HU225424B1 - Modified mp52-protein and process for producing thereof - Google Patents
Modified mp52-protein and process for producing thereof Download PDFInfo
- Publication number
- HU225424B1 HU225424B1 HU9801697A HUP9801697A HU225424B1 HU 225424 B1 HU225424 B1 HU 225424B1 HU 9801697 A HU9801697 A HU 9801697A HU P9801697 A HUP9801697 A HU P9801697A HU 225424 B1 HU225424 B1 HU 225424B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- treatment
- bone
- amino acid
- cartilage
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 121
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 120
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 119
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 36
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 32
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims description 29
- 101100472152 Trypanosoma brucei brucei (strain 927/4 GUTat10.1) REL1 gene Proteins 0.000 claims description 27
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 20
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 13
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 208000015100 cartilage disease Diseases 0.000 claims description 8
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 claims description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 5
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 claims description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 4
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 claims description 4
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 claims 2
- JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N Met-Ala Chemical group CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 9
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 7
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 7
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 6
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 4
- 239000000515 collagen sponge Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000003848 cartilage regeneration Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010007710 Cartilage injury Diseases 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 201000009859 Osteochondrosis Diseases 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 2
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- UABKKMXFBRQKKI-BJDJZHNGSA-N Arg-Cys-Ser-Arg Chemical compound N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O UABKKMXFBRQKKI-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- RVHGJNGNKGDCPX-KKUMJFAQSA-N Asn-Phe-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RVHGJNGNKGDCPX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ZNYKKCADEQAZKA-FXQIFTODSA-N Asn-Ser-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O ZNYKKCADEQAZKA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- KGAJCJXBEWLQDZ-UBHSHLNASA-N Asp-Asp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N KGAJCJXBEWLQDZ-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- SAKCBXNPWDRWPE-BQBZGAKWSA-N Asp-Met-Gly Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N SAKCBXNPWDRWPE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N Asp-Pro-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010026624 GTCGAC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- CBWKURKPYSLMJV-SOUVJXGZSA-N Glu-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O CBWKURKPYSLMJV-SOUVJXGZSA-N 0.000 description 1
- GTFYQOVVVJASOA-ACZMJKKPSA-N Glu-Ser-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N GTFYQOVVVJASOA-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- YZACQYVWLCQWBT-BQBZGAKWSA-N Gly-Cys-Arg Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O YZACQYVWLCQWBT-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- YIFUFYZELCMPJP-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O YIFUFYZELCMPJP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010090290 Growth Differentiation Factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010090254 Growth Differentiation Factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100040892 Growth/differentiation factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100035379 Growth/differentiation factor 5 Human genes 0.000 description 1
- OQDLKDUVMTUPPG-AVGNSLFASA-N His-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OQDLKDUVMTUPPG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- AGGIYSLVUKVOPT-HTFCKZLJSA-N Ile-Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)N AGGIYSLVUKVOPT-HTFCKZLJSA-N 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N Leu-Ser-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N Leu-Ser-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 206010072970 Meniscus injury Diseases 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- HQCSLJFGZYOXHW-KKUMJFAQSA-N Phe-His-Cys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N HQCSLJFGZYOXHW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- HFNPOYOKIPGAEI-SRVKXCTJSA-N Pro-Leu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HFNPOYOKIPGAEI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PKHDJFHFMGQMPS-RCWTZXSCSA-N Pro-Thr-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PKHDJFHFMGQMPS-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- MDAWMJUZHBQTBO-XGEHTFHBSA-N Pro-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1)O MDAWMJUZHBQTBO-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- ZSDXEKUKQAKZFE-XAVMHZPKSA-N Ser-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O ZSDXEKUKQAKZFE-XAVMHZPKSA-N 0.000 description 1
- 206010061363 Skeletal injury Diseases 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- PAOYNIKMYOGBMR-PBCZWWQYSA-N Thr-Asn-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N)O PAOYNIKMYOGBMR-PBCZWWQYSA-N 0.000 description 1
- FIFDDJFLNVAVMS-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Met Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O FIFDDJFLNVAVMS-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000012237 artificial material Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 210000003275 diaphysis Anatomy 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- XQRLCLUYWUNEEH-UHFFFAOYSA-L diphosphonate(2-) Chemical class [O-]P(=O)OP([O-])=O XQRLCLUYWUNEEH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000035194 endochondral ossification Effects 0.000 description 1
- 108010051943 endodeoxyribonuclease SspI Proteins 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 210000004013 groin Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000003239 periodontal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 108010025826 prolyl-leucyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 229940102127 rubidium chloride Drugs 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000000515 tooth Anatomy 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgyát egy MP52-proteinből származó, a szekvencialistában bemutatott 1. azonosító számú szekvenciát tartalmazó protein, valamint annak homodimere képezi. A találmány tárgyát képezi továbbá egy porc- és csontbetegségek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény, amely aktív hatóanyagként a találmány szerinti dimer proteint tartalmazza.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás a találmány szerinti protein nagy mennyiségben és nagy tisztaságban történő előállítására, melynek során a találmány szerinti protein expresszálására képes DNS-szekvenciát tartalmazó plazmiddal transzformált E. co//-sejteket tenyésztünk. A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás porc- és csontbetegségek kezelésére, melynek során egy embernek - aktív hatóanyagként a találmány szerinti homodimer proteint tartalmazó - gyógyászati készítmény hatásos mennyiségét adjuk be.
A találmány szerinti homodimer protein csont-alakfejlődési aktivitást fejt ki, ezért előnyösen alkalmazható porc- és csontbetegségek kezelésére.
A D3-vitamint, kalcitonint, ösztrogént vagy származékait, valamint difoszfonátszármazékokat tartalmazó gyógyászati készítmények csontbetegségek kezelésére alkalmazhatók. Az utóbbi időben beszámoltak arról, hogy a csont-alakfejlődési protein („boné morphogenetic protein”; BMP), a TGF-β szupercsaládba tartozó gének által kódolt proteinek (BMP-2 - BMP-9), valamint az ezekkel rokon proteinek csont-alakfejlődési aktivitásúak.
Az említett proteincsalád egyik tagjáról, az MP52proteinről szintén leírták, hogy csont-alakfejlődési aktivitással bír [WO 93/16099 és WO 95/04819 számú nemzetközi közzétételi irat]. Az MP52-protein érett régiója 120 aminosavat és N-terminálls alanint tartalmaz; aminosavszekvenclájának leírása megtalálható az említett közzétételi iratokban.
Leírtak egy GDF-5 elnevezésű proteint is, amely az MP52-proteinéhez hasonló aminosavszekvenciát tartalmaz [lásd Natúré 368, 639 (1994); és WO 94/15949],
E proteinek nagyüzemi méretekben, tisztított állapotban történő előállítása azonban nehézségekbe ütközik.
Az MP52-protein génsebészeti módszerekkel történő előállítása céljából emlőssejtvonalak (például L-sejtek) alkalmazását vizsgálták, azonban megállapították, hogy az expressziós rendszerek alkalmazásával nem könnyű az MP52-proteint tisztított alakban, nagy kitermeléssel előállítani.
Az MP52-proteint nagyüzemi méretekben, génsebészeti technológia alkalmazásával E. co//-sejtekben próbáltuk előállítani. Az MP52-protein alaninnal kezdődő érett régióját kódoló DNS-hez metionint kódoló kodont adtunk, s az így kapott DNS-t E. co/z-sejtekben expresszáltattuk. Termékként nemcsak az MP52-proteint, hanem az MP52-protein, egy N-terminális metionint tartalmazó 121 aminosavas protein, valamint egy az eredeti N-terminális prolint nem tartalmazó, prolinnal kezdődő - 119 aminosavas protein elegyét kaptuk. Az elegyből rendkívül nehezen sikerült olyan tiszta
MP52-proteint izolálni, amely legalább a protein érett régióját tartalmazta.
