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WO1999016461A1 - Agents antistress et aliments fonctionnels - Google Patents

Agents antistress et aliments fonctionnels Download PDF

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WO1999016461A1
WO1999016461A1 PCT/JP1998/000480 JP9800480W WO9916461A1 WO 1999016461 A1 WO1999016461 A1 WO 1999016461A1 JP 9800480 W JP9800480 W JP 9800480W WO 9916461 A1 WO9916461 A1 WO 9916461A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
stress
pro
group
peptide
tripeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1998/000480
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Akihiro Masuyama
Toshiaki Takano
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asahi Soft Drinks Co Ltd
Original Assignee
Calpis Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Calpis Co Ltd filed Critical Calpis Co Ltd
Priority to DE69823369T priority Critical patent/DE69823369T2/de
Priority to SI9830662T priority patent/SI1018341T1/xx
Priority to SK436-2000A priority patent/SK285148B6/sk
Priority to DK98901519T priority patent/DK1018341T3/da
Priority to AU57801/98A priority patent/AU728565B2/en
Priority to CA002303810A priority patent/CA2303810C/en
Priority to BR9813222-9A priority patent/BR9813222A/pt
Priority to AT98901519T priority patent/ATE264687T1/de
Priority to US09/508,777 priority patent/US6410685B1/en
Priority to HU0004617A priority patent/HUP0004617A3/hu
Priority to EP98901519A priority patent/EP1018341B1/en
Publication of WO1999016461A1 publication Critical patent/WO1999016461A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to an anti-stress agent and a functional food having an effect of preventing and reducing mental and physical symptoms caused by stress.
  • stress does not only cause an increase in blood pressure, but also affects various factors, such as peptic ulcer, ischemic heart disease, cerebrovascular disorder, and hyperlipidemia. Also It is believed that. Therefore, stress is considered to be one of the causative factors of hypertension, but conversely, it is not considered that simply suppressing the increase in blood pressure can provide an anti-stress effect. .
  • antistress agents that can be used on a daily basis and that do not include safety issues, and that reduce and prevent mental and physical symptoms caused by stress have been sought and are being developed. I have.
  • anti-stress agents containing L-theanine contained in tea leaves Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-104442
  • anserine nokurenin
  • n-methylhistidine ⁇ -methylhistidine, etc.
  • An object of the present invention is to provide an anti-stress that can reduce and prevent stress caused by stress that can be used on a daily basis and that does not include safety issues and that can respond to social demands mentioned above. And functional foods.
  • an anti-stress agent comprising a peptide having angiotensin converting enzyme inhibitory activity and / or a salt thereof as an active ingredient.
  • the above anti-stress agent wherein the tripeptide is line-Pro-Pro and / or Val-Pro-Pro.
  • a food having an anti-stress function including the anti-stress agent.
  • a medium containing a peptide and / or a protein containing the sequence of ie-Pro-Pro and Z or Val-Pro-Pro is added to the obtained culture solution by lie-Pro-Pro and / or Provided is a method for producing a food having an anti-stress function, including a step of fermentation with lactic acid bacteria under conditions in which a Val-Pro-Pro tripeptide is produced.
  • a method for reducing stress by orally administering an effective amount of a peptide having angiotensin converting enzyme inhibitory activity and Z or a salt thereof.
  • the anti-stress agent of the present invention contains a tripeptide having angiotensin converting enzyme inhibitory activity and Z or a salt thereof as an active ingredient.
  • the anti-stress effect refers to the effect of lowering systolic blood pressure and diastolic blood pressure, which are increased by stress, and the reduction of spleen cell reactivity. It is the action of approaching a state without stress, such as the action of suppressing or preventing the reduction of immune function due to stress.
  • peptides examples include lie-Pro-Pro and Val-Pro-Pro having angiotensin converting enzyme inhibitory activity (hereinafter, these tripeptides are abbreviated as IPP and VPP, respectively), and Tripeptides selected from the group consisting of mixtures are preferred.
  • Examples of the salt of the tripeptide include pharmacologically acceptable salts, for example, inorganic salts such as hydrochloride, sulfate, and phosphate, and citrate, maleate, fumarate, and tartrate. And organic acid salts such as lactate.
  • Examples of the method for producing the tripeptide include a fermentation method using a microorganism, an enzymatic hydrolysis method, and a chemical synthesis method.
  • a lactic acid bacterium is cultured in a medium of a food material containing a peptide and / or a protein containing an amino acid sequence corresponding to the tripetide, for example, the sequence ie-Pro-Pro, Val-Pro-Pro, or the like. There is a method to do it.
  • the medium is preferably a food material containing a peptide and / or protein containing an amino acid sequence corresponding to the above-mentioned polypeptide.
  • the food material include milk, milk casein, corn, corn protein, barley, wheat protein, soybean, defatted soybean, and soybean protein.
  • the medium may contain other components such as yeast extract, vitamins, and minerals as needed.
  • Lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus can be used as the lactic acid bacteria.
  • Lac Tobachirusu 'Herube Chikasu (Lactobac il lus helve t icus)
  • lactate Tobachirusu' Deruburukii 'subsp Heath Li Kas (Lactobaci l lus delbrueki i subsp. Bulgar i cus)
  • easy Bokuno Ji Lactic acid bacteria such as Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei subsp. Ca sei, Lactobacillus casei subsp. Can be.
  • Lactobacillus Helveticas ATCC 55796 Lactobacillus del Pulchii Subspecies Bulgaricus ATCC 11842, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Lactobacillus famentum ATCC 14931, Lactobacillus casei Species' Casey ATCC393 and other strains.
  • the culturing can be performed by heating and sterilizing the medium, cooling the medium to a predetermined culturing temperature, and then adding a lactic acid bacterium starter pre-cultured in advance.
  • Inoculum of lactic acid bacteria starter culture 1 g per Lactobacillus Number 1 0 5 - 1 0 7 and preferably.
  • the cultivation can be carried out at a temperature of 20 to 50 ° C, preferably 30 to 45 ° C, and a culturing time of 3 to 48 hours, preferably 6 to 24 hours.
  • the obtained culture solution usually contains 0.1 to 100 gZg of IPP and Z or VPP, depending on the medium material and composition.
  • the culture solution can be used as it is as an anti-stress agent of the present invention while lactic acid bacteria are alive. Further, the culture solution can be used in a sterilized state by heat sterilization at a temperature of 80 ° C. or the like. Further, it can be used in a powdered state by freeze drying, mist drying, drum dryer drying, or the like.
  • the culture solution can be used as the anti-stress agent of the present invention after concentrating and purifying the tripeptide component.
  • Said concentration and purification method and For example, there is a method of collecting the supernatant of the culture solution which has been centrifuged. The supernatant is further concentrated and purified by subjecting it to electrodialysis, ion exchange resin treatment, hollow fiber membrane filtration, reverse osmotic pressure treatment, hydrophobic column chromatography, or a combination thereof.
