WO1997016541A1

WO1997016541A1 - Alkaline protease, process for the production thereof, use thereof, and microorganism producing the same

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Publication number: WO1997016541A1
Application number: PCT/JP1996/003216
Authority: WO
Inventors: Yoshiaki Miyota; Shiro Fukuyama; Tadashi Yoneda
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1995-11-02
Filing date: 1996-11-01
Publication date: 1997-05-09
Anticipated expiration: 1998-05-02
Also published as: DE69633676D1; US5981255A; JP4030603B2; EP0859050A1; DE69633676T2; ATE280222T1; CN1125175C; JPH09121857A; AU7339596A; EP0859050B1; EP0859050A4; CN1201489A

Description

明細書アルカリプロテアーゼ、その製造方法、その用途、及びそのプロテア -ゼを生産する微生物技術分野

本発明は、新規なアルカリプロテアーゼに関する。さらに詳しく言えば、界面活性剤と熱に対する安定性に優れたアルカリプロテアーゼ、その製造方法、その洗浄剤等への用途、及びそのアルカリプロテアーゼを生産する微生物に関する。背景技術

近年、環境汚染が問題となり、洗剤成分としてのリン酸塩の使用が規制されるに伴って、を洗剤に配合して、洗浄力を高めることが行なわれている。現在では、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパ —ゼ等を配合した酵素入り洗剤が上市されている。中でもプロテアーゼは、衣類に付着する有機汚垢の 1 0〜4 0 %を占め、従来の洗剤成分だけでは除去しきれないタンパク質汚れを効率よく分解し、洗浄力を高めるための洗浄成分として不可欠になっている。

洗剤用プロテアーゼとしては、アルカリ域で活性を示す微生物由来の力、従来数多く知られており、カズサーゼ（昭和電工（株））、サピナーゼ（ノヴォ（NOVO)社製）、マキサカル（ギスト（GIST)社製）、ァルカラーゼ（ノヴォ（NOVO)社製）、バイオサム（昭和電工（株））等が用いられている。また、自動食器洗浄機の普及に伴って、自動食器洗浄機用洗剤に配合可能な酵素が求められている。卵黄、乳製品等のタンパク質性の食器汚れに対して、プロテアーゼが有効である。ただし、に酵素は高温水中で使用すると失活が促進されるので優れた安定性が要求される。現在この目的にはエスペラーゼ（ノヴォ（NOVO)社製）等が用いられている力十分な活性、安定性を兼ね備えているとは言えない。これまでに知られているプロテアーゼの中で界面活性剤に対して最も安定性の高いのは、バチルス SD 521株の産するプロテアーゼ（特開平 3 - 191781号）であるが、更に安定性の高いプロテアーゼが望まれている。従って、本発明の目的は、界面活性剤存在下においてより安定性の高いアルカリプロテアーゼ、そのアルカリプロテアーゼの製造方法、そのプロテア一ゼを含む洗剤組成物等の用途、及びそのようなプロテアーゼを生産する物を提供することにある。発明の開示

本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、バチルス属の 1菌株である、バチルス s p. (Bacillus sp. ) S D 114株が^するプロテアーゼ A P I一 26が優れた安定性を有し、また洗浄性にも優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の新規アルカリプロテアーゼ、その製造方法、その用途、及びそのプロテアーゼを生産する微生物を提供する。

1) 以下の（a) 〜（c) の少なくとも 1つの条件を充たすアルカリプロテアーゼ：

(a) 界面活性剤溶液（5 OmM Atkins-Pantin ほう酸緩衝液（pH 10)、 O.lmM エチレンジァミン四酢酸（EDT A) 、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（LAS) 500 p pm) 中、 40°C で 30分後に 60 %以上の残存活性を有する；

(b)緩衝液（5 OmM Atkins-Pantin ほう酸緩衝液（pHl 0)、 O.lmM EDTA) 中、 55 °Cで 15分後に 40 %以上の残存活性を有する；

(c)界面活性剤溶液（5 OmM Atkins-Pantin ほう酸緩衝液（pH 10) 、 0. ImM EDTA、 LAS500ppm) 中、 55。Cで 15 分後に 20%R の残存活性を有する。

2) 以下の性質を有する前記 1) に記載のアルカリプロテアーゼ：

(1) 作用

夕ンパク質及びべプチドを加水分解する；

(2) 至適 pH

カゼインを基質とし 30°Cにて 10分間反応させたとき至適 pHは 1 2付近にある；

(3)安定 pH域

30°Cで 24時間インキュベートしたとき、 pH5〜l 1で安定である；

(4) 至適温度

カゼインを基質とし、 pHl 0で 10分間反応させたとき、至適 M¾ が 60て付近にある；

(5) 分子量

S D Sポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した分子量は 2900 0 ±2000である；

(6) 等電点

等電点ポリアクリルァミドゲル電気泳動法による等電点は 10.1±0.5 ある。

3) バチルス (Bacillus)属に属する微生物が生産する前記 1 ) 乃至 2) のいずれかに記載のアルカリプロテアーゼ。

4) バチルス (Bacillus)属に属する！^物がバチルス s p. (Bacill us sp.)D 114株（受託番号 FEKM BP-5736) である前記 3) に記載のアル力リプロテアーゼ。