Felismertük, hogy az N-terminálisán prolinnal kezdődő, 1. azonosító számú aminosavszekvenciát tartalmazó proteint rendkívül nagy kitermeléssel, szelektíven állíthatjuk elő oly módon, hogy kialakítunk egy plazmidot, amelyben a 119 aminosavat tartalmazó (az MP52-protein N-terminális alaninja nélküli) 1. azonosító számú szekvenciát kódoló DNS-szekvenciához egy metionint kódoló kodon van kapcsolva, majd az így kapott plazmidot E. co//-sejtekbe juttatjuk és expresszáltatjuk. Az 1. azonosító számú szekvenciát tartalmazó protein homodimeréről kimutattuk, hogy porc- és csont-alakfejlődési aktivitású.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki egy olyan protein létrehozását, amely a szekvencialistában bemutatott 1. azonosító számú aminosavszekvenciát tartalmazza. Ez a protein 119 aminosavból áll, s egy olyan proteinnek felel meg, amelyből a humán MP52 (melyet 120 aminosavas érett régiónak tekintünk) N-terminális alaninja hiányzik. A találmány szerinti protein vízben oldható és alacsony toxicitású, mivel emberből származik.
További célul tűztük ki egy olyan - porc- és/vagy csontbetegségek kezelésére alkalmazható - gyógyászati készítmény előállítását, amely aktív alkotórészként az 1. azonosító számú aminosavszekvenciájú protein homodimerét tartalmazza. Mivel a találmány szerinti homodimer protein porc- és csont-alakfejlődési aktivitású, a találmány szerinti gyógyászati készítmény osteoporosis, osteoarthritis (például gonarthritis deformans és malum coxae deformans), arthrosteitis, porcsérülések, például meniscussérülés megelőzésére és kezelésére; a csontok vagy porcok - sérülés vagy oncotomia következtében létrejött - hibás részeinek helyreállítására, továbbá csont- vagy porchiányok, csonttörés, öröklött porc- és csontbetegségek (például chondrodysplasia, chondrohypoplasia, achondrogenesis, palatoschisis és osteodysplasia), illetve radicularis és arvecularis hiányosságok kezelésére alkalmazhatók. A találmány szerinti homodimer protein a plasztikai sebészetben csontátültetésnél is felhasználható. A felsorolt kezelések az állatgyógyászatban is alkalmazhatók.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során további célul tűztük ki egy olyan eljárás kifejlesztését, amellyel - gazdasejtként E. coli alkalmazásával - előállítható a humán MP52-protelnből származó 119. aminosavat (lásd 1. azonosító számú szekvencia) tartalmazó protein.
A találmány szerinti protein előállítása céljából olyan plazmid előállítására van szükség, amely a szekvencialistában 1. azonosító számú szekvenciaként bemutatott 119 aminosavas szekvenciát és az N-terminális végen egy további metionint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz. Polimeráz-láncreakció alkalmazásával a humán MP52-cDNS-nek csak az érett régióját amplifikáltuk, melynek során templát DNS-ként a WO 93/16099 számú nemzetközi közzétételi iratban leírt cDNS-t tartalmazó plazmidvektort alkalmaztuk. A polimeráz-láncreakciót (lásd 4 683 195 számú egyesült államokbeli szaba2
HU 225 424 Β1 dalmi leírás) egy DNS vagy RNS nagyon kis mennyiségben rendelkezésre álló fragmenseinek megsokszorozására alkalmazzuk.
A találmány szerinti protein előállítása céljából a kívánt proteint kódoló DNS-t tartalmazó expressziós vektorokat kell előállítani, amelyeket génsebészeti eljárásokkal megfelelő E. coli gazdasejtekbe juttatunk. A protein nagyüzemi méretekben történő előállítására a következő két javított eljárást alkalmaztuk.
Az első eljárással a transzláció hatékonyságának növelése révén fokozható a kívánt protein termelékenysége oly módon, hogy a proteint kódoló DNS ATG iniciációs kodonja közelében megnöveljük az adenin és timin (AT)-mennyiséget [lásd M. Nobuhara és munkatársai: Agric. Bioi. Chem. 52(6), 1331 (1988)].
A másik eljárással a plazmid egy sejtre jutó kópiaszáma fokozható oly módon, hogy a pBR-vektor replikációs kezdőhelyként szolgáló ori-régióját a pUC-vektor hasonló régiójával helyettesítjük. Ezenkívül a találmány szerinti expressziós vektor (pKOT245) előállítása céljából a promoterrégiót az 1. azonosító számú szekvenciaként bemutatott 119 aminosavas szekvenciát, valamint az N-terminális végen egy további metionint kódoló DNS-szekvenciával ligáltuk. A pKOT245-vektort tartalmazó E. coli-törzset a National Institute of Bioscience and Human-Technology intézet „Agency of Industrial Sience and Technology” kirendeltségénél (1-3, Higashi 1-chome, Yatake-cho, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japán) 1995. április 14-én, BIKOKEN-KI P-14895 deponálási számon helyeztük letétbe, majd 1996. április 10-én a Budapesti Szerződés rendelkezéseinek eleget téve - BIKOKEN-KI BP-5499 számon újra letétbe helyeztük.
A fentebb leírtaknak megfelelően a találmány tárgyát képezi egy eljárás monomer proteinek előállítására, melynek során (I) előállítunk egy plazmidot, amely az 1. azonosító számú szekvenciaként bemutatott aminosavszekvenciát, továbbá N-terminális végén egy metionint kódoló DNS-t tartalmaz;
(ii) a plazmidot transzformáció céljából E. coli-sejtekbe juttatjuk;
(iii) az E. coli-sejteket fehérjezárványok kinyerése érdekében tenyésztjük; majd (iv) a fehérjezárványokat szolubilizáljuk és tisztítjuk, miáltal a monomer proteineket kapjuk.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás az 1. azonosító számú szekvenciaként bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó protein homodimerének előállítására, melynek során a fentebb leírtak szerint kapott protein refoldingját (a negyedleges szerkezet, azaz az aktív térszerkezet újraalakítását) és tisztítását hajtjuk végre. A találmány szerinti proteinek előállítása céljából az E. co//-sejtekben létrejött fehérjezárványokat szolubilizáltuk, majd az így kapott oldatot „SP-Sepharose FF” oszlopra és „Sephacryl S-200” oszlopra töltöttük, s az elúciót követően tisztított, szulfonált MP52-proteineket kaptunk, amelyeket refoldingkezelésnek és izoelektromos precipitációnak vetettünk alá, végül „RESOURCE RPC” oszlopon végzett reverz fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával a proteinek tisztított, dimer frakcióit kaptuk. A proteinek fizikai-kémiai tulajdonságait az N-terminális aminosavszekvencia és az aminosav-összetétel alapján, valamint elektroforézissel vizsgáltuk.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás a találmány szerinti expressziós vektorral transzformált E. coli-sejtek tenyésztésére. A sejtek tenyésztését 28-34 °C-on, 6-8-as pH-η és 20-50%-os oldott oxigénkoncentráció mellett végezzük.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás porcés csontbetegségek kezelésére, melynek során egy embernek - aktív hatóanyagként homodimer protein hatásos mennyiségét tartalmazó - gyógyászati készítményt adunk be.
A találmány szerinti homodimer protein biológiai aktivitását lágy röntgensugarak alkalmazásával készített röntgenképek analízisével, szövetfestéses analízissel és az ektópiás porc- és csontképződés időbeli lefolyásának megfigyelésével határoztuk meg. A csonthártyán belüli csontképződésre, az ízületi porcok regenerálására, valamint a csonttörések és -defektusok gyógyulására gyakorolt hatás alapján a találmány szerinti homodimer protein hatásosnak bizonyult a porcés/vagy csontregenerációs terápiákban.
A találmány szerinti homodimer protein intravénás, intramuszkuláris vagy intraperitoneális injekcióval adható be a páciensnek. Intravénás beadás céljára a hagyományos intravénás injekciók mellett intravénás cseppinfúzió is alkalmazható.
Az injektálható készítmények például injektálható porok alakjában állíthatók elő. Ilyen esetben a porokat úgy állítjuk elő, hogy az aktív hatóanyaghoz egy vagy több vízoldékony kötőanyagot (például mannitol, szacharóz, laktóz, maltóz, glükóz, fruktóz és hasonlók) adunk, majd a keveréket vízben feloldjuk, az oldatot fiolákba vagy ampullákba töltjük, liofilizáljuk, s végül hermetikusan lezárjuk.
