JPH078993B2 - 洗浄剤組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアルカリプルラナーゼを含有する洗浄剤組成物
に関する。

〔従来の技術〕

洗浄剤に酵素を配合することは古くから実施されてい
る。洗浄剤中の酵素は洗浄補助剤として働き、例えば衣
料用洗浄剤においては、衣料に付着した各種の汚垢及び
シミを、また食器用洗浄剤においは、食器表面に残留す
る油脂類、蛋白質、澱粉等を分解ないしは変質させて除
去しやすくする機能を果す。

特に澱粉質の汚れを除去するために従来はα−アミラー
ゼが用いられており、α−アミラーゼ含有洗浄液に被洗
物を長時間浸漬しておくことにより澱粉質汚れに対する
洗浄力を向上させることができる。

また、本発明者らは、特定のプルラナーゼが、食器、繊
維などに強固に付着した澱粉質汚れに効果的に作用し、
洗浄力を顕著に向上せしめ得ることを見出した（特願昭
63−285424号）。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、自然界において従来見出されているプル
ラナーゼのほとんどが、中性なしい酸性領域において最
大かつ安定な酵素活性を示す、いわゆる中性もしくは酸
性プルラナーゼに分類されるものであるため、食器用洗
浄剤又は衣料用洗浄剤組成物に適する、すなわちアルカ
リ領域において最大活性を示すか、あるいはアルカリ耐
性を有するプルラナーゼ、いわゆるアルカリプルラナー
ゼ及びアルカリ耐性プルラナーゼの存在は、極めて少な
いのが実情である。

尚、ここでアルカリプルラナーゼとは、至適pHをアルカ
リ領域に有するものを言い、アルカリ耐性プルラナーゼ
とは、至適pHは中性から酸性領域に有するが、アルカリ
領域に於いても至適pHに於ける活性に比較して充分な活
性を有し、且つ安定性を保持するものを言う。また、中
性とはpH6〜８の範囲を言い、アルカリ性とはそれ以上
のpH範囲を言う。

従来、アルカリプルラナーゼとしては特公昭53−27786
号公報に記載されているもののみが知られている。しか
し、これは、アルカリ領域に至適pHを有する酵素であ
り、従来知られているプルラナーゼより基質特異性が広
い等の特徴を有してはいるが、至適pHが８〜９と弱アル
カリ領域にあるため、洗浄剤成分として使用するには適
さないという問題があった。また、酵素が不安定である
と同時に酵素の生産性が悪いという欠点も有しており、
工業的発酵生産に適うものではなかった。

〔課題を解決するための手段〕

このような実情において、本発明者らは洗浄剤成分とし
て好適な、より高pH側に至適pHを有し、しかも安定で生
産性も良好なアルカリプルラナーゼについて鋭意研究を
行った結果、下記のアルカリプルラナーゼがかかる要件
を満たすものであることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、次の酵素学的性質を有するアルカリ
プルラナーゼを含有することを特徴とする洗浄剤組成物
を提供するものである。

１） 作用 プルランのα−1,6グルコシド結合を分解してマルトト
リオースを生成する。また、澱粉、アミロペクチン、グ
リコーゲンまたはこれらの部分分解物のα−1,6グルコ
シド結合を加水分解する。

２） 基質特異性 α−1,6グルコシド結合で分岐した枝分かれ構造を有す
る糖のうち、マルトース以上の重合度を有する枝分かれ
構造を加水分解する。

３） 作用pH及び至適pH 作用pHはpH5〜11の範囲であり、至適pHは9.5〜11の範囲
である。

４） pH安定性 pH8〜10の範囲で極めて安定であり、pH7〜10.5の範囲に
於いても、50％以上の相対活性を有する（45℃、10分間
処理による）。

５） 作用温度範囲及び最適温度 10〜60℃の範囲で作用し、その最適作用温度は約50℃で
ある。

６） 温度安定性 40℃までは極めて安定である（pH9.5の10mMグリシン−
食塩−水酸化ナトリウム緩衝液中、30分間処理によ
る）。

７） 分子量 ソジウムドデシル硫酸電気泳動法による分子量は120,00
0±5,000である。

８） 金属イオンの影響 Hg²⁺,Cd²⁺,Mn²⁺及びPb²⁺で阻害される。

９） 界面活性剤の影響 直鎖アルキルベンゼンスルフォン酸ナトリウム、アルキ
ル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアル
キル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルフ
ォン酸ナトリウム、α−スルフォン化脂肪酸エステルナ
トリウム、アルキルスルフォン酸ナトリウム、ソジウム
ドデシル硫酸、石鹸及びソフタノール等の界面活性剤に
よって殆ど活性阻害を受けない。