5) 前記 4に記載のプロテアーゼと免疫学的交差性を示し、以下の (a)〜（c) の少なくとも 1つの条件を充たすアルカリプロテアーゼ

(a) 界面活性剤溶液（50mM Atkins-Pantinほう酸緩衝液（pH 10) 、 0. ImM EDTA、 LAS500ppm) 中、 40°Cで 30 分後に 60%以上の残存活性を有する；

(b)緩衝液（5 OmM Atkins-Pantin ほう酸緩衝液（p H 10)、 O.lmM EDTA) 中、 55°Cで 15分後に 40 %以上の残存活性を有する；

(c) 界面活性剤溶液（5 OmM Atkins-Pantinほう酸緩衝液（pH 10) 、 O.lmM EDTA、 LAS500p m) 中、 55。Cで 15 分後に 20%以上の残存活性を有する。

6) 前記 1)乃至 5) のいずれかに記載のプロテアーゼの生産能を有するバチルス (Bacillus) 属に属する物またはその変異株を培養し、その培養物から該プロテアーゼを採取することを特徴とするアル力リブ口テアーゼの製造方法。

7) バチルス (Bacillus)属に属する物がバチルス s p. (Bacill us sp.) D 114株（受託番号 FEBM BP- 5736) である前記 6) に記載のアル力リプロテアーゼの製造方法。

8) バチルス s p . (Bacillus sp. ) S D 114株（受託番号 FERM BP- 5736)及びその変異

9) 前記 1) 乃至 5) のいずれかに記載のプロテア一ゼを含む洗浄剤繊物。

10) 前記 1) 乃至 5) のいずれかに記載のプロテアーゼを含む洗剤 _c

11) 前記 1) 乃至 5)のいずれかに記載のプロテアーゼを含む自動食器洗浄機用洗剤。 12) 前記 1) 乃至 5) のいずれかに記載のプロテアーゼを蛋白質またはべプチドに作用させることを特徴とするぺプチドまたはアミノ酸の製造方法。図面の簡単な説明

図 1は本発明酵素の至適 p H範囲を示すグラフである。

図 2は本発明酵素の安定 p H域範囲を示すグラフである。

図 3は本発明酵素の至適温度範囲を示すグラフである。

図 4は本発明酵素及び公知酵素の 55°Cの温度における安定性を示すグラフである。

図 5は本発明酵素及び公知酵素の市販洗剤ウルトラァリエル中 55 °C における安定性を示すグラフである。

図 6は本発明酵素及び公知酵素の市販洗剤スーパーチア一中 55°Cにおける安定性を示すグラフである。

図 7は本発明酵素及び公知の市販洗剤タイド ·グリィース · リリ一シング中 40°Cにおける安定性を示すグラフである。発明の詳細な説明

以下本発明を詳細に説明する。

[酵素生産菌]

本発明の酵素を生産する菌株の 1つであるバチルス s p, (Bacillus sp.) SD 114株は以下に述べる如く、菌学的性質からは Bacillus firmusに近縁の菌株と判断されるが、いくつかの性質において他の公知の菌株と明らかに相連し、新規な菌と認定された。

菌学的性質：

本発明に係るバチルス s p. (Bacillus sp. ) S D 114株は、以下に示す菌学的性質を示す。

(a)形態：桿菌、

(b)グラム染色性：十、

(c)胞子形成能：十、

(d)胞子形態：楕円形、

(e)運動性：十、

(f)酸素に対する態度：好気性、

(g)カタラーゼ生産：十、

(h)嫌気下での生育：―、

(i) V P反応：一、

(]') ？ブロスの ^1： 6. 2 、

00酸の生成：

グルコース一

ァラビノース一

キシロース一

マンニトール一

(1)グルコースからのガスの生成：一、

(m)ゼラチンの液化：十、

(n)デンプンの分解：十、

(0)クェン酸^の利用：一、

(P)プロピオン酸塩の利用：―、

(q)フエ二ルァラニンデァミネーシヨン：一、

(r)卵黄反応：一、

(s)硝酸塩の還元：―、

(t) p H6. 8 での生育：十、

(u) p H5. での生育： +、 (v) 5%塩ィ匕ナトリゥム存在下での生育：十、

(w) 7%塩ィ匕ナトリゥム存在下での生育：十、

(x)l 0°Cでの生育：十、

(y)30°Cでの生育：十、

(z)55°Cでの生育：十、

(aa)菌体内 DNAの GC^» (モル％) : 45%。

上記の菌学的性質を有する本菌の分類学上の性質を "バージーズ ·マ二ユアル*ォブ ·システマチック ·パクテリォロジ一" VOL.2(1986) William & Wilkinsを参考にして他の菌株と比較すると以下の通りである。

