos se comparan con los proporcionados por el S- nitrosoglutatión (GSNO) , usado como producto de referencia .
Los resultados se exponen a continuación en la tabla 2, y se expresan en CI50 (concentración inhibitoria 50) , es decir la concentración de cada compuesto ensayado que inhibe en un 50% la agregación obtenida con una concentración submaximal de colágeno (1 μg/mL) .
Tabla 2. - Ensayos de inhibición de la agregación de las plaquetas.
Compuesto IC50 μM (media ± SD)
GSNO 0.48 ± 0.19
Producto obtenido en el ejemplo 1 0.07 ± 0.02
Producto obtenido en el ejemplo 2 0.19 ± 0.02
Producto obtenido en el ejemplo 3 0.24 ± 0.027
Producto obtenido en el ejemplo 4 0.20 ± 0.12
Producto obtenido en el ejemplo 5 0.047 ± 0.011
Producto obtenido en el ejemplo 6 0.35 ± 0.11
Como se observa en la tabla 2, todos los compuestos ensayados manifiestan una potente actividad inhibitoria de la agregación de las plaquetas, similar o superior a la del producto de referencia GSNO, siendo de destacar que los compuestos 1 y 5 muestran una actividad inhibidora muy superior a la de dicho producto de referencia. Ejemplo 9. - Ensayos in vitro de incremento de los niveles intraplaqueta de GMPc.
El compuesto obtenido en el ejemplo 5 (5) se ensaya in vitro para comprobar su capacidad de incrementar los niveles intraplaquetarios de GMPc en una preparación de plaquetas lavadas humanas.
La metodología seguida en los ensayos es substancialmente coincidente con la descrita en las referencias bibliográficas citadas en el ejemplo 8.
El compuesto se ensaya a cuatro concentraciones diferentes, utilizando 5 donantes de plaquetas distintos. Los datos obtenidos se comparan con los proporcionados por el GSNO (producto de referencia) y con los valores básales. Los resultados obtenidos, que se muestran en la tabla 3, se expresan en pmol/109 plaquetas.
Figure imgf000036_0001
El compuesto 5 aumenta los niveles intra- plaquetarios de GMP de manera similar a la del GSNO de referencia. Es de destacar que para valores próximos a la IC5o, el compuesto 5 induce unos nive- les de GMPc más bajos que el GSNO cuando se utilizan concentraciones próximas a su IC50.
Ejemplo 10. - Ensayo in vitro de bloqueo de la inhibición de la agregación de las plaquetas . La metodología seguida en los ensayos es substancialmente coincidente con la descrita en las referencias bibliográficas citadas en el ejemplo 8, completada con la referencia:
* Moro MA, et al. Pr Nat Acad Se USA. 1996 ;93:1480-5.
El ODQ se ensaya in vitro para bloquear la inhibición de la agregación de las plaquetas en una preparación de plaquetas lavadas humanas lograda por los compuestos obtenidos.
El compuesto obtenido en el ejemplo 5 (5) se ensaya a tres concentraciones diferentes, en presencia o ausencia de ODQ (1 μM) , utilizando 5 donantes de plaquetas diferentes. Los resultados obtenidos se comparan con los proporcionados por el producto de referencia (GSNO) y con los valores en ausencia de ODQ. Los resultados obtenidos, que se muestran en las tablas 4 y 5, se expresan como porcentaje de inhibición sobre la agregación máxima.
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
El ODQ (1 μM) es capaz de bloquear el efecto inhibidor del GSNO y del compuesto 5 cuando se utiliza la dosis IC50 de los compuestos. A dosis superiores a las de la IC50, el efecto inhibidor de la agregación es mejor bloqueado en el caso del compuesto 5 que en el caso del compuesto de referencia.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- S-nitrosotioles derivados de la peni- cilamina o del glutatión, y sus sales farmacéuticamente aceptables, que responden a la fórmula general (I)
Figure imgf000039_0001
en la que:
A y B son grupos fenilo o bien, conjuntamente, conforman el resto -CH2-Q-CH2- constituyendo un anillo de seis unidades en el que Q representa un átomo de oxigeno o de azufre o un resto N- R3, en el que R3 es hidrógeno o un grupo alquilo Cι-C4;
R1 es un resto acilo, que puede ser un acilo alifático Cχ-C5 o un resto de ácido glutámico unido por medio de su carboxilo no aminoacídico;
R2 es un grupo hidroxilo o un resto de glicina unido mediante un enlace peptidico; de manera que cuando R1 es un resto acilo alifático R2 es un grupo hidroxilo, y cuando R1 es un resto de ácido glutámico R2 es un resto de glicina.
2.- S-nitrosotioles, de acuerdo con la reivindicación 1, que responden a la fórmula general
(II)
Figure imgf000040_0001
(II)
en la que A y B tienen los valores indicados anteri- ormente y R4 es un grupo alquilo Cι-C4.
3.- El compuesto, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, ácido N-acetil-2-amino-2- [4- (4-S-nitrosomer-captotetrahidropiran) ] acético (1) .
Figure imgf000040_0002
4 . - El compuesto, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2 , ácido N-acetil-2-amino-2- [ 4- ( 4 -S-nitrosomer-capto-l-metilpiperidin) ] acético (2 ) .
Figure imgf000040_0003
5.- El compuesto, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, ácido N-acetil-2-amino-3- bencil-3-S-nitroso-mercapto-4-fenilbutanoico (3) .
Figure imgf000041_0001
6.- S-nitrosotioles, de acuerdo con la reivindicación 1, que responden a la fórmula general (III)
Figure imgf000041_0002
en la que A y B tienen los valores indicados anteriormente .
7. - El compuesto, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 6, N [N-γ-L-glutamil-2-amino-2- (4- (4-S-nitroso-mercapto) tetrahidropiran) ) acetil]- glicina (4) .
Figure imgf000041_0003
8.- El compuesto, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 6, N [N-γ-L-glutamil-2-amino-2- (4- (4-S-nitroso-mercapto-l-metilpiperidin) ) acetil]- glicina ( 5 )
Figure imgf000042_0001
9.- El compuesto, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 6, N [N-γ-L-glutamil-2-amino-3- bencil-3- (4-metilbencil-S-nitrosomercapto) -4-fenil- butanoil]glicina (6) .
Figure imgf000042_0002
10.- La utilización de los S-nitrosotioles de cualquiera de las reivindicaciones anteriores para preparar medicamentos para el tratamiento de disfunciones circulatorias.
11.- La utilización, de acuerdo con la reivindicación 10, para preparar medicamentos para el tratamiento de disfunciones del sistema cardiovascular .
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