10） キレート剤の影響 EDTA、EGTA、クエン酸及びゼオライトで殆ど活性阻害を
受けない。

11） プロテアーゼ耐性 アルカリプロテアーゼに対して強い耐性を有する。

本発明に用いられる上記アルカリプルラナーゼは、例え
ば好アルカリ性微生物の一種であるバチルス エスピー
（Bacillus sp.）KSM−AP1876（FERM P−10887）が産生
するものである。

この微生物は、次のような菌学的性質を有する。尚、以
下において菌株の分類に用いた培地は次の培地１〜21の
21種類であり、これらは何れも別滅菌した炭酸ナトリウ
ム（Na₂CO₃）を0.5重量％（以下、単に％という）含有
する。

使用した培地の組成（表示は％）： 培地1. ニュートリエントブロス,0.8;寒天末（和光純
薬製）,1.5 培地2. ニュートリエントブロス,0.8 培地3. ニュートリエントブロス,0.8;ゼラチン,20.0;
寒天末（和光純薬製）,1.5 培地4. バクトリトマスミルク,10.5 培地5. ニュートリエントブロス,0.8;KNO₃,0.1 培地6. バクトペプトン,0.7;NaCl,0.5;ブドウ糖,0.5 培地7. SIM寒天培地（栄研化学製），指示量 培地8. TSI寒天培地（栄研化学製），指示量 培地9. 酵母エキス,0.5;バクトペプトン,1.5;K₂HPO₄,
0.1;MgSO₄・7H₂O,0.02;可溶性澱粉,2.0;寒天末（和光純
薬製）,1.5 培地10. コーサー培地（栄研化学製），指示量 培地11. クリステンセン培地（栄研化学製），指示量 培地12. 酵母エキス,0.05;Na₂SO₄,0.1;KH₂PO₄,0.1;ブ
ドウ糖,1.0 酵母エキス,0.05;Na₂SO₄,0.1;KH₂PO₄,0.1;ブドウ糖,
1.0;CaCl₂・2H₂O,0.05;MnSO₄・４〜6H₂O,0.01;FeSO₄・7
H₂O,0.001;MgSO₄・7H₂O,0.02窒素源としては、硝酸ナト
リウム、亜硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム及びリン
酸アンモニウムをそれぞれ0.25％、0.2025％、0.158
％、0.195％となるように上記及びの培地に加えて
用いた。

培地13. キングＡ培地“栄研”（栄研化学製），指示量 培地14. キングＢ培地“栄研”（栄研化学製），指示量 培地15. 尿素培地“栄研”（栄研化学製），指示量 培地16. チトクローム・オキシダーゼ試験用瀘紙（日本
製薬製） 培地17. 3％過酸化水素水 培地18. バクトペプトン,0.5;酵母エキス,0.5;K₂HPO₄,
0.1;ブドウ糖,1.0;MgSO₄・7H₂O,0.02 培地19. バクトペプトン,2.7;NaCl,5.5;K₂HPO₄,0.3;ブ
ドウ糖,0.5;ブロモチモールブルー,0.06;寒天末（和光
純薬製）,1.5 培地20. （NH₄）₂HPO₄,0.1;KCl,0.02;MgSO₄・7H₂O,0.0
2;酵母エキス,0.05;糖,1.0 培地21.カゼイン,0.5;酵母エキス,0.5;ブドウ糖,1.0;K₂
HPO₄,0.1;MgSO₄・7H₂O,0.02;寒天末（和光純薬製）,1.5 〔菌学的性質〕 （ａ） 顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、1.0〜2.2μｍ×2.2〜4.4μｍの桿菌で
あり、菌体の一端に楕円形の内生胞子（0.8〜1.0μｍ×
1.0〜1.8μｍ）を作る。周鞭毛を有し運動性がある。グ
ラム染色は不定。抗酸性はない。

（ｂ） 各種培地に於ける生育状態 肉汁寒天平板培養（培地１） 生育状態は良い。集落の形状は円形であり、表面は円
滑、周縁は円滑又は波状である。

又集落の色調は乳白色半透明で光沢がある。

肉汁寒天斜面培養（培地１） 生育する。その状態は拡布状で光沢が有り、乳白色半透
明である。

肉汁液体培養（培地２） 生育する。

肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３） 生育状態は良い。ゼラチンの液化が認められる。

リトマスミルク培地（培地４） ミルクの凝固、ペプトン化は認められない。リトマスの
変色は培地がアルカリ性のため判定できない。

（ｃ） 生理学的性質 硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５） 硝酸塩の還元は陽性。脱窒反応は陰性。

