WO1988005819A1 - ADN DE PLASMIDES RECOMBINANT pPR-IFNbeta1-13, CODANT POUR LA SYNTHESE D'INTERFERON-beta1 DE FIBROBLASTE HUMAIN, PROCEDE POUR SA CONSTRUCTION ET SOUCHE DE BACTERIES ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFNbeta1-13) A TITRE DE PRODUCTEUR D'INTERFERON-beta1 HUMAIN, LE CONTENANT - Google Patents
ADN DE PLASMIDES RECOMBINANT pPR-IFNbeta1-13, CODANT POUR LA SYNTHESE D'INTERFERON-beta1 DE FIBROBLASTE HUMAIN, PROCEDE POUR SA CONSTRUCTION ET SOUCHE DE BACTERIES ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFNbeta1-13) A TITRE DE PRODUCTEUR D'INTERFERON-beta1 HUMAIN, LE CONTENANT Download PDFInfo
- Publication number
- WO1988005819A1 WO1988005819A1 PCT/SU1988/000033 SU8800033W WO8805819A1 WO 1988005819 A1 WO1988005819 A1 WO 1988005819A1 SU 8800033 W SU8800033 W SU 8800033W WO 8805819 A1 WO8805819 A1 WO 8805819A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- gene
- dηκ
- ppr
- interferon
- ρρκ
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
Definitions
- the area of technology is not limited to the field of genetic engineering and biotechnology, and more specifically.
- the synthesizer used in this case provides an intricate mixture of its various products and functions, which is a result of a complicated operation. This essentially complicates the following properties of individual interactions. ⁇ connection with it more and more
- the appliance receives the input of individual components from the microprocessor-friendly synthesis.
- the invention is also a method of combining a p-combination plasmid for D- ⁇ ⁇ 13 ⁇ -13, which is also true for ⁇ ⁇ 24 north,
- the indicated, the wiring is also the headquarters of the Bacterium ⁇ Igenetica ⁇ 903 ( ⁇ - ⁇
- the strain is claimed to ensure that the person is safe to eat and / or to eat and / or drink;
- the method of eliminating the declared industrial requirement for the maintenance of ⁇ > 1-13 is not limited to several stages.
- the ⁇ - ⁇ zh 1> 1-123 means that the proximity of the ST-sequential gene is closed for the second / second gene
- the transformer will receive cells ⁇ . ⁇ ⁇ ⁇ 600, which eliminates the stress on the medium with an amperage with a direct voltage and a voltage of 28 ° ⁇ .
- the battery is suitable for a temperature range of 5 to 40 ° C (optimum 35 ° C) for 6.7-7.5.
- ⁇ ⁇ aches ⁇ ve is ⁇ chnzh ⁇ a ugle ⁇ da and ⁇ lzuyu ⁇ amin ⁇ zhsl ⁇ y w uglev ⁇ dy (na ⁇ ime ⁇ , sa ⁇ a ⁇ zu) 20 Is ⁇ chni ⁇ m az ⁇ a m ⁇ gu ⁇ sluzhi ⁇ mzhne ⁇ alnye s ⁇ li in nzhyn ⁇ y ⁇ me atm and ⁇ a ⁇ zhe ⁇ ganzhches ⁇ zhe s ⁇ edzhenzhya in vzhde ⁇ e ⁇ na, ⁇ zh ⁇ na, d ⁇ zhzhev ⁇ g ⁇ e ⁇ s ⁇ a ⁇ a w amin ⁇ isl ⁇ Us ⁇ ychzhv ⁇ s ⁇ ⁇ an ⁇ zhbzh ⁇ zh ⁇ am.
- the strain is stable to concentrate up to 100 mg / l and shruzhzhvanzhi 25 burned on agazirovannyh nutritional
- Plasma stability P ⁇ zh ⁇ anenzhzh ⁇ le ⁇ on ar ⁇ iz ⁇ vann ⁇ y s ⁇ ede (s ⁇ m I d ⁇ months) ⁇ i se ⁇ zhzh ⁇ sl d ⁇ va ⁇ elny ⁇ ⁇ e ⁇ esev ⁇ v (in ⁇ echenie at least 6 months) in ⁇ tsesse glubzhnn ⁇ g ⁇ ⁇ ul ⁇ ivzh ⁇ vanzhya in zhzhd ⁇ y s ⁇ ede 30 an ⁇ zhbi ⁇ zh ⁇ m not ⁇ zhs ⁇ di ⁇ ⁇ e ⁇ i Well ⁇ e ⁇ es ⁇ y ⁇ zh ⁇ lazm dy.
- Phase I In fact, even less than the last plasmid is 12 V.
- 2 mcg of the plasmid ⁇ 24 24 enlarges the local distribution of excrement in 40 flop of the isolation buffer ⁇ .
- the accessory 3--parts of the participants of the Département I ⁇ . s ⁇ in ⁇ be ⁇ bem ⁇ m m ⁇ l 20, 10 s ⁇ de boiling m ⁇ ⁇ is- ⁇ S ⁇ , ⁇ 8,0, 10 m ⁇ m ⁇ 2, 2 m ⁇ g ⁇ e ⁇ a D ⁇ , ⁇ 30 m ⁇ dez ⁇ si ⁇ zhb ⁇ nu ⁇ le ⁇ zzhd ⁇ zh ⁇ s ⁇ a ⁇ v 5 edzh ⁇ e ⁇ men ⁇ a.
- Two of the reactive mixtures transfer ethane and dissolve in 100 ⁇ l ⁇ ⁇ ⁇ .
- the resulting mixture is the translucent bore gasket of the C600 C600.
- the accessory of the transformer was composed up to 5 » 10 at the same level as the first one at a time ⁇ 24. It obstructs clones that are stable for amplification (100 mcg / ml), but they also emit a separate module for modifying
- the received message also contains a fragment ( ⁇ ⁇ mulegi ⁇ ) that burns into the receiver ⁇ 24 ⁇ .
- the obtained product is in the range of 150 ⁇ l, containing 50 mt of trap-n ⁇ terrorism, ⁇ 8.0, 10 mk ⁇ of ethylenejaminetetus, as a result
- the remote end participants have been remotely operated by an end user of 100 ⁇ l, which is 2 at a time.
- the nucleotide installed by the method of Sengar, the investigation of the hybrid participation of the communal food in the structure of the device, is the following:
- Shamazmidu ⁇ ⁇ - ⁇ / 31-13 which supports the synthesis of a human being, has an analogous connection to the bathroom, which is included in the manual
- 35 ⁇ 903 is around 10 slots on the 1st week of August - 16 - ⁇ ⁇ whatsoever ⁇ Operations ⁇ - ⁇ - ⁇ . Particles are removed from a medium containing amperage (100 ⁇ g / ml) after a fresh bulb is removed at a temperature of 28 ° C. From all the oblique, they isolate plasmid DB
- the facility is equipped with a fully equipped facility.
- the medium is available at 100 ⁇ g / ml and 10 g / l glucose.
- the seed crop is introduced in the range of 5-10 ma.
- the 25th is the level of supply of ammonia water. Part Pe ⁇ vuyu ⁇ e ⁇ men ⁇ atszhzh ⁇ v ⁇ dya ⁇ ⁇ zh ⁇ em ⁇ e ⁇ a ⁇ u ⁇ e 28 ° C d ⁇ ⁇ zhches ⁇ ⁇ l ⁇ n ⁇ s ⁇ zh, ⁇ avn ⁇ y 3.5 ⁇ i 550 nm and za ⁇ em ⁇ susches ⁇ vlyayu ⁇ ⁇ e ⁇ d ⁇ zhndu ⁇ zhyu, ⁇ vyshaya ⁇ em ⁇ e ⁇ a ⁇ u ⁇ u d ⁇ 42-45 ° C in a 5 ⁇ echenzh mzhn, ⁇ sle cheg ⁇ ⁇ d ⁇ lzhayu ⁇ ⁇ e ⁇ len ⁇ atszhyu still chasa 2 ⁇
- Zayavlyaemyzh sh ⁇ amm ba ⁇ e ⁇ y ⁇ zs ⁇ eg ⁇ s ⁇ and s ⁇ ⁇ IIgene ⁇ i ⁇ a ⁇ ⁇ 903 ( ⁇ - ⁇ Y ⁇ - ⁇ z> - ⁇ dutsen ⁇ /> 1-iya ⁇ e ⁇ e ⁇ on chel ⁇ ve ⁇ a na ⁇ di ⁇ ⁇ zhmenenie in mi ⁇ bi ⁇ l ⁇ giches ⁇ y and meditsins ⁇ y ⁇ myshleyan ⁇ s ⁇ i ⁇ lucheniya for 1 h 15 in ⁇ e ⁇ e ⁇ na l ⁇ ve ⁇ a, ⁇ y m ⁇ zhe ⁇ ⁇ imenya ⁇ sya in meditsins ⁇ y ⁇ a ⁇ i ⁇ e .
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
- 1 -
ΡΕΚΟΜБИΗΑΗΤΗΑЯ Ι ЗΜИДΗΑЯ ДΗΚ ρΡΗ-ΙΕΝуЭ 1-13, ΚΟДИΡУЮЩΑЯ СИΗΤΕЗ ΦИБΡΟБЛΑСΤΗΟГΟ β1-ИΗΤΕΡΦΕΡΟΗΑ ЧΕЛΟΒΕΚΑ, СПΟСΟБ ΕΕ ΚΟΗСΤΡУИΡΟΒΑΗИЯ И ШΤΑΜΜ ΕΑΚΤΕΡИИ Ε50ΗΕΗΙСΗΙΑ СΟЫ ΒΗИИГΕΗΕΤИΚΑ 5 νЬ903 (ρΡΗ-ΙΜ^-ΙЗ)-ПΡΟДУЦΕΗΤ β 1-ИΗΤΕΡϊΕΡΟΗΑ ЧΕЛΟΒΕΚΑ, СΟДΕΡЖΑЩИЙ ΕΕ
Οбласτь τеχниκи Ηасτοящее изοбρеτение οτнοсиτся κ οбласτи геннοй инженеρии и биοτеχнοлοгии, а τοчнее. κ нοвοй ρеκοмбина 10 нοй πлазмиднοй ДΗΚ ρΡΗ-ϊшузι-ιз , κοдиρующей синτез ροбласτнοгο я-инτеρφеροна челοвеκа, сποсοбу ее ποлу яия и шτамму баκτеρий Εзс1ιег:1с1ι1а сοϋ ΒΗИИгенеτиκа νъ 903 (ρΡΚ-ϊΡΝβϊ* з)-προдуцеяτу & 1-инτеρφеροна челο κа, сοдеρжащему ее.
.15 Пρедшесτвующий уροвень τеχниκи
Инτеρφеροны - белκи, синτезиρуемые сπециализиροв ными κлеτκами челοвеκа в οτвеτ на виρусную инφеκцию и дейсτвие ρазличныχ индуκτοροв. Имеющиеся в насτοящее вρемя эκсπеρименτальные даняые свидеτельсτвуюτ ο προτ
20 вοвиρуснοм, анτиπροлиφеρаτивнοм и 'имгνϊуннοмοдулиρующем дейсτвии инτеρφеροна πρи οбρабοτκе им индивидуальныχ τοκ, τκаней и ορганизма в целοм. Пο свοей унивеρсальнο сτи и значимοсτи для ορганизма сисτема инτеρφеροна сρа нима с сисτемοй иммуниτеτа. Β сοοτвеτсτвии с анτигенны
25 ми, биοлοгичесκими и χимичесκими свοйсτвами, а τаκже в зависимοсτи οτ τиπа κлеτοκ, иχ προдуциρующиχ, ияτеρφеρ ны челοвеκа ποдρазделяюτся на τρи гρуππы: ο -лейκοциτ ные, (Ъ -φибροбласτные, γ -иммунный, κοτορые выρабаτ ваюτся в οснοвнοм κлеτκами лейκοциτοв, φибροόласτοв и
30 Τ-лимφοциτοв сοοτвеτсτвеняο.
Β насτοящее вρемя сπеκτρы πρименеяж инτеρφеροнοв в медицине в οснοвнοм οπρеделены. Эτο κеρаτиτы и деρ- маτοзы, лечение ρесπиρаτορныχ инφеκций, вызванныχ ρаз-
- 2 - личными виρусами (гρиππ, аденοвиρусы) , геπаτиτы Β и дρуше.
Οднаκο меχанизм дейсτвия инτеρφеροнοв, иχ сτρуκτу нο-φунκциοнальные οсοбеннοсτи и κлинжчесκий ποτенциал
5 исследοваны еще недοсτаτοчнο. Эτο вο мнοгοм связанο с τρуднοсτью ποлученжя πρеπаρаτивныχ κοличесτв чисτыχ инτеρφеροнοв τρадиπжοнными меτοдаш, οснοванными на ис ποльзοванж в κачесτве исτοчниκа эτοгο белκа индуциροв ныχ κульτуρ κлеτοκ челοвеκа. Κροме τοгο, κаκ πρавилο,
Ю синτезиρуемый в эτοм случае инτеρφеροн πρедсτавляеτ сο бοй слοжную смесь егο ρазличныχ ποдτиποв и φορм, ρазли чающиχся πο сτρуκτуρнο-φунκцжοнальным χаρаκτеρисτиκам. Эτο сущесτвеннο услοжняеτ жсследοванже свοйсτв индиви- дуальныχ инτеρφеροнοв. Β связи с эτим все бοльшее ρас-
15 προсτρанение πρжοбρеτаеτ ποлучение индивидуальныχ инτе φеροнοв миκροбиοлοгжчесκим синτезοм.
Извесτен ρяд сποсοбοв ποлучения челοвечесκиχ инτе φеροнοв с , ρ и γ , οснοваншχ на исποльзοванжи баκ ρжй в κачесτве προдуценτοв, в часτнοсτи ρазличныχ шτам
20 мοв ΕзсЪегΙсЬ±а сοϋ, Βасϋϊиз зиЫη.ϋз, Ρзеиάοтοηаз з сοдеρжащиχ в свοем сοсτаве ρеκοмбжнанτные πлазмидные Д κοτορые οбесπечиваюτ эκсπρессжю геτеροлοгичныχ генοв в нοвοм генеτичесκοм οκρужении. Β случае φибροбласτнοгο жнτеρφеροна челοвеκа ( ιмøι ) дя дοсτиженжя эκсπρес
25 сжи гена ιмул в κлеτκаχ Ε.сοϋ жсποльзοвана ποдсτ нοвκа κοджρующей часτж зρелοгο жнτеρφеροна ποд κοнτροл сжгналοв τρансκρжπцжи ж τρансляπжи генοв (-Ьи£ Β, гβс ж οπеροнοв (Ιас υν 5 гρ ) Ε.сοϋ ж κοлиφагοв ьλ Οбρазующийся в ρезульτаτе мжκροбжοлοгжчесκοгο синτеза
30 зρелый β> 1-жнτеρφеροн (с мοлеκуляρнοж массοй 1900 τοн) χаρаκτеρизуеτся οτсуτсτвжем углевοднοй κοмποненτы наличием φορмил-меτжοнинοвοгο н-κοнцевοгο οсτаτκа в το меτжοнжнοвοгο. Οднаκο эτο οτлжчже не πρивοдиτ κ изм ненжю бжοлοгжчесκοй аκτжвнοсτж белκοвοгο προдуκτа ген
35 ιиш πο сρавнению с πρжροдным глжκοπροτежнοм, προду цжρуемым в κлеτκаχ φжбροбласτοв.
- 3 -
Синτезиροванный уκазанным миκροбиοлοгичесκжм сποсοбοм р 1-инτеρφеροн мοжеτ исποльзοваτься κаκ для исследοва мοлеκуляρныχ меχанизмοв взаимοдейсτвия с κлеτοчными ρ цеπτορамж, τаκ и в меджцжнсκοй πρаκτиκе. 5 Извесτны ρеκοмбжнанτные πлазмждше ДΗΚ, κοдиρущ сжнτез φжбροбласτнοгο β> 1-жнτеρφеροна челοвеκа, τаκже, ρСΙ857 ж ρΡЪ с245Ε?ΧΒ'25 ж шτамм Ε.сοϋ 304044, сοде жащий уκазанные πлазмиды (Κегааи-Ь Ε., З-Ьаиззеηэ Ρ., БЧ 1983, Νисϊ. ΑсϊсΙа Κез. 11, 4677-4688).
Ю в сοсτаве ρеκοмбжнанτнοй πлазмиднοй ДΗΚ ρρъ С24ΗΡΙΡ2 τρансκρиπция гена τтρл κοнτροлиρуеτ ρегуляτορным элеменτοм Ρьοь баκτеρжсφ>ага Λ , а жнжц ция τρансляции белκοвοгο προдуκτа гена οбесπечиваеτся счеτ κοнсτρуиροвания гибρжднοгο учасτκа связывания ρжб
15 сοм на οснοве Зϋ-ποследοваτельнοеτж гена ρеπлжκазы φ га Μ32 . Μаκсжмальный выχοд ρ 1-жнτеρφеροна челοвеκа, οбесπеченный κульτивиροванжем уκазаннοгο шτамма, сοсτа ляеτ 4$ οτ суммаρнοгο белκа πлазмидсοдеρжащиχ κлеτοκ Ε Уκазанныи шτамм χаρаκτеρизуеτся τем, чτο ρегуджρу
20 мая эκсπρессия гена ϊж ρ1 , οбесπечжваемая с ρ^ προмο τορа, τρебуеτ дοποлниτельнοй πлазмиды ρСΙ857 с ρасποлο женным на ней τешеρаτуροчувсτвжτельным генοм ρегуляτο ροм сϊ1?з857 φага λ . Эτο πρивοдиτ κ ποτенциальнοй нес бильнοсτи ρеκοмбинанτнοй πлазмиды в услοвияχ κульτивиρ
25 вания шτамма в κρуπнοмасшτабнοм προжзвοдсτве за счеτ гес Α-зависжмοй ρеκοмбинацжж между πлазмждами ρСΙ857 и ρΡЪ с245ΗΕЧΡ25 πο οбласτям гοмοлοгии. Κροме τοгο, ис- ποльзοванже для ορганжзаπии гибρиднοгο учасτκа связыва нжя ρибοсοм οτнοсиτельнο неπροτяженнοй 30- ποследοва
30 τельнοсτж гена ρеπлжκазы φага Μ32 не ποзвοляеτ в ποлнο меρе ρеалжзοваτь ποτендиальную мοщнοсτь τρансляциοннοг аππаρаτа Ε.сοϊ± из-за недοсτаτοчнο эφφеκτивнοгο взаимο дейсτвия с ρибοсοмами πρи инжπиациж τρансляции φибροбл нοгο инτеρφеροна. Κ τοму же οτсуτсτвже в З'-κοнцевοй
35 неτρанслжρуемοй οбласτи гена ϊш^ι на πлазмиде ρΡЪ С245ΗΡΙΡ25 ρ-независимыχ τеρминаτοροв τρансκρиπциж
- 4 - вοджτ κ сущесτвеннοму снжженжю κοπийнοсτи и даже κ ве- ροяτнοй ποτеρе ρеκοмбжнанτнοй πлазмжды в услοвияχ де- πρессжж высοκοэφφеκτжвнοгο ρ^ προмοτορа φага Λ , οбесπ чжвающегο жнжциацию τρансκρжππжж гена ΙШ .
5 Βсе эτο не ποзвοляеτ дοсτжчь высοκοгο уροвня бжο- сжнτеза προдуκτа гена ιш ρ> 1 и мοжеτ πρивесτи κ даль- нейшему сниженшο сοдеρжанжя уы-жнτеρφеροна в бжοмассе шτамма-προдуценτа πρж егο κρуπнοмасшτабнοм κульτжвжρο- ваниж, чτο услοжняеτ выделенже чисτοгο белκа ж снжжаеτ
10 выχοд целевοгο προдуκτа.
Ρасκρыτже жзοбρеτенжя Заявляемая ρеκοмбжнанτная πлазмидная ДΗΚ ρρκ-ιш/м сποсοб ее κοнсτρужροвания ж шτамм баκτеρии Εзс&егϊсЬ±а сοϋ ΒΗИИгенеτжκа νь 903 (ρΡΚ-ΙШρ 1-13) , сοдеρжащжй
15 ее, являюτся нοвымж ж в лжτеρаτуρе не οπисаны.
Β οснοву жзοбρеτенжя ποлοжена задача сοзданжя нοвο ρеκοмбжнанτнοй πлазмжднοй ДΗΚ, κοдиρующей синτез φибρο- бласτнοгο β 1-инτеρφеροна челοвеκа, сποсοба ее κοнсτρу ροванжя ж нοвοгο высοκοπροдуκτивнοгο шτамма-προдуценτа
20 у31 -инτеρφеροна челοвеκа, сοдеρжащегο ее, οбесπечжвающе ποлучение /з-Ι-инτеρφеροна с высοκжм выχοдοм.
Задача ρешена τем, чτο заявляемая ρеκοмбжнанτная πлазмждная ДΗΚ ρΡΚ-ϊж^з 1-13, κοджρующая сжнτез φжб- ροбласτнοгο β, 1-жнτеρφеροна челοнеκа, сοгласнο жзοбρеτ
25 нжю, жмееτ ρазмеρ 3,9 τыс.н.π. ж сοсτοиτ жз следующжχ элеменτοв: -ΒатΗϊ-вс Ι φρагменτа, ρазмеροм 3,4 τыс. н.π.веκτορнοй πлазмжды ρρκ Ι24Β, ποлученнοй на οснοве ρΡΚ 40 ж ρмь 24-ΕсοΚϊ-ЗаиЗΑ φρагменτа πлазмжды ρПШ--Ьгρ7,ρазмеροм 510 н.π.,и χаρаκτеρизуеτся следующимж
30 πρизнаκамж:
- сοдеρжжτ учасτοκ, οτвеτсτвенный за инжπдацжю ρеπлжκаπжж и ее ρегуляцию - СοϊΕϊ - ρеπлиκοн, ген ρеπρе сορа сϊ-Ьз 857 φага λ , ген усτοйчивοсτи κ амττκτιжллжну τандем ρ -независимыχ τеρминаτοροв τρансκρиπции φага
35 £ά , ρегуляτορную οбласτь Ρ^ο^ и ЗБ- ποследοваτельнοсτь гена сгο , κοдиρующую ποследοваτельнοсτь зρелοгο φиб-
- 5 - ροбласτнοгο инτеρφеροна челοвеκа Ш61 с сοбсτвенным меτиοнжнοвым κοдοнοм;
- сοеджненже ρегуляτορнοй οбласτи гена сгο, κοди ρующей часτи /31- инτеρφеροна и τеρминаτοροв τρансκρж
5 циж φага £ά οсущесτвленο τаκ, чτο πеρед генοм ϊмзι οбρазοван гжбρждный учасτοκ связыванжя ρжбοсοм, имеющ следугошую нуκлеοτидную ποследοваτельнοсτь: 5'-...ϊΑΑйαΑ&αττ(}СΑΤ&...-з', где ϊΑΑα&Α∞τ - зв - ποс дοваτельнοсτь гена сгο φага λ , ΑΤΟ- - меτиοнинοвый κο
10 дοн φибροбласτнοгο инτеρφеροна, а неποсρедсτвеннο за τеρминжρующим κοдοнοм гена шτρι ρасποлοжен τандем Ρ- независжмыχ τеρмжнаτοροв τρансκρиπцжи φага £ά;
- имееτ унжκальные учасτκи узнаванжя ρасτρжκτаз κοορджнаτа κοτοροгο являеτся началοм οτсчеτа (0) ,
15 Ρνиϊ . ( ~ ПΙΟ) , Β$1 Η . ( ~ 1480) , ΑссΙ (~ 1870) , Ρνи (~ 3360); деποниροвана 12.01.87 в κοллеκции κульτуρ миκροορганизмοв Βсесοюзнοгο научнο-исследοваτельсκοгο инсτиτуτа анτжбжοτжκοв ж заρегисτρжροвана за нοмеροм 1825.
20 Заявляемая ρеκοмόжнанτная πлазмждная ДΗΚ ρΡΚ-ϊΡΝ]οϊ-ιз οбесπечиваеτ эκсπρессжю гена ιж ρ 1 πο κοнτροлем ρегуляτορнοй οбласτи
баκτеρиοφага λ Ген сϊ-Ьз857 - ρегуляτορ инжπжанжж τρансκρжгшии с ρан προмοτοροв баκτеρиοφага λ и ген ιш 1 , наχοдяшжйся
25 κοнτροлем Ρн προмοτορа, ρасποлοжены в сοсτаве οднοй τοй же ρеκοмбинанτнοй πлазмжды ρΚ-ϊшуя - 13. Эτο сτοяτельсτвο ποзвοляеτ избежаτь ποτенциальнοй несτа нοсτи в προцессе κульτивиροванжя шτамма с ρеκοмбинанτ мοлеκулοй ДΗΚ, τаκ κаκ в πρедлагаемοй нами κοнсτρуκци
30 не вοзниκаеτ гес Α - зависимοй ρеκοмбинацжж из-за οτс вия дοποлнжτельнοй πлазмиды в шτамме-προдуценτе.
Изοбρеτением являеτся и .сποсοб κοнсτρуиροвания ρ κοмбинанτнοй πлазмиднοж ДΗΚ ρΡΚ-ϊмρϊ-13 , заκлючающж в τοм, чτο веκτορную πлазмжду ρΡΚΪ24 Β, сκοнсτρужροв
35 на οснοве πлазмжд ρΡΚ40 и ΡΜΙ.24 ρасщеπляюτ ρесτρиκ ными эндοнуκлеазамж Εсοκι Ж Β§ΙΪ ' ж προвοдяτ сοеджне
- 6 - бοльшегο из οбρазующиχся φρагменτοв веκτορнοй мοлеκулы с ΕсοΚϊ - Заи ЗΑ φρагменτοм πлазмиды ρΙЫб--Ьгρ7,сοдеρ- жащжм κοджρующую часτь зρелοгο β Λ- инτеρφеροна, в ποлу ченный τаκжм οбρазοм ρеκοмбжнанτнοй πлазмжде ρ -ιшаϊ- - 123 προвοдяτ сблжженже ЗБ - ποследοваτельнοсτж гена сгο и πеρвοгο (меτжοнжнοвοгο) κοдοна β 1- жнτеρφеροна, для чегο πлазмждную ДЖ гждροлжзуюτ ρесτρиκτазοй Βаганϊ, удаляюτ часτь нуκлеοτждοв с ποмοщью эκзοнуκлеазнοй аκτж нοсτж ДΗΚ-ποлимеρазы I Ε. сοϋ, προявляющейея в услοвжя неποлнοгο набορа нуκлеοзждτρжφοсφаτοв в ρеаκциοннοй сме φеρменτаτивнο ρасщеπляюτ ДΗΚ ρесτρиκτазοй Εсοκϊ, οб баτываюτ 31- эндοнуκлеазοй для удаления οднοцеποчечны учасτκοв ДЖ, заτем вοссτанавливаюτ двуцеποчечные κοнцы с ποмοщью Εленοвсκοгο φρагменτа ДΗΚ-ποлимеρазыϊΕ.сοϊϊ ж циκлизуюτ οбρазοвавшиеся лжнейные мοлеκулы ДΗΚ ДΗΚ-л газοй φага Τ4, ποлученным πρеπаρаτοм τρансφορмиρуюτ κле κж Ε.сοϋ с 600 с οτбοροм τρансφορманτοв на сρеде с ам- πжциллжнοм πρж κульτжвжροваниж κлеτοκ πρи τемπеρаτуρе 2 с ποследующей селеκцжеж κлοнοв, οбладающиχ ποниженнοй сκοροсτью ρο'сτа πρи τемπеρаτуρе 42°С, ποсле чегο из οτο ρанныχ κлοнοв выделяюτ ρеκοмбинанτную πлазмидную ДΗΚ
сποсοба κοнсτρуиροвания ρеκοмбинанτ πлазмжды ρ -ШΡузϊ - 13, πρи κοτοροм наибοлее προτяжен жз жзвесτныχ для маτρичнοй ΡΗΚ Ε. сοϋ ж κοлжφагοв
ЗБ -ποследοваτельнοсτь гена сгο баκτеρжοφага Я сοеджн ся с κοджρующей часτью зρелοгο β> 1-жнτеρφеροна челοвеκ πρивοдиτ κ ορганизацжж гжбρжднοгο учасτκа связывания ρи бοсοм гена ιшьл с οπτимальнοй πеρвжчнοж ж προсτρансτ- веннοж сτρуκτуροй 5;-κοнцевοй οбласτж маτρичнοй ΡΕЖ. Β οτлжчже οτ жзвесτнοгο сποсοба заявляемый сποсοб κοκсτρу ροвания οбесπечжваеτ τаκже налжчже в З^ -неτρанслжρуемοй οбласτж гена ОТ|31 на πлазмжде ρΡΕ-шι ι-ιз τандем ρ-незавжсимыχ τеρшнаτοροв τρансκρжππиж, чτο πρедοτвρ щаеτ жнτеρφеρенцжю между ρеπлжκацжей шιазмжднοй ДБΚ ж высοκοэφφеκτжвнο τρансκρжπцией гена φибροбласτнοгο
- 7 - жнτеρφеροна в услοвжяχ деπρессжж ΡΕ προмοτορа.
Κροме уκазаннοгο, жзοбρеτением τаκже являеτся шτа баκτеρии ΞзЫιегΙсЫа сοϋ ΒΗИИгенеτиκа νь 903 (ΡΡΚ-ΙΡЫ
-προдуценτ ]2>1-инτеρφеροна челοвеκа, сοдеρжащжж заявляе
5 ρеκοмбжнанτую πлазмждную ДΗΚ ρΡΚ-ϊж β 1-13 , ποлуче меτοдοм геннοж жнженеρжж πуτем введенжя ρеκοмбинанτнοй
ПЛазмжднοЙ ДΗΚ ρΡΚ-ΙШ /2>1-13 Β баκτеρии Ξзсϊιег:-.сЬд.а деποниροванный 12.01.87 в κοллеκциж κульτуρ миκροορга мοв Βсесοюзнοгο научнο-исследοваτельсκοгο инсτжτуτа ан
10 бжοτжκοв ж заρегжсτρжροванный за нοмеροм 1825.
Заявляемы шτамм ποзвοляеτ οбесπечжτь сτабжльнοе κοπленже уя-жнτеρφеροна челοвеκа в услοвжяχ κρуπнοмас нοгο κульτжвиροвания и дοсτичь выχοда целевοгο προдуκτ бοлее 2 χ 10 ед/л, чτο сοοτвеτсτвуеτ 5-10 οτ οбщегο
15 лжчесτва κлеτοчнοгο белκа.
Лучшжй ваρианτ οсущесτвленжя изοбρеτенжя
Сποсοб κοнсτρуиροванжя заявляемοй ρеκοмбжнанτнοй πлазмжднοй ДΗΚ ρρκ-ιж β> 1-13 οсущесτвлягоτ в несκοль эτаποв.
20 Ηа πеρвοм эτаπе οсущесτвляюτ κοнсτρужροванже веκτ нοй πлазмжды рΡΚϊ24 Β.
Для эτοгο в ДΕΚ πлазмжды ρΡΚ40 (Μοлеκуляρная биο гия, 1987, τ.2Ι, & 5,(Μοсκва), с.1309-1321) в ρайοне у κа узнаванжя ρесτρиκτазы в§ϊ Τ προизвοдяτ делецию с πο
25 эκзοнзκлеазы ΒаΙЗΙ.
Τаκжм οбρазοм ποлучаюτ πлазмжду ρΡΚ 100, в κοτορο учасτοκ узнаванжя ΒагаΗΙ ρасποлагаеτся неποсρедсτвеннο οбласτью связыванжя ρибοсοм φага Я , πρичем в ρайοне инжцииρзющегο дυα κοдοна οбρазуеτся ποследοваτельнοсτь П !ΑШ5Αα?σσ. υ . Βаш. ΗΙ
Β дальнейшем с ποмοщью τρаджциοнныχ геннο-жнжене ныχ меτοджκ меньший Ρз-ы - ΒагаΗϊ φρагменτ πлазмжды ρΡΚΙΟΟ сοеджняюτ с бοлыпим Ρз-ы-Βаш нϊ φρагменτοм πла мжды ρмь 24 с οбρазοванжем πлазмиды ρΡΚϊ24, в κοτορую
35 с ποмοщыο οлжгοвуκлеοτиднοгο лжнκеρа ввοдяτ учасτοκ
- 8 -_ узнаванжя ρесτρиκτазы Β§1]| . Пοлучаюτ πлазмжду ρΡΚ Ι2 Заτем προвοдяτ κοнсτρужροванже προмежуτοчнοй πлаз
ΜЖДЫ ρΡΚ-ЗЖβΙ-123.
Сκοнсτρужροванную веκτορную πлазмжду ρΡΚ Ι24Β ρас 5 щеπляюτ ρесτρжκцжοннымж эндοнуκлеазамж Εсοκϊ ж в§ϊ προвοдяτ сοеджненже бοльшегο из οбρазующжχся φρагменτο веκτορнοй мοлеκулы с Εсοκϊ - ЗаиЗΑ φρагменτοм, сοдеρжа κοджρующую часτь зρелοгο ]31-жнτеρφеροна жз πлазмжды ρШ]δ--Ьгρ7. Пοлучаюτ προмежуτοчную ρеκοмбжнанτную πлаз
Ю ду ρΡΚ-:ШГ]Ь1-123.
Заτем οсущесτвляюτ τρеτжй эτаπ - κοнсτρужροванже мжды ρΡΚ-ΙШ βϊ-13 . Для эτοгο в προмежуτοчнοй πлазм ρρκ-ιж Ρ> 1-123 προвοдяτ сближение ЗБ-ποследοваτельн гена сгο ж πеρвοгο κοдοна /Ы-жнτеρφеροна, для чегο π
15 мждную ДΗΚ гждροлжзуюτ ρесτρиκτазοй ΒагаΗΙ, удаляюτ час нуκлеοτждοв с ποмοщью эκзοнуκлеазнοй аκτжвнοсτж ДΗΚ-πο • меρазы I Ε. сοϋ, ρасщеπляюτ ДΗΚ ρесτρжκτазοй . ΕСΟΗΙ, οбρабаτываюτ зϊ-эндοнуκлеазοж с ποследующжм ποлным в сτанοвлением двуцеποчечныχ κοнцοв с ποмοщыο Κленοвсκοг
20 φρагменτа ДΗΚ-ποлжмеρазы I Ε. сοϋ ж οбесπечжваюτ πжκл зацию οбρазοвавшиχся линейныχ мοлеκул ДΗΚ ДΗΚ-лжгазοй φага Τ4. Пοлученным πρеπаρаτοм τρансφορлжρуюτ κлеτκи Ε. сοϊ± С600, οτбжρаюτ τρансφορманτы на сρеде с амπжπж линοм πρи κульτжвжροваниж κлеτοκ πρи τемπеρаτуρе 28°С
25 ποследующей селеκцжей на ποниженную сκοροсτь ροсτа πρи τемπеρаτуρе 42°С. Из οτοбρанныχ τаκим οбρазοм κлοнοв в деляюτ πлазмждную ДΗΚ ρρκ-ϊгы ϊ-ιз.
Заявляемыж шτамм баκτеρий ΕзсЬ.ег±сЫа сοϋ ΒΗИИге κа νь 903 (ρΡΚ-ϊ_?Ы)Ы-ϊз ) ποлучаюτ τρансφορмацией шτам
30 -ρеπиπиенτа ρеκοмбинанτнοй πлазмждοй ρρκ-ιρτш.-ϊз с π ледующим οτбοροм ρеκοмбинанτныχ κлοнοв на сρеде с амπи πжллжнοм πρж τемπеρаτуρе 28°С и οπρеделением аκτжвнοс φжбροбласτнοгο β -жнτеρφеροна в эκсτρаκτаχ κлеτοκ τρа сφορманτοв ποсле деρеπρессжж ΡΕ-προмοτορа, дοсτжгае-
35 мοж κульτжвжροванием шτамма в τечение 1-2 часοв πρи τе πеρаτуρе 42°С. Β κачесτве ρециπиенτа мοгуτ быτь τаκже
- 9 - исποльзοваны шτаммы Ε.сοϋ σбοο и дρуτие προизвοдн Ε. сοϋ Κ12.
Шτамм Ε. сοϋ ΒΗИИгенеτиκа νъ 903 (ρΡΚ-ш ϊ-13) χаρаκτеρизуеτся следующжми πρжзнаκамж. 5 Μορφοлοгичесκие πρизнаκж. Κлеτκж πρямые, πалοчκο виднοй φορмы (I,2-1,6)χ(2,0-6,0) мκм, слабοποдвижные, сποсοбные κ οбρазοванжю нжτевидныχ φορм, гρамοτρицаτе ные, несποροнοсные.
Κульτуρальные πρизнаκи. Κлеτκж χοροшο ρасτуτ на
10 πлοτныχ ж жждκжχ προсτыχ синτеτжчесκжχ, ποлусжнτеτжче сκжχ и κοмπлеκсныχ сρедаχ. Пρи ροсτе на агаρизοваннοм бульοне Χοττингеρа или ь-бульοне οбρазуюτ οслжзнен κρуглые, слабοмаτοвые κοлοнии. Пρи выρащжваниж в жждκ сρедаχ τжπа ь-бульοна жлж Μ9 с κазамжнοвымж κислοτа 15 οбρазуюτ ρавнοмеρную взвесь.
Φжзиοлοгο-бжοχимжчесκже πρизнаκи. Κлеτκи сποсοбн κ ροсτу в диаπазοне τемπеρаτуρ οτ 5 дο 40°С (οπτжмум 35°С) πρи ρΗ 6,7-7,5. Β κачесτве исτοчнжκа углеροда и ποльзуюτ аминοκжслοτы ж углевοды (наπρимеρ, саχаροзу) 20 Исτοчниκοм азοτа мοгуτ служиτь мжнеρальные сοли в амм нжйнοй φορме, а τаκже ορганжчесκже сοеджненжя в вжде πеπτοна, τρжπτοна, дροжжевοгο эκсτρаκτа ж аминοκислοτ Усτοйчжвοсτь κ анτжбжοτжκам. Шτамм усτοйчив κ ам πжциллжну в κοнценτρации дο 100 мг/л πρи шρащжванжи 25 жждκжχ ж на агазиροванныχ πиτаτельныχ сρедаχ.
Сτабжльнοсτь πлазмжды. Пρж χρаненжж κлеτοκ на аг ρизοваннοй сρеде (сροκοм дο I месяца) , πρи сеρжж ποсл дοваτельныχ πеρесевοв (в τечение на менее 6 месяцев) в προцессе глубжннοгο κульτивжροванжя в жждκοй сρеде 30 анτжбиοτжκοм не προжсχοдиτ ποτеρи ж πеρесτροйκж πлазм ды.
Пοлученный шτамм Ε.сοϋ ΒΗИИгенеτжκа νϊθοз (ρΡΚ-ϊшь 1-13 ) являеτся высοκοэφφеκτжвным πρ дуценτοм φибροбласτнοгο (Ь 1-жнτеρφеροна челοвеκа ж 35 мοжеτ быτь жсποльзοван для προмышленнοгο προизвοдсτва β 1-жнτеρφеροна.
Β дальнейшем изοбρеτенже ποясняеτся πρжмеρамж οс
- 10 - щесτвленжя сποсοба κοнсτρуиροванжя заявляемοж πлазмжды, сποсοба ποлучения шτамма, егο κульτивиροвания и иллюсτ ρжρуеτся следующжмж φжгуρамж, на κοτορыχ жзοбρажены: φжг.Ι- φжзиκο-генеτжчесκая κаρτа ρеκοмбжнанτнοй
5 πлазмжды ρ -шτρι-ι3ϊ φжг.2 - сχема ποлучения заявляемοй πлазмжды ρΡΚ-ГΜΪ)Ы-13. Пρжмеρ I. Ρеκοмбжнанτную πлазмжду ρΡΚ-ϊш/51-13 (φжг.Ι) ποл
Ю чаюτ в несκοльκο эτаποв. Эτаπ I - κοнсτρужροванже веκτο нοж πлазмиды ρΡΚ 12 В.
Для эτοгο κοнсτρужρуюτ πлазмжду ρΡΚ 124 следующжм οбρазοм. _3 мκг ДΕЖ πлазмжды ρΡΚ 40 ρасщеπляюτ ρесτρиκ- τазοϊ в§ϊД в 60 мκл буφеρа для ρесτρжκπжж - I, сοдеρж
15 щегο 10 мΜ τρжс-ΗСΙ , ρΗ 8,0, 6 мΜ м§С12 , 6 мΜ 2 - меρκ τοэτанοла, 150 мΜ ΝаСϊ . ДΗΚ πеρеοсаждаюτ двумя οбъемам эτанοла. Οсадοκ ρасτвορяюτ в 20 мκл Η^Ο. Οбρабοτκу ДЖ эκзοнуκлеазοй Βаϊ 31 προвοдяτ в τечение 3 мин πρж τемπ ρаτуρе 30°'С в 30 мκл буφеρа, сοдеρжащегο 3 Μ- ΝаСϊ, 60
20 СаС12 , 60 мΜ Μ£С12, 100 мΜ τρис-ΗСϊ , ρΗ 8,0, 5 мΜ эτж ленджамжнτеτρауκсуснοж κжслοτы. ДΗΚ πеρеοсаждаюτ двумя οбъемамж эτанοла. Οсадοκ ρасτвορяюτ в 10 мκл Η^Ο. Οбρа- бοτκу ρесτρжκτазοж.ΒатΗϊ προвοдяτ в προбе, οбъемοм 30 мκл, сοдеρжащей уκазанныж буφеρ для ρесτρиκπжж - I.
25 Дοсτροжκу οднοцеπечечныχ з' - κοнцевыχ учасτκοв ДΗΚ 'προв дяτ οбρабοτκοж Κленοвсκжм φρагменτοм ДΗΚ-ποлимеρазы I Ε.сοϋв προбе οбъемοм 20 мκл, сοдеρжащеж 10 мΜ τρжс-Η ρΗ 8,0, 10 мΜ м§сϊ2 , 2 мκг πρеπаρаτа ДΗΚ, πο 30 мκΜ κа дοгο жз дезοκсжρжбοнуκлеοзждτρиφοсφаτοв, 5 единжц φеρме
30 τа. ДΗΚ жз ρеаκциοннοй смесж πеρеοсаждаюτ эτанοлοм ж ρа вορяюτ в 100 мκл Η^Ο. Βοссοеджненже лжнеаρжзοваннοй πла мжднοж ДΗΚ προвοдяτ πρи τемπеρаτуρе Ι6°С в τечение 12 ч сοв с ποмοщью ДЩ-лжгазы φага Τ4 в προбе, сοдеρжащей бу φеρ для лжгжροвания (60 мΜ τρжс-ΗСϊ , ρΗ 7,6,10 мΜ м§сϊ
35 ю мΜ 2-меρκаπτοэτанοла, 0,4 мΜ аденοзжнτρиφοсφаτа) и I ДΗΚ. Пοлученнοй смесью τρансφορмиρуюτ κлеτκж Ε.сοϋ сбο
- II - Эφφеκτжвнοсτь τρансφομдациж сοсτавляеτ дο 5*10 κοлο на I мκг наτивнοй πлазмжды ρΡΚ 40. Οτбжρаюτ κлοны, у чивые κ шщиллину (100 мгκ/мл) , из ниχ выделяюτ πл мждну ДΗΚ πο мοдиφициροваннοму меτοду Биρнбοжма и Д и жсποльзуюτ для ρесτρжκπиοннοгο аналжза. Β ρезульτа ποлучаюτ πлазмиду ρΡΚΙΟΟ, κοτορая сοдеρжиτ унжκальны учасτοκ ρасщеπленжя ΒатΗΙ. Далее προвοдяτ κοнсτρуиρο ние πлазмжды ρΡΚ 124.
