CN1303210C - 脱毛蛋白酶、其制造方法、使用方法和产生此蛋白酶的微生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种来源于短小芽孢杆菌菌株(Bacillus pumilus)CGMCC NO.0518的蛋白酶。该酶能水解蛋白质和肽；在50℃下，在pH 9.6时的酶活最高；在50℃下，pH 6-11范围内酶活力稳定；最适反应温度50℃；分子量为40，000道尔顿。本发明的蛋白酶可以对猪皮、羊皮、牛皮具有非常好的脱毛效果，且不损伤皮胶原；也可用于制革中的浸水工艺和软化工艺。

Description

脱毛蛋白酶、其制造方法、 使用方法和产生此蛋白酶的微生物

本发明涉及一种碱性蛋白酶及其生产方法、其在生皮浸水、酶法脱毛和皮软化工艺中的应用和产生此蛋白酶的微生物。

过去十五年里，世界制革工业的重心逐渐移向了亚洲。中国皮革产量增加了八倍，其中猪皮年产量达1亿张，居世界首位，牛皮5000万张，羊皮7000万张以上。1998年皮革及制品出口创汇达97亿美元，为我国轻工行业创汇首位。我国在获得经济效益的同时，也产生了严重的环境污染。随着制革工业的迅速发展，这种污染的程度将会日益严重。

制革工业最严重的污染源主要来自传统脱毛工艺中的硫化物。为了解决硫化物污染，研究人员曾做了多方面的努力。一方面是增加设备投资，对硫化物污水进行处理，使之达到规定的排放标准(先污染、后处理)。这种方法耗资大，增加了成本。除了现有较大规模的200多家制革厂有“条件”治理污水外，其余遍及全国的数以千计的小厂根本无法处理含硫污水。实践证明，行之有效的方法就是用酶法脱毛取代灰碱法脱毛，即将污染源消灭在生产工艺过程之中。

我国自1968年开始试验酶法脱毛工艺，到1973年在全国范围内全面推广，由于对推广中出现的一些实际问题没有认真加以研究解决，使酶法脱毛未能坚持下去。出现这种状况的最主要的原因是因为微生物蛋白酶制剂成本高，酶脱毛后成革容易出现松面，质量低劣，安全系数低，如有不慎还会造成烂皮，酿成生产事故。究其原因，主要有以下两个方面：

1、脱毛蛋白酶制剂品种少，选择合适的酶制剂投入使用受到限制。常用的蛋白酶制剂有166、AS1398、3942中性蛋白酶和209、2709碱性蛋白酶。其中，只有166与209是专门为脱毛筛选的，其他几种皆是行业引进品种。因此，酶制剂品种少，难以满足制革脱毛的特殊需要。再加上各应用工厂在技术条件、管理、设备以及原料等方面的差异，酶的品种单一，造成无合适的选择余地。在技术上，也只有猪皮脱毛基本过关。这是酶法脱毛难以长期推广使用的原因之一。

2、脱毛酶制剂成份复杂、性能不稳定，特异性差。在脱毛时，脱毛蛋白酶能水解蛋白质，然而因制剂中的蛋白酶种类甚多，每一种蛋白酶又各有其不同的特异性。它们对各种结构极不相同的作用底物表现出来的水解能力很不一样。现在所用的蛋白酶制剂，仅仅是微生物在其代谢过程中所产生的各种活性物质的混合物。这种粗酶制剂往往是以一种蛋白酶为主，同时又含有其他多种蛋白酶和各种杂酶(脂肪酶、糖化酶、淀粉酶)。它们不仅有能水解与脱毛有关的类粘蛋白和粘蛋白之类的糖蛋白水解酶，而且还有与皮软化有关的弹性蛋白酶。此外，还含有能损伤生皮胶原的胶原水解酶，因而使得皮革生产的主要原材料—胶原常常遭到不同程度损伤，影响成革质量。

