UA52646C2 - Гібридні білки, фармацевтична композиція, що містить гібридний білок, ізольована молекула днк, що містить гібридний білок, вектор експресії, клітина-хазяїн, спосіб продукування гібридного білка, спосіб індукування визрівання фолікулів - Google Patents
Гібридні білки, фармацевтична композиція, що містить гібридний білок, ізольована молекула днк, що містить гібридний білок, вектор експресії, клітина-хазяїн, спосіб продукування гібридного білка, спосіб індукування визрівання фолікулів Download PDFInfo
- Publication number
- UA52646C2 UA52646C2 UA98094928A UA98094928A UA52646C2 UA 52646 C2 UA52646 C2 UA 52646C2 UA 98094928 A UA98094928 A UA 98094928A UA 98094928 A UA98094928 A UA 98094928A UA 52646 C2 UA52646 C2 UA 52646C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- sequence
- receptor
- suv
- hybrid protein
- bek
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 112
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 104
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 27
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims abstract description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 67
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 67
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 45
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 14
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 11
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 6
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 claims description 5
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 claims description 5
- 102000001895 Gonadotropin Receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108010040490 Gonadotropin Receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 5
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 claims description 5
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 5
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 claims description 4
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 claims description 4
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 claims description 4
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 claims description 2
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 claims description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims 3
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 claims 2
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 claims 2
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical class IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims 2
- 101800002836 Tumor necrosis factor-binding protein 1 Proteins 0.000 claims 2
- 102400000089 Tumor necrosis factor-binding protein 1 Human genes 0.000 claims 2
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 claims 2
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 claims 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 101800002837 Tumor necrosis factor-binding protein 2 Proteins 0.000 claims 1
- 102400000091 Tumor necrosis factor-binding protein 2 Human genes 0.000 claims 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims 1
- 108010080511 serum sodium transport inhibitor Proteins 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 12
- 239000000539 dimer Substances 0.000 abstract description 5
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 abstract description 2
- 101001125540 Homo sapiens 26S proteasome regulatory subunit 6A Proteins 0.000 abstract 1
- 101000653510 Homo sapiens TATA box-binding protein-like 2 Proteins 0.000 abstract 1
- 101000891654 Homo sapiens TATA-box-binding protein Proteins 0.000 abstract 1
- 102100030631 TATA box-binding protein-like 2 Human genes 0.000 abstract 1
- 102100040296 TATA-box-binding protein Human genes 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 74
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 69
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 17
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 8
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 7
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 6
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 6
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- -1 for example Proteins 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 4
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 3
- 244000019459 Cynara cardunculus Species 0.000 description 3
- 235000019106 Cynara scolymus Nutrition 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 102000009488 Thyroxine-Binding Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010048889 Thyroxine-Binding Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 235000016520 artichoke thistle Nutrition 0.000 description 3
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 101150024950 sstT gene Proteins 0.000 description 3
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 229940125377 Selective β-Amyloid-Lowering Agent Drugs 0.000 description 2
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 2
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- HOEFWOBLOGZQIQ-UHFFFAOYSA-N morpholin-4-yl morpholine-4-carbodithioate Chemical compound C1COCCN1C(=S)SN1CCOCC1 HOEFWOBLOGZQIQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 235000008001 rakum palm Nutrition 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 2,4-D Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241001132374 Asta Species 0.000 description 1
- 241000726103 Atta Species 0.000 description 1
- 241000786798 Atya Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000170006 Bius Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100492787 Caenorhabditis elegans mai-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100420681 Caenorhabditis elegans tir-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100426970 Caenorhabditis elegans ttr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000868422 Homo sapiens Sushi, nidogen and EGF-like domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000734214 Homo sapiens Unconventional prefoldin RPB5 interactor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 1
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101150063042 NR0B1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000743048 Puya Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241001549442 Salassa Species 0.000 description 1
- 241001240273 Sasala Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102100032853 Sushi, nidogen and EGF-like domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000710209 Theiler's encephalomyelitis virus Species 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000533793 Tipuana tipu Species 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100033622 Unconventional prefoldin RPB5 interactor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150094313 XPO1 gene Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- JKKPSTXVKNWEAH-VWHZSNQBSA-N bbip Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CNC(=O)C=2C=CC(=CC=2)C(=O)C=2C=CC=CC=2)CCC1 JKKPSTXVKNWEAH-VWHZSNQBSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000003235 crystal violet staining Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000006525 intracellular process Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000006138 lithiation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- JLESVLCTIOAHPT-UHFFFAOYSA-N mmai Chemical compound C1=C(C)C(OC)=CC2=C1CC(N)C2 JLESVLCTIOAHPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 235000013550 pizza Nutrition 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 230000002477 vacuolizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C209/00—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
- C07C209/04—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton by substitution of functional groups by amino groups
- C07C209/22—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton by substitution of functional groups by amino groups by substitution of other functional groups
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
- A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
До складу гібридного білка входять дві коекспресовані амінокислотні послідовності, які утворюють димер. До складу кожної послідовності входить зв'язувальна ділянка рецептора, наприклад ТВР1 або ТВР2, або ліганду, наприклад IL-6, IFN- та ТРО, зв'язана з субодиницею гетеродимерного білкового гормону, наприклад hCG. До складу кожної коекспресованої послідовності входить відповідна субодиниця гормону для утворення гетеродимеру під час експресії. Розкриваються відповідні молекули ДНК, вектори експресії та клітини-хазяї, а також фармацевтичні композиції та спосіб одержання таких білків.
Description
Цей винахід має відношення до гібридного білку, до складу якого входять дві коекспресовані амінокислотні послідовності, які утворюють димер, причому до складу кожної з них входить: як мінімум одна амінокислотна послідовність, яку вибирають з-посерод гомомерного рецептору, ланцюгу гетеромерного рецептору, ліганду та їх фрагментів; субодиниця гетеродимерного білкового гормону або його фрагменти; де (а) та (б) зв'язані безпосередньо або через пептидний лінкер та, у кожній парі, дві субодиниці (б) є різними і здатними до агрегування з утворенням димерного комплексу.
Передумови створення винаходу.
Взаємодії за типом білок-білок є невід'ємними для нормального фізіологічного функціонування клітин та багатоклітинних організмів. Багато білків у природі демонструють нові або оптимальні функції у разі утворення комплексу з одним або більшою кількістю ланцюгів інших білків. Це ілюструється різними комбінаціями ліганду-рецептору, які роблять свій внесок у регулювання клітинної діяльності. Певні ліганди, наприклад, фактор некротизації пухлин а (ТМЕа), ТМЕВ або хоріонічний гонадотропін людини (пс), виступають у вигляді мультисубодиничних комплексів. До складу деяких з цих комплексів входять численні копії тієї ж самої субодиниці. ТМЕРс та ТМЕ ГГ (які у подальшому описі колективно іменуються ТМЕ) є гомотримерами, утвореними трьома ідентичними субодиницями (1-4). До складу інших лігандів входять неідентичні субодиниці. Наприклад, пбо є гетеродимером (5-7). Рецептори також можуть виступати або функціонувати, як багатоланцюгові комплекси. Наприклад, рецептори ТМЕ трансдукують сигнал після агрегування з утворенням димерів (8, 9).
Ліганди до цих рецепторів стимулюють агрегування двох або трьох рецепторних ланцюгів, завдяки чому забезпечується механізм активації рецептору. Наприклад, ТМЕ-опосередковане агрегування активує рецептори ТМЕ (10-12).
Модулювання взаємодій за типом білок-білок може бути корисним механізмом для терапевтичного втручання у разі різноманітних захворювань та патологічних відхилень. Розчинні зв'язувальні білки, які можуть взаємодіяти з лігандами, потенційно здатні до вилучення ліганду з рецептору, наслідком чого є зменшення активації цього конкретного рецепторного шляху. У альтернативному варіанті, вилучення ліганду може затримати його елімінацію або деградацію, що тим самим спричинює подовження його ефекту та, можливо, його явної з активності іп мімо. У разі ТМЕ, розчинні рецептори ТМЕ пов'язувались, головним чином, з пригніченням активності ТМЕ (13-17).
Розчинні зв'язувальні білюи можуть бути придатними для лікування хвороб людей. Було показано, наприклад, що розчинні рецептори ТМЕ ефективно діють у тваринних моделях артриту (18, 19).
Оскільки ТМЕ має три зв'язувальні сайти для свого рецептору (10-12) і димеризація клітинного поверхневого рецептору є достатньою для біоактивності (8, 9), можливо, що зв'язування одиночного розчинного рецептору з ТМЕ залишить відкритою можливість того, що цей комплекс (1:3) розчинного рецептору: ТМЕ (тримеру) ще зможе зв'язувати та активувати пару клітинних поверхневих рецепторів ТМЕ.
Для досягнення пригнічувального ефекту слід було б очікувати, що два зв'язувальні сайти рецептору на тримері ТМЕ повинні бути зайнятими або блокованими розчинним зв'язувальним білком. У альтернативному варіанті, зв'язувальний білок може блокувати відповідну орієнтацію ТМЕ на клітинній поверхні.
Взагалі, відчувалась необхідність синтезування білків, до складу яких входило б два рецепторних (або лігандних) ланцюги, тобто димерного гібридного білку. Див. Уеллеч (УмМаїІасі) та ін., патент США Мо 5478925.
Головну стратегію, яку було використано для одержання димерних або мультимерних гібридних білків, до складу яких входили зв'язувальні домени з екстрацелюлярних рецепторів, становило злиття цих білків з константними ділянками важкого ланцюгу антитіла.
Згадана стратегія привела, наприклад, до створення імуноадгезинів СО4 (20). Це гібридні молекули, до складу яких входять перші два (або усі чотири) імуноглобуліноподібні домени СО4, злиті з константною ділянкою важких та легких ланцюгів антитіла. Цю стратегію утворення гібридних молекул було адаптовано до рецепторів ТМЕ (10, 16, 21), завдяки чому було одержано генно-інженерні конструкції з вищою активністю іп міо, аніж у мономерних розчинних зв'язувальних білків.
Широко розповсюдженою є думка про те, що більш висока активність димерних злитих білків іп мйго повинна перетворюватись на більш високу активність іп мімо. Підтвердженням цього є одне з досліджень, результати якого демонструють, як мінімум, п'ятдесятикратне підвищення активності злитого білку р75 (ТВР2)-
Ід при захисті мишей від наслідків інтравенозного впорскування ліпополісахаридів (ГР) (16).
Однак, незважаючи на широкорозповсюджене використання імуноглобулінових злитих білків, ця стратегія має декілька недоліків. Один з них полягає у тому, що певні Ес домени імуноглобуліну беруть участь у ефекторних функціях імунної системи. Згадані функції можуть бути небажаними за певних терапевтичних обставин (22).
Друге обмеження належить до особливих випадків, коли виникає необхідність у продукуванні гетеромірних злитих білків, наприклад, розчинних аналогів рецепторів гетеромірного 1-6 (інтерлейкіну-6) або інтерферону типу І. Незважаючи на існування численних методів продукування біфункціональних антитіл (наприклад, шляхом котрансфекції або злиття гібридом), ефективність синтезу значно погіршується сумішшю гомодимерів та гетеродимерів, які, як правило, при цьому утворюються (23). Нещодавно з'явилось декілька повідомлень, у яких наведено опис використання чинників зв'язування лейцину для направлення складання гетеродимерів (24-26). Це видається перспективним підходом для дослідницьких цілей, однак використані ненативні або інтрацелюлярні послідовності можуть виявитись непридатними для постійного застосування у клінічних умовах внаслідок антигенності. Обмеженнями можуть виявитись також ефективність складання та стійкість після складання.
З іншого боку, у конкретному випадку рецепторів ТМЕ було встановлено, що певні модифікації рецептору роб ТМЕ полегшують гомодимеризацію та передачу сигналу у разі відсутності ліганду (27, 28). Було встановлено, що цитоплазматична ділянка рецептору, яку називають "мовчазним доменом", може діяти як гомодимеризаційний чинник (28, 30). Як альтернатива імуноглобуліновому гібридному білку, наслідком злиття екстрацелюлярного домену рецептору ТМЕ з його цитоплазматичним мовчазним доменом може, можливо,
бути секретування білку, який може димеризуватись у разі відсутності ТМЕ. Такі злиті білки було розкрито та заявлено у міжнародний заявці М/О 95/31544.
Третя додаткова стратегія, яку було використано для одержання димерів розчинних рецепторів ТМЕ, полягала у хімічному зшиванні мономерних білків з поліетиленгліколем (31).
Суть винаходу.
Альтернативним способом одержання таких димерних білків, який надає деякі важливі переваги, є один з варіантів втілення цього винаходу, суть якого полягає у використанні природного гетеродимерного остову, який відповідає циркулюючому неімуноглобуліновому білку з довгим періодом напіврозпаду. Переважним прикладом є ПСО, тобто білок, який добре секретується, має висоїсу стійкість та довгий період напіврозпаду (32-33). Приймаючи до уваги головну роль пос, як маркеру вагітності, було розроблено багато реактивів для кількісного визначення та вивчення цього білку іп мімо та іп міго. На додаток до цього, ПСО екстенсивно вивчали за допомогою мутагенезу; відомо, що невеликі делеції білку, наприклад, видалення п'яти залишків на крайньому карбоксикінці « субодиниці, можуть ефективно ліквідувати його біологічну активність з одночасним збереженням його здатності до утворення гетеродимеру (34, 35).
Було показано, що невеликі інсерції, до 30 амінокислот, добре суміщаються на аміно- та карбоксикінцях а субодиниці (36), у той час, як злиття а субодиниці з карбоксикінцем 5 субодиниці також має незначний вплив на утворення гетеродимеру (37).
Повідомлялось також про аналог ПСО, у якого Ес домен імуноглобуліну було злито з С-кінцями б субодиниці по; ця генно-інженерна конструкція, однак, не секретувалась і не було здійснено спроб, спрямованих на її комбінування з а субодиницею (38).
Таким чином, головною ціллю цього винаходу є гібридний білок, до складу якого входять дві коекспресовані амінокислотні послідовності, які утворюють димер, причому до складу кожної з них входить: як мінімум, одна амінокислотна послідовність, яку вибирають з-посеред гомомерного рецептору, ланцюгу гетеромерного рецептору, ліганду та їх фрагментів; та субодиниця гетеродимерного білкового гормону або його фрагменти; де (а) та (б) зв'язані безпосередньо або через пептидний лінкер та у кожній парі дві субодиниці (б) є різними і здатними до агрегування з утворенням димерного комплексу.
Відповідно до цього винаходу, лінкер може бути ферментативне гідролізованим.
Послідовність (а), у переважному варіанті, вибирають з-посеред: екстрацелюлярного домену Рецептору 1
ТМЕ (55 кілодальтон, який також називають ТВРІ), екстрацелюлярного домену Рецептору 2 ТМЕ (75 кілодальтон, який також називають ТВР2), або їх фрагментів, до складу яких ще входить ліганд-зв'язувальний домен; екстрацелюлярних доменів рецепторів 1-6 (які також називають дрво та др130); екстрацелюлярного домену рецептору а/5-інтерферону (ІЕМ) або рецептору у-інтерферону; рецептору гонадотропіну або його екстрацелюлярних фрагментів; легких ланцюгів антитіл або їх фрагментів, які факультативно пов'язані з відповідними важкими ланцюгами; важких ланцюгів антитіл або їх фрагментів, які факультативно пов'язані з відповідними легкими ланцюгами; Рар-доменів антитіла; або лігандних білків, наприклад, цитокінів, факторів росту або гормонів, за виключенням гонадотропінів, до специфічних прикладів яких належать 1-6, ІЕМ-б, ТРО (тканинний активатор плазміногену) або їх фрагменти.
Послідовність (Б), у переважному варіанті, вибирають з-посеред ПСО, ЕЗН (фолікулостимулювальний гормон), -Н (лютеінізувальний гормон), ТеН (тиреотропний гормон), субодиниць інгибіну або їх фрагментів.
Модифікації білків, наприклад, хімічну деградацію або протеазне розщеплення остову білку, або хімічні або ферментативні модифікації певних бокових ланцюгів амінокислот, можна використовувати для інактивації компонентів гібридного білку за цим винаходом. Згадане обмеження активності може також здійснюватись шляхом використання засобів технології рекомбінантних ДНК для зміни кодувальної послідовності гібридного білісу таким чином, який безпосередньо обумовлює обмеження активності одного компоненту або робить білок більш придатним для наступної хімічної або ферментативної модифікації.
Наслідком утворення вищезгаданих гібридних білків буде поява монофункціональних, біфункціональних або мультифункціональних молекул, у залежності від амінокислотних послідовностей (а), які комбінуються з (Б). У кожній парі (а) може зв'язуватись з амінокінцями або з карбоксикінцями (б), або з обома.
До складу моноклонального гібридного білку за цим винаходом може, наприклад, входити екстрацелюлярний домен рецептору гонадотропіну, пов'язаний з однією з відповідних рецептор-зв'язувальних субодиниць гонадотропіну. Відповідно до цього варіанту втілення цього винаходу, гібридний білок за цим винаходом може бути молекулою, у якої, наприклад, екстрацелюлярний домен рецептору ЕН є пов'язаним з
ЕН для підвищення періоду напіврозпаду у плазмі та поліпшення біологічної активності.
Цей препарат може бути застосованим для індукування визрівання фолікул у методах штучного репродукування, наприклад, індукуванні овуляції або заплідненні іп міо, а також використовуватись, як засіб суттєвого підсилення біологічної активності згаданого гормону, що є обов'язковим для успішного здійснення згаданого процесу, завдяки чому зменшується потреба як у самому гормоні, так і у кількості впорскувань, необхідній для досягнення овуляції.
Рецептор фолікулостимулювального гормону (ЕН) та одержання екстрацелюлярного домену рецептору фолікулостимулювального гормону (Е5Н) людини було описано, відповідно, у УМО 92/16620 та МО 96/38575.
Відповідно до конкретного варіанту втілення, екстрацелюлярний домен рецептору фолікулостимулювального гормону людини (ЕСО) може лігуватись зі збереженням рамки зчитування пептидним лінкером, до складу якого входить сайт розпізнавання/розщеплення тромбіну (29) та який представляє "зв'язане" плече. Пептидний лінкер зв'язує екстрацелюлярний домен Е5ЗН з субодиницею ЕН.
Це забезпечує можливість видалення екстрацелюлярного домену рецептору ЕН шляхом розщеплення на сайті розщеплення тромбіну у разі, коли згадана молекула зустрічається з тромбіном у великому крузі кровообігу.
У іншому варіанті втілення цього винаходу, замість сайту розщеплення тромбіну використовують сайт розпізнавання того ферменту, найбільша кількість якого знаходиться у яєчнику. Таким чином, по мірі переміщення молекули ЕСО-Е5Н до яєчнику, вона піддається впливу ферментів, які знаходяться у найбільших концентраціях у цій тканині і ЕСО буде видалено, завдяки чому ЕЗ5Н може взаємодіяти з рецептором, зв'язаним з мембраною.
У ще іншому варіанті втілення цього винаходу, замість сайту розпізнавання ферменту між ЕСО та Е5Н клонується гнучка шарнірна ділянка, завдяки чому ЕСО ферментативне зі згаданого гормону не видаляється.
Таким чином, коли молекула ЕСО-ЕЗН надходить до яєчнику, між ЕСО, який знаходиться на шарнірній ділянці, та ЕСО рецептору Е5Н, який знаходиться на клітинній мембрані яєчнику, виникає конкуренція.
У додатковому переважному варіанті втілення цього винаходу, до складу гібридного протеїну входить агрегат пари послідовностей аа, до складу однієї з яких входить ТВРІ1 (або фрагменти від аа 20 до аа 161 або до аа 190), як (а), та а субодиниця пс, як (Б), у той час, як до складу іншої завжди входить ТВРІ (або ті ж самі фрагменти, що були вказані перед тим), як (а), та Б субодиниця пс або її фрагменти, як (Б). Відповідно до цього варіанту втілення, у залежності від конкретної послідовності, яка обирається, як (р) (5 субодиниця пСо у цілому або її фрагменти, або модифікації), одержаний гібридний білок буде мати одну активність (тільки активність ТВРІ) або комбінацію активностей (активності ТВР з активністю ПСО). У останньому згаданому випадку гібридний білок може бути використано, наприклад, у комбінованому лікуванні саркоми Капоші та послаблення метаболізму при СНІДІ.
У додатковому варіанті втілення цього винаходу, між двома субодиницями (Б) додається один або більше ковалентних зв'язків для підсилення стабільності 10 одержаного гібридного білку. Це може бути здійснено, наприклад, доданням одного або більшої кількості ненативних міжланцюгових дисульфідних зв'язків. Сайти для цих перехресних зшивок можуть бути визначеними з відомих структур гетеродимерних гормонів.
Наприклад, придатним сайтом у пСбОо може буги розміщення цистеїнових залишків на залишку Іуз45 субодиниці а та залишку біш21 субодиниці Б шляхом заміни сольового містку (нековалентного зв'язку) дисульфідним зв'язком (ковалентним зв'язком). Іншою ціллю цього винаходу є поліетиленгліколізовані або інші хімічно модифіковані форми гібридних білків.
Додатковою ціллю цього винаходу є молекула ДНК, до складу якої входить послідовність ДНК, яка кодує вищезгаданий гібридний білок, а також нуклеотидні послідовності, які, по суті, здійснюють те ж саме. До "нуклеотидних послідовностей, які, по суті, здійснюють те ж саме", належать усі інші послідовності нуклеїнової кислоти, які внаслідок виродження генетичного коду також кодують дану амінокислотну послідовність.
Для продукування гібридного білку за цим винаходом, послідовність (а) ДНК, як і (р), одержують з існуючих клонів. Послідовність ДНК, яка кодує необхідну послідовність (а), зв'язана з послідовністю ДНК, яка кодує необхідну послідовність (Б). Ці два злиті продукти вставляються до та зв'язуються з відповідною плазмідою або кожен з них вставляється до та зв'язується з різними плазмідами. Після утворення вектор експресії або два вектори експресії вводяться до придатної клітини-хазяїна, яка після цього експресує вектор(-и) для одержання гібридного білку за цим винаходом, як визначено перед тим.
Переважним способом одержання гібриду за цим винаходом є використання полімеразно-ланцюгової реакції з застосуванням олігонуклеотидів, специфічних для необхідних послідовностей, призначених для копіювання з клонів, які кодують послідовності (а) та (б).
Експресія будь-якого з рекомбінантних білків за цим винаходом, як згадувалось у цьому описі, може здійснюватись у еукаріотичних клітинах (наприклад, клітинах дріжджів, комах або ссавців) або прокаріотичних клітинах з використанням відповідних векторів експресії. Може застосовуватись будь-який метод, відомий у цій галузі техніки.
Наприклад, молекули ДНК, які кодують білки, одержані будь-яким з вищезгаданих способів, вставляють до відповідно сконструйованих векторів експресії за допомогою способів, добре відомих у цій галузі техніки (див.
Сембрук (ЗатргоокК) та ін., 1989). Дволанцюгова кДНК зв'язується з плазмідним вектором шляхом гомополімерного нарощування або шляхом рестрикційного зв'язування з залученням використання синтетичних лінкерів ДНК або способів лігування по "тупим" кінцям: для лігування молекул ДНК використовують ДНК-лігази, а небажаному поєднанню запобігають шляхом обробки лужною фосфатазою.
Для забезпечення здатності до експресування необхідного білку, до складу вектору експресії повинні входити також специфічні нуклеотидні послідовності, які включають транскрипційну та трансляційну регуляторну інформацію, зв'язану з ДНК, яка кодує необхідний протеїн таким чином, що забезпечуйся експресія гену та продукування білку. По-перше, для транскрибування гену йому повинен передувати промотор, який розпізнається РНК-полімеразою, з яким згадана полімераза зв'язується і, таким чином, розпочинає процес транскрипції. Існує цілий ряд подібних придатних для використання промоторів, які працюють з різною ефективністю (сильні та слабкі промотори).
У разі еукаріотичних хазяїв, у залежності від природи згаданого хазяїна, можуть використовуватись різні транскрипційні та трансляційні регуляторні послідовності. Вони можуть бути одержані з вірусних джерел, наприклад, з аденовірусів, папіломатозного вірусу великої рогатої худоби, вакуолізувального вірусу мавп і т.Ін., де регуляторні сигнали пов'язані з конкретним геном, який має високий рівень експресії. До прикладів належить ТК (тимідинкіназний) промотор вірусу герпесу, ранній промотор 5М40, промотор гену да14 дріжджів і т.ін. Можуть вибиратись регуляторні сигнали започаткування транскрипції, які забезпечують можливість репресії та активації, завдяки чому може модулюватись експресія генів.
Молекула ДНК, до складу якої входить нуклеотидна послідовність, яка кодує гібридний білок за цим винаходом, вставляється до вектору(-ів), який має функціонально зв'язані транскрипційні та трансляційні регуляторні сигнали і який є здатним до інтегрування необхідної послідовності генів до клітини-хазяїна.
Клітини, які піддаються постійному трансформуванню шляхом введення ДНК, також можуть відбиратись шляхом введення одного або більшої кількості маркерів, які забезпечують вибір клітин-хазяїв, які вміщують вектор експресії. Згаданий маркер може також забезпечувати ауксотрофного хазяїна фототропними здатностями, стійкістю до біоцидів, наприклад, антибіотиків або важких металів, наприклад, міді і т.ін. Ген селективного маркеру може або безпосередньо зв'язуватись з послідовностями генів ДНК, які призначені до експресії, або вводитись до тієї ж самої клітини шляхом котрансфекції. Для забезпечення оптимального синтезу білків за цим винаходом може також виникнути потреба у додаткових елементах.
До важливих факторів під час вибору конкретної плазміди або вектору на основі вірусу належать: легкість, з якою клітини-реципієнти, які вміщують згаданий вектор, можуть розпізнаватись та відокремлюватись від клітин-реципієнтів, які згаданого вектору не вміщують; кількість копій згаданого вектору, яка є необхідною у конкретного хазяїна; чи є необхідність у "човниковому" переміщенні згаданого вектору між клітинами-хазяями різних видів.
Після того, як вектор(-и) або послідовність ДНК, до складу яких входить згадана генно-інженерна конструкція(-ї), є готовими до експресії, генно-інженерна конструкція(-ї) ДНК може бути введена до відповідної клітини-хазяїна за допомогою будь-якого з цілого ряду придатних засобів: трансформації, трансфекції, кон'югації, злиття протопластів, електропорації осадження за допомогою фосфату кальцію, безпосереднього мікровпорскування |і т.ін.
Клітини-хазяї можуть бути прокаріотичними або еукаріотичними. Перевага надається еукаріотичним хазяям, наприклад, клітинам ссавців, наприклад, людини, мавпи, миші та клітинам яєчнику китайського хом'ячка (СНО), оскільки вони забезпечують посттрансляційні модифікації білкових молекул, у тому числі, відповідний спосіб впорядкування білкового ланцюгу або глікозилювання на відповідних сайтах. Клітини дріжджів також можуть забезпечувати посттрансляційні модифікації пептидів, у тому числі глікозилювання.
Існує ряд стратегій рекомбінантних ДНК, у яких використовують послідовності сильних промоторів та велику кількість копій плазмід, які можуть бути використані для продукування необхідних білків у дріжджах. Дріжджі розпізнають лідерні послідовності на продуктах клонованих генів ссавців та секретують пептиди, які несуть лідерні послідовності (тобто, попередники пептидів).
Після введення вектору(-ів), клітини-хазяї вирощують на селективному середовищі, яке відбирає для росту тільки ті клітини, які вміщують вектор. Наслідком експресії послідовності(ей) клонованих генів є утворення необхідних білків.
Очищення рекомбінантних білків здійснюється за допомогою будь-якого з методів, відомих щодо досягнення цієї мети, тобто, за будь-якою традиційною процедурою, яка включає екстрагування, осадження, хроматографування, електрофорез і т.ін. Додатковою процедурою очистки, якій може надаватись перевага для очищення білку за цим винаходом, є афінна хроматографія з використанням моноклональних антитіл, які зв'язують цільовий білок і які утворюються та іммобілізуються на гелевій матриці, яка знаходиться у колонці.
Неочищені препарати, до складу яких входить рекомбінантний білок, пропускають через колонку. Білок буде зв'язано у колонці специфічним антитілом, у той час, як домішки пройдуть через колонку. Після промивки білок елююють з гелю за допомогою зміни рН або концентрації іонів.
Термін "гібридний білок", який використано у цьому описі, у родовому значенні відноситься до білку, який складається з двох або більше різних білків або їх фрагментів.
Термін "злитий білок", який використано у цьому описі, означає гібридний білок, який складається з двох або більше білків або їх фрагментів, ковалентне зв'язаних між собою.
Термін "агрегація" який використано у цьому описі, означає утворення специфічних нековалентних взаємодій між двома поліпептидними ланцюгами, які утворюють комплекс, наприклад, таких, які існують між а та 5 субодиницями гетеродимерного гормону (наприклад, ЕН, ІН, по або Т5Н).
Термін "ліганд" або "лігандний білок", який використано у цьому описі, означає молекулу, за виключенням антитіла або імуноглобуліну, придатну до зв'язування ліганд-зв'язувальним доменом рецептору; така молекула може існувати у природному стані або може бути хімічно модифікованою або хімічно синтезованою.
Термін "ліганд-зв'язувальний домен", який використано у цьому описі, означає ділянку рецептору, яку залучено до зв'язування ліганду і яка, взагалі, є ділянкою або, по суті, представляє собою екстрацелюлярний домен у цілому.
Термін "рецептор", який використано у цьому описі, означає мембранний білок, зв'язування якого з відповідним лігандом запускає вторинні клітинні реакції, наслідком яких є активація або пригнічення інтрацелюлярного процесу.
Цей винахід, своїм додатковим аспектом, надає використання гібридного білку, як медикаменту. Згаданий медикамент, у переважному варіанті, надається у формі фармацевтичної композиції, до складу якої входить білок за цим винаходом разом з одним або більшою кількістю фармацевтичне прийнятних носіїв та/або наповнювачів. Такі фармацевтичні композиції представляють собою додатковий аспект цього винаходу.
Короткий опис малюнків.
Цей винахід буде більш зрозумілим у разі посилання на малюнки, які додаються, на яких:
Фіг.1(а) та 1(Б) - генно-інженерні конструкції ТВР(20-161)-пСба га ТВР(20-161)-пПСОБ, відповідно, та відповідні послідовності (Послідовності МеМе 1-4). Послідовність лінкера, зображена на фіг.1(а), є АІа-Сс1у-Аїа-
АІа-Рго-СІу (Послідовність Ме 9). Послідовність лінкера, зображена на фіг.1(Б), є АіІа-СІу-АІа-СІу (Послідовність
Мо 10).
Фіг.2(а) та 2(Б) - генно-інженерні конструкції ТВР(20-190)-пиСсбСа та ТВР(20-190)-пСОб, відповідно, та відповідні послідовності (Послідовності МеМе 5-8).
Фіг.3 - графік, який ілюструє дозозалежний захисний ефект ТВР-пСО (20-190), який експресовано клітинами СНО проти цитотоксичності, індукованої ТМРа, відносно клітин ВТ-20 та різних контролів.
Фіг4 -- графік, який ілюструє дозозалежний захисний ефект ТВР-пСО (20-190), який експресовано клітинами СО5, проти цитотоксичності, індукованої ТМРа, відносно клітин ВТ-20 та різних контролів.
Фіг.5 -- графік, який ілюструє дозозалежний захисний ефект очищеного засобами афінної хроматографії
ТВР-нСа (20-161), який експресовано клітинами СНО, проти цитотоксичності, індукованої ТМРа, відносно клітин ВТ-20 та різних контролів.
Докладний опис переважних варіантів втілення винаходу.
Цей винахід буде описано за допомогою наступних Прикладів, які не повинні розглядатися як такі, що будь-яким чином обмежують цей винахід.
Приклади.
Матеріали та методи.
Клітинні лінії, використані у цьому дослідженні, було одержано з Американської колекції типових культур (АТСС), Роквілл, Меріленд, якщо не вказано інше. Клітинну лінію СНО-0ШКХ було одержано від Л. Чазіна (Її.
Спавзіп) з Колумбійського університету через Д. Хаузмана (0. Ноизетап) з Масачусетського технологічного інституту (39). Клітини СНО-ОШКХ, які позбавлені функціонального гену для дигідрофолатредуктази, повсякденно підтримували у повному а-плюс модифікованому середовищі Ігла (4(49УМЕМ), доповненому 10905 сироватки зародку великої рогатої худоби (ЕВ5). Клітини СО5-7 повсякденно підтримували у модифікованому за способом Дульбекко середовищі Ігла (ОМЕМ), доповненому 1095 ЕВ5. У разі відсутності інших вказівок, клітини розводили для підтримки їх у лог-фазі росту; культуральні реактиви було одержано від компанії ОІВСО (Гренд Айленд, Нью-Йорк). 1. Складання генно-інженерних конструкцій, які кодують гібридні білки.
Основу нумераційних розподілів рецептору р55 ТМЕ складає робота Уеллеча (40) по клонуванню, у той час, як основу нумераційних розподілів субодиниць ПСО складають нумераційні розподіли з робіт Фідса (Рідде5) (41, 42) по клонуванню. Скорочення ТВР, або зв'язувальний білок ТМЕ, означає ділянки екстрацелюлярних доменів рецепторів ТМЕ, здатних до зв'язування ТМЕ. У цих прикладах генно-інженерні конструкції ДНК будуть називатися ТВР-гібридними білками з партнером та ділянкою ТВР, зазначеною у номенклатурі генно-інженерної конструкції. До складу усіх генно-інженерних конструкцій ТВР-пСО замість нативної сигнальної послідовності ро5 входить сигнальний пептид гормону росту людини (ПОН). На додаток до цього, сигнальний пептид ПОН розміщено таким чином, що він безпосередньо передує залишку Азр20 ТВР, завдяки чому, як гадають, цей перший залишок перетворюється у зрілий білок, який секретується. Ці модифікації не є суттєвими для основної концепції використання ПСО, як партнеру гібридного білку.
ДНК, які кодують гібридні білки, було сконструйовано з застосуванням методології полімеразно- ланцюгової реакції (43). а. ТВРІ1(20-161)-НСа.
Вихідну генно-інженерну конструкцію ТВР-ПСО було сконструйовано таким чином, що до її складу входив ліганд-зв'язувальний домен з екстрацелюлярної ділянки рецептору р55 ТМЕ (від Азр20 до залишку Сув5161, включно), злитий через короткий лінкер з а та 5 субодиницями ПСО (з започаткуванням на залишках аСуз7 або БРго7, відповідно). Ця генно-інженерна конструкція, яка у подальшому буде іменуватись ТВР1(20-161)- пс, є гетеродимером двох модифікованих субодиниць ПСО: ТВР11(20-161)-пСса та ТВР1(20-161)-пС ОБ.
Для генно-інженерної конструкції ТВР1(20-161)-пСсСа було використано олігодеоксинуклеотидні праймери, які наведено далі:
Праймер 1 (аб): ТТТ ТСТ СОА САТ БОС ТАС АСОо ТАА осо ССС (Послідовність Мо 11).