  • the above-mentioned tripeptide thus obtained can be obtained.
  • a food material containing a peptide and / or a protein containing an amino acid sequence corresponding to the peptide, such as lie-Pro-Pro, Val-Pro-Pro, etc. Is treated with proteinase and further treated with carboxypeptidase.
  • a proteinase derived from a microorganism a proteinase derived from a plant, a proteinase derived from an animal, and the like can be used. These proteinases can be prepared by a known method.
  • a carboxypeptidase derived from a microorganism a carboxypeptidase derived from a plant, a carboxypeptidase derived from an animal, or the like can be used.
  • carboxypeptidases can be prepared by a known method.
  • Examples of the method for producing a tripeptide by the chemical synthesis method include a known organic chemical synthesis method.
  • the amino acid protected with the fluorenylmethoxycarbonyl group is sequentially reacted in accordance with the amino acid sequence according to a conventional method to obtain a triptide-linked resin.
  • the tripeptide can be obtained by separating the resin according to a conventional method and purifying the tripeptide.
  • the content of the above-mentioned polypeptide in the anti-stress agent of the present invention is not limited as long as the content of the above-mentioned effective dose of the above-mentioned polypeptide can be administered. Although it is not particularly limited, it can be usually incorporated in the preparation at a ratio of 0.001-1% by weight.
  • the anti-stress agent of the present invention may contain other additives such as sugars, proteins, lipids, vitamins, minerals, fragrances, and pigments, in addition to the above-mentioned tripeptides and salts thereof.
  • the anti-stress agent of the present invention can be administered to humans or animals.
  • the administration route includes oral and intravenous injections, but oral administration is preferred.
  • the effective dose of the anti-stress agent of the present invention is usually 0. It can be in the range of 1 to 40 mg body weight kg ⁇ day, but higher doses may be used.
  • the anti-stress agent of the present invention When the anti-stress agent of the present invention is administered to a subject, changes in various physiological indices, such as an increase in blood pressure and a decrease in immune function, which occur in response to stress, are less than those in the absence of administration. And these indicators are close to the values when no stress is applied.
  • the functional food of the present invention contains the anti-stress agent, and by eating this functional food, the stress is prevented, reduced, or prevented.
  • the content ratio of the anti-stress agent in the functional food of the present invention is not particularly limited, but the anti-stress agent is contained so that the content of the tripeptide and / or the salt thereof is an amount effective for the anti-stress. Usually, it is sufficient that the anti-stress agent is contained in the functional food so that the content of tripeptide and Z or a salt thereof is 0.001 to 0.1% by weight.
  • the amount of the functional food of the present invention is preferably within the range of 0.1 to 40 mg / kg of body weight / day as the above-mentioned polypeptide, so that the present invention is preferable. Light effects can be obtained, but higher doses may be taken.
  • the functional food of the present invention include yogurt, milky lactic acid bacteria drinks, cheese, processed foods and drinks containing sour milk, health foods, and the like.
  • the form is solid such as powder, granules, and tablets.
  • a fluid such as a paste, a gel, or a liquid.
  • the said tripeptide which is an active ingredient of the anti-stress agent and the functional food of the present invention, is also obtained by fermenting a food material with lactic acid bacteria, and is highly safe.
  • the anti-stress agent and the functional food of the present invention contain the above-mentioned tripeptide, they are highly safe and can reduce and prevent mental and physical symptoms caused by various stresses by ingesting continuously every day. .
  • skim milk powder was dissolved in 50 kg of water, sterilized to 90 ° C, cooled to room temperature, and inoculated with 2 kg of the secondary starter. Cultivation was continued for an hour to obtain 56 kg of fermented milk.
  • IPP was 5.4 mg as a content in the whole amount
  • VPP was contained at a rate of 9.5 mg.
  • Example 1 6 kg of the fermented milk prepared in Example 1 was adjusted to pH 7.3 with a 10 N aqueous sodium hydroxide solution, and then ion-exchanged resin (trade name: Amberlit e XAD-2, manufactured by Organo Corporation) 1 liter was added and distilled water was added to bring the total weight to 20 kg. After stirring with a stirrer for 90 minutes, the resin was separated by filtration with a suction filter, and the resin on the filter was washed with 20 kg of distilled water and then recovered. 0.8 kg of methanol was added to the recovered resin, and the mixture was stirred for 30 minutes with a stirrer. Next, the mixture was filtered using a nylon wool (200 mesh), and suction-filtered with a hard filter paper.
  • ion-exchanged resin trade name: Amberlit e XAD-2, manufactured by Organo Corporation
  • the filtrate was concentrated under reduced pressure at 55 ° C. using an evaporator to obtain 200 g of a purified concentrated solution.
  • 250 ml of an ion exchange resin (trade name: Amberlite IRA-400 (OH type), manufactured by Organo) was added to the purified concentrate, stirred for 10 minutes, and suction-filtered with a hard filter paper.
  • the filtrate was adjusted to pH 7 with a 1N hydrochloric acid solution and then freeze-dried in vacuo.
  • the purified and dried product was uniformly dissolved in 5 ml of distilled water, applied to a column (trade name: Sephadex G-25, manufactured by Pharmacia), eluted with distilled water, and the fraction eluted with the tripeptide was collected.
  • the collected and freeze-dried in vacuo to give 5 mg of purified fractionated powder of tripeptide. 50 mg of this purified fraction powder contained 0.6 mg of IPP and 1.0 mg of VPP.
  • IPP and VPP were synthesized by the following organic chemical synthesis method.
  • the synthesis was performed by the solid phase method using an automatic peptide synthesizer (PS SM-8 type) manufactured by Shimadzu Corporation.
  • PS SM-8 type automatic peptide synthesizer
  • Fmoc fluorenyl methoxycarbonyl group
  • reaction mixture was filtered through a glass filter, and then the purified peptide was precipitated by adding 10 ml of anhydrous ether, and centrifuged at 300 rpm for 5 minutes to separate. The precipitate was washed several times with anhydrous ether, and dried by blowing nitrogen gas.
  • the eluted fraction showing the maximum absorption was collected and freeze-dried to obtain 2.lg and 0.9 mg of the desired synthetic peptides IPP and VPP, respectively.
  • the purified peptide is separated from the N-terminal of the peptide using a fully automatic protein primary structure analyzer (model PPSQ-10, manufactured by Shimadzu Corporation). We prayed and analyzed it with an amino acid analyzer (model 800 series, manufactured by Hamamatsu). As a result, it was confirmed that the design was as designed.
  • rats were treated with (1) stress-unloaded, saline-administered group, (2) stress-loaded, saline-administered group, (3) stress-loaded, VPP, IPP-administered group
  • the animals in groups (2) and (3) were loaded with a cold stress in a low-temperature room (4 ° C) for 4 hours a day for 9 days.
  • Table 1 shows the blood pressure measurement results. As shown in Table 1, the systolic blood pressure and the diastolic blood pressure were higher in the stress-loaded group (2) than in the non-stressed group (1). In group (3) that received VPP and IPP, both systolic blood pressure and diastolic blood pressure were lower than in group (2) that received physiological saline, and blood pressure values did not stress. (1) It was close to the group. Two
  • Table 2 shows the change in blood pressure before and after cold stress. As shown in Table 2, both the systolic blood pressure and the diastolic blood pressure were significantly higher in the stress-loaded group (2) than in the non-stressed group (1). In group (3) receiving VPP and IPP, both systolic blood pressure and diastolic blood pressure were suppressed higher than in group (2) receiving physiological saline, and there was a significant difference in systolic blood pressure. Was. From the above results, it was confirmed that the administration of IPP and VPP was effective in suppressing an increase in blood pressure after stress.
  • Example 5 Male Wistar rats (weight: about 300 g) were preliminarily reared for 24 weeks. During the pre-breeding period and during the experiment period, a solid sample (CE-2, manufactured by Nippon Clear Co., Ltd.) was provided on a restricted diet, and water was freely available. After the completion of preliminary breeding, the rats were divided into three groups: (1) saline administration group, (2) VPP administration group, and (3) IPP administration group (8 animals in each group). (1) group— (3) group Rats were placed in a cold room (4 ° C.) for 4 hours a day, as in Example 4, and loaded with cold stress for 9 days.
  • (1) group was 1 ml of physiological saline
  • (2) and (3) groups were VPP 3 mg / kg body weight synthesized by the method of Example 3, respectively.
  • 1 ml of physiological saline dissolved so as to have an IPP of 3 mg / kg body weight was forcibly administered to the stomach by an oral probe.
  • the rats in groups (1) and (3) were subjected to a cold stress for 4 hours in the same manner as in Example 4, and the blood pressure was measured. Table 3 shows the results.
  • Table 3 shows the blood pressure measurement results. As shown in Table 3, the systolic blood pressure and the diastolic blood pressure were significantly lower in the groups (2) and (3) receiving the tripeptide than in the group (1) receiving the physiological saline. On the other hand, it was confirmed that the administration of the tripeptide has an effect of suppressing an increase in blood pressure after stress.
  • group (1) received 2 ml of physiological saline
  • groups (2) and (3) received 5 m1 of the fermented milk obtained in Example 1, Z kg body weight or A test was performed in the same manner as in Example 5 except that the obtained purified purified fraction powder of 150 mg / kg was dissolved in physiological saline to make 2 ml, and the sample was administered. Blood pressure was measured after restressing.
  • Table 4 shows the blood pressure measurement results. Fermented milk was administered as shown in Table 4. Comparison between group (2) and group (3) to which purified peptide powder was administered and group (1) to which physiological saline was administered showed that both systolic blood pressure and diastolic blood pressure were group (1) The results are lower in the groups (2) and (3), and the administration of the fermented milk and purified fractions of the peptides is effective in suppressing the increase in blood pressure after stress. Admitted.
  • rats were treated with (1) stress-unloaded mono-saline group, (2) stress-loaded mono-saline group, (3) stress-loaded VPP, IPP group
  • the animals in groups (2) and (3) were placed in a wire mesh restrained cage so that their heads came out of the water so that they could breathe. Water immersion restraint stress was applied for 6 hours a day for 5 consecutive days by immersion in a 25 ° C water bath. During the stress load period, the animals were allowed to freely ingest solid feed (C-2, trade name, manufactured by Nippon Clear) and water.
  • C-2 freely ingest solid feed
  • Each rat received a sample for 5 consecutive days from the stress loading start date to the stress loading end date.
  • 1 ml of physiological saline was used for groups (1) and (2), and IPP and VPP synthesized by the method of Example 3 were used for group (3).
  • Urine was collected in metabolic cages from day 2 to day 3 of stress loading, and urinary catecholamine and indoleamine were analyzed using HPLC.
  • the column used was a silica reverse layer column (trade name “Catechol Pack”) manufactured by JASCO Corporation, and the electrochemical detector used was an electrochemical detector (trade name “Kurochem”) manufactured by esa.
  • mice After the stress was completed on the last day of stress loading, the mice were sacrificed by decapitation, blood was collected, and the thymus and spleen were extracted.
  • amino acid composition was measured using an amino acid analyzer (Model 800 series, manufactured by JASCO Corporation), and the Fischer ratio (molar ratio of branched chain amino acid Z aromatic amino acid) was calculated.
  • Thymus and liver were weighed, spleen was prepared for spleen cells by the following method, and the spleen cells were measured for interleukin 2 producing ability and mitogen reactivity.
  • the excised spleen is finely crushed with a homogenizer, and subjected to hypotonic treatment to remove red blood cells, washed with MEM containing 2% fetal calf serum (FCS), and then RPM1664 medium containing 10% FCS. cell numbers were suspended so that the 1 X 1 0 7, to create a free floating cells solution.
  • FCS fetal calf serum
  • the spleen cells were prepared 2. 5 X 1 0 6 carbon atoms, the R PM 1 6 4 0 medium was prepared containing Konkanapari down A (C on A) 5 wg / 1, and 1 0% FCS, and incubated for 24 hours Then, the amount of interleukin 2 in the supernatant was measured. Interleukin 2 content was measured by bioassay using proliferation of interleukin 2 reactive cell lines as an index. (Mitogen reactivity)
  • Table 6 shows the Fischer ratio of serum amino acid after sacrifice. As shown in Table 6, the Fischer ratio was significantly lower in the stress-loaded group (2) than in the non-stressed group (1). In addition, the Fischer ratio in group (3) was significantly higher than that in group (2) that received physiological saline. Table 6
  • Table 7 shows the weight of thymus and spleen after sacrifice. The weight of both the thymus and spleen was significantly lower in the stress-loaded group (2) than in the non-stressed group (1). In the group (3) to which the tripeptide was administered, the thymus weight and spleen weight tended to be slightly higher than those in the group to which the physiological saline was administered (2). Table 7
  • Table 8 shows mitogen reactivity of spleen cells
  • Table 9 shows interleukin 2 producing ability of spleen cells.
  • the mitodin response and the interleukin-2 producing ability tended to decrease in the stress-loaded group (2) compared to the non-stressed group (1).
  • the mitogen response and interleukin-producing ability tended to increase compared to the group receiving the physiological saline (2).
  • IPP and VPP administration caused changes in blood amino acid balance (Fischer ratio) due to stress, thymus It was found to have an inhibitory effect on immune function indicators such as atrophy of the spleen and atrophy of the spleen and decreased reactivity of spleen cells.