本発明に係るバチルス s p. (Bacillus sp. ) S D 114株は糖からの酸の生成や、 50^での生育においてバチルス ·ファーマス (Bacillus firmus) の典型的な性状を示さなかった。一方、公知の菌株である S D521株はグルコースから酸を生成し、硝酸塩を還元し、 PH6.8で生育せず、 50°Cで生育しない。 NC I B 10309はグルコース、ァラビノース、マンニトールから酸を生成する。 PB92はグルコース、キシロースから酸をし、プロピオン酸塩を利用出来る。以上の菌学的性質から明らかなように本菌株 SDl 14株は中温菌であり、バチルス ·ファーマス（Bacillus firmus) と近縁のバチルス s p. (Bacillus sp.)と判断され、他の公知菌株とも相違する。従って、本菌株はバチルス (Bacillus)属に属する新菌株と認められた。本菌株は日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（宛名：日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号）に、平成 7年（1995年） 10月 2日に P-15214号として寄託され、ブタペスト条約に基づき平成 8年（1996年） 10月 30 日に SD 114株（受託番号 FEBM BP-5736) として国際寄託に移管されている。上記 S D 1 1 4株を元菌株として自然または誘発突然変異により、上記菌株が有するプロテア一ゼ生産性を向上させた変異株を得て、本発明によるプロテアーゼの生産菌として用いることが出来る。これらの変異株を調製する方法としては、従来知られている慣用の方法、例えば元菌株を紫外線照射あるいは N—メチルー N' —二トロー N—ニトロソグァ二ジン（N T G) 等の薬剤による Λ 突然変異処理を施して、スキムミルク等を含む寒天培地に広げ、生育してくる菌株の中からコロニーのまわりに形成されるクリアゾーンが、より大きいコロニーを選抜し、性の優れた菌株を選別する方法を用いることが出来る。また本発明の酵素を生産する性質を有するプロテア一ゼ遺伝子を適当な自己複製する D N Aと連結し、これを用いて適当な宿^胞を形質転換し、遺伝子増幅効果によって生産性を向上させることもできる。

[プロテアーゼの製造方法]

本発明のプロテアーゼを製造するに際して使用される培地は、本発明のプロテアーゼ生産菌が増殖し、プロテアーゼを生産し得るものならば任意のものでよい。

例えば、炭素源としてはグルコース、マルトース、シュ一クロース、可溶性デンプン等が用いられ、窒素源としては、大豆かす、ごまかす、ふすまかす、コーンスティープリカ一等の有機窒素源カ佣いられる。また、この他にリン酸塩、力リゥム塩、マグネシゥム塩等の無機塩類が添加される。本発明においては、培養は好気的条件下で、例えば通気撹拌法や振とう培養法で行う。培養温度は 2 0〜4 0 °Cの範囲で良いが、生育の最も良好な 3 0〜3 7 °Cが望ましい。初発 p Hは 9〜1 0、培養中の p Hは 8. 5〜1 0がそれぞれ好ましい。培養時間は 1 6〜6 0時間程度であり、プロテアーゼ活性力最高に達した時に培養を終了するのが望ましい。このように得られる培養液からの目的とするプロテア一ゼの精製は ~¾のの分離精製に準じて行うことが出来る。

すなわち、遠心分離、またはろ過等によって菌体、培地固形物を除去し、上清またはろ液を得ることが出来る。これらの分離液に可溶性塩類、親水性有機溶媒を添加し、蛋白質を沈殿させる塩析法、溶媒沈殿法、噴霧乾燥法、凍結乾燥法等により本発明のプロテアーゼを得る。さらにィォン交換ク口マトグラフィ一及びゲルろ過ク口マトグラフィ一等の精製法を組み合わせ、精製することが出来る。かくして得られる本発明のプ口テアーゼを A Ρ I—26と命名した。 AP I—26の活性は以下に示す方法にて測定される。

[酵素活性測定法]

pH 10の 5 OmM Atkins-Pant inのほう酸緩衝液 500 1に、適当に希釈した酵素液 50 1を加え、 30°Cで 3〜5分プレインキュペートする。この溶液に p H 10の 2%ハマースティンカゼィン溶液 δ θ 1を加え、 10分後トリクロ口酢酸（TCA) 溶液（0.132M TCA：酢酸緩衝液で ρΗ4に調整） 2m 1を加えて反応を停止させる。 30°C10分以上放置後、 No.2のフィルターペーパー（東洋ろ紙）を用いてろ過する。ろ液 lmlに 0.4 M炭酸ソーダ 5ml、水で 6倍希釈のフエノール試薬 lm 1を添加し、 30°Cで 20分間放置して発色させた後、 660 nmにおける吸光度を測定する。酵素単位は 30°C、 p HI 0でカゼインを基質として反応させたとき、 TCA画分中に 1秒間にチロシン 1モル相当の 660 nmの発色を示す分解物を生成するプロテア一ゼ活性を 1力タール（lkatal) とする。

[プロテアーゼの性質]

次に本発明で得られるプロテアーゼ（AP 1-26) の理化学的性質について述べる。

(1)作用及び基質特異性タンパク質及びペプチド、例えばカゼイン、ヘモグロビン、アルプミン、肉タンパク、魚肉タンパク、大豆タンパクなどを分解する。

(2)至適 pH

至適 pHの測定法：

緩衝液として Britton-Bobinsonの広域緩衝液を使用した。また至適 p

Hを調べるに当たっては、 1%カゼインを含む各 PH緩衝液中に、を約 2 Onkatal/m 1とるように加え、 30°Cで 10分間反応させ活性を測定し、 PH11.7での活性を 100とし表 1及び図 1に示した。本酵素は p H 12付近に至適 p Hを有することが分かる。

(3)安定 pH域

安定 pH域の測定法：

各 p Hの緩衝液にを約 20 nkatal/m 1となるように加え、 30 °Cで 24時間ィンキュベートした後の活性を測定した。インキュベート前の活性を 100として、各 pHでの残存活性を表 2及び図 2に示した _c 本酵素の安定 pH域は 30°Cで 5〜11であることが分かる。