MRテスト（培地６） 培地がアルカリ性のため判定できない。

VPテスト（培地６） 陰性。

インドールの生成（培地７） 陰性。

硫化水素の生成（培地８） 陰性。

澱粉の加水分解（培地９） 陽性。

クエン酸の利用 コーサー培地（培地10）で陰性。クリステンセン培地
（培地11）では陽性か陰性か判定できない。

無機窒素源の利用（培地12） 硝酸塩、アンモニウム塩、亜硝酸塩ともに利用する。

色素の生成（培地13,14） 陰性。

ウレアーゼ（培地15） 陰性。

オキシダーゼ（培地16） 陽性、陰性のどちらとも判断できない。

カタラーゼ（培地17） 陽性。

生育の範囲（培地18） 生育の温度範囲は20〜40℃、生育最適温度範囲は30〜35
℃であった。

生育のpH範囲はpH7〜10.5、生育最適pHはpH10であっ
た。

酸素に対する態度 好気的。

Ｏ−Ｆテスト（培地19） アルカリ性のため変色は判定できない。

好気状態でのみ生育する。

糖の利用性（培地20） Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトー
ス、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソルビ
ット、Ｄ−マンニット、グリセリン、デンプン、サリシ
ン、Ｄ−リボース及びデキストリンを利用する。

食塩含有培地に於ける生育（培地１を改変）食塩濃
度が５％では生育するが、７％で生育できない。

カゼインの分解（培地21） 陽性。

以上の菌学的性質に関する検討に基づき、バージーズ・
マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロ
ジー（Bergey's Mannual of Determinative Bacteriolg
y）第８版及びザ・ジーナス・バチルス（“The Genus B
acillus"Ruth,E.Gordon,Agriculture Handbook No.427,
Agricultural Research Service,U.S.Department of Ag
riculture Washington D.C.,（1973））を参照し、比較
検索した結果、本菌株は有胞子桿菌であるバチルス（Ba
cillus）属の一種であると認められる。しかし、本菌株
は中性領域では生育できず、専ら高pH領域で良好な生育
を示すことから、最近、HorikoshiとAkiba（“Alkaloph
ilic Microorganism",Japan Scientific Society Press
（Tokyo）,1982年刊）の主張している、所謂好アルカリ
性（Alkalophilic）微生物に属し、暫定的に、従来の中
性で生育するバチルス属細菌とは区別される。

更に、本菌株の菌学的性質は公知の好アルカリ性バチル
スのいずれとも一致しないので、これを新規菌株と判断
してバチルス エスピー KSM−AP1876と命名し、微工
研菌寄第10887号（FERM P−10887）として通産省工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託した。

上記の微生物を用いて本発明に使用される前記アルカリ
プルラナーゼを得るには、培地に微生物を摂取し、常法
に従って培養すればよい。また、培地中には、資化し得
る炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好
ましい。この炭素源及び窒素源は特に制限されないが、
例えば、窒素源としては、コーングルテンミール、大豆
粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、
ファーマメディア、肉エキス、トリプトン、ソイトン、
ハイプロ、アジパワー、ソイビーンミール、綿実油粕、
カルチベーター、アジプロン、ゼストなどの有機窒素源
及び硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、酢酸ア
ンモニウム等の無機窒素源が挙げられる。また炭素源と
しては、可溶性澱粉、不溶性澱粉、アミロペクチン、グ
リコーゲン、プルラン及びこれらの部分分解により生じ
た分岐オリゴ糖に加え、資化し得る炭素源、例えばグリ
コース、マルトース、アラビノース、キシロース、リボ
ース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、麦芽
糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、マンニット、ソルビ
ット、グリセリンや資化し得る有機酸、例えば酢酸など
が挙げられる。またその他、リン酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、
ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩や、必要であれ
ば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加すること
もできる。

斯くして得られた培養物中からの目的物質であるアルカ
リプルラナーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及
び精製の手段に準して行うことができる。即ち、遠心分
離または濾過等の通常の固液分離手段により菌体を培養
液から除去すれば、粗酵素液を得ることができる。この
粗酵素液は、そのまま使用することもできるが、必要に
応じて、塩析法、沈澱法、限界濾過法等の分離手段によ
り粗酵素を得、更に公知の方法により精製結晶化するこ
とにより精製酵素として使用することも可能である。

以下、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの精製
法の一例を挙げ、更に詳しく説明する。

アルカリ性バチルス属細菌KSM−AP1876株を、１％プル
ラン、0.2％トリプトン、0.1％酵母エキス、0.03％KH₂P
O₄、0.02％CaCl₂・2H₂O、0.1％（NH₄）₂SO₄、0.001％Fe
SO₄・7H₂O、0.0001％MnCl₂・4H₂O、0.02％MgSO₄・7H₂O
及び0.5％炭酸ナトリウムを含む培地で、30℃にて３日
間好気的に振盪培養し、得られる培養液から菌体を除
き、上澄液を得る。次いで、該上澄液にDEAE−セルロー
ス粉末を加え、上澄液中のプルラナーゼを完全にDEAE−
セルロースに吸着させる。次いで、10mMトリス−塩酸緩
衝液（pH8）で樹脂を洗浄した後、0.6Mの食塩を含む同
緩衝液で酵素を溶出する。更に、10mMトリス−塩酸緩衝
液（pH8）に対して透析濃縮後、同緩衝液で平衡化したD
EAE−セルロースDE52に吸着させ、同緩衝液を用いて０
〜1Mの食塩の濃度勾配により溶出し、その活性画分を集
め、平均分画分子量10,000の限外濾過膜を用いて濃縮し
た後、0.1M食塩を含む同緩衝液を用いて一夜透析する。
これを濃縮し、次いで透析後、0.1M食塩を含む同緩衝液
で平衡化したセファクリルＳ−200カラムに吸着後、0.1
M食塩を含む同緩衝液で溶出し、その活性画粉を集め、
更にDEAEトヨパール650Sカラムに吸着させる。吸着した
酵素を、10mMトリス−塩酸緩衝液（pH8）中、0.1〜1Mの
食塩の濃度勾配により溶出し、その活性画分を集める。
集められた活性画分を、限外濾過膜を用いて濃縮した
後、2M硫酸アンモニウムを含む同緩衝液で平衡化したブ
チル トヨパール650Sカラムに吸着させ、10mMトリス−
塩酸緩衝液（pH8）を用いて２〜0Mの硫酸アンモニウム
の濃度勾配により溶出し、その活性画分を集める。集め
られた活性画分を、限外濾過膜を用いて濃縮した後、同
緩衝液を用いて一夜透析する。斯くして得られる精製酵
素はポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度15％）
及びソジウムドデシル硫酸（SDS）電気泳動で単一のバ
ンドを与え、活性収率は約４％であった。

斯くして得られる、アルカリプルラナーゼの酵素化学的
諸性質について、以下に説明する。

尚、酵素活性の測定は次の緩衝液（各々10mM宛）を用
い、以下の方法に従って行った。

pH4〜６ 酢酸緩衝液 pH6〜８ リン酸緩衝液 pH8〜11 グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液 pH11〜12 塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液 酵素活性測定法： 各種緩衝液中にプルラン（反応系に於ける最終濃度は0.
25％）を溶解させた基質溶液0.9mlに、酵素液0.1mlを加
え、40℃で、30分間反応させた。反応後、3,5−ジニト
ロサリチル酸（3,5−dinitrosalicylic acid（DNS））
法にて、還元糖の定量を行った。即ち、反応液1.0mlにD
NS試薬1.0mlを加え、５分間、100℃で加熱発色させ、冷
却後、4.0mlの脱イオン水を加えて希釈し、波長535nmで
比色定量した。酵素の力価は、１分間に１μmolのグル
コースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位（1
U）とした。

（酵素学的諸性質） 作用 プルランのα−1,6グルコシド結合を分解してマルトト
リオースを生成する。また、澱粉、アミロペクチン、グ
リコーゲンまたはこれらの部分分解物のα−1,6グルコ
シド結合も加水分解する。

基質特異性 α−1,6グルコシド結合で分岐した枝分かれ糖のうち、
マルトース以上の重合度を有する枝分かれ構造の加水分
解する（表１）。

作用pH及び至適pH 作用pHをpH5〜11の範囲に有し、至適pHをpH9.5〜11の範
囲に有する。

尚、各pHにおけるプルラナーゼ活性を、0.25％プルラ
ン、10mM酢酸緩衝液（pH4〜６）、リン酸緩衝液（pH6〜
8.5）、グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
8.5〜11）及び塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液
（pH11〜12）の反応系を用い、40℃で30分間反応させて
測定した結果を第１図に示す。

pH安定性 pH8〜10で極めて安定であり、pH7〜10.5に於いても、約
50％以上の活性を維持する。

尚、各pHにおけるプルラナーゼ活性を、0.25％プルラ
ン、10mM酢酸緩衝液（pH4〜６）、リン酸緩衝液（pH6〜
8.5）、グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
8.5〜11）及び塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液
（pH11〜12）の反応系を用い、45℃で10分間反応させて
測定した結果を第２図に示す。

作用温度範囲及び最適温度 10℃〜60℃の広範囲で作用し、その最適作用温度は約50
℃に認められる（第３図）。

温度安定性 本酵素についてpH9.5の条件で温度を変化させ、各温度
で30分間処理することにより失活の条件を調べると、40
℃までは極めて安定であり、また、50℃に於いても約50
％以上の残存活性を有する（第４図）。

分子量 SDS電気泳動法（ゲル濃度7.5％）による分子量は約120,
000±5,000である。

金属イオンの影響 1mMのHg²⁺,Cd²⁺,及びMn²⁺で強く阻害され、Pb²⁺で若干
疎外された。

界面活性剤の影響 直鎖アルキルベンゼンスルフォン酸ナトリウム、アルキ
ル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアル
キル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルフ
ォン酸ナトリウム、α−スルフォン化脂肪酸エステルナ
トリウム、アルキルスルフォン酸ナトリウム、SDS、石
鹸、ソフタノール（登録商標）等の各種界面活性剤の0.
05％溶液で40℃にて15分間処理しても殆ど活性阻害を受
けない。

キレート剤の影響 キレート剤であるEDTA（10mM）、EGTA（10Mm）、クエン
酸（0.05％）及びゼオライト（0.05％）は殆ど活性を阻
害しない。

プロテアーゼ耐性 API−21（昭和電工社製）、マクサターゼ（IBIS社
製）、サビナーゼ、アルカラーゼ、エスペラーゼ（ノボ
社製）等のアルカリプロテアーゼを活性測定時に共存
（0.2AU/）させても、何れのプロテアーゼに対しても
強い耐性を有する。上記アルカリプルラナーゼは、本発
明洗浄剤組成物中に、通常0.1〜10重量％配合される。

なお、アルカリ又はアルカリ耐性プルラナーゼは、精製
酵素を用いてもよいし、培養液をそのまま粗製酵素とし
て用いてもよい。

本発明の洗浄組成物に配合される、その他の洗剤常用成
分は、特に限定は付されず、用途、目的に合わせて任意
に配合されてよい。以下、それらの配合成分について述
べる。

（１） 界面活性剤の配合量は特に限定されないが好ま
しくは0.5〜60重量％配合される。本発明の洗浄剤組成
物に用いることができる界面活性剤としては、陰イオン
性界面活性剤としては、アルキルベンゼンスルフォン酸
塩、アルキル又はアルケニルエーテル硫酸塩、アルキル
又はアルケニル硫酸塩、オレフィンスルフォン酸塩、ア
ルカンスルフォン酸塩、飽和又は不飽和脂肪酸塩、アル
キル又はアルケニルエーテルカルボン酸塩、α−スルホ
脂肪酸塩又はエステル、アミノ酸型界面活性剤、Ｎ−ア
シルアミノ酸型界面活性剤、アルキル又はアルケニル酸
性燐酸エステル、アルキル又はアルケニル燐酸エステル
又はその塩などが、両性界面活性剤としては、カルボキ
シ又はスルホベタイン型界面活性剤などが、非イオン界
面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル又は
アルケニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェ
ニルエーテル、高級脂肪酸アルカノールアミド又はその
アルキレンオキサイド付加物、ショ糖脂肪酸エステル、
脂肪酸グリセリンモノエステル、アルキルアミンオキサ
イド、アルキルグリコシドなどが、カチオン性界面活性
剤としては、第四級アンモニウム塩などが例示される。

本発明の洗浄剤組成物を自動食器洗浄機用洗剤として用
いる場合は界面活性剤としては、低泡性乃至無泡性の非
イオン性界面活性剤が好ましい。この種の界面活性剤の
例としてはアルコキシ化非イオン性界面活性剤（このア
ルコキシ部はエチレンオキサイド、プロピレンオキシド
及びその混合物からなる群から選ばれたものである）が
挙げられる。このような界面活性剤の具体例としては、
BASFジャパン社の“Plurafac（登録商標）LF403"、“Pl
urafac LF1300"及び日本触媒化学工業（株）の“ソフタ
ノールEP7045"（登録商標）等が挙げられる。本発明の
洗浄剤組成物を自動食器洗浄機用洗剤として用いる場
合、界面活性剤は組成物中に0.5〜30重量％配合される
ことが好ましい。

（２） 炭酸塩、重炭酸塩、珪酸塩、ホウ酸塩、アルカ
ノールアミンなどのアルカリ剤あるいは硫酸塩などの無
機電解質は、普通０〜90重量％配合される。

（３） トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルトリン
酸塩等のリン酸塩、エタン−1,1−ジホスホン酸塩等の
ホスホン酸の塩、２−ホスホノブタン−1,2−ジカルボ
ン酸等のホスホノカルボン酸の塩、アスパラギン酸、グ
ルタミン酸等のアミノ酸の塩、ニトリロ三酢酸塩、エチ
レンジアミン四酢酸塩等のアミノポリ酢酸塩、ポリアク
リル酸、ポリアコニット酸等の高分子キレート剤、シュ
ウ酸、クエン酸等の有機酸の塩、アルミノ珪酸塩などの
二価金属イオン捕捉剤は、組成物中に普通０〜50重量％
配合される。

（４） 過炭酸ソーダ、過ホウ酸ソーダ、次亜塩素酸ソ
ーダ、ジクロルイソアル酸などの漂白剤は０〜85重量％
配合される。

（５） その他の少量成分として、ポリエチレングリコ
ール、カルボキシメチルセルロース等の再汚染防止剤、
プロテアーゼ、リパーゼ、α−アミラーゼ、セルラーゼ
等の酵素、亜硫酸塩等の酵素失活防止剤、螢光染料、青
味付剤、色素、ケーキング防止剤、可溶化剤、酵素ある
いは漂白剤の活性化剤、金属腐食防止剤などを必要に応
じて配合することができる。