Для эτοгο 2 мκг ДΕΚ πлазмиды ρΜЪ 24 ρасщеπляюτ месτнο ρесτρжκτазамж ΒагаΗΙ ж Ρз-Ы в 40 мκл буφеρа ρесτρиκции-Ι. Βοссοеджняюτ с ποмοщью ДΗΚ-лжгазы φага πρи 0°С с φρагменτами, ποлученными πρж гждροлжзе ДΒΚ мжды ρΡΚЮΟ ρесτρжκτазамж ΒатΗΙ ж Ρа-ьΙ. Пοлученн πаρаτοм ДΗΚ τρансφορмжρуюτ κлеτκж Ε.сοϋ С600 с οτбο τρансφορманτοв на сρеде с амπжциллжнοм с ποследующей селеκцжей стг -κлοнοв на сρеде с 300 мκг/мл χлορамφен κοла πρи κульτжвжροваниж κлеτοκ πρи τемπеρаτуρе 42°С. οτοбρаншχ τаκжм οбρазοм κлοнοв выделяюτ πлазмждную Д ж исследуюτ с ποмοщью ρесτρиκциοннοгο анализа. Β ρезу τаτе ποлучаюτ πлазмжду ρρκ124, сοдеρжащую унжκальный учасτοκ ρасцеπленжя ρесτρжκτазοй Βаш ΗΙ. Далее 3 мκг πлазмжды ρ?κϊ24 ρасщеπляюτ ρесτρжκτазοй χъаϊ в 70 мκ буφеρа для ρесτρжκцжи -I, сοдеρжащегο 10 мΜ τρис-ΗС, 6 мϊνϊ м§σι≥ , 6 мΜ 2-меρκаπτοэτанοла, 150 мΜ ыасι. ДΗΚ πеρеοсаждаюτ двумя οбъемами эτанοла. Οсадοκ ρасτв ρяюτ в 15 мκл Η^Ο. Дοсτροйκу οднοцеποчечныχ 3' -κοнцев учасτκοв ДΗΚ προвοдяτ οбρаόοτκοй Κленοвсκим φρагменτο ДΗΚ-ποлимеρазы I Ε. сοϋ в προбе οбъемοм 20 мκл, сοде щей 10 мΜ τρис-ΗСϊ , ρΗ 8,0, 10 мΜ м§σϊ2, 2 мκг πρеπа ДΗΚ, πο 30 мκΜ дезοκсиρжбοнуκлеοзждτρжφοсφаτοв, 5 едж φеρменτа. ДΗΚ из ρеаκциοннοй смесж πеρеοсаждаюτ эτанο и ρасτвορяюτ в 100 мκл Η^Ο. Βοссοединенже лжнеаρизοва нοй πлазмиднοй ДΗΚ с ΒаϊЦ- лжнκеρамж προвοдяτ πρи τ πеρаτуρе Ι6°С в τечение 12 часοв с ποмοщью ДΗΚ-лигазы φага Τ4 в προбе, сοдеρжащей буφеρ для лжгжροванжя (60 τρис-ΗСϊ , ρΗ 7,6, 10 мΜ м§σϊ2, 10 мΜ 2-меρκаπτοэτанο
- 12 - 0,4 мΜ аденοзжнτρиφοсφаτа, 2 мκг πлазмиднοй ДΗΚ и 0,5 линκеροв. Пοсле προведенжя лжгжροванжя ДΗΚ ЖЗ ρеаκциοн смесж οсаждаюτ эτанοлοм, ρасτвορяюτ ж ποдвеρгаюτ φеρме τаτжвнοму гждροлжзу ρесτρиκτазοж в§ιД в προбе, οбъемο
5 40 мκл, сοдеρжащеж буφеρ для ρесτρжκцжж - 2 (6 мΜ τρжс -ΗСϊ , ρΗ 7,6, 6 мΜ Μ£С12, 6 мΜ 2-меρκаπτοэτанοла, 50 Ηасι). ДЩ внοвь οсаждаюτ эτанοлοм, ρасτвορяюτ и οбесπ чиваюτ πжκлжзацжю мοлеκул ДΗΚ, для чегο I мκг πρеπаρаτ πлазмжднοж ДΗΚ в 240 мκл буφеρа дя лжгиροванжя οбρаб
Ю τываюτ ДΗΚ-лжгазοж Τ4. Пοлученнοй смесью τρансφορмжρую κлеτκж Ε.сοϋ С600. Зφφеκτжвнοсτь τρансφορмацжж сοсτав еτ дο 5»10 κοлοнжж на I мκг наτжвнοж πлазмжды ρΡΚϊ24. Οτбжρаюτ κлοны, усτοйчжвые κ амπжπнллжну (100 мκг/мл) , жз нжχ выделяюτ πлазмждную ДΗΚ πο мοдиφжцжροваннοму
15 меτοду Бжρнбοйма и Дοлж ж жсποльзуюτ ее для ρесτρжκ- цжοннοгο аналжза. Β ρезульτаτе ποлучаюτ πлазмжду ρΡΚϊ2 κοτορая в οτлжчже οτ жсχοднοй веκτορнοй мοлеκулы ρρκϊ2 сοдеρжжτ унжκальныж учасτοκ ρасщеπленжя в§ιΤ[ вмесτο жм шежся ποследοваτельнοсτж узнавания χъаϊ (φжг.2).
20 Эτаπ 2-κοнсτρуиροвание προмежуτοчнοй πлазмиды
ΡΡΚ-ΙΡΝ)Ο1-123. Β сοсτав веκτορа ρΡΚϊ24Β инτегρжρуюτ джρующую ποследοваτельнοсτь φжбροбласτнοгο жнτеρφеροна челοвеκа жз πлазмжды ρ /5--Ьгρ7.Для эτοгο 10 мκг ДΗΚ ρШ^ -Ι;гρ7 οбρабаτываюτ сοвмесτнο ρесτρжκτазамж ΕсοΚϊ
25 и 5аи ЗΑ в προбе οбъемοм 100 мκл, сοдеρжащей буφеρ для ρесτρиκцжи-2. Пοлученныж πρеπаρаτ нанοсяτ на гель Ι,Ι^-нοй легκοπлавκοй агаροзы и ποдвеρгаюτ элеκτροφορе зу в τρис-ацеτаτнοй буφеρнοй сисτеме. Пοлοсκу геля, сο деρжащую φρагменτ ДΗΚ ддинοй 510 н.π. , выρезаюτ, и ДΗΚ
30 элюжρуюτ жз геля. Пοлученный τаκжм οбρазοм φρагменτ ДΗ Μ мκг) жнτегρжρуюτ в πлазмжду ρΡΚϊ24Β. Для чегο I м ДΗΚ ρΡΚϊ24Β ρасщеπляюτ ρесτρиκτазамж ΕсοΚϊ ж Β§ϊ1 в бе οόъемοм 20 мκл в буφеρе для ρесτρиκцжи - 2. Пοлучен ный πρеπаρаτ ποдвеρгаюτ φенοльнοж деπροτежнжзацжж, ДΗΚ
35 οсаждаюτ эτанοлοм ж ρасτвορяюτ в 10 мκл Η^Ο. 0,5 мκг ДЩ ρасщеπленнοж πлазмжды ρΡΚ!24Β οбъеджняюτ с I мκг
- 13 - выделеннοгο φρагменτа πлазмжды ρШ|3-ϊ;гρ7 ж οбρабаτыва ДΗΚ-лжгазοй Τ4 в προбе οбъемοм 30 мκл, в буφеρе для л гиροвания. Пοлученным πρеπаρаτοм ДΗΚ προвοдяτ τρансφο мацию κлеτοκ Ε. сοϋ С600 с οτбοροм τρансφορманτοв на
5 де с амπиπдллжнοм с ποследующей селеκцией ст3 -κлοнοв сρеде с 200 мκг/мл χлορамφениκοла πρи κульτивиροвании κлеτοκ πρи τемπеρаτуρе 42°С. Из οτοбρанныχ τаκим οбρа зοм κлοнοв выделяюτ πлазмидную ДΗΚ и жсследуюτ с πο- мοщью ρесτρиκциοннοгο аналжза. Β ποлученнοй πлазмжде
Ю Εοοнι-Βδϊ ιι φρагменτ, κοджρующжй С-κοнцевую часτь χлορамφенжκοлацеτилτρансφеρазы в сοсτаве веκτορа ρΡΚϊ замещен на κοджρующую ποследοваτельнοсτь зρелοгο ø 1- τеρφеροна челοвеκа. Данная πлазмида οбοзначаеτся ΡΡΚ-ΙБЧΪ|Μ-123 и исποльзуеτся на следующей сτадии κοн
15 ρуиροвания.
Эτаπ 3 - κοнсτρуиροванже πлазмжды ρρн-ιшρι-ιз« 30 мκг ДΗΚ πлазмжды ρΡΚ-ϊм ι-123 ρасщеπляюτ ρесτρж зοй ΒашΗΙ в 150 мκл буφеρа для ρесτρиκцжж - I, ДΗΚ π веρгаюτ φенοльнοй деπροτежнжзации и οсаждаюτ эτанοлοм
20 Οсадοκ ρасτвορяюτ в 40 мκл Η^Ο. Для οгρанжченнοй дегρ дацжи ДΗΚ с ποмοщью з' →- Ь1 эκзοнуκлеазнοй аκτжвнοсτи ДΗΚ-ποлмеρазы I Ε. сοϊ± ποлученный πρеπаρаτ ДΗΚ инκу- биρуюτ в προбе οбъемοм 150 мκл, сοдеρжащвй 50 мΜ τρис -нσϊ,ρΗ 8,0, 10 мκΜ эτиленджаминτеτρауκсуснοй κжслοτы,
25 5 мΜ м§σϊ2, 100 мκΜ дезοκсжаденοзинτρиφοсφаτа (а заτе дезοκсжгуанοзжнτρиφοсφаτа) и 20 ед. ДΗΚ-ποлимеρазы. Ρ цжю οсτанавлжваюτ , προвοдяτ πеρеοсаждение ДΗΚ,и οсадο внοвь ρасτвορяюτ в 40 мκл Η^Ο. 10 мκг ποлученнοгο πρе ρаτа οбρабаτываюτ ρесτρжκτазοй ΕсοΚϊ в 50 мκл буφеρа
30 для ρесτρиκπиж-2, προвοдяτ φенοльную деπροτеинизацию, οсаждение ДΗΚ эτанοлοм и ρасτвορяюτ οсадοκ в 30 мκл Η
Удаленже οднοниτевыχ κοнцевыχ учасτκοв ποлученнο гο πρеπаρаτа ДΗΚ προвοдяτ πρи ποмοщи эндοнуκлеазы зι προбе οбъемοм 100 мκл, сοдеρжащей 30 мΜ СΗ2С0Ша,
35 ρΗ 4,4, 4,5 мΜ ΖηЗΟ^, 250 мΜ ИаСΙ, 10 мκг ДΗΚ, 200 ед.
- 14 - зι-эндοнуκлеазы. Ρеаιщию προвοдяτ πρи τемπеρаτуρе 20°С, ποсле чегο смесь ποдвеρгаюτ φенοльнοж οбρаόοτκе ж πеρе οсажденжю нуκлежнοвοй κжслοτы эτанοлοм. Οсадοκ ρасτвορ юτ в 20 мκл Η^Ο. 4 мκг ποлученнοгο τаκим οбρазοм πρеπа
5 ρаτа ДΗΚ οбρабаτываюτ Κденοвсκжм φρагменτοм ДΗΚ-ποлиме ρазы I Ε.сοϊ± в услοвияχ, οπжсанныχ выше, для дοсτροй вοзмοжнο жмеющжχся οднοцеποчечныχ κοнцοв мοлеκул дο дв цеποчечныχ. Ρеаκцжю οсτанавлжваюτ φенοльнοй деπροτежни зацжей, нуκлежнοвые κжслοτы οсаждаюτ эτанοлοм ж ρасτвο
10 ρяюτ в 20 мκл Η^Ο.
Лжгжροванже лжнежныχ мοлеκул ДΗΚ с двуцеποчечнымж κοнπамж προвοдяτ πρи τемπеρаτуρе Ι6°С в προбе οбъемοм 50 мκл, сοдеρжащей 60 мΜ τρжс-нσϊ , ρΗ 7,6, 10 мΜ м§σϊ 10 мΜ джτжοτρежτοл, 4 мΜ аденοзжнτρишοсφаτ, 8 ыас.%
15 ποлжэτжленглжκοль-6000, 4 мκг ДЖ, 100 ед. ДΗΚ-лигазы Τ4. Пοсле завеρшенжя ρеаκциж προбу ρазбавляюτ в 4 ρаз ж лροвαдяτ οсаждение нуκлежнοвыχ κжслοτ эτанοлοм, 2 м ρасτвορеннοй в Η^Ο ДΗΚ οбρабаτываюτ ρесτρжκτазοй в§ι| в 30 мκл буφеρа для ρесτρиκцжж - 2, ДΗΚ οсаждаюτ жз ρе
20 цжοннοй смесж эτанοлοм, ρасτвορяюτ в вοде и οбρабаτыва юτ ДДΚ-лжгазοй Τ4 в 200 мκл буφеρа дя лигжροванжя. Пο ченныж πρеπаρаτ ДΗΚ жсποльзуюτ для τρансφορмациж κлеτο Ε.сοϊ±СбΟΟ, κаκ οπисанο выше, с ποследующеж селеκцжей τρансφορманτοв на сρеде с амπжциллжнοм πρи κульτивиροв
25 нжж κлеτοκ в τечение суτοκ πρи τемπеρаτуρе 28°С. Сρедж ποлученныχ τρансφορманτοв οτбиρаюτ ваρианτы, οбладающж ποнжженнοй сποсοбнοсτью κ ροсτу πρи τемπеρаτуρе 42°С. уκазанныχ κлοнοв выделяюτ πлазмидную ДΗΚ, κаκ οπисанο выπιе, ж ποдвеρгаюτ ρесτρжκπжοннοму аналжзу.
30 Для усτанοвления πеρвичнοй сτρуκτзгρы гибρиднοгο учасτκа связыванжя ρжбοсοм πеρед генοм ΙΡΝ^Ι Β ποлучен ΗΟЁ τаκжм οбρазοм πлазмжде ρΡΚ-ϊΡΝϊэι-ιз 30 мκг сοοτвеτ сτвующеж ДΗΚ οбρабаτываюτ ρесτρжκτазοж Ηϊηά 1ъ 100 мκл буφеρа ддя ρесτρиκциж-2, πρеπаρаτ нанοсяτ на гρадиенτ
35 ный: (4-12^) ποлжаκρжламждный гель и ποдвеρгаюτ элеκ φορезу в τρис-ацеτаτнοй буφеρнοж сжсτеме. Φρагменτ ДΗΚ
- 15 - длжнοй ~Ι90 н.π. элюжρуюτ жз геля πο меτοду Μаκсама-Ι беρτа, κ нему πρжсοеджняюτ с ποмοщью ДΗΚ-лжгазы Τ4 Βа -линκеρы аналοгжчнο οπисаннοму выше сποсοбу πρисοеджн в§ι I -линκеροв κ линеаρизοваннοй πлазмжде ρΡΚϊ 4. ДΗΚ
5 ρеаκцжοннοй смеси πеρеοсаждаюτ эτанοлοм,и οсадοκ ρасτ ρяюτ в 20 мκл Η^Ο, ρасщеπляюτ ρесτρиκτазοй ΒашΗϊ в 30 буφеρа для ρесτρиκπжж - I, ДΗΚ ποдвеρгаюτ φенοлънοй д ροτеинизаπжж, внοвь οсаждаюτ эτанοлοм ж ρасτвορяюτ в Μοлеκуляρнοе κлοнжροванже οбρазующегοся πρж ρасще
10 нжж Βатнϊ φρагменτа ДΗΚ Β сοсτаве ρеπлжκаτжвнοй φορмы баκτеρиοφага ΜΙЗтρ 10, селеκцжя ρеκοмбинанτныχ φагοв н жнджκаτορнοй сρеде, сοдеρжащей 5' -бροм-4-χлορ-З-индοли -ρ- Ώ - галаκτοзжд, выделенже οднοцеποчечнοй φагοвοй и οπρеделение πеρвичнοй сτρуκτуρы κлοниροваннοгο φρагм
15 τа с ποмοщью меτοда οгρанжченнοгο маτρичнοгο κοπиροван (меτοд Φ.Сенгеρа) οсущесτвляюτ в сοοτвеτсτвии сο сτанд ными меτοдамж. Усτанοвленная меτοдοм Сенгеρа нуκлеοτид ποследοваτельнοсτь гибρиднοгο учасτκа связыванжя ρжбοс в сοсτаве πлазмжды ρΡΚ-ϊΡΝ/Ы-13 являеτся следующей:
20 5/-...ϊΑΑα&Α&οτταсΑΤθ...-3/ , где ΤΔΑсΑαι - ЗБ-ποсл ваτельнοсτь гена сгο φага λ ,а Ατα-меτжοнжнοвый κοдοн ϊ-жнτеρφеροна. Пρжмеρ 2. Шτамм Ε. сοϋ ΒΗЙИгенеτжκа νь 903 (ρΡΗ-ϊΕΝ]Я-ιз)
25 дуценτ φибροбласτнοгο
челοвеκа ποлучаю следующим οбρазοм.
Шιазмиду Ρ Κ-ΙΡΝ/31-13 , κοдиρующую синτез φибροб нοгο жнτеρφеροна челοвеκа, τρансφορмацией аналοгжчнο ο саннοму в πρжмеρе I ввοдяτ в κлеτκж шτамма Ε.сοϊ± ΒБΕ
30 генеτжκа νьэοз (деποнжροваннοгο вο Βсесοюзнοй κοллеκци προмышленныχ мжκροορганжзмοв Βсесοюзнοгο научнο-жсслед τельсκοгο жнсτжτуτа генеτжκж ж селеκции προмышленныχ ο низмοв и заρегисτρиροваннοгο за нοмеροм ΒΚШ^Ι Β-3546) . Эφφеκτивнοсτь τρансφορмацжж κлеτοκ Ε.сοϋ ΒΗИИгенеτжκа
35 νъ 903 сοсτавляеτ οκοлο 10 κлοнοв на I мκг наτжвнοй
- 16 - ДΗΚ πлазмжды ρρκ-ιж -ϊз . Τρансφορманτы οτбжρаюτ на сρеде, сοдеρжащей амπжπиллжн (100 мκг/мл) ποсле κульτж вжροванжя κлеτοκ в τеченже суτοκ πρи τемπеρаτуρе 28°С. Из οτοбρанныχ κлοнοв выделяюτ πлазмждную ДБΚ ж ποдτвеρ
5 даюτ ее иденτичнοсτь πρеπаρаτу ДΗΚ ρΡΚ-ϊΡΝβϊ-ϊз с πο- мοщью ρесτρжκπиοннοгο анализа. Пοлучаюτ шτамм Ε. сοϋ БΗИЙгенеτжκа νь эοз
Для οπρеделенжя προдуκτжвнοсτж шτамма Ε.сοϋ ΒΗЙИ неτжκа VI 903 (рΡΚ-ϊЖ]Эϊ-ιз) πлазмждсοдеρжащже κлеτκж
10 выρащжваюτ πρж τемπеρаτуρе 28°С на сκοшеннοж агаρжзοв нοй сτандаρτнοй сρеде Χοττжнгеρа, сοдеρжащеж 50 мκг/мл амπжπжллжна, в τеченже 14 часοв. Βыροсшую на κοсяκаχ бжοмассу исποльзуюτ для ποлученжя ποсевнοгο маτеρжала. Для эτοгο κлеτκж πеρенοсяτ в κοлбы Эρленмейеρа οбъемοм
15 750 мл сο 100 мл сρеды Χοττжнгеρа, сο 100 мκг/мл амπи- циллина ж выρащиваюτ πρи τемπеρаτуρе 28°С на κачалκе πρи 240 οб/мжн в τеченже 6 часοв. Οπτжчесκая πлοτнοсτь ποсевнοй κульτуρы сοсτавляеτ 1,5-2,5 ед.
Φеρменτаπию προвοдяτ в φеρменτеρе, οснащеннοм
20 сжсτемамж для ρегулжροванжя ρΗ, τемπеρаτуρы, сκοροсτж πеρемешжванжя ж аэρаπиж. Для φеρменτаπжи жсποльзуюτ сρеду Χοττжнгеρа сο 100 мκг/мл амπжπжллжна ж 10 г/л глюκοзы. Пοсевную κульτуρу внοсяτ в κοлжчесτве 5-10 ма Κульτжвжροванже οсущесτвляюτ πρи ρΗ 6,6-6,8, ποддеρжи-
25 вая эτοτ уροвень ποдачеж аммжачнο вοды. Пеρвую часτь φеρменτацжж προвοдяτ πρж τемπеρаτуρе 28°С дο οπτжчесκο πлοτнοсτж, ρавнοй 3,5 πρи 550 нм, а заτем οсущесτвляюτ τеρдοжндуκπжю, ποвышая τемπеρаτуρу дο 42-45°С в τеченж 5 мжн, ποсле чегο προдοлжаюτ φеρленτацжю еще 2 часа π
30 τοж же τемπеρаτуρе.
Пοсле οκόнчанжя προцесса для οπρеделенжя аκτжвнοс жнτеρφеροна κлеτκж жз I мл κульτуρальнοй жждκοсτж οсаж юτ ценτρиφугжροванием, οсадοκ ρесусπендиρуюτ в I мл Ι^-нοгο ρасτвορа дοдецилсульφаτа наτρия в 0,02 Μ φοсφа
35 нοм буφеρе ρΗ 7,2, сοдеρжащем 1% 2-ιлеρκаπτοэτанοла и προгρеваюτ 2-4 мжн πρж τемπеρаτуρе Ι00οС. Пοсле эτοгο
- 17 - θсадοκ οτбρасываюτ ценτρиφуτжροванжем ж аκτжвнοсτь жнτ φеροна, сοдеρжащегοся в надοсадοчнοж φρаκции, οπρедел юτ сτандаρτными меτοдамж жлж πο защжτе джπлοждныχ φжб ροбласτοв челοвеκа οτ циτοπаτжчесκοгο дежсτвжя вжρуса везжκуляρнοгο сτοмаτжτа жлж меτοдοм жммунο-φеρменτнοг анализа. Β κачесτве сτандаρτοв исποльзуюτ πρеπаρаτы ^-инτеρφеροна ("ϊοгеу", Яποнжя) , οττиτροванные πο сτандаρτу лейκοциτаρнοгο инτеρφеροна ΜΡС Β 69/19 (Βел κοбρиτанжя) . Пο ρазлжчным меτοдам οπρеделенжя аκτжвнοсτь φиб- ροбласτнοгο жнτеρφеροна челοвеκа, сжнτезжρуемοгο в κл κаχ шτамма Ε.сοϋ ΒΗИИгенеτжκа VI 903 (ρΡΗ-ΙΜ|31-13) сοсτавляеτ бοлее 2»10 междунаροдныχ еджнжц/л баκτе- ρжальнοй κульτуρы. Для οπρеделенжя дοли сжнτезжροваннοгο φибροбласτ гο инτеρφеροна οτ суммаρнοгο κлеτοчнοгο белκа κлеτκж I мл κульτуρальнοй жидκοсτж οсаждаюτ ценτρиφугжροвани и οбρабаτываюτ, κаκ οπисанο выше, πρеπаρаτ ρазделяюτ элеκτροφορезοм в πρисуτсτвжж 0,1% дοдецилсульφаτа наτ в 15% ποлиаκρжламжднοм геле πο сϊандаρτнοй меτοджκе. Белκж, ρазделенные в ποлиаκρиламжднοм геле, προκρашжв юτ в ρасτвορе Κумасси κ-250 "Зегνа'ЧΦΡГ) πο сτандаρ нοй меτοджκе. Κοлжчесτвеннοе сοдеρжание белκοв в зοна οπρеделяюτ ποсле сκаниροвания геля на авτοмаτичесκοм лазеρнοм денсиτοмеτρе. Иденτиφиκаπжю зοны, сοοτвеτсτв щей сжнτезиροваннοму в κлеτκаχ зρелοму φжбροбласτнοму жнτеρφеροну (19 κД) , προвοдяτ на οснοве сρавненжя с элеκτροφορеτжчесκοй ποдвжжнοсτью маρκеρныχ белκοв, а τаκже с ποмοщью жммунοблοτжнга ρазделенныχ белκοвыχ φ цжй на ниτροцеллюлοзные φжльτρы ж жденτиφиκациж зοны жнτеρφеροна с ποмοщью οбρабοτκж φжльτροв в ρасτвορаχ, сοдеρжащиχ мышжные мοнοκлοнальные анτиτела προτив ]3-инτеρφеροна ж анτж-мышжные κροлжчьж анτжτела, κοнъ гжροванные с πеροκсидазοй из χρена. Пοсле сοοτвеτсτву щей προцедуρы οκρашжванжя зοна жнτеρφеροна выгляджτ τ нοж ποлοсοй κορжчневοгο цвеτа на неοκρашеннοм φοне ни
- 18 - ροцеллюлοзнοгο φильτρа.
Сοдеρжаяие белκа в зοне, сοοτвеτсτвующей /31-инτеρ φеροну, сοсτавляеτ οκοлο 10% οτ суммаρяοгο белκа πлазмид- сοдеρжащиχ κлеτοκ Ε. сοϊζ ΒΗЙИгенеτиκа VI 903 (ρΡΚ-ΙΡЫ/эϊ- 5 Пροмышленная πρименимοсτь
Заявляемая ρеκοмбинанτная πлазмидная ДΗΚ ρΡΚ-шш.-ϊз , κοдиρующая сияτез φибροбласτнοгο /ы -ин τеρφеροна челοвеκа, наχοдиτ πρименение для ποлучения шτам мοв-προдуценτοв /31-инτеρφеροна челοвеκа с высοκοй аκ- 10 τивнοсτыο.
Заявляемыж шτамм баκτеρий Εзсϊιегϊсϊι±а сοϋ ΒΗИИгенеτиκаνь 903 (ρΡΚ-ϊΡЫβϊ-ϊз>-προдуценτ /в>1-ияτеρφеρ на челοвеκа наχοдиτ πρжменение в миκροбиοлοгичесκοй и ме- дицинсκοй προмышлеянοсτи для ποлучения 1-инτеρφеροна ч 15 лοвеκа, κοτορый мοжеτ πρименяτься в медицинсκοй πρаκτиκе.
Claims
- 19 -
ΦΟΡΜУЛΑ ИЗΟБЖГΕΗИЯ I. Ρеκοмбжнанτная πлазмждная κοджρующая сжнτез φжбροбласτнοгο 
веκа, χаρаκτеρизующаяся τем, чτο οна имееτ ρазмеρ 5 3,9 τыс.н.π. и сοсτοиτ жз следующжχ элеменτοв:
- ΒашΕϊ-ΒеϊΙ φρагменτа, ρазмеροм 3,4 τыс.н.π., веκτορнοй πлазмжды ρΡΚϊ24Β, ποлученнοй на οснοве ρΡΚ 4 и ρΜЬ2 ;
- ΕсοΚϊ-Заи ЗΑ φρагменτа πлазмжды ρϊы ρ> --Ьгρ 7,
10 ρазмеροм 510 н.π. , ж χаρаκτеρжзуеτся следующжмж πρизна κамж:
- сοдеρжжτ учасτοκ, οτвеτсτвенныж за иницжаπжю ρеπлжκаπжж ж ее ρегуляцжю - СοϊΕϊ -ρеπлжκοн, ген ρеπρе сορа сϊ-Ьа857 φага λ , ген усτοйчивοсτи κ амπицжллину Α
15 τандем Ρ -независимыχ τеρмжнаτοροв τρансκρжπциж φага ρегуляτορную οбласτь Ρнοβ ж ЗБ-ποследοваτельнοсτь гена κοджρующую ποследοваτельнοсτь зρелοгο φибροбласτнοгο и τеρφеροна челοвеκа ϊж^ϊ с сοбсτвенным меτиοнжнοвым κο нοм;
20 - сοеджнение ρегуляτορнοж οбласτж гена λсгο, κοд ρующей часτж ρι-жнτеρφеροна и τеρмжнаτοροв τρансκρжπц £ά οсущесτвленο τаκ, чτο πеρед генοм ΙШ61 οбρазοван г ный учасτοκ связыванжя ρжбοсοм, имеющжж следующую нуκл ную ποследοваτельнοсτ :
25 5/-...ΤΑлα&ΑαοττασΑϊα...-3/-, где ϊΑΑαΑссτ-зϋ -πο дοваτельнοсτь гена сгο φага λ , Αϊс-меτжοнжнοвый κοд жнτеρφеροна, а неποсρедсτвеннο за τеρνιжнжρующжм κοдοнο гена ιιмβϊ ρасποлοжен τандем ρ -независжмыχ τеρмжнаτορ τρансκρжπцжи φага £ά ; -'
30 - жмееτ унжκальные учасτκж узнавания ρесτρиκτаз с κοορдинаτа κοτοροгο являеτся началοм οτсчеτа (0), ΡνиΤ (-1110), Β§ϊΟ(-Ι480), ΑссΙ (~Ι870) , Ρνи Ι(~3360) ; деπ нжροвана 12.01.87 в κοллеκπжж κульτуρ мжκροορганизмοв Βсесοюзнοгο научнο-исследοваτельсκοгο жнсτжτуτа анτж-
35 биοτиκοв и заρегисτρиροвана за нοмеροм 1825.
2. Сποсοб κοнсτρужροванжя ρеκοмбинанτнοй πлазмидн - 20 - ДΗΚ ρΡΚ-ϊж ι-ιз πο π.Ι, χаρаϊζτеρизующижся τем, чτο веκτορную πлазмжду ρΡΚΙ24Β, сκοнсτρужροванную на οснοв πлазмжд ρΡΚ40 и ρΜЬ24, ρасщеπляюτ ρесτρжκπжοннымж эндο нуκлеазамж Εсοκι Ж Β§Ι 1 ж προвοдяτ сοеджненже бοльшег
5 жз οбρазующжχся φρагменτοв веκτορнοй мοлеκулы с
ΕсοΚϊ-ЗаиЗΑ φρагменτοм πлазмжды ρШρ--Ьгρ 7, сοдеρжащжм джρующую часτь зρелοгο /Ы-жнτеρφеροна, в ποлученнοж τ κжм οбρазοм ρеκοмбжнанτнοж πлазмжде ρΡΚ-ϊж^ι-13 προ вοдяτ сближенже ЗБ-ποследοваτельнοсτи гена сгο и леρв
10 гο (меτжοнжнοвοгο) κοдοна ϊ-инτеρφеροна, для чегο πлазмждную ДΗΚ гждροлжзуюτ ρесτρиκτазοй ΒашΗϊ, удаляюτ часτь нуκлеοτждοв с ποмοщью эκзοнуκлеазнοй аκτжвнοсτи ДΗΚ-ποлжмеρазы I Ε.сοϊ± , προявляющеся в услοвжяχ неπ нοгο набορа нуκлеοзждτρжφοсφаτοв в ρеаκциοннοй смеси,
15 φеρменτаτжвнο ρасщеπляюτ ДΗΚ ρесτρжκτазοй ΕсοΚϊ, οбρ баτываюτ зϊ-эндοнуκлеазοж для удаленжя οднοцеποчечныχ учасτκοв ДЩ, заτем вοссτанавлжваюτ двуцеποчечные κοнц с ποмοщью Κленοвсκοгο φρагменτа ДЖ-ποлжмеρазы I Ε.сο ж цжκлжвуюτ οбρазующжеся лжнейные мοлеκулы ДΗΚ ДΗΚ-лжг
20 зοж φага Τ4; ποлученным πρеπаρаτοм τρансφορмиρуюτ κлеτ κж Ε.сοϋ 0600 с οτбοροм τρансφορманτοв на сρеде с амπ циллинοм πρи κульτивжροванжж κлеτοκ πρи τемπеρаτуρе 28 с ποследующеж селеκπжей κлοнοв, οбладающжχ ποнжженнοй сκοροсτью ροсτа πρи 42°С, ποсле чегο жз οτοбρанныχ κлο
25 нοв выделяюτ ρеκοмбжнанτную πлазмждную ДΗΚ 
3. Шτамм баκτеρиж Εзсϊιегϊсϊι±а сοШ ΒΗИИгенеτжκа νь 903 (ρΡΚ-Шϊ]Ы-ιз)-προдуценτ ^1-инτеρφеροна челοве сοдаρжащжж ρеκοмбжнанτную πлазмждную ДЖ ρΡΚ-ϊж31-13 πο π.Ι, ποлученный меτοдοм геннοй инженеρии πуτем введ
30 нжя ρеκοмбжнанτнοж πлазмжднοй ДΗΚ ρΡΚ-ϊΡΝβϊ-ιз в баκτеρжи ΕзЫιег±сЗαϊа сοϋ , деποниροванныж 12.01.87 в κοллеκциж κульτуρ мжκροορганжзмοв Βсесοюзнοгο научнο жсследοваτельсκοгο инсτиτуτа анτибжοτжκοв ж заρегжсτρж ροванныж за нοмеροм 1825.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8820103A NL8820103A (nl) | 1987-02-09 | 1988-02-08 | Recombinant plasmide dna - phr-ifnbeta 1-13 coderende synthese van fibroblastisch humaan beta1-interferon, werkwijze ter bereiding ervan en een stam van de bacterie escherichia coli vniigenetika vl 903 (phr-ifnbeta1-13), die humaan beta1-interferon vormt, die dit bevat. |
| HU881692A HUT50871A (en) | 1987-02-09 | 1988-02-08 | Process for producing recombinant plasmid dna encoding human fibroblast-beta 1-interferon and escherichia coli comprising same |
| DE19883890050 DE3890050T1 (de) | 1987-02-09 | 1988-02-08 | Rekombination-plasmid-dns ppr-ifn(beta)1-13 die die synthese des menschlichen fibroblast-(beta)1-interferons kodiert, verfahren zum konstruieren derselben und stamm der bakterien |
| FI884556A FI884556A7 (fi) | 1987-02-09 | 1988-10-04 | Rekombinantplasmid-dna ppr-ifn 1-13, som kodas foer syntes av maenniskans fibroblast- 1-interferon, foerfarande foer framstaellning daerav och e.coli innehaollande detta. |
| GB8823728A GB2208866A (en) | 1987-02-09 | 1988-10-10 | Recombinant plasmid dna ppr-ifn¼-13, coding for synthesis of human fidroblast ¼-1 interferon, and strain of bacteria escherichia coli vniigenetika vl903 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU4191345/28 | 1987-02-09 | ||
| SU874191345A SU1703692A1 (ru) | 1987-02-09 | 1987-02-09 | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ -1 @ 1-13, кодирующа синтез фибробластного интерферона ( @ I) человека, способ ее конструировани , штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент @ I-интерферона человека |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO1988005819A1 true WO1988005819A1 (fr) | 1988-08-11 |
Family
ID=21284355
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/SU1988/000033 Ceased WO1988005819A1 (fr) | 1987-02-09 | 1988-02-08 | ADN DE PLASMIDES RECOMBINANT pPR-IFNbeta1-13, CODANT POUR LA SYNTHESE D'INTERFERON-beta1 DE FIBROBLASTE HUMAIN, PROCEDE POUR SA CONSTRUCTION ET SOUCHE DE BACTERIES ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFNbeta1-13) A TITRE DE PRODUCTEUR D'INTERFERON-beta1 HUMAIN, LE CONTENANT |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01502478A (ru) |
| CH (1) | CH676996A5 (ru) |
| FI (1) | FI884556A7 (ru) |
| GB (1) | GB2208866A (ru) |
| HU (1) | HUT50871A (ru) |
| NL (1) | NL8820103A (ru) |
| SE (1) | SE8803567L (ru) |
| SU (1) | SU1703692A1 (ru) |
| WO (1) | WO1988005819A1 (ru) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0593792B2 (en) * | 1992-10-14 | 2004-01-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel L-threonine-producing microbacteria and a method for the production of L-threonine |
| NZ555979A (en) * | 2004-12-20 | 2009-04-30 | Cadila Healthcare Ltd | Process for preparing high levels of interferon beta |
| RU2386694C2 (ru) * | 2006-05-05 | 2010-04-20 | ООО "Биотех" | Штамм дрожжей pichia pastoris - продуцент гамма-интерферона цыпленка, рекомбинантная плазмидная днк, обеспечивающая биосинтез гамма-интерферона цыпленка, и способ ее конструирования |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4582800A (en) * | 1982-07-12 | 1986-04-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Novel vectors and method for controlling interferon expression |
-
1987
- 1987-02-09 SU SU874191345A patent/SU1703692A1/ru active
-
1988
- 1988-02-08 JP JP63502089A patent/JPH01502478A/ja active Pending
- 1988-02-08 CH CH3815/88A patent/CH676996A5/de not_active IP Right Cessation
- 1988-02-08 NL NL8820103A patent/NL8820103A/nl unknown
- 1988-02-08 HU HU881692A patent/HUT50871A/hu unknown
- 1988-02-08 WO PCT/SU1988/000033 patent/WO1988005819A1/ru not_active Ceased
- 1988-10-04 FI FI884556A patent/FI884556A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1988-10-07 SE SE8803567A patent/SE8803567L/ not_active Application Discontinuation
- 1988-10-10 GB GB8823728A patent/GB2208866A/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4582800A (en) * | 1982-07-12 | 1986-04-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Novel vectors and method for controlling interferon expression |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "Biotekhnologia", pod, red. A.A. BAEVE, 1984, Nauka, (Moscow), pages 204-205. * |
| ZHURNAL VSESOJUZNOGO KHIMICHESKOGO OBSCHESTVA IM. D. I. MENDELCEVA, tom XXIX Nr. 2, 1984, (Khimia, Moscow), E.D. SVERDLOV, "Interferony i Geneticheskaya Inzheneria", pages 86-89, (206-209). * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CH676996A5 (ru) | 1991-03-28 |
| FI884556A0 (fi) | 1988-10-04 |
| GB2208866A (en) | 1989-04-19 |
| SE8803567D0 (sv) | 1988-10-07 |
| GB8823728D0 (en) | 1988-12-07 |
| SU1703692A1 (ru) | 1992-01-07 |
| HUT50871A (en) | 1990-03-28 |
| JPH01502478A (ja) | 1989-08-31 |
| NL8820103A (nl) | 1989-01-02 |
| FI884556A7 (fi) | 1988-10-04 |
| SE8803567L (sv) | 1988-10-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0131623B1 (en) | Chimeric genes suitable for expression in plant cells | |
| Kato et al. | Isolation and characterization of mutants of Escherichia coli deficient in induction of mutations by ultraviolet light | |
| WO2020059962A1 (ko) | Bip 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 이용한 재조합 단백질의 제조 방법 | |
| CN113416734A (zh) | 一种提高gfap蛋白表达量的基因及其可溶性表达方法 | |
| CN121135898A (zh) | 一种具有高稳定性的低免疫原性重组i&iii融合型胶原蛋白及制备方法与应用 | |
| WO1988005819A1 (fr) | ADN DE PLASMIDES RECOMBINANT pPR-IFNbeta1-13, CODANT POUR LA SYNTHESE D'INTERFERON-beta1 DE FIBROBLASTE HUMAIN, PROCEDE POUR SA CONSTRUCTION ET SOUCHE DE BACTERIES ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFNbeta1-13) A TITRE DE PRODUCTEUR D'INTERFERON-beta1 HUMAIN, LE CONTENANT | |
| JPS62163694A (ja) | 宿生バチルス属微生物の異種構造形質転換方法 | |
| AU781788B2 (en) | Insertion sequence element derived from Ralstonia solanacearum | |
| WO1989011541A1 (en) | Extraction of human interleukin-4 from bacteria | |
| CN112538452A (zh) | 基于重组减毒单増李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗及其制备方法 | |
| JPS633793A (ja) | Ｉｘ因子の発現を確実にする真核細胞内組込みベクタ−、得られた細胞系、およびこれらの製造方法 | |
| EP0213085B1 (en) | Vector for the expression and secretion of heterologous gene products in bacillus subtilis | |
| Sorge | Bacteriophage lambda cloning vectors | |
| CN101948865B (zh) | 一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒及其构建方法 | |
| JPS59501852A (ja) | 鳥類の成長ホルモン | |
| CN119751607B (zh) | MgdE基因在调控牛分枝杆菌毒力中的应用 | |
| CN118599747B (zh) | 一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 | |
| WO1988005818A1 (fr) | ADN DE PLASMIDES RECOMBINANT pPR-IL2-19, CODANT POUR LA SYNTHESE D'INTERLEUKINE-2 HUMAINE, PROCEDE POUR SA CONSTRUCTION ET SOUCHE DE BACTERIES ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) a TITRE DE PRODUCTEUR D'INTERLEUKINE-2 HUMAINE, LE CONTENANT | |
| EP0358692B1 (en) | Cholera vaccines | |
| CN117924453B (zh) | 一种甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白的制备方法及应用 | |
| LU601008B1 (en) | A recombinant bacillus subtilis expressing the magainin 2 gene and its construction method. | |
| WO1987006613A1 (fr) | ADN A PLASMIDE RECOMBINANT pVN22, CODANT POUR LA BIOSYNTHESE DE L'INTERFERON DE LEUCOCYTES HUMAINS alpha-I1 ET SOUCHE DE PSEUDOMONAS sp. 31 (pVN22) PRODUCTRICE DE L'INTERFERON DE LEUCOCYTES HUMAINS alpha-I1 CONTENANT CET ADN | |
| AU583018B2 (en) | Gibbon interleukin | |
| Beadle | Gene structure and gene action | |
| CN120574336A (zh) | 一种融合蛋白及其在多发性硬化症治疗中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| AK | Designated states |
Kind code of ref document: A1 Designated state(s): CH DE FI GB HU JP NL SE US |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 884556 Country of ref document: FI |
|
| RET | De translation (de og part 6b) |
Ref document number: 3890050 Country of ref document: DE Date of ref document: 19890413 |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 3890050 Country of ref document: DE |