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Description

明 細 書
抗 ス ト レ ス 剤 及 び機 能 性食 品
技術分野
本発明は、 ス ト レスにより生じる精神的 · 身体的症状を予防及び軽 減する効果を有する抗ス トレス剤及び機能性食品に関する。
背景技術
現代社会は、 科学技術が高度化 · 複雑化し、 社会情勢も激動する環 境下になつており、 人々は様々なス ト レスにさらされている。 特に、 国際化された社会においては、 複雑な人間関係が形成されており、 精 神的ス ト レスが起因する様々な症状について報告がなされている。 精神的ス トレスは、 循環系、 免疫系等に大きな影響を及ぼすとされ ている。 しかし、 ス ト レスの科学的概念及び定義は未だ明確でない点 もあり、 更に方法論的困難性も相俟って、 ス ト レスの評価に関しては 多くの問題が残されているが、 近年、 医学的見地からの検討がなされ ている。
例えば、 ス ト レスを受けるとアンジォテンシン Π等が増加し、 ナト リ ゥム再吸収による体内ナト リ ゥムが過剰となり、 血圧の上昇を引き 起こすことが報告されている （茂原治ら ： 代謝， ^^， 2， 3 2 3 , 1 9 9 1 ) 。 このような知見を基に、 高血圧治療薬として使用されて いるアンジォテンシン変換酵素阻害剤であるェナラブリル及びァラセ プリ ルのス ト レスによる高血圧に対する効果が研究されている（The A raeri can Journal of Cardiology； 68， 15， 1362 ( 1991)， Internal Me di c ine ; 32, 9， 691 ( 1993) )。 しかし、 ス ト レスの負荷は血圧の上昇 を引き起こすのみではなく、 様々な因子に影響を与え、 高血圧の他に 消化性潰瘍、 虚血性心疾患、 脳血管障害、 高脂血症等の要因と もなる と考えられている。 従って、 ス ト レスは高血圧の原因因子の一つであ るとは考えられているが、 逆に単に血圧の上昇を抑制させることによ つて抗ス トレス効果が得られるとは考えられていない。
現在ス ト レスによ り生じる精神的 ♦ 身体的症状の軽減及び予防剤と しては、 精神安定剤、 抗不安剤及び睡眠薬等の化学合成薬剤が使用さ れている。 しかし、 これらの薬剤は、 習慣性や副作用の問題があり、 ス ト レスにより生じる精神的、 身体的症状予防の目的で日常的に使用 するのは好ましくない。 そこで、 日常的に連用可能で、 安全性の問題 を含まない、 ス ト レスにより生じる精神的 · 身体的症状の軽減及び予 防効果を示す抗ス ト レス剤が求められ、 開発が進められている。 例え ば、 茶葉に含まれる L —テアニンを含む抗ス ト レス剤 （特開平 6— 1 0 0 4 4 2号公報） 、 アンセリ ン、 ノくレニン、 n—メチルヒ スチジン、 τ —メチルヒスチジン等のィ ミダゾール化合物を含む抗ス トレス組成 物 （特開平 9— 2 0 6 6 0号公報） 、 及ぴグルタチオンと抗酸化物質 との組成物を含むス ト レス改善食品 （特開平 8— 2 7 5 7 5 2号公報） 等が提案されている。 また、 香りによるス ト レス解消効果についての 報告（FRAGRANCE JOURNAL : 1991 - 1 1， p44- 49)もなされている。 しかし、 ト リぺプチドを用いることによる、 ス ト レスにより生じる精神的 · 身 体的症状軽減及び予防効果を有するという報告は、 これまで認められ ていない。
発明の開示
本発明の目的は、 前述の社会的要請に対応し得る日常的に連用可能 で、 安全性の問題を含まない、 ス ト レスにより生じる精神的 ♦ 身体的 症状を軽減及び予防できる抗ス ト レス剤及び機能性食品を提供するこ とにある。 本発明によれば、 アンジォテンシン変換酵素阻害活性を有する トリ ぺプチド及ぴ 又はその塩を有効成分として含有する抗ス トレス剤が 提供される。
また本発明によれば、 前記トリペプチドが、 l i e- Pro- Pro及び/又 は Val - Pro- Proであることを特徴とする前記抗ス トレス剤が提供され る。
更に本発明によれば、 前記ト リペプチド及び 又はその塩の抗ス ト レス剤製造のための使用が提供される。
また本発明によれば、 前記抗ス トレス剤を含む抗ス トレス機能を有 する食品が提供される。
更に本発明によれば、 前記ト リぺプチド及び/又はその塩の抗ス ト レス機能を有する食品製造のための使用が提供される。
更に本発明によれば、 l ie- Pro- Pro及び Z又は Val- Pro-Proの配列を 含むぺプチド及び 又は蛋白質を含有する培地を、 得られる培養液中 に l i e- Pro- Pro及び 又は Val- Pro- Proの ト リペプチドが生産される条 件で乳酸菌によって発酵する工程を含む抗ス トレス機能を有する食品 の製造法が提供される。
また本発明によれば、 アンジォテンシン変換酵素阻害活性を有する ト リぺプチド及び Z又はその塩を有効量経口投与するス ト レスの低下 方法が提供される。
発明の好ましい荬 ifeの餱搽
本発明の抗ス トレス剤は、 アンジォテンシン変換酵素阻害活性を有 する トリペプチド及び Z又はその塩を有効成分として含有する。 本発 明において抗ス トレス作用とは、 ス ト レスにより上昇する収縮期血圧 及び拡張期血圧を低下させる作用、 並びに脾臓細胞反応性の低下等の ス ト レスによる免疫機能の低下を抑制又は防止する作用等のス ト レス を受けていない状態に近づける作用をいう。
前記ト リぺプチドと しては、 アンジォテンシン変換酵素阻害活性を 有する l i e- Pro- Pro、 Val- Pro- Pro (以下これらの ト リペプチドをそれ ぞれ I P P、 V P Pと略す） 及びこれらの混合物からなる群より選択 される ト リペプチドが好ましく挙げられる。
前記ト リペプチドの塩と しては、 薬理学上許容される塩類、 例えば 塩酸塩、 硫酸塩、 リ ン酸塩等の無機酸塩、 及びクェン酸塩、 マレイン 酸塩、 フマル酸塩、 酒石酸塩、 乳酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。 前記ト リペプチドの製造法と しては、 微生物による発酵法、 酵素加 水分解法又は化学的合成法等が挙げられる。