本発明に使用し得るプロテアーゼの例としては、バチル
ス・ズブチリスやバチルス・リケニフォルミス等、特定
の菌株から得られるズブチリシンが挙げられる。これら
の例としてはギスト社から販売されている“マクサター
ゼ”（登録商標）、ノボ・インダストリー社の“アルカ
ラーゼ”（登録商標）、“エスペラーゼ”（登録商標）
及び“サビナーゼ”（登録商標）などが挙げられる。

また、本発明に使用し得るα−アミラーゼの例として
は、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・ズブチリ
ス等から得られたものが挙げられ、市販品の例としてノ
ボ・インダストリー社の“ターマミル”（登録商標）、
ギスト社の“マキサミル”（登録商標）等が挙げられ
る。

本発明の洗浄剤組成物を自動食器洗浄機用洗剤として用
いる場合、前記各成分以外のバランス成分としては、粉
末組成物の場合、無機アルカリ剤を用いるのが好まし
い。無機アルカリ剤としては、例えばピロリン酸ナトリ
ウム、オルトリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリ
ウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、セスキ炭酸
ナトリウム、ホウ砂、珪酸ナトリウムなとが挙げられ
る。特に、珪酸酸ナトリウムは金属腐食防止作用を有す
るので、これを他のアルカリ剤と併用するのが望まし
い。この場合、他のアルカリ剤35〜85重量％及び珪酸ナ
トリウム（SiO₂/Na₂O比が1/1〜4/1、好ましくは2/1〜2.
5/1）２〜15重量％を併用するのが最も好ましい。無機
アルカリ剤は、0.05〜１重量％濃度の洗剤溶液がpH9.0
〜11.0になるように配合量を調整する。液体の場合は、
バランス成分は水である。

また、自動食器洗浄機用洗剤には、銅腐食防止剤として
炭化水素鎖長が８〜18程度である脂肪酸や、ベンゾトリ
アゾール等を添加することも効果的である。

また、多くの洗浄剤について無リン洗剤が主流である現
在、環境問題の点からリン酸塩含有洗剤は社会的は問題
になりかねない。そこで、自動食器洗浄機の普及に伴
い、各種汚れに対する洗浄力を低下することなく無リン
化することも重要である。

無リン化する際には、二価金属イオン捕捉剤として、次
の一般式（Ｉ）で表わされるヒドロキシ多価カルボン酸
又はその水溶性塩を使用するのが好ましい。

（式中、Ｘは−Ｈ、−CH₃、−CH₂COOH又は−CH（OH）CO
OHを、Ｙは−Ｈ又は−OHを表す） この中でも、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸又はそれらの
水溶性塩が好ましい。かかる塩としては、ナトリウム
塩、カリウム塩、モノエタノールアミン塩、ジエタノー
ルアミン塩、トリエタノールアミン塩等が例示される。

このような成分は、本発明洗浄剤組成物中に0.5〜30重
量％配合するのが好ましい。

また、更に二価金属イオン捕捉剤として高分子キレート
剤１〜10重量％を併用するのが好ましい。高分子キレー
ト剤としては、特開昭57−145199号公報に記載されてい
るような二価金属イオン捕捉高分子電解質が例示できる
が、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、アクリル酸
メタクリル酸共重合体、それらの水溶性塩等が挙げら
れ、平均分子量は1,500〜100,000、特に、3,000〜20,00
0のものが好ましい。

本発明の洗浄剤組成物は、上記成分を常法に従って混合
し、粉末状、顆粒状又は液状の衣料用、食器用、住居用
等の洗浄剤として使用することができる。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明は
これらに限定されるものではない。

製造例１ （１） 神奈川県横浜市の土壌を薬匙一杯（約0.5g）、
滅菌生理食塩水に懸濁し、80℃で15分間熱処理した。こ
の熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天培地
（培地Ａ）に塗布した。次いで、これを30℃にて３日間
培養し、集落を形成させた。集落の周囲にプルランの溶
解に基づく透明帯を形成するものを選出し、プルラナー
ゼ生産菌を取得した。更に、取得菌を培地Ｂの液体培地
に接種し、30℃で３日間振盪培養した。培養後、遠心分
離した上清液について、プルラナーゼ活性をpH10にて測
定し、アルカリプルラナーゼ生産菌をスクリーニングし
た。

上述の方法により、アルカリプルラナーゼ生産菌バチル
ス エスピー KSM−AP1876（FERM P−10887）を取得す
ることが出来た。

培地A.プルラン 0.8％ 着色プルラン 0.2％ ポリペプトン 0.2％ 酵母エキス 0.1％ KH₂PO₄ 0.03％ （NH₄）₂SO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.02％ CaCl₂・2H₂O 0.02％ FeSO₄・7H₂O 0.001％ MnCl₂・4H₂O 0.0001％ 寒天 1.5％ Na₂CO₃ 0.5％ pH10.0 培地B.プルラン １ ％ トリプトン 0.2％ 酵母エキス 0.1％ KH₂PO₄ 0.03％ （NH₄）₂SO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.02％ CaCl₂・2H₂O 0.02％ FeSO₄・7H₂O 0.001％ MnCl₂・4H₂O 0.0001％Na₂CO₃ 0.5％ pH10.0 （２） アルカリプルラナーゼ生産菌であるバチルスエ
スピー KSM−AP1876株を参考例１の液体培地Ｂに接種
し、30℃で３日間振盪培養した。培養後、菌体を遠心分
離して除き、粗プルラナーゼ酵素液とした。更に、通常
の方法に従って、エタノール乾燥粉末とし、以下の表２
に示す粗酵素標品を得た。なお、表２の酵素活性はpH9
に於ける測定値である）。

（３） （２）で得られた粗酵素液について、DEAEセ
ルロース吸着、DEAEセルロース（ワットマン社製）ク
ロマトグラフィー、セファクリル（ファルマシア社
製）クロマトグラフィー、DEAEトヨパール（東洋曹達
社製）クロマトグラフィー、ブチル トヨパール（東
洋曹達社製）クロマトグラフィーをすることによって精
製を行い、アルカリプルラナーゼを得た。

得られたアルカリプルラナーゼについてデービス（Davi
s D.J.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,121,404（1964））の方法に
従って電気泳動を行った後、コマシー・ブリリアント・
ブルーで染色して単一のバンドを与えることを確認した
（第５図）。

（４） （３）で得られたアルカリプルラナーゼについ
て常法に従い、SDS電気泳動を行った（第６図）。この
結果から、本酵素の分子量は120,000±5,000であった。

実施例１（自動食器洗浄機用洗浄剤） 本実施例で採用した洗浄条件、洗浄力試験及びその結果
は次の通りである。

（１） 洗浄条件 使用洗浄機；松下電器（株）製全自動食器洗い機（機種
NP−600） 洗浄剤水溶液が回転ノズルから噴射され、その噴射軌道
上面に設置された食器類を洗浄する形式のもの。

洗浄温度;5℃から55℃まで徐々に昇温する。

洗浄用水；硬度3.5゜DHの水 洗浄濃度;0.2％ 洗浄時間；洗浄20分，すすぎ20分 洗浄時の循環水量;2.5 （２） 洗浄力の評価 澱粉汚れの汚染皿及び評価方法 （汚染皿） 白玉と米飯を9:1で混合し、これに等量の水道水を加え
ミキサーで混合する。この汚れ4gを直径22cmの磁性の皿
に均一に塗布し、一昼夜風乾する。

以上の汚染皿３枚を洗浄試験に供した。

（澱粉汚れ洗浄力評価方法） 澱粉の残存を、ヨウ素の呈色反応によって生じる青色部
分面積（P₁）を写真判定によって測り、以下初期の汚染
面積（S₀）から洗浄率を下の式によって求めた。

洗浄率＝〔（S₀−P₁）/S₀〕×100 （３） 洗浄組成 ソフタノールEP7045（日本触媒化学工業（株）製）2 クエン酸ナトリウム 20 １号珪酸ナトリウム ５ 酵素 表３ 炭酸ナトリウム バランス （注）数字は重量％を示す。

ただし酵素は洗剤中の活性で示す。

（４） 洗浄力試験結果 試験結果を表３に示す。

表３中の酵素活性は、以下の方法で測定した。

プルラナーゼ２種については、10mMグリシン−食塩−水
酸化ナトリウム緩衝液（pH9.0）中にプルラン（反応系
における最終濃度は0.25％）を溶解させた基質溶液0.9m
lに、酵素液0.1mlを加え40℃で30分間反応させる。

また、ターマミル60Tについては、10mMグリシン−食塩
−水酸化ナトリウム緩衝液（pH9）中に可溶性澱粉（反
応系における最終濃度は0.25％）を溶解させた基質溶液
0.9mlに、酵素液0.1mlを加え50℃で、15分間反応させ
る。

反応後、3,5−ジニトロサリチル酸（3.5−dinitrosalic
ylic acid（DNS））法にて、還元糖の定量を行った。即
ち、反応液1.0mlにDNS試薬1.0mlを加え、５分間、100℃
で加熱発色させ、冷却後、4.0mlの脱イオン水を加えて
希釈し、波長535nmで比色定量した。酵素の力価は、１
分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成す
る酵素量を１単位（1U）とした。

実施例２（衣料用洗浄剤） 本実施例で採用した洗浄条件、洗浄力試験及びその結果
は次の通りである。

（１） 人工汚染布 白玉と米飯を9:1で混合し、水道水で２倍に希釈しミキ
サーにかける。この液を木綿布10cm×10cmの試験片に布
の重量の2.5〜５％になるように塗布する。20℃、24時
間乾燥し、実験に供した。