目前进行的酶法脱毛实际上是多种蛋白酶作用于生皮中多种蛋白质底物的多种酶促反应，但是，由于粗酶中含有大量的胶原水解酶(脱毛终点时，溶液中羟脯氨酸含量较脱毛开始时有显著增加)，使得应该保留的胶原蛋白受到了很大损失。这种“综合性”的蛋白质水解结果，极容易出现成革松面等毛病，造成成革质量低劣。显而易见，这种费用高、产品质量低、操作不方便的脱毛方法是难以坚持的。

要使酶法脱毛取代灰碱法脱毛并使之得以推广应用，关键在于脱毛用酶制剂存在的种种问题能否得到解决。

中国专利(申请号：95197015.1)涉及到用酶进行生皮脱毛的方法，它包括以下步骤：①将生皮浸泡；②将经过浸泡的生皮进行主浸泡；③通过加入水、在机械作用和至少一种蛋白酶的作用下对经上述处理的生皮进行脱毛。在步骤①至③中，生皮至少经过了一次至少一种蛋白质二硫化物氧化还原剂的作用，这种方法有以下几个缺点：

1、该专利用任何一种蛋白水解酶或它们的混合物进行脱毛，而损伤生皮胶原的胶原蛋白酶也属于蛋白水解酶，若按中国专利(申请号：95197015.1)的方法用胶原蛋白酶进行生皮脱毛，将使皮革生产的主要原材料—胶原遭到损伤，甚至导致烂皮事故。

2、操作难度较大。例：如果蛋白质二硫化物氧化还原剂和蛋白酶这两种酶分别显示的最适pH值十分不同，它们就必须相继加入，而且要进行pH调节。

中国专利(申请号：95193076.1)也涉及到酶法脱毛，但使用其专利的碱性蛋白酶的脱毛效果非常不好；或者即使脱毛完全，也将生皮变成橡胶块的硬块，失去生产价值。

本发明的目的是提供一种可用于制革工业的浸水工艺、脱毛工艺和软化工艺的蛋白酶、制造这种蛋白酶的方法、这种蛋白酶在制革工业中的应用和产生这种蛋白酶的微生物，以增加蛋白酶的特异性和单一性，使酶法脱毛时不损伤生皮胶原，简化操作，保证成革质量。

发明描述

发明人发现由芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的菌株UN-31-C-42产生的蛋白酶BP-Ap42是一种碱性蛋白酶。仅使用此酶进行的酶法脱毛表明，该酶具有非常好的脱毛效果，并且不损伤皮胶原，比常规用酶AS1398蛋白酶的脱毛时间短而且脱毛效果优于AS1398。同时，该酶对皮具有良好的软化效果，优于目前软化工艺用的胰酶。该酶也可用于脱毛前的浸水工艺。

因此，本发明提供了这种新的蛋白酶、它的生产方法、用途和产生这种蛋白酶的微生物。

产生酶的微生物

产生本发明酶的微生物是芽孢杆菌属的一种与短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)在细菌学上密切相关的菌株UN-31-C-42。

细菌学特性

与本发明相关的芽孢杆菌属菌株UN-31-C-42具有下列的细菌学特性：

(a)形式：芽孢杆菌

(b)革兰氏染色：阴性

(c)孢子的产生：阳性

(d)孢子的形状：椭园

(e)移动性：阳性

(f)对氧的反应：需氧菌

(g)过氧化氢酶的产生：阳性

(h)在厌氧条件下的生长：阴性

(i)伏一普二氏反应(VP)反应：阳性

(j)酸的产生：

葡萄糖：阴性

阿拉伯糖：阳性

甘露糖醇：阴性

(k)由葡萄糖产气：阳性

(l)明胶的液化作用：阳性

(m)淀粉的降解：阳性

(n)能利用草酸铵，尿素、氯化铵、硫酸铵、硝酸钾及磷酸氢二铵，而不利用硝酸铵。

(p)碳源的利用：

能以麦芽糖、半乳糖、果糖和蔗糖为碳源，不能以乳糖和山梨糖为碳源。

根据Bergey的系统细菌学手册(Vol.2，William和Wilkins，1986)，初步鉴定为短小芽孢杆菌，定名UN-31-C-42。

此外，属于所说菌株UN-31-C-42的蛋白酶生产力改进突变体(通过自发或者诱导突变而得)可以作为产生本发明蛋白酶的细菌。为了制备这些突变体，可以使用常规的方法，例如由紫外线照射或者诱变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)对原始菌株诱导突变后，将培养物接种到含有酪蛋白的琼脂培养基中。从在菌落周围形成较大清晰环带的菌落中选择具有极好生产力的突变体；配合通过摇瓶实验测定蛋白酶活性，以及脱毛实验等，得到产生本发明蛋白酶的微生物菌株。

产生蛋白酶的方法

任何能够使产生本发明蛋白酶的微生物生长并产生所说的蛋白酶的培养基都可以用于生产本发明的蛋白酶。

例如，可以使用葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、糊精作为碳源，使用无机的氮化合物(如草酸铵、氯化铵、硝酸钾、磷酸氢二铵等)或有机氮化合物(如酪素、大豆饼、玉米浸液、黄豆粉等)作为氮源，此外还要加入矿物质，如磷酸盐、钾盐、镁盐和钙盐。培养基的初始pH值为7.5-10。在本发明中，将培养物在需氧的条件下培养，培养温度为37℃，培养时间为36小时到48小时，即可得到最大产量的酶。

可以按照常规的分离和纯化方法对通过以上过程获得的培养物进行纯化。通过盐析沉淀蛋白质、喷雾干燥方法、冻干法等，将可溶性盐加入到所得的上清液或滤液(所说的上清液和滤液是通过离心或者过滤菌体细胞和培养基的固体剩余物而得到的)中，即可获得了本发明的蛋白酶。可以结合使用其它的纯化方法(如离子交换层析和凝胶过滤层析)来进一步纯化所说的酶。发明人把通过上述方式所获得的本发明的蛋白酶命名为BP-Ap42。通过下述方法测定蛋白酶的活性并测试它的脱毛活性。

1、蛋白酶活力的测定

1ml酶液在50℃，pH9.6条件下测定，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位(U)。

2、脱毛活性的测试

用硼砂一氢氧化钠缓冲液(pH9.6)将酶液调至400U/ml，于250mL三角瓶内装酶液50mL，放入清洗后的猪臀部盐腌皮(10×15cm)3块，37℃恒温摇床(转速160r/min)上脱毛，定时观察脱毛情况。

蛋白酶的特性

本发明所获得的蛋白酶的物理和化学特性如下：

1、底物特异性

此蛋白酶能降解酪蛋白。

2、最适pH值：

用不同pH值的缓冲液稀释酶液，50℃下测定酶活性，结果如附图1所示。在pH 6-9.6的范围内，酶活随pH升高而升高，其中在pH7-pH8.5范围内曲线较平坦；在pH10-11范围内随pH升高而下降。因此最适pH值为9.6。

3、最适反应温度

以硼砂-氢氧化钠缓冲液(pH 9.6)稀释酶液，在不同反应温度下测定酶活。结果表明，该酶的最适反应温度为50℃，超过50℃酶活迅速降低(见附图2)。

4、抑制剂的影响

使用了6种不同的抑制剂，测定了它们对该蛋白酶的影响。以未加入抑制剂的样品酶活作为100％，加入抑制剂后的样品的酶活进行换算后为剩余相对酶活，结果示于表1。

                      表1抑制剂对于发酵液中碱性蛋白酶活的影响

抑制剂(使用浓度均为1mM/L)	EDTA	EGTA	PMSF	DFP	二钾砷酸钠	苯甲醚
							剩余相对酶活(％)	14.7	12.7	2.1	2.1	90.3	93.4

结果表明，特异性抑制丝氨酸蛋白酶的抑制剂PMSF，DFP能完全抑制该蛋白酶的活性，表明该蛋白酶为一种丝氨酸蛋白酶。EDTA，EGTA对该酶也能抑制，表明该蛋白酶的活性需要金属离子的参与。

5、分子量

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的此酶的分子量为40,000道尔顿。

6、稳定性

在4℃稳定性好。

碱性蛋白酶的使用方法

1、生皮浸水时酶的用法：用盐湿皮，进行皮回软。牛皮浸水时酶用量50U/g，山羊皮、绵羊皮、猪皮酶用量均为30U/g。鼓内温度18℃，液比3，加碳酸钠调节pH10，回软时间15h。

2、堆置酶法脱毛的用法：盐湿皮按上述浸水的条件浸水回软；滴干水后用于堆置酶法脱毛。牛皮、山羊皮、绵羊皮、猪皮堆置酶法脱毛过程中所采用的条件均是：温度18℃，用pH10的碳酸钠溶液稀释酶液，酶用量为100U/g，堆置16h，即可达到很好的脱毛效果。

3、碱性蛋白酶对皮软化的用法：经过浸水，脱毛、浸灰、复灰、脱灰后的皮在鼓内，温度38℃，pH10，软化2h，液比2，牛皮、山羊皮、绵羊皮软化的酶用量为100U/g，猪皮软化的酶用量为150U/g。

附图说明

图1、碱性蛋白酶BP-Ap42的最适反应pH值；

图2、碱性蛋白酶BP-Ap42最适反应温度；

实施例1、短小芽孢杆菌UN-31-C-42的培养

将菌株UN-31-C-42在含有酪蛋白0.5％，酵母膏0.3％，KH₂PO₄ 0.1％，K₂HPO₄ 0.2％，CaCl₂0.1％，MgSO₄.7H₂O 0.02％的培养基中，于37℃摇瓶培养48小时，将培养液10000rpm离心10分钟后取上清液。上清液的酶活为496U/ml。

实施例2、碱性蛋白酶BP-Ap42的纯化

将在实施例1中获得的培养物10000rpm离心10分钟后，取上清液，用20-70％饱和度的硫酸铵将此溶液进行分段盐析。将获得的沉淀溶解在20mM的磷酸缓冲液(pH6.8)，并用此缓冲液透析。然后在pH6.8下，将此溶液加入到CM-cellulofine C-52柱(Whatman公司)中，使用含0.1M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH6，8)洗脱。将酶活峰进行冷冻干燥，得到的干粉重新溶解在20mM磷酸缓冲液(pH6.8)中。将此溶液加入到Sepheadex G-75柱(Pharmacia公司)中，使用含0.1M Nacl的20mM磷酸缓冲液(pH6.8)洗脱，收集酶活峰。对此组分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，表明此酶为一条单一的带。

实施例3、碱性蛋白酶BP-Ap42的浸水试验

(1)首先，对碱性蛋白酶BP-Ap42和用于对照的AS1398蛋白酶活性进行了测定，反应底物是酪素(用硼砂缓冲液配制)，反应温度40℃，反应时间10min，其测定结果示于表2。

                            表2不同蛋白酶活性测定结果

-：未测酶活性

很显然，云南产的AS1398蛋白酶活性高于无锡产蛋白酶，因而对照试验时选用云南产的AS1398蛋白酶。

(2)皮浸水时酶浓度的确定

用盐湿皮，进行皮回软试验，其回软条件是：蛋白酶浓度10，30，50，70U/mL，鼓内温度18℃，液比3，加碳酸钠调节pH10，回软时间15h。

蛋白酶浓度对皮浸水效果的影响见表3。

                          表3蛋白酶浓度对皮浸水效果的影响

皮浸水效果+差，++一般，+++较好

表3结果表明，牛皮用50U/mL，其余3种皮用30U/ml的蛋白酶就能使皮达到快速浸水的要求。

加酶浸水后，皮的充水度较高，皮回软效果较理想。其中，山羊皮的回软增重比最高(表4)。

                          表4盐湿皮浸水前后增重比(千克)

实施例4、碱性蛋白酶BP-Ap42的堆置酶法脱毛试验

(1)碱性蛋白酶BP-Ap42用于堆置酶脱毛时最适pH值的确定

在本发明中，采用堆置酶法脱毛。脱毛用皮按上述确定的条件浸水回软，滴干水后待用。

堆置酶脱毛过程中所采用的条件是：温度18℃，用pH9，10，11的碳酸钠溶液按每克皮用200U的酶稀释酶液。

不同pH值对堆置酶法脱毛效果的影响见表5。在pH10条件下，猪皮的脱毛效果稍差，牛皮、绵羊皮和山羊皮的脱毛效果均很好。

                     表5pH值对堆置酶法脱毛效果的影响

脱毛能力：++++轻推即掉；+++重推可掉；++拔可掉；+用力拉可掉

-拉不掉(以下各表符号同此表)

(2)碱性蛋白酶BP-Ap42用于堆置酶脱毛时最适酶量的确定

为了获得堆置酶法脱毛时酶的最佳用量，采用的脱毛条件是：温度18℃，pH10，堆置12-16h，酶使用浓度为50，100，200U/g。酶浓度对堆置酶法脱毛效果的影响见表6。

                     表6酶浓度对堆置酶法脱毛效果的影响

从4种皮的脱毛效果来看，用200U/g酶浓度堆置16h，脱毛效果很好。

(3)BP-Ap42和AS1398蛋白酶在堆置酶法脱毛中的比较

BP-Ap42和用于对照实验的AS1398蛋白酶均用200U/g。实验用皮从背脊线对剖。脱毛条件：室温20℃，堆置15-24h；AS1398反应pH8；BP-Ap42反应pH10。

                    表7BP-Ap42和AS1398蛋白酶脱毛对比试验

重复试验结果表明：BP-Ap42的脱毛速度快，15h即可；AS1398一般要24h左右。BP-Ap42蛋白酶的猪皮脱毛效果稍逊于AS1398酶；对绵羊皮的脱毛两者差不多；对山羊皮和牛皮，BP-Ap42脱毛效果好，尤其是牛皮的脱毛效果更好。该蛋白酶脱毛的裸皮粒面效果较AS1398脱毛的皮洁白，细致，柔软，丝光感也较强。从感官和手感鉴定的各项指标来看，BP-Ap42脱毛效果优于AS1398。

整张皮的放大试验，每次50张，能较好地重复小试的结果。

(4)猪皮臀部和山羊皮颈部的脱毛试验

由于猪皮臀部和山羊皮颈部的毛难于脱尽，因而在堆置酶法脱毛前，先用BP-Ap42预处理。猪皮脱脂后用400U/g的BP-Ap42酶液包臀部4h，然后再用200U/g的BP-Ap42蛋白酶脱毛，这样既减少了部位差，又有助于臀部的脱毛。

山羊皮浸水后，用400U/g的BP-Ap42酶液涂领鬃部3h，再用200U/g的BP-Ap42蛋白酶脱毛，15h后整张皮的毛完全脱尽，领鬃部不留余毛，且背脊线不明显。

实施例5、碱性蛋白酶BP-Ap42对皮的软化试验

(1)皮软化时酶浓度的确定

经过浸水、脱毛、浸灰、复灰、脱灰后的皮，鼓内温度38℃，反应pH10，软化2h，酶用量为50，100，150，200U/g，液比2。

                  表8蛋白酶浓度对皮软化的影响

皮软化效果：+较差，++一般，+++较好

试验结果表明，猪皮软化用150U/g，牛皮和羊皮软化用100U/g即可。

(2)BP-Ap42和胰酶软化皮效果的比较

胰酶和BP-Ap42蛋白酶用量相同：猪皮150U/g，牛羊皮100U/g；温度38℃，软化2-3h(转停结合)，液比2，胰酶反应pH8，BP-Ap42反应pH10。对比结果示于表9。

              表9BP-Ap42蛋白酶和胰酶的皮软化对比试验

实施例6、酶法脱毛和软化成革的物性检测试验

由不同试验所获得的羊皮鞋面革和猪皮鞋面革进行皮革成品理化检验，结果示于表10和表11。

                        表10羊皮成革物性检测

*1.AS1398脱毛/BP-Ap42软化         4.BP-Ap42脱毛/BP-Ap42软化

2.AS1398脱毛/胰酶软化             5.BP-Ap42脱毛/胰酶软化

3.AS1398脱毛/不软化               6.BP-Ap42脱毛/不软化

羊皮测试结果表明：

(1)两种酶脱毛的皮均能达到了国标标准，但AS1398脱毛的皮(1，2，3)强度比BP-Ap42脱毛的皮(4，5，6)要低一些，说明AS1398对皮胶原的水解作用要强一些，相对来说，BP-Ap42的作用要缓和得多；

(2)同种酶脱毛后用不同的酶软化，可以看出不软化的皮(3，6)强度较高，胰酶软化的皮(2，5)较低，BP-Ap42软化的皮(1，4)稍高。说明胰酶对胶原的水解作用要强于BP-Ap42。

                          表11猪皮成革物性

*1.AS1398脱毛/BP-Ap42软化          4.BP-Ap42脱毛/BP-Ap42软化

2.AS1398脱毛/胰酶软化              5.BP-Ap42脱毛/胰酶软化

3.AS1398脱毛/不软化                6.BP-Ap42脱毛/不软化

猪皮的试验结果与羊皮大致相同，说明BP-Ap42蛋白酶脱毛作用强于AS1398；软化效果优于胰酶。

为了比较短小芽孢杆菌碱性蛋白酶和灰碱法脱毛对皮革物性的影响，我们对2种方法获得的羊皮进行了软化对比试验，结果示于表12。

                          表12软化对比试验

*1.BP-Ap42脱毛/胰酶软化            4.硫化碱脱毛/胰酶软化

2.BP-Ap42脱毛/BP-Ap42软化          5.硫化碱脱毛/BP-Ap42酶软化

3.BP-Ap42脱毛/不软化

两种脱毛方法的软化对比试验成革物性检测表明：

(1)硫化碱脱毛的皮革强度普遍高于BP-Ap42酶脱毛的皮革。说明酶对皮胶原的水解作用强于碱，针对不同的革品种如软革的生产，在制定工艺时可以考虑使用酶处理，以达到制造软革的目的；

(2)同种酶脱毛(1，2，3)不同酶软化，BP-Ap42酶软化的皮强度还是要比胰酶软化的高，这与表11，12的结论相一致。

由此可以说明，BP-Ap42蛋白酶确实也是一种良好的软化剂。

结论

(1)短小芽孢杆菌所产生的碱性蛋白酶BP-Ap42可用于制革过程中的浸水，脱毛和软化。浸水时间从常规的24小时缩短到15小时；脱毛效果彻底，毛孔清晰，粒面完整；用于软化时的皮面更洁白，柔软，粒面更细致，是一种优良的新型酶制剂。

(2)该碱性蛋白酶与AS1398蛋白酶在脱毛，软化上比较，脱毛更彻底，对胶原水解更弱，软化皮更柔软。

实施例7、羊皮鞋面革工艺方案

1、浸水：液比3.0，酶30U/g，鼓内温度为常温，时间12-15h，pH10；

2、堆置酶法脱毛：酶用量200U/g，pH10，常温，转15min，出鼓堆置15-24h，待毛脱完后水洗；

3、膨胀：NaOH 1％，Ca(OH)₂ 3％，液比3.0，常温，转60min，停鼓过夜；

4、复灰：Ca(OH)₂5％，转60min，水洗10min；

5、脱灰：液比2.5，32℃，(NH₄)₂SO₄ 2％转60min；

6、软化：液比1.2，38℃，pH10.0，BP-Ap42酶100U/g(浴液)，转120min；

7、浸酸：液比0.5，常温，食盐6％，转10min，甲酸1％(1∶10稀释)，转10min，硫酸1.2％(1∶10稀释，4×1/4)，转60min，pH2.5停鼓过夜，次日转30min，排液，约剩余1/3浸酸废液；