前記微生物による発酵法は、 前記ト リべプチドに対応するアミノ酸 配列、 例えば配列 l ie- Pro-Pro、 Val- Pro-Pro等を含むペプチド及び 又は蛋白質を含む食品素材の培地中で乳酸菌を培養する方法が挙げら れる。
前記培地と しては、 前記ト リぺプチドに対応するァミノ酸配列を含 むべプチド及び/又は蛋白質を含む食品素材等が好ましい。 前記食品 素材と しては、 乳、 乳カゼイン、 と う もろこし、 コーンタンパク、 小 麦、 小麦タンパク、 大豆、 脱脂大豆、 大豆蛋白等が挙げられる。 更に、 培地には必要に応じて酵母エキス、 ビタミン類、 ミネラル類等の他の 成分を含有させることができる。
前記乳酸菌と しては、 ラク トバチルス属の乳酸菌を用いることがで きる。 例えば、 ラク トバチルス ' ヘルべチカス（Lactobac i l lus helve t icus)、 ラク トバチルス ' デルブルキイ ' サブスピーシーズ · ブルガ リ カス (Lactobaci l lus delbrueki i subsp . bulgar i cus) Λ ラク 卜ノ チ ルス · ァシ ドフィ ラス（Lactobacillus acidophilus) , ラタ 卜パチル ス · ファーメ ンタム (Lactobacillus fermentum)、 ラク 卜ノ チノレス · カゼィ ， サフスピーシース ， 刀ゼィ (Lactobacillus casei subsp. ca sei)等の乳酸菌を挙げることができる。 具体的には、 ラク トバチルス ' ヘルべチカス ATCC55796、 ラク トバチルス · デルプルキイ · サブスピ 一シーズ · ブルガリ カス ATCC11842、 ラク トバチルス · ァシ ドフイ ラ ス ATCC4356、 ラク トバチルス · フアーメ ンタム ATCC14931、 ラク ト バチルス · カゼィ ' サブスピーシーズ ' カゼィ ATCC393等の菌株が挙 げられる。
前記培養は、 前記培地を加熱殺菌し所定の培養温度まで冷却後に、 予め前培養しておいた乳酸菌スターターを添加することにより行うこ とができる。 乳酸菌スターターの接種量は、 培地 1 g当り乳酸菌数 1 05 - 1 07個とするのが好ましい。 培養温度は 20— 50°C、 好まし くは 3 0— 4 5 °C、 培養時間は 3— 4 8時間、 好ましくは 6— 24時 間の範囲で行うことができる。 乳酸菌数が 1 08個 Zg以上及び乳酸 酸度が 1以上となった時点で、 培養を終了することができる。 得られ た培養液中には、 培地原料及び組成によるが、 通常、 I P P及び Z又 は V P Pが 0. 1— l O O gZ g含まれる。
前記培養液は、 そのまま、 乳酸菌が生きている状態で本発明の抗ス ト レス剤として使用できる。 また、 前記培養液を 80°C達温等の条件 にて加熱殺菌することにより、 殺菌した状態で用いること もできる。 更に、 凍結乾燥、 嘖霧乾燥、 ドラム ドライヤー乾燥等により粉末化し た状態でも使用できる。
前記培養液は、 ト リべプチド成分を濃縮し精製してから本発明の抗 ス ト レス剤と して使用することができる。 前記濃縮及び精製の方法と しては、 遠心された前記培養液の上清を取る方法が挙げられる。 また 取られた上清を、 さらに電気透析、 イオン交換樹脂処理、 中空糸膜透 析、 逆浸透圧処理、 疎水性カラムクロマ トグラフィー等、 又はこれら を組み合わせた処理に供することにより、 さらに濃縮し精製された前 記ト リペプチドを得ることができる。
前記酵素加水分解法により トリペプチドを製造するには、 l i e- Pro- Pro , Val - Pro- Pro等の前記ト リぺプチドに対応するァミノ酸配列を含 むぺプチド及び 又は蛋白質を含む食品素材を、 プロティナ一ゼで処 理し、 更にカルボキシぺプチダーゼで処理する方法が挙げられる。 前 記プロティナーゼと しては、 微生物由来のプロティナーゼ、 植物由来 のプロティナーゼ、 動物由来のプロティナーゼ等が使用できる。 これ らのプロティナーゼは、 公知の方法で調製することができる。 前記力 ルポキシぺプチダーゼと しては、 微生物由来のカルボキシぺプチダー ゼ、 植物由来のカルボキシぺプチダーゼ、 動物由来のカルボキシぺプ チダーゼ等が使用できる。 これらのカルボキシぺプチダーゼは、 公知 の方法で調製することができる。
前記化学的合成法により ト リペプチドを製造する方法と しては、 公 知の有機化学合成法が挙げられる。 例えば、 ト リペプチドを構成する アミノ酸のアミノ基をフルォレニルメ トキシカルボニル基で保護した 後に、 順次アミノ酸配列に従ってフルォレニルメ トキシカルボニル基 で保護したァミノ酸を常法に従い反応させて トリぺプチド結合樹脂を 得、 さらに常法に従い樹脂を切り離して ト リべプチドを精製すること により、 前記ト リペプチドを得ることができる。
本発明の抗ス トレス剤中の前記ト リぺプチドの含有割合は、 後述す る有効投与量の ト リぺプチドを投与しうる含有割合である限りにおい て特に限定されないが、 剤中には、 通常 0 . 0 0 1 〜 1重量％の割合 で配合することができる。
本発明の抗ス ト レス剤は、 前記ト リペプチドやその塩の他に、 糖類、 蛋白質、 脂質、 ビタミン、 ミネラル、 香料、 色素等の他の添加剤を含 んでいても良い。
本発明の抗ス ト レス剤は、 ヒ ト又は動物に投与することができる。 投与経路は、 経口、 静注等を挙げることができるが、 経口投与が好ま しい。
本発明の抗ス トレス剤の有効投与量は、 ヒ トにおいてス トレス軽減、 予防等の本発明の効果を得るためには、 前記ト リペプチドと して、 例 えば経口投与の場合は通常 0 . 1 — 4 0 m g 体重 k g · 日の範囲と することができるが、 これを超える量を投与してもよい。
本発明の抗ス トレス剤を被検者に投与した場合、 ス ト レスの負荷に 応答して発生する血圧上昇、 免疫機能の低下等の様々な生理的な指標 の変化が、 非投与時に比べて小さくなり、 これらの指標がス ト レスが 負荷されない場合の値に近いものとなる。
本発明の機能性食品は、 前記抗ス ト レス剤を含み、 この機能性食品 を食することにより前記ス ト レスが予防、 軽減、 防止される。
本発明の機能性食品中の前記抗ス トレス剤の含有割合は、 特に限定 されないが、 ト リペプチド及び/又はその塩の含有量が、 前述の抗ス トレスに有効な量となるように含有させれば良く、 通常機能性食品中 に トリペプチド及び Z又はその塩の含有量が 0 . 0 0 1 〜 0 . 1重量 %となるように抗ス トレス剤が含有されておれば良い。
本発明の機能性食品の摂取量は、 通常前記ト リぺプチドと して 0 . 1 - 4 0 m g /体重 k g · 日の範囲とすることにより、 好ましい本発 明の効果を得ることができるが、 これを超える量を摂取してもよい。 本発明の機能性食品としては、 ヨーグルト、 乳性乳酸菌飲料、 チー ズ、 酸乳配合の加工飲食品、 健康食品等が挙げられ、 形態と しては、 粉末状、 顆粒状、 錠剤等の固体 ； ペース ト状、 ゲル状、 液状等の流体 等が挙げられる。
本発明の抗ス トレス剤及び機能性食品の有効成分である前記ト リべ プチドは、 食品素材を乳酸菌により発酵させることによっても得られ るものであり、 安全性の高いものである。
本発明の抗ス トレス剤及び機能性食品は、 前記ト リペプチドを含む ので、 安全性が高く、 毎日連続摂取することにより各種のス ト レスに より生じる精神的 · 身体的症状を軽減及び予防できる。
実施例
以下実施例により さらに詳細に説明するが、 本発明はこれらに限定 されるものではない。
実施例 1
脱脂粉乳 9 gを水 1 0 0 gに溶解し、 1 1 5 °C、 2 0分間殺菌した 後、 室温まで冷却してラク トバチルス · ヘルべティ力ス ATCC- 8205を 1 白金耳接種し、 3 7 °Cで 2 4時間培養を行って、 1次スターター (乳酸菌数 5 X 1 08個 1 、 p H 3 . 5 ) を調製した。 次いで、 9 0°C達温殺菌した脱脂乳 （固形分 9重量％) 2 k gに、 1次スター ター 8 0 gを接種した後に、 3 7°C、 2 4時間培養を行い、 これを 2 次スターターと した。 次に、 脱脂粉乳 4. 5 k gを水 5 0 k gに溶解 し、 9 0 °C達温殺菌した後室温まで冷却して、 前記 2次スターターを 2 k g接種し、 3 7°Cで 2 4時間培養を行い、 発酵乳 5 6 k gを得た。 得られた発酵乳中には、 全量中の含有量と して I P Pが 5. 4 m g、 V P Pが 9. 5 m gの割合で含有されていた。
実施例 2
実施例 1で調製した発酵乳 6 k gを 1 0 N水酸化ナト リ ゥム水溶液 を用いて p H 7. 3に調整した後、 イオン交換榭脂 （商品名 Amberlit e XAD- 2、 オルガノ社製） 1 リ ツ トルを加え、 更に蒸留水を加えて全 量を 2 0 k g と した。 撹拌器にて 9 0分間撹拌後、 吸引濾過器により 樹脂を濾別し、 濾過器フィルター上の樹脂を蒸留水 2 O k gにて洗浄 した後に樹脂を回収した。 この回収樹脂にメタノール 0. 8 k gを加 えて撹拌器にて 3 0分間撹拌した。 次にナイ口ンウール （ 2 00メ ッ シュ） を用いて濾過し、 さらに硬質濾紙で吸引濾過後、 濾液をエバポ レーターにて 5 5°C、 減圧濃縮し精製濃縮液 20 0 gを得た。 この精 製濃縮液にイオン交換樹脂 （商品名 Amberlite IRA- 400 (OH型）、 オル ガノ社製） 2 5 0 m l を加え、 1 0分間撹拌した後に、 硬質濾紙にて 吸引濾過して得られた濾液を 1 N塩酸溶液にて p H 7に調整後、 真空 凍結乾燥した。 得られた精製乾燥物を 5 m 1 の蒸留水にて均一に溶解 し、 カラム （商品名 Sephadex G- 25、 フアルマシア社製） に供し、 蒸 留水にて溶出し、 ト リペプチド溶出画分を回収し、 真空凍結乾燥して ト リべプチド精製画分粉末 5 Om gを得た。 この精製画分粉末 5 0 m g中には、 I P Pが 0. 6 m g、 V P Pが 1. Om g含有されていた。
実施例 3
I P P、 V P Pを以下に示す有機化学合成法により合成した。 合成 は島津製作所製のペプチド自動合成装置 （P S SM— 8型） を用いた 固相法によって行った。 固相担体と してべンジルォキシベンジルアル コールタイプのポリスチレン樹脂であって、 ァミノ基をフルォレニル メ トキシカルボニル基 （以下 Fmocと略す） で保護されたプロ リ ンが結 合した樹脂 2 0 /z m o l を使用した。 前記アミノ酸配列に従って、 ァ ミノ基が Fmoc基で保護された Fmoc- Ile、 Fmoc- Pro及び Fmoc- Valを 1 0 0 m o 1 づっ、 常法に従い、 ペプチド配列通り順次反応させてぺプ チド結合樹脂を得た。 次にこのぺプチド結合樹脂を 1 m 1 の反応液
( 1重量％エタンジチオール、 5重量％ァニソール、 9 4重量％ トリ フルォロ酢酸） に懸濁し、 室温で 2時間反応させてペプチドを樹脂か ら切離し、 同時に側鎖保護基を外した。 次に反応混合液をガラスフィ ルターで濾過した後、 無水エーテル 1 0 m l を加えて精製したぺプチ ドを沈殿させて、 3 0 0 0回転、 5分間遠心して分離した。 その沈殿 を無水エーテルにて数回洗浄した後、 窒素ガスを吹き付けて乾燥した。 このよ うにして得られた未精製の合成ペプチド全量を、 0. 1 N塩酸 水溶液 2 m 1 に溶解した後に、 全量を、 以下の条件に従い C18の逆層 カラムを用いた H P L Cで、 以下の条件に従って精製した。
ポンプ ： 形式し 6 2 0 0インテリジェントポンプ （ 立製作所） 検出機 ： 形式 L 4 0 0 0 UV検出器 （日立製作所） にて 2 1 5 n mの 紫外部吸収を検出
カラム ： マイクロボンダスフエアー 5 じ18 (ウォーターズ社製） 溶出液 ： A液 ； 0. 1重量％T F A水溶液、 B液 ； 0. 1重量％T F A入り ァセ トニ ト リル
(B/A+ B) X 1 0 0 (%) : 0→4 0 % ( 6 0分）
¾¾¾ ： 1 m 1 分
最大吸収を示した溶出画分を分取し、 これを凍結乾燥することによ り 目的とする合成ペプチド I P P及び V P Pをそれぞれ 2. l g、 0. 9 m g得た。 精製ペプチドを全自動タンパク質一次構造分析装置 （形 式 P P S Q— 1 0、 島津製作所製） により、 ペプチドの N末端から分 祈し、 さらにアミノ酸分析装置 （形式 8 0 0 シリーズ、 本分光社製） にて分析した結果、 設計通りであることが確認できた。
実施例 4
雄ウィスター系ラッ ト （体重 3 0 0 g程度） 2 4匹を、 1週間予備 飼育した。 予備飼育期間中及び実験期間中は、 固形飼料 （商品名 C E — 2、 日本ク レア製） を制限食と して与え、 水は自由摂取とした。
予備飼育終了後、 ラッ トを（1)ス ト レス無負荷一生理食塩水投与群、 (2)ス ト レス負荷—生理食塩水投与群、 （3)ス ト レス負荷— V P P、 I P P投与群の 3群に分け （各群 8匹） 、 （2)群及び（3)群の動物に、 低 温室 （ 4 °C ) に 1 日にっき 4時間入れる寒冷ス ト レスを 9 日間負荷し た。
1 0 日 目に、 試料と して、 （1)及び（2)群のラッ トには生理食塩水 1 m 1 を、 （3)群には実施例 3の方法により合成した I P P及び V P P を各 3 m g / k g体重の濃度になるよ うに溶解した生理食塩水 1 m 1 を、 経口ゾンデにて胃内に強制投与した。 投与後、 （2)群及び（3)群の ラッ トに 4時間の寒冷ス ト レスを負荷し、 ス ト レス負荷終了の 2時間 後に、 無加温、 非観血値的ラッ ト血圧計 （形式 ： P E— 3 0 0型、 シ 一エスアイ社製） を用いて tai l- cuff法にて、 各群のラッ トの血圧を 測定した。 結果を表 1に示す。
血圧の測定結果を表 1に示す。 表 1に示すよ うに、 ス ト レスを負荷 した（2)群では、 ス ト レスを負荷していない（1 )群に比べ、 収縮期血圧、 拡張期血圧共に高くなっていた。 V P P及び I P Pを投与した（3)群 では、 生理食塩水を投与した（2)群に比べ、 収縮期血圧、 拡張期血圧 共に低くなつており 、 血圧の値がス ト レスを負荷していない（1)群に 近くなっていた。 2
表 1
Figure imgf000014_0001
* (1)群に对し、 5 %の危険率で有意差あり 寒冷ス トレス負荷前後の血圧の変動を表 2に示す。 表 2に示すよ う に、 ス ト レスを負荷した（2)群では、 ス ト レスを負荷していない（1 )群 に比べ、 収縮期血圧、 拡張期血圧共に有意に上昇していた。 V P P及 び I P Pを投与した（3)群では、 生理食塩水を投与した（2)群に比べ、 収縮期血圧、 拡張期血圧共に上昇が抑制されており、 収縮期血圧では 有意差が認められた。 以上の結果から、 I P P及び V P Pを投与する ことにより、 ス ト レス負荷後における血圧上昇を抑制する効果が得ら れることが確認された。
表 2
Figure imgf000014_0002
*ひ)群に対し、 5 %の危険率で有意差あり
# (2)群に対し、 5 %の危険率で有意差あり 実施例 5 雄ウィスター系ラッ ト （体重 3 0 0 g程度） 2 4匹を 1週間予備飼 育した。 予備飼育期間中及び実験期間中においては、 固形試料 （C E — 2、 日本ク レア製） を制限食にて与え、 水は自由摂取と した。 予備飼育終了後、 ラッ トを（1)生理食塩水投与群、 （2) V P P投与群 及び（3) I P P投与群の 3群に分けた （各群 8匹） 。 （1 )群—（3)群の ラッ トを、 実施例 4 と同様に低温室 （ 4 °C ) に 1 日にっき 4時間入れ、 9 日間寒冷ス トレスを負荷した。
1 0 日 目に、 試料として、 （1)群は生理食塩水 1 m 1 を、 並びに（2) 群及ぴ（3)群にはそれぞれ実施例 3の方法により合成した V P P 3 m g / k g体重又は I P P 3 m g / k g体重となるよ う溶解した生理 食塩水 l m l を、 経口ゾンデにて胃内に強制投与した。 投与後、 （1 ) 群一（3)群のラッ トについて、 実施例 4 と同様に 4時間の寒冷ス トレ スを負荷し血圧を測定した。 結果を表 3に示す。
血圧の測定結果を表 3に示す。 表 3に示すように、 ト リペプチドを 投与した（2)及び（3)群では、 生理食塩水を投与した（1)群に比べ、 収 縮期血圧、 拡張期血圧共に有意に低くなつており、 ト リペプチドを投 与することによりス ト レス負荷後における血圧上昇を抑制する効果が 得られることが認められた。
表 3
Figure imgf000015_0001
* ( 1)群に対し、 5 %の危険率で有意差あり 実施例 6
試料と して、 （1)群は生理食塩水 2 m 1 を、 並びに（2)群及び（3)群 にはそれぞれ実施例 1で得た発酵乳 5 m 1 Z k g体重又は実施例 2で 得た ト リぺプチド精製画分粉末 1 5 0 m g / k gを生理食塩水に溶解 し 2 m 1 としたものを用いた他は実施例 5 と同様に試験を行い、 試料 投与、 ス ト レス負荷後に血圧を測定した。
血圧の測定結果を表 4に示す。 表 4に示す通り、 発酵乳を投与した (2)群及びトリぺプチド精製画分粉末を投与した（3)群と、 生理食塩水 を投与した（1)群とを比べると、 収縮期血圧、 拡張期血圧と もに（1)群 より（2)群及び（3)群の方が低くなっており、 発酵乳及びト リぺプチド 精製画分を投与することにより、 ス トレス負荷後における血圧上昇を 抑制する効果が得られることが認められた。
表 4
Figure imgf000016_0001
* (1)群に対し、 5 %の危険率で有意差あり 実施例 7
雄ウィスター系ラッ ト （体重 3 0 0 g程度） 2 4匹を 1週間予備飼 育した。 予備飼育期間中は、 固形飼料 （商品名 C E— 2、 B本ク レア 製） を制限食と して与え、 水は自由摂取と した。
予備飼育終了後、 ラッ トを（1)ス ト レス無負荷一生理食塩水投与群、 (2)ス ト レス負荷一生理食塩水投与群、 （3)ス ト レス負荷一 V P P、 I P P投与群の 3群に分け （各群 8匹） 、 （2)群及び（3)群の動物に、 金 網拘束ケージに入れ呼吸ができるように頭部が水面から出るようにし て頭部より下を 2 5 °Cの水槽に浸すことにより、 水浸拘束ス ト レスを 1 日について 6時間、 5 日間連続して負荷した。 ス ト レス負荷期間中 は、 固形飼料 （商品名 C E— 2、 日本ク レア製） 及び水を自由摂取さ せた。
各ラッ トには、 ス トレス負荷開始日より負荷終了日まで 5 日間連続 して試料を投与した。 試料と しては、 （1)及び（2)群には生理食塩水 1 m 1 を、 （3)群には実施例 3の方法により合成した I P P及び V P P を各 3 m g Zk g体重の濃度になるよ うに溶解した生理食塩水 1 m 1 を、 経口ゾンデにて胃内に強制投与した。
ス ト レス負荷 2 日 目から 3 日 目にかけて代謝ケージにて尿を採取し、 尿中のカテコールアミ ン、 イン ドールアミ ンを H P L Cを用いて分析 した。 カラムは日本分光社製シリカ逆層カラム （商品名 「カテコール パック」 ） を、 検出装置は e s a社製電気化学検出器 （商品名 「クー ロケム」 ） を使用した。
ス ト レス負荷最終日のス ト レス負荷終了後、 断頭によりマウスを屠 殺し血液を採取し、 胸腺及び脾臓を摘出した。 血清については、 アミ ノ酸分析装置 （形式 8 0 0シリーズ、 日本分光社製） にてアミノ酸組 成を測定し、 Fischer比 （分枝鎖アミノ酸 Z芳香族アミノ酸のモル比） を算出した。 胸腺及び肝臓は重量を測定し、 脾臓については以下の方 法により脾臓細胞を調製し、 脾臓細胞のィンターロイキン 2産生能及 びマイ トジェン反応性を測定した。
(脾臓細胞の調製）
摘出した脾臓をホモジェナイザーで細かく破砕し、 低張処理するこ とによって赤血球を除去し、 2 %牛胎児血清 （F C S) 含有 MEMで 洗浄後、 1 0 % F C S含有 R PM 1 6 4 0培地に細胞数が 1 X 1 07 となるように浮遊させ、 遊離浮遊細胞液を作成した。
(ィンターロイキン 2産生能の測定）
調製した前記脾臓細胞 2. 5 X 1 06個、 コンカナパリ ン A (C o n A) 5 w g / 1 , 及び 1 0 %F C Sを含む R PM 1 6 4 0培地を 調製し、 2 4時間培養し、 その上清中のインターロイキン 2量を測定 した。 インターロイキン 2量はィンターロイキン 2反応性細胞株の増 殖を指標と したバイオアッセィにより測定した。 (マイ トジェン反応性）
C o n A又はポークウイートマイ トジェン （ P WM) をマイ トジェ ンと し、 これらのいずれか一方の 5 /z g /m 1 , 調製した前記脾臓細 胞 5 X 1 06個、 及び 1 0 % F C Sを含む R PM 1 6 4 0培地を調製 し、 2 4時間培養し、 2 4時間後の細胞数を MT T (3- (4，5-dimethy lthiazoii_2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)の取り込みを指 標と した吸光度により測定し、 マイ トジヱンを含まない時の細胞数に 対する比率で表した。 表 5 にス ト レス負荷 2 日 目から 3 日 目の尿中ノルァ ドレナリ ン、 ド ーパミ ンの排泄量を示す。 表 5に示すように、 ス ト レスを負荷した（2) 群ではス ト レスを負荷していない（1)群に比べ、 尿中ノルア ドレナリ ン、 ドーパミ ンの排泄量が有意に低下していた。 トリペプチドを投与 した（3)群では、 生理食塩水を投与した（2)群に比べ、 尿中ノルア ドレ ナリ ン、 ドーパミ ン排泄量共に低下が抑えられる傾向にあった。 従つ て、 I P P、 V P Pはス ト レス負荷した後の尿中ノルア ドレナリ ン、 ドーパミン排泄量の低下を抑制する効果を有することが認められた。
表 5
Figure imgf000018_0001
*(1)群に対し、 5%の危険率で有意差あり
# (2)群に対し、 10 %の危険率で有意差あり 表 6に屠殺後の血清ァミノ酸の Fischer比を示す。 表 6に示すよう に、 ス ト レスを負荷した（2)群ではス ト レスを負荷していない（1)群に 比べ、 Fischer比が有意に低くなつていたが、 トリペプチドを投与し た（3)群では、 生理食塩水を投与した（2)群に比 · Fischer比が有意 に高く なっていた。 表 6
Figure imgf000019_0001
* (1)群に対し、 5 %の危険率で有意差あり
# (2)群に対し、 5 %の危険率で有意差あり 表 7に屠殺後の胸腺及び脾臓の重量を示した。 ス ト レスを負荷した (2)群ではス ト レスを負荷していない（1)群に比べ、 胸腺、 脾臓共に重 量が大きく低下していた。 トリペプチドを投与した（3)群では、 若干 ではあるが胸腺重量及び脾臓重量が生理食塩水を投与した（2)群に比 ベ高い傾向を示した。 表 7
Figure imgf000019_0002
* (1)群に対し、 5 %の危険率で有意差あり 表 8に脾臓細胞のマイ トジェン反応性を、 表 9に脾臓細胞のインタ 一ロイキン 2産生能を示す。 ス ト レスを負荷した（2)群ではス ト レス を負荷していない（1)群に比べ、 マイ トジヱン反応性の低下とインタ 一ロイキン 2産生能の低下傾向が認められたが、 トリぺプチドを投与 した（3)群では、 生理食塩水を投与した（2)群に比べ、 マイ トジヱン反 応性の上昇とインターロイキン産生能が上昇傾向が認められた。 表 8
Figure imgf000020_0001
* (1)群に対し、 5%の危険率で有意差あり
# (2)群に対し、 5%の危険率で有意差あり 表 9
Figure imgf000020_0002
# (2)群に対し、 10 %の危険率で有意差あり これらの結果より、 I P P、 V P Pの投与は、 ス ト レスの負荷によ る血中アミノ酸のバランス（Fischer比） の変化、 胸腺や脾臓の萎縮、 脾臓細胞反応性の低下等の免疫機能指標の低下に対し抑制効果を有す ることが認められた。

Claims

請 求 の 範 囲
1 ) アンジォテンシン変換酵素阻害活性を有する ト リペプチド及び Z 又はその塩を有効成分と して含有する抗ス トレス剤。
2) 前記トリペプチドが、 l ie- Pro- Pro及び 又は Val - Pro- Proである 請求の範囲 1に記載の抗ス ト レス剤。
3) アンジォテンシン変換酵素阻害活性を有する ト リぺプチド及び/ / 又はその塩を含む抗ス トレス剤製造のための使用。
4) 請求の範囲 1に記載の抗ス トレス剤を含む抗ス トレス機能を有す る食品。
5) アンジォテンシン変換酵素阻害活性を有する ト リぺプチド及び 又はその塩を含む抗ス ト レス機能を有する食品製造のための使用。
6) I l e-Pro- Pro及び 又は Val- Pro- Proの配列を含むぺプチド及び 又は蛋白質を含有する培地を、 得られる培養液中に l i e- Pro- Pro及 び Z又は Va Pro- Proの ト リぺプチドが生産される条件で乳酸菌に よって発酵する工程を含む請求の範囲 4に記載の抗ス ト レス機能を 有する食品の製造法。
7) アンジォテンシン変換酵素阻害活性を有する ト リぺプチド及び 又はその塩を有効量経口投与するス ト レスの低下方法。
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