HUP0004617A2

HUP0004617A2 - Stresszellenes szerek és funkcionális élelmiszerek

Info

Publication number: HUP0004617A2
Application number: HU0004617A
Authority: HU
Inventors: Akihiro Masuyama; Toshiaki Takano
Original assignee: Calpis Co., Ltd.
Priority date: 1997-09-26
Filing date: 1998-02-05
Publication date: 2001-05-28
Also published as: DE69823369T2; PL339348A1; TWI231213B; EP1018341B1; AU728565B2; BR9813222A; CN1279614A; US6410685B1; ID25635A; CN1198641C; JP4727770B2; DK1018341T3; CA2303810A1; KR100379819B1; WO1999016461A1; AU5780198A; BG104381A; HUP0004617A3; KR20010024277A; TR200000863T2

Abstract

A találmány stresszellenes szerre és olyan funkcionálisélelmiszerre vonatkozik, amely minden gyógyszerbiztonsági problémátólmentesen, naponta többször is fogyasztható és alkalmas a stresszokozta mentális és fizikális tünetek enyhítésére vagymegakadályozására. A találmány szerinti stresszellenes szerhatóanyagként egy angiotenzin konvertáz aktivitással rendelkezőtripeptidet, közelebbről I1e-Pro-Pro és/vagy Val-Pro-Pro szekvenciájútripeptidet, és/vagy annak valamely sóját tartalmazza, a találmányszerinti funkcionális élelmiszer pedig ilyen stresszellenes hatásúszert tartalmaz. Ó

Description

-^ZZÉTÖTBÜÍI „XDÁW ·»

Stresszellenes szerek és funkcionális élelmiszerek

A találmány stresszellenes szerekre és funkcionális élelmiszerekre vonatkozik, melyek képesek enyhíteni vagy megakadályozni a stressz okozta mentális és fizikális tüneteket .

A modern társadalomban az emberek a stressz különféle formáinak vannak kitéve, melyeket a magasan fejlett tudományos technológia, illetve a drasztikusan változó társadalmi körülmények okoznak. Közelebbről, a globalizálódó társadalomban komplex emberi kapcsolatok keletkeznek, melyek mentális stresszhez vezetnek. Közleményekből ismeretes, hogy a különböző tünetek a mentális stressznek tudhatok be.

Felismerték, hogy a mentális stressz jelentős hatással van a keringési rendszerre és az immunrendszerre egyaránt. Mindazonáltal, a stressz tudományos definíciója máig sem tisztázott, ami azzal jár, hogy a stressz értékelése számos problémát vet fel, amelyek módszertani nehézségekkel párosulnak. Ennek dacára, a közelmúltban számos vizsgálatot végeztek a stressz orvosi szempontok alapján történő tanulmányozására.

Közölték például, hogy stresszes állapot hatására megemelkedik az angiotenzin II szintje, és fokozódik a nátrium túlzott mértékű visszaszívódása, ami a vérnyomás emelkedését idézi elő [Osamu Mobara et al., Taisha, 28(2), 323 (1991)]. Az ilyen felismerések alapján vizsgálatokat végeztek az angiotenzin konvertáz gátló hatású, és vérnyomás csökkentő hatóanyagként alkalmazott enalaprillel és alaceprillel a stressz által kiváltott magas vérnyomás kezelhetőségét illetően [The American Journal of Cardiology, 68(15), 1362

91779-9977-GI (1991); Internal Medicine, 32(9), 691 (1993)]. A stressz elszenvedése azonban nem csupán a vérnyomás emelkedését idézi elő, hanem egy sor olyan tényezőre is hatással van, amelynek révén gyomorfekély, iszkémiás szívbetegség, cerebrovaszkuláris betegség, hiperlipémia és hasonlók lépnek fel. Fentiek alapján - bár a stresszt a magas vérnyomá egyik kiváltójának tekintik - nem képzelhető el, hogy pusztán a vérnyomás csökkentése stresszellenes hatással járna.

A stressz által okozott mentális és fizikális tünetek enyhítésére vagy megakadályozására jelenleg vegyi úton szintetizált gyógyszereket, így pédául nyugtátokat, feszültségoldókat és altatókat alkalmaznak az orvosi gyakorlatban. Ezekkel a gyógyszerekkel kapcsolatban problémát jelent viszont a hozzászokás, valamint a sokfajta mellékhatás, úgyhogy nem tanácsos napi használatuk a stressz okozta mentális és fizikális tünetek kezelésére. Mindezek alapján kívánatos volna egy olyan stresszellenes hatóanyag, amely minden gyógyszerbiztonsági probléma nélkül naponta akár többször is bevehető, és képes a stressz okozta mentális és fizikális tünetek enyhítésére vagy megakadályozására. Az ilyen hatóanyagok kifejlesztése folyamatban van. Irodalmi közlemények stresszellenes hatóanyagként például a tealevelekben lévő Lteanint [JP-6-100442 számú irat], imidazol-vegyületeket, így például anszerint, valenint, N-metil-hisztidint vagy t-metilhisztidint tartalmazó stresszellenes készítményt [JP-9-20660 számú irat] vagy glutationt és valamely antioxidánst tartalmazó stresszellenes élelmiszert [JP-8-275752 számú irat] javasolnak erre a célra. Ismeretes olyan közlemény is, amely az illatanyagok stresszcsökkentő hatásáról tudósít [Fragrance Journal, 11, 44-49 (1991)]. Mindazonáltal korábbról nem ismeretes, hogy valamely tripeptid a stressz mentális és fizikális tüneteit enyhítő vagy magakadályozó hatással rendelkezne.

A találmány célja tehát olyan stresszellenes szer, valamint olyan funkcionális élelmiszer kidolgozása, amely képes kielégíteni a fentiekben vázolt társadalmi igényt, és minden gyógyszerbiztonsági problémától mentesen, naponta többször is alkalmazható, és alkalmas a stressz okozta mentális és fizikális tünetek enyhítésére vagy megakadályozására .

A találmány tehát stresszellenes szerre vonatkozik, amely hatóanyagként egy angiotenzin konvertáz aktivitással rendelkező tripeptidet és/vagy annak sóját tartalmazza.

A találmány továbbá olyan stresszellenes szerre vonatkozik, amely Ile-Pro-Pro és/vagy Val-Pro-Pro szekvenciájú tripeptidet tartalmaz.

A találmány továbbá az említett tripeptideknek és/vagy sóiknak stresszellenes szer előállításában történő alkalmazásra vonatkozik.

A találmány továbbá stresszellenes hatású élelmiszer készítményre is vonatkozik, amely hatóanyagként a találmány szerinti stresszellenes szert tartalmazza.

A találmány tárgya továbbá a szóbanforgó tripeptideknek és/vagy sóiknak alkalmazása stresszellenes élelmiszer készítmény előállítására.

A találmány tárgya továbbá eljárás stresszellenes hatású élelmiszer készítmény előállítására, amelynek során

Ile-Pro-Pro és/vagy Val-Pro-Pro szekvenciát tartalmazó pepiidből és/vagy fehérjéből összeállított tápközeget tejsavbaktériummal fermentálunk olyan körülmények között, amelyek biztosítják, hogy a fermentált tápközegben az Ile-Pro-Pro és/vagy Val-Pro-Pro tripeptid képződjön.

A találmány tárgyához tartozik a stressz hatásának csökkentésére szolgáló módszer is, amelynek során a kezelést orálisan, az angiotenzin konvertáz gátló hatású tripeptid és/vagy sójának hatásos mennyiségével végezzük.

A találmány szerinti stresszellenes szer hatóanyagként angiotenzin konvertáz gátló aktivitással rendelkező tripeptidet és/vagy annak sóját tartalmazza. A találmány értelmében a stresszellenes hatás olyan aktivitást jelent, amelynek révén a kezelt alany állapota a normális, stresszmentes állapothoz közelíthet, azaz például csökkenti a stressz hatására megemelkedett szisztolés és diasztolés vérnyomást, illetve gátolja vagy megakadályozza az immunfunkciók stressz hatására bekövetkező csökkenését, például a lépsejtek válaszreakciójának csökkenését.

A tripeptidként előnyösen angiotenzin konvertáz gátló aktivitással rendelkező Ile-Pro-Pro, Val-Pro-Pro (melyek rövidítése a következőkben IPP és VPP) tripeptidet vagy ezek keverékét alkalmazzuk.

A tripeptid sója valamely gyógyászatilag elfogadható só lehet, így például szervetlen só, amilyen a klorid, a szulfát és a foszfát, vagy szerves só, amilyen a citrát, a maleát, a fumarát, a tartarát és a laktát.

A tripeptid előállítható például alkalmas mikroorganiz mus segítségével fermentációs úton, enzimatikus hidrolízissel vagy kémiai szintézissel.

A mikroorganizmussal végzett fermentáció kivitelezése tejsavbaktérium alkalmazásával történhet, melyet olyan tápkö— zegben tenyésztünk, amely a tripeptidnek, így az Ile-Pro-Pro és/vagy Val-Pro-Pro tripeptidnek a szekvenciáját tartalmazó peptid és/vagy fehérje tápanyagforrás felhasználásával készült.

A tápközeg előnyösen a tripeptidnek megfelelő aminosavszekvenciát tartalmazó peptid és/vagy fehérje tápanyagforrás. Ez a tápanyagforrás lehet tej, tej kazein, kukorica, kukoricafehérje, búza, búzafehérje, szója, zsírtalanított szója vagy szójafehérje. A tápközeg kívánt esetben tartalmazhat más összetevőket is, így például élesztőkivonatot, vitaminokat és ásványi sókat.

Tej savbaktériumként a Lactobacillus nemzetséghez tartozó tejsavbatérium fajok alkalmazhatók. Ilyenek például a Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentura vagy Lactobacillus casei subsp. casei. Különösen a Lactobacillus helveticus ATCC 55796, Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus ATCC 11842, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Lactobacillus fernentum ATCC 14931 vagy a Lactobacillus casei subsp. casei ATCC 393 törzs alkalmazható.

A fermentáció kivitelezése oly módon történhet, hogy a tápközeget hővel sterilezzük, visszahűtjük a tenyésztéshez megfelelő hőmérsékletre, majd beoltjuk előtenyésztett tejsavbaktérium oltókulturával. Olyan mennyiségű tejsavbaktérium oltótenyészet alkalmazunk, hogy az 10⁵ és 10⁷ tejsavbaktérium sejtet tartalmazzon, a beoltandó tápközeg 1 grammjára vonatkoztatva. A tenyésztést 20 és 50°C közötti, előnyösen 30 és 45°C közötti hőmérsékleten végezhetjük. A tenyésztés ideje 3 és 48 óra közötti, előnyösen 6 és 24 óra közötti időtartam lehet. A tenyésztést befejezhetjük, midőn a tejsavbatériumok száma eléri vagy meghaladja a 10⁸ sejt/g értéket, és a képződő tej sav aciditása eléri vagy meghaladja az 1 értéket. Az igy kapott tenyészet általában 0,1 és 100 pg/g koncentrációban tartalmaz IPP és/vagy VPP tripeptidet, bár ez a tápközeg összetételétől is függ.

Az élő tejsavbaktériumokat tartalmazó tenyészet önmagában is felhasználható a találmány szerinti stresszellenes szerként. Más módon eljárva a tenyészet hősterilezést, például 80 °C hőmérsékletre történő melegítést követően is felhasználható. A tenyészet felhasználható továbbá fagyasztva szárítás, porlasztva szárítást, vagy dobszárítást követően porkészítményként is.

A találmány szerinti stresszellenes szerként való felhasználás előtt a tripeptid tisztítása céljából a tenyészetet töményíthetjük. A töményítés és a tisztítás kivitelezésére a tenyészetet centrifugálhatjuk, és a felülúszót elválaszthatjuk. Az így kapott felülúszót tovább tisztíthatjuk elektrodialízissel, ioncserélő gyantán kezelve, üreges szálú membránon végzett dialízissel, reverz ozmózissal, hidrofób oszlopkromatografálással vagy ezek bármely kombinációjával, hogy töményebb és tisztább tripeptid készítményhez jussunk.

A tripeptid enzimatikus hidrolízissel történő előállt tására a tripeptidnek, így az Ile-Pro-Pro és/vagy Val-Pro-Pro tripeptidnek a szekvenciáját tartalmazó peptid és/vagy fehérje tápanyagforrást proteináz, majd karboxipeptidáz enzimmel kezeljük. Az ennek során alkalmazott proteináz származhat mikroorganizmusokból, növényekből vagy állatokból, és előállítása ismert módon történhet. A karboxipeptidáz szintén származhat mikroorganizmusokból, növényekből vagy állatokból, és előállítása ugyancsak ismert módon történhet.

A tripeptid kémiai úton való előállítása ismert szerves szintetikus reakciókkal történhet. A tripeptid előállítása érdekében elkészíthetők például a célvegyületet alkotó aminosavak, melyek aminocsoportjait fluorenil-metoxi-karbonil csoporttal megvédjük, majd a védőcsoporttal ellátott aminosavakat a célvegyület aminosav szekvenciájának megfelelő sorrendben, hagyományos módon reagáltakjuk egymással. Alkalmas módszerrel gyantához kötött tripeptidet kapunk, melyről a tripeptidet bármely hagyományos módon eltávolíthatjuk, és tovább tisztíthatjuk.

A találmány szerinti stresszellenes szer tripeptid tartalma nincs különösebben korlátozva, feltéve, hogy lehetővé teszi a tripeptid hatásos mennyiségben történő alkalmazását. A szerben a tripeptid koncentrációja szokásosan 0,001 és 1 töm.% közötti.

A találmány szerinti stresszellenes szer a tripeptid és/vagy sója mellett tartalmazhat még más adalékokat is, így például cukrokat, fehérjéket, lipideket, vitaminokat, ásványi anyagokat, ízesítőanyagokat és színezőanyagokat.

A találmány szerinti stresszellenes‘szer embereknek és állatoknak egyaránt beadható. A kezelés történhet orálisan vagy intravénásán. A szert előnyösen orálisan alkalmazzuk.

A találmány szerinti stresszellenes szerrel történő hatásos kezelés során általában naponta és testtömegkilogramonként 0,1 és 40 mg tripeptid közötti mennyiségben, orálisan alkalmazzuk, annak érdekében, hogy eredményesen kifejtse a találmány szerinti, a stressz tüneteit enyhítő vagy megakadályozó hatását emberekben. Mindazonáltal, a stresszellenes szert a megadott tartományt meghaladó mennyiségben is alkalmazhatjuk.

Midőn a találmány szerinti stresszellenes szerrel kezelést végzünk, a különböző fiziológiai paramétereknek a stressz hatására történő megváltozása - így például a vérnyomás emelkedése, az immunfunkciók gyengülése - kisebb mértékű lesz, mintha a szóbanforgó szert nem alkalmaznánk, és megközelíti a stresszmentes körülmények között tapasztalható értéket.

A találmány szerinti funkcionális élelmiszer a streszszellenes szert tartalmazza. Az ilyen funkcionális élelmiszer fogyasztása megakadályozza vagy enyhíti a stressz tüneteit.

A találmány szerinti funkcionális élelmiszerben lévő stresszellenes szer mennyisége nincs különösebben korlátozva, feltéve, hogy abban a tartományban van, ahol a funkcionális élelmiszer tripeptid- és/vagy tripeptidsó-tartalma révén eléri a stresszellenes hatást. A funkcionális élelmiszer általában a stresszellenes készítményt olyan mennyiségben tartalmazhatja, hogy a tripeptid és/vagy annak sója 0,001 és 0,1 töm.% közötti koncentrációt érjen el.

A találmány szerinti funkcionális élelmiszer fogyasztása naponta és testtömegkilogramonként 0,1 és 40 mg tripeptid közötti mennyiségben, eredményesen kifejti a találmány szerinti előnyös hatást. Mindazonáltal, a funkcionális élelmiszer a megadott tartományt meghaladó mennyiségben is fogyasztható.

A találmány szerinti funkcionális élelmiszer lehet joghurt, tejtartalmú savanyított ital, sajt, fermentált savanyú tejet tartalmazó feldolgozott élelmiszer- vagy italkészítmény, vagy gyógyhatású készítmény, amely lehet szilárd állagú, így például por, granulátum és tabletta, vagy folyékony állagú, így például krém, gél és folyadék.

A találmány szerinti stresszellenes szer és funkcionális élelmiszer hatóanyaga, a tripeptid, valamely tápanyagforrásnak tejsavbaktériumokkal végzett fermentációval állítható elő, és így teljesen biztonságosnak tekinthető.

Mivel a találmány szerinti stresszellenes szer és funkcionális élelmiszer a szóbanforgó tripeptidet tartalmazza, így teljesen biztonságosnak tekinthető, és ezek ismételt napi fogyasztása képes enyhíteni vagy megakadályozni a különféle stressz által kiváltott mentális és fizikális tüneteket.

A következő példák a találmány lényegének jobb megértését szolgálják, de annak tárgykörét semmiképpen sem korlátozzák.

1. példa g sovány tejport feloldottunk 100 g vízben. Az így kapott oldatot 115°C hőmérsékleten 20 percen át sterileztük, majd szobahőmérsékletre hűtöttük, és beoltottuk egy platina kacsnyi Lactobacillus helveticus ATCC 8205 tenyészettel. A beoltott tápközeget 37°C hőmérsékleten 24 órán át inkubálva inokulumtenyészetet (5xl0⁸ sejt/ml, pH=3,5) készítettünk. Ezután 2 kg tömegű, 9 töm.% szárazanyag tartalmú sovány tejet 90°C hőmérsékletre melegítve sterileztünk, majd beoltottuk az inokulumtenyészettel, és 37°C hőmérsékleten 24 órán át inkubálva oltótenyészetet készítettünk. Ezt követően 4,5 kg sovány tejport feloldottunk 50 kg vízben, és az így kapott oldatot 90°C hőmérsékletre melegítve sterileztük, majd szobahőmérsékletre hűtöttük, és beoltottuk 2 kg oltótenyészettel. A beoltott tápközeget 37°C hőmérsékleten 24 órán át inkubálva 56 kg tömegű fermentált tejet kaptunk. Az így kapott fermentált tej 5,4 mg/1 IPP és 9,5 mg/1 VPP tripeptidet tartalmazott.

2. példa kg, az 1. példa szerinti módon készített fermentált tej pH-ját 10 N nátrium-hidroxid oldattal 7,3 értékre állítottuk, majd 1 liter térfogatú ioncserélő gyantát (Amberlite XAD-2, Organo Corp.) kevertünk hozzá, és desztillált vízzel 20 kg össztömegre egészítettük ki. Az elegyet 90 percen át kevertük, majd vákuumban szűrve a gyantát elválasztottuk. A gyantát a szűrőn 20 kg desztillált vízzel mostuk, majd 0,8 kg metanollal elegyítettük, és 30 percen át kevertük. Az így kapott elegyet előbb nylon vattán (szálméret 0,074 mm), majd kemény szűrőpapíron vákuumban leszűrtük. A kapott szűrletet 55 °C hőmérsékleten, vákuumban bepárolva 200 g sűrítményt kaptunk. A sűrítményhez 250 ml ioncserélő gyantát (Amberlite IRA-400, Organo Corp.) adtunk, és 10 percen át kevertük, majd szűrőpaíron vákuumban leszűrtük. A szűrlet pH-ját 1 N sósavoldattal 7 értékre állítottuk, majd fagyasztva szárítottuk. Az így tisztított és szárított terméket feloldottuk desztillált vízben, kromatográfiás oszlopra (Sephadex G-25, Pharmacia Co.) vittük, és desztillált vízzel eluáltuk. A tripeptidet tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, és fagyasztva szárítottuk. Az így kapott 50 mg tömegű tisztított tripeptid frakció por 0,6 mg IPP és 1,0 mg VPP tripeptidet tartalmazott.

3. példa

Az IPP és VPP tripeptidet a következő szerveskémiai szintézissel állítottuk elő. A szintézis kivitelezése szilárd fázisú módszerrel, automatikus peptidszintetizátorral (Type PSSM-8, Shimadzu Co.) történt. Szilárd fázisú hordozóként 20 pmól benziloxi-benzil-alkohol típusú polisztirol gyantát használtunk, melyre az aminocsoportot fluorenil-metoxi-karbonil- (Fmoc) -csoporttal védett prolint kapcsoltunk. A tripeptid aminosav-szekvenciájának megfelelő sorrendben 100100 μιηόΐ Fmoc-Ile, Fmoc-Pro és Fmoc-Val, védett aminocsoportot tartalmazó aminosavakkal a szokásos módon elvégeztük a reakciót, hogy megkapjuk a gyantához kapcsolt tripeptideket. A peptidkötött gyantát 1 ml reakcióelegyben (1 töm.% etán-ditiol, 5 töm.% an'izol és 94 töm.% trifluorecetsav) szuszpendáltuk, és 2 órán át szobahőmérsékleten reagáltattuk, hogy a pepiidet leválasszuk a gyantáról, és az oldallánc védőcsoportját eltávolítsuk a pepiidről. A reakcióelegyet üvegszűrőn leszűrtük, a tisztított pepiidet 10 ml vízmentes éterrel kicsaptuk, és a csapadékot 3000/perc fordulattal 5 percen át centrifugálva elválasztottuk. A csapadékot ezután vízmentes éterrel többször mostuk, majd nitrogénáramban megszárítottuk. Az így kapott nyers szintetikus peptideket felodottuk 2 ml térfogatú 0,1 N sósavoldatban, majd fordított fázisú Ci₈ oszlopon HPLC technikával tisztítottuk a következő körülményeket alkalmazva: Pumpa: Type L6200 intelligent pump (Hitachi Ltd.) Detektor: Type L4000 UV detector (Hitachi Ltd.) Detektálás: UV elnyelés 215 nm hullámhosszon

Oszlop: MicroBondasphere 5 μ C₁₈ (Watres Inc.)

Eluens: A oldat - 0,1 töm.%-os töménységű vizes trifluorecetsav-oldat

B oldat - 0,1 töm.% trifluor-ecetsavat tartalmazó acetonitril

Grádiens: (B/A+B)xlOO(%): 0 - 40 % (60 perc)

Áramlási sebesség: 1 ml/perc

A maximális UV elnyelésnél vett frakciókat összegyűjtöttük, és fagyasztva szárítottuk, így 2,1 g IPP és 0,9 mg VPP tripeptidet kaptunk. A tisztított peptidek N-terminális szekvenciáját teljesen automatikus fehérje szekvenátorral (Type PPSQ-10, Shimadzu Co.) és aminosav analizátorral (Type 800 Series, Nihon Bunkou Kougyo Co.) meghatároztuk. Bizonyítást nyert, hogy a kinyert peptidek szerkezete megegyezik a tervezettekével.

4. példa hím Wistar patkányt (testtömeg kb. 300 g) egy héten át előkészítettünk a kísérlethez. Az előkészítő szakaszban, éppúgy, mint később a kísérlet során, az állatokat meghatá rozott mennyiségű kereskedelmi kész tápon (CE-2 táp, Nihon Crea Co.) tartottuk, korlátlan vízfogyasztást biztosítva.

Az előkészítő szakasz után a patkányokat három csoportba osztottuk (nyolc állat csoportonként), és a következőképp kezeltük őket:

1. csoport: stresszmentes körülmények, kezelés sóoldattal (placebo);

2. csoport: stresszes körülmények, kezelés sóoldattal (placebo);

3. csoport: stresszes körülmények, kezelés IPP és VPP tripeptidekkel.

A 2. és 3. csoportba tartozó állatokat 9 napon át tettük ki stressznek, oly módon, hogy naponta négy órán át hűtőszobában (4 °C) tartottuk őket.

A 10. napon az 1. és 2. csoportba tartozó patkányoknak 1 ml sóoldatot adtunk, a 3. csoportba tartozó patkányoknak pedig a 3. példa szerinti módon szintetizált IPP és VPP 3 mg/testtömegkilogrammnyi mennyiségét tartalmazó, 1 ml térfogatú sóoldatot adtunk. A kezelést orális szondával, a szert közvetlenül a gyomorba juttatva végeztük. A kezelés után a 2. és 3. csoportba tartozó patkányokat 4 órán át hidegstressznek tettük ki. Két órával a stressz elmúlta után megmértük a kísérleti állatok farkában a vérnyomást nem melegítő, nem invazív patkány szfigmomanométer (Type PE-300, CSI Co.) alkalmazásával. A kapott eredmények az 1. táblázatban láthatók.

A vérnyomásmérés eredményeit az 1. táblázat tartalmazza. Amint az adatokból látható, mind a szisztolés, mind pedig a diasztolés vérnyomás értékek magasabbak voltak a 2. csoportban, amelyben az állatok stressznek voltak kitéve, mint az 1. csoportban, amelyben az állatok stresszmentes körülmények között voltak. Ezzel ellentétben, a 3. csoportba tartozó, VPP és IPP kezelésben részesült patkányok esetében mind a szisztolés, mind pedig a diasztolés vérnyomás értékek alacsonyabbak voltak, mind a 2. csoportba tartozó patkányoknál, melyek sóoldatot kaptak, és megközelítették az 1. csoportba tartozó, stresszmentes körülmények között tartott patkányok esetében kapott értékeket.

1. táblázat

Kísérleti csoport	Szisztolés vérnyomás (Hgmm)	Diasztolés vérnyomás (Hgmm)
1. stresszmentes, sóoldat	121	97
2. stressz, sóoldat	136*	107
3. stressz, VPP és IPP	129	101

* 5 % szignifikanciaszinten szignifikánsan eltér az 1.

csoport értékétől

A hidegstressz előtt és után mért vérnyomásértékeket a 2. táblázat tartalmazza. Amint az a 2. táblázat adataiból látható, a stressznek kitett 2. csoportban mind a szisztolés, mind pedig a diasztolés vérnyomás értékek magasabbak voltak, mint a stresszmentes körülmények között tartott 1. csoportban. Ugyanakkor a VPP és IPP kezelésben részesült 3. csoportban mind a szisztolés, mind pedig a diasztolés vérnyomásértékek alacsonyabbak voltak, mint a csupán sóoldatot kapott 2. csoportban. Közelebbről, különösen a szisztolés vérnyomás csökkenése tekinthető szignifikánsnak. Ezek az adatok igazolják, hogy az IPP és VPP kezelés eredményesen csökkenti a stressz hatására bekövetkező vérnyomás emelkedést.

2. táblázat

Kísérleti csoport	Szisztolés vérnyomás (AHgmm)	Diasztolés vérnyomás (AHgmm)
1. stresszmentes, sóoldat	-2,2	-2,5
2. stressz, sóoldat	11,2*	6, 1*
3. stressz, VPP és IPP	3,7#	-0,6

* 5 % szignifikanciaszinten szignifikánsan eltér az 1.

csoport értékétől # 5 % szignifikancia szinten szignifikánsan eltér a 2. csoport értékétől

5. példa him Wistar patkányt (testtömeg kb. 300 g) egy héten át előkészítettünk a kísérlethez. Az előkészítő szakaszban, éppúgy, mint később a kísérlet során, az állatokat meghatározott mennyiségű kereskedelmi kész tápon (CE-2 táp, Nihon Crea Co.) tartottuk, korlátlan vízfogyasztást biztosítva.

1. csoport: kezelés sóoldattal (placebo);

2. csoport: kezelés VPP tripeptiddel;

3. csoport: kezelés IPP tripeptiddel.

Az 1-3. csoportba tartozó állatokat 9 napon át tettük ki stressznek, mint a 4. példában, oly módon, hogy naponta négy órán át hűtőszobában (4°C) tartottuk őket.

A 10. napon az 1. csoportba tartozó patkányoknak 1 ml sóoldatot adtunk, a 2. és 3. csoportba tartozó patkányoknak pedig a 3. példa szerinti módon szintetizált IPP, illetve VPP 3 mg/testtömegkilogrammnyi mennyiségét tartalmazó, 1 ml térfogatú sóoldatot adtunk. A kezelést orális szondával, a szert közvetlenül a gyomorba juttatva végeztük. A kezelés után az 1-3. csoportba tartozó patkányokat 4 órán át hidegstressznek tettük ki, majd a 4. példában megadott módon megmértük a vérnyomásukat. A kapott eredmények a 3. táblázatban láthatók.

A vérnyomásmérés eredményeit a 3. táblázat tartalmazza. Amint az adatokból látható, mind a szisztolés, mind pedig a diasztolés vérnyomás értékek szignifikánsan alacsonyabbak voltak a 2. és 3. csoportban, amelyben az állatokat tripeptidekkel kezeltük, mint az 1. csoportban, amelyben az állatok sóoldatot kaptak. Ezek az adatok igazolják, hogy a tripeptidekkel végzett kezelés eredményesen csökkenti a stressz hatására bekövetkező vérnyomás emelkedést.

3. táblázat

Kísérleti csoport	Szisztolés vérnyomás (Hgmm)	Diasztolés vérnyomás (Hgmm)
1. sóoldat	138	110
2. VPP kezelés	131*	101*
3. IPP kezelés	130*	102*

* 5 % szignifikancia szinten szignifikánsan eltér az 1. csoport értékétől

6. példa

A kísérletet az 5. példában ismertetett módon végeztük el, azzal az eltéréssel, hogy az 1. csoportba tartozó patkányoknak 2 ml sóoldatot adtunk, a 2. csoprtba tartozó pat17 kányoknak az 1. példa szerinti módon előállított fermentált tejet adtunk 5 ml/testsúlykilogramm mennyiségben, a 3. csoportba tartozó patkányoknak pedig a 2. példa szerinti módon előállított tisztított tripeptid frakció port adtunk, 150 mg/testtömegkilogramm mennyiségben, 2 ml térfogatú sóoldatban. A kezelés és a stressz után megmértük a patkányok vérnyomását.

A vérnyomásmérés eredményeit a 4. táblázat tartalmazza. A 4. táblázatban, a fermentált tejjel kezelt 2. csoport, és a tisztított tripeptid frakció porával kezelt 3. csoport értékeit a csupán sóoldatot kapott 1. csoport értékeivel összehasonlítva látható, hogy mind a szisztolés, mind pedig a diasztolés vérnyomás értékek szignifikánsan alacsonyabbak voltak a 2. és 3. csoportban, mint az 1. csoportban. Ezek az adatok igazolják, hogy a fermentált tejjel, illetve a tisztított tripeptid frakcióval végzett kezelés eredményesen csökkenti a stressz hatására bekövetkező vérnyomás emelkedést.

4. táblázat

Kísérleti csoport	Szisztolés vérnyomás (Hgmm)	Diasztolés vérnyomás (Hgmm)
1. sóoldat	135	106
2. fermentált tej	132	99*
3. tisztított tripeptid frakció	128*	101*

* 5 % szignifikancia szinten szignifikánsan eltér az 1. csoport értékétől

7. példa hím Wistar patkányt (testtömeg kb. 300 g) egy héten át előkészítettünk a kísérlethez. Az előkészítő szakaszban az állatokat meghatározott mennyiségű kereskedelmi kész tápon (CE-2 táp, Nihon Crea Co.) és vízen tartottuk, korlátlan fogyasztást biztosítva.

1. csoport: stresszmentes körülmények, kezelés sóoldattal (placebo);

2. csoport: stresszes körülmények, kezelés sóoldattal (placebo);

3. csoport: stresszes körülmények, kezelés IPP és VPP tripeptidekkel.

A 2. és 3. csoportba tartozó állatokat 5 egymást követő napon át naponta 6 óra időtartamra vízbemerítéses-fogvatartásos stressznek tettük ki, oly módon, hogy az állatokat drótketrecben fogvatartva 25°C hőmérsékletű vízfürdőbe merítettük, fejüket a vízfelszín fölött tartva, hogy tudjanak lélegezni. A stressz-terhelés alatt az állatokat kereskedelmi kész tápon (CE-2 táp, Nihon Crea Co.) és vízen tartottuk, korlátlan fogyasztást biztosítva.

A stressz-terhelés 5 egymást követő napja alatt az 1. és 2. csoportba tartozó patkányoknak 1 ml sóoldatot adtunk, a 3. csoportba tartozó patkányoknak pedig a 3. példa szerinti módon szintetizált IPP és VPP 3 mg/testtömegkilogrammnyi mennyiségét tartalmazó, 1 ml térfogatú sóoldatot adtunk. A kezelést orális szondával, a szert közvetlenül a gyomorba juttatva végeztük.

A stressz-terhelés 2. és 3. napján metabolikus ketrec alkalmazásával vizeletet gyűjtöttünk, melynek katecholaminés indolaminkoncentrációját HPLC módszerrel meghatároztuk. Az analízis során fordított fázisú szilikagél oszlopot (Catecholpack, Nihon Bunkou Kougyo Co.) és elektrokémiai detektort (Coulochem, Esa Co.) használtunk.

A stressz-terhelés befejeztével, annak utolsó napján, a patkányokat dekapitálással megöltük, hogy vért gyűjsünk, és eltávolítsuk csecsemőmirigyüket, valamint lépüket. A szérum aminosavösszetételét aminosav-analizátorral (Type 800 series, Nihon Bunkou Kougyo Co.) vizsgálva meghatároztuk a Fischer hányadost (az elágazó láncú aminosavaknak az aromás aminosavakra vonatkoztatott mólaránya). A csecsemőmirigy és a máj tömegét megmértük. A lépből lépsejteket preparáltunk, és meghatároztuk interleukin-2 produktivitásukat, valamint mitogén aktivitásukat, a következő módon.

Lépsejtek preparálása

A lépet homogenizátorral finomra aprítottuk, és a hemociták eltávolítása érdekében hipotóniás kezelésnek vetettük alá. Ezután a homogenizátumot 2 % magzati borjúszérumot (FCS) tartalmazó MÉM tápközeggel mostuk, majd 10 % FCS tartalmú RPM1640 tápközegben szuszpendáltuk, hogy lxlO⁷ szabad sejtet tartalmazó szuszpenziót kapjunk.

Az interleukin-2 produktivitás mérése

A fentiek szerint elkészített 2,5xl0⁶ lépsejtet, 5 pg/ml konkanavalin A-t és 10 % FCS-t tartalmazó RPM1640 tápközeget 24 órán át inkubáltuk. A tenyészet felülúszójának interleukin-2 tartalmát biológiai értékméréssel határoztuk meg, egy interleukin-2 reaktív sejtvonal proliferációs indexe alapj án.

Mitogén reaktivitás

A fentiek szerint elkészített 5xl0⁶ lépsejtet, mitogénként 5 pg/ml konkanavalin A-t vagy alkörmös (pokeweed) mitogént (PWM), és 10 % FCS-t tartalmazó RPM1640 tápközeget 24 órán át inkubáltuk. A tenyésztést követően a sejtszámot MTT [3-(4,5-dimetil-tiazoil-2-il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromid] felvételüket felhasználva, az abszorbancia mérésével meghatároztuk, és a mitogén nélküli sejtszámra vonatkoztattuk.

A stressz-terhelés 2. és a 3. napján a vizeletben kiválasztott noradrenalin és dopamin mennyisége az 5. táblázatban látható. Az 5. táblázat adataiból kitűnik, hogy a vizeletben kiválasztott noradrenalin és dopamin mennyisége szignifikánsan alacsonyabb a stressznek kitett 2. csoportban, mint a stresszmentes körülmények között tartott 1. csoportban. A tripeptidekkel kezelt 3. csoportban a noradrenalin és dopamin kiválasztás csökkenése mérséklődni látszik a sóoldattal kezelt 2. csoporthoz képest. Mindezek alapján bebizonyosodott, hogy az IPP és VPP tripeptidek mérséklik a stressz noradrenalin és a dopamin kiválasztást csökkentő hatását a vizeletben.

5. táblázat

Kísérleti csoport	Noradrenalin (mg/nap)	Dopamin (mg/nap)
1. stresszmentes, sóoldat	0,296	0,466
2. stressz, sóoldat	0,168*	0,287*
3. stressz, VPP és IPP	0,231*#	0,396*#

* 5 % szignifikancia szinten szignifikánsan eltér az 1. csoport értékétől # 10 % szignifikancia szinten szignifikánsan eltér a 2. csoport értékétől

Az állatok megölése után a szérumban mért aminosavak Fischer hányadosa a 6. táblázatban látható. Az adatokból kitűnik, hogy a Fischer hányados szignifikánsan alacsonyabb a stressznek kitett 2. csoportban, mint a stresszmentes körülmények között tartott 1. csoportban. Másrészt viszont a tripeptidekkel kezelt 3. csoportban a Fischer hányados szignifikánsan magasabb, mint a sóoldattal kezelt 2. csoportban.

6. táblázat

Kísérleti csoport	Fischer hányados
1. stresszmentes, sóoldat	3,34
2. stressz, sóoldat	2,97*
3. stressz, VPP és IPP	3,27*#

* 5 % szignifikancia szinten szignifikánsan eltér az 1. csoport értékétől # 5 % szignifikancia szinten szignifikánsan eltér a 2. csoport értékétől

Az állatok megölése után a eltávolított csecsemőmirigy és lép tömege a 7. táblázatban látható. Az adatokból kitűnik, hogy a csecsemőmirigy és a lép tömege szignifikánsan alacsonyabb a stressznek kitett 2. csoportban, mint a stresszmentes körülmények között tartott 1. csoportban. A tripeptidekkel kezelt 3. csoportban a csecsemőmirigy és a lép tömege valamivel nagyobb, mint a sóoldattal kezelt 2. csoportban.

7. táblázat

Kísérleti csoport	Csecsemőmirigy tömege (mg)	Lép tömege (mg)
1. stresszmentes, sóoldat	433	769
2. stressz, sóoldat	202*	453*
3. stressz, VPP és IPP	226*	495*

* 5 % szignifikancia szinten szignifikánsan eltér az 1. csoport értékétől

A lépsejtek mitogén reaktivitásának értékei a 8. táblázatban, a lépsejtek interleukin-2 produktivitási értékei pedig a 9. táblázatban láthatók. Az adatokból kitűnik, hogy a mitogén reaktivitás alacsonyabb, az interleukin-2 poduktivitás pedig csökkenő tendenciát mutat a stressznek kitett 2. csoportban, a stresszmentes körülmények között tartott 1. csoporthoz képest. Másrészt viszont a tripeptidekkel kezelt 3. csoportban a mitogén reaktivitás magasabb, az interleukin2 poduktivitás pedig emelkedő tendenciát mutat, a sóoldattal kezelt 2. csoporthoz képest.

8. táblázat

Kísérleti csoport	Mitogén reaktivitás
Konkanavalin A	PWM
1. stresszmentes, sóoldat	1,91	1,45
2. stressz, sóoldat	1,56*	1,26*
3. stressz, VPP és IPP	1,80#	1,37#

9. táblázat

Kísérleti csoport	Interleukin-2 produktivitás (E/ml)
1. stresszmentes, sóoldat	6094
2. stressz, sóoldat	4431
3. stressz, VPP és IPP	7086#

# 10 % szignifikancia szinten szignifikánsan eltér a 2. csoport értékétől

Ezek az adatok azt bizonyítják, hogy az IPP és VPP kezelés mérsékli a stressznek az immunológiai jellemzőket csökkentő hatását, így a vérben lévő aminosavak egyensúlyának megváltozását (Fischer hányados), a csecsemőmirigy és a lép atrófiáját, valamint a lépsejtek reaktivitásának gyengítését.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Stresszellenes szer, amely hatóanyagként angiotenzin konvertáz enzimet gátló aktivitással rendelkező tripeptidet és/vagy annak sóját tartalmazza.
2. Az 1. igénypont szerinti stresszellenes szer, amely Ile-Pro-Pro és/vagy Val-Pro-Pro összetételű tripetidet tartalmaz.
3. Angiotenzin konvertáz enzimet gátló aktivitással rendelkező tripeptid és/vagy sójának alkalmazása stresszellenes szer előállítására.
4. Stresszellenes hatású élelmiszer készítmény, amely az 1. igénypont szerinti szert tartalmaz.
5. Angiotenzin konvertáz enzimet gátló aktivitással rendelkező tripeptid és/vagy sójának alkalmazása stresszellenes hatású élelmiszer készítmény előállítására.
6. Eljárás a 4. igénypont szerinti stresszellenes hatású élelmiszer készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy Ile-Pro-Pro és/vagy Val-Pro-Pro szekvenciát magában foglaló peptidet és/vagy fehérjét tartalmazó tápközeget tejsavbaktériumokkal fermentálunk Ile-Pro-Pro és/vagy Val-ProPro tripeptid képződést biztosító körülmények között.
7. Eljárás a stressz hatásának csökkentésére, azzal jellemezve, hogy a kezelést angiotenzin-konvertáz enzimet gátló aktivitással rendelkező tripeptidnek és/vagy sójának hatásos mennyiségével, orálisan végezzük.

A meghatalmazott:

DANUBIA

Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft Dr. Gárdonyi Zoltánná sza ti ügyvivő