Lokális alkalmazás esetében a kezelni kívánt porcot, csontot vagy fogat homodimer proteint tartalmazó kollagénpasztával, fibrinenywel vagy egyéb tapadóanyaggal vonjuk be. Csontátültetésre természetes mesterséges csont egyaránt alkalmazható. Mesterséges csonton fémből, kerámiából, üvegből és egyéb természetes vagy mesterséges szervetlen anyagból készült csontot értünk. A mesterséges anyagok közül előnyösen hidroxiapatit alkalmazható. A mesterséges csontok, például a belső, nagyobb sűrűségű anyagként acél, a külső, porózus anyagként pedig hidroxiapatit alkalmazásával állíthatók elő. Ezenkívül a homodimer protein előnyösen alkalmazható a csont azon részén, amelyből rákos csontszövetet távolítottak el. Ilyen esetben a homodimer protein a csont újraképződésének felgyorsításában játszik szerepet. A találmány szerinti homodimer protein porcátültetés esetén is alkalmazható.
A találmány szerinti protein dózisa számos - a protein aktivitását befolyásoló - tényezőtől függ, így például a regenerálni kívánt csont vagy porc tömegétől, a csont- vagy porcsérülés helyétől, a tünetektől, a páciens életkorától és nemétől, a fertőzés súlyosságától,
HU 225 424 Β1 az adagolási intervallumtól és más klinikai faktoroktól. A dózis a dimer protein hordozójának típusától függően is változtatható. Hordozót tartalmazó készítmény alkalmazása esetén a homodimer proteint általában - a kezelni kívánt csont vagy porc nedves tömegére vonatkoztatva - 10-106 ng dózistartományban alkalmazzuk. Az injektálással végzett helyi és szisztémás beadás esetében heti egy alkalom és napi egy alkalom közötti gyakorisággal előnyösen 0,1-104 pg homodimer proteint adagolunk.
A találmány szerinti homodimer protein ismert növekedési faktorokkal, például inzulinszerű növekedési faktor l-gyel együttes beadásakor a csont és porc regenerálásában szinergikus hatásra számíthatunk.
A találmány szerinti protein nagyüzemi méretekben és tisztított alakban történő előállításának eljárását korábban nem ismertették. A találmány szerinti homodimer protein hatékonyan alkalmazható porc- és csontbetegségek kezelésére szolgáló gyógyászati készítményben, mivel csont- és porc-alakfejlődési aktivitású. Ezenfelül a találmány szerinti protein előállítási eljárása felhasználható a fentebb említett TGF-β szupercsaládba tartozó - korábban sikerrel csak emlőssejtvonalak alkalmazásával előállítható - egyéb proteinek előállítására is.
A találmány előnyös megvalósítási módjait az alábbiakban kísérleti példákon keresztül szemléltetjük, azonban a találmány igényelt oltalmi köre nem korlátozódik a példákban leírt megoldásokra.
1. példa
Expressziós vektor előállítása
1. Az MP52 érett régiójának izolálása
A humán MP52-cDNS érett régióját polimeráz-láncreakcióval - templát DNS-ként a WO 93/16099 számú nemzetközi közzétételi iratban leírt cDNS-t tartalmazó plazmidvektor (pSK52s) alkalmazásával - amplifikáltuk.
A célproteinek termelékenységének növelésére alkalmas - M. Nobuhara és munkatársai által kifejlesztett - eljárás [lásd Agric. Bioi. Chem. 52(6), 1331 (1988)] értelmében az MP52-gén érett régiója DNS-ének egy részét úgy helyettesítettük, hogy az ATG kezdőkodon környékén megnöveltük az AT-mennyiséget.
A mutagenezist a 2. azonosító számú szekvenciában lévő mutációt magában foglaló 5'-oldali láncindító alkalmazásával, polimeráz-láncreakcióval végeztük. A 2. azonosító számú szekvenciaként bemutatott nukleotidszekvenciát a 5'-oldali láncindítóban, a 3. azonosító számú szekvenciaként bemutatott nukleotidszekvenciát a 3'-oldali láncindítóban használtuk fel.
A polimeráz-láncreakció elvégzéséhez egy kémcsőben a 3'- és 5'-oldali láncindító 50-50 pmol-ját, 0,2 mmol dNTP-t és 1,5 mmol magnézium-kloridot öt egység Taq-DNS-polimerázzal elegyítettük.
Az amplifikációt 30 ciklussal, ciklusonként egy percig 94 °C-on (denaturálás), egy percig 55 °C-on (hibridizálás) és 2 percig 72 °C-on melegítve (lánchosszabbítás) végeztük.
A polimeráz-láncreakcióval kapott termékeket 1,5%-os alacsony olvadáspontú agarózgélen (FMC) végzett elektroforézissel választottuk el, és a kb.
360 bp-os fragmenseket (1. fragmens) izoláltuk.
2. A találmány szerinti protein expresszáltatására alkalmas E. coli expressziős vektor előállítása
A plazmid egy baktériumsejtre jutó kópiaszámának növelése céljából a pBR - replikációs kezdőhelyként funkcionáló - ori-régióját a pUC ori-régiójával helyettesítettük. A tac-promoterrégió Sspl- és EcoRI-endonukleázzal, illetve az rrnBt-|t2-terminátorrégió Sáli- és Sspl-endonukleázzal végzett izolálására a kereskedelmi forgalomban beszerezhető pKK223-3 E. coli expressziós vektort (Pharmacia Biotech) alkalmaztuk. A „Mung Beán” nukleázzal (Takara Shuzo Co., Ltd.) kezelt tac-promoterrégió egyik DNS-fragmensét T4-DNSligáz alkalmazásával az előző lépésben kapott 1. fragmenssel ligáitok, majd az így létrejött DNS-fragmenst Sall-endonukleázzal emésztettük, és az rrnBt-^-régióval ligáitok. Az így kapott DNS-fragmenst a pUC18-vektor Smal-helyére ligáivá a pKOT245 expressziós vektort (deponálási szám: ΒΙΚΟΝΕΝ-ΚΙ P-14895; lásd 1. ábra) hoztuk létre, amelyet a protein előállítására alkalmaztunk. A pKOT245-DNS 3,7 kb hosszúságú nukleotidszekvenciáját „Pharmacia ALF DNS-szekvenáló készülék alkalmazásával vizsgáltuk.
3. Transzformáció
Az E. coli gazdasejtek transzformálását a Kushner és munkatársai által leírt [„Genetic Engineering”, 17. old., Elsevier (1978)] rubídium-kloridos transzformációval hajtottuk végre, és a pKOT245-vektorral E. coli W3110M-törzset transzformáltunk.
2. példa
A gazdasejtek tenyésztése
1. Tenyésztés
A találmány szerinti proteint expresszáló E. co/z-sejtek előtenyésztését módosított SOC-tápközegben (20 g/l „Bacto tryptone”; 5 g/l „Bacto” élesztőkivonat; 0,5 g/l NaCI; 2,03 g/l MgCI2-6H2O; 3,6 g glükóz) végeztük. A proteintermelésre alkalmazott fermentációs tápközeg öt literének beoltására az előtenyészetben kapott baktériumszuszpenzió 100 ml-ét alkalmaztuk. A fermentációs tápközeg összetétele a következő: 5 g/l „Bacto tryptone”; 4,3 g/l citromsav; 4,675 g/l K2HPO4; 1,275 g/l KH2PO4; 0,865 NaCI; 100 mg/l FeSO4-7H2O; 1 mg/l CuSO4-5H2O; 0,5 mg/l MnSO4nH2O; 2 mg/l CaCI2-2H2O; 0,225 mg/l Na2B4O7-10H2O; 0,1 mg/l (NH4)6Mo7O24-4H2O; 2,25 mg/l ZnSO4-7H2O; 6 mg/1 CoCI2-6H2O; 2,2 g/l MgSO4-7H2O; 5,0 mg/l tiamin-HCI; és 3 g/l glükóz. A fermentációs tápközegben a baktériumokat levegőztetéssel és keveréssel 10 literes fermentorban tenyésztettük, majd a logaritmikus szaporodási fázis korai szakaszának elérésekor (OD550=5,0) a tenyészethez 1 mM végkoncentrációban izopropil^-D-tio-galaktopiranozidot adtunk, és a tenyésztést OD550=150 érték eléréséig folytattuk. A tenyésztés alatt a hőmérsékletet 32 °C-on, a pH-t pedig ammónia hozzáadásával - 7,15-on tartottuk. Az oldott oxigén koncentrációja csökkenésének megakadályozása érdekében a tenyészet keverési sebességét időnként felgyorsítottuk, hogy az oxigénkoncentrációt
HU 225 424 Β1
50%-os légtelítettségnek megfelelő értéken tartsuk. A tenyésztés során a fermentorba 0,2%-os végkoncentrációban 50%-os glükózoldatot adagoltunk, hogy nagy sejtsűrűséget érjünk el, amire az oldott oxigén koncentrációjának hirtelen növekedése utal.
2. E. coli fehérjezárványok előállítása
Az előző pontban leírt fermentációval kapott táplevest a sejtek kinyerése céljából lecentrifugáltuk, majd a sejteket -10 mM etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmazó - 25 mM Tris-HCI-pufferben (pH=7,3) szuszpendáltuk. A sejteket homogenizálókészülékben (APV Gaulin Inc.) feltártuk és ismét centrifugáltuk, miáltal megkaptuk a fehérjezárványokat tartalmazó csapadékot.
3. példa
Tisztítás
1. Az E. coli fehérjezárványok szolubilizálása
Az E. coli fehéijezárványokat 1%-os „Triton X-100” alkalmazásával háromszor mostuk, majd 4 °C-on 3000*g-vel centrifugáltuk, s az így kapott csapadékot 8 M karbamidot, 10 mM DTT-t és 1 mM EDTA-t tartalmazó - 20 mM Tris-HCI-pufferben (pH=8,3) végzett ultrahangkezeléssel szolubilizáltuk.
2. Monomer proteinek előállítása
A szolubilizált oldatot 4 °C-on 2000*g-vel 30 percig centrifugáltuk, s a kapott felülúszót összegyűjtöttük. A felülúszót - előzetesen 6 M karbamidot és 1 mM EDTA-t tartalmazó 20 mM Tris-HCI-pufferrel (pH=8,3) ekvilibrált - „SP-Sepharose FF” oszlopra (Pharmacia AB) töltöttük. Az oszlopot az ekvilibráláshoz alkalmazottal azonos oldattal mostuk, majd ugyanezzel - de 0,5 M nátrium-kloridot tartalmazó - oldattal eluáltuk. Az eluátumban lévő proteint 111 mM vékoncentrációjú Na^ SO3 és 13 mM végkoncentrációjú Na2S4O6 hozzáadásával és 4 °C-on 15 órás inkubálással szulfonáltuk. A szulfonált oldatot - előzetesen 6 M karbamidot, 0,2 M nátrium-kloridot és 1 mM EDTA-t tartalmazó 20 mM Tris-HCI-pufferrel (pH=8,3) ekvilibrált - „Sephacryl S-200 HR” (Pharmacia AB) oszlopon gélszűréssel tisztítottuk, miáltal a találmány szerinti protein tisztított, szulfonált monomereit kaptuk.
3. Refoldlng
A szulfonált monomerek oldatát keverés közben 0,2 M nátrium-kloridot, 16 mM CHAPS-t, 5 mM EDTA-t, 2 mM GSH-t (redukált típusú glutation) és 1 mM GSSG-t (oxidált típusú glutation) tartalmazó - kilencszeres térfogatú 50 mM Na-glicin-pufferhez (pH=9,8) adtuk, majd az így kapott oldatot - a találmány szerinti protein oxidálása és refoldingja céljából - 4 °C-on 24 óra hosszat inkubáltuk.
4. Homodimerek előállítása
A refoldingoldatot azonos térfogatú tisztított vízzel hígítottuk, majd a hígított oldat pH-ját 6 N nátrium-klorid hozzáadásával kb. 7,4-es értékre állítottuk be, és izoelektromos precipitációt végeztünk. A 3000*g-vel 20 percig végzett centrifugálással összegyűjtött csapadékot 0,1% trifluor-ecetsavat (TFA) tartalmazó 30%-os acetonitrillel szolubilizáltuk. Az oldatot azonos térfogatú tisztított vízzel hígítottuk, majd - előzőleg 0,05% TFA-t tartalmazó 25%-os acetonitrillel ekvilibrált - „RESOURCE RPC” reverz fázisú HPLC-oszlopra (Pharmacia AB) töltöttük, majd - 0,05% TFA-t tartalmazó - 25% -> 45% acetonitrilgradienssel eluáltuk. Az eluátum abszorbanciáját 280 nm-nél ellenőriztük. A tisztított homodimer proteint tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, majd „SpeedVac Concentrator” készülékben (Servant Co.) betöményítettük.
5. A találmány szerinti tisztított protein fizikai-kémiai tulajdonságainak meghatározása
a) A protein N-terminális aminosavszekvenciájának meghatározása
A tisztított proteinek N-terminális aminosavszekvenciáját „Model 467A” típusú aminosavszekvenáló berendezéssel (Applied Biosystems Inc.) analizáltuk, hogy igazoljuk a protein N-terminális végétől a 30. aminosavig terjedő szekvenciáját (lásd 1. azonosító számú szekvencia).
b) Az aminosav-összetétel vizsgálata
A tisztított proteinek aminosav-összetételét aminosavszekvenáló berendezés (PICO TAG Systems, Waters) alkalmazásával határoztuk meg. Az eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be. A táblázatban feltüntetett számok az egy monomer proteinben lévő aminosavak mennyiségét jelzik.
1. táblázat
| Aminosav | Tapasztalati mennyiség | Várt mennyiség |
| Asx | 11,5 | 12 |
| Gly | 10,9 | 11 |
| Ser | 8,4 | 9 |
| Gly | 4,3 | 4 |
| His | 4,0 | 4 |
| Arg | 7,7 | 7 |
| Thr | 5,4 | 6 |
| Alá | 7,3 | 7 |
| Pro | 10,2 | 10 |
| Tyr | 2,9 | 3 |
| Val | 5,7 | 7 |
| Met | 5,1 | 4 |
| 1/2Cys | 2,6 | 7 |
| lle | 4,9 | 6 |
| Leu | 10,0 | 10 |
| Phe | 4,0 | 4 |
| Lys | 5,9 | 6 |
| Typ | - | 2 |
| A szekvencia hosszúsága: 119 aminosav |
nem mutatható ki
c) Elektroforézissel végzett vizsgálat
Nem redukáló körülmények között végzett
SDS-PAGE analízissel a tisztított proteinek molekulatömegét kb. 28 kD-nak határoztuk meg.
HU 225 424 Β1
Az (a), (b) és (c) pontban leírt eredmények alapján megállapítottuk, hogy a találmány szerinti protein 119 aminosavat tartalmaz, és N-terminálisán prolinnal kezdődik.
4. példa
Biológiai aktivitás meghatározása
1. Ektópiás csontképződésre gyakorolt hatás vizsgálata egerekben
A 3. példában leírtak szerint előállított homodimer protein kb. 500 pg-ját 50 μ110 mM sósavban oldottuk, majd az így kapott oldat 1 pg/10 μΙ, 10 pg/10 μΙ, illetve 100 pg/10 μΙ koncentrációjú hígításait készítettük el. Az egyes hígítások 10-10 μΙ-ét l-es típusú sertésínkollagén 150 μΙ oldatával (Kokén, 0,5%; pH=3; l-AC) elegyítettük, a kapott oldatot semlegesítettük, liofilizáltuk, majd ezt az elegyet nyolchetes ICR-egerek combizmában kialakított üregekbe implantáltuk. Az implantáció utáni 21. napon az állatokat leöltük és combjaikat levágtuk. A bőr leválasztása után az elmeszesedett szövetek jelenlétét röntgenfelvételek alapján állapítottuk meg. Ahogy a 2. táblázatban látható, a dimer protein 1 pg/üreg dózisban végzett beültetése az egerek egy részében meszesedett szövet kialakulását indukálta, míg a 10 pg-os vagy nagyobb dózis valamennyi egérben szövetmeszesedést eredményezett.
2. táblázat
| Homodimer protein dózisa | Meszesedett szövet előfordulása |
| Kontroll (csak kollagén) | 0/4 |
| 1 pg/üreg | 3/4 |
| 10 pg/üreg | 4/4 |
| 100 pg/üreg | 4/4 |
A 2A., 2B. és 2C. ábrán az MP52-protein 1 pg/üreg, 10 pg/üreg, illetve 100 pg/üreg dózisa által indukált meszesedett szövetek - lágy röntgensugárzás alkalmazásával készített - röntgenfelvételeit mutatjuk be. A felvételek alapján látható, hogy a homodimer protein az egerek combjában dózisfüggő módon fokozódó mértékű meszesedést indukál. Annak igazolása céljából, hogy a meszesedett szövetek porc- vagy csontszövetek, a homodimer proteinnel 10 pg/üreg mennyiségben kezelt egércombok metszeteit „von Kossá”, Alcian-kék vagy hematoxilin-eozin színezékkel festettük.
A 3. ábrán a különböző anyagokkal festett metszetek fénymikroszkópos felvételeit mutatjuk be. A 3A. ábrán („von Kossa”-festés) a „ct” jelölés a meszesedett szövetet, a „cc” jelölés pedig a meszesedett porcsejteket mutatja. A 3B. ábrán (Alcian-kék) az „re” jelölés a megmaradt porcszövetet mutatja. A 3C. ábrán (hematoxilin-eozin) az „ad” adipocitát, a „bm” csontvelősejteket, az „Ib” lemezes csontot, az „ob” oszteoblasztokat, a „wb” pedig szivacsos csontot jelöl. A látottak alapján nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti homodimer protein I. típusú kollagénnel együttes implantálása egerek combjában meszesedett porcsejtek, oszteoblasztok és csontvelősejtek kialakulását eredményezi.
Ilyenformán bebizonyítottuk, hogy a találmány szerinti homodimer protein az ektópiás porc- és csontképződés terén aktivitással bír.
2. Az ektópiás csontképződés időbeli lefolyásának vizsgálata egerekben
A 3. példában előállított dimer proteint (3 pg) az előző pontban leírtak szerint I. típusú kollagén oldatával elegyítettük és semlegesítettük, majd a liofilizált anyagot hím ICR-egerek combjába implantáltuk. Az implantációtól számított 3., 7., 10., 14., 21. és 28. napon az egerek combjait levágtuk és 10%-os formaiinban fixáltuk, majd a metszeteket hetmatoxilin-eozinnal és „von Kossa”-festékkel festettük. A 4. ábrán a festett metszetek fénymikroszkópos felvételei láthatók.
A 3. napon (4A. ábra, hematoxilin-eozin-festés) az implantált kollagénrostok (co) és az izomsejtek (m) közötti térben differenciálatlan mesenchymasejtek (mc) ideértve a morfológiailag rostos megjelenésű kötőszöveti sejteket - láthatók. A 7. és 10. nap közötti időszakban (4B., illetve 4C. ábra; hematoxilin-eozin-festés) az említett teret differenciálatlan mesenchymasejtek (mc) töltötték ki, és ezek a sejtek megnagyobbodtak, és embrionális porc jellegű szövetté differenciálódtak. A 14. napon (4D. ábra, hematoxilin-eozin-festés; és 4E. ábra, „von Kossa’-festés) meszesedett porcszövetet (cc) és csontszövetet (b) figyeltünk meg. A 21. napon (4F. ábra, hematoxilin-eozin-festés; és 4G. ábra, „von Kossa’-festés) meszesedett porcszövetet egyáltalán nem találtunk, és úgy tűnt, hogy a 14. napon megfigyelt szövetet a csontban (b) csontvelő (bm) helyettesítette. A 28. napon (4H. ábra, hematoxilin-eozin-festés) nagy mennyiségű csontvelősejtet figyeltünk meg, és a képződött csont reszorpciós fázisban lévőnek bizonyult.
Fentiek alapján nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti homodimer protein ektópiás helyeken bekövetkező porcképződésen keresztül endokondrális csontképződést indukál (ahogy azt egyéb csont-alakfejlődési proteinekről is leírták).
3. A találmány szerinti protein csonthártyán belüli csontképződésre gyakorolt hatása
A 3. példában leírtak szerint előállított homodimer proteint - 0,01% humán szérumalbumint tartalmazó foszfátpufferelt sóoldatban (pH=3,4) oldottuk, és 0,01 pg/20 μΙ, 0,1 pg/20 μΙ és 1 pg/20 μΙ koncentrációjú hígításokat készítettünk. Az egyes hígítások 20-20 μΙ-ét a születés utáni első napon kezdve - mikrofecskendő alkalmazásával - naponta egyszer, összesen 12 alkalommal újszülött patkányok koponyafalcsontjának csonthártyájára injektáltuk. A patkányok koponyájának ellenkező oldalán azonos térfogatú hordozót injektáltunk (kontroll). Az utolsó injektálás utáni első napon a patkányokat leöltük, a koponyafalcsont mindkét oldalát kimetszettük és fixáltuk, majd - az injekciózott helyeken a koponyafalcsont vastagságának mérése céljából - hematoxilin-eozinnal festett, mésztelenített metszeteket állítottunk elő, és ezekről mikroszkópos felvételeket készítettünk. Minden egyes patkány esetében kiszámoltuk a homodimer proteinnel, illetve a
HU 225 424 Β1 hordozóval injektált koponyafalcsont vastagságának egymáshoz viszonyított arányát. A 3. táblázatban bemutatott eredmények alapján látható, hogy a találmány szerinti homodimer protein dózisfüggő módon növelte a falcsont vastagságát. Az 5. ábrán a 0,1 μg homodimer proteinnel kezelt falcsont metszetének (5A. ábra), illetve az ellenkező oldali, csak hordozóval injektált falcsont metszetének (5B. ábra) jellemző mikroszkópos felvételét mutatjuk be. A homodimer protein a csonthártyasejtek (p) aktiválását és proliferációját indukálta; a koponyafalcsonton és azon belül aktivált oszteoblasztokat (ob) figyeltünk meg. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a lokálisan injektált homodimer protein serkenti a csonthártyán belüli csontképződést, ezáltal alkalmas a csontritkulás, a csonttörés, valamint az alveolaris taréj és a periodontium defektusainak kezelésére.
3. táblázat
| Homodimer dózisa (pg/hely/nap) | Koponyacsont-vastagság (pm) | B:A arány | |
| Kontroll (A) | MP52 (B) | ||
| 0 (hordozó) | 128±7 | 141±20 | 1,10±0,16 |
| 0,01 | 134±9 | 167±30 | 1,27±0,33 |
| 0,1 | 119±19 | 190±29 | 1,60±0,10* |
| 1 | 132±9 | 225±25 | 1,70±0,14“ |
A táblázatban megadott eredmények átlagtszórás értékek (n=4); *p<0,05, **p<0,01 vs. abban a csoportban kapott arány, amelyben az egereket mindkét helyen hordozóval injektáltuk (Williams-teszt).
4. A homodimer protein Izületi porc regenerálására gyakorolt hatása
Ebben a kísérletben hat 12 hetes új-zélandi fehér nyulat alkalmaztunk. A nyulak jobb térdén a bőrt és az ízületi burkot felnyitottuk, és - a környező inak károsításának elkerülése érdekében fogászati fúróval - a térdkalács barázdájában 5*5 mm-es, teljes vastagságú osteochondralis defektust hoztunk létre. A hiányos területet liofilizált I. típusú kollagénszivaccsal, illetve a
4. példa (1) pontjában leírtak szerint előállított, 10 pg homodimer proteint tartalmazó liofilizált I. típusú kollagénszivaccsal töltöttük ki, majd az ízületi burkot és a bőrt összevarrtuk. A műtét után három héttel a nyulakat leöltük, a combcsontfejeket levágtuk, 10%-os formaiinban fixáltuk, majd a mésztelenített metszeteket Alcian-kékkel festettük. A metszetek mikroszkópos felvételeinek jellemző példáit a 6. ábrán mutatjuk be. A dimer proteinnel kezelt mintákban (6C. és 6D. ábra) az extracelluláris közeggel körülvett porcsejtek (eh) regenerálódását tapasztaltuk, melyek Alcian-kékkel intenzíven festődtek. Azok az osteochondralis defektusok, amelyekbe I. típusú kollagénszivacsot implantáltunk, rostos szövettel (f) voltak kitöltve. A dimer proteinnel indukált porcszövet zonális szerkezetű volt, s nyugvó porcsejtekből, fejlődő porcsejtekből és túlnőtt porcsejtekből állt, hasonlóan a normális ízületi porcszövethez.
Az MP52-protein által indukált porcképződést valamennyi kezelt nyúl (n=3) esetében megfigyeltük. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a találmány szerinti dimer protein - például osteoarthritisben szenvedő páciensekben - hatásosan alkalmazható a károsodott porcszövet regenerálására.
5. A találmány szerinti protein csonttörések és -hiányok gyógyításában mutatott hatása
Ebben a kísérletben harminc, kb. 15 hetes hím „Sprague-Dawley”-patkányt alkalmaztunk. Az állatok combcsontja diafízisének laterális oldaláról leválasztottuk az izmokat és a csonthártyát. A jobb combcsont középső régiójából fogászati fúróval 5 mm hosszúságú szakaszt távolítottunk el, majd a combcsontot speciálisan kialakított polietiléniemez és rozsdamentes csavarok alkalmazásával rögzítettük. Az (1) pontban leírtak szerint 0 pg, 1 pg, 10 pg és 100 pg homodimer proteint tartalmazó I. típusú kollagénszivacsokat készítettünk, és ezeket a combcsont hiányzó szakasza helyére ültettük, majd a sebet összevarrtuk. Közvetlenül az operáció után, illetve 12 héttel később a csontdefektusokat lágy röntgensugárzás alkalmazásával készített röntgenfelvételeken értékeltük. A 7. ábrán látható, hogy a homodimer protein 10 pg-os és 100 pg-os dózisa a hiányos területen kallusz (cs) képződését eredményezte, és a csont összeforrt. A kontrollkollagénnel kezelt csontok esetében megfigyelt marginális endostealis csontképződéshez képest az 1 pg-os dózisú homodimer protein hatása nem volt egyértelmű. A műtét után 12 héttel a patkányokat leöltük, kezelt combcsontjukat kivágtuk, és a polietilénlemez eltávolítása után kettős energiájú röntgensugaras abszorpciómetriával (Aloka, „DCS-600” modell), 1 mm-es pásztázási szélesség alkalmazásával meghatároztuk a csont (defektus középső harmadában pásztázott sávok egyikében felhalmozódott) ásványianyag-tartalmát. A combcsont mindkét végét gyantával rögzítettük, majd az összeforrt csontszakaszok közötti kapcsolat megszüntetéséhez szükséges torziós erőt csontfeszítővel (Malto, „MZ-500D” modell), 180°/perc csavarást sebesség alkalmazásával mértük. A 4. táblázatban bemutatott eredmények alapján látható, hogy a találmány szerinti homodimer protein növeli a kezelt combcsont ásványianyag-tartalmát és erősségét. Ez azt bizonyítja, hogy a protein hatásos a csonttörések, illetve a csontdefektusok gyógyítására.
4. táblázat
| Dózis (pg/hely) | Ásványianyag-ta italom a defektusban (mg) | Max. torziós erő (Kgfcm) | Mintaszám |
| Kollagén | 120,2±24,5 | 2,92±0,09 | 6 |
| 1 | 176,9±36,4 | 6,24±1,00 | 8 |
| 10 | 277,4±63,9 | 9,35±3,14 | 8 |
| 100 | 374,8±67,1* | 40,34±7,64* | 8 |
A táblázatban szereplő eredmények átlag±szórás értékek. * p<0,05 a csak kollagénnel kezelt kontrolihoz viszonyítva (Student-féle t-teszt).
HU 225 424 Β1
A 4. példában bemutatott eredmények alapján látható, hogy a találmány szerinti homodimer protein porc- és csont-alakfejlődési aktivitású.
A szekvencialista 1. azonosító számú szekvenciájaként bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó 5 protein homodimeréből álló protein porc- és csont-alakfejlődési aktivitású, s ezáltal felhasználható porc- és csontbetegségek kezelésére. Ezenfelül a találmány szerinti protein - génsebészeti eljárások alkalmazásával - nagy kópiaszámú expressziós vektorral transzfer- 10 máit E. co//-sejtek fermentálásával nagyüzemi méretekben és tiszta alakban állítható elő.
A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.
Az 1. ábrán a találmány szerinti protein expresszáltatására alkalmas pKOT245 exp- 15 ressziós vektor (lásd 1. példa 2. rész) plazmidtérképe látható.
A 2. ábrán az egerek combjában indukált meszesedett szövetek lágy röntgensugárzás alkalmazásával készített röntgenfelvéte- 20 leit mutatjuk be (lásd 4. példa 1. rész).
A 3. ábrán az egércombban megfestett, meszeseden szövet fénymikroszkópos felvétele látható (lásd 4. példa 1. rész).
A 4. ábrán az egércombok meszesedésének időbeli lefolyását bemutató fénymikroszkópos felvételek láthatók (lásd 4. példa 2. rész).
Az 5. ábrán a patkányok-4. példa 3. részében leírtak szerint megfestett - koponyafalcsontjainak fénymikroszkópos felvételeit mutatjuk be.
A 6. ábrán a nyulak combcsontfejében létrehozott, festett porcdefektusok fénymikroszkópos felvételeit mutatjuk be (lásd 4. példa 4. rész).
A 7. ábrán a patkányok combcsontjában létrehozott defektusok területén megfigyelt csontképződés - lágy röntgensugárzás alkalmazásával készített - röntgenfelvételei láthatók (lásd 4. példa 5. rész).
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 119
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
FRAGMENSTÍPUS: N-terminális fragmens
EREDETI FORRÁS:
ÉLŐLÉNY: homo sapiens
SZÖVET NEVE: fetus
SAJÁTSÁG:
EGYÉB INFORMÁCIÓ: az MP52 aminosavszekvencia 383-501 aminosavszekvenciái AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
| CCA CTG GCC | ACT Thr | CGC Arg 5 | CAG Gin | GGC AAG | CGA Arg | CCC Pro 10 | AGC Ser | AAG Lys | AAC Asn | CTT Leu | AAG Lys 15 | GCT Alá | 48 | |||
| Pro | Leu | Alá | Gly | Lys | ||||||||||||
| CGC | TGC | AGT | CGG | AAG | GCA | CTG | CAT | GTC | AAC | TTC | AAG | GAC | ATG | GGC | TGG | 96 |
| Arg | Cys | Ser | Arg | Lys | Alá | Leu | His | Val | Asn | Phe | Lys | Asp | Met | Gly | Trp | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| GAC | GAC | TGG | ATC | ATC | GCA | CCC | CTT | GAG | TAC | GAG | GCT | TTC | CAC | TGC | GAG | 144 |
| Asp | Asp | Trp | Ile | Ile | Alá | Pro | Leu | Glu | Tyr | Glu | Alá | Phe | His | Cys | Glu | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| GGG | CTG | TGC | GAG | TTC | CCA | TTG | CGC | TCC | CAC | CTG | GAG | CCC | ACG | AAT | CAT | 192 |
| Gly | Leu | Cys | Glu | Phe | Pro | Leu | Arg | Ser | His | Leu | Glu | Pro | Thr | Asn | His | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| GCA | GTC | ATC | CAG | ACC | CTG | ATG | AAC | TCC | ATG | GAC | CCC | GAG | TCC | ACA | CCA | 240 |
| Alá | Val | Ile | Gin | Thr | Leu | Met | Asn | Ser | Met | Asp | Pro | Glu | Ser | Thr | Pro | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| CCC | ACC | TGC | TGT | GTG | CCC | ACG | CGA | CTG | AGT | CCC | ATC | AGC | ATC | CTC | TTC | 288 |
| Pro | Thr | Cys | Cys | Val | Pro | Thr | Arg | Leu | Ser | Pro | Ile | Ser | Ile | Leu | Phe | |
| 85 | 90 | 95 |
HU 225 424 Β1
| ATT Ile | GAC Asp | TCT Ser | GCC AAC AAC | GTG Val | GTG Val | TAT Tyr 105 | AAG Lys | CAG Gin | TAT Tyr | GAG Glu | GAC Asp 110 | ATG Met | GTC Val | 336 | ||
| Alá Asn 100 | Asn | |||||||||||||||
| GTG | GAG | TCG | TGT | GGC | TGC | AGG | 357 | |||||||||
| Val | Glu | Ser | Cys | Gly | Cys | Arg | ||||||||||
| 115 |
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 27
TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav EREDETI FORRÁS: nem ÉLŐLÉNY: nem TÖRZS: nem
SAJÁTSÁG: az érett típusú MP52 5’-végi PCR-láncindítója A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATAATGCCAC TAGCAACTCG TCAGGGC 27
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 26
TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav EREDETI FORRÁS: nem ÉLŐLÉNY: nem SZÖVET NEVE: nem
SAJÁTSÁG: az érett típusú MP52 3’-végi PCR-láncindítója A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGTCGACTAC CTGCAGCCAC ACGACT 26
Claims (15)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Egy 119 aminosavból álló MP52-proteint tartalmazó készítmény, amely protein szekvenciája megegyezik a szekvencialistában bemutatott 1. azonosító számú szekvenciával, és amely készítmény mentes minden olyan proteintől, melynek szekvenciája az 1. azonosító számú szekvenciától csak egy addicionális N-terminális alaninban vagy egy addicionális N-terminális Met-Ala részletben különbözik.