（２） 洗浄条件及び方法 ４゜DH硬水に洗剤を溶解し、0.665％洗剤水溶液１を
調整する。木綿人工汚染布５枚を洗剤水溶液に添加し、
40℃で１時間静置後、洗剤溶液と人工汚染布をそのまま
ターゴトメーター用ステンレスビーカーに移し、ターゴ
トメーターにて100rpm、20℃、10分間攪拌洗浄する。流
水下ですすいだ後、20℃、24時間乾燥し、重量測定に供
した。

（３） 洗浄力の評価 洗浄前の原布及び洗浄前後の汚染布の重量を測定し、次
式によって洗浄率（％）を算出した。

表４中の各洗浄率の値は５枚の平均値を示した。

（４） 洗剤組成 直鎖ドデシルベンゼンスルフォン酸ソーダ 15 アルキルエトキシ硫酸ソーダ（C₁₄〜C₁₅,▲▼＝3mo
l） ５ 4A型ゼオライト 15 ケイ酸ソーダ 15 炭酸ソーダ 15 ポリアクリル酸ソーダ（▲▼＝8000） 1.5 ポリエチレングリコール（▲▼＝6000） 1.5 酵 素 表４ 螢光染料 0.5 芒 硝 残量 水 ５ （注）数字は重量％を示す。

ただし酵素は洗剤中の活性を示す。

（５） 洗浄力試験結果 試験結果を表４に示す。

なお表４中の酵素活性の測定は、表３に準じて行った。

〔発明の効果〕

以上のように、本発明の洗浄剤組成物は、通常の洗浄時
間内において、澱粉質汚れに対する優れた洗浄力を有す
るものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
反応pHと相対活性との関係を示す図面である。 第２図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
処理pHと残存活性との関係を示す図面である。 第３図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
反応温度（pH9.5）と相対活性との関係を示す図面であ
る。 第４図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
処理温度（pH9.5）と残存活性との関係を示す図面であ
る。 第５図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
電気泳動の結果を示す図面である。 第６図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
SDS電気泳動の結果を示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/44 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 出口 勝彦 栃木県宇都宮市石井町3413―107 (56)参考文献 特開 平３−87177（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の酵素学的性質を有するアルカリプルラ
   ナーゼを含有することを特徴とする洗浄剤組成物。 １） 作用 プルランのα−1,6グルコシド結合を分解してマルトト
   リオースを生成する。また、澱粉、アミロペクチン、グ
   リコーゲンまたはこれらの部分分解物のα−1,6グルコ
   シド結合を加水分解する。 ２） 基質特異性 α−1,6グルコシド結合で分岐した枝分かれ構造を有す
   る糖のうち、マルトース以上の重合度を有する枝分かれ
   構造を加水分解する。 ３） 作用pH及び至適pH 作用pHはpH5〜11の範囲であり、至適pHは9.5〜11の範囲
   である。 ４） pH安定性 pH8〜10の範囲で極めて安定であり、pH7〜10.5の範囲に
   於いても、50％以上の相対活性を有する（45℃、10分間
   処理による）。 ５） 作用温度範囲及び最適温度 10〜60℃の範囲で作用し、その最適作用温度は約50℃で
   ある。 ６） 温度安定性 40℃までは極めて安定である（pH9.5の10mMグリシン−
   食塩−水酸化ナトリウム緩衝液中、30分間処理によ
   る）。 ７） 分子量 ソジウムドデシル硫酸電気泳動法による分子量は120,00
   0±5,000である。 ８） 金属イオンの影響 Hg²⁺,Cd²⁺,Mn²⁺及びPb²⁺で阻害される。 ９） 界面活性剤の影響 直鎖アルキルベンゼンスルフォン酸ナトリウム、アルキ
   ル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアル
   キル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルフ
   ォン酸ナトリウム、α−スルフォン化脂肪酸エステルナ
   トリウム、アルキルスルフォン酸ナトリウム、ソジウム
   ドデシル硫酸、石鹸及びソフタノール等の界面活性剤に
   よって殆ど活性阻害を受けない。 10） キレート剤の影響 EDTA、EGTA、クエン酸及びゼオライトで殆ど活性阻害を
   受けない。 11） プロテアーゼ耐性 アルカリプロテアーゼに対して強い耐性を有する。
2. 【請求項２】アルカリプルラナーゼが、バチルス （Bacillus）属に属する微生物の培養物より分離取得さ
   れたものである請求項１記載の洗浄剤組成物。
3. 【請求項３】微生物が、バチルス エスピー（Bacillus
   sp.）KSM−AP1876と命名され、微工研菌寄第10887号と
   して寄託されたものである請求項２記載の洗浄剤組成
   物。