[go: up one dir, main page]

UA97086C2 - Виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язується з фактором росту нервової тканини (ngf) - Google Patents

Виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язується з фактором росту нервової тканини (ngf) Download PDF

Info

Publication number
UA97086C2
UA97086C2 UAA200601428A UAA200601428A UA97086C2 UA 97086 C2 UA97086 C2 UA 97086C2 UA A200601428 A UAA200601428 A UA A200601428A UA A200601428 A UAA200601428 A UA A200601428A UA 97086 C2 UA97086 C2 UA 97086C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
sequence
amino acid
antibody
antibodies
human
Prior art date
Application number
UAA200601428A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Кеннет Д. Уайлд
Джеймс Дж.С. Трінор
Хайчунь Хуань
Хезер Іну
Тай Дж. Чжан
Френк Мартін
Original Assignee
Емджен, Інк.
Медарекс, Інк
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Емджен, Інк., Медарекс, Інк filed Critical Емджен, Інк.
Priority to UAA201109302A priority Critical patent/UA115960C2/uk
Publication of UA97086C2 publication Critical patent/UA97086C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/04—Drugs for disorders of the respiratory system for throat disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/48—Nerve growth factor [NGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2842—Pain, e.g. neuropathic pain, psychogenic pain

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Abstract

Винахід належить до виділеного людського антитіла, яке специфічно зв'язується з фактором росту нервової тканини (NGF), нуклеїнової кислоти, що його кодує, виділеної клітинної лінії, фармацевтичної композиції, що його містить, лікарського засобу для лікування болісного розладу або стану, пов'язаного з підвищеною експресією NGF або підвищеною чутливістю до NGF, а також до способу виявлення NGF у біологічній пробі.

Description

Цей винахід додатково пропонує гібридні білки, що містять послідовність Ес-ділянки антитіла і одну або декілька послідовностей, позначених як ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 10, ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 12, ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 14, ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 16, ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 18, ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 20, ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 22 |і
ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 79-130. Такі молекули можна одержати за допомогою способів, описаних, наприклад, у публікації міжнародної заявки УМО 00/24782, яку включено до цього опису шляхом посилання. Такі молекули можуть експресуватись, наприклад, у клітинах ссавців (наприклад, у клітинах яєчника китайського хом'ячка) або бактеріальних клітинах (наприклад,у клітинах Е. соїї).
За певними аспектами, цей винахід пропонує антитіла, за варіантом, якому віддають перевагу, моноклональні антитіла, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, людські антитіла і людські моноклональні антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 2, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 4 або
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 6, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 10, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За варіантом, якому віддають перевагу, важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 4.
За певними аспектами, цей винахід пропонує антитіла, за варіантом, якому віддають перевагу, людські антитіла, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, моноклональні антитіла, за варіантом, якому віддають , найбільшу перевагу, людські моноклональні антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить константну ділянку важкого ланцюга, вибрану з групи, що включає константні ділянки важкого ланцюга дае, Ідс2г, ІдаЗ, Ідс4, ІДМ, ІдДА та ІДЕ або будь-який їхній алельний варіант (як обговорюється у роботі Кабат (Кара) та інших, 1991, Зедиепсез ої Ргоївїп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, п'яте видання, 0.5.ЮОерапйтепі ої Неайй апа Нитап Зегуісез, МІН Рибіїсайоп Мо. 91-3242, що включена до цього опису шляхом посилання), а варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 10, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За варіантом, якому віддають перевагу, антитіло за цим винаходом містить амінокислотну послідовність константної ділянки важкого ланцюга ІдДа2, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 4, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
За певними аспектами, цей винахід пропонує антитіла, за варіантом, якому віддають перевагу, людські антитіла, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, моноклональні антитіла, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, людські моноклональні антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 8, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 12, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
За певними аспектами, антитіла за цим винаходом містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 10, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За іншими аспектами, варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 12, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За додатковими аспектами, важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 14, ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 18 або ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 20, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За ще іншими додатковими аспектами, легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність представлену будь-якою з ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 16,
ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 20, ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 24, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
Цей винахід пропонує також антитіла, що специфічно зв'язуються з МОР, важкий ланцюг яких містить варіабельну ділянку, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 10, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а легкий ланцюг містить варіабельну ділянку, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 12, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
Цей винахід додатково пропонує виділені людські антитіла, що специфічно зв'язуються з МОР, де згадані антитіла містять: (а) важкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 79, або її антигензв'язувальний чи |імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 80, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент; (Б) важкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 81, або її антигензв'язувальний чи |імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 82, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент; (с) важкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 83, або її антигензв'язувальний чи |імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 84, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент; або (4) важкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 86, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 87, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
За певними аспектами, цей винахід пропонує також антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга і де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше 7595, за варіантом, якому віддають перевагу, 8095, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 8595, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше 90905, 9190, 9295, 93905, 94905, 9590, 9690, 9795, 98905 і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, приблизно 9995 ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 10, і де згаданий легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, і де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить послідовність що має щонайменше 8095, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше 8595, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 9095, 9195, 92905, 9390, 94905, 9590, 9695, 9790, 9895 і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, приблизно 9995 ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 12, де згадане антитіло специфічно зв'язується з МОР.
Цей винахід пропонує також антитіла, що специфічно зв'язуються з МОР, важкий ланцюг яких містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 14, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 16, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
За певними аспектами, цей винахід пропонує антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, і де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше 7595, за варіантом, якому віддають перевагу, 8095, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 8595, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше 90905, 91905, 9295, 9390, 9495, 9595, 9695, 97905, 9895 і за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, приблизно 9995 ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою будь-якою з ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 14, ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 18, ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 22, і де згаданий легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, і де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 80595, за варіантом, якому відцають перевагу, щонайменше 8595, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 9095, 9195, 9295, 9395, 9490, 9590, 96905, 9790, 9895 і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, приблизно 9995 ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 16, де згадане антитіло специфічно зв'язується з МОР.
Цей винахід пропонує також одноланцюгові антитіла, одноланцюгові Ем антитіла, Е(аб) антитіла, Е(ару антитіла і (Баб')» антитіла.
За конкретними аспектами, цей винахід пропонує легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 16, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
На додаток до цього, цей винахід пропонує важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, представлену будь-якою з ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 14, ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 18 або ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 22, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
Цей винахід має також відношення до виділених людських антитіл, що специфічно зв'язують МОР, де згадане антитіло містить: (а) остовні ділянки людського важкого ланцюга, СОВ1 ділянку людського важкого ланцюга, СОВ2 ділянку людського важкого ланцюга та СОВЗ ділянку людського важкого ланцюга; і (б) остовні ділянки людського легкого ланцюга, СОНІ ділянку людського легкого ланцюга, СОН2 ділянку людського легкого ланцюга та СОВЗ ділянку людського легкого ланцюга. За певними аспектами, СОВ1 ділянка людського важкого ланцюга може бути СОВ1 ділянкою важкого ланцюга моноклонального антитіла (тАбБ), позначеного 404, як показано ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 22, а СОВІ ділянка людського легкого ланцюга може бути СОНВІ1 ділянкою легкого ланцюга моноклонального антитіла 404, як показано ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 24. За іншими аспектами, СОВН2 ділянка людського важкого ланцюга може бути СОНВ2 ділянкою важкого ланцюга моноклонального антитіла 404, як показано ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 18, а СОВ2 ділянка людського легкого ланцюга може бути СОНВ2 ділянкою легкого ланцюга моноклонального антитіла 404, як показано
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 20. За ще іншими аспектами, СОНЗ ділянка людського важкого ланцюга є СОВЗ ділянкою важкого ланцюга моноклонального антитіла 404, як показано ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 14, а СОВЗ ділянка людського легкого ланцюга є СОНЗ ділянкою легкого ланцюга моноклонального антитіла 404, як показано ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 16.
Цей винахід пропонує також виділені людські антитіла, що специфічно зв'язують фактор росту нервової тканини, які містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 10,
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 79, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 81, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 83, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 85 або
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 87, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
Цей винахід додатково пропонує виділені людські антитіла, що специфічно зв'язують МОР, які містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 12, ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 80,
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 82, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 84, ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 86, ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 88,
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 89, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 90, ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 91 або ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме131, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент.
Антитіла за цим винаходом характеризуються здатністю антагонізувати щонайменше одну іп міо та/або іп мімо активність, пов'язану з МОЕ поліпептидами. За варіантом, якому віддають перевагу, цей винахід пропонує виділені людські антитіла проти людського МО з високою спорідненістю зв'язування з МОРЕ поліпептидами, де згадані антитіла зв'язуються з людським МОРЕ поліпептидом і відділяються від людського МОЕ поліпептиду з константою дисоціації (Ко) приблизно 50х1072 М або менше, як визначається за допомогою КіпЕХА, або які пригнічують МОЕ-індуковану виживаність у іп міо реакції нейтралізації з ІСзо приблизно 1х103 М або менше.
За варіантом, якому віддають перевагу, цей винахід пропонує виділене людське антитіло проти людського
МО, що має наведені нижче характеристики: а) пригнічує МОЕ-індуковану виживаність у іп мо реакції нейтралізації з ІС5о приблизно 1х109 М або менше; р) має СОВЗ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 14 і с) має СОВЗ легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 16.
Цей винахід пропонує також виділені людські антитіла або їх антигензв'язувальні чи імунологічно функціональні імуноглобулінові фрагменти, що специфічно зв'язуються з МОРЕ з високою спорідненістю, де згадані антитіла або фрагменти відділяються від людського МОЕ поліпептиду з Ко приблизно 1х109 або менше і нейтралізують біологічну активність людського МОРЕ у стандартній іп міо реакції з ІСвюо приблизно 1х108 М або менше, і де антитіла або фрагменти містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить: а) СОВІ ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули: а!а?аЗазах де: а! - полярний гідрофільний амінокислотний залишок; а? - ароматичний амінокислотний залишок; аз - аліфатичний, полярний гідрофобний, ароматичний амінокислотний залишок; а? - нейтральний гідрофобний або аліфатичний амінокислотний залишок; і а? - аліфатичний або полярний гідрофільний амінокислотний залишок; р) СОВ2 ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули:
БІБЬ2ЬЗЬТЬСЬСЬТЬЗЬТЬ ЮБЬІ1Ь12БІ13Б14515516ф17 де: р' - аліфатичний, полярний гідрофобний або ароматичний амінокислотний залишок; ре - аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; р3 - полярний гідрофільний або ароматичний амінокислотний залишок; р" - полярний гідрофільний, гідрофобний або ароматичний амінокислотний залишок; 05-23, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні або аліфатичні амінокислотні залишки; Б"9 - полярний гідрофільний, ароматичний або аліфатичний амінокислотний залишок; р!!! - ароматичний або гідрофобний амінокислотний залишок; р? - аліфатичний гідрофобний або полярний гідрофільний амінокислотний залишок; Б'З - аліфатичний, гідрофобний або полярний гідрофільний амінокислотний залишок; Бр!" і р'Є, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні амінокислотні залишки; Б'5 - аліфатичний або ароматичний гідрофобний амінокислотний залишок; і р!" - аліфатичний кислий амінокислотний залишок; і с) СОВЗ ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули: сіс2еЗсасзсбст сво юс с12с13с14с15рі16р17 де: с! - відсутня або являє собою аліфатичний амінокислотний залишок; с? - відсутня або являє собою полярний гідрофільний або ароматичний гідрофобний амінокислотний залишок; с3 і с", незалежно одна від одної, відсутні або являють собою полярні гідрофільні, ароматичні гідрофобні або аліфатичні амінокислотні залишки; с? - відсутня або являє собою полярний гідрофільний, аліфатичний або ароматичний амінокислотний залишок; сб - відсутня або являє собою полярний гідрофільний або аліфатичний амінокислотний залишок; с" - полярний гідрофільний або аліфатичний амінокислотний залишок; с - полярний гідрофільний, гідрофобний або ароматичний амінокислотний залишок; с? - полярний гідрофільний, ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; с! - полярний гідрофільний, ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; с!!-с!З, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні або ароматичні гідрофобні амінокислотні залишки; с!" - аліфатичний або ароматичний гідрофобний амінокислотний залишок; с! - полярний гідрофільний або нейтральний гідрофобний амінокислотний залишок; с: - відсутня або являє собою полярний гідрофільний амінокислотний залишок; і с!" - ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок.
За одним аспектом, а! - полярний гідрофільний амінокислотний залишок; а? - ароматичний гідрофобний амінокислотний залишок; аз - аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; а? - нейтральний гідрофобний амінокислотний залишок; а? - полярний гідрофільний амінокислотний залишок; р! - аліфатичний або ароматичний амінокислотний залишок; 02 - Ме; 3 - полярний гідрофільний амінокислотний залишок; р - полярний гідрофільний або ароматичний амінокислотний залишок; Б2-рУ, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні або аліфатичні амінокислотні залишки; Б'9 - аліфатичний амінокислотний залишок; р О- Тут; р? - аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; р!З - аліфатичний або полярний гідрофільний амінокислотний залишок; Б" і р'Є, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні амінокислотні залишки; і Б! - аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; Б!" - аліфатичний кислий амінокислотний залишок; с! - відсутня або являє собою аліфатичний амінокислотний залишок; сг - відсутня або являє собою полярний гідрофільний або ароматичний гідрофобний амінокислотний залишок; с3 і с", незалежно одна від одної, відсутні або являють собою полярні гідрофільні, ароматичні гідрофобні або аліфатичні амінокислотні залишки; с? - відсутня або являє собою полярний гідрофільний амінокислотний г залишок; сб - відсутня або являє собою полярний гідрофільний або аліфатичний амінокислотний залишок; с" - полярний гідрофільний або аліфатичний амінокислотний залишок; с - полярний гідрофільний, гідрофобний або ароматичний амінокислотний залишок; с? - полярний гідрофільний, аліфатичний або ароматичний гідрофобний амінокислотний залишок; с? - полярний гідрофільний, ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; с!!-с!3, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні або ароматичні гідрофобні амінокислотні залишки; с! - аліфатичний або ароматичний гідрофобний амінокислотний залишок; с! - полярний гідрофільний або нейтральний гідрофобний амінокислотний залишок; с: - відсутня або являє собою полярний гідрофільний амінокислотний залишок; і с!" - ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок.
За конкретним аспектом, а! - Зег, Ар або Тнг; аг - Туг; аз - Діа, Зег, Тгтр або Су; а" - Меї або Пе; а? - Ні, Спу або Авп; р! - Туг, Спу, Пе або Авр; р» - Ме; 03 - Зег, ТНг, Туг або Авп; Б" - Тгтр, Агу або Ро; р - Зег, Авп або су; ре - Вег, Аго, А5р або Сту; Б" - Зеї, Ніз або слу; 08 - бег, Пе, А5р або Тнг; 09 - І ем, Пе або Тпг; р - слу, Гу або Ре; р - Туг р: - Аіа або бег; р!З - Авр, Спіу або Рго; Б'Є - бег; р!5 - Ма! або РНе; Б'Є - ув або Сіп; Б!" - спу; с! - відсутня або являє собою аліфатичний амінокислотний залишок; с? - відсутня або являє собою Туг; с3 та с", незалежно одна від одної, відсутні або являють собою Туг, Авп, Ма! або Сім; с? відсутня або являє собою 5ег,
Суу або Тур; сх відсутня або являє собою 5ег, Сіу, Сім або І ви; с" - Сіу, Агу або Авр; сз - Тгр, Ріо, бег або Тнг; с - Ні, Су або Туг; с! - Ма), Туг або Аго; с!!-с3, незалежно одна від одної, являють собою 5ег, Ре, Туг, Авр або Авп; с!" - Ріє, МаїЇ або Су; с!» - Мег або Авр; с"хЄ відсутня або являє собою Авр або Авп; і с!" - Туг або Маї.
За іншим конкретним аспектом, а! - бег або Авр; а? - Туг; аз - ЛІіа або 5бег; а" - Меї або Іе; аз - Ні або Авп; р' - Тугабо слу; р - Пе; 03 - Зег, ТНг, Туг або Авп; р" - Тгр, Аго або Рго; Б: - Зег або Авп; ре - бег або Аго; р" - Ніб або сту; 58 - Ме або Тнпг; 9 - І ем, Пе або Тнг; 09 - сіу або Рне; Б"! - Туг; р": - Аа або бег; 53 - Авр або Стпу; ря -
Зе; Б: - Ма! або РНе; Б'Є - ув або Сп; 67 - Су; с! - відсутня або являє собою Су; с? - відсутня або являє собою Туг; с та с", незалежно одна від одної, відсутні або являють собою Туг, Сіу або Маї; с? відсутня або являє собою 5ег; се - Зег або Су; с" - Сіу або Аго; с" - Ттр або Рго; с" - Нів, Сіу або Туг; с!о - Ма| або Туг; с!!-с8, незалежно одна від одної, являють собою 5ег, Туї, Рпе або Авр; с!" - Рне або маї; с!» - Меї або Авр; с'б відсутня або являє собою Авр; і с!" - Туг або Маї.
За іншими конкретними аспектами: а) СОВІ1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 22, СОВН2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 18, ії СОВАЗ важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 14; р) СОВ1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 92, СОВН2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 93, ії СОВАЗ важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме94; с) СОВІ важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 98, СОН2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 99, ії СОВАЗ важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 100; а) СОВА важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 104,
СОВ2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 105, ії СОВЗ важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 106; е) СОВІ важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 110,
СОВ2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 111, Її СОВЗ важкого ланцфга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 112;
У СОВІ1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 116, СОВ2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 117, ії СОВАЗ важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 118.
Цей винахід пропонує також виділене людське антитіло або його антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, що специфічно зв'язується з МОРЕ, де згадане антитіло або фрагмент містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить: а) СОВІ ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули: аіа2аЗазазабатазаза Юа а12 де: а! - полярний гідрофільний амінокислотний залишок; а?, а"! і а!г, незалежно одна від одної, являють собою аліфатичні або гідрофобні амінокислотні залишки; аз, а», а" і аї, незалежно одна від одної, являють собою аліфатичні, полярні гідрофільні або гідрофобні амінокислотні залишки; а? - полярний гідрофільний амінокислотний залишок; а? - аліфатичний або гідрофобний амінокислотний залишок; а? - відсутня або являє собою аліфатичний або полярний гідрофільний амінокислотний залишок; і а"? - аліфатичний, ароматичний або гідрофобний амінокислотний залишок;
Б) СОВ2 ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули:
ВІБгЬЗЬТЬЗЬсЬ? де: р' - аліфатичний, полярний гідрофобний або гідрофобний амінокислотний залишок; р? - аліфатичний або гідрофобний амінокислотний залишок; З та р", незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні, аліфатичні або гідрофобні амінокислотні залишки; Б - полярний гідрофільний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; 655 - полярний гідрофільний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; і р" - полярний гідрофільний амінокислотний залишок; і с) СОВЗ ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули: сісд2оЗсасзсбостсвсос юс с1зсіЗсі4с15с16с17 де: с! і сг, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні амінокислотні залишки; с - полярний гідрофільний, аліфатичний або гідрофобний амінокислотний залишок; с", с? і сб, незалежно одна від одної, являють собою аліфатичні, полярні гідрофільні або гідрофобні амінокислотні залишки; с" - відсутня або являє собою полярний гідрофільний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; с - полярний гідрофільний або гідрофобний амінокислотний залишок; і с? - полярний гідрофільний амінокислотний залишок; і де згадане антитіло або фрагмент відділяється від людського МСЕ поліпептиду з Ко приблизно 1х1079 або менше і нейтралізує біологічну активність людського МОЕ у стандартній іп міо реакції з ІС5о приблизно 1х108
М або менше.
За одним аспектом, а", аз, а", а" і аї, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні амінокислотні залишки; аг, аб, а!! | а!г, незалежно одна від одної, являють собою аліфатичні гідрофобні амінокислотні залишки; а? - полярний гідрофільний або аліфатичний амінокислотний залишок; а? - відсутня або являє собою аліфатичний або полярний гідрофільний амінокислотний залишок; а"? - аліфатичний або ароматичний амінокислотний залишок; Б! - аліфатичний, полярний гідрофобний або гідрофобний амінокислотний залишок; р? - аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; БУ, р" і р", незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні амінокислотні залишки; Б? і ре, незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні або аліфатичні гідрофобні амінокислотні залишки; с! і с", незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні амінокислотні залишки; с - полярний гідрофільний, аліфатичний або гідрофобний амінокислотний залишок; с", с? і сб, незалежно одна від одної, являють собою аліфатичні, полярні гідрофільні або гідрофобні амінокислотні залишки; с" - відсутня або являє собою аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; се - гідрофобний амінокислотний залишок; і с? - полярний гідрофільний амінокислотний залишок.
За конкретним аспектом, а!, аз, а" і а" - Агу, бе, Сіп та 5ег, відповідно; а? - Аа; аз - Сіу або 5бег; а8 - Зег або Іе; аз - відсутня, Зег або Су; а" - Аа, Туг, Тгр або РНе; р! - Авр, С1у, Аа або Маї; р і 3 - Аа та 5ег, відповідно; р" - бег або Авп; р - І еи або Аго; Бе - См, Аа або Сіп; Б" - Зегабо ТНг с! і сг - Сп; с3 - Ріє, Туг, Ага або Ага; с" - Авп, Сіу або бе"; с? - Зег або Авп; се - Туг, Зег, Тгр або РНе; с" - відсутня, Рго або Нів; с" - І еи, Тр,
Туг або Аго; і с? - ТНг.
За іншим конкретним аспектом, а", аг, аз, а" і а" - Аго, Ага, бег, Сп та бег, відповідно; а? - Су або бег; ав -
Зег або Іе; а? - відсутня, бег або сту; а"? - Аа або Туг; р! - Ар або Су; 62 і 03 - Аа та Зеї, відповідно; Бе - бег або . Авп; 55 - І ем або Аго; 66 - Спи, Аа або Сіп; Б" - бег або Ти; с і се - Сп; с3 - Ріє, Туг, Агу або Аа; с" - Авп,
Суу або 5ег; с? - бег або Авп; се - Тут, Зеї, Тр або РнНе; с" - відсутня, Рго або Нів; с? - І ем, Тгр, Туг або Аго; і с -
ТНг.
За іншими конкретними аспектами: а) СОВІ1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 24, СОВ2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 20, ії СОВАЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 16; р) СОН легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 95, СОВ2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 96, ії СОВАЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме97; с) СОВІ1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 101, СОН2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 102, і СОВАЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 103; а) СОН легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 107, СОВН2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 108, і СОВАЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 109; е) СОВІ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 113, СОВ2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 114, ії СОВАЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 115;
У СОВІ1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 119, СОВ2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 120, ії СОВАЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 121; 9) СОВ1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 122, СОВН2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 123, і СОВАЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 124; п) СОВІ1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 125, СОН2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 126, і СОВАЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 127; її СОВА1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 128, СОВН2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 129, і СОВАЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 130; ) СОВІ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 132, СОВ2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 133, і СОВАЗ легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 134.
Частиною цього винаходу є також полінуклеотидні послідовності, що кодують нові людські антитіла проти людського МОРЕ, вектори, що містять полінуклеотидні послідовності, що кодують людські антитіла проти людського МО, клітини-хазяї, трансформовані векторами, що містять полінуклеотиди, що кодують людські антитіла проти людського МОРЕ, композиції, що містять людські антитіла проти людського МОРЕ та способи її одержання та застосування.
Цей винахід пропонує також способи визначення рівня МО у біологічній пробі, що включають стадію контактування згаданої проби з антитілом за цим винаходом або його антигензв'язувальним фрагментом.
Анти-МОЕ антитіло за цим винаходом може застосовуватись у будь-якому відомому аналітичному методі, наприклад, реакціях конкурентного зв'язування, прямих та непрямих сендвіч-методах, методах імунопреципітації та твердофазному імуноферментному аналізі (ЕГІЗА) (дивись Сола (оіа), 1987, Мопосіопаї!
Апіїродіеєє: А Мапиаї ої Тесппідцев, стор. 147-158, САС Ргевзв, Іпс.) для виявлення та кількісного визначення
МОР. Антитіла можуть зв'язувати МОБ зі спорідненістю, що відповідає застосованому аналітичному методу.
На додаток до цього, цей винахід пропонує способи лікування захворювання, пов'язаного з підвищеним продукуванням МОРЕ або підвищеною чутливістю до МОЕ, що включають стадію введення фармацевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить щонайменше одне антитіло за цим винаходом або його антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, індивіду, який цього потребує.
Конкретні варіанти здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, стануть очевидними з наведеного нижче докладнішого опису певних варіантів здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, та формули винаходу.
На фіг. 1 зображені графіки, що демонструють нейтралізацію активності МОРЕ у реакції нейтралізації на основі нейронів ОВС моноклональними антитілами 404, очищеними з кондиціонованих середовищ для гібридом.
На фіг. 2 зображені графіки, що демонструють експресію УВІ, стимульовану активністю людського МОБ і нейтралізацію активності МОЄ у реакціях нейтралізації на основі нейронів ОВО анти-МаЕ моноклональним антитілом (404), очищеним із кондиціонованих середовищ для гібридом.
На фіг. З зображені графіки, що демонструють нейтралізацію активності МОЕ у реакціях нейтралізації на основі нейронів ОВС тимчасово експресованими рекомбінантними моноклональними анти-МОЕ антитілами 404, експресованими як ІдДа1 або Іда2 та у клітинах, вирощених у ролерній культурі (Р) або у спін-культурі (5).
На Фіг. 4 зображений порівняльний аналіз послідовностей нейротрофінів. Цифрові позначення та елементи вторинної структури над послідовностями відносяться до зрілого людського МОР. Консервативні залишки помічені зірочкою, а ділянки з низькою гомологією послідовностей заштриховані. Людський МО -
ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 135; мишачий МОЕ-ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 136; ВОМЕ - Ме 137; МТЗ - ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 138.
На Фіг. 5 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності СОН1 важкого ланцюга анти-МОЕ антитіл 14010 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 98), 6НО (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 104), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 110), 426 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 116), 14011 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 92) та 404 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 22).
На фіг. 6 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності СОН2 важкого ланцюга анти-МОЕ антитіл 14010 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 99), 6НО (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 105), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 111), 4246 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 117), 14011 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 93) та 404 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 18).
На Фіг. 7 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності СОВЗ важкого ланцюга анти-МОЕ антитіл 14010 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 100), 6НО (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 106), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 112), 426 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 118), 14011 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 94) та 404 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 14).
На фіг. 8 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності СОВІ1 легкого ланцюга анти-МОЕ антитіл 14010 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 95), 6НО (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 107), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 113), 426ба (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 119), 40265 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 122), 4с02бс (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 125), 406а (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 128), 4с4бе (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 132), 14011 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 95) та 404 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 24) (антитіло 4С6ба на різних Фігурах позначається як 20031028340; антитіло 405656 на різних Фігурах позначається як 20031028351; антитіло 4с6с на різних Фігурах позначається як 20031071526; антитіло 4564 на різних Фігурах позначається як 20031028344; антитіло 4с6бе на різних Фігурах позначається як 20031000528).
На фіг. 9 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності СОВ2 легкого ланцюга анти-МОЕ антитіл 14010 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 96), 6НО (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 108), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 114), 4с6ба (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 120), 40265 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 123), 4с02бс (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 126), 40с6а (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 129), 4с4бе (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 133), 14011 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 96) та 404 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 20) (антитіло 4С6ба на різних Фігурах позначається як 20031028340; антитіло 405656 на різних Фігурах позначається як 20031028351; антитіло 4с36бс на різних Фігурах позначається як 20031071526; антитіло 4564 на різних Фігурах позначається як 20031028344; антитіло 4с6бе на різних Фігурах позначається як 20031000528).
На Фіг. 10 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності СОВЗ легкого ланцюга анти-МаЕ антитіл 14010 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 97), 6Н9У (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 109), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 115), 4с6ба (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 121), 40265 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 124), 4с02бс (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 127), 406а (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 130), 4с4бе (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 134), 14011 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 97) та 404 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 16) (антитіло 4С6ба на різних Фігурах позначається як 20031028340; антитіло 4565 на різних Фігурах позначається як 20031028351; антитіло 4с36бс на різних Фігурах позначається як 20031071526; антитіло 4564 на різних Фігурах позначається як 20031028344; антитіло 4с6бе на різних Фігурах позначається як 20031000528).
На фіг. 11 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності легкого ланцюга анти-МОаЕ антитіл 14010 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 82), 6НО (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 84), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 86), 4с6ба (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 88), 40460 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 89), 406бс (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 90), 42664 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 91), 4сббе (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 131), 14011 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 80) та 404 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 12) (антитіло 4С6ба на різних Фігурах позначається як 20031028340; антитіло 405656 на різних Фігурах позначається як 20031028351; антитіло 4(36бс на різних Фігурах позначається як 20031071526; антитіло 4564 на різних Фігурах позначається як 20031028344; антитіло 4с6бе на різних Фігурах позначається як 20031000528).
На Фіг. 12 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності важкого ланцюга анти-МаЕ антитіл 404 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 10), 40246 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 87), 14010 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 81), 14011 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 79), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 85) та 6НУ (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 83).
Докладний опис конкретних варіантів здійснення винаходу, яким віддають перевагу
Назви розділів, що застосовуються у цьому описі, переслідують лише організаційні цілі і не повинні розглядатись як такі, що обмежують об'єкт опису. Усі посилання, згадані у цьому описі, включено до цього опису шляхом посилання для будь-якої цілі.
Визначення
Для одержання рекомбінантних ДНК, синтезу олігонуклеотидів, культивування та трансформації тканин можна вдаватись до традиційних методів (наприклад, електропорації, ліпофекції). Ферментативні реакції та методи очищення можуть здійснюватись за специфікаціями виробника, за традиційними для цієї галузі методиками або за наведеним описом. Подальші методики та процедури можуть, у цілому, здійснюватись за способами, добре відомими у цій галузі та за описами, наведеними у різноманітних загальних та спеціалізованих джерелах, які наводяться шляхом посилання та обговорюються у цьому описі. Дивись, наприклад, довідник Сембрук (ЗатбгоокК) та інші, 2001, МО ЕС АА СГОМІМОа: А ГЕВОВАТОНУ МАМОАГ., З видання, Соїй Єрііпд Наог І арогагу Ргев5, Соїй Єргіпд Нагрог, Нью-Йорк, який включено до цього опису шляхом посилання з будь-якою метою. У разі відсутності конкретних визначень, у цьому описі у зв'язку з та по відношенню до лабораторних процедур та методів аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії, медичної та фармацевтичної хімії застосовується номенклатура, що є добре відомою і традиційно застосовуваною у цій галузі. Подібним чином, для хімічного синтезу, хімічних аналізів, одержання фармацевтичних препаратів, композицій, їх доставки та лікування хворих можуть застосовуватись традиційні методи.
Слід розуміти, що наведені нижче терміни, що вживаються у описі цього винаходу, у разі відсутності інших визначень, мають таке значення: Словосполучення "біологічна властивість", "біологічна характеристика" і термін "активність" відносно антитіла за цим винаходом застосовуються у цьому описі взаємозамінно і означають (але не обмежуються) спорідненість і специфічність відносно антигенної детермінанти (наприклад, зв'язування людського антитіла проти людського МОБ з людським МОРЕ), здатність до антагонізування активності цільового поліпептиду (наприклад, активності МО), іп мімо стабільність антитіла та імуногенні властивості антитіла. Іншими біологічними властивостями або характеристиками антитіла, що піддаються визначенню і визнаються у цій галузі, є, наприклад, перехресна реактивність (тобто з гомологами цільового поліпептиду нелюдського походження або, взагалі, з іншими білками або тканинами) і здатність до збереження високих рівнів експресії білка у клітинах ссавців. Вищезгадані властивості або характеристики можуть спостерігатись або вимірюватись за допомогою визнаних у цій галузі методів, у тому числі, але без обмеження, за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА), конкурентного ЕГІ5А, аналізу поверхневого плазмонного резонансу, іп міо та іп мімо реакцій нейтралізації (наприклад, Приклад 2) та імуногістохімічних методів зі зрізами тканин із різних джерел, у тому числі від людей, приматів або з будь-якого іншого джерела, відповідно до потреб. Конкретні активності та біологічні властивості людських антитіл проти людського МО докладно описані у наведених нижче Прикладах.
Словосполучення "виділений полінуклеотид", що застосовується у цьому описі, означає полінуклеотид геномного, КДНК або синтетичного походження чи їх комбінації, причому, завдяки своєму походженню, згаданий виділений полінуклеотид (1) не є пов'язаним із цілим полінуклеотидом або частиною полінуклеотиду, у складі якого виділений полінуклеотид знаходиться за природних умов, (2) є зв'язаним із полінуклеотидом, з яким він не є зв'язаним за природних умов або (3) не зустрічається за природних умов, як частина більшої послідовності.
Словосполучення "виділений білок", що згадується у цьому описі, означає, що цільовий білок (1) є вільним від щонайменше деяких інших білків, з якими він знаходиться за нормальних умов, (2) є по суті вільним від інших білків з того самого джерела, наприклад, від того самого виду, (3) експресується клітиною іншого виду, (4) було відділено від щонайменше приблизно 50 відсотків полінуклеотидів, ліпідів, вуглеводів або інших матеріалів, з якими він є пов'язаним за природних умов, (5) не є зв'язаним (ковалентною або нековалентною взаємодією) з частинами білка, з якими згаданий "виділений білок" є зв'язаним за природних умов, (6) є функціонально зв'язаним (ковалентною або нековалентною взаємодією) з поліпептидом, з яким він не є зв'язаним за природних умов або (7) не зустрічається за природних умов. Такий виділений білок може кодуватись геномною ДНК, кКДНК, мРНК або іншою РНК синтетичного походження чи будь-якою їх комбінацією.
За варіантом, якому віддають перевагу, згаданий виділений білок є по суті вільним від білків або поліпептидів чи інших забруднювачів, що знаходяться у його природному оточенні, які могли б перешкоджати його застосуванню (терапевтичному, діагностичному, профілактичному, науково-дослідному тощо). "Виділеним" антитілом є антитіло, яке було ідентифіковане і відділене та/або виділене зі складової його природного оточення. Забруднювальними складовими його природного оточення є матеріали, які могли б перешкодити діагностичному або терапевтичному застосуванням антитіла, і вони можуть включати ферменти, гормони та інші білкові або небілкові розчинені речовини. За варіантом, якому віддають перевагу, антитіло буде очищеним (1) до рівня, що перевищує 9595 (мас.) антитіла, що визначається за методом Лоурі, а за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, до рівня, що перевищує 9995 (мас), (2) до ступеня, достатнього для одержання щонайменше 15 залишків М-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності за допомогою секвенатора з центрифугальною чашкою, або (3) до однорідності за допомогою електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (505-РАСЕЕ) за відновних або невідновних умов із застосуванням барвника кумасі блакитного або, за варіантом, якому віддають перевагу, срібла. Виділене антитіло включає антитіло іп 5їш у межах рекомбінантних клітин, оскільки щонайменше одна складова природного середовища антитіла буде відсутньою.
Терміни "поліпептид" або "білок" означають молекули, що мають послідовність нативних білків, тобто білків, продукованих природними клітинами та специфічними нерекомбінантними клітинами, генно- інженерними або рекомбінантними клітинами, і включають молекули, що мають амінокислотну послідовність нативного білка або молекули, з яких були видалені, до яких були додані та/або замінені одна або декілька амінокислот нативної послідовності. Терміни "поліпептид" та "білок", зокрема, означають анти-МаЕ антитіла або послідовності, з яких були видалені, до яких були додані та/або замінені одна або декілька амінокислот анти-КОЕ антитіла.
Термін "фрагмент поліпептиду" означає поліпептид, що має делецію на амінокінці, делецію на карбоксильному кінці та/або внутрішню делецію. За певних варіантів здійснення довжина фрагментів становить від щонайменше 5 амінокислот до приблизно 500 амінокислот. Буде зрозуміло, що, за певними варіантами здійснення довжина фрагментів становить щонайменше 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 або 450 амінокислот. Особливо придатні фрагменти поліпептидів містять функціональні домени, у тому числі зв'язувальні домени. У разі анти-МОЕ антитіла, придатні фрагменти містять (але не обмежуються) СОВА (гіперваріабельну) ділянку, варіабельну ділянку важкого або легкого ланцюга, частину ланцюга антитіла або лише його варіабельну ділянку, що містить дві гіперваріабельні ділянки тощо.
Термін "специфічний зв'язувальний агент" означає природну або штучну молекулу, яка специфічно зв'язується з мішенню. Прикладами специфічних зв'язувальних агентів є (але ними не обмежуються) білки, пептиди, нуклеїнові кислоти, вуглеводи і ліпіди. За певними варіантами здійснення специфічним зв'язувальним агентом є антитіло.
Термін "специфічний МОЕ-зв'язувальний агент" означає специфічний зв'язувальний агент, який специфічно зв'язує будь-яку частину МОБ. За певними варіантами здійснення специфічним МОаБ- зв'язувальним агентом є антитіло, що специфічно зв'язується з МОР.
Термін "імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент", що застосовується у цьому описі, означає фрагмент поліпептиду, що містить щонайменше гіперваріабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів імуноглобуліну. Імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент за цим винаходом є здатним до зв'язування з антигеном. За варіантами, яким віддають перевагу, антиген являє собою ліганд, що специфічно зв'язується з рецептором. За цими варіантами здійснення зв'язування імунологічно функціонального імуноглобулінового фрагмента за цим винаходом запобігає зв'язуванню ліганду з його рецептором, з перериванням біологічної реакції, що є наслідком зв'язування ліганду з рецептором. За варіантом, якому віддають перевагу, імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент за цим винаходом специфічно зв'язується з МОБ. За варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, згаданий фрагмент специфічно зв'язується з людським МО.
Термін "природний", що застосовується у цьому описі і стосується об'єкта, означає те, що цей об'єкт може бути знайденим у природі. Наприклад, поліпептидна або полінуклеотидна послідовність, присутня у організмі (у тому числі вірусах), яка може бути виділена із природного джерела і навмисно людиною не модифікувалась, є природною.
Термін "функціонально зв'язаний" означає, що складові, до яких застосовується цей термін, знаходяться у взаємозв'язку, який надає їм можливість здійснення притаманних їм функцій за відповідних умов. Наприклад, контрольна послідовність, "функціонально зв'язана" з кодувальною послідовністю білка, є сполучена з нею таким чином, що експресія кодувальної послідовності білка відбувається за умов, сумісних із транскрипційною активністю контрольних послідовностей.
Термін "контрольна послідовність", що застосовується у цьому описі, означає полінуклеотидні послідовності, які можуть забезпечувати експресію, процесинг або внутрішньоклітинну локалізацію кодувальних послідовностей, з якими вони зв'язані. Природа таких контрольних послідовностей може залежати від організму-хазяїна. За конкретними варіантами здійснення контрольні послідовності для прокаріот можуть містити промотор, сайт зв'язування рибосом і термінатор транскрипції. За іншими конкретними варіантами здійснення, контрольні послідовності для еукаріот можуть включати промотори, що містять один або множину сайтів упізнання факторів транскрипції, енхансерних послідовностей транскрипції, термінаторів транскрипції та послідовностей поліаденілування. За певними варіантами здійснення "контрольні послідовності" можуть включати лідерні послідовності та/або послідовності гібридизаційного партнера.
Термін "полінуклеотид", що застосовується у цьому описі, означає одноланцюгові або дволанцюгові нуклеїновокислотні полімери довжиною щонайменше 10 нуклеотидів. За певними варіантами здійснення нуклеотидами, що входять до складу полінуклеотиду, можуть бути рибонуклеотиди або дезоксирибонуклеотиди чи модифікована форма нуклеотиду будь-якого з цих типів. Згадані модифікації включають модифікації основ, наприклад, бромуридину, модифікації рибоз, наприклад, арабінозиду та 2'3'- дидезоксирибози та модифікації внутрішньонуклеотидних зв'язків, наприклад, фосфоротіоату, фосфородітіоату, фосфороселеноату, фосфородиселеноату, фосфороанілотіоату, фосфороаніладату і фосфороамідату. Термін "полінуклеотид", зокрема, включає однониткові та двониткові форми ДНК.
Термін "олігонуклеотид", що застосовується у цьому описі, включає природні і модифіковані нуклеотиди, зв'язані природними та/або штучними олігонуклеотидними зв'язками. Олігонуклеотиди являють собою субпопуляцію полінуклеотидів, члени якої є, як правило, однонитковими і мають у довжину 200 або менше нуклеотидів. За певними варіантами здійснення олігонуклеотиди мають від 10 нуклеотидів до 60 нуклеотидів у довжину. За певними варіантами здійснення олігонуклеотиди мають 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 нуклеотидів або від 20 нуклеотидів до 40 нуклеотидів у довжину. Олігонуклеотиди можуть бути однонитковими або двонитковими, наприклад, для застосування при конструюванні генетичного мутанту. Олігонуклеотиди за цим винаходом можуть бути смисловими або антисмисловими олігонуклеотидами відносно білок-кодувальної послідовності.
Термін "природні нуклеотиди" означає дезоксирибонуклеотиди і рибонуклеотиди. Термін "модифіковані нуклеотиди" означає нуклеотиди з модифікованими або заміненими цукровими групами тощо. Термін "олігонуклеотидні зв'язки" означає олігонуклеотидні зв'язки, наприклад, фосфоротіоат, фосфородітісоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанілотіосат, фосфороаніладат, фосфороамідат тощо.
Дивись, наприклад, Лапланш (І аРіапспеє) та інші, 1986, Мисі. Асідй5 Нез., 14:9081; Стек (5іес) та інші, 1984, 3.
Ат. Спет. бос., 106:6077; Стейн (5іеєїп) та інші, 1988, Мисі. Асід5 Нев., 16:3209; Зон (70оп) та інші, 1991, Апії-
Сапсег Огид Оевідп, 6:539; Зон (7оп) та інші, 1991, ОГІСОМОСІ ЕОТІСЕ5 АМО АМАГОСИШЕ5: А РВАСТІСАЇГ.
АРРВОАСН, стор. 87-108, (редактор Ф. Екстейн (Р. Есквієїп)), Охіюга Опімегзйу Ргев5, Охіога Епдіапа; Стек (Зіес) та інші, патент США Мо 5,151,510; Ульман (пІтапп), Пейман (Реутап), 1990, Спетіса! Неміємув, 90:543, розкриття яких наведено у цьому описі шляхом посилання для будь-якої мети. Олігонуклеотид може містити виявну мітку, яка надає можливість виявлення олігонуклеотиду або його гібридизації.
Термін "вектор" означає нуклеїновокислотну молекулу, здатну до транспортування іншої нуклеїнової кислоти, з якою вона зв'язана. Вектором одного з типів є "плазміда", що являє собою кільцеву петлю двониткової ДНК, до якої можуть бути ліговані додаткові сегменти ДНК. Вектором іншого типу є вектор на основі вірусного геному, де додаткові сегменти ДНК можуть бути лігованими до вірусного геному. Певні вектори є здатними до автономної реплікації у клітини-хазяїні, до якої вони були введені (наприклад, вектори на основі бактеріального геному, що мають бактеріальний сайт ініціювання реплікації та вектори на основі епісом ссавців). Інші вектори (наприклад, вектори не на основі епісом ссавців) можуть бути інтегровані до геному клітини-хазяїна при введенні до згаданої клітини і, таким чином, розмножуватися разом із геномом хазяїна. Більше того, певні вектори є здатними до спрямування експресії генів, з якими вони є функціонально зв'язані. Такі вектори згадуються у цьому описі, як "рекомбінантні вектори експресії" (або просто "експресійні вектори"). Взагалі, експресійні вектори, придатні для методу рекомбінантних ДНК, часто мають форму плазмід. У цьому описі терміни "плазміда" і "вектор" можуть застосовуватись взаємозамінно, оскільки плазміда являє собою найпоширенішу форму вектора. Цей винахід, однак, включає інші форми експресійних векторів, наприклад, вектори на основі вірусного геному (наприклад, реплікаційно-дефектні ретровіруси, аденовіруси та аденоасоційовані віруси), які здійснюють еквівалентні функції.
Словосполучення "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн") означає клітину, до якої було введено рекомбінантний експресійний вектор. Фахівцям у цій галузі буде зрозуміло, що такі терміни, як мається на увазі, означають не лише конкретну клітину-об'єкт, але і потомство такої клітини. Оскільки у подальших генераціях можуть відбуватись певні модифікації унаслідок мутацій або впливу навколишнього середовища, таке потомство може, по суті не бути ідентичним батьківській клітині, однак воно, як і до того, включається до обсягу терміну "клітина-хазяїн", який застосовується у цьому описі. Для експресії антитіл за цим винаходом можуть застосовуватись найрізноманітніші системи експресії в хазяїні, у тому числі бактеріальні, дріжджові, бакуловірусні системи експресії та системи експресії у ссавцях (а також системи експресії з фаговою індикацією). Прикладом придатного експресійного вектора на основі бактеріального геному є рОС19. Для рекомбінантної експресії антитіл, клітина-хазяїн трансфікується одним або декількома рекомбінантними експресійними векторами, що несуть фрагменти ДНК, що кодує легкі та важкі ланцюги антитіла таким чином, що згадані легкі та важкі ланцюги експресуються у клітині-хазяїні і, за варіантом, якому віддають перевагу, секретуються до живильного середовища, у якому культивуються клітини-хазяї, з якого згадані антитіла можуть виділятись. Стандартна методика рекомбінантних ДНК застосовується для одержання генів важких і легких ланцюгів антитіла, включення цих генів до рекомбінантних експресійних векторів та введення цих векторів до клітин-хазяїв, описаних, наприклад, у довіднику Сембрук (ЗатрбгоокК) та інші, 2001,
МОГЕСИШГАА СГОМІМа: А Г АВОВАТОВУ МАМОАЇ., Соїа 5рііпд Нагбог І арогаюгієв, (під редакцією Осбел Ф.М. (Аизибеї Е.М.) та інших, Сштепі Ргоїосо!5 іп МоіІесцаг Віоіоду, Сгеепе Рибріїзпіпу Авзосіайіев, (1989)) та у патенті
США Ме 4,816,397 на ім'я Босс (Воз55) та інші.
Термін "клітина-хазяїн" застосовують для позначення клітини, яку було трансформовано або яка є здатною до трансформування нуклеїновокислотною послідовністю з подальшою експресією вибраного гена, який становить інтерес. Згаданий термін доти включає потомство батьківської клітини, незалежно від того, чи є згадане потомство ідентичним вихідній батьківській клітині за морфологією або організацією генетичного матеріалу, доки є присутнім вибраний ген.
Термін "трансдукція" означає перенесення генів від однієї бактерії до іншої, як правило, за допомогою фага. "Трансдукція" означає також набуття та перенесення еукаріотних клітинних послідовностей ретровірусами.
Термін "трансфекція" означає захоплення клітиною чужорідної або екзогенної ДНК і клітина є "трансфікованою" у разі, коли екзогенна ДНК була введена досередини клітинної мембрани. У цій галузі добре відомі численні методи трансфекції, які розкриваються у цьому описі. Дивись, наприклад, Грехем (Станпат) та інші, 1973, Мігоїюду 52:456; Сембрук (бЗатргоок) та інші, 2001, МОГЕСШО АВ СІГОМІМа: А ГАВОВАТОНУ
МАМИШАЇ, Со брііпд Нагрог І арогаюгіевз; Девіс (Оамі5) та інші, 1986, ВАБІС МЕТНОЮ5 ІМ МОГ ЕС АВ
ВІОГ ОС, ЕїІвемієг; Чу (Спи) та інші, 1981, Сепе, 13:197. Такі методи можуть застосовуватись для введення до придатних клітин-хазяїв однієї або декількох екзогенних ДНК.
Термін "трансформація", що застосовується у цьому описі, означає зміну генетичних характеристик клітини, і клітина є трансформованою у тому разі, коли вона була модифікована таким чином, що містить нову
ДНК. Наприклад, клітина є трансформованою у тому разі, коли її піддали генетичній модифікації порівняно з її нативним станом. Після трансфекції або трансдукції, трансформуюча ДНК може рекомбінуватись із ДНК клітини шляхом фізичної інтеграції з хромосомою клітини або може тимчасово підтримуватись як епісомний елемент без реплікації або може реплікуватись незалежно як плазміда. Клітина вважається стабільно трансформованою, коли ДНК реплікується разом із поділом клітини.
Термін "природний" або "нативний", у разі застосування у зв'язку з біологічними матеріалами, наприклад, молекулами нуклеїнової кислоти, поліпептидами, клітинами-хазяями тощо, означає матеріали, які знаходяться у природі, і не зазнавали маніпуляції з боку людини. Аналогічно, термін "штучний" або "ненативний", що застосовується у цьому описі, означає матеріал, який є відсутнім у природі або який був структурно модифікованим або синтезованим людиною.
Термін "антиген" означає молекулу або частину молекули, здатну до зв'язування селективним зв'язувальним агентом, наприклад, антитілом, і додатково здатну до застосування у організмі тварини для продукування антитіл, здатних до зв'язування з антигенною детермінантою цього антигену. Антиген може мати одну або декілька антигенних детермінант.
Термін "ідентичність", як відомо у цій галузі, означає спорідненість між послідовностями двох чи декількох поліпептидних молекул або двох чи декількох нуклеїновокислотних молекул, що визначається шляхом порівняння їх послідовностей. Термін "ідентичність" у цій галузі означає також ступінь спорідненості послідовностей між нуклеїновокислотними молекулами або поліпептидами, відповідно, що визначається сумісністю ниток двох чи декількох нуклеотидних або двох чи декількох амінокислотних послідовностей. "Ідентичність" встановлює відсоток ідентичних співпадінь між меншими з двох або декількох послідовностей з впорядкованим розміщенням двониткових розривів (у разі їх присутності), який визначають за допомогою конкретної математичної моделі або комп'ютерної програми (тобто "алгоритмів").
Термін "подібність" застосовують у цій галузі відносно спорідненої концепції але на відміну від "ідентичності", "подібність" означає ступінь спорідненості, який включає як ідентичні співпадіння, так і консервативні замінні співпадіння. Якщо дві поліпептидні послідовності мають, наприклад, 10/20 ідентичних амінокислот, а усі залишкові амінокислоти є неконсервативними замінами, у такому разі відсоток як ідентичності, так і подібності буде дорівнювати 5095. Якщо, у тому самому прикладі, є п'ять додаткових позицій, де є консервативні заміни, у такому разі відсоток ідентичності залишиться на рівні 5095, а відсоток подібності буде становити 7595 (15/20). Таким чином, у тих випадках, де є консервативні заміни, відсоток подібності між двома поліпептидами буде вищим за відсоток ідентичності між цими двома поліпептидами.
Ідентичність і подібність споріднених нуклеїнових кислот і поліпептидів може бути легко обчислена за відомими методами. До них належать (але ними не обмежуються) методи, описані у СОМРИТАТІОМАЇ.
МОГЕСШАА ВІОГОСУ (редактор Леек А.М. (їе5к АМ.), 1988, Охга Опімегзйу Ргев5, Мем Хоїк;
ВІОСОМРИТІМО: ІМЕОАВМАТІС5 АМО СЕМОМЕ РАОШЕСТУЬ, (редактор Сміт Д.В. (Фтійй ЮЛМУ.)), 1993, Асадетіс
Ргезв, Мем Хоїк; СОМРИТЕВ АМАЇ У5І5 ОРГ БЕОШЕМСЕ ВАТА, Раг!і 1, (редактори Гріффін А.М. (Спйп А.М.),
Гріффін Г.Дж. (Стійіп Н.С2.)), 1994, Нитапа Ргезз, Мем/ УЧегзеу; фон Гейне Дж. (моп Неїпіє с.), «ЕООЕМСЕ
АМАГ У5БІ5 ІМ МОГЕСШ АВ ВІОГОСУ, 1987, Асадетіс Ргезв; ЗЕОШОЕМСЕ АМАЇ У5І5 РАЇМЕВ, (ГрібсковВ. (спреком У.), Деверо Дж. (Оємегеих .)), 1991, М. БюсКюоп Ргев55, Мем Моїк; Карілло (Сапіпо), 1988, БІАМ У.
Арріїга маб., 48:1073; Дурбін (Оитіп) та інші, 1998, ВІЙГОСІСАЇ ЗЕОШЕМСЕ АМАЇ 515, Сатргдде Опіметейу
Ргевв.
Методи визначення ідентичності, яким віддають перевагу, розробляються таким чином, щоб вони забезпечували найбільшу сумісність між послідовностями, що перевіряються. Методи визначення ідентичності описуються у доступних комп'ютерних програмах. Методи комп'ютерних програм із визначення ідентичності двох послідовностей, яким віддають перевагу, включають (але ними не обмежуються) пакет програм СО, що містить програми САР (Деверо (Оемегеєих) та інші, 1984, Мисі. Асійа Нез., 12:387; Сепеїййсв Сотршиїег Сігоир,
Опімегеайу ої М/ізсопвзіп, Мадізоп, штат Вісконсін), ВІ А5ТР, ВІ АБ5ТМ та ЕА5ТА (Алтигул (АЇЇ5спиЇ) та інші, 1990,
У. Мої. ВіоіІ., 215:403-410). Програма ВГА5ТХ є доступною від Національного центру з біотехнологічної інформації (Майопа! Сепієег г Віоїесппоіоду Іпіогтайоп (МСВІ)) та з інших джерел (ВІ А5Т Мапиаї, Алтшул (Аїїзспи) та інші, МСВ/МІМ/МІН ВеїШезада, МО 20894; Алтшул (АїЇївспи!) та інші, 1990, дивись вище). Для визначення ідентичності може застосовуватись також добре відомий алгоритм Сміта Уотермена (Зтіїйп
Магетптап аідопйтт).
Наслідком застосування певних схем порівняльного аналізу з впорядованим розміщенням двох амінокислотних послідовностей може виявитись сумісність лише короткої ділянки двох згаданих послідовностей, і ця невелика впорядковано розміщена ділянка може мати дуже високу ідентичність послідовностей, незважаючи навіть на відсутність значної спорідненості між двома непроцесованими послідовностями. Відповідно, за певними варіантами здійснення наслідком застосування вибраного методу порівняльного аналізу (програма САР) виявиться впорядковане розміщення, що охоплює щонайменше 50 суміжних амінокислот цільового поліпептиду.
Наприклад, у разі застосування комп'ютерного алгоритму САР (Сепеїййсз Сотршег Стоир, Опімегейу ої
Муівсопвзіп, Майдізоп, штат Вісконсін), два поліпептиди, у яких слід визначити відсоток ідентичності послідовностей, впорядковано розміщуються для оптимального співпадіння їх відповідних амінокислот ("суміщений відрізок", як визначається алгоритмом). За певними варіантами здійснення разом з алгоритмом застосовують штрафні бали за розрив (які обчислюються, як потроєна середня діагональ, де "середня діагональ" є середнім значенням діагоналі застосованої порівняльної матриці; "діагональ" являє собою бал або число, що приписується кожному абсолютному співпадінню амінокислоти конкретною порівняльною матрицею) і штрафні бали за довжину розриву (які, як правило, дорівнюють одній десятій штрафних балів за розрив), а також порівняльну матрицю, наприклад, РАМ 250 або ВГОБИМ 62. За певними варіантами здійснення алгоритмом застосовується також стандартна порівняльна матриця (дивись Дейхофф (Пбаупоїй) та інші, 1978, Айаз ої Ргоїєїп Зедиепсе апа бігисішге, 5:345-352 щодо порівняльної матриці РАМ 250; Хенікофф (Непікой) та інші, 1992, Ргос. Май). Асад. сі ОА, 89:10915-10919 щодо порівняльної матриці В ОБИМ 62).
За певними варіантами здійснення параметри порівняння поліпептидних послідовностей охоплюють наведене нижче: алгоритм: Нідлмен (Меедієтап) та інші, 1970, 9. Мої. Віо!., 48:443-453; порівняльна матриця: ВІ ОБИМ 62 від Хенікофф (Непікоїї) та інші, 1992, дивись вище; штрафні бали за розрив: 12; штрафні бали за довжину розриву: 4; поріг подібності: 0.
З вищенаведеними параметрами корисною може бути програма САР. За певними варіантами здійснення вищезгадані параметри є параметрами за замовчуванням для порівняння поліпептидних послідовностей (без штрафних балів за закінчення розриву) із застосуванням алгоритму САР.
Термін "гомологія" означає ступінь подібності між білюовими або нуклеїновокислотними послідовностями.
Інформація щодо гомології є корисною для розуміння генетичної спорідненості певних видів білків або нуклеїнових кислот. Гомологія може визначатись шляхом впорядкованого розміщення і порівняння послідовностей. За типовим варіантом, для визначення гомології амінокислот, білкову послідовність порівнюють із базою даних відомих білкових послідовностей. Гомологічні послідовності мають спільні функціональні одиниці на якійсь ділянці своїх послідовностей. Високий ступінь подібності або ідентичності, як правило, є свідченням гомології, хоча низький ступінь подібності або ідентичності не обов'язково вказує на відсутність гомолога.
Для визначення гомолога шляхом порівняння амінокислот однієї послідовності з амінокислотами іншої послідовності може застосовуватись декілька варіантів підходів. Взагалі, згадані варіанти підходів можна підрозділити на дві категорії: (1) порівняння фізичних характеристик, а саме полярності, заряду, вандерваальсівського об'єму, для створення порівняльної матриці; і (2) порівняння ймовірної заміни амінокислоти у послідовності будь-якою іншою амінокислотою, що грунтується на спостереженні багатьох білкових послідовностей відомих гомологічних білків, і створення Матриці Прийнятних Точкових Мутацій (Роіпі
Ассерієдй Миїайоп Маїгіх (РАМ)).
Відсоток ідентичності може обчислюватись шляхом застосування голки для відбирання програм (пакет програм ЕМВО55) або розширювача програм (пакет програм ЕМВО55) чи узгоджування програм Х, як модуля вектора МТІ пакета програм 9.0.0, із застосуванням значень параметрів, за замовчуванням (наприклад, 5 штрафних балів за присутність двониткового розриву, 15 штрафних балів за відкриття двониткового розриву, 6,6 штрафних балів за довжину двониткового розриву).
У цьому описі застосовуються двадцять традиційних амінокислот та їхні скорочені позначення. Дивись довідник ІММОМОГ ОС - А БЄММТНЕЗ5І5 2 видання, (редактори Е.С.Голаб (Е.5. Сошб), Д.Р. Грен (О.В. Сгеп)),
Зіпацег Ав5осіа(ев: Зипаепапа, штат Массачусетс, 1991, який включено до цього опису шляхом посилання для будь-яких цілей. Стереоізомери (наприклад, ЮО-амінокислоти) двадцяти традиційних амінокислот; штучні амінокислоти, наприклад, а-, а-двозаміщені амінокислоти, М-алкіламінокислоти, молочна кислота та інші нетрадиційні амінокислоти можуть також бути придатними складовими для поліпептидів за цим винаходом.
Прикладами нетрадиційних амінокислот є: 4-гідроксипролін, у-карбоксиглутамат, є-М,М,М-триметиллізин, є-М- ацетиллізин, О-фосфосерин, М-ацетилсерин, М-формілметіонін, З-метилгістидин, 5-гідроксилізин, о-М- метиларгінін та інші подібні амінокислоти та імінокислоти (наприклад, 4-гідроксипролін). У позначенні поліпептидів, яке застосовується у цьому описі, лівостороннім напрямом є напрям до амінокінця, а правостороннім напрямом є напрям до карбоксильного кінця, відповідно до стандартного застосування і традиції.
Природні залишки можуть підрозділятись на класи на основі властивостей звичайних бічних ланцюгів: 1) гідрофобні: норлейцин (Мог), Меї, Аа, Маї, І еи, Пе, РНе, Тр, Туг, Рго; 2) полярні гідрофільні: Аго, Азп, Авр, Сп, СІМ, Нів, Гуз, Зег, ТА; 3) аліфатичні: Аа, Су, Пе, Геи, Маї, Рго; 4) аліфатичні гідрофобні: Аа, Пе, І еи, Маї, Рго; 5) нейтральні гідрофільні: Сув, Зег, ТНг, Авп, Сп; б) кислі: Ар, СИ; 7) основні: Нів, І уз, Аго; 8) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: Сіу, Рго; 9) ароматичні: Нів, Тгр, Туг, Ре; і 10) ароматичні гідрофобні: Рпе, Тгр, Туг.
Консервативні амінокислотні заміни можуть включати заміну члена одного з цих класів іншим членом того самого класу. Консервативні амінокислотні заміни можуть охоплювати штучні амінокислотні залишки, які, як правило, включаються скоріше хімічним синтезом пептидів, аніж синтезом у біологічних системах. Сюди включаються пептидоміметики та інші обернені або інвертовані форми амінокислотних складових.
Неконсервативні заміни можуть включати заміну члена одного з цих класів членом іншого класу. Такі замінені залишки можуть вводитись на ділянки людського антитіла, що є гомологічними з антитілами нелюдського походження або на негомологічні ділянки молекули.
У разі здійснення таких замін, за певними варіантами здійснення, до уваги може прийматись гідропатичний індекс амінокислот. Кожній амінокислоті, на основі характеристик її гідрофобності та заряду, був приписаний гідропатичний індекс. Вони є такими: ізолейцин (4,5); валін (144,2); лейцин (13,8); фенілаланін (12,8); цистеїн/цистин (12,5); метіонін (41,9); аланін (1,8); гліцин (-0,4); треонін (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролін (-1,6); гістидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамін (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагін (- 3,5); лізин (-3,9); і аргінін (-4,5).
Важливість гідропатичного індексу амінокислот при наданні білку інтерактивної біологічної функції є зрозумілою у цій галузі (дивись, наприклад, Кайт (Куїеє) та інші, 1982, 9. Мої. Віої!., 157:105-131). Відомо, що певні амінокислоти можуть бути замінені іншими амінокислотами, що мають подібний гідропатичний індекс або коефіцієнт, і зберегти, як і досі, подібну біологічну активність. При здійсненні замін, виходячи з гідропатичного індексу, за певними варіантами здійснення включають заміну амінокислот, гідропатичні індекси яких знаходяться у межах 32. За певними варіантами здійснення включають амінокислоти, гідропатичні індекси яких знаходяться у межах 41, і за певними варіантами здійснення включають амінокислоти, гідропатичні індекси яких знаходяться у межах 50,5.
У цій галузі зрозуміло також, що заміна подібних амінокислот може здійснюватись ефективніше на основі гідрофільності, зокрема, у тому разі, коли одержаний таким чином біологічно функціональний білок або пептид призначається для застосування у імунологічних варіантах здійснення, що розкриваються у цьому описі. За певними варіантами здійснення найбільша місцева середня гідрофільність білка, яка регулюється гідрофільністю прилеглих амінокислот, корелює з його імуногенністю та антигенністю, тобто з біологічними властивостями білка.
Цим амінокислотним залишкам були приписані наведені нижче значення гідрофільності: аргінін (13,0); лізин (143,0); аспартат (ї3,031); глутамат (143,01); серин (10,3); аспарагін (40,2); глутамін (10,2); гліцин (0); треонін (-0,4); пролін (-0,5--1); аланін (-0,5); гістидин (-0,5); цистеїн (-1,0); метіонін (-1,3); валін (-1,5); лейцин (- 1,8); ізолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенілаланін (-2,5); і триптофан (-3,4). При здійсненні замін, виходячи з подібних значень гідрофільності, за певними варіантами здійснення включають заміну амінокислот, значення гідрофільності яких знаходяться у межах 312, за певними варіантами здійснення включають амінокислоти, значення гідрофільності яких знаходяться у межах ї1, і за певними варіантами здійснення включають амінокислоти, значення гідрофільності яких знаходяться у межах 0,5. За послідовностями основних амінокислот, на основі гідрофільності, можуть також бути ідентифіковані антигенні детермінанти. Ці ділянки називають також "коровими ділянками антигенних детермінант".
Зразкові амінокислотні заміни наведені у Таблиці 1.
Таблиця 1
Амінокислотні заміни
Зразкові заміни віддають залишки перевагу к шннньне норлейцин теодвеиня
Аа, Рпе кислота, Сп, Авп норлейцин
Досвідчений фахівець зможе визначити відповідні варіанти поліпептиду, як наведено у цьому описі, за допомогою добре відомих методів. За певними варіантами здійснення фахівець у цій галузі може визначити відповідні ділянки молекули, які можуть бути змінені без руйнування активності, обираючи мішенню ті ділянки, які, як гадають, не є важливими для активності. За іншими варіантами здійснень досвідчений фахівець може визначити залишки та ділянки молекул, які зберігаються серед подібних поліпептидів. За додатковими варіантами здійснень навіть ділянки, які можуть бути важливими для біологічної активності або для структури, можуть бути піддані консервативним амінокислотним замінам без знищення біологічної активності або без виявлення негативного впливу на структуру поліпептидів.
На додаток до цього, фахівець у цій галузі може переглянути дані структурно-функціональних досліджень, які визначають залишки подібних поліпептидів, що є важливими для активності або структури. Приймаючи до уваги результати такого порівняння, досвідчений фахівець може прогнозувати важливість амінокислотних залишків у білку, що відповідають амінокислотним залишкам, важливим для активності або структури у подібних білків. Фахівець у цій галузі для таких визначених важливих амінокислотних залишків може вибрати хімічно подібні амінокислотні заміни.
Фахівець у цій галузі може також проаналізувати об'ємну структуру і амінокислотну послідовність у зв'язку з такою структурою у подібних поліпептидів. Приймаючи до уваги таку інформацію, фахівець у цій галузі може прогнозувати впорядковане розміщення амінокислотних залишків антитіла відповідно до його об'ємної структури. За певними варіантами здійснення фахівець у цій галузі може уникнути варіанта внесення радикальних змін до амінокислотних залишків, які передбачаються на поверхні білка, оскільки такі залишки можуть бути залученими до важливих взаємодій з іншими молекулами. Більше того, фахівець у цій галузі може розробити експериментальні варіанти, які включають заміну однієї амінокислоти на кожному бажаному амінокислотному залишку. Після цього згадані варіанти можуть перевірятись у реакціях визначення активності, відомих фахівцям у цій галузі. Такі варіанти можуть застосовуватись для збирання інформації щодо придатних варіантів. Наприклад, у разі визначення того, що наслідком заміни певного амінокислотного залишку є знищена, небажано знижена або невідповідна активність, варіанти з такою заміною можуть виключатись. Іншими словами, виходячи з інформації, зібраної шляхом подібних звичайних експериментів, фахівець у цій галузі може легко визначити амінокислоти, які слід виключити з процесу замін або самостійно, або у поєднанні з іншими мутаціями.
Ряд наукових публікацій присвячено прогнозуванню вторинної структури. Дивись Молт (Мою, 1996, Сигт.
Ор. іп Віоїесп., 7:422-427; Чу (Споц) та інші, 1974, Віоспетівігу, 13:222-245; Чу (Спо) та інші, 1974,
Віоспетівігу, 113:211-222: Чу (Спо) та інші, 1978, Аду. Епгутої! Кеїаї. Агеаз Мої. Віо!., 47:45-148; Чу (Споц) та інші, 1979, Апп. Неу. Віоспет. 47:251-276; Чу (Спо) та інші, 1979, Віорпув. у., 26:367-384. Окрім того, зараз є доступними комп'ютерні програми, що допомагають визначити вторинну структуру. Один із методів прогнозування вторинної структури базується на моделюванні гомології. Наприклад, два поліпептиди або білки, що мають ідентичність послідовності, яка перевищує 3095, або подібність, яка перевищує 40905, часто мають подібну структурну топологію. Нещодавнє збільшення обсягу бази даних із структури білків (РОВ) забезпечує значне посилення ступеню прогнозованості вторинної структури, у тому числі потенційної кількості складок у межах структури поліпептиду або білка. Дивись Холм (Ноіт) та інші, 1999, Мисі. Асій. Вев., 27:244- 247. Висунули припущення (Бреннер (Вгеппег) та інші, 1997, Сцит. Ор. Бігисі. Віо!., 7:369-376) про існування обмеженої кількості складок у даного поліпептиду або білка і про те, що після визначення критичної кількості структур, структурне прогнозування стане набагато точнішим.
Додаткові методи прогнозування вторинної структури включають "нарізання різьби" (Джоунс (допев), 1997,
Ст. Ор. 5ігисі. Віо!., 7:377-387; Сіпші (Зіррі) та інші, 1996, Біписішге 4:15-19), "аналіз профілю" (Боуї (Вом/є) та інші, 1991, Зсіепсе 253:164-170; Грібсков ((апреком) та інші, 1990, Мей. Еплут. 183:146-159; Грібсков (спреком) та інші, 1987, Ргос. Маї. Асад. 5сі. 84:4355-4358) та "еволюційний зв'язок" (дивись Холм (Ноіт), 1999, (дивись вище); та Бреннер (Вгеппег!), 1997 (дивись вище)).
За певними варіантами здійснення варіанти антитіл включають глікозиловані варіанти, де кількість та/або тип сайту глікозилування був змінений, порівняно з амінокислотними послідовностями вихідного поліпептиду.
За певними варіантами здійснення білкові варіанти включають більшу або меншу кількість М-зв'язаних сайтів глікозилування, аніж нативний білок. М-зв'язаний сайт глікозилування характеризується послідовністю: Авп-Х-
Зег або Авп-Х-ТПГ, де амінокислотним залишком, позначеним як Х, може бути будь-який амінокислотний залишок, за винятком проліну. Заміна амінокислотних залишків для одержання цієї послідовності забезпечує одержання потенційно нового сайту для додання М-зв'язаного вуглеводного ланцюга. За альтернативним варіантом заміни, які ліквідують цю послідовність, будуть видаляти існуючий М-зв'язаний вуглеводний ланцюг.
Пропонується також реаранжування М-зв'язаних вуглеводних ланцюгів, де один або декілька М-зв'язаних сайтів глікозилування (як правило, природних) ліквідуються з утворенням одного або декількох нових М- зв'язаних сайтів. Додаткові варіанти антитіл, яким віддають перевагу, включають цистеїнові варіанти, де, порівняно з вихідною амінокислотною послідовністю, один або декілька цистеїнових залишків видаляють або замінюють на іншу амінокислоту (наприклад, серин). Цистеїнові варіанти можуть бути придатними у тому разі, коли антитіла повинні повторно укладатись до біологічно активної конформації, такої як, наприклад, після виділення нерозчинних тілець включення. Цистеїнові варіанти, як правило, мають меншу кількість залишків цистеїну, аніж нативний білок і, типово, мають парну їх кількість для зведення до мінімуму взаємодій, що є наслідком неспарованих залишків цистеїну.
За додатковими варіантами здійснення варіанти антитіл можуть включати антитіла, що містять модифікований Ес-фрагмент або модифіковану константну ділянку важкого ланцюга. Есо-фрагмент (де скорочення означає "фрагмент, що кристалізується") або константна ділянка важкого ланцюга можуть бути модифіковані шляхом мутації для надання антитілу змінених характеристик зв'язування. Дивись, наприклад,
Бартон (Випоп), Буф (УМоої), 1992, Адмапсез іп Іттипоіоду 51:1-84; Равеч (Рамеїсі)), Болланд (ВоїіІапа), 2001,
Аппи. Веу. Іттипої. 19:275-290; Шілдс (ЗПієїЇд5) та інші, 2001, дошгпаї ої Віої. Спет. 276:6591-6604; Теллман (ТеПетап), Джунханс (Чипопапв), 2000, Іттипоїоду 100:245-251; Медсан (Медезап) та інші, 1998, ЕЄиг. 9.
Іттипої. 28:2092-2100; усі ці роботи включено до цього опису шляхом посилання. Такі мутації можуть включати заміни, додання, делеції або будь-яку їх комбінацію, і здійснюються, як правило, сайт-спрямованим мутагенезом із застосуванням одного або декількох мутагенних олігонуклеотидів за методами, опис яких наведено у цьому описі, або за методами, відомими у цій галузі (дивись, наприклад, Сембрук (Затогоок) та інші, МОГЕСШГАВА СІ ОМІМОа: А ГАВОВАТОНУ МАМОАЇГ, З видання, 2001, Соїа брііпд Нагбог, М.У. та Бергер (Вегоєг), Кіммел (Кіттеї!), МЕТНОО5 ІМ ЕМ2УМОГ ОС, том 152, Сціде тю МоіІесшаг Сіопіпд Тесппідев, 1987,
Асадетіс Ргезвз, Іпс., Зап Оієдо, штат Каліфорнія, які включено до цього опису шляхом посилання).
За певними варіантами здійснення амінокислотними замшами є заміни, які: (1) знижують сприйнятливість до протеолізу, (2) знижують сприйнятливість до окиснення, (3) змінюють зв'язувальну спорідненість для утворення білкових комплексів, (4) змінюють зв'язувальні спорідненості та/або (5) надають або модифікують інші фізико-хімічні або функціональні властивості таких поліпептидів. За певними варіантами здійснення одиночна амінокислотна заміна або численні амінокислотні заміни (за певними варіантами здійснення консервативні амінокислотні заміни) можуть здійснюватись у природній послідовності (за певними варіантами здійснення на ділянці поліпептиду за межами домену(-ів), що забезпечує міжмолекулярні контакти). За варіантами здійснення, яким віддають перевагу, консервативна амінокислотна заміна, як правило, суттєво не змінює структурних характеристик вихідної послідовності (наприклад, замінна амінокислота не руйнує спіралі, що існує у вихідній послідовності, і не руйнує вторинної структури інших типів, що характеризує вихідну послідовність). Приклади визнаних у цій галузі вторинних та третинних структур поліпептидів описані у
РАВОТЕЇМ5, 5ТАОСТОВЕВ АМО МОГЕСШГАА РАЇМСІРІЕ5, (редактор Крейтон (Стеідніоп)), 1984, М.Н.
Егеетап апа Сотрапу, Мем Моїк; ІМГАОВОСТІОМ ТО РАОТЕІЇМ 5ТАВОСТИОВЕ (редактори К. Бренден (С.
Вгапаеєп), Дж. Туз (У. Тоогє)), 1991, Сапапа Рибіїзпіпо, Мем Хогк, М.У.; Торнтон (Тогпіоп) та інші, 1991, Майте 354:105; кожну з цих робот включено до цього опису шляхом посилання.
Аналоги пептидів широко застосовують у фармацевтичній промисловості як непептидні лікарські засоби з властивостями, аналогічними властивостям матричного пептиду. Непептидні сполуки такого типу називають "пептидними міметиками" або "пептгидоміметиками". Дивись Фошер (Рашспегє), 1986, Аду. Огид Вев. 15:29;
Вебер (Мебег), Фрідінгер (Егеїдіпдег), 1985, ТІМ5, 392; Еванс (Емапв) та інші, 1987, У. Мед. Спет. 30:1229; усі ці роботи включено до цього опису шляхом посилання для будь-яких цілей. Такі сполуки часто розробляються за допомогою комп'ютеризованого молекулярного моделювання. Пептидоміметики, структурно подібні до терапевтично придатних пептидів, можуть застосовуватись для одержання подібного терапевтичного або профілактичного ефекту. Взагалі, пептидоміметики є структурно подібними до парадигматичного поліпептиду (тобто поліпептиду, що має біохімічну властивість або фармакологічну активність), наприклад, людського антитіла, але мають один або декілька пептидних зв'язків, факультативно заміненими зв'язком, вибраним з групи, що включає: -СНо-МН-, -СІН2-5-, -СНа-СНе-, -«СНеСН- (цис і транс), -СООСН»-, -СН(ОН)СН»- і -СН2г5О-, методами, добре відомими у цій галузі. Систематична заміна однієї або декількох амінокислот консенсусної послідовності на ЮО-амінокислоту того самого типу (наприклад, О-лізин замість І -лізину) може застосовуватись у певних варіантах здійснення для одержання більш стійких пептидів. На додаток до цього, обмежені пептиди, що містять консенсусну послідовність або по суті ідентичний варіант консенсусної послідовності, можуть одержуватись за допомогою методів, відомих у цій галузі (Різо (Віго), Гераш (Сієгазсі), 1992, Апп. ВНему.
Віоспет. 61:387; ця робота включена до цього опису шляхом посилання для будь-якої цілі); наприклад, шляхом додання внутрішніх залишків цистеїну, здатних до утворення міжмолекулярних дисульфідних містків, що циклізують пептид.
Термін "антитіло" або "антитіло-пептид(-и)" означає інтактне антитіло або його зв'язувальний фрагмент, що конкурує з інтактним антитілом за специфічне зв'язування. За певними варіантами здійснення зв'язувальні фрагменти одержують методами рекомбінантних ДНК. За додатковими варіантами здійснення зв'язувальні фрагменти одержують шляхом ферментативного або хімічного розщеплення інтактних антитіл. Зв'язувальні фрагменти включають (але ними не обмежуються) К(аб), (аб), Е(аб)», Ем та одноланцюгові антитіла.
Термін "важкий ланцюг" включає будь-який імуноглобуліновий поліпептид, що має достатню послідовність варіабельної ділянки для надання специфічності відносно МОЄ. Термін "легкий ланцюг" включає будь-який імуноглобуліновий поліпептид, що має достатню послідовність варіабельної ділянки для надання специфічності відносно МСЕ. Непроцесований важкий ланцюг включає варіабельну ділянку важкого ланцюга,
Уц-ділянку, та три константні ділянки важкого ланцюга, Сн1, Сн2 і Сн3. Мн-ділянка знаходиться на амінокінці поліпептиду, СнЗ-ділянка знаходиться на карбоксильному кінці. Термін "важкий ланцюг", що застосовується у цьому описі, означає непроцесований важкий ланцюг та його фрагменти. Непроцесований легкий ланцюг включає варіабельну ділянку легкого ланцюга, Мі-ділянку, та константну ділянку легкого ланцюга, Сі-ділянку.
Подібно важкому ланцюгу, варіабельна ділянка легкого ланцюга знаходиться на амінокінці поліпептиду.
Термін "легкий ланцюг", що застосовується у цьому описі, означає непроцесований легкий ланцюг та його фрагменти. Е(ар)-фрагмент включає один легкий ланцюг, Сні і варіабельні ділянки одного важкого ланцюга.
Важкий ланцюг молекули (ар) не може утворювати дисульфідний зв'язок з іншою молекулою важкого ланцюга. Е(аб')-фрагмент включає один легкий ланцюг і один важкий ланцюг, що містить більшу частину константної ділянки, між ділянками Сні і Сн2г, завдяки чому між двома важкими ланцюгами може утворюватись міжланцюговий дисульфідний зв'язок з утворенням молекули Е(аб')». Ем-ділянка включає варіабельні ділянки як важкого, так і легкого ланцюгів, однак їй бракує константних ділянок. Одноланцюгові антитіла є молекулами
Ем, у яких варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів з'єднуються гнучким лінкером з утворенням одного поліпептидного ланцюга, який являє собою антигензв'язувальну ділянку. Одноланцюгові антитіла докладно обговорюються у публікації міжнародної заявки на У/О 88/01649 і патентах США Мо 4,946,778 і Мо 5,260,203.
Слід розуміти, що двовалентне антитіло, окрім "мультиспецифічного" або "мультифункціонального" антитіла, за певними варіантами здійснення включає зв'язувальні сайти, що мають ідентичну антигенну специфічність.
При визначенні зв'язування та специфічності антитіла за цим винаходом, антитіло по суті пригнічує адгезію ліганду до рецептора, коли надлишок антитіла зменшує кількість ліганду, зв'язаного з рецептором щонайменше приблизно на 2095, 40905, 60905, 8095, 85950 або більше (що визначається, іпієг аїа, із застосуванням іп міо реакції конкурентного зв'язування).
Словосполучення "нейтралізуюче антитіло" означає молекулу антитіла, здатну блокувати або суттєво знизити ефекторну функцію антигена-мішені, з яким вона зв'язується. Відповідно, "нейтралізуюче" анти-МОаЕ антитіло є здатним блокувати або суттєво знизити ефекторну функцію МСЕ, наприклад, зв'язування з рецептором та/або викликання клітинної реакції. Словосполучення "суттєво знизити" означає щонайменше приблизно 6095, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше приблизно 7095, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше приблизно 7595, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8095, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8595, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, щонайменше приблизно 9095 зниження ефекторної функції антигена-мішені (наприклад, людського МО).
Термін "антигенна детермінанта" включає будь-яку детермінанту, за варіантом, якому віддають перевагу, поліпептидну детермінанту, здатну до специфічного зв'язування з імуноглобуліном або Т-клітинним рецептором. За певними варіантами здійснення антигенні детермінанти включають хімічно активні поверхневі групи молекул, наприклад, амінокислоти, бічні ланцюги цукрів, фосфорильні групи або сульфонільні групи, і за певними варіантами здійснення можуть мати специфічні об'ємні структурні характеристики та/або специфічні зарядні характеристики. Антигенна детермінанта являє собою ділянку антигену, яка зв'язується антитілом. За певними варіантами здійснення кажуть, що антитіло специфічно зв'язується з антигеном, коли воно переважно розпізнає свій антиген-мішень у складній суміші білків талабо макромолекул. За варіантами, яким віддають перевагу, кажуть, що антитіло специфічно зв'язується з антигеном, коли константа дисоціації у стані рівноваги становить «108 М, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, коли константа дисоціації у стані рівноваги становить «109 М і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, коли константа дисоціації у стані рівноваги становить «10719 М.
Антитіло зв'язує "по суті ту саму антигенну детермінанту", що і еталонне антитіло, коли два антитіла розпізнають ідентичні антигенні детермінанти або антигенні детермінанти, що стерично перекриваються.
Найширше застосовуваними і швидкими методами визначення того, чи зв'язують два антитіла ідентичні антигенні детермінанти або антигенні детермінанти, що стерично перекриваються, є конкурентні реакції, які можуть розроблятись для здійснення у найрізноманітніших форматах, із застосуванням міченого антигену або міченого антитіла. Як правило, антиген іммобілізують на субстраті, і здатність немічених антитіл до блокування зв'язування мічених антитіл визначається за допомогою радіоактивних або ферментних міток.
Термін "агент" застосовують у цьому описі для позначення хімічної сполуки, суміші хімічних сполук, біологічної макромолекули або екстракту, одержаного з біологічних матеріалів.
Терміни "мітка" або "мічений", що застосовуються у цьому описі, означають включення виявного маркера, наприклад, шляхом включення амінокислоти, міченої радіоактивним ізотопом, або приєднання до поліпептиду біотинових складових, які можуть бути виявлені міченим авідином (наприклад, стрептавідином, який, за варіантом, якому віддають перевагу, містить виявний маркер, наприклад, флуоресцентний маркер, хемілюмінесцентний маркер, або який має ферментативну активність, що може бути виявлена оптичними або колориметричними методами). За певними варіантами здійснення згадана мітка може також бути терапевтичною. У цій галузі відомі різні методи мічення поліпептидів і глікопротеїнів, які можуть ефективно бути застосовані у методах, що розкриваються у цьому описі. Прикладами міток для поліпептидів є (але ними не обмежуються) наведені нижче: радіоактивні ізотопи або радіоактивні нукліди (наприклад, ЗН, 7С, "5М, 855, зо, Зате, Ту, 125), 191)), флуоресцентні мітки (наприклад, флуоресцинізотіоціанат або РІТС, родамін або лантаноїдні люмінофори), ферментативні мітки (наприклад, пероксидаза з хрону, р-галактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза), хемілюмінесцентні мітки, гаптенові мітки, наприклад, біотинільні групи, та попередньо визначені поліпептидні антигенні детермінанти, розпізнані вторинним репортером (наприклад послідовності зі зв'язаними парами залишків лейцину, зв'язувальні сайти вторинних антитіл, ділянки зв'язування металів або мітки антигенних детермінант). За певними варіантами здійснення мітки приєднуються спейсерними групами (наприклад (СНг), де п«приблизно 20) різної довжини для зменшення можливої стеричної невідповідності.
Термін "біологічна проба", що застосовується у цьому описі, означає (але не обмежується) будь-яку кількість речовини від живої особини або раніше живої особини. Такі живі особини включають (але не обмежуються) людей, мишей, мавп, пацюків, кролів та інших тварин. Такі речовини включають (але не обмежуються) кров, сироватку, сечу, клітини, органи, тканини, кістку, кістковий мозок, лімфатичні вузли та шкіру.
Термін "фармацевтичний агент або лікарський засіб", що застосовується у цьому описі, означає хімічну сполуку або композицію, здатну індукувати бажаний терапевтичний ефект у разі відповідного введення хворому. Слід розуміти, що словосполучення "фармацевтично ефективна кількість" у відношенні фармацевтичної композиції, що містить одне або декілька антитіл за цим винаходом, означає, за цим винаходом, кількість згаданої фармацевтичної композиції, що є здатною до запобігання, у згаданого хворого, зниження порогу чутливості до зовнішніх подразників із поверненням згаданого порогу чутливості до рівня, порівнянного з тим, що спостерігається у здорових суб'єктів. "Розладом" є будь-який стан, що поліпшується у разі лікування за цим винаходом. Терміни "розлад" та "стан" застосовуються у цьому описі взаємозамінно і включають хронічні та гострі МОЕ-опосередковані розлади або МОагР-опосередковані захворювання, у тому числі ті патологічні стани, які сприяють виникненню у ссавця згаданого розладу.
Словосполучення "МаЕ-опосередковане захворювання" та "Ма Е-опосередкований стан" означають будь- який медичний стан або розлад, що пов'язується зі зростанням рівнів МОЕ або підвищенням чутливості до
МОБ, у тому числі (але без обмеження) гострий біль, зубний біль, біль, викликаний травмою, біль, викликаний хірургічним втручанням, біль унаслідок ампутації або абсцесу, каузалгію, демієлінізаційні захворювання, невралгію трійчастого нерва, рак, хронічний алкоголізм, інсульт, таламічний больовий синдром, діабет, синдром набутого імунодефіциту ("СНІД"), токсини та хіміотерапію, головний біль у цілому, мігрень, сильний нападоподібний головний біль з періодичними рецидивами, змішані серцево-судінні та несерцево-судинні синдроми, головний біль, викликаний гіпер- або гіпотензією, запалення у цілому, артрит, ревматичні захворювання, вовчак, остеоартрит, запальні захворювання кишечнику, синдром подразненої товстої кишки, запальні захворювання очей, запальні розлади або нестабільність сечового міхура, псоріаз, скарги на шкірні захворювання із запальними складовими, сонячну еритему, кардит, дерматит, міозит, неврит, дифузну хворобу сполучної тканини судин, хронічні запальні стани, запальний біль та пов'язані з цим гіпералгезію та алодинію, невропатичний біль та пов'язані з цим гіпералгезію та алодинію, діабетичний невропатичний біль, біль унаслідок пошкодження симпатичних сенсорних нервів, синдроми деаферентації, астму, пошкодження або дисфункцію епітеліальної тканини, простий герпес, порушення вісцеральної рухливості на респіраторних, статево-сечових, шлунково-кишкових або серцево-судинних ділянках, рани, опіки, алергічні шкірні реакції, прурит, вітіліго, загальні захворювання шлунково-кишкового тракту, коліт, виразки шлунка, виразки дванадцятипалої кишки, вазомоторний або алергічний риніт, бронхіальні розлади, дисменорею, диспепсію, гастроезофагеальний рефлюкс, панкреатит і вісцералгію.
Словосполучення "ефективна кількість" та "терапевтично ефективна кількість", що застосовуються у цьому описі, у разі застосування відносно носія або фармацевтичної композиції, що містить одне або декілька людських антитіл проти людського МОРЕ, означає кількість або дозу, достатню для викликання бажаного результату (тобто у разі лікування із застосуванням носія або фармацевтичної композиції, що містить людські антитіла проти людського МОЕ за цим винаходом, бажаним результатом є, наприклад, бажане зменшення запалення та/або болю) або підтримання зменшення рівня однієї або декількох біологічних активностей МО, що спостерігається. Конкретніше, терапевтично ефективною кількістю є кількість людського антитіла(-іл) проти людського МОРЕ, достатня для пригнічення, впродовж деякого періоду часу, одного або декількох клінічно визначених патологічних процесів, що пов'язуються зі згаданим станом, наприклад, запалення або болю, у суб'єкта, якого піддають іп мімо лікуванню за допомогою згаданого засобу. За цим винаходом, "ефективна кількість" анти-МОЯЕ антитіла може запобігати, припиняти, контролювати або зменшувати відчуття болю, пов'язаного з будь-яким болісним медичним станом. У способах за цим винаходом термін "контроль" та його граматичні варіанти застосовуються для позначення запобігання, часткового або повного пригнічення, зменшення, затримки або уповільнення небажаного явища, наприклад, болю. Ефективна кількість може різнитися у залежності від конкретного вибраного носія або людського антитіла(-іл) проти людського МОБ, і залежить також від різноманітних факторів та станів, пов'язаних із суб'єктом, якого піддають лікуванню, а також тяжкості розладу. Наприклад, у разі, якщо носій або людське антитіло(-а) проти людського МОЕ повинні вводитись іп мімо, факторами, які повинні прийматись до уваги, є вік, маса та стан здоров'я хворого, а також криві залежності "доза-ефект" та дані щодо токсичності, одержані у передклінічних дослідах на тваринах.
Якщо засіб має контактувати з клітинами іп мйго, слід розробити також різноманітні передклінічні іп. мйго дослідження для визначення таких параметрів, як поглинання, час напіввиведення, доза, токсичність тощо.
Визначення ефективної кількості або терапевтично ефективної кількості даного засобу знаходиться у межах здатності фахівців у цій галузі.
Терміни "фактор росту нервової тканини" та "МОЄ", що вживаються у цьому описі, означають нативну послідовність МОР усіх видів ссавців, у тому числі рекомбінантний людський МО 1-120, представлений
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 30.
Словосполучення "по суті чистий" або "по суті очищений", що застосовується у цьому описі, означає сполуку або різновид, представлений переважним різновидом (тобто на молярній основі, це різновид у складі композиції, кількісно переважаючий будь-який інший окремий різновид). За певними варіантами здійснення по суті очищеною фракцією є композиція, де згадані різновиди становлять щонайменше приблизно 50 відсотків (на молярній основі) усіх присутніх макромолекулярних різновидів. За певними варіантами здійснення по суті чиста композиція буде містити більше ніж приблизно 8095, 8595, 9095, 9595 або 9995 усіх макромолярних різновидів, присутніх у композиції. За певними варіантами здійснення різновид є очищеним по суті до однорідності (забруднювальні різновиди у складі композиції не можуть бути виявлені за допомогою традиційних методів виявлення), коли композиція містить по суті один макромолекулярний різновид.
Термін "хворий" означає людей і тварин. "Лікування" або "лікувати" означає терапевтичне лікування, профілактичні або запобіжні заходи. До тих, що потребують лікування, належать ті, що вже мають захворювання, а також схильні до появи захворювання, або ті, появі захворювання у яких необхідно запобігти.
Якщо контекстом не вимагається іншого, терміни у однині будуть включати множину, а терміни у множині будуть включати однину.
За певними варіантами здійснення цього винаходу антитіла, спрямовані проти МО, можуть застосовуватись для лікування невропатичного та запального болю і МОаЕ-опосередкованих захворювань, у тому числі (але без обмеження) згаданих вище.
За одним з аспектів цього винаходу пропонуються повністю людські моноклональні антитіла, які були одержані проти і які мають біологічну та імунологічну специфічність до зв'язування з людським МОРЕ. За іншим аспектом винахід пропонує нуклеїнові кислоти, що містять нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні послідовності важкого та легкого ланцюгів імуноглобулінових молекул, зокрема, послідовності, що відповідають їхнім варіабельним ділянкам. Конкретними варіантами здійснення цього аспекту винаходу є послідовності, що відповідають гіперваріабельним ділянкам (СОВ5), зокрема, СОА1-СОВЗ, важких і легких ланцюгів, що пропонуються цим винаходом. За ще іншим аспектом, цей винахід пропонує клітини гібридом та лінії клітин, що експресують імуноглобулінові молекули та антитіла, за варіантом, якому віддають перевагу, моноклональні антитіла за цим винаходом. Цей винахід пропонує також біологічно та імунологічно очищені препарати антитіл, за варіантом, якому віддають перевагу, моноклональних антитіл, що були одержані проти і які мають біологічну та імунологічну специфічність до зв'язування з людським МО.
Можливість клонування та реконструювання людських локусів величиною у мільйони п.н. у дріжджових штучних хромосомах (ЖАСвх) та їх введення до мишачої зародкової лінії, надає вигідний підхід до встановлення функціональних складових дуже великих або приблизно картованих локусів, а також розробки корисних моделей людського захворювання. Окрім того, застосування такої методики для заміни мишачих локусів їхніми людськими еквівалентами надає унікальну можливість зрозуміння механізмів експресії та регуляції продуктів людського гена у процесі їх розвитку, їх зв'язку з іншими системами та їх залучення до індукування і розвитку захворювання.
Важливим практичним варіантом застосування такої методики є "гуманізація" мишачої гуморальної імунної системи. Введення людських імуноглобулінових (Ід) локусів мишам, у яких ендогенні Ід гени були інактивовані, надає можливість вивчення механізмів, що лежать у основі програмованої експресії та складання антитіл, а також їх ролі у розвитку В-клітин. На додаток до цього, подібна методика забезпечує джерело продукування повністю людських моноклональних антитіл (МАбБ5).
Термін "людське антитіло" означає антитіла, що мають варіабельні і константні ділянки, які по суті відповідають імуноглобуліновим послідовностям людської зародкової лінії. За певними варіантами здійснення людські антитіла продукуються ссавцями, окрім людини, у тому числі (але без обмеження) гризунами, наприклад, мишами та пацюками, і зайцеподібними, наприклад, кроликами. За певними варіантами здійснення людські антитіла продукуються клітинами гібридоми. За певними варіантами здійснення людські антитіла продукуються рекомбінантним шляхом.
Термін "рекомбінантний" у відношенні антитіла означає антитіла, які одержують, експресують, створюють або виділяють рекомбінантними способами. Репрезентативними прикладами є антитіла, експресовані за допомогою рекомбінантного експресійного вектора, трансфікованого до клітини-хазяїна, антитіла, виділені з бібліотеки рекомбінантних гібридних людських антитіл, антитіла, виділені з тварини (наприклад, миші), що є трансгенною за людськими імуноглобуліновими генами (дивись, наприклад, Тейлор Л.Д. (Тауюг І.О.) та інші, мисі. Асід5 Нез. 20:6287-6295, (1992)) або антитіла, одержані, експресовані, створені або виділені будь-якими способами, що залучають розщеплення послідовностей людського імуноглобулінового гена на інші послідовності ДНК. Такі рекомбінантні людські антитіла мають варіабельні та константні ділянки, одержані з імуноглобулінових послідовностей людської зародкової лінії.
Людські антитіла мають щонайменше три переваги над нелюдськими та гібридними антитілами для застосування при лікуванні людей: 1) оскільки ефекторна ділянка антитіла є людською, вона може краще взаємодіяти з іншими складовими частинами людської імунної системи (наприклад, ефективніше знищувати клітини-мішені за допомогою комплементзалежної цитотоксичності (СОС) або антитілозалежної клітинної цитотоксичності (АДОСС)); 2) людська імунна система не повинна розпізнавати людське антитіло, як чужорідне і, завдяки цьому, гуморальна імунна відповідь проти такого введеного антитіла повинна бути слабкішою, аніж проти повністю чужорідного нелюдського антитіла або частково чужорідного гібридного антитіла; 3) повідомляли про те, що введені нелюдські антитіла мають набагато коротший час напіввиведення у системі кровообігу людини, аніж час напіввиведення людських антитіл. Час напіввиведення введених людських антитіл буде по суті ідентичним до часу напіввиведення природних людських антитіл, що надасть можливість рідшого введення менших доз.
Очікується, таким чином, що повністю людські антитіла зведуть до мінімуму імуногенні та алергійні реакції, притаманні мишачим моноклональним антитілам та дериватизованим із мишачих моноклональних антитіл і, завдяки цьому, підвищать ефективність та безпечність введених антитіл. Повністю людські антитіла за цим винаходом, таким чином, можуть застосовуватись для лікування хронічного та рецидивного болю, лікування якого потребує повторного введення антитіл. Таким чином, одна з конкретних переваг анти-МаЕ антитіл за цими винаходом полягає у тому, що згадані антитіла є повністю людськими і можуть вводитись хворим безболісним чином з одночасним зведенням до мінімального рівня негативних реакцій, які традиційно пов'язуються з людськими антимишачими антитілами або іншими раніше описаними частково людськими антитілами від інших видів, окрім людини.
Фахівець у цій галузі може одержати лінії мишей, дефіцитних щодо продукування мишачих антитіл, з великими фрагментами людських Ід локусів, завдяки чому такі миші продукують людські антитіла за відсутності мишачих антитіл. Великі людські Ід фрагменти можуть зберігати велике розмаїття варіабельних генів, а також відповідну регуляцію продукування і експресії антитіл. Завдяки використанню мишачих клітинних механізмів для диверсифікації та добору антитіл і відсутності імунологічної толерантності до людських білків, спектр репродукованих людських антитіл у таких мишачих лініях надає високоспоріднені антитіла проти будь- якого антигену, що становить інтерес, у тому числі людських антигенів. За допомогою гібридомної технології можуть продукуватись і відбиратись антиген-специфічні людські моноклональні антитіла бажаної специфічності.
Можуть застосовуватись трансгенні тварини (наприклад, миші), що є здатними, у разі імунізації, до продукування повного спектру людських антитіл за відсутності продукування ендогенного імуноглобуліну.
Наслідком перенесення сукупності людських зародкових імуноглобулінових генів до таких ембріональних мутантних мишей буде продукування людських антитіл у разі антигенної стимуляції (дивись, наприклад,
Джейкобовіц (дЧакобоміїв) та інші, Ргос. Маї). Асай. 5сі. ОБА, 90:2551-2555, (1993); Джейкобовіц (дакоброміїв) та інші, Макиге, 362:255-258, (1993); Бруггемен (Вппддетаптп) та інші, Уєаг іп Іттип., 7:33 (1993); Маштге 148:1547- 1553 (1994), Машге Віоїесппоіоду 14:826 (1996); Гросс Дж.А. ((го55 9.А.) та інші, Майшге, 404:995-999 (2000); та патенти США Мо 5,877,397, Мо 5,874299, Мо 5,814,318, Мо 5,789,650, Мо 5,770,429, Мо 5,661,016, Мо 5,633,425, Мо 5,625,126, Мо 5,569,825 та Мо 5,545,806 (кожен з яких включено до цього опису у повному обсязі шляхом посилання для будь-якої цілі)). Людські антитіла можуть також продукуватись у бібліотеках із проявленням у фагах (Хугенбум (Ноодепроот), Вінтер (Уіпієг), у. Мої. Віої!., 227:381 (1992); Маркс (Маїкзв) та інші, 9. Мої. Віо!., 222:581 (1991)). Доступними для одержання людських моноклональних антитіл є також методи Коул (Соіє) та інших і Бернер (Воеє!тпег!) та інших (Коул (Соіє) та інші, Мопосіопа! Апіїбодієз апа Сапсег Тнегар, Айап В. і ів5, стор. 77 (1985); Бернер (Воеє!пеї!) та інші, 9. Іттипої, 147(1):86-95 (1991)).
Рекомбінантні людські антитіла можуть також бути піддані іп міго мутагенезу (або, у разі застосування тварин, трансгенних за людськими Ід послідовностями, іп мімо соматичному мутагенезу) і, таким чином, амінокислотні послідовності Мн та Мі ділянок рекомбінантних антитіл являють собою послідовності, які, у разі одержання з послідовностей, пов'язаних із людськими зародковими Мн та Мі послідовностями, можуть не існувати за природних умов у межах зародкового спектру людських антитіл іп мімо.
За певними варіантами здійснення досвідчений фахівець для продукування гібридних антитіл такими мишами може застосовувати константні ділянки від інших видів, окрім людини, разом із людською(-ими) варіабельною(-ими) ділянкою(-ами).
Структура природних антитіл
Структурні одиниці природних антитіл являють собою, як правило, тетрамер. Кожен із таких тетрамерів, як правило, складається з двох ідентичних пар поліпептидних ланцюгів, де кожна пара має один повномірний "легкий" ланцюг (молекулярна маса якого становить, як правило, приблизно 25 кДа) і один повномірний "важкий" ланцюг (молекулярна маса якого становить, як правило, приблизно 50-70 кДа). Амінокінцева ділянка кожного легкого і важкого ланцюга, як правило, включає варіабельну ділянку довжиною приблизно 100-110 або більше амінокислот, що, як правило, несе відповідальність за розпізнавання антигенів. Карбоксикінцева ділянка кожного ланцюга, як правило, має константну ділянку, що несе відповідальність за ефекторну функцію. Людські легкі ланцюги, як правило, класифікуються як легкі ланцюги типів каппа і ламбда. Важкі ланцюги, як правило, класифікуються як важкі ланцюги типів мю, дельта, гамма, альфа або епсилон і визначають ізотип антитіла, як ДМ, дО, да, ІдА та ІДЕ, відповідно. ІДС має декілька підкласів, у тому числі (але без обмеження), Іда1, Іде, ІдаЗз та да. ІМ має підкласи, що включають (але не обмежуються) ІЮДМІ та
І9М2. ІДдДА подібним чином підрозділяється на підкласи, що включають (але не обмежуються) ІА та ІдАг.
Варіабельні та константні ділянки у межах повномірних легких і важких ланцюгів сполучаються, як правило, "У" ділянкою, довжина якої становить приблизно 12 або більше амінокислот, причому важкий ланцюг включає також "ОО" ділянку, довжина якої становить приблизно 10 або більше амінокислот. Дивись, наприклад,
ЕРОМОАМЕМТАГ ІММОМОГ ОС, розділ 7, (редактор Пол В. (Раці М/.)), 1989, Вамеп Ргев5, М. М. (ця робота включена до цього опису у повному обсязі шляхом посилання для будь-яких цілей). Варіабельні ділянки кожної пари (легкий/важкий ланцюг) утворюють, як правило, антигензв'язувальний центр.
Варіабельні ділянки, як правило, демонструють таку саму загальну структуру, що і відносно консервативні остовні ділянки (ЕР), і сполучаються трьома гіперваріабельними ділянками, які називають також пуи-ділянками (СОВА5). Гіперваріабельні ділянки двох ланцюгів кожної пари впорядковано розміщаються остовними ділянками, які можуть забезпечити можливість зв'язування зі специфічною антигенною детермінантою. Від М- кінця до С-кінця варіабельні ділянки як легких, так і важких ланцюгів включають, як правило, домени ЕВІ1,
СОВА, ЕН2, СОН, ЕВАЗ, СОВЗ та ЕН4. Приналежність амінокислот до кожного домену відповідає, як правило, визначенням, наведеним у довіднику Кабаї бедиєпсез ої Ргоїєїп5 ої Іттипоіодіса! Іпієгтев5і (1987 та 1991,
Майопаї ІпешШшез ої Неаїй, ВемШезада, штат Мериленд) та роботах Чотья (Споїпіа), Леек (І ек), 1987, у. Мої.
Віо!. 196:901-917; Чотья (Споїпіа) та інші, 1989, Машге 342:878-883.
Біспецифічні або гетеровалентні антитіла
Біспецифічне або гетеровалентне антитіло, як правило, являє собою штучне гібридне антитіло, що має дві різні пари важкий ланцюг/легкий ланцюг та два різні зв'язувальні центри. Біспецифічні антитіла можна одержати різноманітними методами, у тому числі (але без обмеження) шляхом злиття гібридом або зв'язування К(аб )-фрагментів. Дивись, наприклад, Сонгсівілаї (оподвімііаї), Лахман (Гасптапп), 1990, Сіїіп. Ехр.
Ітітипої. 79:315-321; Костелні (КовієїІпу) та інші, 1992, 9. Іттипої. 148:1547-1553.
Одержання антитіл
Цей винахід пропонує антитіла, що зв'язуються з людським МОРЕ. Ці антитіла можуть продукуватись шляхом імунізації повномірним МСЕ або його фрагментами. Антитіла за цим винаходом можу бути поліклональними або моноклоналними та/або можуть бути рекомбінантними антитілами. За варіантами, яким віддають перевагу, антитілами за цим винаходом є людські антитіла, які одержують, наприклад, шляхом імунізації трансгенних тварин, здатних до продукування людських антитіл (дивись, наприклад, міжнародну патентну заявку, публікація УХО 93/12227).
Гіперваріабельні ділянки (СОН») варіабельних ділянок легких і важких ланцюгів анти-МаЕ антитіл за цим винаходом можуть пересаджуватись до остовних ділянок (ЕНе5) того самого або іншого виду. За певними варіантами здійснення гіперваріабельні ділянки варіабельних ділянок легкого і важкого ланцюгів анти-Має антитіла можуть пересаджуватись до консенсусних людських остовних ділянок. Для одержання консенсусних людських остовних ділянок, остовні ділянки амінокислотних послідовностей декількох людських важких або легких ланцюгів впорядковано розміщують для визначення консенсусних амінокислотних послідовностей.
Остовні ділянки важкого або легкого ланцюга анти-МОЕ антитіла можуть бути замінені основними ділянками іншого важкого або легкого ланцюга. Рідкі амінокислоти у остовних ділянках важких і легких ланцюгів анти-
МОРЕ антитіла, як правило, не замінюються, у той час як решта амінокислот остовних ділянок можуть замінюватись. Рідкими амінокислотами є специфічні амінокислоти, які знаходяться у положеннях, які вони, як правило, у остовних ділянках не займають. Пересаджені варіабельні ділянки анти-МОЕ антитіл за цим винаходом можуть застосовуватись із константною ділянкою, що відрізняється від константної ділянки анти-
МО антитіла. За альтернативним варіантом, пересаджені варіабельні ділянки є частиною одноланцюгового
Ек-антитіла. Пересадження гіперваріабельної ділянки описують, наприклад, у патентах США Мо 6,180,370, Мо 5,693,762, Мо 5,693,761, Мо 5,585,089 та Мо 5,530,101, які включено до цього опису шляхом посилання для будь-якої цілі.
Антитіла за цим винаходом, за варіантом, якому віддають перевагу, одержують за допомогою трансгенних мишей, до антитілопродукувальних клітин яких була введена значна частина людського антитілопродукувального локусу. Ці миші були також додатково піддані генно-інженерним заходам для того, щоб перетворитись на дефіцитних із продукування ендогенних мишачих антитіл. Такі миші є здатними до продукування людських імуноглобулінових молекул і антитіл, і не продукують мишачих імуноглобулінових молекул та антитіл або продукують їх у значно зменшеному обсязі. Методики досягнення такого результату розкриваються у патентах, заявках та посиланнях, які розкриваються у наведеному описі. За варіантами, яким віддають перевагу, досвідчений фахівець може застосовувати методи, розкриті у міжнародній патентній заявці, публікація УУХО 98/24893, яку включено до цього опису шляхом посилання з будь-якою метою. Дивись також роботу Мендес (Мепаєг) та інші, 1997, Машге Сепеїйсв 15:146-156, яку включено до цього опису шляхом посилання з будь-якою метою.
Моноклональні антитіла (тАр5) за цим винаходом можуть продукуватись різноманітними методами, у тому числі за традиційною методикою продукування моноклональних антитіл, наприклад, за стандартною методикою гібридизації соматичних клітин Колер (Копієг) та Мілстейн (Міївієїп) (1975, Машге 256:495).
Незважаючи на те, що перевагу віддають методикам гібридизації соматичних клітин, застосовуватись, у принципі, можуть і інші методики продукування моноклональних антитіл, наприклад, вірусна або онкогенна трансформація В-лімфоцитів.
Тваринною системою для одержання гібридом, якій віддають перевагу, є миші. Спосіб продукування гібридом мишачим організмом є добре розробленим, а схеми імунізації та методи виділення імунізованих спленоцитів для злиття є добре відомими у цій галузі. Відомими є також клітини, що зливаються (наприклад, клітини мишачої мієломи) та методики злиття.
За варіантом, якому віддають перевагу, людські моноклональні антитіла, спрямовані проти МОРЕ, можуть одержуватись за допомогою трансгенних мишей, які, замість мишачої імунної системи, несуть складові частини людської імунної системи. Ці трансгенні миші, яких у цьому описі позначають як "НиМар" мишей, несуть в собі мінілокус людського імуноглобулінового гена, що кодує неаранжовані імуноглобулінові послідовності людського важкого ланцюга (типів нн та у) і легкого ланцюга типу к, разом із цільовими мутаціями, які інактивують локуси ендогенних ланцюгів типів н і к (Лонберг (І опрего) та інші, 1994, Маштге 368:856-859). Відповідно, миші демонструють знижену експресію мишачого ДІМ або к і, у відповідь на імунізацію, введені трансгени людського важкого ланцюга і легкого ланцюга зазнають зміну класу і соматичну мутацію з продукуванням високоспоріднених людських моноклональних антитіл Ідсї к (Лонберг (І опрего) та інші (дивись вище); Лонберг (І опрего), Гушар (Низлаїг), 1995, Іпіегп. Нем. Іттипої!. 13:69-93; Гардінг (Нагаїпо),
Лонберг (І опрего), 1995, Апп. МУ. Асай. Осі. 764:536-546). Одержання НиМаб мишей докладно описано у роботах Тейлор (Тауїог) та інші, 1992, Мисієїс Асіах ВНез. 20:6287-6295; Чен (Спеп) та інші, 1993, Іпіегпайопаї!
Іттипоіоду, 5:647-656; Тайон (Тиайоп) та інші, 1994, 9. Іттипої. 152: 2912-2920; Лонберг (І опрего) та інші, 1994, Маште 368:856-859; Лонберг (І опрего), 1994, Напабсок ої Ехр. Рпаптасоіоду 113:49-101; Тейлор (Тауїог) та інші, 1994, Іпіеєгпайопаї! Іттипоіоду 6:579-591; Лонберг (І опрего), Гушар (Нива), 1995, Іпіегп. Неу. Іттипо). 13:65-93; Гардінг (Нагаїіпо), Лонберг (Іопрего), 1995, Апп. М.У. Асай. сі 764:536-546; Фішвайлд (РівпУміа) та інші, 1996, Майшге Віоїесппоіоду 14:845-851, які у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання.
Дивись також патенти США Мо 5,545,806; Мо 5,569,825; Мо 5,625,126; Мо 5,633,425; Мо 5,789,650; Мо 5,877,397;
Мо 5,661,016; Мо 5,814,318; Мо 5,874,299; та Мо 5,770,429 (усі на ім'я Лонберг (І опрего) та Кей (Кау)), а також патент США Мо 5,545,807 (на ім'я Сурані (Зигапі) та інші); міжнародні заявки УУО 93/1227 (опублікована 24 липня 1993 року); УМО 92/22646 (опублікована 23 грудня 1992 року); та УО 92/03918 (опублікована 19 березня
1992 року), розкриття яких у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання. За альтернативним варіантом, для одержання людських анти-МОЕ антитіл можуть застосовуватись трансгенні миші ліній НСо?7,
НсСо12 їі КМ, опис яких представлено у наведених нижче Прикладах.
Цей винахід пропонує людські моноклональні антитіла, які є специфічними до і нейтралізують біологічно активні людські МОЕ поліпептиди. Цей винахід пропонує також амінокислотні послідовності важкого і легкого ланцюгів антитіла, які є високоспецифічними до і нейтралізують МОЄ поліпептиди, у тому разі, коли вони зв'язуються з ними. Ця висока специфічність надає можливість людським антитілам проти людського МО та людським моноклональним антитілам із подібною специфічністю бути ефективним імунотерапевтичним засобом для лікування МаЕ-асоційованих захворювань.
За одним з аспектів, цей винахід пропонує виділені людські антитіла, що зв'язують ту саму або по суті ту саму антигенну детермінанту, що і антитіло 404, яке пропонується цим винаходом.
За одним з аспектів, цей винахід пропонує виділені людські антитіла, що містять щонайменше одну з амінокислотних послідовностей, представлених ПОСЛІДОВНОСТЯМИ Ме 10, Ме 12, Мо 14, Мо 16, Ме 18, Мо 20,
Мо 22, Мо 24 та Мо 79-130, що зв'язують антигенну детермінанту МО поліпептидів із високою спорідненістю і є здатними до антагонізування активності МО поліпептидів. За варіантом, якому віддають перевагу, ці антитіла зв'язують ту саму або по суті ту саму антигенну детермінанту, що і антитіло 404, яке пропонується цим винаходом.
За варіантами, яким віддають перевагу, виділені людські антитіла зв'язуються з МОРЕ поліпептидом із константою дисоціації (Ко) 1х109 М або менше і пригнічують МОЕ-індуковану виживаність у іп міо реакції нейтралізації з ІСво 1х107 М або менше. За варіантами, яким віддають більшу перевагу, виділені людські антитіла зв'язуються з МОЕ поліпептидом із константою дисоціації (Ко) 1х1079 М або менше і пригнічують
МОв-індуковану виживаність у іп міо реакції нейтралізації з ІСво 1х103 М або менше. За варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, виділені людські антитіла зв'язуються з людським МОРЕ поліпептидом із константою дисоціації (Ко) 1х107! М або менше і пригнічують МОЕ-індуковану виживаність у іп міо реакції з
ІСво 1х109 М або менше. Приклади людських антитіл проти людського МОБ, які задовольняють вищезгаданим критеріям зв'язування та нейтралізації, наведені у цьому описі.
Людське антитіло проти людського МОБ за цим винаходом, якому віддають найбільшу перевагу, позначається як 404 і має Мі та Мн поліпептидні послідовності, представлені ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 12 та
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 10, відповідно. Полінуклеотидна послідовність, що кодує Мі і Мн 404 представлена
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 11 та ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 9, відповідно. Властивості людських антитіл проти людського
МО за цим винаходом розкриваються, зокрема, у Прикладах. Особливої уваги заслуговує показана у цьому описі висока спорідненість до МО поліпептиду і висока здатність антагонізувати активність МОРЕ поліпептиду.
Константа дисоціації (Ко) людського антитіла проти людського МОБ може визначатись поверхневим плазмонним резонансом, як у цілому описано у Прикладі 9. Взагалі, аналізом поверхневого плазмонного резонансу (5РА) із застосуванням системи ВіАсоге (Рпаптасіа Віозепзог, Різсаїамжау, штат Нью-Джерсі). у масштабі реального часу визначають зв'язувальні взаємодії між лігандом (рекомбінантний МО поліпептид, іммобілізований на біосенсорній матриці) та речовиною, яку піддають аналізу (антитіла у розчині). Аналіз поверхневого плазмонного резонансу може здійснюватись також шляхом іммобілізації речовини, яку піддають аналізу (антитіла на біосенсорній матриці), і представленням ліганду (рекомбінант М у розчині). Константа дисоціації (Ко) людського антитіла проти людського МСЕ може визначатись також за методикою КіпЕхА. За певними варіантами здійснення цього винаходу антитіла зв'язуються з МОЕ з Ко у межах приблизно 108 М-10- 12 М. Термін "Ко", що застосовується у цьому описі, означає константу дисоціації конкретної взаємодії антитіла-антигена. Для цілей цього винаходу Ко визначали як показано у Прикладі 9.
За варіантами, яким віддають перевагу, антитіла за цим винаходом належать до ізотипів Іда1, аг, аз або Ідс4. За варіантом, якому віддають перевагу, згадані антитіла належать до ізотипу ДОЗ. За варіантом, якому віддають більшу перевагу, згадані антитіла належать до ізотипу ДС1. За варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, згадані антитіла належать до ізотипу Ідс2. За іншими варіантами здійснення антитіла за цим винаходом належать до ізотипів ІМ, ІдА, ДЕ або дО. За варіантами здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, згадані антитіла містять людський легкий ланцюг типу каппа та людський важкий ланцюг
Іс, Ідс2, ДСЗ або ІдсС4. Експресію антитіл за цим винаходом, що містять константну ділянку важкого ланцюга Ідсі1 або Іде, описують у наведених нижче Прикладах. За конкретними варіантами здійснення варіабельні ділянки згаданих антитіл лігуються до іншої константної ділянки, окрім константної ділянки ізотипів
ІС, Іда2г, ІдОаЗ або Ідс24. За певними варіантами здійснення антитіла за цим винаходом клонували для експресії у клітинах ссавців.
За певними варіантами здійснення наслідком консервативних модифікацій важких ланцюгів і легких ланцюгів анти-МОЕ антитіл (і відповідних модифікацій кодувальних нуклеотидів) буде одержання анти-МОЕ антитіл, що мають функціональні і хімічні характеристики, - подібні відповідним характеристикам анти-МОаЕ антитіл, що розкриваються у цьому описі. У протилежність до цього, значні модифікації функціональних та/або хімічних характеристик анти-МОЕ антитіл можуть здійснюватись шляхом вибору замін у амінокислотній послідовності важких і легких ланцюгів, що значно відрізняються за їх ефектом на підтримання (а) структури молекулярного остову на ділянці заміни, наприклад, листової або спіральної конформації, (б) заряду або гідрофобності молекули на цільовій ділянці, або (с) об'єму бічного ланцюга.
Наприклад, "консервативна амінокислотна заміна" може залучати заміну нативного амінокислотного залишку ненативним залишком, що незначно або зовсім не впливає на полярність або заряд амінокислотного залишку у цьому положенні. Окрім того, будь-який нативний залишок поліпептиду може також бути заміненим на аланін, як описувалось раніше для "мутагенезу методом ідентифікації аланіну".
Бажані амінокислотні заміни (консервативні або неконсервативні) можуть визначатись фахівцями у цій галузі під час виникнення необхідності у таких замшах. За певними варіантами здійснення амінокислотні заміни можуть застосовуватись для ідентифікації важливих залишків анти-МСЕ антитіла або для посилення чи ослаблення спорідненості анти-МОЕ антитіл, опис яких наведено.
Як добре відомо, наслідком незначних замін у амінокислотній послідовності, наприклад, видалення, додання або заміни однієї, декількох або навіть декількох десятків амінокислот, може бути одержання алельної форми вихідного білка, яка має по суті ідентичні властивості. Таким чином, на додаток до антитіл, опис яких наведено, інші "по суті гомологічні" антитіла можуть легко розроблятись і одержуватись із застосуванням різноманітних методів рекомбінантних ДНК, добре відомих фахівцям у цій галузі. Взагалі, модифікації генів можуть легко здійснюватись різноманітними добре відомими методами, наприклад, сайт- спрямованим мутагенезом. Таким чином, цей винахід передбачає "варіантні" або "мутантні" людські антитіла проти МОБ, що мають характеристики по суті подібні характеристикам людських антитіл проти МО, які розкриваються у цьому описі. (Дивись, наприклад, УМО 00/56772, яку у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання). Таким чином, згаданий термін "варіантне" або "мутантне" у відношенні до людського антитіла проти МОРЕ означає будь-яку зв'язувальну молекулу (молекулу Х) (ї) гіперваріабельні ділянки СОВІ, СОВ2 ії СОВЗ важкого ланцюга або гіперваріабельні ділялнки СОВНІ, СОВН2 ії СОВАЗ легкого ланцюга якої, взяті у цілому, є щонайменше на 8095 гомологічними, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше на 9095 гомологічними, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше на 9595 гомологічними гіперваріабельним ділянкам, представленим ПОСЛІДОВНОСТЯМИ Мо 14, Мо 18 і Мо 22 або
ПОСЛІДОВНОСТЯМИ Мо 16, Мо 20 і Мо 24, відповідно, і (ії) варіант або мутант якої є здатним до пригнічення активності людського МОРЕ такою самою мірою, що і еталонне людське антитіло проти МОР, яке має остовні ділянки, ідентичні остовним ділянкам молекули Х.
За звичайних умов варіант людського антитіла проти МСЕ буде мати гіперваріабельні ділянки легкого та/або важкого ланцюга, які, взяті у цілому, мають щонайменше приблизно 8095 ідентичність амінокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше приблизно 8595 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9095 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9195 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9295 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9395 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9495 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9595 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9695 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9795 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9895 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9995 ідентичність послідовностей з амінокислотними послідовностями, представленими ПОСЛІДОВНОСТЯМИ Мо 14, Мо 18 і Мо 22 талабо ПОСЛІДОВНОСТЯМИ Ме 16, Мо 20 і Мо 24, відповідно.
За варіантом, якому віддають більшу перевагу, варіант людського антитіла проти МОР буде мати варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка, взята у цілому, має щонайменше приблизно 8095 ідентичність амінокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8195 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8295 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8395 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8495 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8595 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8695 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8795 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8895 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8995 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9095 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9195 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9295 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9395 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9495 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9595 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9695 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9795 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9895 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9995 ідентичність послідовностей з амінокислотними послідовностями, представленими ПОСЛІДОВНОСТЯМИ
Мо 12, Мо 80, Мо 82, Мо 84, Мо 86, Мо 88, Мо 89, Мо 90 або Мо 91, та/або варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка, взята у цілому, має щонайменше приблизно 7095 ідентичність амінокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше приблизно 7595 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8095 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8195 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8295 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8395 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8495 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8595 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8695 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8795 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8895 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8995 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9095 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9195 ідентичність послідовностей, за варіантом,
якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9295 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9395 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9495 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9595 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9695 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9795 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9895 ідентичність послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9995 ідентичність послідовностей з амінокислотними послідовностями, представленими ПОСЛІДОВНОСТЯМИ Мо 10, Мо 81, Мо 83, Мо 85 або Мо 87.
Термін "варіант" відносно полінуклеотиду означає нуклеїновокислотну молекулу, що має щонайменше приблизно 7595 ідентичність нуклеїновокислотної послідовності з полінуклеотидною послідовністю за цим винаходом. За звичайних умов полінуклеотидний варіант буде мати щонайменше приблизно 7595 ідентичність нуклеїновокислотної послідовності, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше приблизно 8095 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8195 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8295 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8395 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 84905 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8595 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8695 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 87905 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 88905 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 8995 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9095 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9195 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 92905 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9395 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9495 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9595 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9695 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9795 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9895 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 9995 ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей з новою амінокислотною послідовністю, що розкривається у цьому описі.
За конкретними варіантами здійснення цей винахід пропонує антитіла, що мають відсоток ідентичності з антитілом за цим винаходом або антитіло, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, варіабельну ділянку легкого ланцюга, СОВІ, СОВ2 або СОНАЗ ділянку, що має відсоток ідентичності з варіабельною ділянкою важкого ланцюга, варіабельною ділянкою легкого ланцюга, СОВ.1, СОВ2 або СОВЗ ділянкою за цим винаходом, як показано у наведеному у цьому описі Прикладі 10 та Фігурах 5-10.
За конкретними варіантами здійснення цей винахід пропонує виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язує фактор росту нервової тканини і містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка є: щонайменше на 7095 або 7595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 10, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095, 80905, 8590 або 95905 гомологічною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 81, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70905, 8095, 8595 або 9595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 83, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7595, 8095 або 8595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 85, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095, 7595 або 8095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 87, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 5695 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 79, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту.
За конкретними варіантами здійснення цей винахід пропонує виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язує фактор росту нервової тканини і містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка є: щонайменше на 7095, 7595, 8095 або 9095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 12, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095, 8595 або 9095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 80, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095, 7495, 9095 або 9495 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 88, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70905, 8095, 8595 або 8795 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 89, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70905, 8595, 9095 або 9495 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 90, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095, 8595, 90905, 9590 або 9995 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо 91, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095, 8095, 9095, 9590 або 9695 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 82, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 70905, 8595, 90905, 95905, 9890 або 9995 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 84, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095, 8595, 9095, 9595, 9895 або 9995 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 86, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту.
За певними іншими варіантами здійснення цей винахід пропонує виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язує фактор росту нервової тканини і містить СОН людського важкого ланцюга, де згадана
СОВА важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 4095 або 6095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 98, ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 105,
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 110 або ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 22, чи її антигензв'язувальному або імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту.
За іншими варіантами здійснення цей винахід пропонує виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язує фактор росту нервової тканини і містить СОН2 людського важкого ланцюга, де згадана СОН2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, що є: щонайменше на 7095, 8295 або 9495 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 99, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 7695 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 106, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 5995 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо18, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 117, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; або щонайменше на 7095, 7595 або 8095 ідентичною амінокислотній послідовності представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 111, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту.
За ще іншими варіантами здійснення цей винахід пропонує виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язує фактор росту нервової тканини і містить СОНТ людського легкого ланцюга, де згадана СОВНІ має амінокислотну послідовність, яка є: щонайменше на 7095 або 8095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 101, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095, 7595, 80905 або 9095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 95, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7595, 8095 або 9095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо119, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7595, 8095 або 9095 ідентичною амінокислотній послідовності представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 122, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 8095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 125, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7595, 8095 або 9095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 24, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 8095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 107, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; або щонайменше на 7095 або 8095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме113, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту.
За додатковими варіантами здійснення цей винахід пропонує виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язує фактор росту нервової тканини і містить СОН2 людського легкого ланцюга, де згадана СОН2 має амінокислотну послідовність, що є: щонайменше на 7095 або 8595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 102, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 96, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ
Мо120, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 123, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 8595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 126, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 8595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 129, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 20, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 8595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мое108, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 133, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; або щонайменше на 7095 або 8595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 114, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту.
За іншими варіантами здійснення цей винахід пропонує виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язує фактор росту нервової тканини і містить СОНЗ людського легкого ланцюга, де згадана СОНЗ має амінокислотну послідовність, що є: щонайменше на 7095 або 8595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 103, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 8595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 97, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 7895 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме121, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 7895 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 127, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 7895 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 130, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 7895 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 16, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7095 або 8595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 109, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; щонайменше на 7895 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме134, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту; або щонайменше на 8595 ідентичною амінокислотній послідовності, представленій
ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 115, або її антигензв'язувальному чи імунологічно функціональному імуноглобуліновому фрагменту.
Послідовності варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів антитіла 404 представлені
ПОСЛІДОВНОСТЯМИ Ме 10 і Мо 12, відповідно. Однак багато потенційних залишків, що контактують із гіперваріабельною ділянкою, є придатними для заміни іншими амінокислотами, але незважаючи на це, антитіло зберігає значний ступінь спорідненості з антигеном. Подібним же чином, багато залишків остовних ділянок, які не контактують із гіперваріабельними ділянками важких і легких ланцюгів, можуть сприйняти заміни амінокислот із відповідних положень інших людських антитіл, людських консенсусних амінокислот або з інших мишачих антитіл, без значної втрати спорідненості або неімуногенності людського антитіла. Можна вдатись до вибору різних альтернативних амінокислот для одержання версій розкритих анти-МОЕ антитіл та їхніх фрагментів, що мають різні комбінації спорідненості, специфічності, неімуногенності, легкості одержання та інші бажані властивості.
За альтернативними варіантами здійснення антитіла за цим винаходом можуть експресуватись у інших лініях клітин, окрім ліній клітин гібридом. За цими варіантами здійснення для трансформації відповідних клітин-хазяїв ссавців можуть застосовуватись послідовності, що кодують конкретні антитіла. За цими варіантами здійснення трансформація може здійснюватись за допомогою будь-якого відомого способу введення полінуклеотидів до клітини-хазяїна, у тому числі, наприклад, шляхом пакування полінуклеотиду до вірусу (або до вектора на основі вірусного геному) і трансдукції клітини-хазяїна згаданим вірусом (або вектором) чи за допомогою методів трансфекції, відомих у цій галузі, як описано у патентах США Ме 4,399,216,
Мо 4,912,040, Мо 4,740,461 та Мо 4,959,455 (усі з яких включені до цього опису шляхом посилання для будь-якої цілі). Взагалі, застосована методика трансформації може залежати від хазяїна, що піддається трансформації.
Методи введення гетерологічних полінуклеотидів до клітин ссавців є добре відомими у цій галузі і включають (але без обмеження) декстран-опосередковану трансфекцію, осадження фосфатом кальцію, полібрен- опосередковану трансфекцію, злиття протопластів, електропорацію, пакування полінуклеотиду(-ів) до ліпосом та пряму мікроін'єкцію ДНК до ядер.
Нуклеїновокислотну молекулу, що кодує амінокислотну послідовність константної ділянки важкого ланцюга, варіабельної ділянки важкого ланцюга, константної ділянки легкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга МаЕ-антитіла за цим винаходом, вводять до відповідного експресійного вектора за допомогою стандартного методу літування. За варіантами, яким віддають перевагу, константна ділянка важкого ланцюга або легкого ланцюга анти-МОРЕ антитіла додається до С-кінця відповідної варіабельної ділянки і лігується до експресійного вектора. Згаданий вектор, як правило, вибирають таким чином, щоб він був функціональним у конкретній застосованій клітині-хазяїні (тобто згаданий вектор є сумісним із механізмами клітини-хазяїна такою мірою, що може відбуватись ампліфікація та/або експресія гена). Огляд експресійних векторів дивись у роботі МЕТН. ЕМ2. 185 (редактор Геддел (Сюеєеаавєе!)), 1990, Асадетіс Ргезв.
За типовим варіантом, експресійні вектори, що застосовуються у будь-якій з клітин-хазяїв, будуть містити послідовності для підтримання плазмід та для клонування і експресії екзогенних нуклеотидних послідовностей. Такі послідовності, які за певними варіантами здійснення у сукупності називають "фланкуючими послідовностями", будуть, як правило, включати одну або декілька з наведених нижче нуклеотидних послідовностей: промотор, одну або декілька енхансерних послідовностей, сайт ініціації реплікації, термінатор транскрипції, повну інтронну послідовність, що містить донорну та акцепторну точку сплайсингу, послідовність, що кодує лідерну послідовність для секреції поліпептиду, сайт зв'язування рибосоми, послідовність поліаденілування, полілінкерну ділянку для введення нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид для експресії та селективний маркерний елемент. Кожна з цих послідовностей обговорюється нижче.
За факультативним варіантом, згаданий вектор може містити послідовність кодування "мітки", тобто олігонуклеотидну молекулу, розміщену на 5' або 3' кінці полілептидної кодувальної послідовності анти-МОаЕ антитіла; згадана олігонуклеотидна послідовність кодує полініх (наприклад, гексаніє) або іншу "мітку", наприклад, БІГ Аа, НА (гемаглютинін вірусу грипу) або тус, для яких існують комерційно доступні антитіла. Ця мітка, як правило, зливається з поліпептидом при його експресії, і може правити за засіб афінного очищення або виявлення МО антитіла у клітині-хазяїні. Афінне очищення може здійснюватись, наприклад, шляхом хроматографування на колонках із застосуванням антитіл проти згаданої мітки, як афінної матриці. За факультативним варіантом, згадана мітка може у подальшому видалятись з очищеного анти-МаЕ антитіла різними способами, наприклад, шляхом застосування певних пептидаз для розщеплення.
Фланкуючі послідовності можуть бути гомологічними (тобто від того самого виду та/або штаму, що і клітина-хазяїн), гетерологічними (тобто від інших видів, окрім виду клітини-хазяїна або штаму), гібридними (тобто комбінація фланкуючих послідовностей з більше ніж одного джерела), синтетичними або нативними. Як таким, джерелом фланкуючої послідовності може бути будь-який прокаріотний або еукаріотний організм, будь- який хребетний або безхребетний організм або будь-яка рослина, за умови, що згадана фланкуюча послідовність є функціональною у клітинних механізмах клітини-хазяїна і може бути активованою клітинними механізмами клітини-хазяїна.
Фланкуючі послідовності, придатні для згаданих векторів за цим винаходом, можна одержати за допомогою будь-якого з декількох способів, добре відомих у цій галузі. За типовим варіантом, фланкуючі послідовності, придатні для цього винаходу, будуть попередньо ідентифікуватись шляхом картування та/або рестриктазного розщеплення і можуть, таким чином, виділятись з відповідного тканинного джерела за допомогою відповідних рестриктаз. У деяких випадках, повна нуклеотидна послідовність фланкуючої послідовності може бути відомою. У такому разі, фланкуюча послідовність може бути синтезована за допомогою наведених у цьому описі методів синтезу або клонування нуклеїнових кислот.
Незалежно від того, чи є відомою уся або лише частина фланкуючої послідовності, цю фланкуючу послідовність можна одержати за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (РСА) та/або шляхом скринінгу геномної бібліотеки за допомогою відповідного зонда, наприклад, олігонуклеотиду та/або фрагмента фланкуючої послідовності від того самого або іншого виду. У разі, коли фланкуюча послідовність є невідомою, фрагмент ДНК, що містить фланкуючу послідовність, може бути виділеним із більшого відрізку ДНК, що може містити, наприклад, кодувальну послідовність або навіть інший ген або гени. Виділення може здійснюватись шляхом рестриктазного розщеплення з одержанням відповідного фрагмента ДНК з подальшим виділенням шляхом очищення на лунках із гелем агарози, хроматографування на колонках Оіадеп? (Снаїзмопй, штат
Каліфорнія) або за допомогою інших методів, відомих досвідченому фахівцю. Вибір відповідних ферментів для досягнення згаданої мети буде очевидним для пересічного фахівця у цій галузі.
Сайт ініціації реплікації являє собою, як правило, частину тих прокаріотних експресійних векторів, які одержують з комерційних джерел, і згаданий сайт допомагає у разі ампліфікації вектора у клітина-хазяїні.
Якщо обраний вектор не містить сайту ініціації реплікації, його можна синтезувати хімічним шляхом, виходячи з відомої послідовності, та лігувати до вектора. Наприклад, сайт ініціації реплікації з плазміди рВАЗ322 (фірма
Мем Епдіапа Віоїаб5, Вемепу, штат Массачусетс) є придатним для більшості грамнегативних бактерій, а різноманітні вірусні сайти (наприклад, 5М40, вірусу поліоми, аденовірусу, вірусу везикулярного стоматиту (М5М) або вірусу папіломи, наприклад, вірусу папіломи людини (НРУ) або вірусу папіломи великої рогатої худоби (ВРУ)) є придатними для клонування векторів у клітинах ссавців. Взагалі, така складова, як сайт ініціації реплікації не є необхідною для експресійних векторів ссавців (наприклад, сайт ініціації реплікації 5440 часто застосовують лише тому, що вш містить також ранній промотор вірусу).
Термінатор транскрипції, як правило, знаходиться у прямому (3) напрямку відносно кінця поліпептидної кодувальної ділянки і призначений для закінчення транскрипції. Термшатор у клітинах-прокаріотах являє собою, як правило, С-С-збагачений фрагмент, за яким іде полі(Т)-послідовність. Незважаючи на те, що термшатор легко клонується з бібліотеки або навіть одержується з комерційних джерел як частина вектора, він може бути легко синтезованим за допомогою методів синтезу нуклеїнових кислоти, наприклад, наведених у цьому описі.
Маркерний ген, що селектується, Селектований маркерний ген кодує білок, необхідний для виживання та росту клітини-хазяїна, яка вирощується на селективному культуральному середовищі. Типові селектовані маркерні гени кодують білки, які (а) забезпечують стійкість до антибіотиків або інших токсинів, наприклад, ампіциліну, тетрацикліну або канаміцину у разі прокаріотних клітин-хазяїв; (б) доповнюють ауксотрофні дефіцити клітини; або (с) постачають критичні поживні речовини, недоступні із живильних середовищ повного або певного складу. Переважними селектованими маркерними генами є ген стійкості до канаміцину, ген стійкості до ампіциліну та ген стійкості до тетрацикліну. Перевага полягає у тому, що ген стійкості до неоміцину може також застосовуватись для добору як прокаріотних, так і еукаріотних клітин-хазяїв.
Для ампліфікації гена, який буде експресуватись, можуть застосовуватись інші селектовані гени.
Ампліфікація являє собою процес, під час якого гени, необхідні для продукування білка, критичного для росту або виживання клітини, послідовно повторюються у хромосомах наступних генерацій рекомбінантних клітин.
Прикладами придатних селектованих маркерів для клітин ссавців є дигідрофолатредуктаза (ОНЕРЕ) та безпромоторні гени тимідинкінази. Клітини-трансформанти ссавців піддаються селекційному тиску, у разі якого лише трансформанти виявляються специфічно пристосованими для виживання завдяки присутності у векторі селектованого гена. Селекційний тиск накладається шляхом культивування трансформованих клітин за умов, при яких концентрація селекційного засобу у живильному середовищі поступово збільшується, наслідком чого є ампліфікація як селектованого гена, так і ДНК, що кодує інший ген, наприклад, антитіло, що зв'язується з
МОР поліпептидом. Як наслідок, з ампліфікованої ДНК синтезуються підвищені кількості поліпептиду, наприклад, анти-МаЕ антитіла.
Сайт зв'язування рибосоми є, як правило, необхідним для ініціювання трансляції мРНК і характеризується присутністю послідовності Шайна-Делгарно (прокаріоти) або послідовності Козака (еукаріоти). Згаданий елемент знаходиться, як правило, у прямому (3) напрямку відносно промотору і зворотному (5) напрямку відносно кодувальної послідовності поліпептиду, що буде експресуватись.
У деяких випадках, наприклад, коли бажаним є глікозилування експресійної системи, представленої еукаріотною клітиною-хазяїном, для поліпшення глікозилування або виходу можна здійснювати маніпуляції з різними пре- або пропослідовностями. Наприклад, можна змінити сайт пептидазного розщеплення конкретного сигнального пептиду або додати пропослідовності, які також можуть вплинути на глікозилування.
Кінцевий білковий продукт може мати у -1 положенні (відносно першої амінокислоти зрілого білка) одну або декілька додаткових амінокислот, зв'язаних з експресією, які могли бути неповністю видаленими. Наприклад, кінцевий білковий продукт може мати один або два амінокислотні залишки на сайті пептидазного розщеплення, приєднані до амінокінця. За альтернативним варіантом, наслідком застосування деяких сайтів ферментативного розщеплення може буде дещо укорочена форма бажаного поліпептиду, якщо фермент виявляє свою дію на такій ділянці у межах зрілого поліпептиду.
Вектори експресії та клонування за цим винаходом будуть, як правило, містити промотор, який розпізнається організмом-хазяїном і є функціонально зв'язаним із молекулою, що кодує анти-МаР антитіло.
Промоторами є нетранскрибовані послідовності, які знаходяться у зворотному напрямку (тобто 5) відносно стартового кодону структурного гена (як правило, приблизно у межах від 100 п.н. до 1000 п.н.), що контролюють транскрипцію структурного гена. Промотори, за традицією, об'єднують одним або двома класами: індуцибельні промотори і конститутивні промотори. Індуцибельні промотори ініціюють підвищені рівні транскрипції з ДНК під своїм контролем у відповідь на деяку зміну умов культивування, наприклад, присутність або відсутність поживної речовини або зміну температури. Конститутивні промотори, з іншого боку, одностайно транскрибують ген, з яким вони є функціонально зв'язаними, тобто з незначним або повною відсутністю контролю за експресією гена. Добре відомою є велика кількість промоторів, що розпізнаються різноманітними потенційними клітинами-хазяями. Придатний промотор функціонально зв'язується з ДНК, що кодує важкий ланцюг або легкий ланцюг, що містить анти-МОЕ антитіло за цим винаходом, шляхом видалення згаданого промотору з ДНК-джерела рестриктазним розщепленням і введенням бажаної промоторної послідовності до вектора.
У цій галузі добре відомими є також придатні промотори для застосування з дріжджовими клітинами- хазяями. Дріжджові енхансери застосовуються переважно з дріжджовими промоторами. Придатні промотори для застосування з клітинами-хазяями ссавців є добре відомими і включають (але без обмеження) промотори, одержані з геномів таких вірусів, як вірус поліоми, вірус віспи птиці, аденовірус (наприклад, аденовірус 2), вірус папіломи великої рогатої худоби, вірус саркоми птиці, вірус цитомегалії людини, ретровіруси, вірус гепатиту В і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, мавпячий вірус 40 (5М40). До інших придатних промоторів ссавців належать гетерологічні промотори ссавців, наприклад, промотори теплового шоку та промотор актину.
Додаткові промотори, що можуть становити інтерес, включають (але не обмежуються): ранній промотор
ЗМ 40 (Бернуа (ВегпоїзІ), Шамбон (Спатрбоп), 1981, Маштге 290:304-10); промотор СММ (Томсен (Тпотвгеп) та інші, 1984, Ргос. Май). Асад. ОБА 81:659-663); промотор, що міститься у 3' довгому кінцевому повторі вірусу саркоми Рауса (Ямамото (Уататоїйо) та інші, 1980, СеїІ 22:757-797); промотор тимідинкінази вірусу герпесу (Вагнер (М/адпег) та інші, 1981, Ргос. Май. Асай. сі. Ш.5.А. 78:1444-1445); промотор та регуляторні послідовності гена металотіоніну (Брінстер (Вііпеіеї) та інші, 1982, Машге 296:39-42); та промотори прокаріот, наприклад, промотор бета-лактамази (Вілла-Камароф (МіПа-Катагоїї) та інші, 1978, Ргос. Май). Асай. 5бі.
О.5.А., 75:3727-3731); або їас промотор (Дебер (Оевоєг!) та інші, 1983, Ргос. Майї). Асад. сі. 0.5.А., 80:21-25).
Інтерес становлять також наведені нижче ділянки транскрипційного контролю тварин, які демонструють тканинну специфічність і застосовуються у трансгенних тварин: контрольна ділянка гена еластази І, що є активною у ацинарних клітинах підшлункової залози (Свіфт (ЗУ!) та інші, 1984, Сеї! 38:639-646; Орніц (Огпіїг) та інші, 1986, Соїй ріпу Нагог бутр. Опцапі. Віої. 50:399-409 (1986); Макдоналд (МасбОопаїа), 1987,
Нерайюіоду 7:425-515); контрольна ділянка інсулінового гена, що є активною у бета-клітинах підшлункової залози (Ханахан (Напапап), 1985, Майте 315:115-22); контрольна ділянка імуноглобулінового гена, що є активною у лімфоїдних клітинах (Гросшедл (Сго55спеаі) та інші, 1984, Сеї! 38:647-658; Адамес (Адатевз) та інші, 1985, Машге 318:533-538; Александер (АІехапаєг") та інші, 1987, Мої. СеїІ. Віо!., 7:1436-1444); контрольна ділянка вірусу пухлин молочної залози мишей, що є активною у тестикулярних клітинах, клітинах молочної залози, лімфоїдних клітинах та тканинних базофільних гранулоцитах (Ледер (і єде/) та інші, 1986, Сеї! 45:485- 495); контрольна ділянка альбумінового гена, що є активною у печінці (Пінкерт (Ріпкег)) та інші, 1987, Сепев5 апа Оемеї. 1:268-276); контрольна ділянка гена альфа-фетобілка, що є активною у печінці (Крумлауф (Ктитіацї) та інші, 1985, Мої. СеїІ. ВіоІ., 5:1639-1648; Хаммер (Натте?!) та інші, 1987, Зсівєпсе 235:53-58); контрольна ділянка гена альфа 1-антитрипсину, що є активною у печінці (Келсі (Кеїзеу) та інші, 1987, Сепез апа Оемеї. 1:161-171); контрольна ділянка гена бета-глобіну, що є активною у мієлоїдних клітинах (Могрем (Модгат) та інші, 1985, Майште 315:338-340; Колліас (Коїїав) та інші, 1986, Сеї! 46:89-94); контрольна ділянка основного мієлінового білка, що є активною у олігодендроцитах головного мозку (Рідхед (Неайнеад) та інші, 1987, Сеї! 48:703-712); контрольна ділянка гена легкого ланцюга-2 міозину, що є активною у скелетних м'язах (Сані (Запі), 1985, Майшге 314:283-286): та контрольна ділянка гена гонадотропінвивільнювального гормону, що є активною у гіпоталамусі (Мейсон (Магоп) та інші, 1986, бсіепсе 234:1372-1378).
Енхансерна послідовність може вводитись до вектора для підсилення транскрипції ДНК, що кодує легкий ланцюг або важкий ланцюг, що містить анти-МаЕ антитіло за цим винаходом, вищими еукаріотами. Енхансери є цис-діючими елементами ДНК, довжиною, як правило, приблизно 10-300 п.н., які діють на промотор для підсилення транскрипції. Енхансери є відносно орієнтаційно та позиційно незалежними, оскільки їх знаходили як у 5-, так і у З-положеннях відносно транскрипційної одиниці. Відомими є декілька енхансерних послідовностей, доступних із генів ссавців (наприклад, глобін, еластаза, альбумін, альфа-фетопротеїн та інсулін). За типовим варіантом, однак, застосовують енхансер із вірусу. Зразковими енхансерними елементами для активації еукаріотних промоторів є такі відомі у цій галузі, як енхансер 5М 40, енхансер раннього промотору вірусу цитомегалії людини, енхансер вірусу поліоми та енхансери аденовірусу.
Незважаючи на те, що енхансер може займати у векторі 5- або 3-положення відносно кодувальної послідовності, він, як правило, розміщується на ділянці у зворотному напрямку (5)відносно промотора.
Експресійні вектори за цим винаходом можуть конструюватись із вихідного вектора, наприклад, комерційно доступного вектора. Такі вектори можуть містити або можуть не містити усі бажані фланкуючі послідовності. У разі, якщо у згаданому векторі немає однієї або декількох фланкуючих послідовностей, опис яких наведено, вони можуть бути одержані у індивідуальному порядку і ліговані до вектора. Методи, що застосовуються для одержання кожної зі згаданих фланкуючих послідовностей, є добре відомими фахівцю у цій галузі.
Після завершення конструювання вектора і введення нуклеїновокислотної молекули, що кодує легкий ланцюг, важкий ланцюг або легкий ланцюг і важкий ланцюг, що містить анти-МОЕ антитіло, на відповідну ділянку вектора, готовий вектор може вводитись до відповідної клітини-хазяїна для ампліфікації та/або експресії поліпептиду. Трансформація експресійного вектора для анти-МОЕ антитіла у вибраній клітині-хазяїні може здійснюватись добре відомими методами, у тому числі шляхом трансфекції, інфекції, копреципітації фосфатом кальцію, електропорації, мікроін'єкції, ліпофекції, трансфекції, опосередкованої ДЕАЕ-декстраном або інших відомих методів. Вибраний метод буде частково залежати від типу застосованої клітини-хазяїна. Ці методи та інші придатні методи є добре відомими досвідченому фахівцю і наведені, наприклад, у довіднику
Сембрук (ЗатрбгоокК) та інших (дивись вище).
Клітина-хазяїн, культивована за відповідних умов, синтезує анти-МаЕ антитіло, яке у подальшому може виділятись із культурального середовища (якщо клітина-хазяїн секретує його до живильного середовища) або безпосередньо з клітини-хазяїна, що його продукує (якщо воно не секретується). Вибір придатної клітини- хазяїна буде залежати від різних факторі, у тому числі бажаних рівнів експресії, модифікацій поліпептиду, що є бажаними або необхідними для активності (наприклад, глікозилування або фосфорилування) та легкості укладання у біологічно активну молекулу.
Лінії клітин ссавців, доступні як хазяї для експресії, є добре відомими у цій галузі і включають (але без обмеження) імморталізовані лінії клітин, доступні від Американської колекції типових культур (АТСС), у тому числі (але без обмеження), клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), клітини НегГа, клітини нирок хом'ячка (ВНК), клітини нирок мавпи (СО5), клітини злоякісної гепатоми людини (наприклад, Нер 22) та ряд інших клітинних ліній. За певними варіантами здійснення лінії клітин можуть бути вибрані шляхом визначення, яка з клітинних ліній має високі рівні експресії і конститутивно продукує антитіла з МОБ-зв'язувальними властивостями. За іншими варіантами здійснення може бути вибрана лінія клітин В-клітинної лінії диференціювання, яка не продукує свого власного антитіла, але є здатною до продукування та секреції гетерологічного антитіла.
Антитіла за цим винаходом є придатними для виявлення МОБ у біологічних пробах та ідентифікації клітин або тканин, що продукують МО білок. Антитіла за цим винаходом, які специфічно зв'язуються з МОЕ, можуть бути придатними для лікування МОЕ-опосередкованих захворювань. Згадані антитіла можуть застосовуватись у реакціях зв'язування для виявлення МОРЕ та пригнічення утворення комплексу МОЕ із рецепторами МО.
Згадані антитіла, що зв'язуються з МОРЕ і блокують взаємодію з іншими зв'язувальними сполуками, можуть мати терапевтичне застосування при модулюванні МОгЕ-опосередкованих захворювань. За варіантами, яким віддають перевагу, антитіла проти МОРЕ можуть блокувати зв'язування МО з його рецептором, наслідком чого може бути руйнування шляху трансдукції МаЕ-індукованого сигналу.
Цей винахід має також відношення до застосування одного або декількох антитіл за цим винаходом для виготовлення лікарського засобу для лікування болісного розладу або стану, що спричинюється підвищеною експресією МОР або підвищеною чутливістю до МО у хворого, наприклад, будь-якого з розладів або станів, розкритих у цьому описбі.
За варіантами, яким віддають перевагу, цей винахід пропонує фармацевтичні композиції, що містять терапевтично ефективну кількість одного або декількох антитіл за цим винаходом разом із фармацевтично прийнятним розріджувачем, носієм, солюбілізатором, емульгатором, консервантом та/або ад'ювантом. За варіантом, якому віддають перевагу, матеріали, придатні для композицій, є нетоксичними для реципієнтів у застосованих дозах та концентраціях. За варіантами, яким віддають перевагу, пропонуються фармацевтичні композиції, що містять терапевтично ефективну кількість анти-МОЕ антитіл.
За певними варіантами здійснення матеріали, придатні для композицій, є нетоксичними для реципієнтів у застосованих дозах та концентраціях.
За певними варіантами здійснення фармацевтична композиція може містити матеріали для модифікування, підтримання або збереження, наприклад, рН, осмотичного тиску, в'язкості, прозорості, кольору, ізотонічності, запаху, стерильності, стабільності, швидкості розчинення або виділення, поглинання або проникнення згаданої композиції. За такими варіантами здійснення до придатних для одержання композицій матеріалів належать (але ними не обмежуються) амінокислоти (наприклад, гліцин, глутамін, аспарагін, аргінін або лізин); протимікробні засоби; антиоксиданти (наприклад, аскорбінова кислота, сульфіт натрію або гідросульфіт натрію); буфери (наприклад, борат, бікарбонат, трис-НСІ, цитрати, фосфати або інші органічні кислоти); наповнювачі (наприклад, маніт або гліцин); хелатоутворювачі (наприклад, етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕОТА)); комплексоутворювачі (наприклад, кофеїн, полівінілпіролідон, бета- циклодекстрин або гідроксипропіл-бета-циклодекстрин); заповнювачі; моносахариди; дисахариди; та інші вуглеводи (наприклад, глюкоза, маноза або декстрини); білки (наприклад, сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни); барвники, коригенти та розріджувачі; емульгатори; гідрофільні полімери (наприклад, полівінілпіролідон); поліпептиди низької молекулярної маси; солетворні протиіїони (наприклад, натрій); консерванти (наприклад, бензалконію хлорид, бензойна кислота, саліцилова кислота, тімеросаль, фенетиловий спирт, метилпарабен, пропілпарабен, хлоргексидин, сорбінова кислота або пероксид водню); розчинники (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь або поліетиленгліколь); спирти з цукру (наприклад, маніт або сорбіт); суспендувальні засоби; поверхнево-активні або змочувальні речовини (наприклад, плуроніки, поліетиленгліколь, складні ефіри сорбітану, полісорбати, наприклад, полісорбат 20, полісорбат 80, тритон, трометамін, лецитин, холестерин, тилоксапал); речовини, що сприяють підвищенню стійкості (наприклад, цукроза або сорбіт); засоби, що сприяють підвищенню ізотонічності (наприклад, галогеніди лужних металів, за варіантом, якому віддають перевагу, хлорид натрію або калію, маніт, сорбіт); носії; розчинники; наповнювачі та/"або фармацевтичні ад'юванти. Дивись НЕМІМЕАТОМ'Є РНАВАВМАСЕШТІСАЇ Б5СІЕМСЕ5, 18 видання, (редактор А.Р. Геннаро (А.В. Сеппаго)), 1990, Маск Рибіїзпіпд Сотрапу.
За певними варіантами здійснення оптимальна фармацевтична композиція буде визначатись фахівцем у цій галузі у залежності від, наприклад, передбачуваного шляху введення, формату доставки та бажаної дози.
Дивись, наприклад, ВЕМІМЕВАВТОМ'Є РНААМАСЕИШТІСАЇ ЗСІЕМСЕ5 (дивись вище). За певними варіантами здійснення такі композиції можуть впливати на фізичний стан, стійкість, швидкість виділення іп мімо та швидкість виведення іп міїго антитіл за цим винаходом.
За певними варіантами здійснення головний розчинник або носій фармацевтичної композиції може бути за своєю природою водним або неводним. Наприклад, прийнятним розчинником або носієм може бути вода для ін'єкцш, фізіологічний розчин або штучна цереброспінальна рідина, можливо, доповнена іншими матеріалами, що традиційно застосовуються у композиціях для парентерального введення. Додатковими зразковими носіями є нейтральний буферний розчин або фізіологічний розчин у суміші із сироватковим альбуміном. За варіантами, яким віддають перевагу, фармацевтичні композиції за цим винаходом містять трис-буфер із приблизним рН 7,0-8,5 або ацетатний буфер із приблизним рН 4,0-5,5 і можуть додатково містити сорбіт, цукрозу, твін-20 та/або їхні придатні замісники. За певними варіантами здійснення цього винаходу композиції анти-МОЕ антитіла можуть готуватись для збереження шляхом змішування вибраної композиції, що має бажаний ступінь чистоти, з факультативними речовинами для виготовлення композицій (АЕМІМСАТОМ'Є
РНАВАВМАСЕИШТІСАЇ ЗСІЕМСЕ5 (дивись вище)) у вигляді ліофілізованого брикету або водного розчину. На додаток до цього, за певними варіантами здійснення анти-МаР антитіло може вводитись до складу композиції як ліофілізат із застосуванням придатних наповнювачів, наприклад, цукрози.
Фармацевтичні композиції за цим винаходом можуть вибиратись для парентерального введення. За альтернативним варіантом, композиції можуть вибиратись для інгаляції або доставки через травний тракт, наприклад, пероральним шляхом. Виготовлення таких фармацевтично прийнятних композицій знаходиться у межах можливостей цієї галузі.
Компоненти композиції, за варіантом, якому віддають перевагу, надаються у концентраціях, які є прийнятними для місця введення. За певними варіантами здшснення буфери застосовуються для підтримання композиції у межах фізіологічного або дещо нижчого рн, як правило, у діапазоні рН від приблизно до приблизно 8.
У разі, коли передбачається парентеральне введення, терапевтичні композиції для застосування за цим винаходом можуть надаватись у формі апірогенного, парентерально прийнятного водного розчину, що містить бажане анти-МИЕ антитіло у фармацевтично прийнятному розчиннику. Особливо прийнятним розчинником для парентеральної ін'єкції є стерильна дистильована вода, до якої анти-МОаЕ антитіло вводять у вигляді стерильного, відповідним чином консервованого ізотонічного розчину. За певними варіантами здійснення виготовлення композиції може включати введення до її складу бажаної молекули з агентом, наприклад, придатними для ін'єкцій мікросферами, частинками, що піддаються біорозкладу, полімерними сполуками (наприклад, полімером молочної кислоти або полігліколевою кислотою), кульками або ліпосомами, який може забезпечити пролонговане вивільнення згаданого продукту, який може доставлятись шляхом ін'єкції речовин уповільненого всмоктування. За певними варіантами здійснення може застосовуватись також гіалуронова кислота, що має ефект збільшення часу перебування у системі кровообігу. За певними варіантами здійснення для введення бажаної молекули антитіла можуть застосовуватись засоби доставки лікарського препарату, що імплантуються.
Фармацевтичні композиції за цим винаходом можуть виготовлятись у формі, придатній для інгаляції. За цими варіантами здійснення композиціям, до складу яких входять анти-Ма антитіла, надається форма сухого порошку для інгаляцій. За варіантами, яким віддають перевагу, до складу інгаляційних розчинів анти-МОаЕ антитіла може вводитись пропелент для аерозольної доставки. За певними варіантами здійснення розчини можуть розпилюватись. Внутрішньолегеневе введення і способи одержання таких композицій додатково описані у міжнародній заявці РОТ/О594/001875, яка включена до цього опису шляхом посилання і описує внутрішньолегеневу доставку хімічно модифікованих білків.
Передбачається також, що композиції можуть вводитись пероральним шляхом. Анти-МОаЕ антитіла, що вводяться подібним чином, можуть вводитись до складу композицій з носіями або без носіїв, які традиційно застосовуються при виготовленні твердих лікарських форм, наприклад, таблеток та капсул. За певними варіантами здійснення капсула може конструюватись таким чином, щоб вивільнення активної складової композиції відбувалось на ділянці шлунково-кишкового тракту, коли біодоступність є максимальною, а передсистемний розклад є мінімальним. Для полегшення поглинання анти-МОЕ антитіла можуть включатись додаткові агенти. Можуть застосовуватись також розріджувачі, коригенти, смоли з низькою температурою розплавлення, рослинні олії, змащувальні речовини, суспендувальні речовини, речовини, що сприяють розпаду таблетки, і в'яжучі речовини.
Фармацевтична композиція за цим винаходом, за варіантом, якому віддають перевагу, надається таким чином, щоб вона містила ефективну кількість одного або декількох анти-МОЕ антитіл у суміші з нетоксичними наповнювачами, придатними для виготовлення таблеток. Шляхом розчинення таблеток у стерильній воді або іншому прийнятному носії можуть бути одержані розчини у однодозовій формі. До прийнятних наповнювачів належать (але без обмеження) інертні розріджувачі, наприклад, карбонат кальцію, карбонат або бікарбонат натрію, лактоза або фосфат кальцію; або зв'язувальні речовини, наприклад, крохмаль, желатин або аравійська камедь; або змащувальні речовини, наприклад, стеарат магнію, стеаринова кислота або тальк.
Фахівцям у цій галузі будуть очевидними додаткові фармацевтичні композиції, у тому числі композиції, що містять анти-МОЕ антитіла для пролонгованого вивільнення. Фахівцям у цій галузі відомі також інші способи виготовлення різноманітних інших засобів доставки пролонгованої дії, наприклад, ліпосомних носіїв, мікрочастинок або пористих кульок, що піддаються біорозкладу і ін'єкцій речовин уповільненого всмоктування.
Дивись, наприклад, міжнародну заявку РСТ/О593/00829, яку включено до цього опису шляхом посилання і яка описує пролонговане вивільнення пористих полімерних мікрочастинок для доставки фармацевтичних композицій. Препарати пролонгованої дії можуть включати напівпроникні полімерні матриці у формі виробів певної форми, наприклад, плівок або мікрокапсул. Матриці пролонгованої дії можуть включати складні поліефіри, гідрогелі, полімери молочної кислоти (як розкривається у патенті США Мо 3,773,919 та публікації заявки на європатент ЕР 058481, які включено до цього опису шляхом посилання), співполімери І- глутамінової кислоти та гамма-етил-і -глутамату (Сідмен (бідтап) та інші, 1983, Віороїутегв 22:547-556), полі- (2-гідроксіетилметакрилат) (Лангер (І апдеїг) та інші, 1981, У. Віотеай. Маїег. Нев. 15:167-277, Лангер (Гапдег), 1982, Спет. Тесі. 12:98-105), етиленвінілацетат (Лангер (Іапдеї) та інші (дивись вище)) або полі-(0)-(-)-3- гідроксимасляну кислоту (публікація заявки на європатент ЕР 133,988). Композиції пролонгованої дії можуть включати також ліпосоми, які можуть бути одержані за будь-яким із декількох способів, відомих у цій галузі.
Дивись, наприклад, Еппстейн (Еррвієїп) та інші, 1985, Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА 82:3688-3692; публікація заявок на європатент ЕР 036,676; ЕР 088,046 та ЕР 143,949, які включено до цього опису шляхом посилання.
Фармацевтичні композиції, що застосовуються для введення іп мімо, надаються, як правило, у вигляді стерильних препаратів. Стерилізація може здійснюватись шляхом фільтрації через стерильні фільтраційні мембрани. Коли композиція ліофілізується, стерилізація за цим способом може здійснюватись перед або після ліофілізації та відновлення. Композиції для парентерального введення можуть зберігатись у ліофілізованій формі або у вигляді розчину. Парентеральні композиції, як правило, вміщують до контейнера, що має отвір для стерильного доступу, наприклад, до мішечка для зберігання внутрішньовенних розчинів або до флакона з пробкою, яка може проколюватись голкою шприца для ін'єкцій.
Після виготовлення фармацевтичної композиції, вона може зберігатись у стерильних флаконах у вигляді розчину, суспензії, гелю, емульсії, твердої речовини або зневодненого чи ліофілізованого порошку. Такі композиції можуть зберігатись у готовій до застосування формі або у формі (наприклад, ліофілізованій), що відновлюється перед введенням.
Цей винахід пропонує також набори для введення разової дози. Кожен зі згаданих наборів за цим винаходом може включати перший контейнер, що містить сухий білок, і другий контейнер, що містить водну композицію. За певними варіантами здійснення цього винаходу пропонуються набори, що включають одно- та багатокамерні попередньо заповнені шприци (наприклад, шприци для рідини та шприци для введення ліофілізованої речовини).
Ефективна кількість фармацевтичної композиції, що містить анти-МОЕ антитіло, призначеної для терапевтичного застосування, буде залежати, наприклад, від терапевтичного контексту та цілей. Фахівцю у цій галузі буде зрозуміло, що придатна доза для лікування буде залежати, частково, від молекули, що доставляється, показання, за яким застосовується анти-МаР антитіло, шляху введення і розміру (маса тіла, поверхня тіла або розмір органа) та/або стану (вік та загальний стан здоров'я) хворого. За певними варіантами здійснення лікар може титрувати дозу і модифікувати шлях введення для одержання оптимального терапевтичного ефекту. Типова доза може коливатись у межах від приблизно 0,1 мкг/кг до приблизно 30 мг/кг або більше, у залежності від згаданих вище факторів. За варіантами, яким віддають перевагу, доза може коливатись у межах від 0,1 мкг/кг до приблизно 30 мг/кг; за варіантом, якому віддають більшу перевагу, від 1 мкг/кг до приблизно 30 мг/кг; за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, від 5 мкг/кг до приблизно 30 мг/кг.
Частота введення доз буде залежати від фармакокінетичних параметрів конкретного анти-МОЕ антитіла, що застосовується у композиції. За типовим варіантом, лікар вводить композицію до досягнення дози, що забезпечує одержання бажаного ефекту. Згадана композиція може, таким чином, вводитись разовою дозою або двома чи більше дозами (які можуть містити або можуть не містити однакову кількість бажаної речовини) впродовж певного періоду часу або шляхом безперервного вливання через імплантований засіб або катетер.
Додаткове точніше визначення придатної дози здійснюється фахівцями у цій галузі звичайним шляхом і входить до обсягу завдань, які традиційно здійснюються ними. Прийнятність дози може підтверджуватись за допомогою відповідних даних залежності реакції від дози. За певними варіантами здійснення антитіла за цим винаходом можуть вводитись хворим впродовж тривалих періодів часу. Постійне введення антитіла за цим винаходом зводить до мінімального рівня негативні імунні та алергічні реакції, які традиційно пов'язують з антитілами, які одержують проти людського антигену у тваринах, окрім людини, наприклад, із неповним людським антитілом, одержаним у видах, окрім людини.
Спосіб введення фармацевтичної композиції відповідає відомим методам, наприклад, пероральним шляхом, шляхом ін'єкцій внутрішньовенним, внутрішньоочеревинним, інтрацеребральним (внутрішньопаренхіматозним), інтрацеребровентрикулярним, внутрішньом'язовим, внутрішньоочним, внутрішньоартеріальним, інтрапортальним шляхами або шляхом введення до середини місця ураження; системами пролонгованого вивільнення або засобами, що імплантуються. За певними варіантами здійснення композиції можуть вводитись шляхом ін'єкції болюса або безперервно шляхом вливання чи засобом, що імплантується.
Композиція може також вводитись місцево шляхом імплантування мембрани, губки або іншого відповідного матеріалу, яким бажана молекула була абсорбована або до якого її було включено. За певними варіантами здійснення у разі застосування засобу, що імплантується, засіб може бути імплантованим до будь- якої відповідної тканини або органа, і доставка бажаної молекули може здійснюватись шляхом дифузії, шляхом застосування болюса пролонгованої дії або шляхом безперервного введення.
Бажаним може також бути ех мімо застосування фармацевтичних композицій, що містять анти-МаЕ антитіло за цим винаходом. У подібних випадках, клітини, тканини або органи, видалені у хворого, обробляють фармацевтичними композиціями, що містять анти-МОЕ антитіло, після чого згадані клітини, тканини та/або органи знову імплантують хворому.
Зокрема, анти-МОаЕ антитіла можуть доставлятись шляхом імплантування певних клітин, які були піддані генно-інженерним маніпуляціям із застосуванням таких, наприклад, способів, які наводяться у цьому описі, для експресії та секреції поліпептиду. За певними варіантами здійснення такими клітинами можуть бути клітини тварин або людей, і ці клітини можуть бути автологічними, гетерологічними або ксеногенними. За певними варіантами здійснення згадані клітини можуть бути імморталізовані За певними варіантами здійснення для зменшення ймовірності імунологічної реакції, клітини можуть бути включені до капсул для запобігання інфільтрації навколишніх тканин. За додатковими варіантами здійснення матеріали для виготовлення згаданих капсул є, як правило, біосумісними, напівпроникними полімерними матеріалами або мембранами, які забезпечують можливість вивільнення білка(-ів), але запобігають знищенню клітин імунною системою хворого або іншими шкідливими факторами з навколишніх тканин.
ПРИКЛАДИ
Наведені нижче приклади, що включають проведені експерименти і одержані результати, подані виключно з ілюстративною метою і не повинні розглядатись як такі, що обмежують цей винахід.
Приклад 1
Одержання людського МОБ білка з клітин Е. сої
Клонування гНи-Ма (1-120)
Нуклеотидну послідовність, що кодує людський МОР, ампліфікували з кДНК за допомогою олігонуклеотидних праймерів із послідовностями, представленими ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 27 та
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 28, і стандартної полімеразної ланцюгової реакції (РСА). 5'і-праймер утворює Маеї! сайт рестрикції та метіоніновий ініціювальний кодон, що безпосередньо передує кодону 1 (серин) зрілої послідовності. 3'-праймер утворює Ватні сайт рестрикції, який безпосередньо розміщується за стоп-кодоном.
Одержаний РСВ продукт піддавали очищенню у лунках із гелем, розщеплювали рестриктазами Має! і Ватні, після чого літували до вектора РСЕМ1656, який також розщеплювали за допомогою Має! і Ватні. Ліговану
ДНК трансформували у компетентних клітинах-хазяях Е. соїї штам 657. Клони перевіряли на здатність до продукування рекомбінантного білкового продукту і на присутність плазміди, що має відповідну нуклеотидну послідовність (наприклад, ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 29). Амінокислотна послідовність рекомбінантного людського
Мав 1-120 представлена як ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме30.
Експресійний вектор РСЕМ1656 (АТС Ме 69576) одержали з експресійної векторної системи, описаної у патенті США Ме 4,710,473. Плазміду РСЕМ1656 можна одержати з описаної плазміди рСЕМ836 (патент Ме 4,710,473) таким чином: (а) руйнуванням двох ендогенних Має! сайтів рестрикції шляхом доповнення кінців ферментом Т4 полімеразою з подальшим літуванням по "тупих" кінцях; (б) заміною послідовності ДНК між специфічними дай і Сіа! сайтами рестрикції, що містить синтетичний промотор Рі, на подібний фрагмент, одержаний з рСЕМб636 (патент Ме 4,710,473), що містить промотор Рі, із подальшою (с) заміною невеликої послідовності ДНК між специфічними Сіаї і Крпі! сайтами рестрикції на олігонуклеотид, який одержали шляхом ренатурації двох зондів, що мають нуклеотидні послідовності, представлені ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 31 і
ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 32.
Штам-хазяїн К12 БЕ. соїї (штам 657, фірма Атдеп) є похідною Е. соїї М/1485 (штам К12), культуру якої одержали з центру Е. соїї Сепеїййс 5іоскК Сепієг, Має Опімегзйу, Меж Намеп, штат Конектикут (С25С штам 6159).
Експресія гНи-МаЕ (1-120)
Клітини БЕ. соїї, що містять генно-інженерну конструкцію для експресії МОЕ (як описано вище), піддавали ферментації у збагаченому середовищі у режимі підживлювання культури одного виробничого циклу. Клітини вирощували при температурі 30"С до оптичної густини 49 при 600 нм, після чого індукували температурним зсувом до 42"С. Клітини збирали шляхом центрифугування впродовж 4 год після індукування. Кінцева оптична густина становила 75. Вихід продукту експресії, за визначенням, становив приблизно 0,15 г/л.
Повторне укладання і очищення гНи-Має (1-120)
Клітинну масу піддавали лізису у Місгойціділег, центрифугували при 10000 худ впродовж 30 хв, осад промивали 195 дезоксихолевою кислотою, центрифугували, як вказано вище, після чого одержаний осад промивали холодною водою і піддавали повторному центрифугуванню. Одержаний осад ((М/ІВ5 - промиті тільця включення) ресуспендували у денатурованому 8 М розчині гуанідину-НСІ, 50 мМ розчині трис-буфера (рН 8,5), що містив 10 мм розчин ОТТ (дитіотреїтол), і солюбілізували при кімнатній температурі впродовж 1 год, центрифугували при 10000 хд впродовж 30 хв, супернатант обережно зливали, після чого піддавали 25- кратному розведенню водним буферним розчином, що містив окислювально-відновну пару при температурі 4"С впродовж 5 днів. Одержаний повторно укладений продукт після цього титрували до рН 3,0 і фільтрували через 0,45 мкМ фільтр. Згаданий повторно укладений продукт очищали на колонці 5р-Зерпагозе Гаві йому із застосуванням стандартного градієнта Масі. Пул із катіонообмінної колонки у подальшому концентрували, і аліквоти заморожували при температурі -80"С. Чистоту білка визначали шляхом електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (505-РАСЕ) і аналізували забарвлюванням кумасі синім. Головну смугу за цим способом більше ніж на 9095 становив очищений білок.
Приклад 2
Одержання людських моноклональних антитіл проти фактора росту нервової тканини (МО)
Трансгенні НиМаб і КМ миші
Повністю людські моноклональні антитіла проти МОРЕ одержали за допомогою трансгенних мишей ліній
НСо7, НСо12, НСо7 -НСо12 і КМ, кожна з яких експресує гени людського антитіла. У кожної з цих ліній мишей ендогенний ген мишачого легкого ланцюга типу каппа гомозиготно руйнували, як описано у Чен (Спеп) та інших (1993, ЕМВО 4. 12:811-820), а ендогенний ген мишачого важкого ланцюга гомозиготно руйнували, як описано у Прикладі 1 публікації міжнародної заявки М/УО 01/09187 (яку включено до цього опису шляхом посилання). Кожна з цих мишачих ліній несе людський трансген легкого ланцюга типа каппа, КСо5, як описано у Фішвайлд (РібвпмлІЯ) та інших (1996, Майте Віосесппоіоду 14:845-851). Лінія НСо7 несе трансген НСо7 людського важкого ланцюга, як описано у патентах США Мо 5,545,806, Ме 5,625,825 і Мо 5,545,807 (які включено до цього опису шляхом посилання). Лінія НСо12 несе трансген НСо12 людського важкого ланцюга, як описано у Прикладі 2 публікації міжнародної заявки УМО 01/09187 (яку включено до цього опису шляхом посилання). Лінія НСо74НСо12 несе обидва трансгени НСо7 і НСо12 важкого ланцюга і є гемізиготною по кожному трансгену. Миші лінії КМ містять трансген 5020 важкого ланцюга, як описано у Томізука (Тотігика) та інших (1997, Маїиге Сепеї. 16, 133-143 і 2000, Ргос. Маї. Асад. 5сі, 97, 722-727). Цей трансген не інтегрується до мишачої хромосоми, але замість цього розмножується як незалежний хромосомний фрагмент. Цей фрагмент включає приблизно 15 МВ людської хромосоми 14. Він містить повний локус людського важкого ланцюга, у тому числі усі сегменти генів МН, 0 їі УН та усі ізотипи константної ділянки важкого ланцюга. Усі ці лінії позначаються у цьому описі як Нимаб миші.
Імунізація НиМаб:
Для одержання повністю людських моноклональних антитіл проти МСЕ, НиМар мишей імунізували очищеним рекомбінантним МО, який одержали з клітин Е. соїї, який відігравав роль антигену (Приклад 1).
Загальні схеми імунізації НиМаб мишей описані у Лонберг (ІГопрего) та інших (1994, Майшге 368:856-859;
Фішвайлд (РівпУлІЯ) та інших (дивись вище) і у публікації міжнародної заявки УУО 98/24884; усі згадані матеріали включено до цього опису шляхом посилання). Під час першого вливання антигену вік мишей становив 6-16 тижнів. Для імунізації НимМар мишей внутрішньоочеревинним (ІР) та підшкірним (52) шляхами застосовували очищений рекомбінантний препарат (25-100 мкг) МО антигену.
Імунізацію НиМар трансгенних мишей здійснювали шляхом введення антигену у повному ад'юванті
Фрейнда і двома ін'єкціями антигену у неповному ад'юванті Фрейнда через 2-4 тижні після імунізації внутрішньоочеревинним шляхом (у загальній кількості до 9 імунізацій). Кожним антигеном імунізували декілька десятків мишей. У загальній кількості МОЕ антигеном імунізували 118 мишей ліній НСо7, НСо12, НСо7-НСо12 і КМ. Імунну реакцію контролювали шляхом відбирання проб крові на ретроорбітальній ділянці.
Для того, щоб вибрати НиМаб мишей, що продукують антитіла, які зв'язують людський МОРЕ, проби сироватки імунізованих мишей піддавали ЕГІЗА (твердофазний імуноферментний аналіз), як описано у
Фішвайлд (Ріпа) та інших (дивись вище). Стисло, титраційні мікропланшети сенсибілізували очищеним рекомбінантним МО від Е. соїї (Приклад 1) (1-2 мкг/мл у РВ5 (забуферений фосфатом фізіологічний розчин)/50 мкл/лунку), інкубували при температурі 4"С впродовж ночі, після чого блокували 200 мкл/лунку 590 розчину курячої сироватки у РВ5/Твін (0,0595). До кожної лунки додавали розведення плазми від МаЕ- імунізованих мишей, і інкубували впродовж 1-2 год при температурі навколишнього середовища. Планшети промивали РВ5Б/ТІвін, після чого інкубували з козячим антилюдським Ідс Ес-специфічним поліклональним реактивом, кон'югованим із пероксидазою з хрону (НАР) впродовж 1 год при кімнатній температурі. Планшети промивали РВ5/Івін і інкубували з козячим антилюдським Ідс: Ес-специфічним поліклональним реактивом, кон'югованим із пероксидазою з хрону (НАР) впродовж 1 год при кімнатній температурі. Після промивання планшети проявляли субстратом АВТ5 (фірма бідта Спетісаї! Со., 5. І оців, штат Міссурі, номер за каталогом
А-1888, 0,22 мг/мл), і піддавали спектрофотометричному аналізу шляхом визначення оптичної густини (00) при довжині хвилі 415-495 нм. Мишей з достатніми титрами людського імуноглобуліну проти Маг застосовували для продукування моноклональних антитіл, як описано нижче.
Одержання гібридом, що продукують людські моноклональні антитіла проти МАЕ
Мишей готували для продукування моноклональних антитіл шляхом внутрішньовенної реїімунізації антигеном за 2 дні до умертвіння з подальшим видаленням селезінок. Мишачі спленоцити виділяли з НиМар мишей і за стандартними методиками, за допомогою поліетиленгліколю, зливали з лінією клітин мишачої мієломи. За типовим варіантом, здійснили 10-20 зливань для кожного антигену.
Стисло, суспензії окремих клітин лімфоцитів селезінки імунізованих мишей зливали з однією четвертою кількості несекретуючих клітин мишачої мієломи РЗХбЗ-Ад8.653 (АТОСС, номер депонування СА 1580) з 5095 розчином поліетиленгліколю (РЕС) (фірма бідта). Клітини висівали (приблизно 1х105/лунку) на титраційні мікропланшети з плоским дном із подальшим приблизно двотижневим інкубуванням у селективному середовищі, що містило 1090 сироватки зародка великої рогатої худоби, 1095 кондиціонованого живильного середовища РЗ880О1 (АТСС, номер депонування СВІ ТІВ-63), 3-595 розчин оригену (фірма ІСЕМ) у ОМЕМ (модифіковане за способом Дульбекко середовище Ігла) (фірма Медіагесі, номер за каталогом СВІ 10013, із високим вмістом глюкози, І -глутаміну і пірувату натрію) плюс 5 мМ розчин ГЕПЕС-буфера, 0,055 мМ розчин 2- меркаптоетанолу, 50 мг/мл гентаміцину і 1ТхНАТ (гіпоксантин-аміноптеринтимідинове середовище) (фірма
Зідта, номер за каталогом СВІ. Р-7185). Через 1-2 тижні клітини культивували у середовищі, у якому НАТ замінили на НТ (гіпоксантин-тимідинове "проміжне" середовище).
Одержані гібридоми перевіряли на продукування антиген-специфічних антитіл. Окремі лунки перевіряли за допомогою ЕГІЗА (описано вище) на людські анти-МОЕ моноклональні да антитіла. Після екстенсивного росту гібридом, середовище контролювали, як правило, через 10-14 днів. Гібридоми, що секретували антитіла, пересівали, знову перевіряли, і у разі, якщо вони все ще залишались позитивними на людський да, анти-МОЕ моноклональні антитіла субклонували щонайменше двічі шляхом обмежувального розведення.
Після цього стабільні субклони культивували іп мімо з одержанням невеликої кількості антитіла у середовищі для культивування тканин для визначення характеристик.
Добір людських моноклональних антитіл, що зв'язуються з МО
Твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГ І5А), як описано вище, застосовували для добору гібридом, які продемонстрували позитивну реактивність із МОЄ імуногеном. Гібридоми, які секретують моноклональне антитіло, що з високою спорідненістю зв'язується з МОРЕ, субклонували і піддавали подальшому визначенню характеристик. Один клон кожної гибридоми, який зберігав реактивність батьківських клітин (за результатами визначення за допомогою ЕГІ5А), вибирали для одержання банку клітин (5-10 флаконів), який зберігали у рідкому азоті.
Для визначення ізотипу моноклональних антитіл, які продукуються за наведеним описом, вдавались до проведення ізотипоспецифічного ЕГІБА. Під час проведення цих експериментів, лунки титраційних мікропланшетів сенсибілізували 50 мкл/лунку розчину 1 мкг/мл мишачого антилюдського легкого ланцюга типу каппа у РВ5 та інкубували при температурі 4"С впродовж ночі. Після блокування 595 розчином курячої сироватки, на планшет наносили супернатант кожного експериментального моноклонального антитіла і очищений контрольний ізотип. Планшети інкубували при температурі навколишнього середовища впродовж 1- 2 год. Після цього до лунок вносили різні людські Ідс-специфічні, кон'юговані з пероксидазою з хрону козячі антилюдські поліклональні антисироватки, планшети проявляли і аналізували, як описувалось вище.
Моноклональні антитіла, очищені із супернатантів гібридом, які продемонстрували значний рівень зв'язування з МОРЕ (за результатами ЕГІЗА) додатково перевіряли на біологічну активність за допомогою різноманітних біоаналізів, як описано нижче.
Приклад З
Добір та клонування анти-МаЕ антитіл із сильною МОЕ-нейтралізуючою активністю
Ефективність антитіл, які початково були ідентифіковані у Прикладі 2, як інгібітори активності МО (тобто
МОаЕ-"нейтралізація"), оцінювали шляхом визначення здатності кожного модифікованого пептиду блокувати викликану МО індукцію експресії ванілоїдного рецептора-1 (МА1).
Культури нейронів гангліїв заднього корінця головного мозку
Ганглії заднього корінця (ОВС) головного мозку відрізали один за одним за асептичних умов від усіх спінальних сегментів 19-добових зародків пацюків (Е19), хірургічним шляхом видалених із маток термінально анестезованих на певному періоді вагітності пацюків лінії Зргадне-ОСам/єу (фірма Спапез Вімег, УМітіпдіоп, штат Массачусетс). ОВО збирали до середовища 1-15 (фірма СірсовВІ., Сгапа Івіапа, штат Нью-Йорк), що мало температуру танення льоду і містило 595 інактивованої теплом конячої сироватки (фірма СсСірсовА, з видаленням будь-якої зайвої сполучної тканини і кровоносних судин. ОСНО двічі промивали фізіологічним розчином, забуференим фосфатом Дульбекко (ОРВО) без Са?» і Мде: (рН 7,4) (фірма СсСірсовв). Після цього з ра, за допомогою папаїнової дисоціаційної системи (фірма Уоппіпдіоп Віоспетіса! Согр., Егеепоїд, штат
Нью-Джерсі), одержували суспензію поодиноких клітин. Стисло, ОНа інкубували у гідролітичному розчині, що містив 20 Од/мл папаїну у збалансованому сольовому розчині Ерла (ЕВ55) при температурі 37"С впродовж 50 хв. Клітини відділяли шляхом продавлювання через відполіровані оплавленням пастерівські піпетки у дисоціативному середовищі, що містило МЕМ (мінімальне підтримувальне середовище)/Нате 12 (неоднорідне штучне живильне середовище Е12) (11), 1 мг/мл овомукоїдного інгібітора, 1 мг/мл овальбуміну та 0,00595 дезоксирибонуклеази І (ДНКаза).
Відділені клітини осаджували при 200 худ впродовж 5 хв і ресуспендували у ЕВ55, що містив 1 мг/мл овомукоїдного інгібітора, 1 мг/мл овальбуміну та 0,00595 ДНКази. Суспензію клітин центрифугували у градієнтному розчині, що містив 10 мг/мл овомукоїдного інгібітора, 10 мг/мл овальбуміну при 200 хд впродовж б хв для видалення дебрісу, після чого фільтрували через 88-мкм нейлонову сітку (фірма Різпег Зсіепійіс,
Рійбригой, штат Пенсільванія) для видалення будь-яких скупчень. Кількість клітин визначали за допомогою гемоцитометра, і клітини висівали (10х103 клітин/лунку) на 96-лункові планшети, сенсибілізовані поліорнітином (100 мкг/мл) (фірма бідта, 51. Гоціз, штат Міссурі) та мишачим ламініном (1 мкг/мл) (фірма Сірсовв) у повному живильному середовищі. Повне живильне середовище містило мінімальне підтримувальне середовище (МЕМ) і Нат' Е12 (11), пеніцилін (100 Од/мл), стрептоміцин (100 мкг/мл) і 1095 активованої теплом конячої сироватки (фірма СібсовнІ). Культури витримували при температурі 37"С, 595 СО» і 10095 вологості. Для контролювання росту ненейронних клітин, до складу живильного середовища включали 5- флуоро-2'-дезоксиуридин (75 мкМ) і уридин (180 мкМ).
Обробка МОБ і анти-МОаЕ
Через 2 год після висівання клітини обробляли рекомбінантним людським В-МОЕ (фірма Атдеп) або рекомбінантним пацючим ВД-МОЕ (фірма НО БЗузієтв, Міппеароїї5, штат Міннесота) з концентрацією 10 нг/мл (0,38 нМ). До кожного культурального планшета додавали позитивні контролі, що містили серійно розведене анти-МОЕ антитіло (фірма НУО БЗузієтв). Експериментальні антитіла додавали у десяти розведеннях із застосуванням 3,16-кратних серійних розведень. Усі проби перед доданням до культур розбавляли у повному живильному середовищі. Перед визначенням експресії МАТ, планшети інкубували впродовж 40 год.
Визначення експресії УА1 у нейронах ОН
Культури фіксували 4956 розчином параформальдегіду у збалансованому сольовому розчині Хенкса впродовж 15 хв, блокували за допомогою Зирегріоск (фірма Рієгсе, Носкога, штат Іллінойс) і підвищували коефіцієнт проникності за допомогою 0,2595 розчину Мопідеї Р-40 (фірма бідта) у фізіологічному розчині, забуференому трис-НСІ (фірма бідта) (ТВ5) впродовж 1 год при кімнатній температурі. Культури один раз промивали ТВ5, що містив 0,195 Твін-20 (фірма бідта) і інкубували з кролячим анти-УВІ да впродовж 1,5 год при кімнатній температурі з подальшим інкубуванням з Еи-міченим антикролячим "другим" антитілом (фірма
Маїїас Су, Титки, Фінляндія) впродовж 1 год при кімнатній температурі. Після інкубування з кожним антитілом, культури промивали ТВ5 (3х5 хв із повільним струшуванням). До культур додавали підсилювальний розчин (150 мкл/лунку, фірма Умайас Оу). Після цього за допомогою флуориметра з часовим розділенням (фірма
МУайас Оу) вимірювали інтенсивність флуоресценції. Експресію МА! у зразках, які були оброблені модифікованими пептидами, визначали шляхом порівняння зі стандартною кривою титрування МОБ від 0-1000 нг/мл. Відсоток (порівняно з максимальним можливим пригніченням) пригнічувального ефекту МОБ на експресію УНІ у нейронах ОВО визначали шляхом порівняння з контролями, які обробці МО не піддавались.
Результати наведені у Таблицях 2 і 5.
Клітинні лінії були позначені Мо 110-129. Антитіла клітинних ліній Мо 119, Ме 124 і Мо 125 демонстрували надзвичайно сильну МаЕ-нейтралізуючу активність (Фіг. 1). Клітинна лінія Ме 124 являла собою батьківську клітинну лінію, на яку також посилаються, як на лінію 404. Клітинні лінії Ме 119 ії Мо 125 були субклонами батьківської лінії 404. З вихідного флакона, що містив гібрид ому Мо 124 (404), виростили додатковий зразок, який помітили Ме 167 (404).
Антитіла, продуковані гібридомою Мо 167 (404), піддавали такому самому аналізу нейтралізації МОЄ на основі нейронів ЮНО, що і попередні зразки. Антитіло Мо 167 (404) демонструвало сильну анти-МОЕ активність з ІСзо на рівні 0,50 нМ (Фіг. 2), що відповідало активності зразків Мо 119, Ме 124 і Ме 125. Рівні активності 4 зразків наведені у Таблиці 2.
Таблиця 2
Анти-пМаБ активність у клітинах ОН із застосуванням 0,38 нМ пМОаЕ
Секвенування М-кінця і мас-спектрометрія
Зразки очищених анти-МОЕ гібридомних антитіл були підготовлені для секвенування білків та рідинно- хроматографічного і мас-спектрометричного (1С/М5) аналізів. Антитіла очищали з кондиціонованих середовищ шляхом концентрування згаданих середовищ за допомогою препаративної центрифуги Атісоп сепіпіргер-30 доти, доки їх об'єм не ставав меншим за 15 мл. Порцію смоли гРгоА (фірма РНагтасіа) промивали (4х) РВ5; після останнього промивання одержали 5095 суспензію у РВ5. До зразка антитіл додавали відповідну кількість смоли гРГОА (приблизно 5 мкг антитіла/мкл смоли, однак застосовувати слід не менше за 50 мкл смоли) та інкубували впродовж ночі при температурі 4"С. Суміш смоли з антитілами центрифугували, і збирали незв'язану фракцію. Після додання 0,5 мл РВ5 і перенесення до 0,45 мкл центрифугальної пробірки Зріп-Х (фірма Собіа)), зразок центрифугували при 10000 об/хв впродовж 3 хв.
Після цього смолу промивали щонайменше тричі 0,5 мл РВ5, після чого до 1,5х об'єму смоли додавали 0,1 М гліцину (рН 2,7) та інкубували впродовж 10 хв при кімнатній температурі з подальшим додатковим центрифугуванням впродовж З хв при 10000 об/хв і збиранням супернатанту. Цю стадію елюювання повторювали ще двічі, після чого об'єднаний супернатант нейтралізували 1/25-ою об'єму 1,0 М розчину трис- буфера (рн 9,2).
Після завершувальної стадії фільтрування через нову пробірку Оріп-х (0,2 мкм), антитіла піддавали кількісному визначенню за допомогою стандартного аналізу Бредфорда із застосуванням людського Ідсї як стандарту або, за альтернативним варіантом, шляхом визначення оптичної густини при 280 нм для зразків більшого об'єму. Гель також піддавали аналізу із застосуванням 2 мкг кожного зразка разом із 2 мкг людського
Ідс21, К (фірма бідта). Для мас-спектрометрії чотири мікрограми зразків деглікозилували, відновлювали і завантажували до хроматографічної колонки (НР 1090), зв'язаної у реальному масштабі часу з мас- спектрометром Ріпіпдап СО). Легкий ланцюг відділяли від важкого ланцюга шляхом високоефективного рідинного хроматографування з оберненою фазою. Легкі ланцюги і важкі ланцюги також збирали для секвенування М-кінцевих білків.
Обидві М-кінцеві послідовності легкого ланцюга і важкого ланцюга проби анти-МОЕ антитіла Ме 167 (404) відповідали обом М-кінцевим послідовностям проби анти-МОЕ антитіла Мо 119 (404). На додаток до цього, визначена маса антитіл вказувала на те, що антитіла, виділені з гібридом Мо 167 і Мо 119, були однаковими.
Визначена маса (23096) розгорнутого легкого ланцюга анти-МОЕ антитіла Мо 167 відповідала визначеній масі (23096) легкого ланцюга анти-МОЕ антитіла Мо 119.
Клонування важкого і легкого ланцюгів анти-МОЕ антитіла
Гібридому, що експресує найсильніше М(аБ-зв'язувальне моноклональне антитіло, 404.07, використовували як джерело для виділення тотальної РНК за допомогою реактиву ТВІ2о0!? (фірма Іпийгодеп).
КДНК першої нитки синтезували за допомогою довільного праймеру з адаптером подовжувального сегменту (5-а050б боб АТА пос СТО САМ МММ ММТ-3) (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 33); препаративний аналіз 5 ВАСЕ (швидка ампліфікація кінців КДНК) здійснили за допомогою набору СепеНасег"М (фірма Іпмйгодеп) за інструкціями виробника. Прямим праймером, застосованим для одержання кКДНК, що кодує повний легкий ланцюг, був праймер, що входив до складу набору СепеВасег "М, у той час як зворотним праймером був 5'- соо! ато Або СТО ОАА СТО дОес-3 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 34). Прямим праймером, застосованим для одержання кКДНК, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга, був праймер, що входив до складу набору
СепеНасег "м, у той час як зворотним праймером був 5-ТЕША й(ОА СОС ТаА ССА САС Са-3' (ПОСЛІДОВНІСТЬ
Ме 35). Продукти аналізу ВАСЕ клонували у рСВ4-ТоРО (фірма Іпмігодеп) із визначенням послідовностей.
Для конструювання праймерів для РОСА (полімеразна ланцюгова реакція) ампліфікації повномірних ланцюгів антитіла застосовували консенсусні послідовності.
Для одержання кДНК, що кодує легкий ланцюг типу каппа анти-МОЕ антитіла 404.07, 5 РОСА праймер кодував амінокінець сигнальної послідовності, сайт рестрикції Хваї і оптимізовану послідовність Козака (5'-
САС САС АС СТІ СТА САС САС САТ п0пА САТ пла пат абб баб тСА ас ссСт апа -3";
ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 36). 3'-праймер кодував карбоксильний кінець, стоп-кодон, а також сайт рестрикції зЗаї! (5'- сСтТТ ТО САС ТСА АСА СТО ТС ССТ ТТ БАА ОСТ 0-37 ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 37). Фрагмент, одержаний за допомогою РСВ, очищали, розщеплювали за допомогою Хрваї і ЗаїІ, після чого виділяли на лунках із гелем і літували до експресійного вектора розКаг20 ссавців (дивись публікацію міжнародної заявки УУО 90/14363, яку включено до цього опису шляхом посилання з будь-якою метою. розМКаг2го одержали шляхом заміни нуклеотиду 2563 у розка19 (гуанозин на аденозин) сайт-спрямованим мутагенезом).
Для одержання кКДНК, що кодує важкий ланцюг анти-МОЕ антитіла 404.07, 5 РОСА праймер кодував амінокінець сигнальної послідовності, сайт рестрикції Храї і оптимізовану послідовність Козака (5-САС САС
Ада СТТ СТА САС САС САТ СА СТ пса Ст ато ста ат тт СсСт тат Т-3; ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 38). 3'-праймер кодував карбоксильний кінець, стоп-кодон, а також сайт рестрикції Заї! (5-ЯСА тат СОаА СТО АТТ
ТАС ССО САС АСА СОС АСА 0-37 ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 39). Одержаний продукт очищали, розщеплювали за допомогою Храї і ЗаїІ, виділяли на лунках із гелем і літували до вектора розКаг0.
Обчислена маса (23099) (яку визначили шляхом трансляції нуклеотидної послідовності на прогнозовані амінокислоти і підсумовуванням молекулярних мас амінокислот) послідовності ДНК легкого ланцюга клону анти-МОЕ антитіла 404 відповідала масі, визначеній мас-спектрометричним шляхом. Визначена маса (49479) розгорнутого важкого ланцюга анти-МОЕ антитіла Ме 167 відповідала визначеній масі (49484) важкого ланцюга анти-МОЕ антитіла Мо 119 і також відповідала теоретичній масі (49484) послідовності ДНК важкого ланцюга клону анти-МОЕ антитіла 404 (Таблиця 3) у межах відхилення вимірювального приладу.
Дані секвенування білків М-кінця і І! С/М5 підтвердили, що гібридома Ме 119 експресувала таке саме антитіло, що і гібридома Мо 167. На додаток до цього, маса антитіл, обчислена на основі послідовності, додатково підтвердила наведене спостереження.
Таблиця З
Підсумок мас-спектрометричних даних антитіла Мо 167 антитіла Мо 119 послідовністю ДНК антитіла 404
Приклад 4
Експресія анти-МОЕ антитіл у клітинах яєчника китайського хом'ячка (СНО)
Стабільну експресію моноклонального анти-МОЕ антитіла 404 забезпечували шляхом котрансфекції важким ланцюгом 404/рО5Ка1т19 Ідбе або важким ланцюгом 404/рОзКа19 ІдСі та Маг-каппа/ро5Ка19 плазмідами дегідрофолатредуктаза-дефіцитних ((ОНЕА) безсироваткових адаптованих клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО) за допомогою кальційфосфатного методу. Трансфіковані клітини відбирали у середовищі, що містило діалізовану сироватку, але не містило гіпоксантину-тимідину, для забезпечення росту клітин, що експресують фермент ОНЕРВ. Трансфіковані клони піддавали перевірці за допомогою таких аналізів, як ЕГПІЗА, для виявлення експресії моноклонального анти-МОЕ антитіла 404 у кондиціонованому середовищі.
Клони з найвищим рівнем експресії піддавали впливу підвищених концентрацій метотрексату (МТХ) для ампліфікації ОНЕВ. Клони, ампліфіковані за допомогою МТУ, піддавали перевірці за допомогою таких аналізів, як ЕЇПІБА, для виявлення підвищеного рівня експресії моноклонального анти-МОР антитіла 404 у кондиціонованому середовищі. Клони з найвищими рівнями експресії піддавали субклонуванню для одержання гомогенної популяції та створення банків клітин.
Рекомбінантні анти-МОСЕ антитіла за цим винаходом можуть бути одержані у ОНЕВ-дефіцитних клітинах яєчника китайського хом'ячка за тією самою методикою, що наведена вище для моноклонального анти-Ма антитіла. Послідовності ДНК, які кодують повний важкий ланцюг або легкий ланцюг кожного анти-МОЕ антитіла за цим винаходом, клонують у експресійних векторах. ОНЕВ-дефіцитні клітини яєчника китайського хом'ячка котрансфікують експресійним вектором, здатним експресувати повний важкий ланцюг та експресійним вектором, що експресує повний легкий ланцюг відповідного анти-Має антитіла. Наприклад, для одержання анти-МОЕ антитіла, клітини котрансфікують вектором, здатним експресувати повний важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Ме 40 і вектором, здатним експресувати повний легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ Мо 44.
Таблиця 4 підсумовує повні важкі і повні легкі ланцюги для 404 антитіл, що мають різні константні ділянки важкого ланцюга да.
Таблиця 4 ділянка важкого ланцюга
Приклад 5 Визначення активності анти-МОЕ антитіла 404
Тимчасово експресовані анти-МОЕ антитіла 404, продуковані клітинами, що вирощуються за умов спін- культури (5) або ролерної культури (В), перевірялись для підтвердження їх здатності нейтралізувати МОЕ у реакції нейтралізації МО на основі нейронів ОВС, яку ставили, як описувалось вище (Приклад 3).
Анти-МОЕ антитіла тимчасово експресувались у адаптованих до безсироваткової суспензії клітинах 293Т.
Трансфекцію здійснювали на 500 мл або 1 л культурах. Стисло, клітинний інокулят (5,0х105 клітин/млхоб'єм культури) центрифугували при 2500 об/хв впродовж 10 хв при температурі 4" С для видалення кондиціонованого середовища. Клітини ресуспендували у безсироватковому ОМЕМ і знову центрифугували при 2500 об/хв впродовж 10 хв при температурі 4"С. Після відсмоктування промивного розчину, клітини ресуспендували у середовищі для вирощування |(ОМЕМ/Е12 (3:1)-41х додаток інсулін-трансферин-селенян1їх
Реп 5ігер Сіш2 мМ розчин І-глутаміную20 мМ розчин ГЕПЕС-буферажн0Оо,0195 розчин плуроник Еб8)| у 1 л або
З л ролерній колбі. Культуру у ролерній колбі встановлювали на стіл магнітної мішалки (125 об/хв), яку вносили до вологої камери (37"С, 595 СО2). Плазмідну ДНК об'єднували з трансфекційним реактивом у 50 мл конічній колбі. Комплекс ДНК-трансфекційний реактив одержували у 5905 кінцевого об'єму культури у безсироватковому ОМЕМ. До безсироваткового ОМЕМ спочатку додавали 1 мкг плазмідної ДНК/мл культури, потім 1 мкл Х-Тгетесбепе НО-1539/мл культури. Згадані комплекси інкубували при кімнатній температурі впродовж приблизно 30 хв, після чого додавали до клітин у ролерній колбі. Трансфекцію/експресію здійснювали впродовж 7 днів, після чого кондиціоноване середовище збирали шляхом центрифугування при 4000 об/хв впродовж 60 хв при температурі 47с.
Для тимчасової трансфекції ролерних колб ми застосовували адгезивні клітини 293Т, які виросли і підтримувались у ОМЕМ, доповненому 595 ЕВ5-1Х замінних амінокислот-їх Реп Бігер СіІші-1х пірувату натрію. Приблизно 4-5х107 клітин 2937 висівали у ролерних колбах (850 см?) впродовж ночі. Наступного дня попередньо висіяні клітини трансфікували за допомогою трансфекційного реактиву Гибепеб. Суміш ДНК- трансфекційний реактив одержували у приблизно 6,75 мл безсироваткового ОМЕМ. Спочатку додавали 675 мкл трансфекційного реактиву ГиСієпеб, потім 112,5 мкг плазмідної ДНК. Одержаний комплекс інкубували при кімнатній температурі впродовж 30 хв. Після цього суміш у цілому вносили до ролер-флакона. Ролер-флакон заповнювали газовою сумішшю (595 СО»2), герметично закривали і вміщували до термостата (37"С) на ролерний штатив, що обертався зі швидкістю 0,35 об/хв. Трансфекцію здійснювали впродовж 24 год, після чого згадане середовище замінювали 100 мл ОМЕМч1х додаток інсулін-трансферин-селенніх Реп 5ігер (піших замінних амінокислот--1х пірувату натрію. За типовим варіантом, з кожного ролер-флакона одержали два 100 мл 48 год врожаю. Зібрані безсироваткові кондиціоновані середовища об'єднували, і центрифугували при 4000 об/хв впродовж 30 хв при температурі 4"С.
Як 404.Іда1, так і 404.Іда2 продемонстрували високу активність проти людського МОБ зі значеннями ІСво від приблизно 0,14 нМ до приблизно 0,2 нМ (Фіг. 2). Результати аналізу активності підсумовані у Таблиці 5.
Згадані антитіла продемонстрували низьку активність проти пацючого МОР (фіг. 3). Одержані результати нагадують активність антитіл, що перевірялись безпосредньо з гибридом, як описувалось вище.
Таблиця 5 пМОгБжлюдський МОБ, (М(аБ-пацючий МО,
А:ролерна культура, 5-спін-культура
Приклад 6
Продукування анти-МОЕ антитіла
Анти-МОЕ антитіло продукують шляхом експресії у клональній лінії клітин СНО. Для кожного виробничого циклу клітини з одного флакона розморожують у безсироваткових культуральних середовищах. Клітини спочатку вирощують у Т-колбі, потім у ролерних колбах, потім у реакторах із нержавіючої сталі у зростаючих об'ємах до 2000 л біореактора. Продукування здійснюють у 2000 л біореакторі за методом підживлювання культури одного виробничого циклу, за яким концентровані поживні інгредієнти середовища додають для підтримання росту клітин та життєздатності культур. Виробничий цикл триває впродовж приблизно двох тижнів. Впродовж цього періоду часу анти-МОЕ антитіло конститутивно продукується клітинами і секретується до культурального середовища.
У виробничому реакторі підтримують визначений рН, температуру і рівень розчиненого кисню: рн регулюють шляхом додання газоподібного діоксиду вуглецю та карбонату натрію; рівень розчиненого кисню регулюють шляхом продування повітря, газоподібного азоту та кисню.
На кінець виробничого циклу клітинну масу вносять до тарілчастого сепаратора, і культуральний супернатант відділяють від клітин. Одержаний концентрат додатково просвітлюють спочатку за допомогою глибинного фільтра, потім за допомогою 0,2 мкм фільтра. Просвітлене кондиціоноване середовище після цього концентрують шляхом ультрафільтрації з тангенціальним потоком. Кондиціоноване середовище піддають 15-30-кратній концентрації. Після цього одержане концентроване кондиціоноване середовище піддають очищенню або заморожують для пізнішого очищення.
Приклад 7
Перехресна реактивність з іншими нейротрофінами
Антитіла 404 перевіряли на перехресну реактивність проти людського МТЗ або людського ВОМЕ (фактор росту нервової тканини мозкового походження) різними біотестами, у тому числі аналізом виживаності нейронів ОВС для людського МТЗ і аналізом поглинання БА (допамін) культивованими нейронами БА для людського ВОМЕ.
Обробка культур ОВС МТЗ, анти-МТЗ і анти-МаЕ антитілами
Через 2 год після висівання клітини ОВС; (опис методики виділення наведено вище у Прикладі 3) обробляли рекомбінантним пМТ-3 (100 нг/мл, 3,8 НМ). Серійно розведене анти-пМТЗ3 антитіло (фірма НУВ) застосовували як позитивний контроль. Невідомі антитіла (проби анти-МОЕ антитіл) додавали у 10 концентраціях із застосуванням 3,16-кратних серійних розведень. Усі проби перед доданням до культур розбавляли у повному живильному середовищі.
Визначення експресії МАР2 у нейронах ОВО
Культури фіксували 4956 розчином параформальдегіду у збалансованому сольовому розчині Хенкса впродовж 15 хв, блокували за допомогою Зирептбіоск (фірма Рієгсє) впродовж 1 год і підвищували коефіцієнт проникності за допомогою 0,2595 розчину Мопідеї Р-40 (фірма бідта) у фізіологічному розчині, забуференому трис-НСІ (фірма бідта) (ТВ5) впродовж 1 год при кімнатній температурі (ВТ). Культури один раз промивали
ТВ5, що містив 0,195 Твін-20 (фірма бідта) і інкубували з мишачим анти-МАР2 ІдсСх (фірма Спетісоп,
Тетесша, штат Каліфорнія) впродовж 1,5 год при кімнатній температурі з подальшим інкубуванням з Еи- міченим антимишачим "другим" антитілом (фірма УлаМас Оу, Тигїки, Фінляндія) впродовж 1 год при кімнатній температурі. Після інкубування з кожним антитілом, культури промивали ТВ5 (3х5 хв з обережним струшуванням). До культур додавали підсилювальний розчин (150 мкл/лунку, фірма УлаїІас Оу). Після цього за допомогою флуориметра з часовим розділенням (фірма Уаїїіас Оу) вимірювали інтенсивність флуоресценції.
Культура клітин середнього мозку зародка
Застосовували 19-добові зародки (Е19) пацюків лінії ЗХргадие-ОСамеу (фірма Часкзоп І арз). Вентральну тканину середнього мозку, збагачену допамінергічними нейронами, видаляли і переносили до холодного фізіологічного розчину, забуференого фосфатом Дульбекко (ОРВ5) без Са і Мао" (рН 7,4) (фірма аірсо). За допомогою папаїнової дисоціаційної системи (фірма Ууоппіпдіоп Віоспетіса! Согр., Егеепоїй, штат Нью-
Джерсі) з фрагментів тканини одержали суспензію окремих клітин. Стисло, фрагменти тканин інкубували у гідролітичному розчині, що містив 20 Од/мл папаїну у збалансованому сольовому розчині Ерла (ЕВ55) при температурі 37"С впродовж 50 хв. Клітини відділяли шляхом продавлювання через відполіровані оплавленням пастерівські піпетки у дисоціативному середовищі, що містило МЕМ (мінімальне підтримувальне середовище)/Нате Е12 (неоднорідне штучне живильне середовище Е12) (1:11), 1 мг/мл овомукоїдного інгібітора, 1 мг/мл овальбуміну та 0,00595 дезоксирибонуклеази І (ДНКаза). Відділені клітини осаджували при 200 худ впродовж 5 хв і ресуспендували у ЕВ55, що містив 1 мг/мл овомукоїдного інгібітора, 1 мг/мл овальбуміну та 0,00595 ДНКази. Суспензію клітин центрифугували у градієнтному розчині, що містив 10 мг/мл овомукоїдного інгібітора, 10 мг/мл овальбуміну при 200 худ впродовж 6 хв для видалення дебрісу, після чого фільтрували через 25 мкг нейлонову сітку Міїтех (фірма Теїко, Іпс.) для видалення скупчень. Відділені клітини висівали (100000/см2) на планшети для культури тканин. Згадані планшети попередньо сенсибілізували поліорнітином (100 мкг/мл) (фірма бЗідта) та мишачим ламініном (1 мкг/мл) (фірма Сібсо ВВА), як описувалось раніше (Луїс Дж.К. (Гоців 9.0.) та інші, У. РНаптасої. Ехр. Тпег. 1992; 262:1274-1283). Культуральне середовище містило мінімальне підтримувальне середовище (МЕМ) і Наптв Е12 (1:1), 1295 конячу сироватку (фірма Сірсо), трансферин (100 мкг/мл) та інсулін (2,5 мкг/мл) (фірма бідта). Культури витримували при температурі 37"С, 595 СОз» і 10095 вологості впродовж 6 днів.
Обробка культур клітин середнього мозку ОВМЕ, анти-ВОМЕ або анти-МОаЕ
Через 2 год після висівання до клітин додавали спочатку ВОМЕ (10 нг/мл), потім серійні концентрації проб анти-МОЕ антитіл. Анти-ВОМЕ антитіло (фірма Атдеп) застосовували як позитивний контроль.
Поглинання СА нейронами середнього мозку
Аналіз поглинання допаміну здійснювали, як описували раніше (Фрідман Л. (Епедтап 1.), Мітіліно К. (Муйіпеои С.), Меийигозсіепсе ІГецегз 1987: 79:65-72). На 6 день культури один раз промивали попередньо підігрітим фосфатним буфером Кребса-Рінгера (рН 7,4), що містив 5,6 мМ розчин глюкози, 1,3 мМ розчин
ЕОТА (етилендіамінтетраоцтова кислота) та 0,5 мМ розчин паргіліну (інгібітор моноаміноксидази). Культури інкубували у буфері для поглинання, що містив 50 нМ розчин І(ЗНІСА (МЕМ), впродовж 60 хв при температурі 37"Сб. Поглинання припиняли шляхом видалення буфера для поглинання і культури тричі промивали фосфатним буфером Кребса-Рінгера. Клітини піддавали лізису для виділення (НІОА шляхом безпосереднього додання до культур рідкої сцинтиляційної суміші Оріїсрназе 5ирегтіх (фірма УмаїІас).
Радіоактивність клітинних лізатів визначали за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника Місгтореїсга- різ (фірма УмаїІас, Іпс.). Поглинання БА низького рівня спорідненості визначали шляхом додання 0,5 мМ розчину ВА12909, специфічного інгібітора сайтів поглинання СА високого рівня спорідненості (Хіккіла Р.Е. (Неїккпа А.Е.), Мазіно Л. (Малгіпо І.), Еигореап уЧошигпа! ої Рпаптасоіоду 1984: 103:241-8), до буфера для поглинання з подальшим відніманням від загальної кількості поглинання з одержанням значення поглинання
ОА з високим рівнем спорідненості.
Таблиця 6
Приклад 8
Ідентифікація антигенної детермінанти для анти-МОЕ антитіл
Картування антигенної детермінанти обмеженим протеолізом
П'ять мікрограмів (мкг) МО інкубували з 404 (11 мкг) впродовж 30 хв при температурі 4"С у 0,1 М розчині трис-буфера (рН 7,5). Після цього одержаний комплекс розщеплювали протеазою (субтилізин) (1 мкг) при температурі 37"С впродовж 1 год і 2 год. Пептидні карти (одержані шляхом високоефективного рідинного хроматографування (НРІ С)) взаємно порівнювали для виявлення пептидів, які були захищені антитілами 404.
Обмежений протеоліз МОЕ показав, що початково з МОР виділились декілька головних пептидів. Особливий інтерес становить одержання пептидів 518.3, 518.5 та 534.4 і їх захист від протеолізу антитілом. Інші піки не були чітко сформованими або захищеними. У Таблиці 7 наведені захищені пептиди двох експериментів (розщеплення впродовж 1 год і 2 год).
Таблиця 7 впродовж 1 год | впродовж 2 год 816 ГОАА(96-983,...ЮЙЮЮЮ7Її17171717171717171717171717171110|Сжінець/// 17777777 11111157
ЕРЕТК (53-57) (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 45)
НУУМ5У)" (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 47
Мо 48)
Відсоток захисту обчислювали за висотою пептидного піка. 518.5 містив два пептиди, але лише один пептид (555НРІЕНА; ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 46) був захищений антитілом 404, оскільки пік іншого пептиду (НМУ/М5ОУ; ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 47), за результатами визначення оптичної густини при 280 нм, при доданні антитіл 404 залишився незмінним. Пептид 518.3 являв собою С-кінцеву частину 534.4; обидва пептиди походили з однієї ділянки петлі. М-кінцеві ділянки та центральні ділянки петлі також були можливими антигенними детермінантами.
Відділення розщеплених пептидів за допомогою мікроцентрифуги
Матеріал, розщеплений субтилізином (по З мкг кожного), інкубували з активними антитілами 404 та з неактивним моноклональним антитілом (Ме 162) впродовж 30 хв при температурі 4"С у 0,1 М розчині трис- буфера (рн 7,5). Зв'язані/незв'язані пептиди відділяли на мікроцентрифузі Місгосоп 10 (фірма МіпПіроге Согр.,
Ведіога, штат Массачусетс), і обидві фракції (зв'язану і незв'язану) піддавали аналізу засобами НРІ С для виявлення пептидів, зв'язаних з антитілами. Виявили два вичерпані піки, ідентифіковані шляхом порівняння засобами НРІ С незв'язаних фракцій після обробки антитілами 404 і Мо 162 та відділення за допомогою
Місгосоп, які вказували на пептиди, зв'язані з антитілами. З антитілом 404 були зв'язані наведені нижче пептиди: 51(4.4) --5АКАМНАВ (113-119) (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 49), С-кінцевий; і 52(28.3) ---ЕМММІ. (35-39) (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 50), ділянка петлі.
Пробу МОРЕ за альтернативним варіантом розщеплювали за допомогою Іуз-С (К) впродовж 24 год.
Залишки цистеїну відновлювали і піддавали карбоксиметилуванню без денатурації. Одержану пробу інкубували з моноклональними антитілами 404 і АМОа162 з подальшим відділенням на Місгосоп 100. Зв'язані і незв'язані фракції аналізували засобами НРІ С з оберненою фазою. Лише два пептиди були ідентифіковані як
К-пептиди, що зв'язують антитіло, як показано нижче. Обчислені маси пептидів, визначені аналізом послідовностей і мас-спектрометрією згаданих пептидів, співпадали. Згадані пептиди, як показано нижче, були картовані на М-кінцевій та С-кінцевій ділянці.
К1(37.6) --5555НРІЕННСЕРЗМСОБУБМММ,ИОК (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 51)
Обчислена маса-2821; фактична маса-2828,2; М-кінцевий.
Кг2(39.5) --КЮМААМУ/ВАЕІВІО ТАСУСМІ ЗАК (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 52)
Обчислена маса-2452; фактична маса-2459,5; С-кінцевий.
Попередні експерименти з картування антигенних детермінант показали, що щонайменше три ділянки були можливими антигенними детермінантами для антитіл 404, у тому числі М-кінець (1-9), внутрішня (46-57) та С-кінцева (96-98) ділянки. На додаток до цього, розщеплення АврМм показало, що фрагмент пептиду, який містив. -55НРІЕНАСЕЕ5МО-- (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 53), був захищеним антитілом 404, у той час як розщеплення трипсином показало, що фрагмент пептиду, який містив --55НРІЕНВ-- (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 54), не був захищеним антитілом 404. Таким чином, на М-кінці, послідовність СЕЕБМС (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 55) є найважливішою для зв'язування антитіл 404.
З метою точнішого встановлення антигенної детермінанти для анти-МОЕ антитіла 404.Ідс1, за стандартними методами, виходячи з повної послідовності людського зрілого МОРЕ (ПМС), синтезували у загальній кількості 23 пептиди (Таблиця 8). Згадані пептиди мали у довжину 15 амінокислот, із взаємоперекриттям 10 амінокислот, і цистеїновий кінцевий сегмент на С-кінці для кон'югації з матрицею. Для проведення експерименту з картування застосовували людське анти-пМОЕ антитіло 404.ІдДС21, описане вище.
Таблиця 8 33582-27-05 |М/МООКТТАТОКОКЕС(21-35).../.:/4ЧМЙ 17777776 33582-27-411 З ОМЕРЕТКАВОРМРУЮС(51-665)Ї/:/ | 77777766 33582-27-143 | РМРУО5ЗОАНСІЮ5КНО(6в1-75)....-: К) | ..ЮЮмуТро 68 47 33582-27-144 | ЗСАВОІЮ5КНУУМ5УС(66-80)...ЙЮюЮюЮЦЇ|777717171717171711в
Фрагменти людського МОРЕ пептиду розбавляли у РВ5 з 595 розчином ОМ5О (диметилсульфоксид), 1 мМ розчином ЕЮОТА (етилендіамінтетраоцтова кислота)» (рн 6,23). Кінцева концентрація пептиду була нормалізована до молярної концентрації, що відповідала 55 мкМ (приблизно 100 мкг/мл). Пептиди інкубували у 96-лункових титраційних мікропланшетах Неасії-Віпа, активізованих малеїмідом (фірма Ріегсе, номер за каталогом 15150) (100 мкг/лунку) при кімнатній температурі впродовж 2 год, потім при температурі 4"С впродовж ночі з перемішуванням. Людський МОРЕ (100 мкг/мл) застосовували як позитивний контроль.
Планшети промивали промивним буфером (КРІ) і блокували 0,295 знежиреним сухим молоком (у буфері РВ5-
ЕОТА, рН 6,23) впродовж 2 год при кімнатній температурі з подальшим додатковим блокування 595 В5А впродовж 1 год. Після цього планшети інкубували з людським анти-МаЕ антитілом у різних концентраціях (0 мкг/мл, З мкг/мл, 10 мкг/мл, 30 мкг/мл), потім із козячим анти-пЕс антитілом, кон'юЮгованим із НАР (пероксидазою з хрону) (КРІ) впродовж 2 год. Сигнал проявляли за допомогою субстрату ТМВ і зчитували при 450 нм після додання розчину для припинення реакції (КРІ).
З-посеред 23 людських МОЄ пептидів, спостерігали щонайменше 4 головні пікию, що вказували на зв'язування 404. Ці опіки відповідали таким пептидам: пептид Ме 1 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 56),
З5ЗНРІЕННОЕРЕ5МС (1-15); пептид Ме 10 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 65), МОМЕКОМУЕРЕТКАНО (46-60); пептиди Мо 16-17 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 71-ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 72), М'М5УАТТТНТЕМКАЇ ---(76-95); і пептиди Ме 18-21 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 73-ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 76), ТТТНТ---І 5АКС (100-115).
Чотири піки зв'язування 404 були картовані на М-кінці, С-кінці, внутрішніх ділянках, а також на петлях 12 і 14 МОР, як описано у Вісман (М/іезтапп) та інших (1999, Майте 401:184-8). Ці результати узагальнені у
Таблиці 9.
Таблиця 9
Антигенні Внутрішня Внутрішня детермінанти М-кінець І?2 утр І4 утр С-кінець
МСЕ ділянка ділянка
Пептид Ме | Пептид Мо 1 Пептид Ме 10 |Пептид Мо 16 |Пептид Ме17 /|Пептид Мо 19 |Пептиди Мо (ПОСЛІДОВ- |(ПОСЛІДОВ- |(ПОСЛІДОВ- |(ПОСЛІДОВ- |(ПОСЛІДОВ- |20-21
НІСТЬ Мо 56), | НІСТЬ Ме 65), | НІСТЬ Мо 71), | НІСТЬ Мо 72), | НІСТЬ Мо 74), | (ПОСЛІДОВ-
ЗБЗНРІ---, 1-. | МОМЕКО---, М МеМА---, 76- | ГТМОСКО---, МмМорак---, 91- | НІСТЬ Ме 75- 46-60 90 81-95 105 ПОСЛІДОВ-
НІСТЬ Ме 76),
ОААМУВ---, 96- 115
Сигнал лили ня літ літ лили літ зв'язування антитіла
Вісман (МУіезтапп) та інші встановили кристалічну структуру МО, зв'язаного з рецептором КА, і показали, що М-кінець (залишки 2-9) був важливим для зв'язування рецептора (Вісман (У/євтапп) та інші, 1999, Майшге 401:184-188). Залишки цього сегменту у МО є також важливими для специфічності до рецептора
ІгКА, порівняно з рецепторами їїкВ або їїКкС. Антитіло 404 є селективним відносно людського МО, порівняно з мишачим/пацючим МОБ, а також ВОМЕ і МТ-3, найбільш ймовірно, з причини М-кінцевих різниць між людським
МО та іншими нейротрофінами.
Антитіло 404 зв'язується з пептидом Мо 10 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 65) (М5МЕК---, 46-60) і пептидом Ме 17 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 72) (ТГТТТНТЕУКАІ ТМООКС, 81-95), що відповідають петлям 12 та 14, відповідно, які представляють дві із семи різних ділянок із більш високою, аніж середня, різницею послідовностей серед нейротрофінів. Експерименти з обміном цих семи ділянок між МОБ і ВОМЕ показали, що 12 і 14 були важливими для біологічної активності МОР. Окрім того, наслідком заміни п'яти залишків МТЗ у петлях І2і14 залишками МОБ була поява МОЕ-подібної активності з одночасним збереженням активності МТЗ. Таким чином, 12 і 14 є можливими ділянками, де антитіло 404 селективно зв'язується з МОР, а не з ВОМЕ або МТ-3.
Антитіло 404 також зв'язується з пептидом Мо 16 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 71) (М/М5МАТТТНТЕМКАГ, 76-90), сполученим із внутрішнім доменом кристалічної структури МОР. Ця ділянка є 10095 гомологічною у людського
МО ії мишачого МО, але відрізняється від інших нейротрофінів. 404 показало набагато слабкішу активність проти пацючого/мишачого МО, порівняно з активністю проти людського МОРЕ. Таким чином, зв'язування з цією частиною МО, найбільш ймовірно, не є критичним для видової специфічності але є важливим для селективності серед нейротрофінів.
Антитіло 404 зв'язується також з С-кінневою ділянкою МО (пептиди Ме 19-21 (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо 74-
ПОСЛІДОВНІСТЬ Ме 76) ТМОрОК-- І 5АКС, 91-115), що являє собою одну з ділянок людського МО, яка відрізняє МСЕ від інших нейротрофінів (ВОМЕ та МТЗ). Зв'язування з цією ділянкою допомагає пояснити, чому 404 не є активним проти інших нейротрофінів. Окрім того, між людським МО і мишачим МОБ на С-кінці існує різниця у одну амінокислоту, що дозволяє висунути припущення про те, що ця одна амінокислота може бути однією з причин того, що 404 віддає перевагу людському МОРЕ, порівняно з падючим/мишачим МОР. Подібне припущення має відношення і до М-кінця, де спостерігаються видові різниці.
І, нарешті, 404 взаємодіє також із внутрішнім доменом, який описується пептидом Ме 10 (ПОСЛІДОВНІСТЬ
Ме 65) (--КАНОС, 50-60) людського МО, який являє собою важливу ділянку для переважного зв'язування Ма з (КА, а не з КВ або КС, що додатково пояснює його вибіркову нейтралізуючу активність проти людського
Ма.
Приклад 9
Визначення спорідненості моноклональних антитіл за допомогою КіпЕХА
Зв'язування антитіла 404 (38859-80) з пиМа (29714-91) перевіряли за допомогою КіпЕХА. Стисло, Неасії-
Сів! бх (фірма Рієсє) попередньо сенсибілізували за допомогою пиМмаБ і блокували за допомогою В5А. Проби антитіла 404 (10 пМ і 30 пМ) інкубували з різними концентраціями пиМОег (фірма Атдеп) при кімнатній температурі впродовж 8 год перед пропусканням через гранули, сенсибілізовані пиМаР. Кількість антитіла, зв'язану з гранулами, визначали за допомогою козячого антилюдського-ІдС; антитіла, міченого флуоресцентною міткою (Суб) (фірма Часквоп Іттипо Незеагсі). Сигнал зв'язування був пропорційним концентрації вільного антитіла у стані рівноваги. Константу дисоціації у стані рівноваги (Ко) визначали шляхом нелінійного регресійного аналізу кривих конкурентного зв'язування із застосуванням моделі гомогенного односайтового зв'язування з двома кривими (програма КіпЕх"М). Ко зв'язування антитіла 404 з пиМаЕ становила приблизно 4 пМ.
Приклад 10
Ідентифікація додаткових анти-МОЕ антитіл
Додаткові анти-МОЕ антитіла (позначені як 14010, 6029, 7Н2, 1411 і 406), які одержали та ідентифікували, як описано у наведених вище Прикладі 2 і Прикладі З, були відібрані для додаткового дослідження. Стисло, кондиціоновані середовища перевіряли на зв'язувальну активність. Антитіла із середовищ очищали і секвенували. Прогнозовану масу порівнювали з мас-спектрометричними даними антитіл із кондиціонованих середовищ. Антитіла піддавали клонуванню. Два клони були експресовані у клітинах СНО і перевірені на активність, як описувалось вище. Результати наведено у Таблиці 10.
Таблиця 10
ІСвюо ЯМИ ІСво "МО . Молекулярний ІСвюо ЯМИ ІСво "Ма 4010 | 03918 | 513 |клонований.у// | С: СС:/::К4ЗНЯ/С:(«/// о 4рі1 17102803 | 520 клонований.ї/ | ХК 77777771 аб | 0414 | 10 |клонований.їу/ | -::К/////////:«/и////С/:К«(/ ////// ЗД
Після цього послідовності варіабельних ділянок легкого і важкого ланцюгів цих антитіл порівнювали з послідовністю антитіла 404, а також між собою (фіг. 5 і Фіг. 6). Відсоток гомології варіабельних ділянок важкого ланцюга, визначений цими порівняннями, подано у Таблиці 11. Відсоток гомолога варіабельних ділянок легкого ланцюга подано у Таблиці 12. Окрім того, на Фіг. 5-10 зображено відсоток гомології гіперваріабельних ділянок різних антитіл.
Таблиця 11 11111111 арамно | олабтомно | бнемн | 7нгмн | сдаріїмно | 4свУн аріомно 17777777 лоз | 955396 | 8596 | 54396 | Во бвнеМно 77777777 фролоозь | 8ббоє | 54361781 й7намн ОО Г!7О1117177777777771171711711711111111111рлоозв | 711 Бе 17179896
Стелі: НИМ ПОН ОН КОН ОН ПОН 7 ННЯ НИЄ с: ІЙ мавмн Її Г1О1ГГ111111111111111тоовь
Таблиця 12 7 Гмараук нари сі4сваг с | лобі с | 4о6сіс (14р10с| внесо |4с6ас| 7нгіс | 406е с4рітьсї 1 оло0о5 | 9495 | 6895 | 7196 | бо | 6895 | 6895 | б5ов | 7095 дова! | 7 фол | 6996 | 7495 | 68965 | 7096 | 7095 | 6995 | 7195 добріс! | 77777777 | олоооє | 8795 | 8395 | 8696 | 8695 | 8695 | 9696 овес! 77777717 робо | 9196 | 9496 | 94956 | 94956 | 9195 ярої 7/7 1 тлооо6 | 196 | 9496 | 9496 | 8695 вняс ЇЇ 77177777 - 7 Ї1777717117177717171717171771171111 роз | 9996 | 98965 | 8995
НЕТет Іо ПО ПОЛЯ ПОН ПОН КОНЯ КОНЯ КОНЯ НО КТ НН НИЄ 75 УНН НЕТ БІЙ
ПІТ НИМИ ПОЛЯ ПОН ПОН КОНЯ КОНЯ КОНЯ КОН НН С Те УНІ НК дове | ((:Л |. 17711117 тою
Слід розуміти, що у наведеному описі наведені певні конкретні варіанти здійснення цього винаходу і що усі модифікації або альтернативні варіанти, еквівалентні згаданим варіантам, входять до суті та обсягу цього винаходу, представлених у формулі винаходу, що додається.
ЛІСТИНГ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» Кеппеф, 14
Тгвапог, 7ате5
Наиапе, Наісвбий
Іпоце, Неашег 7 врапр, Ті ).
Мапіп, Егапк «1205. ЛЮДСЬКІ АНТИ-МСЕ НЕЙТРАЛІЗУЮЧІ АНТИТІЛА ЯК СЕЛЕКТИВНІ ІНГІБІТОРИ
МЕТАБОЛІЧНИХ ШЛЯХІВ ФАКТОРА РОСТУ НЕРВОВОЇ ТКАНИНИ (МОБ) «1305 02-1240 «1502 5 60/487,431 Я . «151» 2003-07-15 «160» 138 «1705 Раїепіп хегвіоп 3.0 «210» 1 -2115 990 «212» ДНК «213» Ното зарієп5 «400» 1 одсстссасса аддосссатс досстесссс студоддсасест сстссаадад сасстстоса 60 ддосасадсяд ссстддаста сстодуєсавя частастссс ссодассоді дасодчічса 120 тодаастсад дсассссдас садсадсЯто сасассттсс судастЯісст асадссеєєса 180 одасестаст ссстсадсад сотодсдасс дтдссстсса дсадсттодуд сасссадасс 240 тасасстоса асотозатса сагосссадс аасассаадо туддасаадаа адттоадсес 00 аавістсут9д асаааастіса сасацдуссса ссоатдсссазд сасстдаасті сстодоадада 360 ссдксаутст ксестсттссс сссаазассс ааддасасес саєоатстс ссоддасссст 420
Чаууєсасат осдтаастааї одасосдадс сасдаадаєс седадотсаа дЕссаастда 480 тасосодасо одсосодадоє дсасаацосс аадасаааос сосЯддовгода дсадтасавс 540 адсасутасс дсосодеєсад соєсстсасс дтсстдсасс аддассоодсе дзатадсаза 600 дадтасааах асааадістс саасаааасс стсссадссс ссатсоаога аассатстсс 660 ааадссааад досадссссо адаассасад одтотасассс тдсссссаїс ссддчваєодад 720 стдассаада ассаддісад сстдасстодс стодусавао дсттстатсс садсдасаєс 780 оссуєадаох дддададсаа ходдсадссо дадаасааст асаадасєсає десссссосо 840 стдоастсса асддсесстт сттссістає адсаадстса ссуводасаа дадсавотда 900 саосадоддда асуссттстс атастссото асусаєдачуд стстдсасаа ссастасасо 960 садаададсєс жстссстаєс тссодотава 990 «2105 2 «2115 330 «2122 РЕТ «213» Ното зарієпь «400» 2
АТа бег тіг о їу5 с1у Рго бег мМмаї Ре Рго Ге АТа Рго 5ег 5ег Гуз 1 5 и) 15 5ег Тиргоб5ег с1у с1у ТБг АТа АїТа їец сіу Суз Гец маї Гуз А5р туг зо
Ре Рго сій Рго ма! ТНг ма! 5ег Тер А5п бег сту Аїа Гей тиг 5ег
СТу маї Ні5 тпг РлЛе Рго АЇа ма! Сеп Сбіп 5ег 5ег С1Уу Гей Туг 5ег 58 60 йен бег бег ума! маї тійг Уаї Рго 5ег бег бег Гец с1у тиг сіп тНг 65 70 75 80
Туг Ше Суб д5п о уаї А5п нів Туз рго бек Ази Тк Гу Уа! А5р Гуз 85 90 55 був Уаї 01 Рго Гуз бег Су Абр Гуз тВг о Ніз Пс Суб Рго Рго Суз 100 105 10
Рго АТа Рго сій Гей Те сТу СТу Рго бег ма! Ре Ген РМПе Рго РГО 115 120 125
СУ Рго Гуз А5р Тиг о їес Мет їіе б5ег Агуд ТБг о Рго бій Уаї Трг суб 130 135 140 ма1ї ма! маї Ар Ма! 5ег нів с1у дор рго би маї Гу РНе Ап тер 145 150 155 160 тує ма1ї д5р сіу ма! си Маї Ніб5 Аб5п АТа губ ТИг Гуз Вбго Ага СИ 165 170 175 сти біп туг д5побег Тіг о Туг Аго ма! уаї бег Уа! Гец тпг ма! Сей 180 185 о
Ні сіп Абр Тер Гей Аб5п о с1іу їм5 бій туго губ Суз Гуз ма! 5ег Ази 195 200 295
Муз АТа бен Рго АТа Рго ІЇе сіу Гуз типг ІТе 5екг о їуз АТа Гуз ФУ 210 215 220 біп о Рго Аг с1И Рго С1п ма! Тук Тпг Гей Рго Рго 5ег Агд А5р сій 225 230 235 240
Гец Тигогуз А5побіп о уаї 5егоїеи ТпгоСу5 Гей уаї Гуз с1у Ре туг 245 250 255
Рго 5ег А5р те Аїа уа1ї си Тгр обі 5ег Аби сіу с1й Рго С) Ап 260 265 270
АзпоТуг Гу5 Тпг о ТВгоРГО Рго уаї Сей Ар Бег дзр СТу бег РПе РП 275 280 285 їеи Туг 5ег уз еп тиг ма! дер Гуз 5ег Аг Тгр біп с1п сту А5п 290 Ї 295 300 уаї вне б5ег о Суз б5ег ума! Меї ні сій АТа гей нів А5п нії туго тиг 305 з10 315 320 сп 1у5 б5ег івеи бег о їец бек рго Фу Гу 325 330 «210». З «2115 978 -2122. ДНК «213» Ното заріеп5 «400» з дсстссасса аддасссатс доїстЕсссс стддсоссст дсессадова сасстссдад бо адсасадсядд ссстоддасто сстддісаад дастасессс ссдаассаді дасдосасєса 120 тдазасссад дсастстдас садсадсдта сасассетсс садстоісстІ асадтсстса 180 ддасьстаст сссссадсад содсдуєдасс дсодсссесса дсаасьссдд сасссадасс 240 тасасстдса асотадаєса саадсссадс аасассаадоа сосасаадас адттдадсос 300 ааасаттоєо єсдадутуссс ассоасоссса дсассасстд сддсаддасс дЕсадетстес 360 стсстессссс садаасссаа оддасассстс асдатсьссс одасссстда ддісасотас 420
Чідосаасод асусдадсса созадасссс даддсссаат їсаастодта сосодасодс 480 дсдоадатос асаатоссаа дасааадсса сддоаудадс адсссаасад сасотсссде 540 апсоадссаяса тссесассої гудтдсассад дастадстда асдосаадда дсасаачсос 600 аадоїтстсса асаааодсст сссадссссс ассоадаааа ссассіссаа аассазааада 660 садссссдад аассасадоє дсасассстд сссссаєссс додаддадає дассаадаайс 720 саддссадсс тоасстдсст даєсазадос тестасссса дсдасатсос сотадачстад 780 дададсаатоа досадссодда даасаастас аадассасас сЕсСссатдсї ддастссдас 840 дасксстЕст тссістасад саадстісасс дсддасаада осаддсодса дсаддаддаас 900 дссттсеСсат дстссоасдає осасоадосі сстосасаасс астасасуса даададсстс 960 тссстдтсьс соудтада 978 «2105 4 «2115 326 «212» РЕТ «213» Ното 5аріепе «4005 4
АЗа бег тагогуз сТу Рго бег Маї Ре Рго Гей АТа Рго Суб 5ег Аг 1 5 10 15 бек типг обег сій бег ТпПиг АТа Аа Ге с1у Су5 Сей маї губ Аз5р туг
РНе рго сій Рго Уа! Тиг маї 5ег Тер А5п 5ег СТу АТа бе Тиг 5ег су маї ні ТК РПпе Рго АТа маї Гей сій 5ег 5ег сС1у Гец Туг 5ег 60 рей 5ег бек уаї маї тиг оуаї Рго 5ег 5ег Азп Ре сіу тпг о сіп о тпг 65 70 75 80 туг тиг о Суб5 А5ломаії дер нів Гуз Рео 5ег АБ5п ТНг о Гу ма! дор Гу 85 90 95 тег омаї січ Ага губ Суз Суб5 Ма! СТИ Сух РгОо Рго Суб РгО АТа Рго 100 105 по
Рго умаї АТа сіу Рго б5ег ма! Рпе Ген Ре Рго Рго їуз Рго їу5 Ад5р 115 120 125
ТИг о їеи Мес Іїе б5ег Аг тТргоРгО с1у Ма! тйгоСуз ма! ма! ма! Азр 130 135 140 маї бек ніх сім А5р Рго сій Ма! сіп Ре А5п Тер туго ма! Ар с1у 145 150 155 160 ма1ї єї ма! нів Ази АТа губ ТВг оїу5 Рго Агу б1ц б1и сп Ре А5Пп 165 170 175 бег ТНг Ре Аг маї ма! 5ег Уа! Гей тБг ма! маї Ні сіп А5р Тгр 180 185 190 еп дп с1у ух сі туго Гуз Суб5 Гу маї 5ег Аб5п о їу5 сту Геи РгОо 195 У у у 200 у 205 у діа Рго І1е сі 1у5 тпг о тТІе 5ег о їу5 Тіг о їу5 саТ1у с1п Рго Агд СТИ 210 215 220
Бго сіп ма! туг тТйг Бей Рго Рго 5ег дгуо бі бі Меж тТагогуз дві 225 230 235 240 сІп ма! бек геу тіг о Суз ем Маї Гуз С1у Рпе Туг Рго бег д5р Ше 245 250 255
Аїа маї сіи Тер сі бек Абп сту сТй Рго СТИ Абп Аби туго суб ТВг 260 265 270
ТНгоРГО Рго Меж їен дер 5ег А5р с1у б5ег Ре Ре ем Ттуг бег ув 275 280 285 еп тег омаї Ар о гуз бег дгуд Тер обіп сіп сіу дл Ма! Рпе 5ег сСуз
290 295 300 5ег ма! мет ні сій Аїа Гей Ні А8зп Ні5 Туг тиг бій уз 5ег гей 305 310 315 320 зег їен 5ег Рго СТУ Гу
325
«2105 5 «211» 981 «212» ДНК «213» Ното зарієпе «А00» 5 дссадсасса адоддссаєс соахстссссс стодсоссся дсессаддад сасстссоаа 60 адсасадссо сестдадсто сстдаєсаая дастасеесс ссодаассоді дасовасаєса 120 тадаасссад дсдссстдас садсдасуто сасассттсс соддссдєсся асадесстса 180 ддассстсаст ссстісадсад сасоадідасс дсдссстсса дсадсссд9д сасдаадасс 240 тасасстоса асдтадаєса саадсссадс аасассаадуд ходасаадад адетодадссс 300 азатастуддаєс ссссатоссс ахтсатодссса осасстдаді ссстоадоддад ассаєсадес зво тТЕсстдусьсс сессаааасс сааудасасі стсатдатст сссодасссс годадцоЕсаса 420 тосасчдсЯдо хтодасаєдад ссаддаадас сссдадоатсс адіссаастд дсасдтуддає 480 часдасоддада стосасаастос сзадасааад ссоасодоааоду адсадсссаа садсасдтас 540 сасодсодіса дсдїссссас сдїсстдсас саддастоддс сдаасддсаа ддадсасавод 60 тдсааддістї ссаасааадуд сстсссдЕсс гссаїсдада адассаєсіс саазассавза 660 дадсадсссс дададссаса ддсодсасасс стдсссссаї сссаададда дасдассаво 720 аассадаєса дсстдассто сстддісааа ддстестасс ссадсдасає сдссатодад 780 тод9дададса асодосадсс ддадаасаас басаадасса сосстсссЯє дстодастсс 840 дасадсесст єсттссеста садсаддста ассдтднпгаса ададсадаєд асаддааосо 900 аатсотсесст сатдсеєссоє дакосаєдад одстстдсаса ассассасас асадаададс 960 сеЕСтСсСсстУЮ стстадотаа а 981 «210» 6 «211» 327 «212» РКЕТ «213» Ното зарієп5 «400» 6 діа бек тк Гуз сіу Рго 5ег Ма! Ріе Рго Ме АТа Рго Суз 5ег АгО9 1 5 10 15
Бег ТНг о Зег сі бек тпг Аіа Аїа їеи С1іу Суз тей уаї Гуз А5р Отуг
Ре Рго с1и Рго ма! тйг ма! 5ег Тер А5п бек сту АТа ген тпг 5ег сТ1у Ма! Ні тік Ре Рго АТа ма! Гей Сіп бег 5ег сі1у Ге туг 5ег 60 іїеи бек бек маї ма! тигомаї РгОо бег бег 5ег бен сіу Ттиг о Гуз тТпг 65 70 755 во тує твВг Суб Ап Уа! др Ні Гуз рРго 5ег о Аб5п о тагогу5 ма! А5рогув 85 90 95
Ага маї біш бек уз туго с1у Рго РКО Су5 Рго 5ег Суб Рго Аза Рго 100 105 мо сі Ре (ец сТу сіу Рго 5ег ма! Ре Гей Рпе Рго Рго Туз РгГО (у 115 120 125 дер тик Сем Меб ІТе 5ег дго ТигоРго сш Уаї тіг о сСух маї Маї ма! 130 135 140
АБр Уа! 5ег сіл сій д5р рго 6Ти ма! біп вБе дп тер отуг маї зр 145 150 155 160 оТу ма! сТи Ма! Ні Аби АЇа губ Тигогу5 Рго ака сій біу біп Ре 165 170 175
Ап бег ТИйг о ТУуг Аго маї мМаї 5зег уаї Гей тб маї ге Ні сп др 180 185 190
Тгр Гей а5п е1у уз С1у Туг ух субх Гує МаЇ 5ег Ап 1ух о1у гей 195 200 205
Рго бег бег ІІе сій Гу5 Тйг ІТе б5ег бує АТа уз сту сп РГО АгО 210 215 220 сій Рго с0іп о Маї туго ТВйгбоБей Рго Рго б5ег біп сіш со Мет тИгогуз 225 230 235 240
Аб5побЄТп маї 5ег ее тиг Суз Мен ма! Куз сіу Ре Туг Рго 5ег Ар 245 750 255 тіе Аза ма1ї сій Тер сі бег Азп сіу біп Рго бій А5п о А5поТуг Гу 260 265 270
ТВготвг Рго Рго Маї гец Ар о бег др с1у бег Ре рРБе гей туг бег 275 280 285
Аг Сей тик омаї А5р гу бег Аго Тгр о с1п си б1у А5пома!ї РНе 5ег 290 295 300
Су Бек ма! Меж ніх сій АТа Ге нНіб5 А5п Ні туго таг о б1п Дуз 5ег 305 310 315 320.
Ге б5ег Ге бег іє су Туз 325 «21025 75112 3215212» днк
«213». Ното в5арієп5 «4005 7 созассуєдо стосассаєс сосстссатс ттсссдссат стдаєдадса дссдааатся 60 дозастасст стоттовоту сстудсвдаат аасттстаєс ссаоададос сазадтасад 120 тадаадасод атаасоссст ссааєсодоаєї аастсссадо ададсоаєсас ададсадчас 180. адсаводаса дсасстасад сстсадсадс ассстдасас тдадсааадс адастасодад 240 ааасасааад тстасдсстд сдаадісасс саєсадддсс тдадсісосс содгсасавад 300 адстїсааса адодадачко Є 321 «2105 8 «2112 107 «212» РЕТ «2135 Ното взаріеп5 «400» 8 дго Тигомаї АТа АТа Рго 5ег ма! Рие ІТе РПЄ Рго Рго 5ег А5р СТИ 1 5 10 15 біп бе Гуз бег о сіу тпг АТа 5ег ома1і мМмаї Су5 теп Те А5зп А5п Рпє туг Рго Аго сі АТа Гуз ма! сіп тгр о гГуб5 маї д5р Абп АТа гей сп 5ег Фф1у Ап о5ег о сСіп бі бек оуа! Тіг осі біп А5р бег Гу5 Азр 5аг 50. 55 бо
Тиг о Туг б5ег Гей б5ег об5ег ТНгогеш Тпгогей 5ег туз АТа д5р Туг Си 65 70 75 80
Суб ні туз ма! туг АТа Суз сіц маї тиг Ніз сіп сіу Гей 5ег 5ег 85 90 95
Рго маї ТПг їу5 5ег РПпе д5п о дгу с1у СТИ Су 100 105 «2105 9 «2115 369 «212» ДНК «213» Ното варієепь «400» 9 дадуєасадс хтадсодадес сододоадудс ктодтасадс стоддоддаєс сстдадасьс 60 тсстатодсад ссЕСТОДСЕТ сассттаада адттатадса сдаастодад: ссдсесадаси 120 ссадддаачя сдостадачіу дастсатас астачєсоста дтадссатас сатаєстстас 180 адсадасьстд созадоддссо астсассаєс тссададаса ахдссаадаа тесастасає 240 стдсааатод асаадасстдад адасааддас асодстасає астастатас дадастатахт 300 аадсадтддст: дасасатстс таастаєєст дастастадо ассадддаат сстадЕсасс збо дЕсссса 369 «2105 10 «2115 123 «212» РКТ «213» Ното варієпаї «4005 10 сій уаї сбіп без маї сі 5ег сіу Сіу СТу цей маї сіп Рго сіу сту 1 5 10 15 зег Гей Аг Гей бег Суз Аїа А1а б5ег сТу Ре Тпг Гец Агд бег туг 20 25 30 5ег Метх дп о Тгро ма! Аго с1іп АТа Рго с1у Гуз С1Уу Сей сти Тер ма! 35 40 45 бег туг Іі1е 5ег Аго бег баг Ні ТНг о І1е Ре туг АТа А5р 5ег ма! 50 55 60 уз С1у Агу Ре Тиг оІТе б5ег Агд Ар А5п АТа Гу Абп бег Геу туг 65 70 15 80
Кец бій Мес Ар 5ек Гей Аго Ар о сТИ дер тйг АТа мес туго туго су 85 90 95 діа Агуд маї Ттуг 5Зег Бег сіу ТтТгр ні5 маї 5ег Азр Туг Ріпе А5зр туг 100 105 110
Тер б1у сіп є1у т1е Сей ма! тТиг ма! 5ег 5ег 120 -2105 11 «21125 321 «2122 ДНК «213» Ното зарієп5 «4005» 11 дссаєссаді гдасссадіс жссатсстсс статстосат статаддада сададссасс 60 ассасттасс додсаадтса дадсастадс адтастстад сстадсасса одсадааасса 120 аддааадстс стаадсесст датстаєдає дсссссадтї сддааадстод доєсссатса 180 адастсадсоу дсадтодатс таддодасадатє тісастстса ссаєсадсад сстдсадсст 240 даазассссо саасттатта стдссаасад тСтаастадсї асссудстсас тЕссодсода 300 додассаадо содадатсаа а Й 821
2105 12 «2115 107 «212» РЕТ «213» Ното заріепь «-8005 12
Аїа тТе бій еп тийг о сіп бег РгО бег бег Ге 5ег АТа 5ег ма! с1У 1 5 160 15
Азр Аго ма! тпг о ї1е тбг Суз Аг АТа бег С1п сТу ІїТе 5ег 5ег А1а
Мен АТа тгротуг о с1іп біп Гуз Рго с1у Гуз АТа Рго Гуз Се ге Пе
Туг А5р АТа бег бег їеи сТи бЗег сіу Маї Рго 5ег Агод Рпе 5ег (1у 60 б5ег сіу 5ег сбіу тТиИг А5зр РіБе ТТГ Гей тр отіе 5ег бег ей сій рРго 65 70 75 80 бій А5р о РНе діа тйготуг туго Суб бів біз Ре А5п о 5ег о Туг Рго геи 85 90 95
Тк оРпе сіу сіу сіу тйгогу5 Ма! сіи Пе Гуз 100 105 «2105 13 «211» 42 «2122» ДНК «213» Ното зарієпз «400» 13 дсасатачса дсдастдаса сасстстдає састтсдаст ас 42 «210» 14 «211» 14 «212» РЕТ -2132 Ното зарієп5 «400» 14
Уа! тТуг Зег зег ПУ тер нів маї 5ег пер тук РНе дер туг «210» 15 «2115 27
«2122 ДНК
«2132 Ното заріепе
«4005 15 саасадієїа атадесасєс дсісаст 27 «2102 16
«211» 9
«212» РВТ а
«213» Ното варіепв
«400» 16 сп сп РНе деп рег тус Рго Гей тНг
«2102 17
«2112 51
«212 ДНК
«2132 Ното заріепе
«400» 17 тасаттадіс дтадстадіса тассатаєстс гасдсадасті стутдаадод с 51 «2105 18
«2115 17
«2122 РЕТ
«213». Ното взарієпь
«400» 18 туг ше 5ег Агуд 5Бег бег нів Тпг о ІТе Ре туг АТа А5р 5ег маї Гуз 1 5 10 15 су
«2105 19
-115 21
«2122 ДНК
«213» Ното варієпв
«4002» 19 чаєдсстсса дЕстодааазо ті «210» 20 «2112 7 «2122» РЕТ «213». Ното заріепве «400» 20
А5р АТа 5ег 5ег Ге сій 5ег 1 5 «2105» 21 «2115 15 «2122 ДНК «213» Ното зарієп5 «4005 21 ачесасацса сдаас ЕЕ -2105 22 «2115 5 «212» РЕТ «213» Ното варіепе «400» 22 зег туг 5ег Мет дп «2105 23 «2115 33 «2125 ДНК «213» Ното 5арієп5 «400» 23 сдддсаадіс аддосаєсад садтостеса дес З «2105 24 -2115 11 «212» РЕТ «213» Ното взарієп5
«4005 724
АгЯ АТа бег б1п СТУ ІТе бег 5ег АТа їец АїА 1 5 10 «2105 25 «2112 1131 «212» ДНК «213» Ното заріеп5 «4005 25 дссіссасса адддсссатс ддєстксссс стодсдссстї дсессаддад сасссстодда 60 часасаасяд ссстоадастЯ сстдатсаго чдастасстьсс ссозассаді дасдасатса 120 тоддаастсад дсадссстдас садсддсуєа сасасстєсс сддстатссі асадссстса 180 заастстасеі ссстсаосад састдасдасс дедссссісса дсадсстядду сасссадасс 240
Хасасстоса асдсдаасса саадсссадс засассавад єдоасаздад адстдадстс 300 аааассссас сдуєдасас аастсасаса тдсссасдді адсссададсс саааєсттдє 360 дасасасстс ссссасдссс асддітдссса дадсссават сттдєдасас асстсссссд 420 тасссасодусє дсссададсс саааєсттді дасасассіс ссссаїдссс асодедссса 480 асасстдаас тсссаддадоа ассцісадіс тЕсстсСтЕсс ссссаааасс сааддатасс 540 сестасдатії сссодасссс сдадаєссасоя тасатоаодтдЯ хтадасоєдад ссасдаадає 600 сссдаадісс адсссааато дсасасодас дасоатодадо хасатаатос саадасаагуд 660 ссосудддадо адсадіїсаа садсасчєтс сдєдтддєса дсдєсстсас саєсстдсас 720 садчассдус сазасоддсаа одадтасаад сдсааддтстї ссаасааадс сстсссадсс 780 сссаєсдада азассатстс саазассааа ддасадсссс дадааєсаса адідстасасс 840 стдсссссає сссдоададда дасдассаад аассаддеса дссєдасєста сстддесааа 900 дусетстасс ссадсдасає сассодсддад тддаададса дсодосадсс ддадаасаас 960 тасаасасса сдссісссат дстддасесс дасаддсесст ЄсесссЕста садсаадстс 1020 ассдтддаса ададсаддсд дсадсаададдуд аасажсттст сасостссає датосасаад 1080 дсестодсаса ассдсттсас дсадаададс стстссстує стссдддстаа а 1131 «210» 26 «2115 376 «2122 РЕТ «213» Ното заріепв
«А0О» 26
АТа бег тпйгоїу5 с1у Рго б5ег ма! Рпе Рго Гей АїТа Рго Су5 5ег Ага 1 5 10 15 чег Тиг 5ег СТУ сіу тик АТа Аїа це ЄСТУ Суз Гецп Ма! щу А5р Туг 2
Рпе Рго сі Рго маї Тігомаї б5ег тгр дб5п бег с1у АТа Гед тиг 5ег сІу ма! Ні тіг о рйе Рго АТа уа)Ї ге біп б5ег 5зег сІу іїеч Туг 5ег 60 бе зег о 5зег ма! ма! тигома! Рго 5ег обег бегоїеу с1у тпг сп тТНг 65 70 75 80
Туг тТигоСуз Азпомаї Ап Ніб їу5 Рго бег о дзп Тийгогуб5 ма! А5ро Гуз 85 90 95
Ага маії сін тей уз ТигоРГо Гец С1у Ар тиг о тТиг о Ні тТвйгоСуб рРгО 100 105 110 дгод Суб Рго 010 Рго Гу 5ег Суб дор ОТГ о РГО Рго Рго Суб РГО АгО 115 120 125
Суз Рго бі Рго ї1у5 б5ег Суз Азр тТпгоРго Рго Рго Суб РгГО Ага сСуз 130 135 140
Рго с1и Рго Су 5ег Су5 Ар ОТГ РГО Рго Рго Суб Рго Аг Су РгО 145 150 155 160
АТа Рго сін Гей ге б1іу сТу Рго бег ма! РБе ге РНе РгО РГгО Гу5 165 170 175
Рго Гм5 дер ТИг осей мет ІТе бег дго ТНгоРгГо сі Ма! тиг суб маї 180 185 190 уа! ма! Ар Ммаї 5ег Ніз сі А5р Рго бТу Маї сій Ре гу5 Тгр туг 195 200 205 мМаї Ар сіу ма! сти уа! нів А5п діа гує Тиг Оу Вго Аго сти би 210 215 220 біп Ре д5п о бег тТпг о РНе Агуд ма! ма! 5ег маї бе тпг Уа Гей Ні5 225 230 235 240 сіп о А5р тер гей дп сіу губ сти Туг о цуз Суб5 руб маї 5ег д5п гу 245 250 255
Аїа Гей рго Аїа Рго ї11е СТИ їу5 тк Іїе бегїу5 Тйг гу б1у п 250 265 270
Рго Ага сій Рго біп ма! тТуг тйгогей єго Рго 5ег Ага сім сі Мет 275 280 285 тТапговуз Ал сіп маї 5ег о гбец тпг о Суз Ген Ма! уз СТ1у Ріпе Туг рРго 290 295 300 5ег А5р ТІе АТа ма!ї бій Тгр о сіи 5ег бек С1у сп Рго СТи дет А5П 305 310 315 320 туг АП ТИг ТИС о РГО Рго Меї ген Ар бек А5р сіу 5ег рРПе рце (ей 325 330 335 туг 5ег вуз беу тс о Уаї Ар Гуз 5ег Агу Тер б1п бій с1у деп ІїІТе 340 345 350
Вре бег Суб бег ума! Мех ніх с1и АТа Те Ні доп Аго Пе ТИг сіп 355 360 365
Гуз ее Гей бег Гей 5ег рге с1у «2102» 27 «2115 29 «212» ДНК «213» Штучна «220» «223» РСЕ праймер для людського МОЕ «00» 27 асассасата тоссатсатс ссатсссах 72 -2105 28 «2112» 40 «212» ДНК «213» Штучна 220» -223» РСК праймер для людського МСЕ «4005 28 ассасаддатї ссіссттато сасдасосас адстттасод ке «210» 29 о -2112 375 -2122 ДНК «213» Штучна «220» «223» Нуклеотидна послідовність, що кодує рекомбінантний людський те-МОЕ «4005» 729 сатаєутсає сатсссаїсс сатстїссас аддадсудаат хсЕсодотоєо судасадтос 60 заасдкдасода стададастаа дассассдсс асадасаєса адодсазода ддасдатачато 120 ттодуададоа туаасаєсаа саасадсдта тісазасаді асттттттоа дчассаадтодс 180 сдддаасссаа аксссояссда садсодотос сддадсаєса астсазадса стддаастса 240 таттутасса сдастсасас стЕсоєсаад дсодстдасєсса тодаєддсаа дсадастасс 300 тодсодсєса сссддатада тасодсстдє діодкососос гсадссосєаа адстотаос9 є збо сотдсатаау датсс 375 «2105 30 «2115 121 «212» РКЕТ «213» Штучна «220» «223» Амінокислотна послідовність рекомбінантного людського те-МСЕ (1-120) «400» 30
Мет зег б5ег о 5ег Ні Рго ІїТе Ре Ні Агд с1у бій Ре бег ма! суб 1 5 10 15
А5р 5ег ма! 5Зег ма! Тгр ма! сту др Гу Тпг о тТПг АТа Тиг о А5р Те
Гуз сту уз сіи ма! Ме мМмаї Ге сіу сі Ма! А5п ї1е д5п А5пП 5ег ма! РБе уз Сіп Туг Ре РНе сій тйк о гу Суб Агд А5р Рго Ахп РгОо 60
Уа! Ар б5ег сТу Суз Аг сіу ІТе Азр 5ег Гуз Ні Тгр А5зп 5ег Туг 65 70 75 80
Суб тТиг оте о твгоні твг о РНе уаї туз АТа їец Таг мес Ар сТу Гуз 85 90 95 біп АТа Аза тер алго Ре ІЇТе дгд т1е А5р ТНг АТа Су5 маї Су ма! 100 105 110
Гец б5ег Аго Гуз АТа Ма! Аг Аго Аїа 115 120 -2102 31 «2115 55 «212» ДНК «213» Штучна «220» «223» Послідовність 5'-праймеру для одержання вектора експресії РСЕМІ1 656 (АТС Р ре сКТТРеТ «400» 31 сдаєсстдасєсс стадааддад одатаасата тддстаасодс дстддааєсс дотас К «210» 32 «211» 49 «212» ДНК
«213» Штучна
«223» Послідовність 3'-праймеру для одержання вектора експресії РСЕМ1656 (АТСС Мо 69576) «4005 32 тааасстааоа ЕСТЕССТсст тактотасас сзаєстососа ассттаадс 43 «2105 33
«2115 24
-212» ДНК
213» Штучна
-220»
«223» РСК праймер
«220»
«221» Непевно
«2222 (18)..(23)
«223» п-а,с,МБабовр
«4005» 33 І аадссудатад чсестссапли пип 24 «2105 34
«2115 21
«2122 ДНК
«213» Штучна
«220»
«223» РСЕ праймер
«00» ЗА ,
чдадаєсадас содаастодад 9 21 «2105 35
«211» 19
-2122 ДНК
«213» Штучна
«223» РСК праймер
«А0О» 35 тдадчдасадсії дассасаса нг 2105 36 "
«211» 54
«-12» ДНК
«2132 Штучна
«220»
«223» РСК праймер
«4005 36 садсадаадс гїстадасса ссасодасат даддосодссс дсесадстсс хода 54 «210» 37
«2115 34
«2122 ДНК
«213» Штучна
«220» Е
«223» РОК праймер
«4005 37 сттоєсдасі саасастсьє ссстатвдаа сс 34 «2105 38
«2115 55
«212» ДНК
«213» Штучна І
220»
«223» РСК праймер
«4005» 38 садсадаадс Сстадасса ссатоадаасє аододостдасас тдодЕстсс вто 55 «210» 39
«1» 34
-2125 ДНК «213» Штучна «223» РСК праймер «4005 39 дсасуїсдас гсаєттассс доадасадад адад 34 «210» 40 «211» 449 «212» РЕТ «213» Ното варіепе «40» 40 сі мМаї сіп ге ма! Сі бег сту сту сіу еп мМаї сіп Рго С1у ЛУ 1 5 10 15 зег Гей Аго це бег Суб Аїа АТа бек сіу Рле ТНг о Гец Акд 5ег туг зег Меї Азп Тгр ма! Аг с1п Аїа Рго сіу туз сТу Ге сі Тгр ма!
БЕ 40 45 5ег туг ї1е 5ег Агу 5ег 5ег ні Тйг ї11е Ре туг АТа А5р 5ег ма! бо
Туз с1у Аго Рпе тиг тї1е 5ег Аг дер д5п Аа Гуз Ап б5ег Ген туг 65 70 75 80
Се бІп Мет Ар 5ег іїец Агд Азр Сі Азр Те АТа Мет Туг туг Суб 85 90 95
Аїа дго ума! Туг б5ег бег сіу тгр нів маї 5ег А5р тТуг Рпе д5р туг 100 105 110
Тгр сту сіп с1у ї1іе ге Уа! тЬг ма! б5ег б5ег АТа 5ег Тігоїуз п1у 115 120 125
Рго 5ег ма! Ре Рго Гей Аїа Рго Суб 5ег дга 5ег Тпг 5ег б1ц 5ег 130 135 140 "Аг АТа АТа бен С1У Су5 Гей ма! Гуз Ар Туг РВе Рго с1и рРго ма! 145 150 155 160
ТВгомаї бег Тгр АБп о бег сту АТа Ге тпг бег сіу ма! Ніє тлг рРПе 165 170 175
Рго АТа ма! еп сіп 5ег 5ег сту Ге туг бег Сец бег 5ег ма! ма! 180 185 190
Таб оМаї Рго бег бег деп Ре сіу тпгосіп тТВготуг тпг Суб Аб5помаї 195 200 205 дер Ні Гуз Рго бег А5п ТігоГуз ма! А5р Гуз Тпгомаї СТИ Ага Гуз 210 215 220 суз Суз ма! Си Суз Рго Рго Суб Рго АТа Рго Рго ма! АТа СТУ РгО 225 230 235 240 сег ума! Ре Гец Рібе Рго Рго їуб5 Рго Гу5 дер Тиг оцей Ммеї Тіе 5ег 245 250 255
Агу типгоРго бі Маї ТВ о Суз Ма! Ма! Ма! Азр ма! бЗег Ні си А5р 260 265 270
Рго би маї сіб РБе А5п о Тгр о туго уаї Азр о б1у Ма! сін Ммаї нів Азп 275 280 285
АТа ув тТйг огу5 Рго Агуд бі сій бі0 РБе Абпобег ТНг о Рпе Аго маї 290 295 300
Ууаї 5ег маї їеш тк ма! ма! ні5 сій др Тер гей доп су Гуз сіц 305 310 315 320 туг уз Суз Губ ма! 5ег А5п Гуз С1у Гей Рго АТа Рго Пе си Гу 325 330 335
Те ої1Те 5ег губ ТиИг губ С1у біп Рго Аго сі рРго сій маї Туг Твг 340 345 350
Гец рго Рго бЗег Агд біц сії Меїс ТпгогГуз д5п сбіп Ма! 5ег гей тТИг 355 360 365
Суз бе ма! цуз с1у РМйе туг Рго 5ег А5р І11е АТа ма! си тТкр си 370 375 380 бег д5л осі сб1п о Рго сш АБИ Азп туго Гу Тваготигс Рго Рго Меї ії ей 385 390 395 400
А5р бЗег Ар біу бег Рре РПе їеи Туг 5ег ГУу5 їеу Тіг о Маї А5Зр Гуз 405 410 415 5ег дгд Тгр сій сп сту доп Ма! Рйе б5ег Суб б5ег маії Ме ніх су 420 А?5 430
АТа їеи нів Азп Ні Туг Тиг о Єїп Гуз бег Гец б5ег Ге 5ег Рго Є1у 435 440 445
Гу5 «2105» 41 «15 4У «212» РЕТ «213» Ното зарієпь «400» 41 со Уа! біп о їеи маї бі) 5ег біу с1у сС1у Ге Уа! біп Рго с1у СУ 1 5 10 15 бег гей Ага цей бег Суз АТа Аїа бЗег с1у Ре ТНг Гей Агуд 5еготуг
Кі век Меї Абзп Тер ма! Агуд сп АТа Рго с1у Гуз С1у Ге сі Тгр Уа бег туг І11е 5ег Агуд бег 5ег Ні Тіг І1е рпе тує Ата Ар 5ег маї
Гуз ЄТу Аг Ре Тйг оІТе 5ег Ага А5р Ап діа гу Азпобзег ген туг 65 70 75 80 іїей Сіп Мет А5р 5ег о їец Ага Ар бі Ар Тк діа Ммеї туг М су 85 90 9
Аа Агод ма! туг 5ег 5ег ЄТу Тер нів Ма! бек Азр Туг Рпе А5р туг
З 10 105 мо
Тгр Є1у сіп С1у І1е ей ма! тг Ома! бег о 5ег АТа 5ег ТНг Гуз С1Уу 115 120 125
РРО бек Уді Ре Рго їєу АТа Рго 5ег 5ег уз Бек Тйг 5ег а1у Фу 130 135 140
Тиг о АТа АТа гей сту Суб5х Ген ма! губ А5р туг біле Рго бій Рго Уа! 145 150 155 160 тис оуаї 5ег о Тгр А5п о зег с1у АТа гей твго бек сіу Ма! Ні5 ТиИг РНе 165 170 175
Рго АТа Уа! Ге сій 5ег бек с1у Ге Туг бег Ге бег бег ма! ма! 180 185 190
Ті омаї Рго 5ег бег б5ег о їєи с1у ТЯГ осіп ТНготуг ІТе Суб Аби ма! 195 200 205 дяп Ні Суб Рго бег А5п о Тагогуз маї А5ріу5 рує Ма! сій Рго Гуз 210 215 220 бег Суб др Гуз ТиИг Ні Тг оСуз Рго Рго Суз Рго Аїа Рго Си Геу 225 230 235 240
Мен сіу Є1у Рго 5ег Уа! Рпе їеи Ре Рго Рго їу5 Рго Гуз Ар тПг 245 250 255 іїец Мет їТе б5ег Аг тТйгоРго сіц Уа! ТпгоСуз ма1ї Ма! Маї А5р ма! 260 205 270
Фе нів сій Ар Рго бТи мМаї Ду Ре Аби Тгротуг Ма! Азр Су маї 275 280 285 сти маї Ні5 А5п АТа губ тТйгогу5 Рго Аго бій б1У сб1п туг А5п о 5ег 290 295 300
Тиг отуг Агуд уаї Ма! Зег Маії Ге тТигомаї їей нів сп д5р тер Геч 305 310 315 320
Ап сту туз ЄТи туго гуз Суз Гу Ма! бек А5п Муз АТа ем Рго діа 325 330 335
Рго ї1іе с1и їуз Тіг ї1їе 5ег гу5 Аїа ух сТ1у сіп РгОо Агу си РГгО 340 345 350 сІп Уа! тує тигогец РгОо Рго 5ег Агд Ар бій Тен Тс оїм5 А5п с1п 355 360 365 уаї б5егіез) тик Суз Тен ма! ї1уз Фіу Рпв Туг рго бег А5р Те діа 370 375 380 маї с1ц тгр сії бег д5п сіу сбіп Вго сі д5п Абп тус су5 Тае тс 385 390 395 400
Рго Рго маї Сей Ар 5ег д5р сІу бег Рпе Ре Гец Туг бек 1у5 1 ей 405 410 415
Тег о Маї Аброгух5 5ег алго Тер біп сп с1у дп маї! РАє 5ег Суб 5ег
420 425 430 ма1! мес ніз сі Аїа Гец Ні Азп Ні Туг Тиг о сіп губ 5ег Геу 5есг 435 440 445
Ге бек Рго сіу Гуз 450 «210» 42 «2115 450 «2122 РЕТ «213» Ното варівепі -400»5 42 сіи ма!ї біп сцени ма! сі 5ег б1у с1у сіу Ге маї с1п Рго їу с1у ї 5 10 15 бег Гей Ага бе бег Суз АТа АТа бег сіу Ре Тіг Гей Агуд бег тТуг
Фег Мет доп Тгр ма! Аго сіп АТа Рго сіу Суз сту ге си Тгр маї бе Туг І1е бек АгЯд б5ег о бег ні тпг Ої1е РбБе туг АТа Ар 5ег Уа! 60 цу С1у Аг Ре тТіг о ІТе бег Агуд Ад5р Ап АТа Гуз АЗп бег Гей туг 65 70 75 60
Сей сп мес А5р 5ег гей Агу А5р сій Ар о ТБге АТа меє тус туг су» 85 90 95
АТа Адгод ма! туг б5ег 5ег сіу Тгр нНі5 ма! бЗег А5р Туг Ре д5р туг 100 105 110
Тер сту біп б1у т11е ге ма1ї тиг оУаї 5ег 5ег Аїд 5ег тТіг о гуз У 115 120 125
Рго бек ма! Рпе Рго Гец Аїа Рго Суз 5ег Агд бег ТИг бег сіи 5ег 130. 135 140
ТАге АТа АТа це сіу Суз іє маї куз А5р Туг РМе Рго СТИ Рго ма) 145 150 155 160
Те о мМаї бек Тгр доп о бег с1у АТа гей тийгоб5ег сі1у маї нів тиг РНе 165 170 175
Рго АТа ма! їеи біп б5ег о б5ег сіу їеу Туг 5ег о їеи 5ег 5ег мУаї Ма! 180 185 190
Тпе ма! Рго 5ег б5ег бег Мбец с1у Тпг Гуз Тиг оТуг тТіпг Суз дзп ма 195 200 205
АВ Ні їу5 Рго 5ег Ап ТпгогГу5 ма! А5р Гуз Агд ма! сіи бек уз 210 215 220 тТуг с1у РГо Рго Су5 Рго 5ег Суз Рго Аїа Рго с1и Ре Геи «1у «ТУ 225 230 235 240
Рго 5ег маї Ре ге Рпе Рго Рго Гуз Рго Суб А5р о ТИг огбец Мет Пе 245 250 255
5ек Ага ТНг оРгО сі Ма! тб Суб ума! Ма! Ма! Азр ма! 5ег сіп и 250 265 270
Ар Рго сбіц маї сп РВе А5п о Тгротуг ма! Ар біу маї бій маї нів 275 280 285
Ап АТа Гуз тТпгоСуз Рго Агуд бій си біп Ре Авлоб5ег ТАКО Туг Аго 290 - 295 300 ма1ї маї бег маї їеу тпгоуа! сей ні5 сТп Азр тгр о ген деп аїу Гу 305 зю 315 320 еЄїш Туг Гуз Су5 ух Ма! бег А5п о їу5 сту Гей Рго 5ег 5ег їТе СТИ 325 330 335
Гу тпгоІТе б5ег Гуз АТа Гуз С1у сіп Рго Аго си Рго сіп ма! туг 340 345 350
ТНК оСец РгОо Рго бег Сбіп сі бТу Меї тТИг Туз А5п сів Маї 5ег 1 ей 355 360 365
ТНК о Суз Гей маї ух с1у Рйе Туг Рго 5ег Ар т11е АТа маї Ми Тгр 370 375 380 сіц 5ег д5побіу сбіп Рго бі А5под5лп о Туг о Ту Тпготпк Рго Рго Ма! 385 390 395 о
Ген др 5ег дор с1у бег Ре РБе Гей Туг б5ег Агд Сей Тг ма! Азр 405 410 415
Іїух бег Агуд Тгр бЇп бій с1у А5п Ма! Ре бег Суб 5Зег ма! Меє Ні 420 425 430 с1ц АТа їец нів дзп Ні Туг Тйг сій уз Зег Гец 5ег сец бег Гец 435 440 445
Су Гуз 450 210» 43 «2112 499 «212» РКТ «213» Ното варіеп5 «400» «3 сТб Уа! сбіп ів маї сТи 5ег су сіу сС1у їеу Ма! сп Рго сіу с1У 1 5 10 15 5ег цен Агод їеи 5ег Суз АТа АТа бег бу РПе тик Ген дгд 5ег туг 5ег мек А5п Тер омаї Агу сїп АТа Рго сту гу5 сту Сей си тер ма! б5ег туг Тіе 5ег дгЯ 5ег 5ег Ні ТйгоІІе РБе тує АТа А5р 5ег маї 60
Гу СТУ Ага впе тйг ЇІТе бег Аго А5р Аб5п діа Гуз Абп о 5ег о їец туг 65 70 75 80 іїец сп меж А5р 5ег Ге Аг А5р сій Азр Тиг АТа Меє туг тук суб 85 90 95
АТа Агу маї туго б5ег б5ег сіу Тгр ніз Уа! 5ег д5р Туг Ре А5р ОтТуУг 100 105 110 тер б1Уу сіп о с1у їТе грец уа! Тиг ма! бег б5ег діа 5ег Тиг о Гу5 С1у 115 120 125
Рго 5ег о ма1 Ре Рго їец АЇа Рго Суб бег Аг 5ек Тиг 5Зег с1у С1У 130 135 140 тт АТа АТа Ге Сіу Су5 Ген Ма! Гуз А5р Туг Ріе Рго сТи Рго Ма! 145 150 155. 160
Тиг о мМаї бек Тгр А5п б5ег сіу А1а Гец Тиг о 5ег сіу ма! нів тиг Ре 165 170 175
Рго АТа Уа! їеи Сіп 5ег зег с1у Ге Туг бег сеу бег 5ег ма! маї 180 185 190
ТвгомМаї Рго 5ег б5ег 5ег гец сіу тпгосіп тйг тує тпг Суб Абп о Маї 195 200 205
А5поНіб Гуз Рго 5ег Абп ТИгоїуз Ма! Азр Гуз Агуд Уа! СТИ Гей Гу 210 215 220
Тгорсо їец сіу дер ТИготпг о Ні ТвгоСуз Рго Аго Су Рго сій РгО 225 230 235 240
Муз 5ек Суб А5р о тВгоРГО РГО РгГО Су Рго Агу Суб РГО би РгО Гу 245 250 255 зег Суб5 Азр ТЕБг о Рго Рго Рго Су5 Рго Агд Суз РГО би Рго 1уб5 5ег 260 265 270 сСу5 Ад5р тийг о Рго Рго Рго Суб Рго Агу Суб Рго АЇа Рго СТИ їей ей 275 2850 285 с1у с1у рРго бег Уа! РНе Ге Ре Рго Рго їу5 Рго Гуз Азр Тиг Гец 290 295 300
Мет І1е бег дгд ТигоРго сбіи Уаї Тпг оСуз ма! Уа! уаї А5р ма! бег 305 310 315 320
Ніз бій А5р Рго сій Маї сп Рбе цу Тгр туго ма! Азр Ту ма! Ти 325 330 335 маї нНіз А5п о АТа Гуз тТигогуз Рго Агд сій СТ бІп РВе Аби 5ег тег 340 345 350
РпєЄ Адго ма! ма! б5ег Ма! Сей тк Уа! Се Ні сіп А5р Тир Гей деп 355 360 365 с1у уз СТИ Туг Гуз Суз Гуз Ма! бег д5п Гуз Аїа ей Рго Аїа РгО 370 375 380
Те сій Суб тпготТе 5ег Гуз тТйгогГуз с1у бій Рго Агод си Рго Сс1п 385 390 з95 400 а! Туг ТПпг Сей Рго Рго бек Агд сі сі Меж Тпг Оу Азп сп ма! 405 410 415 бек Гей типг о сСу5 ен маї Гуз сіу Ріе туг Рго 5ег А5р І1е діа ма! 420 425 430 сій Тер о сбіц бегобег аі1у іп Рго єї А5п Ап оТуг Аби ТВгОтиго РКО 435 440 445
Рго Мет еп Ар б5ег Азр сТу 5ег Ре РНе Гец Туг б5ег їу5 Гей ТНг
«50 455 4бо маї Азр губ зег Агуд Тир о біп сій СТу деп ІїТе Ре 5ег Су 5ег Ма! 465 470 475 480 мех нів сти АТа Ге ніб д5п Аг Ре Тег осІп уз 5ег ї1еи бек Гей 485 дО 495 зег Рго 1У «21055. 44 «2115 214 «2122 РКЕТ «213». Ното заріепе «400» 44 Й діа чІТе спо їец тТвБгобІп бег Ро бег 5ег геу б5ег АТа бег маї СТУ 1 5 10 15 дер Агу ма! тТНг о ІТе тіг осСуз Аго АТа 5ег біп с1у їТе 5ег 5ег АТа єн АТа Тгр Туг ап сп гу Рго сту їу5 АТа Рго Гуз Ге Ге Те 3» 40 45 туг А5р АТа 5ег бег Сей сій 5ег біу ма! Рго 5ег до Ре 5ег Лу 60 5ег сіу 5ег Ту тіПг о А5р РПпе ТБгогец Тк от1іе 5ег б5ег іви сіп Рго 65 70 75 80
СТИ АБр Ре АТа тТпг оТуг туго Суз біп біл РВе Або 5ег о туг рРго Гей 85 50 95
ТК оРНе сТу с1у сТу тигогуз маї сТи 2пТе Гу5 Аго тиго ма! АТа АТа 100 105 по
Рго бег уаї Рпе І1е Рйе Рго Рго 5ег Азр сі сіп ге губ бег лу 115 120 125
Тйг о діа бег Уа! уаї Суз гей еп Ад5п Ап Ре Туг Рго АгГЯ сі Аїа 130 135 140 цу ма! сп тер Гуз маї А5р доп АТа Гей сій 5ег сту дп 5ег Сп 145 150 155 160 січ б5егома! Тиг Осій сп д5р б5ег уз Азр 5ег Тиг Туг бег Гей 5ег 165 170 175
Бег тиг Сем тпгогец бег 1уб5 Аа А5р о Туг сій Гуз Ніз Гуз маї Ттуг 180 185 190
АЇа сСуз си уаї тргонів сп сіу бе чего бег Рго ма! тиг огуб 5ег 195 200 205
Ре А5п дго Фу сіц су 210 «210» 45 «2115» 5
«2122 РКТ «213» Ното взарігп5 «400» 45
Рпе Рйе сім тпг гу 1 5 «210» 46 -115 9 «2122 РЕТ «213» Ното заріеп5 «400» 46 зег баг б5ег Ні рго Іе Ре ні Ага «2105 47 «115 5 «212» РЕТ «213» Ното зарієп5 , «А0О0» 47 нів Тер А5п о 5еготуг 1 5 «2105 48 «211» 12 «212» РЕТ «213» Ното зарієпв «400» 48
А5зп о 5ег ма! сі Гуз сіп туг Ре Ре Си Тиг Гуз 1 5 10 «210» 49 «2115 7 «2122 РКЕТ «213» Ното варієпв «А00» 49 зег Агу вуз Аїа Уа! Ага Ага «2105 50 «115 5 «212» РЕТ «213» Ното заріеп5 «400» 50 сти Уа! мех ма! Ге «210» 51 «1» 23 «212» РЕТ «213» Ното заріеєп5 «400» 51 зег век 5ег нів рго Те РПе Ні5 АгО ву сі Рпе 5ег ма! су; А5р 5ег ма! 5ег маї Тер ма! сіу Ар Гуз «2105 52 «211» 20 «212» РКтТ «213» Ното варіепе «400» 52 сіп АТа АТа тгр Агу Ре ІТе Аго те Азр тИг Аза Суз Ма! Сув ма! 1 5 ик) 15
Гей бег Агд ув 20 «2105 53 2112 14 212» РЕТ «213» Ното зарієпе «4005 53 5ег бБег нів Рго че Рне Ні Агод С1у сій Ре 5еї Уа! Су ї 5 10 ок210» 54 «2117 8 ! | г. . «212» РЕВТ «213» Ното заріепе | ї «4005 54 ' бег бег Ні5 ргОо пе Рпе Ні Ага «2105 55 «2112 6 І «212» РЕТ І «213» Ното 5аріеєп5 : «4005 55
СТУ бу РНе 5ег Уа! су | | : 1 р: «2105 56 | ! «211» 15 «212» РВТ що «213» Ното варіепе «4005 56 . тег 5ег 5ег нів во т1е РНе нів Ага ФУ сі РНе 5ег ма ту : «2105 57 «211» 16 «212» РЕТ «213» Ното варіепь . «або» 57 й пе Ре нів АгО пу сТш Рпе 5ег Маї іа Ар бек Уа! 5ег Уа! Суз «2105. 58 «1» 16 шо . «212» РЕТ м
«213». Ното заріеп5 «400» 58 сій Рпе бег уаї АТа д5р 5ег ма! 5ег маї Тер о маї с1у А5р Гу сув 1 5 40 15 «2105 59 . «2112 16 «212» РЕТ «213» Ното варієп5 «4005 59 - дер б5ег уаї бег Уа! Тер ма! С1У А5рогуб5 Тіпг о тиг Аза трг о Абросуб 1 5 10 15 «210» 60 211» 16 «2122» РЕТ й «213». Ното варієпе «4005 60 І
Тер маї сіу д5р їуз Тиг о тпг Аза Тпг Азр ї11е Гуз С1у їуз сти Суб 1 5 10 15 «210». 61 «211» 16 «212» РКТ «213» Ното зарієеп5 «4005 61 ці Те АТа тиг а5р те гуз су Гуз сі чаї мет маї гГец о1У сСу5 «2105 62 «2112 15 «212» РЕТ «213» Ното варієпь «400» 62 : тіе уз с1у Гуз си Маї мет маї сем с1у си Ууаї Ап їїе д5п 1 5 10 15
«210» 63
«2112 16
«212» РЕТ
«213» Ното заріепе
«4005 63 ма! мес ма! бен сТ1у сі ма! Аєп ІТе д5п доп бег Уа! РПе їу5 Суб 1 5 10 15 «210» 64
«211» 16
«212» РЕТ
«213» Ното зарієпе
«4005 64 сіи ма! доп тТе А5п Аб5п о б5ег о ма! Ре гу5 с)іп Туг Рне РПпе С1и Суз 1 5 10 15 «210» 65
«211» 16
«2122 РВЕТ
«213». Ното заріепь
«4005 65 деп бег маї Рпе рух біп Туг Ріе Ре сі Тіг оїу5 АТа Аг А5р Суз 1 5 10 15 «210» 66
«211» 16
«2122 РКЕТ
«213» Ното 5аріеп5
«400» 66 віп туг РНе рпе віч тТиг Гуз АТа Ага пор РГО Ап РгГО ма пер сСу5 «2105 67
-211»5 16
«212» РЕТ
«213» Ното 5арієп5
«4005 67
ТЕГ оСу5 АТа Аго А5роРГО допо Рго Маї Ар бег б1у АТа Аг А5р су 1 5 0 15 «2105 68 -9115 16 «2122 РКТ «213» Ното зарієпе «400» 68
РгОо дп о РГо Маї Ар бег С1у ліа Аго А5Зр їТе Ар 5ег гу Ні Су 1 3 10 15 «2105. 69 «211» 15 «212» РЕТ «213» Ното варіеєп5 «4005 69 ес су Аа Аго вер Іїе Авр 5ег і уз щі5 Тгр А5п Зег туг су «2105 70 «211» 16 -2122 0 РКЕТ «213» Ното заріеп5 «4005 70 пе А5р 5ег Гу нів тер дп об5еготуг ма те отнг тег нів та Су «210» 71 211» 16 «212» РЕТ «213». Ното зарієпе «4005 71 тгв дзп Зег туг ва Твготвготвге нів це Ре ма! гу Аа во суз
«2105 72 «2115 16 «212» РЕТ «213» Ното варієпв «4005 72
Тиготвготиг о ніє твгоРНе уаї ух АТа їец Твг Мет Ад5р су Гу Су 1 5 10 15 «2102 73 «211» 16 «212» РЕТ «213» Ното взаріеп5 «-4005 73 рРіе Маї їу5 Аїа іє Тиг мес Ар сту 1у5 біп АТа АТа Тгр Ага Суз 4 5 10 15 «2105 74 «211» 16 «212» РЕТ «213» Ното зарігп5 «400» 74
Тит Мет А5р У су оп АТа АТа тгр Аг РНе т1Те Ага Пе Лео су «2105 75 «2115 15 «212» РЕТ «213» Ното зарієпе «4005 75
Сіп АдТа АТа Тгр Аго ве тіє Аг ІТе Азр Трг АТа АТа ма! Су 1 5 10 15 «210» 76 «211» 16 «212» РЕТ «213» Ното заріепе
«00» 75
Рпе Іе Аг ІТе А5р Тиг АТа АТа мМаї Аа ма! Гей 5ег дго Гу Суб 1 5 10 15 «210.77 «115 16 «2122 РЕТ «213» Ното варієпз «400» 77
Твг о АТа АТа маї Ата ма1ї їен 5ег АГ 1їу5 АТа ма! АгЯ Аг АТа сСуз 1 5 10 15 «2105 78 «2112 15 «212» РЕТ «213» Ното варієпв «400» 78
Суб Аїа Аза ма! Ата маї Гей бек Аго 1у5 Аза Ма! Ак лга Аа 1 5 10 15 «2105 79 «2112 125 «212» РЕТ «213» Ното варієп «4005 Щ 79 сі ма! сіп ей Уа! сій б5ег сіу Аїа сіи Ма! Гу5 Суб РгГо су сш ї 2 10 15 5екоїєеи їу5 І1е 5ег Суз уз сіу б5ег сТу Туг А5п Ре тег тиг Отуг 23 кВ) тгр пе сту тгр ма! Аго сіп Меї Рго с1у Гуз СТУ Те сТи Тгр мех сТ1у же їТе туг Рго сіу А5р бег Азр тТаг огуз туго бег Рго 5ег РНе бо б1п сту сіп ма! тік ХТе б5ег АТа д5р Гуз бек ІТе 5ег тис АТа туг 65 70 75 80 бе сТп Тгр б5ег бег цей їу5 АТа 5ег д5р ТПг АТа Меї Туг Туг Суб 85 90 95
Аа дго Ап туго тТуг Ту бег СТу тйг туго туг туг туг туг лу мес
100 105 110
Ап ма! Ттгр С1у сіп сТу тБготйг ма! тпго Уа! 5ег 5ег 115 120 125 «2105. 80 «211» 107 «212» РЕТ «213» Ното заріеп «А00» 80
Азр ї1е сіп меє ТНгосіп 5ег Рго 5ег б5ег маї 5ег Аїа 5ег Уаї сіу 1 5 10 15
Азр Агд ма! тпгохт1іе тіг о сСуз Аго Аїа 5ег сбіп сіу І11е 5ег Пе тгр
Сей АТа тгр туго сіп Ні уз Рго Ссіу Гуз АТа Рго Гуз ей Се Пе
Туг Аїа Аїа 5ег 5ег Ге сбіп б5ег СТу Ма! Рго 5ег Аг Рпе 5ег С1У 60
Зег сІу 5ег с1у Тийг дор Ре ТЕГ оГеу Тк ІТе 5ег 5ег їєи сіп Рго 65 70 75 80 си Ар Рпе Аїа тиготТуг туго Суб біп біп Аа А5п о бег Рпе Рго Тгр 85 90 95
ТВг Ре Ту с1п сту тТйгогуз маї си Ше Гуз 100 105 -2105 81 21315 127 «212» РЕТ «213». Ното варі еп «400» 81 сі ма! сіп їеи ма! 610 бег сіу сту с1у ме ма! сіп Рго с1Уу Ага 1 5 10 15 5ег ге Аго тей бБег Суз ТПг АТа б5ег с1у РПе тпг РПе сій А5р туг 20 25 30
АЗа мет ніх тгр ма! Аго сп АТа Рго сіу уз С1Уу Ге си тТгр ма! 35 40 45 бег сіу І1е зег тур Аби Агод зіу Ії11е І1е Ту туг АТа А5р 5ег Уаї 50 55 60 уз б1у Ага Ре тис ма! 5ег Ага Аб5р А5п АТа Гуз А5лоб5ег о гец туг 65 З 70 75 80 їеи біп Меї дп Бе Се Ага АТа си ФОР Те АТа їеи туго туг Су
АЗа ув сти сіу туг туг с1у 5ег с1у Аго Рго Є1у туг Ре туг туг о 105 110 ма! Меж д5р ма! Тгр с1у сіп сіу тпготВгома! тпгоуаї 5ег 5ег 115 120 125 -2105 82 «2112 108 «212» РЕТ «213» Ното варігп «400» 82 сій піе ма! се Тігосіп бек Рго сіу тіг ем б5ег Сец бег Рго с1у 1 5 10 15 сІ0 Агу АТа тигогеу 5ег Суб Аг АТа б5ег сіп 5ег умаії 5ег 5ег су
Рпе Гей Аїа Ттгр Ре СсТп с1п гі Рго сіу сій АТа Рго АгЯ Сей Гецч 4 45 те туг С1у АТа бег б5ег Аг АТа тпг АТа 11е Рго Адб5р Аг РНе 5ег бо с1у б5ег с1у 5ег сіу ТіПг одер Ре ТпгоСеи тийг о ї1е 5ег Ага гей а 65 70 75 80
Рго сі А5р Ре АТа ма! тТуг туг Суб сіп біп туг с1у 5ег 5ег Рго 85 90 95 туго тйг Ре с1у сіп сіу тиг Гуз Ге сі ше Гуз 100 105 «2105 83 «2112 127 «212» РЕТ «213» Ното заріеп «А0О0» 83 бін ма! біп їец ма! си б5ег сту сіу с1у їеи Ма! сбіп Рго с1у Ага ї з 10 15 5зег сей Аго бе 5ег Суз АТа АТа бег сіу Рпе І1е РМНе Ад5р д5р туг 20 25 30
АТа мет ні Тгр ма! Аг сіп Аїа рРго сі1у їу5 Фу гей си Тгр ма! 35 40 45 зег б1у І1е 5ег Тер Ази Ага СІУу ІТе їіе сТ1у туг АТа сТ1у 5ег Уа! 50 55 59 бу с1у Аго Ре тиг о ІТе 5ег Агу Ар А5п АТа гу Ад5п 5ег гГеу тТуг 55 70 75 80 їен сп Меї деп Зег Те Аго Аїа сти дер ТИг о АТа їеи Туг туго Суз 0 95 уаї гу сти СТу туго туг СТу бег сіу Агуд Рго С1у туг Ре Туг Туг 100 у 105 у 110 уаї Ме др ма! Тгр сбіу сій сту тпйг Тйг ма! тег омаї 5ег 5ег 115 120 125 «2105 84 «211» 108 -2122 РЕТ «213» Ното заріеп «А0О0» 84 сі же Маї гей тігосіп 5егоРго с1у тТигогеу 5егосбен б5ег Рго Фу їі З 10 15
СТИ Аг АТа твйгоГеу б5ег Суб Аг АТа бег сіп 5ег Ма! б5ег бег 5ег 23 30
Туг Ген АТа Тгр Туг сіп сіп Гуз Рго С1у сіп АТа Рго Агд Геу Сей о) 45
І1е туг ма! АТа б5ег 5ег Аг Аїа тйг о сіу ї1е Рго А5р Агуд Рпе 5ег 60 с1у бег СТу бег сТу Тпг Ар Ре Тг о Ге тТиг їТе 5ег Агд Гей сін 65 70 75 80
Рго бій А5р Рйе АТа ма! Туг туго суб біп сій Туг сТ1у б5ег 5ек рго 85 90 95
Туг ТігоРйе сСТу сіп сТ1у Тпг о Су5 Геу сію ІТе Гуз 100 105 «210» 85 «2115 121 «2122 РКТ «2132 Ното заріеп «4005» 85 сій ма! бій ву маї сі б5ег сіу сіу с1у їеи маї сп Рго СТУ дг9 1 5 10 15 5ег сем Ага Ге бег Ссуз АТа АТа 5ег сіу Рпе ІТе РМе Авр Ар Ттуг 20 25 30
АТа Мет ніх Тгр Ма! Агуд сп АТа Рго С1у губ СЛу тей си тгр ма! 35 40 45 б5ег с1у ІїТе тпг Ттр Азп бег Є1у І1е еп су туг Аїа Ар 5ег Ма! 50 55 60 іїуз 61у Аг Рпе ТПг отіе 5ег Аго Ар д5р АТа цу А5пП 5ег Тен туг 65 70 75 80 рей сіп Мег А5п баг їец дго АТа сТи Ар Тйг діа гео туго туг Су
85 90 95
АТа пуб сти сТц сТу 5ег сТу Аг Туг Туг А5п Ре А5р Туг тгр СУ 100 105 І 110 біІп о1у Тигогеи ма! твгома! бег 5ег 115 120 -2105 86 «2115 107 «2122 РЕТ «213» Ното взарігеп «400» 856 сі ІТе ма! цей ТтТйгобїп 5ег Рго сіу ТПг Ге бек гей 5ег Рго сТу 1 5 10 15 оіц Ага АТа тНПгоїей бег о Суз Агу АЗа 5ег біп 5ег ма! 5ег бег 5ег
Зо тТук Ге АТа тер туг сіп біп уз рго сім бій АТа рРгОо Аг Беу геу
ІІе туг с1у АТа 5ег 5ег Аго АТа тик с1у І1е рРго А5р Агу РНе 5ег 60 с1у б5ег б1у 5ег сТІу Типг Ар Ре тТИг оГеи тйг ІТе 5ег Агд ви СТИ 65 70 75 во
Рго аїц Азр Ре АТа ма! туг Туг Суб5 Сіп сіп туг С1у 5ег 5ег туг 85 90 95
ТигоРпе сіу сіп сіу птйг Гуз їец сій Іїе Гуз 100 105 к «210» 87 «211» 124 «2122 РЕТ «213» Ното в5арієп «400» 87 сти маї бій ге маї сій бек Ту с1у с1у маї маї Аг Рго с1у сС1у 1 5 10 15 бег Ген Агод Пец бек Суб5 Аїа АТа 5ег сту Рйе ТиИг рРНе А5р Аз5р туг 20 25 30 с1у Меї Ап Тгр ма! Агуд сіп АТа Рго с1у Цу5 Є1у геи си Тер маї 35 40 45 5ег Ар ІТе Ап Тер Ап с1у с1у бег тіпг сТу туг АТа А5р 5ег ма! 50 55 60
Гуз с1у АК Ре тТиг о І1е бег Аг А5р А5п АТа губ Абп бег Гей Ттуг 65 70 75 80 еп біп Меб Абп бек гей Аг Аа би А5р тТиг АТа ге Туг туг Су 85 90 95
АТа дга сій сіп Тгроїец д5р о РГо туго Туг туго Туг туго с1у меє А5р 100 105 110 уа!ї Тгр с1у стіп б1у тТпг отігома! тТйг ма! 5ег 5ег 115 120 -2105 88 «211» 107 «2122» РКЕТ «213» Ното варіеп «4005 88
Ар ІЛе сп Меї ТНгосїп 5ег Рго б5ег 5ег Тен бег АТа 5ег Уа! бу 1 5 10 15
АБр Аго ма! Ти оїт1е тпгоСуз Агу АТа 5ег біп о1у 11е 5ег 5ег Тер зо бе АТа Тгр туг сій сіп губ Рго 610 Гуз АТа Рго Гуз 5ег гей Ше тТук АТа АТа бек б5ег те сіп 5ег сту Ма! Рго 5ег Ага РПе 5ег су 60 5ег с1у б5ег сТу тіг дор Рпе Типгогец тйг о т1іе б5ег б5ег Гец сп Рго 65 70 75 80
СТИ А5р Ре АТа тіг о туго туго Суз б1іп біп туг Аб5п Зег Туг Рго Тгр 85 90 95 тигоРае с1у сп сту тігогуз маї сту ІЗе Гуз 100 105 «2105 89 -2112 107 «212» РКТ «213» Ното варіеп «400» 89 ст ТІе Маї Кеш тТиг о біп бег Рго Аа ТИгоГец 5ег о Гец б5ег Рго аТу 1 5 их) 15 сій Агуд АТа Тс гей бег Суб Агд АдТа бег сіп сіу маї 5ег 5ег туг 20 25 30 цеч АТа Тгр туго сій сп губ Рго сТу с1п АТа РгОо Аг Гей еп Те 35 40 45 туг Азр АТа 5ег д5п Аг А1а тіг с1у І11е Рго АТа Аг Рпе 5ег сТу 50 55 бо зег 1у Рго сіу тп Ар Ре ТНг Ген тиг о їТе бег бек о тец си РгО 65 70 75 50 сій А5р Рпе А)а ма! туг Туг Сух біп сп дга 5ег д5п тер нів Агу 85 90 95 тйг оре бтіу сіп сіу ті 1їу5 маї сі їТе Гу 100 105 «2105 90 «211» 108 -2122 РЕТ «213» Ното зарієеп «400» 90 бін їіе ма! їєцй тТиг сій бег о Рго сіу тйг Сен 5ег їв 5ег Рго су 1 5 10 15 бій АК Аа тег оїеи 5ег Су5 Аг АЇа 5ег біп 5ег Уа! 5ег 5ег 5ег тук Ттеи Аїа тер туг біп бІп Гуз Рго сТу сіп АТа Рго Агу Ген гей
Ії туг с1у діа 5ег 5ег лагу Аїа тпг о с1іу І1Те Рго А5р Аго Ре 5ег 60 сту бег с1у 5ег с1у тиг соту ре тигоїен тТіг Те 5ег 5ег Гец би 65 70 75 Іо)
Рго 610 А5р Рйе Аїа уа1ї туг туг Су5 Сіп сіп Туг А5ЗпП о 5ег Туг РгО 85 50 95
Тер ти" оРпе сіу сп сТу тик огуз ма! Ти ще Су 100 105 «2105 91 «2112 107 «212» РКЕТ «213» Ното варіеп «-4005» 91 си те Уа! їеи тис сій 5ек о Рго діа Те бе 5ег Ге б5ег Рго лу 1 5 10 15 о1Ц Аго АТа тигогеи б5ег Суз АГЯ Аа бег сіп 5ег о маії бек 5ег туг 20 25 30 їез АТа тер отуг с1п с1п Гуз рго с«1у б1п Аа РгГО Аг їец їеи пе 35 40 45 тус Ад5р Аа бБег А5п Аго АТа Тпг сіу ї1Те Рго АТа Аго Рпе 5ег С1У 50 55 60 зег сіу 5ег с1у ТИ А5р Ре ТИг о Ме Тиг о дТіе 5ег бек Гей си рРго 65 70 75 80 сі А5р Ре АТа ма! Туг туг Су5 сіп сіп Аго 5ег Аб5й тир Рго тгр
85 90 95 тТпгоРйе сіу сбіп сТу ТБг губ ма! си ІЇе Гу 100 105 -2105 92 -211»5 5 «2122 РЕТ «213» Ното варієп «400» 92
Те Туг тгр ше ву «210» 93 «211» 17 -2122 РЕТ «213» Ношто варіеп «400» 93 пе те туг Рго ФУ Ар 5ег Ар піг що туг 5ег рго 5ег ве сп с1у «210» 94 «211» 16 «212» РЕТ «213» Ното зарієп «00» 94 шій тТуг туг Фу рег с1у тиг туго туг туг Туг туг СТу Мет Ап Уа! «2102 95 -2115 11 «2122 РЕТ «213» Ното варієп «4005 95 пго Аа зег сіп У ї1іе зег ІТе Тгр ви Аїа
«2105 96 «2115 7 «212» РКЕТ «213» Ното заріеп «400» 96
АТа А1а б5ег 5ег Гей сіп Ббег 1 5 «2105 97 «2115 9 «212» РЕТ «213» Ното варієп «4005 97 сп с1п Аза доп рес Рпе Рго тгр пг -2105. 98 2115 5 «212» РЕТ «2132 Ното варієп «4005 98 дер тус АТа Мех нів 2105 99 «115 17 «2122 РЕТ -213» Ното заріеп «4005» 99 сС1у те 5ег тгр доп Агд с1іу тІе ІТе сіу туг Аа д5р 5есг маї Гуз 1 5 10 15 су «210» 100 «211» 17 «2122» РЕТ
«213» Ното варієп «400» 100 су туго тук бу 5ег біу Ага Рго б1у Туг Ре Туг туг Уа! Меї дор 1 з 10 15 ма! «2105 101 «2115 12 «212» РЕТ «213» Ното 5арігп «4005 101
АгЯ АТа бег сбіп б5ег ма! бег б5ег сС1у РНе гей Аа 1 5 10 «210» 102 «2115 7 «2122 РЕТ «213» Ното зарієп «А00» 102 пу АТїа 5ег бег ага АТа пт «2105 103 «2115 9 «212» РЕТ «213» Ното 5арієп «4005» 103 сій сп Туг сту бег б5ег Рго туг пПіг 1 З «2105. 104 «-11» 5 «2122 РЕТ «213». Ното 5арієп
«400» 104 дзр туг Аїа Меї Ні
1 З
«2105 105
«2115 17
«212» РЕТ
«213» Ното варієп
«4005 105 с1у ІТе 5ег Тгр А5п Аго біу ї11е І11е сТу тТуг АТа сіу бег маї Гу 1 5 10 15 су .
«210» 106
«211» 17
«212» РЕТ
«213» Ното 5арієп
«400» 106 су Туг туг пу рег СТУ Ага Рго С1У Щі Ре Туг Туг ма! пес Азр ма!
«2105 107
«2115 12
«2122 РЕТ
«213» Ното зарієп
«400» 107 лго АТа 5ег ЄЇп Бек ма! 5ег 5ег 5ег ту Сец АТа
«2105 108 .
«2115 7
«212» РЕТ
«213» Ното варієп
«400» 108 уа! АТа бег 5ег Ага АТа тпг
1 5
«210» 109
«2115 9
«212» РЕТ
«213» Ното 5арієп
«400» 109 ст сп туг ФУ ег 5Зег Рго Туг Тпг
«2105 110
«2112 5
«212» РЕТ
«213» Ното варієп
«1005 110 ав тук АТа Мех ні 5
«2105 11
«2115 17
«212» РЕТ
«213» Ното варіеп
«4005 111 с1у тліє тТиг Тгр Азп о б5ег Ту Т1е їеи СсСТу туг АТа дер 5ег о ма1ї Гуз 1 5 10 15 су
«2105 112
«2115 1
«212» РЕТ
«213» Ното варієп
«4005 112 сі сіу б5ег Є1у Агд Туг Туг А5п РПе Ар тТуг 1 5 КТ) «2105 113
«2112 12 «2122 РЕТ «213» Ното варієп «А00» 113
Аг АТа 5ег сп Бег Уаї бег 5ег 5ег Ту Гей АТа «2105 114 «1 7 «2122 РКТ «213» Ното заріеп «400» 114 су АТа 5ег 5ег ага Аа тиг «210» 115 «2115 8 «2122 РЕТ «213» Ното зарігп «4005 115 сп сп тукг пу рег 5ег о туг Тег «2105 116 «21» 5 «212» РКТ «213» Ното варієп «1005 16 пор Туг ЄсУ мех деп «2105 117 «211» 17 «2122 РКТ «213» Ното зарієп
«А005 117 , дер т1е Ап ТгроА5п о біу С1у бег Тйг сту туг діа Ар 5ег ма! Гуз 1 З 10 15
У
«2105 118 «211» 15 «2122 РЕТ «213» Ното зарієп «400» 118 сі сіп тгроїеи д5р о Рго туго Тує Туг туго туго оТу мес Азр Ма! 4 5 0 15 «210» 119 -2115 11 «212» РЕТ «213» Ното зарієеп «4005 119
Аго АЗа б5ег сіп с1у Іїе 5ег 5ег Тгр їеи АТа 1 5 10 2105 120 «2115 7 «212» РКТ «2135 Ното 5арієп «-4005 120 ма ма б5ег 5ег їеу сіп 5ег «210» 121 -2115 9 «21225 РЕТ «213». Ното заріеп «400» 121 ств сп туг деп рег туг Рго тер тре
«2105 122 «211» 11 «212» РЕТ «213» Ното варієп «А0О» 122
Аг А1їа бег сіп сТу уаї 5ег 5ег Тук Те Аїа 1 5 10 «2105 123 «15 7 «212» РЕТ «213» Ното варієп «400» 123 рій Аїа 5ег доп его Аїа пг «2105 124 «2115 9 «212» РЕТ «213» Ното зарієп «4005 124 вів сіа Агд 5ег доп тер ні дгда тиг «2105 125 «211» 12 «2122» РЕТ «213» Ното зарієп «4005 125 дго АЗа 5ег сп Зег Уаї б5ег 5ег 5ег ЦП Се АТа «2105 126 «115 7 «2122 РЕТ «213» Ното зарієп
«400» 126 с1у Аа 5ег 5ег вге Аїа тпиг 1 «2105 127 «2115 9 «212» РЕТ «213» Ното зарієп «400» 127 сіп аїй туг Ап Зег Тут Рго тТгротег 1 «210» 128 «2115 11 «212» РЕТ «213» Ното варієп «400» 128
Аг Аа бег о Сіп б5ег ма! б5ег бег Туг Те Аїа 1 2 10 «210» 129 «115 7 «2122 РЕТ «213» Ното зарієп «400» 129
Ар АТа бег Ап Ага АТа тег 1 5 «2105 130 «2115 9 «212» РЕТ «213» Ното варігеп «4005 130 сп сІп Аго бег Ап Тер Рго тер отг «210» 131
«2122 РКЕТ «213». Ното зарієп «4005 131 сн ІТе уаї Ге тТпгосіп б5ег Рго СТу Трг Се бег гей б5ег Рго У 1 5 10 15 сти Агуд АТа Твйгогенй бег о Суз Аг9 АТа 5ег біп б5ег ма! 5ег 5ег 5ег туг Ген АТа тер туг Єїл сій уз Рго с1у сп АТа РгО Агу Се Геи 39 40 45 тІ1їе тує С1у АТа бег 5ег Аг діа ТНг о с1у т1е Рго А5р Агд Рпе 5ег 60 с1у бег с1у 5ег Ссіу ТНг Азр Рпе Тіг оїеи Тиг їТе 5ег Агод Гей си 65 70 75 80
Рго сТи А5р Ре Аїя Ммаї туго туг Суб біп соЇп туг с1у б5ег 5ег РГО 85 90 93 туг тБг Ре с1у сТп сту тигоїу5 Се сти Те Гуз 100 105 «2105 132 «115 11 «212» РКЕТ «213» Ното варієп «400» 132 пгя Аа б5ег сіп ву Уаї 5ег 5ег туг ен А1а «210» 133 «2112 7 «212» РЕТ -213» Ното взарієп «4005 133 пу АТа 5ег 5ег аго АТа тик «2105 134 2115 9 «212» РЕТ :
«213» Ното варієп «00» 134 сіп біп туг сіу 5ег 5ег Рго Туг ТаПг и 5 -2105 135 «211» 120 -2122 РЕТ «2132 Ното варієп «400» 135 5ег б5ег о5ег Ні Рго че Рпе Ні5 Аго С1у сі Рійе 5ег Ма! Су5 А5р 1 5 10 15 5ег ма! 5ег ма! тгр ма! С1у А5р Гуз Тиг тТийг АТа Тіг о Азр Ї1е Гуз с1у Суз сти ма! мет ма! їєи сТу сі мМаї А5п ІТе Абп Ап 5ег маї
Ре їу5 біп Туг Ре РПе сі тТйгогу5 Суз АгО А5р Рго Ап Рго ма! 6о0
Азр 5ег б1у Суб Агд сіу гІе д5р б5ег губ ні тер А5зп 5ег туг су 65 у З 70 75 80
Твготйготвг нів тег оРНе Уаї Гуз АТа Гео Тр Мет А5р су Гу5 сп 85 90 95
Аїа АТа Тгр аго Ре ї1Те Ага І11е А5р тТіг Аїа Су ма! Суб уаї Кей 100 105 ник)
Бег Аг 1їу5 Аїа ма! Ага Ага АТа 115 120 «210» 136 «2112 120 «212» РКЕТ «2135 тив тизеши5 «4005 136 5ег бег Те Ні Рго Ма! Ре Ні Мет сіу біи Ре 5ег маї Суб А5р 1 5 10 15 бЗег ма! б5ег маї Тгр ма! С1у Ад5р Бу Трготк АТа твпг др пе Гуз 20 2 30
Ту Гуз сТи Ма! Тиг Ома! Геу АТа сі мМаї А5п т1е Абп А5п бег ма! 35 40 45
Ре вго сіп туг Рпе РНе він Тг Гуз сСуз Аго дій 5ег А5п Рго Ма!
сіи бег сіу Суз дгу с1у че Ар бек їух Ні Тгр дбп зег Туг суб 65 70 75 80
Тег отве о тве оніб тйгоРПе маї Гуз АТа Те ТнготТвг о Абрости Гуз сій 85 90 95
АТа АТа тТгр Аго Ре ІТе Агуд їТе А5р Тіг АТа Су Ма! Су5 Маї Гей 100 105 о 5аг Агу ух Аа ТПг го Аг9 Аїа 115 120 «2105 137 «211» 126 «2122 РКТ «213» Ното зарієп «400» 137 ніх 5Зег д5р Рго АТа Агуд Аго Ні бег А5р Рго АТа Агд Аго Ту СТИ 1 5 10 15 цей бег маї Суз Ар б5ег ІТе 5ег Сіуц Тер маї Ттйг АТа АТа дор Гу
Туз тПг оАТа ма! др Меї б5ег о сіу с1іу тік ма1ї тТрг Ома! Ге си Гуз маі Рго Маї бЗег губ сіу сіп їеи губ біп Туг Рйе тТуг с1и Тпг Гуз 60 був А5поРго Мет с1у туг тиг ух бій сТу Су5 Аг о1у ІЇЄ А5р (Гуз 65 70 75 80
Агу ніз Тер Аби 5егобіп Суб Агуо Так тТагобіп о 5ег тує маї Ага АТа 85 90 95 бе тіг о Мес А5р 5ег 1у5 їу5 Аго чі с1у Тгр Аг Ре 11є Адг9 Пе 100 105 10
Ар Тиг бег Су ма! Сух ТгоГеу тк їТе Гуз Аго сту Ага 115 120 125 «2105 138 «211» 119 «2122 РЕТ «213» Ното зарієеп «400» 138 туг АТа сіи ніх ух 5ег нів Агуд б1у сі тує 5ег уаї Суб5 Ар 5ег 1 5 10 15 сій беє Гей Тер уаї ТНг дер Суб 5ег б5ег АТа ч11е д5р І1е дгд с1у 20 25 30 нів сіп ма! тк омаї гГеш сту сі ї1е руз тпг СТу А5п 5ег РгОо Уаї ко 45 цу сій туго РНе туго сі ТИгоАгу Субз Гуз 10 Аїд Аго РГО Маї Гуз 60
Ап біу Сух Агд с1у 112 Ар Ар Був Ні Тгр о А5п о 5ег сп Суз Гуз 65. 70 75 80 тик озег о біп тег що маї Агд АТа еп Тпг о бег сі Абп Ап о гу Гей 8 90 95 уаї! Ту тгр Аго тгр ІТе Агу те А5р Тпг бег Су Ммаї суб Аза Ге 100 105 ло бЗег Аг суз Тіе с1у Ага трг ук вв вІ ркУк - си 100000 - 1 в ри воооо о іх дбосо «126
Ох 70000 СлІшося. шк о що 80000 428 о ЩО вобоо ШЕ та Я 79000 іст - 129
Е КО восоо ЧА що бобоо Ше іт щ З щ 50000. Ши є Бу 40000 т 40000 т щ З зоооо Ер 0000
З є 20000 ж 5 7000 гра ; Є ЕЕ 4100004 5 А в твою. го ву щ з оз й ІогІмкМ
О| М
ІогІімкМІ рко-ув опе мВ «З е7З БЕ 100000 - 122 іх 100000 а. 117 (2) 90000. « 125 о (2) а 90000 «118 ОКО вообо - 4127 не воосо ; «121 В о тоооо її ве В т000о ноги іт ж во0оо у а) вобоо о Фо 5ороо в В вобою Ша щ сх т ФО 40000 А тА 43 40000 ян РУ А зовоо й тт
З гу 20000 т е 20000 ін Ег 20000 с 10000
Тед 10000 не -4 З 2 Й и ки З 2 В! о 1оІмкМ І
ІЮювімкМ) око-ув! ркб-Уукі 377 100000 «116 «р 100000 . 113 два 90000 - 319 ше 80000 г 120 2, воооо , «123
З восоо. т.д 70000. МИПРНИ лиш щу опитали М дя 70000 життя днк - 2, вобоо й . І 80000. --ч с У Боосо
Р 5 водо " ні 5. 40000 в - 40000 Га 8. 30000 попів ІНН
А 4) 3000 т ОО 20000
В - 20000 я Е 10000 вд 10000 чо) що З 2 7 й
І5з Е -4 - -2 З о я Іов (9) ММ ней Іов(мкМ | й ркоУкІ ел 80000 з 115 сіх 70000. Шини а 124 в що боосо оч де В 50000. 7
Р ау 40000 ве т о 30000 тин іх Б 20000:
Га а Е топоо че т 5 З о
Іог|мкМІ
Фе
ФІГ. 1
Нейтралізація активності МОБ
Вплив активності НМОЕ на юдським анти-МОЕ антитілом (у експресію УКІ зіставленні з п МОР (0,38 нМ)) - 50000 х 60000 хх 5ОООО -Н-тОт є БООбО " ,
Е 40000 Е 40000 30000 В з0000 (9) А ро е г, 20000 «4 - 20000 . е 10000 6 МСЕ Е 10000-4 а 967 (404) е и о о -4 -3 -2 - о 1 72 -4 -3 -2 -1 (о) 1 2 З
ІогІмкМ|І ІогімкМ І
ФІГ. 2
Вплив активності ІМСЕ на Вплив активності ПМОЕ на експресію УКІ у культурах ОКО експресію УКІ у культурах ОКО в - 100000 е - 190000 де Б ух 2) м дщо 75000 о ва. 75000 о а ня В в в ій В БОООО 5 я БОООО с до
Я 2восо я З 25000 ін СУ 88 ЗА о й й 4 З 2 1 о 1 2 -- -3 -2 -41 1 2 т 7 З т
Іор|мкМІ Іо|мкМ 404.07.4061.К 404.07.19051.5 100000. -- 100000 ве Ех . : о що 7800о нин о вик вин нн ще 750004 2 и " ке
НЕ 7 щ
Я щ 5БООСО В Я БОСО0
Е з. Піо. ве « птісЕОоЗВНМ
В Б ооо "їх ВМОБОо ЗНМ їх з 25000. « ВМСЕОЗВНМ ж 88 58 ще о о -4 -3 -2 -1 о 1 2 -4 -3 -2 - о 1 2 1осЇмк МІ Іор|їмк МІ ара.р7лдов2 Кк 404.07902.5 - 199000. в - 100000 - зе спи «ЩІ: «НН ще 75000 " т ЕВ 7500 в ; "В і нт Е
З в БОбОО в що 5О000 я З « сво ЗВНМ Е о - пев ОоЗВнМ я Є» оБОго- м вМсвОоЗяВМ ТО 250004 ж пМОЕО.38 НМ :
ЗЕ а оо о и п ДЕ и НИ он ни и ПТ М
ІосЇмкМ | ІогІмк МІ
АКА. ком оАТ АХ 1 пав ав. тд
ЮюДСЬКИЙ МОБ се: То КНобісзусретЕкнУо- ОКТТАТОДОЧКЕУМУТСЕУМ
Мишачий МОСК -----Єе5ТНРУЕНМСЕКЕВУСІВУУНУО--ОЕТТАТРІКСКЕУТУ ТАМ вВОмЕ НОІПРАВАНВОРАННОВЬВУСОВІЗЕНУТААОККТАМОМБОСТУТУВЕКУ Р
МТЗ шт ХВЕНЕКЯОНАСЕІБУСОІВЕВІЧУТ--ОКЕВАХІІВОНОУТУТ СЕК жк кжккдк ж жи й ж ж жж ща У В. " 13 Ел -тх йо ак мих - з ше м ин їй 70. . шо 5 Ше сви їх - "во и юдський МОБ ЇІЧНМЕУККОУЕТЕТЕСАВРМИМРУЮВОСВОЛИЕКНИМОІСІТІНТАЧКАСТИ
Мишачий МОБ ІМК СУКНОХУЕКЕТКСВАБМНРУЕВЗССНОІТОБКНИМОУСТІТНТЕУКАСТТ
ВІЖЕ УВКБОСКОХЕХЕТКСМРИСТТКВОСКОТОКВНИМОСиТТОУУВАСТИ
Мт ТаМБРУКОХЕХЕТНСКЕАНРУКМООСДВІОДЕНИМООСсКТаОТУ УВА жк жж ж й жжжк ж жжжж оп ж ож ж
І4 кун таня о «вежею, юдський МСЕ ПОКО-ААЧАКІВТОТАСУСУТЕВКАУВА
Мишачий МОБ рЕКО-ААЧНЕІВІСТАСУСУЬБККАТВНА вВОМЕ ПЕЕКВІСМАКІВІРТВСУСТИТІКВОВА -
МмтЗ ЕННКВМОНАМІНІСТВЗСУСАБОВАНІЗВТУ жк жкижкижи жжж
Порівняльний аналіз/95 ідентичності СЮОКІ важкого ланцюга МОРЕ
ФІ 85. ' 14010 НС СОР 1) РАМН
БНО НО СОР Й) рхАМН 7Н? НО СОМ) оУАМНн
АБ НОСОМ (1) же
Мр Не СОР () тУчте 404 НС СОВІ (1) вУвМ т Пабло Не Сов |(вНе Не Сов На не Сов |4с6 НС СОР (14011 НС Сов 1404 НЕ СБК 14010 НО СОР | 100 100 700 60 20 40 вне НС СО | Й 706 100 7780 20 40
ПИ Вод вів кН НИ яв 60100010101710101002020 2686 НС СОР 100 20 60 парті не СОТ | 100 720
Могнссом | у ШШАШИ І 2-00
Порівняльний аналіз/95 ідентичності СЮОКО важкого ланцюга МОЕ ринв ГА 14рлТОо НС Ср ПП) сІЗВМАСТІСУАРреУКО
БНО НССОВКО ПП) стзинвстІСУАОоВУКО 7 НССОВ (р сІтТИМВсСІВСУАВВУКО 46 НС СОК2 (І) рІюшнисеЗтетАонуКОе 404 НС СОМКО (ПП) Уха НТТІЕУАрНУКО 14011 НС СОР Пр хлУрОСрартТЕтяРВЕОЄ 20220227 Тевіб не совоТене нс сбво рас не соня Не срко йоб НС Сов ТТН? НС СОН.
Партоносова! 0001110000101 8010124 891 ----85 гост ЧИ нин МИ НЯ 24 5ЗІ бо 76 14011 НС СОБ2 | в | 100 РА 29 24 зраНнссова | 00100711 пи ст а т ПОД зе6нСсовІ | 7117 | ше 70 тнаенссрюю ГО орто
ФІГ. 6
Порівняльний аналіз/95 ідентичності СЮОКЗ важкого ланцюга МОЕ щи : 14р1О НС Сов (1) сУУсВсВРСУКУХУМВУ
БНО НС СОЗ (1) суУбВовРОХЕУУУМОХ, 14011 НС СО (1) -МУУСсестУУУУХУСМИ У у 46 НС СОКЗ (1)--вОйооРУхУХУСМо У 404 НС СОМ (1) -сУ8- ВОЖНУВОХ-ЕВХ 7Но НОСОВ (1) ---вевсв---УХМЕрУ г 7раріб не сов бно НС СОКУ. | ї4р41 не совасе НС СОКЗ 404 НС СКЗ 17На НС Сов
І14р10 НС СОКЗ | 100 100 ЕС) 41 18 18 бно НС СОКЗ 100) 35 а 18 18 14011 НС СОВЗ | НІ п! ко Ба 29 | 35 456 носок | п 1б0ї 8 729 404 НС СОМ | 1001 41 тнанссоВІ | г тою
Порівняльний аналіз/9о ідентичності СОКІ легкого ланцюга МСЕ (1 12 140111с СО () ла ЗобтІЗІШТА- 4с5 цс СО 20031029340 (|) 7 -зОостВаштА- 4041 СОР; () ва вОвІЗНАВА- 4с61с СОР 20031029351 (1) газова 140101С СОДІ (1) ра зозуановйя. 4с51с СОР 20031000528 (1) ка вовусвУвА- 4с51с СОР 20031071526 (1) в» зозуаввУтА
БНО СОВІ () вазавувааувА 7НгІС сові (1) а" зІВУоЗВХдА
МСг 4651 СОР 20031029344 (1) кг возуввахвА і 4660 сок 46615 СОКІ асбБІССОКІ 0 Моб16 СОКІ
Тр сОв 20031028340 04 ЦСК 200Могва 0 МАТОВІ 120031000528 20031071526 |БНО ЦСЄ СОКІ
ПЕС ее ст НИВА НООНОНОНЛ 7 ПОНООННИННОС КОННАННННЄ НОВО НАННЯ ПОЛОН НОМИС ис 23202031 64 0000834, іеБіссбн в 11120808 осв 20202311, В
ПЕТ хо НИМИ ПІТОН МОНАКО ООН ОСНО КОЛІННОНОННОНЯ МИНА НАННОВНН, ННОННННННС іоБіссові оон 13111101
ГЕ» НН ПОЛОНИН НОЛОНОНННОННН ПОН ВОНО КОЛОН ПОЛОН НАМОНННННИНи НАННЯ тс 02020201 1110
МсЕісвіссов м 1 223ШШ20Ш0ШШШ0100ШШ0002020
ФІГ. 8
Порівняльний аналіз/95 ідентичності СЮОКО легкого ланцюга МОРГ
ФІ 2-26 1401116 Сов ПП) де зво
Асв с Срт2 20031028340 Й) ДА еяБОВ 4р41ссОБ2(0)о свв 4сС61с СОН 20031000528 (11 рАЗПВАТ
Асв с СОР2 20031028351 (І) рана т бНОЗ1С СО () та вавлт 1401016 СОР (І) ба бвавАТ 4с51с СОН 20031071526 1) САВавАт 7216 СОБ2 (І) вАЗВвАТ
МЕ 4661 СОН2 20031029344 (1) ва вавАт 466510 МОР 46610
ЗО6ІБСОВ ЩО ЩОб16 СОВо СОво НО ЦО М4ОТО 10 456146 0821721 сок?
МОТО СОКО 120031028540 |СОК2 0 120031000528. 0031026951 ОБ |СОБ2 0 120031071526 |СОК2 ОО |20091028344
Мо осо івссюхюоювю 111 вв
ПДИЕря рю вв іввіссреюювю 1 11Гююилт іс 12230101 ря Я
ВН ЕС сок ПИ ПИШИ ПИЛ МОН НАННЯ ОН НН ПОН ОНА НОВА
ПОМОТЄ Со? ПОМИНИН ПИШИ ПИ МОНУ ПООНОНН ПОНННЯ ПОН т НАННННК тс ВАННА НАВ біос 132-611 11717762
То сок ПОВИ ПИ ПОН ПОЛОНИН КАНОН КОН КОНИКИ КАН КАНОН НАВАН)
МогіввісооювІ 22111
Порівняльний аналіз/9о ідентичності СЮОКЗ легкого ланцюга МОГ ші 1401016 СОЯЗ (І) осУсаВрРУут 7Нг21с Сов (1) соусах т бНЯТС СО (1) бохеавРУТ 406 С Сова 20031000526 (1) оо мери 461 СОУ 20031028351 (1) сов впеНАТ 14011 4,2 СОКЗ (1) оса МаЕРИТ 4041С СОН (1) освмаУРЬт 46616 СОНЗ 20031028340 (1) поУу му ри 4с6 С СОНЗ 20031071526 1) ооУМаУРИтТ мог 461 СОВЗ 20031029344 (1) оо еваРУТ 4651 т4011 4661с Мов 4661С їссовзІісовЗз |СОвз |20031000528 |І20031028351СОв3 ІСОВЗ /|20031028340 /20031071526 |20031028344 пив ПО В ПО Я ПО В ПМ ПО» ПОД ПО
Бнецесрка 32030301311601 88189783 44440056. 86 ВВ (нецесоа 00100010 00,717111441171110183100561111561111101016111010167.110101100, мсбіссоназгосзювюва | 77707 17777777777001717111178166111144| 01111561 56011711 ісеьссоваорозюгвав! |77717717117111117771117117711717171110117777117л001 1 89,11183111101010391111111 33100118
Мартьссоя 77117111 71777717 06701076 10111107613111171169) могіссоВ 7.001011 10011110 и611ив.01во
Мобіссовзоровювя | 7101 1711711111771117177717771777л01лою 6 яобіссовзоювюлеє 10111711 1117107170071777л001717111 би (мов асвіссонаооозіевмя | |. 77777707 77771777 оо ?
ФІГ. 10
Порівняльний аналіз варіабельних дляноОк легкого ланцюга моноклональних антитіл 406, 7Н2, 14010, 14011, 6Нео, 404 шт ти РА ти т он « « 1 одн 191 2 АН СД ь 5 .--- СБВ2 ---Сегмент 1
Фе. в 080 215 104МК (І) АхортозеаавсАЗУсОд ІТ КАЗОоТЗВ-АБ-УЧОКеОКАвКи І рАаЗиЕаБУв ВЕ во
МСЕ 406 Карра 20031071526бгс М тецоп (І) вх УуртозвРоТОЗІ8ВСЕБАтЬВААВОоВУЗВУо ОО ебОАРАБІГОЗАЗаВАТРІРОВЕЗСЗО
МСЕ 465 12 2003102834Агутвфоп (І) ЕТ УптоЗРОТоЗБЗРОВКАТЬВРАЗОВУВВВУБАМУСОКРЕОКРАБІТУрБАзЗКАТБІРОАКНОЗО
МОР АСВ ІС 20031029340гутедоп (1) рхомтозвЗОВОАЗУСЮРУТІТОВАсОовЕЗ8- МІХ ООКРЕКАРЕВІТЧААеЗВОВБУРсВ Кк З63о
МеСР АСБ1с 20031028361гитедоп (І) ЕТ УБТОСРАТЬНИУВОВААТЬВОВА ВОБУоВ-ХВДИХООКРСОАРАІБІТрАВНВАТБІРАВРЕСВЕ
МОРІС 4с6 СК осВА 20031000528М гефопіо (І) ЕХ ТаТО5РАТЬВВОРОЕКАТЬВОР ОВУ МУСОКРООАРКВиТОаАспВАТБІВАВЕЬО
МОСК 1401016 20031028306 су гедоп (1) ЕХ УстОвР СТІ СЬЗРСЕВАТЬВЦВАЗОВУВЗЕКТАНЕООКРООМРЕБІІТЗАЗВВАТВІРОКЕ НОВЕ
МСЕ 14011 Іс 20031028405 с едюп (І) вх оМтОаРЗВУВАЗУЄЮРУТІТЧВАЗОЗІВІ-ЙЕЧХОНК»СКАРКрІтерааЗвОВрУРУЦЕЗоа
МСЕ БНО Ни керра М гедоп по єр 2002120980 (І) ЕхузтовЕстраВЕРСЕВАТЬВИВАВОВУСВВУ БАХ ООпРООЛЕВЬиТИУАВаВАТБІРОВЕВСВо
МОЕ 7 Н2 Ни Карра 2002120984М вдюпло зр (1) ЕІ УБТОдРСТЬЗиЗРОВВАТЬВОЕ» ВОВуВи ВУ АНУ ОКРСОАВВБрІАНЯВАТБІВОРЕНОВЄ т що их -- нн Сегмент 2 (В) 58 Во т сок 3 108
АПМУК (б) вотоЕТПтТІВЗ0ОРпОгАТІУЧООВиВУвЬтТрОСОТК УВІ В
МСЕ 406 Карра 20031071526гс Мтедоп (68) зт тот ЗВБЕРЕОвАЧУУУЧОСУНВУРИТЕСОСТКУВІК
МОР 406 І Є 20031029344гу гедюп (68) ЗСтТОЕ ТІ ЗАПЕРЕОРАУЗУДОСХЗВРУТЕЗОСТКБЕТЕ
МОР 406 1 С 2003102934Огу гтедюп (57) ЗетоЕтТЬтІапОРЕРКАТУХЧОСУИВУРИТ тбОвтКУвІК
МСЕ 4с6 1С 20031028351гутедюп (57) етоетотгваЕВЕВеАУХУООВ ЗМИНАТЕСОСТКОВІК
МОР1С 406 ОК рСН4 20031000528М теслі? (57) вотокУтІВОЕрЕрРАУ ОВ НИРЕТьООСТЬУВІХ
МОБ 140101.С 20031028386 с угесюп (68) зотоЕтЬТІВАБЕРЕрКАуУхЦаОУсСВВРУТрСОСТКЬКІК
МОР 14011 1є200310284051с хтедюп (7) ЗсторЕтотх ВВПОРБОРАТХХОООАКВЕРШТРООЗТКУВІК
МСЕ БНО Ни КарраУ гесіоп по зр 2002120980 (68) зетортотху Арго гАУХУЦОСУЄВРУТрООСТПЬПІК
МСЕ 7 Н2 Ни Карра 2002120984 М гтедіоп по хр (68) ВСстТОето ТІ ВАВЕРЕРЕАЧУУЦ хо УТЕсОСТКВЕТК ай теріоп - ділянка; Карра - каппа і.
ФІГ. 1
Порівняльний аналіз варіабельних діІлЯНОК важкого ланцюга моноклональних антитіл 404, 406, 14010, 14011, 7Н2, 6НУЗ птн тт СОВІ содо Сегмент 1
ЩІ 10 0 шини 40 пе сх
ЗО4УН () УСБУ всЬуОРОСІрВВ СААЧеЕТІ яУВМЦОУВОАРСКсСЬЕМУУтОАВОНТТЕУАРСУК.
МСЕ 14010 НС 20031071581 у гефіоп () є СЬУЕВЯст ОР хАУІАБУЄТАЗСЕТРЯО ТАМ ПУРОАРСЬОЕСМИУВСІВИНВСТІССАрЗУКО
МОР бНО НС Но-й а. 20021204 ПлаіМєдюло (1) ЕСОБЛЕННООБУСРОАНІВІЗСААЗЄРІЕДВ ТАМИ УЄ ОАРСКОСТЕВОЗСІВУМАСІТСгАВЗУК
МСЕ 72 Ні-вапасоь 52002118141 ПпагУ гедіоп () БУОБПЕБОбоТуОє СВ ЗР сАА РІЕДОХ А, ВУРЗАРСЬЗБЕШУТСІТИНЗСТЬСУАрЗУК
МСЕ 14011 НС гасе 20091028394 ге М гедюп () ЕС ЗЗАВУККРЗЕЗЬКІЗОКОСУМЕ ТТ нтЯмУКОМРЬКОБЕВМІтІхворсотнІВвКО
МСЕ 466 НС ретатого 20031028328иМ гедіют (1 ВУС ТЕЗОСОУУРРЄЄЗІЕВЕЗСААВСРТЕЦО х СМІТ РОАРСКС ВЕУ БрІНКОСсЯтеМАр Оу ян А Я 06 0 ОО о ЛО ло ---------- - -- ГІПІІОТОУ 7) 57 во г по. СоАЗ ізу Сегмент 2
ЯО4МН (7) ВЕтІЗАОМАКЛВ ТУТ МОУ БАРЕРТАМУТСАЯ --УУваешнуВохЕо-Унооствутуяя
МЕ 14010 20031071581 у гедіоп (б/) вЕТУСВОНАКМВІЛЛЬОМИСІ,ВАВГ ТАТІ УСАК СУУБаЗОКРСУКУУ УМО ЧИСОСТТУТУ Я
МСЕ БНО НС Ноа 2002120854 йозі М герою (67) ВЕТІЗВІ НАКМИЗЕТЬОМИЗТААБОТА ТИ 27 ЄЖХУСВОАРОХЕУУ УМО Чи ІВ СТИВу
МОЕ 7Н2 Нь Ка або Ь2002118141 ппаїм гедіоп (67) ВЕТІОВПВАХ МОХ її ІММЗБВАБІТАБУУЬАКЕ-----ЕСЗСВУУМЕВ- Мости
МСЕ 14011 НС гасе 20031028394гсУ тедюп (67) «УРЕВАРКЯІЗТАХ СИВУ БКАЗІТ АМУУСАК ТИУУЄЗСТУУУУУЄМИЧЬ СОСтт, РИ
МСЕ 4с5 НС ВСРАТОРО 20031028328гМ гедісп (Б7) вЕТІСВІ МАКМЗТгБОМНЗОВАКРІА ТІ ХОАВЯ--БОМЬоРУХУХ УМО тт тевміоп - ділянка; Карра - каппа
Ф
ФІГ. 12
UAA200601428A 2003-07-15 2004-07-15 Виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язується з фактором росту нервової тканини (ngf) UA97086C2 (uk)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
UAA201109302A UA115960C2 (uk) 2003-07-15 2004-07-15 Людські анти-ngf нейтралізуючі антитіла як селективні інгібітори метаболічних шляхів фактора росту нервової тканини (ngf)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US48743103P 2003-07-15 2003-07-15
PCT/US2004/022876 WO2005019266A2 (en) 2003-07-15 2004-07-15 Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA97086C2 true UA97086C2 (uk) 2012-01-10

Family

ID=34215825

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA200601428A UA97086C2 (uk) 2003-07-15 2004-07-15 Виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язується з фактором росту нервової тканини (ngf)
UAA201109302A UA115960C2 (uk) 2003-07-15 2004-07-15 Людські анти-ngf нейтралізуючі антитіла як селективні інгібітори метаболічних шляхів фактора росту нервової тканини (ngf)

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201109302A UA115960C2 (uk) 2003-07-15 2004-07-15 Людські анти-ngf нейтралізуючі антитіла як селективні інгібітори метаболічних шляхів фактора росту нервової тканини (ngf)

Country Status (30)

Country Link
US (7) US7601818B2 (uk)
EP (2) EP2364728A1 (uk)
JP (8) JP4489077B2 (uk)
CN (3) CN1849138B (uk)
AR (2) AR045056A1 (uk)
AU (2) AU2004267030B2 (uk)
BR (1) BRPI0412567B1 (uk)
CA (1) CA2534585C (uk)
CY (1) CY1113167T1 (uk)
DK (1) DK1648509T3 (uk)
EA (2) EA030259B8 (uk)
ES (1) ES2392954T3 (uk)
GE (4) GEAP201811194A (uk)
HR (2) HRP20120882T1 (uk)
IL (5) IL173076A (uk)
MA (1) MA27952A1 (uk)
ME (2) ME02785B (uk)
MX (2) MX341869B (uk)
NO (1) NO20060381L (uk)
NZ (3) NZ544751A (uk)
PL (1) PL1648509T3 (uk)
PT (1) PT1648509E (uk)
RS (2) RS52332B (uk)
SG (1) SG10201404744RA (uk)
SI (1) SI1648509T1 (uk)
TN (1) TNSN06010A1 (uk)
TW (4) TWI385180B (uk)
UA (2) UA97086C2 (uk)
WO (1) WO2005019266A2 (uk)
ZA (1) ZA200600847B (uk)

Families Citing this family (212)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003285864C1 (en) 2002-10-08 2010-07-01 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating post-surgical pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same
UA80447C2 (en) * 2002-10-08 2007-09-25 Methods for treating pain by administering nerve growth factor antagonist and opioid analgesic
US7255860B2 (en) 2002-10-08 2007-08-14 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating post-surgical pain by administering an anti-nerve growth factor antagonist antibody
US7569364B2 (en) 2002-12-24 2009-08-04 Pfizer Inc. Anti-NGF antibodies and methods using same
KR101410692B1 (ko) 2002-12-24 2014-06-24 리나트 뉴로사이언스 코프. 항-ｎｇｆ 항체 및 그것을 이용하는 방법
US9498530B2 (en) 2002-12-24 2016-11-22 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating osteoarthritis pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same
EA010159B1 (ru) 2003-02-19 2008-06-30 Ринат Ньюросайенс Корп. Способы лечения боли введением антагониста фактора роста нервов и нестероидного противовоспалительного средства и содержащие их композиции
TWI385180B (zh) * 2003-07-15 2013-02-11 安美基公司 作為選擇性神經生長因子（ｎｇｆ）通道抑制劑之人類抗-ｎｇｆ中和抗體
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
ITRM20030601A1 (it) * 2003-12-24 2005-06-25 Lay Line Genomics Spa Metodo per l'umanizzazione di anticorpi e anticorpi umanizzati con esso ottenuti.
US9396212B2 (en) 2004-04-07 2016-07-19 Visible World, Inc. System and method for enhanced video selection
SI1732949T1 (sl) 2004-04-07 2010-05-31 Rinat Neuroscience Corp Postopki za zdravljenje bolečine kostnega raka zdajanjem antagonista živčnega rastnega faktorja
US7725178B2 (en) * 2004-06-30 2010-05-25 Cedars-Sinai Medical Center Method and system for the prediction of cardiac arrhythmias, myocardial ischemia, and other diseased condition of the heart associated with elevated sympathetic neural discharges
ME00226B (me) * 2004-07-15 2011-02-10 Medarex Llc Humana anti-ngf neutrališuća antitijela kao selektivni inhibitori ngf signalne kaskade
TWI306862B (en) 2005-01-03 2009-03-01 Hoffmann La Roche Antibodies against il-13 receptor alpha 1 and uses thereof
CA2595800C (en) 2005-01-24 2014-07-08 Cambridge Antibody Technology Limited. Specific binding members for ngf
ITRM20050290A1 (it) * 2005-06-07 2006-12-08 Lay Line Genomics Spa Uso di molecole in grado di inibire il legame tra ngf e il suo recettore trka come analgesici ad effetto prolungato.
EP1909831A4 (en) 2005-06-14 2013-02-20 Amgen Inc SELF-BUFFING PROTEIN FORMULATIONS
EP1909838A2 (en) * 2005-07-29 2008-04-16 Amgen Inc. Formulations that inhibit protein aggregation
CA2628843A1 (en) * 2005-11-07 2007-05-10 Copenhagen University Neurotrophin-derived peptide sequences
US7822474B2 (en) * 2005-11-30 2010-10-26 Cedars-Sinai Medical Center Methods for the prediction of arrhythmias and prevention of sudden cardiac death
JP2010507366A (ja) * 2006-10-19 2010-03-11 メルク アンド カンパニー インコーポレイテッド インターロイキン−１３受容体α１の抗体アンタゴニスト
MX2009005189A (es) * 2006-11-15 2009-06-30 Medarex Inc Anticuerpos humanos monoclonales para btla y metodos de uso.
EP2129401B8 (en) * 2006-12-21 2020-01-15 Amgen Inc. Stable buffered formulations containing polypeptides
JP2010520748A (ja) 2007-02-20 2010-06-17 アナプティスバイオ インコーポレイティッド 体細胞超変異系
AU2012216653B2 (en) * 2007-08-10 2013-12-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human nerve growth factor
CN101827609B (zh) 2007-08-10 2014-03-12 里珍纳龙药品有限公司 抗人神经生长因子的高亲和力人抗体
US8309088B2 (en) 2007-08-10 2012-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF
EP2197421A1 (en) * 2007-08-31 2010-06-23 Amgen, Inc Solid-state protein formulation
WO2009043049A2 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP2219602A1 (en) 2007-11-15 2010-08-25 Amgen, Inc Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stablised by antioxidants for parenteral administration
CN106977601A (zh) 2007-12-17 2017-07-25 辉瑞有限公司 间质性膀胱炎的治疗
ES2564635T3 (es) 2008-05-13 2016-03-28 Novimmune Sa Anticuerpos anti-IL-6/IL-6R y métodos de uso de los mismos
WO2009150623A1 (en) 2008-06-13 2009-12-17 Pfizer Inc Treatment of chronic prostatitis
WO2010000721A1 (en) * 2008-06-30 2010-01-07 Novo Nordisk A/S Anti-human interleukin-20 antibodies
SI2331090T1 (en) 2008-09-19 2018-04-30 Pfizer Inc. Stable liquid antibody formulation
SI2350075T1 (sl) 2008-09-22 2014-06-30 Array Biopharma, Inc. Substituirane imidazo (1,2b)piridazinske spojine kot Trk kinazni inhibitorji
ES2900243T3 (es) 2008-10-22 2022-03-16 Array Biopharma Inc Compuestos de pirazolo[1,5-a]pirimidina sustituidos como inhibidores de trk quinasa
EP2376495A4 (en) * 2008-12-08 2012-10-31 Vm Pharma Llc COMPOSITIONS OF PROTEIN RECEPTOR TYROSINE KINASE INHIBITORS
US8435523B2 (en) 2009-05-04 2013-05-07 Abbott Research B.V. Antibodies against nerve growth factor (NGF) with enhanced in vivo stability
WO2010146511A1 (en) 2009-06-17 2010-12-23 Pfizer Limited Treatment of overactive bladder
AR077468A1 (es) 2009-07-09 2011-08-31 Array Biopharma Inc Compuestos de pirazolo (1,5 -a) pirimidina sustituidos como inhibidores de trk- quinasa
US9662271B2 (en) 2009-10-23 2017-05-30 Amgen Inc. Vial adapter and system
US10471212B2 (en) * 2009-10-29 2019-11-12 W. L. Gore & Associates, Inc. Silicone free drug delivery devices
US9597458B2 (en) 2009-10-29 2017-03-21 W. L. Gore & Associates, Inc. Fluoropolymer barrier materials for containers
TWI505838B (zh) 2010-01-20 2015-11-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Stabilized antibody solution containing
CN107496917B (zh) 2010-02-26 2021-06-11 诺沃—诺迪斯克有限公司 包含稳定抗体的组合物
SG10201502587SA (en) 2010-03-01 2015-06-29 Bayer Healthcare Llc Optimized monoclonal antibodies against tissue factor pathway inhibitor (tfpi)
AR080685A1 (es) 2010-03-17 2012-05-02 Abbott Res Bv Composiciones de anticuerpos anti-factor de crecimiento nervioso (ngf)
MX2012013467A (es) 2010-05-20 2013-04-29 Array Biopharma Inc Compuestos macrociclicos como inhibidores de trk cinasa.
EP2575761B1 (en) 2010-05-28 2024-08-14 Novo Nordisk A/S Stable multi-dose compositions comprising an antibody and a preservative
PT2575935E (pt) 2010-06-07 2015-10-20 Amgen Inc Dispositivo de administração de medicamento
PT3333188T (pt) 2010-08-19 2022-03-28 Zoetis Belgium S A Anticorpos de anti-ngf e a sua utilização
US11612697B2 (en) 2010-10-29 2023-03-28 W. L. Gore & Associates, Inc. Non-fluoropolymer tie layer and fluoropolymer barrier layer
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
CA2821515A1 (en) * 2010-12-01 2012-06-07 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Anti-ngf compositions and use thereof
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
CA2831100C (en) 2011-03-31 2020-02-18 Mark Dominis Holt Vial adapter and system
ES2926520T3 (es) 2011-04-20 2022-10-26 Amgen Inc Aparato autoinyector
US9102673B2 (en) 2011-07-12 2015-08-11 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituted pyrrolo[3,2-c]pyridines as TrkA kinase inhibitors
SI2743348T1 (en) 2011-08-11 2018-04-30 Astellas Pharma Inc. Novel anti-human ngf antibody
TR201807808T4 (tr) 2011-10-14 2018-06-21 Amgen Inc Enjektör ve montaj yöntemi.
US8926978B2 (en) 2011-10-25 2015-01-06 Anaptysbio, Inc. Antibodies directed against nerve growth factor (NGF)
CN104884473B (zh) 2012-05-22 2019-12-03 百时美施贵宝公司 Il-17a/f il-23双特异性抗体及其应用
EP2858501A4 (en) 2012-05-22 2015-12-09 Merck Sharp & Dohme TRKA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHOD THEREFOR
AU2013271564A1 (en) 2012-06-06 2014-12-04 Zoetis Services Llc Caninized anti-NGF antibodies and methods thereof
US9592297B2 (en) 2012-08-31 2017-03-14 Bayer Healthcare Llc Antibody and protein formulations
EP3072548B1 (en) 2012-11-21 2019-03-06 Amgen, Inc Drug delivery device
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
JP6135161B2 (ja) * 2013-02-08 2017-05-31 アステラス製薬株式会社 新規抗ヒトｎｇｆ抗体
US9127055B2 (en) 2013-02-08 2015-09-08 Astellas Pharma Inc. Method of treating pain with anti-human NGF antibody
TWI592183B (zh) 2013-03-15 2017-07-21 安美基公司 本體輪廓可調適之自動注射器裝置
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
US10092703B2 (en) 2013-03-15 2018-10-09 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
EP3593839A1 (en) 2013-03-15 2020-01-15 Amgen Inc. Drug cassette
JP6670740B2 (ja) 2013-03-22 2020-03-25 アムジエン・インコーポレーテツド 注入器および組み立て法
US9603775B2 (en) 2013-04-24 2017-03-28 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
MX2016002870A (es) 2013-09-05 2017-02-23 Amgen Inc Moleculas que contienen fc que presentan perfiles de glicoforma predecibles, consistentes y reproducibles.
WO2015039333A1 (en) 2013-09-22 2015-03-26 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
WO2015039334A1 (en) 2013-09-22 2015-03-26 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
AU2014340174B2 (en) 2013-10-24 2019-09-12 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
PL3060275T3 (pl) 2013-10-24 2019-12-31 Amgen Inc. Wstrzykiwacz i sposób montażu
AU2014374055B2 (en) * 2013-12-30 2018-11-08 Epimab Biotherapeutics Inc. Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
SMT202100441T1 (it) 2014-02-05 2021-09-14 VM Oncology LLC Composizioni di composti e loro usi
WO2015143653A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS,COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
WO2015143654A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS,COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
WO2015143652A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS,COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
CA3193070A1 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
EP3143404B1 (en) 2014-05-16 2018-08-29 Amgen Inc. Assay for detecting th1 and th2 cell populations
EP4362039A3 (en) 2014-06-03 2024-08-07 Amgen Inc. Controllable drug delivery system and method of use
WO2016035052A1 (en) * 2014-09-05 2016-03-10 Nvip Pty Ltd Anti-nerve growth factor antibodies for treating itching
JP6766040B2 (ja) 2014-10-14 2020-10-07 アムジエン・インコーポレーテツド 視覚および可聴インジケータを備える薬剤注射装置
US10799505B2 (en) 2014-11-16 2020-10-13 Array Biopharma, Inc. Crystalline form of (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-difluorophenyl)-pyrrolidin-1-yl)-pyrazolo[1,5-A]pyrimidin-3-yl)-3-hydroxypyrrolidine-1-carboxamide hydrogen sulfate
US11357916B2 (en) 2014-12-19 2022-06-14 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
EP3848072A1 (en) 2014-12-19 2021-07-14 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
AR103173A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novarits Ag Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17
CN104910274B (zh) * 2015-02-12 2018-05-04 北京华安科创生物技术有限公司 抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体12c11及其杂交瘤细胞株
CN104774265B (zh) * 2015-02-12 2018-05-04 北京华安科创生物技术有限公司 抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体11f1及其杂交瘤细胞株
WO2016133947A1 (en) 2015-02-17 2016-08-25 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
EP3261690B1 (en) 2015-02-27 2021-12-15 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
WO2016146730A1 (en) * 2015-03-19 2016-09-22 Neuheart S.R.L. PEPTIDES HAVING TrkA-RECEPTOR-AGONISTIC ACTIVITY OR HAVING NGF-ANTAGONISTIC ACTIVITY
MA41842A (fr) 2015-03-31 2018-02-06 Oblique Therapeutics Ab Nouveaux procédés de sélection d'épitope
WO2016161572A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
AU2016268625B2 (en) 2015-05-22 2022-01-27 Astellas Pharma Inc. Novel anti-human NGF antibody Fab fragment
GB201510758D0 (en) 2015-06-18 2015-08-05 Ucb Biopharma Sprl Novel TNFa structure for use in therapy
WO2017027805A1 (en) * 2015-08-13 2017-02-16 University Of Massachusetts Human antibodies against rabies and uses thereof
EP4470648A3 (en) 2015-08-13 2025-03-05 Amgen Inc. Charged depth filtration of antigen-binding proteins
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
EP3368039A1 (en) 2015-10-26 2018-09-05 The Regents of The University of Colorado, A Body Corporate Point mutations in trk inhibitor-resistant cancer and methods relating to the same
EP3386573B1 (en) 2015-12-09 2019-10-02 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
MX2018008300A (es) * 2016-01-13 2018-09-21 Genmab As Formulacion para anticuerpo y conjugado de farmaco del mismo.
CN108884169B (zh) 2016-01-22 2022-03-22 默沙东公司 抗凝血因子xi抗体
RU2767329C2 (ru) 2016-02-06 2022-03-17 Эпимаб Биотерапьютикс, Инк. Иммуноглобулин с тандемными fab-фрагментами и варианты его применения
ES2814287T3 (es) 2016-03-15 2021-03-26 Amgen Inc Reducir la probabilidad de rotura de cristal en dispositivos de administración de fármaco
US10045991B2 (en) 2016-04-04 2018-08-14 Loxo Oncology, Inc. Methods of treating pediatric cancers
HUE068971T2 (hu) 2016-04-04 2025-02-28 Loxo Oncology Inc (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-difluorofenil)-pirrolidin-1-il)-pirazolo[1,5-A]pirimidin-3-il) -3-hidroxipirrolidin-1-karboxamid folyékony készítményei
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
US10988284B2 (en) 2016-05-13 2021-04-27 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
PT3800189T (pt) 2016-05-18 2023-07-27 Array Biopharma Inc Preparação de (s)-n-(5-((r)-2-(2,5- difluoropenil)pirrolidin-1-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3- il)-3-hidroxipirrolidina-1-carboxamida
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
CN109476758B (zh) 2016-06-14 2023-05-23 默沙东有限责任公司 抗-凝血因子xi抗体
US11285266B2 (en) 2016-07-01 2022-03-29 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
EA201990222A1 (ru) 2016-08-05 2019-07-31 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Антитела к o2 и пути их применения
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
GB201614884D0 (en) * 2016-09-01 2016-10-19 Oblique Therapeutics Ab Method
GB201617002D0 (en) * 2016-10-06 2016-11-23 Oblique Therapeutics Ab Multi-protease method
AU2017346488A1 (en) * 2016-10-19 2019-05-30 Humabs Biomed Sa Anti-O1 antibodies and uses thereof
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
JOP20190092A1 (ar) 2016-10-26 2019-04-25 Array Biopharma Inc عملية لتحضير مركبات بيرازولو[1، 5-a]بيريميدين وأملاح منها
GB201621907D0 (en) * 2016-12-21 2017-02-01 Ucb Biopharma Sprl And Sanofi Antibody epitope
CA3049780A1 (en) 2017-01-17 2018-07-26 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
CA3052204A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
US11752258B2 (en) 2017-02-17 2023-09-12 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
AU2018231107B2 (en) 2017-03-06 2023-04-20 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
WO2018164829A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Amgen Inc. Needle insertion by overpressure
IL303449B2 (en) 2017-03-09 2024-08-01 Amgen Inc Insertion mechanism for a drug delivery device
AU2018235928B2 (en) 2017-03-14 2023-09-21 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
JOP20190213A1 (ar) 2017-03-16 2019-09-16 Array Biopharma Inc مركبات حلقية ضخمة كمثبطات لكيناز ros1
LT3600491T (lt) 2017-03-28 2023-10-10 Amgen Inc. Stūmoklio koto ir švirkšto konstrukcinė sistema ir būdas
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
US11904143B2 (en) 2017-06-08 2024-02-20 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
US11541183B2 (en) 2017-06-22 2023-01-03 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
US11395880B2 (en) 2017-06-23 2022-07-26 Amgen Inc. Electronic drug delivery device
EP3651832B1 (en) 2017-07-14 2023-12-13 Amgen Inc. Needle insertion-retraction system having dual torsion spring system
US11672733B2 (en) 2017-07-21 2023-06-13 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
WO2019022950A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE WITH CONTAINER ACCESS SYSTEM AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
EP4085942A1 (en) 2017-07-25 2022-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
EP3664863A2 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
EP3691717B1 (en) 2017-10-04 2023-02-08 Amgen Inc. Flow adapter for drug delivery device
WO2019070552A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A LOCKOUT ASSEMBLY AND ASSOCIATED ASSEMBLY METHOD
MA50348A (fr) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un ensemble d'entraînement et procédé d'assemblage associé
US11826480B2 (en) 2017-11-03 2023-11-28 Amgen Inc. Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
WO2019089178A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
MA50569A (fr) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc Ensembles de remplissage-finition et procédés associés
MX2020004736A (es) 2017-11-10 2020-08-13 Amgen Inc Embolos para dispositivos de administracion de farmacos.
SG11202002772VA (en) 2017-11-16 2020-04-29 Amgen Inc Autoinjector with stall and end point detection
EP3710090A1 (en) 2017-11-16 2020-09-23 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
AR114110A1 (es) 2018-02-28 2020-07-22 Lilly Co Eli Anticuerpo anti-trka
WO2019177690A1 (en) 2018-03-12 2019-09-19 Zoetis Services Llc Anti-ngf antibodies and methods thereof
EP3765516A2 (en) * 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
CA3093853A1 (en) 2018-03-26 2019-10-03 Amgen Inc. Total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
CN108623687A (zh) * 2018-04-17 2018-10-09 中山康方生物医药有限公司 神经生长因子的单克隆抗体及其编码基因和应用
AU2019263850A1 (en) 2018-05-03 2020-11-19 Shanghai Epimab Biotherapeutics Co., Ltd. High affinity antibodies to PD-1 and LAG-3 and bispecific binding proteins made therefrom
US20210147529A1 (en) 2018-05-15 2021-05-20 Astellas Pharma Inc. Pharmaceutical composition for suppressing atrial fibrillation having as active ingredient anti-human ngf antibody or antigen-binding fragment thereof
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
CA3103681A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
MX2021000749A (es) 2018-07-24 2021-03-29 Amgen Inc Dispositivos de suministro para administrar farmacos.
EP3829692A1 (en) 2018-07-31 2021-06-09 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
AU2019347710B2 (en) 2018-09-24 2025-05-08 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
EP3856283A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
WO2020072577A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
CA3112214A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
IT201800009384A1 (it) 2018-10-11 2020-04-11 Cosmo Srl Peptide for cosmetic application
MX2021002791A (es) 2018-10-15 2021-05-12 Amgen Inc Proceso de ensamblaje de plataforma para un dispositivo de administracion de farmacos.
US12053617B2 (en) 2018-10-15 2024-08-06 Amgen Inc. Drug delivery device having damping mechanism
WO2020091956A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
US12485219B2 (en) 2018-11-01 2025-12-02 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
MX2021012557A (es) 2019-04-24 2021-11-12 Amgen Inc Conjuntos y metodos de verificacion de esterilizacion de jeringuillas.
MX2022002149A (es) 2019-08-23 2022-03-17 Amgen Inc Dispositivo de suministro de farmacos con componentes de acoplamiento de capuchon de aguja configurable y metodos relacionados.
WO2021062372A1 (en) 2019-09-26 2021-04-01 Amgen Inc. Methods of producing antibody compositions
CN117003868B (zh) * 2020-04-17 2024-04-16 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 抗人神经生长因子的抗体
CN117050175B (zh) * 2020-04-17 2024-07-16 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 抗人神经生长因子的抗体
WO2021238886A1 (en) 2020-05-27 2021-12-02 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Antibodies specifically recognizing nerve growth factor and uses thereof
AR122141A1 (es) 2020-05-28 2022-08-17 Lilly Co Eli Inhibidor de trka
EP4162257A1 (en) 2020-06-04 2023-04-12 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
AU2020204105B2 (en) * 2020-06-19 2023-06-08 Dartsbio Pharmaceuticals Ltd. Anti-human ngf antibodies and methods using same
US11655292B2 (en) 2020-06-23 2023-05-23 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Anti-human NGF antibodies and methods using same
WO2022081824A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 Amgen Inc. Relative unpaired glycans in antibody production methods
BR112023024278A2 (pt) 2021-05-21 2024-01-30 Amgen Inc Método de otimizar uma receita de enchimento para um recipiente de fármacos
AR126089A1 (es) 2021-06-07 2023-09-13 Amgen Inc Uso de fucosidasa para controlar el nivel de afucosilación de proteínas glucosiladas
JP2024537100A (ja) 2021-10-05 2024-10-10 アムジエン・インコーポレーテツド Ｆｃガンマ受容体ＩＩ結合、及びグリカン含量
JP2025500805A (ja) * 2021-12-16 2025-01-15 インターベット インターナショナル ベー． フェー． ヒトｎｇｆに対するイヌ化およびネコ化抗体
WO2023212586A1 (en) 2022-04-27 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for selecting patients for treatment with an ngf antagonist
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
AU2024256160A1 (en) 2023-04-20 2025-10-02 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content
FR3148027A1 (fr) * 2023-04-24 2024-10-25 Peptinov Composition vaccinale anti-ngf
WO2025038600A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Amgen Inc. Methods for reducing yellow color
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2025264860A2 (en) 2024-06-18 2025-12-26 Yale University Methods of treating post-covid airway disease

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4230691A (en) 1978-05-23 1980-10-28 The Massachusetts General Hospital Nerve growth factor antibody and process
GB2077573A (en) 1980-06-10 1981-12-23 Kangol Magnet Ltd Vehicle seat belt connection device
US4786593A (en) 1985-04-16 1988-11-22 Wistar Institute Of Anatomy And Biology Diagnostic method for detection of neural crest disease
JP2969647B2 (ja) 1988-09-14 1999-11-02 東ソー株式会社 モノクローナル抗体、それからなる阻害剤及びそれを用いた測定方法
SE465573B (sv) 1989-03-14 1991-09-30 Lope Medicine Ab Nervtillvaextfaktorpeptider, motsvarande antikroppar och foerfarande foer bestaemning av nativ nervtillvaextfaktor
DE69031726T2 (de) 1989-08-28 1998-03-12 Takeda Chemical Industries Ltd Antikörper, ihre Herstellung und Verwendung
JPH03163095A (ja) 1989-08-28 1991-07-15 Takeda Chem Ind Ltd ヒト神経成長因子の部分ペプチド、抗体およびその用途
US5656435A (en) 1989-08-28 1997-08-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to peptides having NGF-like activity, said antibodies having no substantial cross-reactivity with NGF, and use thereof
WO1996033735A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6300129B1 (en) * 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
JP3232415B2 (ja) 1990-08-29 2001-11-26 武田薬品工業株式会社 モノクローナル抗体，その製造法および用途
JPH06317587A (ja) 1990-08-31 1994-11-15 Takeda Chem Ind Ltd 抗体およびその用途
US5147294A (en) 1990-10-01 1992-09-15 Trustees Of Boston University Therapeutic method for reducing chronic pain in a living subject
JPH0576384A (ja) 1991-09-20 1993-03-30 Hitachi Ltd 抗ヒト神経成長因子モノクローナル抗体
JP3519096B2 (ja) 1992-07-02 2004-04-12 武田薬品工業株式会社 モノクローナル抗体、ハイブリドーマおよびそれらの用途
US5877016A (en) 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
US5844092A (en) 1994-03-18 1998-12-01 Genentech, Inc. Human TRK receptors and neurotrophic factor inhibitors
GB9616105D0 (en) 1996-07-31 1996-09-11 Univ Kingston TrkA binding site of NGF
US7322122B2 (en) 1997-01-15 2008-01-29 Draka Comteq B.V. Method and apparatus for curing a fiber having at least two fiber coating curing stages
EP1210372B1 (en) 1999-07-29 2008-01-23 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to her2/neu
TR200200472T2 (tr) * 1999-08-27 2002-06-21 Genentech, Inc. Anti-Erb B2 antikorları ile tedavi için dozajlar
US6548062B2 (en) 2000-02-29 2003-04-15 Cephalon, Inc. Method of treating cancer with anti-neurotrophin agents
FR2807660A1 (fr) * 2000-04-13 2001-10-19 Warner Lambert Co Utilisation d'antagonistes du ngf pour la prevention ou le traitement de douleurs viscerales chroniques
CA2448956C (en) 2001-05-30 2017-10-03 Genentech, Inc. Anti-ngf antibodies for the treatment of various disorders
US6881557B2 (en) 2001-07-12 2005-04-19 Arrowsmith Technologies Llp Super humanized antibodies
CA2463634A1 (en) 2001-10-15 2003-04-24 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Anti-hla-dr antibody
EP1467756A4 (en) 2001-12-28 2007-03-21 Abgenix Inc METHODS OF USING ANTI-MUC18 ANTIBODIES
US6919426B2 (en) 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
AU2003285864C1 (en) 2002-10-08 2010-07-01 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating post-surgical pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same
US7569364B2 (en) 2002-12-24 2009-08-04 Pfizer Inc. Anti-NGF antibodies and methods using same
KR101410692B1 (ko) 2002-12-24 2014-06-24 리나트 뉴로사이언스 코프. 항-ｎｇｆ 항체 및 그것을 이용하는 방법
EP1468999A1 (en) * 2003-03-20 2004-10-20 MyoContract Ltd. Substituted piperidine and piperazine derivatives as melanocortin-4 receptor modulators
TWI385180B (zh) 2003-07-15 2013-02-11 安美基公司 作為選擇性神經生長因子（ｎｇｆ）通道抑制劑之人類抗-ｎｇｆ中和抗體
CA2595800C (en) 2005-01-24 2014-07-08 Cambridge Antibody Technology Limited. Specific binding members for ngf

Also Published As

Publication number Publication date
EP1648509A2 (en) 2006-04-26
CN102408483A (zh) 2012-04-11
TWI385180B (zh) 2013-02-11
EA013614B1 (ru) 2010-06-30
HK1096310A1 (en) 2007-06-01
JP2017079782A (ja) 2017-05-18
CY1113167T1 (el) 2016-04-13
ME02785B (me) 2012-12-31
JP2010006812A (ja) 2010-01-14
IL214281A (en) 2016-07-31
CA2534585C (en) 2012-02-21
IL173076A0 (en) 2006-06-11
GEP20196963B (en) 2019-04-10
GEP20104887B (en) 2010-02-10
JP4489077B2 (ja) 2010-06-23
EP2364728A1 (en) 2011-09-14
IL241874A0 (en) 2015-11-30
US20110040076A1 (en) 2011-02-17
TWI382031B (zh) 2013-01-11
TWI635096B (zh) 2018-09-11
CA2534585A1 (en) 2005-03-03
TNSN06010A1 (en) 2007-10-03
EP1648509B1 (en) 2012-09-12
NZ544751A (en) 2009-05-31
BRPI0412567B1 (pt) 2017-03-21
AR045056A1 (es) 2005-10-12
RS20100555A (sr) 2011-08-31
US20160304596A1 (en) 2016-10-20
JP5965964B2 (ja) 2016-08-10
US20110091476A1 (en) 2011-04-21
DK1648509T3 (da) 2013-01-07
GEP20146050B (en) 2014-03-10
AU2004267030B2 (en) 2010-06-17
ZA200600847B (en) 2007-01-31
AU2010202177B2 (en) 2013-12-12
SI1648509T1 (sl) 2012-12-31
TW200911833A (en) 2009-03-16
CN1849138A (zh) 2006-10-18
AU2010202177A1 (en) 2010-06-17
SG10201404744RA (en) 2014-10-30
JP5264798B2 (ja) 2013-08-14
IL173076A (en) 2015-10-29
TW201534621A (zh) 2015-09-16
US8106167B2 (en) 2012-01-31
HRP20120882T1 (hr) 2013-02-28
NZ588527A (en) 2012-06-29
HRP20060033A2 (en) 2007-04-30
CN102358903B (zh) 2017-04-26
US20160237147A1 (en) 2016-08-18
JP2012250986A (ja) 2012-12-20
US20090155274A1 (en) 2009-06-18
JP2010162028A (ja) 2010-07-29
JP2012161316A (ja) 2012-08-30
JP2007537703A (ja) 2007-12-27
AU2004267030A1 (en) 2005-03-03
EA030259B1 (ru) 2018-07-31
RS20060022A (en) 2008-06-05
US7795413B2 (en) 2010-09-14
EA201000245A1 (ru) 2010-12-30
PL1648509T3 (pl) 2013-02-28
HK1088534A1 (en) 2006-11-10
JP2015042670A (ja) 2015-03-05
CN102358903A (zh) 2012-02-22
EA030259B8 (ru) 2018-09-28
HRP20060033B1 (hr) 2014-02-28
US7601818B2 (en) 2009-10-13
TWI503328B (zh) 2015-10-11
CN1849138B (zh) 2011-11-30
US8198410B2 (en) 2012-06-12
ES2392954T3 (es) 2012-12-17
WO2005019266A2 (en) 2005-03-03
JP2015155413A (ja) 2015-08-27
NZ599196A (en) 2014-01-31
UA115960C2 (uk) 2018-01-25
EA200600254A1 (ru) 2006-12-29
NO20060381L (no) 2006-03-22
US20080033157A1 (en) 2008-02-07
US20050074821A1 (en) 2005-04-07
GEAP201811194A (en) 2018-10-10
CN102408483B (zh) 2016-06-08
TW200513468A (en) 2005-04-16
MEP31508A (hr) 2010-10-10
MA27952A1 (fr) 2006-06-01
BRPI0412567A (pt) 2006-09-19
WO2005019266A3 (en) 2005-04-28
IL206823A0 (en) 2011-08-01
IL214281A0 (en) 2011-08-31
RS52332B (sr) 2012-12-31
MXPA06000583A (es) 2006-03-30
TW201311721A (zh) 2013-03-16
EP1648509B8 (en) 2012-10-24
AR075790A2 (es) 2011-04-27
MX341869B (es) 2016-09-06
PT1648509E (pt) 2012-10-18
IL214280A0 (en) 2011-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA97086C2 (uk) Виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язується з фактором росту нервової тканини (ngf)
US9260514B2 (en) Methods of treating conditions caused by increased expression of nerve growth factor (NGF) or increased sensitivity to NGF using anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors
EA011876B1 (ru) АНТИТЕЛА К IFN-γ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ АНТИТЕЛ
AU2016247195A1 (en) Human Anti-NGF Neutralizing Antibodies as Selective NGF Pathway Inhibitors
HK1169133B (en) Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors
HK1166998A (en) Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors
HK1166998B (en) Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors
HK1169133A (en) Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors
AU2013260740A1 (en) Human Anti-NGF Neutralizing Antibodies as Selective NGF Pathway Inhibitors
HK1178428A (en) Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors