UA46767C2 - Білок, фармацевтична композиція для лікування захворювань хрящів і кісток, спосіб отримання білка, спосіб отримання гомодимерного білка, спосіб лікування захворювань хрящів і кісток - Google Patents

Abstract

Штучним методом отриманий білок, що є похідною від природнього білка MP 52, який застосовують при лікуванні захворювань хрящів і кісток. Цей білок отримують шляхом культивування клітин E. coli, трансформованих плазмідою, що включає в себе послідовність ДНК, яка кодує цей білок. Запропонована фавмацевтична композиція, що містить терапевтично ефективну кількість запропонованого білка. Наведено спосіб лікування захворювань хрящів і кісток з використанням цієї фармацевтичної композиції.

Description

Опис винаходу

Даний винахід стосується білка, що має амінокислотну послідовність, подану в ЗЕСО ІЮО Мо 1 Списку 2 послідовностей, зробленому з МРБ2. Винахід стосується також гомодимерного білка цього білка і фармацевтичної композиції для лікування захворювань хрящів і кісток, що містить димерний білок в якості активного інгредієнта. Даний винахід стосується також способу одержання описаного вище білка у великій кількості і з високою чистотою шляхом культивування Е. соїї, трансформовану плазмідою, що містить послідовність ДНК, здатну експресувати описаний вище білок. Даний винахід стосується також способу 70 лікування захворювань хрящів і кісток, що включає в себе введення людині фармацевтичної композиції, що містить ефективну кількість гомодимерного білка.

Фармацевтичні композиції, що містять вітамін ОЗ, кальцитонін, естроген або їх похідні, а також похідні біфосфонатів використовували в клінічній практиці для запобігання і лікування захворювань кісток. Нещодавно повідомлялося, що морфогенетичний білок кісток (далі називаний ВМР), суперсімейство генів ТОБ-(, що містить 12 ВМР-2-ВМР-9, і родинні білки, мають кісткову морфогенетичну активність.

Крім того, повідомлялося про кісткову морфогенетичну активність одного з білків, називаних МРБ52 (МО 93/16099 і МУО 95/04819). Вважають, що зрілий район білка МР52 являє собою білок, що складається з 120 амінокислотних залишків, що мають М-кінцевий аланін, і його амінокислотна послідовність описана в цих публікаціях.

В Майшге, мої. 368, р. 639 - 643 (1994) і МО 94/15449 описаний також білок, називаний ЗОБ-5.

Проте, ці білки важко одержати в очищеному вигляді в промисловому масштабі.

Лінії клітин ссавців, такі як І-клітини, були випробувані на продукування МР5Б2 із використанням генної інженерії. Проте, було виявлено, що з досліджуваними системами експресії нелегко одержати МР-52 в очищеному вигляді і з високим виходом. с

Автори даного винаходу намагалися одержати МР5Б2 із використанням Е. соїї у великих масштабах за Ге) допомогою генної інженерії. Коротенько, автори даного винаходу намагалися одержати МР5Б2 із використанням

Е. соїї шляхом приєднання кодону, що кодує метіонін, КДНК, що кодує зрілий район МР5Б2, який починається з аланіну. Отриманий продукт не був тільки МР5Б2, але являв собою суміш МР5Б2, білка з 121 амінокислотного залишку, що має М-кінцевий метіонін, І білка з 119 амінокислотних залишків, що має віддалений М-кінцевий - аланін і починається з проліну. Було надзвичайно важко виділити чистий МР5Б2 принаймні зі зрілим райономіз «о цієї суміші.

Автори даного винаходу знайшли, що білок із ЗЕО ІЮО Мо 1 Списку послідовностей, що починається з проліну в при М-кінці, може бути отриманий селективно з дуже високим виходом шляхом конструювання плазміди, в якій Ге) кодон, що кодує метіонін, з'єднаний із послідовністю ДНК, що кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ Мо 1 3о Списку послідовностей, що складається з 119 амінокислотних залишків з елімінацією М-кінцевого аланіну МР52, і З шляхом використання отриманої плазміди, введеної в Е. соїї, для експресії. Крім того, було підтверджено, що гомодимер білка, описаного в ЗЕО ІЮ Мо 1 в Списку послідовностей, має хрящову і кісткову морфогенетичну активність, що дозволило завершити даний винахід. «

Ціллю даного винаходу є забезпечення білка, що має амінокислотну послідовність, показану в ЗЕО ІЮ Мо 1 З

Списку послідовностей. Білок складається з 119 амінокислотних залишків і відповідає білюу МР52 людини, який с розглядається як зрілий район, що складається з 120 амінокислотних залишків, в якому виключений М-кінцевий

Із» аланін. Білок відповідно до даного винаходу розчиняється у воді. Крім того, цей білок сам є низькотоксичним, оскільки він отриманий із білка людини.

Іншою ціллю даного винаходу є забезпечення фармацевтичної композиції для лікування захворювань хрящів або кісток, що містить в якості активного інгредієнта гомодимер білка, що має амінокислотну послідовність, шк показану в ЗЕО ІЮО Мо 1 Списку послідовностей. Більш конкретно, даний винахід стосується фармацевтичної

Ге») композиції для запобігання і лікування остеопорозу, остеоартриту, такого як деформівний гонартрит і деформівна хвороба тазостегнового суглоба, або епіфізарного остеомієліту, ушкодження хрящів, такого як і суглобне ушкодження меніска, реконструкції дефектних частин кісток і хряща, обумовлених ушкодженням і

Ге»! 20 онкоектомією, дефекту кісток і хрящів, перелому кісток, уроджених захворювань хрящів і кісток, таких як -ч хондродисплазія, хондрогипоплазія, ахондрогенез, щілина піднебіння й остеодисплазія, і, крім того, корінцевих і арвекулярних дефектів, оскільки гомодимерний білок відповідно до даного винаходу має хрящову і кісткову морфогенетичну активність. Крім того, цей гомодимерний білок може застосовуватися для опрацювання кісткової трансплантації в косметичній хірургії. Ці способи лікування також включають способи лікування в 22 області ветеринарної хірургії.

ГФ) Подальшою ціллю даного винаходу є забезпечення способу одержання білка, що складається з 119 амінокислотних залишків, виготовленого з білка МР52 людини, показаного в ХЕО ІЮО Мо 1 Списку послідовностей, о з використанням Е. сої.

Зокрема, даний винахід стосується конструювання плазміди, що містить послідовність ДНК, яка кодує бо амінокислотну послідовність, що складається з 119 амінокислотних залишків, що показана в 5ЕО ІЮО Мо 1 Списку послідовностей, із додатковим метіоніном на М-кінці. Тільки зрілий район кКДдДНК МР5Б2 людини був ампліфікований полімеразною ланцюговою реакцією (спосіб ПЛР) із використанням в якості матричної ДНК плазмідного вектора, що містить КДНК, описану в УУО 93/16099. Спосіб ПЛР, на який посилаються тут, означає ампліфікацію дуже невеличкої кількості фрагментів ДНК або РНК відповідно до способу, описаному в 0.5. Ра(епі 4683195. бо Для одержання білка даного винаходу необхідно сконструювати відповідні експресуючі вектори, що містять

ДНК, яка кодує даний білок, які потім вводять в бажані штами-хозяїни Е. соїї за допомогою способів генної інженерії. Для широкомасштабного одержання цього білка використовували два наступні удосконалені способи: 1) Спосіб збільшення виходу цільових білків шляхом збільшення ефективності трансляції, повідомлений М.

Морипага еї аї. (Асгіс. Віої Спет, 52(6), 1331 - 1338, 1988), а саме, спосіб збільшення вмісту АТ біля кодону АТО, що ініціює, і 2) Спосіб збільшення середнього числа копій плазмід на клітину, а саме, спосіб заміни району огі для точки початку реплікації вектора рВК районом огі вектора рис. Далі, експресуючий вектор (рКОТ245) даного винаходу конструювали прямим легуванням промоторного району з послідовністю ДНК, що кодує амінокислотну 70 послідовність ЗЕО ІЮ Мо 1 Списку послідовностей, із додатковим метіоніном на її М-кінці. Е. соїї, що містить цей вектор, була депонована (Номер доступу, ВІКОКЕМ-КІР-14895)5 в Майопа! Іпвійше ої Віозсіепсе апа

Нитап-Тесппоіоду, Адепсу ої Іпдивіга! Зсіепсе апа Тесппоїоду, що знаходиться в 1-36 Нідавзпі І-споте,

Уаїаке-сно, Таикиба-впі, Ірагакі-Ккеп, 305 дарап, 14 квітня 1995 року і перенесена на депозит (Номер доступу

ВІКОКЕМ-КІ ВР-5499) 10 квітня 1996 року відповідно до Видаревзі Тгеайу оп (пе Іпіегпайопа! Кесодпіоп ої (пе 7/5 Берозії ої Місгоогдапізтв.

Даний винахід стосується способу одержання мономерних білків, який передбачає стадії: конструювання плазміди, що містить послідовність ДНК, яка кодує амінокислотну послідовність зЗЕО ІО Мо 1

Списку послідовностей із метіоніном на її М-кінці, введення цієї плазміди в Е. соїї для трансформації, культивування Е. соїї для одержання тіл включення, солюбілізацію й очищення тіл включення для одержання Мономерних білків, і до способу одержання гомодимерних білків білка з 5ЕО ІЮО Мо | Списку послідовностей за допомогою повторного укладення й очищення мономерних білків, отриманих, як описано вище. Коротенько, білки даного винаходу одержували солюбілізацією тіл включення Е. соїї із наступним нанесенням на колонку ЗР-Зерпагозе і колонку Зерпасгу! 5-200 з одержанням очищених сульфованих мономерів МР5Б2, які піддавали повторному сч ов укладанню і ізоелектричної преципітації, потім наносили на колонку КЕЗОШКСЕ КЕРС ВЕЖУ із зверненою фазою з одержанням фракцій очищених димерів цих білків. Фізико-хімічні властивості цих білків аналізували на основі і) визначення М-кінцевої амінокислотної послідовності й амінокислотного складу і з застосуванням електрофорезу.

Даний винахід стосується також способу культивування клітин Е. соїї, в які були введені експресуючі вектори даного винаходу в умовах культурального середовища при 28 - 34"С, рН 6 - 8 і концентрації кисню 20- вк зо 9090. Далі, даний винахід стосується способу лікування захворювань хрящів і кісток, що включає в себе введення людині фармацевтичної композиції, що містить в якості активного інгредієнта ефективної кількості ісе) гомодимерного білка. ї-

Біологічні активності гомодимерного білка визначали аналізом рентгенограм м'якого рентгенографічного аналізу, аналізом забарвлювання тканин і аналізом тимчасового ходу ектопічного утворення хрящів/кісток. Крім ісе) зв Того, на підставі результатів дії на внутрішньомембранну осифікацію (окостеніння), дії на регенерацію «Е суглобної хрящової тканини і дії на загоєння перелому і дефекти кісток було показано, що гомодимерний білок даного винаходу є цінним для терапії регенерації хрящової і/або кісткової тканини.

Гомодимерний білок даного винаходу можна вводити системно внутрішньовенною, внутрішньом'язовою або внугрішньочеревною ін'єкцією. У випадку внутрішньовенного введення можна також використовувати краплинне «

Внутрішньовенне вливання, на додаток до звичайних внутрішньовенних ін'єкцій. з с Препарати для ін'єкцій можуть бути приготовлені, наприклад, у вигляді порошків для ін'єкцій. В цьому випадку порошки можуть бути приготовлені шляхом додавання одного або декількох придатних водорозчинних ;» наповнювачів, таких як маніт, сахароза, лактоза, мальтоза, глюкоза, фруктоза і т.п., до активного інгредієнту, розчинення цієї суміші у воді, розподілу и у флакони або ампули з наступною ліофілізацією і герметичним закупорюванням. ї5» У випадку місцевого введення гомодимерний білок може бути нанесений у вигляді покриття на поверхню хряща, кістки або зуба за допомогою колагенової пасти, фібринового клею або інших матеріалів для

Ме, приклеювання. У випадку імплантації кісток можна використовувати як природну кістку, так і звичайну штучну -І кістку. Штучна кістка означає кістку, виготовлену з металу, кераміки, скла й іншої природної або штучної 5ор неорганічної речовини. Кращою штучною речовиною вважають гідроксиапатит. Наприклад, штучна кістка може

Ме, бути виготовлена зі сталі в якості щільного матеріалу у внутрішній частині і гідроксиапатиту в якості "М пористого матеріалу зовнішньої частини. Крім того, вигідно наносити гомодимерний білок на частину, із якої видаляють ракову кісткову тканину, для прискорення відновлення кістки. Він може бути також нанесений на імплантат хряща.

Доза може змінюватися в залежності від різноманітних факторів, що впливають на активність даного білка, таких як вага кістки і хряща, які повинні бути відновлені, ушкоджене місце кістки і хряща і симптоми, вік і

Ф) стать пацієнтів, тяжкість інфекції, інтервали введення та інші клінічні фактори. Доза може також змінюватися ка в залежності від типів носіїв, використовуваних для повторної структуризації з димерним білком. Загалом, доза знаходиться в діапазоні «10 - 10бнг гомодимерного білка на сиру вагу цільових кістки і хряща при введенні у бор вигляді композиції, що містить носій. У випадку місцевого і системного введення у вигляді ін'єкції краще вводити 0,1 - 107 мкг з частотою від одного разу на тиждень до одного разу на день.

Синергічна дія може очікуватися при введенні гомодимерного білка одночасно з відомими факторами росту, наприклад, інсулін- подібним фактором росту-1, для регенерації кісткової і хрящової тканини.

Ніколи не повідомлялося про спосіб одержання білка даного винаходу в промисловому масштабі й в 65 очищеному вигляді, як описано вище, і цей гомодимерний білок може застосовуватися в якості лікарської композиції для лікування захворювань хрящів і кісток, оскільки він має хрящову і кісткову морфогенетичну активність. Далі, спосіб одержання білка відповідно до даного винаходу може бути застосовний для одержання інших білків, членів вищеописаного суперсімейства ТОРБ-Д, які (всі) дотепер можна було успішно одержувати тільки з використанням ліній клітин ссавців.

Даний винахід ілюструється наступними прикладами. Проте, не варто вважати, що даний винахід обмежений тільки цими характерними прикладами.

Приклади

Приклад 1. Конструювання експресуючого вектора (1) Виділення зрілого району МР52 70 КДНК зрілого району МР52 людини ПЛР-ампліфікували з використанням плазмідного вектора (раек5Б258), який містить КДНК, описану в М/О 93/16099, в якості матричної ДНК.

У відповідності зі способом збільшення виходу цільових білків, повідомленим М. Мобрийага, еї аї. (Адгіс.

Віої. Спет., 52(6), 1331 - 1338, 1988), частина ДНК гена зрілого району МР5Б2 заміняли для збільшення вмісту

АТ біля ініціюючого району АТО.

Мутагенез був забезпечений ПЛР-способом із використанням сконструйованого праймера ПЛР, що включає в себе мутацію 5ЕО ІЮО Мо 2 Списку послідовностей. Для послідовності ДНК праймерів ПЛР використовували

ДНК 5ЕО І Мо 2 в якості зворотного (ирзігеат) праймера, а ДНК ЗЕО ІО Мо З Списку послідовностей в якості прямого (дом/"пзігеат) праймера.

ПЛР здійснювали шляхом додавання матричної ДНК (1Онг), ХОнмоль кожного з праймерів ПЛР в прямому напрямку і в зворотному напрямку, аМТР (0,2ммоль) і МОСІ 2 (1,5ммоль) в одній і тій ж тест-пробірці, разом із

ДНЕК-полімеразою Таад (5Е).

Виконували тридцять циклів ПЛР; умови кожного циклу були: 947С протягом 1 хв. для денатурації, 557 протягом 1 хв. для відпалу праймерів і 727С протягом 2 хв. для подовження праймерів.

Продукти, отримані з ПЛР, виділяли за допомогою електрофорезу в 1,595 агарозі з низькою точкою с плавлення (придбаної з ЕМ5) і виділяли фрагменти «ЗбОп.н. (Фрагмент 1). (2) Конструювання експресуючого вектора Е. соїї для білка даного винаходу і)

Для збільшення числа копій плазміди на бактерії район огі для початку реплікації вектора рвВКк заміняли районом огі вектора рус. Експресуючий вектор Е. соїї рКК223-3, доступний в продажі (придбаний із Ріпагтасіа

Віоїесі), використовували для виділення району промотора (ас шляхом розщеплення рестриктазами 52ері і ЕсокіІ ч- і також для виділення термінуючого району гтпВ 105, із використанням заї| і 5врі. Фрагмент ДНК промоторного району іас, що був оброблений нуклеазою маша (Такага 5пи2о Со., Ца), літували ДНК-лігазою Т4 із Фрагментом іш 1, отриманим вище. Отриманий фрагмент ДНК розщеплювали Заї і повторно лігували в сайт Зтаі! вектори риОсС18 для конструювання експресуючого вектора (ркоОтТ245) (Ассезвіоп Мо. ВІКОКЕМ-КІР-14895)) (Фіг.1) для одержання білка. Довжина ДНК рКОТ245 дорівнює 3,7п.н. Нуклеотидну послідовність експресуючого вектора, і-й 3з5 сконструйовану для цього білка, аналізували за допомогою секвенатора ДНК (РНагтасіал І). «І (3)Трансформація

Трансформацію здійснювали відповідно до способу трансформації з хлоридом рубідію Кизнпег еї аї. (Сепейс

Епадіпеегіпо, р. 17, ЕІвемівег, 1978). Коротенько, РКОТ245 використовували для трансформації штаму-хазяїна Е. « соїї МУ311ОМ відповідно до описаного вище способу з одержанням трансформантів Е. соїї для одержання цільового білка. - с Приклад 2. Культивування ц (1) Культивування "» Е. соїї, що експресує білок даного винаходу, попередньо культивували в модифікованому середовищі 5ОС (бактотриптон 20г/л, бакто-дріжджовий екстракт 5г/л, Масі 0О,5г/л, МоСі» 6НЬО 2,0Зг/л, глюкоза З,бг/л). 100мл суспензії бактерій використовували для інокулювання 5л продукційного середовища (бактотриптон 5г/л, лимонна ьч кислота 4,Зг/л, КОНРО, 4,675г/л, КНРО)Х 1,275г/л, Масі 0,865г/л, Гео); 7НьЬО 100мг/л, СиБО, 5НЬО мг/л,

Ф Мпи5О,) пнНоО 0,5мг/л, СасСі» 2Н50 2мг/л, Ма»8507 10Н50 0,225мг/л, (МНі) 6Мо7О054 4Н2О 0, 1мг/л, 2150, 7НьЬО 2,25мг/л, СоСі» 6НьЬО бмг/л, Ма5О0; 7НЬО 2,2р/л, тіамін-НСІ 5,Омг/л, глюкоза Зг/л), яку культивували в -І 10-літровому ферментері з аерацією-перемішуванням і потім при досягненні ранньої стадії логарифмічної фази росту (ОЮОвво - 5,0) добавляли ізопропіл- Д-Ю-тіогалактопіранозид при кінцевій концентрації 1м і культивування

Ф продовжували до досягнення ОО в5во- 150. Під час цього культивування температуру підтримували при 32"7С і що рівень рН 7,15 додаванням аміаку. Для запобігання зниження концентрації розчиненого кисню перемішування здійснювали зі швидкістю, достатньою для підтримки концентрації розчиненого кисню при 5095 від насичення повітря. Культивування продовжували додаванням 5095 розчину глюкози до рівня 0,290 для одержання високої щільності клітин, про яку свідчило різке збільшення концентрації розчиненого кисню. (2) Одержання тіл включення Е. сої о Культуральний бульйон, отриманий описаним вище способом, центрифугували для збору клітин, що потім іме) суспендували в 25м Трис-НСІ-буфері, що містить 10м етилендіамінтетраоцтову кислоту (рН 7,3). Клітини руйнували пропусканням їх через гомогенізатор (АРМ Саціїп Іпс.) і знову центрифугували для збору осаду, що 60 містить тіла включення.

Приклад 3. Очищення (1) Солюбілізація тіл включення Е. сої

Після промивання 195 тритоном Х-100 три рази тіла включення Е. соїї центрифугували при 30009 протягом 30 хвилин при 4"С і потім отриманий осад солюбілізували обробкою ультразвуком в 20мММ Трис-НСІ-буфері, рН 8,3, 65 8М сечовині, 10мММ ДТТ і їмМ ЕДТК. (2) Одержання мономерів

Солюбілізований розчин центрифугували при 200009 протягом 30 хвилин і отриманий супернатант збирали.

Отриманий супернатант наносили на колонку 5Р-Зерпагозе БЕ (РІпагтасіа АВ), урівноважену 20мММ

Трис-НСІ-буфером, рН 8,3, ЄМ сечовиною і 1мММ ЕДТК, і потім після промивання тим же самим розчином, колонку елюювали тим же самим розчином, що містить 0,5М Масі. Білок в елюаті сульфували додаванням Ма 250)» і

Ма,ЗаОв до кінцевої концентрації, відповідно 111мММ і 13мММ і інкубуванням при 4"С протягом 15 годин.

Сульфований розчин піддавали гель-фільтрації на колонці Зерпасгу! 5-200 НК (РІагтасіа АВ), урівноваженій 20м Трис-НСІ-буфером, рН 8,3, ЄМ сечовиною, 0,2 Масі і 1мМ ЕДТК, з одержанням сульфованих мономерів білка даного винаходу. 70 (3) Повторне укладання

Розчин сульфованих мономерів добавляли в 9-кратний об'єм 50ММ Ма-гліцинового буфера, рН 9,8, 02М масі, 16бмМ СНАРБ, 5мММ ЕДТК, 2мМ О5Н (відновленого глютатіону) і мМ 5555 (окисленого глютатіону) і потім інкубували протягом 24 годин при 47С для окислювання і повторного укладання білка даного винаходу. (4) Одержання гомодимерів

Розчин для повторного укладання розбавляли таким же об'ємом очищеної води і потім доводили рн приблизно до 7,4 бн НОЇ і поміщали для ізоелектричного осадження. Осади, зібрані центрифугуванням при 300049 протягом 20 хвилин, солюбілізували в розчині з 3095 ацетонітрилу, що містить 0,195 ТФК. Розчин розбавляли таким же самим об'ємом очищеної води і наносили на колонку КЕЗОШКСЕ КРС (РПпагтасіа АВ) ВЕЖХ із зверненою фазою, урівноваженою 2595 ацетонітрилом, що містить 0,0595 ТФК, і потім елюювали лінійним 2о градієнтом 25 - 4595 ацетонітрилу, що містить 0,0596 ТФК. Елюат піддавали моніторингу на поглинання при 28О0нм. Фракції очищеного гомодимерного білка збирали і ліофілізували за допомогою концентратора ЗреедМас (Зегмапі Со.). (5) Визначення фізико-хімічних властивостей очищеного білка даного винаходу а) Аналіз М-кінцевої амінокислотної послідовності сч

Аналіз М-кінцевої амінокислотної послідовності для очищених білків виконували за допомогою секвенатора амінокислот Моде! 476А (Арріїей Віозувзіетз Іпе) для підтвердження амінокислотної послідовності від М- кінця і) до З30-ої амінокислоти, показаної в ЗЕО ІЮО Мо 1 Списку послідовностей

В) Аналіз амінокислотної сполуки

Аналіз амінокислотної сполуки очищених білків, отриманих, як описано вище, виконували за допомогою М зо секвенатора амінокислот (РІСО ТАС Зузіетвз, УМаїегз) Результат показаний в Таблиці 1 Цифра, подана в

Таблиці 1, вказує число амінокислотних залишків на мономерний білок ісе) ча

Ф зв - ве 84119 ч з с тва . » 15 ї»

Ф ее - бу 20 ве 516 тм 11411 с) Аналіз за допомогою електрофорезу

ІФ) Було підтверджено, що молекулярна маса очищених білків, отриманих як описано вище, дорівнює «28кДа іме) при електрофорезі в ПААГ-ДСН при невідновлюючих умовах.

Із результатів, поданих вище в а), Б) і с), видно, що білок даного винаходу містить 119 амінокислотних 60 залишків і починається з М-кінцевого Рго.

Приклад 4. Визначення біологічних активностей (1) Активність в ектопічному кісткоутворенні у мишей

Приблизно 500мкг гомодимерного білка, отриманого в Прикладі З, розчиняли і розбавляли в 5Омкл 1Ом соляної кислоти й одержували концентрації розчину Тмкг/1Омкл, 1Омкг/1Омкл і 10Омкг/1Омкл. Десять мкл кожного 65 розчину змішували з 150мкл розчину колагену типу-ї свинячого сухожилля (КоКеп, 0,5Х, рН 3, 1-АС), нейтралізували, ліофілізували й отриману суміш імплантували в кишені, створені в м'язах стегна 8-тижневих самців мишей ІСК. На 21-й день від імплантації тварин вбивали і стегна вирізали. Після зняття шкіри стрівальність кальцифікованих тканин оцінювали м'якою рентгенографією. Як показано в Таблиці 2, імплантація 1мкг або більш димерного білка індукувала кальцифіковану тканину у частині цієї групи мишей, а дози 1Омкг і більш індукували кальцифіковану тканину у всіх використаних мишей. то

Фіг.2 показує типові приклади м'яких рентгенограм кальцифікованої тканини, індукованої різноманітними дозами білка МР5Б2. Фіг.2А, 28 і 2С показують приклади м'яких рентгенограм стегон мишей, імплантованих т5 1мкг/ділянка, 1Омкг/ділянка і 10Омкг/ділянка гомодимерного білка, відповідно. Ці рентгенограми показують, що гомодимерний білок індукував кальцифіковану тканину в стегні миші і збільшував її кількість в залежності від дози. Для перевірки, чи була утворена кальцифікована тканина хрящовою або кістковою тканиною, зрізи фіксованих стегон мишей, в які був імплантований гомодимерний білок в концентрації 1Омкг/ділянка, забарвлювали моп Козза, алциановим синім або гематоксиліном-еозином. 720 ФігЗ показує фотографії під світловим мікроскопом зрізів, забарвлених відповідними способами забарвлювання. На фіг.ЗА (забарвлювання моп Козза) зони, зазначені сі і сс, показують кальцифіковану тканину і кальцифіковані хондроцити, відповідно. На фіг.3В (забарвлювання алциановим синім) зони, зазначені гс, показують хрящову тканину, що залишилася. На фіг.3С (забарвлювання гематоксиліном-еозином) елементи, зазначені ай, рт, ІВ, об і м, являють собою адипоцит, клітини кісткового мозку, ламелярну кісткову тканину, сч 25 остеобласти і переплетену кісткову тканину, відповідно. Таким чином, очевидно, що імплантація гомодимерного о білка з колагеном типу-1 в стегна мишей індукує кальцифіковані хондроцити, остеобласти і клітини кісткового мозку в місцях імплантації.

Таким чином, було показано, що гомодимерний білок має активність в ектопічному утворенні хрящової і М кісткової тканини. 30 (2) Аналіз тимчасового ходу ектопічного кісткоутворення у мишей (Се)

Димерний білок (Змкг), отриманий в Прикладі 3, змішували з розчином колагену типу-1 і нейтралізували, як м описано в Прикладі 4 (1), і ліофілізовані матеріали імплантували в стегна самця миші ІСК. На 3-й, 7-й, 10-й, 14-й, 21-й і 28-й дні від імплантації стегна вирізали і фіксували в 1095 формаліні і потім зрізи забарвлювали «(О гематоксиліном-еозином або моп Козза. Фіг.4 показує фотографії під світловим мікроскопом забарвлених зрізів. « 35 На 3-й день (фіг.4А, забарвлювання гематоксиліном-еозином) недиференційовані мезенхімальні клітини (те), в тому числі морфологічно волокнисті сполучнотканинні клітини, з'явилися в просторі між імплантованими волокнами колагену (со) і м'язовими клітинами (т). Між 7-им і 10-им днями (фіг4АЩВ і 4С, відповідно, забарвлювання гематоксиліном-еозином) цей простір заповнювався недиференційованими мезенхімальними « клітинами (тс), і ці клітини були гіпертрофованими і диференціювалися в передхрящову тканину. На 14-й день з (фіг.40, забарвлювання гематоксиліном-еозином і фіг4Е, забарвлювання моп Козвза) спостерігали с кальцифіковану хрящову тканину (ос) і кісткову тканину (Б). На 21-й день (фіг.40, забарвлювання :з» гематоксиліном-еозином і фіг.АЕ, забарвлювання моп Козза) кальцифіковану хрящову тканину не спостерігали взагалі, і тканина, що спостерігалася на 14-ий день, очевидно, замінялася кісткою (Б) із кістковим мозком (рт). На 20-ий день (фіг.АН, забарвлювання гематоксиліном-еозином) була велика кількість клітин кісткового їх но мозку й утворена кістка, очевидно, знаходилася в стані процесу резорбції.

Таким чином, очевидно, що гомодимерний білок індукує ендохрящову осифікацію (окостеніння) через (22) утворення хрящової тканини в ектопічних ділянках, як повідомлялося з використанням інших ВМР. -1 (3) Дія на внутрішньомембранну осифікацію

Гомодимерний білок, отриманий в Прикладі 3, розчиняли в забуференому фосфатом сольовому розчині (рн (22) 50 3,4), що містить 0,0195 людський сироватковий альбумін, і готували концентрації розчинів 0,01мкг/2Омкл, -Ч О,Тмкг/2о0мкл і Тмкг/2О0мкл. Аліквоту 2О0мкл кожного розчину вводили 12 разів один раз в день на періості (окісті) тім'яної кістки новонародженого пацюка за допомогою мікрошприца з 1-го дня після народження. Такий же об'єм носія вводили на протилежній стороні тім'яної кістки кожного пацюка. Той же об'єм носія вводили також на обох сторонах тім'яних кісток контрольних пацюків. На 1-ий день від фінальної ін'єкції пацюків вбивали й обидві сторони тім'яних кісток вирізали і фіксували і потім готували зрізи з віддаленою вапняною

ГФ) речовиною, забарвлені гематоксиліном-еозином, для виміру товщини тім'яних кісток в ін'єкційованих ділянках на з фотографіях під світловим мікроскопом. Розраховували відношення товщини тім'яних кісток кожного пацюка в ін'єкційованій гомодимерним білком/ін'єкційованій носієм ділянці. Як показано в Таблиці 3, гомодимерний білок збільшував товщину тім'яної кістки в залежності від дози. Типовий приклад мікрофотографій зрізу при ділянці, бо ін'єкційованої О0,1мкг гомодимерного білка, показаний на фіг.5В в порівнянні з мікрофотографією протилежної сторони ін'єційованої носієм ділянки (фіг.5А). Ін'єкція гомодимерного білка індукувала активацію і проліферацію клітин періосту (р) і в тім'яній кістці і на тім'яній кістці спостерігалися активовані остеобласти (Б). Ці результати показують, що гомодимерний білок стимулював внутрішньомембранну осифікацію при місцевому введенні, і що гомодимерний білок є корисним для терапії остеопорозу, перелому 65 кісток і дефектів альвеолярного відростка щелепи і періодонтальних дефектів.

Доза гомодимерного білка (мкг/ ділянка/ день) Відношення ві) й 70 Розміри являють собою середні їх середнє квадратичне відхилення (ЗО), "р «0,05, р '« 0,01 в порівнянні з відношенням групи, в якій носій вводили в обидві сторони (тест Віл'ямса) (4) Дія на регенерацію суглобного хряща

Для цього дослідження використовували шість 12-тижневих самців новозеландських білих кроликів. Шкіру і суглобну капсулу правого коліна розрізали і створювали кістково-хрящовий дефект товщиною 5 х 5мм в канавці надколінної чашечки за допомогою стоматологічного бора таким чином, щоб не ушкодити навколишнє ЇЇ сухожилля. Дефекти заповнювали або тампоном із ліофілізованого колагену типу-1, або таким тампоном, що містить 1Омкг гомодимерного білка, отриманого, як описано в Прикладі 4 (1), і потім розріз суглобної капсули і шкіри зашивали. Через З тижні після цієї операції кроликів умертвляли і стегнові голівки вирізали і фіксували в 1095 формаліні і потім зрізи з віддаленою вапняною речовиною забарвлювали алциановим синім.

Типові приклади фотографій під світловим мікроскопом цих зрізів показані на фіг.б6. Оброблені димерним білком дефекти (фігбС і 60) показали регенерацію хондроцитів (сп) із екстрацелюлярними матриксами, які забарвлювали інтенсивно алциановим синім, в порівнянні з контрольними дефектами, імплантованими тампоном із колагену типу-1, які були заповнені волокнистою тканиною (ЇЇ. Хрящова тканина, індукована димерним білком, виявила зональну структуру, що включає в себе спочиваючі хондроцити, хондроцити, що сч ов ростуть, і сгіпертрофовані хондроцити, подібну структурі нормальної суглобної хрящової тканини.

Хондроіндукування білююм МР5Б2 спостерігали в дефектах усіх використаних кроликів (п - 3). Ці результати о) вказують на те, що цей димерний білок ефективний в репарації ушкодженої хрящової тканини у пацієнтів, таких як хворі остеопорозом. (5) Дія на загоєння перелому і дефекти кісток їм зо Для цього дослідження використовували тридцять пацюків Зргадое-Оаулеу (у віці приблизно 15 тижнів). З застосуванням латерального підходу до стегнової кістки всю м'язову і надкісткову тканину знімали з діафіза. ісе)

Створювали дефект у вигляді сегмента 5мм в середній частині правої стрижнеподібної структури стегнової кістки їм за допомогою бора і потім фіксували спеціально виготовлену поліетиленову платівку гвинтами з нержавіючої сталі уздовж кортикального шару стегна. Готували тампони з колагену типу-1, що містять 0, 1, 10 ї 100мкг ісе) з5 Гомодимерного білка, як описано в Прикладі 4 (1), і імплантували їх у сегментні дефекти кістки і потім рану « зашивали. Відразу ж після операції і через 12 тижнів після її ці дефекти оцінювали за допомогою м'якої рентгенографії. Як показано на фіг.7, 1Омкг/ділянка і 1ООмкг/ділянка гомодимерного білка стимулювали утворення калюсу (с5) в дефектах і створили кісткові зрощення, але дія при 1мкг/ділянка не була ясною в порівняння з контрольним, імплантованим колагеном, дефектом, де спостерігали тільки крайове ендостальне « 20 кісткоутворення. Через 12 тижнів після операції пацюків умертвляли і стегнову кістку з дефектом вирізали і - с вимірювали мінеральний вміст кісток (накопичений мінеральний вміст відповідно до трьох (в середньому) скануванням у дефекті) за допомогою абсорбціометрії з використанням рентгенівських променів із подвійною :з» енергією (да! епегду Х-гау) (АІоКа, Моде! ЮС5-600) в режимі із шириною сканування їмм після видалення поліетиленової платівки. Обидва кінці стегнової кістки фіксували смолою, потім вимірювали максимальну межу міцності при крутінні для порушення зрощення зразків за допомогою системи для натягу кісток (Маю, тодеї! їх М2-5004) при швидкості скручування 180"/хв. (Таблиця 4). Таблиця показує, що гомодимерний білок збільшує як мінеральний вміст кісток, так і міцність кісток при дефекті стегнової кістки пацюка, в якій був імплантований (2) цій білок, і свідчить про ефективність даного білка для загоєння перелому і відновлення кістки даного дефекту. -І п ділянка) (мг) см) я июля 00000000 люта вето в тва вмію в, о ю111111111111ттяквзю 77711111 вавизм в 7 юю вмежквтму 77777711 лоді в щі Розміри являють собою середні ЗЕ (стандартна помилка), " р «х 0,05 в порівнянні з групою з одним ді колагеном (ї - тест Ст'юдента),

З результатів Приклада 4 було виявлено, що гомодимерний білок даного винаходу має хрящову і кісткову бо морфогенетичну активність.

Білок, що складається з гомодимера білка, що має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО Мо 1 Списку послідовностей, має хрящову і кісткову морфогенетичну активність і застосовний у вигляді фармацевтичної композиції для лікування захворювань хрящів і кісток. Крім того, білок даного винаходу може бути отриманий в промисловому масштабі і в чистому вигляді за допомогою способу генної інженерії шляхом культивування Е. сої, бо трансформованої з більшою кількістю копій експресуючим вектором для даного білка.

Список послідовностей 5ЗЕО ІЮ Мо 1

Довжина послідовності: 119

Тип послідовності: амінокислота

Топологія: лінійна

Тип молекули: пептид

Тип фрагмента: М-кінцевий фрагмент

Вихідне джерело 70 Організм: Ното заріепв

Назва тканини: плід

Ознаки:

Інша інформація: від 383 до 501 амінокислотна послідовність амінокислотної послідовності МР52

Опис послідовності: ЗЕО ІЮ Мо 1:

ССА СТВ СОС АСТ СВО САб ОС АДб о СсА ССС ДОС ААб дАС СТІ АЛ ост 048

Ро Без АтТа твтІ Ах б1пй б1у уз Аг хо Зеїг буз Азпоїез Буз Аза 5 10 15 20

СосотосС о АСт Со ААбОССА СТО СА Ото АС ОТТС АЛО САС о дте бос тоб 35 275 Аг Схуз Бек алу йуз ліа тей нія Маї д5п Рхе уз Аз Мес піу ТІр се 20 25 30 о з0 САС БАС ТО АТС АТС ССА ССС ОСТТ САС ТАС Сдб о сСтТ тт САС тоС сб 144.

Азр Ав ТІр І1е Ї13 Діа хо ви бів туш Сі діа РНе Ніз Суз бій ч- «5 шо 35 -ї-- - -лпт и т - в з спо СІб ТОС бАб То ССА тт СОС ТОС САС СТО бАб ССС АСО ВАТ САТ 192 (Се) 35 сіу цез Суз бій Ре Рхо їец дод 5ехї нів Тац біц Ро ТВгодзп НІЗ « 59 55 бо 40 бсА БТС АТС СА АСС СТО АТО АМС ТС АТС САС СОС БАС ТС АСА ССА 240 « 40 Віа Уаї І1а бій тТБІ Сей Ме Ап бес мес А5р оРхо б) ет ТІ РЕо в) с - з» 45 55 79 75 80

ССС АСС ТоС тот бто СО АСб особа сто дб ССС АТС АС АТС СІ ІТС 288 ї- Рго тп» Суз Суз Уаії го ТЬї Адс Без бех Рго І1є 58: Ії6 Ццецч Рпе б 85 90 35 -і АТ САС ТСТІ БОС ДАСОААС Сто о отб ТАТ дДАб Со ТАТ САб бАС АТО СС 336 ву 0. І з х-е бар зесг Аїа дха лап Уаї Угі Тук уз біп Тут біц дзр мес Угі 5 100 105 110 в сто баб тов тот бос Тос ло 357 (Ф) уак бій Бех Суз біу Суз А:5

Ге 10 115 во ЗЕОІЮ Мо 2

Довжина послідовності: 27

Тип послідовності: нуклеїнова кислота

Кількість ланцюгів: одна

Топологія: лінійна 65 Тип молекули: інша нуклеїнова кислота

Вихідне джерело: немає

Організм: немає

Штам: немає

Ознаки: Зворотний (ирзігеат) праймер ПЛР МРБ2 зрілого типу

Опис послідовності: ЗЕО ІЮ Мо 2:

АТААТОССАС ТАССЗАСТОС ТоВссОоС 27

ЗЕО ІЮ Мо З

Довжина послідовності: 26 70 Тип послідовності: нуклеїнова кислота

Кількість ланцюгів: одна

Топологія: лінійна

Тип молекули: інша нуклеїнова кислота

Вихідне джерело: немає 12 Організм: немає

Назва тканини: немає

Ознаки:

Інша інформація: Прямий (дом/пзігеат) праймер ПЛР МР зрілого типу

Опис послідовності: ЗЕО ІЮ Мо 3; ч па Ї вант т - - "'- 2 6

СЕТССАСТАС СТОСАБССАС АСОАСТ

Стисле пояснення мадлюнків се

Фіг.1 показує плазмідну карту експресуючого вектора (рКОТ245) для білка даного винаходу, отриманого о згідно з Прикладом 1 (2).

Фіг.2 показує м'яку рентгенограму кальцифікованої тканини, індукованої в стегні у миші в Прикладі 4(1).

Фіг.3 показує фотографію в світловому мікроскопі забарвленої кальцифікованої тканини в стегні у миші в

Прикладі 4(1). о

Фіг.А4 показує фотографію в світловому мікроскопі забарвленої кальцифікованої тканини в стегні у миші з со часом у Прикладі 4 (2).

Фіг.5 показує фотографію в світловому мікроскопі забарвленої тім'яної кістки пацюка в Прикладі 4 (3). о

Фіг.6 показує фотографію в світловому мікроскопі дефектів забарвленого суглобного хряща в голівці стегна со кролика в Прикладі 4 (4). 3 Фіг.7 показує м'яку рентгенограму кісткоутворення в кісткових дефектах стегнових кісток пацюків в «

Прикладі 5 (5).

Claims (1)

1. Формула винаходу « 40 ші с 1 Білок, що має амінокислотну послідовність: з» Рго Гем Аа Тіт Аге СЯп СЯу Гуз Аге Ртго' Бер уз Авп І. ем Гуз Аа Ате Суз Бех Ат 20 . Е ІЙ м « І уз Аа Ге Ні Ма! Азп Ре Гуз Азр Меї-ОЛу Ттр Азр Авр Тгр Пе Пе Аа Рго їм 40 45 не Ом Туг Оїм Аза Рне Ніз Суз Стій СЛулен Суз Си Ріе Рго І.си Аге 5ег Ніз їеи Сі 60 Ф Рго Тіг Азп Нів Аа Ма! Пе Сп Тбг Гей Меї Аза бег Меї Авр Рго Сіц бег Ті Рго 80 -І т к б) Рго Тіг Сув Суз Ма! Рго Тіг Аге Пец Бех Рго Пе бет Пе їх Ріе Це Авр бег Аа 100 -ч Азп Азп Ма! Ма! Тут Гуз Сіп Тут Си Авр Меї Уа! Уа! СЛи бетг Суз СЛу Сувз Агр , 2 Білок за п 1, який відрізняється тим, що він є гомодимерним. 55 З Фармацевтична композиція для лікування захворювань хрящів і кісток, яка відрізняється тим, що містить терапевтично ефективну кількість білка за п. 2 і фармацевтичний носій. (Ф) 4 Фармацевтична композиція за п. 3, яка відрізняється тим, що захворювання хрящів і кісток являє собою Ге остеопороз.

   Фармацевтична композиція за п. 3, яка відрізняється тим, що захворювання хрящів і кісток являє собою бр Остеоартрит або епіфізарний остеомієліт. 6 Фармацевтична композиція за п.

   З, яка відрізняється тим, що захворювання хрящів і кісток являють собою перелом кістки або дефект кістки. 7 Фармацевтична композиція за п. 3, яка відрізняється тим, що захворювання хрящів і кісток являють собою корінцеві та/або альвеолярні дефекти. ве 8 Спосіб отримання білка за п. 17, що включає в себе культивування клітин Е. соїї, трансформованих плазмідою, що містить ДНК, що кодує білок:

   Ме! Рго Цей Ада Тіг Ате п СЛу Гуз Аге Рго 5ег Гуз Авп Теми Гуз Аа Аге Суз бет 20 ; Зг8 Гуз Аа Гем Ні Ма! Азп Ре Гуз Авр Ме Су Тгр Авр Авр Тгр Пе Пе Аа Рто 40 ем бів Тут Сїм Аа Ре Ніз Суз См су І еф Суз СЛи Ре Рго Те Агр.беїг Ніз Геи 60 ю Оїм Рго Тнг Азп Ніз Аїа Ма! Пе Сіп Твг Їеи Меї Азп.бегт Меї Авр Рго Ой Зег Тіг 80 із Рго Ргсо Тіг Суз Суз Ма! Рго Тіг Аге Гем. ет Рто Пе бет Пе їем Рне Пе Авзр бег 100 4 Аа Азп Азп Маї Ма! Тут Гуз Сіп Тут СТИ Авр Меї Ма! Ма! Сім бег Суб Су Суб Агя ,

   9. Спосіб отримання гомодимерного білка за п. 2, що передбачає стадії: конструювання плазміди, що містить 75 ДНК, що кодує амінокислотну послідовність: Меї Рго Гем Аа Тіг Агр біп Су Буз'Аге Рго бег Пуз Авп Гей Гуз Аа Агр Сув бег 20 Агро Пуз АЇа Гем Ні Ма! Азп Рпе Суз Ар Меї СЛУ Тгтр А5р Авр Тгр Пе Пе Аа Рго 40 720 Ген Он Тут Сім Аа Рпе Ніз Суз Сти Слу Цей Сув Сім Ре Рго Пем Аге 5ет Ніз Гем 60 Ов Рго Ту Авп Ні Аа Ма! Пе Сіп Тіг ем Меї Азп 5ег Меї Азр Рго Сім 5ег ТПг 80 дво бо Рго ТІ Суз Су Ма! Рго ТНг Аге Гей 5ет Рго Пе 5ет Пе Ге Рпе Пе Авр бег 100 о Аа Азп Азп Маї Ма! Тут Гуз Сп Тут СЇм Азр Меї Ма! Ма! Си бЗег Суз С1У СузАгр, введення цієї плазміди в Е. соїї шляхом трансформації, солюбілізації тіл включення, отриманих шляхом М 30 культивування цієї Е. сої очищення мономерного білка з солюбілізованого розчину, повторного укладання мономерного білка в димерний білок і його очищення. (Се)

   10. Спосіб лікування захворювань хрящів і кісток що передбачає уведення людині фармацевтичної м композиції, що містить як активний інгредієнт ефективну кількість гомодимерного білка за п. 2.

   11. Спосіб лікування захворювань хрящів і кісток за п. 10, який відрізняється тим, що захворювання являє (Се) собою остеопороз. 35 пк. нище 5. « 12 Спосіб лікування захворювань хрящів і кісток за п. 10, який відрізняється тим, що захворювання являє собою остеоартрит або епіфізарний остеомієліт.

   13. Спосіб лікування захворювань хрящів і кісток за п. 10, який відрізняється тим, що захворювання являють собою перелом кістки або дефект кістки. « 20 14. Спосіб лікування захворювань хрящів і кісток за п. 10, який відрізняється тим, що захворювання являють з собою корінцеві та/або альвеолярні дефекти. с 15. Фармацевтична композиція за п. З, яка відрізняється тим, що :з» захворювання хрящів і кісток е дефектами і ушкодженнями хряща, такими як, ушкодження суглобового меніска.

   16. Фармацевтична композиція за п. З, яка відрізняється тим, що захворювання хрящів і кісток є уродженими їх захворюваннями, такими як хондродисплазія, хондрогіпоплазія, ахондрогенез, щілина піднебіння і остеодисплазія. (22) 17. Фармацевтична композиція за п. З, яка відрізняється тим, що використовується для системного або - місцевого введення.

   18. Фармацевтична композиція за п. 17, яка відрізняється тим, що введення здійснюють в формі ін'єкційного (22) препарату. -Ч 19. Спосіб лікування захворювань хрящів і кісток за п. 10, який відрізняється тим, що трансплантація кістки або трансплантація хряща, або індукція нового хряща чи кістки є бажаним. Ф) іме) 60 б5