NO326806B1

NO326806B1 - S-nitrosotioler som midler for behandling av sirkulatoriske dysfunksjoner

Info

Publication number: NO326806B1
Application number: NO20013385A
Authority: NO
Inventors: Francisco Pubill Coy; Josè Repolles Moliner; Lydia Cabeza Llorente; Marcelli Carbo Banus; Christina Negrie Rofes; Juan-Antonio Cerda Riudavets; Alicia Ferrer Siso; Eduardo Salas Perez-Rasilla; Nuria Trias Adroher; Jesús Murat Moreno; Pedro Michelena Llaguno
Original assignee: Lacer Sa
Priority date: 1999-01-27
Filing date: 2001-07-06
Publication date: 2009-02-16
Also published as: ID29777A; AP1439A; IL144381A; RS50072B; PL202372B1; ES2147162A1; HRP20010562A2; EE200100389A; PL349006A1; ES2147162B1; ATE249428T1; YU53601A; CZ298871B6; NO20013385L; HK1043586A1; WO2000044714A1; EE04524B1; IL144381A0; DE60005154D1; JP3795330B2

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår nye s-nitrosotiolderivater av penicillamin eller glutation som har vasodilaterende virkning og som inhiberer aggregering av blodplater og som derfor er nyttig for fremstilling av legemidler for behandling av dysfunksjoner av det sirkulatoriske system, spesielt på kardiovaskulært nivå.

Det er velkjent at forbindelser som er i stand til å frigjøre nitrogenoksid (NO) i organismen utviser i mange tilfelle en aktivitetstype på det vaskulære system, for eksempel vasodilaterende aktivitet eller inhibisjon av aggregering av blodplater, som gjør dem potensielt nyttig for behandling av forskjellig lidelser relatert til dysfunksjoner i det sirkulatoriske system.

Videre er det også beskrevet at spesifikke derivater som inneholder en s-nitrosotiolgruppe har, fra et medisinsk synspunkt, karakteristiske fordeler fordi de er i stand til å frigjøre NO i organismen.

Radomski et al., Br. J. Pharmacol (1992) 107, 745-749, beskriver at s-nitrosoglutation (GSNO) forbindelsen er i stand til å inhibere aktiviteten til blodplater.

Golino et al, Circulation Research,. 71, No. 6 (1992) beskriver at s-nitrosocystein er i stand til å inhibere blodplateaktivitet på grunn av en antitrombotisk effekt.

Smith et al., Met. Find. Exp. Cline Pharmacy. (1994), 16, 5, beskriver at GSNO produserer en sterk avslappende virkning på arteriolene.

W095/12394 beskriver anvendelse av s-nitrosoadukter av peptider, bland andre s-nitroso-N-asetylpenicilliamin (SNAP) som beskyttende midler mot vaskulær inflammasjon av traumatisk opprinnelse.

WO95/07691 beskriver anvendelse av forskjellige s-nitrosotioler, spesielt GSNO, ved behandling og forhindring av virkningen av blodplater og dannelse av trombose og skadet vaskulær overflate.

WO93/09806 beskriver s-nitroserte proteiner eller aminsyreester, som er i stand til å frigjøre NO, som har en avslappende virkning på muskulaturen og en inhibitorsk virkning på blodplateaggregering.

EP-B1-412699 beskriver s-nitrosotioler tilsvarende følgende generell formel

og dens anvendelse som terapeutiske midler mot kardiovaskulære sykdommer, spesielt som midler mot hypertensjon (øker blodpresstrykk) og som midler for behandling av angina pectoris. Totalt mulige forbindelser med nevnte formel er enormt og beskrivelsen beskriver bare eksplisitt flere titall av slike produkter. Videre er det bare beskrevet data som angår deres generelle vasodilaterende virkning, og intet er nevnt vedrørende blodplateaktivitet.

S-nitrosotioler beskrevet i dokumentene nevnt ovenfor løser ikke i seg selv alle de kompliserte problemene vedrørende behandling av vaskulære lidelser, spesielt på kardiovaskulært nivå. Det er derfor nødvendig å utvikle nye forbindelser som er kraftige og mer effektive.

En hensikt med foreliggende oppfinnelse angår nye s-nitrosotiolderivater av penicillamin eller glutation, som begge har en kraftig vasodilaterende virkning og en høy inhibitorisk virkning på aggregering av blodplater.

Videre angår en hensikt med foreliggende oppfinnelse anvendelse av de nye forbindelser til fremstilling av legemidler for behandling av lidelser relatert til dysfunksjoner i sirkulasjonssystemet, spesielt på kardiovaskulært nivå.

Forbindelsene i henhold til oppfinnelsen er S-nitrosotiolderivater av penicillamin eller glutation og dere farmasøytisk akseptable salter som tilsvarende følgende generelle formel (I)

i hvilke A og B er fenylgrupper eller sammen danner resten -CH2-Q-CH2- som består av en ring av seks enheter hvori Q representerer et atom av oksygen, svovel eller en gruppe N-R<3>, i hvilke R3 er hydrogen eller en alkylgruppe C1-C4; R<1> er en acylrest, som kan være en alifatisk acylgryppe C1-C5 eller en rest av glutaminsyre bundet via dens ikke-aminokarboksylsyre;

R ry er en hydroksylgruppe eller en glysinrest bundet via en peptidbinding; med det forbehold at hvis R<1> er en alifatisk acylrest da er R<2> en hydroksylgruppe, og hvis R<1 >er en rest av glutaminsyre da er R en glysinrest.

Følgelig tilsvarer forbindelsene i henhold til foreliggende oppfinnelse følgende generelle formler (II) eller (III) i hvilke A og B har betydningene nevnt ovenfor og R<4> er en C1-C4 alkylgruppe, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Foretrukne eksempler på forbindelser innenfor oppfinnelsens hensikt er følgende: N-acetyl-2-amino-2-[4-(4-s-nitrosomerkaptotetrahydropyran)] eddiksyre (i).

N-acetyl-2-amino-2- [4-(4-s-nitrosomerkapto-l-metylpipperidin)] eddiksyre (2).

N-acetyl-2-amino-3-benzyl-3-S-nitrosomerkapto-4-fenyl-butansyre (3).

N[N-y-L-glutamyl-2-amino-2-(4- (4-S-nitrosomerkapto) tetrahydropyran)) acetyl]-glysin (4). N[N-y-L-glutamyl-2-amino-2-(4-(4-S-nitrosomerkapto-l-metyl-pipperidin)) acetyl]-glysin (5).

N[N-y -L-glutamyl-2-amino-3-benzyl-3-(S-nitrosomerkapto)-4-fenylbutanoyl]-glysin (6).

For en person med kunnskaper på området er det klart at forbindelsene i henhold til oppfinnelsene omfatter kirale sentre og at dette tillater at det skilles mellom de mulige isomerer og/eller blandinger av disse. Det skal forstås at både blandingene av isomerene og de rene isomerene er innenfor oppfinnelsens hensikt. Det siste kan være oppnådd fra blandingene av isomerer gjennom konvensjonelle teknikker vel kjent for en ekspert på området eller gjennom asymmetriske synteser også velkjent for en person med kunnskap på området.

Forbindelsene i henhold til oppfinnelsen kan oppnås på forskjellige måter og de spesifikke måtene vil generelt avhenge av dens basalstruktur.

For eksempel kan forbindelsene med generell formel (II) oppnås i henhold til den sekvens av trinn illustrert i følgende skjema.

Det vil med å starte fra klorhydratene og aminosyrene, som kan oppnås i henhold til kjente metoder (se for eksempel DE-A-3023830 og DE-A-2801849), etterfulgt av en acylering av aminosyrenitrogengruppen ved konvensjonelle teknikker, for eksempel ved et syreklorid, og i et avsluttende trinn deretter introdusere en nitrosogruppe på det merkaptale svovel, også ved anvendelse av konvensjonelle teknikker.

Vedrørende forbindelse med generell formel (III) kan de oppnås i henhold til sekvensen av trinn illustrert i følgende skjema.

Det vil si med utgangspunkt i de samme klorhydrater av aminosyrer som i tilfelle ovenfor, etterfulgt av en beskyttelse av merkaptogruppen gjennom dannelse av en tioeter av p-metylbenzyl. Dette blir fulgt av en beskyttelse av aminosyrenitrogenet gjennom den kjente teknikken til Boe og deretter blir tripeptidet dannet med restglutaminsyren og glysin (aminosyre c-terminal) i fast fase ved hjelp av kjente teknikker (se for eksempel Barany, G. Et al., The Peptides, 2,1, Gross, E. Meienhofer, Red.Academic Press, NY (1980); Stewart, J.M. et al., Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman, San Francisco, CA (1969); Bodanszky, M. Et al., Peptide Synthesis, 2<nd> ed., Wiley, NY (1976)).

Dannelsen av peptidet omfatter følgende trinn:

a) Forankring av aminosyren C-terminalglysin (Gly), i form av en tert-butoksykarbonyl (Boe) derivat, på en harpiks av

p-metylbenzylhydrylamin/polystyren.

b) Fjerning av Boe gruppen med trifluoreddiksyre og nøytralisering.

c) Inkorporering av mellomprodukt beskyttede modifisert aminosyre.

d) Evaluering av koblingsreaksjonen via ninhydrin (Kaise, E. Et al., Anal.

Biochem., 34, 595 (1970)). e) Gjentakelse av trinnene ovenfor for resten y-glutaminsyre (y-Glu) som er inkorporert som et Boc-derivat eller benzyl beskyttet (Boc-Glu-OBzl). f) Acidolyse med vannfri HF for å avbeskytte tripeptidet og frigjøre dette fra harpiksen.

g) Rensing og karakterisering av de endelige produkter.

Når tripeptidet er dannet blir det ført videre som et avsluttende trinn til nitrosering

av merkaptogruppen frigjort fra sin beskyttende gruppe.

Testene utført viser at de nye s-nitroserte forbindelser i henhold til oppfinnelsen har en vasodilaterende virkning som er minst sammenlignbar til den for GSNO, og i noen tilfeller i stor grad overlegen. Videre har de en inhibitorisk virkning på aggregering av blodplater og også resultatene viser seg å være like eller overlegne sammenlignet med GSNO, i noen tilfeller betydelig overlegne.

Dette resulterer i at forbindelsene i henhold til foreliggende oppfinnelse kan brukes på en meget effektiv måte til fremstilling av et legemiddel med vasodilaterende og antitrombotisk virkning for behandling av dysfunksjoner i sirkulasjonssystemet, spesielt på kardiovaskulær og kransarterienivå.

Følgelig kan forbindelsen med den generell formelen (I), så vel som de farmasøytisk akseptable salter derav, anvendes, ved hjelp av anvendelse av konvensjonelle farmasøytiske teknikker, for fremstilling av legemidler som kan administreres på forskjellige måter.

Som et eksempel kan de administreres oralt i form av farmasøytiske preparater så som tabletter, kapsler, sirup og suspensjoner, for etter alt i former og som oppløsning eller emosjoner etc. Det kan også administreres topisk i form av kremer, pomader, balsam, etc. og transdermalt for eksempel gjennom anvendelse av plaster eller bandasjer. De kan også anvendes direkte i rektum som stikkpiller. Preparatene kan omfatte fysiologisk akseptable bærere, eksipienser, aktivatorer, gelaterende midler, stabilisatorer etc. Tilfellet av injeksjoner kan det inkorporeres fysiologisk akseptable buffere, oppløsningsmidler eller isotone midler. Den daglige dose kan varieres avhengig av pasientens spesifikke symptomer, alder, kroppsvekt, spesifikk administrering etc. og en daglig normaldose for en voksen person kan være mellom 0,1 og 500 mg, og kan administreres som en dose eller deles opp i flere doser over dagen.

I arbeidseksemplene heri ( vide infra) er det beskrevet i detaljer egnede fremgangsmåter til å oppnå forskjellige av forbindelsene i henhold til den generelle formel (I). I lys av disse eksempler er det innenfor en fagpersons generelle kjennskap å oppnå forbindelsene som ikke er spesifikt eksemplifisert heri, ved hjelp av egnede modifikasjoner av arbeidseksemplene som er vist.

Følgelig skal ikke arbeidseksemplene heri tolkes som begrensende for oppfinnelsens ide, men bare som en ytterligere detaljert forklaring som kan lede personen til en dypere forståelse av oppfinnelsen.

EKSEMPLER

I den eksperimenterende del av eksemplene er følgende forkortelse brukt:

Klorhydratene til startaminosyrene blir syntetisert som beskrevet i den tyske patentsøknaden DE-A-3023830 og DE-A-2801849.

De nukleærmagnetiske ressonansspektra har blitt opptatt i en Varian Gemini-200 apparat.

I en <1>HNMR spektra er det angitt arbeidsfrekvensen og oppløsningsmiddelet brukt til å lage spekteret. Posisjonen til signalene er angitt i 8 (ppm), ved å bruke som referanse signalet til protonene i oppløsningsmiddelet. Referanseverdiene er 7,24 ppm for kloroform og 2,49 ppm for deuterium dimetylsulfoksid. Innenfor hakeparenteser er det angitt antallet protoner som korresponderer til hvert signal målt ved elektronisk integrasjon og typen av signal er angitt ved å bruke følgende forkortelser: s (enkel), d (dublett), t (triplett), dd (dublett av dubletter),

sb (signalbredde), sc (signalkompleks), d.e. D2O (forsvinner under dannelse av spekteret etter tilsetting av noen dråper deuterium vann).

I <l3>C-MNR spektra er det angitt arbeidsfrekvensen og oppløsningsmiddel på hvert spektrum. Posisjonen av signalene er angitt i 8 (ppm), ved å bruke som referanse signalet til protonene i oppløsningsmiddelet. Referanseverdien er 77,00 ppm for kloroform og 39,50 ppm for deuterium dimetylsulfoksid.

Videre er det blitt tilveiebrakt magnetiske nukleære ressonanseksperiment ved å bruke den vedlagte protontest (APT).

Analyse ved HPLC for å bestemme renhéten av prøvene er gjort under følgende betingelser:

A-generell gradient

Kolonne: RP-C18, symmetri 150x3,9 mm, 5\ i, 100 A

Mobil fase: H20+H3P04 0,1%/CH3CN + 5% H20 + 0,1% H3P04

Temperatur: romtemperatur

Gjennomstrømning: 1 ml/min

Injeksjonsvolum: 10 ul

B-isokratisk

Kolonne: RP-C18, symmetri 150x3,9 mm, 5|x, 100 A

Mobil fase: 50% de H20+H3P04 0,1% y 50% de CH3CN + 5% H20 + 0,1% H3P04 Temperatur: romtemperatur

Gjennomstrømning: 1 ml/min

Injeksjonsvolum: 10 ul

Ved fremstilling av tripeptidene blir teknikker for preparerende kromatografi og HPLC brukt for å rense råproduktet og identiteten til produktet blir bekreftet av massespektrometri og aminosyreanalyse. Renheten av tripeptidene blir analysert ved HPLC under følgende betingelser: kolonne av type Cl8 Nukleosyl,

250 x 4 mm, 120 A, 10 um; gjennomstrømning de 1 ml/min; eluenter A = H20 (+0.045% TF A) y B = CH3CN (+0.036% TF A).

De ultrafiolette spektra (UV) er blitt gjort ved anvendelse av et

Shimadzu UV-160A spektrofotometer. For hver av forbindelsene er det angitt bølgelengden ( X) i nm og molekylær absorpsjon (e) i cm' 1 mol-<1>1.

For høytrykksvæske kromatografi (HPLC) er det blitt brukt en ultrafiolett fotodiode Hewlett- Packard 1040A detektor.

Eks. 1

Oppnåelse av N- acetvl- 2- amino- 2- r4-( 4- S- nitrosomerkaptotetrahvdropyran)] eddiksyre ( 1 )

Trinn 1) I en 250 med mer glassflaske tilveiebrakt med magnetisk røring ble 4,0 g (17,6 mmol) av klorhydratet av 2-amino-2-[4-(4-merkaptotetrahydropyran)] eddiksyre og 60 ml av en oppløsning av kaliumhydroksid 0,5 N innført. Deretter 3,07 g (21,8 mmol) av vannfritt kaliumkarbonat og 60 mml MeCN tilsatt. Blandingen blir avkjølt i et isbad og 1,42 ml (19,7 mmol) av acetylklorid oppløst i 25 mml MeCN bli tilsatt dråpevis. Til slutt blir dette 0,5 N kaliumhydroksidet tilsatt inntil pH verdien er 9-10. Blandingen blir rystet ved romtemperatur i to timer. Deretter ble 2 N saltsyre tilsatt inntil pH verdien = 6 og oppløsningsmiddelet blir eliminert ved redusert trykk. Det oppnådde faststoffet blir tørket i vakuum over fosforpentoksid og suspendert i 150 ml absolutt EtOH og rystet ved romtemperatur. Den uoppløselige resten blir filtrert og vasket med absolutt EtOH. Oppløsningsmiddelet ble eliminert ved redusert trykk. 3,98 g råprodukt av mellomproduktet N-acetyl-2-amino-2-[4-(4-merkaptotetrahydropyran)] eddiksyre ble oppnådd, og utsatt for forskjellig reverserte preparerende kromatografiske faser for å oppnå 80 mg av produktet med 90% renhet (HPLC gradient A, k=205 mm).

'H-NMR (200 Mhz, DMSO-d6): 7,40 (1H, d, J=10Hz, NH), 4,13(1H, d, J=10Hz, CH), 3,75-3,50 (4H, s.c., CH2), 1,90-1,80 (4H, s.c., CH2), 1,65 (3H, s, CH3).

<13>C -NMR (50 Mhz, DMSO-d6): 171,50 (CO-N), 168,90 (CO), 63,69 (CH2), 63,27 (CH2), 62,80 (CH), 49,18 (C), 37,58 (CH2), 36,12 (CH2), 23,01 (CH3).

Trinn 2) 80 mg (0,34 mmol) av N-acetyl-2-amino-2-(4-(4-merkaptotetrahydropyran)) eddiksyre blir oppløst i 4000 ul av MeOH, og deretter blir 500 ul en N HC1 oppløsning og 136 ul av 5M NaNo2 oppløsning tilsatt. Den resulterende oppløsning blir behandlet i et minutt i et ultralydbad og deretter blir 50 ul 10 NaOH og 14 ul H20 tilsatt.

Fra den resulterende oppløsning blir en porsjonsdel A på 470 ul atskilt og til resten blir vann i overskudd tilsatt, frosset ned og lyofilsert for å oppnå 190 mg av et hygroskopisk faststoff B som er lett fuktig.

HPCL (graden A):

X 220 nm: renhet av fraksjon A 68%

X 339 nm: renhet av fraksjon A 95%

NMR fraksjon B:

<!>H-NMR (200 Mhz, DMSO-d6): 8,00-7,50 (1H, s.c., NH), 4,50-4,00

(1H, s.c, CH), 3,80-3,40 (4H, s.c, CH2) 2,40-1,80 (4H, s.c, CH2), 1,88 (3H, s, CH3). <13>C-NMR (50 Mhz, DMSO-d6): 173,00 (CO), 169, 52 (CO), 67,69 (CH2-0), 63,45 (CH), 53,78 (C), 32,17 (CH2), 22,80 (CH3).

Eks. 2

Oppnåelse av N- acetvl- 2- amino- 2- r4-( 4- s- nitrosomerkapto- l- metylpipperidin') l eddiksyre ( 2)

Trinn 1) I en 250 mm glassflaske tilveiebrakt med magnetisk røring blir det innført 3,69 g (13 mmol) 2-amino-2-[4-(4-merkapto-l-metylpiperidin)] eddiksyre diklorhydrat og 30 ml 0,5 N oppløsning av kaliumhydroksid. Deretter blir det tilsatt 2,2 g (16 mmol) av anhydridkaliumkarbonat og 30 MeCN. Blandingen blir avkjølt på isbad og 1,0 ml (14 mmol) av åcetylklorid oppløst i 10 ml MeCN blir tilsatt dråpevis. Ved avslutning av dette blir 0,5 N kaliumhydroksid tilsatt inntil pH verdien er 9-10. Blandingen blir rystet ved romtemperatur i to timer. Deretter blir 2 N saltsyre tilsatt inntil pH verdien = 6 og oppløsningsmiddelet blir eliminert ved redusert trykk. Det oppnådde faststoff blir vakuumtørket over fosforpentoksid og det tørkede faststoffet blir suspendert i 100 ml absolutt EtOH og rystet ved romtemperatur. Den uoppløselige resten blir filtrert og vasket med absolutt EtOH og oppløsningsmiddelet blir eliminert ved redusert trykk. 2,8 g råmellomprodukt, N-acetyl-2-amino-2-[4-(4-merkapto metylpiperidin)] eddiksyre blir oppnådd, som blir utsatt for forskjellige reverserte preparative kromatografifaser for å oppnå

0,5 g av produktet med 99% renhet (HPCL grad A, A.=210 nm).

<!>H-NMR (200 Mhz, DMSO-d6) : 8,35 (1H, d, J=10Hz, NH), 4,43 (1H, d, J=10HZ, CH), 3,35-3,00 (4H, s.c, CH2), 2,70 (3H, s, CH3), 2,20-1,90 (4H, S.c, CH2), 1,85 (3H, S, CH3).

13C-NMR (50Mhz, DMSO-d6): 170,55 (CO-N), 170,05 (CO), 61,77 (CH), 49,33 (CH2), 49,28 (CH2) 46,38 (C), 42,26 (CH3), 33,05 (CH2), 33,14 (CH2) 22,42 (CH3).

Trinn 2) 50 mg (0,20 mmol) av N-acetyl-2-amino-2-[4-(4-s-nitro-s6merkapto-l-metylpiperidin)] eddiksyre blir oppløst I 800 ul 1 N HC1 og deretter blir 80 ul 5 N NaN02 og deretter blir 80 fil 5 N NaN02 oppløsning tilsatt. Den resulterende oppløsning blir behandlet i et minutt i et ultralydbad og deretter blir 80 ul 10N NaOH og 40 ul H20 tilsatt.

Fra den resulterende oppløsning blir 100 ul av en prøvedel A atskilt og resten blir frosset ned og lyofilisert for å oppnå 190 mg av faststoff B.

HPLC (graden A):

A, 230 nm: renhet fraksjon A 90%; renhet fraksjon B 93%

k " 334 nm: renhet fraksjon A 98%; renhet fraksjon B 98%.

NMR fraksjon B:

'H-NMR (200 Mhz, D20): 4,71 (1H, s, CH), 2,70-2,20 (8H, sc, CH2), 1,95 (3H, s.

CH3-N), 1,71 (3H, s, CH3-CO).

<13>C-NMR (50 Mhz, D20): 172,51 (CO), 171,52 (CO), 61,08 (CH), 58,18 (C), 48,09 (CH2-N), 48,01 (CH2-N), 42,18 (CH3-N), 30,44 (CH2), 29,85 (CH2), 20,17 (CH3-CO).

Eks. 3

Oppnåelse av N- acetvl- 2- amino- 3- benzvl- 3- S- nitrosomerkapto- 4- fenvl- butansyre

LB

Trinn 1) I en 100 ml glassflaske tilveiebrakt med magnetisk røring blir det tilført 2,0 g (5,9 mmol) av 2-amino-3-benzyl-3-merkapto-4-fenyl-butansyre og 20 ml av en 0,5 N oppløsning av kaliumhydroksid. Deretter blir det tilsatt 1, 0 g (7,2 mmol) av vannfri kaliumkarbonat og 20 ml MeCN. Blandingen blir avkjølt i et isbad og 0,5 ml (6,5 mmol) av acetylklorid blir oppløst i 8ml av MeCN tilsatt dråpevis. Etter avslutning av dette blir 0,5 N kaliumhydroksid tilsatt inntil pH verdi 12-13. Blandingen blir rystet ved romtemperatur i to timer. Deretter blir 2 N saltsyre tilsatt inntil pH-verdi 6,0 og oppløsningsmiddelet blir eliminert ved redusert trykk. Det oppnådde råprodukt blir suspendert i 100 ml absolutt EtOH og rystet ved romtemperatur. Den uoppløselig rest blir filtrert og vasket med absolutt EtOH. Oppløsningsmiddelet blir eliminert ved redusert trykk. Resten blir rekrystallisert i vann. Den uoppløselig del blir filtrert og kastet. Filtratet blir frosset ned og lyofilisert. 1,64 g av mellomproduktet, N-acetyl-2-amino-3-benzyl-3-merkapto-4-fenyl-butansyre blir oppnådd. Utbytte: 81%.

'H-NMR (200 Mhz, MSO-d6): 7,68 (1H, d, J=8Hz, NH), 7,35-7,05 (10H, sc, CHar), 4,36 (1H, d , J= 8Hz, CH), 3,42-3,02 (2H, sc, CH2-Car), 2,95-2,55 (2H, sc, CH2), 1,82 (3H, s, CH3)

<13>C -NMR (50 Mhz, DMSO-d6): 172,94 (CO-N), 169,08 (CO), 138,55 (Car), 138,16 (Car), 132,36 (2CHar), 131,89 (2CHar), 127,78 (2CHar), 127,53 (2CHar), 126,44 (CHar), 126,26 (CHar), 60,16 (CH), 55,62 (C), 43,70 (CH2), 42,94 (CH2), 23,14 (CH3).

Trinn 2) 0,62 g (1,8 mmol) av N-acetyl-2-amino-3-benzyl-3- merkapto-4-fenyl-butansyre blir oppløst i 25 ml MeOH og deretter gir 0,25 ml av IN HC1 og 250 mg NaN02 oppløsning i 25 ml H20 tilsatt. Den resulterende oppløsning blir rystet i 35 minutter ved romtemperatur, filtrert og vasket med vann. Etter tørking ved redusert trykk ved nærvær av P2Os blir det oppnådd 0,33 g av et faststoff.

HPLC (isokratisk B):

X 220 nm: renhet 91%

X 342 nm: renhet 100%

■H-NMR (200 Mhz, DMSO-de): 8,77 (1H, d, J=10Hz, NH), 7,28-7,00 (10H, sc, CHar), 5,33 (1H, d, J=10Hz, CH), 4,12 -3,90 (2H, sc, CH2), 3,88-3,38 (2H, sc, CH2), 1,86 (3H, s, CH3)

<13>C -NMR (50 Mhz, DMSO-d6): 171,55 (CO-N), 169,67 (CO-O), 135,51 (Car), 135,27 (Car), 131,52 (CHar), 131,41 (CHar), 128,15 (CHar), 128,05 (CHar), 127,04 (CHar), 65,13 (CH), 56,11 (CH), 40,91 (CH2), 40,15 (CH2), 22,29 (CH3).

Eks.4

O ppnåelse av N|" N- Y- L- glutamyl- 2- amino- 2-( 4-( 4- S- nitrosomerkapto') tetrahydropvran')') acetyl] glysin ( 4).

Trinn 1) I en 250 ml glassflaske tilveiebrakt med magnetisk røring ble det blandet 5,8 g (25,5 mmol) av 2-amino-2-(4-(4- merkaptotetrahydropyran)) eddiksyreklorhydrat, 4,7 g (25,5 mmol) av a-brom-p-xylen, og 100 ml av en blanding av H20/EtOH 3:1. 11 ml av trietylamin ble tilsatt, en argonatmosfære ble tilveiebrakt, og blandingen ble ristet i 18 timer ved romtemperatur. 50 ml mer av H20/EtOH 3:1 ble tilsatt og blandingen ble ristet i ytterligere to timer. Den resulterende suspensjonen ble filtrert og vasket med 100 ml vann og 50 ml EtOH. Et faststoff ble oppnådd som ble tørket ved redusert trykk. 300 ml konsentrert saltsyre ble tilsatt over faststoffet og oppløsningsmiddelet ble eliminert ved redusert trykk. Denne syrebehandling ble gjentatt for annen gang for å oppnå et faststoff som ble tørket ved redusert trykk. 1,59 g av mellomproduktet av interesse ble oppnådd.

<!>H-NMR (200 Mhz, DMSO-d6): 8,80-8,30 (3H, sb, H3N+), 7,26 (2H, d, J=8 Hz, CHar), 7,12 (2H, d, J=8 Hz, CHar), 4,03 (1H, s, CH-N), 3,85-3,55 (6H, sc, CH2-Car, CH2-0), 2,26 (3 H, s , CH3), 2,05 - 1,08 (4H, sc, CH2).

<13>C-NMR (50 Mhz, DMSO-d6): 168,98 (CO), 136,64 (Car), 133,80 (Car), 129,55 (CHar), 129,29 (CHar), 62,36 (CH2 -O), 59,85 (CH-N), 49,15 (C), 32,03 (CH2), 31,19 (CH2), 30,84 (CH2), 20,69 (CH3).

Trinn 2) 1004 mg av klorhydratet av 2-amino-2-(4-(4-p-metylbenzylmerkapto)tetrahydropyran)) eddiksyre (3,029 mmol) blir suspendert i 20 ml tBuOH/H20 2:1 og 5% NaOH ble tilsatt inntil pH verdien var 9. Deretter ble

3 ekvivalenter av Boc20 tilsatt og blandingen ble etterlatt reagerende i 30 minutter, hvoretter pH verdien ble justert til pH=9 en gang til. Reaksjonen ble forlenget ytterligere 30 minutter og pH verdien ble igjen korrigert, sammenlignet med utgangsamino syren. Ved å sammenligne med utgangsamino syren ved å bruke tynnlagskromatografi (TLC) er det konfirmert at reaksjonen er blitt fullstendig gjennomført.

Produktet ble isolert ved 2 påfølgende ekstraksjoner med 50 ml heksan og den

vandige fase ble behandlet med IN HC1 til pH verdi=2. Deretter blir det foretatt tre ekstraksjonstrinn med 60 ml AcOEt i hvert. Oppløsningen av EcOEt ble tørket med vannfritt MgS04 og, etter eliminering av oppløsningsmiddelet ved inndamping blir produktet gjenoppløst i DCM og inndampet igjen. Dette trinn ble gjentatt to ganger og deretter oppnådde man 1191 mg (3,015 mmol) av det N-Boc beskyttede

mellomprodukt.

Produktet er kjennetegnet ved:

a) TLC, med CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5 som mobil fase. El Rf=0,48, uten å observere noe signal fra utgangsmaterialet. b) HPLC i gradient fra 10% til 100% av MeCN i 30 minutter + isokratisk ved 100% av MeCN i fem minutter. Den resulterende renhet er på 96% (220 nm). c) Massespektrometri ved FAB-teknikk. Mregnet=:395, (M<+>H<+>)eksperimenteii<=>396.0 d) NMR (CDC13): 7,18 (2H, d, J=8 Hz) 7,09 (2H, d, J=8 Hz), 5,54 (1H, d, J=

11,2 Hz), 4,44 (1H, d, J= 8,3 Hz), 3,69 (1H, d, J=ll,2 Hz), 3,57 (1H, d, J=ll,2

Hz), 3,75-3,98 (4H, sb), 2,32 (3H, s), 1,26-2,19 (4H, sb), 1,46 (9H, s).

Trinn 3) Tripeptidet ble fremstilt ved fastfasesynteseteknikk, med utgangspunkt i 1595 mg av et Boc-Gly-OCH2-Pam-harpiks (neosystem, ref. nr. RP00801) med 0,63 mmol/g substitusjon. Arbeidsskalaen er på 1,005 mmol.

Den generelle protokoll for tilsetting av det gjenværende amino er følgende:

Oppsvelling av harpiksen med fem vasker på 0,5 minutter med DCM.

Fjerning av Boe gruppen med 40% TFA i DCM, 1X1 minutt + 1 X 20 minutter. Vask med DCM, 5 X 0,5 minutt.

Testing med ninhydrin.

Vask med DMF, 3 X 1 minutt.

Binding over en tidsperiode på en 1,5 timer.

Vask med DMF, 3 X 1 minutt.

Vask med DCM, 5 X 0,5 minutt.

Testing med ninhydrin.

I tilfelle testen med ninhydrin i det avsluttende trinn er positiv ble det fortsatt å binde på nytt i det trinnene 5-8 ble gjentatt.

Bindingen blir fullført med seks ekvivalenter (ekv) av DIEA, tre ekvivalenter av Boc-aminosyre og tre ekvivalenter av aktivt middel, som i dette tilfellet er PyAOp

(heksafluorfosfat av 7-asabenzotriasol-l-il-oksytris (pyrrolidino) fosfonium). For binding av y-Glu blir det brukt Boc-Gly-(a-OBzl).

Under avslutning av bindingssekvensen ble den resulterende peptidylharpiks underkastet acidolyse med HF/p-kreosol (9:1) i en time med 0°C. Etter inndamping blir den faste rest ekstrahert med vannfri EtOEt og deretter ble peptidet isolert ved ekstraksjon med 10% AcOH. Når volumet ble redusert ved inndamping ble råproduktet lyofilisert og karakterisert ved:

HPLC i en gradient fra 5% til 65% MeCN i 30 minutter.

MS ved elektrosprayeteknikken: Mberegnet<=>377, (M<+>H<+>)ekSperimenteii<=>378,2.

Mengden av peptid blir kvantifisert ved aminosyreanalyse: m=329 mg

(0,873 mmol). I alle peptidkvantifiseringene ble det benyttet en peptidanalyse ved å tilsette en ytterligere mengde av Ile (Isoleucin) til prøven for å hydrolysere den.

Rensingen av tripeptidet (i to porsjoner) ble gjort ved HPLC i preparativ skala. Benyttede systemet er følgende:

Kolonne: Cl8 Nukloesyl, 200 X 20 med mer, 120 Å, 10 um.

Eluenter: A=H20 (+0,1 % TF A), b=mEcn (+0,1 % TF A).

Gradienter: Isokratisk 0% B I 40 minutter + gradient fra +% til 1+% B i 40 minutter.

Gjennomstrømning: 25 ml/min.

En total mengde på 227 mg (0,602 mmol) av mellomtripeptidet ble oppnådd, som ble karakterisert ved: HPLC i en gradient fra % til 45% av MeCN i 20 minutter. Den resulterende renhet er 95% (220 nm). Den lille topp ved 8,4 minutter reduseres i relative proporsjoner inntil den forsvinner, ved progressivt å fortynne den anvendte prøve. Følgelig blir det konkludert at den tilsvarer en aggregering av tripeptidet (og ikke en oksidering) og den blir derfor vurdert som et verdifullt produkt.

MS elektrospray: Mberegnet<=>377 (M+H<+>)ekSpCrimentcii<=>378,2.

Trinn 4) Til en oppløsning av 14,2 mg (0,38 mmol) av tripeptidet oppnådd i trinn 3 i 800 ul 1 N HC1 ble det tilsatt 76 ul av en 0,5 M NaN02 oppløsning. Risting ble utført i et ultrasonisk bad ved romtemperatur i et minutt og deretter ble 80 ul NaOH oppløsning tilsatt. Den oppnådde oppløsning ble frosset ned og lyofilisert og det oppnådde faststoff er karakterisert ved: 'H-NMR (200 Mhz, DMSO-d6): 8,90-8,50 (2H, sb, NH), 5,35 (1H, d, J=10 Hz, CH), 4,10-3,00 (3H, sc, CH2,CH), 1,95-1,65 (4H, sc, 2CH2).

<13>C-NMR (50 Mhz , DMSO-d6): 172,18 (CO-N), 171,21 (CO-N), 168,40 (CO-O), 63,03 (CH2), 62,31 (C), 59,56 (CH), 53,19 (CH), 41,20 (CH2), 32,94 (CH2), 31,71 (CH2), 31,41 (CH2), 27,12(CH2).

HPLC (Metode A): X 220 nm (renhet 94%); X 334 nm (renhet 95%)

UV X 346 nm e(H20) 502 cm"<1>mol"<1> L

Eks. 5

Oppnåelse av N[ N- Y- L- glutamvl- 2- amino- 2-( 4-( 4- s- nitrosomerkapto- l - metylpipperidin')') acetyl] glvsin ( 5 )

Trinn 1) I en 100 ml glassflaske tilveiebrakt med magnetisk risting ved 6,4 g

(23 mmol) av diklorhydratet av 2-amino-2-(4-(4-merkapto-l-metylpipperidin)) eddiksyre, 4,3 g (23 mmol) av a-brom-p-xylen, og 40 ml av en blanding av H20/EtOH 1:1 blandet. 13 ml av trietylamin ble tilsatt og en argonatmosfære ble dannet og blandingen ble ristet i 42 timer ved romtemperatur. Fra den resulterende oppløsning ble oppløsningsmiddelet eliminert ved et redusert trykk og til det oppnådde råprodukt ble 20 ml absolutt EtOH tilsatt. Det oppnådde faststoff ble filtrert og vasket påfølgende med absolutt EtOH og EtOEt, og deretter tørket ved redusert trykk. 2,11 g av mellomproduktet klorhydrat av 2-amino-2-(4-(4-metylbenzylmerkapto)-l-metylpipperidin)) eddiksyre oppnådd. Utbytte 29,6.

NMR spektrum ble registrert i D20 og som referanse ble det brukt 4,75 ppm for

HDO.

•H-NMR (200 Mhz, D20): 7,28 (2H, d, J=8 Hz, CHar), 7,15 (2H, d, J=8 Hz, Char),3,64-3,74 (2H, sc, CH2-Car), 3,62 (1H, s, CH-N), 3,4-3,1 (4H, sc, CH2-N), 2,76 (3H, s, CH3-N), 2,24 (3H, s, CH3), 2,15-1,92 (4H, sc, CH2).

<13>C -NMR (50 Mhz, D20): 173.15 (CO), 141.00 (Car), 136.39 (Car), 132.58 (CHar), 131. 95 (CHar), 63.57 (CH-N), 52.48 (CH2)+, 50.65 (C), 45,66 (CH3-N), 34.05 (CH2), 32.35 (CH2), 31.28 (CH2), 22.77(CH3)

Trinn 2) Ved å starte fra 1016 mg (2,958 mmol) av mellomproduktet oppnådd i det forrige trinn og fortsette på samme måten som beskrevet i trinn 2 i eks. 4, ble det oppnådd 1016 mg (2,490 mmol) av det N-Boc beskyttede mellomprodukt som er karakterisert ved: a) CCF (mobil fase CHCI3/MeOH/AcOH 85:10:5). Rf=0,32, uten at signalet for utgangsproduktet er observert. b) HPLC gradient fra 10% til 100% MeCN i 30 minutter. Renheten er 96%

(220 nm).

c) MS ved FAB teknikk: Mberegn=408 (M+H<+>)ekSp=408,9.

d) MS ved elektrosprayteknikk: (M+H<+>)eksp=409,3.

Trinn 3) Tripeptidmellomproduktet blir oppnådd ved å bruke fremgangsmåten

beskrevet i trinn 3 i eks. 4, ved å starte med 794 mg av harpiksen nevnt ovenfor. Arbeidsskalaen er 0,5 mmol. På grunn av vanskelighetene med å oppløse Boc-derivatet blir det valgt å benytte N-metylmorfolin som base (tre ekvivalenter) i stedet for DIE A i koblingsreaksjonen nevnt ovenfor. Etter inkorporering av yGlu, blir tripeptidet dratt sammen og peptidharpiksbåndet blir brutt ved acidolyse på samme måte som beskrevet ovenfor. Endelig ble det oppnådd et råprodukt i 10 % AcOH som blir lyofilisert og kvantifisert etterpå. 137 mg (0,351 mmol) av mellomprodukttripeptidet blir oppnådd og karakterisert ved: a) HPLC, isokratisk gradient 0% i 10 minutter + 5%->65% av MeCN i 30 minutter. Det blir sett at det injiserte produkt i eddikoppløsning elueres med

fronten, som gjør det nødvendig å lyofilisere porsjonene for å eliminere syren og gjenoppløse lyofilisatet i ImM HC1. På denne måte kunne peptidet observeres kromatografisk og det eluerer ved 6,8 minutter i den anvendte gradienten.

b) MS ved elektrosprayteknikk: Mberegn=390 (M+H<+>)ekSp=391,2.

Rensingen av råmaterialet blir utført ved hjelp av HPLC, i preparativ skala, med

parameterne allerede beskrevet i eks. 4. Det blir også anvendt en isokrati på 0% av B i 40 minutter etterfulgt av en gradient fra 0% til 10% av B i 40 minutter. På denne måten ble 107 mg (0,274 mmol) av produktet oppnådd, og karakterisert ved: a) HPLC gradient fra 0% til 0% i 10 minutter pluss 0% til 30% i 20 minutter. Renheten er 94% (220 nm). Det er konfirmert at den ytterligere topp på 8,0

minutter korresponderer i dette tilfellet til aggregering og dette er i henhold til korrekt produkt.

b) MS ved elektrosprayteknikk: Mberegn=390 (M+H<+>)eksp=391,1.

Trinn 4) Med utgangspunkt i 10,0 mg (0,026 mmol) av tripeptidmellomproduktet oppnådd i det tidligere trinn blir nitrosering utført som beskrevet i trinn 4, i eks. 4, ved å bruke 52 ul av 0,5 m NaN02. Det oppnådde produkt er karakterisert ved: <13>C-NMR (50 Mhz , DMSO-d6): 171,57 (CO-N), 170,99 (CO-N), 170,76 (CO-N), 168,20 (CO-O), 60,23 (C), 59,53 (CH), 51,57 (CH), 49,02 (CH2), 42,20 (CH3), 41,59 (CH2), 30,49 (CH2), 29,75 (CH2), 29,31 (CH2), 26,05 (CH2).

HPLC (metode B): X 220 nm (renhet 74%); X 334 nm (renhet 88%).

UV: X 346 nm e (H20) 198 cm-<1> mol<-1> L

Eks. 6

Oppnåelse av N[ N- Y- L- glutamyl- 2- amino- 3- benzvl- 3-( S- nitrosomerkapto')- 4-fenylbutanovllelvsin ( 6).

Trinn 1) I en 100 ml glassflaske tilveiebrakt med magnetisk røring ble 1,25 g

(3,7 mmol) av klorhydratet av 2-amino-3-benzyl-3-merkapto-4-fenylbutansyre, 0,68 g (3,7 mmol) av a-brom-p-xylen og 40 ml av en blanding av H20/EtOH 1:1 blandet. 1,6 ml av trietylamin ble tilsatt og hoveddelen av det suspenderte faststoff ble oppløst. En argonatmosfære ble skapt og blandingen ble rørt i 24 timer ved romtemperatur. Etanolen og deler av trietylaminet ble eliminert ved redusert trykk. Den resulterende vandige suspensjon blir filtrert og et hvitt faststoff ble oppnådd. Det ble renset via reversfasekolonnekromatografi med CH3CN-H20. 10 ml av MeOH/CHl 1:1 blir tilsatt over det oppnådde faststoff og oppløsningsmiddelet ble eliminert ved redusert trykk. 0,5 g av mellomproduktet, klorhydratet av 2-amino-3-benzyl-3-(4-metylbenzylmerkapto)-4-fenylbutansyre ble oppnådd.

'HNMR (200 Mhz, DMSO-d6) 8,95-8,50 (3H, sb, H3N+), 7,45-7,25 (10H, sc, CHar), 7,08 (2H, d, J=10 Hz, CHar), 6,98 (2H, d, J=10 Hz, CHar), 4,05 (1H, s,

CH-N), 3,55- 3,0 (4H, sc, CH2-C6H5, CH2-Car), 2,90-2,60 (2H, sc, CH2), 2,20 (3H, s, CH3).

<13>C -NMR (50 Mhz, DMSO-d6): 168,70 (CO), 136,53 (Car), 136,00 (Car), 134, 94 (Car), 132,50 (Car), 131,18 (CHar), 129,169 (CHar), 128,90 (CHar), 128,26 (CHar), 128-02 (CHar), 127,07 (CHar), 57,06 (CH-N), 53,64(C) 42,22 (CH2), 41,65 (CH2), 31,90 (CH2.S), 20,48(CH3).

Trinn 2) Ved å starte fra de to fraksjoner oppnådd i det forrige trinn (180 mg med 83% renhet og 530 mg med 94% renhet) og å fortsette som beskrevet i trinn 2 i eks. 4, med 733 mg (1,45 mmol) av det beskyttede mellomprodukt N-Boc oppnådd og karakterisert ved:

a) CCF (CHCl3-MeOH-HOAc 85:10:5), Rf=0,63.

b) HPLC gradient fra 10% til 100% MeCN, 30 minutter, isokratisk 100%, fem

minutter, renhet: 91% (220 nm).

c) EM-MALDI-TOF (massespektrum): Matrix av dihydroksidbenzosyre, Mberegn<=>505 (M+H<+>)eksp=528,585 (M+Na).

d) NMR: Nærvær av Boc-gruppen ble konfirmert

Trinn 3) Tripeptidmellomproduktet ble oppnådd ved å bruke fremgangsmåten

beskrevet i trinn 3 i eks. 4, ved å starte fra 0,43 mmol av harpikset nevnt ovenfor. Etter det acidolytiske trinnet ble det isolert et råprodukt som inneholder 14,4 mg (29,96 umol) av tripeptidmellomproduktet som er karakterisert ved:

a) HPLC analytisk gradient fra 5 % til 65 % i 30 minutter, ca. renhet 95 %.

b) EM-elektrospray: Mberegn<=>487 (M+H<+>), Meksp<=>488,3.

Trinn 4) Ved å starte fra 5,7 mg (0,012 mmol) av tripeptidmellomproduktet

oppnådd i det forrige trinn, ble nitrosering utført som beskrevet i trinn 4 i eks. 4, ved å bruke 24 ul av 0,5 M NaN02. Det oppnådde produkt er karakterisert ved:

HPLC (metode A): X 220 nm renhet 68%; X 334 nm renhet 86%.

UV: X 345 nm e (H20) 368 cm<-1> mol"<1> L.

Eks. 7

Tester for in vitro vasodilasion.

Fremgangsmåten benyttet i essayene er hovedsakelig den samme som beskrevet i følgende referanser: • Furchgot, R.F. "Methods in nitric oxide research". Feelisch & Stamler red. John Wiley & Sons, Chichester, England, pp 567-581.

Trongvanichnam, K, et al. Jpn J. Pharmacol. 1996; 71:167-173

• Salas, E., et al. Eur. J. Pharmacol. 1994; 258:47-55

Forbindelsene ble testet ved fem forskjellige konsentrasjoner i et konsentrasjonsområde fra 0,001 til 10 mm, ved å bruke fra 6-9 partielle ringer for hver forbindelse. De oppnådde resultatene er sammenlignet med de fra S-nitrosoglutation (GSNO), som ble brukt som et referanseprodukt.

Resultatene er vist i tabell 1 nedenfor og er tilveiebrakt som CE50 (konsentrasjon, 50 % effektiv), som er konsentrasjonen til hver av de testede forbindelser hvori det blir produsert en vasodilasjon på 50 % av den arterielle ring tidligere kontraktert med 1 uM av Norepinefrin.

Som det kan observeres hadde alle forbindelsene testet en kraftig vasodilaterende aktivitet, lik eller overlegen til den for referanseforbindelsen (GSNO) og forbindelse 2 har en vasodilaterende aktivitet som er stor grad overlegen til den for referanseproduktet.

Eks. 8.

Tester in vitro og inhibisjon av aggregering av blodplater.

Fremgangsmåten brukt i essayene er hovedsakelig den samme som beskrevet i følgende referanser: • Loscalzo J, et al. En: Methods in nitric oxide research (Feelisch M, Stamler JS, red.) John Wiley & Sons, Chichester, England, pp 583-591.

Radomski MW, et al. Br J Pharmacol 1987;92:181-187.

• Salas E, et al. Br J Pharmacol 1994; 112:1071-1076.

Forbindelsene er testet ved fire forskjellige konsentrasjoner, ved å bruke blodplater fra fem til 23 forskjellige givere. De oppnådde resultatene ble sammenlignet med de fra S-nitrosoglutation (GSNO) som er brukt som referanseprodukt.

Resultatene er vist i tabell 2 og er uttrykt som CI50 (konsentrasjon av 50 % inhibisjon), som er konsentrasjonen for hver av de testede forbindelsene hvori blir produsert en inhibisjon på 50 % av aggregeringen oppnådd med en submaksimal kollagenkonsentrasjon (1 ug/ml).

Som det kan observeres i tabell 2 hadde alle de testede forbindelsene en kraftig inhiberende aktivitet på aggregering av blodplater, lik eller overlegen til den for referanseforbindelsen (GSNO), og forbindelsene 1 og 5 hadde en inhiberende aktivitet på blodplateaggregering som var i stor grad overlegen til referanseproduktet.

Eks. 9

Tester in vitro for økning av intrablodplate nivået av GMPc.

Forbindelsene oppnådd i eks. 5 (5) er testet in vitro for å undersøke dens kapasitet til å øke intrablodplate nivåene til GMPc i et preparat av humane vaskede blodplater.

Fremgangsmåten brukt i testen er hovedsakelig den samme som beskrevet i referansene sitert i eks. 8.

Forbindelsene ble testet ved fire forsjellige konsentrasjoner ved å bruke forskjellige blodplater fra fem givere. De oppnådde resultater ble sammenlignet med resultatene fra GSNO (referanseprodukt) og med basal verdi ene. Resultatene er vist i tabell 3, uttrykt som pmol/10<9> blodplater.

Forbindelse 5 øker intrablodplate nivåene av GMP på en lignende måte som GSNO referansen gjør. Det skal nevnes at for verdier tett opp til IC50 induserer forbindelse 5 nivåer av GMPc lavere enn GSNO gjør når den blir brukt ved konsentrasjoner tett opptil sin IC50.

Eks. 10

Test in vitro på blokkering av blodplatea<gg>re<g>eringsinhibisjon.

Fremgangsmåten brukt testen er hovedsakelig den samme som beskrevet i referansene sitert i eks. 8, komplimentert med referansen:

• Moro MA, et al. Pr Nat Akk Sc USA. 1996; 93:1480-5

ODQ er testet in vitro for å blokkere inhibisjon av blodplateaggregeringen oppnådd med de oppnådde produkter i humane vaskede blodplatepreparater.

Forbindelsen oppnådd i eks. 5 (5) ble testet ved tre forskjellige konsentrasjoner i nærvær og fravær av ODQ (1 uM), ved å bruke blodplater fra fem forskjellige givere. De oppnådde resultater ble sammenlignet med de fra GSNO (referanseprodukt) og med verdiene i fravær av ODQ. Resultatene er vist i tabell 4 og 5 og uttrykt som prosentandel av inhibisjon av maksimal aggregering.

Hvor ODQ (1 um) er i stand til å blokkere den inhiberende effekt av GSNO og forbindelse 5, når IC50 dosen til forbindelsen blir brukt. Ved høyere doser enn den for IC50, blir virkningen av inhibisjon av aggregeringen bedre blokkert ved forbindelse 5 sammenlignet med tilfellet med referanseprodukt.

Claims

1. S-nitrosotiolederivater av penicillamin eller glutation, og deres farmasøytisk akseptable salter, karakterisert ved at de tilsvarer følgende generelle formel (I). hvori: A og B er fenylgrupper eller sammen danner resten -CH2-Q-CH2- som består av en ring med seks enheter i hvilke Q representerer et oksygenatom, svovelatom, eller en N-R , i hvilke R er hydrogen eller en alkylgruppe C1-C4; R<1> er en acylrest, som kan være en alifatisk acylgruppe C1-C5 eller en rest av glutaminsyre bundet gjennom dens ikke-aminosyrekarboksyl; R er en hydroksylgruppe eller en glysinrest bundet ved en peptidbinding; med det forbehold at dersom R<1> er en alifatisk acylrest da er R2 en hydroksylgruppe, og hvis R<1> er en rest av glutaminsyre da er R<2> en glysinrest.

2. S-nitrosotiol som angitt i krav 1, karakterisert ved at en tilsvarer følgende generelle formel (II) hvori A og B har benevnelsen nevnt ovenfor og R<4> er en alkylgruppe C1-C4.

3. Forbindelse som angitt i ett av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at den er N-acetyl-2-amino-2-[4-(4-S-nitrosomerkaptotetrahydropyran)] eddiksyre(i).

4. Forbindelse som angitt i ett av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at den er N-acetyl-2-amino-2-[4-(4-S-nitrosomerkapto-l-metylpipperidin)] eddiksyre (2).

5. Forbindelse som angitt i ett av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at den er N-acetyl-2-amino-3-benzyl-3-S-nitrosomerkapto-4-fenyl-butansyre (3).

6. S-nitrosotioler som angitt i krav 1, karakterisert ved at den tilsvarer følgende generell formel (III) hvor A og B har benevnelsene nevnt ovenfor.

7. Forbindelse som angitt i ett av kravene 1 eller 6, karakterisert ved at den er N [N-y-L-glutamyl-2-amino-2-(4-(4-S-nitrosomerkapto) tetrahydropyran)) acetyl]-glysin (4).

8. Forbindelse som angitt i et av kravene 1 eller 6, karakterisert ved at den er N [N-y-L-glutamyl-2-amino-2-(4-(4-S-nitrosomerkapto-l-metylpipperidin)) acetyl]-glysin (5).

9. Forbindelse som angitt i ett av kravene 1 eller 6, karakterisert ved at den er N [N-y-L-glutamyl-2-amino-3-benzyl-3-(S-nitrosomerkapto)-4-fenylbutanoyl]-glysin (6).

10. Anvendelse av S-nitrosotiol som angitt i et av de foregående krav, til fremstilling av et legemiddel for behandling av sirkulatoriske dysfunksjoner.

11. Anvendelse som angitt i krav 10 til fremstilling av et legemiddel for behandling av dysfunksjoner av det kardiovaskulære system.