Праймер 2 (а). АСС тоб БОС АОС АС СОС АСА ОСА САС АСА СТО ОТ ТС (Послідовність Мо 12).
Праймер З (а); ТТ СС ост ОСТ ОСС ССА ОСТ ТОС ССА САА ТОС АСО СТА САС (Послідовність Мо 13).
Праймер 4 (а): ТТТ ТОС АТС СТТ АДО АТТ ТОТ САТ ААТ ААС ААС ТАС (Послідовність Мо 14).
Ці та усі інші праймери, які описано у цих Прикладах, було синтезовано на апараті для синтезування ДНК
Арріїеа Віозузіет5 Модеї! 392 (компанія АВІ, Фостер-Сіті, Каліфорнія), з застосуванням хімії фосфорамідиту.
Оскільки обидві генно-інженерні конструкції субодиниці ТВР-пСО мають однаковий 5'-кінець (тобто, 5'- кінець генно-інженерної конструкції ІОН/ТВР), праймер 1 (аб) було використано для обох генно-інженерних конструкцій субодиниці ТВР-ПСО. Для генно-інженерної конструкції ТВРІ(20-161)-пПСОБ було використано інші праймери, які наведено далі:
Праймер 2 (5): ССО ТО АСС АОС АСС ДОС АСА БА БАС АСА СТО ОТ ТС (Послідовність Мо 15).
Праймер 3 (5): ТОТ ОСТ ОСТ ОСТ ОСТ ССА Со ТОоС СОС ССС АТС ААТ (Послідовність Ме 16).
Праймер 4 (0): ТТТ То АТС СТТ АТТ ОТО БА ОбА ТСО обо ТО (Послідовність Мо 17).
Праймери 2 (0) та 3 (0) є зворотними комплементами і охоплюють як 3'-кінець кодувальної ділянки екстрацелюлярного домену р5»5, так і 5'-кшець а субодиниці ПСО. Подібним же чином, праймери 2 (2) та З (0) також є зворотними комплементами і охоплюють як 3'-кінець кодувальної ділянки екстрацелюлярного домену р55, так і 5-кінець 2 субодиниці ПСО.
Кожну з двох генно-інженерних конструкцій субодиниці ТВР-пСО було піддано двом полімеразно- ланцюговим реакціям. У першій з них було використано праймери 1 (аг) та 2 (с або г); плазміду, яка кодує розчинні залишки 20-180 р55 було використано, як матрицю, якій передував сигнальний пептид (плазміда рОоМУпОоНзрсоОМА.рАХ). У другій з них було використано праймери 3 (са або г) та 4 (с або 0); як матрицю було використано плазміду рем -пСса або реміІ-пСо (44). Для проведення полімеразно-ланцюгової реакції було використано полімеразу Мепі (ТМ) від компанії Мем Епдіапа Віоіар5 (Беверлі, Масачусетс) відповідно до рекомендацій виробника. Реакцію здійснювали впродовж 25 циклів за наступних умов: 100Омкг матричної ДНК; 1мкг кожного праймеру; 2Од. полімерази Мепі (ТМ) (компанія Мем Епдіапа Віоїабв); денатурація при 997С впродовж 30 секунд; ренатурація при: 597С впродовж 30 секунд для праймерів 1 (аб) та 2 (а); 597С впродовж 30 секунд для праймерів З (а) та 4 (а); 57"С впродовж 30 секунд для праймерів І (аб) та 2 (8); 63"С впродовж 30 секунд для праймерів З (СГ) та 4 (5), подовження при 75"С впродовж 75 секунд.
Продукти полімеразно-ланцюгової реакції мали потрібний розмір, що було перевірено засобами електрофорезу у 295 агарозному гелі з забарвленням етидію бромідом. Після цього фрагменти очищали на колонці М/7ага (компанія Рготеда) відповідно до рекомендацій виробника колонки.
Кінцеву кодувальну послідовність для ТВРІ1(20-161)-пСбба складали за допомогою полімеразно-
ланцюгової реакції злиття з використанням праймеру 1 (05) та праймеру 4 (а) та, як матриці, очищених продуктів з фрагментів ро5 та пСба, одержаних у перших полімеразно-ланцюгових реакціях. Спочатку дві матриці, які, внаслідок перекриття праймерів 2 (а) та З (а) можна було піддавати денатурації та ренатурації разом, пропустили через 10 циклів полімеразно-ланцюгової реакції за відсутності будь-яких доданих праймерів. Умови проведення цих циклів були, по суті, ті ж самі, що і у попередніх, за виключенням того, що ренатурацію здійснювали при 67"С, а подовження проходило впродовж 2 хвилин. У кінці згаданих 10 циклів було додано праймери 1 (аб) та 4 (0), після чого здійснено ще 10 циклів. Умови проведення кінцевої групи реакцій були такими ж самими, що і раніш, за виключенням того, що температура проведення ренатурації дорівнювала 59"С, а подовження здійснювали впродовж 75 секунд.
Результати аналізу продуктів цієї реакції за допомогою електрофорезу у 195 агарозному гелі підтвердили одержання необхідного фрагменту, який дорівнював, приблизно, 1100 п.н. Продукти реакції пропускали через колонку М/і2ага з метою очищення фрагменту, який після цього розщеплювали за допомогою Хваї та Ватні і піддавали поновному очищенню у 0,790 агарозному гелі з низькою температурою розтоплення. Очищений фрагмент було субклоновано до плазміди ром (компанія РПпагптасіа), яку перед тим було піддано розщепленню за допомогою Хра! та Ватні та очищенню у 0,895 агарозному гелі з низькою температурою розтоплення. Після літування за допомогою лігази Т4 згадану суміш було використано для трансформування
АСІ1 Е.соїї з наступним висіванням на планшети з лактобіозою/ампіциліном для культивування впродовж ночі при 37"С. ДНК плазмід з ампіцилін-резистентних колоній аналізували шляхом розщеплення за допомогою Храї та Ватні для підтвердження присутності інсерційного сегменту (який вирізається у цьому переварі). Було виявлено шість клонів, які вміщували інсерційні сегменти. Один з них (клон 7) було відібрано для подальшої розробки; його було позначено рамі тТВвРИСсСа (як такий, що вміщував ТВРІ1(20-161)-пСса). Результати дідеоксисеквенування ДНК (за допомогою бЗедиепазе"мМм, компанія Ш.5. Віоспетіса!5, Клівленд, Огайо) інсерційного сегменту цього вектору підтвердили коректність цієї генно-інженерної конструкції та відсутність небажаних перебудов.
Кінцеву кодувальну послідовність для ТВР1(20-161)-пСо складали у спосіб, подібний до наведеного для
ТВРІ(20-161)-пнСба за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції злиття та праймерів 1 (аб) та 4 (5) і, як матриці, очищених продуктів з фрагментів ро5 та ПСО, одержаних у перших полімеразно-ланцюгових реакціях. Одержану плазміду ром, яка вміщувала необхідний інсерційний сегмент, було позначено, як рамі твРИСОВ. р. ТВР(20-190)-пСа.
Другу групу білків ТВР-ПСО було одержано шляхом модифікування генно-інженерних конструкцій ТВР(20- 161)-пСо для одержання аналогу, до складу якого входив сегмент ТВР, який простягався від Азр 20 до Тпг 190, замість ділянки 20-161 вихідного аналогу. Це було здійснено заміною фрагменту між сайтами ВО! та хХваї! у плазміді раМТВРИССса на фрагмент, одержаний за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції, до складу якого входила згадала перебудова. Згаданий фрагмент було одержано за допомогою полімеразно- ланцюгової реакції злиття. Було використано наступні праймери:
Праймер 1: ТТТ ТАС АТС ТСТ ТСТ ТОС АСА СТО САС (Послідовність Ме 18)
Праймер 2: ТТ ОСТ ОСС ТА СТО СТО АСТ (Послідовність Ме 19)
Праймер 3: АСТ САС БАС ТСА СОС АСС АСА СС ост ОСТ ОСС ССА ОСТ ТО (Послідовність Ме 20)
Праймер 4: ТТ ІТС ТАС АСА ДОС АОС АОС АОС ССА ТО (Послідовність Ме 21)
Праймери 1 та 2 було використано для одержання послідовності, яка кодує додаткові залишки р55 від 161-190. Полімеразно-ланцюгову реакцію здійснювали, по суті, як описано перед тим з використанням 1мкг кожного праймеру та руОсС-р55, як матриці. Подібним же чином, праймери З та 4 було використано для одержання, за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції, лінкеру між 3-кінцем ТВР-кодувальної ділянки та 5-кінцем а кодувальної ділянки субодиниці ПСО з використанням, як матриці, плазміди рем тТВвРИСса. За даними аналізу засобами електрофорезу у поліакриламідному гелі (РАСЕ) (895 гель), продукти згаданих полімеразно-ланцюгових реакцій мали відповідний розмір (приблизно, 296 п.н. та 121 п.н., відповідно). Після цього вони буї и піддані очищенню за допомогою колонки Умігага. Склад праймерів 2 та З був таким, що до нього входила ділянка перекриття, завдяки чому два продукти полімеразно-ланцюгової реакції (з праймерів 1 та 2 та з праймерів З та 4) можна було піддавати ренатурації для полімеразно-ланцюгової реакції злиття з праймерами 1 та 4. Після реакції злиття було одержано необхідний продукт (приблизно, 400 п.н.), який очищали за допомогою 1,595 агарозного гелю та колонки М/ізага. Після цього згадану ДНК розщеплювали за допомогою Валі га Хра! і лігували з Ва1П/ХраІ-розщепленою ром твРИСса. Присутність інсерційного сегменту у плазмідах, виділених з трансформованої АС! Е.соїї було підтверджено розщепленням за допомогою Ва! та Храї. Нову генно-інженерну конструкцію було позначено, як рем твВР(20-190)-пСса.
Подібним же чином, плазміду рем ТВвВРИСО було модифіковано шляхом заміни фрагменту ВоПІ-Хсті.
Однак, це було здійснено шляхом субклонування продукту простої полімеразно-ланцюгової реакції, а не продукту полімеразно-ланцюгової реакції злиття. Було використано праймери 1 та 25 (див. далі), та рОС-р5об5, як матрицю.
Праймер 20: ТТ ТСС АСА ССС АСОо СТО ОСА То АТО оо Со САС СОТ ОБА ССА СА ССА ОСТ
СТО СТО ССТ САС ТСС ТСА СТО (Послідовність Мо 22)
Одержаний продукт полімеразно-ланцюгової реакції (приблизно, 337 п.к.) було перевірено, як описано перед тим, розщеплено за допомогою ВдтТі! та Хеті, після чого ліговано з ВоаП/ХраІ-розщепленою ром твВРєРИСОБ. Присутність інсерційного сегменту у плазмідах, виділених з трансформованої АС1 Е.соїї було підтверджено розщепленням за допомогою Вл! та Хсті. Нову генно-інженерну конструкцію було позначено, як рМмІ-тВР(20-190)-пСОВ.
У подальшому нові генно-інженерні конструкції було перевірено шляхом секвенування ДНК.
На додаток до продукування цих нових плазмід на основі ром, ці генно-інженерні конструкції було також субклоновано до інших векторів експресії, які, можливо, були більш придатними для стабільної експресії у
СНО, зокрема, до вектору Юа, який раніше було описано, як плазміду СІНЗАХОМ2ОНЕК (45). Це було здійснено шляхом перетворення сайту Ватні, який фланкував інсерційні сегменти у векторах на основі рем, на сайт Хпої, з наступним видаленням інсерційного сегменту за допомогою Хпої та його клонування до Хпо1!- розщепленого а. 2. Тимчасова та стабільна експресія гібридних білків.
Трансфекцію клітин СО5-7 (Американська колекція типових культур СКІ 1651, Мо 46) для тимчасової експресії гібридних білків ТВР-ПСО було здійснено за допомогою електропорації (47). Клітини СО5-7 на етапі експоненціального росту видаляли шляхом трипсинізації, збирали за допомогою не дуже активного центрифугування (800 об/хв, 4 хвилини), промивали холодним фізрозчином, забуференим фосфатом (РВ5), рН 7,3-7,4, після чого осаджували центрифугуванням. Клітини ресуспендували у концентрації 5 х 106 клітин на 400мкл холодного РВ5 і змішували з 7Омкг плазмідної ДНК у попередньо охолодженій кюветі для електропорації з 2мм проміжком. Для котрансфекцій було використано по 5мкг кожної плазміди. Кювету та клітини додатково охолоджували на льоду впродовж 10 хвилин, після чого піддавали електропорації за допомогою апарату ВТХ Модель 600 (125 В, 950 мФ, к-8). Далі клітини охолоджували на льоду впродовж 10 хвилин, переносили до 15мл конічної колби, у якій знаходилось 9,5мл повного живильного середовища (модифіковане за способом Дульбекко середовище Ігла (ОМЕМ), доповнене 1095 сироватки зародку великої рогатої худоби (ЕВ5) та 195 І -глутаміну) і витримували при кімнатній температурі впродовж 5 хвилин. Після обережного перемішування у 15мл колбі, вміст у повному об'ємі висівали на два планшети Р100 і поміщали до термостату (37"С, 595 СО»2). Через 18 годин згадане середовище було замінено, і, у деяких випадках, до складу нових середовищ входили лише 1905 або 095 ЕВ5. Через 72 години кондиційовані середовища збирали, центрифугували для видалення клітин, після чого зберігали замороженими при -7070.
Трансфекції клітин СНО-ДШКХ (СНО) для тимчасової або стабільної експресії здійснювали за допомогою осадження ДНК фосфатом кальцію. За двадцять чотири години до трансфекції, клітини СНО на етапі експоненціального росту висівали на культуральні чашки діаметром 100мм з густиною 7,5 х 105 клітин на чашку. У день трансфекції 10мкг плазмідної ДНК переносили до 0,5мл трансфекційного буферу (див. далі), додавали Зімкл 2М Сасі», розчин ДНК-СаСі» інтенсивно перемішували і відстоювали при кімнатній температурі впродовж 45 хвилин. Після цього згадані середовища з чашок відсмоктували, до клітин за допомогою стерильної пластикової піпетки додавали ДНК і залишали клітини при кімнатній температурі на 20 хвилин. По завершенню цього часового періоду, до чашок додавали 5мл повного а(4)МЕМ, до складу якого входило 1095 ЕВ5, з їх наступним інкубуванням при 37"С впродовж 4-6 годин. Після цього середовища з чашок видаляли відсмоктуванням, клітини піддавали гліцериновому шоку шляхом їх інкубування з розчином 1595 гліцерину у трансфекційному буфері при 37"С впродовж 3,5 хвилини. Після видалення гліцеринового розчину клітини двічі промивали РВ5, додавали 1Омл повного «(4)МЕМ, 1095 ЕВ5 і знову вміщували до термостату (37"С). Для здійснення постійних трансфекцій, клітини через 48 годин розводили 1 : 10 і додавали вибіркове середовище (повне а-мінус МЕМ (без нуклеозидів), 1095 діалізованої ЕВ5 та 0,02мкМ метотрексату).
Нетрансфектовані (нерезистентні) клітини, як правило, видаляли через 3-4 тижні з одержанням популяції трансфектованих метотрексат-резистентних клітин. 3. Кількісне визначення експресії.
Секретування гібридних білків трансфектованими клітинами визначали за допомогою комерційного тест- набору для розчинного р55 (компанія КУО Зузіет5, Мінеаполіс, Мінесота) відповідно до інструкцій виробника.
Цей тест, крім того, допомагав визначити рівні гібридних білків у кондиційованому та обробленому середовищах, які було використано, як основу для вибору доз, призначених для застосування при постановці біопроб. 4. Визначення утворення гетеродимеру.
Для визначення здатності гібридних субодиниць ТВР-пСОо до об'єднання та утворення гетеродимерів, було здійснено імуноферментний сендвіч-аналіз з застосуванням антитіл до субодиниць ПСО. У цьому аналізі моноклональне антитіло до 5 субодиниці ПСО наносять на мікротитраційні планшети і використовують для захвату досліджуваної речовини. Первинним ідентифікувальним антитілом є козяче поліклональне антитіло, одержане проти а субодиниці ТЗН людини (Ме 08242205 - компанія Віодезідп Іпіегпайопа!; Кенненбункпорт,
Мен), яке, у свою чергу, ідентифікували за допомогою кролячого антикозячого поліклонального антитіла, кон'югованого пероксидазсю з хрону (компанія Сарреї; Дархем, Північна Кароліна).
У цій роботі було використано декілька різних анти-пСбО 5 субодиничних антитіл; усі вони продемонстрували відсутність перехресної реактивності з вільною а субодиницею. Одне з цих антитіл (3/6) використовується у комерційне доступному тест-наборі МАІАсіопе ПСО (компанія Віодаїа; Рим, Італія).
Мікротитраційні планшети з високим рівнем зв'язування білків (компанія Совіаг Мо 3590) сенсибілізували іммобілізованим антитілом шляхом інкубування (2 години при 37"С) з 100мкл/лунку 5мкг/мл розчину антитіла у буфері для сенсибілізування поверхні (РВ5, рН 7,4, 0,1 тМ Са", 0,1 тМ Ма"). Після одноразової промивки промивальним розчином (РВ5, рН 7,4 ж 0,195 Твін 20) планшет блокували шляхом заповнення лунок доверху (400мкл/лунку) блокувальним розчином (395 сироваткового альбуміну великої рогатої худоби (ВЗА; фракція М-
А-4503 Зідта) у РВ5, рН 74) та інкубували впродовж однієї години при 37"С або впродовж ночі при 4". Після цього планшет двічі промивали промивальним розчином і додавали еталонні та експериментальні зразки, розведені у розріджувачі (5 мг/мл В5А у РВ5, рН 7,4) до одержання 100мкл об'єму. Після інкубування зразків та планшету впродовж двох годин при 37"С, планшет знову двічі промивали промивальним розчином.
Додавали (1О0Омкл/лунку) первинне ідентифікувальне антитіло, розведене 1 : 5000 у розріджувачі та інкубували впродовж 1 години при 37"С. Додавали (100мкл/лунку) вторинне ідентифікувальне антитіло (кролячий антикозячий Ід, кон'югований пероксидазою з хрону), розведене 1 : 5000 у розріджувачі, і після інкубування впродовж 1 години при 377"С планшет тричі промивали промивальним розчином. Додавали 100 мкл субстратного розчину ТМВ (компанія Кігкедаага апа Регтгу ГІ арогайюгієз), планшет інкубували впродовж 20 хвилин у темряві при кімнатній температурі, після чого ферментативну реакцію зупиняли шляхом додання
БОмкл/лунку 0,3 М Н25БОх. Після цього планшет аналізували за допомогою апарату для читання мікротитрувальних планшетів, який було виставлено на довжину хвилі 450О0нм.
5. Часткова очистка.
Для поліпшення кількісного визначення активності згаданих гібридних білків, гібридні білою ТВР-пПСОа піддавали частковому очищенню засобами імуноафінної хроматографії. Було застосовано моноклональне антитіло, комерційне доступне від компанії КУО Бузіет5 (МАВ Ме 225). Колонку було заповнено СМВг- активованою сефарозою, до якої вносили антитіла у відповідності з інструкціями виробника (компанія
РНагтасіа).
Збір кожної лінії клітин (п'ять зборів для кожної лінії), якому піддавали кондиціоновані конфлюентні культури у матрацах Т-175, щоденно складав 5ЗХО0мл середовища 5ЕМІЇ (компанія СІВСО). Збори піддавали центрифугуванню (1000об/хв) для видалення клітинного дебрісу. Після цього матеріал піддавали аналізу на вміст ТВР за допомогою комерційного набору для імуноаналізу та концентрували (апарати Сепігісоп компанії
Атісоп, Беверлі, Масачусетс) таким чином, що явна концентрація ТВР становила, приблизно, 5Онг/мл.
Десять мл концентрованого ТВР-пПСО (зразок Ме 18873) вносили, приблизно, до 1М масі шляхом додання масі, і провідність згаданого розчину доводили, приблизно, до рівня 85мікросіменсів/см. Згаданий розчин пропускати через 0,5мл анти-ТВР імуноафінну колонку. Елюент збирали і знов пропускати через колонку.
Після цього колонку промивали 1М Масі у РВ5. Зв'язаний ТВР(20-161)-пСО збирали після елюювання 50тМ лимонною кислотою (рН 2,5). Елюат (приблизно, 7мл) концентрували фільтруванням за допомогою апарату
Атісоп Сепіісоп- 105 у відповідності до інструкцій виробника (компакія Атісоп) до об'єму, приблизно, 200мкл.
Приблизно, 800мкл РВ5 додавали дня доведення об'єму зразку до 1мл, який зберігали при 4"С до проведення біопроби. 6. Визначення анти-ТМЕ активності.
Для оцінки аналогів розчинних рецепторів ТМЕ було розроблено численні проби на ТМЕ-індуковану цитотоксичність іп міо. Нами було використано пробу з застосуванням клітинної лінії карциноми грудної залози людини - клітини ВТ-20 (Американська колекція типових культур НТВ 19). Використання цях клітин, як основи біопроби на ТМЕ, було описано раніше (48). Ці клітини культивують при 37"С у середовищі ЕРМІ 1640, доповненому 10595 інактивовакої нагріванням ЕВ5. Клітини вирощували до максимального 80-9095 злиття, для чого клітини через 3-4 дні розводили до посівної густини, яка складала, приблизно, З х 1092 клітин на матрац
Т175сму.
У пробі на клітинах ВТ-20 включення клітинного барвника, кристалвіолету, використовують, як ідентифікаційний метод визначення виживаності клітин після обробки ТМЕ. Мертві клітини нездатні до поглинання та утримування барвника.
Стисло, протокол, який використовують для проведення проби на анти-ТМЕ активність, виглядає наступним чином. Рекомбінантний ТМЕРа людини (компанія КеО бБузіет5) та експериментальні зразки вирощують у живильному середовищі (КРМІ 1640 з 595 інактивованої нагріванням ЕВ5) і додають до лунок 96- лункових культуральних планшетів. Після цього у ці лунки висівають клітини з густиною 1 х 105 клітин/лунку.
Кількість доданого ТМЕсо було визначено перед тим під час проведення титраційних досліджень, і вона представляє собою дозу, яка вбиває, приблизно, 5090 клітин.
Після додання зразків клітини культивують впродовж 48 годин при 39"С, після чого за допомогою забарвлювання кристалвіолетом та апарату для читання мікротитрувальних планшетів (57Онм), визначають долю життєздатних клітин
Результати. 1. Експериментальні генно-інженерні конструкції.
Схеми проведення досліджень гібридних білків у скороченому узагальненому вигляді наведено далі; з порівняльною метою було досліджено дза контрольні білки: мономерний розчинний р55 (/-пТВР-1) та димерний білок, одержаний злиттям ТВР-імуноглобуліну (ТВР-Ідо3) (одержаний, по суті, як описано у (10)).
Генно-інженерна Я Я
Послідовності ДНК, які кодують ТВР(20-190)-ПСО та ТВР(20-161)-пСО наведено на фіг.1 та 2, відповідно. 2. Секретування білків ТВР-НСО.
Було встановлено, що усі досліджені генно-інженерні конструкції продукувались та секретувались до культуральних середовищ трансфектованими клітинами ссавців. Ілюстративні дані наведено у Таблицях 1 та 2. 3. Складання злитих білків ТВР-ПСО (а0/5) до гетеродимерів.
Комбінацію ТВР-пСса та ТВР-ПСО було перевірено за допомогою імуноферментного сендвіч-аналізу для гетеродимеру ПСО.
Гетеродимер було виявлено лише у разі комбінованої трансфекції злитих субодиниць а та 0 (Таблиця 3). 4. Гібридні білюи ТВР-пСО демонструють підвищену активність м порівнянні з мономером ТВР.
Було встановлено, що гібридні білки, одержані у клітинах СО5-7 або СНО, були активними інгибіторами
ТМЕос у біопробі на ВТ-20. Узагальнені результати випробування деяких зразків наведено у Таблиці 4.
До зразків на середовищах їх було включено негативні контролі 31 (кондиційовані середовища з імітаційних трансфекцій).
Як показано на фіг.3-5 (точки на осі у), наслідком додавання ТМЕ (2,5нг/мл) було явне зниження кількості життєздатних клітин (за результатами визначення оптичної густини (00 570)). У кожному випадку, максимальним захисним ефектом у активних зразків було відновлення життєздатності клітин до рівня, який спостерігався за відсутністю доданого ТМЕ (тобто, контроль з поміткою "тільки клітини").
Обидва позитивні контролі, г-пПТВР-1 та ТВР-ІДОСЗ, посідають захисні властивості, причому вони демонструють очевидну дозозалежність та ЕО5О (ефективні дози), які дорівнюють, приблизно, 10Онг/мл для г-
НТВР-1 (фіг.3-5) та, приблизно, 1,5нг/мл для ТВР-ІдОЗ (фіг.3), відповідно.
Генно-інженерні конструкції ТВР-пСО з середовищ їх (СНО або СО5) або одержані шляхом імуноочищення, демонструють дозозалежний рівень захисту, причому ЕО5О коливаються у межах, приблизно, 2-11нг/мл (фіг.3-5).
Результати біопроб іп міо наведено у Таблиці 5. Наведені дані свідчать про те, що гібридні білки пригнічують цитотоксичність ТМЕ і що вони значно активніші, аніж мономер ТВР. Негативні контролі були позбавлені захисної активності.
На додаток до можливості того, що димеризація ТВР може підвищувати активність, можливо також, що активність гібридних білків не пов'язана з димерною взаємодією з ТВР, а, скоріше, зі стеричним пригніченням внаслідок того, що партнер гібриду втручається у зв'язування ТВР/ТМЕ з клітинноповерхневими рецепторами
ТЕ.
Усі джерела, процитовані у цьому описі, у тому числі, журнальні статті або резюме, опубліковані або відповідні заявки на патенти СІЛА або зарубіжні патенти, видані патенти СІЛА або зарубіжні патенти та будь- які інші джерела, у повному обсязі включено до цього опису як посилання, у тому числі, усі дані, таблиці, малюнки та текст, представлені у згаданих джерелах. Додатково, усі джерела у повному обсязі, згадані у джерелах, які згадуються у цьому описі, також включено до цього опису як посилання.
Посилання на етапи відомих способів, етапи традиційних способів, відомі або традиційні способи ні в якому разі не є припущенням того, що будь-який аспект, опис або варіант втілення цього винаходу розкривається, описується або пропонується у відповідній галузі.
Наведений опис конкретних варіантів втілення цього винаходу з такою повнотою розкриває загальну природу цього винаходу, що інші можуть, використавши фахові знання у відповідній галузі техніки (у тому числі, вміст джерел, зацитованих у цьому описі), легко модифікувати та/або адаптувати для різних варіантів застосування згадані конкретні варіанти втілення без непотрібного експериментування, без відхилення від загальної концепції цього винаходу. Таким чином, припускається, що подібні адаптації та модифікації будуть знаходитись у межах значення та діапазону еквівалентів розкритих варіантів втілення, основу яких складає опис та настанови, які наведено у цьому описі. Слід розуміти, що застосована фразеологія або термінологія призначені для опису, а не для обмеження, завдяки чому термінологія або фразеологія цього опису повинна трактуватися досвідченим фахівцем у світлі вчення та настанов, наведених у цьому описі, у поєднанні зі знаннями пересічного фахівця у цій галузі техніки.
ТАБЛИЦІ:
Таблиця 1
Тимчасова експресія СО5-7 (твердофазний імуноферментний аналіз на тироксин- зв'язувальний білок) твРІ 77 77777171 6в6с1
Генно-інженерні конструкції було експресовано за допомогою ром. (компанія Рпаптасіа)
Таблиця 2
Тимчасова експресія СО5 -7 (твердофазний імуноферментний аналіз на тироксин- зв'язувальний білок) твРіиСоВ(20-190).. | :.юЮЙ8ї
Генно-інженерні конструкції було експресовано за допомогою мишачого вектору (ра), до складу якого входив металотіоніновий промотор.
Таблиця З
Тимчасова експресія СО5 -7 (гетеродимерна проба на по)
Генно-інженерні конструкції було експресовано за допомогою мишачого вектору (ра), до складу якого входив металотіоніновий промотор.
Таблиця 4
Зразки, перевірені на анти-ТМЕ активність конструкція
Таблиця 5
Попередня оцінка гібридних білків у пробі на цитотоксичність ТМЕ конструкція біопробі на ВТ-2О" "Кількісне визначення матеріалу для дозування та визначення ЕОБ5О здійснювали за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу на тироксин-зв'язувальний білок.
ЛІСТИНГ ПОСЛІДОВНОСТІ: (1) ЗАГАЛЬНА ІНФОРМАЦІЯ (ї) ЗАЯВНИК: (А) НАЗВА: Арріїєй Кезеагсп Зузіет5 АКЗ
Ноїдіпд М.М. (В) ВУЛИЦЯ: 14 допп В. Согзігамед (С) МІСТО: Кюрасао (Е) КРАЇНА: Мешепапаз АпіШев (ГЕ) поштовий КОД (ІНДЕКС): (8) ПРІЗВИЩЕ: Кемпбелл Роберт К. (САМРВЕГ, Кобреп С.) (В) ВУЛИЦЯ: 25 Меадомгоок Огіме (С) МІСТО: Рентам (ЕЕ) ШТАТ: Масачусетс (Е) КРАЇНА: Сполучені Штати Америки (А) ПРІЗВИЩЕ: Джеймсон бБредфорд А. (ЧАМЕ5ОМ, Вгадююога А.) (В) ВУЛИЦЯ: 76 Робрбіпз 5ігеєї (С) МІСТО: Мільтон (ЕЕ) ШТАТ: Масачусетс (Е) КРАЇНА: Сполучені Штати Америки (8) ПРІЗВИЩЕ: Чеппел Скотт К. (СНАРРЕЇ,
Зсой б.) (В) ВУЛИЦЯ: 125 Сапюоп Амепие (С) МІСТО: Мільтон (ЕЕ) ШТАТ: Масачусетс (Е) КРАЇНА: Сполучені Штати Америки
(її НАЗВА ВИНАХОДУ: ГІБРИДНІ БІЛКИ (її) КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ: 22 (м) АДРЕСА ДЛЯ ЛИСТУВАННЯ: (А) АДРЕСАТ: ВКОМ/ОМ АМО МЕІМАКК (В) ВУЛИЦЯ:419 Бемепій бігеєї М.УМ., 56.
Зоо (С) МІСТО: Вашингтон (0) ШТАТ: Округ Колумбія (Е) КРАЇНА: США (ЕР) поштовий КОД (ІНДЕКС): 22207 (м) ФОРМА, ЯКА ЗЧИТУЄТЬСЯ КОМП'ЮТЕРОМ: (А) ТИП НОСІЯ: Гнучкий диск (В) КОМП'ЮТЕР: ІВМ РС сумісний (С) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА: РО-0О5/М5- роз (м) ДАНІ ПРО ПОПЕРЕДНІ ЗАЯВКИ: (А) Ме ЗАЯВКИ: 60/011 936 (В) ДАТА ПОДАЧІ: 20 лютого 1996 (С) КЛАСИФІКАЦІЯ: (мі) ІНФОРМАЦІЯ ВІДНОСНО ПОВІРЕНОГО /
АГЕНТУ: (А) ПРІЗВИЩЕ: Брауді Роджер Л. (Вгомау,
Водег Г..) (В) РЕЄСТРАЦІЙНИЙ НОМЕР: 25618 (С) НОМЕР ДО ПОСИЛАННЯ / РЕЄСТРО-
ВИЙ НОМЕР: САМРВЕГ ЇЇ. -2А РСТ (іх) ТЕЛЕКОМУНІКАЦІЙНА ІНФОРМАЦІЯ: (А) ТЕЛЕФОН: (202) 628-5197 (В) ТЕЛЕФАКС: (202) 737-3528 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме1: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 1049 п.н. (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: кКДдНК (іх) ОСОБЛИВІ ВІДЗНАКИ: (А) НАЗВАЖЛЮЧ: СО5 (В) МІСЦЕЗНАХОДЖЕННЯ: 2781047 (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме1:
ТОСАСАТОСС ТАСАССТААО ССССССТАЛА АТОССТТТЗа ОСАСААТСТО ТоСТолосос 60
АСАПОСАССО АССТСТАСАТ СОСАСОООСО САСТАЛСССТ САССТТТОбо ССТТСТОВАТ 120
СТСАСТАТСО ССАТОТАВОС ССАСТАТТТО ОССААТСТСА САДАОСТОСТ ССТСССТОСА 180
СССАТОСАСА САСААДАААСА ААСАОСТОСТ ОСАОСАСОСА сдатТостТосс СстотТтТОосІстТ 240 сесостоесст стсттоессстТ СтТОостТІТСТо СССАбОоС тТоСс соб дос тосС сто СТ 295 бБег Ак Тік Бех реч Гей 1 5 сто Ост отТтТтТ сосС сто сте ТтосС стТо ССС то СТТ САА САС сб АстТ ос 343 їем А1а Рпе сіу Бей Печ Суб Пей Рко Тур еп біп біз сіу бек Аіїа
САТ АСТ ПТО ТЗТ ССС САА ОбА ААА ТАТ АТО САС ССТ САА ДАТ ДАТ ТОоС 391
Авр бек УМаї Сув Рго біп сіу Пув Тук Ії Нія Ркго сій двп Авп б5ег
АТІ ТОС ТОТ АСС дАС ТОС САС ААА ОбА ДСС ТАС ОТТО ТАС ДАТ САС ТОТ 439
І1е Сув Су5 Тік Пцун Суз Нія Пув б1у Ту Тук Пец Тук Авп Авзр Сув
ССА СОС ССО соб САС САТ АС ЗАС ТОС Аоо САС тот сла дос зсс тес 487
Рко б1у Рко б1у біп Авр Тс АвБр СуБ Аку 013 Сув 01) бех біу бех 60 65 70
ТТС АСС ОСТ ТСА САА ААС САС СТО АОА САС ОТОС СТО дес о тТосС тес дАА 535
Рпе тру Ата Бех 01ч АвБп Нів Пе Акад Нів Сув цей Зех Сув Бех Пув 175 во 85
ТОС СА АЛЛО САА АТО ОТ САС СТО СА АТС тТСТ тост ТС АСА сто САС 583
Сув Агя Буз бі Ммеб с01у біп Уа1 б) 116 Бек бек Сув Тік Маї Авр 50 а5 100
ССО САС АСо сто тот СОС ТОоС Або ААб ААС САС ТАС СОС САТ ТАТ Тад 631
Ахч Авр Ті Маї Сув 01у Суз Ак Цув Ап бій Тух Агу Ніб Тух Ткр 105 110 115
АСТ САД АВС ОСТІ ТТС САС ТОС ТТС ААТ о ТОС дос сто ТОоС СТО ААТ соб 679
Бет с)й Авп цец Рре б1п Сув Ре Ап Суз бех Гей Сув печ Авп Ф1У 120 125 130
АСС ОТО САС ОСТС тТОС ТОС СА БАС ААА САС АС Одес сто тас дес тас 727
Тпк о Маї Нів Пес Бек Сув с1іп Сбіш цувз біп дп ТВ Уаї1 Сув Трх Сув 135 140 145 150
САТ ОСА СОТ ТТС тТТТ СТА АСА САА ААС ОСА тот сто тес тот сос ост 715
Нів А1їа біу Рпе Ре Пем Ак 21ц Авп о сії Сув уаї бЗех Сув Аза біу 155 160 165
ОСТ СС ССА ОСТ ТеС ССА САА ТОС АСО СТА САС САД ААС ОССА тТтТе тт 823
Аза Аза Рко а1у Суб Рко бій Суз Тих Пец біп 014 АБп о рго Ре рБе 170 175 180 тоссАо сСса ост ОСС ССА АТА СТТ САС ТОоС АтТа бос отосСс тос тто тет 8в71
Бек біп Рко с1у Аза Рго І16є Пец біп Суз Меє біу Сув Сув Ріе 5бех 185 190 - 195
АСА ОСА ТАТ ССС АСТ ССА СТА Са ТОС ААС ААС АСО АТО ТТ ОТО САА 819
Аха Аза Тут Рго ТПх Рхо цей Ак бес ув Пцув ТБх Меє цец Уаі1ї біп 200 205 210
Ал ААС ОСТ АСС ТСА ОА ТоС АСТ ТОС ТОТ СТА ОСТ ААА ТСА ТАТ дАС 967 цуз вп оУа1! ТПх бек бі бек Типу Сув Сув Уаї Аїа був бек Тухк Авп 215 220 225 230
Об СТО АСА СТО АТО бо бот ТТ ААА СТО САС ААС САС АСо бос Тос 1015
Акха уаї Тргоуаї Мес біу бі1іу Ре Пув Уаї 6510 Авп Нів Тіх біу Сув 235 240 245
САС ТОС АСТ АСТ ОТОТ ТАТ ТАТ САС ААА ТСТ ТА до 1049
Нів Суз бек ТПх Сув Тук Тут Нів Був Бех 250 255 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 2: (М ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 256 амінокислот (В) ТИП: нуклеїнова кислота (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: білок (їх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме 2
Бек Ак Так бек пес Ппей Пец Аза Рпе 01у Гей Пе СуБ Пей рко ТІр 1 5 10 15
Печш біп біч біу бек Аза Авр Зек Уаї Сузв Рко Сбіп сіу Пув Тух І1е
Нів Вго біп АБп АБп о БбБег І1е Сув Сув Тс Пцув Сув Нів цув б1у Трх
Тук ївц Тук Авп дер о Сув Рко біу Рко п1у б1п А5р ТБх Авр о Сув Ах 5О 55 6о біц Сув б1з БВег З1іу бек Рпе Трт А1їа бег 011 Авп Ні Пцемш Акд Нів 65 70 75 80
Сув реп бек Сув бек Мцув Сув АхЯЧ Був сій Мес с1у біп Маї січ І1е 85 зо 95 бек бек Суз Тіт Уаї Авр Ак дДяр Тіх Уаїії Суз б1у Суз дкд Буз Авп 100 105 110 біп Тук Акад Нів Тук Тер бек Сіц Азп Пес Ре сіп Сув рРпе Авп о сСув 115 120 125
Бех цем Сув бе Авп бС1у Тік УМаї Нів рем бек Сув Сіп сіц цув Сіп 130 135 140
Авп Тк уаї Сув Тік оСув Нів А1їа сіу Рпе Ріе Пец Ак С1ц Авп сім 145 150 155 160
Сув Маії бек Сув Аїа б0іу Аза Аза Рго с1іу Сув Рко 010 Сув ТПх ей 165 170 175 б1іп бій Авп о Рго Рре ре бек біп Рго б1іу Аїа Рко І1е цец Сіп Сув 180 185 190
Мес с1у СуБ Сув Ре бек Акд Аза тук рко ТНх Рко Пец Акуд Бех цув 195 200 205
Був Тпк Мес пен УМаї Сбіп ЦПув Авп оУаї ТБг обех сій бех ТЬк Сув Сув 210 215 220 чаї Аіа цуз бег Тух Авп Ак Уаї Тс Маї Меє Сіу сіу Рре цув Уаї 225 230 235 240
Сі Азп нія Тк 01у Сув Нів Сув бек Тік Сув Тук Тук нів Муз Бех 245 250 255 (2). ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 3: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 1202 п.н. (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: КДНК (іх) ОСОБЛИВІ ВІДЗНАКИ: (А) НАЗВАЖЛЮЧ: СО5 (В) МІСЦЕЗНАХОДЖЕННЯ: 2791199 (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме3:
СТООАЗАТОС СТАСАСОТАА ОСОСОССТАА ААТСССТТТО СОСАСААТаТ стосСтТодосо бо
САСАССТАОС САССТОТАСА ТООСАСООСа ОСАСТААССС ТОАООТТТОО СОСТТСТОАА 120
ТОТОАСТАТС ОССАТОТААС СССАСТАТТТ СОССААТОТС АПАААССТоС тТостТосстаб 180
АСОСАТОСАС АСАСАЛАААС АВАСАОСТОС ТОСАоСАбсс дДОдотостас сстоттосте 240 тссвбостосс тототтосес тотосттІТстТ соселабс тос соб дес тес ста 293 бек Акч ТЬг Бех Пе 260 сто сто аст о тттТ о сос сто Сто тТас сто сос отоо СТТ САА сдо СОС от 341 їз рей Аза Рре сп1іу цем Пе Сув Бе) Рко Ткр Гей біп б1ій б1у бек 265 270 275
ОСС АТ АСсТ ОТО ТСТ ССС САА ббА ДА ТАТ АТС САС ССТ САА ААТ ААТ 389 діа дар бек Уаї Сув Рко піп б1у Був Тук ї11е Нів рхо Зіп Авп Авп 280 285 290
ТС АТТ ТОС ТОТ АСС ДАО ТС САС ААА ОСА АОС ТАС ОТТО ТАС ААТ САС 437 бек І1е Суз Сув тТпх Пуз Сув нів Був біу тТбк тух Пец Тух Авп Авр 2935 300 305
ТТ ССА бос ССО са САС САТ Аа АС ТО АОС бдОо тот Сас дос бос 485
Сув Рко б1у Рко сіу Сіп АДяр Тк Авр о Сув Ахку сіц Сув б1й бек б1іу 310 315 320 325
ТСТ ТТС СС ОСТ ТСА САА ААС САС СТО АСА САС тТоС стТо ласо тас тос 533
Зек Рпе ТпПг Аза бек 01! деп Нів цей Агу Ніз Сув Пец бек Сув б5ег 330 335 340. '
ААА ТОС ССсА ААб САА АТО ОСТ сло ато САС АТО ТОТ ТСтТ тТОС АСА сто 581
Пцув Сув Аку цпуз біз Мес бі1у біп Уаї бій Ії бех Бех Сув Трк уві 345 350 355
БАС Соо САС АСС сто тот бас ТоС Або ААЗ ДАС САС ТАС СО САТ ТАТ 529
Ар АхЯ Авр Тіх Уаії Суз біу Суз Аку цув Авп біп Тух Аку Нів Тукг 360 355 370
ТО АСТ ОДА ДАС ОСТІ ТТС САС ТОС ТТС ААТ о ТаС АоС Сто ТОоС Сто АлАТ 677
Ткр бех біч Авп Пец Рре біп Суз Ріпе Азп Сув бЗех пес Сув Пец Авп 375 380 385 сО0 СС ста САС Сто тес ТО САС ОА ДАА САС АдС дос сто ТОС дес 725 сі1у Тв Уаї Ніз Пецш бек Суз біп піц цув с1іп Авп Так о Уаї Сув ТБх 390 395 400 405
ТОС САТ ССА ССТ ТС ТТТ СТА АСА САЛА ААС САС тот сто тТос тст ост 773
Сув Нів Аїа піу Рне Рпе пед Аку 0й)ч Ап бій Сув Чаї бек Суз Аза 410 415 420 сот ост ост ССА Сбо ТосС СОС ССС АТО ААТ СС дос ста ост ота А 821 с1у АТа біу Рко Ахкуд Сув Акд рго І1їе Азп Ата Так Тец АТїа Уаї Зі 425 азо 435
АдОо САС спос ТОосС СОС сто ТОС АТС СС СТО ВАС АСС СС АТС Тст сс 869
Був біз сіу Сув Рко Ма1ї Сув Х1е Три Уа1ї Авп Тпх Трк І1їе Сув Аіїа 440 445 450 бос ТАС ТС ССС АСС АТО дос со сто сто сао боб сто сто сос осс 317 сіу Тук Сув Рко Тапх Мес ТПх Адку Уаї Пец б1іп б1у уаї рей Рго діа 455 460 465 ста СсСтТ СаО сто сто ТС ААС ТАС СОС САТ ста Сас о тТТо САС ТОС АТС зе5 їец Рго біп Уаї Уаї Сувз Авп Тук Ак Ар Уаї Аку Рре біц бек І1е 470 475 480 485 со сто сст сос о тосС ссо сосС о сбосС ста вАС оСоС сто сто ТосС тТАС ОСТ 1013
Ак ей Рго сіу Сув Рко Акч біу Уаї Азп рко Маї Уаї бек Тух Аа 490 495 І 5О0 ста ост Сто АОС ТОТ САА тот ОСА СТО ТоС СОС СОС АОС АСС АСтТ АС зов
Ууаї Аїа Пец Бек Сув біп Сув А1ї1а йемш СуБ Аг Агу бек ТП Тих дер 505 510 515 тассоа ОТ ССС АС САС САС ССС ОТТО АОС ТОТ САТ САС ссс сос тТтТо 1109
Суз а1у сіу Рко цув Авр Нів Рхто ей Тік Суз Авр Ар Рко АкчЧ Ре 520 525 530
САС САС ОТСС ТСТ ОТОС ТСА Ас бСс сСсСтТ Сосс ССС АОС СТ ССА АС СсСА 1157 біп Авр бек бек бек Бех Пув Аіїа Рко Рго Рго бек Бей Рхо Бек Рко 535 540 54а5 тс са сто соб соб СОС тоб САС дос ССО АТО СТО ССА САА ТАА 1202
Бек АКкЯ Пец Рхо біу рко бЗех АБр ТБбЕ Рго ІТ1е Гемй Рко сій 550 555 560 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 4: (М ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 307 амінокислот (В) ТИП: амінокислота (0) топологія: лінійна (й) (її ТИП МОЛЕКУЛИ: білок (їх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме4 бек Акч ТБг обек рец пез пец Аза Ре аї1у йео цец СуБ Пец Рко Ткр і Б 10 15 пез б1п 1 с1у бек Аза Авр бек уаї Сув рРко біп б1у цуз Тух 1І11е
Нів Рко біп Авзп Авп бек І1е Сув Сув ТПх Пцув Суб Ніз цуз Сіу ТБк
Тух пес Тух Авп оАвр Сув Рко б51іу Рхо 01у біп Авр ТрПкг Авр Сув Ак9 бо
Сі. Сув бій Бек 41у бек Рибне тах А1а Бех бій Авип Нів Пец Аку. із 65 79 75 80
Суз рец Бех Сув бех Пцув Суз Акад Пув б1й1 Меб б1у с1п Уаї бі. І12е 85 з0 35
Бех Бек Сув ТПг Уаі Авр Акд Авзр Тік Уаї СубвБ с1у Суб Акуд Був Авп 100 105 . 110 біп Тут Агу Нів Тук Ткр Бех бій Авп пемш Рпе б1п Су5 Рре Авп Сув 115 120 125 ех рем Суз Меп АБп о сіу ТпПх Маї1 Нів Гей бек Сув аїп сії цув сід 130 135 140
Авп Тк оУМаії Сув ТБх Сув Нібв Аїа сіу Рпе Рпе Пецп Аку бій дзп бій 145 150 155 160
Суз Маї бек Сув А1їа біу Аіа біу Рко Акд Суз Акад Рко ІїІ1е Ап А1а 165 170 175
ТПпх оре Міа Маї бій цув бій б1іу Сув Рго Уаї Сув І1еє Тих Уа1ї Авр 180 185 190
Твг ТВ І1е Сув А1а сіу Тук Сув Рко Ту Мес Тбх Аг уаї реч сіп 195 200 205 сіу Маї цей Рхо А1ї1а Пец Рго біп Уаї Уаії Сув Авп Тук Акад Азр Маї 210 215 220
АхЯ Рпе 01 бек І1Зїе Акд Пец Ркго Сіу Суз Рко Аку біу УМаї Авп Рго 225 230 235 240 чаї Маї Бех Тух А1їа Уаї А1їа Пепй бЗег Сув біп Сув Аїа цей Суз Аху 245 250 255
Ата Бех Тпх Тр Авр Сув біу с1іу Рго був Аєр Нів Рхо цем ТпПх Сув 2650 2655 270
АЗзр Авр Ркго АхгуУ Рпе Сіп Азр Бек Бек бек бек Пуя Аїа Рхо Рко Рго 2715 280 285
Бех Гей Рко Бех Рко бЗег Акд Пец Рго а1у рко Зек Азр Тік Рго І1е 290 295 опо іїво рхо сіп 305 (2). ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 5: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 1147 п.н. (В) ТИП: нуклеїнова кислота
(С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: к днк (іх) ОСОБЛИВІ ВІДЗНАКИ: (А) НАЗВАЖЛЮЧ: СО5 (В) МІСЦЕЗНАХОДЖЕННЯ: 2781132 (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме5: бсСТ ТОС ССА САА ТОоС АСО СТА САС САА ААС ОССА ТТС тТто тес сао се 919 сіу Сув РКго 011 Сув Так Пец 41п біч дзп ртго Ре РБе бех біп рРго 510 о 515 520
ССТ ССС ССА АТА СТІ САС ТОС АТО СОС ТоС тТОосС ТтС ТСтТ АСА ОСА ТАТ 967 б1іу А1а Рко Ії цею біп Суб Меб Сіу Сув Сув Ріе Бех Акч Аіїа Туг 525 530 5з5
СОС АСТ ССА СТА АСС тес АдДОо ДАО АСО АТО ТТоО СТО САА Або АдСс сте 1015
РКО Тдх рРко Пец Аку бех Пув був Тік Мес Пем уУаї біп цуз Авп Уаї 540 545 550 7
АСС ТСА БАС ТСС АСТ ТОС о ТоОТ ОТА ОСТ ААА ТСА ТАТ ААС АСЯо сто АСА 1063
Тих Бех біц Бек Тік Сув Сув Маї Аїа був Бек Тук Азп Аку Уаї Тахг 555 5БО 565
СТА АТО боб ОСТ ТТ ААА ОТО САС АС САС да оса тс САС То дет 1111
Уаї Ме біу с1іу Рре Був Маї п1ц Авзп нів Тих Аза Суз Нів Суб бек
Ба 575 580 585
АСТ ТСТ ТАТ ТАТ САС ААА ТСТ ТАДООАТосСС ТосдОо 1147
ТБх Сув Тухк Тук Нів Пув бек 590 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 6: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 285 амінокислот (В) ТИП: амінокислота (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: білок (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Моб:
Бех Аку ТПх бек Пец Пец Пед Аза Ре д1іу пем Цей Сув їеч рко Ттр 1 5 10 15 їемс біп біо б1у бек Аїа Авр Зех Уаї Сув Ркго біп С1іу Був Тук І1їеє
Нів рРхо Сбіп Ап Авпобех Т1е Сув Сув Тік Пуя Сув Нів цув сіу ТвВг «5
Тук теп Тук АБп Ар Сув Рхо Сіу Рго б1у 012 Авр Тах Авр Суз Ах9д 60 суч Сув Січ бек 01у Бех Рре Ту А1їа бек 011 Азп нія цей АхкчЧч Нів 65 70 75 во
Сув цей Бех Сув бек пув Сув Агу пує 01 Меб біу сіп уаї Сіц Ії 85 80 95
Зек Бек Сув ТБх Уаї Авр Аку Авр ТіПх Маї Сув сіу СувБ дкч Був Авп 100 105 110 бій Тух Акад Ніз Тук Ткр Бек бій Авп ей Ре біп Сув РБе Авп Сув 115 120 125
ТЕ Пец Сув Пец Авп б1у ТВх Уаї Ні цей Бех Сув біп їй цуз біп 130 135 140
Авп Тпх Уаї Сув Тік Сув Ніз Аза Сіу Рре вне цей Аку сій Авп б1ч 145 150 155 160
Суз Чаї бек Сув Вех Авп Сув ув цув бЯвх ем бі Сув Тпх Був Тез 165 170 175 бек пем рко біп І11е сім Авп Уаї Ппув сіу ТБх Сі Авр бех б1у ТЕ 180 185 190
Тв Аза сіу А1а Аіа Рго б1у Сув Рко сії Сув Так реч іп бу Авп 195 200 205
Рго Рпе Рпе бек Сіп рко біу А1їа Рго Іїе Гей біп Сув Меє сіу сСув 210 215 220
Сув Ре Бех Ака Аїа Тук Рко Тих Рко Пец Акд бек Пцуз цувБ Тих Меє 225 230 235 - 240
Пед уаї біп Був АБп оУа1ї Ту бек біц Бех тре Сув Сув Маї А1а Цуз 245 250 255
Зек Тук Азп Ака Уаї ТПпе Уаї Мес сіу с1іу Рпе цуз Маї Пій АБ нів 260 265 270 тик діа Сув Нів Сув Зех Тих Суя Тук Тук Нібв пуб Бех 275 280 285 (2). ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 7: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 1301 п.н. (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) Топологія: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: КДНК (іх) ОСОБЛИВІ ВІДЗНАКИ:
(А) / НАЗВА/ЖЛЮЧ: СО5 (В) МІСЦЕЗНАХОДЖЕННЯ: 2791287 (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме7:
СТОСАСАТОа СТАСАССТАА ЗСаССССТАА ААТСССТТТО СССАСААТОоТ ОТОСТОоАОСо во
САСДСОСАОС САССТОТАСА тТОоосдобсаво пСАСТААСоо ТодОастТТТоо сОСТТСтТадА 120
ТОТСАСТАТС СССАТОТАДО СССАСОТАТТТ ССССААТСТО АСААдаСстТоСс ТоОсТоссСтос 180
АСССАТОСАС АСАСАДАВАС АААСАССТОС тТапАдосСАСОос дОодотТОоСстТоС сстТеттосто 240 тесосстоесе тототтосеос тетостттст сСсссдоос тос соб дСо Тос сто 293
Бек АкЯ ТпПЕ Бех цем 290 сто сто ост тттовас сто стос тТосС сто сс тоб СТТ САА пло бос АСтТ 343
Бей Пец діа Ре П1у Пец Бей Суз Пец Рхо Ттр Пец біп біц с1у Бех 295 300 305
ОСС САТ АСТ ОТО тот ССС САА СбА ДАХ ТАТ АТО САС ССТ САА ААТ ДАТ 389
Аїа Авр бек Маї Сув Рко сіп б1іу Був Ту Х1е Нів рко біп Авп Авп 310 315 320
ТСС АТТ ТОС ТсТ ДСС ДАС о ТОоС САС ААА ОбА АСС ТАС ОТТО ТАС ААТ САС 437 бБех Т1е Сув Сув тах цув Суб Нібв Гув Зіу ТПпу Тук Пей Тук Ап Авр 325 330 335 о тот ссА соасСсосссо обо СА САТ АСОо ПАС ОТОоС Або сда тот сабо Лос бос 485
Сув Рко с1у Рго біу біп Азр ТБу Авр Сув Ага сій Сув Сі бех а1У 340 345 350
ТС ТТС СС ОСТ ТСА САА ААС САС СТО АСА САС ТОС сто оС тТОоС Тос 5133
Бек Рпе Тіхг Аїа бек сій Аво Нів Пец Ага Нія Сув Гей Бег Сув Бех 355 360 й 365 370
ААА ТОС ССА ДАС САА АТС ОСТ САС сто САС АТС ТСТ о ТСТ о ТОС АСА сто 581 цув Суз Ах Шцуз сій Мес біу біп Уаї біц І1їе Бек бек Су Тіх Уаї 375 380 385 бдо соб САС АС сто тат обс о тос дос ААо АС ОСЛО ТАС СОС САТ ТАТ 629 двр Ага Авр Тпг Уаї Сув с1у Сув Акд цув АвпобОіп Тут Аха Нів. Тук 390 395 400 Й
ТО АСТ бАА АС ОСТТ ТТ САС ТОоС ТС ААТ о ТОоС АОС сто ТОоС Сто ААТ 677
Ткр Зек сі Авп Бей Рбе б1іп Суз Рре Авп Сув бех ГПей Сув цем Ав 405 410 415 по дос сто САС ОСТО ТОС ТоС СА СД АВА САб ААС дос сто ТосС дес 725 сіу Тпг Уаї Нів Пец бек Сув біл Сі Пуз біп Азп ТЕ Уа1ї Сув Тих а20 425 4зо
ТОС САТ ОСА ост ТІС ТТТ СТА ДБА бАА ВАС Ода тот оТС о Тос тот от 773
Сув НівБ Аіїа сі1у Рпе Рре Пем АкЯ 011 Авп обі) Суб Уаї бек Сув бек 435 440 445 450
ААСОТОТ АЛ АЛЛА АОС СТО до ТОосС АСа ААс ТтТа ТОС СТА СосС сАб АТ 821
АвпосСув пПув був Бек Пец біц Суз Тпг о Пув ред Сув Бей Рго б1іп Ще 455 460 465
САС ААТ СТТ АД СО АСТ САС САС ТСА ОС АСС дсд о сстТ ост ост от 869 січ Аза Маії пув бі1у тру бім Ар бек зіу ТНК: Тк Аза с1у діа Ф1У 470 475 во
ССА СОо ТОС СОС ССС АТС ААТ ОСС дос СТО ост сто ЗАб дда сАб ос 917
Рко Акуд Сув Акад Рко І1е Авп Аза Тк оре Аза Уаї біц цув б1ц б1Уу 485 490 495 тТОоС ССС ста ТОоС АТО АС Сто ААС АС АСС АТО тот ссо СОС ТАС ТОос 365
Сув Рко Маї СуБ І1е ТПх Ма1ї Авп ТіПк тТБг І1їе Суя А1а біу Тук Сув
БОО0 505 510
ССС АСС дта дес сос сто сто сло зоб ато сто соб о оос ста сст сда 1213
Рхто Тцк Ме ТПх Акд Уаї Ппей Зіп б1у Маї Гцез рко А1ї1а Пец Рго а1іп 515 520 5а5 530 сто Сто ТОС ААС ТАС СОС САТ сто СОС ТТо ЗАО ТоС АТО Со сто сст 1961
Ууаї Маї Сувз Авп о Тук Агд Авр Уаії Аку Ре 012 бек І12е Акд Тем рхо 535 540 545 озстас ссо сосС оосС ОТо ААС ССС ото сто тТосС тТАС бос осто ост сте 1109 б1у Сув Рко Аку Сіу Уаії Авп Рго Маії Маї Бех Тук Аза Уаї Азїа Гей 550 5655 560
ДОС ТСТ САА тот оСАоСсТо тТосС сСос сСосС АОС АС АСТ бде тосС обо ост 1157
Бех Сув біп Сув Аїа Бей Су5 Аку Ах бех Тр Тих Авр о Сув с1у С1У 565 570 | 575
ССС Ав аАС САС СОС ТТо АСС ТТ САТ САС СОС СОС ТтТо СА САС ТоеС 1205
Рго пу Авр Нів Рго Пец ТБу Сув АБр Авр Рко АкЯ Рпе бід Авр Бех: : 580 585 590
ТСТ ТОС ТСА лАб ОСС СсСТ СОС СОС ДОС СТ ССА АОС ОСА ТОС СбА Сто 1253
Бек Бех бек пуб А1а Рхо Рхо Рко бек ем Ро Бек Ртго беїх АкЧ Гец 595 600 605 610 ссо соб сСес тТса САС АСС СОС АТС СТО ССЬ САА т ААОСАТоОСТ Садо 1301 рхо а1іу рхо бЗех Авр ТБх Рхо І1е Тез рко біп 615 620
(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 8: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 336 амінокислот (В) ТИП: амінокислота (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: білок (їх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Мед:
бек Ак Ту бек Ппей Пец Тез Аза РБе біу Пец пемй Сув Бей Рко ТЕр 1 5 10 15 цец біп Січ сіу бек діа Авр бек Маї Суз рхо біп б01у пуБ Тух І1е 20 25 30
Нів рко біп Авп Авп бек І1е Суя Су Тік Пуз Сув Нів Пцув с1у ТВх 35 40 45
Тук рез Тухк АзпоАвр о Сув Рго Сбіу Ркго біу біп Авр ТтТПх Ар Сув Ака
БО 55 бо :
Счіц Сув січ бех с1у бек Рре Тих А1а бек біц Азп Нів реч Ахку Нів 65 70 75 во
Сув ем бек Суа Бек Пув СуБ Акч Мцув бій Меї біу біп Уаї 5011 І1е 85 90 95
Бех бег Сув ТПпК УМаї Авр Ак Азр ТИПх Уаї Суб сб1іу Сув АкЧч Пуз АБп 100 05 110 біп Тух Акз Нів Тут Тур бех біц Авзп гей Ріе біп Сув Рпе Авп о сСув 115 120 125
Бех Пец Сув цец Авп о сіу ТБу Уаї Нібв Пец бег Сув бій сіц цуз біп 130 135 140
Азп отТЬг о Уаї Суз ТІ Сув Нів діа сіу врБе Рбе Гей Дку бій Азп 1 445 150 155 160
Суз Уаі бек Суз бетх деп Сув Був пуб бек Пец біл Сув Ту Буз Гей 165 170 175
Суя пед Ркго біп І11е 014 Доп Заї Муз б1іу Тс 14 Авр Бех 9З1у ТЕ 180 185 190
Тих А1їа біу А1а с012у рРго Акч Сув Ах Рхо Її11е Азп Аїа Ту Печ Аі1а 195 200 205
Ммаї 81 пПув с1іц б1у Суз Рко Ма1ї Сув ІЗе Тік Уаї Авп Тапх ТБх І1е 210 215 220
Сув Аза Сіу Тух Сув Рко ТПх Мес Ти Акад Маї Ге біп б1у Уаї пей 225 230 235 240
Рго А1а Пец Ркго Ссіп Маї Уаї Сув Авп Тук Аку АБр о УМаї АкЯ Ре 93ц 245 250 255
Бек т11е Агу Гем Рко Зіу Сув Рко Ак4Я4 Сіу уУаї АБп Рко Уаі Уаї 5ег 260 265 270
Тукх Аза Ууаї Аза пед бек Сув біп Сув Аза Тед СуБ Аку АкЧ Бек Тіхг 275 280 285
Тк Авр о Сув б1у б1іу Рхо Був Авр Нів Рго Пец Тих Суз Авр Авр Ркго 290 295 зоба тя РБе сіп Авр бек зго бек Бек Ппув А1їа Рко Рко Рко бек цей Рко 315 320
Век Рхо Зет Ак Пец Рко біу Рко бек Авр ТВК ркго Іїе Пец рРго 01п 325 330 335
(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 9: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 6 амінокислот (В) ТИП: амінокислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (їх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме9:
Аа су Аа Аа Ріо су 1 5 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 10: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 4 амінокислоти (В) ТИП: амінокислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме10:
Аа су Аа су 4 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 11: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 30 п.н. (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: кКДдНК (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме11: ттттстсада АТассСтТАСАСЄ сСТАДОСОаССС (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 12: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 39 п.н. (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: кКДдНК (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме12:
АдостасаасСАаСАССИаССАС АаОсАаАСАСА СТСОИТТТТо (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 13: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 42 п.н. (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: кКДдНК (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме13: татасссата стТаССсССАСа тТаСССАСАА ТаСАСаТстАС Аа (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 14: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 36 п.н. (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: кКДдНК (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме14: ттттацапАТСОСС ТТААСАТТТа ТОАТААТААС ААДИТАС (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 15: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ:
(А) ДОВЖИНА: 39 п.н. (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: кКДдНК (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме15: ссатавпАССА ВаСАССАаСАС АОСАСАСАСА СТССОТТТТО (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 16: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 36 п.н. (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: кКДдНК (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме16:
ТОоТОСТОоСТОо СТОСТССАСО СТОССОСССС АТСААТ (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 17: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 32 п.н. (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: кКДдНК (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме17: тато ТТАТТаТОСОЯ АСОАТСОбСсас Та (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 18: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 27 п.н. (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: кКДдНК (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме18:
ТТТТАСАТСТ СсТТоттТасАС датоаадс (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 19: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 21 п.н. (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: кКДдНК (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме19: татастасст адатостсАа т 21 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 20: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 41 п.н. (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: кКДдНК (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме20:
АстТаАасАСТ САСССАССАС ДОССОСОЯТОаСтТ асссСАсат а (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Ме 21: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 29 п.н. (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна
(її ТИП МОЛЕКУЛИ: кКДНК (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме21:
ТТТТТСТАСВА САДаСАаСАса САаСССАТО (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ ПОСЛІДОВНОСТІ Мо 22: () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 75 п.н. (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) КІЛЬКІСТЬ НИТОК: одна (0) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її ТИП МОЛЕКУЛИ: кКДНК (іх) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: Послідовність Ме22:
ТІТССАСАСЄС ССАСОСОаТСас АТТОАТОасСас басСАсСата адСсСАасСАСС даСстатаатТа сСстТОАаТоСтТоАсатТа
Список використаної літератури: 1. тій В.А. ї а)/.,.. Вісі. Спет. 262:6951-6954, 1987. 2. ЕСК, М... еї а/., 9. Віої. Спет.-. 264:17595-17605, 1989.
З. УЧопев, Е.У. еї аЇ, Майшге 338: 225-228, 1989. 4. ЕСК, М... єї а/., 9. Віої. Спет. 267: 2119-2122, 1992. 5. Ріегсе, у. егаіІ., Аппи. Неу. Віоспет. 50:465-495, 1981. б. Ії аріопт, А... еї аІ., Машге 369:455-461, 1994. 7. Ми, Н., ег а|., Бігисіште 2: 545-550, 1994. 8. ЕпдеІтапп, Н., єї аї., у. Віої. Спет. 265:14497-14504, 1990. 9. Адат, 0. еї аї., 9. Віої. Спет. 270:17482-17487, 1995. 10. І овївспетг, Н.В., єї аї., 9. Віої. Спет. 266:18324-18329, 1991. 11. Ваппег, ОМУ., єї а!., Сеї! 73:431-445, 1993. 12. Реппіса, О., еї аІ., Віоспетівіу 32:3131-3138, 1993. 13. ЕпоєЇтапп, Н. еї аї., 9. Віої. Спет. 265:1531-1536, 1990. 14. Мап 7ее, К.). ег а|., Ргос. Май). Асад. ві. ОБА 89:4845-4849, 1992. 15. Адегка, 0. єї а!., У. Ехр. Мед. 175:323-329, 1992. 16. Нопіег, К.М., еїа|ї., У. Іттипої. 151:1548-156:., 1993. 17. Вепіпі, В., егаі., Биг. СуюкКіпе Мейм., 1993. 18. Рідиеєї, Р.Р., еї аі., Іттипоіоду 77: 510-514, 1992. 19. М/ІШатв, В.О., єї аї., Іттипоіоду 84:433-439, 1995. 20. Сароп, 0.., еї аі, Маште 337: 525-531, 1989. 21. АзпКепа?і, "А., єї аї., Ргос. Маї). Асай. 5еїі. 88:10535-10539, 1991. 22. ЗцМіЩегв, А.)., еї а). У. Ехр. Меа. 179:849-856, 1994. 23. Моїап, О.еї а!., Віоспіт. Віорпуз.Асіа 1040:1-11, 1990. 24. Воагіднев, М.Г.., еї аї., У. Іттипої. 151:6954-6961, 1993. 25. Спапо, Н.-С., євї аі., Ргос. Маї). Асад. ві. ОБА 91:11408-11412, 1994. 26. Ми, 2., вї а)., у. Віої. Спет. 270:16039-16044, 1995. 27. Вагг2опі, РЕ. єї а), Ргос. Маї). Асай. ві. ОБА 92:5376-5380, 1995. 28. Воїдіп, М.Р., єї аї., 9. Віої. Спет. 270:387-391,1995. 29. Ми, Т.-К.Н., ві а.., Сеїї, 64:1057-1068, 1991. 30. опо, Н.У., єї а!., 9. Віої. Спет. 269:22492-22495, 1994. 31. Вигвеї, О.А., еї аї., у. ІпТесіоив Оізеазев 171:1528-1538, 1995. 32. Вао С.М. ві а|., Ат. 9. ОбБвівї. Супесої!., 146, 65-68, 1983. 33. Юатемжооса М.О. еї аї., Репії. (епі. 52, 398-400, 1989. 34. СНеп, Е., вї аІ., Мої. Епдосгіпої. 6:914-919, 1992.
З5. Вієїїп5Ка, М.., еї а/!., У. Сеї! Віо!. П:ЗЗОа, 1990. 36. Ригипавзні, М., ег а, Мої Епадостгіпо!ї. 9:54-63, 1995. 37. Зудапага, Т., ег аі., Ргос. Май. Асад. 5еї. ОБА 92:2041-2045, 1995. 38. доппзоп, О.А., еї аї., Вісі. Нергоад. 52:68-73, 1995. 39. ОпПацб, с. апа Спазвіп, І. Ргос. Маї!. Асад. ві. ОБА 77:4216-4220, 1980. 40. Морпаг, У., еї аі., ЕМВО у. 9:3269-3278, 1990. 41. Ріддезв, 9.С. еїаі., Маште 281:351-356, 1979. 42. Ріадезв, 9.С. еї аі., Маште 286:684-687, 1980. 43. Еїоп, Е.А., іп Сштепі Ргоїосої!в іп МоіІесціаг Віоіоду, єеаз. А!изибіє, ЕМ. єї аї., донп УМієу 5 бопв, 1993. 44. Сатрреї), В., Ргос. Маї). Асай./5сі. ЮОБА 88:760-764, 1991. 45. Соїє Е.5. єї а!., Віотесппоіоду, 11, 1014-1024, 1993. 46. Сіи2тап, У., Се! 23:175-182, 1981. 47. Спи, С. еї аї., Мисі. Асійа НКев. 15:1311-1326, 1987. 48. Хеп, 9. еї аї., У. ІттипоїНегару 10:174-181, 1991.
Пізній . премотор РУуші
ЗУ 4Оогі 40 ме Лідерна
ЕсоВі послідовність
У, ЕсонУ
УРІ1 Інтрон
РН І рЗМС-НТВРІ, СВО рбо У і " --
Підсилена | (5920 п.н.) і-й хво резистентність тив
ВТВРІ. соборна Лія
РВАЗ2? оті 5-0
ЗОЇ Вотні
Фіг. Та)
Хвої1 Сигнальна послідовність ПОН Інтрон НОСН
ТОСАС АТО ОСТ АСА б стААсСсоСоСстТААААТСССТТТООССАСААТСТОТОСТОАССОСАСАСОСАС меє А1а тіпкг
СААТСТСАСТАТСОССАТСТААОСССАСТАТТТОСССААТСТОАСАЛАССТОСТОСТОССТОПАССОАТОоСАСАСАС ссостоесстстстто сстСТОСТтТтТСстТесссАвОосС тТос соб дес тес сто сто ста ост кБех АхЯч о Тпк Бех пем Ппей Пез Аїа --20А8р пропесованого ТВРІ
УСВА САС ОбС АСТ ССС сАтТ о АСТ сто ТСТ СОС САА СА ААА ТАТ АТС САС ОССТ САА бСіп сій с1іу бек АЗЛа др век уаї Суз Рко біп б1іу цу Тук І1їє ніз вхо біп А у пос ТАС ТТ ТАС ААТ САС тот ССА бос СОС со САС САТ АС САС тТоС АОС САС тет с.
Тіт Тук Ппеч Тук Авп Авр Сув Рко Сіу Рго біу біп Авр Тік Авр Суз Акад біч Сув 5. у бА САС ОТОС Сто АОС о тТоС тТоС о дАд ТОС ССА ААС ОСАА АТО ССТ САС СТО САб АТС тТСтТ ОТ
АкЯ Ні Суз рей бек Су бег Був Суб АкаЯ4 Ппуз бій Меє сі1у біп Уа) сії Ізе бек 85. у дос ААС ААС САС ТАС ССС САТ ТАТ ТОС АСТ САА АдСОСтТТ ТтТС САС о Тос ТТ ЛАТ Тео ді
АхЯ Сузв АБпоСіп Тук Ак Нів Тукг Ткр Бек біз Азп Пец Рпе ббіп Суб Ріе Авп Сув 5 усАо СА АЛА САС АдДС ДСС сто ТоС АСС ТОС САТ ССА ОСТ ТТС тТтТТ СТА АСА САА АС с. сіп сій Ббуз біп АбБпотТйк о уаї Сув Тк оСув Нія А1їа с1іу Ре Рпе Пец Агд б3іи Авп б: -7Сув пиСОсо у вс ССА САА ТОС АС СТА САС САА лААС ОССА ТЕС ТТС ТСС САС ССО ОСТ ОСС ССА АТА С
Суз Рхо сімї Сув ТБг Пец біп біч Авп о рхо Рпе Рре бех біп Ркго б1у Аза Рко І1е Іл у ссс АСТ ССА СТА дос ОТоС о ААС о АЛС АСС АТо ТТО СТО САА ААб ААСОСТС АСТ ТСА сде ті
Рто Тах Рхо Пед Ак бех МДув пуз ТПх Мебє ред Ма) Сіп руз Абзп Уаї ТЬх бек сій 5. у ДСА СТА АТС боб о сстТ ТТ дАдД сто САС ОААС САС дссо сСссо ТОоС САС ТОС АСТ АСТ ТСТ ЛІ
ТВх Маї Меє сі1у сіу Ре Пув уаї бі Авп Нів Тахо Аза Сув Нів Сув бек ТНК Сув ТС
Пізпй промотор
ЗУ руці
ЕсоКІ будо
РІ Лідерня
РАЗОМ, послідовність
З Есоп У
МР1 Інтрон
РЕ рУМІ.- ВТВРНСО Бета
Підсилена . - р хвої резистентність й г й
ВТВРІ. СО Бе ду о. раза огі ЗК
За! Ватні
Фіг. 1БИ)
хвої Сигнальна послідовність ПОН | Інтрон НН :
СТосАс АТО ОСТ АСА С стААСССССССтТААЛАТСССТТТОСССАСААТСТОТОСТОАССОСАСАССТАОССАССТОТА "Ме Аза тв
ССТІСТСААТОТОАСТАТССССАТОТААЛССССАСТАТТТОСССААТСТСАСАААССТОСТОСТОССТОСАСОБАТОСАСАСАСАЛ стесттестстоссостосстетсттсссстстосттІСТосСссАсос тТоС соб дсо тес ста сто сто сс
Кбдекг АкЯ Так бек Пез Пем пем А1: ! т20А5р процесованого ТВРІ
ССС Тео СТЕ САА САС СОС дСуТ ССС о сАТ о АСТ сСтТо ТОТ ССС САА ОСА ААА ТАТ АТО САС С
Кк Вко Тхтр рем біп б) сіу бек Аїа дАвр бек Маї Сув Рко біп сіу Буз Тук Іїе Нів Р: , АВС ОотТос САС АКА ССА АОС ОТАС ОТТО ТАС ААТ САС ТСТ ССА бос соб боб САС бАТ АС САС тос до пув Сув Нів Муз с1у ТПк Тук о Бем Тухк Азп Азр Сув Рго Сіу Рко біу біп Азр Тапг Авр Сув Аї
ССТ ТСА САА АС о САС СТО ДСА САС ТОоС Сто АСС ТОоС ТоС ААА ТОС ССА ААС СА АТО ОбТ САС С » Аза Зек Сіц Азп Нів Бем Ага ніз Сув Грем бех Сувз Бек Пув Сув АкЧ Пув біз Мебє біу Сіп Уг щ СО БАС АС СТО тот Сос тТоС АбС АД ААС САС ТАС о Сбо САТ ТАТ ТОС АСТ САА ААС СТТ ТтС с
АкЯ Авр Тапг оМаї Суб б1у Суз Аку Був Авп сій Туг Ах Нів Тук Тур бек бій Азп Пец Рпе с1
ААТ ОСС АСсС СТ САС СТО тес о тТоС сСАб САС ААА САС лАС лес Сто тос дес ТОС САТ ССА Ст
У Авп біу твх Ууаз Нів Бей бек Сув біп бі Був біп Азп ТвВкоМаї Суб ТБг оСуз Нів Аза сіу РІ лінкер Н7Рго НСОВД
У тес о тсСтТ СТ СсСтТ сССтТ ССтТ о ССА Сбо ТоС Сб ССС АТС ААТ ОСС АСС Сто ОСТ СТО САС ААб САС бек Су Аї1а сіу Аза Сіу рхто Аха Сув Агуд Рго І1е Авп Аїа ТПк Бец Аза Уаї с14 Пув січ
ААС АСС ААС АТС тот ССС ССС ТАС ТОС СОС АСС АТС дес о сосС сто сто САС соб сто сто СС ос
М деп ть ТБг оЇІ1є Суз Аїа біу Тук Сув Рго ТіК Меє ТНК Акд Маї Пец біп біу Уаї Печ Рго АЛІ
СС САТ сто сСосС отТтТо САС тТоС одто Ссб сто сст бос отос сСос сосС сб бто ААС о сСос сто оте т ь АкЧ АБроуаї АтаЯ Рпе бій бЗех ї31е АкчЧч Пец рхо біу Суз Рко Ат с1у Маї Азп Рго Уаї Уаї 5е
ТСТ ССА СТО ТОС СОС СС АбС дес АСТ САС тТОС сСбо сст ССС ЛАС САС САС СОС ТТ АСС оТстТ се » Сув Аіа Пезч Суз АкЯ АгЯ бек Тік ТБт АвроСуз біу біу Рко Муз Авзр Ні Рко Пез тик Сув Аля у ТОС ОТСА ААб ССО сстТ СсС ССС дос о сСтТтТ СсСА ДОС ССА ТСС ССА Сто соб бос СОС тоб САС дес сс бак бЗек Ббуз Аї1а Рко Рко Рго бе Гей Рго бех Рко Бех Аку Гем Рго б1у Рго Бек Авр Так РЕ
ЗУаОЕ Вот! Промотор рої А ЗУАЕ
На
ТВеР19Онсо « 5асі
Ват
Реципієнт Сто» сплайсованого 4 Ще, Інтрон фрагменту З не Дигідрофолат- РОЇ А пах 5А редуктаза
Ватні
Донор те сплайсованого О«к- ТВРІЗО нсбаїрна огі фрагменту 5" х 10590 п.п.
Х
Ба рмІ-1 ватні І і? Промотор сові ек ММт-І вас! вх сту
Ще яви Руці
Краї! Кия т
ЕсобвІ
І ЕсоНіІ
Біо
Фіг. 2аг1)
Хвої Сигнальна послідовність НО Н Інтрон СН
ТССсАсС АТС ОСТ АСА бо стААССОССССТААААТОССТІТТОСССАСААТСТСТОСТОАОбОСАСАСССЛОССАССТСТІ
КМеє Аза тнг
СЛАТСТСАСТАТССССАТОТААССССАСТАТТТССССААТСТСАСАЛАССТССТОСТОССТОСАСОБАТОСАСАСАСААЛАЛСАХ севстссстототІбсСстотостттстосесАссс ТоС сСес Асс тос сто сто сто ост о жІтт бос бек Акад Тих бех Пем ле Гпец А1їа Ріе Ссіу 4-20А5р процесованого ІГВРІ ц САА САС СОС АСТ ССС обАТ лет сто ТСТ СОС САЛА ОСА ААА ТАТ АТО САС ОССТ САЛА ААТ ААТ Ті біп Сі с1у ех Аза дер ех Уаії Сув рРко біп с12у Пух Туг І1е Нів Рго Ссіп Авп Авп 5
У АОС ОТАС ОТТО ТАС АдДТ о бАС о ТСТ ССА СОС ССО боб САС САТ АС САС о ТоС лоб сдо тот САС доо с
Тих Тук Пем Тут АвпоАвр о Суз Рхо Сіу Рко сіу бсіп Авр ТБк Азр Суз Лк біз Суз бів Бех о.
АСА САС ТС Сто АСсС о тТосС тес дАД ТОС ССА ААС САЛА АТО ОСТ САС сто бАа АТС Тест тест ТОс ді »АхЯ4 Ніз Суз Печ Зет Су бех Пуз Суб Ауд ПБуз бім Мес Сіу біп Уаї біб ІЇІ1е бек Зек Сув Ті
АС ААС ЛАС САС ТАС о ССб САТ ТАТ ТОС АСТ о САА ААС ОСТТ ОТТО САС ТОС ТТС АдАТ ТОсС дос сто т
Кк Ага Був Авп біп туг Лтд Ні тут Тур Бех бій Авп опбеш Бе біл о Суз Ре АвпрСув ВЗек ГПем С у САЛО САС АЛА САС ЛАС лес сто ТоС дос ТС САТ бслобстТ ТІС ТТТ СТА АСА САА ААС бло тот с сіп біз був бів Авп о Тргоуаї Суб Тк о Сує Нів Аїа б1іу Рпе Ріе Пец АкЯя бім Авп біч Сув У , САС ТС АСО ААС Отто тТоС сСтТА ССС САб АТТ САС АлАТ о СтТтТ АЛ ССС АСТ СА САС ТСА бос АС м бій Сув ТВт Був бец Су5з цей Рко біп І1їе бій Авп Уаї Буз С1іу Тік біц Азр бек сіу тьк т.
САА ТС АСС СТА САС ОСАА дАС ССА тТТо тТТС ТоС САС ССО СТ ССС ССА АТА СТТ САС ТОС АТО С
Кбіч Суз тТвх Печ біп біб леп ркго Рре Рпе Бех бсіп Рко сіу Аіа Рко І1е цеч біп Сувз Ммеє б: » ССА СТА АС о ТСС ААс лАС АСС АТО ТТО СТ СЛА АД ЛАС ОСТ АСС ТсСА бас ТосС АеСТ тТоС тот о
Рто Бем Ах бек цуз Муз Тіпх Меє Печ Маії біп Пцуз Авп Маї ТЬх Бех бій бек Трг Суз Суз У; ц АТО бо ССТ ТТС АЛЛА Сто СлС дДАС САС лоб бо ТоС САС ТС АСТ АСТ ТТ ТАТ ТАТ САС ААА ТІ
Меє б1іу біу Ре був Ууаї біч дп Ніз ТЬг лЛіа Суя Ніб Суз бек Тк Суз Тук Тух Нів Мцуз 5
УДО Ватні Промотор
Роїу А ЗУ х нів ті х осі таРІвонсся Ен БО . З НИ дет Кен
Реципіснт яд со Інтрон сплайсопаного о. ше 54 що ле АДигінроднудат- фрагменту З «5 редуклиза РоїуАд
Во тні
ІБ А зай
Донор с огі сілайсовацого ра щеТя веб Бета
Фриугменту 5 11043 л.н. хв і п- рі -1
Ватні ор, Промотор я, ММ-І
Есені же і ка Ри: васі вх тт-гтут т й «чї кет
Краї
Есоті Есо Ні
Ні
Фіг. Зв)
Хної Сигнальна послідовність ООН о Інтрон ОСП
СТосАС АТО СТ АСА б стААоСоССССТААЛАТОССТТТОСОСАСААТОТОТССТОЛОСОСАСЛАССАССОЛеСТСТІ "Меб Аза тк І
ССТІСТОААТСТОАСтТАТСОсССАтТО ГТАВССССАСТАТТТОССССААТСТСАСАААОоСТОСТОСТеСсСТоаАСССАТОСАСАСАСАЛА)
СЕ сстетосоостосстотсттТсссстТотТостТтТтТстТесесА с тс сео дев тес сто сте сто сс
Бех АтЯя тв Бек Пец БПбеч Бем ді; и 20А5р процесованого ТВРІ
ЄС бо СТІТ САА САС обоС о дотТ бСС сАТ АСТ Сто ТСТ СОС САЛА ССА АЛА ТАТ АТС САС СС
КРгОо Ттр Геч біп біц біу бер Аза дер бек уві Суз Рго біп Сіу Був Тук їїє Нів ре
ЛАС ТОС САС АЛЛА ССА ССО ТАС ТТ ТАС ДАТ САС ТСТ ССА бос соб обб САС САТ АСо САС ТОс ло
Круг Сув Ні цу біу ть Тух Бец Тухк Авп Абвр Сув Рго сіу Рго п1у Сіп Авр о ТВкК Ар Суб Акос
МОст ТСА САА ААС САС СТО АбА САС ОТОС Сто лЛОС о тТОоС ТСС ААА ТО СА лЛАС САЛА АТО ОСТ САС Ст
Аза Бех біч Азп Ні Пеп Аку нів Суз Сем бЗех Суб Бех Був Суз Аху Пув сім Меб б1іу біп Уа!
СО САС АСС сто тот СоС тсс ДСО ААС ААС САО ТАС Соб САТ ТАТ ТО АСТ ОСА АдС оСстт ТТ САС
УАгУЯ Азр ТЕ Уаї Суз біу Сувз Ак ПЦув Авп Сіп Туг Агу Ніз Тух Тгр бек Січ Авп орем РНе сії
ААТ боб СС сто САС СРС о тТоС ТОС САС САб ДАА САб ААС дСС сто ТС АСС ТоС САТ ССА ост тт
КАзп б1у ТВх Уаї Ні Тец бех Сув біп біч Ппув біп Азп Тпк Угі Сув Тік оСув Нів діа бсіу Ріє , ТОС ТСТ АСТ ААС ТСтТ о дАб о ААА АОС ОСТ САС ТОС АСОо лЛАС ТТС тТосС СТА ССС САС АТТ САС ААТ СТІ
Бет Сув Бек А5п Су Був Був бег Печ біц Суз трт Пув Бем Суз Бем Рко біп І11є січ Авл Уа!
Лінкер --7Рго Д
АСА ССТ СсСтТ СсСтТ ССтТ о ссА сСос о тТосС СОС ССС АТС ААТ СС АСо Сто ССТ СТО САб лАб САС сбс
У тпх діа б1у Аїа Сіу ро АкЧд Сувз Аг рРго І1е Авп Аїа Трт Гм АТа Уаї бі пуб Січ СІ)
АСС АСС АТС ТсСТ о бСС СОС ТАС ТоС ССС АСС АТО дес СОС сто СТО САС о Ссос обте сто соб о бсс ст
ТЕ ТЕ І1е Суз Аїа сіу Тук Суз рго тТвкг Мебс Ту Агу Маї рем біп б1у Маї Ппез го ліа рем бАТ СТ СОС ТС САС тес о АтТо сос сто сст о Сос тТеос соб СосС бос сто ААС ССС сто сто тео тА
У А5р Уаї Ах Ре січ сег ї3е Акад оПеч Рго біу Суб5 Рко Аку біу Ма! Аяп Рко Уа1 Уаі1ї бех Туз бСА СТО ТОС СОС ССС АбС АСС АСТ САС ТоС боб сСтТ ССС ААС САС САС ССО ТТО АСОС ТСТ САТ Ас
ЬАїа преп Суз Ах АтЯ бек Тнх ТК о Лер Суз сіу Сіу Рго Пуз Авр Нів Рко Пец тТНЕ Сув Авр Аз;
ТСА ВААС ССС СсСтТ Сос сосС дос о сСтТТ ССА АОС ССА ТОС ССА Сто Ссб сб ССС Теб САС АСС СС АТ
КБег цув А1а Руо рРго Рго бек реч Рго бет Рто бет люд Пем Рго Сіу Рго бег леюр Тік Рко І1є
-- 105 клітин/лунку2,5 нг/мл ТМЕсжтмономерГ БР 8» Лільки клітини с Клітини--2,5 нг/мл ТР (без ТЕР) , ж Клітини ТВР-п1СО(20-190) СО5 7 живильні середовища 2,5 нг/мл ТМ Бо.
Фо клітини-НСО»5 7 імітаційні трансфектантні 4.5 живильні середовишай2,5 нг/мл ТМЕа ш- Я- ях
Шин 4.0 7 Тільки клітини
З.З твр-всо
В 5. сота Мономер ТВР т-
Св шо 2.5-
Е
5)
Є 2. ле Ш .
Ж Клітини ТЕ
Е (н/- імітаційні
Е 1.5-ї живильні ай о середовиша) й й
Ь сов терта тт опор титр р о О.О ол 1 ІФ) по це о; 10000 нг/мл еквівалентів ТВР (КА Ф«У5ТЕМ Б15А)
Фіг. 4 --ж-4 105 клітин/лунку 2,5 нг/мл ТМЕсамономерТ ВР 4. Лільки клітини с Клітини-н2,5 нг/мл ТІ (без ТЕР Й --- Клітини ТВР-БСО(20-190) СО5 7 живильні середовища 2,5 нг/мл ТМ Ро. І 4.0 Фо клітини СО5 7 імітаційні трансфектантні живильні середовища 2,5 нг/мл ТМЧЕа
Зв. , т Тільки клітини с зо т-- в ТбвР-ноес й - ! (20- Ше
Бе 181) І Мономер ТВІ 0 2.5 --
Е
Ге й .
Є аг
Ж
Е Клітини ЕМ 1.5 б м го щи. -
Яттсттттт-- о о От тет сталтттртотсттттт
То о 000 лосо 1000о нг/мл еквівалентів ТЕР (КА 5У5ТЕМ БМІБА)
Фіг.5
Claims (20)
1. Гібридний білок, який містить дві різні коекспресовані амінокислотні послідовності, що утворюють гетеродимер, кожна з яких містить: (а) щонайменше одну амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з ланцюга гомомерного рецептора, ланцюга гетеромерного рецептора, ліганду, відмінного від гонадотропіну, фрагмента згаданого ланцюга згаданого гомогенного рецептора, згаданого ланцюга згаданого гетеромерного рецептора або згаданого ліганду, причому згаданий ліганд або його фрагмент зберігає здатність до зв'язування ліганду з рецептором, і згаданий ланцюг згаданого гомомерного рецептора або його фрагмент і згаданий ланцюг згаданого гетеромерного рецептора або його фрагмент зберігають здатність до зв'язування ліганду з рецептором самі по собі або в комбінації з гомологічним чи гетерологічним ланцюгом згаданого рецептора; і (5) субодиницю гетеродимерного білкового гормону або її фрагмент, який зберігає здатність субодиниці до утворення гетеродимеру з іншими його субодиницями; в якому послідовності (а) і (Б) з'єднані між собою безпосередньо або через пептидний лінкер і в якому послідовності (Б) кожної зі згаданих двох коекспресованих послідовностей агреговані між собою так, що вони димеризовані і утворюють гетеродимер.
2. Гібридний білок за п. 1, який відрізняється тим, що згадана послідовність (а) вибрана з групи, що складається з протеїну-1, який зв'язує фактор некрозу пухлин (ТВРІ), протеїну-2, який зв'язує фактор некрозу пухлин (ТВР2), або фрагмента згаданого ТВРІ чи ТВР2, який крім того містить область зв'язування ліганду; позаклітинної області рецептора ІЕМе/В або рецептора ІЕМ"; рецептора гонадотропіну або його позаклітинних фрагментів; та інтерлейкіну-б (ІІ -6), ІєМ-В, тромбопоетину (ТРО) або їх фрагментів.
3. Гібридний білок за п. 1, який відрізняється тим, що згадана послідовність (Б) вибрана з групи, що складається з субодиниць хоріонічного гонадотропіну людини (по), фолікулостимулюючого гормону (Е5Н), лютеїнізуючого гормону (ІН), тиреоїдного гормону (Т5Н) або інгібітину та їх фрагментів.
4. Гібридний білок за п. 1, який відрізняється тим, що послідовність (а) приєднана безпосередньо або через лінкер до кінцевої аміногрупи послідовності (б).
5. Гібридний білок за п. 1, який відрізняється тим, що послідовність (а) приєднана безпосередньо або через лінкер до кінцевої карбоксильної групи послідовності (Б).
б. Гібридний білок за п. 1, який відрізняється тим, що кожна з двох згаданих коекспресованих амінокислотних послідовностей включає послідовність для ТВР1 або її фрагмент, що містить залишки амінокислот 20 - 161 або 20 - 190 ТВРІ як послідовність (а) і відповідніс" і В субодиниці СОС або їх фрагменти як послідовність (Б), причому дві згадані коекспресовані амінокислотні послідовності утворюють гетеродимерний комплекс шляхом асоціації згаданих Є- і В субодиниць "СО або їх фрагментів.
7. Гібридний білок за п. 1, який відрізняється тим, що кожна з двох згаданих коекспресованих амінокислотних послідовностей включає позаклітинну область рецептора гонадотропіну як послідовність (а) та відповідні Є- і В субодиниці гонадотропіну як послідовність (б).
8. Гібридний білок за п. 7, який відрізняється тим, що згадана послідовність (а) є позаклітинною областю рецептора Е5Н і послідовність (Б) є субодиницею ЕН.
9. Гібридний білок за п.7, який відрізняється тим, що згадані послідовності (а) і (Б) з'єднані пептидним містком.
10. Гібридний білок за п.9, який відрізняється тим, що згаданий пептидний лінкер включає сайт ферментативного розщеплення.
11. Гібридний білок за п.1О0, який відрізняється тим, що згаданий сайт ферментативного розщеплення є сайтом розщеплення тромбіну.
12. Гібридний білок за п.10, який відрізняється тим, що згаданий сайт ферментативного розщеплення розпізнається й розщеплюється ферментом, який міститься в яєчнику.
13. Гібридний білок за п.9, який відрізняється тим, що згаданий пептидний лінкер діє як гнучке шарнірне зєднання.
14. Гібридний білок за п.1, який відрізняється тим, що кожна з двох згаданих коекспресованих амінокислотних послідовностей складається здебільшого З послідовностей (а) і (б).
15. Фармацевтична композиція, яка відрізняється тим, що містить гібридний білок за п.1 та фармацевтично прийнятний носій та/або наповнювач.
16. Ізольована молекула ДНК, яка кодує гібридний білок, причому згаданий гібридний білок містить дві різні коекспресовані амінокислотні послідовності, що утворюють гетеродимер, кожна з яких містить: (а) щонайменше одну амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з ланцюга гомомерного рецептора, ланцюга гетеромерного рецептора, ліганду, відмінного від гонадотропіну, фрагмента згаданого ланцюга згаданого гомогенного рецептора, згаданого ланцюга згаданого гетеромерного рецептора або згаданого ліганду, причому згаданий ліганд або його фрагмент зберігає здатність до зв'язування ліганду з рецептором, і згаданий ланцюг згаданого гомомерного рецептора або його фрагмент і згаданий ланцюг згаданого гетеромерного рецептора або його фрагмент зберігають здатність до зв'язування ліганду з рецептором самі по собі або в комбінації з гомологічним чи гетерологічним ланцюгом згаданого рецептора; і (5) субодиницю гетеродимерного білкового гормону або її фрагмент, який зберігає здатність субодиниці до утворення гетеродимеру з іншими його субодиницями; в якому послідовності (а) і (Б) з'єднані між собою безпосередньо або через пептидний лінкер і в якому послідовності (Б) кожної зі згаданих двох коекспресованих послідовностей агреговані між собою так, що вони димеризовані і утворюють гетеродимер.
17. Вектор експресії, до складу якого входить молекула ДНК за п.16.
18. Клітина-хазяїн, що містить вектор експресії за п.17, яка здатна до експресії згаданого гібридного білка.
19. Спосіб продукування гібридного білка, який включає культивування клітини- хазяїна за п.18 і виділення експресованого нею гібридного білка.
20. Спосіб індукування визрівання фолікулів, який включає введення суб'єкту, який цього потребує, фармацевтичної композиції, до складу якої входить гібридний білок за п.8
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US1193696P | 1996-02-20 | 1996-02-20 | |
| PCT/US1997/002315 WO1997030161A1 (en) | 1996-02-20 | 1997-02-20 | Hybrid proteins which form heterodimers |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA52646C2 true UA52646C2 (uk) | 2003-01-15 |
Family
ID=21752599
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA98094928A UA52646C2 (uk) | 1996-02-20 | 1997-02-20 | Гібридні білки, фармацевтична композиція, що містить гібридний білок, ізольована молекула днк, що містить гібридний білок, вектор експресії, клітина-хазяїн, спосіб продукування гібридного білка, спосіб індукування визрівання фолікулів |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6193972B1 (uk) |
| EP (1) | EP0894141B1 (uk) |
| JP (2) | JP4140927B2 (uk) |
| KR (1) | KR100369985B1 (uk) |
| CN (1) | CN1261579C (uk) |
| AT (1) | ATE295887T1 (uk) |
| AU (1) | AU706504B2 (uk) |
| BG (1) | BG64510B1 (uk) |
| BR (1) | BR9707589A (uk) |
| CA (1) | CA2245877C (uk) |
| CZ (1) | CZ291212B6 (uk) |
| DE (1) | DE69733309T2 (uk) |
| DK (1) | DK0894141T3 (uk) |
| EA (1) | EA002474B1 (uk) |
| EE (1) | EE04025B1 (uk) |
| ES (1) | ES2241040T3 (uk) |
| HU (1) | HUP9900619A3 (uk) |
| IL (1) | IL125864A (uk) |
| NO (1) | NO321777B1 (uk) |
| NZ (1) | NZ331539A (uk) |
| PL (1) | PL187400B1 (uk) |
| PT (1) | PT894141E (uk) |
| SK (1) | SK282326B6 (uk) |
| UA (1) | UA52646C2 (uk) |
| WO (1) | WO1997030161A1 (uk) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL187400B1 (pl) * | 1996-02-20 | 2004-06-30 | Applied Research Systems | Białka hybrydowe tworzące heterodimery |
| US6635740B1 (en) * | 1997-03-27 | 2003-10-21 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Ligand/lytic peptide compositions and methods of use |
| US6844161B2 (en) | 1997-09-04 | 2005-01-18 | Gryphon Therapeutics, Inc. | Modular protein libraries and methods of preparation |
| EP1257564B1 (en) * | 2000-02-22 | 2008-08-27 | Laboratoires Serono SA | Process for purification of recombinant hcg having a specific bioactivity |
| US20030228600A1 (en) * | 2000-07-14 | 2003-12-11 | Eppendorf 5 Prime, Inc. | DNA isolation method and kit |
| IL147414A0 (en) * | 2001-12-31 | 2002-08-14 | Yeda Res & Dev | Ifnar2 mutants, their production and use |
| US20030157091A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Dyax Corporation | Multi-functional proteins |
| DE10247755B4 (de) * | 2002-10-14 | 2006-01-19 | Pfizenmaier, Klaus, Prof. Dr. | Selektive, lokale Aktivierung von Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie durch systemisch inaktive nicht-Antikörper-TNF-Liganden-Fusionsproteine |
| BRPI0507174A (pt) * | 2004-01-28 | 2008-04-01 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | proteìnas de fusão hormÈnio-fc (fsh-fc) heterodiméricas estimuladoras de folìculo para o tratamento da infertilidade |
| JP2008525002A (ja) | 2004-12-23 | 2008-07-17 | ラボラトワール セローノ ソシエテ アノニム | Ｂｃｍａポリペプチド及びその使用 |
| PL1885753T3 (pl) | 2005-06-03 | 2011-12-30 | Ares Trading Sa | Wytwarzanie rekombinowanego białka wiążącego IL-18 |
| KR101759460B1 (ko) * | 2007-09-21 | 2017-07-18 | 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 표적화된 인터페론이 강력한 아폽토시스 및 항-종양 활성을 발휘함 |
| AU2009215106B2 (en) * | 2008-02-01 | 2015-07-23 | Chromocell Corporation | Cell lines and methods for making and using them |
| CN102002495B (zh) * | 2009-08-31 | 2012-07-18 | 成都蓉生药业有限责任公司 | 用于表达异二聚体糖蛋白激素的表达框、表达载体及制备方法 |
| KR20200052383A (ko) * | 2011-03-25 | 2020-05-14 | 아이크노스 사이언스 에스. 아. | 헤테로 이량체 면역글로불린 |
| RU2699007C2 (ru) | 2013-02-18 | 2019-09-02 | Ведженикс Пти Лимитед | Молекулы, связывающие лиганды, и их применение |
| BR112020026112A2 (pt) * | 2018-06-21 | 2021-04-06 | Shattuck Labs, Inc. | Proteínas heterodiméricas e usos das mesmas |
| CN113874390A (zh) * | 2019-05-24 | 2021-12-31 | 普罗维瓦疗法香港有限公司 | Il-2组合物及其使用方法 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE68926888T2 (de) * | 1988-01-22 | 1997-01-09 | Zymogenetics Inc | Verfahren zur Herstellung von sekretierten Rezeptoranalogen |
| US6225449B1 (en) * | 1991-10-04 | 2001-05-01 | Washington University | Hormone analogs with multiple CTP extensions |
| US5705478A (en) * | 1989-02-21 | 1998-01-06 | Washington University | Covalently linked β subunits of the glycoprotein hormones as antagonists |
| US5116964A (en) * | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| WO1990012877A1 (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-01 | Cetus Corporation | Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor |
| US5650150A (en) * | 1990-11-09 | 1997-07-22 | Gillies; Stephen D. | Recombinant antibody cytokine fusion proteins |
| IL99120A0 (en) * | 1991-08-07 | 1992-07-15 | Yeda Res & Dev | Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
| US5932448A (en) * | 1991-11-29 | 1999-08-03 | Protein Design Labs., Inc. | Bispecific antibody heterodimers |
| CA2133326C (en) | 1992-03-30 | 2005-03-01 | Craig A. Smith | Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor |
| US5447851B1 (en) * | 1992-04-02 | 1999-07-06 | Univ Texas System Board Of | Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells |
| IL111125A0 (en) * | 1994-05-11 | 1994-12-29 | Yeda Res & Dev | Soluble oligomeric tnf/ngf super family ligand receptors and their use |
| US6194177B1 (en) * | 1996-02-20 | 2001-02-27 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | DNA encoding a hybrid heterodimeric protein |
| PL187400B1 (pl) * | 1996-02-20 | 2004-06-30 | Applied Research Systems | Białka hybrydowe tworzące heterodimery |
-
1997
- 1997-02-20 PL PL97328454A patent/PL187400B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 WO PCT/US1997/002315 patent/WO1997030161A1/en not_active Ceased
- 1997-02-20 PT PT97906604T patent/PT894141E/pt unknown
- 1997-02-20 NZ NZ331539A patent/NZ331539A/xx unknown
- 1997-02-20 AT AT97906604T patent/ATE295887T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 SK SK1148-98A patent/SK282326B6/sk unknown
- 1997-02-20 JP JP52949897A patent/JP4140927B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-20 KR KR10-1998-0706215A patent/KR100369985B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-20 UA UA98094928A patent/UA52646C2/uk unknown
- 1997-02-20 CA CA2245877A patent/CA2245877C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-20 DE DE69733309T patent/DE69733309T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-20 ES ES97906604T patent/ES2241040T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-20 US US08/804,166 patent/US6193972B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-20 CZ CZ19982644A patent/CZ291212B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 BR BR9707589-2A patent/BR9707589A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-02-20 HU HU9900619A patent/HUP9900619A3/hu unknown
- 1997-02-20 IL IL125864A patent/IL125864A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 DK DK97906604T patent/DK0894141T3/da active
- 1997-02-20 EP EP97906604A patent/EP0894141B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-20 AU AU21252/97A patent/AU706504B2/en not_active Ceased
- 1997-02-20 EA EA199800744A patent/EA002474B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 CN CNB971924112A patent/CN1261579C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-20 EE EE9800256A patent/EE04025B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-08-19 NO NO19983799A patent/NO321777B1/no unknown
- 1998-08-20 BG BG102705A patent/BG64510B1/bg unknown
-
2001
- 2001-01-09 US US09/756,186 patent/US6663867B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-12-01 US US10/724,226 patent/US7291339B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-07-10 JP JP2007181534A patent/JP2008019258A/ja active Pending
- 2007-09-26 US US11/861,835 patent/US20100075402A1/en not_active Abandoned
- 2007-10-30 US US11/929,292 patent/US20090240039A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA52646C2 (uk) | Гібридні білки, фармацевтична композиція, що містить гібридний білок, ізольована молекула днк, що містить гібридний білок, вектор експресії, клітина-хазяїн, спосіб продукування гібридного білка, спосіб індукування визрівання фолікулів | |
| JP5077924B2 (ja) | 分泌された三量体受容体類似体及び生物学的活性融合タンパク質を製造するための方法及び組成物 | |
| EP0617126B1 (en) | Polypeptide capable of inhibiting the binding between human IL-6 and its receptor | |
| AU2014249405B2 (en) | Fusion immunomodulatory proteins and methods for making same | |
| US6300080B1 (en) | Methods and compositions for modulating heterotypic E-cadherin interactions with T lymphocytes | |
| CN105722855B (zh) | 恒定链经修饰的双特异性五价和六价Ig-M抗体 | |
| TW565570B (en) | Human IL-13 receptor beta | |
| CZ20011287A3 (cs) | Dimerní trombopoetinová peptidová mimetika vázající se na MP1 receptor a mající trombopoetickou aktivitu | |
| CN100390201C (zh) | 具有增强红细胞生成素体内活性的融合蛋白 | |
| CN110267977A (zh) | 细胞因子免疫球蛋白Fc融合异二聚体和包含其的药物组合物 | |
| US6194177B1 (en) | DNA encoding a hybrid heterodimeric protein | |
| CN101914161B (zh) | 抑制肿瘤生长的融合蛋白HGFα-Fc及其用途 | |
| EP4417619A1 (en) | Nucleotide sequence encoding a fusion protein | |
| EP1541689B1 (en) | Hybrid proteins which form heterodimers | |
| JPH10155489A (ja) | 組換え抗体及びそれをコードする核酸 | |
| TWI327149B (en) | Peptides and related compounds having thrombopoietic activity | |
| CN114712495A (zh) | 一种多功能抗体的组合物 | |
| JPS62175182A (ja) | 動物細胞用発現ベクタ−およびその用途 | |
| JPH05184368A (ja) | ヒト細胞表面抗原をコードするｄｎａ |