- 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben a 119 aminosavból álló MP52-protein homodimer proteinként van jelen.
- 3. Gyógyászati készítmény porc- és csontbetegségek kezelésére, amely a 2. igénypont szerinti készítmény terápiásán hatásos mennyiségét, valamint gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
- 4. A 3. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, osteoporosis kezelésére.
- 5. A 3. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, osteoarthritis vagy arthrosteitis kezelésére.40
- 6. A 3. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, csonttörés és csonthiány kezelésére.
- 7. A 3. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, radicularis és alveolaris hiányosság kezelésére.
- 8. Eljárás az 1. igénypont szerinti készítmény 45 előállítására, azzal jellemezve, hogy a protein expresszáltatására alkalmas DNS-szekvenciát tartalmazó plazmiddal transzformált E. coli-sejteket tenyésztünk.
- 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 50 hogy a szekvencialista 1. azonosító számú szekvenciájaként bemutatott aminosavszekvenciát, valamint a szekvencia N-terminális végén egy addicionális metionint kódoló DNS-t tartalmazó plazmiddal transzformáltE. co//-sejteket tenyésztünk.55
- 10. Eljárás a 2. igénypont szerinti készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) előállítunk egy plazmidot, amely az 1. azonosító számú szekvenciaként bemutatott aminosavszekvenciát és annak N-terminális végén egy metionint kódoló60 DNS-t tartalmaz;HU 225 424 Β1 (ii) a plazmidot transzformáció céljából E. coli-sejtekbe juttatjuk;(iii) az E. coli-sejtek tenyésztésével kapott fehérjezárványokat szolubilizáljuk;(iv) a szolubilizált oldatból monomer proteint tiszti- 5 tünk;(v) a monomer protein refoldingjával dimer proteint hozunk létre, és az így kapott dimer proteint tisztítjuk.
- 11. A 2. igénypont szerinti készítmény alkalmazása 10 porc- és csontbetegségek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
- 12. A 11. igénypont szerinti alkalmazás, osteoporosis kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
- 13. A 11. igénypont szerinti alkalmazás, osteoarthritis vagy arthrosteitis kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
- 14. A 11. igénypont szerinti alkalmazás, csonttörés vagy csonthiány kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
- 15. A 11. igénypont szerinti alkalmazás, radicularis vagy alveolaris hiányosságok kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9366495 | 1995-04-19 | ||
| JP32240395 | 1995-11-17 | ||
| PCT/JP1996/001062 WO1996033215A1 (en) | 1995-04-19 | 1996-04-19 | Novel protein and process for producing the same |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP9801697A2 HUP9801697A2 (hu) | 1998-10-28 |
| HUP9801697A3 HUP9801697A3 (en) | 2000-06-28 |
| HU225424B1 true HU225424B1 (en) | 2006-11-28 |
Family
ID=26434967
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9801697A HU225424B1 (en) | 1995-04-19 | 1996-04-19 | Modified mp52-protein and process for producing thereof |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7235527B2 (hu) |
| EP (1) | EP0955313B1 (hu) |
| AT (1) | ATE325131T1 (hu) |
| AU (1) | AU704515C (hu) |
| BR (1) | BR9608019A (hu) |
| CA (1) | CA2216741C (hu) |
| DE (2) | DE69636728T4 (hu) |
| DK (1) | DK0955313T3 (hu) |
| EA (1) | EA000582B1 (hu) |
| ES (1) | ES2258774T3 (hu) |
| HU (1) | HU225424B1 (hu) |
| NO (1) | NO321153B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ305472A (hu) |
| OA (1) | OA10528A (hu) |
| PL (1) | PL186518B1 (hu) |
| PT (1) | PT955313E (hu) |
| UA (1) | UA46767C2 (hu) |
| WO (1) | WO1996033215A1 (hu) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070166353A1 (en) * | 1988-04-08 | 2007-07-19 | Stryker Corporation | Osteogenic proteins |
| US6586388B2 (en) | 1988-04-08 | 2003-07-01 | Stryker Corporation | Method of using recombinant osteogenic protein to repair bone or cartilage defects |
| US20080233170A1 (en) * | 1992-02-21 | 2008-09-25 | Stryker Corporation | Osteogenic Proteins |
| ZA9711580B (en) * | 1996-12-25 | 1999-09-23 | Hoechst Marion Roussel Ltd | Process for the production of purified dimeric bone morphogenetic factors. |
| RS49691B (sr) * | 1997-01-30 | 2007-12-31 | Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh., | Liofilizovan preparat ljudskog morfogenetskog faktora mp52 kosti |
| DE69814352T3 (de) † | 1997-02-07 | 2009-08-13 | Stryker Corp., Kalamazoo | Matrixlose osteogene vorrichtungen und implantate und verfahren zu deren verwendung |
| US6727224B1 (en) | 1999-02-01 | 2004-04-27 | Genetics Institute, Llc. | Methods and compositions for healing and repair of articular cartilage |
| KR100775958B1 (ko) | 2005-03-30 | 2007-11-13 | 김정문 | 조직재생 기능을 가지는 비활성 폴리펩티드 및 그 제조방법 |
| WO2006104306A1 (en) * | 2005-03-30 | 2006-10-05 | Jung Moon Kim | Non-activated polypeptides having a function of tissue regeneration and method for preparing the same |
| US20060286144A1 (en) * | 2005-06-17 | 2006-12-21 | Chunlin Yang | Reinforced collagen scaffold |
| DK1948689T3 (da) | 2005-11-18 | 2012-07-23 | Bioph Biotech Entw Pharm Gmbh | Højaktivitetsvækstfaktormutanter |
| EP1880731A1 (en) * | 2006-07-18 | 2008-01-23 | BIOPHARM GESELLSCHAFT ZUR BIOTECHNOLOGISCHEN ENTWICKLUNG VON PHARMAKA mbH | Human growth and differentiation factor GDF-5 |
| AU2007234612B2 (en) | 2006-12-14 | 2013-06-27 | Johnson & Johnson Regenerative Therapeutics, Llc | Protein stabilization formulations |
| US20100047299A1 (en) * | 2007-01-25 | 2010-02-25 | Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh | Use of gdf-5 for the improvement or maintenance of dermal appearance |
| US7678764B2 (en) | 2007-06-29 | 2010-03-16 | Johnson & Johnson Regenerative Therapeutics, Llc | Protein formulations for use at elevated temperatures |
| EP2019117A1 (en) | 2007-07-27 | 2009-01-28 | BIOPHARM GESELLSCHAFT ZUR BIOTECHNOLOGISCHEN ENTWICKLUNG VON PHARMAKA mbH | Optimized purification process of recombinant growth factor protein |
| WO2009020744A1 (en) | 2007-08-07 | 2009-02-12 | Johnson & Johnson Regenerative Therapeutics, Llc | Protein formulations comprising gdf-5 in aqueous acidic solution |
| JP2009106163A (ja) * | 2007-10-26 | 2009-05-21 | Kyushu Univ | 核酸配列、ベクター、形質転換体、製造方法、及び、核酸配列プライマー |
| EP2276458A1 (en) | 2008-04-14 | 2011-01-26 | Advanced Technologies and Regenerative Medicine, LLC | Liquid buffered gdf-5 formulations |