PH 7.1 7.9 9.0 9.9 10.6 11.2 11.7 12.1 活性 19 35 46 64 79 86 100 94 表 2

PH 4 5 6 7 8 9 10 11 12 残存活性 0 100 100 100 100 100 100 100 0

0 (4)至適温度

至適温度の測定法：

基質として 1%のカゼイン及び 2mM EDTA (ethylenedia ine tetraacetic acid、エチレンジアミン四酔酸）を含む p H 10の 25 mM Atkins- Pantinほう酸緩衝液を 5分間各でプレインキュペートした後、酵素を添加し 10分間各^で反応させた。 60°Cでの活性を 100として各温度での相対活性を表 3及び図 3に示す。本酵素は 60 °C付近に至適温度を有することが分かる。表 3 温度 (°C) 30 40 50 60 70

活性 13 25 49 100 35

(5)阻害剤の影響

以下の条件及び方法により本酵素に対する各種阻害剤の影響を調べた 5 OmMほう酸緩衝液（pH 10) で、本酵素を約 2 Onkatal/m 1 になるように調製し、 EDTA、 p—メルクリ安息香酸（PCMV)、フエニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF) を表 4に示した濃度で添加し、 3 (TC30分間インキュベート後活性を測定した。阻害剤無添加のものを 100%とした相対活性で表した結果を表 4に示す。表 4 から明らかなように本酵素は PMSFにより著しく阻害されることから、セリンプロテアーゼであることがわかる。表 4 阻害剤濃度活性無添加 100

PCMV ImM 100

PMS F 1 OmM 0.7

EDTA 5 mM 99

(6)分子量

S D Sポリアクリルアミドゲル電気泳動を行つた結果、本酵素の分子量は、 29000±2000と算出された。

(7)等電点

等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により得られた等電点は 10. 1±0.5ある。

(8)安定性

以下に示す条件のうち少なくとも 1っを充たす。

(a)界面活性剤溶液（5 OmM Atkins- Pantin ほう酸緩衝液（pH 10)、 0. ImM EDTA、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリゥム（LAS) 500 p pm) 中、 40 で 30分後に 60 %以上の残存活性を有する。

(b)緩衝液（5 OmM Atkins-Pantin ほう酸緩衝液（p H 10)、 0. ImM EDTA) 中、 55 °Cで 15分後に 40%以上の残存活性を有する。

(c) 界面活性剤溶液（5 OmM Atkins-Pantin ほう酸緩衝液（pH 10) 、 0.1 mM E D T A、 L A S 500 p p m) 中、 55 °Cで 15 分後に 20%以上の残存活性を有する。

2 [抗 AP I 26抗体との交差性]

本発明のプロテアーゼは、以下の測定条件で、好ましくは抗 A P I一 26抗体と交差反応を示す。

交差反応測定条件：

抗原である AP I— 26を 2mg/m 1に調整し、等量のフロイント完全アジュバンド（Freund' s complete adjuvant) と混合し、完全に油中水滴状 (Water in oil) にする。 2羽の雌ゥサギにこの試料 1 m 1を 0日目、 21日目、 42日目、 63日目の間隔で注射する。 70日目に全採血し、抗体を含む血清を調製する。

交差反応はオーク夕ロニー（Ouchterlony) 法 (Acta. Med. Scan.133,

76-79(1950)) によって評価する。すなわち、中央の穴に lmgZm 1 の AP I 26または同濃度の他プロテアーゼ 10 1添加し、周りの穴に 2の n乗系列（n = l， 2, 3, 4, 5， 6, 7) で希釈した抗血清を添加し、湿潤箱に入れて 37 °Cで一晩放置し沈降線を観察する。 AP I 26に対して沈降線を形成する限界の濃度の少なくとも 4倍以上の濃度で沈降線を形成する場合、抗 AP I— 26抗体と交差性を有すると判断^る o

[プロテアーゼ作用方法]

本発明のプロテアーゼをタンパク質やべプチドに作用させることによりペプチドやアミノ酸を製造することが出来る。また、タンパク質やべプチドを成分に含む目的物質に作用させることにより目的物質の加工に使用することが出来る。その方法としては、従来用いられてきた方法において、従来酵素の代わりに本発明のプロテアーゼを使用する形態をとることが出来る。さらに、従来酵素が失活してしまうような過酷な条件においても、本発明のプロテアーゼが活性を保持する限りは使用可能である。例えば 50 pm以上 5 O Op p m以下の L A S存在下は勿論の

3 こと、 5 O O P p m hの L A S存在下においても使用可能である。ただし、好ましくは 3 0 0 0 p p m以下、より好ましくは 3 0 0 p p m以下で使用する。また、温度に関しては 4 8 °C以上の高温においても使用可能である。ただし、好ましくは 7 5 C以下、より好ましくは 7 0 °C以下にて使用する。

[用途]

本発明のアル力リプロテアーゼは、各種市販洗浄剤溶液中や界面活性剤存在下で既存のアル力リプロテア一ゼに比べて高い安定性を有する。また熱に対しても安定であり、洗濯や食器洗浄で使用される温水中においてタンパク質の汚れを効率的に分解するので、洗剤に配合して洗浄力の増強を図ることが出来る。

その他の用途としては、例えば、飼料加工、食品加工（魚油加工、食肉加工等）、繊維加工、耗加工、皮革加工、コンタクトレンズ洗浄、配管洗浄等があり、また入浴剤や脱毛剤に配合することも出来る。

[洗浄剤組成物]

本発明により、前記の性質を有するアルカリプロテアーゼを配合した洗浄剤組成物が提供される。本発明の洗浄剤組成物に配合されるアル力リプロテアーゼの量には特に限定はないが、洗浄液 1リットル当たり、 1 0〜1 0 0 Onkatalに相当する量を配合するのが適当である。配合量が少なすぎると十分な洗^果の向上が得られず、また逆に多過ぎる塲合には酵素配合量に比して洗浄効果の向上が大きくなく、経済性の点で好ましくない。

本発明のアル力リプロテアーゼは、従来公知の任意の洗浄剤組成物の他の成分を何等変更することなく配合することができる。

そのような洗浄剤#誠物の代表例をあげれば、洗浄剤組成物重量当たり 1 0〜5 0重量％の界面活性剤、 0〜5 0重量％のビルダー、 1〜 5 0重量％のアルカリ剤あるいは無機電解質、 0. 1〜5重量％の再汚染防止剤、酵素、漂白剤、蛍光染料、ケーキング防止剤及び酸化防止剤からなる群より選ばれる少なくとも 1種以上の配合成分からなる洗浄剤組成物が挙げられる。

界面活性剤としては石鎮、例えば直鎖または分岐アルキルあるいはァルケニル硫酸塩、アミド硫酸塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基を有し、エチレンォキサイド、プロピレンォキサイド及びブチレンオキサイドのうちの単独ある t、は複数成分が付加したアルキルまたはアルケニルェ一テル硫酸塩のような脂肪族硫酸化物、アルキルスルホン酸塩、アミドスルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩、 - ォレフィン、ビニリデン型ォレフィン及び内部ォレフィンの各スルホン酸塩のような脂肪族スルホン酸塩、直鎖または分岐鎖のアルキルべンゼンスルホン酸塩のような芳香族スルホン酸塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基を有し、エチレンォキサイド、プロピレンォキサイド及びブチレンォキサイドのうちの単独あるいは複数成分が付加したアルキルまたはアルケニルエーテルカルボン酸塩またはアミド、 a 一スルホ脂肪酸塩またはエステル、アミノ酸型界面活性剤、アルキルまたはアルケニル酸性リン酸エステル、アルキルまたはアルケニルリン酸塩の如きリン酸エステル系界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、ベタイン型両性界面活性剤、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基を有し、エチレンォキサイド、プロピレンォキサイド及びプチレンォキサイドのうちの単独あるいは複数成分が付加したアルキルまたはアルケニルエーテルあるいはアルコール、直鎖または分岐鎖のアルキル基を有し、エチレンォキサイド、プロピレンォキサイド及びプチレンォキサイドのうちの単独あるいは複数成分が付加したポリオキシェチレンアルキルフエニルエーテル、高級脂肪酸アル力ノールアミドまたはそ

5 のアルキレンォキサイド付加物、ショ糖脂肪酸エステル、脂肪酸グリセリンモノエステル、アルキルまたはアルケニルァミンォキサイド、テトラアルキルァンモニゥム力チォン界面活性剤など洗剤組成物として通常配合される界面活性剤であればいずれも使用可能であり、陰イオン性界面活性剤の場合の対ィオンとしてはナトリウムイオンまたは力リウムイオンであることが好ましい。これらの界面活性剤は、単独または 2 種以上の混合物として使用される。

ビルダー及びアル力リ剤あるいは無機電解質としてはオルソリン酸塩、ピロリン酸塩、トリポリ酸塩、メタリン酸塩、へキサメ夕リン酸塩、フイチン酸塩などのリン酸塩、エタンー 1 , 1—ジホスホン酸、ェタン一 1 , 1 , 2—トリホスホン酸、ェタン一 1ーヒドロキシー 1 , 1ージホスホン酸及びその誘導体、エタンヒドロキシー 1 , 1 , 2—トリホスホン酸、エタンー 1， 2—ジカルボキシー1， 2—ジホスホン酸、メタンヒドロキシホスホン酸などのホスホン酸塩、 2—ホスホノブタン一 1 , 2—ジカルボン酸、 1一ホスホノブタン一 2， 3， 4—トリカルボン酸、 α—メチルホスホノコハク酸などのホスホノカルボン酸塩、ァスパラギン酸、ダル夕ミン酸などのァミノ酸塩、二トリ口三酢酸塩、エチレンジァミン四酢酸塩、ジエチレントリアミン五酢酸塩などのアミノポリ酔酸塩、ポリアクリル酸、ポリイタコン酸、ポリマレイン酸、無水マレイン酸共重合体、カルボキンメチルセルロース塩などの高分子電解質、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなどの非解離高分子、ジグリコール酸、ォキシジコハク酸、カルボキシメチルォキシコハク酸、クェン酸、乳酸、酒石酸、ショ糖、ラクトースなどのカルボキシメチル化物、ペンタエリスリトールのカルボキシメチル化物、ダルコン酸のカルボキシメチルイ匕物、ベンゼンポリカルボン酸、シユウ酸、リンゴ酸、ォキシジコハク酸、ダルコン酸などの有機酸塩、ゼォライトなどのアルミ

6 ノケィ酸塩、炭酸塩、セスキ炭酸塩、硫酸塩、メタケイ酸塩などの無機塩をアルカリ金属塩として用いることができる。また、デンプン、尿素などの有機物質及び塩化ナトリウム、ベントナイトなどの無機化合物を用いることができ、更には有機アル力リ剤としでトリエタノールァミン、ジエタノールァミン、モノエタノールァミン、トリイソプロパノールァミンなどを用いることができる。

本発明の洗浄剤組成物は、前述の如く、界面活性剤、本発明のアル力リプロテアーゼ、アル力リ剤または無機電解質を必須の構成成分として含むが、その他必要に応じて両性界面活性剤、例えば過炭酸ソーダ、過ホウ酸ソーダなどの漂白剤、漂白活性剤、色素、ビルダー、例えばポリェチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、力ルボキシメチルセルロースなどの再汚染防止剤、ケーキング防止剤、酸化防止剤、耐食剤、蛍光増白剤、起泡増進剤、リパーゼなどのその他の酵素を必要に応じて含ませることができる。

本発明の洗浄剤組成物に酵素を配合する方法については特に制限はないが、微粉末状で配合することは、洗剤取扱い時の発塵による洗剤使用者や洗剤工業における作業者の安全衛^]:好ましいことではなく、溶液状態あるいはあらかじめ発塵性をおさえた形状に賦形しておくことが好ましい。この賦形は通常良く用いられるマルメ造粒、押し出し造粒、流動造粒、遠心流動造粒やその他の方法のいずれによるものであってもよく、本発明の洗浄剤組成物に配合する酵素の形状は特にこれらの方法によって賦形されたものに限定されるものではない。なお、本発明のアルカリプロテアーゼは安定性が高いため、通常、酵素の製剤（賦形）が行われる温度以上の温度、例えば 5 0°C以上での賦形も可能である。

本発明の洗浄剤組成物の具体例としては、本発明のアル力リプロテアーゼを添加した洗濯用洗剤や自動食器洗浄機用洗剤等の洗剤が挙げられ

7 る。発明を実施するための最良の形態次に実施例を挙げて説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

なお、実施例に記載の市販洗剤はすべて、予めそれに含まれる酵素粒剤を選別除去する等して実質的に酵素を含まないものを調製して使用し

実施例 1 ：バチルス s p. (Bacillus sp. ) S D 114株の培養法

カゼイン 1%、肉エキス 1%及びポリペプトン 1%を含有し、かつ炭酸ナトリウムで pH 7.5に調整した培地300 1中で35で、 66時間振とう培養し、培養液中に酵素を分泌生産させた。この培養液を、 4 C、 1000Gで遠心分離し、上清をとり、活性を沏|定したところ、約 50 nkatal/m 1であつた。実施例 2 ： AP I—26酵素精製法

実施例 1で得られた物培養液の上清を除菌膜処理し、ついで限外ろ過膜により酵素を濃縮した。この濃縮液を 30〜 60%飽和の硫安塩析を行った。さらに得られた沈殿を ImM CaC l₂ を含む 25mM トリス—塩酸緩衝液 PH 7.5に溶解し、同緩衝液で透析した。続いて該溶液を ρΗ 7.5で CMセル口ファイン（CM-cellulofine) C— 500 カラム（生化学工業製）に吸着させ、 ImM CaC を含む 0〜1 M KC 1 J¾勾配法により溶出し、比活性がイオン交換クロマトダラフィ一前の約 8倍に上昇した酵素画分を回収した。このサンプルを用いて SDSポリアクリルアミド電気泳動を行ったところ単一バンドとして

8 検出された c 実施例 3 ：温度安定性

O.lmM EDTAを含む pH 10の 5 OmM Atkins- Pantin ほう酸緩衝液に約 2 Onkatal/ml濃度になるように本発明の酵素（AP I 2 6)、 Subtilisin膽 9 (NCIB10309株の産する酵素）、 PB92 (バチルス PB 92株の産する S^)、 SD521 (バチルス SD521株の産する酵素）を加え、 55°Cでインキュベートする。経時的にサンプリングし、残存活性を 30°Cで測定した。熱処理なしの活性を 100としたときの各時間での残存活性を表 5に示す。但し、 Subtilisin 10309、 PB92、 SD521はそれぞれ特公昭 51-8401号、特開昭 51-125407 号、特開平 3- 191781号に記載の方法で調製した。表 5及び図 4から分かるように A P I 26は優れた温度安定性を有する。表 5：温度安定性 (55°C) 時間（分） 0 7.5 15 22.5 30

AP I 26 100 70 43 25 30

Subtilisin 10309 100 4 3 3 3

PB 92 100 5 3 4 3

SD 521 100 20 13 10 8 実施例 4 ：界面活性剤安定性

本酵素の界面活性剤に対する安定性を調べた。

測定法：

0. ImM EDTAを含む 5 OmM Atkins-Pantinほう酸緩衝液 p H 10に LASを 500 p pmとなるように溶解する。この溶液に約 20 nkatal/m 1濃度になるように酵素（AP I 26、 Subtilisin 10309、 PB92、 SD521) を加え、 40°C及び 55°Cでインキュベートし残存活性を 30 °Cで経時的に測定した。時間 0での活性を 100としたときの各時間での残存活性を表 6 (40°C)及び表 7 (55°C) に示す _c AP I 26は従来の酵素に比べて格段に優れた界面活性剤安定性を有することが分かる。表 6 ：界面活性剤存在下での安定性（40°C) 時間（分） 0 7.5 15 22.5 30

AP I 26 100 100 100 99 97

Subtilisin 10309 100 0 0 0 0

P B 92 100 0 0 0 0

SD 521 100 7 5 0 0 表 7 ：界面活性剤存在下での安定性（55°C) 時間（分） 0 7.5 15 22.5 30

AP I 26 100 65 40 20 15

Subtilisin 10309 100 0 0 0 0

P B 92 100 0 0 0 0

SD521 100 3 0 0 0 実施例 5 ： AP I -26酵素の洗剤溶液中での安定性

以下の条件及び方法により市販洗剤ウルトラァリエル（Ultra Ariel) (P&G社製）、スーパーチア一（Super Cheer) (P&G社製）、夕イド ·グリィース ·リリーシング（Tide Grease Releasing) (P&G 社製）溶液中での本酵素の安定性を調べた。 50mM Atkins- Pantinほう酸緩衝液 PHI 0 50 ppm C a ⁺洗剤濃度 ΙΟΟΟρ p mの溶液で本酵素 A P I 26及び他歸 Subtilisin 10309、 PB92、 SD I 52 1を約 2 Onkatal/m 1になるように加え、 55°Cまたは 40°Cでインキュベートし、残存活性を 30°Cで経時的に測定した。時間 0での活性を 100とした時の各時間での残存活性を表 8〜 10及び図 5〜図 7に示す。この結果から A P I 26は他の酵素と比較して著しく洗剤溶液中で安定性が高いことが分かる。表 8 ：ウルトラァリエル（Ultra Ariel) ( 55 °C) 時間（分） 0 7.5 15 22.5 30

AP I 26 100 90 82 75 65

Subtil isin 10309 100 75 48 35 22

P B 92 100 73 46 33 21

SD521 100 81 53 44 31 表 9 ：スーパ'一チア一 (Super Cheer) (55°C) 時間（分） 0 7.5 15 22.5 30

AP I 26 100 90 80 71 63

Subtil isin 10309 100 25 7 5 3

P B 92 100 26 8 5 4

SD 521 100 41 25 10 9

2 表 10：タイド*グリィース * リリーシング

(Tide Grease Releasing) (40。C) 時間（分） 0 7.5 15 22.5 30

AP I 26 100 98 92 84 81

Subtil isin 10309 100 65 40 30 21

PB 92 100 66 41 28 20

SD521 100 72 66 52 39 実施例 6 ： AP I -26 S ^含有液体洗剤洗^ 試験

実施例 1と同様にして得られた培養液の上清を除菌膜処理し、ついで限外ろ過膜により酵素を濃縮した後、喷霧乾燥法により粗酵素を調製した。この粗酵素を用いて、市販の液体洗剤タイド（Tide) (P&G) に添加した際の洗浄効果を調べた。タイドに粗酵素を 10 OnkatalZm 1 となるように加え、本酵素を配合した洗剤を調製し、それを 40°Cで 4 週間保存した。カルシウムイオン（Ca^) 濃度が 4 Op pmの水 1リットルに対し、この 4週間保存した洗剤を 2 g添加し汚染布を洗浄後、白度を測定し、以下の式によって定義する洗浄効率を求めた。なお、汚染布は EMP A— 116 5 cmx 5 cmのものを各 10枚用いた。洗浄効率（） = (洗濯後の布の白度—汚染布の白度） / (非汚染布の白度一汚染布の白度） X 100

対照として SD521も同時に試験した。結果を表 11に示す。この結果から液体洗剤中に AP I 26を添加することは有効であることが分力、る。表 11 酵素洗浄効率（％)

AP I 26 62

Subtilisin 10309 55

PB92 54

SD521 58

無添加 52 実施例 7 ： AP I-26酵素含有自動食器洗浄機用洗剤の洗浄性試験実施例 6に記載の AP I—26粗酵素を用いて、自動食器洗浄機での洗浄効果を調べた。

まず、市販洗剤（商品名ハイゥォッシュ S；株式会社ェヌシーシ一；成分はポリエチレンアルキレンエーテル、過炭酸ナトリウム、炭酸塩、硫酸塩、有機酸塩）と A P I— 26粗酵素を重量比 20： 1の割合で混合して酵素含有自動食器洗浄機用洗剤を調製し、これを洗浄時 0.21%となるように使用して以下の条件により洗浄性を試験した。

洗浄条件

使用機種：松下電器（株）製自動食器洗い機（N P— 600洗浄剤水溶液が回転ノズルから噴射され、その噴射軌道上面に設置された食器類を洗浄する形式のもの）。

洗浄： 5°C〜55°Cまで徐々に上昇させる。

使用水：硬度 3.5° DHの水、

0. οι%、

洗浄時の循環水量： 2.5リットル、

汚染皿の調製：卵黄 1 gを直径 25 cmの磁性の皿に塗布し、一昼夜風乾したもの 2枚を試験に供する。

[洗浄力評価法]

洗浄後の皿にアミドシュニッツ^応により、皿上の紫色面積 (P₁ ) を写真判定によつて測り、汚染面積から下記の式によつて洗浄率を求め洗浄率（％) = { (P₀ -P₁ ) /P₀ } x 00

但し、 P₀ ：皿の瞧

求めた洗浄率を表 12に示す。対照として SD521も同時に試験した。この結果より、本酵素を含むサンプルは洗浄作用が強く、今回特別に設定した強固な汚れに対しても効果的に作用して 100%の洗浄率を示し、自動洗浄機用洗剤の洗浄力の改善に大きく寄与していることことが分かる。

表 12 洗浄率（％)

AP I 26 100

SD521 98

酵素無添加 80 産業上の利用の可能性

本発明のアル力リプロテアーゼは既存のアル力リプロテアーゼに比べて各種市販洗剤溶液中や界面活性剤存在下で高い安定性を有し、また熱に対しても安定であり、洗濯や食器洗浄においてタンパク質の汚れを効率的に分解するので、洗剤に配合して洗浄力の増強を図ること力、 '出来る _c また、蛋白質やべプチドに作用させて他のぺプチドゃァミノ酸を製造する際、その安定性か^いために経済的なプロセスが可能となる。本発明のバチルス s p . (Bacillus sp. ) S D 1 1 4株及びその変異株は、取扱い易い中温菌であり、本発明のアルカリプロテアーゼの生産等において有用である。

また、バチルス (Bacil lus) 属に属する微生物またはその変異株を培養する本発明のプロテアーゼの製造方法により本発明のアルカリプロテァ一ゼを効率良く生産することが出来る。

Claims

請求の範囲

1. 以下の（a)〜（c) の少なくとも 1つの条件を充たすアルカリプロテアーゼ：

(a)界面活性剤溶液（ 50 m M Atkins-Pantin ほう酸緩衝液（ p H

10)、 0.1 mM EDTA、 L AS 500 p pm) 中、 40°Cで 30 分後に 60%以上の残存活性を有する；

(b)緩衝液（5 OmM Atkins-Pantin ほう酸緩衝液（pH 10) ； 0.1 mM E D T A) 中、 55でで 15分後に 40 %以上の残存活性を有する；

(c)界面活性剤溶液（5 OmM Atkins-Pantinほう酸緩衝液（pHl

0)、 0.1 mM EDTA、 L AS 500 p pm) 中、 55°Cで 15分後に 20%以上の残存活性を有する。 2. 以下の性質を有する請求の範囲第 1項に記載のアル力リプロテア

—ゼ：

(1)作用

タンパク質及びべプチドを加水分解する；

(2) 至適 pH

カゼインを基質とし 30°Cにて 10分間反応させたとき至適 pHは 1

2付近にある；

(3)安定 pH域

(4)至適温度

カゼインを基質とし、 pH 10で 10分間反応させたとき、至適が 60°C付近にある；

(5)分子量

(6)等電点

等電点ポリアクリルァミドゲル電気腿法による等電点は 10.1±0.5 乙、 'あ

3. バチルス (Bacillus)属に属する物が生産する請求の範囲第 1項または第 2項のいずれかに記載のアルカリプロテア一ゼ。

4. バチルス（Bacillus) 属に属する微生物がバチルス s p . (Bacill us sp.) SD 114株（受託番号 FEBM BP- 5736) である請求の範囲第 3 項に記載のアル力リプロテアーゼ。

5. 請求の範囲第 4項に記載のプロテアーゼと免疫学的交差性を示し、以下の（a)〜（c) の少なくとも 1つの条件を充たすアルカリプロテァーゼ：

(a)界面活性剤溶液（5 OmM Atkins-Pantin ほう酸緩衝液（pH 10) 、 0.1 mM E D T A、 L A S 500 p p m) 中、 40°Cで 30 分後に 60%以上の残存活性を有する；

(b)緩衝液（5 OmM Atkins-Pantin ほう酸緩衝液（pH 10)、 0.1 mM EDTA) 中、 55 °Cで 15分後に 40%以上の残存活性を有する；

(c)界面活性剤溶液（ 50 mM Atkins-Pant inほう酸緩衝液 (pHl

0) .0.1 mM EDTA、 LAS500ppm) 中、 55°Cで 15分後に 2 0 %以上の残存活性を有する。

6. 請求の範囲第 1項乃至第 5項の L、ずれかに記載のプロテアーゼの生産能を有するバチルス (Bacil lus) 属に属する物またはその変異株を培養し、その培養物から該プロテアーゼを採取することを特徴とするアル力リプロテアーゼの製造方法。

7. バチルス (Bacillus) 属に属する微生物がバチルス s p . (Bacil lH§ sp. ) S D 1 1 4株（受託番号 FERM BP- 5736) である請求の範囲第 6 項に記載のアル力リプロテアーゼの製造方法。

8. バチルス s p . (Bacil lus sp. ) S D 1 1 4株（受託番号 FERM BP- 5736) 及びその変異株。

9. 請求の範囲第 1項乃至第 5項の L、ずれかに記載のプロテアーゼを含む洗浄剤組成物。

1 0. 請求の範囲第 1項乃至第 5項のいずれかに記載のプロテアーゼを含む洗剤。

1 1. 請求の範囲第 1項乃至第 5項のいずれかに記載のプロテアーゼを含む自動食器洗浄機用洗剤。

1 2. 請求の範囲第 1項乃至第 5項のいずれかに記載のプロテアーゼを蛋白質またはべプチドに作用させることを特徴とするぺプチドまたはアミノ酸の製造方法。