8、铬鞣：阳离子油1％，转20min，铬粉6％，NaAc 1％，转60min，检查全透。小苏打1.2％，分4次加入，每次转15min，至pH3.8，补加50℃热水至液比2.5，调节鼓内温度至38℃，转60min，停鼓过夜，次日转30min(pH3.8)，出鼓搭马24h；

9、片皮后削匀，然后修边；

10、回软：液比3.0，温度40℃，渗透剂0.3％，转120min，停鼓过夜；

11、复鞣：液比2.0，常温20℃，AA 3.0％，转30min，调节pH4.5，MB-14.0％，201 1.0％，转60min，铬粉4.0％，转90min，调节pH4.0，水洗10min，小苏打0.6％，甲酸钠1.0％，转60min，pH6.5，溴甲酚绿检查是否中和透，水洗20min；

12、染色加油：液比1.5，40℃，酸性黑ATT 1％，直接耐晒黑2％，转30min，补加水至液比2.0，调节鼓内温度55℃，201 12％，801 2％，L-3 3％，ST 2％，亚硫酸化鱼油1％，转60min，甲酸0.5％×2，每次转20min，pH3.8，水洗，出鼓搭马；

13、底涂：黑膏1％，BS-100 1.5％，302 2％，蜡0.2％；

14、中层：黑膏1％，络合黑0.1％，PUC-9702 0.8％，PUC-9703 1.5％，PUC-333 1.5％，蜡0.2％；

15、顶层：PUC-333 1.5％，蜡0.5％，手感剂0.01％，光亮剂0.03％；

注：浸水，脱毛，软化中调节pH均用碳酸钠。

实施例8、猪皮鞋面革工艺方案

1、浸水：液比3.0，常温，pH10，BP-Ap42酶30U/g(浴液)，转30min，停鼓过夜；

2、脱脂：液比2.5，32℃，纯碱4％，平平加4％，转60min；

3、浸碱：液比2.5，NaOH 1％，转30min，停鼓过夜；

4、脱碱：水洗10min，液比1.5，32℃，硫酸铵1％，转60min；

5、脱毛：BP-Ap42酶200U/g，pH10，滚酶30min，堆置15h；

6、软化：液比1.2，38℃，BP-Ap42酶100U/mL，转30min，水洗10min；

7、浸酸：液比0.5，常温，食盐6％，转10min，甲酸1％(1∶10稀释)，硫酸1.2％(1∶10稀释，4×1/4)，转60min，pH2.5，停鼓过夜，次日转30min；

8、铬鞣：倒去浸酸废液(留1/3)，阳离子油1％，转20min，铬粉6％，醋酸钠1％，转30min，检查全透。小苏打1.2％，分4次加入，每次转15min，pH3.8，补加50℃热水至液比2.5，调节鼓内温度38℃，转60min，停鼓过夜，次日转30min(pH3.8)，出鼓搭马24h；

9、片皮后削匀，然后修边；

10、回软：液比3.0，40℃，渗透剂0.3％，转120min，停鼓过夜，换液，液比2.5，40℃，渗透剂0.3％，甲酸0.5％，转30min；

11、复鞣：液比2.0，常温，AA3.0％，转30min，MB 4.0％，L-3 1.0％，转60min，铬粉4.0％，转90min，pH4.0，水洗10min；

12、中和：液比2.0，小苏打1.0％，醋酸钠0.6％，转60min，pH6.5(溴甲酚绿检查是否全透)水洗20min；

13、染色加油：液比2.0，55℃，酸性黑ATT 1％，直接耐晒黑2％，大红0.01％，转30min，201 6％，801 3％，L-3 6％，ST 2％，亚硫酸性鱼油1％，改性羊毛脂2％，转60min，甲酸0.5％×2/20min，pH3.8，水洗，出鼓。

注：浸水，脱毛，软化中调节pH均用碳酸钠。

本发明具有如下特点：

本发明发现脱毛反应不一定要多种蛋白酶参与，通过加入水、在机械作用和本发明蛋白酶的作用下就完全可以完成整个脱毛反应；并且本发明的蛋白酶不仅可以脱毛，而且可以使胶原纤维分散而达到使皮革软化的目的；也可用于浸水工艺。本发明的蛋白酶对猪皮、绵着皮和山羊皮和牛皮均具有良好的脱毛效果，对羊皮和牛皮的脱毛效果尤佳。采用本发明的蛋白酶的脱毛实验规模放大到50张/批时，效果依然非常好。利用本发明的蛋白酶进行的皮革软化试验表明：该蛋白酶对猪皮、羊皮和牛皮均具有良好的软化效果。软化的成革物性均达到国际标准。因此本发明的蛋白酶不仅解决了目前化学方法脱毛的污染问题，也克服了常规酶法脱毛的性能不稳定，易损伤皮胶原又不好操作的缺点，而且本发明的蛋白酶还可用于制革工业中的浸水工艺和软化工艺。

本发明蛋白酶活性高，作用条件温和，活性保持时间长，受环境因素影响少，可按常规方法分离纯化。产生本发明蛋白酶的微生物菌株，其培养基成份普通，培养方法简便。

Claims (5)

1.一种生产碱性蛋白酶的方法，其包括下列步骤：

在培养基中培养能够产生碱性蛋白酶的短小芽孢杆菌菌株(Bacillus pumilus)CGMCCNO.0518，并从培养基中回收所产生的碱性蛋白酶，其中所述碱性蛋白酶的特征是：

(1)仅使用此碱性蛋白酶可以进行不损伤生皮胶原而脱毛效果很好的脱毛；

(2)满足下列(a)-(d)所规定的至少一个条件：(a)在室温下，在1mM的EDTA作用下，剩余活力达14.7％；(b)在室温下，在1mM的EGTA作用下，剩余活力达12.7％；(c)在室温下，在1mM的二钾砷酸钠作用下，剩余活力达90.3％；(d)在室温下，在1mM的苯甲醚作用下，剩余活力达93.4％；

(3)此蛋白酶能水解蛋白质和肽；

(4)最适pH

在50℃下，pH9.6时酶活最高；

(5)稳定的pH范围

在50℃下，在pH6-pH11范围内酶活稳定；

(6)最适反应温度

该酶的最适反应温度为50℃；

(7)分子量

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的该酶的分子量为40,000道尔顿。

2.一种包括根据权利要求1的方法所制备的碱性蛋白酶的浸水脱毛软化剂。

3.生皮浸水的方法，其特征是用盐湿皮，浸水时使用含有根据权利要求1的方法所制备的碱性蛋白酶的浸水制剂，该酶用量为30U/g或50U/g，转鼓内温度18℃，液比3，加碳酸钠调节pH10，回软时间15h。

4.生皮脱毛的方法，其特征是用盐湿皮，按权利要求3的浸水条件浸水回软；滴干水后用于堆置酶法脱毛；脱毛过程中所采用的条件为：使用含有根据权利要求1的方法所制备的碱性蛋白酶的脱毛制剂，用pH10的碳酸钠溶液稀释酶液，该酶用量为100U/g，温度18℃，堆置16h。

5.制革中的软化工艺的方法，其特征是所说的方法具体步骤为：经过浸水、脱毛、浸灰、复灰、脱灰后的皮在转鼓内，使用含有根据权利要求1的方法所制备的碱性蛋白酶的软化制剂，该酶用量为100U/g或150U/g，温度38℃，pH10，软化2h，液比2。

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