| US11260110B2 (en) | 2009-11-18 | 2022-03-01 | Ptlnv, Llc, Series Four (4) | Nanoparticles for the therapeutic treatment of radiation-induced skin ulcers |
| US9226898B1 (en) * | 2009-11-18 | 2016-01-05 | Richard C. K. Yen | Submicron particles for the treatment of radiation damage in patients |
| AU2011284657B2 (en) | 2010-07-30 | 2013-11-14 | Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh | Drug delivery devices and growth factor formulations for accelerated wound healing |
| US8551525B2 (en) | 2010-12-23 | 2013-10-08 | Biostructures, Llc | Bone graft materials and methods |
| US8455436B2 (en) | 2010-12-28 | 2013-06-04 | Depuy Mitek, Llc | Compositions and methods for treating joints |
| US8524662B2 (en) | 2010-12-28 | 2013-09-03 | Depuy Mitek, Llc | Compositions and methods for treating joints |
| US8398611B2 (en) | 2010-12-28 | 2013-03-19 | Depuy Mitek, Inc. | Compositions and methods for treating joints |
| EP2537538A1 (en) | 2011-06-22 | 2012-12-26 | Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka mbH | Bioresorbable Wound Dressing |
| US8623839B2 (en) | 2011-06-30 | 2014-01-07 | Depuy Mitek, Llc | Compositions and methods for stabilized polysaccharide formulations |
| EP2602264A1 (en) | 2011-12-05 | 2013-06-12 | Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka mbH | GDF-5 mutant for inducing cartilage formation |
| US9682099B2 (en) | 2015-01-20 | 2017-06-20 | DePuy Synthes Products, Inc. | Compositions and methods for treating joints |
| JP7700127B2 (ja) | 2019-12-18 | 2025-06-30 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 疼痛及び軟骨破壊を治療するためのｇｄｆ－５変異体の使用 |
| KR20240064367A (ko) * | 2022-11-04 | 2024-05-13 | 주식회사 대웅제약 | TGF-β3 단백질의 정제방법 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4725234A (en) * | 1985-08-15 | 1988-02-16 | Ethridge Edwin C | Alveolar bone grafting process with controlled surface active ceramics |
| US5079352A (en) * | 1986-08-22 | 1992-01-07 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
| US5354557A (en) * | 1988-04-08 | 1994-10-11 | Stryker Corporation | Osteogenic devices |
| GB8927546D0 (en) * | 1989-12-06 | 1990-02-07 | Ciba Geigy | Process for the production of biologically active tgf-beta |
| US5143829A (en) * | 1990-03-29 | 1992-09-01 | California Biotechnology Inc. | High level expression of basic fibroblast growth factor having a homogeneous n-terminus |
| US5118667A (en) * | 1991-05-03 | 1992-06-02 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Bone growth factors and inhibitors of bone resorption for promoting bone formation |
| US5171579A (en) * | 1991-10-11 | 1992-12-15 | Genetics Institute, Inc. | Formulations of blood clot-polymer matrix for delivery of osteogenic proteins |
| ATE238417T1 (de) | 1991-11-04 | 2003-05-15 | Inst Genetics Llc | Rekombinante knochenmorphogenetische protein heterodimere, zusammensetzungen und verfahren zur verwendung |
| NZ249113A (en) | 1992-02-12 | 1996-07-26 | Bioph Biotech Entw Pharm Gmbh | Recombinant dna encoding tgf-b, its production and pharmaceutical compositions thereof |
| EP0690871A4 (en) | 1993-01-12 | 1999-10-20 | Univ Johns Hopkins Med | GROWTH DIFFERENTIATION FACTOR-5 |
| IL110589A0 (en) * | 1993-08-10 | 1994-11-11 | Bioph Biotech Entw Pharm Gmbh | Growth/differentiation factor of the TGF- beta family |
| US6248554B1 (en) | 1993-11-24 | 2001-06-19 | The Procter & Gamble Company | DNA sequence coding for a BMP receptor |
| US5399677A (en) | 1993-12-07 | 1995-03-21 | Genetics Institute, Inc. | Mutants of bone morphogenetic proteins |
| ATE319823T1 (de) * | 1993-12-07 | 2006-03-15 | Inst Genetics Llc | Bmp-12, bmp-13 und diese enthaltende sehne- induzierende zusammensetzungen |
| US5707962A (en) * | 1994-09-28 | 1998-01-13 | Gensci Regeneration Sciences Inc. | Compositions with enhanced osteogenic potential, method for making the same and therapeutic uses thereof |
-
1996
- 1996-04-19 EP EP96910198A patent/EP0955313B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-19 DE DE69636728T patent/DE69636728T4/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-19 PL PL96322945A patent/PL186518B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-04-19 AT AT96910198T patent/ATE325131T1/de active
- 1996-04-19 AU AU53470/96A patent/AU704515C/en not_active Ceased
- 1996-04-19 PT PT96910198T patent/PT955313E/pt unknown
- 1996-04-19 BR BR9608019-1A patent/BR9608019A/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-04-19 US US08/945,459 patent/US7235527B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-04-19 HU HU9801697A patent/HU225424B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-04-19 NZ NZ305472A patent/NZ305472A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-04-19 WO PCT/JP1996/001062 patent/WO1996033215A1/ja not_active Ceased
- 1996-04-19 CA CA002216741A patent/CA2216741C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-04-19 DK DK96910198T patent/DK0955313T3/da active
- 1996-04-19 ES ES96910198T patent/ES2258774T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-19 EA EA199700329A patent/EA000582B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-04-19 UA UA97115563A patent/UA46767C2/uk unknown
- 1996-04-19 DE DE69636728A patent/DE69636728D1/de not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-10-17 OA OA70112A patent/OA10528A/en unknown
- 1997-10-17 NO NO19974812A patent/NO321153B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-02-12 US US10/365,231 patent/US7268114B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-08-03 US US11/833,653 patent/US7816103B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU225424B1 (en) | Modified mp52-protein and process for producing thereof | |
| US7638129B2 (en) | Monomer protein with bone morphogenetic activity and medicinal agent containing the same for preventing and treating diseases of cartilage and bone | |
| KR101772449B1 (ko) | 신규한 펩타이드 | |
| KR100458413B1 (ko) | 연골·뼈유도성수복용재료 | |
| CN1951964B (zh) | 长链型重组人骨形态发生蛋白-2及其制备方法和应用 | |
| CA2224289A1 (en) | New protein hmw human mp52s | |
| AP856A (en) | A novel homodimer protein used in pharmaceutical preparation for treating cartlage and bone diseases. | |
| KR100490817B1 (ko) | 119아미노산으로구성된mp52유래의단백질및그제법 | |
| JP2997549B2 (ja) | 新規なタンパク質およびその製法 | |
| JP3527760B2 (ja) | 新規骨形成誘導蛋白質、それをコードするｄｎａ及び該蛋白質の製造方法並びにそれを有効成分とする骨形成誘導剤 | |
| MXPA97008011A (en) | New protein and process for your preparation | |
| JPWO1996033215A1 (ja) | 新規なタンパク質およびその製法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |