[go: up one dir, main page]

UA127917C2 - Рекомбінантна клітина brassica napus, яка містить довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти, трансгенна рослина та насіння brassica napus, спосіб отримання екстрагованого ліпіду рослин, харчового продукту та етилового ефіру поліненасичених жирних кислот - Google Patents

Рекомбінантна клітина brassica napus, яка містить довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти, трансгенна рослина та насіння brassica napus, спосіб отримання екстрагованого ліпіду рослин, харчового продукту та етилового ефіру поліненасичених жирних кислот Download PDF

Info

Publication number
UA127917C2
UA127917C2 UAA201803576A UAA201803576A UA127917C2 UA 127917 C2 UA127917 C2 UA 127917C2 UA A201803576 A UAA201803576 A UA A201803576A UA A201803576 A UAA201803576 A UA A201803576A UA 127917 C2 UA127917 C2 UA 127917C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
desaturase
fatty acids
less
lipid
acid
Prior art date
Application number
UAA201803576A
Other languages
English (en)
Inventor
Джеймс Робертсон Петрі
Джэймс Робертсон Пэтри
Суріндер Пал Сінгх
Суриндэр Пал Сингх
Фейтер Роберт Чарльз Де
Фэйтэр Роберт Чарльз дэ
Original Assignee
Коммонвелт Сайнтіфік Енд Індастріел Рісерч Організейшн
Коммонвэлт Сайнтифик Энд Индастриел Рисерч Организэйшн
Грейнз Рісерч Енд Дівелопмент Корпорейшн
Грэйнз Рисерч Энд Дивелопмент Корпорэйшн
Нусід Нутрішинел Остреліа Пті Лтд
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49756497&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA127917(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Коммонвелт Сайнтіфік Енд Індастріел Рісерч Організейшн, Коммонвэлт Сайнтифик Энд Индастриел Рисерч Организэйшн, Грейнз Рісерч Енд Дівелопмент Корпорейшн, Грэйнз Рисерч Энд Дивелопмент Корпорэйшн, Нусід Нутрішинел Остреліа Пті Лтд filed Critical Коммонвелт Сайнтіфік Енд Індастріел Рісерч Організейшн
Publication of UA127917C2 publication Critical patent/UA127917C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/10—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/23—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms
    • A61K31/232—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms having three or more double bonds, e.g. etretinate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/10—Processes for modifying non-agronomic quality output traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • A01H1/101—Processes for modifying non-agronomic quality output traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine or caffeine
    • A01H1/104—Processes for modifying non-agronomic quality output traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine or caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/20—Brassicaceae, e.g. canola, broccoli or rucola
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A23L33/12—Fatty acids or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/23—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms
    • A61K31/231—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms having one or two double bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/31—Brassicaceae or Cruciferae (Mustard family), e.g. broccoli, cabbage or kohlrabi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/08—Antiseborrheics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/06—Antiarrhythmics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C57/00—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C57/02—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms with only carbon-to-carbon double bonds as unsaturation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C57/00—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C57/02—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms with only carbon-to-carbon double bonds as unsaturation
    • C07C57/03—Monocarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/02—Preparation of carboxylic acid esters by interreacting ester groups, i.e. transesterification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C1/00—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids
    • C11C1/002—Sources of fatty acids, e.g. natural glycerides, characterised by the nature, the quantities or the distribution of said acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C11C3/003—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fatty acids with alcohols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C11C3/04—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fats or fatty oils
    • C11C3/06—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fats or fatty oils with glycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01075—Long-chain-alcohol O-fatty-acyltransferase (2.3.1.75)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/158—Fatty acids; Fats; Products containing oils or fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/35—Extraction with lipophilic solvents, e.g. Hexane or petrol ether

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

Винахід стосується рекомбінантної клітини Brassica napus, яка містить екзогенні полінуклеотиди, які кодують Δ12-десатуразу, ω3-десатуразу або Δ15-десатуразу, Δ6-десатуразу, Δ5-десатуразу, Δ4-десатуразу, Δ6-елонгазу і Δ5-елонгазу, трансгенної рослини Brassica napus, трансгенного насіння трансгенної рослини Brassica napus, способу отримання та очищення екстрагованого ліпіду рослин, макухи отриманої з насіння, способу отримання харчового продукту та етилового ефіру поліненасичених жирних кислот.

Description

(56) Перелік документів, взятих до уваги експертизою:
Смопаї УУи, Майіп Тгикза, Мадатапі Оайа єї а!. Зтержівзе епдіпеегіпд ю ргодисе підп уієЇїд5 ої мегу Ююпд-спаїіп роїууипзайштгагеа Тацу асіаз іп ріапів. Маї. Віоїтеснпої. 2005. мої. 23.
Мо. 8. Р. 1013 - 1017 ОВІ: пере: /дої.ого/10.1038/пр11107 (дата звернення 03.10.2023)
Вобегїї Зіапієу 5. еї а. Ізоїайоп апа спагасіегізайноп ої а А5-Тацу асіа еіопдазе їМот Ше тагіпе тістоаІда Раміома заїїпа.
Магіпе ріотеснпоїоду. 2009. Мо. 11. Р. 410- 418 ОВ: нерв //дої.ого/10.1007/510126-008- 9157-у (дата звернення 03.10.2023)
АусКерозсі Еїпе еї аі. Містоаідає аз ап акегпаїйме 5ошгсе ої отеда-З Іопд спаїп роїзуипзайшгтгагїеа Гацу асіав. ІП іріа Тесппоіоду. 2012. Мої. 24. Мо. 6. Р. 128-130 ОВІ: пере: //дої.ого/10.1002/йе.201200197 (дата звернення 03.10.2023)
Аці2-І оре? Моеті ег а). Еппапсіпд Ше асситшиіайоп ої отеда-3 Іопд снаїп роїзуипзаштгагеа Гацу асіаз іп ігапздепіс
Агарідорзіз (Найіїапа міа Кегайме теїароїїс епдіпеегіпд апа депеїйс сгов5віпд. Тгапздепіс
Вев. 2012. Мої. 21. Мо. 6. Р. 1233-1243 ВІ:
Нерз://дої.ого/10.1007/511248-012-9596-0 (дата звернення 03.10.2023)
Реггіє у. В. еї а). Наріа ехргевзвіоп ої їгапздепез агмеп Бу зеєа-гересійс сопвігисів іп Ієай їіззие: ОНА ргодисійоп. Ріапі Меїпоав. 2010. Мої. 6. Мо. 8. Р. 1-6 ОВІ: пере: /дої.ого/10.1186/1746-4811-6-8 (дата звернення 03.10.2023)
Оп г егаї. Епісіепі ІпКіпу апа «(гапвтег ої тийПіріє депез Бу а тийідепе аззетбріу апа ігапеіогтаїйоп месіог зузіет. Ргосеєдіпдв ої
Ше Маїйопаї Асадету ої бсієпсевз. 2003. Мої. 100. Мо. 10. Р. 5962-6 (54) РЕКОМБІНАНТНА КЛІТИНА ВАеАБ5БІСА МАРИ5, ЯКА МІСТИТЬ ДОВГОЛАНЦЮГОВІ
ПОЛІНЕНАСИЧЕНІ ЖИРНІ КИСЛОТИ, ТРАНСГЕННА РОСЛИНА ТА НАСІННЯ ВАА5Б5БІСА МАРИиЗ5,
СПОСІБ ОТРИМАННЯ ЕКСТРАГОВАНОГО ЛІПІДУ РОСЛИН, ХАРЧОВОГО ПРОДУКТУ ТА ЕТИЛОВОГО
ЕФІРУ ПОЛІНЕНАСИЧЕНИХ ЖИРНИХ КИСЛОТ
(57) Реферат:
Винахід стосується рекомбінантної клітини Вгазвзіса опарив, яка містить екзогенні полінуклеотиди, які кодують Д12-десатуразу, 03-десатуразу або Д15-десатуразу, Дб- десатуразу, Д5-десатуразу, ДЛ4-десатуразу, Дб-елонгазу і Д5-елонгазу, трансгенної рослини
Вгаззіса париз, трансгенного насіння трансгенної рослини Вгазвзіса пари, способу отримання та очищення екстрагованого ліпіду рослин, макухи отриманої з насіння, способу отримання харчового продукту та етилового ефіру поліненасичених жирних кислот.
ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ
Цей винахід належить до способів синтезу довголанцюгових поліненасичених жирних кислот, особливо докозагексаєнової кислоти, в рекомбінантних рослинних клітинах.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Довголанцюгові омега-3 поліненасичені жирні кислоти (ДЛ-ПНЖК) на сьогоднішній день широко визнані як важливі сполуки для здоров'я людини і тварин. Вказані жирні кислоти можуть бути одержані з харчових джерелом або шляхом перетворення лінолевої (ЛК, 18:206) або с- ліноленової (АЛК, 18:3003) жирних кислот, обидві з яких розглядаються як незамінні жирні кислоти в раціоні людини. Хоча людина і багато інших хребетних тварин можуть перетворювати
ЛК або АЛК, одержані з рослинних джерел, на С22, вони здійснюють таке перетворення з дуже низькою швидкістю. Крім того, більшості сучасних суспільств властиве незбалансоване харчування, в якому щонайменше 90 95 поліненасичених жирних кислот (ПНЖК) складають об жирні кислоти, замість співвідношення 4:1 або менше для Фб:03 жирних кислот, яке вважається ідеальним (Тгацїмеїй, 2001). Безпосереднім харчовим джерелом ДЛ-ПНЖК, наприклад, ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК, 20:53) і докозагексаєнової кислоти (ДГК, 22:603) для людини, в основному, є риба або риб'ячий жир. Таким чином, медичні працівники рекомендують регулярно включати рибу до раціону людини, що містить значні рівні ДЛ-ПНЖК. Все частіше ДЛ-
ПНЖК, одержані з риб'ячого жиру, вводять, наприклад, в харчові продукти і дитяче харчування.
Однак за рахунок зменшення глобального і національного вилову риби, необхідні альтернативні джерела вказаних жирів, що проявляють позитивний вплив на здоров'я.
Квіткові рослини, на противагу тваринам, не володіють здатністю синтезувати поліненасичені жирні кислоти з довжиною ланцюга більше 18 атомів вуглецю. Зокрема, культивовані і садові рослини разом з іншими покритонасінними не мають ферментів, необхідних для синтезу 03 жирних кислот з довшим ланцюгом, наприклад, ЕПК, докозапентаєнової кислоти (ДПК, 22:53) і ДГК, одержаних з АЛК. Важливою метою в біотехнології рослин, таким чином, є створення культивованих рослин, що продукують значні кількості ДЛ-ПНЖК, таким чином забезпечуючи альтернативне джерело цих сполук.
Шляхи біосинтезу ДЛА-ПНЖК
Біосинтез ДЛ-ПНЖК в організмах, таких як мікроводорості, мохи і гриби, звичайно
Зо відбувається як серія реакцій кисень-залежної десатурації і елонгації (Фіг. 1). Найпоширеніший шлях одержання ЕПК у вказаних організмах включає АДб-десатурацію, Дб-елонгацію і Д5Ь- десатурацію (має назву шляху Лб-десатурації), тоді як в менш поширеному шляху використовується ЛОУ-елонгація, ДЛ8-десатурація і Д5-десатурація (має назву шляху Дое- десатурації). Вказані послідовні реакції десатурації і елонгації можуть починатися із субстрату б жирної кислоти ЛК, схематично проілюстрованого у верхній лівій частині Фіг. 1 (06) або субстрату 03 АЛК до ЕПК, проілюстрованого на нижній правій частині Фіг. 1 (03). Якщо початкова Дб-десатурація здійснюється на субстраті 06 ЛК, продукт серії із трьох ферментів
ДЛ-ПНЖК буде 06 жирною арахідоновою кислотою (АРК). Організми, які синтезують ДЛ-ПНЖК, можуть перетворювати 06 жирні кислоти на 03 жирні кислоти з використанням о3-десатурази, що проілюстровано як стадія А17-десатурази на Фіг. 1, для перетворення арахідонової кислоти (АРК, 20:406) на ЕПК. Деякі члени родини о3-десатурази можуть впливати на різні субстрати, що варіюють від ЛК до АРК. Рослинні 0З3-десатурази часто специфічно каталізують А15- десатурацію ЛК до АЛК, тоді як грибкові і дріжджові 3-десатурази можуть бути специфічними по відношенню до А17-десатурації АРК до ЕПК (Регеїга еї аї., 2004а; 7апк еї аї., 2005). Деякі звіти наводять на думку про те, що можуть існувати неспецифічні Ф3-десатурази, які можуть перетворювати широкий спектр об субстратів на відповідні 3 продукти (2Ппапо еї аї!., 2008).
Перетворення ЕПК на ДГК в таких організмах відбувається шляхом Д5-елонгації ЕПК з утворенням ДПК, після чого слідує Д4-десатурація з утворенням ДГК (Фіг. 1). І навпаки, ссавці використовують так званий шлях "Шпрехера", в якому ДПК перетворюється на ДГК в ході трьох окремих реакцій, незалежних від Д4-десатурази (Зргеспег еї аї., 1995).
Егопі-епа десатурази, загалом знайдені в рослинах, мохах, мікроводоростях і нижчих тваринах, наприклад, Саепогппабраїйїіх еієдап5, в основному приймають субстрати жирних кислот, естерифікованих в положенні 5п-2 фосфатидилхолінового (ФХ) субстрату. Вказані десатурази, таким чином, відомі як ацил-ФХ, зв'язані з ліпідом, їтопі-епа десатурази (Ботегопе еї аї., 2003). І навпаки, їгопі-епіа десатурази вищих тварин загалом приймають субстрати ацил-КоА, де жирнокислотний субстрат зв'язаний з КоА замість ФХ (Юотегопе еї аї., 2005). Відомо, що деякі десатурази мікроводоростей і одна рослинна десатураза використовують жирнокислотні субстрати, естерифіковані до КоА (Табл. 2).
Кожна реакція елонгації ПНЖК складається з чотирьох стадій, що каталізуються 60 багатокомпонентним білковим комплексом: спочатку, реакція конденсації приводить до додавання модуля 2С з малоніл-КоОА до жирної кислоти, результатом чого є утворення рД- кетоацильної проміжної сполуки. Далі вона відновлюється НАДФ-Н, з подальшою дегідратацією і утворенням єноїльної проміжної сполуки. Вкінці ця проміжна сполука повторно відновлюється з утворенням подовженої жирної кислоти. Загалом, вважається, що стадія конденсації в числі вказаних чотирьох реакцій є специфічною для субстрату, а інші стадії - ні. На практиці це означає, що природний апарат елонгації рослини здатний до елонгації ПНЖК, за умови, що введений конденсаційний фермент (звичайно під назвою "елонгаза"), специфічний по відношенню до ПНЖК, хоча ефективність природного апарату елонгації рослини з точки зору елонгації неприродних субстратів ПНЖК може бути низькою. У 2007 році була опублікована інформація щодо ідентифікації та опису циклу елонгації дегідратази дріжджів (Оепіс апа
М/еів5тап, 2007).
Десатурація ПНЖК в рослинах, мохах і мікроводоростях природним чином відбувається на жирнокислотних субстратах, в основному, в пулі ацил-ФХ, тоді як елонгація відбувається на субстратах в пулі ацил-КоА. Перенесення жирних кислот від молекул ацил-ФХ до носія КоА здійснюється фосфоліпазами (ФЛА), тоді як перенесення жирних кислот ацил-КоА до носія ФХ здійснюється лізофосфатидил-холін ацилтрансферазами (ЛФХАТ) (Фіг. 21) (5іпдн еї а!., 2005).
Сконструйоване продукування ДЛ-ПНЖК
Велика частина метаболічного конструювання ДЛ-ПНЖК здійснювалася з використанням аеробного шляху Дб-десатурація/елонгація. Про біосинтез у-ліноленової кислоти (ГЛК, 18:306) в тютюні з використанням Аб-десатурази із ціанобактерії Зупеспосувзіїз вперше повідомлялося в 1996 році (Кедау апа Тротавх, 1996). Пізніше ГЛК була одержана в культивованих рослинах, таких як сафлор (73 9о ГЛК в олії з насіння; Кпашї еї аї!., 2006) і соя (28 95 ГлЛК; зай еї аї., 2004).
Продукування ДЛ-ПНЖК, наприклад, ЕПК і ДГК, включає складніше конструювання за рахунок збільшення кількості залучених стадій десатурації та елонгації. Про продукування ЕПК в наземній рослині вперше повідомлялося 0О) еї аї. (2004), які ввели гени, що кодують Д9У-елонгазу з Ізоспгузіз даІрапа, Ав-десатуразу з Еидієпа дгасіїє і Дб-десатуразу з МопіегеїПа аїріпа в
Агарідорзіє з одержанням до З 96 ЕПК. Ця робота була продовжена Абраді еї аї. (2004), які повідомляли про продукування до 0,8 95 ЕПК в насінні льону з використанням генів, що кодують дб-десатуразу і Дб-елонгазу з РпузсоптійїгеїПа раїепз і Д5-десатуразу з Рпаєодасіу шт кісотишт.
Зо Перший звіт про одержання ДДЛ-ДГК, і на сьогоднішній день найвищих зареєстрованих рівнів ПНЖК з дуже довгим ланцюгом, міститься у УМО 04/017467, в якій розкрито продукування
З 956 ДГК у зародках сої, але не насінні, шляхом введення генів, що кодують Аб-десатуразу заргоїєдпіа даісіїпа, АДб-десатуразу МогіегеПйа аїріпа, А5-десатуразу МогііегейМйа аїріпа, да- десатуразу заргоЇІедпіа адісіїпа, Д17-десатуразу ЗаргоїІедпіа адісіїпа, Аб-елонгазу МогііегеПа аїріпа та А5-елонгазу Раміома ІшПегі. Максимальний рівень ЕПК в ембріонах, які також продукують
ДГК, становив 19, 95, вказуючи на низьку ефективність перетворення ЕПК на ДГК (МО 2004/071467). Це відкриття було подобнім до опублікованого Кобегі еї аї. (2005), де вихід перетворення ЕПК на ДГК був низьким, з продукуванням З 95 ЕПК і 0,5 95 ДГК в Агабідаорвів з використанням А5Б/б-десатурази БВапіо гегіо, Дб-елонгази Саепогпарай5 еІедапз та А5-елонгази і
Дд4-десатурази Раміома заїїпа. Крім того, в 2005 році Ми еї аІ. опублікували повідомлення щодо продукування 25 95 АРК, 15 95 ЕПК і 1,5 95 ДГК у Вгазвзіса |ипсеа з використанням лЛб-десатурази
РуїШішт ітедиіаге, Д5-десатурази ТПгаивіоспуїгій, Дб-елонгази РПузсотійгеПйа раїеп5, А12- десатурази Саїепаціа ойісіпаїйє, Д5-елонгази ТПгаизіоспуїгіа, А17-десатурази Рпуорпїпога іптебїап5, елонгази ДЦ-ПНЖК Опсогпупсиз5 тпукКкіб5, А4-десатурази ТПгаивіоспуїйій і ЛФХАТ
Тигаивіоспуїгій (УМи еї а, 2005). Короткий опис зусиль з одержання врожаю насіння олійних культур, яке синтезує Ф3 ДЛ-ПНЖК, наведений у Мепедаз-Саїегоп еї а. (2010) ії Киї2-І оре? еї аї. (2012). Як вказано Еці-І оре; еї аї. (2012), на дату публікації результати з одержання ДГК у трансгенних рослинах навіть віддалено не нагадують рівнів, що спостерігаються в риб'ячому жирі.
Таким чином, залишається потреба в ефективнішому продукуванні ДЛ-ПНЖК в рекомбінантних клітинах, зокрема ДГК в насінні рослин олійних культур.
СУТЬ ВИНАХОДУ
Авторами цього винаходу ідентифіковані способи і рослини для одержання ліпіду з високими рівнями ДГК.
У першому аспекті цього винаходу розкривається екстрагований рослинний ліпід, що містить жирні кислоти в естерифікованій формі, причому жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають о-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), та необов'язково одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти бо (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) та ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), при тому, що рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить приблизно 7-20
Фо.
У варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід має одну або більше, або всі наступні ознаки: ї) рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 2 95 до 18 95, від приблизно 2 95 до 16 95 або від приблизно 2 95 до 15
Фо, і) рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 6 95, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2 до або менше, ніж приблизно 1 95, ії) рівень олеїнової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 1 95 до приблизно 30 95, від приблизно З 956 до приблизно 30 95, від приблизно б 956 до приблизно 30 95, від 1 95 до приблизно 20 95, від приблизно 30 95 до приблизно 60 95, від приблизно 45 95 до приблизно 60 95 або становить приблизно 30 905, їм) рівень лінолевої кислоти (ЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 35 95, від приблизно 4 95 до приблизно 20 95 або від приблизно 4 95 до 17 95, м) рівень о-ліноленової кислоти (АЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 40 95, від приблизно 7 95 до приблизно 40 95, від приблизно 10 95 до приблизно 35 95, від приблизно 20 95 до приблизно 35 95, від приблизно 4
Фо до приблизно 16 95 або від приблизно 2 95 до приблизно 16 95, мі) рівень у-ліноленової кислоти (ГЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2 до, менше, ніж приблизно 1 95, менше, ніж приблизно 0,5 95, від 0,05 95 до приблизно 7 95, від 0,05 95 до приблизно 4 95, від 0,05 95 до приблизно З 95 або від 0,05 95 до приблизно 2 95, мії) рівень стеаридонової кислоти (СДК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 7 95, менше, ніж приблизно 6 95, менше, ніж приблизно 4 до, менше, ніж приблизно З 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 7 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 6 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 4 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно З
Зо Фо, або від 0,05 95 до приблизно 2 905, мії) рівень ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 6 95, менше, ніж приблизно 5 95, менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно 1 95, менше, ніж приблизно 0,5 95, від приблизно 0,05
Фо до приблизно б 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 5 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 4 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно З 95 або від приблизно 0,05 95 до приблизно 2 90, їх) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТРрК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно 2 95, менше, ніж приблизно 1
Фо, від приблизно 0,05 95 до приблизно 4 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно З 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 2 95 або від приблизно 0,05 95 до приблизно 1 95, х) рівень ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2 95, від приблизно 0,05 96 до приблизно 10 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 5 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно З 95 або від приблизно 0,05 95 до приблизно 2 об, хі) рівень докозапентаєнової кислоти (ДПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 8 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 5 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно З 95 або від приблизно 0,05 95 до приблизно 2 905, хії) рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить приблизно 8 95, приблизно 9 95, приблизно 10 95, приблизно 11 95, приблизно 12 95, приблизно 13 95, приблизно 14 95, приблизно 15 95, приблизно 16 95, приблизно 17 95, приблизно 18 95, від приблизно 8 95 до 20 95, від приблизно 10 95 до 20 95, від приблизно 11 95 до 20 95, від приблизно 10 95 до приблизно 16 95 або від приблизно 14 95 до 20 905, хії) ліпід містить юб-докозапентаєнову кислоту (22:525710и1316) серед жирних кислот, що містяться в ньому, хім) ліпід по суті не містить 0б-докозапентаєновой кислоти (22:54710и13153 серед жирних кислот, що містяться в ньому, хм) ліпід по суті не містить СДК, ЕПК і ЕТК серед жирних кислот, що містяться в ньому,
Хмі) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 25 95, від приблизно 4 95 до приблизно 20 95, від приблизно 6 95 до приблизно 20 95, від приблизно 4 95 до приблизно 60 95, від приблизно 30 95 до приблизно 60 95 або від приблизно 45 95 до приблизно 60 95, хмії) рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 35 95, від приблизно 8 95 до приблизно 25 95 або від 8 95 до приблизно 22 965, хмії) рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 20 95 до приблизно 75 95, від приблизно 50 95 до приблизно 75 95 або від приблизно 60 95 до приблизно 75 95, хіх) рівень загальних 0б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 35 95 до приблизно 50 95, від приблизно 20 95 до приблизно 35
Фо, від приблизно 6 95 до 20 95, менше, ніж приблизно 20 95, менше, ніж приблизно 16 95, менше, ніж приблизно 10 95, від приблизно 1 95 до приблизно 16 95, від приблизно 2 95 до приблизно 10
Фо або від приблизно 4 95 до приблизно 10 95, хх) рівень нових б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 10 95, менше, ніж приблизно 8 95, менше, ніж приблизно 6 905, менше, ніж 4 95, від приблизно 1 95 до приблизно 20 95, від приблизно 1 95 до приблизно 10 95, від приблизно 0,5 95 до приблизно 8 95 або від приблизно 0,5 до 4 905, ххі) рівень загальних 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 36 95 до приблизно 65 95, від приблизно 40 95 до приблизно 60 95, від приблизно 20 95 до приблизно 35 95, від приблизно 10 95 до приблизно 20 95, приблизно 25 95, приблизно 30 95, приблизно 35 95 або приблизно 40 95, ххії) рівень нових 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 9 95 до приблизно 33 95, від приблизно 10 95 до приблизно 20 95, від приблизно 20 95 до приблизно 30 95, від приблизно 12 95 до приблизно 25 95, приблизно 13 95, приблизно 15 95, приблизно 17 95 або приблизно 20 95, ххії) співвідношення загальних 0б жирних кислот : загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 1,0 до приблизно 3,0, від
Зо приблизно 0,1 до приблизно 1, від приблизно 0,1 до приблизно 0,5, менше, ніж приблизно 0,50, менше, ніж приблизно 0,40, менше, ніж приблизно 0,30, менше, ніж приблизно 0,20, менше, ніж приблизно 0,15, приблизно 1,0, приблизно 0,1 або приблизно 0,2, ххім) співвідношення нових 0б жирних кислот : нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 1,0 до приблизно 3,0, від приблизно 0,1 до приблизно 1, від приблизно 0,1 до приблизно 0,5, менше, ніж приблизно 0,50, менше, ніж приблизно 0,40, менше, ніж приблизно 0,30, менше, ніж приблизно 0,20, менше, ніж приблизно 0,15, приблизно 0,1, приблизно 0,2 або приблизно 1,0, ххм) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ЛК під дією Д12-десатурази щонайменше приблизно 60 95, щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 80 95, від приблизно 60 95 до приблизно 98 95, від приблизно 70 95 до приблизно 95 95 або від приблизно 75 95 до приблизно 90 965, ххмі) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на СДК під дією Дб-десатурази щонайменше приблизно 30 95, щонайменше приблизно 40 95, щонайменше приблизно 50 95, щонайменше приблизно 60 95, щонайменше приблизно 70 95, від приблизно 30
Фо до приблизно 70 95, від приблизно 35 96 до приблизно 60 95 або від приблизно 50 95 до приблизно 70 905, ххмії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення СДК на кислоту
ЕТК під дією Дб-елонгази щонайменше приблизно 60 95, щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 75 95, від приблизно 60 95 до приблизно 95 95, від приблизно 70 95 до
БО приблизно 88 95 або від приблизно 75 95 до приблизно 85 965, ххміїї) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЕТК на ЕПК під дією Д5-десатурази щонайменше приблизно 60 95, щонайменше приблизно 70 9565, щонайменше приблизно 75 95, від приблизно 60 95 до приблизно 99 95, від приблизно 70 95 до приблизно 99 95 або від приблизно 75 95 до приблизно 98 95, ххіх) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЕПК на ДПК під дією Д5-елонгази щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 85 95, щонайменше приблизно 90 95, від приблизно 50 95 до приблизно 95 95 або від приблизно 85 95 до приблизно 95 об, ххх) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ДПК на ДГК під бо дією Д4-десатурази щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 90 95, щонайменше приблизно 93 95, від приблизно 50 95 до приблизно 95 95, від приблизно 80 95 до приблизно 95 905 або від приблизно 85 95 до приблизно 95 95, хххі) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК щонайменше приблизно 10 95, щонайменше приблизно 15 95, щонайменше приблизно 20 95, від приблизно 10 95 до приблизно 50 95, від приблизно 10 95 до приблизно 30 95 або від приблизно 10 95 до приблизно 25 9б5, хххії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЛК на ДГК щонайменше приблизно 15 96, щонайменше приблизно 20 9565, щонайменше приблизно 22 95, щонайменше приблизно 25 95, від приблизно 15 95 до приблизно 50 95, від приблизно 20 95 до приблизно 40 95 або від приблизно 20 95 до приблизно 30 965, хххіїї) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на ДГК щонайменше приблизно 17 95, щонайменше приблизно 22 95, щонайменше приблизно 24 95, від приблизно 17 95 до приблизно 55 95, від приблизно 22 95 до приблизно 35 95 або від приблизно 24 95 до приблизно 35 905, хххім) загальні жирні кислоти в екстрагованому ліпіді містять менше, ніж 1 96 02071, хххм) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 90 95, щонайменше 95 95, від приблизно 70 95 до приблизно 99 95 або від приблизно 90 95 до приблизно 99 95, хххмії) ліпід містить діацилгліцерол (ДАГ), ххумії) ліпід містить менше, ніж приблизно 10 95, менш ніж приблизно 5 95, менше, ніж приблизно 1 95 або від приблизно 0,001 95 до приблизно 5 95 вільних (неестерифікованих) жирних кислот та/або фосфоліпіду, або по суті не містить їх, хххмії) щонайменше 70 95 або щонайменше 80 95 естерифікованої ДГК у формі ТАГ знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ, хххіх) в ліпіді найпоширенішими видами ТАГ, що містять ДГК, є ДГК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12), і
ХІ) ліпід містить три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18).
В іншому варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід знаходиться у формі олії, причому ліпід становить щонайменше приблизно 90 95, або щонайменше приблизно 95 95, щонайменше приблизно 98 95 або від приблизно 95 95 до приблизно 98 мас. 95 олії.
Зо У переважному варіанті реалізації винаходу ліпід або олія, переважно олія з насіння, має наступні ознаки: у загальному вмісті жирних кислот ліпіду або олії рівень ДГК становить від приблизно 7 95 до 20 95, рівень пальмітинової кислоти становить від приблизно 2 95 до приблизно 16 95, рівень міристинової кислоти становить менше, ніж приблизно б 95, рівень олеїнової кислоти становить від приблизно 1 95 до приблизно 30 95, рівень ЛК становить від приблизно 4 95 до приблизно 35 95, АЛК присутня, ГЛК присутня, рівень СДК становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 7 95, рівень ЕТК становить менше, ніж приблизно 4 95, рівень
ЕПК становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 10 95, рівень ДПК становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 8 95, рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 25 95, рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 35 95, рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 20 95 до приблизно 75 95, співвідношення загальних 0б жирних кислот : загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,05 до приблизно 3,0, співвідношення нових 0б жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,03 до приблизно 3,0, переважно менше, ніж приблизно 0,50, склад жирних кислот ліпіду базується на: ефективності перетворення олеїнової кислоти на ЛК під дією Д12-десатурази щонайменше приблизно 60 95, ефективності перетворення СДК на кислоту ЕТК під дією Дб-елонгази щонайменше приблизно 60 95, ефективності перетворення ЕПК на ДПК під дією Д5-елонгази від приблизно 50 95 до приблизно 95 95, ефективності перетворення ДПК на ДГК під дією Д4-десатурази від приблизно 50 95 до приблизно 95 95, ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК щонайменше приблизно 10 95, і вміст триацилгліцеролу (ТАГ), в ліпіді становить щонайменше приблизно 70
Фо, і необов'язково ліпід по суті не містить холестерину та/або ліпід містить три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18).
У більш переважному варіанті реалізації винаходу ліпід або олія, переважно олія з насіння, має наступні ознаки: у загальному вмісті жирних кислот ліпіду рівень ДГК становить від приблизно 7 до 20 95, рівень пальмітинової кислоти становить від приблизно 2 95 до приблизно 16 95, рівень міристинової кислоти становить менше, ніж приблизно 2 95, рівень олеїнової 60 кислоти становить від приблизно 1 95 до приблизно 30 95, рівень ЛК становить від приблизно 4
Фо до приблизно 35 95, рівень АЛК становить від приблизно 7 95 до приблизно 40 95, рівень ГЛК становить менше, ніж приблизно 4 95, рівень СДК становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 7 У, рівень ЕТК становить менше, ніж приблизно 4 95, рівень ЕТрК становить від приблизно 0,05
Фо до приблизно 4 95, рівень ЕПК становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 10 95, рівень
ДПК становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 8 95, рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 25 95, рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 35 95, рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 20 95 до приблизно 75 95, рівень нових 0б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,5 95 до приблизно 10 95, рівень загальних 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 36 95 до приблизно 75 95, рівень нових 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 9 95 до приблизно 33 95, співвідношення загальних Фб жирних кислот: загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,05 до приблизно 3,0, співвідношення нових 0б жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,03 до приблизно 3,0, склад жирних кислот ліпіду базується на: ефективності перетворення олеїнової кислоти на ЛК під дією А12-десатурази щонайменше приблизно 60 95, ефективності перетворення СДК на кислоту ЕТК під дією АДб-елонгази щонайменше приблизно 60 95, ефективності перетворення ЕТК на ЕПК під дією А5-десатурази щонайменше приблизно 60 95, ефективності перетворення ЕПК на ДПК під дією Д5-елонгази від приблизно 50 95 до приблизно 95 95, ефективності перетворення ДПК на ДГК під дією Д4- десатурази від приблизно 50 95 до приблизно 95 95, ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК щонайменше приблизно 10 95, ефективності перетворення ЛК на ДГК щонайменше приблизно 15 95, ефективності перетворення АЛК на ДГК щонайменше приблизно 17 95, і у вмісті загальних жирних кислот в екстрагованому ліпіді С20:ІЇ становить менше, ніж 1 905, вміст триацилгліцеролу (ТАГ), в ліпіді становить щонайменше приблизно 70 95, ліпід по суті не містить холестерину, і ліпід містить три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18). Переважно ліпід або олія є
Зо канолаолією каноли та/"або не оброблений за методом переестерифікації після екстракції з рослини або частини рослини. У конкретному варіанті реалізації винаходу ліпід або олія каноли в подальшому можуть бути оброблені, з метою перетворення жирних кислот в олії на алкілові ефіри, наприклад, метилові або етилові ефіри. Додаткова обробка може застосовуватися для збагачення ліпіду або олії ДГК.
У варіанті реалізації винаходу ліпід або олія, переважно олія з насіння, має наступні ознаки: у загальному вмісті жирних кислот ліпіду рівень ДГК становить від приблизно 7 до 20 95, рівень пальмітинової кислоти становить від приблизно 2 95 до приблизно 16 95, рівень міристинової кислоти становить менше, ніж приблизно 2 95, рівень олеїнової кислоти становить від приблизно 30 95 до приблизно 60 95, переважно від приблизно 45 95 до приблизно 60 95, рівень
ЛК становить від приблизно 4 95 до приблизно 20 95, рівень АЛК становить від приблизно 2 95 до приблизно 16 95, рівень ГЛК становить менше, ніж приблизно З 95, рівень СДК становить менше, ніж приблизно З 95, рівень ЕТК становить менше, ніж приблизно 4 95, рівень ЕТрК менше, ніж приблизно 2 95, рівень ЕПК становить менше, ніж приблизно 4 95, рівень ДПК становить менше, ніж приблизно 4 95, рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 25 95, рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 30 95 до приблизно 60 95 або від приблизно 40 95 до приблизно 60 95, рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 20 95 до приблизно 75 95, рівень нових 06 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,5 95 до приблизно 10 95, рівень загальних 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 10 95 до приблизно 20 95, рівень нових 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 9 95 до приблизно 20 95, співвідношення загальних б жирних кислот: загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,05 до приблизно 3,0, переважно менше, ніж приблизно 0,50, співвідношення нових сб жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,03 до приблизно 3,0, вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше приблизно 70 95, ліпід по суті не містить холестерину, і ліпід містить три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18). Переважно 60 ліпід або олія по суті не містить СДК, ЕПК і ЕТК та/або є олією каноли та/або не оброблений за методом переестерифікації після виділення з рослини або частини рослини. У конкретному варіанті реалізації винаходу ліпід або олія каноли в подальшому можуть бути оброблені, з метою перетворення жирних кислот в олії на алкілові ефіри, наприклад, метилові або етилові ефіри. Додаткова обробка може застосовуватися для збагачення ліпіду або олії ДГК.
У ще одному переважному варіанті реалізації винаходу ліпід або олія, переважно олія з насіння, має наступні ознаки: у загальному вмісті жирних кислот ліпіду або олії рівень ДГК становить від приблизно 7 95 до 20 95, рівень пальмітинової кислоти становить від приблизно 2
Фо до приблизно 16 95, рівень міристинової кислоти становить менше, ніж приблизно 6 95, рівень олеїнової кислоти становить від приблизно 1 95 до приблизно 30 95, рівень ЛК становить від приблизно 4 95 до приблизно 35 95, АЛК присутня, ГЛК присутня, рівень СДК становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 7 95, рівень ЕТК становить менше, ніж приблизно 6 95, рівень
ЕПК становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 10 95, рівень ДПК становить від приблизно 0,05 95 до приблизно 8 95.
У подальшому варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід додатково містить один або більш стеролів, переважно рослинних стеролів.
В іншому варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід знаходиться у формі олії і містить менше, ніж приблизно 10 мг стеролів/г олії, менше, ніж приблизно 7 мг стеролів/г олії, від приблизно 1,5 мг до приблизно 10 мг стеролів/г олії, або від приблизно 1,5 мг до приблизно 7 мг стеролів/г олії.
Приклади стеролів, які можуть бути присутніми в екстрагованому ліпіді, включають, не обов'язково обмежуючись ними, один або більш або все з наступного: кампестрол/24- метилхолестерин, Д5-стигмастерол, ебурикол, ДВ-ситостерол/24-етилхолестерин, /-(Д5- авенастерол/ізофукостерол, Д7-стигмастерол/стигмаст-7-ен-3р-ол і Д7-авенастерол.
У варіанті реалізації винаходу вид рослини є одним з наведених в Табл. 26, наприклад, канола, і рівень стеролів є приблизно таким же, як наведений в Табл. 26 для цього конкретного виду рослини.
У варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід містить менше, ніж приблизно 0,5 мг холестерину/г олії, менше, ніж приблизно 0,25 мг холестерину/г олії, від приблизно 0 мг до приблизно 0,5 мг холестерину/г олії, або від приблизно 0 мг до приблизно 0,25 мг холестерину/г
Зо олії, або по суті не містить холестерину.
У подальшому варіанті реалізації винаходу ліпід є олією, переважно олією з олійної культури. Приклади таких олій включають, без обмеження, олію Вгавв5іса 5р., наприклад, олію каноли, олію со55урішт пігешшт, олію Гіпит изнайбвзітит, олію НеїЇапійиз 5р., олію Сагіпатив
Ііпсіогіи5, олію СіІусіпе тах, олію 7єа таув, олію Агарідорб5і5 ІПайііапа, олію Богдпит бБісоог, олію
Зогупит уцідагє, олію Амепа заїїма, олію ТийоЇйшт 5р., олію ЕІаевзі5 диіпеєпів, олію Місоїапа
Бепіпатіапа, олію Ногдешт уцідаге, олію І иріпиє апдивійоїйШе, олію Огула заїїма, олію Огуа діабетіта, олію Сатеїймпа заїїма, олію Статье абуззіпіса, олію Мізсапіпи5 х дідапіви5 або олію
Мізсапійиз» віпепвів.
Також розкритий екстрагований рослинний ліпід, переважно екстрагована олія з насіння каноли, що містить жирні кислоти в естерифікованій формі, причому жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 06 жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають с-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і необов'язково одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що ліпід має наступні ознаки по відношенню до загального вмісту жирних кислот в ліпіді: ї) рівень ДГК становить приблизно З 95, приблизно 4 95, приблизно 5 95, приблизно 6 95 або приблизно 7 905, ії) рівень пальмітинової кислоти становить від приблизно 2 95 до приблизно 16 905, ії) рівень міристинової кислоти становить менше, ніж приблизно 2 95, їм) рівень олеїнової кислоти становить від приблизно 30 95 до приблизно 60 95, переважно від приблизно 45 95 до приблизно 60 905, м) рівень ЛК становить від приблизно 4 95 до приблизно 20 95, мі) рівень АЛК становить від приблизно 2 95 до приблизно 16 905, мії) рівень ГЛК становить менше, ніж приблизно 4 95, мії) рівень СДК становить менше, ніж приблизно 6 95 або менше, ніж приблизно 4 95, їх) рівень ЕТК становить менше, ніж приблизно 6 95 або менше, ніж приблизно 4 905, х) рівень ЕТрК становить менше, ніж приблизно 1 95, хі) рівень ЕПК становить менше, ніж приблизно 10 95 та/або рівень ЕПК становить 0,5-2,0 х рівень ДГК, бо хії) рівень ДПК становить менше, ніж приблизно 4 95,
хії) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 25 965, хім) рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 30 95 до приблизно 70 95, хм) рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 15 95 до приблизно 75 95, переважно від приблизно 15 95 до приблизно 30 965, хмі) рівень нових б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,5 95 до приблизно 10 95, хмії) рівень загальних 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 10 95 до приблизно 20 95, хмії) рівень нових 003 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно З 95 до приблизно 20 905, хіх) співвідношення загальних б жирних кислот : загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,05 до приблизно 3,0, переважно менше, ніж приблизно 0,50, хх) співвідношення нових 006 жирних кислот : нових 003 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,03 до приблизно 3,0, ххі) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше приблизно 70 95, і ххії) ліпід по суті не містить холестерину. У варіанті реалізації винаходу ліпід містить три-ДГК
ТАГ (ТАГ 66:18). Більш переважно, ліпід по суті не містить СДК і ЕТК, та/або не оброблений за методом переестерифікації після виділення з рослини або частини рослини.
В іншому аспекті розкритий екстрагований рослинний ліпід, що містить жирні кислоти в естерифікованій формі, причому жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають со-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) та ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що (ї) рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 7 956 до 20 905, (ії) рівень пальмітинової
Зо кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 90 до 16 90, (іїї) рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж б 95, (ім) рівень олеїнової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1 95 до 30 95 або від 30 95 до 60 95, (м) рівень лінолевої кислоти (ЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 35
Фо, (мі) рівень о-ліноленової кислоти (АЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 40 9б, (мії) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТрК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж 4 905, (мії) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 25
Фо, (їх) співвідношення загальних 0б жирних кислот : загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1,0 до 3,0 або від 0,1 до 1, (х) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше 70 905, і (хі) щонайменше 70 905 естерифікованої ДГК у формі ТАГ знаходиться в положенні 5п-1ї або 5п-3 ТАГ. У варіанті реалізації винаходу присутні одна або більше, або всі з наступних ознак: ї) рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 95 до 15 95, і) рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж 1 95, ії) рівень олеїнової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно З 95 до приблизно 30 95, від приблизно 6 95 до приблизно 30 905, від 1 90
БО до приблизно 20 95, від приблизно 45 95 до приблизно 60 95, або становить приблизно 30 95, ім) рівень лінолевої кислоти (ЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 20 95 або від приблизно 4 95 до 17 95, м) рівень о-ліноленової кислоти (АЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 7 95 до приблизно 40 95, від приблизно 10 95 до приблизно 35 905, від приблизно 20 95 до приблизно 35 95 або від приблизно 4 до 16 905, мі) рівень у-ліноленової кислоти (ГЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 4 95, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2 95, менше, ніж приблизно 1 95, менше, ніж приблизно 0,5 905, від 0,05 95 до 7 905, від 0,05 95 до 4 95 або від 0,05 95 до приблизно З 95, або від 0,05 95 до приблизно 2 95,
мії) рівень стеаридонової кислоти (СДК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно З 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 7 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 4 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно З
Фо, або від 0,05 95 до приблизно 2 905, мії) рівень ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно 1 95, менше, ніж приблизно 0,5 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 5 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 4 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно З 95 або від приблизно 0,05 95 до приблизно 2 90, їх) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТрК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 2 95, менше, ніж приблизно 1 95, від 0,05 95 до 4 9б, від 0,05 95 до З 95, або від 0,05 95 до приблизно 2 95, або від 0,05 95 до приблизно 1 95, х) рівень ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж 4 956, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2 95, від 0,05 95 до 10 95, від 0,05 95 до 5 9б, або від 0,05 95 до приблизно З 95, або від 0,05 95 до приблизно 2 95, хі) рівень докозапентаєнової кислоти (ДПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж 4 956, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2 9б, від 0,05 95 до 8 95, від 0,05 95 до 5 95, або від 0,05 95 до приблизно З 95, або від 0,05 95 до приблизно 2 95, хії) рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить приблизно 8 95, приблизно 9 95, приблизно 10 95, приблизно 11 95, приблизно 12 95, приблизно 13 95, приблизно 14 95, приблизно 15 95, приблизно 16 95, приблизно 17 95, приблизно 18 95, від приблизно 8 95 до 20 95, від приблизно 10 95 до 20 95, від приблизно 11 95 до 20 95, від приблизно 10 95 до приблизно 16 95 або від приблизно 14 95 до 20 95, хії) ліпід містить 0б-докозапентаєнову кислоту (22:54710и13153 серед жирних кислот, що містяться в ньому, хім) ліпід в істотній мірі не містить Фб-докозапентаєнової кислоти (22:54 7л0131853 серед жирних кислот, що містяться в ньому,
Зо хм) ліпід по суті не містить СДК, ЕПК і ЕТК серед жирних кислот, що містяться в ньому,
Хмі) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 20 95 або від приблизно 6 95 до приблизно 20 905, хмії) рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 35 95, від приблизно 8 95 до приблизно 25 95, або від 8 95 до приблизно 22 905, хмії) рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 20 95 до приблизно 75 95, від приблизно 50 95 до приблизно 75 95, або від приблизно 60 95 до приблизно 75 905, хіх) рівень загальних 0б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 35 95 до приблизно 50 95, від приблизно 20 95 до приблизно 35
Фо, від приблизно 6 95 до 20 95, менше 20 95, менше, ніж приблизно 16 95, менше, ніж приблизно 10 95, від приблизно 1 95 до приблизно 16 95, від приблизно 2 95 до приблизно 10 95 або від приблизно 4 95 до приблизно 10 95, хх) рівень нових б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 10 95, менше, ніж приблизно 8 95, менше, ніж приблизно 6 905, менше 4 95, від приблизно 1 95 до приблизно 20 95, від приблизно 1 95 до приблизно 10 95, від приблизно 0,5 95 до приблизно 8 95 або від приблизно 0,5 95 до 4 95, ххі) рівень загальних 003 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого
БО ліпіду становить від 36 95 до приблизно 65 9б, від 40 95 до приблизно 60 95, від приблизно 20 95 до приблизно 35 95, від приблизно 10 95 до приблизно 20 95, приблизно 25 95, приблизно 30 95, приблизно 35 95 або приблизно 40 95, ххії) рівень нових 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 9 95 до приблизно 33 95, від приблизно 10 95 до приблизно 20 95, від приблизно 20
Фо до приблизно 30 95, від приблизно 12 95 до приблизно 25 95, приблизно 13 95, приблизно 15
Фо, приблизно 17 95 або приблизно 20 905, ххії) співвідношення загальних 0б жирних кислот : загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,1 до приблизно 0,5, менше, ніж приблизно 0,50, менше, ніж приблизно 0,40, менше, ніж приблизно 0,30, менше, ніж приблизно 60 0,20, менше, ніж приблизно 0,15, приблизно 1,0, приблизно 0,1 або приблизно 0,2,
ххім) співвідношення нових 0б жирних кислот : нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 1,0 до приблизно 3,0, від приблизно 0,1 до приблизно 1, від приблизно 0,1 до приблизно 0,5, менше, ніж приблизно 0,50, менше, ніж приблизно 0,40, менше, ніж приблизно 0,30, менше, ніж приблизно 0,20, менше, ніж приблизно 0,15, приблизно 0,1, приблизно 0,2 або приблизно 1,0, ххм) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК щонайменше приблизно 10 95, щонайменше приблизно 15 95, щонайменше приблизно 20 95, від приблизно 10 95 до приблизно 50 95, від приблизно 10 95 до приблизно 30 95 або від приблизно 10 95 до приблизно 25 965, ххмі) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЛК на ДГК щонайменше приблизно 15 96, щонайменше приблизно 20 95, щонайменше приблизно 22 95, щонайменше приблизно 25 95, від приблизно 15 95 до приблизно 50 95, від приблизно 20 95 до приблизно 40 95 або від приблизно 20 95 до приблизно 30 965, ххмії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на ДГК щонайменше приблизно 17 95, щонайменше приблизно 22 95, щонайменше приблизно 24 95, від приблизно 17 95 до приблизно 55 95, від приблизно 22 95 до приблизно 35 95 або від приблизно 24 95 до приблизно 35 905, ххмії) загальні жирні кислоти в екстрагованому ліпіді містять менше 1 95 С2071, ххіх) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 90 95, щонайменше 95 95, від приблизно 70 95 до приблизно 99 95 або від приблизно 90 95 до приблизно 99 905, ххх) ліпід містить діацилгліцерол (ДАГ), хххі) ліпід містить менше, ніж приблизно 10 95, менше, ніж приблизно 5 95, менше, ніж приблизно 1 95 або від приблизно 0,001 95 до приблизно 5 95 вільних (неестерифікованих) жирних кислот та/або фосфоліпіду, або по суті не містить їх, хххії) щонайменше 80 95 естерифікованої ДГК у формі ТАГ знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ, хххії) в ліпіді найпоширенішими видами ТАГ, що містять ДГК, є ДГК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12), і хххім) ліпід містить три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18).
Зо З особливою увагою до згаданого вище аспекту, у варіанті реалізації винаходу: ї) ліпід знаходиться у формі олії, причому олія містить один або більше стеролів, наприклад, один або більше або всі з кампестеролу, Д5-стигмастеролу, ебуриколу, ВД-ситостеролу, Д5- авенастеролу, Д7-стигмастеролу і Д7-авенастеролу, і олія необов'язково містить менше 10 мг стеролів/г олії та/або олія істотною мірою не містить холестерину, та/або і) ліпід знаходиться у формі олії з насіння олійної культури, такого як насіння олійної культури, що є насінням Вгазвіса 5р. або насінням каноли.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання екстрагованого рослинного ліпіду, який включає стадії: ї) одержання частини рослини, що містить ліпід, причому ліпід містить жирні кислоти в естерифікованій формі, при тому, що жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, Ффб жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають со-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і необов'язково одну або більше з ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), стеаридонової кислоти (СДК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) та ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), і, при цьому, рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот ліпіду, що екстрагується, в частині рослини становить приблизно 7-20 95, і і) екстракція ліпіду з частини рослини, причому рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить приблизно 7-20 95.
У переважному варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід має одну або більше ознак, визначених вище.
У варіанті реалізації винаходу, в якому частина рослини є насінням, переважним є насіння олійної культури. Приклади такого насіння включають, без обмеження, насіння Вгаввіса 5р.,
Созвурішт Пітт, Гіпит ивйаїіввітит, Неїапіпив 5р., Саппатив ііпсіогіи5, Сіусіпе тах, 7єа тауз, Агарідорвів Іпаіїапа, Зогупит бБісоіог, зогопит мцідаге, Амепа взаїїма, ТиоЇїшт звр., ЕІаевів диіпеепіб, Місойапа Бепіпатіапа, Ногдешт уцїдаге, ІГиріпиє апдивійоїйше, Огула заїїма, Огуга діабетіта, Сатвеїїпа займа або Статре абруззіпіса, переважно Вгаззіса пари, В. їшипсеа або
С. займа.
В іншому варіанті реалізації винаходу насіння містить щонайменше приблизно 18 мг, 60 щонайменше приблизно 22 мг, щонайменше приблизно 26 мг, від приблизно 18 мг до приблизно 100 мг, від приблизно 22 мг до приблизно 70 мг, або від приблизно 24 мг до приблизно 50 мг ДГК на грам насіння.
У подальшому варіанті реалізації винаходу частина рослини містить екзогенні полінуклеотиди, що кодують один з наступних наборів ферментів: ї) ю3-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, і) А15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Дб-елонгаза і дь- елонгаза, ії) А12-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, АДб-елонгаза і дь- елонгаза, їм) А12-десатураза, 03-десатураза або Л15-десатураза, Аб-десатураза, А5-десатураза, Да- десатураза, Аб-елонгаза і Д5-елонгаза, м) 3-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, м) А15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, ЛО-елонгаза і дь- елонгаза, мі) д12-десатураза, Дв-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, ДУ-елонгаза і дД5- елонгаза, або мії) Д12-десатураза, о3-десатураза або Л15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Да- десатураза, ДЛ9-елонгаза і Д5-елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше промоторами, здатними спрямовувати експресію вказаних полінуклеотидів в клітині частини рослини.
Ще в одному варіанті реалізації винаходу частина рослини має одну або більше, або всі з наступних ознак: її Д12-десатураза перетворює олеїнову кислоту на лінолеву кислоту в одній або більше клітинах рослини з ефективністю щонайменше приблизно 60 956, щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 80 95, від приблизно 60 95 до приблизно 98 95, від приблизно 70 95 до приблизно 95 95 або від приблизно 75 95 до приблизно 90 965, ії) 03-десатураза перетворює 0б жирні кислоти на 03 жирні кислоти в одній або більше клітинах рослини з ефективністю щонайменше приблизно 65 956, щонайменше приблизно 75 95, щонайменше приблизно 85 95, від приблизно 65 95 до приблизно 95 95, від приблизно 75 95 до
Зо приблизно 95 95 або від приблизно 80 95 до приблизно 95 95, ії) Дб-десатураза перетворює АЛК на СДК в одній або більше клітинах рослини з ефективністю щонайменше приблизно 30 95, щонайменше приблизно 40 956, щонайменше приблизно 50 95, щонайменше приблизно 60 95, щонайменше приблизно 70 95, від приблизно 30
Фо до приблизно 70 95, від приблизно 35 96 до приблизно 60 95 або від приблизно 50 95 до приблизно 70 905, їм) Аб-десатураза перетворює лінолеву кислоту на у-ліноленову кислоту в одній або більше клітинах рослини з ефективністю менше, ніж приблизно 5 95, менше, ніж приблизно 2,5 95, менше, ніж приблизно 1 95, від приблизно 0,1 95 до приблизно 5 95, від приблизно 0,5 95 до приблизно 2,5 95, або від приблизно 0,5 95 до приблизно 1 905, м) Аб-елонгаза перетворює СДК на ЕТК в одній або більше клітинах рослини з ефективністю щонайменше приблизно 60 95, щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 75 95, від приблизно 60 95 до приблизно 95 95, від приблизно 70 95 до приблизно 88 95 або від приблизно 75 95 до приблизно 85 95, мі) АБ-десатураза перетворює ЕТК на ЕПК в одній або більше клітинах рослини з ефективністю щонайменше приблизно 60 95, щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 75 95, щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 90 95, від приблизно 60
Фо до приблизно 99 95, від приблизно 70 96 до приблизно 99 95 або від приблизно 75 95 до приблизно 98 95, мі) АбБ-елонгаза перетворює ЕПК на ДПК в одній або більше клітинах рослини з ефективністю щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 85 95, щонайменше приблизно 90 95, від приблизно 50 95 до приблизно 95 95 або від приблизно 85 95 до приблизно 95 б, мії) Д4-десатураза перетворює ДПК на ДГК в одній або більше клітинах рослини з ефективністю щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 90 95, щонайменше приблизно 93 95, від приблизно 50 95 до приблизно 95 95, від приблизно 80 95 до приблизно 95 905 або від приблизне 85 950 до приблизно 95 95, їх) ефективність перетворення олеїнової кислоти на ДГК в одній або більше клітинах частини рослини становить щонайменше приблизно 10 95, щонайменше приблизно 15 95, щонайменше приблизно 20 95, від приблизно 10 95 до приблизно 50 95, від приблизно 10 95 до 60 приблизно 30 95 або від приблизно 10 95 до приблизно 25 95,
х) ефективність перетворення ЛК на ДГК в одній або більше клітинах частини рослини становить щонайменше приблизно 15 95, щонайменше приблизно 20 95, щонайменше приблизно 22 95, щонайменше приблизно 25 95, від приблизно 15 95 до приблизно 50 95, від приблизно 20 95 до приблизно 40 95 або від приблизно 20 95 до приблизно 30 95, хі) ефективність перетворення АЛК на ДГК в одній або більше клітинах частини рослини становить щонайменше приблизно 17 956, щонайменше приблизно 22 95, щонайменше приблизно 24 95, від приблизно 17 95 до приблизно 55 95, від приблизно 22 95 до приблизно 35 95 або від приблизно 24 95 до приблизно 35 965, хії) одна або більше клітин частини рослини містять щонайменше приблизно на 15 95, щонайменше приблизно на 20 95, від приблизно 15 95 до приблизно 30 95 або від приблизно 22,5 9У5 до приблизно 27,5 95, більше жирних кислот 03, ніж відповідні клітини без екзогенних полінуклеотидів, хії) Аб-десатураза переважно зменшує насиченість о-ліноленової кислоти (АЛК) щодо лінолевої кислоти (ЛК), хім) Аб-елонгаза додатково має активність Д9У-елонгази, хм) А12-десатураза додатково має активність Д15-десатурази, хмі) Аб-десатураза додатково має активність Ав-десатурази, хмії) Дв-десатураза додатково має активність Лб-десатурази або не має активність Дб- десатурази, хмії) А15-десатураза додатково має активність 03-десатурази по відношенню до ГЛК, хіх) Фо3-десатураза додатково має активність А15-десатурази по відношенню до ЛК, хх) Ф3-десатураза зменшує насиченість ЛК та/або ГЛК, ххі) Фо3-десатураза переважно зменшує насиченість ГЛК щодо ЛК, ххії) рівень ДГК в частині рослини базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК в частині рослини щонайменше приблизно 10 95, щонайменше приблизно 15 965, щонайменше приблизно 20 95, від приблизно 10 95 до приблизно 50 95, від приблизно 15 95 до приблизно 30 95 або від приблизно 20 95 до приблизно 25 95, ххії) рівень ДГК в частині рослини базується на ефективності перетворення ЛК на ДГК в частині рослини щонайменше приблизно 15 9565, щонайменше приблизно 20 95, щонайменше
Зо приблизно 22 95, від приблизно 15 95 до приблизно 60 95, від приблизно 20 95 до приблизно 40 95 або від приблизно 22 95 до приблизно 30 95, ххім) рівень ДГК в частині рослини базується на ефективності перетворення АЛК на ДГК в частині рослини щонайменше приблизно 17 96, щонайменше приблизно 22 95, щонайменше приблизно 24 95, від приблизно 17 95 до приблизно 65 95, від приблизно 22 95 до приблизно 35 95 або від приблизно 24 95 до приблизно 35 965, ххх) одна або більше або всі десатурази володіють вищою активністю на субстраті ацил-
КоА, ніж на відповідному субстраті адил-фосфатидилхоліну (ацил-ФХ), хххі) Дб-десатураза має вищу активність Аб-десатурази по відношенню до АЛК, ніж ЛК як жирнокислотного субстрату, хххії) Аб-десатураза має вищу активність Аб-десатурази по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, хххії) Дб-десатураза має щонайменше в 2 рази вищу активність Дб-десатурази, щонайменше в З рази вищу активність, щонайменше в 4 рази вищу активність або щонайменше в 5 разів вищу активність по відношенню до АЛК як субстрату, в порівнянні з ЛК, хххім) Аб-десатураза має вищу активність по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, хххм) Дб-десатураза має щонайменше в 5 разів вищу активність Дб-десатурази або щонайменше в 10 разів вищу активність по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, ххумі) десатураза являє собою їгопі-епа десатуразу, хххмії) Аб-десатураза не має активність А5-десатурази по відношенню до ЕТК, яку можна було б виявити.
Ще в одному варіанті реалізації винаходу частина рослини має одну або більше, або всі з наступних ознак: її Д12-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 10, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну 60 ЗЕОІЮО МО: 10,
ії) ю3-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЕБЕО ІЮ МО: 12, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну
ЗЕО ІЮ МО: 12, ії) Дб-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЗЕО ІЮ МО: 16, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну
ЗЕОІЮО МО: 16, їм) Дб-елонгаза містить послідовність амінокислот, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 25, її біологічно активний фрагмент, такий як ЗЕО ІЮ МО: 26, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну 5ЕО ІЮ МО: 25 та/або 5ЕО ІЮ МО: 26, м) д5-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 30, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну
ЗЕО ІЮ МО: 30, мі) АБбБ-елонгаза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 37, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну
ЗЕО ІЮ МО: 37, мії) Д4-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 41, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну
ЗЕО ІЮ МО: 41.
У варіанті реалізації винаходу частина рослини додатково містить екзогенний полінуклеотид, що кодує діацилгліцерол ацилтрансферазу (ДГАТ), моноацилгліцерол ацилтрансферазу (МГАТ), гліцерол-3-фосфат ацилтрансферазу (ГФАТ), 1-ацил-гліцерол-3- фосфат ацилтрансферазу (ЛФКАТ) переважно ЛФКАТ, яка може використовувати поліненасичений жирний ацил-КоА субстрат С22, ацил-КоА:лізофосфатидилхолін ацилтрансферазу (ЛФХАТ), фосфоліпазу Аг (РІ Аг), фосфоліпазу С (РГС), фосфоліпазу Ю (РГС), СДП-холін діацилгліцероллхолін фосфотрансферазу (ХФТ), фосфатидилхолін діацилгліцерол ацилтрансферазу (ФДАТ), фосфатидилхолін:діацилгліцерол холін фосфотрансферазу (ФДХТ), ацил-КоА синтазу (АКС) або комбінацію двох або більше із вказаних ферментів.
В іншому варіанті реалізації винаходу частина рослини додатково містить введену мутацію
Зо або екзогенний полінуклеотид, який в клітині частини рослини негативно регулює продукування та/або активність ендогенного ферменту, вибраного серед РАЕТ, ДГАТ, МГАТ, ГФАТ, ЛФКАТ,
ЛФХАТ, РІ А», РІ С, РІ0Ю, ХФТ, ФДАТ, тіоестерази, наприклад, ЕАТВ або Л12-десатурази, або комбінації двох або більше із вказаних ферментів.
У подальшому варіанті реалізації винаходу щонайменше один або всі промотори є специфічними для насіння промоторами. У варіанті реалізації винаходу щонайменше один або всі промотори одержані з генів біосинтезу або акумуляції олії, таких як олеозин, або із генів зберігання білка в насінні, таких як конлінін.
В іншому варіанті реалізації винаходу промотор(и), що спрямовує(ють) експресію екзогенних полінуклеотидів, які кодують Д4-десатуразу і Д5-елонгазу, ініціює експресію полінуклеотидів в насінні частини рослини, що розвивається, перед або досягає піку експресії перед промотором(ами), що спрямовує(ють) експресію екзогенних полінуклеотидів, що кодують А12- десатуразу і о3-десатуразу.
У подальшому варіанті реалізації винаходу екзогенні полінуклеотиди ковалентно з'єднані в молекулу ДНК, переважно молекулу Т-ДНК, інтегровану в геном клітин частини рослини, причому кількість таких молекул ДНК, інтегрованих в геном клітин частини рослини переважно становить не більше однією, двох або трьох, або становить дві або три.
Ще в одному варіанті реалізації винаходу рослина містить щонайменше два різні екзогенні полінуклеотиди, кожний з яких кодує Дб-десатуразу з такою ж або іншою послідовністю амінокислот.
У подальшому варіанті реалізації винаходу загальний вміст олії в частині рослини, що містить екзогенні полінуклеотиди, становить щонайменше приблизно 40 95, або щонайменше приблизно 50 95, або щонайменше приблизно 60 95, або щонайменше приблизно 70 95 або від приблизно 50 95 до приблизно 80 95 від загального вмісту олії у відповідній частині рослини, в якій відсутні екзогенні полінуклеотиди. У цих варіантах реалізації винаходу максимальний вміст олії може становити приблизно 100 95 від вмісту олії у відповідній частині рослини дикого типу.
В іншому варіанті реалізації винаходу ліпід знаходиться у формі олії, переважно олії з насіння олійної культури, причому щонайменше приблизно 90 95, або щонайменше приблизно 95 95, щонайменше приблизно 98 95 або від приблизно 95 95 до приблизно 98 мас. 95 ліпіду складають тріацилгліцероли.
У подальшому варіанті реалізації винаходу спосіб додатково включає обробку ліпіду, з метою підвищення рівня ДГК як відсотка від загального вмісту жирних кислот. Наприклад, обробка може бути переестерифікацією. Наприклад, ліпід, такий як олія каноли, може бути підданий обробці з метою перетворення жирних кислот в олії на алкілові ефіри, наприклад, метилові або етилові ефіри, які далі можуть бути фракційовані із збагаченням ліпіду або олії
ДГК.
Додатково розкритий спосіб одержання екстрагованого рослинного ліпіду, який включає стадії: ї) одержання частини рослини, переважно насіння каноли, що містить ліпід, причому ліпід містить жирні кислоти в естерифікованій формі, притому, що жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, фб жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають со-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і необов'язково одну або більше із ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), стеаридонової кислоти (СДК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), і, при цьому, рівень
ДГК в загальному вмісті жирних кислот ліпіду, що екстрагується, в частині рослини становить приблизно 3 95, приблизно 4 95, приблизно 5 95, приблизно 6 95 або від приблизно 7 95, і і) екстракція ліпіду з частини рослини, причому екстрагований ліпід має наступні ознаки загального вмісту жирних кислот в ліпіді; ї) рівень ДГК становить приблизно З 95, приблизно 4 95, приблизно 5 95, приблизно 6 95 або приблизно 7 905, ії) рівень пальмітинової кислоти становить від приблизно 2 95 до приблизно 16 95, ії) рівень міристинової кислоти становить менше, ніж приблизно 2 95, їм) рівень олеїнової кислоти становить від приблизно 30 95 до приблизно 60 95, переважно від приблизно 45 95 до приблизно 60 905, м) рівень ЛК становить від приблизно 4 95 до приблизно 20 965, мі) рівень АЛК становить від приблизно 2 95 до приблизно 16 905, мії) рівень ГЛК становить менше, ніж приблизно 4 95, мії) рівень СДК становить менше, ніж приблизно 6 95 або менше, ніж приблизно 4 905, їх) рівень ЕТК становить менше, ніж приблизно 6 95 або менше, ніж приблизно 4 95,
Зо х) рівень ЕТРрК становить менше, ніж приблизно 1 95, хі) рівень ЕПК становить менше, ніж приблизно 10 95 та/або рівень ЕПК становить 0,5-2,0 х рівень ДГК, хії) рівень ДПК становить менше, ніж приблизно 4 95, хії) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 25 95, хім) рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 30 95 до приблизно 70 905, хм) рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 15 95 до приблизно 75 95, переважно від приблизно 15 95 до приблизно 30 965, хмі) рівень нових б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,5 95 до приблизно 10 95, хмії) рівень загальних 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 10 95 до приблизно 20 905, хмії) рівень нових 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно З 95 до приблизно 20 95, хіх) співвідношення загальних б жирних кислот : загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,05 до приблизно 3,0, переважно менше, ніж приблизно 0,50, хх) співвідношення нових б жирних кислот : нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,03 до приблизно 3,0, ххі) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше приблизно 70 95, і ххії) ліпід по суті не містить холестерину. У варіанті реалізації винаходу ліпід містить три-ДГК
ТАГ (ТАГ 66:18). Більш переважно, ліпід по суті не містить СДК і ЕТК, та/або не оброблений за методом переестерифікації після виділення з рослини або частини рослини.
Також розкритий спосіб одержання екстрагованого рослинного ліпіду, який включає стадії: ї) одержання частини рослини, що містить ліпід, причому ліпід містить жирні кислоти в естерифікованій формі, притому, що жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, Ффб жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 003 жирні кислоти, які бо включають с-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), і, при цьому: (і) рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 7 95 до 20 9б, (ії) рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 95 до 16 90, (ії) рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 6 95, (ім) рівень олеїнової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1 95 до 30 95 або від 30 95 до 60 95, (м) рівень лінолевої кислоти (ЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 35 9б, (мі) рівень с- ліноленової кислоти (АЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 40 905, (мії) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТрК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 4 9б, (мії) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 25 9б, (їх) співвідношення загальних 0б жирних кислот : загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1,0 до 3,0 або від 0,1 до 1, (х) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше 70 90, і (хі) щонайменше 70 90 естерифікованих ДГК у формі ТАГ знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ. оо, і і) екстракція ліпіду з частини рослини, при цьому, рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить приблизно 7-20 95.
Крім того, розкритий ліпід, або олія, що містить ліпід, одержані із застосуванням способу за винаходом.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання етилових ефірів поліненасичених жирних кислот, який включає переестерифікацію триацилгліцеролів в екстрагованому рослинному ліпіді, причому екстрагований рослинний ліпід містить жирні кислоти в естерифікованій формі, притому, що жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають о-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГЮК),, і необов'язково одне або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти
Зо (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що рівень
ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить приблизно 7-20 95, з одержанням в такий спосіб етилових ефірів.
У переважному варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід має один або більше з ознак, визначених вище.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання етилових ефірів поліненасичених жирних кислот, який включає переестерифікацію триацилгліцеролів в екстрагованому рослинному ліпід, причому екстрагований рослинний ліпід містить естерифіковані жирні кислоти у формі триацилгліцеролів, причому жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 06 жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають с-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і одну або більш із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що (ї) рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить приблизно З 95, приблизно 4
Фо, приблизно 5 95, приблизно б 95 або від 7 905 до 20 9рб, (ії) рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 95 до 16 90, (іїї) рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 6 95, (ім) рівень олеїнової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1 95 до 30 95 або від 30 95 до 60 95, (м) рівень лінолевої кислоти (ЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 35 9б, (мі) рівень с- ліноленової кислоти (АЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 40 905, (мії) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТРрК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 4 9б, (мії) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 25 9б, (їх) співвідношення загальних б жирних кислот : загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1,0 до 3,0 або від 0,1 до 1, (х) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше 70 95, і (хі) щонайменше 70 95 естерифікованої ДГК у формі ТАГ знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ, з одержанням в такий спосіб етилових ефірів. У варіанті реалізації винаходу екстрагований рослинний ліпід має одну або більше, або всі з наступних ознак:
ї) рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 95 до 15 905, і) рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 1 95, хххМм) рівень олеїнової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно З 95 до приблизно 30 95, від приблизно 6 95 до приблизно 30 95, від 1 90 до приблизно 20 95, від приблизно 45 95 до приблизно 60 95 або становить приблизно 30 905, хххмії) рівень лінолевої кислоти (ЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 20 95 або від приблизно 4 95 до 17 95, ххумії) рівень со-ліноленової кислоти (АЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 7 95 до приблизно 40 95, від приблизно 10 95 до приблизно 35 905, від приблизно 20 95 до приблизно 35 95 або від приблизно 4 95 до 16 95, ххухмії) рівень у-ліноленової кислоти (ГЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 4 95, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2 95, менше, ніж приблизно 1 95, менше, ніж приблизно 0,5 95, від 0,05 95 до 7 905, від 0,05 95 до 4 95, або від 0,05
Фо до приблизно З 95, або від 0,05 95 до приблизно 2 95, хххіх) рівень стеаридонової кислоти (СДК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно З 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 7 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 4 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно З
Фо, або від 0,05 95 до приблизно 2 905,
ХІ) рівень ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно 1 95, менше, ніж приблизно 0,5 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 5 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно 4 95, від приблизно 0,05 95 до приблизно З 95 або від приблизно 0,05 95 до приблизно 2 об, хії) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТРрК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 2 95, менше, ніж приблизно 1 95, від 0,05 95 до 4 9б, від 0,05 95 до З 95 або від 0,05 95 до приблизно 2 95 або від 0,05 95 до приблизно 1 905,
Ххіїї) рівень ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж 4 956, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2 9б, від 0,05 95 до 10 95, від 0,05 95 до 5 95 або від 0,05 95 до приблизно З 95 або від 0,05 95 до приблизно 2 95,
Хіїйї) рівень докозапентаєнової кислоти (ДПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 4 95, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2
Фо, від 0,05 95 до 8 905, від 0,05 95 до 5 95 або від 0,05 95 до приблизно З 95 або від 0,05 95 до приблизно 2 905, хІїм) рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить приблизно 8 95, приблизно 9 95, приблизно 10 95, приблизно 11 95, приблизно 12 95, приблизно 13 95, приблизно 14 95, приблизно 15 95, приблизно 16 95, приблизно 17 95, приблизно 18 9б, від приблизно 8 95 до 20 95, від приблизно 10 95 до 20 95, від приблизно 11 95 до 20 95, від приблизно 10 95 до приблизно 16 95 або від приблизно 14 95 до 20 95,
ХІМ) ліпід містить юб-докозапентаєнову кислоту (22:545710и13183 серед жирних кислот, що містяться в ньому, хім) ліпід по суті не містить Фб-докозапентаєновой кислоти (22:54710и13163 серед жирних кислот, що містяться в ньому, хімії) ліпід по суті не містить СДК, ЕПК і ЕТК серед жирних кислот, що містяться в ньому, хімії) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 20 95 або від приблизно 6 95 до приблизно 20 905, хіїх) рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 4 95 до приблизно 35 95, від приблизно 8 95 до приблизно 25 95 або від 8 95 до приблизно 22 965, 1) рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 20 95 до приблизно 75 95, від приблизно 50 95 до приблизно 75 95, або від приблизно 60 95 до приблизно 75 905,
І) рівень загальних 0б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 35 95 до приблизно 50 95, від приблизно 20 95 до приблизно 35
Фо, від приблизно б 95 до 20 95, менше, ніж 20 95, менше, ніж приблизно 16 95, менше, ніж приблизно 10 95, від приблизно 1 95 до приблизно 16 95, від приблизно 2 95 до приблизно 10 95 60 або від приблизно 4 95 до приблизно 10 95,
Ії) рівень нових 0б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж приблизно 10 95, менше, ніж приблизно 8 95, менше, ніж приблизно 6 905, менше 4 95, від приблизно 1 95 до приблизно 20 95, від приблизно 1 95 до приблизно 10 95, від приблизно 0,5 95 до приблизно 8 95 або від приблизно 0,5 95 до 4 95,
Ійї) рівень загальних 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 36 95 до приблизно 65 9б, від 40 95 до приблизно 60 95, від приблизно 20 905 до приблизно 35 95, від приблизно 10 95 до приблизно 20 95, приблизно 25 95, приблизно 30 95, приблизно 35 95 або приблизно 40 95,
Ім) рівень нових 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 9 95 до приблизно 33 95, від приблизно 10 95 до приблизно 20 95, від приблизно 20
Фо до приблизно 30 95, від приблизно 12 95 до приблизно 25 95, приблизно 13 95, приблизно 15
Фо, приблизно 17 95 або приблизно 20 905,
Ім) співвідношення загальних 0б жирних кислот : загальних 003 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 0,1 до приблизно 0,5, менше, ніж приблизно 0,50, менше, ніж приблизно 0,40, менше, ніж приблизно 0,30, менше, ніж приблизно 0,20, менше, ніж приблизно 0,15, приблизно 1,0, приблизно 0,1 або приблизно 0,2,
Імі) співвідношення нових 06 жирних кислот : нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від приблизно 1,0 до приблизно 3,0, від приблизно 0,1 до приблизно 1, від приблизно 0,1 до приблизно 0,5, менше, ніж приблизно 0,50, менше, ніж приблизно 0,40, менше, ніж приблизно 0,30, менше, ніж приблизно 0,20, менше, ніж приблизно 0,15, приблизно 0,1, приблизно 0,2 або приблизно 1,0,
Імії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК щонайменше приблизно 10 95, щонайменше приблизно 15 95, щонайменше приблизно 20 95, від приблизно 10 95 до приблизно 50 95, від приблизно 10 95 до приблизно 30 95 або від приблизно 10 95 до приблизно 25 9б5,
Імії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЛК на ДГК щонайменше приблизно 15 96, щонайменше приблизно 20 95, щонайменше приблизно 22 95, щонайменше приблизно 25 95, від приблизно 15 95 до приблизно 50 95, від приблизно 20 95 до приблизно 40 95 або від приблизно 20 95 до приблизно 30 965,
Зо Їх) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на ДГК щонайменше приблизно 17 95, щонайменше приблизно 22 95, щонайменше приблизно 24 95, від приблизно 17 95 до приблизно 55 95, від приблизно 22 95 до приблизно 35 95 або від приблизно 24 95 до приблизно 35 905,
Їх) загальні жирні кислоти в екстрагованому ліпіді містять менше 1 95 С2071,
Їхі) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) в ліпіді становить щонайменше приблизно 80 9б5, щонайменше приблизно 90 95, щонайменше 95 95, від приблизно 70 95 до приблизно 99 95 або від приблизно 90 95 до приблизно 99 905,
Їхії) ліпід містить діацилгліцерол (ДАГ),
Їхії) ліпід містить менше, ніж приблизно 10 95, менше, ніж приблизно 5 95, менше, ніж приблизно 1 95 або від приблизно 0,001 95 до приблизно 5 95, вільних (неестерифікованих) жирних кислот та/або фосфоліпіду або по суті не містить їх,
Їхім) щонайменше 80 95 естерифікованої ДГК у формі ТАГ знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ,
Їхм) в ліпіді найпоширенішими видами ТАГ, що містять ДГК, є ДГК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12), і
Їхмі) ліпід містить три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18).
З особливою увагою до згаданого вище аспекту, у варіанті реалізації винаходу застосовують одне або більше або все з наступного: ї) ліпід знаходиться у формі олії, причому олія містить один або більше стеролів, наприклад, один або більше або всі з кампестеролу, Д5-стигмастеролу, ебуриколу, ВД-ситостеролу, Д5- авенастеролу, А7-стигмастеролу і Д7-авенастеролу, і олія необов'язково містить менше 10 мг стеролів/г олії та/або олія істотною мірою не містить холестерину, і) ліпід знаходиться у формі олії з насіння олійної культури, такого як насіння олійної культури, що є насінням Вгазвзіса 5р. або насінням каноли, ії) рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить приблизно З 95, приблизно 4 95, приблизно 5 95, приблизно 6 95, або становить від 7
Фо до 20 95.
У подальшому аспекті цього винаходу розкривається химерна генетична конструкція, що містить у вказаному порядку: перший ген, другий ген, третій ген, четвертий ген, п'ятий ген і шостий ген, всі з яких ковалентно з'єднані в єдиній молекулі ДНК, причому перший, другий і 60 третій гени об'єднані як перший кластер генів, і четвертий, п'ятий і шостий гени об'єднані як другий кластер генів, притому, що кожен ген містить промотор, кодуючу ділянку і термінатор транскрипції та/або ділянку поліаденілювання таким чином, що кожен промотор функціонально пов'язаний з кодуючою ділянкою і термінатором транскрипції та/або ділянкою поліаденілювання, при цьому, кожен промотор незалежно є ідентичним або відрізняється від інших промоторів таким чином, що молекула ДНК містить три, чотири, п'ять або шість різних промоторів, причому один або більш або всі промотори є гетерологічними відносно кодуючої ділянки, з якою вони функціонально пов'язані, притому, що напрямок транскрипції першого гена йде від третього гена і протилежний напрямку транскрипції третього гена, при цьому, напрямок транскрипції четвертого гена йде від шостого гена і протилежний напрямку транскрипції шостого гена, причому напрямок транскрипції другого гена такий же, як для першого гена або третього гена, притому, що напрямок транскрипції п'ятого гена такий же, як для четвертого гена або шостого гена, при цьому, термінатор транскрипції та/або ділянка поліаденілювання другого гена відокремлені від промотору першого або третього гена, в залежності від того, який із них є ближчим, першою ділянкою розпірки розміром від приблизно 0,2 до приблизно 3,0 тисяч основ, причому перший кластер генів відокремлений від другого кластера генів другою ділянкою розпірки розміром від приблизно 1,0 до приблизно 10,0 тисяч основ, і при цьому, термінатор транскрипції та/або ділянка поліаденілювання п'ятого гена відокремлені від промотору четвертого або шостого гена, в залежності від того, який із них є ближчим, третьою ділянкою розпірки розміром від приблизно 0,2 до приблизно 3,0 тисяч основ.
У варіанті реалізації винаходу молекула ДНК містить сьомий ген, що відокремлений від першого кластера генів або другого кластера генів, в залежності від того, який із них є ближчим, ділянкою розпірки розміром від приблизно 1,0 до приблизно 10,0 тисяч основ.
В іншому варіанті реалізації винаходу молекула ДНК містить два або більше різних термінаторів транскрипції та/або ділянок поліаденілювання.
Зо Ще в одному варіанті реалізації винаходу щонайменше одна з ділянок розпірки містить ділянку прикріплення до матриксу (ДПМ).
У подальшому варіанті реалізації винаходу молекула ДНК містить праві і ліві ділянки межі, що фланкують гени, і являє собою молекулу Т-ДНК.
В іншому варіанті реалізації винаходу генетична конструкція знаходиться в клітині
Адгобрасієгійт або інтегрована в геном рослинної клітини.
У переважному варіанті реалізації винаходу щонайменше один з генів кодує десатуразу жирних кислот або елонгазу жирних кислот.
В іншому варіанті реалізації винаходу генетична конструкція містить гени, що кодують набір ферментів, як визначається в цьому документі, та/або один або більше генів кодують фермент, як визначається в цьому документі.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається виділений та/або екзогенний полінуклеотид, що містить: ї) послідовність нуклеотидів, вибрану як будь-яка із ФЕО ІЮ МО: 1-9, 11, 14, 18, 22, 23, 28, 34, 35, 39 або 45, та/або ії) послідовність нуклеотидів, щонайменше на 95 95 ідентичну або на 99 95 ідентичну одній або більше послідовностям, представленим у 5ЕО ІЮ МО: 1-9, 11, 14, 18, 22, 23, 28, 34, 35, 39 або 45.
В особливо переважному варіанті реалізації винаходу виділений та/або екзогенний полінуклеотид містить:
БО ї) послідовність нуклеотидів ЗЕО ІО МО: 2 та/або ії) послідовність нуклеотидів, щонайменше на 95 95 ідентичну або на 99 95 ідентичну послідовності, представленій в 5ЕО ІЮ МО: 2.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається вектор або генетична конструкція, що містить полінуклеотид за винаходом та/або генетичну конструкцію за винаходом.
У варіанті реалізації винаходу послідовність нуклеотидів, вибрана як будь-яка із ФЕО ІЮ МО: 11, 14, 18, 22, 23, 28, 34, 35, 39 або 45, або послідовність нуклеотидів, щонайменше на 95 95 ідентична або на 99 95 ідентична одній або більше послідовностям, представленим у ЗЕО ІЮ
МО: 11, 14, 18, 22, 23, 28, 34, 35, 39 або 45, функціонально пов'язана з промотором.
У ще одному аспекті цього винаходу розкривається клітина-хазяїн, що містить екзогенні бо полінуклеотиди, які кодують один з наступних наборів ферментів:
ї) ю3-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, і) А15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, Дб-елонгаза і дь- елонгаза, ії) А12-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, АДб-елонгаза і дь- елонгаза, їм) А12-десатураза, 03-десатураза або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Да- десатураза, Аб-елонгаза і Д5-елонгаза, м) 3-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, м) А15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, ЛО-елонгаза і дь- елонгаза, мі) А12-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, ЛУ-елонгаза і дь- елонгаза, або мії) Д12-десатураза, о3-десатураза або Л15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Да- десатураза, ДЛ9-елонгаза і Д5-елонгаза, і при цьому, кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше промоторами, що здатні спрямовувати експресію вказаних полінуклеотидів в клітині.
У варіанті реалізації винаходу клітина містить ліпід, як визначається вище, або в ній одна або більше або всі десатурази або елонгази володіють однією або більше ознак, як визначається вище.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається клітина-хазяїн, яка містить: ї) перший екзогенний полінуклеотид, що кодує А12-десатуразу, яка містить амінокислоти з послідовністю, представленою в 5ЕБО ІО МО: 10, її біологічно активний фрагмент або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну 5ЕО ІЮО МО: 10, і і) другий екзогенний полінуклеотид, що кодує 03-десатуразу, яка містить амінокислоти з послідовністю, представленою в 5БО ІЮ МО: 12, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну 5ЕО ІЮ МО: 12, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше промоторами, здатними спрямовувати експресію вказаних полінуклеотидів в клітині.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається клітина-хазяїн, що містить один або більше полінуклеотидів за винаходом, генетичну конструкцію за винаходом, або вектор або генетичну конструкцію за винаходом.
У варіанті реалізації винаходу клітина знаходиться в рослині, в частині рослини та/або є клітиною насіння зрілої рослини.
У варіанті реалізації винаходу рослина або насіння рослини є рослиною олійної культури або насінням олійної культури, відповідно.
Також розкритий трансгенний організм, що не належить до людського роду, який містить клітину за винаходом. Переважно трансгенний організм, що не належить до людського роду, є трансгенною рослиною, переважно рослиною олійної культури або Агарідорвзіз5 (ПаїЇйапа. У варіанті реалізації винаходу рослина є рослиною Вгаззіса, переважно В. пари5 або В. |ипсєа, або іншою рослиною, окрім Агабідорбзів ІНаїііапа.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається рослина олійної культури, що містить: а) ліпід в її насінні, причому ліпід містить жирні кислоти в естерифікованій формі, і б) екзогенні полінуклеотиди, що кодують один із наступних наборів ферментів: ї) А12-десатураза, грибкова 03-десатураза та/або грибкова ДЛ15-десатураза, Дб-десатураза, д5-десатураза, Д4-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, або її) А12-десатураза, грибкова ю03-десатураза та/або грибкова А15-десатураза, Дв-десатураза, д5-десатураза, Д4-десатураза, Д9У-елонгаза і Д5-елонгаза, притому, що кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше специфічними для насіння промоторами, які здатні спрямовувати експресію вказаних полінуклеотидів в насінні рослини, що розвивається, і, при цьому, жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 06 жирні кислоти, що включають лінолеву кислоту (ЛК) і у-ліноленову кислоту (ГЛК), 03 жирні кислоти, які включають о-ліноленову кислоту (АЛК), стеаридонову кислоту (СДК), докозапентаєнову кислоту (ДПК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і необов'язково ейкозапентаєнову кислоту (ЕПК) та/або ейкозатетраєнову кислоту (ЕТК), причому рівень ДГК в загальному вмісті жирних кислот ліпіду становить приблизно 7-20 95.
Приклади рослин олійної культури включають, без обмеження, Вгаззіса 5р., Соззурійит пігвшійт, Гіпит ивйайввітит, Неїїапіпив 5р., Сапнатив іпсіопйи5, Суіусіпе тах, 76а таув,
Агабідорвзів ІНаійапа, Богапйит бБісоіїог, богупит умцідагє, Амепа заїїма, ТийоїйШшт 5р., ЕІаєзів диіпеепіб, Місойапа Бепіпатіапа, Ногдешт уцїдаге, ІГиріпиє апдивійоїйше, Огула заїїма, Огуга 60 діабетіта, Сатеїїпа займа або Статре абуззіпіса. У варіанті реалізації винаходу рослина олійної культури являє собою канола, Суіусіпе тах, рослину Сатеїйпа 5заїїма або Агабідорвів
ІНнаійапа. В альтернативному варіанті реалізації винаходу рослина олійної культури являє собою рослину, окрім А. ІНаїїапа.
У варіанті реалізації винаходу одна або більш десатураз здатні використовувати субстрат ацил-КоА. У переважному варіанті реалізації винаходу одна або більш з Аб-десатурази, Д5- десатурази, Л4-десатурази і Д8-десатурази, якщо вони присутні, здатні використовувати субстрат ацил-КоА, переважно кожна з ї) ДАб-десатурази, Д5-десатурази і Д4-десатурази або ії) д5-десатурази, Л4-десатурази і Дв-десатурази здатна використовувати субстрат ацил-КоА. У варіанті реалізації винаходу Д12-десатураза та/або о03-десатураза здатні використовувати субстрат ацил-КоА. Субстрат ацил-КоА переважно являє собою АЛК-КоА, ЕТК-КоА, ДПК-КоА,
ЕТрК-КоА, ЛК-КоА, ГЛК-КоА або АРК-КОА.
У варіанті реалізації винаходу зріле, зібране в процесі збору урожаю насіння рослини містить ДГК в кількості щонайменше близько 28 мг на грам насіння, переважно щонайменше близько 32 мг на грам насіння, щонайменше близько 36 мг на грам насіння, щонайменше близько 40 мг на грам насіння, більш переважно щонайменше близько 44 мг на грам насіння або щонайменше близько 48 мг на грам насіння. Максимальний вміст ДГК може становити від приблизно 80 до приблизно 100 мг на грам насіння, або приблизно 80 мг або приблизно 100 мг на грам насіння.
У подальшому аспекті цього винаходу розкривається рослина Вгаз5іса парив, В. |Їнпсєа або
Сатеїйпа займа, яка здатна давати насіння, що містить ДГК, причому зібране в процесі збору урожаю, зріле насіння рослини містить ДГК в кількості щонайменше близько 28 мг на грам насіння, переважно щонайменше близько 32 мг на грам насіння, щонайменше близько 36 мг на грам насіння, щонайменше близько 40 мг на грам насіння, більш переважно щонайменше близько 44 мг на грам насіння або щонайменше близько 48 мг на грам насіння. Максимальний вміст ДГК може становити від приблизно 80 до приблизно 100 мг на грам насіння, або приблизно 80 мг або приблизно 100 мг на грам насіння.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається клітина рослини за винаходом, що містить екзогенні полінуклеотиди.
Також розкрита частина рослини, переважно насіння, яка має одну або більше з наступних
Зо ознак: ї) одержана з рослини за винаходом, ії) містить ліпід, розкритий в цьому документі, ії) може використовуватися в способі за винаходом, їм) містить генетичну конструкцію за винаходом, або м) містить набір екзогенних полінуклеотидів, як визначено в цьому документі.
Ще в одному аспекті цього винаходу розкривається зріле, зібране в процесі збору урожаю насіння Вгаззіса парих, В. їнпсеа або Сатеїїмнпа взаїїма, що містить ДГК, із вмістом вологи від приблизно 4 95 до приблизно 15 мас. 95, причому вміст ДГК в насінні становить щонайменше близько 28 мг на грам насіння, переважно щонайменше близько 32 мг на грам насіння, щонайменше близько 36 мг на грам насіння, щонайменше близько 40 мг на грам насіння, більш переважно щонайменше близько 44 мг на грам насіння або щонайменше близько 48 мг на грам насіння. Максимальний вміст ДГК може становити від приблизно 80 до приблизно 100 мг на грам насіння або приблизно 80 мг або приблизно 100 мг на грам насіння.
У варіанті реалізації винаходу розкрита клітина за винаходом, трансгенний організм за винаходом, рослина олійної культури за винаходом, рослина Вгаззіса пари5, В. |Їнпсеа або
Сатвеїйнпа заїма за винаходом, частина рослини за винаходом або насіння за винаходом, які можуть застосовуватися для одержання екстрагованого ліпіду, що має одну або більше, або всі ознаки, визначені в цьому документі.
Ще в одному аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання клітини за винаходом, який включає: а) введення в клітину, переважно клітину, яка не здатна до синтезу ДЛ-ПНЖК, генної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, однієї або більш комбінацій екзогенних полінуклеотидів, визначених в цьому документі, б) необов'язково експресію генів або полінуклеотиду(ів) у клітині; в) необов'язково аналіз складу жирних кислот у клітині, і г) необов'язково селекцію клітини, яка експресує гени або полінуклеотид(и).
У варіанті реалізації винаходу ліпід в клітині має одну або більше ознак, визначених у цьому документі.
В іншому варіанті реалізації винаходу генетична конструкція, виділений та/або екзогенний полінуклеотид, вектор, генетична конструкція або комбінація екзогенних полінуклеотидів стають стабільно інтегрованими до геному клітини.
В іншому варіанті реалізації винаходу клітина є клітиною рослини, і спосіб додатково включає стадію регенерації трансформованої рослини з клітини із стадії а).
В іншому варіанті реалізації винаходу гени та/або екзогенний(ії) полінуклеотид(и) тимчасово експресуються в клітині.
Також розкрита клітина, одержана із застосуванням способу за винаходом.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання насіння, який включає: а) вирощування рослини за винаходом або рослини, яка утворює частину, розкриту в цьому документі, переважно в полі як частини популяції розміром щонайменше 1000 таких рослин або на площі щонайменше 1 гектар, насаджених із стандартною щільністю насадження, б) збір урожаю насіння з рослини або рослин, і в) необов'язково, екстракцію ліпіду з насіння, Переважно з одержанням олії із загальним виходом ДГК щонайменше 60 кг ДГК/гектар.
У варіанті реалізації винаходу рослина, клітина рослини, частина рослини або насіння за винаходом має одну або більше з наступних ознак: ї) олія є такою, як розкрито в цьому документі, ії) частина рослини або насіння можуть застосовуватися в способі за винаходом, ії) екзогенні полінуклеотиди введені в генетичну конструкцію за винаходом, ім) екзогенні полінуклеотиди включають екзогенний полінуклеотид за винаходом, м) клітина рослини є клітиною за винаходом, і мі) насіння одержане у відповідності до способу за винаходом.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання однієї або більше десатураз жирних кислот та/або елонгаз жирних кислот, або однієї або більше десатураз жирних кислот і однієї або більше елонгаз жирних кислот, причому вказаний спосіб включає експресію в клітині або неклітинній системі експресії генетичної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектору або генетичної конструкції за винаходом, однієї або більше комбінацій екзогенних полінуклеотидів, розкритих в цьому
Зо документі, переважно в насінні олійної культури, що розвивається, на рослині олійної культури в полі.
У подальшому аспекті цього винаходу розкривається ліпід або олія, продуковані або одержані із застосуванням способу за винаходом, із клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини Вгаззіса париз, В. |нпсєа або Сатвеїймпа заїїма за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом або рослини, клітини рослини, частини рослини або насіння за винаходом.
У варіанті реалізації винаходу ліпід або олія одержані екстракцією олії з олійної культури.
Приклади олії з олійних культур включають, без обмеження, олію каноли (Вгаз5іса паривх, підвид
Вгаззіса гара), олію гірчиці (Вгазбвіса |ппсеа), іншу олію Вгазвзіса 5р., соняшникову олію (Неїїапіпив аппив), льняну олію (І іпит изнагіббвітит), соєву олію (Сіусіпе тах), сафлорову олію (Сапнатизвз ііпсіогіиз), кукурудзяну олію (7еа тауз), олію тютюну (Місоїапа іабасит), арахісове масло (Агаспі5 пуродаєа), пальмову олію, бавовняну олію ((зо55урішт Впігшит), кокосове масло (Сосов писіїега), олію авокадо (Регхеа атегісапа), оливкову олію (ОІеа еигораєа), олію кеш'ю (Апасагадішт оссідепіаіє), олію макадамії (Масадатіа іпіегагіоїйа), мигдальну олію (Ргипив5 атудаа!шв) або олію насіння Агарідорвзів (Агарідорвів ІНаїіапа).
У подальшому аспекті цього винаходу розкривається жирна кислота, продукована або одержана із застосуванням способу за винаходом, з клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини Вгаззіса париз, В. нпсєа або Сатеїнпа заїїма за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, або рослини, клітини рослини, частини рослини або насіння за винаходом. Переважно жирна кислота являє собою ДГК. Жирна кислота може знаходитися в суміші жирних кислот, склад жирних кислот у якій є таким, як розкрито в цьому документі. У варіанті реалізації винаходу жирна кислота є неестерифікованою.
Також розглядається шрот, отриманий з насіння за винаходом. Переважно шрот включає, не обов'язково обмежуючись ними, шрот Вгаз5зіса пари, В. |їнпсєа, Сатеїмпа заїїма або Сіпіусіпе тах. У варіанті реалізації винаходу шрот містить екзогенний(і) полінуклеотид(и) та/або генетичні конструкції, як розкрито в цьому документі.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається композиція, що містить один або більше з ліпіду або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, генетичної конструкції за 60 винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини Вгазвзіса пари, В. їипсеа або
Сатвеіїйпа заїїма за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини, рослинної клітини, частини рослини або насіння за винаходом або макухи за винаходом. У варіантах реалізації винаходу композиція містить носій, придатний для фармацевтичного, харчового або сільськогосподарського застосування, сполуки для обробки насіння, добриво, інший харчовий продукт або поживний інгрідієнт, або додатковий білок або вітаміни.
Також розкриті харчові продукти (корми), косметика або хімічні речовини, що містять одне або більше з ліпіду або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, генетичної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини Вгаззіса пари5, В. |їнпсеа або
Сатвеіїйпа заїїма за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини рослинної клітини, частини рослини або насіння за винаходом, макухи за винаходом або композиції за винаходом.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання харчових продуктів (корму), який включає змішування одного або більше ліпідів, або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, генетичної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини Вгабзіса парих5, В. їнпсеа або Сатеїїпа займа за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини, рослинної клітини, частини рослини або насіння за винаходом, макухи за винаходом або композиції за винаходом, щонайменше із ще одним поживним інгредієнтом.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб лікування або попередження стану, при якому ПНЖК здійснюють сприятливу дію, причому вказаний спосіб включає введення суб'єкту одного або більше з ліпіду або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, генетичної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, клітини за винаходом,
Зо трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини Вгаззіса парив, В. |їнпсєа або Сатвеїїйпа заїма за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини, рослинної клітини, частини рослини або насіння за винаходом, шроту за винаходом, композиції за винаходом або харчових продуктів (корму) за винаходом.
Приклади станів, при яких ПНЖК здійснюють сприятливу дію, включають, без обмеження, серцеву аритмію, ангіопластику, запалення, астму, псоріаз, остеопороз, камені в нирках, СНІД, множинний склероз, ревматоїдний артрит, хворобу Крона, шизофренію, рак, плодовий алкогольний синдром, синдром гіперактивності і дефіциту уваги, муковісцидоз, фенілкетонурію, уніполярну депресію, агресивну ворожість, адренолейкодістрофію, захворювання коронарних судин серця, гіпертензію, діабет, ожиріння, хворобу Альцгеймера, хронічне обструктивне захворювання легенів, виразковий коліт, рестеноз після ангіопластики, екзему, гіпертонію, агрегацію тромбоцитів, шлунково-кишкову кровотечу, ендометріоз, передменструальний синдром, міалгічний енцефаломієліт, хронічну втомленість після вірусних інфекцій або захворювання очей.
Також розкрите застосування одного або більше з ліпіду або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, генетичної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини Вгаззіса парих5, В. |нпсєа або Сатеїїпа займа за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини, рослинної клітини, частини рослини або насіння за винаходом, шроту за винаходом, композиції за винаходом або харчових продуктів (корму) за винаходом для виробництва лікарського засобу для лікування або попередження стану, при якому ПНЖК здійснюють сприятливу дію. Одержання лікарського засобу може включати змішування олії за винаходом з фармацевтично прийнятним носієм, з метою лікування стану, розкритого в цьому документі. Спосіб може включати, по-перше, очищення та/або переестерифікацію олії та/або фракціонування олії з метою підвищення рівня ДГК. У конкретному варіанті реалізації винаходу спосіб включає обробку ліпіду або олії, наприклад, олії каноли, з метою перетворення жирних кислот в олії на алкілові ефіри, наприклад, метилові або етилові ефіри. Подальша обробка, наприклад, фракціонування або дистиляція, може застосовуватися для збагачення ліпіду або олії ДГК. У переважному варіанті реалізації бо винаходу лікарський засіб містить етилові ефіри ДГК. У ще більш переважному варіанті реалізації винаходу рівень етилових ефірів ДГК в лікарському засобі становить від 30 95 до 50
Фо. Лікарський засіб може додатково містити етилові ефіри ЕПК, наприклад, від 30 95 до 50 95 від загального вмісту жирних кислот в лікарському засобі. Такі лікарські засоби придатні для введення суб'єктам-людям або тваринам при лікуванні медичних станів, як розкрито в цьому документі.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб торгівлі насінням, який включає одержання насіння за винаходом і торгівлі одержаним насінням з одержанням грошової вигоди.
У варіанті реалізації винаходу одержання насіння включає культивацію рослин за винаходом та/або збір урожаю насіння з рослин.
В іншому варіанті реалізації винаходу одержання насіння додатково включає вміщення насіння до ємності та/або зберігання насіння.
У подальшому варіанті реалізації винаходу одержання насіння додатково включає перевезення насіння в інше місце.
Ще в одному варіанті реалізації винаходу спосіб додатково включає перевезення насіння в інше місце після продажу насіння.
У подальшому варіанті реалізації винаходу торгівля здійснюється з використанням електронних засобів, наприклад, комп'ютера.
Ще в одному аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання бункерів з насінням, який включає: а) валкування, рядкове компостування та/або жнива наземних частин рослин, що містять насіння за винаходом, б) молотьбу та/або віяння частин рослин, з відокремленням насіння від залишку частин рослини, і в) просівання та/або сортування насіння, відокремленого на стадії б), і завантаження просіяного та/"або сортованого насіння в бункери, з одержанням в такий спосіб бункерів із насінням.
У варіанті реалізації винаходу, якщо це доречно, ліпід або олія, переважно олія з насіння, за винаходом або придатні у відповідності до винаходу, містять приблизно такі рівні жиру, як розкрито в Таблиці в розділі Прикладів, наприклад, насіння 14 з Табл. 16.
Зо Будь-який варіант реалізації в цьому документі слід інтерпретувати як застосовний, з відповідними поправками, до будь-якого іншого варіанту, якщо конкретно не вказано інше.
Контекст цього винаходу не повинен обмежуватись конкретними варіантами, розкритими в цьому документі, які наведені тільки з метою ілюстрації. Функціонально еквівалентні продукти, композиції і способи очевидно знаходяться в межах обсягу винаходу, розкритого в цьому документі.
В цьому документі, якщо конкретно не вказано інше або з контексту очевидно не слідує інше, посилання на єдину стадію, композицію речовини, групу стадій або групу композицій речовини повинно бути інтерпретоване як включаюче однину і множину (тобто, одну або більше) таких стадій, композицій речовини, груп стадій або груп композицій речовини.
Винахід додатково розкритий за допомогою наступних необмежуючих Прикладів, з посиланням на додані графічні матеріали.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
Фігура 1. Аеробні шляхи біосинтезу ДГК.
Фігура 2. Карта ділянки вставки Т-ДНК від лівої до правої меж руР3416-5А7. КВ позначає праву межу; ІВ, ліва межа; ТЕК, ділянка термінатора транскрипції/поліаденілювання; РКО, промотор; кодуючі ділянки показані над стрілками, промотори і термінатори - під стрілками.
Місри-АбО, Дб-десатураза Місготопа5 ризійа; Ругсо-АбЕ, Дб-елонгаза Ругатітопав согаайа;
Рамза-А5БО, Д5-десатураза Раміома заїїпа; Рісра-ю30, Ф3-десатураза Ріспіа разіогіз; Рамза-А40О, да десатураза Р. заїїпа; І асКкІ-А120, А12-десатураза І аспапсеа Кіпумегі; Ругсо-А5ЗЕ, Д5-елонгаза
Ругатітопах согдаїа. МО5 позначає ділянку термінатора транскрипції/поліаденілювання нопалінсинтази Адгобасіегічт їштеїасіеп5; ЕР1, укорочений промотор напіну Вгаззіса парив;
ЕАЕЇ, промотор Агарідорзів Іаїапа ЕАЕ1; Ї есііп, ділянка термінатора транскрипції/поліаденілювання лектину Сіусіпе тах; Спії і Спі2 позначає промотор або термінатор конлініну 1 або конлініну 2 Гіпит изнаїізбзітит. ДПМ позначає ділянку прикріплення до матриксу КБ7 з Місоїапа їарасит.
Фігура 3. Карта ділянки вставки Т-ДНК від лівої до правої межі рОР3404. Позначення такі ж, як на Фіг. 2.
Фігура 4. Карта ділянки вставки від лівої до правої межі руР3367. Позначення такі ж, як на
Фіг. 2.
Фігура 5. Рівні ДГК як відсоток загальних жирних кислот в ліпіді насіння декількох незалежних трансгенних зерен Агабідорзі5 Ійаїійапа в поколіннях Т»г і Тз. Взяті в дужки події Т2 були відібрані для Тз. Проілюстровані події з генетичного оточення мутанта А. ІНаійапа Соіштбіа і тад2.
Фігура 6. Вміст олії (мас/мас) проти вмісту ДГК, як відсоток від загального вмісту жирних кислот ліпіду з трансгенних зерен Агарідорзів Шаїїапа.
Фігура 7. Характерний ЗТ-ПЛР гель, що ілюструє низьку експресію гена Аб-десатурази щодо інших трансгенів в Т-ДНК зародків В. пари5, трансформованих з використанням рОРЗ3416-сА7.
Доріжки зліва ілюструють продукти ЗТ-ПЛР: 1, ДНК маркери розміру; доріжка 2, А12-десатураза; доріжка 3, 03-десатураза; доріжка 4, Аб-десатураза (низька експресія); доріжка 5, Аб-елонгаза; доріжка 6, Д5-десатураза; доріжка 7, Д5-елонгаза; доріжка 8, Л4-десатураза.
Фігура 8. Відсоток АЛК, нанесений на графік проти відсотка олеїнової кислоти, кожен у вигляді відсотку загальних жирних кислот в ліпіді, одержаному з трансгенних 355: ЕС2 соматичних ембріонів Вгаз5іса парив.
Фігура 9. Позиційний аналіз розподілу ЯМР на А) жирі тунця і, В) олії трансгенних зерен ДГК
Агарідорзів. Піки, позначені "ДГК-альфа" представляють кількість ДГК, присутньої в положеннях 5п-1 і 5п-3 ТАГ (без позиційної переваги це дорівнювало 6 66 95 від загальної ДГК), тоді як піки, позначені "ДГК-бета" представляють кількість ДГК, присутньої в положенні 5п-2 ТАГ (без переваги це дорівнювало би 33 95 ДГК).
Фігура 10. Аналіз методом РХ-МС основних різновидів триацилгліцеролів, що містять ДГК, в трансгенному насінні, що розвивається (сірі), і зрілих (чорні), А. ІпаІгапа. Число, наступне за ДГК, позначає загальну кількість атомів вуглецю і загальну кількість подвійних зв'язків у двох інших жирних кислотах. Таким чином, ДГК/34:1 може також бути позначений як ТАГ 56:7, тощо.
Фігура 11. Карта ділянки вставки Т-ДНК від лівої до правої межі рОКЕО4-411АВОВЕС Сомреа ЕРА іпзегі. Позначення такі ж, як на Фіг.2. 55), промотор маленької субодиниці рубіско Агабідорбвів ІПаїїапа.
Фігура 12. Карта бінарного вектора роУР3364, що ілюструє рестрикційний сайт МОЇ!, в який були клоновані Д12-десатурази-кандидати.
Фігура 13. Коробчаста діаграма, що згенерована з використанням 5ідтаРіої та ілюструє
Зо відсоток жирної кислоти 20:4006 (АРК) в ліпіді насіння з популяцій насіння Т2 АгаБрідорзів, трансформованого реЕМОо45-рРЕМО50. Межа кожного прямокутника, найближча до нуля, вказує на 25-й процентиль, лінія в межах кожного прямокутника позначає медіану, і межа кожного прямокутника, найвіддаленіша від нуля, вказує на 75-й процентиль. Стовпчики помилки, наведені вище і нижче кожного прямокутника, вказують на 90-й і 10-й процентилі.
Фігура 14. Середній рівень АРК як відсоток від загального вмісту жирних кислот в ліпіді насіння з насіння Т2 Агарідорзіз, трансформованого реЕМОо45-рЕМО50О.
Фігура 15. Коробчата діаграма, що ілюструє відсоток жирної кислоти 20:206 (ЕДК) в ліпіді насіння з популяцій насіння Т2 Агарідорзі5, трансформованих рЕМО45-рЕМО50. Коробчаста діаграма представляє значення, як визначено на Фіг. 13.
Фігура 16. Коробчаста діаграма, що ілюструє відсоток АРК в ліпіді насіння з популяцій насіння Т4 Агарідорзі5, трансформованих рЕМОо45-рЕМО50. Коробчата діаграма представляє значення, як визначено на Фіг. 13.
Фігура 17. Середній рівень АРК як відсоток від загального вмісту жирних кислот в ліпіді насіння з популяцій насіння Та Агарідорзіз, трансформованого рЕМОо45-рЕеЕМО5О.
Фігура 18. Коробчаста діаграма, що ілюструє відсоток ЕДК в ліпіді насіння з популяцій насіння Агарідорзіє Т4, трансформованих рЕМОо45-рЕМО50. Коробчата діаграма представляє значення, як визначено на Фіг. 13.
Фігура 19. (А) Основна структура фітостерину з кільцем і нумерацією бічного ланцюга. (В)
Хімічні структури деяких фітостеринів.
Фігура 20. Філогенетичне дерево відомих ЛФКАТ (І РААТ).
Фігура 21. Різноманітні ферменти обміну ацилу, які переносять жирні кислоти між ФХ, пулами КоА і пулами ТАГ. Адаптовано із 5іпдп еї аї. (2005).
КЛЮЧ ДО ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
ЗЕО ІО МО: 1 - послідовність нуклеотидів руР3416-СА7.
ЗЕО ІО МО: 2 - послідовність нуклеотидів рдА7-тосй В.
ЗЕО ІО МО: З - послідовність нуклеотидів рА7-тосй С.
ЗЕО ІО МО: 4 - послідовність нуклеотидів ред7-той 0.
ЗЕО ІО МО: 5 - послідовність нуклеотидів рдА7-той Е.
ЗЕО ІО МО: 6 - послідовність нуклеотидів ред7-тодй ЕК. бо ЗЕО ІО МО: 7 - послідовність нуклеотидів рА7-той ОЦ.
ЗЕО І МО: 8 - послідовність нуклеотидів РОКЕО4-- 11АВОВЕС Сомреа ЕРА іпзеті.
ЗЕО ІЮ МО: 9 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії АТ2-десатурази
І аспапсеа Кіпумегі в рослинах.
ЗЕО І МО: 10 - А12-десатураза І аспапсеа Кішпумегі.
ЗЕО І МО: 11 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії 03-десатурази
Ріспіа разіогі5 в рослинах.
ЗЕО І МО: 12 - Фф3-десатураза Ріспіа равіогів.
ЗЕО І МО: 13 - відкрита рамка зчитування, кодуюча Аб-десатуразу Місготопах ризірНа.
ЗЕО ІЮ МО: 14 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Аб-десатурази
Місготопах ризйа в рослинах (версія 1).
ЗЕО ІЮ МО: 15 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Аб-десатурази
Місготопазх рихіПа в рослинах (версія 2).
ЗЕО І МО: 16 - Аб-десатураза Місготопах ризіПНа.
ЗЕО І МО: 17-відкрита рамка зчитування, кодуюча Аб-десатуразу О5ігеососсив Іюсітагіпив.
ЗЕО ІЮ МО: 18 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Аб-десатурази
О5ігеососсиз Іссітагіпи5 в рослинах.
ЗЕО І МО: 19 - Аб-десатураза О5ігеососсиз5 Іюсітагіпив.
ЗЕО І МО: 20 - Аб-десатураза О5ігеососсиз їашгі.
ЗЕО І МО: 21 - відкрита рамка зчитування, кодуюча Аб-елонгазу Ругатітопавх согааїа.
ЗЕО ІЮ МО: 22 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Аб-елонгази
Ругатітопаз согдага в рослинах (вкорочена на 3' кінці і кодуюча функціональну елонгазу) (версія 1).
ЗЕО ІЮ МО: 23 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Аб-елонгази
Ругатітопаз согдага в рослинах (укорочена на 3' кінці і кодуюча функціональну елонгазу) (версія 2).
ЗЕО ІЮ МО: 24 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Аб-елонгази
Ругатітопаб5 согдаїа в рослинах (вкорочена на 3' кінці і кодуюча функціональну елонгазу) (версія 3).
ЗЕО І МО: 25 - Аб-елонгаза Ругатітопах согааїа.
ЗЕО І МО: 26 - вкорочена Аб-елонгаза Ругатітопах согааа.
ЗЕО І МО: 27 - відкрита рамка зчитування, кодуюча А5-десатуразу Раміома заїїпа.
ЗЕО ІЮ МО: 28 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії А5-десатурази
Рамома заїїпа в рослинах (версія 1).
ЗЕО ІЮ МО: 29 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії А5-десатурази
Раміома заїййпа в рослинах (версія 2).
ЗЕО І МО: 30 - А5-десатураза Раміома заїїпа.
ЗЕО І МО: 31 - відкрита рамка зчитування, кодуюча А5-десатуразу Ругатітопавх согаага.
ЗЕО І МО: 32 - А5-десатураза Ругатітопавх согааїа.
ЗЕО І МО: 33 - відкрита рамка зчитування, кодуюча А5-елонгазу Ругатітопавх согааїа.
ЗЕО ІЮ МО: 34 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії А5-елонгази
Ругатітопаз согааїа в рослинах (версія 1).
ЗЕО ІЮ МО: 35 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії А5-елонгази
Ругатітопавзх согадаїа в рослинах (версія 2).
ЗЕО ІЮ МО: 36 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії А5-елонгази
Ругатітопавх согдаїйа в рослинах (версія 3).
ЗЕО І МО: 37 - Аб-елонгаза Ругатітопах согааїа.
ЗЕО І МО: 38 - відкрита рамка зчитування, кодуюча Л4-десатуразу Раміома заїїпа.
ЗЕО ІЮ МО: 39 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Л4-десатурази
Рамома заїїпа в рослинах (версія 1).
ЗЕО ІЮ МО: 40 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Л4-десатурази
Раміома заїїпа в рослинах (версія 2).
ЗЕО І МО: 41 - Д4-десатураза Раміома заїїпа.
ЗЕО І МО: 42 - відкрита рамка зчитування, кодуюча Ло9-елонгазу Ізоспгузі5 даіІбапа.
ЗЕО І МО: 43 - Д9У-елонгаза Ізоспгузів даІрапа.
ЗЕБЕО 10 МО: 44 - відкрита рамка зчитування, кодуюча ЛО-елонгазу Ептіййапіа Пихіеуї
ССМРІ1516.
ЗЕО ІЮ МО: 45 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії ЛУ-елонгази
Етійапіа пихіеуї в рослинах.
ЗЕО І МО 46 - ДУ-елонгаза Етійапіа пихіеуї ССМР1516. бо ЗЕО І МО 47 - відкрита рамка зчитування, кодуюча Де9-елонгазу Раміома ріпдиів5.
ЗЕО І МО 48 - ДУ-елонгаза Раміома ріпдцпів.
ЗЕО І МО 49 - відкрита рамка зчитування, кодуюча ДЛ9-елонгазу Раміома заїїпа.
ЗЕО І МО 50 - Д9У-елонгаза Раміома заїїпа.
ЗЕО І МО 51 - відкрита рамка зчитування, кодуюча Ав-десатуразу Раміома заїїпа.
ЗЕО І МО 52 - Дв-десатураза Раміома заїїпа.
ЗЕО І МО 53 - вірусний супресор Р19.
ЗЕО І МО 54 - вірусний супресор М2.
ЗЕО І МО 55 - вірусний супресор РЗ8.
ЗЕО І МО 56 - вірусний супресор Ре-РО.
ЗЕО І МО 57 - вірусний супресор КРУ-РО.
ЗЕО І МО 58 - відкрита рамка зчитування, кодуюча вірусний супресор Р19.
ЗЕО І МО 59 - відкрита рамка зчитування, кодуюча вірусний супресор М2.
ЗЕО І МО 60 - відкрита рамка зчитування, кодуюча вірусний супресор РЗ8.
ЗЕО І МО 61 - відкрита рамка зчитування, кодуюча вірусний супресор Ре-РО.
ЗЕО І МО 652 - відкрита рамка зчитування, кодуюча вірусний супресор КРУ-РО.
ЗЕО ІО МО 63 - ЛФКАТ2 Агабрідорвів ІНайііапа.
ЗЕО ІО МО 64 - ЛФКАТ І ітпапінез аївра.
ЗЕО ІЮ МО 65 - ЛФКАТ Засспаготусез сегемівіає.
ЗЕО ІО МО 66 - ЛФКАТ Місгтотопаз ризіПа.
ЗЕО ІО МО 67 - ЛФКАТ Мопієге!Іа аїріпа.
ЗЕО ІО МО 68 - ЛФКАТ Вгассіза парив.
ЗЕО ІО МО 69 - ЛФКАТ Вгазвіса парив.
ЗЕО І МО 70 - 3 десатураза Рпуїоріїнога іпіевіапв.
ЗЕО І МО 71 - 3 десатураза Таїіазвіозіга рсендопапа.
ЗЕО І МО 72 - 3 десатураза РушШйішт іггедшіаге.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Загальні способи і визначення
Якщо конкретно не визначено інше, всі технічні і наукові терміни, використані в цьому документі, слід розуміти, як маючі таке ж значення, якого завжди надає їм середній фахівець в
Зо даній галузі техніки (наприклад, в культивуванні клітин, молекулярній генетиці, синтезі жирних кислот, трансгенних рослинах, хімії білка і біохімії).
Якщо не вказано інше, рекомбінантний білок, культура клітин та імунологічні методи, що використовуються в цьому винаході, являють собою стандартні способи, добре відомі фахівцям з рівня техніки. Такі методики описані і пояснені в літературних джерелах, наприклад, -. Регваї,
А Ргасіїса! Сціде то МоїІесшіаг Сіопіпуд, Уопп Умієеу апа Зопз5 (1984), У. Затбгоок еї аї!., МоіІесшціаг
Сіопіпд: А Гарогаїгу Мапиаї, Соїа 5ргіпд Нагроиг І арогафогу Ргезз (1989), Т.А. Вгом/п (редактор),
Еззепіа! МоїІесшаг Віоіоду: А РгасіїсаІ Арргоасії, МоЇїштез 1 апа 2, ІК Ргез5 (1991), О.М. Сіомег апа В.О. Натез (редактори), ОМА Сіопіпд: А РгасіїсаІ! Арргоасі, Моїштез 1-4, ІК Ргез5 (1995 і 1996), Е.М. А!йзибеї! еї аїЇ. (редактори), Сшитепі РгоїосоЇ5 іп МоїІесшаг Віоіоду, Сгеепе Риб.
Авзосіаїе5 апа УМіеу-Іпіегесіепсе (1988, включаючи всі видання до сьогоднішнього дня), Еа
Напомж апа Оамій Гапе (редактори), Апііродіеє: А Гарогаїгу Мапиаї, Соїй Зргіпд Нагроиг
І арогагогу, (1988) і У.Е. Соїїдап еї а. (редактори), Ситепі Ргоїосої5 іп Іпттипоїоду, допп Уміеу 5 зоп5 (включаючи всі видання до сьогоднішнього дня).
Термін "та/або", наприклад, "Х та/або У" слід розуміти, як такий, що позначає будь-яке з "Хі "або "Х або У", і його слід інтерпретувати як явно підтримуючий обидва значення або будь-яке із значень.
В цьому документі термін "близько", якщо не вказано протилежне, позначає --/- 10 95, більш переважно ч-/- 5 95, більш переважно ч«/- 1 95 від наведеного значення.
В цьому документі слово "включають" або його варіації, наприклад, "включає" або "який включає" слід розуміти, як таке, що позначає включення заявленого елементу, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій, але не виключення будь-якого іншого елементу, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій.
Деякі визначення
В цьому документі терміни "екстрагований рослинний ліпід" і "виділений рослинний ліпід" позначають ліпідну композицію, що виділена, наприклад, шляхом подрібнення, з рослини або її частини, такої як насіння. Екстрагований ліпід може являти собою відносно неочищену композицію, одержану, наприклад, шляхом подрібнення насіння рослини, або більш очищену композицію, з якої більшість, якщо не всі з одного або більше або кожного із води, нуклеїнових кислот, білків і вуглеводів, що походять з рослинного матеріалу, видалені. Нижче розкриті бо приклади способів очищення. У варіанті реалізації винаходу екстрагований або виділений рослинний ліпід містить щонайменше приблизно 60 95, щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 90 95, або щонайменше приблизно 95 мас./мас. 95 ліпіду в композиції. Ліпід може бути твердим або рідким за кімнатної температури, якщо він є рідиною, то має назву олії. У варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід за винаходом не змішується з іншим ліпідом, наприклад, ДГК, що не продукованою іншим джерелом (наприклад, ДГК з риб'ячого жиру). У варіанті реалізації винаходу після екстракції одне або більше або всі із співвідношень олеїнова кислота : ДГК, пальмітинова кислота : ДГК, лінолева кислота : ДГК, і загальні 06 жирні кислоти : загальні 03 жирні кислоти, істотною мірою не змінюються (наприклад, не більш, ніж 10 95 або 5 95 змін), в порівнянні із співвідношенням в інтактному насінні або клітині. В іншому варіанті реалізації винаходу екстрагований рослинний ліпід не обробляється процедурою, такою як гідрогенізація або фракціонування, яка може змінити одне або більше або всі із співвідношень олеїнова кислота : ДГК, пальмітинова кислота : ДГК, лінолева кислота : ДГК і загальні 0б жирні кислоти : загальні 03 жирні кислоти, в порівнянні із співвідношенням в інтактному насінні або клітині. Якщо екстрагований рослинний ліпід за винаходом міститься в олії, олія може додатково містити молекули, що не є жирними кислотами, наприклад, стероли.
В цьому документі терміни "екстрагована рослинна олія (масло)" і "виділена рослинна олія (масло)" позначають речовину або композицію, що містить екстрагований рослинний ліпід або виділений рослинний ліпід, що є рідким за кімнатної температури. Олію одержують з рослини або її частини, наприклад, насіння. Екстрагована або виділена олія може являти собою відносно неочищену композицію, одержану, наприклад, шляхом подрібнення насіння рослини, або більш очищену композицію, з якої більшість, якщо не всі, з одного або більше або кожного із води, нуклеїнових кислот, білків і вуглеводів, що походять з рослинного матеріалу, видалені.
Композиція може містити інші компоненти, що можуть бути ліпідними або неліпідними. У варіанті реалізації винаходу олійна композиція містить щонайменше приблизно 60 9б5, щонайменше приблизно 70 95, щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 90 95, або щонайменше приблизно 95 мабс./мас. 95 екстрагованого рослинного ліпіду. У варіанті реалізації винаходу екстрагована олія за винаходом не змішується з іншим маслом, таким як
ДГК, не продукована іншим джерелом (наприклад, ДГК з риб'ячого жиру). У варіанті реалізації
Зо винаходу, після екстракції одне або більше або всі із співвідношень олеїнова кислота : ДГК, пальмітинова кислота: ДГК, лінолева кислота: ДГК і загальні 0б жирні кислоти : загальні 03 жирні кислоти істотно не змінюються (наприклад, не більше, ніж 10 95 або 5 95 змін), в порівнянні із співвідношенням в інтактному насінні або клітині. В іншому варіанті реалізації винаходу екстраговану олію рослини не обробляють процедурою, такою як гідрогенізація або фракціонування, яка може змінювати одне або більше або всі із співвідношень олеїнова кислота : ДГК, пальмітинова кислота: ДГК, лінолева кислота: ДГК і загальні 0б жирні кислоти : загальні 03 жирні кислоти, в порівнянні із співвідношенням в інтактному насінні або клітині. Екстрагована рослинна олія за винаходом може містити молекули, що не є жирними кислотами, наприклад, стероли.
В цьому документі "олія (масло)" являє собою композицію, що містить в основному ліпід і є рідкою за кімнатної температури. Наприклад, олія за винаходом переважно містить щонайменше 75 95, щонайменше 80 95, щонайменше 85 95 або щонайменше 90 мас. 95 ліпіду.
Як правило, очищена олія містить щонайменше 90 мас. 95 триацилгліцеролів (ТАГ), від вмісту ліпіду в олії. Мінорні компоненти олії, такі як діацилгліцероли (ДАГ,, вільні жирні кислоти (ВЖК), фосфоліпід і стероли, можуть бути присутніми, як розкрито в цьому документі.
В цьому документі термін "жирна кислота" позначає карбонову кислоту (або органічну кислоту), часто з довгим аліфатичним хвостом, насиченим або ненасиченим. Зазвичай жирні кислоти містять ланцюг вуглець-вуглецевих зв'язків завдовжки щонайменше 8 атомів вуглецю, більш переважно завдовжки щонайменше 12 атомів вуглецю. Більшість жирних кислот, що зустрічаються в природі, містить парну кількість атомів вуглецю, оскільки в їх біосинтезі приймає участь ацетат, що містить два атоми вуглецю. Жирні кислоти можуть бути у вільному стані (неестерифіковані) або в естерифікованій формі, наприклад, як частина тригліцеролу, діацилгліцеролу, моноацилгліцеролу, зв'язки з ацил-КоА (тіоефір) або іншої форми зв'язку.
Жирна кислота може бути естерифікованою як фосфоліпід, наприклад, форми фосфатидилхоліну, фосфатидилетаноламіну, фосфатидилсерину, фосфатидилгліцеролу, фосфатидилінозитолу або дифосфатидилгліцеролу. "Насичені жирні кислоти" не містять подвійних зв'язків або інших функціональних груп уздовж ланцюга. Термін "насичений" позначає водень, з тим, що всі атоми вуглецю (окрім групи карбонової кислоти І-СООНІ) містять максимально можливу кількість водню. Іншими словами,
омега (0)) кінець містить З атоми водню (СНЗ-), і кожен атом вуглецю в межах ланцюга містить 2 атоми водню (-СН2-). "Ненасичені жирні кислоти" за формою подібні до насичених жирних кислот, за винятком того, що одна або більше алкенових функціональних груп присутні вздовж ланцюга, причому кожен алкен замінює одинарний зв'язок "-СН2-СН2г-" частини ланцюга подвійним зв'язком "-
СН-СН-" (тобто, вуглець приєднаний подвійним зв'язком до іншого атома вуглецю). Два наступні атоми вуглецю в ланцюгу, які приєднані до кожної із сторін подвійного зв'язку, можуть бути присутніми в цис- або транс-конфігурації.
В цьому документі термін "мононенасичена жирна кислота" позначає жирну кислоту, що містить щонайменше 12 атомів вуглецю у вуглецевому ланцюгу, і лише одну алкенову групу (подвійний вуглець-вуглецевий зв'язок) в ланцюгу. В цьому документі терміни "поліненасичена жирна кислота" або "ПНЖК" позначають жирну кислоту, яка містить щонайменше 12 атомів вуглецю у вуглецевому ланцюгу і щонайменше дві алкенові групи (подвійні вуглець-вуглецеві зв'язки).
В цьому документі терміни "довголанцюгова поліненасичена жирна кислота" і "ДЛ-ПНЖК" позначають жирну кислоту, яка містить щонайменше 20 атомів вуглецю у вуглецевому ланцюгу і щонайменше два подвійні вуглець-вуглецевих зв'язки, і таким чином включають ДДЛ-ПНЖК. В цьому документі терміни "поліненасичена жирна кислота з дуже довгим ланцюгом" і "ДДЛ-
ПНЖК" позначають жирну кислоту, яка містить щонайменше 22 атоми вуглецю у вуглецевому ланцюгу їі щонайменше три подвійні вуглець-вуглецевих зв'язки. Звичайно, кількість атомів вуглецю у вуглецевому ланцюгу жирних кислот відноситься до нерозгалуженого вуглецевого ланцюга. Якщо вуглецевий ланцюг розгалужений, кількість атомів вуглецю виключає атоми вуглецю бічних груп. В одному варіанті реалізації винаходу довголанцюгова поліненасичена жирна кислота являє собою 03 жирну кислоту, тобто, містить десатурацію (подвійний вуглець- вуглецевий зв'язок) в положенні третього вуглець-вуглецевого зв'язку від метильного кінця жирної кислоти. В іншому варіанті реалізації винаходу довголанцюгова поліненасичена жирна кислота є 0б жирною кислотою, тобто, містить десатурацію (подвійний вуглець-вуглецевий зв'язок) в положенні шостого вуглець-вуглецевого зв'язку від метильного кінця жирної кислоти.
В іншому варіанті реалізації винаходу довголанцюгова поліненасичена жирна кислота вибрана з групи, що складається з: арахідонової кислоти (АРК, 20:4А5,8,11,14; 06), ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК, 20:4Д8,11,14,17, 03), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК, 20:5Д5,8,11,14,17; 03), докозапентаєнової кислоти (ДПК, 22:5А7,10,13,16,19, 03) або докозагексаєнової кислоти (ДГК, 22:6Л4,7,10,13,16,19, 03). Крім того, ДЛА-ПНЖК можуть являти собою дигомо-у-лінолеву кислоту (ДГЛК) або ейкозатриєнову кислоту (ЕТрК, 20:3А11,14,17, 03). Буде очевидно, що ДЛ-ПНЖК, одержана у відповідності до винаходу, може бути сумішшю будь-яких або всіх згаданих вище сполук, і може містити іншу ДЛ-ПНЖК або похідні будь-якої з наведених ДЛ-ПНЖК. В переважному варіанті реалізації винаходу 3 жирні кислоти являють собою щонайменше ДГК, переважно ДПК і ДГК або ЕПК, ДПК і ДГК.
Додатково, в цьому документі терміни "довголанцюгова поліненасичена жирна кислота" і "поліненасичена жирна кислота з дуже довгим ланцюгом" позначають жирну кислоту, що знаходиться у вільному стані (неестерифіковану) або в естерифікованій формі, наприклад, як частина тригліцеролу, діацилгліцеролу, моноацилгліцеролу, зв'язки з ацил-КоА (тіоефір) або іншої форми зв'язку. Жирна кислота може бути естерифікованою як фосфоліпід, наприклад, форми фосфатидилхоліну (ФХ), фосфатидилетаноламіну, фосфатидилсерину, фосфатидилгліцеролу, фосфатидилінозитолу або дифосфатидилгліцеролу. Тому, ДЛ-ПНЖК може бути присутньою як суміш форм в ліпіді клітини або очищеній олії або ліпіді, екстрагованих з клітин, тканин або організмів. У переважних варіантах реалізації винаходу розкривається олія, що містить щонайменше 75 95 або щонайменше 85 95 триацилгліцеролів, причому решта представлена іншими формами ліпіду, такими як згадані вище, у яких присутні щонайменше вказані триацилгліцероли, що містять ДЛ-ПНЖК. В подальшому олія може бути додатково очищена або оброблена, наприклад гідролізом із сильною основою, з метою вивільнення вільних жирних кислот, або дистиляцією, тощо.
В цьому документі вираз "загальні б жирні кислоти" або "загальний вміст 0б жирних кислот" або подібний позначає суму всіх 006 жирних кислот, естерифікованих і неестерифікованих, в екстрагованому ліпіді, олії, рекомбінантній клітині, частині рослини або насінні, як визначається контекстом, виражену як відсоток від загального вмісту жирних кислот.
Вказані б жирні кислоти включають ( за наявності) ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК ї о6-ДПК, але виключають будь-які 03 жирні кислоти і мононенасичені жирні кислоти.
В цьому документі вираз "нові 0б жирні кислоти" або "вміст нових об жирних кислот" або бо подібний позначає суму всіх 0б жирних кислот, за винятком ЛК, естерифікованих і неестерифікованих, в екстрагованому ліпіді, олії, рекомбінантній клітині, частині рослини або насінні, як визначається контекстом, виражену, як відсоток від загального вмісту жирних кислот.
Такі нові 06 жирні кислоти є жирними кислотами, продукованими в клітинах, рослинах, частинах рослини і насінні за винаходом шляхом експресії генетичних конструкцій (екзогенні полінуклеотиди), введених в клітини, і включають (за наявності) ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК ї об-ДПК, але виключають ЛК і будь-які 03 жирні кислоти і мононенасичені жирні кислоти. Характерний загальний вміст 0б жирних кислот і вміст нових 0б жирних кислот визначається за перетворенням жирних кислот у зразку на МЕЖК і результатами аналізу ГХ, як розкрито в
Прикладі 1.
В цьому документі вираз "загальні 03 жирні кислоти" або "загальний вміст 03 жирних кислот" або подібний позначає суму всіх 003 жирних кислот, естерифікованих і неестерифікованих, в екстрагованому ліпіді, олії, рекомбінантній клітині, частині рослини або насінні, як визначається контекстом, виражену, як відсоток від загального вмісту жирних кислот.
Такі 03 жирні кислоти включають (якщо вони присутні) АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК ії ДГК, і виключають будь-які б жирні кислоти і мононенасичені жирні кислоти.
В цьому документі вираз "нові 03 жирні кислоти" або "вміст нових 03 жирних кислот" або подібний позначає суму всіх 003 жирних кислот, за винятком АЛК, естерифікованих і неестерифікованих, в екстрагованому ліпіді, олії, рекомбінантній клітині, частині рослини або насінні, як визначається контекстом, виражену, як відсоток від загального вмісту жирних кислот.
Такі нові 3 жирні кислоти є жирними кислотами, продукованими в клітинах, рослинах, частинах рослин і насінні за винаходом шляхом експресії генетичних конструкцій (екзогенні полінуклеотиди), введених в клітини, і включають (якщо вони присутні) СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК,
ДПК ї ДГК, але виключають АЛК і будь-які 0б жирні кислоти і мононенасичені жирні кислоти.
Характерний загальний вміст 03 жирних кислот і вміст нових 03 жирних кислот визначається за перетворенням жирних кислот у зразку на МЕЖК їі результатами аналізу ГХ, як розкрито в
Прикладі 1.
Білки десатураза, елонгаза і ацилтрансфераза та гени, що кодують їх, які можуть застосовуватися у відповідності до винаходу, є будь-якими з відомих в рівні техніки або їх гомологами або похідними. Приклади таких генів і розмір кодованих білків наведені в Табл. 1.
Зо Ферменти десатурази, для яких продемонстровано участь в біосинтезі ДЛ-ПНЖК, всі належать до групи так званих "Ггопі-епа" десатураз.
В цьому документі термін "Шїопі-епа десатураза" позначає члена класу ферментів, які вводять подвійний зв'язок між карбоксильною групою і вже існуючою ненасиченою частиною ацильного ланцюга ліпідів, які структурно характеризуються присутністю домену М-кінцевого цитохром Б5, разом з типовим доменом десатурази жирних кислот, що містить три високою мірою консервативних гістидинових бокси (Маріеєг еї аї., 1997).
Активність будь-якої з елонгаз або десатураз для застосування у відповідності до винаходу може бути протестована шляхом експресії гена, що кодує фермент, в клітині, такій як, наприклад, дріжджова клітина, рослинна клітина, або переважно в соматичних ембріонах або трансгенних рослинах, і визначення того, чи має клітина, ембріон або рослина підвищеною здатністю до продукування ДЛ-ПНЖК, в порівнянні з аналогічною клітиною, ембріоном або рослиною, у яких фермент не експресується.
В одному варіанті реалізації винаходу одна або більше десатураз та/або елонгаз для застосування у відповідності до винаходу можуть бути одержані з мікроводорості і очищені, тобто мати послідовність амінокислот, ідентичну поліпептиду, який може бути одержаний з мікроводорості і очищений.
Хоча деякі ферменти конкретно розкриваються в цьому документі як "біфункціональні", відсутність такого терміну не обов'язково означає, що конкретний фермент не має іншу активність, окрім конкретно розкритої.
Десатурази
В цьому документі термін "десатураза" позначає фермент, що здатний вводити подвійний вуглець-вуглецевий зв'язок до ацильної групи жирнокислотного субстрату, який звичайно знаходиться в естерифікованій формі, наприклад, ефіри ацил-КоА. Ацильна група може бути естерифікована до фосфоліпіду, наприклад, фосфатидилхолін (ФХ), або до білка-носія ацилу (БНА), або, в переважному варіанті реалізації винаходу, до КоА. Десатурази загалом можуть бути розділені на три групи, відповідно. В одному варіанті реалізації винаходу десатураза являє собою їгопі-епа десатуразу.
В цьому документі "Д4-десатураза" позначає білок, який здійснює реакцію десатурації із введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 4-го вуглець-вуглецевого зв'язку бо від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Щонайменше "А4-десатураза" здатна перетворювати ДПК на ДГК. Стадія десатурації з утворенням ДГК з ДПК каталізується Д4- десатуразою в організмах, що не відносяться до ссавців, і ген, що кодує даний фермент, виділений із виду прісноводних найпростіших Еидієпа дгасіїї5 і морських видів Тпгаивіоспуїгічт (Оїм еї аїЇ., 2001; Меуег еї аЇ., 2003). В одному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Л4-десатурази відповідає представленій в 5ЕО ІЮО МО: 41, або Д4-десатуразі виду
Тигаивіоспуїсіцт, її біологічно активному фрагменту або послідовності амінокислот, щонайменше на 80 95 ідентичній 5ЕО ІЮ МО: 41.
Таблиця 1
Клоновані гени, що беруть участь в біосинтезі ДЛА-ПНЖК
Фермент Тип організму Номери Розмір Посилання доступу (білка (ак) да-десатураза| Найпростіші (Еидієпадтасіїв | АМ278558 Меуєег еї а!., 2003 01 Водорості |Раміома ІшїПегії АУЗ332747 Топоп е! а!., 2003 1 Пвосігувів даірапа АдДУЗ33631 Регеїга ві а!., 20046 11110171 |Рамомавайна | ААМ15136 7поц еїа!., 2007
ААМ75707
Траустохітри- | Тпгаивіоспуїйнит ААМ75708 дієві ашеийт ААМ75709 515 Отсутствуют
ААМ75710
Тпигаийивіоснуїніит 5р. . . . Со еїга!., 1999р
Міспає!5оп еї аї.,
Саєпотарайїйів АРГ11440, 19986;
Нематода еіедапо ММ 069350 441 У/айнв5 апа Вгомузе, 1999р
Міспає!5оп еї аї.,
Гриби Мопіегеїа аіІріпа АгРО67654 446 1998а;
Кпиїг2оп єї а!., 1998 0 ТРуїйіцт ітедшіаге АЕ419297 Нопо ві а!., 2002а дівсоїдент 77711117 |Заргоівопіадієїна. | | 470 |МО0гов1668 . - |Рпаєодасу т Ротегаие еї аї., 01 Водорості | Тнгайвіоспуїйішт 5р. | АЕ489588 Ом ві а!., 2001 ашгейт 77111117 Пвоспгувівдайрала.ї// | | 442 |МО0гов1668
Мох | Магспапа дуБ83465| 484 |Каїїкама е! аі., 2004 роїтутогріа . . Со ега!., 1999а; 71111117 |Мивтивсшив ММ 019699 Спо ега!., 1999а вівдапз 0000 Рослини / |Вогадо ойісіпа!е5 079010 Зауапома ві а!., 1997
Еспішт АХО55117 Сагсіа-Магою 6ї аї.,
АМО55118 2002 11017711 |Рбтшахміай | АУ234127 Зауапома ві а!., 2003 11111111 ТАпетопе Іємеїві АЕ536525 МУпіпеу ві а!., 2003 11111110 Мохи // |Сегаюдопригритецв / 250735 Зрепіпа еї а!., 2000
Магспапа дуб83463| 481 |Каїкама е! аі., 2004 роїтутогріа 1 ТРіпувсотіїнеїа раїєп5 | САА110О33 Сіїке єї а!., 1998
Таблиця 1
Клоновані гени, що беруть участь в біосинтезі ДЛА-ПНЖК
Фермент Тип організму Номери Розмір Посилання доступу (білка (ак)
Ниапа єї а!., 1999;
Гриби Мопіеєгеїа аіІріпа АР110510 457 зЗаКигаадапі еї аї.,
АвОг2г0ОЗ2 1999 1 ТРУШІШт іпедиіаге АЕ419296 Нопа ві а!., 2002а 1 ЇМисог сіїсіпеПІоідев АВОБ20О86 МОВІ" 11111171 Ф|видвпідориз | АУЗ2ог288 7папо ега!., 2004 77771711 |Заргоівопіаадієїпта,. | | 453 |МО0г2о81668 . - |РНаєдасіушт Ротегаие еї аї., 11111111. | Бактерії |Зупеспосувів./////// 111421 Ведду е! а!., 1993 ашеит
Біфункціональ на Д5/Дб- Бапіо гетпіо АРЗ309556 444 Навінпоз сеї а!., 2001 десатураза
С20 дВ- . «і мав апа Вгомузе, 01 Рослини |Вогадо ойісіпа!є5 АДО43277 Орепіпо еї а!., 2001 01000 Мохи 0 |Рбузсотіїеїіа раїєпе5 | АЕ428243 7апк еї а!., 2002
Магспапна АУБВЗАбА Каїкама е! а!., 2004 роїтутогріа 11111111. | Водорості |Раміома ше" | 8501 |МОо3078639 1 ТТвгавіоснумт АХ9О51565 МО 03093482 вид бою) АХ214454 УКО 0159128
Тпгаиймвіоспуїнит пНжЖк- . . Ї еопага єї а!., 20006; 11111171 |Вайивпомедісив | АВО71985 Іпадакі еї аї., 2002 11111111 |Вайивпомедісив" | АВО71986 Іпадакі еї а!., 2002 11110171 |Мивтивсшив | АРТ70907 Тугаїк ега!., 2000 11111107 |Мивтивсшив АР Т70908 Тугаїк ега!., 2000 77111111. | Риба |Оапіотейо | АЕБЗ2782 |291 (282) Адараєгаї., 2004 11110171 |Оапіотейо" ММ 199532 Г.о еїаі., 2003 ' Саєпотарайїйів АРрБбої еї а!., 1998 10177111 |Рамомашней" | 320 |М0о3078639
Івоспгувзіз даірбапа АЕ390174 ОЇ ві а!., 2002 11111117 |Ейдіепадгасів///// | 7777700 | 258 |МОовл2вга
ААУб7 798 Меуєег еї а!., 2004 11111011 |Ругатітопавсоюаю| | 268 |МО 2010/057246 1 Івид Рамоума ССМРАБ9|Ї ДАМ33630 Регеїга ві а!., 20046 11110171 |Рамомавайна | ААМ15155 Вореті ві а!., 2009 роеидопапа 100 Риба ІОпсотупспив туків5 | САМ55862 МО 06/008099
Мох о |Магспапа ВАЕ71129 Какама е! а!., 2006 роїтутогріа
" перулумли. порі. піт.пійп.дом/ "7" Функція не доведена/не продемонстрована
В цьому документі "Д5-десатураза" позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 5-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Приклади "А5-десатураз" наведені в Еціз-
І оре; еї аї. (2012) і Реїгіє єї аї. (2010а), а також у Табл. 1 цього документу. В одному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Д5-десатурази відповідає представленій в ХЕ
ІО МО: 30, її біологічно активному фрагменту або послідовності амінокислот, щонайменше на 80
Фо ідентичній БЕО ІЮО МО: 30. В іншому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот
Д5-десатурази відповідає представленій ЗЕО ІЮО МО: 32, її біологічно активному фрагменту, або послідовності амінокислот, щонайменше на 53 95 ідентичній 560 ІЮО МО: 32. В іншому варіанті реалізації винаходу Д5-десатураза одержана з виду Тпгаизіоспуїгічт або Ептіїапіа пихіеуї.
В цьому документі "Дб-десатураза" позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 6-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Приклади Аб-десатураз наведені в Еціз-
І оре; еї аї. (2012) і Реїгіє єї аї. (2010а), а також в Табл. 1 цього документу. Переважні Дб- десатурази одержані з Місготопах ризіПа, Руїпішт ігедшиіаге або О5ігеососсиз Зацгії.
У варіанті реалізації винаходу Дб-десатураза додатково характеризується наявністю щонайменше двох, переважно всіх трьох і переважно в рослинній клітині, з наступного: ії) вища активність Дб-десатурази по відношенню до с-ліноленової кислоти (АЛК, 18:349,12,15, Ф3), ніж по відношенню до лінолевої кислоти (ЛК, 18:249,12, б) як жирнокислотного субстрату; ії) вища активність Дб-десатурази по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної в положенні 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату; іїії) активність Д8-десатурази по відношенню до ЕТрК. Приклади таких Аб-десатураз наведені в
Табл. 2.
У варіанті реалізації винаходу Дб-десатураза має вищу активність по відношенню до 03 субстрату, ніж по відношенню до відповідного 0б субстрату, і має активність по відношенню до
АЛК з утворенням октадекатетраєнової кислоти (стеаридонова кислота, СДК, 18:4Д6,9,12,15, 03), з ефективністю щонайменше 30 95, більш переважно щонайменше 40 95, або найбільш
Зо переважно щонайменше 50 95, при експресії з екзогенного полінуклеотиду в рекомбінантній клітині, такій як рослинна клітина, або щонайменше 35 95 при експресії в дріжджовій клітині. В одному варіанті реалізації винаходу Дб-десатураза має вищу активністю, наприклад, щонайменше приблизно в 2 рази вищу активність Аб-десатурази по відношенню до АЛК, ніж по відношенню до ЛК як жирнокислотного субстрату. В іншому варіанті реалізації винаходу Дб- десатураза має вищу активність, наприклад, щонайменше приблизно в 5 разів вищу активність
Дб-десатурази або щонайменше в 10 разів вищу активність по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної в положенні 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату. В іншому варіанті реалізації винаходу, ЛДб-десатураза має активність по відношенню до обох жирнокислотних субстратів - АЛК-КоА і АЛК, приєднаних в положенні 5п-2 ФХ.
Таблиця 2
Десатурази, які продемонстрували активність на субстраті ацил-КоА тен ення ря З дення доступу (аю . МапіопієЇїа Нойтант ев аї., 110 онеоежннтви дюн ери
Реїне вї аї.,
Містотопаз ривіїїа | ЕЕНЬ8637 2010а (ЗЕО ІЮ
МО: 13 . МапіопієЇїа Нойтант ев аї., рен феенеююню нини, 00
Таблиця 2
Десатурази, які продемонстрували активність на субстраті ацил-КоА сени Феснентя ви 000 (ее Гнееие ененя доступу (аю
Руштійт Хивє еї а!., 2012; 71 (бо июня педа
Гриби Рпуюрптога Хивє еї а!., 2012; 00 езищев о |шлошто мем) зв Одоовюввввь.
В одному варіанті реалізації винаходу Аб-десатураза не має активність Д5-десатурази по відношенню до ЕТК, яка могла би бути виявлена. В іншому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Дб-десатурази представлена ЗЕО ІЮ МО: 16, 5ЕО ІЮО МО: 19 або 5ЕО
ІО МО: 20, їх біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 77 У5 ідентичною 5ЕО ІЮ МО: 16, ЗЕО ІЮ МО: 19 або 5ЕО ІО МО: 20. В іншому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот ДЛб-десатурази представлена 5ЕО ІЮ МО: 19 або 5ЕО ІЮ
МО: 20, їх біологічно активним фрагментом або послідовністю амінокислот, щонайменше на 67
Фо ідентичною одній або обом з 5ЕО ІЮ МО:19 або 5ЕО ІЮО МО: 20. Крім того, ДАб-десатураза може володіти активністю Д8-десатурази.
В цьому документі "Дв-десатураза" позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 8-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Щонайменше Д8-десатураза здатна перетворювати ЕТрК на ЕТК. Приклади Д8-десатураз наведені в Табл. 1. В одному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот л8-десатурази відповідає представленій 5ЕО ІЮ
МО: 52, її біологічно активним фрагментом або послідовності амінокислот, щонайменше на 80 95 ідентичній ЗЕО ІЮО МО: 52.
В цьому документі "юЗ3-десатураза" позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вугллецевого зв'язку в положенні 3-ого вуглець-вуглецевого зв'язку від метилового кінця жирнокислотного субстрату. Таким чином, Фю3-десатураза може перетворювати ЛК на АЛК і ГЛК на СДК (всі С18 жирні кислоти), або ДГЛК на ЕТК та/або АРК на
ЗПК (020 жирні кислоти). Деякі 03-десатурази (група І) володіють активністю тільки на С18 субстратах, таких як рослинні і ціанобактеріальні 03-десатурази. Такі о3-десатурази також є
Д15-десатуразами. Інші 3-десатурази виявляють активність на субстратах С20 без активності (група Ії) або з деякою активністю (група Ії) на субстратах С18. Такі о3-десатурази також є А17- десатуразами. Переважними о03-десатуразами є група Ії типу, яка перетворює ЛК на АЛК, ГЛК на СДК, ДГЛК на 9ТК ї АРК на ЗПК, наприклад, Ріспіа равіогі5 Ф3-десатураза (5ЕО ІО МО: 12).
Приклади Ф3-десатураз включають описані Регеїга єї аї. (2004а) (03-десатураза ЗаргоІедпіа дісіїпа, група ІІ), Ногідиспі еї аї. (1998), Вегбегісп еї аїЇ. (1998) і Бруспайа еї аї. (1997) (03-
Зо десатураза С. еієдап5, група І). В переважному варіанті реалізації винаходу 03-десатураза являє собою грибкову д03-десатуразу. В цьому документі "грибкова ою3-десатураза" позначає 0шЗ3-десатуразу, одержану з грибкового джерела, в тому числі, ооміцетного джерела, або її варіант з послідовністю амінокислот, щонайменше на 95 95 ідентичною їй. Гени, що кодують численні о3-десатурази, виділені з грибкових джерел, таких як, наприклад, РПпуюрпїщтога іптебїап5 (номер доступу САУЗО870, УМО2005083053; ЗЕО ІЮ МО: 70), Заргоіеопіа дісіїпа (номер доступу ААК20444, Регеїга еї аІ., 2004а і патент США Мо 7211656), Руїйішт ітедшаге (М/О2008022963, Група І; 5ЕОІО МО: 72), МогіегеїІа аїІріпа (ЗаКигадапі еї аї.,, 2005; номер доступу ВАБУО1495; М/О2006019192), Тпаїіазвзіозіга роендопапа (Апгтргибі еї аї.,, 2004; номер доступу ХР 002291057; УМО2005012316, 5ЕО ІО МО: 71), І аспапсеа Кісумегі (також відомий як зЗасспаготусез Кішйумегі; Оицга еї аї., 2004; номер доступу АВ118663). Хие еї аї. (2012) описує Ф3- десатурази з ооміцетів Руїйішт арпапідетпайт, РпуорпїщШшога зоздае і РпуїорпїШога гатогит, здатні ефективно перетворювати жирнокислотні субстрати 06 на відповідні 003 жирні кислоти, з перевагою у відношенні субстратів С20, тобто ті, що володіють вираженішою активністю Д17- десатурази порівняно з активністю Д15-десатурази. Такі ферменти не володіють активністю д12-десатурази, але здатні використовувати жирні кислоти в ацил-КоА і фосфоліпідній фракції як субстрати.
У більш переважному варіанті реалізації винаходу грибкова 03-десатураза являє собою 03- десатуразу/л15-десатуразу Ріспіа разіогі5 (також відома як КотадаїаєїІа равіогі5) (7Напо еї аї.,
2008; номер доступу ЕЕ116884; 5ЕО ІЮО МО: 12) або поліпептид, який щонайменше на 95 95 ідентичний їй.
У варіанті реалізації винаходу 03З-десатураза здатна здійснювати щонайменше одне з наступних перетворень: АРК на ЕПК, ДГЛК на ЕТК, ГЛК на СДК, АРК на ЕПК і ДГЛК на ЕТК, АРК на ЕПК і ГЛК на СДК, або всі три з них.
В одному варіанті реалізації винаходу 03-десатураза має активність Л17-десатурази по відношенню до жирної кислоти С20, яка містить щонайменше три подвійних вуглець-вуглецевих зв'язки, переважно АРК. В іншому варіанті реалізації винаходу о3-десатураза має активністю
А15-десатурази по відношенню до жирної кислоти С18, яка містить три подвійних вуглець- вуглецевих зв'язки, переважно ГЛК. Переважно обидва види активності присутні.
В цьому документі "А12-десатураза" позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 12-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Звичайно А12-десатурази перетворюють олеоїл-фосфатидилхолін або олеоїл-КоА на лінолеоїл-фосфатидилхолін (18:1-
ФХ) або лінолеоїл-КоА (18:1-КоА), відповідно. Підклас, що використовує пов'язаний з ФХ субстрат, називають фосфоліпід-залежними Д12-десатуразами, другий підклас -- ацил-Код- залежними Д12-десатуразами. Рослинні і грибкові ДІТ2-десатурази звичайно відносяться до першого підкласу, тоді як тваринні А12-десатурази відносяться до другого підкласу, наприклад,
А12-десатурази, кодовані генами, які клоновані з комах 2пои еї аїЇ. (2008). Численні інші послідовності А12-десатурази можуть бути легко ідентифіковані шляхом пошуку в базах даних послідовностей.
В цьому документі "А15-десатураза" позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 15-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Численні гени, що кодують А15- десатурази, клоновані з рослинних і грибкових видів. Наприклад, в 055952544 розкриті нуклеїнові кислоти, що кодують рослинні А15-десатурази (ЕАОЗ). Ці ферменти містить мотиви амінокислот, які були характерними для рослинних Л15-десатураз. У ММО200114538 розкритий ген, що кодує БАЮЗ сої. Численні інші послідовності ДТ5-десатурази можуть бути легко ідентифіковані шляхом пошуку в базах даних послідовностей.
Зо В цьому документі "А17-десатураза" позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 17-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Крім того, АД17-десатураза розцінюється як 03-десатураза, якщо вона діє на субстрат С20, з введенням десатурації в положенні зв'язку 003.
У переважному варіанті реалізації винаходу А12-десатураза та/або А15-десатураза являє собою грибкову Д12-десатуразу або грибкову А15-десатуразу. В цьому документі "грибкова Л12- десатураза" або "грибкова Д15-десатураза" позначає Д12-десатуразу або АД15-десатуразу, одержану з грибкового джерела, зокрема, ооміцетного джерела, або її варіант, послідовність амінокислот якого є щонайменше на 95 95 ідентичною їй. Гени, що кодують численні десатурази, виділені з грибкових джерел. У 05 7211656 розкрита А12-десатураза із ЗаргоІедпіа дісіпа. У УМО2009016202 розкриті грибкові десатурази з НеїЇобаейа гобивхіа, І ассагіа бБісоїог,
Гоша дідапієа, Місгтосоїєн5 сПпіпопоріазієїх, Мопозіда Бгемісой5, Мусоз5рпаєгеїа Піепвів,
МусозраеєгеМйа дгатіпісоїа, Маедієга дгибеп, Месійа Паєтайюсосса, Метаїйозівйа месіеєпвів,
Рпусотусез ріаКезієвапив, Тгісподепта гевії, РпузсотіейПа раїепв, Ровійа ріасепіа, ЗеїЇадіпеїМа тоеїепадогіїй і Місгодоспічт пімаіе. У УМО2005/012316 розкрита А12-десатураза з Тпаїіазвзіовіга рхешйдопапа та інших грибів. У ММО2003/099216 розкриті гени, кодуючі грибкові Д12-десатурази і
А15-десатурази, виділені з Меигозрога сгазза, Азрегуйи5 піашіап5, Воїгуїйб5 сіпегеа і МогііегеПНа аіІріпа. У ММО2007133425 розкриті грибкові А15 десатурази, виділені з: Засспаготусез Кішйуметгі,
Мопіегеїа аїріпа, А5регуйШивє підшап5, Мешйгозрога стазза, Ризагпйт дгатіпеагит, Еизапйит топіїйопте і Мадпаройне дгізеєа. Переважна Л12 десатураза виділена з РНуїорнпіпога 5оі|ає (Виі2-І оре? ві аї., 2012).
Іншим підкласом грибкових Д12-десатураз і грибкових ДЛ15-десатураз є біфункціональні грибкові Д12/А15-десатурази. Гени, що кодують їх, клоновані з Ризагшт топоїЇйогте (номер доступу 00272516, Оатиде еї аї., 2006), Асапіпатоебра савзіеїІапії (номер доступу ЕБО17656,
Зауапома вї аї!., 2006), РеКкіпзи5 таїгіпив (М/О2007042510), Сіамісер5 ритригеа (номер доступу
ЕЕ536898, Меезаруоазик еї а!ї., 2007) ії Соргіпи5 сіпегеиз (номер доступу АЕ269266, 7Ппапо еї аї., 2007).
В іншому варіанті реалізації винаходу о3-десатураза має щонайменше деяку активність, переважно більшу активність, по відношенню до субстрату ацил-КоА, ніж до субстрату бо відповідного ацил-ФХ. В цьому документі "відповідний субстрат ацил-фФХ" позначає естерифікований жирною кислотою в положенні 5п-2 фосфатидилхолін (ФХ), в якому жирна кислота є такою ж жирною кислотою, як в субстраті ацил-КоА. Наприклад, субстрат ацил-КоА може бути АРК-КОА, і тоді відповідний субстрат ацил-ФХ являє собою 5п-2 АРК-ФХ. У варіанті реалізації винаходу активність щонайменше вдвічі вища. Переважно (03-десатураза має щонайменше деяку активність по відношенню до субстрату ацил-КоА і відповідного субстрату ацил-ФХ, і має активність по відношенню до субстратів С18 і С20. Приклади таких 03-десатураз відомі серед клонованих грибкових десатураз, наведених вище.
В іншому варіанті реалізації винаходу о3-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену 5ЕО ІЮО МО: 12, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, яка є щонайменше на 60 95 ідентичною 5ЕО ІЮО МО: 12, переважно є щонайменше на 90 95 або щонайменше на 95 95 ідентичною ЗЕО ІЮО МО: 12.
Ще в одному варіанті реалізації винаходу десатураза для використання в цьому винаході має вищу активність по відношенню до субстрату ацил-КоА, ніж відповідного субстрату ацил-
ФХ. В іншому варіанті реалізації винаходу десатураза для використання в цьому винаході має вищу активність по відношенню до субстрату ацил-ФХ, ніж відповідного субстрату ацил-КоА, але має деяку активність по відношенню до обох субстратів. Як окреслено вище, "відповідний субстрат ацил-ФХ" позначає естерифікований жирною кислотою в положенні 5п-2 фосфатидилхолін (ФХ), в якому жирна кислота є такою ж, як жирна кислота в субстраті ацил-
КоА. У варіанті реалізації винаходу вища активність означає щонайменше вдвічі вищу активність. У варіанті реалізації винаходу десатураза являє собою Д5- або Дб-десатуразу, або ошЗ3-десатуразу, приклади яких розкриті, без обмеження, в Табл. 2. З метою тестування того, на який субстрат діє десатураза, а саме, на субстрат ацил-КоА або ацил-ФХ, можуть бути проведені аналізи на дріжджових клітинах, як описано в ЮОотегопце еї аї. (2003) ії (2005). Крім того, здатність десатурази діяти на субстрат ацил-КоА може передбачатися, якщо елонгаза, яка експресується разом з десатуразою, демонструє ефективність ферментного перетворення в рослинних клітинах щонайменше близько 90 95, якщо елонгаза каталізує елонгацію продукту десатурази. Базуючись на цьому, Д5-десатураза і Д4-десатурази, що експресуються із конструкта СА? (Приклади 2 і 3) та їх варіанти (Приклад 5) здатні до десатурації відповідних ацил-КоА субстратів, ЕТК-КоА і ДПК-КоА.
Зо Елонгази
Біохімічні докази наводять на думку про те, що елонгація жирної кислоти складається з 4-х стадій: конденсація, відновлення, дегідратація і друге відновлення. В контексті цього винаходу, "елонгаза" позначає поліпептид, що каталізує стадію конденсації в присутності інших членів комплексу елонгації, у відповідних фізіологічних умовах. Показано, що гетерологічна або гомологічна експресія в клітині тільки конденсуючого компоненту ("елонгаза") комплексу елонгації білка потрібна для елонгації відповідного ацильного ланцюга. Тому, введена елонгаза може успішно рекрутувати відновлювальну і дегідратувальну активність з трансгенного хазяїна, з метою здійснення успішної елонгації ацилу. Вважається, що за специфічність реакції елонгації щодо довжини ланцюга і ступеня десатурації жирнокислотних субстратів відповідає компонент конденсації. Крім того, вважається, що цей компонент є обмежуючим швидкість в реакції елонгації.
В цьому документі "Аб5-елонгаза" щонайменше здатна перетворювати ЕПК на ДПК.
Приклади Д5-елонгаз включають розкриті у УМО2005/103253. В одному варіанті реалізації винаходу Д5-елонгаза має активність по відношенню до ЕПК з утворенням ДПК із ефективністю щонайменше 60 95, більш переважно щонайменше 65 95, більш переважно щонайменше 70 95 або найбільш переважно щонайменше 80 95 або 90 95. В додатковому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Д5-елонгази представлена 5ЕО ІЮ МО: 37, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 47 95 ідентичною 5ЕО
ІЮО МО: 37. У подальшому варіанті реалізації винаходу Дб-елонгаза походить з О5ігеососсив5
Ташгії або О5ігеососсив Ішсітагіпи5 (052010/088776).
В цьому документі "Дб-елонгаза" щонайменше здатна перетворювати СДК на ЕТК.
Приклади Дб-елонгаз включають наведені в Табл. 1. В одному варіанті реалізації винаходу елонгаза містить послідовність амінокислот, представлену 5ЕО ІЮО МО: 25, її біологічно активний фрагмент (наприклад, фрагмент, розкритий як 5ХЕО ІЮ МО: 26), або послідовність амінокислот, щонайменше на 55 95 ідентичну одній або обом з ЗЕО ІЮО МО: 25 або 5ЕО ІЮО МО: 26. У варіанті реалізації винаходу Аб-елонгаза одержана з Рпузсоптійгеїйа раїеп5 (7апК еї аІ., 2002; номер доступу АЕ428243) або Таїіазвіовіга рхоейдопапа (Еипі-І оре? єї аї., 2012).
В цьому документі "л9-елонгаза" щонайменше здатна перетворювати АЛК на ЕТРрК.
Приклади Д9-елонгаз включають наведені в Табл. 1. В одному варіанті реалізації винаходу 60 послідовність амінокислот ДУ-елонгази представлена ЗЕО ІЮ МО: 43, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 80 95 ідентичною 5ЕО ІЮ МО: 43.
В іншому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот ДУ-елонгази представлена
ЗЕБЕО 10 МО: 46, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 81 9о ідентичною 5ЕО ІО МО: 46. У ще одному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Д9-елонгази представлена ЗЕО ІЮ МО: 48, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичною 5ЕО ІЮ МО: 48.
В іншому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот ДУ-елонгази представлена
ЗБО І МО: 50, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичною 5ЕО ІЮО МО: 50. У подальшому варіанті реалізації винаходу
ДдоУ-елонгаза має вищу активність по відношенню до 0б субстрату, ніж відповідного (03 субстрату, або навпаки.
В цьому документі термін "має вищу активність по відношенню до субстрату 06, ніж відповідного субстрату 03" позначає відносну активність ферменту по відношенню до субстратів, яка відрізняється за активністю 03 десатурази. Переважно субстрат 06 являє собою
ЛК, ї субстрат ю3 являє собою АЛК.
Елонгаза з активністю Дб-елонгази і ДУ9-елонгази щонайменше здатна (ї) перетворювати
СДК на ЕТК і (ії) перетворювати АЛК на ЕТрК, а також має вищу активність Аб-елонгази, ніж активністю ЛОУ-елонгази. В одному варіанті реалізації винаходу елонгаза має ефективність перетворення СДК з утворенням ЕТК, яка становить щонайменше 50 95, більш переважно щонайменше 60 95, та/або ефективністю перетворення АЛК з утворенням ЕТркК, яка становить щонайменше 6 95 або більш переважно щонайменше 9 95. В іншому варіанті реалізації винаходу елонгаза має активність Дб-елонгази, щонайменше приблизно в 6,5 раз перевищуючою активність Л9-елонгази. У подальшому варіанті реалізації винаходу елонгаза не має активність
Дд5-елонгази, яка могла би бути виявлена.
Інші ферменти
В цьому документі термін "І-ацил-гліцерол-3-фосфат ацилтрансфераза" (ЛФКАТ), що також має назву ацилтрансферази лізофосфатидинової кислоти або ацил-КоА-лізофосфатидат- ацилтрансферази, позначає білок, який ацилює 5п-1-ацил-гліцерол-З-фосфат (5п-1 С-3-Р) в положенні 5п-2, з утворенням фосфатидної кислоти (ФК). Таким чином, термін "активність І-
Зо ацил-гліцерол-3-фосфат ацилтрансферази" позначає ацилування (5п-1 (3-3-Р) в положенні 5п-2, з утворенням ФК (ЄС 2.3.1.51). Переважними ЛФКАТ є такі, що можуть використовувати поліненасичений С22 ацил-КоА як субстрат, для перенесення поліненасиченої групи ацилу С22 в положення 5п-2 ЛФК, з утворенням ФК. Приклади таких ЛФКАТ наведені в Прикладі 13 і можуть бути протестовані, як розкрито в цьому документі. У варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот ЛФКАТ, придатна у відповідності до винаходу, представлена будь- якою з 5ЕО ІЮ МО: 63-69, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 40 95 ідентичною будь-якій одній або більше із 5ЕО ІЮ МО: 63-69. У переважному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот ЛФКАТ, придатна у відповідності до винаходу, представлена будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 64, 65 і 67, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 40 95 ідентичною будь- який однієї або більш з 5ЕО ІЮ МО: 64, 65 і 67.
В цьому документі термін "діацилгліцерол ацилтрансфераза" (ЄС 2.3.1.20; ДГАТ), позначає білок, який переносить жирну групу ацилу з ацил-КоА до діацилгліцерольного субстрату, з утворенням триацилгліцеролу. Тому, термін "активність діацилгліцерол ацилтрансферази" позначає перенесення ацил-КоА до діацилгліцеролу, з утворенням триацилгліцеролу. Існує три відомих види ДГАТ, позначені як ДГАТІ, ДГАТ2 ії ДГАТЗ, відповідно. Поліпептиди ДГАТ1 звичайно містять 10 трансмембранних доменів, ДГАТ2 звичайно містять 2 трансмембранних домени, тоді як ДГАТЗ звичайно є розчинним. Приклади поліпептидів ДГАТІ включають поліпептиди, кодовані генами ДГАТІ1 з АвзрегойШив5 Титідайше (номер доступу ХР 755172),
Агарідорвзіз Іаійапа (САВ44774), Вісіпи5 соттипів (ААНІ11479), Мегпісіа Тогаї (АВСО4472),
Мегпопіа даіатепвзіз (АВМ21945, АВМ21946), Епопутив аїа(йє (ААМЗ31083), Саепотарайів еіедапо (ААЕ82410), Кайи5 погмедісиє (МР 445889), Ното з5аріеп5 (МР 036211), а також їх варіанти та/"або мутанти. Приклади поліпептидів ДГАТ2 включають поліпептиди, кодовані генами ДГАТаО з Агабрідорзів ІПпаіапа (номер доступу МР 566952), Кісіпи5 соттипів (ААМ16324), / Метісіа їюогаїї (АВС94474), МопіегеПа гатаппіапа (ААК84179), Ното зарієп5 (096РО7, О58НТ5),
Во5 їашгив (9070М08), Мив тивсшив (ААК84175), Місготопаз ССМРІ1545, а також їх варіанти та/або мутанти. Приклади поліпептидів ДГАТЗ включають поліпептиди, кодовані генами ДГАТЗ з арахісу (Агаспіз нуродаєа, запа, еї аї., 2006), а також їх варіанти та/або мутанти.
Поліпептиди/пептиди
Зб
Термін "рекомбінантний" в контексті поліпептиду позначає поліпептид, який продукується клітиною або неклітинною системою експресії у модифікованій кількості або з модифікованою швидкістю, в порівнянні з його природним станом, коли він продується природним шляхом. В одному варіанті реалізації винаходу клітина є клітиною, яка в природі не продукує поліпептиду.
Однак, клітина може бути клітиною, яка містить не ендогенний ген, що приводить до продукування модифікованої кількості поліпептиду. Рекомбінантний поліпептид за винаходом включає поліпептиди в клітині, тканині, органі або організмі, або неклітинній системі експресії, у якій він продукується, тобто поліпептид, який не був очищений або відокремлений від інших компонентів трансгенної (рекомбінантної) клітини, в якій він був продукований, і поліпептидів, продукованих в таких клітинах або неклітинних системах, які в подальшому очищають щонайменше від деяких інших компонентів.
Терміни "поліпептид" і "білок" загалом використовуються рівнозначно.
Поліпептид або клас поліпептидів може бути визначений за ступенем ідентичності ( 905 ідентичності) його послідовності амінокислот референтній послідовності амінокислот, або за більшим 595 ідентичності одній референтній послідовності амінокислот, ніж іншій. 9 ідентичності поліпептиду референтній послідовність амінокислот звичайно визначається за аналізом САР (Меедіетап апа Уушп5сй, 1970; програма СС) з параметрами штрафу на відкриття проміжку - 5 і штрафу на подовження проміжку - 0,3. Довжина послідовності запиту становить щонайменше 15 амінокислот, і аналіз САР вирівнює дві послідовності протягом ділянки завдовжки щонайменше 15 амінокислот. Переважніше довжина послідовності запиту становить щонайменше 50 амінокислот, і аналіз САР вирівнює дві послідовності протягом ділянки завдовжки щонайменше 50 амінокислот. Переважніше довжина послідовності запиту становить щонайменше 100 амінокислот, і аналіз ЗАР вирівнює дві послідовності протягом ділянки завдовжки щонайменше 100 амінокислот. Навіть переважніше довжина послідовності запиту становить щонайменше 250 амінокислот, і аналіз (АР вирівнює дві послідовності протягом ділянки завдовжки щонайменше 250 амінокислот. Навіть більш Переважно аналіз САР вирівнює дві послідовності протягом їх повної довжини. Поліпептид або клас поліпептидів може володіти такою ж ферментною активністю або іншою активністю або не володіти активністю референтного поліпептиду. Переважно поліпептид має ферментну активність на рівні
Зо щонайменше 10 95, щонайменше 50 95, щонайменше 75 95 або щонайменше 90 95 від активності референтного поліпептиду. "Біологічно активний фрагмент" є частиною поліпептиду, визначеного в цьому документі, яка зберігає певну активність повнорозмірного референтного поліпептиду, наприклад, має активність десатурази та/або елонгази або іншу ферментну активність. Біологічно активні фрагменти в цьому документі виключають повнорозмірний поліпептид. Біологічно активні фрагменти можуть бути частиною будь-якого розміру, до тих пір, поки вони зберігають певну активність. Переважно біологічно активний фрагмент зберігає щонайменше 10 95, щонайменше 50 965, щонайменше 75 95 або щонайменше 90 95 активності повнорозмірного білка.
Щодо певного поліпептиду або ферменту, необхідно розуміти, що 95 ідентичності, перевищуючий розкриті в цьому документі, включає переважні варіанти. Таким чином, якщо це доречно, у світлі мінімального 95 ідентичності, Переважно щоб поліпептид/фермент містив послідовність амінокислот, яка є щонайменше на 60 95, більш переважно щонайменше на 65 95, більш переважно щонайменше на 70 95, більш переважно щонайменше на 75 95, більш переважно щонайменше на 76 95, більш переважно щонайменше на 80 95, більш переважно щонайменше на 85 95, більш переважно щонайменше на 90 95, більш переважно щонайменше на 91 95, більш переважно щонайменше на 92 95, більш переважно щонайменше на 93 95, більш переважно щонайменше на 94 95, більш переважно щонайменше на 95 95, більш переважно щонайменше на 96 95, більш переважно щонайменше на 97 95, більш переважно щонайменше на 98 95, більш переважно щонайменше на 99 95, більш переважно щонайменше на 99,1 95,
БО більш переважно щонайменше на 99,2 95, більш переважно щонайменше на 99,3 95, більш переважно щонайменше на 99,4 95, більш переважно щонайменше на 99,5 95, більш переважно щонайменше на 99, 95, більш переважно щонайменше на 99,7 95, більш переважно щонайменше на 99,8 95, і навіть більш переважно щонайменше на 99,9 95 ідентична вказаній у зв'язку з нею 5ЕО ІЮ МО.
Варіанти/мутанти амінокислотної послідовності поліпептидів, розкритих в цьому документі, можуть бути одержані шляхом введення відповідних модифікацій нуклеотидів до нуклеїнової кислоти, розкритої в цьому документі, або синтезу цільового поліпептиду іп мйго. Такі варіанти/мутанти включають, наприклад, делеції, вставки або заміни залишків в межах послідовності амінокислот. Комбінація делеції, вставки і заміни може бути здійснена таким чином, щоб одержати кінцеву конструкцію, за умови, що кінцевий пептидний продукт має бажану ферментну активність.
Мутантні (модифіковані) пептиди можуть бути одержані із застосуванням будь-якої методології, відомої з рівня техніки. Наприклад, полінуклеотид, розкритий в цьому документі, може бути оброблений методами мутагенезу іп міго або тасування ДНК, як детально описано
Нагауата (1998). Скринінг продуктів, які одержують з видозміненої/модифікованої ДНК, може бути з легкістю здійснений із застосуванням способів, розкритих в цьому документі, для визначення того, чи володіють вони, наприклад, десатуразною або елонгазною активністю.
При конструюванні мутантів послідовності амінокислот, місцеположення сайту мутації і природа мутації залежатимуть від характеристики(ик), яку модифікують. Сайти для мутації можуть бути модифіковані індивідуально або посерійно, наприклад, шляхом: (1) заміни спочатку вибраних консервативних амінокислот, а потім більш радикальних замін, в залежності від досягнутих результатів, (2) видалення залишку-мішені, або (3) вставки інших залишків, суміжних з розміщеним сайтом.
Делеції в амінокислотній послідовності загалом варіюють від приблизно 1 до 15 залишків, переважніше від приблизно 1 до 10 залишків і звичайно приблизно від 1 до 5 суміжних залишків.
У мутантах заміни видалений щонайменше один залишок амінокислоти в молекулі поліпептиду, та інший залишок вставлений на його місце. Найцікавіші положення для мутагенезу шляхом заміни включають сайти, що не є консервативними в природних десатуразах або елонгазах. Заміни в таких сайти переважно здійснюються відносно консервативним чином, з метою збереження активності ферменту. Такі консервативні заміни проілюстровані в Табл. З під заголовком "приклади замін".
У переважному варіанті реалізації винаходу мутантний/варіантний поліпептид містить тільки або не більше ніж одну або дві або три або чотири консервативні модифікації амінокислот, в порівнянні з природним поліпептидом. Подробиці консервативних модифікацій амінокислот наведені в Табл. 3. Як буде зрозуміле кваліфікованому фахівцю, такі незначні модифікації можуть в розумних межах бути спрогнозовані як не впливаючі на активність поліпептиду при експресії в рекомбінантній клітині.
Поліпептиди можуть бути одержані різноманітними шляхами, зокрема, продукування і виділення природних поліпептидів або рекомбінантних поліпептидів у відповідності до методів, відомих з рівня техніки. В одному варіанті реалізації винаходу рекомбінантний поліпептид продукується культивованою клітиною, здатною експресувати поліпептид в умовах, ефективних для продукування поліпептиду, наприклад, клітиною-хазяїном, розкритою в цьому документі.
Більш переважною клітиною для продукування поліпептиду є клітина в рослині, особливо в насінні на рослині.
Полінуклеотиди
Крім того, у винаході розкриваються та/або застосовуються полінуклеотиди, які можуть бути, наприклад, геном, виділеним полінуклеотидом, химерною генетичною конструкцією, такою як молекула Т-ДНК або химерна ДНК. Це може бути ДНК або РНК геномного або синтетичного походження, двохланцюгова або одноланцюгова, а також комбінована з вуглеводом, ліпідами, білком або іншими матеріалами з метою здійснення конкретної активності, розкритої в цьому документі. Термін "полінуклеотид" використовується в цьому документі рівнозначно з терміном "молекула нуклеїнової кислоти". Під "виділеним полінуклеотидом" ми маємо на увазі полінуклеотид, який, при одержанні з природного джерела, був відокремлений від полінуклеотидних послідовностей, з якими він асоційований або зв'язаний в природному стані, або полінуклеотид, що не зустрічається в природі. Переважно виділений полінуклеотид є щонайменше на 60 95 вільним, переважніше щонайменше на 75 95 вільним, і переважніше щонайменше на 90 595 вільним від інших компонентів, з якими він зв'язаний в природі.
Таблиця З
Приклади замін
Приклади замін залишок
Таблиця З
Приклади замін
Приклади замін залишок ле) Пешмараа//////СсС
РР бу 77777111
У варіанті реалізації винаходу полінуклеотид за винаходом не зустрічається в природі.
Приклади полінуклеотидів, що не зустрічаються в природі, включають, без обмеження, такі, що мутували (наприклад, в результаті застосування способів, розкритих в цьому документі), і полінуклеотиди, у яких відкрита рамка зчитування, кодуюча білок, функціонально пов'язана з промотором, із яким вона не пов'язана в природі (наприклад, у конструкціях, розкритих в цьому документі).
В цьому документі термін "ген" використовується в найширшому контексті і включає дезоксирибонуклеотидні послідовності, що містять транскрибовану ділянку і, у випадку трансляції, ділянка кодування білка структурного гена, включаючи послідовності, розміщені суміжно з кодуючою ділянкою на 5'і 3' кінцях, на відстані щонайменше приблизно 2 тисячі пар основ на будь-якому кінці, що беруть участь в експресії гена. В цьому відношенні, ген містить контрольні сигнали, наприклад, промотори, енхансери, сигнали термінації та/або поліаденілювання, які в природі асоційовані з даним геном, або гетерологічні контрольні сигнали, і в цьому випадку ген носить назву "Химерного гена". Послідовності, що розміщені на 5' кінці кодуючої білок ділянки, і які присутні на мРНК, позначаються як 5' нетрансльовані послідовності. Послідовності, що розміщені на 3' кінці або нижче по відношенню до кодуючої білок ділянки, і які присутні на мРНК, позначаються як 3' нетрансльовані послідовності. Термін "ген" включає кКДНК і геномні форми гена. Геномна форма або клон гена містить кодуючу ділянку, що може перериватися некодуючими послідовностями під назвою "інтрони" або "проміжні ділянки" або "проміжні послідовності". Інтрони являє собою сегменти гена, транскрибовані в ядерну РНК (гетерогенну ядерну РНК, гяЯРНК). Інтрони можуть містити регуляторні елементи, наприклад, енхансери. Інтрони видаляють або "зрощують" з ядерним або первинним транскриптом; таким чином, інтрони відсутні в транскрипті матричної РНК (мРНК).
Функція мРНК в ході трансляції полягає в конкретизації послідовності або порядку амінокислот у виникаючому поліпептиді. Термін "ген" включає синтетичну або злиту молекулу, що кодує повнорозмірні білки або їх частини за винаходом, розкриті в цьому документі, і нуклеотидну послідовність, комплементарну до будь-якої із згаданих вище.
В цьому документі "химерна ДНК" або "химерна генетична конструкція" позначає будь-яку
Зо молекулу ДНК, що не є природною молекулою ДНК в її природному місцеположенні, яка також позначається в цьому документі як "конструкція ДНК". Як правила, химерна ДНК або химерний ген містить регуляторну і транскрибовану або кодуючу білок послідовності, які не знайдені функціонально пов'язаними одна з однією в природі, тобто які є гетерологічними по відношенню одна до одної. Відповідно, химерна ДНК або химерний ген можуть містити регуляторні послідовності і кодуючі послідовності, що походять з різних джерел, або регуляторні послідовності і кодуючі послідовності, що походять з одного джерела, але організовані в інший спосіб, ніж знайдені в природі.
Термін "ендогенний" використовується в цьому документі для позначення субстанції, що звичайно присутня або продукується, наприклад, в немодифікованій рослині на такій же стадії розвитку, що і досліджувана рослина. "Ендогенний ген" позначає природний ген в його природному положенні в геномі організму. В цьому документі "молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти", "рекомбінантний полінуклеотид" або їх варіації позначають молекулу нуклеїнової кислоти, що конструюється або модифікується за допомогою технології рекомбінантної ДНК. Терміни "чужорідний полінуклеотид" або "екзогенний полінуклеотид" або "гетерологічний полінуклеотид" і подібні позначають будь-яку нуклеїнову кислоту, що введена в геном клітини за допомогою експериментальних маніпуляцій. Чужорідні або екзогенні гени можуть являти собою гени, вставлені в неприродний організм, природні гени, що введені в нове місцеположення в межах природного хазяїна, або химерні гени. "Трансген" є геном, що введений в геном процедурою трансформації. Терміни "генетично модифікований", "грансгенний" та їх варіації включають введення генів в клітини шляхом трансформації або трансдукції, мутацію генів в клітинах і модифікацію або модуляцію регуляції гена в клітині або організмах, над якими здійснювалися вказані дії, або їх потомстві. "Геномна ділянка" в цьому документі позначає положення в межах геному, в якому трансген або група трансгенів (також позначена в цьому документі як кластер) вставлені в клітину або її предка. Такі ділянки включають тільки нуклеотиди, що введені в результаті втручання людини, наприклад, за способами, розкритими в цьому документі.
Термін "екзогенний" в контексті полінуклеотиду позначає полінуклеотид, присутній в клітині в модифікованій кількості, в порівнянні з його природним станом. В одному варіанті реалізації винаходу клітина є клітиною, що в природі не містять полінуклеотиду. Однак, клітина може бути клітиною, яка містить не ендогенний полінуклеотид, що приводить до зміни рівня продукування кодованого поліпептиду. Екзогенний полінуклеотид за винаходом включає полінуклеотиди, що не відокремлені від інших компонентів трансгенної (рекомбінантної) клітини або неклітинної системи експресії, в якій вони присутні, і полінуклеотиди, продуковані в таких клітинах або неклітинних системах, які в подальшому були очищені щонайменше від деяких інших компонентів. Екзогенний полінуклеотид (нуклеїнова кислота) може бути безперервним ланцюгом нуклеотидів, існуючим в природі, або містити дві або більше суміжних нуклеотидних ділянок з різних джерел (природних та/або синтетичних), сполучені таким чином, щоб утворити єдиний полінуклеотид. Звичайно такі химерні полінуклеотиди містять щонайменше відкриту
Зо рамку зчитування, що кодує поліпептид за винаходом, функціонально пов'язаний з промотором, придатним для управління транскрипцією відкритої рамки зчитування в цільовій клітині.
В цьому документі термін "різноманітні екзогенні полінуклеотиди" або його варіації означають, що нуклеотидна послідовність кожного полінуклеотиду відрізняється щонайменше одним, переважно більше нуклеотидами. Полінуклеотиди кодують РНК, що можуть транслюватися або не транслюватися в білок у межах клітини. В прикладі, кожен полінуклеотид переважно кодує білок з іншою активністю. В іншому прикладі, кожен екзогенний полінуклеотид є менше, ніж на 95 95, менше, ніж на 90 95 або менше, ніж на 80 95 ідентичним іншим екзогенним полінуклеотидам. Переважно екзогенні полінуклеотиди кодують функціональні білки/ферменти.
Крім того, різні екзогенні полінуклеотиди переважно є такими, що частково не перекриваються, в тому значенні, що кожен полінуклеотид являє собою чітко визначену ділянку, наприклад, позахромосомно переносиму нуклеїнову кислоту, що частково не перекривається з іншим екзогенним полінуклеотидом. Щонайменше, кожен екзогенний полінуклеотид містить сайт ініціації і термінації транскрипції а також позначений промотор. Окремий екзогенний полінуклеотид може містити або не містити інтронів.
Щодо розкритих полінуклеотидів, необхідно розуміти, що вищий 95 ідентичності, ніж розкриті вище, включатиме переважні варіанти. Таким чином, якщо це доречно, у світлі мінімального 90 ідентичності, полінуклеотид переважно містить полінуклеотидну послідовність, яка є щонайменше на 60 95, більш переважно щонайменше на 65 95, більш переважно щонайменше на 70 95, більш переважно щонайменше на 75 95, більш переважно щонайменше на 80 95, більш переважно щонайменше на 85 95, більш переважно щонайменше на 90 95, більш переважно щонайменше на 91 95, більш переважно щонайменше на 92 95, більш переважно щонайменше на 93 95, більш переважно щонайменше на 94 95, більш переважно щонайменше на 95 95, більш переважно щонайменше на 96 95, більш переважно щонайменше на 97 95, більш переважно щонайменше на 98 95, більш переважно щонайменше на 99 95, більш переважно щонайменше на 99,1 95, більш переважно щонайменше на 99,2 95, більш переважно щонайменше на 99,3 95, більш переважно щонайменше на 99,4 95, більш переважно щонайменше на 99,5 95, більш переважно щонайменше на 99,6 95, більш переважно щонайменше на 99,7 95, більш переважно щонайменше на 99,8 95, і навіть більш переважно щонайменше на 99,9 95 ідентичною відповідній вказаній 5ЕО ІЮ МО.
Полінуклеотид за даним винаходом може селективно гібридизуватися, в суворих умовах, з полінуклеотидом, який кодує поліпептид за даним винаходом. В цьому документі суворі умови є наступними: (1) застосування в ході гібридизації денатуруючого агента, такого як формамід, наприклад, 50 об/об 95 формаміду, 0,1 мас/об 95 альбуміну телячої сироватки, що містить, 0,1 90
Фіколу, 0,1 95 полівінілпіролідону, 50 мМ натрій-фосфатний буфер, рН 6,5, що містить 750 мМ
Масі, 75 мМ натрію цитрату при 42"С; або (2) застосування 50 95 формаміду, 5 х натрію хлорид т натрію цитрат (ХЦН, 0,75 М масі, 0,075 М натрій цитрату), 50 мМ натрію фосфату (рН 6,8), 0,1
Фо натрію пірофосфату, 5 х розчин Денхардта, оброблена ультразвуком ДНК сперми лосося (50 г/мл), 0,1 95 натрію додецилсульфату і 10 95 декстрану сульфату при 42"С в 0,2 х натрій хлорид ж натрію цитрат і 0,1 95 натрію додецилсульфату та/або (3) застосування низької іонної сили і високотемпературного промивання, наприклад, 0,015 М МасСі/0,0015 М натрію цитрату/0,1 95 натрію додецилсульфату при 507С.
Полінуклеотиди за винаходом можуть містити, в порівнянні з молекулами, що зустрічаються в природі, одну або більше мутацій, що являють собою делеції, вставки або заміни нуклеотидних залишків. Полінуклеотиди, що містять мутації відносно референтної послідовності, можуть бути природними (тобто, виділеними з природного джерела) або синтетичними (наприклад, одержаними в результаті сайт-спрямованого мутагенезу або тасування ДНК з нуклеїнової кислоти, як розкрито вище). Таким чином, очевидно, що полінуклеотиди за винаходом можуть бути одержані з природного джерела або можуть бути рекомбінантними. Переважними полінуклеотидами є такі, що містять кодуючі ділянки, кодон- оптимізовані для трансляції в клітинах рослини, як відомо з рівня техніки.
Рекомбінантні вектори
Один варіант реалізації цього винаходу включає рекомбінантний вектор, який містить щонайменше одну молекулу полінуклеотиду, розкриту в цьому документі, вставлену в будь- який вектор, здатний доставити молекулу полінуклеотиду в клітину-хазяїна. Рекомбінантні вектори включають вектори експресії. Рекомбінантні вектори містять гетерологічні полінуклеотидні послідовності, тобто, полінуклеотидні послідовності, що в природі не знайдені суміжними з молекулами полінуклеотиду, розкритими в цьому документі, які переважно одержані з інших видів, ніж ті, з яких одержана(и) молекула(и) полінуклеотиду. Вектор може являти собою РНК або ДНК, і звичайно є плазмідою. Плазмідні вектори звичайно містять додаткові послідовності нуклеїнових кислот, які забезпечують простоту селекції, ампліфікації і трансформації касети експресії в прокаріотних клітинах, наприклад, одержані з рос вектори, одержані з реК вектори, одержані з РОЕМ вектори, одержані з реР вектори, одержані з рВ5 вектори, або переважно бінарні вектори, що містять одну або більш ділянок Т-ДНК. Додаткові послідовності нуклеїнових кислот включають джерела реплікації для забезпечення автономної реплікації вектора, гени селекційних маркерів, переважно кодуючі резистентність до антибіотика або гербіциду, унікальні множинні сайти клонування, які забезпечують множинні сайти вставки послідовностей нуклеїнових кислот або генів, кодованих в конструкції нуклеїнової кислоти, і послідовності, які підвищують активність трансформації прокаріотних і еукаріотних (особливо рослинних) клітин. Рекомбінантний вектор може містити більш ніж один полінуклеотид, розкритий в цьому документі, наприклад, три, чотири, п'ять або шість полінуклеотидів, розкритих в цьому документі, в комбінації, переважно химерну генетичну конструкцію за винаходом, в якій кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з послідовностями контролю експресії, активними в цільовій клітині. Більш ніж один полінуклеотид, розкритий в цьому документі, наприклад, 3, 4, 5 або 6 полінуклеотидів, переважно ковалентно сполучені в єдиному рекомбінантному векторі, переважно в межах єдиної молекули Т-ДНК, яка в подальшому може бути введена як єдина молекула в клітину, з одержанням рекомбінантній клітини за винаходом, і переважно інтегрована в геном рекомбінантної клітини, наприклад, в трансгенній рослині. Таким чином, полінуклеотиди, сполучені у такий спосіб, будуть успадковуватися разом як єдиний генетичний локус у нащадка рекомбінантної клітини або рослини. Рекомбінантний вектор або рослина може містити два або більше таких рекомбінантних векторів, кожен з яких містить декілька полінуклеотидів, наприклад, кожен рекомбінантний вектор містить 3, 4, 5 або 6 полінуклеотидів. "Функціонально пов'язаний" в цьому документі позначає функціональне взаємовідношення між двома або більш сегментами нуклеїнової кислоти (наприклад, ДНК). Як правило, це позначає функціональне взаємовідношення транскрипційного регуляторного елементу (промотору) і транскрибованої послідовності. Наприклад, промотор функціонально пов'язаний з кодуючою послідовністю, такою як полінуклеотид, розкритий в цьому документі, якщо він стимулює або модулює транскрипцію кодуючої послідовності у відповідній клітині. Загалом, бо транскрипційні регуляторні елементи промотору, які функціонально пов'язані з транскрибованою послідовністю, є фізично суміжними з транскрибованою послідовністю, тобто, вони є сіз-діючими. Однак, для деяких транскрипційних регуляторних елементів, таких як енхансери, немає необхідності бути фізично суміжними або розташованими в безпосередній близькості від кодуючих послідовностей, транскрипцію яких вони збільшують.
Якщо присутні декілька промоторів, кожен промотор може незалежно бути таким же або іншим.
Крім того, рекомбінантні молекули, наприклад, химерні ДНК або генетичні конструкції, можуть містити: (а) один або більш секреторних сигналів, що кодують сигнальні пептидні послідовності, щоб дозволити експресованому поліпептиду, розкритому в цьому документі, секретуватися з клітини, яка продукує поліпептид, або яка забезпечує локалізацію експресованого поліпептиду, наприклад, для утримання поліпептиду в ендоплазматичному ретикулумі (ЕР) клітини або перенесення в пластиду, та/або (б) химерні послідовності, які приводять до експресії молекул нуклеїнових кислот у вигляді химерних білків. Приклади відповідних сигнальних сегментів включають будь-який сигнальний сегмент, здатний спрямовувати секрецію або локалізацію поліпептиду, розкритого в цьому документі. Додатково, рекомбінантні молекули можуть містити проміжні та/або нетрансльовані послідовності, навколо та/або в межах послідовностей нуклеїнових кислот молекул нуклеїнових кислот, розкритих в цьому документі.
Для спрощення ідентифікації трансформантів, бажано, щоб конструкція нуклеїнової кислоти містила ген селекційного або скринінгового маркера у вигляді або на додаток до чужорідного або екзогенного полінуклеотиду. "Ген маркера" позначає ген, який надає відмінного фенотипу клітинам, що експресують ген маркера, таким чином, що трансформовані клітини відрізняються від клітин, які не містять маркера. Ген селекційного маркера забезпечує ознаку, за якою можна "здійснювати селекцію" на базі резистентності до селекційного агента (наприклад, гербіцид, антибіотик, випромінювання, нагрівання або інший вид обробки, ушкоджуючий нетрансформовані клітини). Ген придатного для скринінгу маркера (або репортерний ген) забезпечує ознаку, за якою можна ідентифікувати, шляхом спостереження або тестування, наприклад, за допомогою "скринінгу" (наприклад, активність рД-глюкуронідази, люциферази, зеленого флуоресцентного білка (ЗФБ) або іншого ферменту, відсутню в нетрансформованих
Зо клітинах). Ген маркера і цільова нуклеотидна послідовність не обов'язково повинні бути пов'язаними. Фактично, вибір маркера не є критичним, до тих пір, поки він є функціональним (тобто, селективним) в поєднанні з клітинами вибору, такими як рослинна клітина.
Прикладами бактеріальних селекційних маркерів є маркери, що забезпечують резистентність до антибіотиків, наприклад, резистентність до ампіциліну, еритроміцину, хлорамфеніколу або тетрацикліну, переважно резистентність до канаміцину. Приклади селекційних маркерів для селекції рослин включають, без обмеження, ген пуд, який кодує резистентність до гігроміцину В; ген неоміцин фосфотрансферази (прі), що забезпечує резистентність до канаміцину, паромоміцину, 5418; ген глутатіон-5-трансферази з печінки щурів, що забезпечує резистентність до гербіцидів-похідних глутатіону, наприклад, таких як, розкриті у ЕР 256223; ген глутамінсинтетази, що при надмірній експресії забезпечує резистентність до інгібіторів глутамінсинтетази, таких як фосфінотрицин, наприклад, розкритий у МО 87/05327, ген ацетилтрансферази із бБігеріотусе5 міпідоспготодепе5, що забезпечує резистентність до селекційного агента фосфінотрицину, наприклад, розкритий у ЕР 275957, ген, що кодує 5-єнолшикімат-З3-фосфат синтазу (ЄШФС), що забезпечує переносимість М- фосфонометилгліцину, наприклад, розкритий Ніпспее еї аІ. (1988), ген Баг, що забезпечує резистентність до біалафосу, наприклад, розкритий у УМО91/02071; ген нітрилази, наприклад, рхп із Кіерзіва о7аепає, що забезпечує резистентність до бромоксинілу (-аїКег еї аї., 1988); ген дигідрофолатредуктази (ДГФР), що забезпечує резистентність до метотрексату (ТпйШеї еї аї., 1988); ген мутанта ацетолактатсинтази (АЛС), який забезпечує резистентність до імідазолінону, сульфонілсечовини або інших хімічних речовин, що інгібують АЛС (ЕР 154204); мутантний ген антранілат синтази, який забезпечує резистентність до 5-метилтриптофану; або ген далапон дегалогенази, який забезпечує резистентність до гербіциду.
Переважні скринінгові маркери включають, без обмеження, ген пцідА, що кодує р- глюкуронідазу (505), фермент, для якого відомі різноманітні хромогенні субстрати, ген зеленого флуоресцентного білка (Міедз еї а!., 1995) або його похідні; ген люциферази (Ійс) (Оу еї аїЇ,, 1986), який дозволяє виявити біолюмінесценцію, та інші, відомі з рівня техніки. "Репортерною молекулою" в цьому документі називається молекула, яка, за своєю хімічною природою, забезпечує придатний для аналітичної ідентифікації сигнал, що спрощує визначення активності промотору на базі білкового продукту.
Переважно конструкція нуклеїнової кислоти стабільно інкорпорована в геном клітини, наприклад, рослинної клітини. Відповідно, нуклеїнова кислота може містити відповідні елементи, які дозволяють молекулі інкорпоруватися в геном, переважно послідовності правої і лівої меж молекули Т-ДНК, або конструкція розміщена у відповідному векторі, який може бути інкорпорований в хромосому клітини.
Експресія
В цьому документі вектор експресії являє собою вектор ДНК, що здатний трансформувати клітину-хазяїна і здійснювати експресію однієї або більше вказаних молекул полінуклеотиду.
Переважні вектори експресії за даним винаходом можуть спрямовувати експресію гена в дріжджових та/або рослинних клітинах. Вектори експресії, придатні у відповідності до винаходу, містять регуляторні послідовності, наприклад, послідовності для контролю транскрипції, послідовності для контролю трансляції, джерела реплікації та інші регуляторні послідовності, сумісні з рекомбінантною клітиною, які контролюють експресію молекул полінуклеотиду за даним винаходом. Зокрема, полінуклеотиди або вектори, придатні у відповідності до цього винаходу, містять послідовності для контролю транскрипції. Послідовності для контролю транскрипції є послідовностями, які контролюють ініціацію, елонгацію і термінацію транскрипції.
Особливо важливими послідовностями для контролю транскрипції є такі, які контролюють ініціацію транскрипції, наприклад, послідовності промотору та енхансера. Відповідні послідовності для контролю транскрипції включають будь-яку послідовність для контролю транскрипції, яка може функціонувати щонайменше в одній з рекомбінантних клітин за даним винаходом. Вибір використовуваних регуляторних послідовностей залежить від організму- мішені, такого як рослина, та/або органу-мішені або цільової тканини. Такі регуляторні послідовності можуть бути одержані з будь-якого еукаріотного організму, такого як рослини, або віруси рослин, або можуть бути хімічно синтезовані. Численні такі послідовності для контролю транскрипції відомі фахівцям з рівня техніки. Особливо переважними послідовностями для контролю транскрипції є промотори, що активно спрямовують транскрипцію в рослинах, конститутивно або специфічним для стадії та/або тканини чином, в залежності від використання рослини або її частин.
Ряд векторів, придатних для стабільної трансфекції рослинних клітин або одержання трансгенних рослин, описаний, наприклад, у Рошмеї5 еї аї., Сіопіпуд Месіоге: А І арогагу МапаиаїЇ, 1985, зирр. 1987; М/єіз5расі апа М/еізвбаси, Меїпосдіз Тог Ріапі МоїІесціаг Віоіоду, Асадетіс Ргев5, 1989; ії Сеїмп еї аї., Ріапі МоІесшаг Віоюду Мапиаї, Кісу'ег Асадетіс Рибіїєпег5, 1990. Як правила, вектори експресії в рослинах містять, наприклад, один або більше клонованих генів рослини під транскрипційним контролем 5' і 3 регуляторних послідовностей і домінантний селекційний маркер. Додатково, такі вектори експресії в рослинах можуть містити регуляторну ділянку промотору (наприклад, регуляторна ділянка, що контролює індуцибельну або конститутивну, регульовану умовами навколишнього середовища або стадією розвитку, або клітинно- або тканиноспецифічну експресію), старт-сайт ініціації транскрипції, сайт зв'язування з рибосомою, сигнал процесингу РНК, сайт термінації транскрипції та/або сигнал поліаденілювання.
Описаний цілий ряд конститутивних промоторів, які активні в клітинах рослини. Придатні промотори для конститутивної експресії в рослинах включають, без обмеження, промотор 355 вірусу мозаїки цвітної капусти (Самм), 355 мозаїчного вірусу ранника шишкуватого (ЕММ), промотор паличкоподібного вірусу цукрової тростини, промотор вірусу жовтої крапки комеліни, індуцибельний світлом промотор з маленької субодиниці рибулозо-1,5-біс-фосфат карбоксилази, промотор цитозольної триосефосфат ізомерази рису, промотор аденін фосфорибозилтрансферази Агабідорзії, промотор гена рисового актину 1, промотори манопінсинтази та октопінсинтази, промотор Аайп, промотор синтази сахарози, промотор комплексу К гена і промотор гена хлорофіл-зв'язувального білка с/р.
З метою експресії у вихідних тканинах рослини, таких як листя, насіння, коріння або стебло, промоторам, використовуваним у відповідності до цього винаходу, переважно властива відносно висока експресія в цих конкретних тканинах. Для даної мети можна здійснювати вибір із цілого ряду промоторів для генів з тканино- або клітиноспецифічною або -підсиленою експресією. Відомі з літератури приклади таких промоторів включають промотор глутамін синтази 552 з хлоропласту гороху, промотор фруктозо-1,6-біросфатази хлоропласту з пшениці, промотор ядерного фотосинтетичного 51-І5 1 з картоплі, промотор серин кінази і промотор глюкоамілази (СН) з Агабідорзі5 їйпайапа. Також повідомлялося про активність у фотосинтетично активних тканинах промоторів рибулозо-1,5-бісфосфат карбоксилази і промоторів Саб.
Різноманітні промотори рослинних генів, які регулюються у відповідь на екологічні, гормональні, хімічні та/або пов'язані з розвитком сигнали, також можуть використовуватися для експресії генів в клітинах рослини, зокрема, промотори, регульовані (1) нагріванням, (2) освітленням (наприклад, промотор Кбо5-ЗА гороху, промотор Кро5 маїсу); (3) гормонами, наприклад, абсцизиновою кислотою, (4) пошкодженнями (наприклад, УУшпі); або (5) хімічними речовинами, наприклад, метилжасмонатом, саліциловою кислотою, стероїдними гормонами, спиртом, сафенерами (У/097/06269), або може бути переважним використання (б) орган- специфічних промоторів.
В цьому документі термін "промотор, специфічний для насіння рослини" або його варіації позначає промотор, який переважно в порівнянні з іншими тканинами рослини, спрямовує транскрипцію гена в насінні рослини, що розвивається. У варіанті реалізації винаходу промотор, специфічний для насіння, експресується щонайменше в 5 разів активніше у насінні рослини, що розвивається, відносно листя та/або стебел рослини, і переважно експресується активніше в ембріоні насіння, що розвивається, в порівнянні з іншими тканинами рослини. Переважно промотор тільки спрямовує експресію цільового гена в насінні, що розвивається, та/або експресія цільового гена у інших частинах рослини, таких як листя, не може бути виявлена нозерн-блотингом та/або ЗТ-ПЛР. Звичайно, промотор контролює експресією генів в процесі росту і розвитку насіння, зокрема, в ході фази синтезу і акумуляції запасних речовин в насінні.
Такі промотори можуть контролювати експресією гена в суцільному запасному органі рослини або тільки в його частині, наприклад, оболонці насіння або сім'ядолі(ях), переважно в ембріонах, у насінні дводольних рослин або ендоспермі або алейроновому шарі насіння однодольних рослин.
Переважні промотори специфічної для насіння експресії включають: і) промотори з генів, що кодують ферменти, які беруть участь в біосинтезі жирних кислот та їх акумуляції в насінні, наприклад, десатурази і елонгази, ії) промотори з генів, що кодують запасні білки для зберігання в насінні, і ії) промотори з генів, що кодують ферменти, які беруть участь в біосинтезі вуглеводів та їх акумуляції в насінні. Придатними специфічними для насіння промоторами є промотор гена напіну олійної каноли (5 5608152), промотор О5Р Місіа Ттаба (Ваштіеїп еї аї., 1991), промотор олеозину Агабідорзі5 (М/098/45461), промотор фазеоліну РпазеоЇи5 уцідагіє (005 5504200),
Зо промотор Все4 Вгазвзіса (М/О91/13980) або промотор легуміну ГеВа4 з Місіа Ттаба (Вайтівїп еї аї., 1992), і промотори, які забезпечують специфічну для насіння експресію в однодольних, таких як маїс, ячмінь, пшениця, жито, рис, тощо. Як придатні слід зазначити такі промотори: промотор гена Ірі2 або ІрИ ячменю (М/095/15389 і ММО95/23230) або промотори, розкриті у УМО99/16890 (промотори з гена гордеїну ячменю, гена глютеліну рису, гена оризину рису, гена проламіну рису, гена гліадину пшениці, гена глютеліну пшениці, гена зеїну маїсу, гена глютеліну вівса, гена казирину сорго, гена секаліну жита). Інші промотори включають розкриті Вгоцп еї аї. (1998),
Роїепла еї аІ. (2004), 00520070192902 і 0520030159173. У варіанті реалізації винаходу специфічний для насіння промотор переважно експресується в певних частинах насіння, таких як ембріон, сім'ядоля(ї) або ендосперм. Приклади таких специфічних промоторів включають, без обмеження, промотор ЕР (ЕПегеїгот еї аї., 1996), промотор легуміну гороху (Регттіп еї аї., 2000), промотор фітогемаглютиніну боба (Регїтіп еї аї., 2000), промотори конлінін 1 їі конлінін 2 для генів, що кодують запасні білюм 25 льону (Спепд еї аї., 2010), промотор гена БАЕЇ1 з
Агабрідорзі5 Іпаійапа, промотор ВпоОїІ Р. гена глобулін-подібного білка Вгаззіса пари, промотор
І РХЕ гена пероксиредоксину з І іпит и5йайвзвітит. 5 нетрансльована лідерна послідовність може бути одержана з промотору, вибраного для експресії гетерологічної послідовності гена полінуклеотиду за даним винаходом, або переважно є гетерологічною щодо ділянки, яка кодує фермент, що виробляється, і може бути специфічно модифікована, при бажанні, таким чином, щоб збільшити трансляцію мРНК. Огляд оптимізації експресії трансгенів див. у Коієї єї аї. (1996). Додатково, 5' нетрансльовані ділянки можуть бути одержані з РНК вірусів рослин (серед іншого, вірус мозаїки тютюну, вірус гравіювання тютюну, вірус карликової мозаїчності маїсу, вірус мозаїки люцерни), з відповідних еукаріотних генів, рослинних генів (лідер гена білка а/ю хлорофілу пшениці і маїсу, що зв'язується), або із синтетичної послідовності гена. Даний винахід не обмежується конструкціями, в яких нетрансльована ділянка одержана з 5' нетрансльованої послідовності, супроводжуючої послідовність промотору. Додатково, лідерна послідовність може бути одержана із неспорідненого промотору або кодуючої послідовності. Лідерні послідовності, придатні в контексті цього винаходу, включають лідер Н5р70 маїсу (5 5362865 і 05 5859347) і омега- елемент вірусу мозаїки тютюну (ТММ).
Термінація транскрипції забезпечується 3 нетрансльованою послідовністю ДНК, бо функціонально пов'язаною в химерному векторі з цільовим полінуклеотидом. 3' нетрансльована ділянка рекомбінантної молекули ДНК містить сигнал поліаденілювання, функція якого в рослинах полягає у забезпеченні додавання аденілатних нуклеотидів до 3 кінця РНК. 3' нетрансльовані ділянки можуть бути одержані з різноманітних генів, які експресуються в клітинах рослин. У такому випадку звичайно використовуються 3' нетрансльована ділянка нопалінсинтази, 3 нетрансльована ділянка з маленької субодиниці гена Кибібхсо гороху, 3' нетрансльована ділянка з гена запасного білка 75 насіння сої або гена конлініну льону. Крім того, придатними є 3' транскрибовані, нетрансльовані ділянки, що містять поліаденілатний сигнал індукуючих пухлину (Ті) Адгобасіегішт плазмідних генів.
Технології рекомбінантної ДНК можуть застосовуватися для покращення експресії трансформованої молекули полінуклеотиду, шляхом маніпуляції, наприклад, кількістю копій молекули полінуклеотиду в межах клітини-хазяїна, ефективністю, з якою такі молекули полінуклеотиду транскрибуються, ефективністю, з якою транслюються копії, що утворюються в результаті, та ефективністю посттрансляційних модифікацій. Рекомбінантні методи, придатні для збільшення експресії молекул полінуклеотиду, розкритих в цьому документі, включають, без обмеження, інтеграцію молекули полінуклеотиду в одну або більше хромосом клітини-хазяїна, введення стабілізуючих послідовностей в мРНК, заміни або модифікації сигналів контролю транскрипції (наприклад, промотори, оператори, енхансери), заміни або модифікації сигналів контролю трансляції (наприклад, сайти зв'язування з рибосомою, послідовності Шайна-
Дальгарно), модифікацію молекул полінуклеотиду для відповідності використанню кодонів в клітині-хазяїні і делецію послідовностей, що дестабілізують транскрипти.
Рекомбінантні клітини
У винаході також розкривається рекомбінантна клітина, переважно рекомбінантна клітина рослини, що є клітиною-хазяїном, трансформованою однією або більше рекомбінантними молекулами, такими як полінуклеотиди, химерні генетичні конструкції або рекомбінантні вектори, розкриті в цьому документі. Рекомбінантна клітина може містити будь-яку їх комбінацію, наприклад, два або три рекомбінантних вектори, або рекомбінантний вектор і один або більше додаткових полінуклеотидів або химерних ДНК. Придатні клітини за винаходом включають будь-яку клітину, яка може бути трансформована полінуклеотидом, химерною ДНК або рекомбінантним вектором за винаходом, таку як молекула, що кодує поліпептид або
Зо фермент, розкритий в цьому документі. Переважно клітина є клітиною, яка, таким чином, придатна для використання з метою одержання ДЛ-ПНЖК. Рекомбінантна клітина може бути клітиною в культурі, клітиною іп міго, або в організмі, такому як, наприклад, рослина, або в органі, такому як, наприклад, насіння або лист. Переважно клітина знаходиться в рослині або частині рослини, переважніше в насінні рослини.
Клітини-хазяї, до яких введений(і) полінуклеотид(и), можуть бути нетрансформованими клітинами або клітинами, які вже трансформовані щонайменше однією молекулою нуклеїнової кислоти. Такі молекули нуклеїнової кислоти можуть бути пов'язані з синтезом ДЛ-ПНЖК або не пов'язані з ним. Клітини-хазяї за даним винаходом можуть бути ендогенно (тобто, природним чином) здатні до продукування білків, розкритих в цьому документі, і в цьому випадку рекомбінантна клітина, одержана з них, має підвищену здатність до продукування поліпептидів, або вони можуть бути здатні до продукування таких білків тільки після трансформації щонайменше одним полінуклеотидом за винаходом. У варіанті реалізації винаходу рекомбінантна клітина за винаходом має підвищену здатність до синтезу довголанцюгової поліненасиченої жирної кислоти. В цьому документі термін "клітина з підвищеною здатністю до синтезу довголанцюгової поліненасиченої жирної кислоти" є відносним терміном, за допомогою якого рекомбінантна клітина за винаходом порівнюється з клітиною-хазяїном, в якій відсутній) полінуклеотид(и) за винаходом, з рекомбінантною клітиною, яка продукує поліненасичені жирні кислоти з довшим ланцюгом, або з більшою концентрацією ДЛ-ПНЖК, наприклад, ДГК (щодо інших жирних кислот), ніж у природній клітині. Клітина з підвищеною здатністю до синтезу іншого продукту, наприклад, іншої жирної кислоти, ліпіду, вуглеводу, такого як крохмаль, молекули РНК, поліпептиду, фармацевтичного або іншого продукту, має відповідне значення.
Клітини-хазяї за даним винаходом можуть являти собою будь-яку клітину, здатну до продукування щонайменше одного білка, розкритого в цьому документі, і включають клітини бактерій, грибів (зокрема, дріжджів), паразитів, членистоногих, тварин і рослин. Клітини можуть бути прокаріотними або еукаріотними. Переважні клітини-хазяї являють собою клітини дріжджів і рослин. У переважному варіанті реалізації винаходу клітина рослини являє собою клітину насіння, зокрема, клітину в сім'ядолі або ендоспермі насіння. В одному варіанті реалізації винаходу клітина являє собою тваринну клітину або водоростеву клітину. Тваринна клітина може належати до будь-якого виду тварин, наприклад, клітина тварини, що не належить до 60 людського роду, клітина хребетного, що не належить до людського роду, клітина ссавця, що не належить до людського роду, або клітини водних тварин, таких як риба або ракоподібні, безхребетних, комах, тощо. Клітини можуть належати організму, придатному для процесу ферментації. В цьому документі термін "процес ферментації" позначає будь-який процес ферментації або будь-який процес, що включає стадію ферментації. Приклади ферментувальних мікроорганізмів включають грибкові організми, наприклад, дріжджі. В цьому документі "дріжджі" включають вид Засспаготусе5, Засспаготусев сегемізіаєе, засспаготусев сапрегдепзі5, вид Сапаїда, види Кіимеготусе5, види Ріспіа, вид Напзепшіа, вид Тгісподегта,
Протусез «іагкеу і Маггом/а Ігроїміса. Переважні дріжджі включають штами видів засспаготусев і, зокрема, Засспаготусез сегемівіавє.
Трансгенні рослини
Додатково, у винаході розкривається рослина, що містить клітину за винаходом, наприклад, трансгенна рослина, що містить один або більше полінуклеотидів за винаходом. Термін "рослина" в цьому документі як іменник позначає суцільні рослини, але при використанні в ролі прикметника ("рослинний") позначає будь-яку субстанцію, в якій присутній, одержану 3, що походить із або пов'язану з рослиною, наприклад, органи рослини (такі як листя, стебла, коріння, квіти), одиничні клітини (такі як пилок), насіння, рослинні клітини, тощо. Термін "частина рослини" позначає всі частини рослини, які містять ДНК рослини, зокрема, вегетативні структури, наприклад, листя або стебла, коріння, квіткові органи або структури, пилок, насіння, частини насіння, такі як ембріон, ендосперм, щиток зародка або оболонка насіння, тканину рослини, таку як судинна тканина, клітини і їх потомство, до тих пір, поки частина рослини синтезує ліпід за винаходом. "Трансгенна рослина", "генетично модифікована рослина" або їх варіації позначають рослину, яка містить генетичну конструкцію ("трансген"), не знайдену в рослині дикого типу такого ж виду, різновиди або сорти. Трансгенні рослини в контексті цього винаходу включають рослини та їх потомство, генетично модифіковані із застосуванням рекомбінантних методів, що приводить до продукування ліпіду або щонайменше одного поліпептиду, розкритого в цьому документі, у цільовій рослині або органі рослини. Трансгенні клітини рослини і трансгенні частини рослини мають відповідне значення. "Грансген" в цьому документі має звичайне значення для даної галузі біотехнології і містить генетичну послідовність, яка одержана або модифікована технологією рекомбінації ДНК або РНК, і яка введена до клітини за винаходом, переважно клітини рослини. Трансген може містити генетичні послідовності, одержані з клітини рослини, яка може належати до того ж виду, різновиду або сорту, що і клітина рослини, до якої введений трансген, або до іншого виду, різновиду або сорту, або з клітини, що не є рослинною.
Звичайно, трансген вводять до клітини, наприклад, рослинної, шляхом маніпуляції людиною, наприклад, трансформації, причому може застосовуватися будь-який спосіб за рішенням фахівця в цій галузі техніки.
Терміни "насіння" і "зерно" в цьому документі використовуються рівнозначно. "Зерно" позначає зріле зерно, наприклад, зібране в процесі збору врожаю зерно, або зерно, яке ще знаходиться на рослині, але готове для збору врожаю, а також може позначати насіння після набухання або проростання, згідно контексту. Зріле зерно або насіння звичайно містить вологу в кількості менше, ніж приблизно 18-20 95. "Насіння, що розвивається" в цьому документі позначає насіння до настання зрілості, звичайно знайдене в репродуктивних структурах рослини після запліднення або цвітіння, але може також позначати таке насіння до настання зрілості, яке виділено з рослини.
В цьому документі термін "одержання частини рослини" або "одержання насіння" позначає будь-які засоби для одержання частини рослини або насіння, відповідно, зокрема, збір урожаю частин рослини або насіння з рослин у полі або в закритому просторі, такому як теплиця або камера для росту, або придбання або одержання від постачальника частин рослини або насіння. Насіння може бути придатним для насадження, тобто здатним до проростання і утворення рослини-нащадка, або альтернативно, оброблено таким чином, що більше не може прорости, наприклад розколене, шліфоване або змолочене насіння, придатне для застосування при одержанні харчових продуктів або в харчуванні або для екстракції ліпіду за винаходом.
В цьому документі термін "запасаючий орган рослини" позначає частину рослини, що спеціалізується на зберіганні енергії у формі, наприклад, білків, вуглеводів, жирних кислот та/або олій. Прикладами запасаючих органів рослини є насіння, плід, бульбоподібне коріння і бульби. Переважним запасаючим органом рослини за винаходом є насіння.
В цьому документі термін "фенотипово нормальний" позначає генетично модифіковану рослину або орган рослини, особливо запасаючий орган, такий як насіння, бульбу або плід за винаходом, не володіючий істотною мірою зниженою здатністю до росту і відтворення, в бо порівнянні з немодифікованою рослиною або органом рослини. У варіанті реалізації винаходу генетично модифікована рослина або орган рослини, які є фенотипово нормальними, містять екзогенний полінуклеотид, що кодує супресор сайленсингу, функціонально пов'язаний з промотором, специфічним для запасаючого органу рослини, і має здатність до росту або відтворення, по суті такою ж, як ізогенна рослина або орган, що не містить вказаного полінуклеотиду. Переважно біомаса, темпи росту, швидкість проростання, розмір запасаючого органу, розмір насіння та/або кількість утворених життєздатних зерен становить не менше 90 95 від показників рослини, яка не містить вказаного екзогенного полінуклеотиду, при вирощуванні в ідентичних умовах. Даний термін не охоплює ознак рослини, що можуть відрізнятися від рослини дикого типу, але при цьому не впливають на повноцінність рослини з точки зору комерційних цілей, наприклад, фенотип балерини листя саджанця.
Рослини, розкриті або включені для використання у практиці цього винаходу, включають однодольні рослини і дводольні рослини. В переважних варіантах реалізації рослини за даним винаходом являють собою урожайні рослини (наприклад, злакові і зернобобові, маїс, пшеницю, картоплю, тапіоку, рис, сорго, просо., маніоку, ячмінь або горох) або інші бобові. Рослини можеть бути вирощені для одержання їстівних коренів, клубенів, листя, стебел, квітів або плоду.
Рослини можуть бути овочевими або декоративними рослинами. Рослини за винаходом можуть являти собою: кукурудзу (7еа таувз), канола (Вгаззіса пари, підвид Вгазхв5іса гара), гірчицю (Вгаззіса |ипсеа), льон (Гіпит из5йаззітит), люцерну (Медісадо заїйїма), рис (Огула заїїма), жито (ЗесаІе сегаіє), сорго (Богупит бБісоїоиг, Зогуопит миЇдаге), соняшник (Неїїапійи5 аппив), пшеницю (Тгйішт аезіїмит), сою (Сіусіпе тах), тютюн (Місойапа їарбасит), картоплю (Зоїапит їмбегозит), арахіс (Агаспіє пуродаеєа), бавовник (Соз5зурішт Пігшішит), солодку картоплю (Гортоеа бБаїаскш5), маніоку (Мапіпої езсціепіа), каву (вид Соїеа), кокосовий горіх (Сосо5 писіїега), ананас (Апапа сотози5), цитрусове дерево (вид Сіїги5), какао (Пеобгота сасаоб), чай (Сатеїа б5епепвіб5), банан (вид Миза), авокадо (Регзеа атегісапа), інжир (Ріси5 савіса), гуаву (Рзідіит доиазама), манго (Мапоїтег іпдіса), оливу (ОїЇєа еигораєа), папайю (Сагіса рарауа), кеш'ю (Апасагаійшт оссідепіаіє), макадамію (Масадатіа іпіегугітоЇйа), мигдаль (Ргипи5 атудаа!нв), цукровий буряк (Веїа миЇдагіб5), овес або ячмінь.
У переважному варіанті реалізації винаходу рослина є покритонасінною рослиною.
У варіанті реалізації винаходу рослина є рослиною олійної культури, переважно урожайною
Зо рослиною олійної культури. В цьому документі "рослина олійної культури" є видом рослини, використовуваним для комерційного одержання олій з насіння рослини. Рослина олійної культури може бути олійним канолаом (наприклад, канола), маїсом, соняшником, соєю, сорго, льоном (насіння льону) або цукровим буряком. Крім того, рослина олійної культури може бути іншими представниками Вгаззіса5, бавовником, арахісом, маком, гірчицею, рициною звичайною, кунжутом, сафлором або рослиною, що дає горіхи. Рослина може продукувати високі рівні олії в плоді, наприклад, олива, олійна пальма або кокосовий горіх. Садовими рослинами, до яких може бути застосований даний винахід, є салат, ендивій або хрестоцвітні овочі, включаючи капусту, броколі або цвітну капусту. Цей винахід може бути застосований до тютюну, гарбузових, моркви, суниці, помідора або перцю.
У ще одному переважному варіанті реалізації винаходу нетрансогенна рослина, використовувана для одержання трансгенної рослини за винаходом, продукує олію, особливо у насінні, яке містить: ї) менше 20 95, менше 10 95 або менше 5 95 жирних кислот 18:2 та/або ії) менше 10 95 або менше 5 95 жирних кислот 18:3.
У переважному варіанті реалізації винаходу трансгенна рослина є гомозиготною по всіх і кожному введеному гену (трансгену), таким чином, що її потомство не розділяється для бажаного фенотипу. Крім того, трансгенна рослина може бути гетерозиготною по введеному(им) трансгену(ам), переважно однорідно гетерозиготною по трансгену, наприклад, в потомстві Е1, яке вирощене з гібридного насіння. Такі рослини можуть забезпечувати переваги, наприклад, гібридну силу, добре відому з рівня техніки.
Якщо це доречно, трансгенні рослини можуть містити додаткові трансгени, що кодують ферменти, які беруть участь у продукуванні ДЛ-ПНЖК, такі як, без обмеження, Аб-десатураза, д9-елонгаза, Д8в-десатураза, Дб-елонгаза, Д5-десатураза, ю3-десатураза, Д4-десатураза, Д5Ь- елонгаза, діацилгліцерол ацилтрансфераза, ЛФКАТ, А17-десатураза, Д1Т5-десатураза та/або
Д12-десатураза. Приклади таких ферментів з одним або більше вказаних видів активності відомі з рівня техніки і включають розкриті в цьому документі. У конкретних прикладах, трансгенна рослина щонайменше містить екзогенні полінуклеотиди, які кодують: а) Д4-десатуразу, Д5-десатуразу, Дб-десатуразу, Д5-елонгазу і ДАб-елонгазу, б) Д4-десатуразу, Д5-десатуразу, Дв-десатуразу, Д5-елонгазу і Д9У-елонгазу, в) Д4-десатуразу, Д5-десатуразу, Дб-десатуразу, Д5-елонгазу, Дб-елонгазу і Д15-десатуразу, бо г) Д4-десатуразу, Д5-десатуразу, Дв-десатуразу, Д5-елонгазу, Л9-елонгазу і А15-десатуразу,
д) Д4-десатуразу, Д5-десатуразу, Дб-десатуразу, Д5-елонгазу, Лб-елонгазу і А17- десатуразу, або е) Д4-десатуразу, Д5-десатуразу, Д8-десатуразу, Д5-елонгазу, Д9-елонгазу і А17-десатуразу.
У варіанті реалізації винаходу екзогенні полінуклеотиди кодують набір поліпептидів, що являють собою Дб-десатуразу РуїПпішт ігедціаге, А5-дезатуразу ТНгайзіоснуні або д5Ь- дезатуразу Етійапа пихієуї, Аб-елонгазу РнпузсотіїгеПа раїеп5, А5-елонгазу Тпгаивіоспуйній або д5-елонгазу О5ігеосссиз Іашгії, оЗз-десатуразу Рпуїорпїнога іптехїап5 або о3-десатуразу Руїтійт ігтедшаге і Д4-десатуразу Тпгаивіоспуїгіа.
У варіанті реалізації винаходу рослини за винаходом вирощені в полі, переважно як популяція розміром щонайменше 1000 або 1000000 рослин, які по суті є однаковими, або на площі щонайменше 1 гектар. Щільність насадження варіює у відповідності до виду рослини, різновиду рослини, клімату, умов грунту, норм застосування добрив та інших факторів, як відомо з рівня техніки. Наприклад, канолу звичайно вирощують із щільністю насадження 1,2-- 1,5 млн. рослин на гектар. Урожай рослин збирають, як відомо з рівня техніки, що може включати валкування, рядне компостування та/або жнива плодів рослин, з подальшою молотьбою та/або віянням рослинного матеріалу для відокремлення насіння від решти частин рослини, часто у формі полови. Альтернативно, урожай насіння може бути зібраний з рослин у полі в ході єдиного процесу, а саме, комбайнування.
Трансформація рослин
Трансгенні рослини можуть бути одержані із застосуванням методів, відомих з рівня техніки, таких як загалом описані в А. Зіаїег еї аї!., Ріапі Віотесппоїосду -- Те Сепеїїс Мапіршіайоп ої
Ріапі5, Охіога Опімегейу Ргезз (2003), і Р. Спгізіои апа Н. Кіеєе, Напаброок ої Ріапі Віотесппоіоду,
Уопп Уміеу апа 5опв (2004).
В цьому документі терміни "стабільно трансформуючий", "стабільно трансформований" і їх варіації позначають інтеграцію екзогенних молекул нуклеїнових кислот в геном клітини таким чином, що вони передаються клітинам потомства в процесі поділу клітини, без необхідності в проведенні позитивної селекції щодо їх присутності. Стабільні трансформанти або їх потомство можуть бути відібрані будь-якими засобами, відомими з рівня техніки, такими як саузерн-блоти на хромосомній ДНК або гібридизація геномної ДНК іп 5йи.
Зо Опосередковане Адгобрасієтійт перенесення є широко використовуваною системою для введення генів в рослинні клітини, оскільки ДНК може бути введена в клітини в суцільних тканинах рослини або органах рослини або експлантах в культурі тканини, з метою тимчасової експресії або стабільної інтеграції ДНК в геном клітини рослини. Використання опосередкованих
Адгорасієегішт векторів, що інтегруються, для рослин з метою введення ДНК в клітини рослини добре відоме з рівня техніки (див., наприклад, Ш5 5177010, 5 5104310, 5 5004863 або 05 5159135), включаючи методи занурення квіток з використанням Адгобасіегішт або інших бактерій, які можуть переносити ДНК в клітини рослини. Ділянка ДНК для перенесення визначається послідовностями межі, причому проміжна ДНК (Т-ДНК) звичайно вставляється до геному рослини. В подальшому, інтеграція Т-ДНК є відносно точним процесом, що приводить до декількох реорганізацій. У тих різновидах рослин, в яких опосередкована Адгорасіегійт трансформація є ефективною, вона є способом вибору завдяки легкій і визначеній природі перенесення гена. Переважні вектори трансформації Адгобасіегіит здатні до реплікації в Е. сої, так само, як і Адогобасіегічт, дозволяючи здійснити необхідні маніпуляції, як було описано (Кіеве еї аї., в: Ріапі ОМА Іптесійои5 Адепів, Нопп апа зсепеїї, ед5., Зргіпдег-Мепад, Мем МогК, рр. 179-203 (1985)).
Способи прискорення, які можуть застосовуватися, включають, наприклад, балістичну трансфекцію, тощо. Одним із прикладів способу доставки трансформуючих молекул нуклеїнових кислот в клітини рослини є балістична трансфекція. Даний спосіб розглянутий Хапд еї а)., Рапісіє Вотрагатепі Тесппоіоду тог Сепе Тгапвівгї, Охіога Ргез55, Охіога, Епдіапа (1994).
Небіологічні частинки (мікрочастинки) в ньому можуть бути вкриті нуклеїновими кислотами і доставлені в клітини рушійною силою. Приклади частинок включають виготовлені з вольфраму, золота, платини, тощо. Конкретна перевага балістичної трансфекції, на додаток до того, що вона є ефективним засобом відтворюваної трансформації однодольних, є те, що вона не вимагає ані виділення протопластів, ні сприйнятливості до інфекції Адгорасіегійт.
В іншому альтернативному варіанті реалізації винаходу пластиди можуть бути стабільно трансформовані. Способи, розкриті для трансформації пластиди у вищих рослинах, включають доставку за допомогою генної гармати частинки ДНК, що містить селекційний маркер, і націлювання ДНК на геном пластиди за допомогою гомологічної рекомбінації (05 5451513, 05 5545818, 005 5877402, 05 5932479 і УМО 99/05265).
Інші способи трансформації клітини можуть також застосовуватися і включають, без обмеження, введення ДНК в рослини прямим перенесенням ДНК в пилок, прямою ін'єкцією ДНК в репродуктивні органи рослини або прямою ін'єкцією ДНК у клітини незрілих ембріонів, з подальшою регідратацією висушених ембріонів.
Регенерація, розвиток і культивування рослин з одинарних трансформантів протопласта рослини або з різноманітних трансформованих експлантів добре відомі з рівня техніки (УУвіззрасн еї а!ї. У: Меїпоаз ог Ріапі МоїІесшіаг Віоіоду, Асадетіс Ргез5, Зап Оіедо, Саїїї., (1988)).
Така регенерація і процес росту звичайно включають стадії селекції трансформованих клітин, культивування таких індивідуальних клітин через звичайні стадії ембріонального розвитку, зокрема, стадію вкорінення саджанця. Трансгенні ембріони і насіння регенерують в такий же спосіб. Одержані трансгенні укорінені пагони в подальшому висаджують у відповідне середовище для росту рослини, таке як грунт.
Розвиток або регенерація рослин, що містять чужорідний, екзогенний ген, добре відомі з рівня техніки. Переважно регенеровані рослини є такими, що самозапилюються, щоб забезпечити гомозиготні трансгенні рослини. В іншому випадку, пилок, одержаний від регенерованих рослин, схрещують з вирощеними із насіння рослинами важливих з агрономічної точки зору ліній. З другого боку, пилок рослин таких важливих ліній використовується для запилення регенерованих рослин. Трансгенну рослину за даним винаходом, що містить бажану екзогенну нуклеїнову кислоту, культивують із застосуванням способів, добре відомих фахівцю в даній галузі техніки.
Щоб підтвердити присутність трансгенів в трансгенних клітинах і рослинах, може бути здійснена ампліфікація шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або аналіз методом саузерн-блота, із застосуванням способів, відомих фахівцям в дані галузі техніки. Продукти експресії трансгенів можуть бути виявлені будь-яким з численних шляхів, в залежності від природи продукту, що включають вестерн-блот і ферментний аналіз. Як тільки трансгенні рослини одержані, їх можна вирощувати для одержання тканин або частин рослини з бажаним фенотипом. Тканина рослини або частини рослини можуть бути зібрані як урожай, та/або зібране насіння. Насіння може служити джерелом вирощування додаткових рослин з тканинами або частинами, що володіють бажаними характеристиками.
Зо Трансгенна рослина, одержана із застосуванням Адгорасієгцт або інших способів трансформації, звичайно містить єдиний генетичний локус на одній хромосомі. Такі трансгенні рослини можуть носити назву гемізиготних по введеному(им) гену(ам). Більш переважною є трансгенна рослина, гомозиготна по введеному(им) гену(ам); тобто, трансгенна рослина, яка містить два додаткових гени, по одному гену в однакових локусах на кожній хромосомі з пари
З5 хромосом. Гомозиготна трансгенна рослина може бути одержана шляхом самозапліднення гемізиготної трансгенної рослини, пророщування частини одержаного насіння та аналізу одержаних рослин щодо присутності цільового гена.
Крім того, необхідно розуміти, що дві різні трансгенні рослини, що містять два незалежно сегрегуючих екзогенних гени або локуси, можуть бути схрещеними (спареними), з метою одержання потомства, яке містить обидва набори генів або локусів. Самозапліднення відповідного нащадка ЕЇ може давати рослини, гомозиготні по обох екзогенних генах або локусах. Зворотне схрещування з материнською рослиною і знищення нетрансгенної рослини також розглядаються, як вегетативне розведення. Опис інших способів розведення, які звичайно використовуються для різноманітних ознак і врожаю, можна знайти в ЕРенйг, в: Вгеедіпд
Меїподз їтог Сийімаг Оемеіортепі, УМіїсох у). ед., Атегісап босієїу ої Адгопоту, Мадізоп МУ/ів. (1987).
Підвищення рівнів екзогенної РНК і стабілізована експресія
Супрессори сайленсингу
У варіанті реалізації винаходу клітина, рослина або частина рослини за винаходом містить екзогенний полінуклеотид, що кодує білок супресора сайленсингу.
Посттранскрипційний сайленсинг гена (ПТСГ) є специфічним для послідовності нуклеотидів механізмом захисту, що може бути націлений як на клітинні, так і на вірусні мРНК з метою їх розкладу. ПТСГ виникає в рослинах або грибах, стабільно або тимчасово трансформованих чужорідною (гетерологічною) або ендогенною ДНК, і приводить до зменшення акумуляції молекул РНК, послідовність яких подібна до введеної нуклеїнової кислоти.
Широко досліджений той факт, що співекспресія супресора сайленсинга з цільовим трансгеном підвищує рівні присутньої в клітині РНК, що транскрибована із трансгена. Хоча це є доведеним фактом для клітин іп мійго, значущі побічні ефекти спостерігаються в багатьох дослідженнях співекспресії у суцільних рослинах. Більш конкретно, як описано в Маїогу еї аї. 60 (2002), Спартап еї а!. (2004), Снеп єї а!. (2004), Юипоуєег вї а!. (2004), 7Напа еї а!. (2006), І ем/узеу еї а. (2007) і Мепо еї а. (2008) рослини, що експресують супресори сайленсинга, загалом під контролем конститутивних промоторів, часто є фенотипово аномальними до такої міри, що вони непридатні для комерційного виробництва.
Нещодавно було виявлено, що рівні молекул РНК можуть бути збільшені та/або рівні молекул РНК можуть бути стабілізовані протягом численних поколінь шляхом допомогою обмеження експресії супресора сайленсинга насінням рослини або його частиною (МО2010/057246). В цьому документі "білок-супресор сайленсинга" або БСС являє собою будь- який поліпептид, який може експресуватися в клітині рослини, що підвищує рівень продукту експресії іншого трансгена в клітині рослини, особливо в подальших поколіннях, одержаних від початково трансформованої рослини. У варіанті реалізації винаходу БСС являє собою вірусний супресор сайленсинга або його мутант. Велика кількість вірусних супресорів сайленсинга відома з рівня техніки і включає, без обмеження, Р19, М2, РЗ8, Ре-Ро і КРУ-РО. У варіанті реалізації винаходу вірусний супресор сайленсинга містить послідовність амінокислот, представлену будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 53-57, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот щонайменше на 50 95 ідентичною будь-якій одній або більше із ЗЕО
ІО МО: 53-57, яка додатково має активність супресора сайленсинга.
В цьому документі терміни "стабілізуючий експресію" "стабільно експресований", "стабілізована експресія" та їх варіації позначають рівень молекули РНК, по суті такий ж або перевищуючий рівень у рослинах-нащадках протягом наступних поколінь, наприклад, щонайменше 3, щонайменше 5 або щонайменше 10 поколінь, в порівнянні з ізогенними рослинами, які не містять екзогенного полінуклеотиду, що кодує супресор сайленсинга. Однак, даний(і) термін(и) не виключає(ють) можливості деякого зниження рівнів молекули РНК в наступних поколіннях, в порівнянні з попереднім поколінням, наприклад, зниження не менше 10
Фо на покоління.
Супресор може бути вибраний з будь-якого джерела, наприклад, рослини, вірусу, ссавця, тощо. Див. ММО2010/057246 щодо переліку вірусів, з яких може бути одержаний супресор і позначення білка (наприклад, В2, Р14, тощо.) або кодуючої ділянки для супресора з кожного конкретного вірусу. Множинні копії супресора можуть бути використані. Різні супресори можуть використовуватися спільно (наприклад, в тандемі).
Зо Молекули РНК
По суті будь-яка молекула РНК, яку бажано екпресувати в насінні рослини, може бути співекспресована із супресором сайленсинга. Кодовані поліпептиди можуть приймати участь в метаболізмі олії, крохмалю, вуглеводів, поживних речовин, тощо, або можуть бути відповідальними за синтез білків, пептидів, жирних кислот, ліпідів, воску, масел, крохмалів, цукру, вуглеводів, смакоароматичних речовин, ароматичних речовин, токсинів, каротиноїдів, гормонів, полімерів, флавоноїдів, запасних білків, фенолових кислот, алкалоїдів, лігніну, танінів, целюлози, глікопротеїнів, гліколіпідів, тощо, переважно біосинтез або збирання ТАГ.
У конкретному прикладі, рослини продукують підвищені рівні ферментів для продукування олії в рослинах, наприклад, видів Вгаз5зіса, таких як канола або соняшника, сафлору, льону, бавовнику, соєвому бобі, Сатеїїйпа або магїгсі.
Рівні продукування ДЛ-ПНЖК
Рівні ДЛ-ПНЖК або комбінацій ДЛ-ПНЖК, що продукуються в рекомбінантній клітині або частині рослини, наприклад, насінні, мають велике значення. Рівні можуть бути виражені, як склад (у відсотках) загальних жирних кислот, які є конкретними ДЛ-ПНЖК або групою споріднених ДЛ-ПНЖК, наприклад, 03 ДЛ-ПНЖК або об ДЛ-ПНЖК, або ДДЛ-ПНЖК, або інші, що може бути визначене за способами, відомими з рівня техніки. Крім того, рівень може бути виражений, як вміст ДЛ-ПНЖК, наприклад як відсоток ДЛ-ПНЖК в сухій масі матеріалу, що містить рекомбінантні клітини, наприклад, відсоток від маси насіння, який представляє ДЛ-
ПНЖК. Необхідно розуміти, що рівень ДЛ-ПНЖК, що продукується в олійній культурі, може бути значно вищим за показниками вмісту ДЛ-ПНЖК, ніж в овочі або насінні, яке не вирощувалося для цілей одержання олії, хоча обидва можуть мати подібний склад ДЛ-ПНЖК і обидва можуть використовуватися як джерела ДЛ-ПНЖК для споживання людиною або твариною.
Рівні ДЛ-ПНЖК можуть бути визначені за будь-яким із способів, відомих у даній галузі техніки. У переважному способі загальний ліпід добувають з клітин, тканин або організмів, і жирну кислоту перетворюють на метилові ефіри перед аналізом газовою хроматографією (ГХ).
Такі методи розкриті у Прикладі 1. Розташування піку на хроматограмі може використовуватися для ідентифікації кожної конкретної жирної кислоти, і площу кожного піку інтегрують для визначення кількості. В цьому документі, якщо не вказано інше, відсоток конкретної жирної кислоти у зразку визначають, виражаючи площу піку вказаної жирної кислоти як відсоток від бо загальної площі піків жирних кислот на хроматограмі. По суті, це відповідає масовому відсотку
(мас/мас). Ідентичність жирних кислот може бути підтверджена ГХ-МС. Загальні ліпіди можуть бути виділені методами, відомими з рівня технікию, з метою очищення фракцій, наприклад, фракції ТАГ. Наприклад, тонкошарова хроматографія (ТШХ) може бути здійснена в аналітичному масштабі, щоб відокремити ТАГ від інших фракцій ліпіду, таких як ДАГ, ацил-КоА або фосфоліпід, з метою визначення складу жирних кислот конкретно для ТАГ.
В одному варіанті реалізації винаходу загальна сума АРК, ЕПК, ДПК і ДГК в жирних кислотах екстрагованого ліпіду становить від приблизно 7 95 до приблизно 25 95 загальних жирних кислот в клітині. У подальшому варіанті реалізації винаходу загальні жирні кислоти в клітині містять менше 1 95 С20:1. У переважних варіантах реалізації екстрагований ТАГ в клітині містить жирні кислоти в кількостях, вказаних у цьому документі. Кожна з можливих комбінацій ознак, що визначають ліпід, розкритий в цьому документі, також включена.
Додатково рівень продукування ДЛ-ПНЖК в рекомбінантній клітині, рослині або частині рослини, наприклад, насінні, може бути виражений, як відсоток перетворення конкретного жирнокислотного субстрату на один або більше жирнокислотних продуктів, що в цьому документі додатково носить назву "ефективності перетворення" або "ефективності ферменту".
Цей параметр базується на жирнокислотному складі ліпіду, екстрагованого з клітини, рослини, частини рослини або насіння, тобто, кількості утвореної ДЛ-ПНЖК (зокрема іншої ДЛА-ПНЖК, одержаної з неї), вираженому як відсоток від одного або більше жирнокислотних субстратів (зокрема, всіх інших жирних кислот, одержаних із нього). Загальна формула для відсотка перетворення: 100 х (сума відсотків продукту ДЛ-ПНЖК і всіх продуктів, одержаних із нього)/(сума відсотків жирнокислотного субстрату і всіх продуктів, одержаних із нього). Стосовно
ДГК, наприклад, це може бути виражено, як співвідношення рівня ДГК (у вигляді відсотка від загального вмісту жирних кислот в ліпіді) до рівня жирнокислотного субстрату (наприклад ОК,
ЛК, АЛК, СДК, ЕТК або ЕПК) і всіх продуктів, окрім ДГК, одержаних з субстрату. Відсоток перетворення або ефективність перетворення можуть бути виражені для єдиної ферментної стадії біохімічного шляху, а також для частини або всього шляху.
Специфічна ефективність перетворення обчислена в цьому документі за наступними формулами: 1. ОК на ДГК - 100 х ( 96ДГК)Хсума 95 для ОК, ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТРК,
Зо ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 2. ЛК на ДГК - 100 х ( 96ДГК)/сума 95 для ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТРрК, ЕТК,
ЕПК, ДПК і ДГК). 3. АЛК на ДГК - 100 х ( 96ДГКЮ)Хсума 95 для АЛК, СДК, ЕТРрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 4. ЕПК на ДГК - 100 х ( 96ДГК)Хсума 95 для ЕПК, ДПК і ДГК). 5. ДПК на ДГК (ефективність А4-десатурази) - 100 х ( 96ДГК)/(сума 95 для ДПК і ДГК). 6. Ефективність ДІ12-десатурази - 100 х (сума 95 для ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК,
ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГКЮ)/сума 95 для ОК, ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТРрК, ЕТК,
ЕПК, ДПК і ДГК). 7. Ефективність 03З-десатурази - 100 х (сума 956 для АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і
Ддгюк)/сума 95 ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 8. ОК на АЛК - 100 х (сума 95 для АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГЮ/(сума 95 для ОК,
ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТРрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 9. Ефективність Дб-десатурази (на 03 субстраті АЛК) - 100 х (сума 95 для СДК, ЕТК, ЕПК,
ДПК і ДГЮЛ 95 АЛК, СДК, ЕТРрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 10. Ефективність Аб-елонгази (на 03 субстраті СДК) - 100 х (сума 95 для ЕТК, ЕПК, ДПК і
ДГЮ/сума 95 для СДК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 11. Ефективність Д5-десатурази (на 03 субстраті ЕТК) - 100 х (сума 95 для ЕПК, ДПК і
ДГЮ/Ссума 95 для ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 12. Ефективність Д5-елонгази (на 3 субстраті ЕПК) - 100 х (сума 95 для ДПК і ДГКЮ)/сума 90 для ЕПК, ДПК і ДГК).
Жирнокислотний склад ліпіду, переважно олії з насіння, за винаходом також відрізняється за співвідношенням 06 жирних кислот : 03 жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот, для будь-яких загальних 0б жирних кислот : загальних 03 жирних кислот або для нових 0б жирних кислот : 003 нових жирних кислот. Терміни загальні 06 жирні кислоти, загальні 03 жирні кислоти, нові фб жирні кислоти і нові 03 жирні кислоти мають значення, визначені в цьому документі.
Співвідношення обчислюють на базі складу жирних кислот у ліпіді, екстрагованому з клітини, рослини, частини рослини або насіння ліпіду, за способом, приклад якого наведений у цьому документі. Більш бажаною є присутність в ліпіді вищого рівня 03 жирних кислот, ніж 0б жирних кислот, і таким чином співвідношення 06:03 менше 1,0 є переважним. Співвідношення 0,0 60 вказує на повну відсутність певних б жирних кислот; співвідношення 0,03 було досягнуте, як розкрито у Прикладі 6. Такі низькі значення співвідношення можуть бути досягнуті шляхом сполученого використання Дб-десатурази з перевагою по відношенню до субстрату 03, разом з ошЗ3-десатуразою, особливо грибковою с3-десатуразою, такою як 03-десатураза Ріспіа равіогів, приклад якої наведений в цьому документі.
Додатково вихід ДЛ-ПНЖК на масу насіння може бути обчислений на базі загального вмісту олії в насінні і 95 ДГК в олії. Наприклад, якщо вміст олії в насінні канолау становить приблизно 40 95 (мас./масс.), і приблизно 12 95 від загального вмісту жирних кислот в олії становить ДГК, вміст ДГК в насінні становить приблизно 4,8 95 або близько 48 мг на грам насіння. Як розкрито в
Прикладі 2, вміст ДГК в насінні Агабрідорві5, що містить приблизно 9 95 ДГК, в якому вміст олії нижчий, ніж в канолаї, становив 25 мг/г насіння. При вмісті ДГК приблизно 7 95, насіння канолау або насіння Сатеїйпа заїїма містить рівень ДГК приблизно 28 мг на грам насіння. У цьому винаході таким чином розкриваються рослини Вгаззіса парих, В. |йпсеа і Сатеїйпа заїїма та одержане з них насіння, яке містить щонайменше близько 28 мг ДГК на грам насіння. Вміст вологи в насінні є стандартним для зібраного в процесі збору урожаю зрілого насіння після сушіння (4-15 95 вологи). У винаході також розкривається спосіб одержання олії, який включає одержання насіння і виділення олії з насіння, застосування олії і способи одержання насіння, включаючі збір урожаю насіння з рослин за винаходом.
Крім того, може бути обчислена кількість ДГК, що продукується на гектар, якщо вихід насіння з гектара відомий або може бути оцінений. Наприклад, урожайність каноли в Австралії зазвичай приблизно 2,5 тони насіння на гектар, що при вмісті олії 40 95 дає близько 1000 кг олії. При вмісті ДГК 12 95 в кінцевій олії, це забезпечує близько 120 кг ДГК на гектар. Якщо вміст олії знижується на 50 95, це все ще забезпечує близько 60 кг ДГК/га.
Одержані на сьогоднішній день докази свідчать про те, що деякі десатурази, що гетерологічно експресуються в дріжджах або рослинах, володіють відносно низькою активністю в комбінації з деякими елонгазами. Дану ситуацію можна покращити, надаючи десатуразі здатність використовувати форму ацил-КоОА жирної кислоти як субстрат у синтезі ДЛ-ПНЖК, і це вважається переважним в рекомбінантних клітинах, особливо у клітинах рослини. Особливо переважна комбінація для ефективного синтезу ДГК являє собою грибкову о03-десатуразу, наприклад, таку як ФЗ3-десатураза Ріспіа равіогіз (ЗЕО ІО МО: 12), що є АДб-десатуразою з
Зо перевагою по відношенню до 003 ацильних субстратів, наприклад, таку як Аб-десатураза
Місготопаз ризійа (ЗЕО ІЮ МО: 13) або її варіанти з ідентичністю послідовності амінокислот щонайменше 95 95.
В цьому документі термін "що по суті не містить" означає, що композиція (наприклад, ліпід або олія) містить невелику кількість (наприклад, менше, ніж приблизно 0,5 95, менше, ніж приблизно 0,25 95, менше, ніж приблизно 0,1 95, або менше, ніж приблизно 0,01 95) або не містить певного компоненту. У варіанті реалізації винаходу "такий, що по суті не містить" означає, що компонент неможливо знайти за допомогою шаблонної методики аналізу, наприклад, конкретна жирна кислота (наприклад, об-докозапентаєнова кислота) не може бути знайдена за допомогою газової хроматографії, як у загальних рисах розкрито в Прикладі 1
Отримання олій
Методи, які шаблонно практикуються в цій галузі техніки, можуть застосовуватися для виділення, обробки і аналізу олій, продукованих клітинами, рослинами, насінням, тощо за даним винаходом. Зазвичай насіння рослини термічно обробляють, пресують і екстрагують, щоб продукувати неочищену олію, яку далі гідратують, рафінують, відбілюють і дезодорують.
Загалом методи подрібнення насіння відомі з рівня техніки. Наприклад, насіння олійних культур може бути пом'якшено шляхом орошування його водою для підвищення вмісту вологи, наприклад, до 8,5 95, і провальцьоване за допомогою гладкого валу із щілинами розміром 0,23-- 0,27 мм. В залежності від виду насіння, перед подрібненням можна не додавати воду.
Застосування нагрівання інактивує ферменти, полегшує подальший розрив клітини, об'єднання олійних крапель, і забезпечує агломерацію частинок білка, причому все це спрощує процес екстракції.
У варіанті реалізації винаходу більшість олії з насіння вивільняється при пропусканні крізь гвинтовий прес. Макуху, що виходить з гвинтового пресу, далі екстрагують, наприклад, гексаном, з використанням колонки із супровідним теплоконтролем. Як альтернатива, неочищена олія, одержана в ході операції пресування, може бути пропущена крізь резервуар для осадження з дротяним дренажним верхом із прорізами, щоб видалити тверді речовини, які потрапляють в олію в ході операції пресування. Освітлена олія може бути пропущена крізь рамний і фільтр-прес для видалення будь-яких тонких механічних включень, що залишилися. За необхідності олія після процесу екстракції може бути об'єднана з освітленою олією, з бо одержанням змішаної неочищеної олії.
Як тільки розчинник відділений з неочищеної олії, пресовані та екстраговані порції об'єднують і обробляють звичайними процедурами обробки олії. В цьому документі термін "очищений", використовуваний у зв'язку з ліпідом або олією за винаходом, звичайно означає, що екстрагований ліпід або олія пройшли одну або більше стадій обробки, які підвищують ступінь чистоти ліпідного/олійного компоненту. Наприклад, стадія очищення може включати одне або більше або все із групи, що складається з: гідратації, дезодорування, відбілювання, сушіння та/або фракціонування екстрагованого олії. Однак в цьому документі термін "очищений" не включає процесу переестерифікації або іншого процесу, що модифікує склад жирних кислот ліпіду або олії за винаходом для збільшення вмісту ДГК як відсотка від загального вмісту жирних кислот. Іншими словами, склад жирних кислот очищеного ліпіду або олії по суті є таким же, як склад неочищеного ліпіду або олії.
Гідратація
Гідратація є початковою стадією рафінацій олій, і його основна мета полягає у видаленні з олії більшості фосфоліпідів, які можуть бути присутніми в кількості приблизно 1-2 95 від загального екстрагованого ліпіду. Додавання до неочищеного олії х2 95 води, що звичайно містить фосфорну кислоту, при 70-80"С приводить до відокремлення більшості фосфоліпідів, за наявності залишкових кількостей металів і пігментів. Нерозчинний матеріал, який відокремлюється, в основному є сумішшю фосфоліпідів і триацилгліцеролів, і також відомий як лецитин. Гідратація може здійснюватись шляхом додавання концентрованої фосфорної кислоти до неочищеної олії з насіння, з метою переведення нездатних до гідратації фосфатидів у здатну до гідратації форму та утворення хелатів металів, які присутні в незначних кількостях. Смолу відокремлюють від олії з насіння центрифугуванням.
Лужна рафінація
Лужна рафінація є одним із способів очищення для обробки неочищеного олії, який іноді також називають нейтралізацією. Вона зазвичай слідує за гідратацією і передує відбілюванню.
Після гідратації олія з насіння може бути оброблена додаванням достатньої кількості розчину лугу, щоб відтитрувати всі жирні кислоти і фосфорні кислоти, з подальшим видаленням утвореного мила. Придатні лужні матеріали включають натрію гідроксид, калію гідроксид, натрію карбонат, літію гідроксид, кальцію гідроксид, кальцію карбонат і амонію гідроксид. Цей
Зо спосіб, як правило, здійснюють за кімнатної температури, з видаленням фракції вільних жирних кислот. Мило видаляють центрифугуванням або екстракцією мила розчинником , і нейтралізовану олію промивають водою. За необхідності, надлишок лугу в олії може бути нейтралізований відповідною кислотою, такою як хлористоводнева кислота або сірчана кислота.
Відбілювання
Відбілювання є способом очищення, за якого олію нагрівають до 90-120"С, витримуючи за цієї температури протягом 10-30 хвилин у присутності відбілюючої глини (0,2-2,0 Осо) і за відсутності кисню, в атмосфері азоту або пари або під вакуумом. Ця стадія обробки олії розроблена таким чином, щоб видаляти небажані пігменти (каротиноїди, хлорофіл, госипол, тощо), причому спосіб додатково видаляє продукти окиснення, залишкові метали, сполуки сірки і залишок мила.
Дезодорування
Дезодорування є обробкою олій і жирів за високої температури (200-260) і низького тиску (0,1-1 мм рт. ст). Зазвичай, це досягається шляхом введення пари в олію з насіння із швидкістю приблизно 0,1 мл/хвилину/100 мл олії з насіння. Приблизно через 30 хвилин зрошування олії з насіння охолоджують під вакуумом. Олію з насіння зазвичай подають до скляного контейнеру і пропускають аргон, після чого зберігають за низької температури. Така обробка покращує колір олії з насіння і видаляє більшість летючих субстанцій або пахучих сполук, включаючи вільні жирні кислоти, що залишилися, моноацилгліцероли і продукти окиснення.
Вінтеризація
Вінтеризація є способом, що іноді застосовується в комерційному виробництві олій з метою розділення олій і жирів на тверді (стеарин) і рідкі (олеїн) фракції шляхом кристалізації за температур, нижчих за температуру навколишнього середовища. Спочатку його застосовували до бавовняної олії, з метою одержання продукту, що не містить твердих речовин. Зазвичай, цей спосіб застосовують для зменшення вмісту насичених жирних кислот в олії.
Переестерифікація
Переестерифікація є способом обміну жирних кислот в межах і між ТАГ або перенесення жирних кислот на інший спирт, з утворенням ефіру, спочатку шляхом вивільнення жирних кислот з ТАГ у формі вільних жирних кислот або у формі ефірів жирних кислот, звичайно бо метилових ефірів або етилових ефірів жирних кислот. За умови поєднання із способом фракціонування, переестерифікація може застосовуватися для модифікації жирнокислотного складу ліпідів (Магапдопі еї аї., 1995). Для переестерифікації можуть використовуватися хімічні (наприклад, каталізовані сильною кислотою або основою) або ферментні препарати, причому останні включають ліпази, що можуть бути специфічними до положення (5п-1/3 або 5п-2 специфічними) жирної кислоти в ТАГ, або з перевагою по відношенню до деяких жирних кислот в порівнянні з іншими (Зрегап7а еї аї., 2012). Фракціонування жирних кислот, з метою підвищення концентрації ДЛ-ПНЖК в олії може бути здійснено будь-яким із способів, відомих з рівня техніки, таких як, наприклад, кристалізація виморожуванням, утворення комплексів з використанням сечовини, молекулярна дистиляція, екстракція надкритичною рідиною і утворення комплексів з іоном срібла. Утворення комплексів із сечовиною є переважним способом унаслідок його простоти та ефективності з точки зору зниження рівня насичених і мононенасичених жирних кислот в олії (сате? еї аї., 2003). Спочатку, ТАГ в олії розщеплюють на складові жирні кислоти, часто у формі ефірів жирних кислот, шляхом гідролізу в умовах каталізу кислотою або основою, внаслідок чого один моль ТАГ реагує щонайменше з З моль спирту (наприклад, етанолу у випадку етилових ефірів або метанолу у випадку метилових ефірів), причому використовують надлишок спирту, щоб забезпечує розділення алкілових ефірів, які утворилися, і гліцерину, який також утворюється, або за допомогою ліпаз. Такі вільні жирні кислоти або ефіри жирних кислот, що звичайно залишаються в незміненому виді у складі жирних кислот після обробки, в подальшому можуть бути змішані з етанольним розчином сечовини для утворення комплексів. Насичені і мононенасичені жирні кислоти легко утворюють комплекси із сечовиною, кристалізуються при охолодженні і далі можуть бути видалені фільтрацією. Фракція, що не утворила комплекси із сечовиною, таким чином, збагачується ДЛ-
ПНЖК.
Продукти харчування (корми)
Цей винахід включає композиції, які можуть використовуватися як продукти харчування (корми). Для цілей цього винаходу "продукти харчування (корми)" включають будь-який продукт харчування або препарат для споживання людиною або твариною, який при надходженні в організм: (а) служить цілям живлення або утворення тканин або постачання енергією; та/або (б) підтримує, відновлює або сприяє належному харчовому статусу або метаболічній функції.
Зо Продукти харчування (корми) за винаходом включають харчові суміші для немовлят та/або дітей молодшого віку, такі як, наприклад, молочна суміш для дитячого харчування, і шрот за винаходом.
Продукти харчування (корми) за винаходом включають, наприклад, клітину за винаходом, рослину за винаходом, частину рослини за винаходом, насіння за винаходом, екстракт за винаходом, продукт способу за винаходом, продукт процесу ферментації за винаходом, або композицію разом з відповідним(и) носієм(ями). Термін "носій" використовується в найширшому значенні і включає будь-який компонент, який може мати харчове значення або не мати його. Як буде зрозуміло кваліфікованому фахівцю, носій повинен бути придатним для використання (або використовуваним в достатньо низькій концентрації) в продукті харчування (кормі), таким чином, що він не здійснює шкідливого впливу на організм, якій споживає продукт харчування (корм).
Продукт харчування (корм) за цим винаходом включає олію, ефір жирної кислоти або жирну кислоту, одержану прямо або непрямо із застосуванням способів, клітин або рослин, розкритих у цьому документі. Додатково композиція може знаходитися в твердій або рідкій формі. Крім того, композиція може містити їстівні мікронутрієнти, білок, вуглеводи, вітаміни та/або мінерали в кількостях, бажаних для конкретного застосування. Кількості цих інгредієнтів варіюватимуть залежно від того, чи призначається композиція для застосування у здорових індивідуумів або для застосування у індивідуумів з особливими потребами, наприклад, індивідуумів, які страждають на метаболічні розлади, тощо.
Приклади придатних носіїв, що мають харчове значення, включають, без обмеження, макронутрієнти, наприклад, їстівні жири, вуглеводи і білки. Приклади таких їстівних жирів включають, без обмеження, кокосове масло, олію бурячника, олію грибів, олію чорної смородини, соєву олію, а також моно- і дигліцероли. Приклади таких вуглеводів включають (без обмеження): глюкозу, їстівну лактозу і гідролізований крохмаль. Додатково, приклади білків, які можуть використовуватися в харчовій композиції за винаходом, включають (без обмеження) білки сої, оброблену електродіалізом сироватку, оброблене електродіалізомзбиране молоко, молочну сироватку або гідролізати вказаних білків.
Стосовно вітамінів і мінералів, наступне може бути додане до композицій харчових продуктів (кормів) за цим винаходом: кальцій, фосфор, калій, натрій, хлорид, магній, марганець, залізо, мідь, цинк, селен, йод, вітаміни А, Е, 0, С і вітаміни групи В. Крім того, інші такі вітаміни і бо мінерали можуть бути додані.
Компоненти, що використовуються в композиціях продукту харчування (корма) за цим винаходом, можуть бути напівочищеними або очищеними. Під напівочищеним або очищеним мається на увазі матеріал, який одержаний шляхом очищення природного матеріалу або синтезу де помо.
Додатково композиція харчового продукту (корми) за даним винаходом може бути додана до їжі навіть в тому випадку, якщо немає необхідності в добавках до раціону. Наприклад, композиція може бути додана до їжі будь-якого типу, зокрема (без обмеження): маргарин, модифіковане масло, сири, молоко, йогурт, шоколад, цукерки, легкі закуски, олії для салатів, олії для приготування їжі, кулінарні жири, м'ясо, риба і напої.
Рід Засспаготусев 5рр. використовується як при виготовленні пива, так і у виноробстві, а також як агент у випічці, особливо хліба. Крім того, інші види дріжджів, такі як дріжджі- продуценти ліпідів, включаючи, наприклад, вид Магтомжіа, є придатними для одержання ДлЛ-
ПНЖК. Дріжджі можуть використовуватися як добавка до харчування тварин, наприклад, в аквакультурі. Необхідно розуміти, що можуть бути запропоновані генетично сконструйовані штами дріжджів, адаптовані до синтезу ДЛ-ПНЖК, як розкрито в цьому документі. Такі штами дріжджів або продукуючі ДЛ-ПНЖК можуть в подальшому використовуватися в продовольчих продуктах, а також виробництві вина і пива, з метою забезпечення продуктів із підвищеним вмістом жирних кислот.
Додатково жирні кислоти, що отримують відповідно за цим винаходом, або клітини-хазяї, трансформовані таким чином, що в них містяться та експресуються цільові гени, можуть використовуватися як харчові добавки для тварин, з метою модифікації складу жирних кислот в тканині, яйці або молоці тварини до необхідного для споживання людиною або твариною.
Приклади таких тварин включають овець, велику рогату худобу, коней, домашніх птахів, наприклад, курей, тощо.
До того ж, продукти харчування (корми) за винаходом можуть використовуватися в аквакультурі, з метою підвищення рівнів жирних кислот в організмі риби або ракоподібних, таких як, наприклад, креветки, для споживання людиною або твариною. Переважно риба є лососем.
Переважні продукти харчування (корми) за винаходом є рослинами, насінням та іншими частинами рослини, такими як листя і стебла, що безпосередньо можуть використовуватися як їжа або корм для людини або тварин. Наприклад, тварини можуть безпосередньо пастися на таких рослинах, вирощуваних в полі, або їм можуть згодовуватися точніше визначені кількості в ході контрольованого годування. Винахід включає застосування таких рослин і частин рослини як їжі для підвищення рівнів ДЛ-ПНЖК в організмі людини і тварин.
Композиції
Цей винахід також включає композиції, особливо фармацевтичні композиції, що містять одну або більше жирних кислот та/або олій, одержаних із застосуванням способів за винаходом.
Фармацевтична композиція може містити одну або більше жирних кислот та/або олій, в комбінації із стандартним, відомим, нетоксичним фармацевтично прийнятним носієм, ад'ювантом або розчинником, таким як фосфатно-сольовий буфер, вода, етанол, поліоли, рослинні олії, зволожуючий агент або емульсія, наприклад, емульсія вода/олія. Композиція може знаходитися в рідкій або твердій формі. Наприклад, композиція може бути у формі пігулки, капсули, рідини для ковтання або порошку, в ін'єкційній формі або у формі мазі або крему для місцевого застосування. Необхідна текучість може підтримуватись, наприклад, шляхом підтримки необхідного розміру частинок у разі дисперсій і використовування поверхнево- активних речовин. Крім того, може бути бажаним введення ізотонічних агентів, наприклад, цукру, натрію хлориду, тощо. Окрім таких інертних розбавлювачів, композиція може містити ад'юванти, такі як зволожувачі, емульгатори і суспендувальні агенти, підсолоджувачі, смакові добавки та ароматизатори.
Суспензії разом з активними сполуками можуть містити суспендувальні агенти, такі як етоксильовані ізостеарилові спирти, складні ефіри сорбіту і поліоксиетилен сорбітану, мікрокристалічну целюлозу, мета-гідроксид алюмінію, бентоніт, агар-агар і трагакант або суміші цих субстанцій.
Тверді лікарські форми, такі як таблетки і капсули, можуть бути одержані із застосуванням способів, добре відомих з рівня техніки. Наприклад, жирні кислоти, одержані у відповідності до цього винаходу, можуть бути таблетовані із звичайними основами таблеток, такими як лактоза, сахароза і кукурудзяний крохмаль, у комбінації із зв'язувальними речовинами, такими як акація, кукурудзяний крохмаль або желатин, дезінтегрантами, такими як картопляний крохмаль або альгінова кислота, і змащувальними речовинами, такими як стеаринова кислота або магнію стеарат. Капсули можуть бути одержані шляхом об'єднання вказаних допоміжних речовин в бо желатиновій капсулі з антиоксидантами і відповідною жирною(ими) кислотою(ами).
Для внутрішньовенного введення, жирні кислоти, одержані у відповідності до цього винаходу, або їх похідні, можуть бути введені в комерційні препарати.
Типові дози конкретної жирної кислоти становлять від 0,1 мг до 20 г, при введенні від 1 до 5 разів на день (до 100 г щоденно), і переважно знаходяться в інтервалі від приблизно 10 мг до приблизно 1, 2, 5 або 10 г щодня (у вигляді однієї або декількох доз). Як відомо з рівня техніки, бажано вводити щонайменше приблизно 300 мг/день жирної кислоти, особливо ДЛ-ПНЖК.
Проте необхідно розуміти, що будь-яка кількість жирної кислоти буде корисною для суб'єкта.
Можливі способи введення фармацевтичних композицій за цим винаходом включають, наприклад, ентеральний (наприклад, пероральний і ректальний) і парентеральний. Наприклад, рідкий препарат може бути введений перорально або ректально. Додатково гомогенна суміш може бути повністю диспергована у воді, попередньо змішаній в стерильних умовах з фізіологічно прийнятними розбавлювачами, консервантами, буферами або пропелентами для одержання спрею або засобу для інгаляцій.
Дози композиції для введення пацієнту можуть бути визначені звичайним фахівцем в цій галузі техніки і залежать від різних факторів, таких як маса тіла пацієнта, вік пацієнта, загальний стан здоров'я пацієнта, анамнез пацієнта, імунний статус пацієнта, тощо.
Додатково композиції за цим винаходом можуть застосовуватися для косметичних цілей.
Вони можуть додаватися до існуючих косметичних композицій таким чином, що утворюється суміш, або жирна кислота, одержана у відповідності до цього винаходу, може використовуватися як єдиний "активний" інгредієнт в косметичній композиції.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1. Матеріали і способи
Експресія генів в клітинах рослини в системі тимчасової експресії
Екзогенні генетичні конструкції експресують в клітинах рослини в системі тимчасової експресії, як суттєво описано Моїппеї еї аІ. (2003) ї Ууоса еї аї. (2009). Плазміди, що містять кодуючу ділянку, яка експресується з високоактивного конститутивного промотору, наприклад, промотору Самм 355, вводять в Адгобрасіегішт (шптегасіеп5, штам АСІ1. Химерний ген 355:р19 для експресії вірусного супресора сайленсинга р19 окремо вводять в Асі 1, як розкрито у МО 2010/057246. Рекомбінантні клітини Адгобасіегішт вирощують за 28"С в лізогенному бульйоні
Зо (ЛЕ), що містить 50 мг/л канаміцину їі 50 мг/л рифампіцину, до стаціонарної фази. Далі бактерії гранулюють центрифугуванням при 5000 9 протягом 15 хвилин при кімнатній температурі, після чого ресуспендують до 00600 - 1,0 в інфільтраційному буфері, що містить 10 мМ морфоліноетансульфонової кислоти (МЕС), рН 5,7, 10 мМ Мас» і 100 мкМ ацетосирингону. Далі клітини інкубують за 28"С із струшуванням протягом З годин, після чого рівні об'єми культур
Адгобрасіегішт, що містять 355:р19 і досліджувану цільову химерну конструкцію(ї), змішують перед інфільтрацією листової тканини. Рослини звичайно вирощують ще протягом 5 днів після інфільтрації, після чого листові диски витягують і сушать виморожуванням для аналізу жирних кислот методом ГХ.
Складні метилові ефіри жирних кислот (МЕЖК) загальних листових ліпідів у ліофілізованих зразках одержують, інкубуючи зразки протягом 2 годин при 80"С в розчині метанол/НСі/дихлорметан (10/1/1, об/об), що містить відому кількість гексадеканової кислоти як внутрішній стандарт. МЕЖК екстрагують в гексан/дхХМ, концентрують до невеликого об'єму в гексані і вводять в прилад для ГХ. Кількість присутніх індивідуальних і загальних жирних кислот в ліпідних фракціях визначають на базі відомої кількості внутрішнього стандарту.
Аналіз жирних кислот методом газової хроматографії (ГХ)
МЕЖК аналізують методом газової хроматографії за допомогою газового хроматографа
Адііепі ТесппоЇодіеє 7890А ОС (Пало-Альто, Каліфорнія, США), обладнаного колонкою 5ОЕ-
ВРХ7О (70 95 ціанопропіл полісилфенілен-силоксану, внутрішній діаметр 0,25 мм, товщина плівки 0,25 мм) завдовжки 30 м, ПІД (плазмово-іонізаційним детектором), інжектором з розділенням/без розділення, а також серійним аутосамплером та інжектором Адіїепі
Тесппоодіеє 7693. Гелій використовують як газ-носій. Зразки вводять інжекцією в методі з розділенням (співвідношення 50:1) при температурі печі 1507. Після інжекції температуру печі підтримують на рівні 1507" протягом 1 хвилини, далі підвищують до 210"С із швидкістю
З"С/хвилину, знову підвищують до 240"С із швидкістю 50"С/хвилину і остаточно підтримують протягом 1,4 хвилин на рівні 240"С. Площу піків визначають за допомогою програмного забезпечення Адієпі ТесппоЇодіеє Спетеїайоп (версія Кем 88.04.03 (16), Пало-Альто,
Каліфорнія, США), на базі відповіді відомої кількості зовнішнього стандарту І С-411 (МиспескК) і внутрішнього стандарту С17:О-МЕ.
Аналіз ліпідів методом рідинної хроматографії-мас-спектрометрії (РХ-МС)
Загальні ліпіди екстрагують з ліофілізованого насіння, що розвивається, через 12 днів після цвітіння (дпц) і зрілого насіння після додавання відомої кількості три-С17:0-ТАГ як внутрішнього стандарту для кількісної оцінки. Екстраговані ліпіди розчиняють в 1 мл 10 мМ бутильованого гідрокситолуолу в суміші бутанол/метанол (1:1, об/об) на 5 мг сухого матеріалу і аналізують за допомогою рідинного хроматографа серії Адіїепі 1200 з РХ та іонізацією електророзпиленням за допомогою РХ-МС 64106 з трьома квадрупольними лінзами. Ліпіди хроматографічно розділяють з використанням колонки Азсепіїз Ехрге55 КР-Атіае (50 мм х 2,1 мм, 2,7 мкм, З,иреїсо) в режимі бінарного градієнта із швидкістю потоку 0,2 мл/хвилину. Рухомі фази: А. 10 мМ амонію форміату в суміші НгО/метанол/тетрагідрофуран (50:20:30 об/об/об); В. 10 мМ амонію форміату в суміші
НгО/метанол/гетрагідрофуран (5:20:75, об/об/о06). Переліки для моніторингу множинних реакцій (ММР) базуються на наступних основних жирних кислотах: 16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 18:4, 2071, 20:2, 20:3, 20:4, 20:5, 22:4, 22:5, 22:6, з використанням енергії зіткнення 30 В ії фрагментора 60
В. Індивідуальні ТАГ згідно ММР ідентифікують на базі іона амонізованого прекурсору та іона продукту, утвореного в результаті втрати нейтральних частинок 22:6. Кількість ТАГ визначають з використанням 10 мкМ зовнішнього стандарту тристеарину.
Визначення профілю жирних кислот і вмісту олії в насінні
За необхідності визначення вмісту олії в насінні, насіння сушать в ексикаторі протягом 24 годин, і приблизно 4 мг насіння переносять до скляного флакону місткістю 2 мл, із вкритою
Тефлоном нагвинчувальною кришкою. 0,05 мг тригептадеканоїну, розчиненого в 0,1 мл толуолу, додають у флакон як внутрішній стандарт.
МЕЖК насіння одержують, додаючи 0,7 мл 1 н метанольного НСІ (ЗиреїЇсо) у флакон, що містить матеріал насіння, короткочасно обробляють вихровим перемішуванням та інкубують при 80" С протягом 2 годин. Після охолодження до кімнатної температури, 0,3 мл 0,9 95 (мас/об) розчину Масі ії 0,1 мл гексану додають у флакон і ретельно перемішують протягом 10 хвилин в
НеїдоІрпи Мібгатах 110. МЕЖК збирають у скляну вставку місткістю 0,3 мл і аналізують методом
ГХ з плазмово-іонізаційним детектором (ПІД), як було згадано раніше.
Площу піку окремого МЕЖК спочатку коректують на базі відповіді у вигляді площі піку відомої кількості таких же МЕЖК, присутніх в комерційному стандарті СІ С-411 (МО-СНЕК РЕАЕР,
ІМС., США). (І С-411 містить рівні кількості 31 жирної кислоти (мас. 95), в інтервалі від С8:0 до
С22:6. У випадку жирних кислот, які відсутні в стандарті, винахідники використовували відповіді у вигляді площі піку найбільш подібного МЕЖК. Наприклад, відповідь у вигляді площі піку МЕЖК 16:149 використовували для 16147, і відповідь МЕЖК С22:6 використовували для С22:5.
Скоректовані значення площі піку використовують для обчислення маси кожного МЕЖК в зразку, в порівнянні з масою внутрішнього стандарту. Олія зберігається в основному у формі
ТАГ, і її масу обчислюють на базі маси МЕЖК. Загальну кількість моль гліцерину визначають шляхом обчислення кількості моль кожного МЕЖК і поділу загальної кількості моль МЕЖК на три. Вміст ТАГ обчислюють як суму гліцерину і жирних ацильних фрагментів, з використанням співвідношення: мас. 9о олії - 100 х ((41 х загальна кількість моль МЕЖК/З) « (загальна кількість грам МЕЖК - (15 х загальна кількість моль МЕЖК)))/грам насіння, де 41 і 15 -- молекулярна маса залишку гліцеролу і метильної групи, відповідно.
Аналіз вмісту стеролів у зразках олії
Зразки приблизно по 10 мг олії, разом з доданою аліквотою С24:0 монолу як внутрішнього стандарту, омилюють за допомогою 4 мл 5 95 розчину КОН у 80 95 МеОнН і нагрівання до 807С, витримуючи протягом 2 годин при цій температурі, у вкритій Тефлоном скляній пробірці з нагвинчувальною кришкою. Після охолодження реакційної суміші додають 2 мл води МіїйЇ-О), і стероли екстрагують 2 мл суміші гексан/дихлорметан (4:21, об./06.) при струшуванні і вихровому перемішуванні. Суміш центрифугують, екстракт стеролів витягають і промивають 2 мл води
МІ-С. Далі екстракт стеролів відокремлюють після струшування і центрифугування. Екстракт упарюють в потоку газоподібного азоту, і стероли силілюють з використанням 200 мл М,О- бис(триметилсиліл)утрифторацетаміду (БСТФА) при нагріванні до 80"С, витримуючи протягом 2 годин при цій температурі.
Для аналізу стеролів методом ГХ/ГХ-МС, похідні стерол-О-триметилсилілу (стерол-ЮОТМ5І) сушать в потоку газоподібного азоту на термоблоці при 40"С, і далі повторно розчиняють у хлороформі або гексані безпосередньо перед аналізом методом ГХ/ГХ-МС. Похідні стерол-
ОТМ5 аналізують газовою хроматографією (ГХ) за допомогою газового хроматографа Адіїепі
ТесппоЇодіеє 6890А ОС (Пало-Альто, Каліфорнія, США), обладнаного капілярною колонкою з кварцевого скла Зиреїсо Едийу 7-1 (15 м х 0,1 мм внутрішній діаметр, товщина плівки 0,1 мкм),
ПІД та інжектором з розщепленням/без розщеплення, а також серійним аутосемплером Адіїепі
Тесппоіодіеєє 7683В та інжектором. Як газ-носій використовують гелій. Інжекцію зразків бо здійснюють в режимі без розщеплення при температурі печі 120"С. Після інжекції температуру печі підвищують до 270"С із швидкістю 10"С/хвилину, і в кінці до З300"С із швидкістю 5"С/хвилину. Площу піків визначають за допомогою програмного забезпечення Адіепі
Тесппоіодіеєє Спетеїайноп (Пало-Альто, Каліфорнія, США). Результати ГХ містять помилку х 5
Фо, від значень площі піку окремих компонентів.
Аналізи методом ГХ-мас-спектрометрії (ГХ-МС) здійснюють за допомогою приладів для ГХ-
МС Ріппідап Трегтодиезі СО ії Ріппідап Тпепто ЕїІесігоп Согрогайоп 5С-М5, притому, що обидві системи обладнані інжектором для введення проб безпосередньо на колонку, і програмного забезпечення ТПпептодиеві Хсаїїриг (Остін, Техас, США). Кожний з приладів для ГХ обладнаний капілярною колонкою, полярність якої подібна до розкритої вище. Індивідуальні компоненти ідентифікують, використовуючи дані мас-спектрометрії і порівнюючи дані часу утримування з одержаними для автентичних і лабораторних стандартів. Повну методику холостого аналізу виконують паралельно із серією зразків.
Умови ЗТ-ПЛР
Ампліфікацію методом ПЛР із зворотною транскриптазою (ЗТ-ПЛР) звичайно здійснюють з використанням системи ЗТ-ПЛР Зирегзсгпрі ПШ Опе-біер (Іпийгодеп) в об'ємі 25 мкл, з використанням 10 пмоль прямого праймера і 30 пмоль зворотного праймера, Мд5О» до кінцевої концентрації 2,5 мМ, 400 нг загальної РНК з буфером і нуклеотидними компонентами згідно інструкцій виробника. Типові температурні режими були наступними: 1 цикл при температурі 45"С протягом 30 хвилин для виникнення зворотної транскрипції; потім 1 цикл при температурі 94"С протягом 2 хвилин, і далі 40 циклів з температурою 947С протягом 30 секунд, 527С протягом 30 секунд, 70"7С протягом 1 хвилини; потім 1 цикл при температурі 72"С протягом 2 хвилин перед охолодженням реакційних сумішей до 57С.
Одержання соматичних ембріонів В. пари5 за допомогою індукції за допомогою 355-І ЕС2
Насіння В. паризв (сорт О5саїг) стерилізують газоподібним хлором, як описано (Айіа Кегезв7і еї аїІ,, 2007). Стерилізоване насіння пророщують на середовищах М5 (Мигазпіде апа 5Коод, 1962) з 1/2 активності, що містять 0,8 95 агару, з корекцією рН до 5,8, і вирощують при 24"7С при освітленні флуоресцентним світлом (50 мкЕ/мес) з фотоперіодом 18/6 годин (освітлення/темрява) протягом 6-7 днів. Сім'ядольні черешки з довжиною ніжки 2-4 мм виділяють в асептичних умовах з одержаних пагонів і використовують як експланти. Культури
Зо трансформованого А. їштеїасієп5, штам АСІЇ1, одна з яких несе специфічний для насіння бінарний вектор і друга -- конструкцію 355-ГЕС2, інокулюють з одиничних колоній із свіжих планшетів та вирощують в 10 мл середовища Лурія-Бертані з відповідними антибіотиками протягом ночі при 28" С і збовтуванні із швидкістю 150 об/хв. Бактеріальні клітини збирають центрифугуванням із швидкістю 4000 об/хв протягом 5 хвилин, промивають середовищами М5, що містять 2 9о сахарози, ресуспендують в 10 мл такого ж середовища і вирощують з антибіотиками для селекції у відповідних умовах протягом 4 годин після додавання ацетосирингону до концентрації 100 мкМ. За 2 години до додавання рослинних тканин, додають спермідин до кінцевої концентрації 1,5 мМ, і кінцеву щільність бактерій доводять до 00 600 нм - 0,4 за допомогою свіжого середовища. Дві культури бактерій, одна з яких несе специфічну для насіння конструкцію, а інша несе 355-АЇІ ЕС2, змішують у співвідношеннях від 1:1 до 1:1,5.
Свіжовиділені сім'ядольні черешки В. паризх інфікують 20 мл культур А. їшптегасіеп5 протягом б хвилин. Сім'ядольні черешки промокають стерильним фільтрувальним папером для видалення надлишку А. їштеїасієпо, і далі переносять в середовища для співкультивування (середовища М5, що містять 1 мг/л тіді«азурону (ТДЗ), 01 мг/л о-нафталіноцтової кислоти (НОК), 100 мкМ ацетосирингону з додаванням І-цистеїну (50 мг/л), аскорбінової кислоти (15 мг/л) і морфоліноетанолсульфонової кислоти (МЕС, 250 мг/л)). Планшети герметизують мікропористою стрічкою та інкубують в темряві при 24"С протягом 48 годин. Співкультивовані експланти переносять у передселекційні середовища (М5, що містять 1 мг/л ТДЗ, 0,1 мг/л НОК,
З мг/л АЯМО», 250 мг/л цефотаксиму і 50 мг/л тиментину) і культивують протягом 4-5 днів при температурі 247 С з фотоперіодом 16 годин/8 годин. В подальшому експланти переносять на селекційні середовища (М5, що містять 1 мг/л ТДЗ, 0,1 мг/л НОК, З мг/л АдМОз, 250 мг/л цефотаксиму і 50 мг/л тиментину), що відповідають гену селекційного маркера на специфічному для насіння векторі, і культивують протягом 2-3 тижнів при 247С з фотоперіодом 16 годин/8 годин. Експланти із зеленим ембріогенним калюсом переносять в середовища М5, що не містять гормонів (М5, що містять З мг/л АдМО»з, 250 мг/л цефотаксиму, 50 мг/л тиментину і селекційний агент), і культивують ще протягом 2-3 тижнів. Торпедоподібні ембріони або ембріони сім'ядольної стадії, виділені з експлантів, що вижили на селекційному середовищі, аналізують щодо складу жирних кислот в загальному ліпіді методом ГХ.
Приклад 2. Стабільна експресія трансгенних біохімічних шляхів ДГК в насінні Агабідорвів 60 ІТаїїапа
Конструкція бінарного вектора
Бінарні вектори руР3416-с5А7 і руРЗ3404, кожен з яких містить 7 гетерологічних генів біосинтезу жирних кислот, кодуючих 5 десатураз і 2 елонгази, та селекційний маркер для рослин між повторами лівої і правої меж Т-ДНК, присутніми в кожному векторі (Фіг. 2 і 3). У ЗЕО
ІО МО: 1 розкрита нуклеотидна послідовність ділянки Т-ДНК руР3416-сА?7 від правої до лівої граничних послідовностей. Обидві генетичні конструкції містять рослинні кодон-оптимізовані гени, що кодують А12-десатуразу І аспапсеа Кісумегі (містить нуклеотиди 14143--16648 із БЕО ІЮ
МО: 1), ю3-десатуразу Ріспіа равіогі5 (містить нуклеотиди 7654-10156 із БЕО ІЮО МО: 1), Дб- десатуразу Місготопах ризійа (містить нуклеотиди 226-2309 із 5ЕБО ІЮО МО: 1), Д5Б- і дА- десатурази Раміома заїїпа (містять нуклеотиди 4524-6485 і 10157-14142 із 5ЕО ІЮ МО: 1, відповідно) і Дб- і Д5-елонгази Ругатітопа5 согдаїа (містить нуклеотиди 2310-4523 і 17825- 19967 із 5ЕО ІЮ МО: 1, відповідно). Конкретні ділянки Т-ДНК (орієнтація: від правої до лівої граничної послідовності) бінарного вектора руР3416-СА7 щодо 5ЕО ІО МО: 1 є наступними: нуклеотиди 1-163: права межа; 480-226, термінатор нопалінсинтази Аадгобасіегійт їмтеїасієпе (ТЕН МОБ); 1883-489, Аб-десатураза Місготопа5 ри5Ша; 2309-1952, вкорочений промотор напіну Вгаззіса пари5 (РВО ЕР); 2310-3243, промотор ЕАЕ1 Агабідорвів ІНаїїапа (РВО ЕБЕАЕЇТ1); 3312-4181, Аб-елонгаза Ругатітопа5 согдага; 4190-4523, термінатор лектину
СПіусіпе тах (ТЕВ І есійп); 4524-4881, РВО ЕРІ; 4950-6230: Д5-десатураза Раміома заїїпа; 6231-6485: ТЕН МОБ; 7653-6486, ділянка прикріплення до матриксу КБ7 Місойапа їабасит (ДПМ); 8387-7654, термінатор конлініну 1 Ііпит ивПаїйввітит (ТЕЙ Спі!); 9638-8388, Ф3- десатураза Рісніа разіогіє; 10156-9707, промотор конлініну 1 І іпит ивіайввзітит (РО Спі!); 10157-12189, промотор конлініну 1 Гіпит изйайзвітит; 12258-13604, Д4-десатураза Раміома запа; 13605-14142, термінатор конлініну 2 Гіпит изйаїййббітит; 14143-14592, РВО Спі!; 14661-15914, Д12-десатураза І аспапсеа Кісумегі; 15915-16648, ТЕН Спі!; 17816-16649, ДПМ; 17825-18758, РВО ЕАЕТ; 18827-19633, Д5-елонгаза Ругатітопаб5 согдаїа; 19634-19967,
ТЕА Гесійп; 19990-20527, промотор вірусу мозаїки цвітної капусти 355 з подвоєною ділянкою енхансера; 20537-21088, гени фосфінотрицин-М-ацетилтрансферази 5ігеріотусез мігідоспгото; 21097-21349, ТЕН МОБ; 21367-21527, ліва межа.
Кожна із 7 кодуючих ділянок в конструкціях знаходиться під контролем специфічного для
Зо насіння промотору, причому використовуються три різних промотори, а саме вкорочений промотор напіну Вгаззіса пари5 (рВпЕР'1), промотор Агарідорзі5 Іпайапа ЕАЕ1 (рАгАЕЇ) і промотор конлініну 1 Гіпит и5наїййввітит (рі иСпі!). Сім генів біосинтезу жирних кислот спільно кодують повний біохімічний шлях синтезу ДГК, сконструйований з метою перетворення 18:149 (олеїнова кислота) на 22:б4и710,13,16и19 (ДГК). Обидва бінарні вектори містять селекційний маркер для рослин ВАК, кодуючий ділянку, функціонально пов'язану з промотором вірусу мозаїки цвітної капусти 355 (Саму), що містить подвоєну ділянку енхансера, а також з термінатором транскрипції-ділянкою поліаденілювання по53' А. Шшптегасіеп5. Селекційний маркер для рослин розташований суміжно з лівою межею Т-ДНК, тобто, дистально на Т-ДНК відносно орієнтації перенесення Т-ДНК в клітини рослини. Це підвищує вірогідність того, що часткове перенесення
Т-ДНК, яке, ймовірно, не включає ген селекційного маркера, не пройде селекцію. Кожний з руРЗ416-сА?7 і руРЗ3404 містить джерело реплікації КІА4 з Адгобасієегішт гпі2годепез5 (Натійоп, 1997). руРЗ416-сА7 генерують шляхом синтезу ділянки ДНК, що відповідає нуклеотидам 226- 19975 5ЕО ІО МО: 1 (ділянка СА?) і вставки даної ділянки в бінарний вектор-реципієнт рОР3416 на сайті РорОМІ. Кожен ген біосинтезу жирних кислот на СА7 містить послідовність 5' нетрансльованої ділянки (5'ЮТК) вірусу мозаїки тютюну, функціонально пов'язану з кожною кодуючою ділянкою, між промотором і кодоном ініціації трансляції АТО, з метою максимізації ефективності трансляції мРНК, одержаних з генів. Конструкція ЗА також містить дві послідовності ділянки прикріплення до матриксу Кр7 (ДПМ) Місоїапа їабасит, як описано Наї! єї аІ. (1991). Послідовності ДПМ, які іноді називають ядерними ділянками прикріплення, відомі як такі, що специфічно зв'язуються з ядерним матриксом іп міго і можуть опосередкувати зв'язування хроматину з ядерним матриксом іп мімо. Вважається, що ДПМ зменшують сайленсинг трансгена. У руР3416-ЗА7 ДПМ також вставлені і розташовані в межах ділянки Т-
ДНК для того, щоб вони виконували функцію розпірок ДНК, з метою ізоляції трансгенних касет експресії. Вектор руР3416 перед вставкою ділянки СА7 містить тільки касету селекційного маркера для рослин між межами.
Генетичну конструкцію руР3404 одержують послідовною вставкою, що базується на рестрикційних ферментах, в ході якої касети генів додають до бінарного вектора, руР3367, який містить гени для продукування СДК у насінні. Дана конструкція містить гени, що кодують А12- бо десатуразу Г. Кісумегі і Ф3З-десатуразу Р. равіогіз, причому обидва експресуються вкороченим промотором напіну В. парив (ЕРІ), ії Дб-десатуразу М. ризійа, експресовану промотором ЕАЕ1
А. ІНаїіапа (Фіг. 4). Спочатку, інтрон ЕАбВа А. Іпаійапа фланкують сайтами Есокі їі клонують в сайт
Ме! руР3367 з одержанням руРЗ3395. Фрагмент, що містить касети Дб- і Д5-елонгази Р. согдаїа під контролем промоторів ЕАЕТ1 і ЕРІТ, відповідно, клонують в сайт Казі рОР3395 з одержанням руР3398. Далі одержують руР3399 шляхом заміни джерела реплікації КК2 в руР3398 джерелом реплікації КіА4. Кінцевий бінарний вектор рО)Р3404 одержують шляхом клонування 5БбІІ- фланкованого фрагмента, що містить касети Д5- і Д4-десатурази Р. заїйпа під контролем промоторів ЕР і РАЕТ, відповідно, у сайт БОБИ рурР3399.
Трансформація А. ІНаїапа і аналіз складу жирних кислот
Химерні вектори вводять в А. ішптегасієп5, штам АСІ 1, і клітини з культур трансформованої
Адгобрасієгійт використовують для обробки. рослин А. ІПаїїапа (екотипи СоЇштрбіа і мутант тадг), застосовуючи для трансформації спосіб занурення квіток (Сіоцдпй апа Вепі, 1998). Після дозрівання врожай зерен Ті з оброблених рослин збирають і наносять на планшети М5, що містять фосфінотрицин (ФФТ), з метою селекції рослин, що містять ген селекційного маркера
ВАК. Саджанці Ті, що вижили і є здоровими, переносять в грунт. Після вирощування рослин до стану зрілості і надання їм можливості для самозапліднення, збирають урожай зерен То з одержаних рослин, і склад жирних кислот у ліпіді їх насіння аналізують за методом ГХ, як розкрито у Прикладі 1.
Дані щодо рівня ДГК в ліпідах насіння проілюстровані на Фіг. 5 (вузькі доріжки з відміткою Т2) для 13 трансформантів з руРЗ3416-ЗА7, введеним в генетичний фон СоіІштбіа, і для 6 трансформантів з використанням мутанта їайд2. Конструкція руР3416-ЗА7 приводить до продукування дещо вищих рівнів ДГК, виражених як відсоток від загального вмісту жирних кислот, в середньому щодо конструкції роР3404. У Табл. 4 наведений склад жирних кислот в загальному ліпіді насіння ліній Т2 з найвищими рівнями ДГК. Обчислена ефективність перетворення для кожної стадії ферментації в продукуванні ДГК з олеїнової кислоти в тому ж насінні наведена в Табл. 5. Ефективність перетворення обчислена як ( 95 продуктів х 100)/( 95 субстрату, що залишився - 95 продуктів), і таким чином виражена у відсотках.
Найвищий спостережуваний рівень продукування ДГК в трансформованих руР3416-сА7 лініях То становить 6,2 95, додатково з 0,5 95 ЕПК і 0,2 95 ДПК (лінія 214). Вказане насіння Тег все
Зо ще було сегрегованим по трансгену, тобто ще не було однорідно гомозиготним. Компільовані дані з профілів загального ліпіду насіння для незалежного трансгенного насіння (Табл. 4) наведені в Табл. 6. Рівень 003 жирних кислот, продукованих в результаті наявності трансгенів в цьому насінні (нові загальні 003 жирні кислоти, за винятком рівня АЛК, яка виробляється ендогенно в екотипі СоЇштрбіа), становить 10,7 95, тоді як рівень 06 жирних кислот (нові загальні 0б жирні кислоти, за винятком 18:2289и12) становить 1,5 95. Це представляє надзвичайно сприятливе співвідношення нових 003 жирних кислот : нових 06 жирних кислот, а саме 7,3:1.
Насіння Т» відібраних ліній, трансформованих роР3416-сА7, а саме ліній, позначених 7, 10, 14, 22 їі 34 в екотипі СоЇштріа, і ліній, позначених 18, 21 і 25 в мутанті екотипі Тад2, наносять на планшети із середовищами М5, що містять ФФТ, для селекції трансгенних саджанців іп міго. По 20 ФФТ-резистентних саджанців з кожної лінії переносять в грунт і вирощують до стану зрілості після самозапліднення. Було високою мірою вірогідним, що ці рослини будуть гомозиготними по гену селекційного маркера, і таким чином, містити щонайменше по одній вставці Т-ДНК в геномі рослин. Урожай зерен Тз з цих рослин збирають і аналізують склад жирних кислот в олії з насіння за методом ГХ. Дані наведені в Табл. 7. Даний аналіз виявив, що конструкції руб 3416-
СА7 генерують вищі рівні 03 ДЛ-ПНЖК ДГК в насінні Тз гомозиготних рослин, ніж в сегрегованому насінні Т2. До приблизно 13,9 95 ДГК спостерігається в трансформованій руУРЗ416-сА7 лінії Тз, позначеній 22.2 в екотипі СоІштбріа, що означає збільшення з рівня приблизно 5,5 95 в гемізиготному насінні Т2, причому сумарний рівень нових 03 жирних кислот становить приблизно 24,3 95 від вмісту загальних жирних кислот в ліпіді насіння. Рівень нових 06 жирних кислот становить 1,1 95 від загальних жирних кислот, представляючи високою мірою сприятливе співвідношення нових 003 жирних кислот : нових 0б жирних кислот, а саме, приблизно 22:1. Так само, трансформанти в екотипі Ттад2 дають сумарну кількість нових 03 жирних кислот 20,6 95, включаючи 11,5 95 ДГК, як відсоток від загального вмісту жирних кислот в ліпіді насіння.
Таблиця 4
Склад жирних кислот загальних ліпідів насіння незалежного трансгенного насіння Тег Агарідорзів з рівнями ДГК на верхній межі спостережуваного інтервалу. "Со!" позначає екотип СоЇштрбіа, і "ЕАБ2" позначає мутантний екотип їад2. "ЗА7" позначає трансформацію за допомогою Т-ДНК з вектора рОРЗ3416-СА7, рОРЗ404 - за допомогою Т-ДНК з вектора руР3404. Жирні кислоти 20:1п-9 і 2011-11 не розділяли в ході аналізу ГХ. "Інші незначні" жирні кислоти включають 14:0, 16:1п7, 16:1п9, 161113, 16:2п6, 16:3Зп3, і18:0, 18:1п5, 20:1п5, 22:0, 22117, 22:1п11/п13, 24:0, 247119. сА7 ІБА7 |йА7 ІБА7 |(БА7 |ША7 |(БА7 |2А7 ру пвлоисо Ро чої вАго Сої ЯіСої йСої ЖСої ЖСої ЯЕАОгІЕАОгІ| гАО? - - 34 2 10 | 22 |) 14 | я25| яЯ2г1| я18 160 | 96 | 78 | 87 |82|87|86|83197|72| 85 | 75 18 2011913 20:149/а11 221413 11 181149 18206 | 289 | 2893 | 164 |161 0 182|13,7|13,7|114| 66 | 166) 43 18:303 г 18:306 20:26 20306 | 00 | 00 | 00 001|00/|00Щ|00Щ100 0010010 20406 | 00 | 00 | 00 00|00/|00Щ|00Щ100 0010010 22:406 | 16 | 06 | 03 03|03|04|05104 05104 04 22:506 | 01 2 | о | 00 00|001|001|00Щ100 00100100 г 18:43 20303 | 00 | 00 | 00 1 061|00/|00106107 0010806 20403 | 04 | 06 | 06 071|05108/|081|04 71010808 20:503 | 02 2 | 02 | 03 031|03/|031|07|0506|04/|05 22:503 | 00 | 02 | 02 02|02|02|02|02 0310303 22:603
Таблиця 5
Ефективність перетворення для окремих ферментних стадій в процесі одержання ДГК з олеїнової кислоти, що спостерігалася в загальних ліпідах насіння незалежного трансгенного насіння, наведеного в Табл. 4.
ДАРУ о Я 2. йЗ Я | яз | я2 | йо | І йо2 | 4 |02 я25|02 я21|02 8 (йт2-дес| 69695 | 62595 )|664951|666951| 66,7 95 | 67,595 | 70,2 95 | 72,7 95 | 45,9 95 | 69,5 95 | 53,7 95 о фа5-дес| 39895 | 37,95 )|661951|66,895| бг,396| 72195| 72,7 95| 77,2 95 | 79,7 9ь | 66,0 95 | 88.1 95
ГГ
Ов Гав-ело| 71495 | 5без 83355 83455 83,05 84735 70,35 74595 85,55 66,15 880 6 11111
Омега
Таблиця 5
Ефективність перетворення для окремих ферментних стадій в процесі одержання ДГК з олеїнової кислоти, що спостерігалася в загальних ліпідах насіння незалежного трансгенного насіння, наведеного в Табл. 4. руРз3404 С рІРЗаб04 РАСА? СопЗА7 СойА?7 СоїйА7 Со|йА7 Со(А7 Со|йА7 РАЗА? РАСА? БА ої Я 2 31 Я ШЕ 2 по | 1822 | Яй4 02 Я25102 я21102 Я18 80,6 95 86,6 95 77,7 96 | 79,6 95 | 79,4 95 | 77,5 95 | 72,7 95 | 73,0 95 | 76,7 95 | 77,4 95 | 79,2 95 93,7 96 92,1 95 91,7 95 | 91,4 95 | 91,5 95 | 92,6 95 | 89,6 95 | 92,4 95 | 88,0 95 | 91,8 95 | 91,0 95 93,7 96 92,1 96 91,7 95 | 91,4 95 | 91,5 95 | 92,6 95 | 89,6 95 | 92,4 95 | 88,0 95 | 91,8 95 | 91,0 965 100,0 о 90,6 до 94,8 9о | 94,0 95 | 95,3 9о | 94,4 95 | 95,8 95 | 96,9 95 | 93,1 95 | 92,9 95 | 94,2 95
Таблиця 6
Компільовані дані з профілів загального ліпіду насіння для незалежного трансгенного насіння, наведеного в Табл. 2. Обчислення не включають "незначні жирні кислоти" в Табл. 4. руУРЗа40 | роРЗ40 СА7 ЕЕ | БА Е | БАХ БЕ
Параметр її РА ЗАС ВАТ ол ст ЗАТОКИ о ДОБ Ася | Сея с: 2 31 - - - - - - 25 21 18
Загальні м/З ( 95 від
Загальні мб ( 95 від ває 0066 о! те | оо 0 те) ав, ов | 33 зе те5 | гав
МЗЛУб
Співвідношеня ни Пт» зи фою|ою ою пою ов св.
Загальні нові м/З ( 96 відсагльшююю 352039 | 53 | 60) 54 67 | ю"| ви | вв | вт
Загальні нові му/б ( 96 відзатльшоюю 20 | 27 | 15 | 6) те) 7 | 15 тю | го | ов
Співвідношеня 130 | 144 | 353 | 3,75 | Зи8 | 447 | вбив | 713 | 810 |) 425 | 967 нових ЗЛУ
Співвідношеня вовхнемо 0077 | 069 | 02 | 02 оз) га ол | сля ог | я | оо
Ефективність перетворення ОКна | 4,895 | 5,595 | 4,395 | 4495 | 4,795 | 5495 | 7,995 | 8,890 | 6,390 | 64996 | 6,7 95
ЕПК
Ефективність перетворення ОКна | 4,595 | 3,095 | З,/9У0 | 3,895 | 4,195 | 4,895 | 6890 | 7,990 | 5,290 | 5,590 | 5,895 дк
Ефективність перетворенняЛКна | 6,995 | 5,695 | б бою | 68595 | 7,205 | 8,195 | 11,4 95| 12,295| 13,895 | 9,3 90 | 12,7 95
ЕПК
Ефективність перетворенняЛКна | 6,695 | 4,895 | 5,790 | 5,895 | 6,390 | 7,290 | 9890 |11,095| 11,495| 8,095 | 10,9 95 дк
Ефективність перетворення АЛК 17,4951| 14,995| 10,095 | 10,1 95 | 11,6 95 | 11,93 95 | 15,6 95 | 15,9.95 | 17,9 95 | 14,1 95 | 14,4 95 на ЕПК
Ефективність перетворення АЛК 16,595| 12,895| 8,69 | 8,7 9ю | 10,095 | 10,05 | 13,4 95 ) 14,395 | 14,93 96 | 12,2 95 | 12,4 95 на ДГК
Загальні насичені
Загальні мононенасичені 29,3 34,7 31,4 312 31,4 31,0 28,7 26,6 48,7 29,1 42,3 жирні кислоти
Загальні поліненасичені 54,7 49,8 52,8 53,3 52,8 54,3 56,3 56,4 37,6 54,8 44,0 жирні кислоти
Загальні С20
Загальні С22
Співвідношення
Таблиця 7
Склад жирних кислот загального ліпіду насіння для незалежного трансгенного насіння нащадків
Тз і Та Агарідорзі5, одержаних з ліній рослин, наведених в Табл. 3. Помилка, вказана в поколінні
Та, позначає стандартне відхилення (3) для п--10.
Та Со! 22.2 Та
СА7 СС ду САТ С с д7 СОАТ С С,СА7 РЗА7 РА? Б) (середнє Сої 22.2 о! 101 ої 14.1А02 2ІА02 2ІАВІ2 1 |значення -- о! 7.2 рі 342 о! 22.2 (краща
З 9 5.10 | 1.2 | 8.14 |Істандартне| " . . лінія) відхилення) 160 98/90 /|95|112|т104| Ви |107| 77 | 0609 122 гола 12 | 12 | 08 | 06 | 16 | 10 | 1 | 15 | бом | 08 пед Я п Я ПНЯ ПОЛЯ ПОН КОНЯ КОКОН НОЯ ОХ о лвлаз 55 | 67 | 68 | 46 | 69 | 113| 42 |115| 4610 | 33 18206 75 | 79 | 74 | 56 |148)| 58) 89 | 56 | 53509 43 пед Я По Я ПНЯ ПОЛЯ ПОЛЯ ПОЛОН КОНЯ НО ОХ лав 02 0202104 |0|03|06 | о | оно | 04 20206 10 | то | 0707 | 14 | 06 | 12 | 06 | бом | 09 20306 | 0 | 0 | 0 0 | 0 | 0 | 0 0 / 20406 | 0 | 0 | 0 0 | 0 | 0 | 0 0 / 22406 | 0 | 0 | о | о | о | о | о | о | олябо | ом 22506 | 0 | 0 | 0 0 | 0 | 0 | 0 0 / недо Я п Я ПНЯ ПОЛЯ ПОЛЯ КОНЯ КОНЯ НОЯ ПОН 20403 07 | 06060902) 17109109 | 08502 | 08 205503 09109107 1|19|08| 72 |10 | 08 | 15503 18 22503 | 07/06/0610 |04|08|06|05)| 11-02 | 15 22603 | 95 | 92 | 94 |139)| 66 | 103| 115) 79 | 3316) 15
Ефективність ферментного перетворення для кожної ферментної стадії в біохімічному шляху одержання ДГК з олеїнової кислоти наведена в Табл. 8 для насіння Тз з вищими рівнями
ДГК. Ефективність перетворення під дією А12-десатурази в насінні лінії 22.2 становила 81,6 905, і ефективність 03-десатурази становила 89,1 95, причому обидва значення є досить високими і вказують на те, що дані грибкові (дріжджові) ферменти можуть добре функціонувати в насінні, що розвивається. Активність інших екзогенних ферментів в дорозі ДГК була подібним чином високою по відношенню до субстратів 03, причому ефективність Дб-десатурази становить 42,2
Фо, Дб-елонгази - 76,8 95, Д5-десатурази - 95,0 95, Д5-елонгази - 88,7 95 і Л4-десатурази - 93,3 Фо.
Активність Дб-десатурази по відношенню до субстрату 06 ЛК є набагато нижчою, і ефективність перетворення ЛК під дією Дб-десатурази становить тільки 0,7 95. ГЛК присутній на рівні всього 0,4 95 і являє собою єдиний новий продукт 06, за винятком 20:206, знайденої в насінні Тз з найвищим вмістом ДГК. Компільовані дані з профілів загального ліпіду насіння для незалежного трансгенного насіння (Табл. 7) наведені в Табл. 9. Такі дані для лінії з найвищим рівнем ДГК включають співвідношення загального вмісту об ФК (зокрема, ЛК) до загального вмісту 03 ФК (зокрема, АЛК), що дорівнює 0,10. Співвідношення нових 006 ФК (за винятком ЛК) і нових 03 ФК (за винятком АЛК) в ліпіді даної лінії становило 0,05. Рівні загальних поліненасичених жирних кислот становлять більше 50 95 в даних лініях, і перевищують 60 95 щонайменше в 4 лініях.
Загальна ефективність перетворення обчислена як: ОК на ЕПК - 21,8 95, ОК на ДГК - 18,0 95,
ЛК на ЕПК - 26,9 95, ЛК на ДГК - 22,2 95, АЛК на ЕПК - 30,1 95, АЛК на ДГК - 24,9 95.
Таблиця 8
Ефективність перетворення для окремих ферментних стадій одержання ДГК з олеїнової кислоти, що спостерігалася в загальних ліпідах насіння для трансгенного насіння Тз Агарідорзвів, наведеного в Табл. 7.
Та
Со! 22.2 (середнє Та
ША? |СА7 |СА? |СА7 СА? |СА05|СА Або | значення Сої 22.2
Со! 7 |Сої! З| Со! 1 | Со! 2 | Со! 1 ов ЕАО2 181 щ/- (найк- 2 42 | 013) 2.2 | 419 ЩІ 21.2 тА стандар- раща тне лінія) відхилен- ня) 00 Тат2-дес 75,4 95173,1 95І75,7 95181,6 951734 95166,6 95178,5 95І63,1 95 67,695 | 82,7 95 00 Тат5-дес І85,3 95184,4 95І86,2 95189,1 95170,2 95187,5 95182,2. 95187, 95 81,095 | 90,9 95 пи и п ПИ ПНЯ ПОН ПОН ПОН КОЛОНИ КОНЯ КОН КО
Омегав Ябелоїї 11117111 дбдес|./// |! ГГ дбелоЇї./// ЇЇ Г11171Г11171Г111ГГгч, дядесє|.// ЇЇ пли и ПО Я ПНЯ КОНЯ ПОН ПОЛОН КОНЯ НОЮ КОН КОН /аб-дес |30,7 95|29,3 95І28,2 96|42,2 95130,2 95І38,5 95140,0 95І29,2 95 41,095 | 45,7 95
Омега з/ 9б-ело 179,0 95ІВ1,1 9рІ79,0 95176,8 95170,9 95179,2 965173,2 965179, 90 77,59 | 77,7 9 абБ-дес 194,0 95194,6 95194,5 95І95,0 95197,9 95187,8 95193,3 95191,1 95І 95,095 | 95,89 аб-ело |91,9 95191,7 95193,6 95188, 7 95І89,5 95189,9 95192,2 95191,6 95| 90,895 | 90,2 95 / ад-дес |93,2 95193,7 951944 95193,3 95І93,7 95І92,5 95І95,0 95193,9 95| 92295 | 90,9 95
Таблиця 9
Компільовані дані з профілів загальних ліпідів насіння для незалежного трансгенного насіння, наведеного в Табл. 5. Обчислення не включають "незначні жирні кислоти", як в Табл. 7.
Та
Со! 22.2 (середнє пА7 С СА7 СіЗА7 ГА РА г Та Со! 22.2
Параметр Аза аюі 10 рою 14 доро г|Ар2 гідро ення (найкраща -ерозта 3 роєєє о | 5БЛО| 42 | 814 стан) лінія) дартне відхи- лення)
Загальні м/З ( 90 від загальних 50,0 | 48,9 1 51,61 55,68 | 38,6 | 47,1 | 494 | 44,68 54,0 55,9
ЖК)
Загальні ж/б ( 90 від загальних 8,7 91 8,3 б, | 16,3 | 6,7 | 10,7 | 6 6,7 5,7
ЖК) м Злив
Співвідношення | 447 | оче | олв | 02 | 042 | 04 | 02201402 оо м б/лмЗ
Загальні нові м/З (95 від 16,5 | 152 | 1551 243 | 12,5 | 18,8 | 20,5 | 140 23,0 26,4 загальних ЖК)
Таблиця 9
Компільовані дані з профілів загальних ліпідів насіння для незалежного трансгенного насіння, наведеного в Табл. 5. Обчислення не включають "незначні жирні кислоти", як в Табл. 7.
Та
Со! 22.2 (середнє пА7 С аА7 СідА7 БА БА Е Та Со! 22.2
Параметр ей 104 А дозою 14 Ар гІАро гІАро т тення (найкраща ши и З ВТ 9 510 12 1814 7 лінія) дартне відхи- лення)
Загальні нові м/б (95 від 12 12 1,1 1,5 1,8 0,7 1,4 1,4 загальних ЖК) нових м/ЗЛУб ки ви ме з» о|ат| ме ою оо зле| о нових мблиЗ
Ефективність перетворення //|14,1 9вІ13,3 ФоІ13,4 95121,8 95110,2 УоІ15,0 У0І16,8 9оІ11,2 95! 20,4 95 24,5 905
ОК на ЕПК
Ефективність перетворення /12,0 9в|11,4 ФоІ11,8 95118,0 95 8,6 95 112,6 90148 Ус 9,6 90 | 17,1 90 20,1 96
ОК на ДГК
Ефективність перетворення /18,9 9в|18,4 Фо117,9 95126,9 95114,2 УвІ22,9 Уві21,8 Усі18,0 95| 26,2 90 29,9 до
ЛК на ЕПК
Ефективність перетворення /|16,2 9вІ15,9 ФеІ15,7 95122,2 90112,0 Уо119,1 019,1 У0І15,5 95| 21,9 95 24,5 905
ЛК на ДГК
Ефективність перетворення /|22,2 Ув|21,9 чеІ20,7 905130,1 95120,2 У026,1 Уоі26,5 020,5 95|. 29,4 95 32,9 чо
АЛК на ЕПК
Ефективність перетворення /19,0 95|18,8 Фоі18,2 95124,9 95117,1 У0І21,9 УоІі23,3 УоІ17,6 95| 24,6 90 27,0 96
АЛК на ДГК
Загальні насичені жирні 16,0) 14,7 | 154 ) 16,0 | 16,2 | 13,4 | 16,5 | 12,9 16,0 17,6 кислоти
Загальні мононенасичені | 23,7 | 25,8 | 234 | 192 126,51 30,9. 21,3 | 34,3 21,1 18,1 жирні кислоти
Загальні поліненасичені | 58,7 | 58,01 5991 62,5 | 54,9.153,8 | 601 | 511 60,7 61,6 жирні кислоти
Загальніс22 |114| 11 |108/|155)| 86 | 21 | 132 99 | 154 | 175
Співвідношення
Насіння Тз лінії руР3416-СА?7 22.2 в екотипі СоЇштбіа, що є нащадками лінії Те» 22, висівають безпосередньо в грунт, і склад жирних кислот в зрілому насінні одержаних в результаті рослин
Тз аналізують за методом ГХ. Середній рівень ДГК в цьому насінні становить 13,3 95 ж 1,6 (п - 10) як відсоток від загальних жирних кислот в ліпіді насіння. Як проілюстровано в Табл. 6 (права колонка), лінія з найвищим рівнем ДГК містить 15,1 95 ДГК від загального вмісту жирних кислот в ліпіді насіння. Ферментна ефективність перетворення наведена в Табл. 8 для кожної стадії одержання ДГК з олеїнової кислоти.
Співвідношення загального вмісту б ФК (зокрема, ЛК) до загального вмісту 03 ФК (зокрема, АЛК) в лінії з найвищим рівнем ДГК становило 0,102. Співвідношення нових об ФК (за винятком ЛК) і нових 03 ФК (за винятком АЛК) в лінії з найвищим рівнем ДГК становило 0,053.
Рівень загальних насичених жирних кислот становив приблизно 17,8 95, і рівень загальних мононенасичених жирних кислот становив близько 18,1 95. Рівень загальних Фб-жирних кислот становив близько 5,7 95, і рівень фЗ-жирних кислот становив близько 55,9 95. Обчислена загальна ефективність перетворення становила: ОК на ЕПК - 24,5 95, ОК на ДГК - 20,1 95, ЛК на
ЕПК - 29,9 95, ЛК на ДГК - 24,5 95, АЛК на ЕПК - 32,9 95, АЛК на ДГК - 27,0 95. Знайдено, що загальні омега-3 жирні кислоти акумулюються на рівні 55,9 95 від загальних жирних кислот, тоді як омега-6 жирні кислоти складають 5,7 95 від загального профілю.
Здійснюють аналіз гібридизації методом саузерн-блоту. Результати показують, що лінії з високим рівнем акумуляція ДГК містять одинарну або подвійну копію Т-ДНК з конструкції руРЗ416-сА?7, за винятком трансгенної лінії Соїшмтбріа 22, що містить три вставки Т-ДНК в геномі рослини Агабрідор5хі5. Насіння покоління Т5 також проаналізоване, і знайдено вміст до 13,6 95 ДГК в загальних ліпідах насіння. Конструкція (ЗА7 продемонструвала стабільність протягом декількох поколінь з точки зору здатності до утворення ДГК.
Визначення вмісту олії в трансгенних лініях А. Іпаіапа ДГК
Вміст олії в трансгенному насінні А. ІПаїіапа з різними рівнями ДГК визначають за методом
ГХ, як розкрито в Прикладі 1. Дані проілюстровані на Фіг. 6, на якій наведений графік вмісту олії (95 олії від маси насіння) проти вмісту ДГК (як відсотка від загальних жирних кислот). Знайдено до 26,5 мг ДГК на грам насіння (Табл. 10). Знайдено, що вміст олії в трансгенному насінні
Агарідорзі5 негативно корелює з вмістом ДГК. Кількість ДГК на масу насіння була великою в трансформованому насінні, з рівнем ДГК приблизно 9 95 відносно насіння із вмістом ДГК приблизно 14 95. Чи буде це справедливо для іншого насіння, окрім Агабрідорвзі5, встановлено не було.
Таблиця 10
Частка і кількість ДГК в насінні трансформованого СА? Агарідорзвів. ати р якокннекоі вки грам насіння мг/г насіння аА?7/сої 22.2-1 142 14,89 202 аА?7/сої 22.2-2 143 15,02 20,5 аА?7/сої! 22.2-3 14,0 15,92 21,2 сіА?Т/сої 10.15-1 8,7 30,23 25,06 сА?7/сої 10.15-2 8,6 31,25 25,77
СА?7/сої! 10.15-3 8,6 31,70 26,49
Приклад 3. Стабільна експресія трансгенного шляху ДГК в насінні Сатеїїйпа 5аїїма
Бінарний вектор руР3416-А7, розкритий вище, вводять в штам А. Штегасіеп5 АСІ1, і
Зо клітини з культури трансформованої Адгобасіепйцт використовують для обробки квітучої рослини С. заїїма, із застосуванням способу занурення квіток для трансформації (І и апа Капод, 2008). Після вирощування і дозрівання рослин, урожай насіння Ті. з оброблених рослин збирають, висівають в грунт, і одержані в результаті рослини обробляють шляхом обприскування гербіцидом ВАБЗТА для селекції трансгенних рослин, що експресують ген селекційного маркера баг на Т-ДНК руР3416-сА?Т7. Рослини Ті, що вижили і є толерантними до гербіциду, вирощують до стану зрілості після того, як їм дають можливість самозапліднення, і збирають урожай насіння То, що утворилося. П'ять трансгенних рослин були одержані, тільки три з них містили повну Т-ДНК.
Ліпід екстрагують з пулу приблизно 20 насінин кожної з трьох рослин, що містили повну Т-
ДНК. Два з об'єднаних в пул зразків містили дуже низькі, ледве знайдені рівні ДГК, але третій пул зразків містив приблизно 4,7 95 ДГК (Табл. 12). Таким чином, ліпід був витягнутий із 10 індивідуальних насінин Т2 даної рослини, і склад жирних кислот проаналізований методом ГХ.
Дані щодо складу жирних кислот індивідуального насіння для даної трансформованої лінії також наведені в Табл. 11. Компільовані дані з профілів (Табл. 11) загального ліпіду насіння наведені в Табл. 12.
Таблиця 11
Склад жирних кислот загальних ліпідів насіння з трансгенного насіння Тг Сатвеїіїпа заїїма, трансформованих Т-ДНК з рОР3416-СА7. Склад жирних кислот наведений для об'єднаної в пул серії (ЕО5.46) насіння і для 10 окремих насінин, ранжируваних (зліва направо) від найвищого до найнижчого рівня ДГК.
Пул 140 | 0 1 021|02|о011|021|02|02 02|о01 02 /| 02 167 | 02 | 00|о01|о011|001|021|00 02|02 02 | ог 163 | 03 | 0 |о00|001|00|00|00 00 |о00 00 | оо 187 | 108 8080 | 86 | 8594 | 110 т102| 83 | 94 | 86 18306 | 02 14 |03|031|04|02|05 00105 04/06 18453 | 22 | 68 |64 | 57 | 72 | 57 | 41 00 | 00 00 | 00 2блію, | 04 03103 |031|03|03|00 05106 05/05 202юв6 | 08 | 08109108 /|06|08|07 13 | 15 | 14 | 14 20303 | 06 / 08108108 /07|08|07 06107 0 | 06 220 | 04 1 051|051051|04|051|05 06/06 0606 20453 | 02 | 031|03|031|04| 04 | 05 00|00 00 | 00 221 | 111 | 12 | 1 | 05 | 09 | 08 | 16 | 22 | 19 | 20 20503 | 07 | 13 |16|15/|16 | 11 |17 00 |00 00 | о 22 2юв | 01 00100 |001|00|001|00 02/03 02 | ог о22:40622:303| 03 02103 |031|00|031|00 04 |06 05 | 05 240 | 03 03103103 1|00|03|00 04|04 04 /|о4 241 | 03 04104 |031|00|03|00 05106 05/05 22503 | 03 | 11 | 12 | 11 | 11 | 09 | 08 0000 00 | о 22бю3 | 47 | 90 | 85 | 83 | 83 | 71 | 49 | 00 | 00 | 00 | о
Таблиця 12
Компільовані дані з профілів загального ліпіду насіння для трансгенного насіння, наведеного в
Табл. 11. Обчислення не включають "незначних жирних кислот", включених в Табл. 11.
ЕО5.46 ит зм) є ва) в вано ям змо ло ме зо від загальних 36,1 46 45,4 45 482 | 442 | 401 128,91 29,91 302 | 28,9
ЖК)
Загальні ж/б ( 90
ЖК) м блуз бі || е|нв|не|не| не е| с мЗ ( 9о від 8,1 18,5 18 16,9 | 18,6 1 152 12 01 загальних ЖК)
Таблиця 12
Компільовані дані з профілів загального ліпіду насіння для трансгенного насіння, наведеного в
Табл. 11. Обчислення не включають "незначних жирних кислот", включених в Табл. 11.
ЕО5.46
Загальні нові мб ( 96 від 1,1 2,2 12 11 1 1 12 1,5 2,3 2 2,2 загальних ЖК)
КЕМТИЖ те ви рю вою зиою! | оо я нових ЗЛ
Співвідношенн яновикщемо Оля | ооо оо |оов|оо| ол | | емо
Ефективність перетворення 8.2 о 15,6 о 15,5 о 15,1 о 1571 о 12,8 о 10,5 о 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо 01 Зо
ОК на ЕПК
Ефективність перетворення 6,7 о 12,3 зв|11 66 зв|11 ,5 о 11 4 о 10,0 о 7,0 о 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо 0,0 Зо
ОК на ДГК
Ефективність перетворення 92 о 17,2 о 17,1 о 16,7 о 16,2 о 13,9 о 11,4 о 0,0 о 0,0 о 0,0 о 02 Зо
ЛК на ЕПК
Ефективність перетворення 7,6 о 13,6 о 12,9 о 12,7 о 12,3 о 10,9 Уо| 7,5 90 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо 0,0 Зо
ЛК на ДГК
Ефективність перетворення 15,8 о 24,8 о 24,9 о 242 о 22,8 о 20,6 о 18,5 о 0,0 о 0,0 Зо 0,0 Зо 0,3 Зо
АЛК на ЕПК
Ефективність перетворення 13,0 о 19,6 о 18,7 о 18,4 о 172 о 16,1 о 122 о 0,0 о 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо
АЛК на ДГК
Загальні насичені жирні | 17,6 17,8 | 17,8 | 17,6 18 17,8 | 18,1 | 18,2 | 17,7 | 17,8 | 18,1 кислоти
Загальні мононенасичені| 19,8 15,5 16 16,6 | 14,3 | 16,6 | 16,8 | 18,7 | 193 | 19,6 | 18,6 і жирні кислоти
Загальні поліненасичені | 62,5 66,4 | 65,6 | 67,7 | 656 | 651 63 63116251 632 жирні кислоти
Загальніс2о | 9,6 | 93 | 98 | 99 81 89 | 85 | 86 | 11 | 103 0
Загальніс22 | 54 | 103 | 10 | 97 94 | 83 | 57 | 06 09107 0
Співвідношенн я загальні 1,78 0,98 | 1,02 | 0,86 | 1,07 | 14,9. .114,33112,22|14,71|1443
С20/022
ДГК присутня в 6 з 10 індивідуальних насінин. Чотири інші насіння не містили ДГК, і, ймовірно, були нульовими сегрегантами, що не містять Т-ДНК, на базі гемізиготності вставки Т-
ДНК в материнській рослині. Екстрагований ліпід з єдиної насінини з найвищим рівнем ДГК містив 9,0 95 ДГК, тоді як сумарний відсоток для ЕПК, ДПК і ДГК становив 11,4 95. Сумарний відсоток для нових 03 жирних кислот, продукованих в цьому насінні в результаті перетворення (СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК, ДГК) становив 19,3 95, тоді як відповідний сумарний відсоток для нових 0б жирних кислот (ГЛК, ЕДК, ДГЛК, АРК їі будь-яких продуктів 0б елонгації) становив 2,2
Фо; тільки ГЛК ії ЕДК були знайдені як нові б жирні кислоти. Співвідношення загальних 06 ЖК (включаючи ЛК) до 03 ЖК (включаючи АЛК) становило 0,44. Співвідношення нових 0б ЖК (за винятком ЛК) до нових 03 ЖК (за винятком АЛК) у насінині з найвищим рівнем ДГК становило 0,12. Рівень загальних насичених жирних кислот становив приблизно 17,8 905, і рівень мононенасичених жирних кислот становив приблизно 15,5 95. Рівень загальних 0б жирних кислот становив приблизно 20,4 95, і рівень 03 жирних кислот становив приблизно 46 95.
Обчислена загальна ефективність перетворення становила: ОК на ЕПК - 15,6 95, ОК на ДГК - 12,3 95, ЛК на ЕПК - 17,2 95, ЛК на ДГК - 13,6 95, АЛК на ЕПК - 24,8 95, АЛК на ДГК - 19,6 95.
Гомозиготне насіння цієї лінії одержують в поколінні Т4. До 10,3 956 ДГК продукується в події
ЕО5-46-18-110, із середньою величиною 7,3 95 ДГК, спостережуваною для всього покоління Т4.
Гомозиготне насіння висаджують в декілька теплиць, з метою одержання сумарно понад 600 індивідуальні рослини. Олію екстрагують з насіння із застосуванням різноманітних способів, зокрема, апарату Сокслета, екстракції ацетоном і гексаном.
Оскільки кількість одержаних незалежно трансформованих ліній С. заїїма, як розкрито вище, було низьким, виконуються подальші експерименти з трансформації С. займа за допомогою руРЗ3416-сСА7. Винахідники прогнозують, що в подальших трансформованих лініях будуть досягнуті рівні ДГК, що перевищують 10 95, як відсоток від загального вмісту жирних кислот в олії з насіння, і в рослинах, гомозиготних по Т-ДНК -- до 20 95 ДГК. Одержані 20 подій С. займа
СА7 тон, і насіння проаналізоване щодо вмісту ДГК. Одержані З події ЗА7 тоаВ, їі аналіз насіння Т1 від події СМО17.1 виявив вміст ДГК в пулі насіння 9,8 95. Найвищий вміст ДГК, знайдений в окремому насінні, становить 13,5 905.
Приклад 4. Стабільна експресія трансгенних шляхів ДГК в насінні Вгазвіса пари
Трансформація В. пари і аналіз складу жирних кислот з використанням єдиного вектора
Бінарний вектор руР3416-5А7 використовують для одержання трансформованих рослин
Вгазбзіса пари5 і насіння з рослин. Вектор руРЗ3416-зЗА7, розкритий вище, вводять в
Адгорасієгійт їштеїасієп5, штам АСІ1, за допомогою стандартних процедур електропорації.
Культури трансгенних клітин Адгорасіегішт вирощують протягом ночі при 28"С в середовищі
Лурія-Бертані при збовтуванні із швидкістю 150 об/хв. Бактеріальні клітини збирають центрифугуванням із швидкістю 4000 об/хв протягом 5 хвилин, промивають середовищем
ММіпап5 АВ (Уміпап5, 1988), ресуспендують в 10 мл середовища УУіпап5 АВ (рн 5,2) і продовжують культивування протягом ночі в присутності канаміцину (50 мг/л), рифампіцину (25 мг/л) ії 100 мкМ ацетосирингону. За 2 години до інфікування клітин Вгаззіса додають спермідин (120 мг/л), і кінцеву щільність бактерій доводять до ОО 600 нм 0,3-0,4 за допомогою свіжого середовища АВ. Свіжовиділені сім'ядольні черешки 8-денних саджанців Вгазвзіса пари», вирощених на середовищі М5 (Мигазпіде апа 5Коод, 1962) з 1/2 активності або сегменти підсім'ядольного коліна, попередньо кондиційовані протягом 3-4 днів на середовищах М5, що містять 1 мг/л тіадіазурону (ТДЗ) і 0,1 мг/л сх-нафталіноцтової кислоти (НОК), інфікують 10 мл культури Адгорасіегішт протягом 5 хвилин. Експланти, інфіковані Адгорасіегішт, в подальшому промокають стерильним фільтрувальним папером для видалення надлишку Адгобасієегічт і переносять в середовища спів-культивування (середовища М5, що містять 1 мг/л ТДЗ, 0,1 мг/л
НОК ії 100 мкМ ацетосирингону), з додаванням або без додавання різних антиоксидантів (І - цистеїн, 50 мг/л і аскорбінова кислота 15 мг/л). Всі планшети герметизують парафіном та інкубують в темряві при температурі 23-24"С протягом 48 годин.
Оброблені експланти далі промивають стерильною дистильованою водою, що містить 500 мг/л цефотаксиму і 50 мг/л тиментину, протягом 10 хвилин, споліскують стерильною дистильованою водою протягом 10 хвилин, промокають стерильним фільтрувальним папером, переносять в передселекційні середовища (М5, що містять 1 мг/л ТДЗ, 0,1 мг/л НОК, 20 мг/л аденіну сульфату (АДС), 1,5 мг/л АЗ9МОз, 250 мг/л цефотаксиму і 50 мг/л тиментину) і культивують протягом 5 днів при температурі 247С з фотоперіодом 16 годин/8 годин. Після цього їх переносять в селекційні середовища (М5, що містять 1 мг/л ТДЗ, 0,1 мг/л НОК, 20 мг/л
АДС, 1,5 мг/л АоМО», 250 мг/л цефотаксиму і 50 мг/л тиментину) з додаванням 1,5 мг/л амонію глюфозинату як агента для селекції трансформованих клітин, і культивують протягом 4 тижнів при температурі 247С з фотоперіодом 16 годин/8 годин, кожні два тижні перевиваючи в такі ж середовища. Експланти із зеленим калюсом переносять в середовища ініціації пагонів (М5, ЩО містять 1 мг/л кінетину, 20 мг/л АДС, 1,5 мг/л А9МО», 250 мг/л цефотаксиму, 50 мг/л тиментину і 1,5 мг/л амонію глюфозинату) і культивують ще протягом 2-3 тижнів. Пагони, що з'являються від резистентних експлантів, переносять в середовища для подовження пагонів (середовища
М5, що містять 0,1 мг/л гіберелової кислоти, 20 мг/л АДС, 1,5 мг/л Ад9МО», 250 мг/л цефотаксиму і 1,5 мг/л амонію глюфозинату) та культивують ще протягом двох тижнів. Здорові пагони довжиною 2-3 см відбирають і переносять в середовища для коренеутворення (1/2 М5, 1 мг/л
НОК, що містять, 20 мг/л АДС, 1,5 мг/л АдМОз і 250 мг/л цефотаксиму) і культивують протягом 2-3 тижнів. Добре розвинені пагони з корінням переносять в горщики, що містять суміш для росту саджанців, вирощують в кімнаті для росту протягом двох тижнів, і далі переносять в теплицю. Приблизно 40 (То) рослин, трансформованих конструкцією СА?7, були одержані в такий спосіб.
Рослини вирощують до стану зрілості після надання їм можливості самозапліднення.
Насіння, одержане від трансформованих рослин, аналізують щодо складу жирних кислот в олії з насіння, як розкрито у Прикладі 1. Дані для трансформованої лінії з найвищим рівнем ДГК наведені в Табл. 13. Значно нижчі рівні ДГК в середньому присутні в олії з насіння В. парив, трансформованих Т-ДНК з руОРЗ416-СА?7, ніж у насінні А. Парйапа (Приклад 2) або насінні
Сатеїйпа (Приклад 3), трансформованому такою ж конструкцією. Найвищий рівень ДГК приблизно в 40 лініях був визначений як 1,52 95, причому більшість трансгенних ліній містила знайденні рівні ДГК. Слід зазначити, що значущою була акумуляція АЛК, приблизно 35 95 від загальних жирних кислот, в тому насінні, яке не здійснювало ефективного перетворення на СДК або наступні продукти в біохімічному шляху.
Проаналізовані профілі жирних кислот в окремих насінинах В. париз від події Ті, СТ125-2, з метою більш точного визначення кількості ДГК, продукованої в трансгенному насінні. Знайдено вміст в насінні від 0 95 (нульове насіння) до 8,5 95 ДГК (Табл. 13).
Деякі з насінин від лінії рослин СТ116, а також інших трансгенних ліній, що демонструють продукування ДГК, висівають з метою одержання рослин-нащадків. ЗТ-ПЛР виконують на загальній РНК, виділеній з ембріонів, що розвиваються, від таких рослин, для визначення того, чому конструкція (ЗА7 здійснює слабкий вплив з точки зору одержання ДГК відносно трансгенних А. ІПаїїапа і С. займа, що містять таку ж конструкцію, і слабкий ефект відносно комбінації генів на руР3115 і ру)уРЗ3116 (нижче). ЗТ-ПЛР проводять на загальній РНК з використанням набору для одностадійної ЗТ-ПЛР (Іпмігодеп) і специфічних для гена праймерів, націлених на кожен трансген. Це підтвердило, що кожний з генів в конструкції ЗА7 належним чином експресується в трансформантах В. пари5, за винятком Дб-десатурази, яка слабко експресувалася в більшості трансформованого насіння. Інші гени із вказаного конструкта функціонують належним чином в насінні В. париз і А. Іпаійапа, наприклад, А12- і Д15-десатурази, функція яких полягає у продукуванні підвищених рівнів ЛК і АЛК в насінні, при зниженні рівнів олеїнової кислоти. Характерний гель ЗТ-ПЛР проілюстрований на Фіг. 7 і чітко демонструє низьку експресію Аб-десатурази відносно інших трансгенів з рОР3416-сА7.
Зо Трансгенні рослини і насіння, гомозиготні по трансгенах, одержують вирощуванням потомства ліній із найвищим вмістом ДГК.
Таблиця 13
Склад жирних кислот як відсоток від загальних жирних кислот в олії з насіння для незалежного насіння Т; Вгаззіса парих5, трансформованого рОРЗ416-ОА7, лінії СТ116-11 і СТ-125-2, в порівнянні з контролем дикого типу (нетрансформований). 22:6003 представляє ДГК. Дані одиничних насінин СТ125-2 В. пари5 позначені "55".
Ст125-2 я2 | СТ125-2 яЗ3 |ІСТ125-2 НО 00000уженроль | ств! спова (СЛ І вв ви 161 | 02 | 05 | 04 | 03 | 03 | 08 / вла | 37 | 66 | 42 | 44 | 43 | 96 200 | 06 | 05 | 06 | 04 | 03 | 07 184093 | 00 | 09 | 03 | 05 | 06 | 26 / гола | 12 | 11 | 70 | 10 | 08 | 06 / о 2голіюї/ | 777777 177717102 | 6/1 701 ї17777171717171171102г 20303 | (00/17 13 | 107 | 08 | 16 | 09 20403 | .0/ 17 011 11103 | 04 | 06 1 05 г 1
Таблиця 13
Склад жирних кислот як відсоток від загальних жирних кислот в олії з насіння для незалежного насіння Т; Вгаззіса парих5, трансформованого рОРЗ416-ОА7, лінії СТ116-11 і СТ-125-2, в порівнянні з контролем дикого типу (нетрансформований). 22:6003 представляє ДГК. Дані одиничних насінин СТ125-2 В. пари5 позначені "55".
Ст125-2 я2 | СТ125-2 яЗ3 |ІСТ125-2 НО есте спа |пнт еле ран 20503 | 777777177711111111171Г11111117111111111117110м1 103 22303 | 77171111 22503 | (17 01 1011 101 101 105 22803 | юю. | 152 | 12 | 13 | 27 | 85
Трансформація В. пари і аналіз складу жирних кислот з використанням двох векторів
В іншому експерименті з В. парив5, і як альтернативний формат для введення трансгенів, бінарні вектори роР3115 ії руР3116, розкриті у МО 2010/057246, використовують для окремого одержання трансформованих рослин В. пари5, і одержують трансформоване насіння від рослин. Т-ДНК на руРЗ3115 містить химерні гени, що кодують А12-десатуразу Стерів раїезііпа, дб-десатуразу Місготопа5 ризійа, Аб-елонгазу Ругатітопав согдаїа і Д5-десатуразу Раміома заїїпа, ії Т-ДНК на руР3116 містить химерні гени, що кодують А15-десатуразу Репа їкшевзсепв, д5-елонгазу Ругатітопаз согадаїйа і Д4-десатуразу Раміома заїїпа. Дві Т-ДНК, якщо вони присутні спільно і експресуються в насінні, що розвивається, утворюють 7-генний шлях для одержання
ДГК з олеїнової кислоти, що продукується ендогенно. Вказані вектори вводять в Адгорасіегійт
Іштегїасієп5, штам АСІ1, за допомогою стандартних процедур електропорації, і трансформовані клітини використовують незалежно для трансформації В. пари5 із застосуванням розкритого вище способу для одержання стабільно трансформованих рослин То. Були одержані 29 трансформантів руР3115 і 19 трансформантів руР3116, вказані рослини були вирощені до стану зрілості, і одержане насіння після самозапліднення було проаналізоване щодо складу жирних кислот в олії з насіння. У випадку Т-ДНК з руОРЗ115 очікувалося, що перетворення буде приводити до утворення ЕПК з ендогенно продукованої АЛК, тоді як у випадку Т-ДНК з рОР3116 очікувався результат у вигляді підвищеного продукування АЛК з ЛК. Ідентифіковані деякі рослини, що демонстрували вказані фенотипи. Більшість подій демонструвала фенотип зниження ОК/підвищення ЛК в результаті 412 десатурації, з низьким рівнем продукування ЕПК.
До 2,6 95 ЕПК спостерігалося в пулі трансгенного насіння руР31115. Подібним чином знайдено, що більшість подій руР311б6 має фенотип підвищення АЛК в результаті активності А15- десатурази. До 18,5 95 АЛК знайдено в пулі насіння, трансформованого Т-ДНК з рОРЗ116.
Рослини Т|. з ліній із найвищими рівнями ЕПК і АЛК схрещують, і насіння нащадків (Е1) від 24 виділених подій аналізують щодо вмісту ДГК. У 17 з цих подій знайдена ДГК, причому до 1,9 90
ДГК знайдено в пулі насіння від цих подій. Аналіз одиничних насінин виконують з метою визначення інтервалу продукування ДГК -- дані наведені у Табл. 14. Великий інтервал рівнів
ДГК спостерігається у нащадків схрещування, ймовірно за рахунок гемізиготної природи Т-ДНК в материнських рослинах, таким чином, що деяке насіння не одержало обох Т-ДНК. До 6,7 90
ДГК спостерігається в загальному ліпіді насіння.
Таблиця 14
Склад жирних кислот як відсоток від загальних жирних кислот в олії з насіння для одиничних насінин В. париз ЕТ, одержаних в результаті схрещування рослин, трансгенних по Т-ДНК із ругРЗ115, з рослинами, трансгенними по Т-ДНК із рОРЗ3116. В1, В2 і В4 позначають події. 0,0 - неможливо виявити методом ГХ. 7... (віл |в12| в.з |В1.4-о|81.5-9| во. | Во.2 |82.3о|82.49|82.59| ВЗ. | 83.2 7160 | 66 | 64 | 45123) 79 | 51 | 50 |л0л1| 85168 | 53 | 72 161 | 04 |051|02|70 06/04/0406 | |05105 06
Таблиця 14
Склад жирних кислот як відсоток від загальних жирних кислот в олії з насіння для одиничних насінин В. париз ЕТ, одержаних в результаті схрещування рослин, трансгенних по Т-ДНК із ругРЗ115, з рослинами, трансгенними по Т-ДНК із рОРЗ3116. В1, В2 і В4 позначають події. 0,0 - неможливо виявити методом ГХ. 77777777 вл 1812 | віз ІВ1.4-о|81.5-9| ва | в2о |в2.39|82.49| 82.50 83.1 | в3.2 вла | 46 58 | 27 | 68 | б2 | 38 | 49 | 59 | 87 | 45 | 55 | 51 200 106 07|061|051|07|08|091|06 0407 |09/| 07 18403 | 02 01 | 01108051 021|021|08 00 |02|02 | ог гола | то 171 | 11 | 07 | 08 | ли | 11 | 05 09 | 1 | 1 | 05 2голіво | 01 ол | 00 | ол | ол |о|о | ооо о 20306 | 00 00 | 00 | 00100100 |00|00 00 |о00 |о0 | о 20406 | 00 00 | 00 |001|00|00|00|о01 0000 | оо | о 20303 | 18 | 16 | 11 | 28 | 21 | 11 | 10 | 27 | 07 | 14 | 09 | 16 20403 | 03 02 |02г| 04 | 04 | ол | ол | 05 00102 |ол | ог 221 | 00 о00|00|о00|о00|о00|о00|о00 00 |о00 | оо | оо 20503 | 00 00 | 00 |о0л|о0л|о00|00|02 00 |о00 | оо | оо 22206 | 00 00 | 00 |00/|00|00|00|00 00 |о00 |о0 | оо 22506 | 01 02 | 0 | 02 | оз | ол | ол | 05 00102 |ол | ог 22503 | 07 07 |03| 21 | 16 |03|04| 32 00 | 05 | 04 | 12 22бо3 | 14 | 10 | 05155139 | 08 | 07 | 67 | 00 | 11 | 08 | 2
Таблиця 15
Компільовані дані з профілів загального ліпіду насіння для трансгенного насіння, наведеного в
Табл. 14. Обчислення не включають "незначних жирних кислот", включених в Табл. 14.
Загальні м/З ( 90
Пн мн ж о юн
ЖК)
Шен |з ме|юе ще хз змиє и юв| зх від загальних 44,5 | 38,5 | 38,5 | 48,8) 50,3 | 40,5 341 | 494 | 52,7 | 40,5 | 35,7
ЖК)
Шини ою ою о 05 о» 007 о о ог о оо м ЗЛУб
Загальні нові
ШЕ в загальних ЖК) онямю тв те |т жи ва|ає ви та мо вт т. мб ( 95 від 10,5 7,5 7,9 1941 1 154 8,4 61 15,8 | 28,3 6,7 7,5 загальних ЖК)
КТАИТИ о ого оно о ог ол о оо нових м/ЗЛмб ками о вв те ввіви зюїз» і». Тоіво нових мб/мЗ
Таблиця 15
Компільовані дані з профілів загального ліпіду насіння для трансгенного насіння, наведеного в
Табл. 14. Обчислення не включають "незначних жирних кислот", включених в Табл. 14.
Ефективність перетворення 2,5 о 2 о 0,9 о 101 о 6,9 о 1,3 о 1,3 о 12,8 о 1,9 о 1,4 о
ОК на ЕПК дон ирямвенрланінвнфовн овж вв Техн перетворення 1,7 о 12 о 0,6 о 7.2 о 4,8 о 0,9 о 0,68 о 8,5 о 1,3 Зо 1,0 Зо
ОК на ДГК
Ефективність перетворення 4,3 о 4,0 о 2,0 о 12,6 о 9,4 о 2,5 о 3,0 о 15,7 о 3,6 о З Зо
ЛК на ЕПК
Ефективність перетворення 2,9 о 2,4 о 12 о 9,0 о 6,6 о 1,9 о 1,9 о 104 о 2,5 о 2 о
ЛК на ДГК
Ефективність перетворення /|47,7 95|44,7 УоІ36,4 УоІ68,1 Уо165,9 95І44,0 9У0145,8 Фо172,1 Фо А7,1 Ув|50,0 95
АЛК на ЕПК
Ефективність перетворення 31 8 о 26,3 о 22,7 о 48,7 о 45,9 о 32,0 о 29,2 о 47,9 о 32,4 о 33,3 о
АЛК на ДГК
Загальні насичені жирні | 102 | 106 | 7,9 15,1 | 12,4 102 | 13,7 | 11,6) 11,3 | 106 кислоти
Загальні мононенасиченії 40,4 47 51,1 123,8) 28,7 | 472 53 21,8 | 34,7 | 44,7 51 жирні кислоти
Загальні поліненасичені | 49,2 | 42,5 | 40,9 61 59,4 | 43,3 | 36,8.) 64,3 | 53,7 | 442 | 384 жирні кислоти
Співвідношення загальні 162 11,60) 246) 061 | 0,73 | 212) 1,94) 046 | 5,60 | 1,67 | 1,79 б20/022
Компільовані дані профілів загального ліпіду (Табл. 14) наведені в Табл. 15. На базі даних
Табл. 15, співвідношення загальних б ЖК (включаючи ЛК) і 03 ЖК (включаючи АЛК) в насінні з найвищим рівнем ДГК становило 3,34. Співвідношення нових 0б ЖК (за винятком ЛК) і нових Ф3
ЖК (за винятком АЛК) становило 1,39. Рівень загальних насичених жирних кислот становив приблизно 13,7 95, і рівень мононенасичених жирних кислот становив приблизно 21,8 95. Рівень загальних 0б жирних кислот становив приблизно 46,4 95, і рівень 03 жирних кислот становив приблизно 14,8 95. Обчислена загальна ефективність перетворення становила: ОК на ЕПК - 12,8 95, ОК на ДГК - 8,5 95, ЛК на ЕПК - 15,7 95, ЛК на ДГК - 10,4 95, АЛК на ЕПК - 72,1 95, АЛК на ДГК - 47,9 9о. Знижена ефективність перетворення 0б жирних кислот на 03 жирні кислоти, яка спостерігалася в цьому експерименті при використанні комбінації руР3115 і руР3116, була віднесена на рахунок нижчої ефективності рослинної ДЛ15-десатурази, в порівнянні з грибковою
А15/03 десатуразою (Приклади 2 і 3) при комбінації з генами для перетворення АЛК на ДГК.
Потомство ліній, що містять ДГК, гомозиготних по всіх введених трансгенах, було одержане для аналізу.
Приклад 5. Модифікації Т-ДНК, що кодують шляхи ДГК в насінні рослин
Для покращення рівня продукування ДГК у В. парив, в порівнянні з рівнями, розкритими у
Прикладі 4, бінарні вектори руР3416-с4А7-тодА, руРЗ416-СА7-тоав, руРЗ416-СА7-тоас, ругР3416-саА7-тодО, руР3416-сА?7-тодЕ і рОРЗ3416-сСА7-тоав були сконструйовані, як розкрито нижче. Ці бінарні вектори є варіантами конструкції рОРЗ3416-БА7, розкритої у Прикладі 2, і були сконструйовані з метою подальшого підвищення синтезу ДГК в насінні рослин, особливо шляхом покращення функцій Дб-десатурази і Дб-елонгази. Спостерігалася акумуляція СДК в деякому насінні, трансформованому конструкцією СА?7, внаслідок відносно низької ефективності елонгації, в порівнянні з Д5-елонгазою, тому, серед інших модифікацій, положення двох генів елонгази було змінене в Т-ДНК.
Дві послідовності, що кодують елонгази у р)ОР3416-СА?7, були поміняні місцями на Т-ДНК, з одержанням руРЗ3416-Щ4ЧЬА7-тодА першим клонуванням нової касети Аб-елонгази Р. согдага між сайтами 5БЯ руР3416-СА7, для заміни касети Д5-елонгази Р. согдаїа. Ця конструкція була додатково модифікована шляхом обміну промотору ЕРІ, який контролює Дб-десатуразу
М. ризійа, з промотором конлініну Спі2 (рі иСпі2), щоб одержати рОРЗ3416-СА7-тоаВ. Дана модифікація була здійснена з метою збільшення експресії Дб-десатурази, і таким чином ефективності фермента. Вважається, що промотор Спі?2 може давати більш вісоку експресію трансгену у В. парих5, ніж вкороченій промотор напінк. рОР3416-СА7-тодС було одержано шляхом додавання другої касети Дб-десатурази М. ризйа з дещо іншим використанням кодонів (ЗЕО ІО МО: 15), контрольованої промотором ЕРІ, який було вставлено у сайт Ртеї! тільки всередині правої межі руР3416-сА7-тоаВв. Друга касета Аб-десатурази додана до руР3416- сА7-тоавВ і руР3416-СЧ4А7-тоав з метою підвищення рівня експресії Аб-десатурази і збільшення періоду часу в процесі розвитку насіння для експресії Аб-десатурази шляхом використання декілької промоторів. Різноманітні способи використання кодонів застосовувались у двох нуклеотидних послідовностях, щоб здійснити трансляцію однієї і тієї ж послідовності білка без ризику ко-супресії з боку подобніх кодуючих ділянок в межах одніє і тієї ж Т-ДНК. руР3416-СА7- тод і руР3416-С(А7-тодЕ являють собою подібні варіанти, у яких третя послідовність ДПМ, що відповідає нуклеотидам 16649-17816 5ЕО ІО МО: 1, додана до руР3416-СА7 і рурР3416-сА?7- тоавВ, відповідно, на сайті Ртеї. руР3416-СА7-тодЕ одержаний шляхом додавання другої касети Дб-десатурази М. ризхіа, що містить нуклеотидну послідовність природної Дб-десатурази і контрольованої промотором ЕР'Ї на сайте Рітеї у правій границі руРЗ3416-СА7-тоав. руРЗ3416-
СпА7-тодб одержаний спочатку заміною касети Лб-десатурази М. ризійа касетою Спі2:А5Б- елонгази Р. согдаїа рестрикційним клонуванням на сайтах Азсі-Расі. Далі руРЗ3416-сА7-тодаї був одержаний шляхом заміни оригінальної касети ЕРАЕ1:А5-елонгаза Р. согдайа касетою
ЕАЕ1:Аб-десатураза М. ризййа рестрикційним клонуванням на сайтах БИ. Нуклеотидні послідовності Т-ДНК з кожної із вказаних генетичних конструкцій наведені як: рОР3416-СА7- тоав (ЗЕО ІО МО: 2), руРЗ416-СЬА7-тодС (5ЕО ІО МО: 3), руР3416-сСА7-тодо (5ЕО ІО МО: 4), ругР3416-саА7-тодЕ (5ЕО ІОЮ МО: 5), руРЗ416-СА7-тоав (5ЕОІЮ МО: 6) и рурР3416-сА7-тода (ЗЕО ІО МО: 7).
Бінарні вектори руР3416-сА7-тоав, руРЗ416-СА7-тоаС, руРЗ416-СА7-тодО, руРЗ416- сСА7-тодЕ, руРЗ416-4,А7-тодЕ і руОРЗ416-4,А7-тодо використовуються для одержання трансформованих соматичних ембріонів Вгаззіса і рослин Вгаззіса пари5, Сатеїйпа заїїма і
Агабідорвзів ІНайапа, а також насіння потомства. Дані для руР3416-сА7-тоаВв наведені в наступному Прикладі.
Одержані 8 трансгенних подій руРЗ3416-сА7-тоаВ А. іїНарйапа і 15 трансгенних подій ругР3416-аА7-тоас А. ІПайііапа. Спостерігається від 3,4 95 до 7,2 95 ДГК в пулі насіння руР3416-
СА?7-тоаВ, і від 0,6 до 4,1 95 ДГК в пулі насіння 12 руР3416-СА7-тоаб. Деякі з подій руР3416-
СІА7-тоаВ з найвищим рівнем висівають на селекційні середовища, і саджанці, що вижили, відбирають для наступного покоління. Насіння аналізують щодо вмісту ДГК. Оскільки об'єднане в пул насіння Т1 представляє популяції, сегреговані по трансгенах, і включають будь-які нульові сегреганти, очікується, що в гомозиготному насінні рослин-нащадків рівні ДГК будуть вищими, до 20 95 від загального вмісту жирних кислот в олії насіння. Інші модифіковані конструкції використовувалися для трансформації А. Пайапа. Хоча одержана тільки невелика кількість трансформованих ліній, жодна з них не давала вищих рівнів ДГК, ніж конструкція тоавВ.
Конструкція руР3416-С|А7-тоав також використовувалася для одержання трансформованих рослин В. пари сорту Озсаг і в лінії розведення, позначеній МХО05. Таким чином були одержані 10 незалежних трансформованих рослин (ТО) для трансформації Озсаг, і 20 незалежних ліній - для МХО05. Урожай насіння (насіння Т1) одержаний від вказаних трансгенних ліній. Пули насіння були проаналізовані щодо рівнів ДГК в олії з насіння, і дві лінії, які продемонстрували найвищі рівні, були вибрані і позначені як лінії СТ132.5 (у сорті О5саг) і СТ133.15 (у МХОО05).
Набухають 20 насінин з СТ132.5 і 11 насінин з СТ133.15, і через два дні олію витягають з половини сім'ядолі кожної з індивідуальних насінин. Другу половину сім'ядоль з ембріональними осями утримують і культивують на середовищах, щоб зберегти конкретні лінії нащадків. Склад жирних кислот в олії визначають; дані для СТ132.5 наведені в Табл. 16. Рівень
ДГК в 10 із проаналізованих 20 насінин, за даними аналізу методом ГХ, знаходиться в інтервалі 7-20 95 від загального вмісту жирних кислот. Інші насінини містили менше 7 95 ДГК ї могли бо містити часткову (неповну) копію Т-ДНК із руР3416-СА7-тоаВ. Схоже, що трансгенна лінія містить множинні вставки трансгена, які були генетично роз'єднані. Насіння трансгенної лінії
СТ133.15 продемонструвало рівні ДГК в інтервалі 0-5 95. Насінини без ДГК, ймовірно, були нульовими сегрегантами. Ці дані підтверджують, що конструкція тоав функціонує належним чином для одержання ДГК в насінні каноли.
Конструкції руРЗ3416-сА7-тойВ і руРЗ416-4,лА7-тодЕ також використовувалися для одержання трансформованих рослин Сатеїїпа займа. Щонайменше 24 незалежні трансформовані рослини (ТО) були одержані і детальніше вивчені шляхом аналізу нащадків.
Урожай насіння (насіння Т1) був зібраний із вказаних трансгенних ліній. Пули насіння були проаналізовані щодо рівнів ДГК в олії з насіння, і 6 ліній, які продемонстрували найвищі рівні
ДГК (від 6 95 до 9 95), були відібрані. Рівні ДГК в 20 насінні Т1 з кожної лінії були проаналізовані, і більшість насіння продемонструвала рівні ДГК в інтервалі 6-14 95 від загального вмісту жирних кислот, за даними аналізу методом ГХ. Склад жирних кислот в олії був визначений; дані для декількох трансгенних насінин наведені в Табл. 17. Ці дані підтверджують, що конструкції тоаВ і той обидві належним чином функціонують для продукування ДГК в зерні Сатеїіпа.
Таблиця 16
Профілі жирних кислот в половинках сім'ядоль пророщеного трансгенного насіння Т1 В. пари», що містять конструкт тоавВ. До 18,1 95 ДГК спостерігалося в численних зразках, що містять більше 10 95 ДГК.
На- ПА:0116:0116:1116:1116:3118:011871118:1118:2118:3118:3120:0118:41С2012071С201С2010с22120:420:5І22:3ІС2 АС А22:5ІС22: сін- аз? ат11 пб | п3 п3 (тат ат3|2о6|Зо3| 0 |пз|п3|п3| о | 1 | пз |бо3 ня 1 1 Толуде|олуому0,2|1,8|29,9|2,515,910,1 І38,410,510,8|11,010,0101|2,110,3|2,810,3|0110,210,210,51 3,9 2 (ол олуоліогІ|о 23,0|2,317,4 10,3 |29,3|1,014,311,1Ц|10,010,111,9|10,416,911,010,010,310,11,7 19,5 з (01137 |02|10110,2|1,8 |(55.111,914,7|0,2 152108 11,8|1,4 1 0,010110,310,5 П1,9(0,010,010,3|10,210,010,0 4 (01146 |02|02|021|29 22.111,816,6 10,4 |26,5|1,017,211,010,010,110,8 10,5 11,211,910,0|0,2|10,211,7 18,7 5 голо ололіогІ|т7 27421181 10,3 (26,410,6|2,811,010,010,111,5Щ10,317,611,510,0 10110111, пегі 6 (олІ35|0л 010,2 |1,6|59,8| 20143101 18,510,610,511,310,010,0 10,7 (0,316,010,0|0,010,2|0,110,010,0 7 |0116.010,310,310,311,7 16,6) 2,6 |23,9 1,0 |(23,210,615,410,8|10,010,210,6 (0,4 |2,6|1,110,010,310,311,7 19,9 8 голосом 02|2,7 12,9|1,4 П11,710,3 34,9|10,9 15.010,9 10,01 0,2|2,410,5| 41 |1,3|10,010,210,2 11,8 М5,8 9 (0113901 10л1101 124 41,6) 1,7 |21,510,0 |(23,410,710,011.2|0,010112,2|10,410,010,0101Ц10,310,210,0 10,0 ло То113,7|02 100 2,1 |30,9| 1,7 19,210,4 25,6|0,7 21111 10,010111,510,4|3,610,610,010,210,110,716,9 11101157 |0410,3102 13,8 41,2| 2,4 |26,7 21|7.2Ц|11,310,311,210,010,210,3|10,814,810,010,010,610,310,0 10,0 1201146 |10,0101102 | 24 25,5|1,7 16,11 0,3 (28,910,813,911,1|10,010,111,9|10,413,910,610,0|0,2|10,0| 11 | 6,2 зола ол ол 42 Пея|1,6 152101 45,5|1,010,2|1,1 10,010115210,4|2,610,3|02|10,2|10110,4 | 34 1401163 |02|0,2Ц|0214,0 10,5|2,318,4 11,3 ІЗ1.1|1,313,910,8|10,010,112,3|0,6 14,6 |1,8 101 Ц10,310,2 | 2,5 ПВЛ 15015101 0,210,2| 3,3 16,8| 2,4 11,210,3 28,8|1,014,510,9 10,01 01 |2,110,6 13,2 |1,510,110,9310,1 11,8 Б. 1601144 01010102 14,0 16,21 1,5 11,6 0,2 І33,5|0,9|2,811,1Ц|10,010,213,7 | 0,4 (4,6 10,7 01 10,31 0,113 ПІ 17 |02|72|02|02Щ|10214,9 15,0|2118,9 10,3 (25,9|1,415.110,9|10,010,011,6|10,814,9|2110,010,610,31 2,2 15.0) лев оліло ол ом 10,2| 2,3 |6А8|т2| 72101 п2,5|1,013,511,510,010,110,010,7 |0,010,010,010,5|10,210,010,0 19101139 01101102 14,6 36,911,7|7110,2 |28,6|1,2|11,811,2|10,010,111,4 |0,514,310,4 100104 (011084 го олігеу|ол (ом ц0,2|6,0 18,5 1,2 П2,8|0,2 Із4,8| 1,4 |24|1,110,0101 13,4 |0,6|3,2 (0,4 |0110,3|0,110,7 | 7,6
Таблиця 17
Профілі жирних кислот трансгенного насіння Т1 С. з5аїїма, що містять конструкції тоав або тоан. стапсвіствіствістві о віствіствіствісгог ва зоон|сгоісго сг сго сг родісго рос: со ро:вісго 001711 0|7Г 1 2 (Зпб:Зп3 0 | п 1 ат г2пбі:Зпбі4пбі:Зп3 0 | п3| 1 | п с2пбіп3| 0 | 7 | пз боз воомітв|ооіве твто|7т отр во! ти |оя ол|оої ою ов ом 13 то віоо ол о 085 За пе ол ва|оо|ва та г|вт оертяев вт|вв|ов от ооо ово 151250 оооліог ом вза 5-810,118,310,113,519,4|1,318,1|1,1 29,011,019,3|7,910,410,610,010,010,810,210,410,813,410,010,110,210,410,9 П2,6 5-910,118,110,013,519,4|1,218,4| 1.2 129,211,019,018,110,310,6|10,010,010,810,210,510,813,510,010,110,110,310,9 12,6 торт олія ва та в|торенітентя 72 оз оо|ом ооо вом от 55/00 00102 ов тла зв (ов ол |ве|во тв в|оерта ат олівг|оз|ою от роя м ово то атом ол |ов|ов то рзи
Винахідники вважають, що, загалом, ефективність обмежуючої швидкість ферментної активності в біохімічному шляху ДГК може бути вищою у трансформантах, що містять декілька копій Т-ДНК, в порівнянні з трансформантами, що містять єдину копію Т-ДНК, або може бути збільшена за допомогою вставки в Т-ДНК декількох генів, що кодують фермент, який може бути обмежуючим в біохімічному шляху. Докази можливої значущості трансформантів, що містять декілька копій, спостерігалися в насінні Агарідорзі5, трансформованому конструкцією СА7 (Приклад 2), в яких подія з найвищим вмістом ДГК включала три Т-ДНК, вставлені в геном хазяїна. Декілька генів можуть бути ідентичними, або переважно є різними варіантами, що кодують один і той же поліпептид, або що знаходяться під контролем різних промоторів, яким властивий характер експресії, що частково перекривається. Наприклад, збільшена експресія могла б бути досягнута шляхом експресії декількох ділянок, що кодують Дб-десатуразу, навіть, якщо продукується один і той же білок. Наприклад, в руР3416-сА7-тойЕ і рОР3416-сА7-тоасС присутні дві версії Аб-десатурази М. ризіа, які експресуються різними промоторами. Кодуючі послідовності включають різне використання кодонів, і таким чином різні нуклеотидні послідовності, з метою зменшення потенційного сайленсинга або ефектів ко-супресії, але що приводять до продукування одного і того ж білка.
Приклад 6. Активність специфічних для насіння конструкцій в соматичних ембріонах
Для одержання системи швидкого аналізу, яка буде прогностичною для експресії генетичних конструкцій в насінні під контролем специфічних для насіння промоторів, система соматичних ембріонів була одержана для Вгахзіса париб5. Це здійснюється з використанням вектора для експресії фактора транскрипції І ЕС2, який приймає участь в ініціації соматичного ембріогенезу.
Як демонстрація, бінарні вектори 35511ЕС2 і руР107 (Рейіє еї аїЇ.,, 2010а і Б) вводять в
Адгорасієгійт їштеїасіеп5, штам Асі 1, шляхом стандартної електропорації, і трансформантів
Адгорасіегіїт використовують /- для співтрансформації Вгавзвіса пари шляхом співкультивування. Ділянка Т-ДНК руР107 містить гени, що кодують ЛО9-елонгазу Ізоспгувзів даІбапа, Ав-десатуразу Р. заїіпа і Д5-десатуразу Р. запа, причому кожен ген експресується специфічним для насіння промотором. Для контрольної трансформації використовують тільки вектори 355: ЕС2. Експресія 355: ЕС2 приводить до генерації соматичних ембріонів в культурі тканини безпосередньо із тканини калюсу, трансформованої В. парив, як розкрито у Прикладі 1.
Аналіз жирних кислот продемонстрував, що специфічні для насіння гени на Т-ДНК конструкції руР107 експресуються в трансгенних соматичних ембріонах в присутності співтрансформуючого гена ГЕС2 і функціонують для продукування АРК (20:42581115) з ЛК ї ЕПК (20:525811и17) з АЛК. Дані для трьох співтрансформованих соматичних ембріонів наведені у
Табл. 18, і склад жирних кислот кожного з них порівнюється зі складом жирних кислот олії з насіння для насіння Вгаззіса пари5, яке було трансгенним та експресуючим Т-ДНК руР107 (Реїгіє еї аї., 2010а ї Б). Подібний загальний відсоток АРК і проміжних жирних кислот ЕДК (20:26) ії ДГЛК (20:306), а також ефективність перетворення, спостерігалися для соматичної ембріональної тканини, при порівнянні з профілями стабільно трансформованого насіння.
Подібні результати спостерігалися для складу жирних кислот стабільного трансгенного насіння
Те» Її соматичних ембріонів: вміст б жирних кислот знаходився на рівні 26,6 95 і 25,6 95 (середня величина), відповідно, тоді як рівні АРК становили 9,7 95 їі 10,6 95 (середня величина), відповідно.
При введенні тільки 355111ЕС2 і аналізі соматичних ембріонів в часі було знайдено, що профіль жирних кислот змінюється на більш подібний до ембріонів профіль, причому вміст 18:38а91215 знижується, і вміст 18:19 підвищується зворотно корелюючим чином (Фіг. 8).
Одержані результати вказують на те, що соматичні ембріони дійсно ставали подібними насінню за характером, і експресувалися гени на Т-ДНК із руР107. Це є демонстрацією того, що система соматичних ембріонів дозволяє швидку характеристику специфічних для насіння трансгенних конструкцій в В. пари5, без необхідності у проведенні повного способу одержання трансгенної рослини та її зрілого насіння.
Таблиця 18
Склад жирних кислот ліпіду, одержаного із соматичних ембріонів Вгаз5іса пари», що генеруються за допомогою співтрансформації рОР107 і 355: ЕС2, в порівнянні з контрольним нетрансформованим насінням (ДТ) і насінням Т», трансформованим р.ОР107. Ефективність перетворення для окремих ферментів наведена в дужках після відповідних ферментних стадій. 09-Ело позначає Д9-елонгазу, рв-Дес позначає Дв-десатуразу, і 05-Дес позначає Д5-десатуразу
Трансгенне дТ насіння Т2 ІГЕС2:яЯ45 ГЕС2:Я57 ГЕС2:я58 руР107 тгек 1 в/йробн ватою (нале ронна віти ота. 67 95 09-ело) | (61,8 95 09-ело) | (56,7 ую ЮЗ9-ело) | (61,8 ую 0З-ело) едвл А 11-02 о 0,2 0,4 созеино | обвід (М(бттередес (739; бедесу | (7992 тет 00 обо пеі Хол вежа він 90 95 О05-дес) (98 95 О5-дес) (96 95 05-дес) (97 ую ЮБ5-дес) гол | | або | 99 2 щЩ | 55 | 73 рода | | озжо | 04 юЮЩ | 03 | 04 роваввтт | | гажоа | 76 | 64 | 79 (Всьогонових | | 246 2 2 | 341 | 261 2 | 38
З використанням такої ж системи для генерації соматичних ембріонів, клітини Вгавв5іса париз окремо трансформують руР3416-сА7-тоав і рОуРЗ416-С.А7-тодО. Були одержані 42 ембріони, 18 для тоаВ і 24 для тодО. Загальний ліпід екстрагують з ембріонів і аналізують склад жирних кислот. Ембріони містять від 0 95 до 16,9 95 ДГК (Табл. 19). Результати з 0 95 ДГК, ймовірно, були одержані унаслідок тільки часткової інтеграції Т-ДНК або вставки в транскрипціонально "мовчазну" ділянку геному. Співвідношення загальних 03 ЖК (зокрема,
АЛК) до загальних об ЖК (зокрема, ЛК) становить 2,3 для ембріона 2270 і 11,96 для ембріона 284. Співвідношення загальних ю0б ЖК (зокрема, ЛК) до загальних 03 ЖК (зокрема, АЛК) становить 0,08 для 2284. Співвідношення нових 0б ЖК (за винятком ЛК) до нових 03 ЖК (за винятком АЛК) становить 0,03 для 2284. Обчислена загальна ефективність перетворення становить: (для ембріонів 2270, 25284) ОК на ЕПК - 14,0 95, 29,8 95; ОК на ДГК - 9,7 95, 24,2 90;
ЛК на ЕПК - 15,4 95, 30,7 95; ЛК на ДГК - 10,7 95, 25,0 95; АЛК на ЕПК - 22,1 95, 33,3 95; АЛК на
ДГК - 15,3 95, 27,0 95. Ці значення ефективності подібні або перевищують, у випадку 2284, спостережувані для ліній Тз РУРЗ416-СА7 Агарідорзі5, що вказує на здатність вектора роОР3416-
СІА7-тоав до належного функціонування в клітинах В. пари5. Рівень СДК становить менше 3,0
Фо, вказуючи на те, що Дб-елонгаза функціонує навіть краще, ніж конструкція сА?7.
Індивідуальна ефективність ферментів, досягнута в Ж284, становила: 97,4 95 для А12- десатурази; 92,3 95 для Ф3-десатурази; 38,2 95 для Дб-десатурази; 88,2 95 для Аб-елонгази; 98,8 до для Д5-десатурази; 94,1 96 для Д5-елонгази; і 86,3 96 для Л4-десатурази. Загальний вміст насичених жирних кислот становить 21,2 956, загальний вміст мононенасичених жирних кислот становить 10,2 95, загальний вміст поліненасичених жирних кислот становить 68,6 905.
Винахідники вважають, що це був найвищий рівень ДГК, досягнутий в клітинах В. пари на даний момент, за винятком подальших даних, розкритих нижче. Це також продемонструвало, що модифікація рОРЗ3416-сжА7-тоаВ відносно руРЗ416-зА7 є ефективною з точки зору з погляду підвищення рівня експресії гена Аб-десатурази. Бінарні вектори руР3416-СА?7, руРЗ3416- пА7-тодА, руРЗ3416-сА7-тоас, руРЗ3416-СА7-тоаб, руРЗ3416-сА7-тоаєЕ, і руР3416-СА7-тоа, розкриті вище, використовуються для співтрансформації з 3551 ЕС2, з метою одержання
Зо трансформованих соматичних ембріонів В. пари5. До 7,0 95 ДГК спостерігається в ембріонах той, 9,9 90 - в ембріонах тоаЕ, 8,3 95 - в ембріонах тоаб і 3,6 95 - в невеликій кількості ембріонів тодо.
Таблиця 19
Склад жирних кислот олії із соматичних ембріонів Вгаз5іса пари 2270 і 24284, одержаних співтрансформацією специфічною для насіння конструкцією кислоти ДГК руР3416-сА7-тоаВ і 355: ЕС2, а також 2286 і 2289 (руРЗ3416-СА7-тоа) 111111 1111ж270 | я2вя | й286/ | 28907 16149 ї177717171007 | ..Ц(ЮЙо0о4 юЮюф(| 08 2 щ | 08 Ф 11111163. ї17771105 2 | 5 Ющ 06 | їм ( 13 1 18ла8 77 17777711667711 77111815 1 18лат 7 1777771163 | 1768 | 2 щ-Б,б5 67 4 11111827 1777111189 7 | ..юЮю45 щЩ | 700 | 98 г Ф 18306 ї7777171007 | .ЮюЮЙЛ08 ЮюЮ(.03 6 щ | 03 гФ 7777.и.200 771... .09 | 09 | 08 | 08 1120303 17777105 | .-.-.ОЇЮ | 05 2 щЩ | 06 Ф 771111.220 777. 17717171717108 |. .ЮЮюЮД15 | 06 2 щЩ | 07 - 111 204ю3 17777102 | ..юЮюЮюЙ09 2 ЮюЮДщ | 07 2 щЩщ | 07 " 111 222ов 17777100 | 7.12 | 00 6 юЮющж «ЛЗ 00 г Ф(-с( 11122303 17777100 | 77011100 1.70 11111240 777 17771717117108 | 710 | 10 | 10 1172441 77777177111108 | 70 | 07 6 ющ З 098 г Ф
Приклад 7. Аналіз ТАГ з трансгенного насіння А. ПаіІапа, що продукує ДГК
Позиційний розподіл ДГК в ТАГ із трансформованого насіння А. Наїйапа визначали за методом ЯМР. Загальний ліпід екстрагують приблизно з 200 мг насіння, спочатку роздавлюючи його під шаром гексану, з подальшим перенесенням роздавленого насіння до скляної пробірки, що містить 10 мл гексану. Пробірку нагрівають приблизно до 55"С на водяній бані, після чого обробляють вихровим перемішуванням і центрифугують. Гексановий розчин екстрагують, і процедуру повторюють з додатковими порціями 4 х 10 мл. Екстракти об'єднують, упарюють за допомогою роторного випарника, і ТАГ в екстрагованому ліпіді очищують від полярних ліпідів шляхом пропускання крізь коротку колонку з кремнію діоксидом, з використанням 20 мл 7 90 діеєтилового ефіру в гексані. Позиційний розподіл ацильної групи на очищеному ТАГ визначають кількісно, як було описано раніше (Реїгіє еї аї., 2010а і Б).
Аналіз продемонстрував, що велика частина ДГК в загальній олії з насіння розташована в положеннях 5п-1/3 ТАГ, і невелика кількість знайдена в положенні 5п-2 (Фіг.9). На протилежність цьому, ТАГ з продукуючого АРК насіння продемонстрували, що 50 95 АРК (20:4А58и1л12) розташовано в положенні 5п-2 олії трансгенної каноли, тоді як очікувана величина для випадкового розподілу становить тільки 33 95 (Реїгіє еї аї., 2012).
Позиційний розподіл ДГК в ТАГ з насіння В. пари, трансформованого руР3416-сА7 або комбінацією руР3115 і р)РЗ3116, визначали по суті в такий же спосіб.
Додатково, загальний ліпід з трансгенного. насіння А. ІНаїІйапа був проаналізований РХ-МС з потрійною квадрупольною лінзою, щоб визначити основні різновиди триацилгліцеролу, які містять ДГК (ТАГ) (Фіг. 10). Знайдено, що різновидами ТАГ з найвищим вмістом ДГК є ДГК-18:3- 18:3 (ТАГ 58:12; номенклатура не описує позиційного розподілу), і на другому місці знаходиться
ДдГК-18:3-18:2 (ТАГ 58:11). Три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18) спостерігається в загальній олії з насіння, хоча і з низькими, але знайденими рівнями. Інші основні різновиди ТАГ, що містять ДГК, включали ДГК-34:3 (ТАГ 56:9), ДГК-36:3 (ТАГ 58:9), ДГК-36:4 (ТАГ 58:10), ДГК-36:7 (ТАГ 58:13) і
ДдгГК-38:4 (ТАГ 60:10). Ідентичність двох основних ТАГ, що містять ДГК, була додатково підтверджена квадрупольною часопролітною (20-ТОЕ) МС/МС
Приклад 8. Прогнозування продукування ДГК в насінні В. пари
Ефективне продукування ДГК в насінні Агарідорвзіє з рівнем 15 95 при використанні генетичної конструкції СА7 було продемонстроване у Прикладі 2. Така ж конструкція в насінні
Вгаззіса пари приводила до продукування тільки приблизно 1,5 95 ДГК у багатьох (але не всіх) із трансформантів, перш за все за рахунок слабкої експресії гена Дб-десатурази СА7 в цьому виді (Приклад 4). На базі припущення про те, що модифікації конструкції ЗА7 можуть подолати проблему (див. Приклад 5, як продемонстровано у Прикладі б) експресії гена Дб-десатурази, були здійснені обчислення для визначення вірогідного профілю жирних кислот для трансгенного насіння В. пари5, що експресує гени з варіанту роуР3416-5А7, в якому кожен кодований трансгеном фермент функціонує так само ефективно, як спостерігається для А. ІПаїїапа, що містить конструкцію СА7. Передбачений склад жирних кислот для трьох обчислень (41, 22, ЯЗ) наведений в Табл. 20. Дані базуються на складі жирних кислот дикого типу (нетрансформований) для В. пари, що містить 59 Фо олеїнової кислоти, 20 9о ЛК і 8 95 АЛК. Три передбачені часткові профілі жирних кислот, наведені у нижній половині таблиці, базуються на ефективності перетворення для кожної ферментної стадії, наведеної у верхній половині таблиці. У прогнозі 22, комбінація Д12-десатурації з ефективністю 75 95, Д15-десатурації! з ефективністю 75 95, Дб-десатурації! з ефективністю 35 95, Дб-елонгації з ефективністю 80 905, д5-десатурації з ефективністю 90 95, Д5-елонгації з ефективністю 90 905 і Д4-десатурації з ефективністю 90 95 приводила б до продукування приблизно 10 95 ДГК в типовому трансгенному насінні каноли. Всі наведені значення ефективності є нижчими або дорівнюють індивідуальній ефективності, спостережуваній в Агарідорзіх, тому прогноз Ж2 представляє консервативну оцінку. Ефективність трансформації, наведена в Ж3, представляє наближення, що базуються на ефективних перетвореннях, які спостерігалися в А. ІНаїіїапа, трансформованій руР3416-сА?. Згідно прогнозу, ДГК буде продукуватися на рівні приблизно 15 95 від загального вмісту жирних кислот в олії з насіння, що продукується в насінні В. парих5, причому даний результат відображує найефективніші рівні продукування, спостережувані в А. Паїїапа.
Очікується, що вставка декількох Т-ДНК в гомозиготному стані підвищуватиме рівень ДГК до 20 9о у В. парив.
Таблиця 20
Прогнозований склад жирних кислот для відібраних жирних кислот як відсоток від загального вмісту жирних кислот в олії з насіння Вгаззіса пари5, трансформованого конструкцією біохімічного шляху ДГК, що базується на ефективності ферментів, що спостерігалася у трансгенному Агабідорзі5. Ферменти наведені у порядку біохімічного шляху для одержання ДГК з олеїнової кислоти, дес - десатураза, ело - елонгаза. Передбачений склад жирних кислот 41, 42 і
ЯЗ базується на значеннях ефективності, наведених у верхній половині таблиці.
Фермент | 77777771 11111111 11111112 |у атадес/////7777777717771717171711111111111111111111117096111171111117596 | 8096
Я15дес 777777 17777171717171711111111111111111111709611171111117596 | 8096 аб-дес(ш3) ///7777171777111111111111111111111111119309611 17111111 3596 | 40956 2
Явб'єло777777771111Ї7771171717171717171711111111Ї1711711180961 77111806 7111119096 дбідес/////7777777777171777171717171111111111111111111118096. 1771717171719096 | 9096 2 бб'ело////777777771717771717171717171717111111111111111118096. 17717171717119096 |... 9096 2 бадес//////7777777717777171717171111111111111111111118096.17717171717119096 |... 909562
Шо азЗов 17111111 11111126 1111131 ннІШЕНЕИНШНШНШОІ ЛЛІПОЛЛИЬОЖЛІТТООВОВ ОШЛОЛОТНЯ ПООООНЯ ПОЛО 84311111 11111136 1111111 2043 1111111111111111111111111111а61 1111111 196 11111121 2053 1111111111111111111111111111аб611111111196 11111121 22531116 11111196 22вш37777111117111111111111111117111111115б611117111111о96 | 7 15961
Приклад 9. Стабільна експресія трансгенного біохімічного шляху ЕПК в листі рослини
Конструкція бінарного вектора
Бінарний вектор, РОКЕ0О4-11АВОВЕС Сомреа ЕРА іпзетп (5ЕО ІЮ МО: 8) сконструйований для введення Т-ДНК в рослини з метою синтезу ЕПК в тканинах листя. Він містить химерні гени, що кодують ферменти: Аб-десатуразу М. ризійа (ЗЕО ІО МО: 16), Аб-елонгазу Р. согааїа (ЗЕО І
МО: 25) і Д5-десатуразу Р. заїїпа (5ЕО ІЮ МО: 30), кожну під контролем Самм 355 і промоторів маленької субодиниці (ПМС) рубіско А. ІНаїЇапа (Фіг. 9). Бінарний вектор конструюють шляхом синтезу ділянки 199-10878 ЗЕО ІЮ МО: 2 і клонування його в бінарний вектор-реципієнта
РОВЕОЯ4 (Соши еї аї., 1997) на сайтах В5іУМІ і Казхі. Три гени біосинтезу жирних кислот, кодуючі ферменти, необхідні для перетворення АЛК, 18:329.1215 на ЕПК, 20:5А558.11ли17,
Тимчасова експресія конструкції ЕПК в клітинах листя М. репінатіапа
Для перевірки правильності конструкції та її здатності ефективно експресувати гени в тканинах листа, химерний вектор роКкЕО4-11АВОВЕС Сомреа ЕРА іпзегі вводять в
А. Штеїасієпо, штам АСІ1. Химерний вектор 355:р19 також вводять в А. їштеїасієп5, штам
АСІ1, як розкрито у Прикладі 1. Клітинами з одержаних культур інфільтрують тканину листя рослин Місоїйапа репіпатіапа в кімнаті для росту з температурою 24"С. Декілька зразків для прямого порівняння інфільтрують зразками для порівняння, розміщеними з обох боків одного і того ж листа. Експерименти виконують в трьох повтореннях. Після інфільтрації рослини вирощують ще протягом 5 днів, після чого листові диски витягають для аналізу профілю жирних кислот за методом ГХ, як розкрито у Прикладі 1. Аналіз за методом ГХ виявив, що вектор ЕПК здійснює свою функцію у вигляді продукування ЕПК в листі Місоїйапа репіпатіапа (Табл. 21) з найвищим рівнем ЕПК, який становить 10,7 95 від загальних ліпідів листа.
Стабільна трансформація Місоїйапа їарасит
Химерний вектор РОКЕ0О4-11АВСОВЕС Сомреа ЕРА іпзегі використовують для стабільної трансформації Місоцйапа їарасит. Вектор вводять в А. Шштеїасіеп5, штам АСЇ1, шляхом стандартної процедури електропорації. Трансформовані клітини вирощують на твердих середовищах Лурія-Бертані з додаванням канаміцину (50 мг/л) Її рифампіцину (25 мг/л) та інкубують при температурі 28"С протягом двох днів. Одиничну колонію використовують для ініціації свіжої культури. Через 48 годин інтенсивного культивування, клітини збирають
Зо центрифугуванням при 2000 х д, і супернатант видаляють. Клітини ресуспендують у свіжому розчині, що містить 50 95 середовища Лурія-Бертані і 50 95 середовища М5, з оптичною густиною ОЮвоо - 0,5.
Таблиця 21
Склад жирних кислот загального ліпіду листя трансгенних подій Місойапа репіпатіапа (тимчасова експресія) і Місоїйапа їабасит (стабільний первинний трансформант) з найвищими рівнями ЕПК із кожного експерименту 11111111 Мореппатіала,/ | /// Мо'арасит7/З 74011710
ОО 111716011111117171111111111718511Ї1711111111111781 1 лвим 1 17111112 11111138 1 л16лая717777777717111011111 11111101 11171631 11111116 11111115 л8ю11111 11111134 11111113 вла 177777777171711108111111111 11111101 11120011 171111111711105. | 05 КК ношення хни 24011710 11111111 04721 ншиииинининнннннининнинншишшшши ви 11111111111281111171 11111116 111111 182ов|777771717171711171261 |7111111111171451 нини 1111 2б2ов/17777771111111001117 11111100 ее ---- нини
Таблиця 21
Склад жирних кислот загального ліпіду листя трансгенних подій Місойапа репіпатіапа (тимчасова експресія) і Місоїйапа їабасит (стабільний первинний трансформант) з найвищими рівнями ЕПК із кожного експерименту 11111111 Морепшпатіала,/ | /// Мо'арасит7/З
Омега З
Зразки листя М. Тарасит, сорт МУ38, вирощеного іп міїго, зрізають і розрізають на квадратні секції розміром приблизно 0,5-1 см" за допомогою гострого скальпеля в зануреному у розчин
А. їІштеїтасієп5 стані. Пораненим фрагментам листя М.арасит, зануреним в А. Штвеїгасіеєпв, витримували за кімнатної температури протягом 10 хвилин, після чого промокали стерильним фільтрувальним папером і переносили на планшети М5 без добавок. Після періоду співкультивування протягом двох днів при 24"С, експланти тричі промивають стерильним рідким середовищем М5, і далі промокають насухо стерильним фільтрувальним папером та вміщують на селекційний агар М5, 1,0 мг/л бензиламінопурину (БАП), що містять 0,25 мг/л індолоцтової кислоти (ІК), 50 мг/л канаміцину і 250 мг/л цефотаксиму. Планшети інкубують при температурі 24"С протягом двох тижнів, щоб дати можливість розвинутися пагонам із трансформованих фрагментів листя М. їабасит.
Для одержання вкорінених трансгенних рослин іп міїго, здорові зелені пагони зрізають і переносять в горщики для культури тканини місткістю 200 мл, що містять агарове середовище
М5 з додаванням 25 мкг/л ІУК, 50 мг/л канаміцину і 250 мг/л цефотаксиму. Після утворення коріння трансгенні пагони переносять в грунт і вирощують до стану зрілості в теплиці. Листові диски досить великого розміру одержані від 21 зрілої трансгенної рослини, і профіль жирних кислот аналізують, як розкрито у Прикладі 1. Виявлено, що всі трансгенні зразки містять ЕПК (Табл. 21), причому найвищий рівень ЕПК знайдений в первинному гемізиготному трансформанті і становить 12,1 до від загальних ліпідів листя, причому зразки листя також містять невелику кількість (« 0,5 95) ДПК в ліпіді, що є результатом елонгації ЕПК з низьким рівнем Д5-елонгазной активності у Аб-елонгази. Співвідношення загальних 003 ЖК (зокрема,
АЛК) до об ЖК (зокрема, ЛК) становить 2,7. Обчислена загальна ефективність перетворення становить: ОК на ЕПК - 18,4 95, ЛК на ЕПК - 18,9 95, АЛК на ЕПК - 25,9 95. Продукування 12,1 90
ЕПК є особливо значущим, оскільки події були первинними гемізиготними трансформантами.
Зокрема, ефективність перетворення АЛК на ЕПК є близькою до спостережуваної в стабільних трансформантах насіння. Також слід зазначити, що конструкція не містить Д12- або А15- десатурази, щоб збільшити перетворення ОК і ЛК на АЛК. Очікується підвищення ефективності при додаванні такої активності.
Зо Урожай насіння гемізиготних трансформантів збирають і висівають для одержання гомозиготних рослин.
Набір насіння ліній з найвищими рівнями ЕПК виглядає нормальним, і насіння ліній 210 і 217 проростає достатньо добре, щоб одержати покоління Т2. Співвідношення ЕПК до вказаних нульових (відсутність ЕПК) ліній показує, що подія 228 була однолокусною, і покоління Тз було таким же. Аналіз профілю жирних кислот вказаної популяції Тз продемонстрував, що трансгени були гомозиготними без нульових подій та із стабільною кількістю ЕПК. Середня кількість ЕПК в загальних ліпідах листя загальної популяції Тз становить 9,4 хз 0,3 95 (Табл. 22).
Таблиця 22
Характерні профілі жирних кислот загальних ліпідів листя дикого типа (ДТ) і незалежних трансгенних або тимчасово трансформованих ліній (ЕПК).
Представлені види Місойапа репіпатіапа (тимчасова трансформація),
М. табасит (стабільно трансформована популяція Тз), Мідпа ипоацісшагїа (стабільно трансформована подія Ті). Помилка позначає стандартне відхилення для декількох зразків. Очевидна ефективність перетворення, наведена внизу, описує шлях 03 та обчислена як сума продуктів у вигляді ЖК/суму субстрату ж продуктів у вигляді ЖК. 71111110 1771111111110171Мобепйатіапа, | Моїарасит | УМ.шпоцісшав 11777711 до | в оК ОЇ дт | вПК ОЇ дт | вп 777.7.7.юЮМ/7Ю | 7160 |17лжхол о лвиногі|5охов| вові 180 |в 1... |бломзу зано) гомо | ЗБ | 3003 38 |20х09 777.7.7.юЮМ7/7 | 7163 |вбваом | вохол | Баов | 5403 777..7.7.юЮИ | 7180 | зло | З5оЗз | 2оаног | вно | 18 |45504 1111111. |Незначн| 1450 | ї14хол | зл я04 | 250 23 |2БОМ пед п Я Я ПОЛЯ ПОЛЯ ПОН ОХ 77717111. ОК |тльом | гхог| 16 | іноз 20 77717111 | ЛК |л2бжо4 л127ногі| лоти |ї80х09 134 |182х30 7777717... | АЛК |53302 37202|522х19|34006 586 | 3820 пед п Я Я ПОЛЯ ПОХНЯ ПООННЯ ОХ лк ої - 230 | - 23503 | - |бвбхог
Омегає (20206 | блжо | - | бймжо | оляо | - | бло
ДдгЛК | бижо | б0ижо | - | - | - | -
АРК Її - | 030 | - охо | - | 020 пе п Я Я ПОЛЯ ПОХЛОНЯ ПООНЯ ОХ сдкК ої - | лтвжом | - лл1лвбом | - | 150
Омега3 | ЗК | - | 040 | - лихом | - |03х02
БПК | - |02хо5| - /94:03| - |71х02 док ої - | 030 | - 040 | - |в пе я Я Я ПОЛЯ ПОЛЯ КОНЯ ОХ о Абдес| -:( | 2595 | 2 Ю-.:К(К. | 2795 | -(К | 2095
Перетворення Аб-єло | | 8895 | | 8795 | (Р: | 8595 омега-3 | Аб-деє| | 9795 | | 90956 | (Р: Й 9695
І Абело| | 39 | Б | 49 | | обе
Зразки листя гомозиготних рослин Тз М. їабасит піддають подальшому біохімічному аналізу.
Загальні ліпіди екстрагують з ліофілізованого листового матеріалу і фракціонують тонкошаровою хроматографією (ТШХ). Виявлено, що ЕПК присутня в ТАГ М. їарасит в кількості до 30,1 95, а також у полярних ліпідах в кількості 6,3 95 (Табл. 23). Було цікаво відзначити, що
ЕПК, продукована трансгенним шляхом, присутня у всіх оцінених ліпідних фракціях зокрема,
ТАГ, моногалактозилдигліцероли (МГДГ), дигалактозилдигліцероли (ДГДГ),, сульфохіновазилдіацилгліцероли (СХДГ), фосфатидилгліцерол (ФГ), ФХ, фосфатидилетаноламін (ФЕ), фосфатидилінозитол (ФЕ) і фосфатидилсерин (ФС). Всі пули ліпідів містили низькі рівні нової проміжної сполуки або 0б жирних кислот ДЛ-ПНЖК, із співвідношенням ТАГ нових 033 і б жирних кислот, що становить 10:1.
Стабільна трансформація вігни китайської (коров'ячий горох, Соуреа)
Химерний вектор РОКЕО4-11АВСВЕС-Сомреа-ЕРА-іпзегі трансформують у вігну китайську (Мідпа иподпцісціаїа;), як розкрито нижче. Зріле сухе насіння є переважним початковим матеріалом, хоча насіння, зібране із незрілих стручків з максимальною масою свіжого насіння, також може використовуватися. Сухе насіння молотять уручну, щоб уникнути розколювання оболонки насіння, і таким чином зменшити інфікування мікроорганізмами.
Сухе насіння або незрілі стручки занурюють в 70 95 етанол на 2 хвилини, і далі обробляють протягом 30 хвилин в 20 95 комерційному відбілювачі (кінцева концентрація натрію гіпохлориту
8,4 г/л). Далі насіння кілька разів промивають стерильною водою. Незріле насіння витягують із стручків в асептичних умовах, тоді як зріле насіння замочують для набухання протягом ночі. Два різних експланти можуть використовуватися для одержання множинних пагонів, а саме, ембріональна вісь і сім'ядоля безпосередньо, переважно сім'ядоля з приєднаною, розрізаною навпіл ембріональною віссю. Пагони і кореневі бруньки видаляють з осі перед утворенням пошкодження в сім'ядольному вузлі, тобто точці прикріплення осі до сім'ядолі. На основі початкового порівняння 19 сортів і ліній стало зрозумілим, що більшість ліній вігни китайської може бути трансформована, і єдине застереження полягає у тому, що різні умови культивування тканин слід оптимізувати для кожної лінії.
Таблиця 23
Аналіз триацилгліцеролу (ТАГ) ліпідних фракцій молодого і зрілого листя (молодих | зрілих), загального полярного ліпіду (ПЛ), моногалактозилдіацилгліцеролу (МГДГ), дигалактозилдіацилгліцеролу (ДГДГ), сульфохіновазилдіацилгліцеролу (СХДГ), фосфатидилгліцеролу (ФГ), фосфатидилхоліну (ФХ), фосфатидилетаноламіну (ФЕ), фосфатидилінозитолу (ФЕ) і фосфатидилсерину (ФС) із зразків трансгенного листя Місопйапа
ІїІарбасит. Помилка означає стандартне відхилення для декількох зразків. До 30 96 ЕПК спостерігається в ТАГ листя, причому ЕПК також поширена в полярних ліпідах. Крім того, для декількох жирних кислот спостерігалися відмінності в профілях між молодим і зрілим листям. 17117111 | Хлоропластидні | 0 Позахлоропластидні//://З тТАгІ| Фл |мгдг/дгдг у схдг тво 8118,17,8 123, 31132 18,0 | 148,3 | 521,0 | 26(22,9 | 30240 | 3038,7 | 43І31,9 | 36
І З 8 " "| 6,6 0,0 4 0 о З 2 161101 34,0132 бою змі) ою оо ою РОМ оо оо | оїо тоїтя , 14811 0,411, ев реву ввів рат сію ою ою тво. во рувівя 29139 1111235135 57, 47168166 19 пог з41в8г0219 фе в|зв 14124 зотодовіто 2, 1,011 ,511,413,6 4,9|14и116,517,72,513,7 пи п п Я ПОН ПОН КОНЯ КОНЯ КОНЯ КОН КОНЯ КОХ око Іо,8і 2,811,1 0,810,31,8 11,0 ет. 5,3 |4,918,1 12,912,5 11142,5 | 0,814,9 |2,3 лк 27,7 11117312, в.016 віз 110,11,7 ІВИ 7 | 13і39,2 | 25137,9 | 28і22,0 | 13244 |17 3,7 З М 5 9 е 2 не) й НІ длюо 96117, 39,0134, 60,3 |5161,2 | 523,7 |215,7 11417,3118, 5,5 110,17,6 110,14,8 | 10, 2 4 1,9 8,6 1,5 НІ 2 5 0 5 пи п п Я ОН ПОН ПОН КОНЯ КОНЯ КОН КОНЯ КОХ глюорвізо 152 ри ІЗ МИ 02 То 1в12511,7І2,7|0,8 109111 11,3
Омега: 20:206| оо |олічїл | оо / оо | оо | оо / оо |о5І0| оо / оо дглк оо | оо | оо оо оо | оо | оо | оо / оо / оо
АРК 60,91 0,1Щ|10,2 02|04| о|о | оЇо / оо (0,310,310,4|0404|0,6| 002 пи п п Я ПОН ПОН ПОЛОН КОХ КОНЯ КОН КОНЯ КОХ сдко ої 1,612,0 1,7 |2,00,610,7 1211 ото ем І3,611,3 12,010,810,810,9 11,6
Омега. 20:303 0,210, 0,110,2 0То д2Ї0,3 оо |оТом | о2То (03Т04| оо | ого з (ЗК 0еЇ02|02і0з 0020103 оо | оо | б2о да огіоліогі оо
ПК РВВЗ ви 163 ба 111 оз І3,6 змія, 1,010,819,7 16,4 91178 12 вдів док ра|о5| оо |оіом| оо | оїо | оо (03040504 0102 | оо
Гени селекційних маркерів Баг або Мрій можуть використовуватися для трансформації.
Адгорасієгйт їштеїасіеєпо, штам АСІ1, є переважним штамом для трансформації вігни китайською. АдгоБбасіегішт, що несе вектор роКкЕ04-11АВСОСВЕС-Сомреа-ЕРА-іпзей культивують протягом ночі при 287"С на шейкері із швидкістю обертання 180 об/хв, суспензію центрифугують при 8000 д протягом 10 хвилин і ресуспендують в Середовищі 1 (середовище на базі М5, розбавлене 1/10, що містить 30 г/л сахарози, 20 мМ 2-МЕС, рН доводять до 5,6 перед обробкою в автоклаві, з додаванням оброблених стерилізуючою фільтрацією вітамінів М5, 100 мг/л міоінозитолу, 1,7 мг/л БАП, 0,25 мг/л гіберелової кислоти (Аз), 0,2 мМ ацетосирингону, 250 мг/л Ма тіосульфату, 150 мг/л дитіотрейтолу і 0,4 г/л І -цистеїну). Експланти занурюють без струшування до бактеріальної суспензії на 1 годину після утворення пошкоджень в меристематичних ділянках з використанням скальпелю. Далі оброблені експланти промокають стерильним фільтрувальним папером і переносять до затверділого Середовища 2 (Середовище 1, що містить 0,8 9о агару), накрите фільтрувальним папером. Через 4 дні співкультивування, експланти переносять в Середовище 3 (середовище М5 з повною активністю, що містить 100 мг/л міоінозитолу, 150 мг/л тиментину, 30 г/л сахарози, З мМ МЕС, 1,7 мг/л БАП, 5 мг/л ФФТ або 25-50 мг/л генетицину або 150 мг/л канаміцину, 0,8 г/л агару, рН доведено до 5,6) для ініціації пагонів і селекції трансформованих пагонів. За два тижні з'являються перші пагони. Сім'ядолі видаляють з ділянки сім'ядольного вузла, і культури переносять у свіже Середовище 3. Культури переносять у свіже Середовище З кожні два тижні після видалення мертвої і вмираючої тканини. Перші чотири субкультури вирощують із селекцією канаміцином, і далі чергують генетицин і канаміцин. Після шести субкультур зелені пагони, що вижили, переносять в Середовище 4 (Середовище З без БАП, але з додаванням 0,5 мг/л БАЗ, 50 мг/л аспарагіну, 0,1 мг/л З-індолоцтової кислоти (ІК), 150 мг/л тиментину або
ФФТ (10 мг/л), генетицин (50 мг/л) або канаміцин (150 мг/л)) для подовження пагонів. Пагони перевивають кожні два тижні, до тих пір, поки довжина одиничних пагонів не буде становити більше 1 см. Такі великі пагони переносять із чашок Петрі в банки для культури (заввишки 80 мм) для подальшого росту в умовах селекції.
Більшість регенерованих пагонів може вкорінятися іп міго, причому рослини з утвореним корінням переносять в грунт і дозволяють укорінятися в камері з високою вологістю протягом 14-21 дня перед перенесенням в теплицю з умовами навколишнього середовища.
Для підвищення частоти перенесення гена у вігну китайську, до середовищ для співкультивування додають тіольні сполуки. Додавання І-цистеїну, дитіотрейтолу і натрію тіосульфату зменшує появу бурого забарвлення пораненої тканини.
Великі кількості експлантів вігни китайської можуть оброблятися за спрощеним протоколом.
Коротко, протокол складається з наступних стадій: набухання стерилізованого зрілого насіння протягом ночі у воді; одержання експлантів шляхом подовжнього розрізання насіння навпіл, внаслідок чого розщеплена ембріональна вісь (з видаленими верхівками пагонів і коріння) все ще залишається приєднаною до сім'ядолі; інфікування Адгобасіегішт, штам АСІ 1, якому сприяє утворення місцевих пошкоджень на меристематичних ділянках, співкультивування на середовищах, що містять тіольні сполуки, протягом 4 днів при 25"7С в освітленому місці, ініціація пагонів і елонгації на середовищі, що містить селективні агенти, вкорінення пагонів іп міїго і перенесення їх в умови теплиці для цвітіння і утворення насіння, ПЛР або ферментний аналіз передбачуваних трансгенних рослин, і скринінг наступного покоління нащадків за методом ПЛР або визначення ферментної активності.
Потомство трансгенних рослин То є фенотипово нормальним. Трансгени передаються потомству, і гомозиготні рослини Те» ідентифікують за допомогою скринінгу їх нащадків Тз щодо ферментної активності або ПЛР.
Із застосуванням даної системи трансформації одержані приблизно 10 трансгенних рослин на 1000 експлантів, що є подібним до частоти трансформації для інших бобів. В залежності від сорту або лінії, яку трансформують, даний протокол вимагає 5-8 місяців з моменту одержання експланту до збирання урожаю насіння Т..
Система трансформації використовується для введення бінарного вектора рРОНЕО4-11АВОВЕС-Сомреа-ЕРА-іпзег ов регенеровані, трансформовані рослини вігни китайської.
Були здійснені модифікації бінарного вектора рРОКЕО4411АВОВЕС-Сомреа-ЕРА-іпзетп, в ході яких додані гени, що кодують Д5-елонгазу і л4-десатуразу, щоб забезпечити генетичну конструкцію, яка має додаткову здатність перетворення продукованої ЕПК на ДГК. Конструкцію трансформують в рослини для одержання ДГК у вегетативних тканинах.
Присутність ЕПК була знайдена в невеликій кількості подій, що вижили в результаті хімічної селекції. Лінія з найвищим вмістом містила 7,1 ж 0,2 95 ЕПК в загальних ліпідах листя. Швидкість перетворення була нижчою, ніж звичайно спостерігається для вігни китайською, причому тільки 6 ліній були підтверджені як трансгенні. Це означає, що на даний момент невідоме, що саме 60 спричиняло вказаний ефект, хоча цікаво відзначити, що більша, ніж звичайно частка трансгенних подій містила неповні ділянки Т-ДНК. Можливо, великий розмір конструкції сприяв зниженню ефективності. Крім того, була обчислена очевидна ефективність перетворення для кожного із трьох трансгенних ферментів (Табл. 22). Результати були високою мірою подібними для всіх трьох видів, з високим рівнем перетворення на ЕПК після початкової Дб-десатурації природної АЛК. Деяка міра Д5-елонгації ЕПК до ДПК була відзначена, незважаючи на відсутність специфічної Д5-елонгази. Попередньо Дб-елонгаза Р. согдаїа продемонструвала низький рівень Д9-елонгазної активності (тобто, перетворення 18:389и12и15 на 20:3А1171417), хоча в дріжджовому аналізі Д5-елонгазної активності виявлено не було.
Приклад 10. Тестування варіацій генів А12-десатурази
Конструкція бінарного вектора
У спробі протестувати і порівняти серії химерних генів А12-десатурази, було сконструйовано декілька бінарних векторів, які використовуються для трансформації А. ІНаійапа і В. парив.
Кожний з бінарних векторів руР3365, рОРЗ3366, руР3367, руР3368 і руР3369 містить гени, що кодують ферменти о3-десатуразу Р. равзіогі5 (ЗЕО ІЮ МО: 12) і Аб-десатуразу М. ризіїа (ЗЕО ІЮ
МО: 16), ї одну з серії Д12-десатураз. ДЛ12-десатурази одержані з Стуріососси5 пеоїогтапь5 (номер доступу ХР 570226 у руРЗ3365), версії Д12-десатурази Стуріососси5 пеоїогтап5, що містить мутацію І151М, мета якої полягає у збільшенні активності гена (у руР3366), І аспапсеа
Кішумегі (ЗЕБЕО І МО: 10 в руРЗ367), 5упеспосузів РСОСб803 (номер доступу ВАА18169 в руР3368) і Стері5 раїіаезііпа (номер доступу САА76157, І ее сеї аї., 1998, в руР3369). Десатураза
Стеріз є єдиною рослинною десатуразою в серії; інші є грибковими ферментами. Вектори одержані за допомогою вставки рослинної кодон-оптимізованої ділянки кодування білка, за винятком Д12-десатурази Стгеріб5 раїевіїпа, яка була ділянкою дикого типу, для кожної А12- десатурази в сайт Мої! вектора руР3364 (див. Фіг. 12), в орієнтації, функціонально пов'язаній з промотором ЕР, щоб забезпечити специфічну для насіння експресію кожної десатурази.
Вектор руРЗ364 вже містить химерні гени, що кодують омгаЗ-десатуразу Р. равіогіб5 і Ддб- десатуразу М. ризійа, кожна під контролем специфічних для насіння промоторів (Фіг. 12).
Комбінація трьох ферментів біосинтезу жирних кислот, а саме Д12-десатурази, о3-десатурази і
Дб-десатурази, була розроблена таким чином, щоб здійснити збирання біохімічного шляху перетворення олеїнової кислоти (18:129У на СДК (18:4269и12153, Далі проводять аналізи для
Зо вимірювання рівня утворення СДК в трансформованому насінні.
Трансформація і аналіз А. Іаїїапа і В. пари
Химерні бінарні вектори вводять в А. штеїасієпе, штам АСІ1, і клітини з культур трансформованої Аадгорасієтйшт використовують для трансформації рослин мутантів Тад2
А. Іпаійапа, застосовуючи для трансформації спосіб занурення квіток (Сіоцоп апа Вепі, 1998).
Після дозрівання, урожай насіння Ті оброблених рослин збирають і здійснюють скринінг на планшетах М5, що містять канаміцин для селекції саджанців, які несуть ген селекційного маркера Мрій, присутній на Т-ДНК кожного химерного вектора. Саджанці Ті, що вижили, переносять в грунт. Після того, як рослинам дозволяють самозапліднитися і вирощують їх до стану зрілості, врожай насіння Т2 вказаних рослин збирають, і склад жирних кислот ліпідів насіння аналізують методом ГХ.
Химерний вектор рОРЗ3367 також використовували для трансформації В. пари5 за способом, розкритим у Прикладі 4, з одержанням 12 трансгенних подій. Вміст СДК був знайдений в інтервалі від 0,6 95 до 2,2 95 в пулі насіння рослин, і 9 індивідуальних насінин трансгенної рослини з найвищим рівнем СДК були проаналізовані щодо складу жирних кислот. Одержані в результаті такого аналізу дані щодо складу жирних кислот наведені в Табл. 24.
Дані продемонстрували, що активність Л12-десатурази, експресованої з кожної із Т-ДНК в
А. Паійапа і В. парих була несподівано низкою, забезпечуючи ефективність ферментного перетворення приблизно 20 95 замість 70-80 95, спостережуваних для такої ж касети експресії в конструкції (ЗА? (Приклади 2 і 3). Причина такої відносно слабкої експресії генів Д12-десатурази із вказаних векторів є не до кінця зрозумілою, але може бути пов'язана з положенням генів у конструкції в цілому.
Ї навпаки, аналіз експресії методом ЗТ-ПЛР продемонстрував, що гени о03-десатурази
Р.равіогіє і ДАб-десатурази М. риб5Ша на Т-ДНК відносно добре експресувалися у трансформованому насінні. Табл. 24 включає ефективність перетворення під дією Дб- десатурази в трансформованому насінні, яка варіює від приблизно 11 95 до приблизно 25 95 в одній трансформованій лінії В. пари5. Це значно вище, ніж ефективність перетворення під дією
Дб-десатурази приблизно 7 95, яка спостерігалася в насінні В. пари5, трансформованому конструкцією СА? (Приклад 4).
Таблиця 24
Склад жирних кислот як відсоток від загальних жирних кислот в олії з насіння, одержаному з одиничного насіння рослини ТТ: Вгазвіса пари5, трансформованої Т-ДНК з рОРєРЗ367. СДК (18:403) позначена напівжирним зображенням шрифту. зи зя2 ЗЯЗ зя4 35 36 ЗА 38 39 л16ла7 | 01 | 01 | 01 | 01 | 00 | 01 | ол | ом | ол сівзюо3 | 82 | 90 | 111 | 86 | 75 | 102 | 98 | 93 | 98 сбгою | 05 | 05 | 04 | 05 | 06 | 05 | 06 | 07 | 06 пед І Я ПНЯ ПОЛЯ ПОЛЯ ПОЛОН ПОЛОН КОН КОХ
Таким чином, для одержання переваги вищої ефективності перетворення під дією Дб- десатурази, що надається Т-ДНК із роОР3367, рослини В. пари5, трансформовані даною Т-ДНК, схрещують з рослинами, трансформованими Т-ДНК із руРЗ3416-СА7 (Приклад 4), з метою одержання рослин-нащадків і насіння, що несе обидві Т-ДНК. Склад жирних кислот олії, екстрагованої з насіння Е1, аналізують методом ГХ щодо вмісту ДГК та вмісту інших жирних кислот. Спостерігаються підвищені рівні ДГК, як наслідок збільшеної експресії Дб-десатурази.
Рослини, що є гомозиготними по обом Т-ДНК, одержані і повинні продукувати вищі рівні ДГК.
Приклад 11. Збільшення акумуляції жирних кислот з використанням білків-супресорів сайленсинга
Конструкція бінарного вектора
У УМО 2010/057246 розкрито використання білків-супресорів сайленсинга (БСС) для збільшення експресії трансгена в насінні рослин. Для демонстрації того, що використання таких білків може збільшити і стабілізувати продукування ДЛ-ПНЖК в олійних культурах протягом декількох поколінь, декілька БСС були вибрані з метою тестування, а саме М2 (номер доступу 5И178820.1), р19 (номер доступу Ау288943.1), р38 (номер доступу 0О0286869.1) і РОРЕ (номер доступу І 04573.1). рі9 являє собою білок-супресор з вірусу кущистої карликовості томатів (ВККТ), який зв'язується з міРНК завдовжки 21 нуклеотид перед тим, як вони будуть контролювати спрямоване Агдопаше розщеплення гомологічної РНК (Моїіппеї еї аї., 2003). М2, білок-супресор з вірусу жовтої кучерявості листя томату (ВЖКЛТ), зв'язується з рослинним білком 5553 (С1їСК еї а!І., 2008), тобто білком, який вважається необхідним для одержання проміжних сполук двохланцюгових РНК із субстрату олРНК (Весіїп еї аї., 2002), або зв'язується із структурами длРНК, що містять 5' виступ (РиКкипада еї аї., 2009). р.8 являє собою білок- супресор з вірусу складчастості ріпи (ВСР), який створює перешкоди в механізмі сайленсинга рослини шляхом зв'язуванні з білками Оісег і Агдопаціє (Алемедо еї аї., 2010). Білки РО, наприклад, РОРЕ і ЕРУ-РО, із полеровірусів, націлюють на білки Агдопацшіє, щоб підсилити розкладання (Ваштбегодег еї аї., 2007; Вопоїатіої! еї аї., 2007, Ризаго еї аї!., 2012). Генетичні конструкції були? таким чином? підготовлені для експресії даних БСС в зерні рослини, в комбінації з набором генів біосинтезу жирних кислот для одержання АРК (20:4858,11и15) з ЛК (18:189и12), як вказано нижче.
Гени біосинтезу жирних кислот, кодуючі лЛУ-елонгазу Ізоспгузіз даірапа та АВ8- і АДБ- десатурази Раміома заїїпа і бактеріальний селекційний маркер, одержані на єдиному фрагменті
ДНК з руР3010 шляхом розщеплення Ртвеїі і Амгії, що дає фрагмент розміром 9560 пар основ.
Ділянку, що кодує Д9-елонгазу, на цьому фрагменті сполучають з промотором ЕАЕЇ А. ІНаїїапа (рАСЄЕРАЕЇТ) і ділянкою термінації транскрипції/поліаденілювання конлініну (СиСпі2-3). Кожну з ділянок, що кодують десатуразу, приєднують до вкороченого промотору напіну ЕР1 (рВпЕР') і ділянки термінації транскрипції/поліаденілювання по53". Три гени біосинтезу жирних кислот на цьому фрагменті орієнтовані і розміщені таким же чином, як у руР107 (Реїіє еї аї., 2012) і кодують такі ж білки, як рОР107. Фрагмент ДНК також містить ген рЕР1:ОБгІіР:по53' з рСМ/141 (див. УМО 2010/057246), який кодує зелений флуоресцентний білок (З3ФБ). Даний ген скринінгового маркера використовується як специфічний для насіння візуальний маркер, що дає можливість простої і неруйнівної ідентифікації, і таким чином селекції трансгенного насіння, що несе та експресує ген.
Фрагмент Ріте!І-Амії! вставляють у сайт РіпеІ-АмтїІ кожної із серій по 5 векторів, кожен з яких містить інший ген БСС (УМО 2010/057246), з одержанням генетичних конструкцій, позначених рЕМО45, рЕМО46, рРЕМО47, рЕМО48 і рЕМО49. Вони містять гени, які кодують БСС РОРЕ, р38, р19, 355:М2 і М2, відповідно. Кожен з генів БСС знаходиться під контролем промотору ЕР і ділянки термінації транскрипції/поліаденілювання ос53", за винятком конструкції рРЕМО48, в якій ділянка, що кодує М2, знаходиться під контролем конститутивного промотору Самм 355. Ген БОС у кожному випадку знаходиться в межах ділянки Т-ДНК конструкцій, суміжної з правою межею (ПГ) Т-ДНК. Шоста конструкція, рЕМО50О, в якій відсутні послідовності, що кодують БСС, одержана за допомогою розщеплення рЕМО45 Апаї і Мпеї, з подальшою рециркуляризації ДНК для видалення гену ЕР1:РОРЕ, Кожна з 6 конструкцій містить ген селекційного маркера Мр в межах Т-ДНК, суміжно з лівою межею Т-ДНК. Всі конструкції містять джерела реплікації КК2 для підтримки плазмід в Адгобасіетгішт.
Трансформація А. ІНаійапа векторами експресії АРК в комбінації з БСС
Для трансформації генотипу МС49 Агабідорзі5, що являє собою подвійний мутант Тад2/ає1 з високими рівнями лінолевої кислоти в ліпіді насіння, рослини, обробляють за способом занурення квіток (Сіоцдп апа Вепі, 1998) з використанням А. іштеїасіеєп5, штам 5М3101, окремо трансформованої кожною із шести конструкцій РЕМО45-рРЕМО50. Оброблені рослини вирощують до стану зрілості, і зібраний з них урожай насіння Т: вміщують на планшети із середовищем М5, що містить канаміцин, для селекції трансформованих рослин Ті. Скринінг щодо експресії ЗФБ в насінні також застосовують як візуальний маркер для трансформованого насіння Ті. Саджанці, які вижили на планшетах М5/Кап, або які були одержані із ЗФБ-позитивного насіння, переносять в грунт і вирощують до стану зрілості для одержання насіння ТТ». Кількість одержаних трансформованих рослин становила 5, 14, 32, 8, 23 і 24 для трансформації рЕМО45, рЕМО46, рЕМО47, рЕМО48, рЕМО49 і реЕМО50, відповідно. На даній стадії було виявлено, що ген, який кодує р38 в рЕМО46б, був нефункціональним і, таким чином, рослини, трансформовані вектором рЕМО46б розглядалися як додатковий контроль, тобто по суті такий же, як і рРЕМО50.
Пул чисельністю близько 100 насінин Т»2 одержаний від кожної трансформованої рослини для визначення складу жирних кислот в ліпіді насіння шляхом одержання МЕЖК і аналізу методом ГХ. Крім того, 6 саджанців Те з кожної трансгенної лінії були вирощені для одержання насіння ТЗ.
Склад жирних кислот в загальному ліпіді, екстрагованому з насіння Т2, визначають за допомогою ГХ. Аналіз продемонстрував інтервал рівнів АРК і проміжних сполук ЕДК (20:206) і
ДГЛК (20:306) в популяціях Т». Дані для АРК проілюстровані на Фіг. 13 і 14.
Фіг. 13 ілюструє аналіз методом коробчатої діаграми рівня АРК в ліпіді популяцій насіння Т».
Очевидно, що медіанний рівень (50-й процентиль) АРК в популяціях насіння, які містили гени
ЕР'1:р19 і 355:М2, на додаток до генів біосинтезу АРК, є значно вищим, ніж у насінні, що містить дефектний ген ЕР1:р38 або контрольну Т-ДНК із рЕРО5БО, що не містить гена БСС. Середні рівні
АРК для насіння, трансформованого генами, які кодують р19 і М2, є вищими, ніж для насіння, що трансформоване геном р38 або не містить БСС (Фіг. 14). Одна лінія ЕР: р19 і дві лінії ЕР1:М2 продемонстрували близько 19 95, 20 95 і 23 95 АРК, відповідно. Вони представляють значення, що різко відхиляються, і таким чином не входили до обчислення для аналізу методом коробчатої діаграми. Вижила менша кількість рослин, трансформованих Т-ДНК, що містять гени
ЕРІ:РОРЕ ї 355:М2, в порівнянні з іншими конструкціями; вважається, що ці гени можуть шкодити здоров'ю рослини на фоні МС49.
Не тільки рівні АРК значно відрізнялися для різних конструкцій, але і спостережувані рівні в ліпіді насіння першої проміжної сполуки біохімічного шляху від ЛК до АРК, а саме ЕДК (20:206) були нижчими в лініях, що експресують М2 або р19, ніж у насінні, що не містить БСС або що містить конструкцію р38 (Фіг. 15). Серед насіння Тз, одна популяція, що містить конструкцію, яка експресує р19, продемонструвала рівень АРК 38 95, як відсоток від загальних жирних кислот в ліпіді насіння.
Ряд трансгенних ліній Тз прогресував до покоління Та. Рівні АРК в насінні Та, що експресує
М2, Є такими ж, як і в попередньому поколінні, або дійсно демонструють підвищені рівні, в порівнянні з їх батьками Тз (Фіг. 16). Лінії що експресують р19, продемонстрували більш різноманітні рівні АРК. Рівень АРК був зниженим у деяких лініях, тоді як в інших він був таким же або вищим, в порівнянні з батьками 13. | навпаки, лінії, що містять дефектний ген р38 або не містять БСС, загалом продемонстрували зниження рівня АРК і підвищення рівнів проміжних сполук (Фіг. 18). У деяких із цих ліній, вміст АРК був зменшений приблизно до 1 95, і рівні ЕДК зросли приблизно до 20 95. Середній рівень АРК в насінні Т4 був вищим для ліній, що експресують р19 ї М2, в порівнянні з лініями, що експресують р38 або що не містять БСС (Фіг. 17).
Даний експеримент проілюстрував, що експресія БСС у насінні трансгенної рослини, разом з додатковими генами для біосинтетичного шляху ДЛ-ПНЖК, не тільки підвищує рівень продукування бажаної жирної кислоти в першому поколінні нащадків, але і стабілізує рівень продукування жирної кислоти в більш пізніх поколіннях, наприклад, третьому або четвертому поколінні нащадків. Збільшене продукування жирних кислот супроводжується зниженням рівнів проміжних жирних кислот в біосинтетичному шляху. БСС р1іЗ ії М2, що експресуються із специфічних для насіння промоторів, є переважними. Конструкція, розроблена для експресії
БСС рз8, виявилася дефектною, і придатні дані не були одержані при використанні даної конструкції. БСС М2 і його гомологи з інших вірусів вважаються особливо переважними, оскільки вони дозволяють максимальну експресію генів біосинтетичного шляху і одночасний сайленсинг інших генів в тих же клітинах насіння, що розвивається.
Приклад 12. Аналіз вмісту і складу стеролів в оліях
Фітостерини з 12 зразків рослинної олії, придбаних із комерційних джерел в Австралії,
Зо охарактеризовані за методами ГХ і ГХ-МС. як похідні О-триметилсилілового ефіру (ОТМ5І- ефір), як розкрито у Прикладі 1. Стероли ідентифікували за даними утримання, інтерпретацією мас-спектрів і порівнянням з літературними даними та даними мас-спектроскопії лабораторних стандартів. Кількість стеролів визначають з використанням внутрішнього стандарту 5|(Н)-холан- 24-олу. Базова структура фітостерину і хімічна структура деяких з ідентифікованих стеролів проілюстровані на Фіг. 19 і в Табл. 25.
Аналізували рослинні олії: кунжуту (Зезатит іпаісит), оливи (ОІеа епгораєа), соняшнику (Неїїапіпи5 аппих), рицини (Кісіпи5 соттипів), каноли (Вгаззіса парих), сафлору (Сапнатив
Ппсюгіцв), арахісу (Агаспіз пуродаєа), льону (Гіпит ивіаїіввітит) ї сої (Сіусіпе тах). У порядку зниження по відношенню відносного вмісту, у всіх зразках олії основними фітостеринами були:
В-ситостерол (інтервал 28-55 95 від загального вмісту стеролів), Д5-авенастерол (ізофукостерол) (3-24 95), кампестерол (2-33 90), Д5-стигмастерол (0,7-18 Фо), ДУ-стигмастерол (1-18 905) і Д7- авенастерол (0,1-5 90). Були ідентифіковані декілька інших мінорних стеролів: холестерин, брасікастерол, чалінастерол, кампестанол та ебурикол. Додатково, були знайдені чотири С29:2 і два С30:2 стероли, але необхідне подальше дослідження для остаточної ідентифікації цих мінорних компонентів. Крім того, в деяких з олій присутні декілька інших неідентифікованих стеролів, але через дуже низький їх вміст, мас-спектри не були достатньо інтенсивними, щоб дозволити ідентифікацію їх структури.
Вміст стеролів, виражений як мг/г олії, у порядку зниження: олія каноли (6,8 мг/г), кунжутна олія (5,8 мг/г), льняна олія (4,8-5,2 мг/г), олія соняшнику (3,7-4,1 мг/г), арахісова олія (3,2 мг/г), сафлорова олія (3,0 мг/г), соєва олія (3,0 мг/г), оливкова олія (2,4 мг/г), рицинова олія (1,9 мг/г). до стеролів в складі і загальний вміст стеролів наведені у Табл. 26.
Таблиця 25
Назви за ІЮПАК / систематичні назви ідентифікованих стеролів
Таблиця 25
Назви за ІЮПАК / систематичні назви ідентифікованих стеролів
ІЮПАК/систематична назва 11111111 |метиленхолеетерин./://ОО/ОЇ./СС11111111111111111111111сСсСс кампестерол / 24- 24-метилхолест-5-ен-38-ол метилхолестерин метилхолестанол 24-етилхолеста-5,22Е-дієн-3В-ол 00019 Тергост-7-ен-3Д-ол 24-метилхолест-7-ен-38-ол 4,4, 14-триметилергоста-8,24(28)-дієн-ЗВ-ол
В-ситостерол / 24-етилхолестерин | 24-етилхолест-5-ен-38-ол р5-авенастерол / ізофукостерол /|24-етилхолеста-5,24(28)27 -дієн-38-ол б -стигмастерол / стигмаст-7-ен- од-етилхолест-7-ен-38-ол 24-етилхолеста-7,24(28)-дієн-3р-ол
Загалом, серед усіх зразків олії з насіння основним фітостерином був ВДВ-ситостерол (інтервал 30-57 95 від загального вмісту стеролів). Для олій спостерігався широкий інтервал частки інших основних стеролів: кампестерол (2-17 95), А5-стигмастерол (0,7-18 95), Д5- авенастерол (4-23 90), Д7-стигмастерол (1-18 905). Олії різних видів містили інший профіль стеролів, причому деякі профілі були досить відмінними. У випадку олії каноли, вона містило найвищу частку кампестеролу (33,6 95), тоді як зразки інших видів загалом містили нижчі рівні, наприклад, до 17 95 в арахісовій олії. Сафлорова олія містила відносно високу частку Д7- стигмастеролу (18 95), тоді як вміст цього стеролу звичайно був низьким в оліях інших видів, до 9 Фо в олії соняшнику. Оскільки вони є характерними для кожного виду, профілі стеролів можуть, таким чином, використовуватися як допоміжні для ідентифікації конкретних овочевих або рослинних олій та перевірки їх непідробленості або підробки іншими оліями.
Таблиця 26
Вміст і склад стеролів у проаналізованих рослинних оліях
Льон | Льон
Номер Загальна Кун- | Оли- ІСоня-ІСоня-ІРици-|Кано-| Саф- |Саф- | Ара- (на- (на- сте- -. |сіння |сіння | Соя «назва стеролу| жут | ва |шникіІшник|І на | ла | лор | лор | хіс ролу льо- | льо- ну) | ну) холо- холо- дне дне пре- пре- сува- сува- ння ння 1 холестерин /021081|02|00 01 |03|02/|01|02104|04 | 02 2 |брасікастерол 01 | 00100100 03|01|00100|00102|02 | 00 чалінастерол
З |/24-метилен-| 1,501 10,3 101 11/24 102 | 01 15114 холестерин кампестерол / 4 |24-метилхо- |162| 24 | 7,4 | 7,91854 3361121) 8,5 | 17,4 |15,7 1144 | 16,9 лестерин кампестанол / 5 24-метилхо- 0,703) 0301 0,2 03102102 10,7 лестанол 6 |С29:2" о0о|00|о011|02і|001|01105 05100 12/13 0 д- 7 опимастерол| 64 | 12 | 74 | 72 | тв | от | то | ав | 69 | ви | вв те
Таблиця 26
Вміст і склад стеролів у проаналізованих рослинних оліях
Льон | Льон
Номер Загальна Кун- | Оли- ІСоня-ІСоня-ІРици-|Кано-| Саф- |Саф- | Ара- (на- (на- сте- -. |сіння |сіння | Соя «назва стеролу| жут | ва |шникіІшник|І на | ла | лор | лор | хіс ролу льо- | льо-
Н Н
8 Ц|невдомий /|05|13107|06 08/|07|07/|13|04|07|06| 13 и 70 Ц|невдомий, /|00|131091|08 121/09|18107|12107|05107 11 |ебурикл.ї /|16|18141|44 15|10|191|29|121|35| 33109
В-ситостерол 12 |24-етилхолес-| 55,3 1456143,9143,6137,7150,81402|351/572|29,9128,4| 402 терин д- авенастерол / 13 ізофукос- 16972141 1193) 44 | 73163 | 53 23012421 33 терол т |(влясмох 00 24 09 їм |00|00|те|те|оо|оо| ос ов вий спирт седитнк пере ол|ов по пе ге| те во пе ово вий спирт
С29:2" 0010510710,7|151|121|28 19120101 0,7 05
С29:2" 10109|231|24|061|04|13 19/09/1017 1
СЗ0:2" 0о01|00|001001|191|001|00 001001 00100 0 д7-стигмас- терол / 19 стигмаст-7-ен- 2217119311091| 23 10,5|18,3) 1,1 | 7,9. | 8,7 | 5,6
ЗвВ-ол з ішаене 1т5||хо зе ов|ог|20|5707|ои| от ов. 21 |невдомий /|0,7|7110910800/04|031|04|001|30 13600 22 |невідомий /|031|00103109 00/|00|12/|13|02/|01 10003 24 |невідомий /|00|31109|13 06/04|02104|071|17,7|19| 08 25 |невідомий 1/091|04103|05 03|01|05107|03|0 01.06 сЗ0:2 22160|461|57|14|06|10 12712 12| 1 | 52 27 |невідомий 1001041 04|03 03|02|011|021|031|01 100035
І ІСума 100,0 1100,01100,01100,01100,01100,01100,01100,01100,01100,01100,01100,0
Загальний стерол (мг/г 58124413, | 1,9 321301 32148152 | 53,0 олії)
С29:27 ї 30:27 позначають стерол С29 з двома подвійними зв'язками і стерол СЗ30 з двома подвійними зв'язками, відповідно
Порівнювали по два зразки соняшнику і сафлору, у кожному випадку один був одержаний холодним пресуванням насіння і був нерафінованим, тоді як інший не був одержаний холодним пресуванням і був рафінованим. Хоча спостерігалися деякі відмінності, два джерела олії містили подібний склад стеролів і загальний вміст стеролів, наводячи на думку про те, що обробка і рафінування здійснюють незначний вплив на два вказаних параметри. Вміст стеролів серед зразків відрізнявся в З рази і варіював від 1,9 мг/г до 6,8 мг/г. В олії каноли він був найвищий, а в рициновій олії -- найнижчий вміст стеролів.
Приклад 13. Збільшення акумуляції ДГК в положенні 5п-2 ТАГ
Автори цього винаходу припускали, що акумуляція ДГК в положенні 5п-2 ТАГ може бути збільшена шляхом співекспресії І-ацил-гліцерол-3-фосфат ацилтрансферази (ЛФКАТ) із шляхом біосинтезу ДГК, наприклад, наданим конструкцією СА? або її варіантами. Переважними ЛФКАТ є такі, які можуть впливати на поліненасичений С22 жирний ацил-КоА як субстрат, що приводить до збільшення вставки поліненасиченого ланцюга С22 в положенні 5п-2 ЛФК з утворенням ФК, відносно ендогенного ЛФКАТ. Цитоплазматичні ферменти ЛФКАТ часто демонструють варіюючі переваги по відношенню до субстрату, особливо, якщо вид синтезує і акумулює в ТАГ незвичайні жирні кислоти. Продемонстровано, що ЛФКАТ2 з Іітпапіпев5 доцдіаєі може використовувати ерукоїл-КоА (С22:1-КоА) як субстрат для синтезу ФК, на протилежність ЛФКАТІ з того ж виду, яка не може утилізувати субстрат С22 (Вгоуп еїа!., 2002).
Розглядалися відомі ЛФКАТ, і багато з них були вибрані для тестування, зокрема, ті, від яких не очікувалося збільшення інкорпорації ДГК в положенні 5п-2, як контроль. Відомі ЛФКАТ включали: ЛФКАТ2: Агабрідорзів (пайапа (5ЕО ІЮ МО: 63, номер доступу АВО48392, Кіт еї аї., 2005), ЛФКАТ І ітпапіпех аіІра (ЗЕО ІЮО МО: 64, номер доступу ААС49185, І аззпег еї аї., 1995),
Зіс1р Засспаготусев сегемізіае (ЗЕО ІЮ МО: 65, номер доступу МР 010231, 70и еї аї., 1997),
ЛФКАТ 1 МогіієгеПа аїІріпа (ЗЕО ІЮ МО: 67, номер доступу АЕЮОЗ33305; патент США Ме 7879591) і
ЛФКАТ Вгавзвзіса пари (ЗЕО ІЮ МО: 68 і ЗЕО ІО МО: 69, номери доступу АЮОС97479 і АЮС97478, відповідно). Вони були вибрані таким чином, щоб охопити три групи ферментів ЛФКАТ: 1) контрольні рослинні ЛФКАТ насіння, звичайно з низькою активністю по відношенню до незвичайних довголанцюгових поліненасичених жирних кислот (зокрема, ЛФКАТ Агабідорбвів і
Вгазвзіса); 2. ЛФКАТ, які раніше продемонстрували дію на жирні кислоти С22 і використовування
С22 ацил-КоА як субстрат, в цьому випадку, ерукової кислоти С22:1 (зокрема, ЛФКАТ
Ітпапінез і Засснаготусев); 3. ЛФКАТ, які винахідники вважали найбільш ймовірна здатними утилізувати довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти, такі як ЕПК і ДГК, як субстрати (зокрема, ЛФКАТ МопгііегеП Іа).
ЛФКАТ2 Агарідорзіз (також позначена як ЛФАТ2) являє собою локалізований в ендоплазматичному ретикулумі фермент, що продемонстрував активність по відношенню до субстратів С1б і С18, однак активність по відношенню до субстратів С20 або С22 не тестувалася (Кіт еї аї., 2005). ЛФКАТаО І ітпапіпе5х анІра продемонструвала вставку ацильного ланцюга С22:1 в положення 5п-2 ФК, хоча здатність використовувати ДГК як субстрат не тестувалася (Га55пег еї аїЇ., 1995). Вибрана ЛФКАТ 5. сегемізіае 5Іісїр продемонструвала
Зо активність у вигляді використання 22:1-КоА на додаток до 18:1-КоА як субстратів, указуючи на широку специфічність по відношенню до субстратів з урахуванням довжини ланцюга (701 еї аї., 1997). Знову, ДГК-КоОА та інші ДЛ-ПНЖК не тестувалися як субстрати. Раніше було продемонстровано, що ЛФКАТ МопієгеПа має активність по відношенню до жирнокислотних субстратів ЕПК і ДГК в трансгенному Маїтоула Ігроїуїїса (05 7879591).
Додаткові ЛФКАТ були ідентифіковані винахідниками. Місготопах ривзійа являє собою мікроводорость, що продукує та акумулює ДГК в олії, хоча позиційний розподіл ДГК на ТАГ у цьому виді не було підтверджено. ЛФКАТ Місготопах ризйШа (ЗЕО ІЮ МО: 66, номер доступу
ХР 002501997) була ідентифікована шляхом пошуку серед геномних послідовностей
Містотопабз ризійа з використанням ЛФКАТ2 Агабрідорзіз як послідовності запиту ВІАЗ5Т.
З'явилися декілька послідовностей-кандидатів, і послідовність ХР. 002501997 була синтезована для тестування як вірогідний фермент ЛФКАТ з активністю по відношенню до С22 ДЛ-ПНЖК.
ЛФКАТ Кісіпи5 соттипіх була анотована як передбачувана ЛФКАТ в послідовності геному рицини (Спап еї аї., 2010). Чотири кандидати на ЛФКАТ з геному рицини були синтезовані і протестовані на неочищених лізатах листя інфільтрованої тканини листа М. бБепіпатіапа.
Розкрита в цьому документі послідовність-кандидат продемонструвала активність ЛФКАТ.
Ряд кандидатів на ЛФКАТ був вирівняний з відомим ЛФКАТ на філогенетичному дереві (Фіг. 20). Слід зазначити, що передбачувана ЛФКАТ Місготопах не групується з передбачуваними С22 ЛФКАТ, але має дивергуючу послідовність.
Як первинний аналіз різних ЛФКАТ щодо їх здатності використовувати ДГК-КоА як субстрат, одержують химерні генетичні конструкції для конститутивної експресії екзогенних ЛФКАТ в листі
М. Ббепіпатіапа, кожна під контролем промотору 355, як розкрито нижче: 355:хАга(й-ЛФАТ2 (Агабідорзіз ЕК ЛФКАТ); 355:Кіссо-ЛФКАТ2; 355: іта-ЛФКАТ (ЛФКАТ Іітпапіпез аїрБа);
З55:5ассе-5ісїр (ЛФКАТ 5. сегемізіає); З55:Місри-ЛФКАТ (ЛФКАТ Місгтотопавз ризійа); 355:Могаі-ЛФКАТІ (ЛФКАТ МогііегеПа аїріпа). Конструкції 355:р1і9, що не містять екзогенної
ЛФКАТ, використовуються в експерименті як контроль. Кожну із вказаних конструкцій вводять за допомогою Адгорасіегішт в листя М. Ббепіпатіапа, як розкрито у Прикладі 1, і через 5 днів після інфільтрації оброблені зони листя вирізують і подрібнюють для одержання лізату листя. Кожен лізат містить екзогенну ЛФКАТ, а також ендогенні ферменти для синтезу ЛФК. Реакційні суміші одержують іп міїго, окремо додаючи до лізатів мічені 77С ОК, ЛК або АЛК (субстрати С18), АРК бо (субстрат С20) і ДГК (С22), в трьох повтореннях. Реакційні суміші інкубують при 25"7С, і рівень інкорпорації мічених "Сб жирних кислот у ФК визначають за методом ТСХ. Обчислюють здатність кожної ЛФКАТ використовувати ДГК відносно АРК і жирних кислот С18. Знайдено, що
ЛФКАТ пінника лугового, МогііегеМПа і засспаготусев5 володіють активністю по відношенню до субстрату ДГК, причому радіомічена ФК виникає у випадку цих, але не інших ЛФКАТ. Активність всіх ЛФКАТ була підтверджена подібним споживанням олеїнової кислоти.
Для тестування активності ЛФКАТ в насінні, деяку кількість кодуючих білок послідовностей або ЛФКАТ вставляють в бінарний вектор під контролем промотору конлініну (рі иСпі1).
Одержані в результаті генетичні конструкції, що містять химерні гени СпітАгатй-ЛФКАТ (негативний контроль), Спі1: І ітаІ-ЛФКАТ, Сп1:Зассе-5іІсір, і Спії МогаІ-ЛФКАТ, відповідно, далі використовують для трансформації рослин В. париб5 і А. Шйайапа, щоб одержати стабільні трансформанти, які експресують ЛФКАТ в специфічній для насіння формі. Трансформовані рослини, що містять конструкції Спі1-ЛФКАТ, схрещують з рослинами, які експресують конструкцію ЗА або її варіанти (Приклад 5), які продукують ДГК в насінні, щоб досягти збільшення інкорпорації ДГК у положенні 5п-2 ТАГ. Крім того, конструкції використовуються для трансформації рослин В. парив, С. заїїма і А. (паійапа, які вже містять конструкцію БА?7 та її варіанти (Приклади 2-5), з метою одержання потомства, що несе материнські і ЛФКАТ генетичні конструкції. Очікується збільшення інкорпорації ДГК в положенні 51-2 ТАГ відносно інкорпорації в рослинах без кодуючих ЛФКАТ трансгенів. Вміст олії також підвищується в насінні, особливо у випадку насіння, що продукує вищі рівні ДГК, нейтралізуючи тенденцію, спостережувану в насінні Агарідорзіз, як розкрито у Прикладі 2.
Кваліфікованим фахівцям в цій галузі техніки буде зрозуміло, що численні варіації та/або модифікації винаходу можуть бути здійснені, як розкрито в конкретних варіантах, без відходу від духу або контексту винаходу в його широкому значенні. Представлені варіанти, таким чином, слід розглядати в усіх відношеннях як ілюстративні, але не обмежуючі.
У цій заявці заявлений пріоритет по 05 61/660392, поданій 15 червня 2012 року, 5 61/663344, поданій 22 червня 2012 року, 05 61/697676, поданій б вересня 2012 року, і 5 61/782680, поданій 14 березня 2013 року, кожна з яких включена до цього документу шляхом посилання в повному обсязі.
Всі публікації, що обговорювалися, та/або на які присутнє посилання в цьому документі,
Зо включені до цього документу в повному обсязі.
Ця заявка включає до цього документу шляхом посилання 5 61/660392, подану 15 червня 2012 року, 5 61/663344, подану 22 червня 2012 року, 05 61/697676, подану 6 вересня 2012 року.
Будь-яке обговорення документів, дій, матеріалів, пристроїв, виробів, тощо, яке включено до цього документу, призначене виключно для цілей забезпечення контексту цього винаходу. Не слід робити припущення, що будь-які або всі ці питання утворюють частину відомого рівня техніки або являли собою загальнодоступне знання в галузі техніки, до якої відноситься це винахід, в тому вигляді, в якому воно існувало до дати пріоритету кожного з пунктів формули цієї заявки.
Джерела інформації:
Арбасді еї а!. (2004) Ріапі Сеї! 16: 2734-2748.
АРррбої! вї а!. (1998) бсієпсе 282:2012-2018.
Арашпан еї а!. (1986) Віоїтесн. 41087.
Адаба еї а!. (2004) Магіпе Віоїесппої. (МУ) 6:251-261.
АЇмаге? єї а!. (2000) Тнеог Аррі Сепеї 100:319-327.
Агтьгиві єї а!. (2004) Зсієпсе 306:79-86.
Аціа Кегебз71і єї а!. (2007) Маштгте Ргоїосої5 2:948 - 952.
Ваштрегоег" єї аї. (2007) Ситт. Віої. 17:1609-1614.
Вайтівіп єї аї. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 225:459-467.
Вайтівіп еї а. (1992) Ріапі у). 2:233-239.
Веацаоіп еї а!. (2000) Ргос. Маї!. Асад. бсі. 0О.5.А. 97:6421-6426.
Весіїйп евї аї. (2002) Сит. Віо!. 12:684-688.
Вегбетгісн. єї аї. (1998) Ріапі Мої. Вісої. 36:297-306.
Вопоїатіо! еї аї. (2007) Ситт. Віої. 17:1615-1621.
Вгошп єї а. (1998) Ріапі У). 13:201-210.
Вгомлп еї аї. (2002) Віоспет .). 364:795-805.
СНнартаг еї а!. (2004) Сеп. Оєм. 18:1179-1186.
СнНеп еї а!. (2004) Тне Ріапі Сеї! 16:1302-1313.
Снепа еї аї. (1996) Ріапі Сеї! Вер. 15:653-657. 60 Снепа єї аї. (2010) Тгапздепіс Вез 19: 221-229.
Спікматьа е! а!. (2003) Ргос. Маї). Асад. зсі. 0О.5.А. 100:11127-11132.
Спо еї а. (1999а) . Вісі. Спет. 274:471-477.
Сно еї а!. (199960) У. Віої. Снет. 274:37335-37339.
Сіоцди апа Вепі (1998) Ріапі .). 16:735-43.
Соши єї аї. (2007) Тгапздепіс Вев. 16: 771-781.
Ратиае єї аї. (2006). Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 103: 9446-9451.
Оепіс апа М/віззтап (2007) Сеї! 130:663-677. ротегаше еї а! (2002) Єиг. у. Віоспет. 269:4105-4113. ротегаше еї а!. (2002) Єиг. У. Віоспет. 269:4105-4113.
Ботегане евї а!. (2003) У. Віої. Снет. 278: 35115-35126.
Ботегаце евї а!. (2005) Віоспет. .). 1 389: 483-490.
Рипоуеєг еї а. (2004) Те Ріапі Сеї! 16:11235-1250.
ЕПегвіготє еї аї. (1996) Ріапі Мо!. Вісої. 32:1019-1027.
Ецітига еї а!. (1985) Ріапі Тізвиє Сийиге І ей. 2:74.
ЕиКипада (2009) ЕМВО 3. 28:545-55.
Сате? єї а!. (2003) Роса Вез Іпіегпайопаї! 36: 721-727.
Сагсіа-Магоїй еї а. (2002) Ііріав 37:417-426.
СіїКе еї а!. (1998) Ріапі 9. 15:39-48.
СІсК єї а. (2008) Ргос. Маї!. Асад. сі 0О.5.А. 105-157-161.
Стапі єї а!. (1995) Ріапі Сеї! Вер. 15:254-258.
Наї є! а. (1991) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 88:9320-9324
Натіюп апа Вацйісотрбе (1999) бсієпсе 286:950-952.
Натійгп еї а!. (1997) Сепе 200:107-16.
Нагауата (1998). Тгтепаз ВіоїтесНпо!. 16: 76-82.
Назвіїпоз вї а!. (2001) Ргос. Майї. Асад. 5сі. 0О.5.А. 98:14304-14309.
Ніпснеєе еї а!. (1988) ВіотесппоІоду 6:915-922.
Нойтанпт еї а. (2008) У Віої. Спет. 283:22352-22362.
Нопа ев! а!. (200г2а) Ііріаз 37:863-868.
Ногідисні еї а!. (1998) Ріапі Сеї! Рнузіої. 39:540-544.
Зо Ногуаїн в! а!. (2000) Ргос. Маї). Асад. 5сі. 0.5.А. 97:1914-1919.
Ниапоа єї а. (1999) І іріа5 34:649-659.
Іпадакі еї а. (2002) Віовсі. Віоїтесппої. Віоспет. 66:613-621.
Удонапзеп апа Саттіпоаїюп (2001) Ріапі Рнпузіої. 126-930-938.
Ка|Кама еї а!. (2004) Ріапі Мої. Віої. 54:335-52.
Каїїкама єї а!. (2006) РЕВ5 І ен 580:149-154.
Кіт еї а. (2005) Ріапі СеїІ. 2005 1073-89.
Кпиїгоп вї а!. (1998) 9. Віої Спет. 273:29360-6.
Ко?лівї еї а. (1996) Ріапі Мої. Віої. 32:393-405.
Ї аззпег (1995) Ріапі Рпузіої. 109:1389-94.
Ї еопага еїа!. (2000) Віоспет. 9. 347:719-724.
Ї еопага еї аї. (20005) Віоспет. 9. 350:765-770.
Ї еопага еїа!. (2002) І іріа5 37:733-740.
Ї емувеу єї аї. (2007) Ріапі 9. 50:240-252.
І о єї а. (2003) Сепоте Везв. 13:455-466.
Ги апа Кап (2008) Ріапі Сеї! Нер. 27:273-8.
Маїогу еї а!. (2002) Маї. Віотесн. 20:622-625.
Магаподопі єї а!. (1995) Тгепавз іп Роса 5сі. Теснпої!. 6: 329-335.
Меезаруоа3зик еї аї. (2007) У Віої Снет 282: 20191-20199.
Мепоа вї а!. (2008) 9. Сіеп. Міго!. 89:2349-2358.
Меуєг єї а!. (2003) Віоспет. 42:9779-9788.
Меуег еї а). (2004) І іріа Вез 45:1899-1909.
Міснає!зоп вї а. (1998а) 9. ВіоЇ. Спет. 273:19055-19059.
Міснає!зоп вї аї. (199860) ЕРЕВЗ І еїї. 439:215-218.
Митгазніде апа 5Косяд (1962) Рпузіоіодіа Ріапіагит 15:473-497.
Марієг еї а. (1998) Віоспет. 9. 330:611-614.
Меєаієтап апа УУипвсй (1970) 9. Мої. Віої. 48:443-453.
Мієд2 єї а. (1995) Ріапі Сеї! ВБерогів 14:403.
Ом еєїа!. (1986) Зсієпсе 234:856-859.
Раке!-Ваттез еї аї. (2000) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 97:8284-8289. 60 Регеїга єї а. (2004а) Віоспет. У). 378:665-671.
Регеїга єї а!. (20045) Віоспет. 9. 384:357-366.
Реттіп еї аї. (2000) Мої! Вгеєа 6:345-352.
Реїтгіє еї а. (2010а) Меїар. Епод. 12:233-240.
Реїтгіє еї а. (20100) Ріапі Меїносдвз 11:6:8.
Реїніє еї а!. (2012) Ттапздепіс Нев. 21:139-147.
Роїепла еї а. (2004) Іп Міїто Сеї! Оєм Віо! - Ріапі 40:1-22.
Ргазнег еї а! (1985) Віоспет. Віорпуз. Не5. Соттип. 127:31-36.
ОЇ еї а. (2002) РЕВЗ І ейї. 510:159-165.
ОЇ еї а. (2004) Маї. Віоїесн. 22: 739-745.
Ом еї а!. (2001) 9. Віої. Снет. 276:31561-31566.
Ведау апа Тротазх (1996) Маї. Віоїесі. 14:639-642.
Ведау еї а. (1993) Ріапі Мої. Вісі. 22:293-300.
Вобет еї аї. (2005) Рипс. Ріапі Вісі. 32:473-479.
Вобет! еї а!. (2009) Магіпе Віоїесй 11:410-418.
Виї2-І оре? вії а!. (2012) Ттапздепіс Нев. 21:139-147. зага еї аї. (2006) Ріапі Рпузіо!. 141:1533-1543. зЗаїю єї а. (2000) Єик. У. Віоспет. 267:1813-1818. зЗакигтадапі єї а. (1999) Сепе 238:445-453. зай єї а!. (2004) Стор 5сі. 44: 646-652. закКигадапі еї а. (2005) Аррі. Місгобіої. Віотесппої. 66:648-654.
Зауапома єї а!. (2006) У Віої Снет 281: 36533-36541.
Зауапома єї а!. (1997) Ргос. Майї). Асад. 5сі. 0О.5.А. 94:4211-4216.
Зауапома єї а. (2003) РЕВ5 І ейї. 542:100-104.
Зауапома єї а!. (2006) Ріапіа 224:1269-1277.
Зауапома вї а!. (2007) Ріапі Рнузіо! 144:455-467. зіпой еїаї. (2005) Сит. Оріп. іп Ріапі Віої!. 8:197-203. зЗрегапла еї а!. (2012) Ргосев5 Віоспетівігу (Іп Ргев5). зЗретпінпа єї аї. (2000) Єиг. 9. Віоснет. 267:3801-3811. зЗренпіпа еї аї. (2001) Агсй. Віоспт. Віорпувз. 388:293-8. зЗргеснег єї а!. (1995) 9. Гіріа Вев. 36:2471-2477. зруспаїа єї аї. (1997) Ргос. Маї)!. Асад. 5сі. 0.5.А. 94:1142-1147. «аїКег єї а!. (1998) У. Віої. Снет. 263:6310-6314.
Тпйеї еї а. (1988) 9. Віої. Спет 263:12500-12508.
Топоп єї а. (2003) РЕВЗ5 І еїї. 553:440-444.
Топуата еї а!. (1986) Тнеог. Аррі. Сепеї. 205:34.
Ткгашймувїп (2001) Еигореап .. І іріа 5сі. апа Тесн. 103:45-55.
Тмгаїк (2000) 9. Сеї! Віо!. 149:707-718.
Мепедаз-Саїегоп еї а!. (2010) Ргсоад. І ірід Бевз. 49:108-119.
Моіппеї еї а. (2003) Ріапі У. 33:949-956. маїїв апа Вгомухе (1999) Агсп. Віоспет. Віорпу5. 365:307-316.
Манз апа Вгом/зе (19996) Агсп. Віоспет. Віорпувз. 362:175-182.
Меїв5 еї а. (2003) Іпі. У. Меа. Місгобіо!. 293:95:106.
М/піїпеу сеї а. (2003) Ріапіа 217:983-992.
М/іпапз (1988) 9. Васіеєгіо!. 170:4047-54. моса (2009) Ріапі Віоїтеснпої у. 7:914-24.
Ми еї а. (2005) Маї. Віоїеєсй. 23:1013-1017.
Уапа еї а. (2003) Ріапіа 216:597-603. 2гапк еї аї. (2002) Ріапі 9. 31:255-268. -7апк еїаї. (2005) УО 2005/012316 7Ппапяд єї а. (2004) РЕВЗ5 І еїї. 556:81-85. «папа еїаї. (2006) 20:3255-3268. папа еїгаї. (2007а) РЕВЗ І ецеїв 581: 315-319. «папа еї а. (2008) Уеаві 25: 21-27. 2пои еї а. (2007) Рпуюспет. 68:785-796. 2пои еї а. (2008) Інзесі Мої Віо! 17: 667-676. 7ои еї а. (1997) Ріапі СеїІ. 9:909-23.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 МивееЯ РЕУ ГЕЙ
Стаіїіп Резеаксп апй РеуеіоршепеЕ Согрогавіоп Сошпопмеа1і ЄП 5сіеєпсітїіс апа
ІпацйвЕегіа1! Бевеасксіп Огдапівзаєсіоп «1205 ПРОДУКУВАННЯ ДОВГОЛАНЦЮГОВИХ ПОЛІНЕНАСИЧЕНИХ ЖИРНИХ КИСЛОТ У
РОСЛИННИХ КЛІТИНАХ
«130» 513594 «1505 75 61/660,392 «151» 2012-06-15 «1505 75 61/663,344 «151» 2012-06-22 «1505 75 61/697,676 «151» 2012-09-06 «1505 75 61/782,680 «151» 2013-03-14 «1605 72 «170» Рабепсіп версія 3.5 «2105 1 «2115» 21527 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» рЗ3РЗ416-СА7 нуклеотидна послідовність. «4005 1
ТсКТВТевК несасвсаса Сясвзавасвва сезасивата авестТтсяа свсессста ца заїатссватх саіїссвата васвстстет тстсттавех ттасссвєса ататаєссте 158 їсавасаєтв зсвастїваз ссвавивске дазасвасаз сствставтв ваїстессав їва тсаснасвіс візазасвер свссссВсве завис сесв вссвессваї ствисзасях гав зваївасисс всвсвсвета апїїатсста віїтТвсвсве Татасссттв: ТКІсСкатсвс зва яїаїївзаїв саїзастврсе веастствваї саїааавасс свісссятав зтаазвскксах 36 всаїтТасвтк Єбаатїтїтаїїз сетрдсттаас втавтксавс заззаїттата сизсаваксаї а: свсзвазвассв всазсаввах їсаасстєвна вазастєтає твсслаВкЕК хтравсвасс за вЕсВсвссТс ассзиствавс сттстсавсс стрес таз сесзетався севтсссасс то пІзєсвевеї тававававу вессттссвла резссвтарт ааракавсво сссвсавсе 5 звїссссасї Ссстїавсваа аддивснааї стбствссаа ссссавЕств Тстразаїссва 600 кЕКатаїсле визавакети неви свасс Твасавссва небвссссає занссадете 788 асвтвіссїс їарааввахс кзізісвасе всвіваїсав сзвсніавсє засссзавав Уа аввсвсстаї саваєвиаас засавевави сезвїаїтвав завхававаз вбраасвааа ваз зЕкізсясвї заксивтсса вкссссваза вірвассвсс арсаансває авроссаавав зво стесссавтав саввсттваї авсавсЕЕуХу ствасавсах какавасвар сакссаавназ зва вестісттсвтї автістестї асеваваасї свіствВеееї врЕзваВсета ватссанааа 1820 воссїрвасна даванїіссвва ввізасавва зсеклавштсє завсетвайв сставсссва 1088 веїстзвава аїссуствев ссівЕТатссс бсазсавсве ХеЕстваввай ввссавсвиса 148 ввав'ввіаї саавеатсєсак аїсвсврїств ВКсЄткттрав вЕвтавсатв ВЕВСТТИСа зав
ТЕсаєсєтввї сссясажсЄс вссавзавія рававтссва асссвсвавї сатавсства 1268 авістсстах ссасвталас звикссвета авававстат вїссвсестс атвіїтнавасс 1328 сакссвсатк старстссказ вааавсесся їТазасвасав завсватрає зврихакеса їз88 всвїзсаіав вавсзвіїсс зававскааХ «савсадвая вссбсвававе ЄсСсВКЗаВе 1440 асистента сараавессї вазнзаксса сстсхстсза всессавсаск ссасставсВ ї5ав зазвгсстсва вксатавшлвс зїсстсзрас їсаваїстсї сраксісзис ареустзвав ї156а знсвавнстх Єаввсакссї сслявссски арадазсиса СвсввааКкс страва 1528 «сввсвксях савсасслвс нссаясаввс асесаразвв сСсасвкассс аскарялятнс 1658 піддані тав тсасассвта стсапасвтсс їсвастстав сссатстанї стсрвавита 1748 шсарсзавсї саївзинссс закавтсїсв адассзасак нассантана висаєссїта їв всзссзавар сстсзасава зрасссвзкас стврсзавсе навасстаре знаавквессх 18658 ссассавісс саввроавревяса саснвіаїве Єзасївіваай Свсзасктвта «свв їЕ 1528
ЕЕ ЕсЕ СтреитвВтаз СВК Техаааз вваїссксвЄ саке засос евКЕ ї1955а втассдатва всжссвеККї вавіаазкав сСрадвсввас вата зіавевстата 2540 завкавастЕ всаїрасраї сасрткїааї ааїрсаївсв сесатктваї сабясесеТЕ «іва
Свт в'івавя даназвсїсї СлевсВсс те завввавтва саарсивсиз зеаададсай 2168 їткЕтссвсвеВ стесасеста СвївбвасвХ вївроетаати ЖТстдЕсасв всвтсетаєв за засвяссксЕ гТсслааяянса зинізавадс сСсвасєттсає зазаїтаааа звазавасвї ака
Тасгларії Вест завав вреаївакас тартавнаттк всткеїїввЕ ссссатеїас 348 савазаявстї асссжастав Єсвразевссв ааассссвКх ссссасссав Тісставессв за ївіваатсвта Твіасасвсв асвївтасла засвїавсаєсє стазаасваєх зввавївесї т4ва сттвадяссе аївавравасе внарсававс Сазакатває касаїааєса звазсевакх 2528 сназазввстс сСсавЕЇства ассссзсксв адаасВиї Сессаазкаї аЕсвЕсвакх а5Е8 стдвассваа шйаавсвіїх зазазассак хатссриїта сЕтссатвса захвизадеє 25468 кВЕсідвнах стваїсетаа ссжтвнаст: вавизвикстс ссзазивктса ассстввстВ тав сЕтасєвазаєс бїасазаїавї аа Естава стажЕссввсє ЄТвассаває їтссвстсах з760 їзїстяства ввссававаз бакастєвсв засазасасв Сссссваваа зкастсатва 282 тсссатвасєс вессававев Саскссзатє адасстзана асасвсвттс сссвавЕтх зва ївасвсвозі всавїсвізи ЄбСтТарсвсва бісзазавіз зівівріаїї зазпасанав зчай асссвсввас ТЕССССЄТнВ сеітвавава зкастаавсх Сзіасвсаса Тая заве здіврааваєс сезааКЇКсс саїсназаса Сесразіїїа нтататаясаї СЕсСіксваїв зав
Хзеїатессв сстаксстввс азасестсавї ввастастас сЄссвстаєва сеЕсесаєвва Зх твсасевВКї твавбаясаса сатвіссава СвсаівстЄ всзадасвїз зсикавоссаса зіка зааранкакс сасвсзаата сатестсткаїтвн стссстссат саксссссва сасааасава за ксвссттасв всзастасса зсавсаасаа асзасваяся зсаїїасваї ївсвксївса 1386 яксвссатає сасввавтсс всссавссіс СТВСсвстВї дестсазван сзатасесте заве сівтїсвасис ВСЕ сВсЄ сежтвссатех схстресає сваїтсссаєс скати ас 3428 схвавсстаЄ стсТКсТВсЄ зстаавваєт свостсттвї Єравтссссї асасстстса зав
ТЕСССССКК вЕСТВССТВс ЕСсрЕстатсв Стрвасскни всссиїїтас арававиєсу 3540 їссстарвас сдсвнавава саараєссає Тесісбсваа васссксатв сттдсїсаса з5Бав
ВККС Хаїтсввасєє секекттаса сСвївссбссав встсрсясає кавистсася 366а івасзався стсїїтствЕ кавасистє асазссстве Ссзвасткав зівяссавве 373а
ТЕВЄствваї стсстаєрін звсаянатєст асвявсксаї вдасассттс зсасвстсс Уа тсваввжнайа свкїаассяв вставстссс Стсасвсста ссвісасниа состав 384 вайтстевів ватватсвеї їасвссвссс стірвтветва света ссс жїствосквсе зва їтвастсттк ввВїтсасвів ТвТатбвтаса сстастакєту сатрествсс вбвсттсств ззева аенаснавня засїтаазвека заятассєсє сеїввввавеЕ атассєтаєт савасвсариа чада чвЕтксЗвЕї сстсзтввас стсстссаве ствтттвсст Тстежаскс їсвтсКе зане зсссіварїї сзбсвсссав стесстсесве їрбасасввї бастсттстс ав св да ваававстЕста стасатизав сассасвста всаавікаїтв авесвсвссв срссвксрос го асртваєвиз їсвазввази зааебсетавї завасевєтє ссассаєстсе авссвстаеке З асттвссатсв Сіасасеасаз савабвісаєє сСКСтсасаасх Сбаїсвсзеси сасвівавас 45328
Теїзавсвсаї сСвзассстїзсї ТвІсатасва Сласвсїсєтс сссассутаза астсттисса їз8а віїїазаваї асваавраттстї сїзвасваїї зазавазаєа бабсасаваї ссвассвссс 4за4о сІвстзасаа атіаєтавсЄ вата Єс ваїїаваалая втасстасає саасстввс 4358 твазтаваає застава сс савбстсакс ссстсстаза ссвассставї азасвссу азБа
ЕТ Ставсе Сстабразвїї заксссстас сесії з зазаадазісв стсабварає з65а вссасвссак васаставст зсасвіїїТася сабввсатєвс вессвсввав затв асо сттквссасї євссастесес ттсаавсеаєс їааваВекКс Тсбстсзсав сасасасясе 4740 сваїсзсзсв сетвсасвсв Стастасасд сватсвссає шкаваїсстсс сСстасвнссї зво згаваєтавс тсатїксрвсїї састстсЄтає їсадассаза всссассязї асазасваня зва
Стїязазасиу зсавсваввяї СТ їївсвас вабїавссвас засаасавас засвавсаас 8958 зіївсааста світ сясвзаї тассатаска Твсссссазо нвастсстає тсстасесте «ча
КХестсстЄс ЖтЕСТсВасЄХ свсваавтєв зсаєтсстся звавсасвас завазававе за4а ствссассвв звасавввсї Сасвасвіїз ссавсттсВЇ Свавравзсзс сстресррав 513а зваїсаствс ссассавзвії кизастватв стассватвсо тбасзавсав Ттссасвств вібБа ваїстнстаз ввссдасзан атесксвивс стсЕсссСКс ТевВсссиХХ сасазедвах БІВ звсїстссвав завввсєтвакє сетатсвств акттссвада вуссассаарв сазстсваЕВ зав ссвавеиваас Всссвавссс кссстссїс асист ЕсТсз савасттвст данЕсїатсв 358 стаєвсатнї ТЕссввсВсу ветсттаскс весвсввата свсссссКесї веваєсвсся Беца
Твстєвваяї ТВстсаввна адзтвтввас пясітаєвся сваввЕсвва саїтсастсте 5488 хост ввадо сЯКТвсКТтс дасававств Кссаавітво срссасвря ства 5528 навсвістїви івсссявІнвВ свізассавк азіавсдавса ссвсвссасх сстсавааес За їТссвесасра ЕКС васвосстс стві свс жссссасвав адазсесвсте зааВ ствариїїав вбстсствсї згвавевсТї вк стїсхах всаядстави СТЕССсвссс БУВ стві вссас КСТССЄТВТЕ встсттвват весаксїста ссгсасесЄ зизсасасис пев тсзввастав всзсівсваї взвстсвста бисїсвеааї саватасвна сітгессеваї БЕУе весЕтвствс таастясввї вствиЕатасе сТстсвсТкВ сСТасстстї сСасрітсаде Уняй тїдкавстат втасатстес сСреавстсск стиЕттстсв свстсасссс сссВеТИВ 5348 звсстзасва псаївсєвВсх сВрЕЕСКвадЄ асестрствав ссасаствсї заст ота сатеїтвнтв нсвїваеїтни сдЕЗїВЕсКЕ вссктвааста ссазватсввв сасесевесскЕх оваеВ асссКЕссаї всстсзакус знасассста арассвсссс їадавітанй савсссстся біхе звазнсасвв акїїсастає вабвссавов ваїассссвз вретаєвесєї насастттсв іа стзассстїва їзасдікнесс сабвсбссся зкаараввях всазвсавівз ваїсвіїсза БІяа всвіствисз агааавссЕс сіалнатїва всссвуТес сввїсссвсв абрактатся вза засвастісї вссвваєсас віїзавсвся Сзаїзеєтваа свівіаацес аєвасвітах зей
СЖасваватв виска зсбаезвекКсс сасвасїзка савессвасзс всезеаваяа ваза зсаззаєаїа всрсвсвяазс тзйвраїааяї їаєсревсЕс вЕТВсаїсє асрієвстад БАК зісвихсваї сзаавйаєксс застаїтаєєх веєстааєех авсссветає свравсаазваєс 5 адасісваз: садассаада таїазатаїта Свріїжстаї асбаїтасвккї ТЄзарасте авав
Ттзсзвваїї Тїстсїлаза заївісїава заїахїївсв астстіствЕ сакртзатах воБа
ТЕсястзаве атвавитнеї севіїїтстаї гластттаза баажтнвВтЇїИ свсваїсвсї етев стевії саа втвстастаа засисвісвя ТЄТСЕССвУХ сттссатати сатасвєкав Б'на заїстатсза аасхЄтеавєа сассжМттс взасттрази сезавістсв абааїїтааа 6Б5Ао зстазасака всаСатскаск асставвсаех сатаєсваєс ССсасасста всбастанах вва тент свасу їївззавсвї асзісвзвсва заввіїаріс аваснастаа захвдасааа БО бассеївтв саставраава ЗЄЕКТсстВЕ авраататст сватанаєсв татів тах зазаааясса аїжсссвста зсасаєатах ссвсссасса вавесїсвас ааветазеах тва
Єзазасваса ттстассїлас ззаазазава ссававааєе сстраааассс ввЕсаваассе АВ звасксваїсса авссраїзтв віск Сїбраїтсв асаїззассв зассавастсв 7-08 віссвіїтрс зсссстваєс зтвзтавссЕ базївіїїса зевтассасї завссаасеє ме свссавтасс ссвкааактє сврсезааїна ассазвсста баксресівси зсасвавктї 328 зазавсирвсї свасесвесв всаасаєЄвсОв звіїбасстсва їжссваззав абабсссвав 7388 сатутватавт тТтсствсставряи задзадеїтта встзеваєсї всзвсаяванс сакавтасав 448 авазассаїаа арінасїнва вссскааваїа бвсраавкая свааївсссї сазаззваазтв тзва свсзаєЄвасх Срвавсазаз ваававксваса стае твї їсссазасва всассссске 55 таввиватрвни савїїїТссЄ ствсатвсва стакттатистх сссттсеєта сазаваєєсе та вазстастає сввезастсс ссствазаат звсваїтавав сссасасвай сасвтрох 26556 скаіїсазв(ії їїаваазссв звавасаєавс засаїавсз їТссаїсвве сс т74аа
ТтттваЕтясв віїавтїдасЕ сазавсасаї сттіаєбасєс сассссїває асставсввє 7808 вІссстатас ваїтсїсаїсв ассзсассї севззассаєв санаствств ссвсссстеВ 786 зпвстквсатс вЕссзвЕсти ветвссвсає Твтсссвраа вВЕссставс вастсреста Уа касїваесвии весасстстс авссссствс ребрі ссст воротах Вест Т98а зтстивссва ствсасвстс савтссеств сасвКвсасє свккестсав ССнстсзава кал тсатсвсяие звстатсива яквстввстс Трітвссстс стссвсвнсс ТСвВсЄвсав піва
Хавхавствс сиссвБссссЄ седЕВеК ссссасаряв вссйсесвавї заттсватав 158 вассасесна всатисвекХ ссасссат сбазавассва вавасатвсв Саасатетса 228
Ксзвсстссє ее ес сссвстете Тесс стека вна ттасанствт сзсастаасу саавасясат тсасстсатє встастяста стасссаск 8340 їХазвсвсств всаВсВІсїї Євсевсваїст сасавесвах сасссккктса ссварвТатсс вава їїввЕсТїсВ ссссаасвсЄ різвсавуса сввзасаїве зсасвссясєс зтввЕСссса вава зесдзаствЕс азватстсса звжїсКїссвз зреЕстаассс зсвевссстс аїсветеКЕх 8520 сївтаисвсх стсссвівас Ссссствкасв сзсссввуве стсстставс атветаваах во вЕдаїссітїе завсніввїв зснЕарсвса срадістїсва їваїяссвів даавасваї 45 седавкнаїїс севастсісї вксоватазиїа всзрсавсвс сссбзасвваа авбесвссоє вав гЕврсвісвї автдаввсаї визаваатсв вт ссвва вкавввсвас вааввсазве Ус хавїдЕссвав сазардлатссв зедасаквас саївїваєка завбвивсса взабессвайх З5Хи вссстнтвав севіКЕяаає зназвтеаиВ Ктзисаавва стссвадаєс зваазкааси ява аівізссарї зеЕїсстїсїЄ зссвзаваса явестзваан вссвисявів авасссввав зав застїзвазаа сассаввита авЕствіссв ктзвсвитан ївисававита зврадвавех зава сстссвадсї вдЕтвязасза каварсваза асаизисврз сват Є стсадснаєа зава
Тсехсразвис треїзастсе яїесЕсстЕї ссряВісссї сеясеВтнса анказсдала зі1і2а зссатясстс срвтїсаївтк єссарїавсс статвЕтЕсї їзвсастрава важке тссак зіва ствазвізав ваассаслає закавайсве звЕаасссаїс сазсвнтасс шОїїаасссвх за сксвсавїїав авазаесава зжвсссвсас ссатвїссвза ввасЄскаваїт тссизаксссв зіва звасвавава такавласає діаавсаває садрдсвисва асстааввяа сСТсвІСавВвиЕ з3в8 зразкавера їнтавесвай їссзасвіза всвасавсав акаївессас рабатсістс 428 вгсаситбазве зсабввассх саскававаї сссссвіаас зетвсссавЕ ваїавсВесса зана андястаїссЕ Єракрвтнта асстхрисасс стразваасеї сСтссиварнї зісвасвися азавй
ВЕСТ ТесЕ всстваавва Хвсзасвуху ссаваасвос їваасевтсте авсздвієсс зева їтсававвассї саваЕссвра сзсврівасє СтТарасаївв сатввїааєї ртазасесви ЗБ
Ттрсвасвкє вста СЕС сВЄс яеізаєсикх ктаваазтї сЄвЕсСрескаї з7за
ТЕВТТСТтста знов свива віКаВЕСЕТи зве ТЕВ сВеВІТТВВЕ даратксенкй чУна
ВЕЕВСЕБЕ Хатаксавтвв звзсівавва зсЕввЕссЕх вавсвссаає ССсВсасЕвЕ з84а сівсасвівк ВЕСССССТвЕвВ всссСасаскеї аисавосакссс аївсавасвс зкссвасаса зо такасввтят їїїваєнати Теїврвааїа сзяхатрссв веЕтаїтстасє СваттссЕве зав засвасазвї всвсасїтве зсаїстсас Єсевсссссє Кбвссосваї ссвврассатї мага
ТТІвВЕЕсСссЄ сассєсидсс вІТсасакс асасссстла вднсзаваса взасттвааєе 1995 нЕднссвааа ассзазасна свщдататсвас ссазсатавсв Тарвассват савсесскаа 1348 нвзавасасу ваїКсссссаз зесасасева садвцитааа Єзасатавсс ассававсяє їхав засвавсвав завтїрсаваа всварастая аазвазттввс Таїдравнсатт сарксссаа 13266 ттївваваасят свкїассств віссбвтваНсє сажссстес сссвостставд сСтвававесс 105520
Гівввассза сезнавкиїса весвиваїтав сзвассстта Сссбзвасса всссскскнЕ 1355 сахухсавав їсте свтвсс вссвістаса ссбвістссв ставвїстра зваснасссї 18448 сжасассвзас васвоссзав ясстстассс састсстанс сСОвезатасс свесстесва 3585 їасствйвис авїсдівсяся асевіїтнивї астрівнаки арезихнІтх дествасссав 1а558 якстсссЕВс СНЕНіваКіс вассссвакх тсавсссаве ствестинав КТ саВКЕ 18628 месаствївнз засссссвва ксстівавссЄ ссттссасву сбазтвестсв ассдавкаєх 196588 сстававаза авркнавессв аксїіствакї зісвазаїтск завтксасатї ес ссква 18746 свінїссаає сазаєссзсва асзалисава зкасеавЕстаа їсттжсасас статасівас завво задіаатвиї сібассвссв бСвсвівасваа свісксвїсс ссссваравв висока 1685 саїссастває васссвадис стсаїназав сасївивеза даасскствв СЕС СССЕХ 128 сесСрессТсї злсвввсесса вссравстсв сезатксссв Сссраствис Сссвсвазах їа95о зіїскласке саарвіїасври асттвсоавсє зсзастссає вртастваде апрасствх цеда віваврастє зістсястврра всїїсвазає всрехтнісая всвавссваї вассвваавсе МВВ сохсвсаєра свБасвІсса шТЕнЕсдавс вазасдаває анвазисясс баїсС св 111658 вЕтїснтранс кссзвсассро аіїссввсва ссасвівствВ весаввстїс десвтаскав 11258 авататїтвссв зквсСавассс асствувсса стсвсасває Тасвававсо вс 112858
ТЕВІТттсст автЄсстсвї ТваТвесвак стсзтВіжєстї звсвтсвтатТе втстсєсавс МАВ
Вс ссс весаєсхувас зксссвосяЄ сСсясаїссас Всневссвос бсессвсвеска м14ваа авсссставв свтсатвсавс вссаавттве сВесЕвТВсв ввссвссстВ вс ас 114658
СВЯСЕЕЕТЕЕ ЗБИССЕОеНК СВБКВЕССТЄ свсБЕСЕИСИ БТавтвВЕЕТЄ БОСВЕССТЕЕ 31559
ТВТЕВВСтва севсаєтває саасттасту стквсстсвяа ас сївес звззавсавї 11588
Ссастїздасу вдазссвнза вссвнавікв сваваснкає Свавїсвваї гссзасадає 116548
ТЕвсастсксЕ сзадазаксаа сртадссссх ставастсЄса аїасссвса асівавлава 117085
Таасствасї ТЕтарасттЕ зсзсатавтє ставтваста звесїтвасса стстаттаїтхї 11768 їаїаєсвзав сіасбСтвсаЄ шКестсссстс сазатааасс свЕсайївсв сСссбасвеаас ї1828 стзвіааїсая збзакєсзата сЕсваєстваз всїсвівсав їїваєтезав враїтвасев т188о ссвазаївсвз стайдтаттаї сазвссвавата вастсвсасї авабсдвссаї тїссассває 11945 зісассвссв КТС ККоЄ всссвсактаї сссссстваз встснанава сасстрсясе 12880 тевтєвТскї Тастасесет свсвазаства засссатствсв їссатсвсаза стравкавте 128589 вкисзавайс ссотккссстс сассесссаК ківвсваска тссаїтсссас сестессе їх128 їасававсвс ссссятсасс ссвссіввва сатесвтсвсї асттрвстовк севтссазав 12385 вабвсссаєї їїїасаасва ссзссзаєва савсзазсав савасзаєсає сасавттася ї22Ав їТісвсзасса ссвіассаєвВ ссвссканси ссВссварса зазівававсї їстассввев 12300
Сссвівствв сНссасіває Тесс їсассввнай нваївссвсЄ кабзвасств ї2358 зжстїсвссає свїтреаваї Хот жстасе зкестваввс Сттсвваксє варсатсєств 15458 яІвЕЕвстса КІТсесЕСсс ссестсввав ваавзкаїтвс їастввевст Тісатбреаах 12488 ассовізнаве ввсссввссї завістанаа свтствнатс ссасвіїнна сс 12548 сіаствадва асссествсї всбрасваве ватасстссв зсгТТвТвсЄ арраїсвста 12682 звасвЕївсс ТЕСТ сствваїттсв сссствсктс стаствветт ааррстввас 128588 гтТатссссви зїствстасс вессстсваки ссбасаєвсх Сасесївва звианастте 12728 жест стаї свсссстнва ТаВсСТССссв стсттатсве СсСЄєЄавсаєс сарсатсваїе 12788 стзассасре свстеевКс ЗавксТвВссЕ ствсзассх сроссствва стттрісаве 12848 зіїнвассви звевасстатств аїсстїтвнс гссзаранса СЕСсвВстатв сасеасстсс їі2588 зсастласва Ес їватаая вебсстватс зававрестсв сКВсВсКсКЄ зврастсаане 3129850 стасідитЕс сбвессасст зітЕсЗітввс сссавсатсє ссаЄст св состава ї3028 ствівтасво тстсазввссї їївсссстсв всасстстна всттвеївтн гЕвсеСтивЕ 1388 анБЕСЯЗВсс тассіскаав сЕсвссвкає ассессссак сс ссгстславс 3148
Сіасссїссв вЕсставасієс вусвстКсрс сте асс снессстсЄ встсвізеКе ї13388 сІівІдсЕТат свствдстаст ЕСсСаїваств васстітста сесевскс тест 1388 тстїсссасва сстсваввві вЕЕсесТТссВ СТревсстіна Тррасствкс зсіїстакра 13350 стадорвівс савстссТї зодавасзає стваваєтес тсставсво вваввасстс 13388
ТЕсттЕстас гсСссвасввї квастсваст зссазваєтна везтсаесся стТссстакаВ ї344а
Кісассаясвв аїїствсссї араєїтвстс ссссквттаз рествавстє вадестарад 135595 взаксвивсв сеарсастяс сссастаксе вЕсставсст сЕсстстасс сссзватата 135358
СвтВсВсЕсХ ївезанзаре сссСадасста прЕссвавса аскасависї басвївасех 1302 кзаваїааїза сввіаавата їзвсКізаїна Свабзаснах ввавссясвя здсравизаїе їзБЯВ авявЕзавас казаїрсвса зтварссавт зЕссентняЄ вссааткстЕ сассисасте 15748 їсзвізаасс асвавсссбв Сена вес ззаїсасвва Кі зааст: 3508 тїатзазаїав їстссваїсв ваздавсаяс зїїссататс свтврсатена ТЕХ В із86а сссваасств вТїсСіїврава вваскаавса ссвссравса всссівсєвас бСассссссва ї392О завсїттаай аївавсаззсз арвавсвиави свасесїсєса аяваїсссва зсвааасата ї39858 ттясстаїас сазсастата стассвасста стасстрсссе ваатсасває ссестваватеа 14848 ссхстассяй стасаварссє сасскЕнсВКс Вканааетва ССВЕсВсЕВс дедаавсавс іа41098 нвасісвваЕ зскавасстї нЕзавасств вЕісвзасвв нсававтссад СЗТ і14158 «васиствах Свяссстаєз стасвсавек сабасссасс есссезакк стввосасса 14530 снсваїттств ССС сстТЕК явеваїствіна зсзсезасвн ссаавввїаав занвнасвазав іа їватссаваї їзаарсяяра кавнссааЕї авиаєаатсс авааєвтсякас ттвтсаєтТЕс з14348 сазаавітавх зазаїастсв всасастеса сСссссвсаса стаставаає ассЕсасате 14409 їастбїввсіївс асібвсатвз втвасастає вівївавссс вазарзассс асвтртарсе 1445а сасвсвайиу Ївзсавстїсаєсє рассссабсс стсавссссс ассабасзав сесвосатсс та5де ссавтстсас сазасєссвсос асасаассса сзасссвоєс Ссасассттв зававесяяє 14588 сассвссляаа авссїїавсавв сваїтассяв свасвзасзаа саасаваєва свіївсвясї ї4о4а асассттасєва ссассатбвсос аібкаксвств Єсассвстас ствЕасссваї сстазвавса 1478а кеввасеттсє їзрсвасвск вавсзазКавв сіссвававї ївстаєсваї ассавсвназ 14788
ЗсВівВЕСстс свібссїнаї їїсассяссв зевасаїссЄ сЕнавсівкс ссссасвавЕ 14820
Віївсдавзв йараєтввеї асскстстст встасесЕї сававатвїс СЕсЕвсаТее 14888
СХассассвв аїасстссасс сасзанатеєс стсассссєт сетсаксест Сасаєстеста 34549 всавсвссаї сазвтєсасї Тссррвссс стЕзсасста свттсвавва се ссвЕаа 1585955 ссвЕВвасссв виїїсісвсї сасравсвев васаїсвеавс СТ стваї сасвдянссВ ї155650 теЕВвасЯЗІсї сЕствдваснин всссттсаст сстассстає ввЕсесктає сТтсзиссвеа 151728 авсастсіїса їввавадсас сасзавеста ссвЕрасасакє вассавядас асист 151585
СІсствскас саааварияа Єссазвеазавї сстарваакту сттсвиєаас сссвссвавї 155489 астствадеа сїєтссвстЕ ввавссстеї вскаветТст беттсзасаа стсвваввах їз58о вкаксвсств сстектсЕКх засвіїасав васаасстта сестра сет 15360 засрвавсса СССССНАСЄЄ ассхстссво ЇССЄсеввсв зараваїрст стстасвксх ї5428
СЕСЖТсСства Тсствваакс сссзсссзве ваатсвесск Тастссесви сСасаавазахт 15458 ссвдадваки ВКсссТКтКс абсваствих КсВстсссса саїстевВсЄ заскастиее і5546
Тест тсат сасвттсстї садсвсастя вісстастає всстсасттас звасяствана ізвеВ засвивстсс снссазЕнис Вссдсквсіа ссяссраїар заадессвна стсвзссврас 565 сісасвісїї ссозжкатаєс зксвздасже атнтвссїса сеавставствВЕ сссавнатес 15728
Ккаїїствсва сроївивсст вссстезре сівїсаввав звїсасввва завсастака 15755 пЕїставЕска сезваасасе сввазвісає їїснЕзавіс Єстсаввтсї ївссзасасе 15848
ТтТрасвктва таасеетвЕт сссаситтсс втвасатсяав сазастясвка вІТЕвавстВ іхаав ствававкіа зсвеаввнис ватсвассиє какаїсвсас звавасассв скарніва 159568 зккасяваса зіазаїзаїтай сзастизкасв ваквтвї завттавтвї аасарствта 1502О яисазвававав зравкавакзе авававанак зваваравав звавакзває акадавесто їбвача вівавесвоу асвсасвсЕе СЕНАТ К зазасзаася заздсвсаїя стсвсВсеВЕ їв148 іїстзЕсдавне ТастсврвсвЕ сСсстртвиК зааавиїсса каввшвссвс свсакстасі 15280 астаєзасса аввссдтевЕа ввавЕвсавс звавссався ссСтсватавс свесескаїте 162650 вштЕсїзавсз астрарезис ванЕнсасає везирекаст вваврсиєвся ассриссава 16320 ївавдсакно саїссовсав севкиазсавс звсавеаавтї свававиуве Тессаєсане 16380 ставзаславі свствведас ссСссеввас засксвиєсвс ссвЕсставс сиатнссвас 154340
Тсгаввввса всазвсЗеТсТ восасвЕссо євавтівисва Хсватваває ситасаазеа за сассдствий свСтвавваї евцатавтаа ватвТВкК аавссвстаз ссвтаатава 14559 звадзвакада ввссдасвнв асвстатита євсатсвкттс ЄЄВЕССССТа завставаєв 16620 нававсасат ветссрінїнн нтїстаєстс ваїїтвававї сссваїтєата ССтрЕєстав зевна гГІбавсїввВ Гаїїрдадтаа засавазвсїся засєвавсса ааасвтаваї взтатавсесє 10748 татаєасвтв сссісзаває єсстастана асестстїта звазатсактсї зказатаєєє 16580 вскзсгстс тТкрсаїтнезвза тасстсиктз забистравитї встссасссс таттаассс ївБявБа завасавітев СсЕтасваєс астсЕстсах саадвтвесає сазаатвсв сазтеКекх зга вЕссттссабє зсссатакну сзазасстиє сазаатссте аїасасссіє сссдваєс зона аватраваїї ГсСвасаастї зававіїзавї авазсзівіс ассассаве Свісасаксе ї7а48
ВСЕЄЄсасає їтвастаста засссвеїта ассусдавав сЕсасассва сеаааваєса 17189 птсазасвас Саваазтазаї алаасассабн свіїаїївзав зазаїїстсс Сзбавизата 171658
КІ тавгавра ссзізкВЕтЇ візалавааа сгзаКССКта ствасавкаса сакттастіаз 17228 їсвадавїїї васзвавдтде кастазаата абасскакстї засазазваза завссзвайа 17259 аївссвааза сссвесаваз ссравссвих ссвазассвяє всавстевїЄ Єви свасх 1753483
КІваїасааи ссвавссвас ЄсввіссВії Свсасссстз абсасявсав ства 17488
КХсзванасвії ассазвссза сесїірісавЄ нссстрвава ССС нсвада Єваассазне 17450 стасасвисх вІвасасваз їЖїзазадса всссватвсв всявкавтає вбавестасх 175525
Квасіссаав азавівіссс завбестваї васссссВсЕ зедазвавви Сбзвсїасва ї75Ка нхсвсвнсва зиссзизваїа сазвадазсса тзазвївасх вазистскаа ахтахзсизав ї7о4а нашжсваавіає ЄСссСвазаза збасвсозасв ассбрвааєса зазвазчасе зага 17788
Свїссссавз саавсакссс стссааввва сВЕсЗВКС сесствсатяи сааствіах 17759 вежЖссссісв СТазсвазааї ССсЕрастас сассвннавс сссссстява авсавсссув 17858 «ввЕставівя вассввїсни ССвЕсстссе Квіассеваз ввествсссї зітТавствав 17555 адгтвазасї сів ссста стсватЕссї звіїнсвіза аїркасисаеє зс(віаасвсв їо40 їзіввавсвх зигасстлай Срзсїввнав сні КсТїра вассизінав авасевезне їі18реа звазсізано аїваївасвї листазвазс дваїттиааз вЕССсткави Ствватссх 185а685 неїсказвавї ВЕСЕссЕсса завасавсеаи сваїсствза ссвадвавана сакїїтвазав 18128 авісавсаїтсс ккссасвїКс зквсавасар зазакідвісї звватссваєЄ свсазека ї1518а васісалеца вКсїстілав зсссваїссї вЕссвсвтас зазаєтаєва асзвасасасх 18348 їїзвастаїтї Тввссххвас твавсттсска стсвттасеї аствавеста свизвіавас 18388 ттвсваатаз зсазсаїттссс варезаїтаст сабраїтссся Свасїзиссз варрясатис 18358 свеаїсвкаїс Тївадравсасв саїбссстса авбтїссвате сасаситваї свтавсстви 1848 свслаїтсаа ззаїаасеїа візсївааара саввазатскя ХвезсЇТКсЄ ЄСВ іно заазваавасї завіїїатас вСвсаіїттВа ссстазиїва аваассвайа СЕС саєсв 15550 апетататєва аєссавтвказ бТастаєссств саабасаєста Ті бсвстахє стввсаасте 185 їсзвтввастї азствсссЄтає сазсзасвтеє атввазбвсає ват тваве втасзсаТеї 18860 ствавівсях встїївїваз йасесаасеиз ссасазавив дваїссатас авасасатсх їв7га стасвкстїсс Єссакссвіїї сссвасаєва асавадеясї стасласазс Ївссвасвас 15788 засзадсянк звасвасасх зсавітасає ЄСесзаєтас сасассатн сссстаские тло таєсссквех дсссствств язвассссстви аїтасвстстаєс тзсавзтиєве ствассства і18в9ра таїсссзвсї Єсткакзави СЖСствстєсвВ стїсатнсак кЕбвавсвсї варКасстає 18565
Какссвравсх зссвваєасс Ткексїтсає стасстсвва аввесевївїса сасававсвЕ ї1ча2о асстсласст КХсврастся вдазесвстає всесвіт тас ваксуєтаєс знассссс ї1зац5 спаеасавстас свсвсствсс СОС сас СЕстсастаде встсоаввнас сбазввїств 19149 ккванасатс сссдратстаєда стрстзасєс їтеникаасс їсїсаввнста Сстввсїїса 132808 «еасвасаве завіавсвсєв зесттстсва сасстесскс асвисватна веаадазиух 18268 сввссзвесу сстТКсссгс асаїствссвя ссовсвесесЄ стсаяїссявї сасивсєсех 1з328 ївЕтасвазе сссракссїв сСсвваваств стВвсіїсввя сс ствсса всассттсвх із35а всвсвсваск аївсассссу звсїасрвасХ ТвссвсссКу вравіїсвасї вЕссствиза 19440 вазисзвсвїс асссзвассс вваскосксса вссствсаєс свтвесссте встствеста 19588 савссвстївс вЕссаравів ссвессств всттссттас ссїсвзсТсї врвсїатвих 135859 вазсатвесс вЕТсЕстссе сезастеста ссвсалараве їасазестста ардвсбнставз 19828
Ейансарівл сеанввессвс свссаквВіва сакаїссвлав кзавлаавтв Тазіаавасе 19658 астстсвєта стісратсвсї звтвраїтетс асерітатає асавтавтнї хатсїїттсас 13748 застстїаїснї заївсатитк звааствівас азсаїтватссс їасстиссаї аїдатлакгає ізн
Тсіссссасх їаааастсЕК вісазссказа адратасзава ттсїїтазяє вастазазла 1868 забїасвіїат звавіїсас вктсстасса зсзавсеяех автсасстаїх сассвассва 153528 зваваатассу віаставсск авіствзаїз вайтазстав асїствеВссЄ доз свЕє 153558 свснкаіссс атїкнзвісав анакссавес зизевасста зсадавстсв ссвсвааває зав4а їввсЕВасви бісакасада вістсттасв астсвасїває завазкаааа Хе 2815а катвВЕвнак сасдасасаєсє їТкЕїстастс сазанасаїтс аазадатасак Ссссавзвакз звів сгсазнавввсз аствавастє сссвасаааи веїзаснсск везазвсстсс бТсвваскса г2а25а
ТХдсссявої агстуєсвсх біаствтева раблисрваа зацезарвтв встсстасая 28258 півссвтсяї сврсвзбанар бвазвивесаї свствравває вессствсск асавіввтєс таза сазаваєвна сссссесссв сваввадовВї свсввназаа дазвасвктс саассвевс 2458 їтславнсвза вскЕВїтвах нсвастаїтстс сестваскся авякасваси сасавсссся жез ствВїсскксв сазеравессстЕ сстствктата звиавеєтсв тстсаєствЕ звадвасасе газ нЕвкаствна їтавасесва весссдаданк всвтсссвсї давзтсзвас стветаствс 20550 ївстквівівя вссвсївВіїї вага їсеЄ нззссастає зісвараєсте стассяєтва зоБаВ стісввваст давссїсваз стсстсвава відкаїсває пзїстсрана язстссвава зат5о сараївссс сввосівісв стванвстїра век Вссевї кссвваатсв сСсТасистне Б2атаа зссстКизав вссаразаск стісзсвасск враствссвав СстзесвВЕс зсвсттсаса за82а скадвсвісав акасстнкас сСбвваїссає ссствсаст свостсстся ввсстаткиа 258 ввостсеввва стсларістВ тет вствЄ сассврастс сставскатс сесстассва 28948 апсстсатвзЕ всїсттївявї асасєтвставВ звявастстї ававстветв касасвввса 180 сВнівнасЕВ свіваївіїя вассссввсз занарасссс вавстссств сстсстсстав тіаБа зествїЕара севріїаєїтс вкабствавії їТвсвсрасс віїсвавсяї сСТерсватав 23178 ас ссіваа ваїсвавссс ТЕТ вссвиХ стсЕсватва ЄСатсатакта асссствККВ 21189 пассасвісз зисатвіааАЄ ажссаасасте їТаваївсясва сеїїатстає давасеЕвятї 1549 тіївсваїсста кавїсссвса всбасасаїї їзавтасвсра Савзазасєза заїахаврснвс 21385 ккавастави асСезаїсатс всвсвсвВКВ ссасссаїво саставакса ствах 21350 зсвпксївааз ссассссаях асвіїзаава сроссвсаазу вівїсастаа весеКстазе «ака свісваксксв їстіасассас аебасвВсссї вссавссяшес зессавсадс сСксссваксв з14не всвЕстсввс асазвавісвс састїсватає ввисвессса ссавтсе 21577 «2105 2 «2115» 23512 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» рбА7-щшод В нуклеотидна послідовність «4005 2
Тест ТЕВсХ висасвсаса їзсазаїтвиа свзасиваїв авсоттттса сессесесса БО датасссваї хаїтстазта засвсссЄсс бессстзнве сЕасесесса зувІвссеки що тсзазсзсїв асадсстаза ссрааввсев дазаскасва їстнсбавев вассссссає зе ксгасвасніє ктазавсввя свссссвовВВ зазевстївся вес ас свв аа астсзавасст сссзавеєст свжЕссссвав СсСВСТВСЖЕ сСтсвссрсвс сваха Зо бесвссвсса асеарестти бТавіїзабтае взаїсвзіссз вес сва сссввасЗе за таекааїтає тавсзсзиЕа сХавсатава аасасежКЕ ства ссссанасе ЗО
ТтвЕТСТвІХ сот сис сассттазак сстссканнс зіарісвсяк ваствсєсве «80 трасвстсса тсстсїсзан ааствеаЕсЄ внріяавиза асатссасвс зсвевсзтне ав засдЕтвтитс ЖсснвттевеЕ зиапїтажтТЕ асазватссв звабсєсаїва єссзззавав випа сасеїваайа ссзсааватї сасраїстаї їрзсавіасв віавсзаавтї засясесвссв «во реїзствясї сасбасзсяс КфссссєтЄкс єстсвеКссс вессбвтвес Сссвітаста та
Ктассасевс яїасвссЄєз ссвссастах Сбсасвссвс абазвстїсвх бвасбаасса 785о ттзЕсвайск КостсвВссЕ ЄТссвІсаВе втавсввїВс свтсссвсст Саскааввсе чав аварававтв вксттссвае сассисакта зшзнавсаєс ссЕсавсева вКссссассХ зав сттзвсвала пнавсвваїс ЄЕстрвствас стсавЕсТВЕ сткавітврав дсабвїсане зе цазававшіве їдвасазссЄ дасактсівння сассссавтя зрссадскса свсвсссТсх 1938 авлавикаїсв аіаїсзасре КВсКяссаас зрсвівзвста асссазкзав виб 1888 аваївканса зсаревавев: ваеїзсвава аврбарадази Єравскаааа ввївсаєнеа цав авсдятссав стїссравнав Твзассассв розаврсався веЕссвавравї асссвВтаес 12959 ваксіївата зслисвеїїс тїаасавсатсв здазасвавс аїссавваав сотстесва їз
ВІСССССтта севавазссс віставеВТВ Вевазсисая збссеказан ссткзасвав 13720 завіссяакав нідасарназ свзаввссса ансесвааве ссавсссвав сеставаква 386
Ксстставеї ствітаєско сзасзавсавї ксбтвазвава вссевгарсви варта ї44а паваїссате тсвсвостаз сот тваве квсавсасвк сЕсЄКТВЕсКак всасссевх 1585 ссасятсїса ссзевавкаж заавтссвва їссаказетс астансствав ККСЕСЕТЕСЕ і1558 сасавтзазсоз ваїссврикай гаракктаєсв їссвссстсв ср сївавссс атссвсассх івхе «кс скчне зазввсзссвї азасявсавиз аисваскита вкитясссад свтасатази їі8585 звсаВсссса зварсвазЕв їансваюааи стскнЕаавт ссвтавксся сатин снях 1750 зкаввяскте ззквайжссзї стетстсзав стсвзвсасве саЕссСвесна аебкесезав 18528 ситареанся Хсстсзкасєт свивістстЕ кассісзиса кктстстаравн всававсусх їі завсатсске саавнссттри взнзасровкх втврважжесє ссказваврссх саввбадевес 19525 висассавтв СбСадсзався Срізрайрнах сасадаєсся ссзвевсвоЄ Сваавскадї 188 касвтсвтве Єсвасрієсєст савостставс єсажєстаріс Єкскврававкав сзревадессе заз зіваввстсв анавсстїаа ваїсвасаве ансактаваа дсаїсстїав сабсавадвис 2388 сісввсаваа васккввасс свеїзавтки звасстаква вавватсткс сах «188 зЕшаквисас зсресатнеї звассвсанає втіааЄсисва ТЕСЕВсссЕХ ТВІР ТВХ 2828
ЇнїсяВсаак сеСсрсяийан Єбазіївавс вввІзЕсссу севаївнаса авсавитакї заЩа ваїтвезтвсїс таввжкаввї васрееввтв їсїтаїтавсе враваївесе завтроасев «за тскссасасаі авазасввав вва сссвсвсса сс сНвК всатвнасис гаа зіввиїстїса ЄССТрЕсСавса свїзаєнаре асватіравих вовзЕВТвїст стсаввтсєс зав зваввЕвата їрірвасара зваавазсре свасвататх насвразас весасставї 2528 яірзаїстає ссвнЕїтвата атаствитвс аесствиссв їсаакссссЕ сзасєваєте 258 сасзазсссс автсвавтаї Свассассв вссасаввс стрсааасвс вагяссавих 2548 мївІставзй вЕвавасата сазатавсуу сватасавах затававсва стазастав ко ківіїзавасє татвїтаїтваз всстсзававу Кавастатсї ссїтавствс зватататав ува авістававв ввссеасаєта сс тТлава вабтехавестс Свстнвавтс їкасставатс г82а сЕтстсажса стстВВЄКСс санжтставт стаесвавхт ВЕСКЕесктесс завизватете 2вва завслараан тазаїїваїс забдссвска зсссасвссв зассвісаас ссастаксах чав квссвсввав акссессаває Єсавсстсса сссаксввів аваавсзсав вЕсадсскес зав вссвоссвсса вссбСввсесв свікасассс звввзссбве сасвенавис ввсвсасвсе запо датесавате зсдвкасасс аваскасавв звасивсесу радаваскахє зсраївтада зІ2а аіаквансіс ассаїсаасе акзавстяари аазаїсасаз вававасавс Тебсвтсвате З188 візсвавсвв сасввасєвна сстЕсстсва сабаєстсся зіаскнсдаа всстрессаа БУ касеїаввісв ссвреаасссе втесввансе сасвастств ваарасавес Вес запа тсвістТсвВос сасссаствв зсвїскасса ївСватвваї Тсветса вас ветеа З3бБа савссзсату стваазвесссс азіваватвав сссКсзсвах аввтссТвсх сваївссвсв 3425 вакстаєвЕ: бвсвавісса їазстївссв Тїсравівїї сТрсвоврсс автсввасве заза ваассвисва всїсваства сасстатвааа вессасвасєз ввавнвясса зазнтКсе з543а сставсвсх тсаткаввсє ссивиХсЕкК: аїввасвісе кааавссссє сесезанвав з50В скакасвіса ссасвсатва сеЕсавнасї асїтасесете авсасазвта сезвавваєса зевБа сети їТсК вес сесттв скеЗЕївасї вевсасЕссв зазазанаєи Хвсасстсдя 37за
Яттсзасасх сзвадяссва сесесстттс стставезах всссвассяя весаставса зувеа тТЕназвваан стсваВсТсї вааристтса сааснезасс тевавваттє саясаврссї зав занссваває сЕзантсваа Ссасссваєсс ввварссукта аабсявсаза састостеся 3988 ссаксавтїастс сваїтсяксех всавсрясЕст ссвектаєтя сзавссвевЕ актисазнсї заба зивавтвврва їзвавасссс авасеісвнтїє ретнїваава вСсатсттса васставтеЕ ча2о звчнізнаїиЄ зраскнсвяс асдавваскс Сваявсвзсса ваваристак їссаввасий аа ввассжвста ссксзаства сстссКеста вссссварвс стстсвасєта вавсавивий а14о заввасвнтс зсавпрасіве васавтскасе їТТссвасат каасствавт вессасавсх 458 заст тєси ветсккесттс свсзстсК вста сасЕ СОсСтеетвас ас за асссттвесс всвівстсвв денївссста всаввіїнвї срисквеКї ссабріасса 4328 каави зе сстассавсу дазавтївав сс тсс стастсвзаск сставттехе зазна тїзвавасріатн татабеілатї ртссаїзаза свтаитастї вазідастає вази 34348 твавассвах езваватвив звсавазста заваївасва састзаствав аасвавтекв 4550 зааввстстї зрЕїїївзаї сстаєтсвви ваївіїЕЕсЕ Ссаззваїак свЕсдасЕс з5ва ввассзавара авасасссва взазісавта Єссвнїсасв Сссасбвсваз Садааавтве 46520 тствЕваїсх какїнсвасе ЄсСараєсхтаав зкавтсссЕх аадзвтссват сссвЕствІв 4енка їасзаваств сєвазіаавтвї аббЕсврасї абттрЕссЖЕ вастаивкуЄ ссасїсатта 4740
ТЕсаетраве тбзрадаата взсттвсваз сСвазсасзсї сссваваааї асєсасвасе «нов ссвізВієав їсвкаквиїа сдссаиссве Зістзавиях асвовссесск сСсазаєттв ява звтівсясаївї затсабадіс свесасавеї саазаатазтї втартаїтїза зкаслданах ча
Ттвтавассє КСВ се Ссаааавазе астазвеука сасесасакЄ стактвав лава ївевазассв авастстссз тсвраавтаєа теЕззЕставтї атасасвтсї стесзаїтнта 54 статис ассссвасва СС свесря зссвсїассЄ бЄассзсзаїтв срсасввасе 5іва саТваЕКіїЕ зибасасаса теісїаваєв саїнсїїїВї ззавсртаає вкассвсааа зіва акввнассся їасазвасаса сетсвівкст тсстссаєта ЄСЕхссвраса савасвеане 55 її зсвас авіїзссвас авсзазсзває дасзаасаве аксасваєтта сага 5АНа цескаїтасся СЕЕСЄКСТаК свссассесск Все ссв ствеаастсх Свватасесх З3Ає асстасвати їрЕствассс траїатссса всттїстяава завтїтсстяс зе тсатв дав саваттваеї зствдввасс састаїсвва всбаїтвдає асстсстсте сакєстаєсттс 5ава визаавсеси ксз'всвваа садакстсва сссстсквас ссзавазсве тасвсссвхЕ 5559 басваєттсє зссарасетї сббсавсавс ївстрсаксх восгссЄсвЕ сасстексає з58а звеввсісвив васссаавВї стврввазає зкссстваса Скастестав стссствввна 554в зістстсввв татстввстЇ Єсястївсвавс васаветасе Єсвавесстст свасасстхе 57аа їїсвіввіва бТезЕваввав всссввссвв ссТЕссЄсс стсасаєстя ссзссзсВсї ЗУБА сТКСТсвкст ввісасВвс свссесствів азвсссвзес ствствдвава ссЕссаске в яваВтсттстя сївасасстїї свівсасетїв абсвівіасєЄ ссівссвсве асссвстесе 583о сттввавсса встувіїтсїв кааваавтсає язбсасссава сссаваКестї СсавтЕссвх 5340
ВісТвівсгї сссастстах стасаєсесс сасестсава асассрексЕ ствветтссї вада тТассжтсаво свв СаХ врсрвасаєв ТСсвсЕсксх СсрссвассЄ ссовосисвад баба вввіасвантї стзавевівс Саараарсак Тваївадвсн свсввсвсвс СВК БІЗа ссатвсваса ваксразева зразавсеса аїзавасвасє їстсасівсї свабевстав БвівВе їтвзїївїсаї тистаївсвї заїзаєвісяа сс свсава сссассвсва Сясаївїрав ва зетаєдасвс зкїавтсста сЄбдссасах вабавсаскс сссссаКсса вавсістсвї 53Ва сеасствазав абсасававасх стїїаззаска сСсвазаззаза баїтаєсаказ зжтсзвассас зо їкстастлаї завіїаїїав ЄсаТсаЕЄта стрВссаваза аватасєтаї астіваєттан вага їстввасава аїзаєсавек сставтстсз ЄскссіЇїсвз зассааєктта незазсвх вава
СКС ссля состаткаав ссаввссс вссссвесЄсх сСзазаввявх квссаїтавв 55БАВ ятвссаїрсс зввасактан ствсясвеса сасвтввсах всарсовсве аваактвтЕх сна ттЕттсвссз ств саєтс сесттслаасв состава сетстстсвс авсасасаса БЕ касазссвсз всвЕнсаси састаїтзса свсвассвсс асСисаавіст сссссасаде 678 статяааста астсасссвс сСсассссЄ зсссваасса авасісаїєв акасвавсай ето взЕсззазас зсзсесвава асссссаса зсаассаєса зсвасзасза зсазсазаса вав асаттасвах свсасстасаи абтассаєас сазтвсстеса зквнастске асксктатяс 6взво
ТвстсстссЄ сствсссавс сссасвазеЄ свасастссх сзаваисвся зсзаназава зва всїЖнїїаїс везнатавви сестасваїву Кассвасіїс кстаззванасє ассстнетие ага завватсзїї всїїассзвр ХХвеЕавстна квсїавссваї вебтасваде вибтесатву така
КаваїсівсїЇ аавкрсткаса аваїясїттва яксссккест стсвЕсств сссасааЕвЕ 7148 аівстсссса драввввссв ассстатсвс тТврасстссаз вавстсасся авсласттва хв вистнавива аснстснзис ЄКТС Єсасевссвсх базсзвасттв стдаввТсах Уа свссасвсах штКвссвиТн ствстеКтаї ссрЕсаяєЄваа Сасасєтітсв ствнавтсвє 7386 тасдсЕсвва БІсЕЕсСсави кааваїтетня зтввстсаєеЕ сасранветв касаєтастс 75 тстсасїнаа авсаіквех їсрасвивис Сзіссзавїї всссессвсв ввсоствнВе зада сЕнавівісї ввсвсЕсвеЕЄ врвсвхазасса всатазсаад сассасвста стскссавая 7508 вслісврсає васвссваєс ствасассст ссскстсвІї всессссасв аваравссВе 7580
ТЕствавеії завїстсстр статсвнивес ствисттсї атрсаввств авессессКес Тт62а сествтхассє асістксттв СсвсбсссвВ зскесавежтї тассстсавес стадасакає тва вотсавиастї завсастасв аскавстсвс сасвсссвва зісзватасв дасстиссЕЕ тва атасстсвсї всставссесе всессвеата сеКсссвсЄ сресакскс Ксувснттесв 78ав
КСТТЕНавст всвсвсасст Ссбвсвасту своївЕЕЕсСЕ сатбастсясс їссствІтНу 7в8ва ївавсстває вавсатнста сїїввЕсЕка всвВКаВсХвсї авссвсозста стааседеЕс 7528
Тссаїсттвя Свясвсвату врисевасвїс сїасстївас Єассавасска зесассассх 7з8а
ККасссітсї зінссїсваї їсавасаєссс тазвврассвох сстзнавста арсавстКЕ вада свававесак веастссвесх асевжнтсав ареасасткє раристасии ссратастеї віза сЕстаВссЇх врасвасвітв ссесзтистсс їракавваза збвесезихааї кадасснкте зібБа заавсзЕКсве саабааавсКХ сессваваєх вавїсствсе вссвасскутв свасиасках 8228 саізівасїї стестваасЄ зснссзансз сніавівасєЄ авсебвсває ксасваснКх щ2вВ асгїТатвака ТЕреКсКтта тезїсзЕавї сссвсватта сасаттєває асвсвакара зай авасвазазса бавсвсвсаз зсїавваївза асівісвсвс всяка ссасвесаєсє вщой звЕаісввісВ аїтївавааяїс ссавбтаїає ТтТввістаяс сЕавсстТвЕї яствавтава лава зсвавіїсва вссавассвая аагазсаваята ТаїаВТї абасасасиє сескавваєсх 528 тії зЕздвя Тс СїЗа ззазгатсгЗз вавастасссе свассссксх весасвсаве 5а астсвїїна аїясваавкв стссаїїшТе зїївастста засазссвеї свтасватса Бай
СЕКС зїс завївссвсї ззазідсвіс авісісєтстя сСсссЄсссаєЄя сссасатвс вч звазісїзіс заваїїстфта Сатакессїї ссравтїїва звсраватсет сватааттта вва зазаіїзазій каасакатсз Став КбаввВї зссаїтаскра ЄСЕстСаєасєє сваєсасєтад вало аїстїввссзаз сіствзазві штасаїсзасє вазаваттав їсвайвснаст дазватазата во авівісавЕвВї віїатїсаака завсжстссї зсавзваасає СССвасаває сасаєвссв 8540 їазадааайє ТЗ тас тазсасатат атссасссаЄ сазааакєср всаварвсаяо за аїталялтаа састсаєстя асаалаллал лассавдяява сдссваааає ссвисаваас зай сЕВвассваєс свазвссвата бавссевсЕ ветїтввЕї їезтатзаас саеаассвВасЕ зга сЕвсссастЄ дсасссссва Єсасаабавс Сстзасассе сазвнатвіта стзавстаає під віїнісвата ссстнраваї їбїрсавааї двакссависс статасбеноте Сававбасваах 248 їїваваосав стсрасевсва свЕсаасасо свакстастх растстазаа зазсзтссса пев авсаестваса аісссЕста вравевавех савскаєваї сТзсзисаза кссаивакає азва зазкаассзї зазиїраттн ааксісваза татасезанв засазатаєх стсзазававз зага твснсвасва сссвнаасви вавяневсвя ся носсссзазс завсасессо зЗана
Єстаазвряає ввезВееесс сеЄсвсасвЄ зассвстате сесссстсвх сасававняєх За кідвасіасії аствеЕкавстї їстстїстеазав асавіватав аасссасасв врсаївТКсх зева
КТссвККтав ККсїаававазс свавразасат зсаївсаїтав саїтссатса вої 650
СЕКТ аста севїтаазтра стїаззазасаєсє аїсїївітат сссассстта асасставса 728
ВЕВІСКІТвВг зсввістсвЕ свзісвссвс Сїсвавасса Трсаваствс трете ака
ЕваКствЕса тсРЕСІарес ТвКЕївссвс аствісссвв аавЕстссста ксвасіТвх заява
Тавасткзїв ввассасстє їсаавсктсстї восвствссс сідссвостир зівтсстКес зове тсакствнеє ваїсвсасвс сссвитсссс Свсасвсдса СсісвсЕсстс заувства заБа катссассеса всавсєвесв вавтесснис ссвссЕссс тсстссасвЕ СЕТ ЕНІТЕї 19358 зкбїавтваст вссвссвесс сет сЕу ККтсссасавр взассвкессяа асаасесиву 18850 зизассисасє варвсактеївс сТїсассса сїзазавсо азизавсаїта сабаасиєсе 101548 каїсввостс Тесстекесте тсетстетсте бстїсжестебс Тежежекетс ТсТетсТс 1ог2ва таттасзвсс вссасассза ссстазвасваєсє астсвса стассаєсаЄ сассакссаїх 192650 ссстзасвс Тансвисвіс ССтТрсасваї сстсвтвассв атсассссте сатсаввтат 19358 ссттвввстЄ састссвасе Тв Твсавх сзсвеаасатїє джавсвсасса тсасвЕсеся зазво сзлсдавскв ксазватетс савиттсссс заавевставс ссасвтвисс саке ї1644а віствівитЕ стстсссзта астссесссва свсастсвио зесттссста всясенсака т1а58а зіввЕВЕссї сназзсеіве свасрввеса саїванестс даїтваїнїса Свкзвавасеа чав їїссвакваї їссраяссстх статсватяв Сайсавсавс асссссанев авактссасх їізва2а стївавсаїс візаєнавис зсарзакзаї сретесиств заркаввита асравазасавз 18580 кссзаїтивїї ззвсзаккаїс сааврасазва ассвівїват заззавівввс саврявсесив 18740 заассттеса зеснЕтисаа асарсевсва кееїаЕсаявВ вассссазава ссавазадяа т1евоз сваївтївссв всавккскккс Ктзссвазваз сявивстадаяа зввссеніви ТизеазстТва із868 авзасттвва засассодвеЕ Хзадисїнїсє савсвесиїї вкїавсваде сазараєвав ї80929 вЕсстссвав ствссовЕВас зарзезесва аззсяйчеста ваїтаввавсх сссессавска ї1в9зва їавісвїваав встає ївеївстКсЄ ссствавстс сскресвитв Саавдавска 11озча звассаїтвїс їсіввісабся їдіссвЕїав сстібаЄЕвсВ сіїавсасва вада за зистнзаврія зризассасз зсзакававї незвавссса бссазсввта Ксвїївассс 15188 аїссЕтавтї завакаазеса взаїтнтссас всбсатвїсєс завдеасксвя аїтссизатс 11229 свааасазна взізрарняс асиїваксвр ассварсвис нзаїссаави авсссвусав 1155а сваваававеЕ васвїавета аврбссвасвиї завсваєавс анаватавсс асан 11559 їсзссзсвтя арасатавасє сссвсваварн атсксссВса асавтвстса вевясавсвх ї14ва сваввасисс стТївасввїв ТЗассТвеса сстсвазазас вЕстссвазв віассватав 11ї4аБО
СсВВТСТТТТЕ ствсттвава раїдсавсвї КЕссарааєв ссгавсветє Ттавївваєе 11520 ксксваввай сісавасссз васасввсав сстїавасах веїаївасаа Сснсбаватех 11588 аабтвтавтв СТТВСККВСКВ КЕсВІТВІТа ссвеОзассея ссвізазасеЕ ссспоєввЕв Мей
ЗВЕТРЕстсТї Тазвввівїра вайсвзвітв свавссВТЕї ВЕС ТВ втвавассве 11758 країнвЕввЕ Тбтататаке ваарастезн даатевиніс всравствста астстрсаєв 1т75а ввстасасві вс К ввясітасає втзвтастах ссаїтвсаває всавссааіа 113828 сататасвеї зЕсссаатва сеїТетввкаа сасаатасви свеавівтссо зсхваїєте ізо ксалінасав вірівсасЕЄ врабтаїстї асссввоссїіс сс та аїбЄсвраств 11340
ЖЕ тактст сттассттвв севЄсСсатаї бсвсатсссї ззавесвава свкавїтТваа ї1208о свЕсЕВсєва аваствавас ваїввасати асстасаєае їрїавнивтся атбтвасвїся 12565 завваадаєса ствзісстсї сазесвівсв васававкеіа дабазсакав їсассадаве 121ха зізатаваса зазартнсав завсазваєї заазаваєта востасвраса са сся 13188 тТаїжввазавс ебсаїтатсс зністсвеєн зссвісстес стсствсЕс авіснаваке з1234А8 ссЕсвивасї засваврарех савїтевнас ввсанатсстї Саїєствкас сяк 123858 вЕЕКЕсссав авЕстсстя ссвссвіста сасставтстс сассарвтсї ваавасвасх 12350 сітсасасса всвасвіїїа вв ссстак сстастсста есствсваса секс 17428 забсассівна всаєсвівся сраівассвв васірївва ВЕзвиааїВЕ СВО 15488 звавстсссв вттвивсвас ссвасттсва ссссавтста ввсссЕссва аатсстссав 12540 іїкссаїтвє влавссжкта вавсетвавс ссссстссяє вхїааївсст сратссравка 12508 стсставяса ззанвкаав сдасскствка ксассраваї сразксвсак актттктеЕс 1зо5а васиїкіссв абсвасссає зазсаалеса ваадасавиї ваїстттсат зестатасе 12728 зсазитавтя вісїтасскї сабрсатазт засвїстсву їсстїїсвава веветтуКес 15788 васаксєсвів асвасссваз вссїсасдих звсаїтарив закзасттсс двСсссес 128548 кісасинссї КЕвбависех савсскавсї сдссавіїсс сисссваєтв всгссисавя і2зваа агаї(сезасє ввсвавстає вевстсвсза ссасааєтес асвисеєсвна всаввасста і29858 ствсЕзанас Хсатстсасте давсуссзва азсееЕусЕї савсавасса всвассиваз ї13а2а їссатсвсві васввасвус саескеетТва всвавасдяя асзввазвсв сота їізаа акакісвіна встссасвсс веаїїссвес азссасвївЕЇ сввЕсавист ЄсессвгаЕЕ 131458 аванатати: їракросзвас ссаїстетївнс савсжсвеавсая зстасвавав СВК 15х8а ївтватїтсткс ставтетссс ектратвитв австсататєт стасаєсиєв Севссесеса 135658
ГсвтїсвВЕсКс ствЕсатств асаїтсссвнтс аЕствсаєсс яасвсвсвссв сесссвере 13330 с«завтїссста вЕсЕТсасвс зсвосавато десретвесв свввссвосс Сас х 13380 пссваївивї вваввсїтвав СТТвВвВВіс ссвсвесЕВ свніавЕвив Стреси 13848
ВВТВТВВВсЄ васввсаств зссваїєтєтас ЄСссстИсекс вавтіжсїїке бсавзаваса 13580 асссзсїара ЄтадааствЕ заассававо весванесив асбтазитсав асссвасак 13568 авісасатст стсазваває зпабвтавссс сессаеиВеХ Хататаєтте саавбїзазад їз застав сай сссствнясс сСбабасасве СОСсвасвас баз Каасє сасістаа 1лекв
Мт вїаЕсва вастаєству абеїстсссс сствавкава стек ТЕ свт всвеа 13748 зссгаїзастс даатлаєсда бастсааств аавсствсвс знттааїттна адиваттзає їз8ве ввссвавасв саставсяЄс ассаассваа Савасссася стадатенсс аткесакса ї138568 зтаїссвтїсвс свЕтсЕКстЄ сЕессвВсАЄ асссссжстВ завсстврара васасствса 13920 стїсвітївсс сттаєсасет всслсоадаак вавзасссасв саєссатнса застезавай 13980
ТЕВсВвсвавв всссетсссс сссаїтесте асесввсвас свіссамксє ассатестсес 14848
ЕСтасаззаас зсссссаїсз сттсзссбак авсаїсасса стасктвстї віссатссава 14189 вавасассся ст тасває вастассвасє авсаасаває засаяасняс астаснасса 14188 саїссїасваї ївссатасса свссасссви свобистзвак сазатввнав СТТсТасТви 14229 сис тсвівсї вЕТВстаств вестсЕЕсеве ссссассвеа завеатеіїев стваївевесс 14-50 свассссасе асснссвнав зссствіста сеаівстаав вс ссаввЕ серадевсс ї14348 кВЕСВЕЄКСЯ сасфссвКК ств ТсВВ звваававаї встассваве стіссатва 14408 ахвссатвнва аввесссЕВс ссавнтсєтве заївістава Тбссасвсєв ваСссстєве ї4ава тІстаствая вазссствссе стессвакска якваїтассте сзассссвтв ссврваєсвео 14528 твакасеветв сстссТвКст стствваТе свссествсх Ксстастеве гсвавЕстав 145858
Вес аісст вевіствста ссвсссссра васссасате сттасвсте вазананасї 1448 етсссссс атсАсКссса васвВсессє свстсттатс веїстізаса Єссздсатиа 147аа
Євстазссет ВЕТЕСТССВЄ стазвсствс суссвітаве свв дассетитсз 14768 вваствеасс везевасста сСвассссссв весестсзавак сасвїсвкса сСвсассвесЕ тав ссвсассвасє каснттвата зевзісства бсзазакветї сасребвстс Єбакасесаа 145856 вкстассває вести тсасє стаствсаїкв всстсавеаї СсЕСЕассЕе сСвсствВТиа 14948 касєтатвівс всссссаввс ТТКТВЕКссї свасатстсє вавсЄсЕєта сЕсвВЕсВсВ 159988 певевриїсвав сстатстстїва вестХвестнв аквостстте абс света їзаБа всттассттс бдввставаї їсвїтестїЕ всстссвсас сссвсссссі ссвсссяєас 15120 твсінївївї зссвссвста седЕсаєвас сива їасстсвстї Тс сТсї 15156 сгакстсссас завсстїсвзве ВТВЕКАсТсс сВсСсвдасск катвнаїтста гсасттстаї 15-49 вастававетї встзисттсс ЄсСзадакаса австевваст кстжсївасе стврезевасс 15390 сеттсттвнст зстстКазсв втдВастсва сгвссавасх варсазксаст КЕТТссстаЕ 15366 завіїсассвї ввактстасс сіавасттвс ТссТсСТТеСЇ аарестванє їтїваввстав 15428 зкраассвзви їзсзансвсї зссствссаї стресссаас ство тста ссстсавака ї5ава
Твувтасвсх сстввазназв дисстзизЕс їаакаствав саабрасази сетатиквас із5ав ствавахвех заскнтазза їагасвіааї засваїваса асазвввссяс вавеєбвавав із680 сканнвнаав вевавнитеїв Сазсвадссв візнссвиїи ВеВстВасеЄ сесассася 15658 ткЕїсаавтаза хсатвзактї Кріс ЗТВСеЕСЕСЕЄ ЄТазаїсаїтв заїїїїтазаї іо їїтзсавайе забссссазу сквЕзадазса зсаттссаса єссясвсаЄв вас іх78а ївсссзазЕс ТавтТіїстска ваккаївЕзав савкєвссврав свисествся австассссес 15548 азаавссстта заазїівзасза сваєвавсар звсаасВстус сазакатссс авасваваса 15599 тасЄсасстах асїзастаста їтатхастаає бассаствсс сСвезатсвсва аїссствааї 155509 вастксхасх азсівсазввс стівсІвЕсЕ всввивазву ваїсввсвск єсвакавнса 15070 ясввастсве звавсдаввсс Кіреазанасс сравссваас нрЕсакаатс аа КкКее 15859 «Хсвазсвтїїа актватсста сассабетви вісаїазїсся света ССссквссас 16140 састсваттс ТЕссТТнссЕ ставив ТЕХ кавасаснавс вессваркта авадвасава 16288 зпасавіткссва ассааазрвсва вававвссва візависнаї ссазаситає зсїтвссатї 16259 жссзавиваста візазатасї серсаїаєтв їаїїсссвса сакстЗїтаав вівссвсвта 15 сЕтагіввст шсатттвсає рзаузатаст засисеїаавс ссвазававс ссасвтета і65Зз8а сссавтїнсзаа вКктавсвстс зсвассссаї їссссазвтс ссевссаката засскассах 16448 ссссивієкс ассаанессса ссвсаслааст сасвасесає кстсвсвсс Тазанаасся 16588 звісвссасса зазаїтсїсас засазібасс зисзасвася засзасавас засзвусасав ів тжасаїїїасє заїїассзїз ссасрадеснс ТЕсСсасситї аскриавуств зссставиаа 16678 сздавеатсї Єсслисазасз ссвадслаеа вет ссаваа тсЕстассе азгзвссавасве 16588 завсвівссс ссївтїсств вссссвссаї сававраєсато стсеванста тссстсасва 15748 птвІТаскае анавеаїїни стасстстсї стастасвїв СТсававаса тестсівсах 16508 всстассвсс ввасассска ссесастааватє сстттассст стссссассє сссвсассте ї6ябБа їзасавсаїс зссвавтєса стттстввЕс сктттасаст їазсвттсвзаве расттстсви 1595 вассваватс їввеКістсв стсатиавсв сввасатсда вежжтсТств аїтасвеаау 15:80 сріваасниє СТсвІТввак ввасссктсВв сесстаєстт асвЕвстсстЕ асстсавссе 17846 кванівсісї сясвваавис звссасаврво Тасіврдаєсвс агнассаває авіатввіЕ 17ї88 сВЕКсстнсс ассазаданя засїсавнан віставвавс Сет свЕса ессксвстна ї756а візассствав ваїїстссас сіавазссск сіасвавстх сствітслас авсстввяий ТУ2ха атнкассес тасстсттси ссОаасвіїас аднасвассї тассстрвася КсссттсТя 17988 сваатвелає касткєтвЕвс ттасссстск авсїїКссряв кавававатв стстстасає 17348 сЕЕсКстКст ваєсссввраз ссстсасссаз ввразсеЕх сссастссссХ весасазваз 17489
Гактсввадви свЕисссстЕЇ їсатсавсск ВіЖсестссЄ сасакствнв сСаассассв 17450
ЕСТсЕКІКЕс вссасаїтїсс їЄсадсасає бваїсствсб абрсстсаїї зсвзасестра т75ха нраавївиасї Сісасізави вінсївсТес бСастзіскаї арааввїксв ваїїсвісвя 17588 дсстсвсаїсє Кжссасваса ссаксеавас тсибесевстЕ сассастаєх весіавевї 17548 сксаттствс аасвставає стТвстсствВа весіаїсаав взаавіїаївв равансвста 17780 сарЕїсєтакс касваквасв ТЕїввазвїс асіїТвЕЗаа Жстїтсавит стсвссвата 1У7658 сЕттвасвах ватазсввсв ссстКатвї ссвівасактс васавствск варіїрванс зов тнстраваар сзатвазнки вівассватх: зскавраїссвї зсваврасає твставртрв 17855 тазчвнватвва Сзасзатзах засласвава сезасвсве стааврісаис всзасврете їУзав їавіваарак звзввравав зеавакавае зракарараи зрававадак звавававеє 15888 свасрачасв СівівсасвО СКК ВЕК ССазвасзаз бдавзависвсв КВссВсВсЕ 1865 піссгвісвя аствІссвЕс вис ствіЇ яканааавіс сздаавевся весвсарсся ї82а стїастїзсвас свааввссвівЕ вавдавинса звсававссвв састісраса вебвстнсна і1ві8а
Свасстїаав саасствавеа всвавсвсас зівсаввива ствравситв сазвтсввеся 185246 ваїваврсав наситссарс авсаррваси ясавсазинав кстязЕвВЕнї ввісссаїтса їз аїствавсза вїсвставви ассстссввЕ асветвсвво асссВвисста вссватиссв 1513650 встссаввив сврсввсаАЄ ствсефеикх ЄсТвзартинт ваєсваткав звтсвтавтава 18428 весествста васнссазее азскввасєзах заватїтвєвеу сбазнссакє зассвтаата 18488 ззааварена варрссваси вватнстаїв сатвузТвЕї ств Сааваствав 185548 зввазавсис акесїсвтвЕ ВВС таїс ссдесказаз ассссзатєта татесввЕсЄ 18бав дасттзеКЕЇ ввсзстевиї зазаславїх свзаксваавс сзазатаєаа акзуазсавії і8650 гЕтататата твсстжєтаве астттстаєя ваактеесеЄ Сазааватає сстараааїат 18790
ЄСтвсвЕасКсх їстннсабвї заїатїКссес сСавататива втЕсіссаєс ссвесвасї 1875 їїазватазеї ввісСвтасва ссаскїжетт аєсавесесХ асівававтнс кссаакстс 18840
ЕВ сє аїаїтсасвї вссаанассх азссаазваїтсс Ссасатаксх Тесссваатї 18900
Тдванїнайв СсСсвасувах ссТазааїтаа асввазасавса їсазїтастта вЕсатсатах 1ща6о
ТЕВСКустає астївастас савасескиЄ Сазссствав аятдєзсвїс засвзававї 13050 тавссаввасе астаазаєза абсваасасса Сествтаїса авазавасссю сетатавеаа мова
Са тїааса ваїсаіавкнї сбвізаваза автжавіїтї Таствасаса тасвікїаєх 19148 їзісзааває ССвазсававо задаїїзава бвабасїсвї сізасаайда зааваассвра їз288 авастиссваз засссдвсав вассдавсся віссаавссв абвіввстнк Сива ї9иБО «ЕСЕратаїа засскавссз звстсрвісся СТтТвсасссс Хзвїсвтавт зессттвата 15326 сс сваваса стзссазВЄ засвсТвКса ататсссвва зассксвсай затвазксва 19388 всстасатсве ствсзатасте засбсазазе савсісвасв свасевсаасЄ зсесвасета 153440 сттвассстя авазвасекс севавтакта абавтстїств стариааваа вЕсСтавстає 19588 ватттасавс ваазиссарай таславвкавс савтваввтва їбвавЕсссе авасбасаєсра 15558
Гакизасвааї вісі сваааа ваасасвсяа Квасссвваа саавававав ївакатаєкти 19538
Тс стта васадвсасс сессставав азтвесавтх Ктсстствса тЕтавстатх іч асвстссст свісаслаза атЄсввасє зссексвена асїїсттств валасавсес з1ч746 хвсавистак сарастввкЕ кЕТТЕВТТІс сасвсассве зарястктасс сбаєсвнсєВ 19580 аалвссвани СКК ссс їавсїсавтіїс ссвастдсех зазівтатех збаєківзаїе 1986 їдізсвавас нівантасіїя авівасівеве авіввіїсїЄ ракассвати звзнасивеа 19578 всвдзаєїла врясвасрас втсавїтвава зсвзасссра ваввстстта вс теаватс ї1з950 стастсвава асвВЕсСССеЄ саданавсавсу виска ссв аассавзавая засасксава 28040 ззассантаї ссвЕсКсасвЕ ссабвсвяах знаазавівБвї ставваєссвя асснувассс з2о1688 танаєїттаза вавїстсстсв дарасссвясс стевкстівтвЕї асававстаєс азасвасата гаї168
ТЖЕсСараста ТтбввссКбв зсізавсфссє сасссаствї їтаствнавВї Сававаатав за асстрсвнах звасасвокс ссвавзваїта сісабсвассс сасазїтавї савадвитаї гавне вссавассави Сстаананся сасабстсссї свавіїїїТаз ївсасаєртя абсасавтсї 2034 задсвсаатїс зазавізаїн Савіассава васававаєх Севсзвастку ств 2о4в8а їавазевава ствантиаї всвїасвіїтї свВстЄтаавї вгрвавасєсва автттсссвух га4ва свзавівїас дласставта басасавуссс Сясзваїтвтає їТастствста сессввсвас тав
СЇтсавійдва ствстастЕї астасватис ябасрраїтяс аїсдантстїка втатасвсаї 293558 ніссазатвс зтнсссїкїВ заасвтвасв вассасзаза кзрраїссас зсававсасах завБай сесасавстї сегссатсвЕ тСтссЕасас авасанавса ТттТасвасз аттассавса 2а7а9 асевсайаєв асзавсзааса сїзсваїївс асстасаатєє зссасвссаї квавтствсх 287658 сазсстстсв Ствстастввс ссазвавсав їваекстТвстВ ТсваТвстВЄ ТЕСТ га3а встаїстістї ствстассва стстаствва СевЕвасіса авсстаїстс ТЕсСтвсЕасЕ згавва азвавістсс сістсвіїва вісісствсе ссбсттаскс ССС свсбтассЕс чай встассвсв ЕССствваст свсттассеЄ заавтвєссс сстадавссвх Сазпввасає ло вассссСссс сСбобсвзавес Єсссасвссс дсссасвасв ССС тах серастсаве щ1о5о стстасасих вссткаавсс сЕссбасвав всссасвева асазисастс сесссввива 138 засесксаса ассстиестсВ зассвавасв встазветсва сстввакссу стаєте 1388 заваїсївсн авіїсатена сессттсас вснсхТстсз знЕдаавсвї базссавинх 1740 ес сстсс ав ссвзссв ссасввассу віссссвеаза ссіввіївезї ввісвстсвї 21300 всївстссзн вівязнаїнс стасстстеЄ всувстстсвз встсттвивї тсаївтвЕвс і135а асисасвсест астасттсву вЕствсКихх стїсссааво зсизаларає сварзназак 2148
ТаСССТЕВВЕІ ЕВЕдДаВваса сеттасссав асвсваатаЄ сссзвЇТссе сасиаассї 14 стссаваств тез ссткКК стастетест тссїсеттасс стазвтїсвї Свсссавкїс зіхав сксВітВИ зсавірніїас сстсстсасв ссссїсвиаа всссствста саїдаарсас 21605 каскстєста зніваїзавв вссвксвсса СвЕсврасараї скаавразва завтвтааса 21660 2дасЕзеТсс састаєстска ссвставсви СТвісассвє сасататває засув Ма ттсясавстт втсвіваатТес зівїваваст яставевсвсї васссївстх всяка ща засасістсс ссзіссавла ссосбстнссва СсСтаааваса Таарасксує газасваєта 71846 заанваасаї азстасзавк савїсасссс саскавсаа ЄХабставїта стаєссвсв г1599 зтїзавазаза сасстаїтвсї васссавсєх радбарзаса аїбавасксї зрестврсаре ків
ВСЕВССЕСЕВ втсссасрна ессааанаєє савасакаван асставсзна звсбсвссвка 22854 завасіввсв васаріїсаї зсажарістс їїасвасєса аївасаврав разааїстїс его
Кісвасаїве трвайсасва сзсасіївЕс Єавстссаала асаїсзаава їасадестса з2148
Каввассава вквсааїтра сесєтхттсвза сававреитаа ТасЄссреава сстсстсвва загав сТссвссвсс сваєтатстя ссассссвії відлавасаи Тввааванва анвсввстсс заява тТасазваєрсс аїсвіїксяа тазаввиаав вссвссвесе заваїрсссс Срссвасавії иа ввісєсвазе аїввассссс асссасваве зесатсвВсре зазазвзара сЕбсСссався Жан И всрсссссза звсаансвЕв СсТвасвІває асстссвссв асисаванева Свасесасва зада
Ксссастесє сстсвнсааня сескссстсї зсасаввнаа вссс са Сствваваря 32588 зсзсрввдна сівавіїзаа Таїравсссї взиаввсвтс стрїсдазах савасствсх 855 асТнсТЕстВ зсесвиссвс Твіст свес ассвіваасс азсізсассва вас тасе вавеВ вітвасіїсв даастварсє Хсаавстсстї сазравтівра сязїщаїсї сварарасте еББО скаавасакатї зессссянс сЕТТЕствав вставте СсЕстВеТвЕ ватсвсстає 22740 вствиВссХЄ рказндстав йвасесттас ваствнаєти ттдавсктає сеїттаведеї 22388 ксасаслвяє аїсзвиакасї Тввастсєвва сстівскестКї всастсвостї Тстсазвнісї 23860 есвнаввсїс звввастсза якссдссЕсх вствісаєсе вастссства сдасссткесх 22996 віїзввстс: аїварвстсї ТЕватасасї вствванрав сісттававє тистнкатає дано авксзсввсв васввсатка твісввасс сЕвсааавав акт свадсє ссссвеесх 23948 сстТарассід СЄзваскеврі Тасссадвіс Єразіїївся Сраїсвстсз засаєстввс 23188 звіаварії «ксСавваєсе зассссвіКв ссввсссКяєЄ васваєсаєс автаїваттєс 753160 ївіскааїса свісзввсзї візаснаїта звсзірівесн саївасвста сссасвавах ЕК вва вассзнавсс ссвсваєстах зсаїїїавса сЕсСЕВізназ авсааааках зва здсисвЕсаза сбаврасава стаїсвсвсв сврівтсаєс тТасектвста ваїсастаре 23348 ваївіаснит їзаавссасс ссвиуасзії вазавсвТсс всвасвкисх зіва 23409 сівавсвєсв аїїтеіїтвас ассасаатат аїтсстиссає савссвиеса асавстсссс 233468 вассвЕсавс тсввсасвааз аїсвссвстс вабасаввиса всссатсвиЕ сс 3512 «2105 З «2115» 25787 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» рбА7/-щшод С нуклеотидна послідовність «4005 З сстВтввС весаїрсаса їасаватива свеаасвната аассткттса свосстта ща пасасеєскаї сассстаата засискст ссставве Ссасссвссо атаїтаїтестр 128
Ссавасассе асавсссаза сіврааресвв вайесвасаа СсЖвстаКсв вакстієссав їва їсазсвасесї віавзавсввЕ сиссссваєс тавтазсата ваєрасаєсв сасвсвасав ва
ЖЕсассстав сствсвсвст Ва КвТЕ стстаїсвсвВ Хаїїаваєвє зтааіївсвв зва вастставсс всайнаавссс аїсїсатбавв Свасеїсвтїв саїїасатеє сСавіївїтас 3168
КІКсттнвсв Тавттсваса казваєсасаї вабвассатс дсаадаксне савсавивх 428 савієттвлав азастітасє вссаватесї Хезасвасст вссседавис рессаастсв чва завасїєває сватсвісзе Єрарссттсс сарсстстсс всївасисве саврінствес ва саасттєвІс радестессе зазесавссї Тссававсасс віяетазвав аврсассттх вай завкснавтєс ссасстстта дсвазарява сСеватсесст Сврасасссса вЕссвсссеа оба азїкївраввсаї зісавввави аваїрвсвиз їласствеса встзаветає ссесатаввсс 22 звїїавсвтв сссзскаваз веатсратсех сзаасвасвїв аісвасавсв ставу авассс 8 пЕстаанвтв сствісаває вразсазсви веавкїнавї тканина вавзаврснав ца скзаввависа сзівсависв віссявсТТс сязазвтвза ссвссввтая рсавсвевсс зва завранівссє пвізвсвавс Сваїласар свКЕсссаас засесвакза всваровкес зва завависттс сЄсисанітс ССС сстна вкасствссс зкнаскварае асвіаняссе 1459 звзаввссїв засрарджаиї ссанаансва савднансваз васссвавсЕ равиїстад 1058 ссснансісї зизнавісєсс ссвввіссає свісстссес зесвесеКкВ вавазакссв 14а севсактавї ввсассзава Єссасвісвс вСстаавсссс стваввввисеа всасввсВсо 1398 свиасвсві стірниїїссас ябстстссво Свроізваван Сссвваабсся савзЕссакар 13688 «ствзавісу сссзіссесв сСзсзсвраїс сЕнбаврава Ессвівісєсв состав 1328 вавсссассс всвасставеї ссваевазан сяссвіасяс засестався зікаїавввЕ 1588 згссавснсй сасзававсв всїссвавай скававсзеє азвааветсс зававаскЕх ї44О завсаасеїя весвасаиаа весссвзава «сссвісест сссзавссв всїстссасс 1508 їеакскаваїс сісвавсаса внавсакссї савасісава СстсттївзКс Єсавсавнтс їізе8 їзвеарнсав ввскставкс аксктссзав соттнавасї асвсясисва вас ква 1629 вавкстсзВїЇ звсассзисз ссавіТвксак сзавсвскта кавезвісвсв ссїссвссаи їБ5Бна ваївсссказ вссвжусаск їсятасссве саїссссває сстласссвї ставессска 1748 зивіздсакс зазвсїсясра висісзавее ссіїаакаєс засзквашсв втзнаавсах 1558 ссствнсасс вананссїсва всанаснаст СацасстввЄ візнаккаває ссадванаве 1560 зісїсссвіс ввіссісанвз двасасаснЕ свсвсснвих Ссвакасве таассвегава 1328 тріавствса зівсївсссеЕ ЄХеЕсснссе ЄтТвіКриїлза їбвіТвсаза зусснзніТе ї1з86 иссонекіссв веваїсстсв СВК сЄзассккесЄ Себассваєв зЕСССКНеТХ 2840 ївавслазва всдайвсява свавсснасс бвсадкстат заавванакї Тесаєввсва ав їсасрсвсза ївасвсвснс зсвсасекеа СТЕК тесті ВаЕ зЕЗвавнсес 168 тїаиВТВсЕЄ кзавреаесв йасазеівЕсВ завававаєсз аїбстссвсв вссвсВТЕс 2270 зівіясався Гесавставї всбссввсвк весатсктає взваснаессу ЄС вазавс г28а азвиїаанза стїаастхсае їтававствез задизавасв СссвставвЄ сов тТавав "148 яЕвКатвана кВсКссссяс ввазавсссв станссвасї веввсссває вЕсстсваЕї 2400
СТгсссвдва вназаствза вескнизавс касватствс савкїкваєсЄ сссавісасв 468 асВіївсава асвевсвскс срсвднанаис Ттвсвессис вЕсассвссс віхсвастся чвеш ваїсттсєсаз ввсстсвіст ссваніссвс ТЕСТТсСтсвс свсвсснахс астессссес 2588 свссвасаан всствтанії забавнавіс асбсзвеват Єеїваїїсся весавіадта 2540 автїавізата їавбатсвех втзваїтявївз ТТ сВСЕ кризи вавсвсесЕ 27ав сіВЕіКККТК ЄВС СВІЄЕ Євааавссссї равдватаві свсарзаств ССС васЕ туУао сКкттсатсстс Ссвавравста ваксїнерта заравасатє сасвсаїтвна Сабриватнє 520
ТВЕтсттссв аїївЕаваХї аїтттатааа абстававтї саїнаєттва зазавсясаї евва зазаавссаєсв завтїсасва ТЕСАЄсввса асХаскатяса аваїїавсас сассврктає 248 сввстсвіта сасвккссс стсесссссв СЕС св а Своє зва аїївсастаїа СттсассетЄ вежЖетїтсвзе втсасатави сттвїкавїї зассаттанї зава вавесЕтстс вресксссси Ктвасасзиї автвстетсс сассттеєса авиставана 3128 заксавсскї ссзавсассв Єавїазавади всассссита вссдавкссс своеї тве зіва «ваварваас рааїсттстВ ставсстсвав ВсКеїстдяа бваврсвса ссаввваава зз4а вЕсшЕсКВат засксвасак ссзавататс ссазсзавссЗ вссКасвкат сссстакаає 3380 квіснасесс засвесвтва Єсвзасавсво авіїаасссв авазавеХис Таїсадасв 5558 квасавсазвеЕ ракнїкакта їрзрвавізи знаавтнанс даааакитас абвтаансев зага тссадОсїсс влаавксвзас сассавсаак сввсавесса звавсвісса всавкавест заве сввізасярно вріїстансе зсазідзваза скзвсаїссв зкаавсстсх бсвтавКЕсх з5ай тсстасднад аасєствста веЕткнамаз сетакатстсся ввавнсттствра асазкааввс звав сяравеїаас звевасвааа втссавзвсттЇ раввсставс ссааестста ваванакессте зобо хаввістякх асссксваса йсавітвссва аздазавссає азвслввактвВ втатсавнах За ссаїассвсн гсслассєуХ Траввдисав сасввкВсКе вебетнсвїс ЄввсЄссзса зва
Їстсзссвра антадававЕх сесеввабссас аввбсасавс стдавакстс ствЕссасвї зва влюсараїсс рисвазваввав тсйсвіссас ссткаївісв азсссатссв саїтставсес ззаа кваавайавс ассрсазаса зсавзавнкаа бвабЄяаввета сссавсвіас абазваксав зз68 сіссвавяво вазвтнізиса зизавсісвя ввакїстяса знссвсасре нснаївевав 4829 всжсрзавав Сссеїсїскс сславоссан сасессатсє зрсєназаєсс ссазвесатав зава цвесасссс: авасусаває стстбвассу свавсаввісї авразивсвааа яссстзансв зіва сеттссваве сеЕтевиаЕНнИ сесаїтвтвнА ІТС твав ввсстсарта всаїсвисає аа сгайсвВставс заЕКасвтак закассасав асссвссавв шоксттраве сКавісвсах зіва квсвстсвак вісстсаасс ссавсссвтс савтсссвав зртавсявса авестсасває 4559 ксїсавнаву сіїварахсв зсзврадсвЕ Сзрависаїс сгібвоисаїсв здарссссви 4388 сванианзіїї здзсстввіа авсеизвнаїс сСадианаава Єстсссаїса вставав 448 вЕсасаєвес азсквІЗасЕВ Сзаатвтаес сЕїаасвсТЕ СТВ ВСТВССЕСя аБ5ай
КЕЗВЇСНТХЕ Сзавасєїваї Сзавтїввнта СТ Їсврваї квасависваа всавсватеа аз сВІТставих єзавтваснЕ ВВІВ ССи сарсеввида Сввсвазати ваївсснсс 452о авсабваказаз свезвеквоаа вевВскстсЕс вссвВіТсЇКс авіїтксате ваївсасиди чека секснкев їзвасасгріаав сзаржнсвзаї казшсвсвви сс тсаа дссссзвавЕ 4748 ввасасвтнв всярайдаан аасвискабн асасстваїви авасдессвї сізнЕвіКаа звва їстассскВЕ бкаїтавтасє авсвсасКк ввссвссваак ссстссвасЄ заствсзсав зва авсесїсзвіїЕ вріаїскакї згтївиссах зві ЖстТвса авсасазізс савнісїаї 4328 такаввенав асастасвнає авіїїсваса Сзазвізаїзв всі їзаза сіставутату 4558 айавєстаїаї зсзайнсста ваавіїазаї Таб та астрсвавтв тзсаавкїсї зай азавевнїта савіїассст бязвзнасвї застстиске кааїссваст свакесвсх зіва саїсасістеЕ есїїссанЕї сбавсствак равесесссх сірссавава асстезареса 5166 зкзаківааї їраїсавсвс свїсвассса свссввассв Ссазсссвсї ассассросе 5228 сввзнасссс сао тсває стссасссас сЕшізаваав сасвенвнсая сссвсассяс зва свссовісТр всвідсвїда сасставева сствесасне варасввсне асЕсвиаТес 3348 звахкасеяви зіаїгавасв зсаввазася звссвавак зссасесває всанвасасе ЗАОО австсассаї сСвасвадава ссаеЕраваяї сасазааава всвастстср їзасстетасв завБа звінйсасан аївржетстис стсзасатає стстзасвс всвзавеств сссазсасеХ з525 звсжвссдна зсссвисеКе казвстсвсва стствзазва саввснсктс сс З5Ве їсвсісассс есіввасвсс свссасвсва бввекЇїсви ТсяссвяЕс вссваквасс теза асєзЕскївай всїтссабеви абраниїсттє всазізвисс ствсісзаєв ссрсвиввТЕ 5Ува зідеїївсва віссвбвасс сессесссва сві твсе варссвВєсв Вася ЗУБ вЕКснавстсв Вссвасасст абавааресся Твзсвавзав зассазаває хсттссстаз ка2а
Твсікїсвсв знвосїсвви їсЕстатвва свЕїсвеваза сексїстева авкваскадя ЗВО скКсастзсв сасвасрвтв аваствстас ссвісавтаї азвкасравна вассакствї заав
ЄсткстроїК ві кірраї Свасскваса свстезаваз авасесрсво Ссрасскся вва аслстсаван аїсвасттсс сестїстссв вкавтаттсв ассваарекає Євасатнина БОБИ ризанстісав Всістазаре сстсасаабе вайсстнаяав заїссєсваса авсстазасх 6120 вазаїсказе єсваавісасс саассвевнав сстстадатса всзвасастс стестссаса Бвіва кІіатссватс аїсвтвсасв атасїссгаве ївітЕсовавс савритакствс авеставнад 55248
Гаввасавав ассісазасв їсиїтТрЕїнї вавизвнісвї сЕїсвивссї ваївраваєа взев касвіаврасо ссввсасваа вастствази сассадазае вссадсссзе васаадезтс Базва ївстатссса астдассест свставтссс азвевсстскс азвстзварса квавддивнева вага твдїсасаав аставваїва сват сс аасеснавсо свЕаазівсссв сЄвиствасеї цавй уст тавсссс веттссвсВс СЕС та Стасрсїстк есрастатниї бакжївсссє о5аа свтссвсасв стсваквдтв ссставеана СОВА вАЄссссати сассиравне Ба стєвзссстаї савстназаан Єсваинаєктт всссєстасє сваїїсстай стеТвтааає пева нізівсясиху візасвсвса свзазасвсвЕ басссазакв асбавевавів веСсЕсвава Б7га ссрасцнрав зувидавсав застззанахє набнавсясаа їсзававасва зсссваавов Іва сТсттавнКї свзассстатї ссразвааїтво СССсвЕсляая Бакактввсв акт тваасс 840
«аввадавсв ЇКтаалазнас савівсссвв бтасестссві всазатсавава авсввестве вада ваїстТнАсКЕ ЇВваттттака сттазаквесЄ стсттзараї тсватссстви ствсктасаа зей авствсваваї детбтататіїї авассетв дссозаста васттссаст саствтттас 719 тЕаввітава вазтавассх вскаатваавс всаїссссва вайасастса вассессака тава віїавтсара вевізїрсса зісававєстя аразвсасниса ТТссстсазва ТСтсзаїрса т143 сасасавтся савіставса сазєєсаваа абаасетавї есїаааяаса давайте 72ва квстЕх їввсдссайна зеаавастав віїтасасеї асассссакї ТтТазвсвказ УЕва звассезавїї їСссвісвза абатаствавї байта тата твсїіссвсв втетастаке 238 крат врсвассстс акСеваєтас састссасезЗ свасетвтаєЄ ввасвсахна тва віїсвавсаї авсасахвсст завсасасис їв тавазс всаасвеасс асававеане тада абссвізсаз атасвісїтса жаксстссТс састаїттсс срасасзавс аравсаттсх 75 всвасааїтва ссавсзасая саавсзасва зсавсяктає заїтїасатїї всзаєсассв 255 їзссасввсс сХатсвста ссскаискнс сссбвссврдя астсттвиає асисЄтасстав ТО сласвтввсх аассствата бсссаВсТис ЄвзиававеЕ ссбвсссас Ссаїрсавве 2588 гранівствв квасстсаста Есеразстївї СевавЕавссЕс стсітсвЕсЄ астссвивав 7748 вкевтзісасте саквасаває стсвасстЕХ сврасссвав азсистатвс ссовсссасаа вва «сЕсссассав ассстсттсз асвзеЕстаств сзсстассте сбсвтсасс стєатарввс 7868
ТсзвЕРастє внареіїттввЕ разавасатссс Твабасвасї встааЙстстє серрааїстс Т9са їсвевїТасс Сресстсазсї зсвасзасва втасвіївай сїїсЄсваса сстссттсаї зо ввїнаскади авраадЕсси вссавссїс ССбСссттсас аїссвссаєс асвсссстсу кода сасстввтсЗз ТевІЖсВЕсЕ сСтатсваввстї сваксестех ввзеаїтнст акт свваЕс вів
ТтсІвстває асстссвіврс асвсваїсат всестсттає тТасдвастів СерсСсссвЕ зів шпистазвсінЕ їісірвавни звівсассвс ссаратссав есветтсаре Сствіасссе ваза ївсттстсве Жстаїтствсв севсхтасвї хсвезатасс вежбсствас Єсстевсся КН їсаастстре ВЕТасрвїва асясвсссвЕ Єсссттсвсс вастїсєтасс вгаарарята зай сеавісїває нЕТвссдари зесавсвеяса анвсесвснв сЕсЕссВиВо сЕсеВссаЕВ 5400 увасзватсв задкзадава всасзасаав асвастстссв стастсваєс вссавсвахе або штсгатївїїа бабаслятна сВСсакстх свсавстТаєЄ сеїватнсвї дтвавастає п52а засасасєтїав бссїасксвї сябасвасва свссстсссс асссаннх сссвсааїх 8558 їзазватата аваткстттса заїрассааа звазастатах атака зсезстсста 8549 сїаасанаку азкбааєтатх звістсасеває сазазазаасв сттабассва сс ства 5700 зівкзаєавї Савраїтстає хсїсаксссс ССсСтаваєсаз зстбавєваа сеСЕКСсЕХ зва зїїваКЕфїсв Сваарссаве ТЕТТуВсстЄ ВС ївавв зкавісвсїє асвавасесс 82 зІвссзвзас асбавстасв свтхзсзсвї авсасвсвис сисрКанавї ССС ника свссасству свстсссттс авасвеєстстаа вавЕсттстсї стсасвисає всзсвтвсаа Зав їсзсатвсвї всабтнсасєта ССвсасеїра Ксросаїнсов ваїесссс асСавсссаса зво заессввсїса їссвсктсас ст састсв вассаааясе саїсввізсаз васвараїтта зоба зазасатаса свавнатсту стзсвасаає Сассвасзає засавасаас ааасавсасх за вспзосвовї гбасваїсає сабассвсвс стссаврева сте сассст сабвсівсе зіва сс СсСсрс КХсаасутсвс вазВЕсваса сссстсвава всасвасвав зваввеистсе зай їХзісвнана Сарресттає ваївЕївсса ассссвісаз вавасасессє ввеввавава 35 тактвссс: ссзавссвва зсскатвста ссвасвостз сазвсавсєс сасвосавах 355 стЕстазввс Свасвавасв сстаавтстс СессЄсстсе Ксствттсас зарввасасє заго сіссланаав вествасссу згсвсіватЕ сссззВавїї саєсвадсва сстраввсїв зазна зввязвахнус скавссткст сттсстсаїв ЄСисстасав асствсствав вСсаєсеста з5аВ
Тнеаівісвс тнвінсЕнсї сттатстквс асвдаєсзсає сЄснстврвра аїсвстатас з6500 стЕвавнсІвВЕ ссзеЕввазва сртввасвис іаствсасва пкетрласає свесексеса вва сірвЕвавсвії Твстсссває аезЕстатТкс завттвсєте стасввассї врасетЕваа зга
ТвЕссЕБІНс ЗТвВІдВсВс аассавксаїта ясазвсавсса Євотбасїсєстї саваавсятес зва зневсЕатЕк ТнвесЕЄваЄ ассстїсстс тсЕСКесТКЇ ссестванана ассвсквеа зва зЕніївавсс Єссбвсїзін заввссснЕс ССїссясСвсз заставок Стсвсїсств заав стассвстск ССС ства сЕве зве зсКХ Тсатествва сасатвестсв ззва вЕЗСставвсва стасваствав СССВсСсаЯСес їсввааїсвЕ зсасвнрассї вісрратасс зівага
ТЄВствства стВсвЕТВст вкасасВКЕс севсКвсся сот тас вітсарстсв 1ваве вавстатиса сатсттссво вассссвкте сЕтстсатас Єсессксссї ВЕСвІтваВс 1п14а ствасравса їТвстастсив ВЕскаетаке стестазсса скастаєтаає Тест стссає 15288 сківвірвся свасбевЕтвВ вівісЕсасєс ссазссасса ваїсвадсас свсстхївсс 18980 сс таївсс ссвастсвна савсссіаава ссвсссставк акстаздсан СЕТТТсевиа 10358 звсасввасЄ Ссассвсває ксХававває зсскснаввс їабевссвас асСсссвста 105850 зссктввІза срссвсскат ветсствара авааавасреа візаєвакає свбссайвсв 10446 «свв саяся завсстссса занабївавіс ствствесек їсіТрсвасв аЄсассасає 185858 аеЖЕЖЕЖссВТЕ вавїтасеєї взксаснїва ївиїсСавсаї нсзатвсате всеїївкїїа заз сЕзЕЗівЕвІ сії втвви зизКЕсссяс звіїатзсвї Ссваївсвсв зтадазавасв 18520 звавсасвЕсЕ свсзавстай сзтвавттвх сесвсвсввї вісажєстаке Єсвстараїєс засне
ВЕЕсвасівна завтсссваї сабаЄссявї ставттїєвис сСтритастна візавасава 18748 ттсеЕзассаз вссзазасає заабататав СС сатата бабвссссса аваст а 19599 тараасттїс С(фТсзвававс асстававаї аїсєвсвастї стіссснвсяЄ рбазкактїс завев втжаласСасв азвтвстсса ССС ЄЄва стгтадасаа Ствеїтвтає вассастекс 18325 їтвїсзавЕв Ссастазавї всвїсвассХ сс ссататтсвї зсвссвадає 18958 сівісвааат СсбсаЄвсве с Єсвва СЕбвравзвїва ваєктсезїв абЄкаваатї уї10о48 зазізвдавсев свісаттїасх сариївесат аїїваєес атасесвате аставнсстЕ зав вгтзасїїсв заавївїаса ссвасраааа зставісава свастаавах зазтаавтах ль саївситтаї Єварзазатх стсстаєзав засасктстза тараксасає всссЕкаваа 122а зазваєсєнаєє тїтастзаса сатасвссса сттаєсазаз ассснасаза всяаянастаа 1288 вабавтаїтс віствзасаава яазазавасса вазааївроссв звавсссвис завасскаас 11346 сватссаває сдастаївисх ветссрихтх ваїїєтвата сазавссвває савстєвнхс 114па гаттхвсаєс сстзассаста акавстєсаз саїсєсазва тазєсастазе Ссаасрссех 11429 сзасвіссїв взавісїївс сважвзаїс зазиссїатаЄ несївтвася Сеаасстала 11528 зЕсВЕстсва свсевІввіїа зтатетазїї сасствраїтс сзевазаавта Скксаавтає 11589 їзатаастхс Сестакказв азевїслвех зсвасстасз весаазвссав васасзаака 11548 ассатазавї ваїбїдлавсх свазазвсзїас рзавнлясаа аїаїссства зазваасасес 11759 васвасїївЕ засзазаваа звЕвататаї стек ТсТ сТезасварся скесстсва 11752 авватексви ТтІСсссухв сатвтавства ЄтТатвсосссс сс сасаз ваассссвеа 11829 кіастаїсвЕ ввастєстістс тТрзазаїзає раїакаасєс асасравсаї ВТС сса 115585 тесзаткуся зазассаава засахбасата сеасзасактс сатсавсссс те ц134а таітасовтх заграстстав ззсвсакстє зЕбаєсссвї сссбавсовсс Таврсавсвус їди
ЖСтатаснаї стсаїскаїс вссасетсва звассабясзн аствствстВ сссствваКс же стввсатсввс санестКВвВо всснсасТеЄ сссннаввих ссставсває ТКС ЕТаКях 12128 їкатшеЕваєс восстстсавес ссстЕствс свсссссвстї вВостТвЕватвКс седесксате 15189 тжвссваВЕсВ сасвоїссвв їсссствсаї вівсвоксве Ссстсаазіїв сттазваїсв 12748 тсвсзвсавс твісвазввкв стнвсТссвО Свссстсстс сасввосссе вБТТЕТавсав 15365 їавствссвс свссстсств вас сасавезасс всснаатааї ссвисСакває з236о сасасвавса ТвівсїїЄса гас Сза заззссваараа зсатасаєва са сяєся 2458 якскКстсвсї сжежетстст сесбстстеє сесфстевст «кетстсїсю сістттакв 123480 савссвстас астаясссва звасасессса їстсессаксї асстеЄсаєта єссяєсса 13548 зкасставсв втЕссКККеХ аскатетсає затсравссве ссстєсатсв видтассстїа т25ав ввсттсзстс савсвСнї всавЕссасвЕ аасвівіасв сассаїсвтв вісі сзасе згава вастввсазЕ всстссзввїі ССїссвнавв сівасссвса сві ссСсавкс вВСввісВ 15958 їавЕвстскс ссвівасссї сіїватнсвс ЄсвЕтсавсжї ссстансатв віввазбевв 12788 аіссїїваза сятїавіраїтв явксаситав вісїсрасра Твссасвраав дисевктссе зт2848 зЕДаКТссВва ЗВсЕСсТсСтатс вастарсвиса вовдсассст Кавсрвавих ссастсскев 125388 нсгзісвтізає вашксатазва авзаїсвЕхн сВссказвна зиКЕваснаа засваерссаЕ і2че5 бвріївзвсаа дЕзсссавие всарзассаї всвазгваван гавррссавнаа Кссвававке 13858
ТТвізарсви сесазасава зніванвяїа всванваїтїс сзараєсвва заразсизів 3055 тзссавтавт сссісствіс давазсзвве стзваанисс авсвнтнава стсвзараас 33148
Старазасас садвесаєве СТВЕссавів всріїавіяй сваресвази зравадтсся 13286 ссавця вваасвавав авсвваваса вавіаваїви вравсттссіс врсдататся 132650 їдаавнства савсїївесе СЕКСІ застсстісве свЕТЕТаанв засрлазасс із398 зїівжстстви ссасеївісс врївисссїв ТвКсдстїак саїяанздаа сттссввстЕ 133850 аветазаваа ссвівзасвнав адзасеврака зсссатссваи срвтассвїт авсссасесв 13448 їзвЕтввава азисакаатєд сссвсвсссв ТвЕтссваква сссаватссс взатссввпав 135883 савраввтаа акавсасрта адсадассав всвескавсс тазивавйттс дітаквеана їз559 звавджваївї звехазвісс авсеіваисе зіавсарава сарссвснає зісістсасе 136728 авсиїазваст Фавасєсссас вакзевтстк сСсрівасваї всствавеає авсесказее ізн зівксстора сквВтвтаакс тивсасстїв заласеиїтсс свааритаєс ватавснес ї3748
КК ТвстКсК Грлявраткс васвстстсса вайсвсстда сЕдісїТавЕ зиаїссетса ї3вав авдассісак зсСссзвасасє ресавссвсяЗ васасдаствкї ввЕзЗассика азсвснектя і3868 тааївЕсесї ТБЕКВСЕКЕХ КВсТВЕсНеї загс вів вавсїїїтре сресвасЕвие 13928
ТЕС тзарв свірававтв зеїївтваВс свікївасее всссввВскав ассвранеахе 13588 діввнстас асояснказна сстдаввазів виЕссвїває Себсвассу всзівневста 14049 сасківвво сссттевЕсХ сСвсавсвбвиї встаїїсате саватвсаве сласасатаї 14186 асЕвіакссу засзаєнсиї ввивасвсва Сасвссваву зЕСстбасіза СССТвисдає 1мев явсвадівса савсссвваст актсстасєтсв вестсссстте стссзасссв пато їв аскссстсак сссвЕссніх сеасасссаса їссствавеи Сяарасадая Кравс виси 14288 дссваававсї аазвсватве ататрясстіа сасавівсзе вассаастаа свссраввва їа540 заатастваї Кстстсазис втасвнасала вшвсазаїва сетарісасс врзасатайх 14408 паакаавнан Срсавависа звассзазаз зассавстах нвасеасссав всссаакв 14450 даавсатсві сабсстзвІс ссВтТвассвЕ сс сссссї встствеВски здавессстЕ 14520
Евасіївасва взеЕвссеВТХ вввасансав абссісаєсс звеассввсє СССстнВЕВх 14550
ККсававтсї Ссвтвесясс нтстасаєсх зіссссвкса веїстваава Срастсстса 1935ІВ скзссвасивс язані Тстазїсстас їсствисттв сзабасстве сттвсзатає 13788 сівввЕсВсс нівсасваїн абтввасасє втввавдане звів Свсс касскавзиєе 14759 тсссрисїве втвзкКївас стсваїстсз есссзвресї віїввавктї бсаввїтсс 14828 астЕткаанс складав К ХвавстссЄ сссасвЄсва твесстваєЄк вавсассскх 14855 зазнавав ваавВісватс ставах валятсвайв свсасатстї єссвасвї 145348 втссавісва Сссавсаеасе азвсзеазна савнЕзасех єжЕсекасттий састдасавя ї15882
Тзаїавтссї вссиїсаїкс асваїзасвЕЕ стсріїсстє сааназревеї ЕсСссвасає їхиБа ссаїтавквас ссвзавсссс аївлавесає Саривавива сесукЕВесс есте сах 15128 вЕссжїсата ввЕрссавсо варстскссе авсбсссеїсс савсїдевктеє ксвяватате іМщо сввисвЕсва вітасвЕаст Твсавссаїа ессссасвик асбвевсадв авсстассЕКе 15248 завасісвіє Ксвіввавст їсаравсвВтв вссвіїсвЕКа дассваїтває сваватосах 15303 сасаїтвасве зсвжссавів виссавсваа асказасаки ааревсста сксесаванї 1536585 свсвавстсс зсассвиатї ссвисзаств сеівесЕВВс акесТКсвес втатавава т5450 сатвІївавв савасссвіс теївссаскк втасвактаєсє вакавїжнсЕ ССС ТеЕЕвра їі5458
ТІСтсствет стстсвВЕсва ТввідаВвстс вївісстаса гсетаїтвесс їстсвасвтс 15548 вУЖТсствіс агстратвісє ссвісасств сабссвосвтв свссвсстсс сеЄресавих 15699 сесілвеівї саївсасвсс ззаїїнитве СревівсЕрвс Свссствтвс ТТсгтассва їі8БЕО
ТЕБЕТВВАЕЕ ЄСДавісстве вБЕССТесвс ВЕсваївека ВіВНЕТТвас ВЕСССЕЕТЯХ 15728 вявЕсвасЕВ саїтсвяссва ЄССастЕс встав ссстресаваз авасзаєсса 157856
Єглраібнди зссрвазасєе вкавснаїва васвжаттая вісавастсс засававтта і584а сатстсстза даватавтсвї засссстуса дастттавтяї азсствсвасї азааваатая 598
ТЗ сТКЄ вкасессата бабавтесста асааставвї сСсваєсасєт тастасесах їз зісдааасєта КібтвтТасвсс їсссстства зіавасттвЕ ТаттесвіїЕ всадааскіа ї6ога тавісаввіа аїсватастє авастваавії Твтвсавсєз ассвавввеа хевасрисся 16080 заасдсвстя ктассассав ссевзаєсакаї ссвсассава СвЕссасттс сассзасаєс 15148
ЗЕсЕСсВТс СЕСХТстВЕЄ сасасвіссс сістравасї сваварасас ствсасетса і6х8а
Ківсссттах Тасвскстас зазасвавас ссатвсаксс вувсваасси зававінасе ів: свевалсссї тТсссстссяЄ ТтТсесаквів дсвассатсс вкктсасеат стсссвесах зез28 зазакасссс сзтсасттса ссетавнаасаї саСкастнсх ївсстаїсса тссавазнаї ї5388 засссвссККХ зсзасзасса ссзаслаєза свзазсяасаз асаавсаєтас заїхасвіс 165440 зеввіїасся бСассасрсса ссбввсвств сіаарсаває нивавсіссї асїресвсус 185985 зівстввівї Тастваєтсї сетвсЕКсса ссакаладва СТеЄсвстває авасссеаїс 155658 їсвссвссвї Сроавеавтссї віттасвасв ставрестт савасстевав сессствате 3і5628 півстсат сВЕуКЕсСКств ЄСсввавкаа варясестає Тваврсїссс атвряякаєс 16558 зізназввс СТвЕсстзав СстзвавтвЕ ссзваїссса систввасст ство 165748 стЕаЗЕВаВсс СВСсвстВсс ватдавенає ассттсвасу ссЕЇВссввЕ ЗСсвстанеа і65808 тЕнівссттс ТВ сХ вваксевсте ствоскТскта соввастазв встає їБ80о
Ессхквватс сдесВЕсвеХ стане зсакВсткта сестдазав адвастессоє 16955 «ЕХстаєсвЕ СссСтввасвн сЕСЕссвске ТКассввтс хазсаїссав саткаснсїа 159558 зассвіресвс стр стазя КСТрсТсстр ттавсстсво сесстреасеє трісариаїї 17948 врассвваврае зЕстатважс «ств сиХс ванзвсасит сествтвсає сасскссвся Ттлиав «Євасвасвї тдасвзавкає сстдассааа зевсссасеЕ ТЕСТСЄЄЗва стсаавеста 17169 стввтвстев вісзвсстатн састввсєтє арсаїстеса состсквссє ввтвавасєта т7а8а
ТЕїВСВсТТЕ свавстскв Сссстсваса сстссваес свЕСасЕїне сеїіТевиаве 17258 нівавсскас стстсаввсту встіввасаєс тебстаствсс ТЕСССтВсЄ стсаадстса 17348 сетсствнвс стакеїїсвос вссссвесєс ТСбассствс сс ссесЄ сасбастнеєк 17469 «рІвтятсве твстассвїЕ асвассвват сстсєасст сет тестах 174ва ссесасвассї сварки встссВтто взсстивеви акстатсяст їстатвастя 17528 вавВівстая сстссусазк зрасзавосв адаскїссоє сазсвссвиа вЕасстеске 175850
ТТНетасТсЕ тазсквснва сссвастаєс авассвавсв ссассциктс сетакавттс тТ75ав вссасввасЄ ствссстава сктвстсскс сбвісавевс свавсствав Всгаканева 177ва тсвввїзсав всясїассст астассівВу ставссєтвро ТЕсСтассстс анасаїатис 177654 зсвсїстсне задааввостї звассіаавв ствавтаватв зсавесттяХ відасвквай 17828 аКазізвсви ївазаїаїві дтваїзлтва Сажіваїлавз вссасзазиїу взизаїнавр 1888 нкезвкнкаг атвівсзасв авссавсакс СсЕВІВЕСВСї вайбїїЄвстаї сисассрссв 17ч40 зізвассасв авссстетве КТС саїеєв ТТ аза усзтравттї тзазткітає ї8заа зазваїзаїсї ссавтсвваа взасвасає? ссасвіссах всатнватвх Тест Кассс їі8або завсстакії стїваданва ЄдазвсасЄсвз ссезасанії ствсавстаї сссксазнає 151598 сіттзазаєе засвасаавви засададсая сеїїссазав зісссазвасе азасасахта 15158 їсСтасвстаа Каствізїса Сівабсзста ствсссвеаа Тсасваїссс твадсвактс 15248 стаїїзаста саавостівх КрЕсрвсвла взадтвасси всвсвВсЕВЕ завсвксвва 18386 сісрезввсв зЕвссттвва зваїстівзес сизасвекса вазісавіву ОСС сва 15368 скосвветве хсстасвстя снсзЕвБтсаб всссексве Сізаєсссв десзссвс іназе автектвссх ївсстїтаве вазсдтразса севмаслрсса аритазвиава аїзазваєав ї1848о кссвааїкав авсавравяв яссанеїзав зсзасссава бвбасестЕВ бевсЕдсєва ї8549 наїїзвізаз аїасїсвяса бабтетакес ссасвовіта ЗбТааватасс вівсасвах 1858609 стЕвстВсатт сдсасвазка зхастасесте савесссава зваавсссаси ТЕбарсссях і1в6ба всздарітааи скастсасввс сссзЕсстс артстссасе збакаваєсс асевЕсссеа їі875о зісїсвссав зсссзвссаса савсїсзсаа сісасісбса сассіїїіааав аавеслассве 15788 сассвазваве (стасласва тіаскзасвя свасаваєаа сазасавсау Тасаатстаса 18848
ТїТвсаваєсз ссасаксатв еавснстеста ссвстастве зістваїтссс яавадсарав 18550 вактстссізр саасассвве сазадаввїтс саазантсвс сассваснсс заснназвася 1895а
ВЕСТ ссв госсраїТс зссаїсваве асясестсвв анссассссє сасвавсисх 15828 зсвавараав ессввстас: Тсжссетаст асвтвсссав зракаєсссс твсасеЕскта їчана псвксвната ссстасесат авзеатссеек ассктістессх свтссктївс зкетставса ізі4а певісатсва ВсїсвсККтс ТВВВССсТЇ асасттасвх їсавинастх ТтсряаассЕ таз павтстівивї їстсвсбсвзЕ вавтнтввас атсавресіх стстваєтає вразіснВтев 13258 аскасїтсвЕ їлраївнасс стїсассстї ассббаївиХ їссббвессс авсівваанї 13328 асхсісескк ааввшсзссає заревссастк васасаснає савакатаєв вії 193858 сїдссассаз вравдазаутс задаарісса вразстстК сертаасстс весрартасії ї1з44а стдакнястс їссасєттаняа ассскЕтасв авсстстКеЕ їсзасавскє роавекасвра 1ізза тсвествесск ссксвссаає вЖтасаввас аассттассс сват Жссу СстЕввазах 19550 кваессвсїї стресствосс їсбссзсТКу тсраргавав затв ТасаТсТТсс ї1ч528
СЕКесвассе ТЕвВВаїсстЄ всссаррваа їсвТЕсттає ССС тКВТас зарааатєтсв 13888 каЕваїнвіс сект свіс аастввіїсе ТсссСтасаї ствревЕсаве састіввсїсв 15748
ТЕС свїсСвсо вссссттсяв свсастратс стастатвєє їсасЄтвсзаєс вствавезах і9589 «вас тсвс стазвввеижксс вссвссаста сбскасакава ксссввахсс ассввассс 13859 всзісттсса ївзтассатс варяастсвся Твссссвсса стветяєссє авдасессах 15928
ТсЕзсавсвс бервессдеї їсбраввста Єсзорававї сСабрвеавав састаєсвеве 13980 сізвсвасва разсяїтрдїви зарісасЕсЄ вввавтстсЕ саввістстнс сватаскття 2904 зсвитсяаєза «вив сстс асиктссвса всассавсза сснсврантіє вЕавссЕстВ 2188 авзишізаєв азвБввестрваїт скзітасває аїсвтасаза расастиста вЕтессзаие 2815 жщеватвнаса зсваїазсвна сбзрасизаї штетЕссаан Ссаектвсва: акствзаїта 20228 закавзнава дакарадана вадазнакава вараеввака сдакзведавна вас д гази авекнЕКасв КВЕСТ СКЕ пеяїссссазаз зїаазатваза ксасаївсс яхисвессх 22345 віхвавстає ссвЕсСвНЕЕС схрсввраза завіссянаа врассвосвс авсбвстасї вада всвавссваре «свівКкавва вЕвсВвасавя вссареасет сватавескис свсватвасе яв тазввсвисс дареансвав сесвсатрса кевраствва ксясрсзаєс виссвнатеа а5ЕВ нвсвевасаї ссаввсаввсав ввасавскавс звевавдсства варЕїввскс сассаваВЕста 258 авсаяріснс їакррассїї ссвррасавї всдрсзссса рсестадесва тресввссе 248 звЕвивсвиса дсвесствса ТЕТ стТтраз всреткаксв аївадассех атазввасве аг
ТвсіавЕїнї Казевасвви зізасаввас ке Кссвзав Єсвкїваске саасвиваав 257вБа зварававас Скатднавсев стТасТЕтасво відсЕКссКи вс сЄсзава Ссазасяваа аа звсвзсасвсйї срсвкеввиЕЄ сТасстсват сззааасссє заасатаєсє весставтїї го ливі їКкаяхаззасє завстсезас сзавссвава бабаватстата тав стах зва4а зізтакессє Єсванасссї ксасавазтїї їїсссзаза авїзіссвназ ваїсаїттксв «1ова зе Есірв сасвсавтаї сс їдаахс зівзавтівсе ссаєссває сазсксвава 1а6а їваїїввіїв ЄСасваєсасЄ СТсстетсва втвітастаа аеувевссза Тесс 24128 сІтссвівс саїасвссав автсстаїтсаз азбссстаса стассссстс ваза сване 211858 твзааттєтсв зтїзакттаваз зкЖаватава звкаїтатсеакї зессвникає сасаєтваїх 21248 ттїтатастква аїївсталатї трек свасхї СтвааваитТВї ясаїсвасна ааааксввіс 2138а заасивстаа заїталасвзва їассзтвсис їассзаказаи аїтїстсстат звозватаєст 368 сввїадатса тахакхїдса зазвазаєта аск таста асасататас ссвсстасев гіда зваиїкМтвасє азавтяннаї сававаїалса тІсасЄставс йзайлавназа ссвевавати 148 «іразазвссс ввсааввссв дассваїсся звассвастата Всіевескве Сссвактсєу зї548 зідсазвасся звассавстсв дессвїссвс взсссствзаєс візабаветї базтастсса зіва зевіавтссатї аавдоссвасвє ствіїсвзататс стрраватсї їнсязавіва авісаввссєв 21558 таїавссвіЗз збаснзассЄ зававсввсї срабвівиси всааіазсвся віїтасссва 2175289
К(стззавай віаїсссван ТаЄсбватаає Кіствстави зававрвста вссасватх ау зсавсаанес сзавасасза вравссасаа авсраїскваа кстсравата Сасивадкаа 2ів4а сазатаєїїї Євававаета сесааївастї сТррзасаваз вававтсняса аЕЕСтСЕВ ізо
Хествавсвзв дсвтсссстс Сазадаасвн сав'сскест Єсрсзсвїаз статтастесх 19658 пеетусвїса сзазавкттс краствстас треразскк: ссссязазває важсствсзВ 22828 вставтнваї ТЕВТТЕВЄсе всжсссасЕО ассярааввеЕс ТтТяссстясх авссиававне 28 тразастїтв їїссстастс вахтсставї їрівїзавій баїнбавсаки Тватитесаї 2148 ззазсвіанї зсстбазаїра ктарвавіве ТТстбвавас свасезнавна Сввнадсава 2805 аствааратв атвасаєзаї таараваснаа їттдазавйх СсссаиВЕКх кваткетаєсє 322658 «езвваїтвкжЕ сссвссзави асвисавсна ст наасеа заразавсах ссаззавакс за3хО звсасссвВХ басвсссаств сазасаваза штрясссанв вістдасквт вастссарас заз сЕвзавивсс єстїазвнтї саваїсствре Твїрузсзда зстасзавта зкаїас єв з-пав вастасєтве сстїзаства авсітссасск атсвіїсасї вавеїтяавав васавастте 32589 свааїзавсв саїтсссави зватїасссат вабсссвсаз тсавтсавак вЕсатвессав 72558 їсзвваїстав давсвсасаї Єсссісваві Сставсвсас зівїзяссає здітсвясас 2828 заїссзаавди їзасеїанта їїааасасав аватктнтар астттТКЕ кисасєзаза БО напдасїтвав Сібаїтзсввтв сассстаїсє гаавбревав ассвазаєсх тссассвайа 22748
Ктятавївавії Єаріазтатаї весїствсва твтастактт сествІтсТЕ всвасстсса 289 всвЕастВсЕ асіїїастас аесвівсатв васвсатЕав СсТвавсата сасасдсска ач заїсвсаїнстї їївсавазсв базвсврассв саззарадевя їссяхасава сасасстсавї 2398 австтссісс зітаскстсс дасасвааса вавсатжста саасзаттає свасавсадс ег98и зазсвдасзав савсаєтаса яктасастта сазстеєссає зссасяразеЕ ссветсавсе 303 текс асрвстсави весавтясве їрстаїтснаЕ вові Кв стссівссВ 23108 стістессвої яссвастстїв сССрдабввеив астсвавсстї збебстствВ стасєтанева 231058
Гехссететс вЕтвазаїстс стасссстесї ТеїссКеЕсЕ стсстсвсіє астєсвстає зАйаа сВЕївВЕТсї вопастсЕТТЇЕ ассвіаавиї віїсссїана асснітавив васарватсс 253288
ТїКесстсгс ванестісєтста Свсісвскса сазсесс тс сітаєЄсвває теавссстта 3346 «каєвтнссєс вавстевеЄс зсваквстта сескаасєзан їВстесКТсї ввввавасвс 23з4а6
Ксасазссст встїсззвасси зваїввескза винасстни абссїстасв СрСссвавах 23458 стасвавісє зіврвясасст тсвісатвсї Жстславива засвстаасс аввтссссї 235к8 сстссаснїї: свссассасв ватстясстс треваїссври Євраїтнасса стсаквскис 23559 тссавеївва ваївксттастї бстїстрктрс тстсаасісї ївевіїсасв брснсвівіїв 348 сасстастає тхсатврств ствсссттсс тазвраєвна завряссвака ваавантвессї 237аа
ТТВЕТАЕКВа акзсвссста сссвичсЕса засвтєссая Єссстсастна асссетесв 23758 вВссВістсає стсссстаст сбгссЄстес їтассствае Жссастнскс австссєсех 23820
ТВКТЄжсвів векКассстсс ЄсаКвсСКХ серазасєсе Гастзсасра звсяссасво 2зава сКстаактва сзврерсскс свссзсвіва сарассЕзак вазизавркв сватавнасе 2Зч4а астессвств сстскатсвсЄ звіваттвїс астессастає зізасавтвї Сакс сєсас заово засЕсасснЕ забвсесвси ззасїтасзас зсзіїааєсс Тассттврссає зіказсвасас злаавба тстссссасо бтававсістїї нссзаїства арасатзаря СЕсТїтазат раствзазазва 23120 заїтатаїїає зайсїсвайс астсствста аїдлятстатх аастаєстактх тассраєсва 41858 заваатсвссї втастаестї звіїсїдлаєа казтаасєсан астстїввосу пса КсВвс 24248 свсрказссс астризнїсвна акастсвває врайврасстая зсаразсксв ссвсвазврас 2азаа
Хвкснзасав ЄсСсабасана вксссссасв асссаасває аавзанаваа СТВ 243650 свісввтекав сасвасасає ТтртІстаєте сазаватаїс зааратаксає їстсараавя 24428 сксазоввиса аствавассє сбсазсвавзв вЕїзататсс везавсстсс ссвраттсса Фаза ствсссавоЄ асстнтсвсе сСстасЄсвсваа васавсвнаа ааввазнків всксстасва га5ав зівссассві Твсвасвазе казаврвссакх сегївлавак воессствеся асавсввссс 24б0а сазавасвва сссссасссва сдавЕансаї срсявавава ваакасястс свассвсвіс 24668 їХсавазвсва всСеввіїваї втвасвістс састнасвта авЕнаїрася свсзваїсссяа 24788 стасесссссе савевссстх ссістасата арвзавкєса їїсасттев аваравсасе з47ва ввивасєївай ЄТазаїаїва дссстванав всвіссквсЄ ваазісавраєс стнстастре 24авАв
ТВствасате ВСТВСТАСТЇ втрасаєсвї дзассаєтас зісдавастт ствссвїїава 24580 сттсадласт вавсстслав стісстсавра вівраєсратї ваїстстстврава вастссавиа 2435
Тарасасссї свеЕскТвств став тра вис сВсї встнезаїсв сттасвстве 5828 ассКгввазв вставазасев сстаскастсв вастрісвав СссзссвВІсЄ асвсїєсаса 25ОНа кавасатсве акасстяяас Скрвасстве сесствсяст сзесксстса авессатвка 345 знстсярека КГсвавтїств КсвутвстеїХ сВїсррасте сстазвсватс стжстрЕтав 25288 ассттсатвар кстсттвкаї зсассястав арвавстстЄ зраветеств васасвавева Б свріднаївв сясраткієв ваїїстршса зарявакксс вравстсссте сксстсстар ЗВ асствієява ссавїтастс аватсхвазї їХесртваїс встсааасвї Єбреєзватав 5388 звук сваа вастїваассс сВсїяссвЕК сссвскаїна Сбаїсасакса всессе 25440 васасЕссв зввсесиоваї австсвасвсв свасвсасда сЕстасссаї вавасевесу 2з5ОВ тЕсСасвазїка ванісссвса зсїзізсасх свасасесва свезазасаз заїагавсес зай цсванствва аіаавктатс всвсесевіВ ссаїстаєЕХ баставатса ставсватеї 25638 зсвніїаааа скассссанї асасїаавна свсссвсаах всестассав все ссааВ ЗБ свісвастттв Сібвсессає дабетабсстї вссассавсє авссавсавс сссссвассв 25748 всавстевВс всзазатсво састсряєає ависавссса ссвЕхес Уві «2105 4 «211» 22824 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» рбА7-щшод 0 нуклеотидна послідовність «4005 4
ТсСсТАТВВІЇ деясаївсвса тасазаєика сваасенасв азвсстіттся сврссссссея ва ааксаїссваї їатїстзаса васвскекиї тстсссаввї гТасссвсса зтатасссте 128 тсваасассв зсавсїсзаз стразаввсви дзавзсваєва хстрстадтв дассксссаву 188
Хсвсвасе всдавасввв свсстсвакт аадааєсссв асстатаєттв всстватсєся 24 вістрисатї вакїзазвся даїссваасс ззассазааї асааасасає звис сата за тасасвсстс сСзаназссіЇї сасвеаасєсє сссссзавазв агасстарна асасссвсва зва сТсТСссвВВс асеисаататт їсвїтвавта Єраввтестс сатстсТаЄЄ аастставах 428 ааїтнВссВЄ асватсастт їсттактсаван їдссастзав атиксвтсваї ССС зва тіссзівссс зтабрссвав вїстаїсзаа ВСксстасаЄ все сутсв ласстевавії ЗАВ ввазвіїїсвиа їаасссзаза сїазасаваа сасатсаєта сставЕсатс абассваєту ев
Масасскав Єбастваасє бЕВсївассу Срааявсвів сассазсваа аааставеся БВ заскастіаав згяаасаавї аісаетакВтї ястзавазах СТебсстаса ававтах зав заксаваїсаї зівсжсрсна ззазааєсва ССС сассза сасаєзтакї вставав тва заакссссоса алртвавасх аазаїтаатаї їсаїстазсз ззвазазазс сарзаватис АВ
Єввазазсссв всаваазссва ассватссва зссрататзе СТвнеЕтвреї ства скра чай їаївлаєссва вссаасісвЕ Сссакїтвся сссстансса СзабавстсЕ засаєттсвя ово вВХВКсасса ввїїласеКХ вісласаксс секазатсеЄ всзазасЕаа Ксзавсстат 1820 зівасіївїза Саїказікїта азвавсавстс ваївсвасев саазсзтетай СЄтаєтеває 188а їсівазляаваа бассссавиї ассааїавЕї СстнстТакда зраді твк стасваєтта 1148 савсвазвсс авразвсасназ ваавссятсваа всряїтвазе сесвазятах асвазверваає ї1208 завіяс(щїЇ давзаазаівс всавукасєє веаасанвак зазисяатає тв 1368 сіївазслав сабсссстстї авававтвве авссстссеЄ сесасвсває бабсбасвссе 1329 ссЄссвїсвс азазвакксте раствстаєї квкаасєкск Ссбказааса втнвесдсссс 13858 веввлавЕсї сЕстарссаа ТТЕЕвЕвссса ВснТЄсткра вежТстстак аврраваств т44а зваввсввяза асеасавсст всївнівваї стсссврїсз сдасксскса завсркисеє 1558 сссрсреаза всетівсввКК всссритста ртіаасатара Сравсассесв срсватавтї із89 тассстзисї трсвсескаї асссствсЕс сСтассвсвса стааазсвсаЄ закквсвдва 1628 сісівааїсаї авазасссає сссзівваса асвссасвесв стасатвсса звітассесвх і1688 вежтвзсвта зсавсавиа ааїтатаїтна кзассвісвс завассявса зсаврахєкев 1748 вІсстазняв асестастрс саваєнкттв засивісвнис ВсвсстсавеЕ авхванестх 1880 ктскавсссс ссдссавсвї авсактвссвВ ссссассста сспавеїтав звазавсаве 1868 сЕсссаарса ссвіавсвав звавсасстї втаВіївавб сбссастссї тТарсказаве 1950 засваВЕст стяставееї сарвствісЄ взаїсвравес асассзврва зЕакеТЕВсВ 1з38а васвесства савіїтаввех атсссатазе ссавЕстсасв СТатсстстав завваєсваї 2845 аксзасевів Їваїсавсавн свтарсттазс ссаававаряи Свсїїаїсвр атеразвсзас 2108 чзЕкнавяїки віасвадняв Сакакзлавсв звсдашнавня Тасаствтвав свисккавї 2168
Ксскаварів аассассавї задсзасаве ссвавравтях ссзвіаврсва встсвасває 22за аксввіїстз всзакаснан ззасваясат ссвааравнсс сттсвтаве ссіїсттасв га варавсттвї ставвЕЕсвва вавсвтаває ссакававсї тдавсавиаа ксссадавех 234 засаваазасв анвавтссази ссстнвавтсє зркссаавст стававансс стставвєсх 408 нібвісстсв асавсентиХ Зввавававс сасансавва всвиїаксаа васссвКаїс г455 птвтсгзасе Т/ттвавЕри їаввсзсввси сісВстатвс зестреЕїсс всасстсасс 2578 пдазетаваа зшсссвазтс сасазевтсає звествваве стсісвЕска сеталасяда еаий їтссвеїзака давїтвтнжс сассесксате стрвассксаї ссасаїстав стссваадав за двсвссдтавз авсазсарави савбвасвев втасссарсв сасатавеав сарбтссаве 2788 авсвзаксрівз всазезаксє свзваавссу вїазвссаса Свреїраїаи азвррсїтвай ува вавіссеассї стстсвавсї савсасвсса ссотвесрава Ксстсвавса Садиввсаїє 228 сісавасссв касстсусва сстсвесавре Сставравевє ававистстав всассткеса 28о адссітракз ваасеЕсаквї яваатссттї язависстса дтарсаїсав кассавтрвсх за нвсазисясв їакавкасса сзвасссасс звЕвівстЄв аавссавтсв саєсвтасіє зво засвткстов астставссс аїстїансстс ваззисврса всзавстсявє варестсаае заба звістсаава хсзасареав савсанзавс асссттавса тедавранссї садсасвава 3120
ТЕсакассств втзадіввав асставеава зкаїстжсса їсвніссївав вавнивсасах Зіна квсасрріза ССдсвзазсвї заитнсвасв ТВІТИ СЕТВІЕНЄСЕ сКввізасте 3248 тясавзаадяи Ссстсвсета все сЕсвВЕстеХа тскатсравстї ссввВЕстнакв ззва
Хвазававсва звсвЕваївак свасстзса вествсвавв вадесствса ЄвеЕсратсас 33658
Ківсаесзаї всаївсзсвс зуніКассих зснсясвтис ТеЕснаввнав задссссєвЕ 342а вІнТсТвлак ввавтвасва віресевава яааавсватєтс тссвсвеств сасдстатнє зава ківасеувта вставвссс Твесасвеса ссстатвайс ваїісткесх аавзасавие 3548 їавзвавсста зссСїсаїазв асбазаазав заазасвєтта стазесіввї ЄсСвазаввяв з6аВ итрвиастав Тавраствисї евіївЕсстс сасерсассзв вадисітасс ствттветтв ї568 авдавстваав СЄТТВІКссс свВстсвзассс ставте тех ззасесвтвх зсатбеитваїв 3728
ЖЕтатваває всзисасіта забнасіавв ЗесЕВТКссЄ взвассвати зезвасвина з7ва вЕсававссав зрасратсвас аївастзава асвавсс тва заввстскта весстеиаатс 3349 сіре ссвазра СВІЖЕ ТВЕ свзазезкіанї ввсваїїїїв ззссааараз засасїєвав зва азаєсавтах ссриссаскє ЄсясСвсваас «разавсвис ставдасксв зсїдсах зва
Сзвасссааа вавсстссса зваїїсааїс ссрествТнї взсвазаєтстає зазтавсата 4628 тт ваваста ттнксссса аствавсттс сасссасєтат ссаствкаввї сзсараатав 4а05о всствсваає пазсасатос ссвавазваса стсаївасск сатазставт сараввеках зідза кссаатсзва сстававааса сасзітскеї савассєтаа тнсасасеха зксаханктх 42ва висзвсватіс ававасавів Тавсзіїава вєзвсзваваху ТЕСВвасКЕХ сс твнсях Ба свазавдазиз ставнсстає зсвївсасїх Та ссзаву безавассва авассстесах 4326 сваввіатаї вазїїсСавта гаїаївїс ївсзазівсає Таїсїївста Сет тввсдає зазва її савтвна стасєсвотсЄ аєтасааснтї втвсвнатвс асвзвсутна вітвсасасаї 4448 вкістївазствс звквсссСсита авасесвасе диссвсаава вадваїссаяЕ асазабасає 4508 стсаставскї сстссвіта стссвасає ааасвзиавса С тасавсз зїтассваса 4565 асавсвавса всовасавса Кфасвасївс аїХКасааст зссасСвєсає визакїсвсс чай сввсстстсвВ ссвссзївес сСсзанавсаа Хасестнста ссвЕвівссих ВЕС ссХ зле встаїсттсЄ стдстастна гсстаїсдра ТЕвеЕвасїттста арсстякстс Ксствстаст 4748 «гаввасттво сЕсстеЕства втстсстасв сстстсатсс ІТТСЕТТНСТ ТЕсттастте анво аствісєвісн васстЕвасї свістасава задистсїсс сіававссвї дазавевасай знев ваїссактїсс ЕСствавввс ТсттасвЕстЕ встїсасавсв ТВЕСССКсаЄ свцастсссх зага ссСсасаївї вссісаавсї бербнтасвав всстТасвута асваавіастЄ КЕсСтеввва дова айксвсесттаса ассссвстса аастваряисв ессавевтсв ссТВвассТ сстасесвадс за4а завасстсасв звстсаєвна Сасссскаїс атвстсстса аррезаасво Саассани зі австксстЕс асдстсаєса Єсасврваєст асссствела сствЕсЕНаХ вассасттас 516
ВсСВсКСссВ ВіВЕСНЗІВС ССВСККСКСС вето ста ястстсввиХ ТсасвКеКех 52О зівсасвосї асізкіїссаєЄ висівссвКВ сСссстларв асвавазаає Єазвавазну зона
Таєссксідеї вРЕВазвата ссстастсай зівсаватвї Єссавтссто сасравсстх «340 стссавнссв ЄСтзсесКсЄ стастсюсса секс тасс ставвсстає сестсавстс 5400 сЕсківвові зсаївЕстає СЕС тсаєв сіїсссвваз ассїстаста саїрдазвсає заБа сасвстйвса лисватнавв Кисссвврє свскЕссагто трасаваїсв зареаанаяа 52 всЕсвзаїаан зсвастктса ссастсватс всіавсваїї вссаїсвеса свсаєзасав з5ва
ТЕТ атсст савсвасттТає сеїваєвкатї вбразастятє засасаєтав скссаскВЕ 588 сасатеавтна сасістсксс атбтазавсє стїктсааїї бааввататса аватстсессв з7Уда засшаїжаза даззватасаї табзавісса вісасісств ставсаззаєє всбзвітасу 576 ажстаксскаї їзазавааїаз стгасастаз СЕсаВЕстяв азкавазевах саваєсссав З820 ссебсвтсссс Ок вавсся асітадтана свт ставте сєта тразиставе 5
ТК ВЕС стваза аваетсвіїс вбазватствсос абвсканвас зсСсавстаса з940 свЕтасвсаї засатвсадк свсЕванаВт ВЕС сдесасесво састессєсе вра авасасстав варсЕссїст сбсесвзесаєс зсасасасаз їсасасвов всесвсатка бове
ТтасасвКва Сквссаївса застосо згавсстаїз засїаасссв Тесс БІзА
Тсїттастса вассазаасєк сассваїаса засзавасса заласактаса свавеавтсте БіБе
Сасавсаяє сСвссавсяао засавасває авасвасасе зсзассасех бтасааєсає 5248 сакассвівс стссваввка сссткастсє тасвсінстс стсссссвдс савссссас Ба вазвтїваса стссісезиа всасвасайв ааарареєсе С(Тассврадя баяввсттас вава васвксасся асттїсястаз дадасзсссх весЕнавада ксассвсуса ссвавусева вага заскЕваєвств ссвасисіїЗ свавсаактсє сасвктаваї стоставвоє ївасавезЗІВ вава сігзавссс стссссстсвВ сЕствсссас завивасаєт сссосварзав вста за зіссвствасї Тссварзку свссаввсза стїваррств авнкаатнтт сванессксх Ба сттестсатв СТВСстасав асссвствав вїсассвстВ ТвсасВктяс СВЕТВсвс б «їкасствис атвдятеасас сстскствна ассрстасвє сСрракстиї ссзррезавя а72о чЕсввасввс Ссаїврсвсва вевівнасає ївсіссстся сбризавсяє свосгїсвас Та звавстассс аавссВсККв сСсТесавасте враквірива свЕстТвяхНс ССВЕХКВсКЕ вав зассавсвзів зсазвсасса КХвсїассссї славвистТіс засзсвасвх Тезвсстсвах зва асссітсстс СсвСсвсЕ ссасваована зссествста зввстаавнїс бествстаєте баба заврстсвас сі всрса звсіаансКх Сгсвотсств Соассасеск ств тяга сЕсвватвис аретїтассї ссаїсстава сасаєвстсв врастазвся стасевівае това сттвсівЗївє їснрзаєсак зсвсрвасії вссрватаєс стнстЕссваа стасеВснеХ 7148 вваїасвіїс бсасксвсса секс тас віїсввектв давстатніа сасетїствс 7528 засжтсвстн ТТ сЕсакКає їсавсстсссї вісЕссвавс ставсвадсв Сестасссвя 268 віХвавтасв ствстаавессв свстастаає бевЕТсТссаЄ СТЕК КВЗЕСЕВТЕЕ 7358 зінїссткасс СТзастідссв каїсвавсас саєєстьсвсє ссссаствес свасссяда 738 свгсстлава їтсвстсстав авствавсав сот рана зисвсвнастї хсвесасиве 7448 вісававває звсїїсвравис тасквстваї акїїтсрсса ассссраїтза «квттнсссах 75аа детссідава арзаватиса всзаїнаває сиїтсаваса їни сваса ававтсксєста чав звассваасс сствіїтясснв бстсвсваїтв зсхатсабає ваєссстесє ваваїтасвсх вв лаввсасвсаа тавесавсаї втсазівсасе асеїсаттїв сравзівЕех Тег тасватї 7вва звавссссвс азстатасат сїаасасвсв асаразазаса азасесався срсазастав 7788 патзавеЕтах свсвсвсвиї вссасетасв Ктастясасс веїескастаз вазтсссавах 7вав сатаїісваї стваксїїавї ЄЄреївЕїїна візвзазасава їїіскаассавз вссавааках вва азатаїтавсви ЇМ ЕтАахзка сатвсстета аквексттта такзаксктс тссзазазає зга зіствванас віссвквасі сссствврсяї візасаїїес віїазаксате авесвстсся 7988
Стас сяа стссваасза ЄТкВіснтає ваїсастЕсс ссабсазиїтвя гтастававх нео вевісаяих СЕКС ЄЄ ссатаєтсаї асвісляваї стаїсавааяє їсттасатах 8516 сс Ксваа «тв аавсва лассьсвата асстазвазвсє зазсвдвааса баса 160
Твввізїсаї зітнаїттее аїзстсавтїї зсіаваєтєте дЕсаастієїе азазксвсаска 28 ссвасевава аставісзаз сваставазах зазтасатат сатнтеКах сааразвавтї ціка стссїЗзсаар авабзіїсства їзвзїсатах ВЕстеївзаза ваааттвасе сстастваса 8349 сататсаттта сстаїсзайй Всствасваяа візаваєтсва азгласаскс згствакава лов звавнавсса роваасвств веаайсссвеис вазассввас сазтссваяс сватабавє аби
ВЕТІТВВІСЇ вактттвата їзазссвавс саастсвесс саїїквсясс сстватсаєа 8528 асавскстай свіїїсалавра Састаїсани сбаасвесех саасаксств ваваТстВс 586 зависвазіс аайсстаївї врсткїавій свзассїйааа ансзвсїсна сКТвЕсве З наяа асзідЕзаку сасЕсрасхс сазазавата ссскезитає сазізакссс сЕстанкаад вав занніїтавсо аснаїїстаса дсзазвссзи азтасааава ассабазав? вассвазесх 8708 сквайасатас влавразсаа асасссттаа авазаїасвс заїврасссве засаааарай вах авівасасаї СТ ТеССсХ їазасавров Тссестстаа араатвесяв СУТ ссТЕсВ ве саївтааєта статис кскс Стсвссасаа авактттвна стастатєне ввасттстЕс а тгазазсаву баїарзассс асасвавсях втвсЕсксса Кббавсста зазассаара чаво взасатсвсата сасСвасзіїс сассовавестс ссКоТегЕЄ сві асевКЄ авідасттаа Зав засвсатїєстт аЕтаїсссаї ссттавсасс їарсавтвїс Сстаївсває стсаїтсвакс з12а зссастссва зассасвсви зсТествстЕ сссстЕнавс їЕВсатсвАЄ ТавВсТЕКВї зіва вксисаствВї сесвиаарвт ссставснас їтрсттараї свасрЕрасє асстсєсавс ЗЕ ттсствствс Снссссквсї вссвиаскіс ствессксаєс СЕнссВаЄЄВ сзсистссав зай тсссссвсаї вівсастсвс Кссісавесв стсваваїсаз їсесвисвздє Сабсевантв ззва стввсїссвІ КЕВсестсстс сасвессссв Вссесантве Тавссвссвс свссекссти заха васттсстїскс сасавкавсс всскласаві ссрасаразс сяасасвавса срок са зЗаво гітассстза явассазиза зсасасаєва сасктсваєся всстсКессоЄ скстессксх а54в сте Есе ск сс акса савоссвусає зскаасстав зва ззвсасаєтсз Тсжсессац вітаєсаєоа їссасссіта асвсставвса вВевесСАх вав асивтсєїсяЄ авссраїсас сссітсвіса вибавісссса веежтсастс сзвсвесеєї З7т2а ксавіївсвеЕ йасатетїася сасєсаїсати рсїстісазсе застевсаве аустеєсавиє 278а кткссвааве ссаасссаса хеїтсссас ввсвсВсств Савсвстстс ссасавскК знав сігвабнсазс ТсресзросЄ ссставсаси врізразїврев зіссєтрава сесавтвасе зага павсаситиз вестсваква сЯхсвідвиа васдавстссв звязіттссра вссстстате зава ватавіввся всввсасссї Тввсваванї ссвсісттїва всвзссЕтавє дявррсвівна ї18аг8 виваїсвитв їдствазвв: звеїазсвиз засавядесав Хвніїансва вваїссавея 185855 апсавазссвї рікаїтдвави Харжссенаа тссвазався ссдівавсвя свсазасада з1а34в вЕївзвветЗ вслерваттс свараїсава ззизасваїй тассадтавЕ Єєстссетате ї1азва пазаясанди сізвазивсс звсзнійана стбсвавкаає сСіаввавсавс сарнвтавик 103658 сттвтссаврса всвставтав саавиїавае акваавтсстї ссаавстВсЄ везаасавеає зазгв ввспвзазаса савіавятав навжстсстс звсватаєсв ТвавЕЕстнЕ сВасствВсЕ тазнао сТТЄКесТЕсрваттсстсве сЕВІВТавни засвалавкє атасстестви ссатвтиссс зай звіавсстїа сївисесїїаЕ сасранакав стжссавессЕ зарізавоза ссасвасаав 10589 акайхявадя авсссасссва сивжатсвїт аасссвессе Тазрісакакяа аазрвсадавтв і1856й їссасасіїса ссссааввиа сссавасєсс вазїссваав саанаряитар акзасасвка 106578 авсевассла всавсвзаєс їаазкеваїтїс втсаввекаика здадеваїтвї звеЕтавнтсс ї1д6ва засвіварвсв збсавсарана Тарссзсватх зїстсїсавсс асвівараса Сзрасстсає 18748 ванаратссс тсвтазвсвих ясттаЕвватї зеЕсЕксазвив зізтссттва твЕсвтавтс 1а58а тТвЕВвсассттв аваасеїїїс сраоаввізіс найвесевнтс ТССтТЕсТвсї КЕзаавасве лова азсвтєтїсса вавсвнсства сентїссївиї звабссстса зеваїстсзв ассезеивсає ївога авідасстї васаїввксах янтїаастета засетавесе гзасЕсквсЕ СЕТ 18558
СВТ сСТвЕО завів ївса зваєссстве сивБІіваєсвВ ІС ссзане сеВсвааВсВ 13840 айїтиїкавс свІКЕнеТнЕ Всссвнткав зісввовати встає асбактвдава 3188 стваквласе вевЕсетнав сдесаасеКХ всасдевста свсвівдис стСсСННесї мів
Хзсвовтвиї зЕсактсатеЕ сазвведсвиє свасбасатасє всБеЕжасстЕ дасааєвЕде 115258 зашавтвсяа таїсдссвантї ассстасстла СТ висваї расазвєвса сасссреах 11288 зксттасттв ВЕСТСІСТЕВ статки вас МКЕСЕ аїтстстсас сссдессис 113548 саКасїсзса Сесстанарк сзврасвила СТвразгввкнк вссазазасо зазваскаїтои 11488 жаївасєста саїавіківзе ваїсаяктая себсваавна завіасснай тстсісазве ї1АБо втазсррасвне ввЕсаватва сазсавтсякс зраевсатставахє йаавсиваазв свсававвся 11528 знастовава засїввссві врасвіссвв віїсесасїв взавсвісек Євуссівисо ї155а
ТтЕТВВскат сесттсстсст ветстерітВ звадессете вЕЗствасва авта 11558 виватавсви зієсттаїсс срраставсс хісстввКЕї їСтсзвавссЕ ссвтвеснек ца втствсатст аїстссаїта кисстизава брастсттса сассваєсвас вітав зіва
Ссбассстає гсставсств сашоасстви сттвсевас «тТрравсасс вівсаесватв 11825 зсжкрватаст вівнаннвЕи аЕТВЕствсї васссававс гсссвЕстяк ксваїтЕрас зІ1888 їтсвабстса ВіттбавестЄ вКївавзаєто Кгсаввїтїск абівіднавє сс авраксї 11548
Ткавкттссї тссясТвстава Твсстівасс вазтастссї зраказааре ваавіснає 12 тсєвавінтх влаазісвави Тясасвістї ссбсаасВЕ куссаатсва сссвсайвса т1295а завсадазра саввтваксї сссатаскта сСавствасвав саасавтсст зссдскатис 32128 зівасавсвк стсдіїсстЄ садравеивиХ Тбїссвасаї ссаїазслас ссеаавеске 15158 зіяаававсах савЕнзадаа сс ске св ссз ввестЄсзса вет савее 12548 вареїтсвсса астсссвусс вастввстесс всаазасате севасввсва віасврасх з2з0а
Твсаассзіа асКссасвВї асбвадсаве асстассвсв вавасксатс Ксасвавсії 132368 їсзаваївтв втжвссвкса зассватвас скзаатссах савсвідасвв зсвуссввЕв 12420 весавсваз асвааасзеЕв задсвестатє сссссаванї сеснансссє зсассвдакх зо4ве «сввсааста свтВссвНис адвсктсвсс втаставава сзсвсскавв савасссвте 1х548 тхвувссастс дтвсзаство веде К сс свсва сктсставе ссстевесва їз5а8
СЕС навстс асасствка ссвіавівЕсс сстссаасвтс ВТС ссвіс асствасвіс 1-58 сксЕсКВсссв сатссзсвсв свесвсскес сеснссазВх ссставвКях сабвсиквеє 12у28 заасївесЕк свист свЕНС ЄвсссТвсКе КусСтТассва севеснкавв СТВО ху рЕвїссссвс срскатевіа всввВссвас вет сеесЕс вввсстКкасви састватсяаа 12848
СТКастссЄ вссссвазес сітбррсвава ззасваєссвз СїТаваїїава ассвнавасес 125988 анаетвасна десеваттна нісаваєссс засвнавета саїстсссав дазатзаєрвї їх95а зассссттєа растссетаї аєссесвасє азаовааїда тктаастєтск арастттаєа 13028
Єаїавссссв асайсїізавс Стзассаєїс саїїзсссв» аєсизавств Есе сатвЕс ізо їкссссстая аЩазаскстня ТаствівїКї асаваасста сазссавата аксзаїасте їі3148 ваствазвсї Твсисаніта есівазвшка Ссазсвиска даасвсаєта вЕвсСтаЄсзва 13293 ксвзатаває ссасаствва срдскаїтсс саїсазтатс агсвссвхіс сті сТвке 3250 сакахасскс ссстезавсє сязнарисас ссвсасссса ссвссстсає басвсвесає 13558 зазаскавасє ссатвсиссс асдсзавств аавзаетвесе сзававсест ссссссссах 1338а кІсстатвсе всвассатсс асттсвссах стсссрестас зазикасєссс саїтсассса 3440 сетаразсає саїсастаєт твстсаїсса Кссадавеає звсссасекї зсвасзатта 13580 ссазсвасаз савасзасва зсазсвеіїас азіїасзіїї зсааїївсса бассасвоса 13569 сстадсвств сівансвавї вЕшавсевхї астнрівесс абастевЕВх таствасєтся 13670 свт ссва ссадавацня сессвесЕає аквсссяакс Ссвссяссвї СЕЗ і1365Ба ві асвацв ставввсксу савабствак састсствевін ВтвстсакЕЕ сессстсв 13743 сссвваиваз кавасвссас сваввескстс асвшаасасс абакаавниє ССввсствав 1388 їствравтвї скавастсся свіїввасск сіївстїєта сіваввавсс ТектвствКї ї1з8Ба каиїкаввдах асстксваст сСТеїрстави зесадствава сТЕвсвссс ВСЕ ссКЕсх і3528 вЕВЕКсВЕКс сво сЄсста ссревІснав вссввасєсв сссстввасе гвосбаереє ї1398а став ясавівстЕта сессвиаазе звасттстес «Тістассве єсстввасек 14046 сТКсЄсвссс ттаЄсввїст свасатссви сасезівста воссатявсВе СТВ стааВ 119 ств ств ствассКтяс КЕСТНКАСКХ тессаввасх вдасснвавв асстаєсваїс 143583 стЕсевсттс завжаЕсатвї свстасвсвс савссїссвка ссезевасвс сФвасазееаї 14328 сстнатсава зввсскасвв свстсстава стсвавсста ствасвесск вїсасстатв ічхна саксннскст авсасстсїв сктгсЄвосї ввсваваста СвБтвсвесс сзавстмтв ї4340 тссстсвавсв Тежстваврсх свссасесве сеїсвВикавв шовадсстаї ссставвст 14408 кстнватасс тстітатрос СССТЕЕВССЕ стсаавестта сосссствдвс тавастсскихх 14458
ВС всскИ Кбасстсвс тесстствтЕ сабвстрсти їдтїнтажсвс ТВетастнтє 14528 асвассвває ссстствесх сс ссстссаксе сссасавстє сездевЕвКх 14558 ветсссвссв васссвзеви ахстяссаст сссасвассв варисвссав стбсессквав 1авА8 звасазввотв аввсстстсс сваасвствез деасекскс сбрстастек свасинсвва 14798 сісваствсс вазтєЄвавса Ссвстсвсєс ссстввавКс зссасвцако стазссстсава 147659 сіїдсіїєстс ТсвЇсваввс скарстївав вставання їсдарівсла реавстаєссе 14826 астнесдиу ставссттвс МСствссссс звасатаєвт асвеїтеттри зараанесст 14858 зваїстазвя ствавтсзакв яасававсєтаВї втвасвтваа асзатавсве баававакасаї 14248 йізатавтівза їзазїзасаза шссзсавакї вавзяїваве вкааевянааяа атитрсавтев 1580й завссветавс свЕТЕВТяСУ зассствтає сесаствсса збазатсаєн зассеквсяв 15860
ТЕСТ Тасвів ЄСЖТЕЄсСваа Єсатезаттх Євваїтсссаї зазатватст ссеваїсвреав 15128 капсвасяст ссасатссає всасовасвс стетссвссс аваїссвЕсе сствававиа 15158
Явазавсяїса ссразсавії стрсвастях сссісваави ставав те васласавив 15248 звкаравсова сріїссовав абсксазвакв ажаваїлєта їстатастза ївстататта 15300 їїавіївств стдсссввза їсасватссс трааїваїтїс ствіїзаєта сависсствх ї15369 їввсЕвсана вааЕсваТсй ЕсСВсВЕсКак аавсЗзнсвва сСтсввавася ВЕБсстевИа 15458 зЕвтствавт сравсдевса даассантят ТЕСсстЕсра сВгсазттва їсстасаста 15480
Твіаввтсає аїссассвкКї ЄбавіїсстВ вссвесаєтс аабкеївЕсу Євсссскавя 15545 вабсвівазта Івавкресса зреїаврава асазаватаз стссззястаз зисзадвнає і156586 нссзарізар абдасссвзав їнтакассттр їсяїтвссва заїїзасваз ябастсрвса 15558 чтакстехвктс ссзсасвіта бсваяатасс ктасвсвсах срествсакх сесакраата 15758 асзсстасвїв сСваввсссзаа адзасксасея ТВтавсссаї всвзазветав састсвсвас 15788 сссвіїсстсЄ авестссзст асаствавссс вссабссссв аЕсісассаз асссвесаєа 15848 свасїсесва стсастстса сассусаван вассазісає сассвааває Сстасвасиа 15580 тївссвасза садвсавасан сазасаасяу їзсвассаса сстасвзаїта ссатассаїв ї5чБа звевствЕса сосВїтаствЕ асстеатссї аарзасарав васстсстав свасасквав 158020 сзававвусс саававісвс габсватасс авсвваяаєв ЄВсКстств Ссствасс 15086 ассавксаввв всаксстсвЕ авссассссЕ сВКвВаВсвКК ясвавадаае ЗСсНестасЄ 156148 сте сСтасї асеснЕссак звасвістс сСвсяївосїса ссвссриася сстсвсссаї їбзав вавассстсе зЕесжессст сеяссКеЄЄвс асстставсз всассвЕсаа вЕтсеавксс 162658
ТЕЕВССССК всвсстасрХ бсзадеастє стсввазссв вааїссвиВЕ сстсвсїсах 16328 кавтЕтввас аїсвавкттї стстрастає визассвсваз асваисттсвс гТРЕатсинасс 16388 стксасїстїї зссствївеЕї їссстастїс врсїдказиї астстсатре заарсвссях 15448 взавстяств васзвзсасвяєс сарадвівтв ВКТСссВТс ствссассаа авзвеваКке 3650 задлавсстя ррвазстсстї свекавсссс вссвавтасЄ ствавватсс сссасстава 16559 звссстттаси вве сссТвЕ Єсазсвасії возвквасвва Ссвсбтассї сссрттавс 16520 вітасавввс вассссассс ївакестссї сстсвезавї вваассвстї стввсїтаєє їваве тсТсеВстТї сскадсазав аваїнсестс тасатєтесс СТтстявтсї єреаатсссс 1етав ассеорвваа ТесвЖКссСтає кетствитас завразасєтся варнасввїх сстжссате то засівасЄтсв КТссттасає стрес тавс састввстск ТХстсаєєвс астксттсяв їіекев сасяксктнатс стастасвсс тсзетасавс вЕсіназЕвавї крастттсвс тааввеесї зва вссвстаста ссрдасавава всїсЕвасєс весвкассєс зсатсссссв свататсаєс зазна вадестєаєв Хвсїссасса стаствМсЄ звкаїсссаї сстасвасвс Сакасссвсх 17848 тсівадвста ссзарааанї саївикавнв сзстасаввї сіаксрасва ваисаїтнТеВ ї718а азвісаскттт ввазнтсссх савеісттЕс свзатасвссв зсЕнійатав срЕТвКсс 17188 атЕїїссвта зсассазвсза серсвдаВїї везрствсте авазвтіавів ларрритвах ї7528 с«яевсїаткЕви ассвтзсаза васастрота врсвсваде актввйтавів атзакватла тва їкакасраавї веріїттаве їїзвсївсазс арстївтаасєв задарванана дадвизвара 17348 вававарава навававава вавананава каввсснатв зажестасн сатвесс 174ай виКсстїзав акзвасвзав всасатвскс нЕВТевІТсЄ аісввзяєтак їсеЕвсвиТс 17468 сТКтввяааз завсссзвав ядессвссвс зротастасх звсвассваве ссвтнкавеа 1752 квЕсазвсави вссавсастух свасавссвс сисвасвасс сЄтазввсааєх варевевскає 17588
Твсасаскса веивеасівна всвтрсааїс виссарзїва врсарвасах ссансавсав 17540 квасавсвес аввавнїїра веватТвретсс саїсзаєста засаавтсвс сарвиасстї 17788 «синЕвасавї всевсзсссв вссбавссва ївссвистсс зввроусанса всавжествся 17758
ТВЕКСТТвая ЕІВЕТВаїсв яскавассвї абававасає їяставесву базрваєвив 17828 звізасзавах відс твав сСсассаассв саасазазав здарявавес бизіввавіЕ 17550
СатитакнЕ аксетстсттв дес зава стаззаїнназа звсасаєвеХ себе Теве 17948 скасстсває їзааавіссс застатаєке ветссваїїт аркстЕнтає сдавтаавас їі8вав аластсквнас свавссадла сасазасаса зве стає зсакасвеех ЄсззвасккЕ 1595 сЖаївравтк їсстссвава дитатсстада засастсвсв вс сЕвеВ сасвсзатає 15128 чісвіївває зтваавтвст ссакттїтає ївастїїааз Єааїтвеств Тасватсаст 181858
ТЕсСттаісая вувІТаства азсрерісва КстсТстрі ссессатаєє сзтатвесаа 38248 ваїстаїсав засїсстаєз татстЕестс пзасствази СрзавїЄєсв абласєствавз 18309 збгзаатава асвівтсаїї зтбтаветак сатастваєх тстаїастста зкївстлавї заз тХвЕТїааисї їСТвававївї асаїсзасна зазаїїавїс азаасдаства затвавусвав 18458 твссасвЕде таїїтазвваз аїтбсссстат завазвтаєсї Сзатавасса саївїсаха іа зваазааиста ас таста зсзсатасакс сСес(таїса ззаассукас ананіаавах 1853 слазеталса сСКсасстває азавазаааа ксзвайвасв ссвзавассс крсававссв 18480 авссаатсса дассратаса ств ссве СССврасіїЄв зіаславссв аассвастсв 18568 вессаттїнс асссссаво асвватсзвете Хазвізсссса авасаттаєє зарїївасих 18728
СЕЇсватаїс ссвизвассу Твсаваавїна ассзвисста Саєврисівса зсаїрвастї 18789 зазансавсії сеаївкввїв візасаївсз ав сва гсствазавла зевЕсссави 18845 їазттавіаає Сстрставе зарйоввіта всізсваЇї зкзвсайвеє садайтаєва ї189ов аваассаїва звіваєсвза вессдазаєв Тасдяезивав сСазатаєткх Тааввазата зоба сЕхавтваст хвкавсазаз вазавсниса тасссКссвх ссссвавасав дсвІсссссе їза78 тавздеасвн савжТЕсссх СтВдсакрвтаа стастасвсї сссжтсвЄса садаває їзава визстастас сЕвшаавсттс Єсствазнаї авссствсяв вссавтакат СЕКС сВ 15145
ВІТтскатке ассананвеє сбассстакє анкїсвразавї сСезаастссв Тбсссаете 13208 впактсстяеї сВЕВсаваєе сСаївтасасе тласЕКВТаАЄ заалсвтані асттазатрва 1зава с«іадварівв Сссттвздас скаєранака стривадсвара астазаваєв атрасасаах 19350 їзвразсрза «Е(взавввс ссттавнєсї взаїсстасє сварантвії ЄСсСвтсазав 1938 аіїзкіЯвсна сСтКквасся завзваайсвх сбаззазавес авівбссвевх таскттсате із448 сававасаваай ВКЕВісСтвнЕ абсскакТвЕ аїтїссвває ссаваравск ставив 19589 савісствеє сЕсЕсвсааа астасадата асабвіїтєЄа кастаствв ссттвастай із560 зсстбксаАскс ветастсних ваввссавав ваїавраєтєтв скваавізласа сагтссскав 1965239 завівстсвзЕ вабсссаїаа Сбавісавай васитнссля Єсараєстаз вавсаєасеє 13688
Їссстсваає ссбззсвсає зсвсваєсає авбстсадсає аасссаазая Єваєвсавта їз748 їтазвавасая ззасттвівн ас ттеесх нЕсвстазаа взаваствав сстатаснся із сЗстКїВІїї тазетевава ассдавекте їссассваав сатакєваат сзвтасасах 15868
ВТ їсірсав трусах твехаїсттв всансїсєся вТврастасє астесаєтає 193929 ааївїнкізїя взівсесЄвав СССвавсета сасзівсста аабнсесвсх ЕсВсСвазасе ї1чава каасеввассв садазвавва Хесасвсава сзсасстає звстессксс аа 20846 касасавасв дарсатсста савсавікає сзасавсзас ззасвасайа сзасассасв 253180 астасас(їв сзаїтассазї ассаквясст ссатсвстат ссствссясх сттветвеваа звів стсстівнатв свссвсстаєс заївсвиста вссссватає сссавстс взнааавссе 2258 ствсісасїї саївсавеїї давтаствве дасстастаї срразстаєє ввабасстсс «аг8О їстїсаїсіз ссссндявар свтаїсатдс арзасаваєс їсавсстієс ррастсвана 28348 аввстаквеї сист тасаає тсстассавя «сссктсзаз савстаєствс акссасскх вай ев асіс Ссасаввнеї сарвнасеєв зрЕсссевий завсассссє васахваскв 284658 сізастстїв врЕзатстсх савВскаЕст весессзсста савсвасвар кавове 29520 тістснасає стітсттсасн вбрабдавна зввавїїсна севестсксЄ жтсстусвсв та5Ва
Сссвссвссва сасесгетс Ззкстввссві вЕТТсвесВЕ басваввстх вавсотвие «обла ваватсвксїв сстсвваЄсК Тствсставсв сстксвівса сЕїняссатв Євстсттакх 2га7па асвЕвВсттВс Квроегсссвка віїваствсї сстрвЕазваа втясаксасс садавтсссава зва івсттсавсє ствбасствї всттсєсест сбассїасає срсстасвсє саваасассв 28829 сТКЕсСЕвВСЇ Сссттвсс свассстввЕ стабввтваа сасвтссвк сссттсвсса газо асеЕсстассв саарадЕтас аактстаане всЕстааваз всзитваїав нервссвссвс 28940 сетвісрасав яссвзаквла каавшхетай сазадаснастї стсаствстс рассЕстадх 2198 ветвтсв вІсасатата асааїнссаї ссттсасаве сбабсеїаає всагвсраза 21а6а «ктаїазсакса Єсватсствс сТтвссактати аізасактст ссссатєссаав австсктвЕс 1120 засїсзаава їтагавраїтс сстаазЕраї їзваваазає зізїїатаза сїсазвтїсасї 21189 сстасіваєса заїївісзаї Саїбассївї їраїїавава аясасібата сізастїакт 2128 «іваатавраз Савіїввасєї старсеївса вевсввссво вЕВісссаін равссавара 51389 їїсаааїзра врассіааса вазсїснссв їзаарастре сввасавтїєє зтасакантс 2135 ст всвасї сватвасаве ваваззассї Ссвісвасаї ватнвавсвс васзсасктв 21450 тустастссаз зватассзва дасвсактст садваваєся завевсваєс кавассстте «1480 засиваввиї ааїаїссдна авсстсстсв васбссвесте сесанссикє твткасткка 21548
СТЕсязаваї артриаваан вазрвїввст сссвсзаати ссвісаствс вабзавевав 2168 завссяссВЕ траарятвсс Сстнссдаса вівиссссай зватдеЕаессс ссасссвсва -3о6О квавсвісвї квапазавав васвссссва ссасиїсЕКс завдсазекв ваїбевсвта з1у2а асгикскссяс срасніанвв васвасвсає авссссаста ссссбсдсваа васссттссх 2750 стасзтлакв аазвтссастс састтвявиа взасзсяврни васткаатта заїазкварсс 1543 сткаканвсе Ссссяссваа абсвваєств стассвствс Свасасввосх нстЕсстяТе г1їзва жізісвтвав ссастаєвіс девастсієска ссевісавссу саважсквав ссксааастс зава стїсзакайтв ваїсвасваї стсоваванає Сссавраїсан авівсссттви стгвссвсЕв вв «Кві кнанЕВ світе ссвсї дизатснстї зсвстнваАсс СсЕдазивсе везавсветЕ ОВО всраєсквас твгїкеВісЄ ассвсссасв скссясзсяд зсассанада сгтядасссв 22148 каєстассст ТЄасавстсвс стЕстсаавх стятввадис їсареваєєє аадбствссе 22280 ттВствІсах сввастссст аасваїсссту ститтаврасєє Єсатварисї сбсикатаєсв за58 стрставанк вастстсана ветествваї зсазвсаєве Свваєнесах каївсєкваї 25398 їстрвсзазан араїсєсвав ств стсстарасс Себтавасса вріїастсака 2258а тстваВЕусв сисвассвсх савасаєссе всазтазавт КЕсссзаває Сввааїсссву 22448 свссвВТсТх всвасватта їсясбатвасє сствтстЕзаї сТасвісзавс асесвзахвах ги5ОВ ївасасєвсава Срсаївасвх таїїстасвав абсввіїссї абвастарав Ксссвсавсх зе згтасвкстав сзвсяснасав зазазсзааває азсзвсвсвса заставдата аважсаксвсв 22528 свсреївЕсВ їсСтатвітаєс бвеаїсяиста вскаївтаси вісСааазасса ссссавкаса 208
КІааавасву ссвсдзасвтв Тсасєвавеє аксслааресвї сазвїттеЄс зсассасавї 22748 аїагсствсс ассавссявс сзасарстсс ссвассввисв всссвесаса ааабсассас аа ксвасасаввн савсссятса все "284 «2105 5 «211» 24809 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» рда/-шщшод е нуклеотидна послідовність
«4005 5
ТССТЕСВВСЄ ввсасвсаса сасазатвка сввасината звасстстєсса сессстттта ва застаєссваї гассстласа васястсттї єсЕсттавеї стазсссвсса асСасассств 125 їслвасаєтьв зсавсссава ссрзайвсво раззасвасаз Кстиставнтв вассесссав 159 їсасврасеху кїзазавсвве свссссваєу зазаатссса атак встав са до віїтрЕсакх вавіаазаса аасссевасс азассаваає зсазататаї авсссстаса зас
ЖХатїатвсстї Саараскест тасакаатїї сссссзвазва асасставазв асасссеска Бо сЕсСТїсСтявс абївніааєаєї їсесбсавасЄа тТраавтївсєс сасссттаїї застставає зго васжввссвї зсваїсасук ссссвісазв СНСбастаза всвсвссаа ств аво
Стгсвтаїсс асасвісзва аїстассала ассїтасає асо їтсв аасттравех 54 авааттксва ЄпасЄсваза їтаватараз гататсатта ЄЄбаретатєс ататседаєсє вав стасасства КМКассаваєс ЄвесСбзассї Срадавнснта саїсаясвав азаїтаріса вав засвастааа зтавасзавї ассасвівїї ассаараваа Сбсссстатса аразвтаїттту 728 зеїзвраїскаї зЕвссстртаз вавазнаєтаз ССС тастав сасасаєекх сасссаскав тва ваасттваса вавтааваєє вазаїдисаї їсвїставаєв завазаааас савазваїтес вай бввааасссв всаазиакссва ассвзатксва ассвататав стввсстваЕ страссуєка во їаївавссяв вссзастсян їссазбссвсв сесстаатся севіаввссЄЄ заїастєсав За ваїеїкаїсз зеїїаасесс вїсвататєсс тевазасЇїї вдслааасназ Єсвавксстає 1958 атЕЕстаЕтаз сабраатста аладсавсіс васеТвесВВ сазасасасаа Ттасстеах зів
СсСтваааазна сСвісссавис аставтааку Сствссввва авазввствя стасдасста 1132 сздсалавсс авазтасваз ваассаїваа всваїтваан сісвазасаї зседаннаве 1588 аплатакттКс азаазазасас всазідасеЄ реалсвазає завекЕататє ассссттвтЄ 17658 кМтазасазк сажсссктст азарзасвво ЗВУ КсстС срсаєвтазс їаїтасвесе 1328 «стТеєнКТнс вааазаїсств вастастасу яввансуссї ссЄвазазсз всрневсссс і155а нсЕкаваВКХ Кнстанссва ТтвнЕнссса зсссстсвя вЕТТсЕствя азеКавасте за4а заресвевал всрасватсс вставтввас стсссвевсса севкихТВсЗ заасеввсвс 1508 сссвсдезаз ВсКСвсвЕсс всвисСвассво сс свасе саваєссскс завдссссвх 1550 «тссвавісс всосвссіссс вссвсвссва їсассссссс весвссааса аннсствтав і5:х8 сїваїаррвав гсастсавви ассекнватсс сивисавтав тзаїсааєва Катадсасса ї6б88 втаївиасна їаВсвЕтСсвї стісвваїстї свваасвутв сествЕТсс свв 17453
ХТтІллареїтї ссвавеваєз: встрсаввас ТТ ссрЕСва Трсжтсатсс сстсаадаве і158а такаіїїдин сааадаласа їссаєксаїв расвірЕааЄ ВЕТТВсссстЄ срастккаеа 1856 сівіКжтаса завасстзаза СісаїваїЕї зваазвасає зіаававсса сСалавіїсвЕ 15328 квІїсассва сзасвсватса савзаїсвЕс зссзссвест астЕКСсТтсає свсасвЕєсе їзва сссттсссст саттстсасє стен зсбїаїївзса сїавстзсаса св сассв аа їтессзстсс асвісасеса звсссассва ссвассасся втвавсссс ссавекКсте 218а сві ласвта втантвствї сссзссїТаЄ сааввстава вазазетавсо ттесзавсяс хів сиЕсапізавва взнсзсстсВ Савссвавісє сссвстїссо звисваланна асваассте 2895
ТВставсете авЕстВЕстя застдависа сзісаввнаа веввскЕсвЕ атазссєрає жава акКізарита Єсссасавис савтсїсвсях аїссєстава адраєсвата їТсаасеетвї з34аа каїсаасанс віавсслесс сазкзаанеЕЄ вебівісара Твввасазса виравискай а твікаваавї звавааксда всказававвтї зсаствівавс накссавтєє ссвазавтка зава вксвссавса авсзасаввс савнанівіс сарсвксзав стсваєзвася вс став 2528 казвсаївака васевесатсє свававвсст стссвтавтк сетсЄтасри аивасесиєе а5ЗВа
ХавЕвкскаВе авсвтаняисс сканзвавстс дазсававаян сссанависв зсозвизасда зав занїссавес сСтТказвіста досссазаветс савзвавжеєс сет стТв ссСатсстесва тав савсаноктЇ раврзависо зсавсариаи свЕсассавв абссататсв ТутссааНссх ее
СІсвравшЕВІ арсосвЕствс Ксвітатасз тствестссз саїсісассв кзавівавава га віссвзвісс асаввусзуа всстваявіс їссгвСссвс візавсанаї ссЕвсзанад еще звЕхатЕксс ассстсаСВЄ Свавсссасс сзасаіссакс тесвразкааа всвссвтяаа 29АВ савасадаанє ааїватарее ХаїссввсвВї асаїваравс арітссавва всеВватрїав зав сааввавссс наказеїств сазвиссасаї ввисщасара звисттваав васссаксте забБа
ТкЕхсаввоїс арсасвссаї старсввааї сстсаврсвї арвравсвїсс ссакастсяй 395 зістсттває стсарсвзвих ставааввся завссстставн саїсїсссва косстТвакав 1855 авсвсаїтвів кавісстсси вазвиссїсав Сарсаїсавс вссавесвВтТа всвавсвінї зав звазнатссас яраїссасса виисвВсстка авсснвІсас ассЕсастса асвтсстсна здав сІствассса сставссссв ззавсввсав сзавстсаєв зввсїсавна всі вавах 33655 сзасарванс авїаввався бссбтаксаЄ сазниавсстс аесвиваває сСбавасстви 3428 сзадінвака сставравза взтсссссвї сзвесссаве адрдвсасаїв вКатввтаає зае тЕїзавінта астїктазівї сріїтвТКвЕ ЄсСяссвсвЕ сСКяїавсвї Севсавазіїа з5аа зіївавтвни тассссїїни зсрвасзавс азвїзекваї каївсїстви всназвтввх звав
БЕВНЖСНЕСЄ іїзтаврсввва даївитїнава СвраївиЄсв ссвсаїваря васинаввви з6во завнеетссс всессатїсу ссавсссеса Твваснсатв ввссссвтї втзасасву За засваввасз асвраввівса виТЕІссстс азвЕсссава квркататсиї ввасанаана ЗуУва акзасввсна Тватаствас краваїввсс аїсїавтесе заєсстатсєтсв вссваїаата звів ставїінсасу сввссЕсса зіссскссза Сбавсївсає азассєсзиї Свавїзїсва зза5 пат ЕВїЕ атанеїїств савасасааї вссазвіїся Саразкине звасясасва заба візвїїїсва таїавасавї здарівекса застсавіка ссзааастаї асазсзваавсс чага їааазавїїая акта сСЄЄ базтсрпсаза тзсатазввЄ стазавириї Хасаєтатїї зава «іїазваваї дспассстве Срравістня сїїазїссві стсаксаске сввіїтссав 14 сЕстааїста асвавттесс ТтстВссваз дзасктнвав сазанаавесва зствассваї ззаа
Кесвїсвасс сястксавас свсСсааНесся стассассвос свсовнанасс ссесвавстся аа звсстссассс авісннізада зксасарояс звсссвсвсс ассвссвасєї тТидсвтисаї ззга кзсасствев вассукЕсас днвеннсвВис всасесвкаї дсязатизсв вкакатсарда ява ївасавказа срисеіїївав зрассасзсв аївкзвазта Євазрсїсасс зісавсрара Адаяй застава звісасавава завсваєтеєх сесСваїсєаєа севесввсас зрасеввЕсЕ кад вссїсавсзі абстстазвтяа сввевававск ївсссвасас всактЇєвссе кватссвеке азва їввансссає васіссраза васадневсї сект сєся Кттсвессвс ссестввасв авха їссвссаткі ваївваєсссс виїсвісвих Сівссдасаа ссасаєсссв аавстссасЕ 3638 аввївавіст їсвсваатввв Ксствкстсва сассвЕїввав ЄтТасввссве завсссаїтаз ж74а скбКЕссвіїс дваївісссв сивавссаву севасвиваа ЄсЕнсвався севствасає анев сівтазаврс свівасазна зкаассазав вс сссЄ засво сраднсссВ з8б5а кнЕсЕссвів ваїнссввнай гаакссссістї вааврваасва вакЕСтатєта Свсзїваске 4928
ТавивссКасЄ зсссвісвнї зквавбасва вавзусасст вксссстст свое 4аава
ВеїважжЕра сзсвстеаав ззаваїнтївс асттсваєех сзастастсзе зрабсвасх Звай сссЕтсСстс таввавтаЖу сввссваввс азстазсяске завЕазнстс ваястствая ЗМО ввсттїсасва Єдозасства вавазвсттсаа сазвсстаза ссраваїєсвра здісавасса зіва скссвассвевв знсїссзааЄ сзисавасає СссСтТсстсса савіатссва сяссвсвка 5228 «ваївссссв веиКастисяв вссавніасс ясазвссавв аесвикатав авасстсава 5АНО "вісі Е втвзаравтус асеїїсвиас стватнвана свразїясана севсвЕсасе 5348 аввзвсіства аасиссавав зрробавісс азрваїлевна їссвставїсєс сазвсївассх 54ав стсвставтс ссаависстс Єсвассвзнкад сакваераак пяхрвтсвсая аврасєїтавних зав аатватвїї ссзататсева сствазаївіс ситавставу СТСТЄсСвнтс ТС Є 552 зе ХассСасвесс скВінассві весассасс ссствіссвса вся врвеЕ зва їзсестанта вассннттвЕ СВТ сса сЕтассадва ввсетасссї абтавттваа 5ваа авссизавсу ТТвЕСссссз стсваєсссї аествТВтаа зтвтастЕтаї зтвіватвїк 572 їтатзвазсвє звіастсаая срастаквне СВК ссства вассвасвав звати 5ва зизастазав асвасвасат дассазеавас взасїтвава ввсссставе тстназвтссї з2а астсвавраак їв са завасавевв свасЕстеаа ссзаавааза сатттдазаа зва зісзатаїсс ввсївснкїс асбесаззіяв ававіввїсї зввасссваї срунаїссса ззАй васїїзазва втстссСсаве асісласссї вествтитас зазастасаай зтваїтатату Бра чттвваствтє серкссттвас савастссса сссвстаттї астванисса квразтавас вва схвсялатаз асасяжсссс даввавіасї сабрдатсссв тТазїісаріса вакретаїне Біза сайссвраїс Тазвазсаса саїїссстка азбжссваїв сакатеїзває сахєаніїстав іа сазсвасссва алабаасека всассзаара садазаєттв савасссскх ттсеЕсяВ вІяа зайривиасу язвіфКїятТас втзсасссса СсСсзавівв зазассвада СКК саКсЕ ев зазвізстаїка зіїсанівіз Сабе(їссів савбвіассв СС СвссвсЕ ССвисавст езбо тсантввзсЄ асєтастттає ївсзаївскї зкрявтнсаї деавсттвавс зсасвсатех Баг сіваватисаї детсївіаза зсвхвасвка ссасаваара вдасссатвс заатасвісх БадО саїввстжск ТсезстаСсХ Тссвасасав асабзвсату сСстасзаснас тассаасває 654аВ засазасавс ззасаасвтк вслябтасаї ЄСазсззїсас савівссясни сстссзскиє 65оВО їабсествї вессссвсїв виаестсїсвВ Віавсвстасс сзсвасвІвЕ ставок ста обо
Каїсссвнсї сстдававав ЄТсствсств сттсатвсевВ вЕсвавтаєт венвасстас ба татїсвваасо асвваксасс сесстссссах стастктсвна аавсвсассвВ свсазвавса во аістіснляссх сссввасїса авдвасвстає всїісвЕЄсас аасстстасс звасссстх ба сдаасавстас Твсаїстасс ТЕТ светає їтсссатавв встсаняває ставав 5-ева нкввавасаїс сствастатва ствстввестс ссвевайасе їсбсввеКта ства пВаз5о стівсвасває зарсасвісв авсскстсва сассттстєс атрвїдасна крававаавте 7058 сввссаветЕ сеСсЕссКтс зсасстаєса ссасастесті стєвЕствИє свтввтсвЕ 7850 тЕстатвяани сттвавсссв Сбвравяссв стзссссвка сссствіїа асвсстссні л14а всесисиВіс есвуасЕссї асбаєвнасє треївстстЄ ввавссзасх віт стввав 238 вазитасзіс асссараксс авасостса весссвіасс тетнсЕссвс зетствтса 7558 свссвсктас Віїсадааса ссвсбссстя восбсссттас сессвасісї вЕвнктатрнї 7328 вавезтвстс втїстсстсЕ ссзассссса ссвсаараке гвсавиїста арвесистаа 238 ввивсзвіва баавнсвсвс дисвевсснЕ Ессвссксса Твідвсадах сезаврвавев 2440 зайснисвзатєав авасеветст састсвсссва ссвссавтва СсвтсасТнЄ Сабатсасавх 7588 затвсїатст сссасзвасто жсеїаастес асвїваваст атавсевсаєх вассстаскх що вісатаснвкї васассстсєс ссасстазза сЕсТсвВісза СбтТазаваста баз їс 2958 їзавтвасса ааззазаатсаї зісвгвваєї сватїсастсс Таставтаза Єтаїтавтїа вва
Єв їаєск асїзавааная Тассїатвсс азсїтсвиссї равсзкааса звутадаєссх ттАа звістсвссс сстсссзазє сазссєєзеса азвсвУсЕКЕ ССО ааттє ЄазсСрааввїта 78в8а пасті їлсс сс сля азакааїсвє сСсаїааваЄв ссасвссава асастявста твоа свсвїїасво агарсасвсз вссвсвЕаевв аніс Стуса вІсвВессссх 75328 їсазвсвссї вадавессст сістсвсявс всзсясаїає заїсасавтвс відсаєвсаїх тав їтастасавсвї вассвссасв свазтстсст ссаїансста Сваатєтзакт сах вач зсїстттасєї сазассавзав стсатсдата савасваває Саззазсата сасизевдаїс Він сїс(тїаеасавсв ассвссвзаса асаасзався асааасваса Каслаєсає асбтасваясх 16 зссатассеє всестссваде вастсттнек сттаєвокиє тестссттст дессваскс 8770 засквавітна гастсєтсва дадсясваса арлевванст їТріїассвка вабавнвстя чинне зкваквікас сазвстссвІї заравзсасс ствЕсвдаза ватсаскист бассазиств взяй яизассшатєвс гассваквсї басазвсавї сссабрісав зссївстаав ветвасааря 8400
Твсстазкос ССТТесесс сЕКсссвЄЄс зсзавенаса стстссазна авввствае апа
СтассвЕства ССсссзазвав сссассзавс авсствавес тЕзвЕнаатн Ттсвавсстя в5Ій стсттсстса сріївсттає звис зиВстассис бабвсасвії всіввінсте 5 сіссЄсатств всасквакас астессвсти ввасскстаї всстнввЕЄ кітсавкаива з54а ватдтккате всссасиксаї вавввстнЕас аїбастстеї састввазає асвстКсВ ува авсаварстат ссзарстеск трстасереє ТсвЕваївсне засвоєних: ВсссвЕсеве в'яєа шсзассавса їзасаавсас сатвстассс стсзававсх Ссавсасває країв ага вівссскЕсс СсТсВЕЕВсЕ сСсссаткадя шааїсвсеве сазннссвад ХСКСССЕсТя зва твазевнеїтв все тате свавставно СЕссснсїсс свссаєсасо сс нада сісїтнкасЕ всавссссаєс сттсатссста касасасист саввастави састасврати зваа зиЕсттвстяї нетсквааїс арзїазсвкас Ссвстнната ссттвствс застаскате зава ствватасві сстснсжтвт їТасстссссє зсвіїсавсЄ тевавссаєв баса 31298 всавсттєвс ТвВЕЕсстсак астсвсстсс сінітисєври всствасвав сасрскастії зіва нвВнссвакта снсгрставс сасвстаста ассвксстсс асссувитни Свсвассвих з240 нЕзІвсссса ссстїавстас сядасскавс ассасссута сссссстатн сстсзастся азва васассстіаа раїтсвстссї арарстааввс арстссссяз дзавсасвна сттсастасе 2368 аскстававе астассссвав встасрЕсся атастстсис свасстсває засвутрссс з428 атвсссства дадвавваєсе савтвасвав айсвстсааа саїїттврсаа Єва заза іїзавнасЄсвава Тест всс врссссвсна Сврабссвісяї асеаїббссв Єсрааєбаєв з54а
Стаарсасвї ааїзваїтазс абЄнсавсрса Срасвісакї саєЄвранаєсне як ссасва зва
ТЄввадєссс дсвавіїасас зсстазсасєв свасавлаля свааваївсав свсовсзавсї зва зкнатаавхї збсвквснсв вТвссатсКа кет астара їсквЕскаєо заззатссся зва жжЖатаїссв всставіска вЕссевКакї влесазаавса заСсскаасс азассазааї зва втзвататат висесЕсата тзбсатрсстх тазввасстех Татараяєсх стстттавадай 840 аїаїставав аїаїїкисва ссссествис абвтаатато Єсеставаєа свваркрсте ззаа са КТаїЕ лдассссяизах аастввосех асваєсасто їстіассавае ТРітастааа 958 відсвісаву стсссКессс хтссвКаїєс візїрісаав зісстзікскава аккстквтях 1ваза
ВЕСТКТЕЄсВ заксттнзадє кзаасстсва базсставай Єсазатавав сасассатка 19 тттаввснтс аїтаєсватки тсасасстаа сбастааакстї серіїластї Травартїрів 18140 сисїсзасяла зазітїавсся засвассваа зіваятаваї абсаївЕисЄ ассавилдайа з1аз9а
ТСТсстТвВіВ аравізЕссї ваїаваєсає аїеїЕстетаз зазазаїїва ССС аства 185 сгасаєнсатх тасстассва зайссскаса завтааваєє зазаєватаї Ссабставвсз 19328 заазазанає сакавлатес СваваасссВ ровавассва аксазтссава ассватсасав 1938а сів свВї ссЕаїїра їтаїазассра зссаастсвв Сссасктвса сесстватся 18440 бавтавстсї забатстссав кабаїЄтаїтв звїсазвсиес вісзасаяссс сЕвааассСХ 185008 всваватича їсзавсстях акевссвтва табраастта зазавсавсіс васаїевіри 16560 їзаєасвіза сСсасссваї сссвзававаа Сабсссааве аіїаасвак сствссареа 19620 зкааввссвае сіасватстта савсалавсс зваатзсзаа вавссватааа вівкаттвавиу іпевО сїсряазвіз: асазанваас веасахті(сЕ азазаваєас всваєдаєстх визасванар 1748 зававтдитеХ веЕстсСтТеХт сттлавсван сатсссстет зазеваїтввс ВТС 18859
ТвЕсаївіяаас Састатясєс сссбсвігас азазасєткск вассаствіє насе 195698 їстідааваїа вівасаваас ссасасвавс асвтївстттс сатстааттх тТазазвассав 18928 вказасасваса їзсаставасак їссвісавсс Тесс сСсаєтасне Ссаакраєтії ї8о988 аавасасаєс ссажкхвтссс асссттався сстансавтв кет астасв аїтстсассив Те бсассясссс вазвассвонс аврассвссвс ївссскссвва всскисаїсв вссавествв ЇМО штЕссСвсасе ВКсссввавв ВТСсставсв асттесссвзЕ зітвасвива ссасстстесв 111658
ВЕ есЕНсСС встнКссстр стнссвваКе Хсссвсстса Сссвоссває Срозснстес 119558 виссссствс вівівсасте всїссссааЄ Свсссазваї себсвсввса весвесвалв 11250 твствВКтсї ВЕтЕсКсТсс Жссвсивссї ЄВИїТвіаВе ввтакссвкк вссдссстке 11343
ТввасттскЕ сссвсввказа сскссвавата астсватава зссасасизи сатебвессух 11ла8 сис аїїжс азааассайв ззасаєбнсях засаєстсві савсстстТсЕ сте 11460
СТЕК сЕСТеКСКсТ стстетест стстТессстаяє тасадствіє асастанї 11528 ваввсвсаЄЄ свістсаєта ствїЄаєтаї Таїссаїсстї Єавсасстве свитвтстЕЕ 13558 втасватскс асаатснажс всєсстЕсає сакксатсст сарвсїтсас сссаасвїТВ 11548
Ссвсзвітас незасастита сасассвіся СвЕсїсїсвзз сваастввся араїстссва 11750 кТКСсссвза виставссса саїніКсссв ГсвЕїнівїс свіїавтївскс гсссятавсї 11750 ттсттнасяс асісввсавс сїстствнса Сррізваасе кваїссссна заснтантва 11520 сЕКАНнсасвх вавїсксваЄ васвЕсятви заваїтнатїс сваяваєтсс дзастстеєта 118858 їсвзізвсвн сзисавсасс сттарскзава втссвстстх вавсаїтснів асваннсяса з1548 казиааїсве бкївссваде даакисвасв звавсвавссо автвиссває ззикаїссав ї278а8 сввасарлясс вгкїратстива звсаквссав авісскаваз ссотвізаро ретвсваався з12пБа казеївавве їавсавврат їссааратса казараасва Тетассвита косе тта 1218 ссвайнасар ввствезанв ссактіавєва васствавва асттававає зссавевсав 121855 нвіснсссве КаВБсВЇТавВї зисзавесав зваказавіс сіссвавскЕ СіврваасавЕ 175245 пдавсваайаз саввесават зввавскксс ссвисвасат свтвазвнаст вВсвасттвв 1253588 твеЕссТсТЄ Євавстсстс ввсвевсвсаз кеавсвазва ссатвжстесХ ввісаєсвувЕ іга ссввЕарссї зіресвстє арсаївававє засстїссвис Сваавтавве авссатааса 12420 зрадавтвва разсссвтсс засввсатсв ссвасссасс сетавставра раварсвваз із4Ке свіссасвої сабесссази вабссаваїї сскзасксва засааканаї аранавсясе 12548
Тазисавасс завсзвсЕаа сстїлаввавї сЄсрставвва взавайвнах везе 125 сксвасеХвав сдясарсана шабавссвсе зіасссстса ссвсвіаара сатавассе 12068 асвараватс КсссвсСеНа втвсссавев аСазвесвссва ввасятсст дасте сва 12778 теТЕВсассХ Тваавасвії тссвавевтв ссватвисви ССС твсевВ ссоваавває ЗУ всавасвІСіс савласвеєї аасввісста вставабсссс саарезісїс звасссавас ї2н4а зеввіавссєт Кзавсативї атсвитазетр їЇзаатежває сеїааєвЕср СТВА 125352
ВІТЕССВсТВ всазіївствВ Єзазассстї Веста кесТстссЄва весвсванав 17968
Тдавріїнтне ВЕСВКВСЕИТ ВВВССТКНІВ зезіїввева ТВВсВееТї зсасзвтвеа 13828 вастрареза треЕрЕКсКкЕв звЕвїсаасХ ТЕвсатввис Сасасвснни ТТсСЕССсвеВ ї13089 стїїасаєвта кІвЕсаестса тТесаватвса шссзатасат атасввтаїє ссСавтавтеє 13148 кІвщЕааїтас яатаїтвссва втаїстссасї азжтссвеса абваславсЕ Тасясствеа 132858 сттатсстасс теавестстс свостсвасе сввассасс хат естсЕЄ вестсввссв 13266 стгакаєєся саїссстваз двсазвасвв вассказїяЕ Свиссаавааа Єсазазскаї їі352е ввасатсивсс їасабавтвї аркаїсавуЄ засвісвавак раваасаств аттсссїсва іхжеа всзсасярає зарввівваїє засазсавсса ссадаавсакєа асааасвааа анїірсаваав 13440 кавВвкастлян звазаїтавстї вовкасаїїс ар їсаїтаїє Єввавасаєс астаісєстав 1358 соссвтрасс ассссссстс ствосетвву Сдарависсї сСеряаставс варив е 13568 їткЕввятавс адасссттах ссівддастав сстессвВи вісссававї ство 13520 севІсСтасат ствістссат Сазвеїстваа ваївастсКЕ сзезссвасв асисставев їіз5ЕО
Посствісс астссіввс Срсваїавссї виссінсазї всствивиса ссвсвсасва їі374а
ТВассввраїа ссвтеравва вЕезВтеТМтВ стватттава встсссКвех вкеТваєстеЕ ї138599 зттїсваксХ савсссавннс ес свазах ССстсвенЕї ссаствівав Вест звав 118695 сттнакстїк сттесвВтТвсЄ аатвсстсвра їсдлатбастс ствеарваза ркваантсна 139520 тстсснавтя ЄсСвзазаїсва автксвсасЄ ССС Кісавс вКвіссваєс авїссасава 13988 сзазвсаваз васарвтаає стттсасасх Тасастваса автзатавтсс ствссвтев 14445 всвіазвтляс втстсвЕїсс сжсвадарве вітїтссвас атссаїався асссгезавсє 1а188 псасразавс аставевиаав васткттеввЕ Ссестсттвсс з'вВссЕЄта таврвсвссяв 14159 «ксравссснк свасссссис ссваствисх ссясвазаєта сбсвазсввс ванссасвва 143220 сЕсвсвасса Саассссєазсв всассвавса вкнссїаїтв бЄказвастса сСсссзівеве зага тгїсвкаасв сввісвїсав саавссаатв ассваватсс аїсасавтдає нкасвсссаве 34148 тЕкВінався йзазсвазаса визнансвссї асстстсава втснївавстї ссасвссвка 14405 ттссвЕкаас таситреквв всадвсКісв ссвсвстара касазсвіїтва десакассса їл4АвО тствскскас ссвсясаВКх асдаданКти СТВО вата десссесвх 14520 катвЕсвавс тсетаєтста сабсвсасвя тссстсвасв СКС сстЕ Скассквака 145858 тсссвКсаск сврсзсссвсв СвсдескВест сссвтвссва втссставвї вссвсвсасВ ї1ААВ ссааавіївеХ рехвитЕсвв вствссстве встїсттасє раївивтдна внттвадеке з479а
ВЕВВВЕСТсс весввискатстнв савївваВссе асевсесВех етеввссває кесаєсваєе 14758 ваїїївсссс ТКвстстсваав ЄС веиса взавасваєсс свіїавраєта рааствнада ї1482а ссававіраї варасрраттї зарссзватсї ссавасаваяї басаїстссї аавадаєваї 14858 віаассссттї Тавастїтбає атаїїтївсва їбазазалає аатттвастт ЄсСарастется 14340 сасесавссс сСавівастава всссавссас Сстассастї е«бассваняс Тасссвсакв їзда сстсссстсї анатваасесс детастесвї сСсТасвзвадсс таблаатсваа Сваїсвасає ї15ае8
Ксезсіваак КССгвсСвсавї саествааре ваїтайсвево сазааснсвс Савсеаттаєс 15150 зассдаатав астсасасста дасвиссвї сссвісвдаса їсаєсвессво секс 15188
Жссасататс ссстстваза сссвараває зсстдсасіс сабтївїссте аїтасетрії 15240 авсзаваєказ асссзівсає ссаїрсавзає Сразваасвв свсаваЕзасс сстессстсс 1530
«ЕКС сасвЕ сдЕсЕассаЄ ссаїсскасс асктсссвсї абававасасс сесассастї 15358 сасствравс зісазтсвста сттрежтвасс сатссазази вквсссаскЕ тбасаасєвахт ї15ага їяссазсаас засавасває вавсавасатт зслаїтасає ттасааіїтзс сатассасрс 15459 касставрсис трсїзавсва атввканстї стзствихнЕ Ссатвствех вас 15540 стос сассалазае васиТКвств зівдасства тстсассаїтс десСЕваваєс 13500
ТВі їасев їдссСазвео стсавасєств авсатсссвв сввскстсаЄ Тов 15550 твІтсвЕравЕ нараватвсї астварестї їсатвизаїа ссасздаани дСесСТвЕсстя 15728 звсставзаї втставраїттс сзсвтсвваї стстжвсстК Тастравняяа секс 15780 ствасраввв аїаєсттсаа сстТрЕвсгз диаєсвсоїва ваїбвитвсст Стрес ї583а стнваКссве ТссТВсЕСоХ Кастревтса аввсснвасє свіссссвва бсКветассв 155388 «сс свазввс ссасвсвеЄЄ сзсдссвваа акавастКе сестсссзкс ВУСТАХ і5558
ВЕСТ Кснс Ксттвісвих стсзасвісс зисасватвс свзавссатвви вес вЕсха за зажствсутс вббавссеє кстсутввас сТсбКессвика бвваїсква кезЕстаєиа їів85а тТЕсЕствЕвої Єсааввавсаї вЕТгЕЇТасвс ассвсстсса састваєкас вітївнасавне 1858358 акскстваїтся звавестсвс секс стта вастсзаиєсє тастнасяєх стввтсвсста 15208 всі КсаксвісКе сасссгствс ссввскаває баївсасвсї Сбсвавссс 16250 твСТссссва свостіссван сссВО ас вес вЕда вЕВснавсоє аїсссванс і5329
ТЕВстЕВаТа сстссетасв ссттсеттвє тгстсвадеї таВсстТсєвЕ вставав 165388
КтВсКссвсс тсттсасс всжссттссв їтсатаєствс теТдсвтаїс етвсаств 316448
Кіоївассяв асстссстас стсвсіКсх ссстскісає сієссзсває ТбсваврвеїВ 165883
ТС сТЕс тдвасствас вкаїссвсса ссттїстаскак Євсавесвсї вестсссєта 15558 виввясвавс свавастсї Сссвасвссв вавиавсстсЄ Ксссвобасє ссзаски іа8528 кастсавтїв ссаавіївав касові ТссстававЕ Єсвсосабсвеа їуствссста 156588 вастешетсс сеттТвствав воебдавсЕтЕ звЕставаде заїсваріас зарсастакк 1474 стастаєсте КЕсСтВасст всттстаєсс їсввасатах віасвстстї дкавеаавес 168кав ставвіства висткавіла сТрасавнсїї атвівасвте аваїтватавс весвазватах 1585 аксвтзасавтї зазсаасЄвата завссасааа втввЕзаїтря беввааневи ззахетасна ї6ва
Тдзрсєсявтів вссвеївеЕЕ стааєсстві зссвЕассТвх савівааєЄка гвааСетех і59Ка
ВІК ттТеатв ТВ ЖЕКа затсатбвзаї ЄттазасетжЕ атсззааєзає стссзаїсев ї7вав задзасазсв ссссвтсассе абвсатввих Усе сас ссаватстак сссттваває 17/188 кзгдазвсну свссдваєзи ССствсвасєЄ зссостсваа звис твала Свазсаасав ї71659 кЕВвасодаво засвіїссля зввІсссваа сказасясаї СабстаєЄвасх аабассвтах 17328 увеханікас тветвсссвн вабсвзсаяасс сссвазіває Ссестсасствас Сасвавссту 17280
БІЕТЕВсВВсв вавазарінат сЕвсвсдисв зввавсавсв васссввава свавЕссттВ та каанзістна вссвзасквн сарзассвнї астстсстсс явскссавтє вабсстасяс зав
Саївївввїс асвіссассв СЕСтвВте ТвЕссвосаї Ссаастссвї сттясстєесв ї7а5а нЕрзУнтраа сяСкзасрис сагррізава кайїазаявЕ засссваясї звавсавняв ув о звиссзвруз адаїзассса засиїзсвеї свосзесисс зазаттвеїз завхастсве 17558 «візттвтах їсссєвсасаї таїїзазаса ссртататнї зісввствка тссрсзідав 3754 їваїастаєв Сртвавссса завраасска сесвїавсссє зтрсааянїії айсастсвсе 17788 акессатЕсс тсаясстсса статастазас севссаїссс сваєстсасс вазсссясса ї775а тасавсїтсвс аавстїкастст сасаскіїза зражсказвтс ассассвава айбїссЄвсвас ї17820 заствссвас засзвасанає засавасаває зссвсваєта сяскїзсааї Сассатасса ї78858
СвевсЕствЕ Сассвітасє кваїссватс стазкаасан зЕваєстссє авсавсвссв 17заа звсвавариХ їсслазвисі вссабсвяса ссвасвизав СВТВЕТСССЮЄ нежсссваїї їі18в8ай їхассатсда ддасаїсстт вреавстатсс стсвівавсв ТТасезвнара авзіткиста 15о68 сетсТссста стасекеЕсте заравазкасск кствсЗКасх Євссассвва тассежассс 18129 зівяввієсс сСтвсссссс сісяссск ясасстставя сзвсаєсвіс завсссвосе 151858
Сетеввсссї Стасесібає вбсбсзаввас КТгїснезає сввзаїствв ВЕЖсСКсвскс 18248 зівлЕСВКВв зсаїсавест СКеТствВасК асвезаїсяХ вазвсваєске сжхвЕеасвеа 18398 сссттсвсте їтассттбатв встсстіасє зсавсєвиаа вувсістсах веааавсвесс 18366 зізавЕстасє сСвеазсасясн зссараваса ТНК сяХ Ссссвссвсс вазнавеаах 18аса їсвававвіс ТввжавсЕсс Стсвресбазсс ссрсїнвита сствавват Хессесастув 1845 вавссстстїв свавстсКї віїсазасеає біврзввате Бвісвсттувс сісктснЕта 18548 зсвстасане чсзассттвс сствакхнікс стссссвреаа асиназвссас СССТвВсСса іп «Кс тссасх ссбсодавсаз зйазваївосск стос сс ссвах стсвезатес 156650 їсасссазрнв ваісв(Тсс асссссствеї зсзавазчасї свевавеасве ССС есв 18728 тсвасїівнсх свЕсскіїас ассквивста ассаствест сет тсвс асвеесккїс 15750 знсвсаства їкстаститв сстсастаса зсвсіравда аїдЕастіс встазкивЕв їі8ав стдствстас таїсватана азвстсвває ссвтсврасс ссвеатстес сасрататса 18308
Ксварастсв ТвсВСсссве свстаствсє стлерватссс зкТсбеаєсвас вставассте за9ев сіїствадес сСеїсадвоза віїасвреваз зесастасав веставсває вавазсаїтвї їзаха сввартсвсї Тсввзавіту СгсавВТсїх вссваїзсвВї Свасвретвах засввтве ї1зайа тсасистссвЕ їзасяссавс застврсднав ТЕКСТ кзазарвїва Сраввннкта 19188 ассвестасн зваєсиїаса азизсасствс Таввсвісая вваскватаа Савеваслих 18280 паїваватвра зірівїсста зрставсвта асанстрсва гаааварзва вадававрака іп кзваданова вавзвкарара раванадава взвакистна Єразатикка Свати с 13328 тЕвВВіїсста аадбавзатва зависасасвс ТСЕТККВЕЕХ стяєсевату зтгсвесвех їз38а
Тсстятнвва ааззвтссвай завриссвсс всавстеста стасаассява ВЕссВсККаВ їзама вадевсаавса вавссвнсас сСсваїавсї всівсваїра Сстїазвсва Ссравнансе 13589 пЕсЕсасасв соававкаств вавсесисаа ссоввссараї вавЕсаввас асссавнсаве 135658 зЕКнасарса всаниаавск кзваднтвну сссвісваїс сзаасавиїс воссаВнЕасє із528 тХссввваса втвсЕВсясе савсставсс шатвссавст ссавеввсвв саврсавтссу 19658 сасВнїКсср завхвЕїнаЄ спасвавасс всахзазвас астиставеє встзанвати 13748 низїваїтави ати ств вкбсатстває сибваїваза зрадвовяаи кстдесннаа ї1чщай «витасвсах візІвЕЕКсЄ СевтКТСЄяая засїаазєвв заавсасасвВ стсвтівсвнЕ 138595
КСстессїсвя ествавазкс ссаастаіаі се стааї Стан ствеї аЄбвавитаза кое зсаластсва звссяваєсва зататавата батарсск зсасататвс стесавкаєї 1959 стві аваа КЖСТсСЄЕсСяа зазатассся сезатасєсе свастссссх квсатвтадає 28049 зЕСссвітаа асаїваантв сстксвітТтТсЄ акїавссЄта азсаатівеї ТЕсасдаїтса за10о «її сссеакс аввсвссасї зааасвсвіс ваєстестсв гост тссаса Зсаасисс «91658 заваїсстаєс ааззаїттстта сасатсктХ Тсвраасттваз авіваваєтт сраївастта 28228 вавассазаїв даасавсвЕсз ССаїстїзнис ассвівсбда ТУССсТяЄаВсї савбсаства за28а аїїсвдітла стствЕвавиї кстасвссаас дааавзатїав Ссааваскаст ваватавата за34а васвісзївЕ Встаїтавави звактстссЄ зізадявсак їставнсаваї Сас азоО чвазаааавї тавзбсстає таавсасзтах асссвсттТаЄ сззаваєєєв зсазавтаве а845О аїєвазаїда Хавіїсаїста зсзававано зассаразав ївссдзазає ссевсваває зага сввассввіє савассвата бавтКкеККЄ ввВсгїваттї Сезїзїзвасє спазссвасу за5вО свріссаккЕ дсзсссства Ссатласанвс кЕбавксатто свакатаєса стаздссаає гаБаО вВусвссваїта сТсствеааВХ ссгівсезавї ваассвавсс бСвізївиссЕ Свасасивах а785 ттвазавсяв стсвясвТвВ сТвидтївататв сваїттвассї вастстазаз заасасссса 2а75а зВКлїтавта асстїстисїа веванзакиї тарстясват Стасансава вкссзрватас занІй звавззссяї звазвсдаєкя зарсїсвава Тахавсрлвасе звасавататт сссазаваза гани ївВсвсааїва сссЕЕЗасаа закзависва ївтяссКТт всКсттлявс аавсаксски щизАВ
Хстзазрваї ввсзесСстс стСсрсаїве аастатснв сіссстїсвї Сасвазаатх 21888 ттЕшасТасс астЕнЕанКК Кстстдаза абавїсствс звевссзисав ассевсКеВ 21068 сввіїтссаї втассвеази вестассста сСсавссваза встазассє свКтссстає 1128 автссста всївсвсава КеїТасетаїа бесваїевсеї асбадавсвїа всасутаваї зма касілякані ввссссїван йасскаївана насвввавса даасівавня Севівасаса зів зібзакаасв васгівавави Вставай Сбвзаїсссва Сфісварзатв ССС ВКсаА г138а застане васустваас саазезаайс зіссзаззаз ссзвіасссв Вісасвессв візев
ТЕсвазізва завіввіств веасЄссваїї ясазітїтав асссвазнав сстсстзара 2138 їїсватсстїв вствтвріаса взастасавв баабаїавтєс Хввастаєсї внресссвасу і4ща завсжжєссає тсассаттта страввттав аязатаваст ТЕсезасава сасвутссся 21548 зввваїастс асввтсссає ваїтавссяв зввисатнсс заїсаваєст завравсасас зіва аксксєстсав зіїствясис зсасвсаасс втіавтісавс зсазктсала затавтетай віБва таїїзаврає зклавтствВї веВссттЕКЕ ссресиства яазизаваста авсссесаее 21728 їзвсассїївЕ сстззаКдна ззазссрааве Ктссвссявз засасасвва Єставтатах 21788 аесвітїствс забясвстає ТЕТвссаЕсЕ сЕвсавстте савтндваста стастктасе зідла асватрівтїаз трявівсати зв твавївз тясвсаївїс їзавтисвів сте вава 21чав скисазсвкас сасавазизи вабссвіаса авївсаїстс асввстссю ссаса 21958 сксвасасваз свезввсВЕСу савсвзасляте вссаавсзасєв всаваєваса засвасаєтя зах сваїтасвтх свсваєтаєє асассактвва звтссЕстсвза сесбестевеКи стасввстев 22а80 зЕзвсввтас всТвссассв асвссвкквї сротсссркк ассссскств ссассвасте з21495 бастврасвя ввасіславс стабссКус свстастазе вассусссіс ссвствааєс ачиао ссежасссст стек сссбсстсвс фтзсЕКсвсї вссвїТивсЕ севвасісвх вва стассвсяла ВОВК сствВ вайссвкЕяВ вряасанкаї сесктссвск стсазвввсссх безий вівстснсї сасавенїєї сСсосттаєсве зетсарсстЄ сЄвсатвсвсс ссзавстсвї за3щО
Гіасваввсс сасвівадйсв автастсссї ствидеаавє ястїасвасс ссвстеавас зай сизвасенсї аарвсвас вевісссств сетвтссзав зсстасвавт свв с езВО віссатсаїу стКстславн вваасескза сезнвЕстсс СКсстссвКе Ствссвсса аЖЗБа свватстаїс сстрвавісї вотвЕасвак сасссатвсє вротссаресв какзсвска 22520 сс ЕВсХ всжстКваст сЕСЕдеККса ТВсвІвсясв тасасстаск ассскзувие зай
СвствКїсїї ссосаавнаси азазивссва варававтас ссоктвесвЕв вавватассх 2748 сСвсссадасв сазасвотсс авессстсве вазесстссс садові ассссстеея зищОв «Тс К скттассста зестсзжве Тсдастєсто ВссвіЄсаса свв вва ссісвсвоКК Сссвназас сссястасоє шзавсяассає всссстазв: расазвввес ча9аа вссвссасеЄ касаввісво звизаванар свсзасаава свастстсає басссвассв -98О сївЕїтваїтн їсаїтитсаї абатазіаає встатстссє всавсктасс втааївсасе «2348 сваваствка авсзсаттвах сстзстсвтс асабвзївас вестстсссса стала 23188
Ттвіслаїїї вазайдвівіва вабтїстсстяаа зідасЄсаваз вазаїтатаїєу абазаїссав азі16а
Хсвстсстяє бвасазаєка сбляЄсатта Єсбаїттваєї ззазазатає сСтакастаах 23238
Мавсстваа Сзкаатлаєє звазїїссвис ствсанЕесВ ВссвсВВихс ссасВЕВВЄ 3280 зазвкзіссяв зіадовиасс Садсвивасєс свссвіаазе асбввснвас авсссвіаса 23348 вавісїсїїа свасїсааєе зсзаваарва авссттсвіс засасвиснЕ зесасрасає «488 екс саес Кссдававів Ссаазеаівс ввіскКсвлрва вассазавве свастеавас 23459
С(тсСавсва анввізатїтає севиааассї ссссвриВіїс сасбвсссав стасствсса «3520 сті зЕТесн завасавтвк ваааввазни Сввсгсссво заасвесвіс асхвератниа 235БЕ зеваазвкнсс ассвктваян асисстссвс свясавівЕї сссввараси ввсссссвВсс зваб касвавнвакс ассесвназа завааявсві їсслассасв сс сваввс зантЕКАста 237о8
БвІвІВатТаВтс тссаствасв савзвеваєва свсасзаєсс сзетатсссє свсвадясеє ЗУБА
Мтсстстаєа тезриазВсЄ світтсесїх врабадзася севБЕвЕастВ зваЄсвавкає 3825 вавсксівак зевровЕссте ствавассав вссквоссасх встдстната єрЕссвсТвЕ зання ссрінаїнсс нінвассасї зсассвавас їістассвії засіїїсавраа сіваксстса 23548 васісстїсва данскиатср асваїсєсев вараєтссва ватзкатаєсє стрес чав їдстнаввсї вавввсВТКВ івствиааК сесттасвсї рЕасстсвяиа звКставаавй лоба свсттаскаї седзесесси зВКестассвк Тбаснїттса свсавасавтс авакастсве 24125 асствеассс всестсївсов сссвоссКсЕ сазиустасв казнсїсаве васксзавіїс гаї18а
ТВІЖВСТВСК вЕСассвЕВс Кссстаасва Тест стект звасєтсаса вас 4248 зівсаствсї звакваакск їтїавоавствс Зввасасвак сасевіннак весабваєнх жАЗаВ
ТЕЕассствй свзвававаєх сслаксттсс твстсстсс авасствкта кзссавттяє зАЗБО їсаваїтсєва зкжжЖвсвсна ссястсзазвс асстеЕвсадє зааеїТТссї заваїтвавї заг «сс твссв Всссвсваї вассвссвіз гвакесстВї Тразетвсвї Саарсатвта 74а8о жзаїсваса свтазівсаЄ насвттастс асвавасвив СССсТтТасваєЄ сзвиавтїсссВ тазАв спаїтбївтвсв їЄбавтасвс вабадазавс зазатаїтакс всосаваста вкасбаватта Ява їсвсвсЕсвв ЇВЕсСяТсТтак ріїастадяиї саставєкакх вівсвдессаа аассасссся 24558 втасвітаза засвтсєсвса асвтветаку азиттесскса звсвтсваєє сесстасвсс зага асаватавтвїс стрсосзссак ссаресзаса встксссває сврсавстсв всасваваїс 2а75а звссасіскві зсаввсавсс саїсавТсс во ? «2105 6
«2115» 26543 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» рбА7-щшод Е нуклеотидна послідовність «4005 6 стсствсвВІс висатвсася бзсаззасвна сезасввата засстиссв сессссеса аа еаквкссрах саїсствзса васвеке сстсттавех Сбасссвсса абахвтсесв 158 тсазасаств зтавїїтаза стявависво давасраєва Єсхеставтв ваїстсссвр 180 ссвсвасвВсЕ всавзасвви сВЕВсВЕссВ сссавзаксї звсївессса КЕсадаєтаа га аттавитатваа втежтТЕСКЄї заїтсаитзаз бтастватсєза КаассЄстеаста всавезетва їа0
КтІравсїтаїє загасвЕжтї ссстставтсаї їїззварватс ттасатстЕЕ савіїнзсав зва павсеєтваа ХЕвЕКакавї вссвЕсасаї васазвтїави азїхзасвкик стабнвескса ча саївсвітає дасвавжжит взвазизтзас аїїветатаї асвакавтка сааїтсвстав аво скатсеввта вбсвадавтся їсттаЄсаса стЖетсссх ссваєссекЄ зсатсавсвиє аб вЕсссвсваї свсватааіх стсавтвесвс сстстссвдсс ТвссВкТва свхавтавтв Бов жтдессвасс ссатссаавї сСскававсих сЕссстссав нсвссвказах аврасвисає еВ «ТТнтадсїс адсссссвої їсстсвсвва сиввасваве свосввстса сстссвисте 788 всраавство ввсабвсссв вваасаветк асеватвасс сввсаріїсв весатеєссах на с«вассаріїс зсвіавсссвс всвасвввсс ваСвіссасв вівівассва сессії няо сасєссавстсє пвЕсвсКТаї ссвразвевсас вассриварев свсвтвіввс ссср варав ща втдсксвавв знкїасасвеї взсвсрасссв вссиссваая всдаассвос весасвсиае зв вивссаєвав свссссВІсЕ спанттїтваї сассрсввтс «ктрасвасеї вакавякиае 1828 касссасяає всстКсссву аВсКсКТсЕс ссвсвасасс ТВссвсвВВЕ са асВКа їажо вавтссававс вссїнвасва всавсссЕна вВСсассЕви зсвавсессс асвсстваая 1150 ссвавсссас всвсвевава зессссссве ссВЕСТвКсс сссасвЕсве ва зазаЗ ї120а свесассвсв ВЕЕНІСКІВ: ссаввіссас вісвЕвсстс асссссівсЕ вевБісвсВТВ ї36а ктвсстаств стрсасстввтх тссасвсктс сссвстсвсв васавсссва асссркасевї 13728 сассвоствв аввсвсктвї сдасятаваєс везссссятрв арсвавктвї всссвсссте Заща втвстввасс сазссвсасс кзвсвссвав шавснсвссв Сасасвраснв асискатиаї 1440 свдЕсасссв всесавсвасва вресввівсс каренсваав дісвсвннена Вессвавеаа їізпа ссраївсвср зснірсвсказ СсварвнстЇ авазвавесси ссвсвїїсва вссссвснеВ їв псвесдєвнсвВ алатссссса асвісквсве вісстсисіс ссестисвЕЄ СезІсїссес 1528 сенвсвскає ввсаЕсвсІс Сварсатїстт ссаєвссста арсваєсвсз Тесрвавстс 1658 сіїрачсвсс Єссктввсв ссвсвсссвс Віїсвсваве псвтакааїй ЩевсКсЕрсс іа жессревКВт стваввстте Твасвссеїа стскасексс тссасвсвсвя сесассвсвх 1500 сісвзасдієс весЕсвавсї свідснвесс дес ССтв звассвисве всвсенссца зїкев сВСВЕКсСтТв всдссвавсв сетссвсввая веаїтсвссв свситсвисв всватсисяв ага вваескатсвв ссвЕссвВссс КсевсВВЕса саєснісвсв сесвсялсЄю азассдасиа ізке сввасекасв засстнсвас вескааїтає сазвіїраеснс вЕсвсКствЕ Ссвувісвва 2848 «авсзасСнна кикаавстасв аватясасто всаївиатсс Те нтви ссвссвсвх зіва
ТгТдсававс всясатттаве асатвКВТах авсстсаваєтс зівсасссазї асасактета зіва асаплдсант авсссасіва вавсснссав засавЕсваза Тавіїасассе саравасаха зага бТасасівлас ссвгасакЄсЄ сдаївелаза СТїсвЕКККї ссасттавав саззатвсає 2-ва втасвавстї арїістїсстї Єзасиссвва аззааижкста савазіїїств Сстетавеас 2348 тасавттаттї стканствтн ставасєтаїн асстасасрів свіїтаааатх Трзрвевате зай свв ста Баїстивєсв всвівссстс твастваїїта сдеваїсвтв артатттссс зав вввзасвтиї стабссвсаз всстастстс Сазсосісаву ааасляскав Тева ста 2528 вітварвсса заїавтістня вататастак СтвсавКкКсЕ дсасасався акрассраах е5ниа сЕсазаязвасє сстїївазвЕс їазвавсЕЄвса вісавакссї знассасїєї сві вся за4в каасвівзасс вватактваї сстстааати ТОКЕсТЕсКЕ Кісзааассв ссастаКсТх 27аа твасзазавс аттстскааї веваїссава сставсансс тсссазаттс роса тва зідісассві СТСсавстсх нстсссасст стсвісввус ссзавайсса стестаВЕсся 28520
Сказав асвсїтсатва сесактстасає акасаєзсах сТасасавсє зннаастткав зва такиказвсов ансстсєваст сссзастваї авеесзавес ссссветаса сввазаєссаа 2348 ссзассазіс Гассаввсви ссвсссдісв вивісїїств свадсассїс Как сстра 3850 авеїстлякс їсвавнаєтї зараїїєваї Тасеїїтата зіїасзаавЕ сраїтставЕ забва вісті тнаїї сСазтвсссаї асаттзусаа їТазїставтї астттєзатт сах сссвЕа 328 чзасстасктта стасссста Єазаасвааа нЕваряааає ввссаескіаав ассввавкся зіва кдавасрасз віствстаяХ вваїсісссе вісвсвасях сСвсзаавсвв вскссссвсВ з»24а
ЕзаансТївс ввсснсвита ссвсссвосс васссавакс фоссааввсс ССС сва 3388
ВТссвстВсх СстТевссвсвВ ссввесасте сесскесвос яасавенстх всавссваєа з3аа вкянксасте зЕвКнстЕсв аїссвваса віавсзасса збїавсвасних акїавтатав заха есзваїатвсс ссрістеведа ССС тевазс вствекстіКе сс вІтвІ ссасестаза защи всі стваве васавствсз ваассистсв вівасЕсоктс аїссєсссза взаставасу 3548
ТВЕЕСазава васаїссасв сатвкатате вазвсвісвсї сттсскатсе кавастаке зБаВ їавїазадїїу ввазіїсате ЗСїїзвазвад зсасзізааа ассвсваває ссзсвяисуса звеш ттївасавтас вастасазадє бавсассасс ввосаствес їсвіїасаса ТСЕсслекЕс 3750 соктсассст сассствтви ссствЕсатс зтсастаєта састататтс ассвтсаста зУна сЕтсасвеся сзізавсств їХвастааїс зітавінавс стЕсссадсс ЕСсссВттав 38540 сЕсКансавтув сстресссвсс ссСабсваввеу садзрлазвх вавсстіссяя дрсассвеанх зва задаравсас сттвтавств вдіссссвсї Есставсвва авизасвааї ссістястав з95а ссгКсаввств тствааства деЕсвівзтсве визавареївВ всдизвтавсс страсавискав АОІа вЕсВІсссає азвесавтсс всвтаєсстс сТавазидаїс взтассався втвхрахсав зава «звсВсанії засссааваа аввтвсїсаЄ сакабрввас васанвкаро ївантаєвав аа йерізваваа вовавсдава здеїасаївї варскаєсса вітЕссвава ведвассасс дво зесазнслас арвссвавак табссарвтан свавсієрає аасзисявії ссааєзасає 4965е взЕвавсявв сасєсвадяия вестссссЕх авссскксте зсевнаваасх свіставвЕї а328 вЕкЕавазвсиса вабссвваза всссезасала нзавтссава весавоввва асразавксс азйеа ааксттвази сставсссаз Вссставана ассстставя тетвстасСсс тсаасвисаВ 4448 тВіївавказ звассвсввса ввантваКаЄ саззваєссві аксвтнїста всскксквад 4588 еБЕїввсясв всреттвІїа грсвяїствв: тссасвтстс ассаваавта дааветссва аа зіссасазанї саїавсстра веїсссєктвх ссасдіааас вазїссвиса зяавадетах зага всссвссстс всрттвавсс сатссасвіс Сарсїссвав вказазвсасся свавсавсве аова аздсватсвз: зрвинївтсся всріасясвеа вавсВВККсс яаваясввах Веавслацняа аа вгїсвадаве їстрсаавсс асасрвитка їавааввсуу взавааєска фетстсесва чна всїсярсвсв ссасстввосй вааїсстсав всаївиваре асссстсаввс тсввакстсяї ав5а їваїстсзвис ареїссввая врозазвистс їззвсаїстї ссавесстсв врававснса зада свсявавссс стіразанко їТсввсансаї савсзссваву вісавславс вівсавравна чаве їсвслваїтсєс зссеввиТВс сСтезавсстав їсасаксвкта сссазсвісс Єсаастстаа за кскаїссаву сісвзавека вслисависї сабваввссс завввсстуа авяссвасаи зіва вавсактава авсатсссса всассааван сстсарсана врасттаває ствріававія 1658 вавзіссаве арававатстт ссаєсавтсї Такваврнека саївесатви таассетава вва бТвсааксвса асвссвссся ССС івісе СВ їввсаа СВІ ївсава встав свав БІО свЕЕНТатсссї сСсЕкаїяває завсазнтав Євастваїсвс старвсвави Свати 53з4а
КІСТ тасСанс веввоваскиЕх вааасрвакси вісрссавсаї лдавазаснна вревавивЕх зава
СсттТвсвсса ТТсгссаркс Євсаїквасїв саїнввсксс асстсесаає асвсвасаавр 5460
Бйсвактваар Свсаввівїс ЄсЄкаавіїї саравевває атеїкрасян заєзарзасв 5578 ксваївратаї Сваїрраваї вррссасстан техраатста тс ваїє васаставтя зз8О саїсссввсс вісаассссї ссСаватсавсЄ всасаваєстї савссвавта Ссрассасс 2548 ваїтакзвву сСствіаваса сзатассвав Стас тстава кееравасає асазаасавсє 5780 їсваїзїааа сваїтаравїк вїїааастта вїсаттвазаа стататзєза зрсстазазв 57650
СХаваїтвс ТЕХ тавтсЕ сааатастата аарїстазак врЕСсасаєх аттгсттаае 5820 звякнквасї ссЕсснЕзаї сівасссвнає севкстсатс астістрвссЄ ссавттстав за8о тстаяаасравт ХВО СтТвс свазваатсї ваввсзавав всзавіїтваї сапснссесс зай васссасесс вавссвісав сссастасса Єсвссвсвна васссссава стсавсстес вайо асссвіскиї аавазксаса вевсавссск сассассасс заїссвисЕх неатрасасс ваво савридасссте всасввнавк севсвсасих веЕатрсаавт дасввраєсає саватеяавсак 6120 нказасвасих свававасса Сасватетав вабасвавстї сассатсвас раравастав БІО казватсвася заазавасав стстсесСває Кртаскварств всасараєви вісівсстса 6248 асасвсстстї аасасреЕска арсствссса асасетавсс кссввлаєсс висів акс езаа ссасвасісї вававаєани свсстсствЄ ттсвВІїссвс тсавсссассв васякссвтс 6зев асвіваїтвра ЄстсвЕТсат среЕсстств асайссасаї страви сатранаєра база вісСтсясав тарвісство Ссваїтассвс врарітаїтви сСтесаавтїсс абаасстрсс вава вссСсваавіаї Есбдсрвавс савссеваси шнаастнвЕсв авсссвЕствЕ асасстаєай вада зевссасвасє аавазрайсе зазакттстс ссстватист сСтсатїраврс ССсрЕвКсЕх «во
Таїквасріс вкаваасссс їстсрааика асвадасктї ассасвсатв асрвтадвас ввБо
Тястасіївї савбасвавї асрававаєх асствбсттс КеСЕТТВСС етеякаттват вза їврасасвії вравадаанах втвсасттсв асстсавастас тсаванаїсв астесссткх б57Ва
Тсгстзнвав їагїсваїсая аврвсабівасє асриаанкваа вссвакстс Сзааввсссс над асзатрвадас ствазазаїту їсласазнсс Сазассваза Тсразрссвза аїсасссзас зо сЕвЕаксісїЇ ааассарсаз асастссєсс тссасавсає ссааїтсассе Свсаскатвс взва їссависаїї всаввссвив сТаїїврсаввис савваріаве абанавассї Сзавсрїсиї 2а28
ТЕВІВідавв авїсакстїс завасстаате вавасавате Тарасвнсвв сасваанаст 7ава сівазвасасс арзаарисіа віссвввата авватстесї аїсссваєте ассісторвтє 7140 авртсссавви сссстсвасї акавсарвав казинасррх сасзавасса рвнатавінає 7788 вІСтссзакто сТравссєваа свІсСатарс таатттттсс пвх ссевсгасттх 7269
ТВ аЄтТат втїстввЕва стаєвттатт їассстєвтс сесаєвсттв авввіассся 2328 аніавайєсев КЕ КЕВСЄ сссаївсаєс арзаввстса ссстаїтавс Євзазвства уза застїтеїсс сстастсват ссстарттеї вСзаасетає кбасатиїза тЕсесасава т44а асвїанкївсї їазабЄраста краріввсїс сТварассна тТвававаска єВЕсаввасєе 2588 завиасваїв асаїзаєсїаа вавсвааєсї реаавнсссЄ барні СТваз Ссстасссва 7368 вааївіїїсї вїсазаваїта втерсраїттії Траассааан дазасаттта зазаваєсавт 7520 акссвистасє віссаєвсва атараалеєн вістарраєс Траїтствтлаїт сжтавастта 7688 завартсткї їтаараєссааи сТссЕвисТвЕЇ дсасазазсї асазаєаата саскткавас 774а
Таїстнвсст ївасіавасє Сссвстсайї аєстасївав всставакааї арасстисва "вай зівлесвсат бсссвдазвави Хастсвсвак кссасваїсса вісаравяде аїтвссватсв вра каїсівзарав сасасветсс стсвавтссї заїбрсвсясв Тзаїтсзтвиї ЄТарсвсзає УЗ ссзазавкла квіїавізсста заздасвиаай Ссствтанас СУК уввс вссвававай ТУзкВ квсЖавКісї зсвсктасах сах ставй втнвававсє ваватєстксс зкссдаватає 848 вівзаїїїав таїтататасєс сствсвасевї зстаєуктвс тасекввса звстЕссвва тав дастаєтася ЄтассвсзаЄ втебасвває всведавкуу вавтаєвсасє вівссваве вій ксвсвстсср сзавасисав севассасиа азвареаткс атасаввасає зЕстсатзис ваг кЕсстссас ассткссвас васаззсанай састктасза савктассааз сазсзасава що свасааасаз свїїтасваїс акаїїтсвсва їївссасасс аївнссїста Ссвстатссе влав
Твствестї вссввавстс їбдватасеї сасетасаає вреввставасєє ствнатасссс вава вЕсіїїссвав зазвтсств ство сах всавВстван саствввває стассассвЕ або заствсствра Гасстсстсї їсвісївВссї севзааавсве ассвівсава асавваістса й5З3а всстїїснва стсавввасв сівсвстевї гСасваєтьс бассавассе Кссссвасав 8558 стївствсаїс тассттттсЕ ЄтТасттстся таврестсви ввасісзаве Сссвеввайа Ббзаа сатссесват вівастесте вссссїтвиве ваїссстсав всКаїссвве Ттсассасав УВО савсвавтає ніїтвравстїс їсвасзсссї сттсасввств асравкаава зВсевасса вувБа веж сстсвсатсЄ вссвссасяс Сссесссвіс свв сазсвВаХ свв ВІВ звансесснавв ссгвісвиак яса севсКЕ севзіссЄсх вссавсассс сснККсВсВЕ вино паїсаївтас ксстзстаси васстяство СссвЕзвЕЄ заст вевавазВа аа гаїсвсссвв взіссаватис їтсавїсств Сабстктвс беїсассста тебасвзссве зава тїасвїїсвр зваїяссвсЕ Кстдвсстсс сСтвоссїссва стссевВиКта СвеКезасає заби
Нттсвїстс кбсвссвасх їсївссетаа ванисасваав сствавився стаадазвесв з12а вІоваїварвс всвсввснсн ссвввссвсс ссатесязс арассвзаве авизавеех зЗіня забаврасив сісісзстас їсвзісвсїв нгвабїкісва Єбвіїаїаса Казав ис зг48 вісїїїсаса асттассніа абвсаївіва вассзіавса свббавтссЄ вссувтсата ззва
Ткасаасвсї скКссссвзЕКо зазвастєсств їсвасссзава вабазклаває сстссааасВ взво зіїззааанв візбяїсата звіїсватса ссссїасставз Гавабсвіїа ассассаїт заха зіхезІтана аззатаєтуз баставіїста дустрваєви забаасївава ств лава віск ссЕССК авзассзастс звдтаазсвех ТЕСТ В свсваа Кут су з54а
Тессіївсїх ЕсСаазззваа СсвККсаєЄаа вабвскаїво сзезасяста встасесвух зов всзсатарсв Тасавссвсв раквастиїї ЖЕТсССТсвсс Всствссаст сссттсвзаве зева зсстаадавс тссжтстстсвВ саввсясасзс асвсзатсеє зівсвсвсат всвстаттас з728 зсквсваїсис сасисавасс Ссссстаєсен «сстасаваку яесісаєссв стос з788 бастсввасєс взавастсеаєс ваїзсзазса звис їаазазн састасвкрав дя кас чзвавз засааіїзсс засазсазсв висвасаває засвіївсаз СбТасаєттає заїівссаса з3о8 ссатвсостсс ваввнассст савссстївсв сіксссстес Єсствстсва ссссасеаад зза
Ттїдеївстсс ссзававсвс васзадяаав зксжсвісаї седяваїаКи всстасиву зва2а
ЖезесвастК світзазвава сассстввтрР пдазаваксат Сясттвссла кствезаств 1веава зЗівстассра СТВстїсасзав савстссаси СТаваїстївс їззввстває авраївнссте 185158 авЕсссЄтсс СссссвВіссу Есссасваве ваїзстстсс варазвввнсє взЕстсатсВ 18288 стдатстсся аравтссасє звавсавстєв зввссдавев ваївттїсвав сс 1а3Б6а стсаїветвс Кгясаваскї сствзвЕста ссястатися систвсївиї дствсвстка 133720 тсквЕхаїнЕ ебасасскс кстндазтсв сівівсстви заїтнсїсав нкзаваснів захва
БаТВВсссат всзтвзевиї веазсаїтаст стсссвствв авасаєтеєт сссвасавав 1448 «їатссвавт тест Етас вЕаВсЕсвеаї Есввавтикс СВЕХЕСТТЕВ СЕНС 18588 звсяїазсам всзвссатвсї зссссїсваа ввосстсавсвз сраїнссваї сттдаесассс іо ттісстстсовї бвссттссаї рададвакск строхвавеї ївавітстсст встатнава; 38538 сТТдВсТТсс Татївсаавсї завсїїїїср стсстретає сактстессс нЕТвоссстсв забБа ватсннсвнсї КТасстїсас сстакасаса бесжсвквас бзадсастає ваїнансїсся 15740 сіатрехсвв аа саватає ввасствттв ватасссувс сретазстас ветвствиВЕ зава аск сксво КбВЄсСесстї сссбасвссс звсссввавс бабвсасвсс Сессвсаасе задБи хевссвОКтс їсаїтвстсяс стссссвсв СсиазЕсссва сеансатвст асїтвавессЕ 312920 пЕТВСВСЕЄ баса сВсТ встаасКвТТ ссср ВсветТясвВа ТЕвсвКатнє зіва сіхвссетан ствссзеаїє вавсвсеасе КЖсвВсссттс асвоссїсва ЄТсаКасяКеЕ ї1т848 ствздассве ТссївваЕтт завсавЄвсї їсдававвся сквасттЄвВс сасевЕВеКа гла айентаєте сЕевнстати ветваїВстт КсЕстаассх бвасеасвІт весеатве 1150 схведнарай засвслисва ТвакЗїсисТ савасзсетв всвасававк ссосттавнає 3539 твиайїсстві СКссВЕКсТЕ всовсваєіва сататая Вестоїткаах свсвтсавиє 11588 певізатаве свасозквїна свсзсвасеО світасна засво асевхкзане зхз4а
Хсссдквате асасаєссва ссвсвасях заазсзавах зізрсвсвоЗ зассадвата 40 застатсвке сксвеївеса їствасвїтас сзвассквус васфазнн сссваккаа зх
ТЕТвВтстаВ ЖстТавтсстве Сасївактав засвавтїсе зассваасса ааататазає 1558 абасзви Її Тасататате сстїтаавас ТЕТ віава аЕЖстсТСта взаззаїатс 11588 зазватастх всвастстТс сввсасвсва з СсеїХз затасвавит есЕссаЄЕхх 11648 тТвВїхаастсї азатазвсєве ЄХріаскатєс зІїЖтсЄтах сзавтвесасє таазаєвсес 13768 сла встсстссаї асссвсаксеї сявватстстає сазааїєїстЄ асасвксттх 11768
ТТсванісїк авртвдааату ссввтвасєту зазаєсаває зевасаївтс агтаєссавв 13яза таїсаїатєтв вітїттатас ссваїтаста заїїтввЄта асїїткаває трівсаксяв ТІ8Не свйазазіїв вссявавсвас саяватаваї айпатассаїтв свісаїтївзав вазаїїсїсс 115428 ївЕїваввасав ТТ їаасавя їсатасескї втаававааа СКаасєсєствз стзасасаєа 1-й їтабствстта їсзазвассх взсзавесва васовзазаса асавїссассє засадавава зов ававссвравз асестиваза сссвесзааа ссвзассаат ссавассває асВвссввх 12178
ТВБІМТКаСЇ їївагаїава ссввдассявс Ссввессат сесасссств авбсатаатай 13188 сіттвнататї їсаяваїактї астазвієва сиїїніслах авісссрввазав СССбисвавв 12248 твазаїсавшс стасасввсї віаасатваз сствазадса вестсдасвув вствисваках 15388 візасттвст Євастстаяй зазасвссс завбястват аасссєтвсЄ зЕкааваяке 12388 сСузвстасва сгтїасавсаз ввссаравта сазаввассв Зававсвахї ваавстскаа 12428 зтатбасизав вазсазатах Хїхїваааавз зтасясваїтв астсвиавасз ззанавявсе іхава атататсстт твстсттавв сававсвтссс стстзавнав тввсавусте сстствсЗВ і2548 їааствіїзї весссстїсєв їтїасаававї їстреастзс тастренаас сте стваз ЗБ зшавнитввкій взасссасає вавсаЕвівс їстссатеса кс стивава сесзаяразаса ї-550 їзсаїзсаєв зсатсссзКс ввсстсксус СТЕК зсриствати асссавався ї27ха свістівЕжа ксссаксскії азвсеасставс айтристкз сзсдвістка сєсевксясеа 15758 стїсзавасс атшсавасїв ствстрсссс тврадствис аїсвиставе ссвЕнсЕссВ 12848 сасірдесссв кааритссст арсиасттвЕ стараттрат ррявссасст сткаавстесс зов
ТвстВствЕс сствотвсск шасвсссовВес сЕсахствнс квассвсясе сКссаВсКес 32956 сіІрсждідк астквсєссї сзаїтвсссв ависаїкво вростає с дався зїзаха сСіКЖВЕСвсс стсстссасв ВЕККТвВсте СартТавсавс брссвсевсс стісєввасї ї3а8а
Кт Ксссвса везассвссв засзасссва Сазваассзса скарсвівтн сессаїесе 13146
СКК азавас сазезавсаяї зсативсатЕ Тсабкавссю стстсксвКх сс 13288 сістсКесК стос стос їтасбвсавс Тест асиста ассеваваасв 15260 саєсїсзістс астаєтаєтса ЄСатїзсссв Сссїтвясвс стввсарідї єсттЕбасив 133729
Жстсабазіс ваксассссї Єсзісввета сссттавесї бсастссває втїТвсКвсав 13355 їїзсвдався Хкжакасасс зкїсасенЕтс їсаасивасх висазнаскх ссвадїссе 13445 сввакестаз сссасзтяух сісатсвихв Свсствксавї ветстсссаї абс 13558 асвеасссвв Савсссстст адсасвЕсев весввнассс ствавеаєвтя вгваскваве 13568 зсжівавікї сизівасвіїсє асврезанятв зстссвиврва їтссдаасїс сетассваа ї3з5ІВ
Есвисарсав сасссутавс вавадіссас Ссттвевсаї скїзасезвя сагававнав їзБ5а ссвеяснсвсс взавкаавВс засвиззася звссавтявх їаасвавнає ссазевасав 13748 авссатстнтва сказактївей ссвеваксси ззвассссвї задсевснта весзизавсе ізвоа зЕнЕКансва вваїїссвав ассзраззва асраївсаєс авсавсссїх ссоатсвава 1386 зсапивсїзн задиссанів вснавасути ааизастїав азасассарев дтааввссих 135929 скавтавсвї Тавїзвсван йіаазрараз зрісстссаз ястресвнза саврадансе 13388 зазасавзаеї враївикавї їтссїсався вівбсвіваа вестввїдак ТІК 14848
Кстскванї сстсрясвЕї втзарразсв задассатах стствиссаї втвїссавта 14189 весттзсвих всссавсасе звадазсссс савстваакт звшиаассаї васазаванне 141690 ївнаравасск віссвасвву вісвісаасс сабссвтавї їларавааавс драаквксса 142598 скастсаквсс саявваїсса нассссввас сєскизасави адитавзваз сасекаввев 1-88 кавссаввсяв свватствав ваастсвуєа вивеказває ввеВсванаї аавсссвасе 13548 твавсвВіав савядаївавс сасвритаїст стісассасвї азкасасава сттсвсвана 13488 взЗістстсні засавтвосїї арираїавксв Ксаввдаїавї ссїїнасСвеї втавтстрнс 14480 ас іваава світ сскаа ветаїсваса всретстКї вкївсесваз зваїтвсвасв 14520 тітесавазс рессвасвис стїзестакат сестсаанка їсїсаввтісс акасасвека зазва асстКарасв сриїзІвретуа яссаїззаси їваїтвтваї ЕКС ВСТВесТеТх 14548
Віста Ся свазає ССС: вас сС Стзавресвтв зЕзвсяВиК 147за
ВІЇ Аси ЗВЕТВНВЕСТ внесе вевеТнВсве вІстататае їТвкарастка 14768 звазвкввнн: сеїкзесвЕї вастттвсаї вевствсаєск тТренЕТсЕхХ трвнсскаса 14538 свізвТаїта сТсесвсваа Сесавссваї зкаїасвсвв Таїтссаавіа «сет свВвва 14888 асзсазвстатв ссввріазЕжЕ ївстаавїстїї весваятваса актвтасвтєх хввастатсЕ їаз4аа
Касттвнсст стссквсЕу авжствваєє асгттаєтс ссбсассттв восвстсатя 15258 ттсасяїссс їяазквсази зсавазтсва збквтквсса зазаїтаваа сраїтннатах іс касссвасзіа вівїянаакс йзісвасвїс вазазвниваає зсівасссте Єсвавсисає 15158 нЕВСсСВавЕНТ Ззаатазсата Втсассзвай сабаасадас завноївся вазисаавас 15180 твазанавії звстасєвиас асссаввттсс абастррдава сетсаєтаєс станете 15548 шассатссЕЕ сстсствсїе Жавіїїевиав всссінвкас сСзасвававе СсанЕТриКа 15508 чввсаваїся фіаїссівЕй ставсессттс ХерЕВТТТса вавссстсве вссвссвксх 15360 псвістатсї ссвіїаввїє їдзавраївкає їсстсасясє вззсрасвееї завевтессста 15428
Тескаскссї акссївсва?ї асстввсссЕ савтасстнв авнсаїсвснс аскабєваєів 15288 кавгасірівкЕ зивавнавів ТЕКСТ ваїт таванстссс беіждникна сн ассеВ і5540 віїїсєввїїї завсїїнств ааассжесся внїжссвЕісе тваавссссЄ звавсссвав 15688 «ттксїєЄсса свїтаватисс їбраїбсвваї астсстакар вавареканв їскаїстісте і5650 звівїтнада Тсдаввтвся саїсссестЕЄ сазвсвКвїск забсаассса сзаасававс 15738 ававидавкане Сватссттся СасксаївсЄ дасаавіває антсїївссв СсвсвКатна 15788 савсвістев їстсстїсаав аввевІстжтс красиїєсат засваєсска авксстсатєтня 15848 завсаїїзвв взаваасїїЕ свя кКсЕ свртсасввск сТтатаввсе бсавесвавс з15в5ав
Ссвесавссс севссснаєт ваестссвЕсаа ааїасссвай свисвавтта Тевасствся 15558 вссятаастс сасвЕшіаєтя аксвариассх актрінзана стсатстсаї врвавсстса іо засніквссв їсавсадаск заївасеваа абссвісвсаз свасрвасвї ссавТЕвиКе ї15083 засвазаксва засавивавс всстВссукї саварісвсв австссвсає свраттесие і6і4а сзласжасвсв СТвЕВвсавнс СссЕссВтаї Тававатасв ссвравшсава сссаєствсв 15298 ксасєсвіас зестасрава екв сова соте ссср 16250 кавстсасах сстасаїсне асеЕнїстссх авсеиксвссє сстрссаїсї врабаїтсссрх 165320 сассжЕвсаїс сасвівсвсс вссссссвтв скаавєсксї завтвтсесе сасвсказаї ї16138а тНЕсняївиЄ ясКЕсТясс стдДТнсКЕсЄ Їзссратввв Снкависсна Весни Е 164340 стссвсвЕсв зтвВтактве БЕНасееТї СребктвиВї свесвнсясЄх ватсваєтта 16555 сс твсЕс свазвесссух десадазаас звиссасєтви асїзвваств вяиаасесзиае 16550 уваскавасЕ нассавиїса васкссляисва вавссвсаєс сесЕсазиааа Єватбтвіаасе 10620 ксКїтаквсї Стататаксх всааставва азаїтавсста асскктаває сттасасата іббва кітїтїавізаа ставиїттсва ссастстатї аїїїасвїсв завстїаєсєтїв басвкстссс 18748 стстазасаз асссввсвКЕ вус асве засссакаах сзазсвакса зсвстсвасх 158580 кави Ствів савіїаасєтв заврвваєїад слвссазааї всаставсає Таїсазссва 16586 асацвіїсас астлратенс саєстссаєс заїассаїтсв ссекЕссКс Єссетссяса 31595708 таксссстсї вавасттрав знасвсствс астксаєсех ссткаттасЕ ївїтасавав ї16985 їваззсссаЄ всвсссвівс авадасївазиа абврвсвєавв васссстссс ссксасткс 179430 тасвідЕсКе ссвтссасЕс сассасскссс сестатанав сасесссаєс асттсвсств 17188 вавсассвтс всіасссвої сзбскаїсся заздаєтассс акїїїтасза савбєвссаа 17168 сазсаасвва садсазасза саїївсваїї зсасутвсва їТтассвізсс зкяссасста 17238 всвствсїаа рсзаасввва ВсТТссассе вед ссатвс севіяссвеК васссссе 172856 сІїхсвссая вавзнватвтх вссватаває стивістсає сатсвстсвва вас 17348 зсвасвства вЕстсссвра тсбдавсаєс ссвеТВВсЕс їсаЄСКевЕЕ сс сВ 17485 ваквзаввана Свстаствазв яссубсаїврв ззсассасан алввисісТвв сстаавіста 17408 взатдсстак яссссасяис кдатсссссв стсссаствяа вдавсссвеЄ встяссвая 17528 хрижаїасст їсвастстех вставеакся ссзавасвих сс ссесскнеВх 17586 тсвстсетвс ТЄсстзстня всСтвависти касссвсси скраїствсх ассесксссЕ 170648 зввосївсає ветссасвсї реазававасє сект ссе тассвксстї вас 17704
ЄсвсїсЄсві сввсстїаас асссвисасо аїдсїавссз СрБівссств бставвсств 77
КЕсствстна сстсесЕсс ввасстттвсс адратсвваї сккавватст абевжсссте т7я2а8 вискссаавказ всасеттктЇї асесвссасс сссвсастаз севтнттває аанкассске ї788а яЕсазазинс їсасвитесї стїавастсз адсстассра бксссввссз сетаїнсвЕх 1973408 вЕвсТїсавса СТУ сасскї їбесссвеЕсв зкастаснта срстЕссаан СКК ї18вава тсвасабстс твавстсвуЕ атвтвЕситХ ведавнивіва всстатсстск ваясттнете 1855 ватсвсскстї тТасессттст Ствсттссса вистсасстЕ ссрнистава ССС 18128
ТвсктстЄсв єсттвежссю тТесвітсаїз ссротвівЄрв бабсвстест ассвстатева 18158 птвнассЖиї стасстсвот ТЕСТ КсК тсатсжсссВ саасттсвав сВТеЕТТЕсїї 18248 сТВЕСвеасс скатеваїст зісастсста свасївизве брставсіїс сесазвавас ї858а задсівадях КТсСтсстаас детаравкає сістбісттрс басіссєває ветдрясєса 133650 всївссвааї сварвсавтсас ств тссста взвттсассв сррзссстас сестарасттв 18428 сТссТсТКОХ їазвдстван сттЕЗВиНСтТВ ванеЕзассиз штасависяс Свссстаста івана став сстжесЕТсТ зссстсарас згтаесвіасде сстїкевава зввсстацаЕ 18548 сіаарества візасрасва всїсвїнтва свінзаясаа Гаасеиізаа абатазївсав 18500 таавтдасааї заївазвсся сазавадтваваз аївадреваа денраваснї дівасвавсс івеве чЕсанссват веївссаВЕх сСбвотвїсвЕа СТвссаетав зссакиваєо СВТ ї187ча таївЕвтКЇ сставаїсає вавіїїсава стстатавза бааєсіссза Єсвозававс 189но авевттесях асссасевсавї дваситктст їсвсссевах ставку сткЕ акзератваа 18548 всзісассна зсзшесствс вассїзісссЄ сазазистїї зазаїтизаса зсазнизаса зай навсозасвсї ссавзаваєсс сазасвалає зтакссвасста бастзатясс аїассастаз зівозвО
СТтзствствс ссвразтсве заїтсссткав твястсстає Євастасаавн ссссеттвнс 12828 вЕсвизвави сСваїсвисвВс ввсдававес адсвнастся кавасвакес ссснвазнає ї1зо5о скславссваз сидйсзваат садка стссвасВї застватосх асастасита 15148 ввЕсаївісс вссвісссаа СССЄсСввсса сс сваЄ сТвСсСТсс Єссаввнати 18568 тразівсназ сврссааввеї зараваасля ааваїзаєсса зяссазвадса акавависса 13268 звівпаряїав Сссазабвів састтвїсяЄ Хрссзаваєї авіазаасає бсрвсасахї 19328 вівїтсссас зсвіїассвза ааївсситаї асвівттвис СТвсасттвся Сеазатавсас і1з38о їзсвсвіазв сссазазвяя сесзсвсясв всссасвсзя авїїавсасу свсвассссв 19448 я«Жссксвадхс тссастатах завсссвсся Кесесватст сассвавссс авссвсзсвас 193508 тсзсавстсв стстсасвсс сбазздавсс заїсассвсс авазаєтута савсвастас із589 саавасзасвас взасваєсєваз савсаїттвся абтвсаїстсв свассассвї ассасевесе 9628 ствЕтассвї таствнаїсї ваїсставва зсававнатс сСсставсаас вссвавсаа 196588 звиїїссака звібСврсївїсє васассавсв вазасвіве сс ссХ вассссвска 19740 ісавврасвні ссфїрвавсї вїсссісвів ввірбсвсва вавзавайсв встіасстстс 1980 тстаствсвї віїсзваватє аїстїствсв бвсстївссає свваївсктту асссясавра 138658 тест ассс їстскссатс ЕсЄсавсассї стіавсявсвї саїсаавтсс асіїїствее 19928 «кестїїасас їїтасвіїсва врастссссе казссвеиаває сів вессясвадї 199856 щіввасетса аск Кст вассасвваа ссетвваска ТЕЕСЕКтвиВ Сррассстєс зав4а зсЕстізсстс тасЕвгсссс сТасієсявсї вЕзенсассс ссаїввенев сассясаадя зва сізсїввасз сабтрассава васасввтсє сс сстнс сассвазвав ваасссзака 20165 звїстанвзаа стТссїсевЕ зассїсвосв авсисстєтвна виаїїссссва сттаввяссе авг
Кхзсвавсх кет ВЄссза саасусерав дабвнассих їтассскжтс кссавсвуєв зг8286 савдасавос Єтассстнає ВКТсстКсСХ вразатввав ссасттссвв сттасстсте газ састтттсра всзапкавниї всжстстасв ТСТЖсстТЄсс сСваїсстївиаз абсстсвссс глава заввказісні тсттастсїї сввсасвава васісеваве зсврвтсссїї Єбгаїтєавсї га4ва вЕТТсвжтКс їтвсатстни всСавссасєт вресссвисЕх сассвсаттс стссавсася жага сткаїсстас таєвссісаї сасзасвсся звязасввас Ссссвставв ВТС 2аз8а сіассасска Сазраазантсїс ррасбсвссв касстсвсяї ссбссасраї зісассвана або сісаївтвсї їсассастає гвіжсїазввз бсссаїїссв сзасистава сет сте 2а7ав авасіассавз взавеїтасв виазавсаст зсаветсстав сквснававс ЗзтЕТрЕВаВЕ 20705 «ассствина віск санв Ксссрссваї асвствасин Твасавкеве вес 28558 кссвіввсах свасзвсївс ввадіїввав сівсідаваа візасвазви вЕсСвассваї авво каїваваїск їасазаваєв ссвотависв сбазвваєве зсваїаасаа їзаїзаєвав «ача4й вказати сКсаавссак сеівасавнсї відаасазава вадидаврара рарарарава 1888
Баравзвава Кеаканавава дававававе «ТвЕасванаї кікаївсате ССС рех 16 їКІзазатаз зтраварвсас зЕвВсссвЕТвх ввіїстатсв заїтаїтссвро свт зії пЕваазазес ссараздевс свосвсввсх астастаєва ссааррссву ВеЕпЕЕаввнс 21188 пасвезвсоса всзвектсває авсстествся атваїтстїва всаастваве звсвавсвсв віха саївсадени асслвавсиї всваєсвроес авасеавирса ввасаїссав сввсзвкЕКас 1308 звсзксарег акїтраранк ТвЕтїсссатє автствааса звїсрсївни расстїссви 2136508 вясавїнсвв сесссакссі авссваївсс ввссссвеви всзвсввсви Кствсасвах г1Аа
Мітдяансвв їрассраєна ваїсвсатсаз знасаствсї вибівіїзав васивнаєая зіча сзаваївіве сстазвссає СазссвтваЄ ззазавзвак зваввстваї ддаасвесаї 81548 віасвхахтвї ссосуваХїХ ССавзасєтва 2бврававса сасвсссЕЄв сбеввТстає 21590 стсваїтааа затссєватї атзіїсвнїЄ сзаставтї стрЕтаїїнав сазавсааває 216559 тїсвазссаза ссазазтатса вататасавс сїттататає асвсстства вастссстаї 21728 ававастсссї сбазаазаса сссаказата Єствсвассс ссствЕсасЕ сзатасссся 21788 стазасасве зЕївстссає ссстаттває ЄЕтлаатсват ЄрЕЄсЕтасв ассасттеся 71848 патсавкївВЕ Састававтв сетєавтстс ТеУвКтстсК сазбвттсата твесавааке 83500 таїсававії сттасататс ТТТТКсанає стваавєваа аїсєсватаа Стгалавсєв за засаравсзі вссассаїє звитассвівз ссСраєтїста базсїїтазтса ссвааїїтреЕ 2282о їївзвосїїтїТвра завтвкізсаєЄ сваснзазваа стактсваас ваствзаваята ватззвасатс ав зівївсасх завшвависсс Тсстасазва азтасессааї авассетате Ттсесвзааав ахідча зваїтавккє ссаскавсас асакасктас тївіїсєвзазав С(твасавар Хазнаїтсада 22298 зівастастсз їсСствасаваз звааавйассввВ завабества ввасссврса ваассеваасс 72765а затссавасе ватасавксв Вітте аїссвасає авассвавсс астсввсе изаа асстнеЕВссс ссваїсатаа Сврвоссївас вбсссзавнає зїсбаєтаваих бзасвісатс за3йО забаїссіврв зааїсссрса заабрвзвассв арсссабаєев восвузакає вазЕїсадав вача всзвстсваї всвитввтаа сесеквастт асттваєтст зазаааакат сссвадхатї 22598 зага сЕ вставлена авевЕсввоса сврасстасне свааздссана зсасваввав ово ссвізазиін аіїдависіс девасатасе завдаасааа Сас їстзав аазатасеЕса ода зіввссткра асзваадаєи ківасисасї ЄСВ СсЄ заасазисат сскстстівай зяБКа вазіввсанї сТСссстХвс асвсзастає саївстсссї Єсесквсява аатсетЕсве 227458 тастяастввя пастїстсст дававтсавтс стдсанвста кітавастевї СЕТ ЕСЄ зав ссвівїіасса вааввсттає сссвітавсЄ бааавствав астжтВЕЕсс ставстсваєх з285а ссіавІТвів Сзваївіатв Таїаєвтавої всвсаїазай срізетасії звасрастав 2958
ВУКІВВСССЄ Твадаскваї даквнраєеввЕй звсанвасїа задаїваєва сатазссвад «аа звевзаєтся завевеєсх аквсстнавї сстастсвав заївТтСств тсзазкатає 238030
СЕВСКаСККЄ давссаваді зазвсастства зазаєсавса сссвектасв сСссвсвсава 3198 їакаварувеЕ їсіавваїсх ваєтесватї Ссавасіїав звавїстксЕ аандзЕссваї 23150 сстТанеТВКВ Сасвазаста сазвайватає авсїїсявасї аєссвесстЄ зассавасте ззиха сесвсгсаїта стгастеазве тадазввакта васттвсєвав сазвсвсвс сссквианеє зав зетсатваїс ссаїтавсїве Єсвиакевка ївсслаїсар асстзаваає ассвіїссс 23348 свваіїїв аїрсасаїві заїсасавїї їавсвсаасє сазавасаяу віаввсассав з3а0е звасававаї їїрівкасЕЕ СЕ свесв сгзавйаввав асізавіїта Єасвтасатї 23468
ТІвібСсзав срезазвассв заз їсса Ксялаекаса сваатїтавї акбакасаєсх 23528 севсвасвіа ста свсї вії гресваа стссСсавіКВ астаєтасеє Свктасласе х358В інбасввате «аївавжессв зехасасзса євскїтазваєд сасестствЕ зазасехавс 364 вкассзсвай зизввасссв асааатвса Жебевіавет Сестссаєта сестксваса 23788 сазасададс зві тасаавс звастаєсвасє засавсаває заскавасазс асївсваття 2575 сазтттвсавтї ївссвтасса тТрвавтсстївс Єсавсстстс вІїнстаєрЕ стсвадавса 238Ув втасвствсї аїтсратестн стеттвстсс Жвотатстес тствстассв астстатеве 23 зівжЕнасте варсстатст сттствстає сляарваїстс ссетстсвттр автстсстас 2394а сестстгасс стобстстсс тевестастх сесбабсвтї врісствивс Єсвіїсассе 24чоп0а тзаввсЕсКс ссотвваассв сСавккваса ввасссгтсє сбстсвадв сЕсттакеся тАвай свстсасляє вІссссстта ссеЕвасссав сстбтлсвів твссїсаадс сові стасва 24120 вретжасеїв засаансаст ссссствево вадсвсїтає зассстястс заассванаї г4а18а пЕстзакнїв асссвкатст ссбасвтвує сааратстає квестсатдн всассттсає г4285а сасвсІссс заривазасв стаассвево ЕссТЕссТс сасвісасс ассасввас жало тажсЕстрва асствитвВва Твяїкасттв свссвстсса веде акв сСКастсктє зав тТвстветстс авсссетвив свЕВсртв сяхвїзсасє тастасттса сТввстестех 24428
СеЕусставв васравзава ссзадвназа вітвасссстре СЄреввааває ассісаєссв за45а ваіврсавзсв СТссавтЕсї Єсазсвазест ссгссаввої вбсвссссс Тс заБай їІстесттак сссаантієсв Ттвсбсавсс ссссвіїеух гасасввта ссстсстсах тав вок ЕсеЕна засттстаєс авсвсвзавсв ссзесносссї ззвінастазе ВВсеВссвеє засо автнївасанв Ссвразвлааи заактдтавї варзевастс їсассвстсв ассвстаЗВТВ затв звкхвІсаств стасасвкяа Єваївстатс Кстсасавсє Тассесзаєв сасвтваавас а7ва саїаасасаї їватсстасх Квссаїтасра їзасастстс сссатссвааа зстсттвкся зай зістзазнаї абазраттсх савзаквасєх азвааазита бастасзазї Єсватсвсте здада сівсізаєсаз встастлатї зссвіїКаїї вяїсзавзав зїастсвтвс Сазкїсавує газБи
Бказіяавкваї ззкїареккс Єввссбесав дисявссвсВ датсскатни арісаааває 25828 їсвавїанзе кзссівасак васісресву загезствес кзасавтїтсва басавантіст зва сствзсвактс завідрасєвава адазаавтстЄ сиєсвасаси віннансвся асасасесрї 25145 сівстссааа заїзісаззи атасавтістс акзарассав зревснаїтя акасскЕсса 25588 шсваавевса зраїсссвиза ассбссїсвЕ ассссетвс ссаветатех веЕсасстКає 25200 свтвнивася вЕЕвеаазаве йеввсрист стасзазаквс саЄсаттвсв асааарваза яка вЕссассвЕї впазратдссї скевссвасар кдвтсссааа ватррасссс сасссасвав з5іна дварсассвса кзазааанзав асексссаак сасвЕсстсвВ авадсвавтіре аіїваснїва 25448 їасстскаст явсетазевени асвасвсасв втсссевстає єстісєнсяан асесеКксс аз5аО хахтасавдна автїсвЕсс: асттвравав аасасреврив зстравттва ататравссс 255659 твававесих сстВЕсЕЗав Ссазрасствс тастествост катаєввстк СЕКТ ВА 85828 таїсвсвЕзас сестасаєсв авасттстас сеїтзассіс авааствавиє сісаваєтес 35589 їссзвававсвв зісвасваїс сСтравадясї ссаараїтавя їасссссввс СЕКТ встеа 25740 веїсваривї ВУСТА ссЕ вавЕсвоКта срсїнвассх твраавнвсса назасестта 25 сваїсвкасх втїдавсств ссвкттасиї стсасасава саїсарадас ССреасствв зБ5вБа зісілссстї ГТасасісвсо стстсалитс Таївкзавсос саввивісса автсткстих 2928
Твствітвіс крастссста асребссїїс світавасїї сясваввссс ТТввасасас 25 тдстававка асссстввав ствсївкаса саадсаєвих везсвисаїв асЕстВВасе зеваа
«тквсазака васттєвавс бтсстветсс Сссєзвасст віїтадассав стастсаваї БІВ сіввиствс вівассяхїс ааасасттре сзаївазекє ссстазвраєе вавтсствтї 25158 вссврісттр снаіввіса: сататавксї ствстївавксї асвтітвансз Твсватвате вза засзівівзві всиївасесу зіїсасвава бвревї та свассвзвавт сссвсаекта бив їзсастїсвзає асесвасСава вазсавлята тавсвсЕсав зставватсва абтассвсвс зез9а всквівіся стасвітасї аватсастав їракєртасвЕ СтТазавесас сссавтасах звчав
Сїлаазавсвіс свсазтнтвх Каїсазеїтв сставвсвіс заїїсвіта сазссвсзата 26458 ївісствеся ссавссввсс айсавстссс свассввсав сссвЕсасва зассавссасє 25578 сватасадек авсссзтсав ес 554 «2105 7 «2115 23760 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» рбА7-щшод б нуклеотидна послідовність «4005 7
ТсстВТеВСЄ пвсасвсаса сзсавасова сезасвжвіа аавсстсЕсЄа свссстсева Ба затаїссвак сажсствата васвстсКЕї ссістїсаниї кізсссвсса зсатвїсств 138 їтєвзасаств абавтсссазав ссдаакесди валасвасав стсжнставти Каїсбсссве 188 тТєвсвасвії ртзазасреив свсссснсвор зазрсттвсв вссВсеВіас свое 240 застсанатсії їссваввост свістссвав СссвстВсКЕ сткрссдево сваєсвскс зай їссвссвссз асазвестсв тавїсазіая казісаїтса веиасснува стссвКЕсар зва авгяаастая сватаєвита ссвесабсавз свасвтвсЕх свістнвває стсгввавсе 28
ТЕКСТ ссЄКНТесЄ каїтссавав ССС снвнее асзвісрсвзе австистсев зва тваєдсттса ссстстсвав ваствкаєсї ввдсвааняяй зсасссзтвнс асвкатасев 54 засвиївсЕ їКссввіїви враттакКтх асазазтса зааїїсаєра їтсзазаваз во сасзівзвава ссавсзавааєтх сатвассКах ївразсватасвя атзсавазвих авсассвсев вве кесастввсу састасасві ЄссссссЄсс сстсвітскК астсснтвВс Стат такса та
Стат асЄсвс зсатастєта ссеесастає сссасвссас асвавстсеї Сластваття 78 хсвссвеїсс стзвсвсссї сСавасссета сссссїасви садзавесвЕ сразезиаас що дансаїдітс ассвтавссс здавссявав штазнивВадс садававсяк стастссраає зав ксаавсветВ такатзввІ дадавнсвса датасававає сТраврсзїск врзТссЕних зва квівснНскЕс Хіссаназвс авбїїаасскс задавсавса звсїссвтавї азравхаєзе 31820 ввтсаскснк асдзанвсвї савсардавна Ссскаавесав сааестссва сарестсвар зака стхсатавсз асевавссасе зссвивтвве азеаисасва СевїзивКеЄ казевааана 1148 завстваїсв авсїїсттеєс тсеїсассак реаезавеиси їсвзеаадкт саасвіасте 12788 вІТВствїзеВ їназшесанй таасстрава ваїтссксоаа вавїєвесан Єкактаїсяре 1368 каїніїтссс савасстіва віссстввис сствскараза всваскаава кетаватнса їзІа вІавсЕвсїв задеарЕжсї вза вавії різавсвавс зіависвСКсї тав сснва 1388 ввтсвакех сеВСКствса СваїесвссЕ сссвзавсав асезававдва нвсасссаває 1348 звітссвата всавдвтсссс авбастсвас ствсасвзав сззксавнва сестееава 1588 адстввЕата ссвнвессевн ссасаствіа квівасвтаї ссзавравссс савсазваєс 1568 звсанвваси всвасававя ссаїтрисаясвВ візактвтав зтесавіївЄ зате 1632
ІСТ К вЕсргТнВся аібдствтаз ваіїтвлаєтва вбере тажсх ТссвЕзтвКа 1680 їазввсвавта віввтвакиї єссввнснаа втвясЕвнЕЕ ТЕСЕСсаїтав севяаБасЕК 1748 їваваївнаї виссвссаса їзаваавівеЕ авврязавве СТССТвсвсс віїсфїсарї ївав
ТЄвсастррах ксасвввисЇ саїтїсесаз сасвтзатав рвасвасваа всвсанкЕвЕ і850 стстсазиїї їсававввва СвівтТвеазса вааналаваасє квсратиаса секта 1528
Тввссякста яснтнзаскї зіїсввстка сазбасізвї воезЕсстКис сиїтавессс 1959
Тсаастзас Свсасавасї Ссзкстванс ассваїтаєх Срастатадв стствсавас 2938 всезіассае вІКтТаксттав зеввЕанаса Тасазатавяї сссвастатаз зсвасаваде 2189 пвітавзастї зріїаєєзза астаїаїтатса азртїстваая вітаваїтає «(Ес свасх з159 всаваїатас звазибстаза древісясаї ГасіссїсЄза раваївіває сссбвсткваа 2жза тТстївасттва гссвсстсес сзесссве ЄссавЕсста ассгаасбева СЕС сТВ тва ствааризії Єрзарсазра оріааества ссзаївссвї сазсесвово сзавсовеся 234ча асстаєктасе зксвссвкви зкассеесая аВежсВекстс сасесатсвЕи таза сВс 8455 певроврссс всассвссвяс савіствесв срсасквсяс стае сСЇ весвсвеваВ заБа всжиквсаси їврвасвсваа свасреваса їсзвасвасз вразасвасе сераварасс 2525 асвскавсвів даясативис ссвссассаа свадавастя вваваатсяЄ алязазавса Би зстсксдтая ТсЄБтзсвавс ввсдсчиасв ввісївссжЄ аасесаїєсс тзатасевсе 2548 попествесе закасвсвик Срсскваас свеТЕсЕвав стсасдассс Твапарасав ав всвсттсств сЕТсріКТсв Кктсасссвсї прасвіссво сасвсвасвви ассссввеса Ба
ТТвЕОсКвсє васазссаса ССсосваавсє сесаткавасе зЕссттсаса асавакссте звуВ стісваїзссв їврвавїїаїн вїтрсаавнтїс свізастїнс сеїбсвааса СТ всЕваК зв ссврісвває вввавекрис ванстсввст расасстаїз вариссаяатка савразравс 94 сваззвіїстї сссстааєво Сттсазбвави стссниВтсв Статева сведазвссс зоба сісіївдааве засравасндї таїїтасрсвї расвеїавна сєтастаєтти Єсавтаєзав звБо тасрааввак СассТвСсЕс ство ЄвсЕваєсва сотврвасзсвх Сказавадавх зга сЕсвсасссе каїсссазка сбсакавасєс вастскесії сСТссстявра втасссватс з15а8 заквсаїтаз сатвеаавра арсісавист стазавессї сасавтвеза сстразвааває за їгсазсавис сізааствваа зссеЕЗавтся заїсассказ ссрнвансїс бавзєсавса ззав звасистсстс стссасвкта Сссзассаїс втдсасвасе ссссанетах свсаадссаВ 3350
Вівгінсазе ссзввавтсав ваїававасс ставаснісв Стввівсева вавтсаїсте 32428 садвракеїавазї вравасараї всввасввсв всзкваанак ссЕрааасяс скаразвявесх зада аЕКссВвваї заррвіствс баїсссваєї вассссбсяї баврісссавв вестстсває 354ао їзвавсавва яезавваєвв Ксаславаст звеасааства сеї тссзаї абвазестев зваВ асвтссаїтлаи ставкссскї тавтсттвст їствсастух ствсусвіса сетїствресе з6565а ескжхаївЕсві СтакесеедЕ сенсясвстї вавинксвссс тартавастя Веста 3770 кіссатвївс свизаресхт зссствЕсае іравзавктстсн азавзссеукК ссстастсавй 7
Ісесївассв Свсаваїнка беїзсаєрія асвтвКасаз васвтввітаєс «Хавасвасх зва
ЗВваВТВЕсТ сссвавасск зіданавася ввавсанеає Сзаздаскаї висасваєся зва звазаснав Твавакисіс Старе стна абссівсссв зваатеЕсТЄЄ ТртісаавеЗу з53Б5а вкірЕснНаКЇ їТизассява вадвасакКу зазадассзв СасссвВсса свсскаївся 3а20 засанавовї квїссадяаї ссвастясва ЗССсзвасех ааварадісєтс Єсааваєска зава віссівиств Тисасзалас саслаатавї асаїїтстава стаїїсввсс гтваєтазваєс 4138 хіссвсїсаЄ саїКсаствз кВСтаваква бавасстксв вабтазасаса Тесссеаваа --аз зінсісвіда сссатазеї авіїсвзвавни їасвссваєс звасстаава асвсвсассх 22658 скїєазатєх євабХвсасає ркзаєсатан ссїавксясаз стсзавааєа зуідтавтаух 4325 ававасакав акти тадає КЕЕСКСТТКе сксїааазиа аваствавЕх Табасвсаса 43 ла та анівнайаас сваваїтєск сассвазаєи Кабвазїтєя різсзсасах за46
ТКстдсвасв Сасбесуссв ссасКссувас застоссввс ввассасєтаєс ссассвкаа Я сатвхатсвка ївсасявисЕ Сракїзсвсав сасихствва свсасвсКК візаваснка а всвнассасв аззварватс саївсваваїв сяжстсасав сттсстесат татсстссва 452 сасзаасаве всассутасв асааттвасса зсзасаасаа зсавсаваса зсастасаат 4588 свеасссаса зстассвтасє сабреаассс вессввесстс СТЕ светатє крстсзарав тав сватасиств стзссваїтвс світ сисї сствстас еКствстає сват стате авов вЕВТВВЕВаС їсвавсетає стсссссвст астваднаєї свестскКиК равсетсся чав асзсстсссв ССС нессвсссас стсвссассв Ссревзіссвре зсссресає зага зивазивнісї ссссіараас свіваоввва сявваїссяї сс тнаа врессстате азай кіївсссвсвз всі сатсввастї ссссттвса сСвтвестсва всттеКвіве в вависіїасв ссвззсаврів стсСіТС(ствВ рраавзсвсїї зсаассствє бсвавствад зіва зіввсіваня Статсіввяї скїстасвте арсавнаєсх зсвадсссаї вивсасстс 5іБа аісвівстсї їсвззврраза ївїсазссав віїанссєсс СЕсасвіїта ссзїсасвеа Іза тстассіств вваїстввсв ватваєтсастї сасрсївстс сувБетвЕсва срестаєтте кУКа
Тствствсетс ктзвастсттв дЕсссасєдев свЕїатЕтаєсв сетвстатс катриствке 5заа відсстсста вреасизкаа австазадана завбаєстст веїтвввевав звевссктаст зав сазвасксава Євтсссавкк сстсаїтрвас ЄЕсстссаве СЕВТЕКаскХ сс заба їсвссіссст ассссавВКЕ їабсветсав стсстсвсве ТЕбасатвве састеттсс зва звіврстсїїсв вававсіїсба сівсасвиве сассвсвста нозавсвасв аввсвсрссв зва вшссвссвсс зівінасака їсСвазрезая заавідснаї вадасвастс скастасесв ща зісвставів абувісассе сЄсаїатасав Саасвісаєс Єбсасваєх батсеєвате 5788 сасвіваває сзтвасзсвї Сваєсстасї Євїсастасва баасвсжете сссатктвай ЗУБ
ЗсТсттвЕся акстїїззаває аїазкаєтсї гтТвавткасї зазадайаєта тасбасазаї Іо їсватсвсхс стасстваєаа аїбассзаєе аттактсаї ваєсвазазва асзсстатас 5вва тзаїїжїансс тязагсзнлає заставаєтс Гавсстїсвсс ссосфссЄтїваз ссвасставх зз40 паст КТС слаєх хбатевнавії зареттттає ств з ававарзатсв водо
Кссвасзанес вссаснскав засасставсї асавсвісвса сабавкаївс явссвсввав асо
ЗВЕЖКЕКЕСК сстсвссвст сСвбсастссс ссТсзаасвасс ївававсвтс Єссетсасав БІ саксасасята савтїсасатв сшхресвтисяи стастсасася сратскссяЄ всаватетке вІіВа
Тігвіавкссї абзавієбвзас Тсзтсєсвстх сасбстїтас сСсззассваяз всісассвах во асааасаава їСзаваасвї зсаскавваї сїїстасаас заїтвссвас васазвсаваас 63оа азвсанасєває астасзватся сатттвсавт сассаїтасєся свросіссвав квас тас Без
ТЕттїаївотв о стсстссттс сСвстсзассс саскаарств асасісстса аравсзсвас 538 паквазварс ссвітассри везтаввесї Тасраїтиста ссзасттсвї Таздадасае вБава сствЕсвВваз зваїсатквс сСсОассварсї вваастваїв сбасскатвс гсСасаавсав 54В
Стесатиств ватсствстза вессЕвсвзав ясдетвавтс стстсссттсс тевссстх ввай сасзазневвих асістссазн заквессвах ссТассвсте яїїтссвава віїсзссває Боба саввссївраки сстравнказї віїсввисст їстстЕсстс зріс всста саврасіївсї БУТ
Баввсївіси сізбвсасвї Ївсідасвст ВсСсссїВЕсї весаїтввата сасссссесх 578о ввавнствсса сЕстТвваВе СЕсІсаввва авеєвстнваї двсстатвсаяа скаввнтвка вав ап е їсассввзаз сабтвоЇїїс взсзнавста ссзантстне Ссвстбасвка еза сіїївкасвтв квасевїссви сЕсїсевкви свсвассавс ахвасвався ссаїветасх БОБ ссїсвазвавс Єссввсвсва КЕЕТВВЕссс квівсссс сЕстснсвс ССсссвска таза акавісвств стаавестаа вЕстКсТнсї есвавввстї вості ктаї всазестаав тав сі тсвстс сте кассас ТССЕССТНТ всбсттвкаї ввсавстека сстсаєсоу ті здасавсаївс їсавваства всвстасває вас свстЄв ївсссвизаї саватасвеа 72аа стжвітршаї всстбветвс тавстасввт ветвнатасе КТсТсвосКжкВ Стас сх 7268 їзсвіссавс тсрдрансівї віасаїссїс ївсвастстск стр Кссся сСастсвестє 52
СКК ЄСЕ анксставсра всатЕсїасії Тревїїдавтї асиствстав сесвсастасї т7зва заствттсїс сассттїниєв всвїнассве ТЕСТ Є вксставста ссзиассвив та свссВссКТХ зсссттстаї вссісвзаттс звасассста акассвстсс сСававстазав зва скавстссссв зизарсасве асіїсасствс: васвсТанав шетассссва врстзувсї т75ва кабастсксев стзассссвз сзасвЕсвсс сабвоссств звкаавазавак всаисваква вав каїсвкїсза асакседиса асзаарвестс Єсаанвєтвра аксстескве секс 7тава вікаскасся саївасссс всскваєтас вссзавсасв їаасваєїва сасесваєкс та зівавсвісаї їсзїрваваєв висїїїсзїв звісававісс сесваєссися саїстаатасє 7вев
Кксваисаразз всазазасаса нсдсрсавяс Карватаваї ївісвсясрс ввідесатсх 7865 аскстастад ассвЕссват саааввкссс ваттататєх весстазесу веЕсттввках ча «вввілазає еаатхсваас сазассайаав сасСаав'ята СвзВтїсЄсає атасасассх 7955 стваваскскс сгасанавсї сссКссаззв засаїтскадз заїсаєствсв австсстсеє за свівтавізї ТїсВгсТалаї асваанїівст сові сетаЕ їавсїїтїтава КаяссввтїВ ай твсвзтсасї Кссссатсза всвктассав засровксва сте тве стКссатаєх 8158 сзтакетсва взвістаєсаа заїссстата твіст вазстївзав Тваватктсяв БИ втазкїївав аїсалазтвва асзівісаЄї аїїсвевїаї сасаЄсваїї Сусагастсв нака зіїассазаї стввЕсайсу КСівлаявисвї зсаїсаасва зазаєтадеє зазсдаєтав зав зисзааілав баїсевквї сабтаазряза аїтсссєсєтає завзята Єзасавватся кава їаївїссСвта завеааатта аїїкстаста зсасататаїє їсасбсавтса зазастєсраєс за5о аалшїазаває їавзаїнаїа гтсаїствас азааацвава сєсавизавате сівеававссє 5га висавадяссв вассааїсся зассвасака віснвустрв ХсТраксктТВ зївсзвассв вив звссвасісн воссасєтве зсссстаакс всватарстє Свататесса зкаксастасї 54 панбівасвйї їнісваївнїс стррвазатЕЄ сТвсявазіва вісаввоста састввстесв що півткансх алазвсавсЄ сЕвівсвахе всваїасята асстасєтєври стставаава вве зізїсссваи байфіантазавк ссстеставе завазввуїа встасвеасєхх зсвеєвазкс ча сакааїасяа авзассатаз зехраттраз ястсразата тТвсраариза саватассх зава таваззавїв сесазінасї їКкааслаяза резаніваса таєсссксвЄ Ссстанисав дала всвїссссіс їазаввасвеЕ савтсссссє сС(всвсЕсав стастатвкк соска запа сапаваїїїх вкастастаї стриваастсс їтЕстрававї авсвасаназ сссвсвекад зоба сВсвоБсссе сквіїсаа сСанавасса авазаситас асвсасанса скссассаКс зх тіскстсвсї КЕсівббасв всбавтвастї свазасєвоаї сікайтаєсс сатестхвас З185 всестадсвиу вЕссттатвс васстсзссв авссаксвстї савзаєсати сарастиств Зав ствдессстви звстнЕсаїс вЕставвссв ввсвесвсяс свісссврав вЕСссстВАс ззай
ЕВсТТВЕКсВв каствкаквев авссвеетстс васттествс СветяссссЄ встнстевАЄ 2369 нісссвесіс ассівнссва Єсрсовснсїс сзвієссств сасвівсасє светсссва зада
Кіксттадва тсабсвсзвс звстаїсдрав відесввстс Хвіст сесевВсввсс зане
СівЕБССВХав Севсавство своеснессї ссввасс сСсссасавра ассвсснавх 548 закїскеїсав зассясасна ксатвснскх ссвіївіїї Тзаззассава вавасатаса звай їазасаїстїєа бсавеетстс Тест есскс Кос тстеКс КС есте Зева тЕхеїсттта сїавсавствї Хагсасівастї Сзазасасає ссзїсссВЕх зітатсаста аа
СТаїсєвтсс Сбваєсвссса все ТсКї їрЕасваїсї сзтавтсваєЄ свссссттев за їсзвВсеесс сеаввеїсса стссвасеус ВссесвВвкЕз сСвкаасатих асясассаке зиаа аввіїстїса зсрнастсявс заваїстісса звсїтїссаз зрвставнссо асатЕсксес зе атсввтвЕКї ствтВВЕеЄ стсссавтває Тест тваТЕ светсввтав ссТсТсвЕс аа ачвесузвавї вевазсссЇїв азаасвсзете асвазвсаса Єваесстсва траса Е 13890 каздасдаїї ссваввассс сваасістст абсвратавтса всавсавсвяс ссттавсвий 18вава взитссастіст ївавсаксеву затвависавх аваавнассв всесЕствав вза зає 181489 каазасавшс савіввїїаа свавизісся авизесвивас сатвїватна завтвавсса загов вазсссвава ассїївіаав срисвтааас ававитнаке візвсзавра сСтссавнаїс їв зназавався зсвівссвис здіссс ії вісвазазса вевставаав вксантарте заз2а авасттвзав вастїарава свссавнвріа авиїївіссв ксавсвссзи Єввсазриса 19388 заваказаві сссссвзавсї весрЕЗаЗсаа дедавсвала асазвавсява савиавесес т0445 стісавсвата тсрівайдвис сввізасств вівссссссї сова тссї сввсЕЕцеТа за5во авевасваза ассататстеє стреїсв'втв сссавізвсс їтатвеєвсї стзрсасвада 38560 квастїссав страврїаан дзаессасавс заваравтяв аравсссатс сваснитатс іваг0 зіїавсссат ссвіавстаи звааавсзва азсврїссасасє ссеситсєсав ввазсссават 196 їссвзаєссв авасаарара Сзраввасає всаавсввас сзарсвисва весозавиза 18740
Хссвссазсвв авазвавева свтавЕсаав Сссвасвтїая всезіавсав акаїавссяс 18500 васассіскс ассасніави зсаїзвастї саскававаєЄ сістсвсаас ансвессаре завоа звізвсріса азнкраїахсеї Театрі асссзвоасс СТезазасвї Ссссразкнєе їваге пссватансв ВТЄТТТТвст встївалара твсаасвЕтх ссадааєвес сласвиесТх чв98О авівдатскс їсаявватсї садасссава сасевіазасс ЄсбвкасасвиЕ саїввтаасх меава псвзазівєЄва ТтТрЕзаїнижї кЕЖЕВСТеяКї ТВЕСЕКЄНТЕ вЕТаВТТАЖЕ всзазвіттї 11386
ЧЕВТВВСЕеЇ ХЕВІїСЄЄся авштівівад» ДІКеВЄЄВтЕ ЗЕЄСЕТЕТНЕ СЕЕЕТЄТЕВ: 0 мОба кавассЕКве забавні Сасеасавіве зврасінанва зіввивїсву вакквїївас 11528
ТттТвсзіван стасасесви В'ТсКсве всітасвсиї авсаєтвісс асвсаватне 31289 зиЕссваївса татасевтаї тссаатазтв СеївКизата сзататвсосв антаттттас 1132а чавесствес азбвасвавт візсасссвеЕ асбасетївс Єбввссісвс Срок тавї лава
ТтвЕнастатт сутаттстстЄ сассттввссЄ встсатасте асасссстза аввсаазваса цавда ваВіїрвавів віввссвзаа аіїаввасва сТвревтаїває стзсатавсв Єзрваїсаах 13558 їавсвїсдаа яизавасасє кахсссстса висастасива савдянізаяа Таасаїантс 1358 аскаязасає азсзазсзая зарієсавав шсзаваства ззаваєсарс тзсдвасакх 1154 саквіїсаса біввавасає саїтабсста вїсссаЄває сассстссст сствссстав 11788 їХранкакнсс ССривасіва севванніся всїКвнясав сздвїсссса Ссстввасса 11758
ВІСТСТствв ВТС тсаван сстїсвінсс десрістаса ссїаїстсся Ссарнїства ї183а зкзівастст їсасассває васеїсєааа йксЕстажКс Тастсссавс сЕрслатасє 118580 їБЕсствсаа ббсстввавс зссвсвсвсв асваствват зстетЕваве ав 11348 всткЕвіссав вреїсссяву сТреЕкїваєсу васттсвасєе їсавсссаве стеВссеваа 12838а
ТЕСсТтсаквї їссастнтка арсстїтава всжснавстє сестссасяє сзатесстев 12968 зісвнасасї сстбадакава авдканиїсе втстсствант астраватсв варувсвсах 125128
У К(сва свтвїссває сазіссвсявз зсазаввсава авасанитва соссссатаєс 121860 їстатастввсо задіваїаді сссассвсса сСевсвтавсвна сеКессвсє ссссваваре 12780 врізїїссва саїссайвас васссвавис сісвівазав саставвраз засув 12300
Те ТсссвВК саїтввссссх атанвсисса вссднестсн ссвасїсссв ссквастиде 12366 їссвсяаавї всссвазвсви саавіїаїве зсбтївсвасс всзвссссяс вибавствавс заз авкасстаїї ясСвзакастс ессісабвва вссіслвзаї вівЕЄсСвсса всадассвах 12488 нассввавіс сзісасаїва сввасвісса врсяретнавс вазасеаааєс авшазавсвсс 12548 ївусіїтсвв авісдтКавс їссасассвр ВсТссЕнсВа стасвТвуТЕ вЕсавистте 1:88 зесвівстав авататркте адесанассс асствтвсся стсЕбасват Тасвававке ї2вБев
ВЕСТ твВ СвасЕсссст адссссссвї сватевсван стсакаттст асатсвтате 12728 вістстсвас вТсвЕТіссс вісвїсскат зїсссвісає Ствевсссво відсвссвсс 127885
Хсссвївссв ввіссставе Соїсвтвсас вссаваїкни Сврїветвсв вествссстр з28а4а
ЖВсТтсєсас сезсвВясвЕ ЗБВЕТранІЄ ЄросеВЕстс сксресватв втавтвнТЕ 12999 ваєсввстівв СВТвЕЕТТнЗ срЕсВІсваХ савтссастїт сесрсттсла аїТстКтрес 12968 звазавсзват їсвставасї авзастяраз ассаравтна ївзрасреаї Сварссаиах 13058 тссвасврак стасвтстст їваназаїтав їтЕтавссссї Кбавасттта татаєттрся 33988 астазавплаз їаасттвВсх ставав ябаївізвеЄ ссватавста звсссавсся ізн148 сТсТаїКаїї сеївтсєвапма ставах втсссссстс Єазатазвастх тевіассекЕ 139208 кітасавзасє сстатааїсва абтазіслата сісаассраа ВССсЕТвсав ТтаавесваЗе 13260 вваттазасвв седаваєвсва стідитатівї сазссвайса васссасасї орасвиссах ї1333а етссетсваї авусавісвсся КТС с віссасзкак ссєстссвавз асгсврараева 13388 гасствсясх Тсаїтесссї бассасвтвї Єасзавасва засссатвса сссатвсаваа 13446 стідвевавів всвсаававс ссткесссссс сВКссссає всввсвассв Сссабессях з358а0 саїссісссврс бпідлевсво сессабсасї ссвасставав сассассвсї аск таїт 135658 ссвїссзаза ваївсссасї Стсавсвасав КСвссавасва сезсзвасав сазвасвасях 13590
Сасаавсїасв Сфіасааїїз ссабассатв ссассїавси ствссазиса васнвеаиеї 13658 їсівстввтв сЕсаїнстве встассває КсСТКссесї Єсяссзвала везївтЕсЄ 34 кавксавасств зістсассакє сессеваваї сссвістасв асестазннвс ТССсаваКсх 3358 вавсятсств вседувстсв СЕССВКТКСЕ Ствтссврвав кзававасис таствадисї 13568 тїсеЄкваве ассзкаваав вВЕсстТвВссЄ вавїставаз сасствватс сксасеттедя 15чеа
ТетЄттксх стастнарна зсствосавст дссрасваве баїасстєсга астстекрсх їі3989 звваїсвств авабсрштвсс СКСТВТСКСЇ сстЕвастсв стсствсТтс гсассвви 14846 авависєївиас Сбавтссттря зссівессасс вссстїсваве сстбасаєвоє стасвстера і18о авиавакттс Ксестствк свссстовка СЕС Есв сссттаксви ст баасвте 14156 свЕсаїтвате стзассаястик Тветссвссї азвтстностї стрітавсст кестсттвеа 14228 стЄситсавв зібввассви зввасстатв ассссіЄвис гісазкавса СріснсСаке 14280 свссясетсс асаставсвра срусвасавн вассствасс ааазвесєса свЕсвстсЕ з434о авасїсаявс сезстратнс СТЕВТсВссЄ аїдсастрис тссансвЕс Стас 13488 сствЕвївава статвсасвс сттсаароїї ЄсВіїссєсв зсаєстсіва досві таєе з435а вис сввЕ авввсвансс Сеаїстстїзав сКтвссвваї вссссТссе несісссВ 14528 сттсткавиє сСтассткссв ввставастс зов Квс сс всет свое зай ніїсатаств статті сЕствЕстасо вісаснасів вратсссуста сестсвстте заваАВ кс тТЕгіса тсїсссасаз сСгссранвеї яствсїсссв СТврасства Сирасстаєс 1178а астЕстаїва стакзввтівс Тавсітїсстї заварасааа стиввастжс гтстааситх 147685 ввеанкасстс стсствстас Ссбїтавснві ввкастсвасх весайвакєсва всатсасся 145870 сїссставав їїсавссатрв абтстассстї зрасттвстс стсїїистаа вЕстдавстх 14880 ваввставан вазссранів сазвсаствс сссастаїсст веїстаассх свВстстВсс 14548 сісавасата свівсвстсї свЕнавраавв сстввасста авеЕсТванта відвсварст 1за0О таквівасеї вазасаавіва серїзазата їтзїехзаїза саваїааєваї вадвсесвсва ї5а6а авскавезт; збевпазввв ваватеквїв асдавссевЕ адссвеясиВх всізаїв 15129 сатсвтаття ссзасбазатс асравтсєся СВВЕСССТаЕ ЯТВСЕССССЮ звассатева і5188
МІЖ ЗааїтЄ КХаївазаєаа устссавтсе вазказсває аїіссвізїє сасвсвТЕва 1524 свт ссгта сссаваїстів вЕссіївзра визіравнса Ссассвааса кс сває 15388 твіссстсва азкссїїайе зіваасзаса авезасадак сайсЕстсся заваїсссаа 15368 зсвваавсвта їїавїстастає їзатастата так тааєтв стаєствсесся кзаксасавї 154285 ссствЕваїтдя ЇХсстастаа стасзавсотї бвісресввс враназиска тсрисвсяКе 153488 вадвависарврс ввасссвиви асвавнссєЄ вЕваватств авсснвасви всаравїсав 15548
ТВ сссї сдасевіїааї сраїсстаса статвіанит сєасаєккатс встав 15588 міддскасся ттсавеескв сте сТЕс зеявасЕсва атбативасвЕ ссадвтазе 155598 вЕвакаваза тзасссаває сСааавсвана вавкссазву заватбазїсс авасеївсає 15729 їТвЕсаїїдс сазаавстврї залятастсд дсаїаїстота сСсссасвася Ктзгбваваї 157856 аксяїзвізсв саїсквстяс атствсасра зтівавсастас всесависсє авзавказвске ї584а асЕствсавсс сатнсваздї саасастсяс давссссвссс стсвЕсстсс зссасатааз ї5з95аа сесвассатск ссаавбсстсвас свазсссаєс зсзсавстся сзастсвстя Хсасвссєтв ї59568 аавазвссзає свссавссвай зассїїасав сваїсасєсза савсазсваа сазсавасай 18028 саїтасватєтї звсабїїзсва СбТассавтасс аскавсвсся Ствссвссас Срвасствах їі608о сссвавааси кавеатстстс таксласаєє вирсазеаки Єтссазлявї свстатсвах зї8140 згсзасвваз асеївіжсіс твссєстнаЄ Єссассясса адвасаїєстї Єрварстаєс і1вБз2ае сстсвінаВу вігасвавзе аавассвист аск сТсЕ зстзовсеЄЄ сарадатате з8258
Тссвксвівс Сбассзссея аїассїтасс каївадасес ссСбассстеє сескаксстсх 16328 саєвсстста зсавсаЄсаї саадтссаєї ЄбствЕвссс сСстасасєтса світсадева 165358 ст сввле ссвЕзаскКи евЕСссСсвсї сасванЕвся васаїсавнє КЕССССтваХ їіб6Ба4а їасвдваїсв сравсвастєє свїївватсве асссттсвск сссаєсткає веттсстас 185580
СтТкавсєвве авїастстса Трдивансєас сясаавнсста ствваясасат кассаданах їівБазва
ЗіБЕНТХКссСЕ Ссссівссас саававзнвна сісавшавиї ссарЕвасте сссквсвас їівБбо стісвсїнаву асіствавиа Стссссвоїї ававссстЕЄ асяввссссї ТЕсссваєав 16580 сієлдивквах девтсвстса сетсттсвЄ засесєсасав дасвасстсєа сествасвес 157483 сстжсссСвва засвввнасса сссстввоетЕ асекетесас СТ СсвзЕса лававасесх 16505 стістасавкст ссстктства їсстввааєс стсасссзве вавссвісЄ сестер а 1585 -асвакаває ссввадратн вЕсссТжТтс взксавствяї ссЕКтссЄта сасссрннії 15920 зассвсоївис ХсвсККусаНї сасаскесте сарсасасєтв зссстастас вестсаскає 16988 засвстизре авсвнастїЕ сеиставкееї нетвЕсхвста стаксватая завиїтсвва 17а43а ттсвісврдає стсасатсїт ссаїватасс ассвазрасєс аївтрссїсаз ссастаствє 1718 їствиваєссс сабїєстасва сисїавасст встїстраве сіассваюва австатрева 17160 завсастасв КЕКсСгодска свадчасаїв севаввссас сСстввававск КТТсаввТєх 17458 тЕссзатсисв їСвасЕетва Савсвевск стсасвттсс віавсассаа савстЕсвЕя ен кіїввазвсїв ссврараавса зіразкеево вассвастаї ваваїсвівс заадасасв 17346 сіаквЕвсса аквасЕкаси зіазтзасаа слзаскарасв затв завітав 17808 васивсївса з'азаравав аварвоававав зкавадзвав здавававаи звараданав 17468 авкававеств асСвааатевсє асвіасекК сСЕСИВТТЕЄЄ звайтазатв аззвисасасе 17578 стсВтЕїввї хствЕсвааї ТасссввснЕ Стсссвсря ззазвантссв вазвввссес 17589 свсвистаєсї астасавсса зрикссвсвЕа кЕзикнсазс ададссадса ссссраїакс т75аВа
Твстрсваїтв абссттаавса ассвавевис ракївсасах дсарвнкасу вварсвтесв 17788 вісввссара сваввсакна сакссавсве савеЕрасаве звисадкаврвї трараввтка 7758 тсссвісзат ставвсаарї свссяренас сітссвевас веЕсвсдисяс ссавсставе ХУвІв сваївскавс їссавевнся всавсавісї всасеВсЄЕЄ взавссеква їскваїтвавяиє 17888 сдтатавава каствстарве Твттааврваї ккраїаваєва вахти Жх вавссаттав 17948 «ксвізасава аарайавзва дестрасина аїдссясята сЕсатвтссс СЕС КЕсКа 1508 зваставасв вазавсвсак вЕстсвсесеЕв вссстатсссс катканазаї сссазктата ївоБа
УЖтвеїсіва їЄтТавіїтве Сасхравтай засляйатксв зассавассе зазтаєали 15198 їаївиїїтї сзгатасате сссїЄааває СССстатсава акТссеЄста алавасатсї 18189 авкааасвіїсї всвастстїє сЕвгаївтний Савїісссвїта засвтввадї встссакеее ї18з74а таїтївасісЄ заасаастни ССвбасваєс асстссттає сзавсвссає Саааасвсвї 15388 савістсіїї віїсттссаї яббсзіаїес сзаваасстаї сазазієссЄ зсагаксу зл
Тїсвазвсєтв азиїваваїї Ссвесааїсї зазазстзаак зрзвасакєатс астаєєтавев 18450
Табсетвсєтв ес тастас Ссавїтсасса засссввіта ассттвавав Квсзсаскав 1848е сЕаававіїа втсззасраєс Свзазвасаваї вавтавтсате свІтаєсави зааассстеє 18540 тТаїбзавайта сс автара ссясасви всвазааава тва тта стаазсаесевка 1 твВЕстасктв їсавазактХ васвазитяа касіваваса зсастеаКе засзвазавя 156560 завссавзава есвствазав сесвЕсаваз ссвавссааЄ ссзавсснає зіва 18720
Тв івасс Стрясасазаз ссваассвас ТсввтссасТ гвсвссссїа ассакаатад 18980 ст сваїтаїї ссзаватас ассаавссза сессЕссзає ассстввана Кс всазав 18540
Тнавісаавс сіасасвесї візасатваа СОтааванка всссвасеїв всввЕтватах 18905 вівайїтасї Тваїтїстваз валясахссс завїзітаах заїссстисї звеаавазане ї8вавБО сіадствсва сїтасавсав звссавааїв савававсса Євазвїваєї кзавстсваа 15858 зізізсяазав кадсаватвї ссссвзаава збаснсваїв асеснвваса вавиаавнтв 159 атататтсс: тетїстсааа сзадсассєс сістававаа СресВЕЕЕКС соссЕсвсате 13138 їтавствккаї встсссттсв Стасавазає «їїввастас саєсреваас їссЖЕстеза зазав заеіавіссте саввстзиста вассвистви ссвеІїїсса Хртассвеза дисЕЕасссї 15268 зібавїїваз авїївазваст сте тссств стсваєсссї авссетнїаз абЕсатвсає 13338 жївтавктвсв таїзазаасех звеїастсава свзссанинЕ ТвиТссЕсва ввссдатЕаЕ 15380 зваєннкаве аввастааав йсваївасає ваїїадвазс власєтваза врсбсїїаве 134 і(твазвіссї астсрававї ВТССствІсз заввесвесви сввссссвза ссвазеввав 153568 сасстзазвва ассавнсаїсс янісвсвіїс вбвсаввїзи вавиївиїст зидаїсснах 1з588 ївжївастссвз васстазава кжсссїсази зіїсвасесї дво заавстасла 19628 яасавізіесК їїзвастаєу ївессствзас байассїсся ссассасЕ зсєравеста ї1з368а вадавтавас хрсдавтла асасаттссс дакаватєаст сасЄкаїссса стзаттадсся 153748 ваврввтатрІ сазеєсавраїє таавваасвся саїтсссісвз аассссавїв сасасвтузайх 193599 саїавісєїан сасазвіїсва азаїаасеса нсассазана сараазтсте сакастсссЄ 18568
УХтввсвтта задкаввастх звавескатас ежсасвтжтса стстааертвв вавассиваа 13025
ЗІттссаїсв зватаїтатва ассїавтатста ївЕвссссїк сааївізста Тиса 1535850 ссвисавотї Ссвріввасу астастттає сасзаївсвх атввасрсаї вавсстевех гав втасвсатвї ставзаєрсаї встствсаляи асвізасвва ссасвлавава ввасссатве аа завівсаєст сабавсесжкк Кссастасух їссваесаєаза асававсвва ссСктакавнз зиїца кесссссвЕх сЕЗзсаасааї Єзссваєвзас засзазвсзає завасзасаєє асзасттвсах 28278
ЖКасавттвс саїсссавах сивевсвсса сиві ссЕсс Сзавасскає дваадасесту лхазве стсставаєє хестсссаєє зввіссавит сассствства пвсессттва ветазвраєа 23340 стхебассде СсствІїкаЄ стбааввссс сіравссбса свзасссвстї нссасстеВ 7о4оа зкастараїв ввгтавреїї ваквасвіїв звтзсеавсвВЕ сассавастсс ававсаїссте та4дев всвизавсву наїсссстас аївсєсвста асаствеисвс Свасвссасї вадиссккса за528 заваажіїса сабвсвтавс стсваввстї веааватвсї Сававеєтте сстставас гоа5на «фтвствавяає савравассх вавсствавв асвотсстаЄ нсісравваї Ссспсосавех 28640 квзвавстка асстнзиаве васвевіїсЄ сСсвавссткс бабсзвессак всКвсттасс ха7аа
ВЕСТ ТЕсЕва восгссстастї зесбсвстс сСбвдавссво бсбтатвтїас ветррвасасс затев ствдткахтївс тарсвттвсе сасвиКвКт стссвравс ївкаситвоа сви свас 2838 аівавдитве асасвастсї сссвссввас «Твінтясвї врасванвава сСсссаннеся чзаква твасстевскЕ зкжсвнасЄХ їстассярсв варакатсвсв давссавваїск сасзасавкс хаз4а згсабсрствс ссстсзвааа весавнасасе асатдватст ТЕвВсвссВсЄ сетестеТвВ «Юа ст тІсла сассвстисв ваввасзаїта васставвии збсссстара всссевиста 21058 васіксавис ССввассіїс вгссссвІїа сссстнвасу фсїсвсссви Вес ссвва 21128
Бствсвіїсї ссаїсстаря саввідстса впрзававнав стасваквав воттсттена 21188
ТЕстсВЕсКс ссвсвЕтТяхх звавссветв табсзавеє систассвна бастстеаве 219248 стнтжвсїКа ссвеївВвТТс асїттсввза аствватснс стасатвсвс стсттевеЕс 213583 асттстстає Ттстсасасі сзсстсссти Ті їссаїс ївасвавсвс ссггавствее 1365 ісфаосхвсвс сЕКївассас вссвіїваса бсреясссїїс СсрівЕВЕас встаассвне 21430
ЯТасввката ссбсавстис сазвВскаксс вссакстсвее сествасаки сстсвастев 21488 васавсстна шетрісавзвя араїтсвтсс сттсснства кааріввина стсавстаса 21548 аввтветстс тастасеввї всттТесаавв стастттсвзв слаєстсває ааарстввас 15 звсвссвета сиссзасвва завествана зристсастя віватівасо заазїїтвивс і565а їсквассвиу бсравсаявс Соаївсвасв сразасвзата асквсзаваї зЕасетсвака 21728 зізаїааїва таалркссвсвз аакідеразї кавдевзаве вваввтдтвї ваткавссве 21758 таврссввїва сеставсстт втатсвсвії вїсазтвавс сзтвавсеех вт ка 21840
ТВЕВТЕСТТ тазаєсатка астттазваїї їсабазаас» асстссзаїс драаназвсаз зізаа саїсссвктаЄ ссвівсаєви вів сЄЄХ зсссазвксї авсссттвак аввасвааес 19560 вісассвавеас звссстнсва ссаїссссса ааавстіїіїва заїдаасавс авидвасяра его всвасвіїсс зазввасссса засевавсяє аїбасстаста сівасастакє аЄсасттаасе кова асївстнссс визактсасяв ссссєвеакв всхсссасЄта астаєвавсс СТВ СВЕсве 22148 сЕвзваввтв ассввсвЕсвВ сваваансав сввастсвиа васвависсї грезаваєсє яатаа сствсаввЕс ЕВссяСсНВат сесзівванї саваратїса ззтаравнас ставсврває 28856 їсвссятаза насіввсвав савсссвіас зивВісЖсхЕ асезсїсвах васазезава 22329 заасстссях сзасасквів вавсасвасй сасбсвісса стссавазає еЄсвававаси ва сзвістсава адвссааави всваєтсевва сс тсваєвз вадевтваса бссвваавВсс згА4а ксстсввнсс сксаксвосса косвіствсс асссовісвс базвасЗесе ваааавинай хавай віІрЕстсків саваїтвссех сазісдкваїа зареазанис сасскрттвав васВссКсТВ Е5О сгсвасадсви їсссваазваї вевсссссвс ссясвзвАаЕ сассесвваа зазеаадвев 22558
КЕсквзассас вестїсаван свавсвкасх дабвїдясаї ссссаствас всвавнииасВ з2Бва зевсасваїтс ссастаєссї тсвсаанвсє сттсстестає аївавравиї їсатстсате зау46 їдверадваис асквввкасї вазіїзавта Гвадссссва ваввсвіссє стеми ка 22888 кассївстас їносвсїваЄ аквесснссв ССсвІваеасак свсвавссяс тасассеаеа зацн6О стїстасснї Євасїїсара астдвростс зазсіссїсв звавбевваїс васваїтстсв 25828 здашастсса анагаратас сеїжвнссси Стесткавеї ТвавенсвсЄ вссессвнавз 22380 ссдстжаснс ївЕассїТрЕ азвросвниза асвсттасва Єбкнаствсх кавсстаєся з3аза
СТгасроїс асасарасат саравасіси васссвватс сассесссовс асо 23188 їсвавістахї ядечвсїсав настої сСсВСсВЕЄВС СЕС ссвва стсестлаКе 2315 асссісссв їявастксаЄ ваввсссскВ ваївсасснс їаривиааою сбававссв 2335 «інвасасав нсзеввсрва бввсесрасв Сінна стЕ всвазнаває сбсравес з398а ствесссїсе їзкасствї звасєвзвссв сісаватств аасЕсвсЕсв зесвсссааз 23349 гвсттвксна їзаввіїїсЄ Саавассрва СссбріТнес вВсстєвсяа Траксвісях 2340а атаввтстстк їСеваїттвси сстзавсатвї затазєставнс аїдсазствса касетах "3468 таїдаваївЕ ку їтаєва старавтссс всаастатас асхтваєасв свасзезааа 23588 сзззастаєве сясксзвасЄ звнаїазаєї ассксвсвсЕ всвссаїста сект астава таза тевставтда ТЕСесввта аазссасссс артдсетаа авасвісєсвс аабвтястах 23548 їзвавїїтвісї вадсвтсваї стерЕїїасзс сасзазтатаї сессрсосвсся поесавссває за7ай звстсЕссва сервсавстс весасаванак саскасісва Тасзвакавс ссассавксс 23750 «2105 8 «211» 11042 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» рОВБЕО4-11АВОВЕС Сомреа ЕРА іпзегЕ нуклеотидна послідовність «4005 8 геІствТвВВТї веЕсвзтнсвса Сасавзівка сеавсявата азаесестЕеєсв свссссста ва звтатссраї табтставта авсвстсттЕ тстсттавиЕ Стасссвссва ясасаїсств 120 їгазасаств ахавсссзав ствазавесив базасвасаз сствссавТв ваїстсссве 188 їсвсвасвії ясзазасеев свссствкаа ства таєс стастсаває саавассзвта 248 таза їСЄзассавї вазсвясавії їаабвакскта Сбертавнав свасскааї зве
Тасавіасау СЕКС Є савсКтазава вісттасасс база ссва саанавссКХ з65оа анасенивав зехвїїатса саїсасаввї ареаствате свїсаїанеЄ тсвсабвсях ще ївсвятавиї тибввавваї авсястаєка татїатаасав Свакавтсас Сансватска зве вІВвНнІВварнв ССВІсСТЕАЄЄ звкастстстс ссітсвассЄ вісвсасвис ввсвВвсссЕа 48 пЇїстсвіса сссавазвсе Свв са сесавсаваз вссссвава засаєвакав 6 вартсзссв везсвссвсв звКаВсткав сваїзанастх звКесазиеї ваза ву ББИА анівезЕвуВ сеасвЕсссни звавввсуса брУдвавоквВ вен све зсуви га пЕтажКсксс ссозссакакв сассссстсх такс атсетавве засасавсае УВА севізавитя візвЕтЕтас зівеВсВсЕЄ везсссавра всскававса веоелиававах вай авкеяісаєс всстрвавсв всвсаеріва тсатссвссв ражїссзвае вівеаВТссВЕ зав цаскетасас воевавжнас васвоствВс ссвсассесє сствннЕВВе Зв В зоб
Таїссвтваа стсвтавакє сс сЗевІ пвазаатссоя пзісасств вссагетсве 1523 сетвавсове ВСТЕсаарсвВ БЕСссссавВ зявавіастЄ ебСтєвсетав вссжєвтаса з1аве свансївав всзсаївтав арівавзвЕс сватварена сасвссаїра вевавсакеа Щі1ла кавссстткавк салеватика ссссвтссс ссавевВсТсЄ вевазасяаєсє стсстЕтася здав «кевнтосява їсссасвата бсваавітаае скзекарайа сзаватавка кевеізевав зва яксскасває авеваватсс стактавсавВ зарависзви ставі сасссвасае 1328 зассянквис аклрвазваса вовна сазсвисасс вазавсанси ЗК їзва вавссзіанєс свсваавяйс їпзКсвааЕу ссзівеає СЕКС сасестсввх 1448
КЕВВствани ств їстав СВБ ївЕЄс вісївсясСає ззедасвасєз зсавсварав 1588 сазавсКот ве Есе вва вявВсстаква сесатваває бсаззеЕтвває аква ссао ї558
ЗссКссввах СЕсВЗЕсе: нзсвбесеїв звастазЕ басббвиєаа сереєвсвая ї62е нрссізаева вавивіВісви кассессаїс весісвавасс ествеаакав СессвсвКЕВ їава закисазікс скасизатссє зсевЕсзКсо асан нела СКК вЕсСКаєе крани х за
НСІїВСсКак СтсасстЕсс їВВсСввеску двссекїтос ссатнвввиа сстакаєтее їв зсітвсівта ваксттіса ас ЕЕЕЄ сасстбвва? фбарттавія сабаабвеїв 15858 кватжсвіка азсазававвтнк вазаїхжетв важ твтасх всбаляаснсв сазавяскаше їх
ТтЕВВАСТЕТв вЗатАсатах КУЕЕЕтсахх савзарсваа зККтвссЕЕЕ сзетавааЕЕ їзви чсазаксасав зазазісес засастсаяв сзаазеєваз забзаваасЕ сСссвазаває «вай зваестТВіКЕ сСрласвівКа вавасуваїс всасзісває ХсовістТеєсв саатаТеКея Ла каасзаріка сазрссєсвасє зазрітсзрсз скбкїаззаса засівазвав сссазсвазаз іа частисанає савотаавсска зсазвеєсаЄ бвассаазаа аазаназсве ссдасаааве жиша заваясазанк сслеанаааа сстсссвавЕ стссяєттє сссвіннає яксдававсї лива стйсвеавав сианісават част К ствкЕсетЕЄ ссткссвасє сСсстазсвса 254 стЖесстатє вратєвнатв МЕТЕВстсВО вессбсске бгвсаасвах зесвасаЕКа лава
ТЕКС ТвВівза часта іаЕЕ КсСжсВЗатс ваарісзТне засазівеаєє бенсссаана зава см ссвова Во сстаах звааавЕсска їсассадааа ссастввів ваабявасев ака севтсанві Кс ТтаЄ всвссзавВЕу савтазбваєХ візкавнаека ТтЕсааваКиа 5 взасисатва асЕссактзи сааеснетсв вЕсванасєвт тзазазазсс сОасесава гаща гзбїсвНссЕ Бвазазіїсв вісавсвіви заствсасва ява сссаскаах а зкзтасветЕ стЕсаснаса сібвваКсК ТТЕСтеЕавв севеВаїєїЄ савсстасаї Та
ІЕСТВІКсЕ ВссаКвсЗсс века УВЕ ЄВС яЄ зок сек сввакяє янв
ЗЕВС ВЕ всосауксве збааванК сісвасках всвсасасас ясесасаках БВ зжаізкакні аквЕітаїаса їсвінсесКЕ стазссївана заасаасяка бабака Зав дівсвкіК: сствасавсс засів свессевссЄ всавзавсяс свсхвивва За зідазавасв бавіствутв сіваваксвзу сів Е заява Свавсааах зад кекс тсзааї СТЕавссзЗва звісссвЕна бавсбзаава зічасасвов вс свасса 158 свнасаааас еасаовіазса засссвевис сесксакааКс сзаствоксЄ асссавастя зів зассанїнса закінчує Слассвайна зізацеьиуз ан тає звіаевавсе зе зчіквассса СавіввЕКу Ст твасса Сссзазвавас суКаКаиМ аа ЗЗаВ звавітіїзя звірина фвїсвзісвзіз їсавсвзвтав дессвзївкЕ Часавс з3во паівсасса сваїваестя сивааваїаа сассвтаєа сабаасвасв асвассаста ЗЯхЗ всвяссравї веЕївановсс вісбсвітас асжЕтстткс сЄсоВіств кас вВсеВ аа свЕсссвсва ссвстсатся ВтревссЄЄ їсаВссТТїКс світїсасрвіа втавтвЄТВЕ зав сссЯсКТТаЄ свовксЄсва вази сессзадсає сс Езава навсВссеВ зо8о
ТардіїнавЕх сесасткст: звераазвов зсваасстЕс схвасвсскс звести стВ ЗБЕ заствтреся саїстврнаа вазвасслаїви астасствес зВсснавЕся бсссвеване 738 савіїсеасве звссссізва авнаіснат сссасвВсЕЄ висссасене вівса се зУва саанвазвиу вссрассзва їввсассвсі видзевасвЕЕ саїкаравет завававвева ЗяяВ псЕйпеВаЗнЕХ зсеснтвВаЕс ватссавЕжЕ сскзавЕсва зссвссвасв здсенВесЗКее Зчаа спавзвжакс севжановиЗ стхдекаася шевКттстсВ савсвсввоа сясравсасе за сеавааВссу сетсвІВВсс стек тстВ врсвоствтс савевасвеаВ вас аваКе зва схвкзаавсскМ всасвавнав їссеваввїс зсаяразеда завіссазвевЄ ствавеесеВ деко всссзвВееЕс савалазасес сетаввсств стассстсна савсввІвих ваза АВ зсврсзнЕви тКесвВссваи ЗЕссВтаїса свсстсаєст ТЕН СВВЕВЕ сЕКоТреКеЄ 32088 тво твїЕсз ства тсса сассссвсса вавесавазв віссвавтсс всазисєсата зва естЕКавсе Ксттасссас асзсзкаваХ ссввсваван австасвасє ассстсвсвЕ аа ївазсссвус сасатстяЕс сссваавава всассвсяса ссзсажнниє вабаасввие азни
СаїссввсЗї явсвіванивс ВЕссссвароа всразанїве сазвазвссс вававвіств «зло тт вссзоВтї веЕТватава звВсссезав аажссвВієюс ссбсзавесе австстссаЄ 50 сівЕсСраЗзах стСсвевоВх зеКавсатсс їсзвасссзе восїсстваї стсввеТвдЕ Зо сівралюсса зароссставвне саїсттссяв вссітезвак вієтсвтвнсе ваастеЄттте Ів заавссїсзи севсатсанс ассвЕсніта всвавсаївї визна ає пиадссасев вна
ВЕвірсттвВи звтЄсвоїавс зісвівноєст зсвтесїсава стсісвессв ТстаВЕеЕсЕ 4яУ4в зависансвк ссластсатв зеакстсавно уст ванас ссзсавнанс зВтараавса ав тссгкаксвя сизнансктс внсвнеасвис ссзвасссне Сваравесна сстзеванаа а8Ба ватсссссаї савОсСККеЕ зввисаєатв свессвосие КТС сас СТВ ага ястнавВЕсу ввісілвЕВс сттввїсВ СаО аказї вясвВвасаася есвававсаа зак
ВО свванї висСсввевакве Собавевтас есвавяиса ЗзВКввасквЕ вві стасеє Зааа
БІТЕНаССсх возвідтевах зівсвсвяии СТвастттає сСсвесвасев ссзсзааавее зі сівавевизе сві вакас «са севс ссвавссвос ведасвнатвс сасесвеваЕ зіва зсзавЕтссаї давсеттвис вебвсївув звсваввеКи свеваЕвЕся зніс КУ сВСТЄВТЕЄТС асттдесствя СЕрасттвВе сесттсстта свведеактт засесствся зАВВ твесвтаван ССС КОКС Сяк сссвнас а вссаасатає завивка З тїсвсраамса зааабввеза зоб ваз) сбесвствст зватрсасви ваїтавиєна що аМстесреза татакатттЄ сбсатстаЗ завсааватєї сносттає сзаазастата заБа заївізнана засзтасвас з'їсаааєаз звасезазак алразвестсс заззававсзиа ВІВ век їз ясні ззав аЕсСарісвся сахсвавтка їссвісаєза Катиссасва ЗНА «азввтсасва всссанкваз втЄлЕєсвВевї ствавіааас бззававтсс зскзавасає 5аЗ жезатсаї зарсссався зевітасква ссазававаз азавсиссси всазавекаа БУ зсвпснуєса зоелазавске сісезавісїє сакетбссєЄ сзсваасвЕх взазассаха 5БУва сапанваєзи шісаваканя ФСК вВсссВКсХ сссавссссю баса звха ктсхассвна ТОВантвККх абс тасс СО тсевВиК саажваТаКЕ васакеаЕЕх БВ
Іде Взаас Тзатаввясє засаассваз вссаївизатє аз'вваєссре бссазеаттї заЗща укевадавсї КСстевіава аанессаїка сезвавакЕх веЕжвВвтІзаая бгававЕсасся БЕЗ встав ксс тсзсасвів ссязаійсзеа свіааЕсака зва тахтї сазатеваза Баба свбзассаввІв стві свисаз зсврїсвеВу зазивевітав зазавссста свтсаваиах ва ттавстстаз зазстсратсє зЕсртввазї себасззава їсскЕватст астазхаєва БАБИ сатааВквсКЄ свсавсасЕу вас торвавесек швах тЕссввВ бстасасах пляЮ
ВТ ТЕЕсЕАсс зтреексвас ст КТтта віБІвабакХ ТЕрВЖЕЕТВЕ свавтатате щі свіїсвідсв ївЕссвКаєз звазсЕтсе тезссясва сасвсасвса татакасека аа тятакасасй тсакзіатся свое зосказавав сзаїасясиє зкатакавсе а
КгаїжЕсткї засавссвіз Бабдбївсва Кіраїствсз вазатаєївс сСвввисзаїе Бахе завватасая їствітясто заавббабстс вазбвсвсаае зе жсттаа звбазаєкся во тісаваїтЄЄ зесбазааве сетнсватав стзезвався збасвсаясс Ссвассасве вав вазнлячнаса сасавтавна стовЕсвБсВе сВсжТаКТвЕ ствяаансавс сувсосвасах обев нвувнавсас ввсвстстсв їстастссаа взазгаїсвав ватасвитєх савааиакса да пвссреїатт сарасєтестс меааввкит заївісввива авестсстсв ваіїссвттВ БУва песввствкс свісасЄсса Тесваллвийє звтлеааек яливисееса сс ваВКв БНФ ссавссвКтвс васанавоаз зедсснсвї тсаниаквсс Сствесваса Всввісссва озаа зкаствивссс ссаєксвска вевлсвтсв: шеававанянв взосдтстесва сєсасвесуе За заавсазнсЕ йатткатеся азсазсвсвис вкавсасивс зессссвтссЕ астссванваа Увага саїсвзваває зсавссссви завассвазк вЕссесткав астсттєавс заавевтває ВО авіснризавс стксіЄєвиВЕ ссеЗежвссє зретатству састєсясстаз завдвеаснех тав вразвзавнва веЕсЕвсвокх асазаєнссе їсаствсває вазаравади ствксвВЕКся ТОВ пвасвсстсЕ веосвасвисв вусссзавша Кввассссєв сссасеавво вовзісеквиа 2858 зававланвс вкїссвасса свої їсєваз всазрівниї срасвтшаєа бетссвсква тав свізавввау васвсасвах сссвскатеє фісвовадяє сеКестсвах зсазовазнє зна св Ссвії їккзвавває зсвссвзаат сассввскіє ссбсувсвяа тота ЖсЕсТЕ аа свв ів ссісссавев збсттастє Сосвотвеє секесретви сбовистеся Т5аВ твазадсскас астсстсвяав звсасваєвВа даааваєстс верессввай везе ТЕ саїнівасс засскевніна вравасвссє КрисСврачай засне аскавнскне тиха застдатвсї ясЄКаТВсСХ зсваксав: севсвсТЕаваЇ бесвесаввя ставів това дсткзавтсу стсссяка висствтвсе сазевивтає ссбсславаа вис аКСе зУ4а таїсвства: їіїссзавяво їКассзавса ВСсТваВЕКХ влевнааїве сваассКЄ зви тетесстсиї вТІвВсттзса вастсвсктви Вся сесї ЗсКсаКиКТЕ ссВЕТВсСТВс ТЕЩЕ
Теїсазтстне сасвваіасв ст тсвстве детсвстяув сссвиВеТви гссавввиВе ТаІВ атЕХсККаївВ сітасЕсаси вав твеаса ЄТастсКстс зссвнанчаса свое 75
Хаввистасс сзеКтнвсеХ вСсосвезсЕ сна ЗсВсКЕВсЕ Сова Еко жмнесвисяех засяяшсаєс ясщстассск сазазвстс сзесасвати вес Іва тастстссст сссвкввсЕ сссосвавав захсветвКх ааввтвазвЕ сесстТвсКах ів как сєкессстасес еввстааясх ККтсвкКссЕ ВТКаСКВСС ТСоссВЕЕс вла зеМЕввасве сешсксїсє Кесвссстая зсазсатвосс аввассааво зсбасвасва пок восхтвстасв стсввсаїса дасзскнасх свісвЕавас сссвсєвста асо с 348 твватасвт стсвстТвсс Зесїтесста свотсавЕссс кваветатвє зсаїстессе ча савсстсвсї всЕесссВса сісаїстссс сіре ссина ссїазсвавс зсвстаств ап кЕктвзвКас ветвставсс ясастаєсав ствссєкессв КСВ вве ссВВЕВ БІВ пзідтсстасє сісзаєтсясє зваїсвадся сеасстссве ссгістасвс сесавітсав йо асассстаак йссвесксстВ вавсКазеса вевсессвав злвсзевнає тесастякиа вата зЕЕнававва своссссвеер статввства сВссїїсвВиХ засстсваса асетвестсВ УВО сЕСТсстдах заваааатвс виска ввис висовсвас зіссзвасвї сСіроєвакаа Влоа заст стїча вассвзатсс твВСтсвссвеЕ ссєвскасва ссассасата змстВсєВ БІВ зас звсасвсзас аабізнсатв їзаївсеасва свя сКтай вакасквеЄ ва
Тісассесса вавссссеса ассакасаЄх Саавсасесва савовазсав засасансне вала вівзвестави зізавтсаєЄс всвсксЕаїЕ хсВістТасрх свесвеавїсс севсВвосВ зай хеаттднстяв взвезвВсттВс каесатнесВ ВавсасЕИйсВ СКС стссавиаие Зо
Віссвиоваїо садестсзва азвассизаве вссистезва сттсосваса зваветаата зів жхедиванасс ХсстснваЄЄ созктвсссв всїавЕсствес асЕссассвза заввасвиха ЗАВ дечазнивае щіннсвсста свазквесак сесткскеса завизавнис саксВЕКсвя зав катсксстяїв ссвясансви їссслввяваї вевсссссас ссвсканкак сяссвсвнаа з3ев вйзваавасв ХКссазссвс ЩССТтсвавв свавівВе васвсратаз саїваитавев ЗЗБи свсизсветсЄ бсвїстВсТс савенататє аванаїзсяв сстсзканевя ссваавеще зав вітвлвнихх стсласанав ветавтатсв веававсстке ЗсекВттска КЕвсссВес пана «КствісвсЄ сСсатсзайави васаксзваз зевезавеТи всавестасаа вода ссах зав твсвоїВазЕ швавнвстат свсїсаввах кестсєсиссв асвесевтсс сзвавасива Зк стсссассста сварнансаХ сетвказаая вазвасеїс сєзассвсвс: ставала зева вувивасівчас віваіаКсКс саствеасвіа зревасвася сеасазакєсса сс с ща «вапвссткс сосбасвуза вазансссах Ссзсстсвкна взвевасасвс Тказасасе зЗУ8О звтстТстскс ївсозазіста Ксхеєтстсвра васкВкїКав сазаватвкаї тТевсвсневЕЕ ЗНЯВ
Кс сЕВсс ВСтТавЕїне аваВВстаїх седссВївас ЄВвИсасавс врасвассее ща сідстотввї вссвосетвВо ТссЕвсТаЄс засисаввве аВвесВЕСОс ТКС саа Забе
Кассвасстя СссккіКесс сраасвааВсх Ссанваскав всаВсСЕсКВс тассвсвВсх їз пвссосаКЕ ввсвУКсстс всКеавсхВЕ сссКасвеЄ БОсзствави кова ЗККа ваза
Ку їх СУХУ ХУ Ме ХУ Бім М Км 5 хх їх сіниствсїа сбввясваав Звссдвевса биЗЕстЕскв боВтЄсвоє ВВС СТЕо зча14а с ; х ; ; - УНН еф ую КН м мух ух ЗЕ «ванзазитя їссассвіве ссдяївсваї всвдвсввств сасвсвВесКкВ ВсссвсосВе тах с«твсссаїї взесасся свазасвіси саксвзасва шозевівсес вЕЗзсеЕаае: ів2цо «врісткріс ваїсввкаїв аСствезска аваксвісар воястсвсвс савссвавесх зазЗха птосвссвве стсванисвс всВзсвссосва свисвавнак сссвссина стсасввсвя таза свссЕвстсн ссвавсакся свЕсекааза СенесвсТеЄ скснкассся ссвассВІвЕ за сеЕвВЕстЕвиї ВТБЕсвЕВсо йствтсавЕв сатавсЕКхе вотасесвтв Вас еа МОВО пастви с весезаствив ссвассвсск соті сКЄ КасвЕснісвВ севссссва 19558
Місвсенсво Вісроссєю вісвосєсВ срасвавкіс сбстваався свівассВЕЕ заБ5І кзавсзіїкв везазсалаантї іст тзЗаває звазісских свссвнїЄх всоясваств заБаа тебвстаксавсї стсетежївзває сасеттвакс асеїавтаає сазезсесва кесвевасеЄ ї1874о «Встав ЗТЕдЕсССХХ аївасствниав їссосвсвВасЕ псасастаз тасвсвасав зво вераквавнх жаузвсвсвса йвссавнася яастатсвсвВ свсвякВеКа бетатаєсис 18550 ставаєсквсов ссесешНсвВї гвадавссзсс ссавсвоаКе азавасвЕсс всввУВВКЕ їз зіівзнітвЕ ствчнсвоса акне Ктаєс вссасвекає зіссбвесас савссанеов ОЗ зсвЕсСТсссс ваксевсвис Ссвесасваз вікассзсЕс Каїзсздаса всессвЕсае 1848 те 1885 «2105 9
«2115 1254 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії
Ттаспапсеа Кіцууекі 12 десатурази в рослинах «4005 9 «Срансенств Ссессвікво сВеВісстраЄ сстазанняса сзиВаЕсКс савсвасвеє БО вавсявваре Тбссаланеї сестатсваї зсезасвраз зсесектетс ХВСЕссТКаЄ 38 сісзссвсса зввасаїестї сТрдавстате сєсісзЕваВ Всїзсвавав заваККве їна звесжетстиЕ асжеВсвЕнеТ свраваїатс Ксстрсатнс стассяссви вевсстЕаеє «ав сетазиатсс бЕтассексТ сстсвЕстЕХ Еасвсстета асвисвтсаЄ саавессвВех ЗО тістнвЕссс ссСзсзстса сресїсавене ЄББЕсСсвваа ссваааеств ВЕС Ба сасизетвий вис газес сс твВаХ КасевазскВ безасвасЕ сек васня ща асссїжсвск сткасектах веКсесЕтас Єссввствва весестсЕса Терааавсв ще сасзавшкка стввисасвс Бассананве зснЕужжтсв Єссссвссвє сааававвая 5 зх ававннис ставав сооскетняс стбсвстванх асхссвадна Кс тесвсх вав завассскІї зсвзвсттєх сві авсзз сттвезноа: вватевесся кЕТЕТТсВКе аа заскісвсвв васавсскка сссівасвсс сс хниа езівваасса ЄКТС 73е зессстссяс Мі сСверсз звезваївск сіссвсясеї ес ствя СсКЕвнааКе То сктсвссовре важесвВКЕст ХветсКСтив тасавозаВе зсввавеакв ВТС Зав зчісазствЕї СсвВЕссеЕка сестро ЕЄ зассзстовс свт сах сзсаїтесеє Об садсвгаств авткстасєве вестсяскає засествави затв свстааввеє а
Ветвствсса статсвакае зааестсвка сісаЄсвває стсвсатсЄю ссаїваса ав аксвзкастс «атТвстсЕсВ ссастаскиЕ сссзвваєсс сасестасва состааассх їацо
ЖЕЖХСтЕаве стяссваваз заст атввиВ завсиотаса витставсва сваваасвв ТЯ ткани тсВс с твиаванес Тс сї текс аасасЕ ствасвВехва св егвЕХ що
ОКХ їх ЗО - мох М хх т їЖХ З ЖУХУ З КУ стсвЕдеТкК візасаксав сааствсвра віТввавствВ ссванкаавсв ав 125 «2105 10 «2115» 416 «212» Білок «213» гаспапсеа Кіцучуегі «4005 10
Меб бек дії Уві тиб Ууаі Тве піу баг вар Вго бух дхйп дви біу щр ї 5 їв ІБ
Баг баб й5и Тве бів бій біб Уві БРо Буз Уві АТа Ті й5р Те дей зе 5 за
Оіу й Уві БНе баг ові го а ББе Те (ів бух Ах Ті ев щу 35 що а йіз тів Бк Ні Зіб бух Ту бі аБЕ о АБб Геб Аза Твб бек Бей Туб
Тек мні бе дгв до Ті Бе Сук Моб Би те Те біу Туб рев Те -х за 75 ва нія бух Кі ви Ту БРО іву ви Ті Зв Ту Твг бек дкл бек ТІВ ях За в тів Куб БВе ТВе Бве Тер АТ ів о Туб Таб о Тує узі біп біу ви вне 188 105 ща піш те щіУу Ті Те омаз ів Аїа Ні біб бух Зу Ні біп Аза Рле їх ї25 аг Ах о ТУк бі 16 Узі Аба Ахо Бве Узі у Тев о ївкБ ген Ні Зев 13 135 14
Тук сво Меї Уві Бео Ту Вне бак Терору Тує бек НІ Б1У ух Ні їжа що ї55 168
Ні вух АТа ТВг осі Ні МежЖ Тигб дкв Аво Меї Узі Бе узі Бко дів 165 ЩУВ 75
ТНБ оїу5 ІД Бі ББе ух бух Берг АКЕ Ап Бве Ре оту ах Гей Аа о зе ї85 ї5а
Пій Тув заб біб Ар Бе Рг фец АБЕ о ТНг ово Ту бів ім во ма
Т95 а 5 біч піп івец піу біж ТгРрої1в вів Туг ге о ВБпе уві Ахп омаі ТВг обіу ле 5 вай ціп ово Тук бко дбо муяі ко бБеб Теробух ТероАха Ні вне Тр ев ах Кн аа аа їв о бає вБо фу вне біб біз ве Ах ва бен Тубє Щіе Ре Єви 5ег . «В аа ка
Ар сеи бі ів Кеш Те бів ББУу ті УВІ бе тТйе бе Тео оТук Су
ЗБ 265 78 іїу5 Вне Бі (1у тТРО Зек жо РВЕ Ті да Тер о Бве Уві вка Тут Її еВ зва КЕ їкр омЗі ди Ні тер обеб Уві ББе їі ТНе бБе о їеи біп Ні ТВК дЕр га У Мк го тТне Мет РРО Ніб Туг дхйи Аза (і б ко Тне Бе діз ух Біу 305 За 3515 328 дів ліз Ата Тек їі дер аАгЕВ Куб РН бі вве їі біу вро нія тів
За з3а 335 вче Ні Ахв Ті Тіз зіб тТне Ні Уві зей Мі Ні Тує Суб бек АгЕ 4 З 5
Ше вго рве Туб Азп Аїд дев обро Аза беб бів Аза Ї16 Бт5 бух уві 135 Бе 365
МеК обі Сух Мі5 Ту АБ бее Бак АБО 010 Абе Ме Тр бух бек о ец ав 5 ЗНе т соуси КЕ суку ба йти що Ех щі пору ор х мк хи
Кб обу зве ре Ас Зек Суб БІВ Тук Уві А5робіу А5р ода біу Уві 35 ЗВ КНУ зве і х туї схуд ши Ж о х ук фах у. З й їх іви Меб вве Ага Ахи 16 Ах» ода Су щі Узі біу діа віз біо су ча а 5 «2105 11 «2115 1251 «2125» ДНК «213» Ріспіа равсогів «4005 11 звівїставне сСівссяївтс брраїствав ЗЕсстсвави вабеївсЕяя вассвітаве В
СВХЕСТтрвав вевжкКвсВтс КТїсазксар сзававассв стасвакяє сеесвоваве 128 гово еру и М Ку рах у нори ее мережа о пит ур у ду пу тут ис рух заг вуТсКт:ваве свссзкаха сассассчао вереск тв асвесакссс авЕсесівЕ 188 соми у одн в и у куту ер ув ки у скул друк леделюф су ит усу ть му у ра» Заг тасреинаває кістсвіваз секасвссь сесвіввсво вена тсвЕ вЕсСсВСКеї жи встатсрстї зсвесвкаеє Езвсстаєвтс сетсттетес ставсвиавЕх сессвватЕе зо х. па сумуй я диф жит дув нд жу фо ку их фо ух ня УУЛУЯ ем уж ух ху ау Я, Зх
Вс ТТВНЕ стокове ВЕК сяк св ввЕгсдкаах статок ще вивсясваве всвЕасаКтс свист зассзсввах вевсхвасна їзссветива Зай х ї1-ї оато лу фар ре ж дж ау ши екв вх у пуер ВХ, пра и вику 25
ТВЕН ТКстсЄ веБессесеХ саке К сассссваесї ванн скс бсасвотааЕ «еще х зу у у а ху рам куми тру р ех хх сассзтівави сівсгвеася сакрассява вататвиХЖХ совжЄсскуа свосвскває За пачках звалвевавека ЗВ ване ККЗ ваЕщ ке оееваних пек кави вазсісєвазв знаавсасся зассвссадс сссасвася тсрстдадна застЕссате вав
Фк УоОО сфхдкию кіж ую фу дк жу у мк у КВК сузжатуєх ВОК АК Яр с пам жи ри ше каВСІСЕВЕТЕ терстеТсхЄ всбеЕсавесни сствреввЕаЄ СКС ссхткскасе ЗО засвосттнхв взвсласссса сествЕсВсЕ стани совет са сова сї 26 та фу а в р М ух дру мус ЮК в ви КУ хви пав у ді вн в ву добрива ка г спохавесссКн КК ксватай ваазвеазссас светасат ССС сства Стає ТВА сттвствекс КсасЕКетвЕ стВсасквої сасаавеЖЕ свист всстВотТе нав вісвсасвиЕ теТЕТссЖЕв КаБссЕТеЄ зассзстнвс ХВ ївВссЕТсе зва сжвсасассв ВТЖсЕссвВ вестсаЄтає квЕвеЄсаак засвеастсЄ сробаввних зе всстнстеста стссевакав зачекссева асссїсвиаа бсасссссеа твасеїсаїє ча завастсясв сестссассв стасвстта авЕВссєсеє сботассатвс Сававлавсх тана вссвантвса ссазвазаеі сабвквавав састасеває зсасскаска ваасаїВЕВЕ 1345
Вітввссетуу вразаветтк казаеїсттнс саріїсвВеев зезассатеа сКртвТеїає їгаа асвстссяте зстесаасвних свттввавтв аавсстаавв зсаВсстЕаКВ а її «2105 12 «211» 415 «212» Білок «213» Ріспіа равсогів «4005 12
Мей Бек обу5 Уаі тТве Узі бебе біу бек бій Ті бео біз 53іу бБеб ТВг ї 5 18 15 іує твеоУві АгРЕ дев Заг оФіу Аза Узі діа беє ББе губ іп ой о сух
В й ЗВ
Те вів гів де Тв обне біу ат Уді Ре бух УЗЬ Бго йзй тує Те 5 ча 85
Ті у Азр Ті їєо дзр Аза Ті Ре уз Ніх Суб Тук Бі Ага бек я 5 ва їеч Уві уз бег МОЖ его Тук уаї УВі Ага йзо Ті Узі Аїв Ті баг та 75 ще
Аїа тії Азфа Ту Уді біу ев о тТае Тук Т16 РРО ву гей бро Ахи 1 5 за З5
РЕ фе) Ав Ро із АТа Тго бек Аза Тук уаї Ре баг ї3е бек Суб їв 185 118
Ве біу ве біу Хі Тгр 118 їв б3іу Ні Біб Сує ЗРУу Ні бек Аза 115 136 125
Бре его Ахи Тук Біу їгроМаї Аха Азр о їве Уаі ЗРУ ТгроУа3 без НІВ ї138 135 15
Заг оїез уві Мебї Маі Рео Ту РНе беб Тер огуб Ре бек ні із Ку 145 5 155 15 ніх нів ух дів Те сіу Нів Меї Тнгодге АкроМех Уві Рие уві Рго 155 178 175
Туєс Тнг дів біб біо Бе уз Біч фу5 Ні бій Ууаї ТР бек бед Ні зва 185 із38
Ар тів Аза біз біб тТВРОБКо їі Туб бе Ууді Ре діа бе без рве 495 о 205
Чіп бів ів біу біу цец беб феу Туб без Аза Те Ахи дів Те овіу іа 215 ва пі" бро тує Рго біу ві бег о їуз5 пе рив був бее Ніє Ту Тер бро 238 235 248
Заг беє Вгро Узі Бе Ар огух уз АброТуг ТРр о Тує 116 Узі Геу бег 245 ТОВ 55
Акросез біу Ті беб Аза Таб обзи Так оБеР МВі Туб тпм Аїа Тує Ку еВ жо 218 маї вве біу вне Тер оре Те Бе тів Те То Ве Суб го Тер Ті 575 28 285 іїеу маї Аби Ні Теробеву Мі РНе узі Те Ве о беу бій Ні Тне Ар ва 255 зда
Бек о бЗеб Меї РРО Ніз Туб Ар ліз спів бів Ткротвг БВе Аїа бух о1у 385 З 315 а атїа віз діа Тве о Тіе Ар оАгв біб Ре біу їі ів; Я1у Ті Те вве
БУ з3а 335
Мі Ар 11е Се бій те нії Уві Бен Ні ніх Тук Маї Бек Ас Де і ме ЗА 35
Бго Ве Тує Ніє Аїа йде бі АЗфВ Тиг обі Сує Се суб бух уаї мес 55 зва 365
Зіу біб нНіє Туг Аве Ні ТНе Аз біз Аза Межх То Уві б5егБ о їва Тер зв 375 за
Му» Ве Тер дес беб бує Бій Бе узі 51) дей Мія Абв обіу Уві Тує зи ща 395 чав чаї вне АгЕ Ази Суз Ахп Аза Уаї Зі чаї уз Бго су5 А5о ТНе и за ма 4315 «2105 13 «2115 1392 «2125» ДНК «213» Місготопавз ризії1а «4005 13 зЕвВтвсссвс свазняасвра сввссраїсн сссссвсКах свссвохвас всрсввсзаа а їссіїссвсве звесвсссва сиссварвас ЕсВісвякКсв сВсКсВІсва сстсаааясе 129 стсдавсскс асвавстсдс весвасвссс вадасвсваЕ шЕНТНСВсЕх квас с 158 навсзсвасв їсасваастї сазасасссв веарввсВрсв їКасастста сатвеєтевсв аа засасвенся сврдаснссас шраресдєсс завдавіїсс асаїясвахс всеісавЕнся зев ївназниасвс їсзвавсвеї вссвтсвсяс сссвсвизва Тсзвасвсаи севавансває звБа касвснссва СЕсіввавва ттСсвсвсви ТвРвсВсЕСвВ ВЕстсвазев срАсВиВТС зав жесвавсскї сватсваєвся сеїсвсисаї свестастсв австсстсвс ввссстсвеє зва жїсввсвссв ксстсасвуа свссееввтас кссввссатсв сесссвЕсеХ втасевсКсВ 530
ТЕКСТ сВвсв стсрЕТВсВЕ Свв сСсВв сзсравнвсв вЕсавсаавстс вехезсвеЕВ Бваеа тесвістасв їсрасазрсвя сстссвавсв асивоверск вЕбСТсВнЕсї ніссасване й вирезнаТеу визассаивї всасазсаав сассасвсва сиссясаназ автваввсяс у
Касзсввасс сядасвсвас сессвсннКВ вс стЗ зсассвссвх КеЕЗеваснає ва сввссвавве вдсїссссв СВСВТВВВсСЕ срЕсССТсаве садтврасвс сЕесссвНВ 548 асстссвВнс СВсоссвісса весвіїссве ассотасвесс ТвсакссвсвВ Сас зва свазвравва астасвавва весевесВувЕ асвВсТсВТс стовВснЕсВї саквасевсВ чей зівастазавс ТкрорасЕЕе ВЕасссвтВЕ сссвісвевт аствнТвВЕЕ сассттсвес 18:58 засствватсе сЕсвсаївтха сстесттсвсв састтскссз свзресВсаЄ веВссжесКЕ 1855 вісвтвсссї серахтззвся сссваясїве всЕзастаєсв свиіснаєсв сассвТввас цла вісвасссві свсрсвквіа сесзавстре стваєвеває зкствавссв ссвеввтсвЕх 1208 стнісвсссвІ їсссвивсвЕ вксвсадеКї сессавссвя адвснавссе КеКНЕсКВс 1955 ссвіїсЕсва яназвсднЕк вссинасївс вакесвстне сстаєсавсви сросстрвказв 1328 нсвасвЕтс скзассЄсриа Сваарвїсвев сарсастасх зсвЕсазсвв савинсевив їі1388 занвсвсаст да 1595 «2105 14 «2115» 1395 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії
Місгошопавз ризіі1а б десатурази в рослинах (версія 1) «4005 14 аснжвсссск стваваства бевазвак Кстссїавак скссассас сві 5 ство тв ян їтва СВвссзаввах всссстасїв стсстнства сс вавасе 128 сітївавссзс асвавсттвс тесїасестс вавржнтарає вееттававї троврисиїх 159 вавівсватЕ тваствактк сларсвессЕ ветевабств їрасстїста сакреттвсх зла засаствеЕїв стваквстас скаввстссс заадааїтсс затв ТстсаЗЕКеї 305
Твнаавваїиє тававеккт вссеКстава сетвссвава їсвадаваєс твавтствав зва васастсста свстївавда ТКссвссазна ТрисвТвссе звести зрасивакте зга «тсвввсстт скабсаєссв секеескЕвВс арасксстск вес сЕКасЄ сасвзексвих зва сїїсравств стсттаїета саствреаївс сетатсвібн стістяжтнЕ гбасвнтвсї аа тЖссєЄсвивА ствваксевївни янв Есва саснавднетВ васатавскс Єсетассвиа БВ стві сзсе сввзсаавав асктсарвсї асвасктвси каїїсвявсК Сстастс «ва вВІнзваївї везассзевзї всатїазсваяв свссаскста сссстсвааа весіввасає уза кзтаївваїс ствзбвссас ссствстеси вості сттса зсзстескиХ Тваррасвас 788 звасстздав ватсстстав вистїрвист адасттїсаве сттвЕастКЕ секс ав весЕстврас СЕС вІКсвВ вроїксстгре вїстасвткс сссвссстав всзаніїсте тва сштїааназва австаскайра якос тив авсрстсвККЕ стсатвикнЕ тавзассцсї зеа
ЕХ вЕсвавс ссвстастик асастсесвЕ ЄстТЕССВСЕЄ Весни сасеттсвна 1028 зансстрнатсв сттасатита сосжКсссвсх сват сеста сттстсатає ссвестессє зе
ВіТВЕсЄссаї стватвзався соті сЄсвЕ вібзасєтасв сствїтвасЄка сассвттваї 1158 зїсваїсст: ставлаваста сесдявсквв ссоасввреє ассссвастр ссаврвіївЕс за сассассіст сссскраїаєЄ вссіслаєтс авасавЕсстїв аевіїавсвв аавасссех 1258 ссссссвсса аразВсввЕй встсваствс завесвсТесЄ сстїавссасви встав 1328 встасжттТсЕ ставссттва їазрЕтТреиаз сявсастаст всвттавсве даврествав ї5о заквстсаст аазіва 1395 «52105 15 «2115» 1395 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії
Місгошопаз ризіі1а б десатурази в рослинах (версія 2) «4005 15 асвхвЕсстс стзавассва Свравваєсу сстсставзк сісстстсвс садесствав БО тсатстестя ЗБЕСТССТва сестааВКає воїтстассв стсстВссва фгсітавнасе 12а стЕравсстс всяваєїтткс Сдствесїїс ванаєтаває ввесіаввях Кпавраснсх 159 кантасвасе Твассластт сазвасассст ввірЕнакси ївассттста сасесттнисї зай засасівясв ссЕвівстас беввастТс вазвизассє асвтвсевтав сстсвавнсї в
ТЕдазватвс ставанестї вессусскава сстестваво ссзававасєс свавкстеае 368 ватвсїсста свсствавна ссссессвКе Свеававств васттвадав насвнаттс «Іа
Ктсзавссск стаєсаєска твттвсссас свсссствя авсесксквє тасессвсх аа сіївЕвассв сссттаївта сествватає сставісаєєв ссзвсвстих нтасввтвсях Ба ттестсвЕнав ставасятяе зд ссавз сасваввнтЕ васасавсес сессассика Бо
ТстТвІвЕсвВсК Твваславав асїїсадист атвастсдск ваїттсвдасєт ттстассвре 5ББО виавадатвї враассаває всвіазсваав сассатвстя сссстсаваа ввстзвасає 2 васатвваїс Єсдатассвс тессвстеїр дебсітсстсвз зсассвотвЕ вяврваєвах тва звасстлвнв вассстстав зестТвВЕсТ авасттсяяр стТвЕКасссЄ сВЕТСсСТВК вав асттстЕНнас теСТСЕТТсВ ВВсЕсссТЕК абстеясЕКТс Єссассєтвв асаресесіс зай зввававаннв зстасрадна аВсїТсттве втвстсвеех стсасаєєве бТазкавссвсх Ба вСХВІсзавс Єсвсівссвв яСастсттвв сствуКВссК ассвВЕВВКК састстскка та28 заствватсв сттасеквтв сеткжтсвст свежжстста сттстсасає тсвостессх 31980 вгснітссаї стевасзавса сссбавстяв віїаассасв ствЕсдатсз сзосисскає 1140 атсраїсстї стсвїндаса сеїївастве сттасвркаї вссссааєти ссваррттатс т28а кзссасесКсх кссссратах весссааїтс зрасансстн аввснЕсвад задасссвсс 1558 сстжжснскЗ азраанівнни астсавстає задитвсссї стсассасви СвсїсвррааВ 1329 весетастЄсса всзассїсєва сававктвва сарсвестаст аскссзасве азавевсткав 1350 аатвстсвос вахва 1395 «2105 16 «211» 463 «212» Білок «213» Місготопавз ривіїїа «4005 16
Меї Сук Рго Бго ух ТАиг Ар о іУу Аве баб оБеє бго Агв Заг Бго ев 1 З 19 15
Твг о АеЕ бЗвг фу бек озеб Аза бів» Аїа ев АбБр Аз Ту Акро Аза бев за я за
Тнг діа рко мві Ар оїеу Гуз ТР офаер бі Рео Ні біб бен Аза дів ча 45
Тве Ве біб тТВгоАеноТго Уві Аге Уві біц Абромаї Зі Туб Ар о мді
ЗВ 25 56
Тве о дДхн Ве ух Ніб Рго біу біу бек Уві ЇТіе Рне Туг Меб ви Аїв та їх ява
Ахап Те о піу віз Ахройів Те обі» діз БВе ух біб Ре Ні Меї ге 85 ав 5
Бе" без бух Аїа Теробує Меб Гец АР Аза їеоу бго беб АгЕ Рго дів 180 і85 116
ЗУ тів гу5 Аг ев бій бБеб бів А5р о Аїа Ро Меї бе біб Ар рве 135 128 125 ліз Аге Та Аг Аіа бій зеш біб АбЕ Азробіу бе Ре губ га бек : ще 135 148
Ше тве ніє уаї Аїда Ту АКр їви ів) іще їв Аза Тве ВНе дів за а 155 158
Мен Ффіу Те віз Бей Меї ТУ дія Бі Тує БгРо Те їі дів бег уві 5 З 5
УВІ тує Щіу Аза рве Бо іу лів ЯБв о Сух Біу тра узі бів ні 519 їв з що сіу щіу ні лап бек бе ТвК оБіу бек Узі Тук Уві Я5рв уз Аги Се
Її ге 85 пів дів Меї Те бух БІБУу ВНе піу ер бек Те бек ФіУ 016 Меб їго жа 15 Р дшпо бін Меї НІЖ Авпобуз Ні Нія дів ТВК оРго бій вуз УВі Абвонія ке КЗ Ах М
АхроМеї Аброіви Ах Те ТВбРобго віз Узі АТ бе Ба дей ТВг дів за5 ав ВМ чаї бів а5р о Ах АкБе РРО АР Обіу не 5ае Арв вів ТР ліз АР їв еще 55 Та ців Аза То Тк рве маі Бео Уві Те баб бі ео їез Мві бів лів ах «ва аз
Бе їв сіє Тук Уа без Ні Бе две бій Уаї зец АгЕ Су Суб АЖ
ОВ а аа
Тук Бі біо дія беб Тео МеЄ ів Уві 5ее Ні Узі маї де тТве діа зах За З5 ке чаї Ті ух сецз діа Тнбобіу Туб бае ТгРО Рго Уучі бів Туб Тер Ко
ЗБ а 335
Мне Тае вве бтіу дп Тер Ті АЇз Тук Меб Тук ів ВНе дів ніх РНе м За5 з5а аг оте Мае Ні Твг Ні фе БРо Уві Узі Бго бек Ар огух Ні їви
ЗБ ЗЕ аб оТРВ УВІ Аши Тує із Уві д5роМНіх Тве о Маі Аз ї18 Ав Бго ог ув 375 зна
Агв о біу Тук Маї Ап Тер осн Ме бі Тук ів Аа бух іп уві Те
Зх з9аа З а
У й я гі; Ура Жук ую КУ бух ух ВВ хвою ВУ ка ча ду ще де
Ніє ніх ре БНе бго дхроМек го чій Не Ак бін бо бін Уві Зег за5 Бе 15 дих уч У вк -- а з хе с. СУ тих се у ЖЖ - ху «ке ух
Ага о агРи Бе Узі Бго Ре Аза бух Гу Тео о БіуУ ву Аа Ту гук УВІ а28 25 Я їохі1ї лу Сагу» Мах: Се ох жи ки я ху их мух дек мех 0 Ще дих іец о беє Тук Туг бі АЇВ їер обу ВІВ таб ВЕ бек дев ео Ахрогух з35 ав 45
Живу ЗХ оо сжауу ей Фе у ук м ді і ге Хол БЕ
Уаї БІУ БЖа Ні Ту тує Ма3і вхо Б3іУ ух вів біо бу АТа нів зи ак зво «2105 17 «211» 1449 «2125» ДНК «213» О5БЕгеососсив Тисішагіпив «4005 17 аЕВтзсаїсв ззвасваскве зввсзсаїсе сковснавівЕ сезасизасЕ сасвавесЕ І тсвісвїсше Теавснвзаре срдавснесесв зсВЕтЕВеве ссввЕнТяне завсвазКає зи шСЕенКЕЗава двесісваВаеа сЕсваесВЕс зскрсвівен сеавававсї вени ає 155 ксвассвсва звВсктєсва всевевекас дсивевасВ авовсвівна зсасвасВсе 48 веввасссст засаїсссве певассвек ас тастеа Ессе сваВ сасввиВЕсВ Зо8 сови ку іх ик щури руту сус усу й ве су озкудре их У У уту суди ши тут де у ук. ка свсвсвВсеви зеесХЕїїза зизатетсВЕ їзтскаїсва аззакасЕси савквсвї ТЕ за пе КУ нір пф УК ою пе ук ув пра ве зв вони КО вс свсесзевсо звіввасвсе невасвосдВЕ вассваїсва арясВНЕсе «хв ясвЕтказвки ас свсрса ВевЕсвсває вва свривих БІкарЕнауЄ Ку азвнсес ана їсвссдесвс зсвтдисвЕЗ Ссвраїїсвсс ваесжсвсвВ сЕасЕжжесвВе вежеврсВсе ща веВтЇткатвс асвсЕсвТКК КсаеВЕсЕс ТсосКЕвассе ТВуЗсЕсВКе ССС сКве оо всвсвиТесв нІТЕВВІвВса веасеаВеЕне зЕбсвсаВЕЕ свссвастни заасасесве ев ствЕвасзаВс вс ссЗавс сс свсв ВВЕ сВЕсХ ТрЕсЕссВаВ севсвасате те зинайасваса гюегсасавсва всовісвсвов звсвссссвааа аввівсижвсв сяйва виВ УМ свй аВса свое оз снсЕевВ вевссссана звукова Ся кдекасеКих я сісЕвсассВа сбкксасве весеіїсЕєс завсвссЕсвЕ Стразввиза ссвсссневе ща ввастсавсв звіт сиВуК вевсесссва ВКБКВВаСКХ Тевсвсксво ВасВіссЕВХ зав шви тсссстввас всссвІсЕхВ сасссвсвіВ аснСВствоВ асвспеах зай стсковваав сЕВстсваВК ВІСК ссКсв свсВісВКує восвоВЕеве: сексвависс їх вісассввск аСТСствват свсстсвса весЕТЕстсе свосвЗсВиХ ВтівввсваЕє зах ввахтижтаст сВттсвсвсв ст тссвсв тстсасасве астсвнатви свв аВс 148 заїаваасисс ссісвівВеХ водасаєсвес вссвассаєз сняссвас сезіссвайс їх засаксвісв бсВвасТКесс васеввссвс сова Енес аВЕсснЕсКа кеВссеВККе 1268 ссввавїзтвс сіслвСЕссв сепасссвав ВустсссвВеЄ ваті ссс ВессрсваяВ їаВ завтввавсї сайвассасза ВЕССТТКасВ ЗссасЕвеЕ сссвкзащЕс КЗсВЕссИКе 13858 пастсвоавсв зсеісвВЕНа всастастас всвозевваЄ сісявкнек сезасєвазв 1448 товста заява «2105 18 «211» 1449 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії
О5Егеососсив Ійсішакгіпив б-десатурази в рослинах «4005 18 асатвтвіїв ацвастаєсва вревасстсЄ звавстатро ствасваран ввсстскКсх Ба кс ссксво ссствавне ЕВ тссх вссиотаєсв свеБааКВВЕ есте ще нсїниваазна знассввава сВсУсеТнЕЕ строки а ссваававих таза ї15а вссаїсвствя зрасстісва ванаазщатає веКассаксвВ звести всаскасВІ ет зссвассссв ззсассствЕ КЕВесссЕКК віссвстасе Свссстссза састЕВтВеЄ зай ес сер пруг м іаєує тую фугу с5«Уту и вку х зу їх ур екку и ж ЕЕ васвстасся плеЕвстс ав зва ссас сассвКссв зразввстав ававвЕессєх зва весвсістс сісасавнко СЕКівнасвех востаставая знов: вЕзсеанесе ща агроїтазви зсїсвстсв кхввакаваа вантїсввева дававЕвату сттсвавоєх зва
Жессстнстс веВесветувВ сс свое дае евсКЕ ВТС Кока 5 кт тасвс зквсіеваса сте сЄ звоевЕсНтєсвВ кас есев СКСК Терра Бай ксізнасвсв кати ісса звсаївавввЄ веесвсвась сесскассвк зваасвіссвЕ а танвІаїлева вантссввис СКЄсвсбвоЄ вЕжстсвває КТвСБЕсЄЄК твВсвакахв тав
СЕЕВВасВасВ ЖБсВвсавеВаа всВсКаВсЕ зесЕсвиа вавсеазвася сватати УЩо тіКнасеса ссккЕасово вес КеЄс заст вехВ скбаншачаз сзвасскаве зай вавастстста авсстстЕнсї санок сай вста сов ессвЕ сбасетствва зав зівшсшексс сстістЕвес ВМТ тЄ сабсставня зсвсотстссв сововавісї ЗБ5о тбккавнява сідстсвеаї ВККС сасвтсасса ваассвстВЕ саїсаввисх ага вІтассках авсссстреаї свебавстає бвастіксв стветаствх вірної 15 вваїВсЕвос Ст свстка ЄєТТсТстаєт тстсасассє восісваїне сесбесаВЕсх мяз васаввсяєс фаст внЕТ свеясвсксЄ нітвлїєаєв ссазїсдасе сазосставе 179 вастствїсв сивастввої ївівдеакас сттавссвсс зЕВїсаєсса сЕВТстевКе зва сссввкзжо стсвексав зсврсссвня Бівісааива важїсвессе Ттесвствав 358 аветвяаасс їсвастзаесва реївстсвех тасіавсвето сствеаавис тасіттсквя 1388 ааесєтсвасв звеВтТірваза вевстастяс етссВкеЕВЕ сстсввлааех квавасевав. за авсвЕтТтна Щ445 «2105 19 «211» 482 «212» Білок «213» О5Егеососсицв Іцсішагіпив «4005 19
МУ би с ха Же є ех ЖК Чім Жахуг ду СТ Я З сх Ко п:
Ме Су Уві іш Тв оТВе БЦ Б1у Тве оХес аг ТВ Мех біз Ахв о
А 5 10 ї5
Мт СК Букю Му о У Жезу» ак» Жевує 1 ю МКО тік тва о бкчуа СТЬ Ен
АБ ОНР бе бек Хав Беб баб осев ев бів Б1Уу Бі Тве о Бко Тве Уві
В 25 За не омві щу Ме сіу ее ІБ АВ АТа БТУу бух Суб ТР о АКЕ Аа дів ча 55 зе Мі ТАБ одіЯ тро отТнг руб біб ев б3 вгРОо Ні Аза її Аа гу а 55 їв пфщик і ех г зго Дума й і оЖжЖвим тт Кв ші ау ху сту Фу: ек
Те вве пін Аг Ага їук Уві ТНе Ті біз бі Узі 10 ТУуБ дхр о Уві ща за У ВО
ТвР АЩр Бе бух міх ко біУу щі зе уді ТТ Тув Тує Меї зб бек 85 за 55 дай Ти? опіу дія Ах дів Тве бів діа рМа буб бі) Ре Мія Тук де зо 185 318 5е" су Сук Аза др о сух Аза Без Аза Аз Бео обго Ні бує вро уд 115 120 155 ав ойіз йіз ївгодвв біо Вго Ті Зіз Ак» 035 Аїз Меї зву Куб АБр 0000 Аа їз5 14 вне Аіа бів їз АРК Суз Я Ме З Аг ів (У Бе вве ух ВР ах ї58 їії5 158 г хх дя Ям чад Ж т; паж ЗіБ: й ке Жах вх За ЗБ іА заб Бго Аїа Ні Уві ДіВ Тує дев бе Азв 0іц їв Аза віз Меї вне
ЩЦУХ Ка 5 мок хі ох Ст ве жов осуг: Ве о у З іх. Боу Б й А сему їях дів бе саду Те дів се Меб Ні Аза АКе ТРо Ні У«і Аза Ззеб уві 3188 З зо ток сх лю дю брус я зуб кое в хгу се». лю тишу де фо вх їі Уві Те баб Сух Бе вне пі дія АгвосСуб БіУу ТР узі бі нія : ї95 ОО од пі щ1У б31у Ні дхп"п о бев ів Тве біт йза ї18 То ТР Ар обух АГЕ зів «5 ЗВ їтїе пі дід сне дів діз бі Бе бі ів діЗз зве Бак Бі дов МЕ їже дій вка вве віз Аза сохУу Не лу ви Аза зеб Бак і АБО мех 238 вах я тго да" Ах мес Ні деп оку Ні ніх дів Таб Бгто бій уз У де жу 25а 255
Мі: йБроМеї АБ о гед Ар Тве ТР ОрКБО ТНК Узі Аза БВ ле Ай Зег ов ах а із Уві піч біз Ахи Аге о Рго АРв обі Бе беб буб сво Тгроївь аг узи зва 2и5 їеч віп діа ТР Тве ВВЕ Уві Бео чаї Тве беб Біу Меб Уві ів; вве ща 255 а вве їв Меї Не Уві се Ні БРМ Аве одхйп йіз бер АгЕ АБ Гу зер 35 1 Зі Зо не біз бі) АЇв Аза ТероМеє Ве о б5ек Аза ні Узі Ї12е дев Твк Аза
ЗУ за 135
Уві Се буз Дів УМ ТТГ осіУу Тугб Бек Тго Ті Ага обБеб Ту біу Це за Зх ЗА
Ба ліз дів Те Меє Тер А1а бее пі Суб Туб ез вне Аіва Ні вне 355 38 365 ек Тнгобеє Ні Те НІіз Бен Ар уві Уві бо баб АБ ув Ні ів
Уа 75 во хаб тт Уві АБш Ту Аїв Уві дев Ні Тве гів Азов Ті Аква Рг деп 385 Зо За ща
Ази бегс уді Уаї Аа їБробец Ме біу Туб їео хи Суб біл Уві Ті ща чів
Ні нів іеч Бнв о вко АБО Ме Бго бін Бе Аве Бій бро біб Уві бег
За Зи5 Аза
Агв о Ака вне узі Без РНе Аза ух бух ТР одей Кен Ахй Ту окух УВІ . 415 чав Ах ев о тТпе о Тує Тує сіу ді ТР о їт5 Афа о ТВг рве біб Авт бец Ак ер а 45 що
УВІ БіуУ суб Ні Туб Тує Узі ніз сіу бег бій Аги Уві уз бе" уз
За В 4уУ5 ва
Зек дій «2105 20 «211» 456 «212» Білок «213» О5БЕгеососсив Тисішагіпив «4005 20
Меї Сух мві бі) Тне Біб да йзоп Ах Бі Ті бго ТВе УВУ біб Те
Ж 5 та 15
Аіз вне Ар біт сіб Ага із Аг о АізЗ бій Ат Ай Узі Муз бви бок
КЕ. Ка За лід ів їух МЕЖ дію Ре дів дія гей Аіа руб Те Реве Аза АКБ Атв
Іо 5
Туб Уві Уві їі біб 51у чаї біз Тук або Уві Тве А5р вве Ту Ні
За 5 «а вкО і сіу тйб Маї Се РМе Ту АТ ем о зеб Аа ТР обІу йіз АБр 55 та КК ща
Афа тб Зі) Аза ве суб БІ БВе Ні Ні Аг беБ Ага Суб АТЗ АСВ 5 са 35 уз Дія Кез лів АїЇВ ів) Бго ЗВ о Аге Бе ліз бух ТВ АЇя фу Маї зо 105 ККЗ
Аза Ар дія біс Ме сво бій Абр обне Аза ух ТБ АбВ о їуб5 біз гео 155 їжа 155 іш Ага ов фу гне БВ ух Бго Зее БгоОо дів Ні Узі Аза Туб АКЕ за їх ї14а
: з м : тя се пий Ку кух їх ема щі я х Теж іє; Ма т І не дів біс сво дів дів Меї Тук Аа іви Біу Тве Туг ву Мех ук що яке ка 145 158 155 108 ше чення ех ті зб в Аді а чек їХМаа бер. 2145 зів дев Тук Уві Уді бер бен Уді Сец Ууві Тук Афа Су« ВНа вна пі1у
Й й "у ру ЗЕ 165 іа 175 - як яд ск не ик ах хе у п і їж с сах є ку Км т ск «ів дев сСуз чіу тТгрвоУуві бів ніх біз Бі Бі Ні баб 5еб бе т шо в | ів З На їна ка ща г чи ух В че мк Ж чут в ЗК ях у ж Ж ву їх -х я КУ Ух як она бі дви Т16 ТР отр» й5р обух дев о їів біз Аза рве тег лів ЗМУ вна 7 е Ї тугу:я ак - з хх Ж з од дк ж дк» блю Мав міх деп фо Ні шіу ви віз біу бек пі Ах Меї Тїкз Аа Зее МеЖ ніх Ах бух НІВ 7 сом м ї ЗЕ З а за 215 зга т : г муку БЕ у ск ВУуК йеску Бема з же бе ех
МНів Ата тв овВРО Ів БУХ Узі АгЕ Мі5 Азв Мет Ахв о Се Ах о тВе тих ук | ї 7 ху же а 3 235 ке . -х хі гм ох З Я хи в КУ дату дк ту Ду зва діа мі Афа Бе бне АБп їне Аїа УВІ біз Ар Ап Ага ро Аг шо шо 4 и Зк ах аа З
З1у РВе зве губ Туг Терорев дев їв бій Аза те Тйг РЬе 1128 го сту вне зе бух Ту їв осей Аг о сев Бій Аїа терте бе Ще ї зу ях . тра у
КЕ; ох Я: ; Зк ї ев іє ба отр аб Ва вве ге; Ні Вре
Уа Те обоє біб Без Уді фев осев РВЕ отТсбр Меє пе Ра бе) Ні го 275 «ва за5 7 ; : их хх. ау Таз КЛ, ФО хм, За зму Мері 3
Бе" у вів ев іух БіУ ШРу буб Тут О1Б біз беб оУаї Тер Меб ге
Ж Ку я им згх
Ов я ЗО ка ді ї і лів два ТВ оте о ТтВБ їі 155 діЗз Уа Тве Бі вве лів ді нів УВО Ще А КЕ ТВО зе а ув Ам шк ЕН; й ; у. см хх зе ах ще Зх зав тки А Мобівп Хек Тук бі бео БВ оїеу діз ТВгб оХег ТрРе Узі бек їе діа Ме За бек тує Біу ей Ре оїеу дів тТвге Хе з ув 335 Б За5 од Урі Форум Фу ЇЗ кО тіух й її у Ах к сі бу ук за вве Аїз із Ре Зее ТВе озер НІ Твен їв) дев
У т Ще жк до - хе ча ах 35 тр р прям до дви жа ів би Жук ХЕ ж Ж З оба ки
Уві узі РКО Аза АБО Зіш НІ Без бегб о Тер оМві Аве Туб діва Маї АБр 355 зв 3655
Ні тек тів Ах бі Азр обро беб о біп біУу Тер Уві лей Тео беу Меї
ЗУВ 5 зе
Чім Тує бери дбай Су бій Узі ї31е Ні Ні зе вне БРОо 5вб Ве рка 385 ща 395 о
Кк 3 еро тез Ко А Как сек акту Тура зр З В Ж йдок бі" Ве дев ці Ре біб Узі 5е" Або вге обве уві Аза Бве діа Ух ча5 зв 15
Су Твродха іецодхи Тук уз Узі МеЄ Те Тує АЇ1З біу АЛа тро о гу за я що
Дів ТБг із ці Дуч іа АБ ба Уві Ві уз Ніж ТубБ Туг Уві Ні
За» ща 45 сі ціп Мі зеб бі іч Тк АЇївВ ще з «2105 21 «2115» 894 «2125» ДНК «213» Ругашішопав согааєва «4005 21 втвантссв сскавсексх ЄЕК Каке всасавеанс звсасвссвс зассваснсе Ба восЕЕтанвсес ствсвату стсвявстаєсєс васвисассв всєвевВієї Звавесссвсє жа звсозвсЕсвеа сазавнеасКу КсестсТсвс Вова ссва сЕссвссаЄ зесвавесВ їх
ТЕрЕССТВІЄ Стверваїсвт срветокнев сЕВЕжЕсасє ведзааВтакЕ ссстовсясВ я вувазвЕвис аВЕЗсссЕсХ сствсткавЕ вереТсакВе фтрсвсасва СЕС Есс За асбервсстса вЕстасвсаї вТвсссваве сЕбрессвсв вемеесвекЕ сзасавКещ їі5а тесЕЕствеЕ вазасрестя сзассоснсй санассваве сЕвсваавВс сасстиватї ага лЖїасвКЄ ссззватста сваЕсссате васвсВсіса СсзЕвсКсїї вазвкдевве В вісаессанЕ сс їссї всятаснтве сабсвтвист сом бстви ТВестВЕКвЕ вена ахвилїсассе асессвсссс сТрревиввас всвбасіжеї севсввсреї казстсвтве вав сівксасисві всясвівсво вісті зве снвсвЕ Гествсссаа врасвакаа ОЙ зссайвсвсв снтзесісв воквевссво Сасствзссс зеасвсврау кс та їїсзтвавсс БрстссзЕвЄ вежствеете стоєвстссу сбввсссста сессваВісе зва аЖксвссснвс БВССВЕСЕВЕ втасасвеїс асествесве ТЕСТеЄЄсвЕ свассєстве що їзсвїдвайс асозсвскав саврзавсад аансотвисса везавазиса КОНЕ а «2105 22 «2115 870 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії
Рухкашішопав согдагра б елонгази в рослинах (вкорочена на 3' кінці і кодуюча функціональну елонгазу) (версія 1) «4005 22 вівкаВіСсов сссввссесу ТВІТВсТаЄВ всісачзнавс засасестяс сассвакасї ва вЕсВеКвете севебасЄЇ ссстретаеї веїїскассв КаЗсвЕЕВеКХУ Свавсссасс їй злі сжВКта стаавнасЕ воестсттвх вавісїсств саєстсвсвВЕ стос ЕТе Мо ан и А и А и и НН я лу ВЕ КО уч й ув ов Зяй «Тбксіїасб їсвстаєсяих севаіствеа сЗсвЕстаса сзвавЕвіМІї ссставравсє ай втвивеввас дарвтссВЕт ссктттвавн вексстатес СТрсотасаа сс 308 ісввастТІХ стсвттасаї егвсстКааи сЕтесЕївсВ ЗЕВС савсваВкає зав ксссісіввн вазасвстЕВ савесєтнсї савастрарва севсклавее такса яе тхтехзедтва всзакавска свБактЕсатв озвтасєсттєв їсеквстесї савевеваах КЕ вовассяви Сізвестех ссасВіїквс саїсзевває скаЄссстЕи асо сеЕКВЕ 548 зідвттастї ясдетвстсс свеквЕсеа БеЕТаССссХ свое саваеКеству Ба ніссасвКві всасеїасвс схвсТаКХЄ зтввствесвВ сВсттссст веВсВанава БО пствававна звтасссств вівЕиказва Євзеєттассх завсвсвзнат восссвиТЕс ЕВ сіслсвазсс КССбеєавво СВК тасске іс еКе сасстссуса сссояавсХ то (секс аве СК СВОКиХ всасвовеКх вес сксв се сСссвв азс 54 ївсасезавс зссасветав сзавтвитей 78 «2105 23 «2115 870 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «223»
«223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії
Рухкашішопав согдагра б елонгази в рослинах (вкорочена на 3' кінці і кодуюча функціональну елонгазу) (версія 2) «4005 23 чіриваКтсн секавссЄсх Сеіїнессатв нессвававс затасветес тассватвсє Ба
ВУ свсїс свое ство сх вкассссЗКсв весен сх Кавове Ка
Кеті сЕвося сезавваст вееКсссвт кашієссств сасссссвЕ се 189
СТВ ссвссаєсеу сСевабссввеа сісвеСаса вази ссссавияеє що віваавеиас звратссису ссттссвзав вет ТасвЄ Стестсвраз свт схЕ ня яїсвиастх стсвствсах Всежестеляв сВТнТВсЗсК зЕнЄттяасвх їазсаветає ЗО пет сКкХвиВ кзавесветєвВ саассствех саваєтвавае ТвЕставве такт атТе В
Скствсвївз вслевасста сват саєв каївссса ссоавстссх саавЕшанах ана
Кіхаяскавн совет сст ссасвКссас саскасввах ствжеосоквВ пасссвВКЕ За вівактївсгс асествастесс свВсреіваЄ вебувесссєї ствеївсвсї Сазсбсоссев Бо піїсвсвІвЕ псасвїасас стасЕаЕЕс зЕваствссв сЕссїсства кЕакваказа са аствзвавай аввївсстете ксрвррааня тасссївсїс зайтвоввах вЕїссявсе ТхВ ттєВжшнасс ТтстссВвЕс ТЕСТ ЕВсЄКЕ стстастевЕ саїстесжев ссствантте ща жусистсаде ВесссвІвЕЕ шсВсЗЕвеКХ воБстієтсв светеЕссвв аавасттсуве ка баса зв пси годе удо в а тв «зечКвиЗКе чия МОЗКУ ях «2105 24 «2115» 870 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії
Рухашішопав согдаба б елонгази в рослинах (вкорочена на 3' кінці їі кодуюча функціональну елонгазу) (версія 3) «4005 24 прави ттВ стсавсстсс свствстякв вот зававс автзсвстео сассватвех ва нТТвЕсвВетс ствсЕВЕсст стетвставес вассстаттв вясевеваєї сазнестате КЗ зсув В ствавватст ссстссВУх вав сссстсттах сс 150
ЄсЕСЕСТЖВСЕ БсестаїсеХ ТвоТЕстева стсВЕЕтваес веваветТетЄ сесканавес ав яКтавврввеє зав с свав Встав своссвеаа СЕС заа зісввастсв всеж твозе штбосотсвав стсесссвев звассїасвеї вазславтає ЗО сеосттствев влавсвоїев сазвссстнех саалссвава свЕстааннї ВЗЕсЕнКаКе 43 сЕстнКвуКК ссзвавссоЗ свавессесв васвоссссска сатвсКеК сзаввеааас ЯКО вгсзассвВвЕ сс ККссх ссвсвоссає свосасеваї ссаїКсствЕ аассевасие 54 зідаєсвсск аївссвссеєс зидівванах Всі скВствссх сзассттве ие вІТсасетех воезсдевсве сжхасїВстес абрессвств Же тТссєза свасвааває о їх аазвавий ЗЕВС вівзвисвзва Мис сіІсассс зайва ий вав та пеізадОавеяВ зи БАБУ Ми К КК неви УК ех -е їх ж я с ке аж х чи чх ке С їїхатсвавасс осссввБс СКС стстассКх сесессткВ сс е ща зЕтвстТсває тсстсВссвВЕ ствсаїввес Весстссткя СретЕстсваВ зазстїстас що уасаівасро вскзсвВоіЄ Савка аа та «2105» 25 «2115» 297 «212» Білок «213» Ругашішопав согааєва «4005 25
Меї із вна діїв біб ВБо ізи Узі Аза Межх із біз біз співа тує діа
З 5 їв 15 віз сі А5родіз Уві Уві Аза Бе Аза тів Бе хек Аїв ТВе Аво баг , за КУ за ше щу ТРО Ффіу мезо суб Рг ї3е бЗве баб ді ТБ ух ав ів вка 5 ча 5 сви Уві бій зЗаб рБО тТае БгРо їв іа ее бек іі іев Аїа Тук ВБе ща 5 В ! сю сук -ч и й х є їі ут ку: гу су хх Ху х г зі дів їі уві Біу Бе" б1у бео чаї Туб АРБ буз Маі вве вгО АбЕОтТвК
Б та 75 на
УВІ був бі Бій АхО БкО бе гей без бух АТ бе) Меб гео діва нів 5 за З5 в БІ Ух Тонка же і ге нев Кока нт. "Жука йди о г зу Я хе їх ди Уяі Ра оівн ті бі бец ве бе) Тує Меї Су БО БУХ фі Уві 108 185 ча
Тут бі діа Туб Маї Ап бух Туг бег Кре їв б3іу АЗй Аза Тук Ав
МБ 28 1х5
Ре діз бій Тве бів меж дів уз Уві Ще Тгротів Бе Туб ма3 бек : 158 Мах що муз Щі Туб піц бе Мек Азо Те оВБе 116 Меж бе ви Гуз Біу Аква ху 1 ї55 1658 ві АЕп біп Уа беб Бе ве ні Маїф Туб Ні Ні б3у бе (о 5ег 1655 178 ї75 біУу 16 їв Тк; Меб То ТвгР оту дів Аїз БгОо щі біу Аз Аїа тує їще ї1й5 за
Бе бе віз Аів без Ахп бек Тго Уві Ніз Уві Су МЕТ тує Те Тук ї ї55 аа 05
Тут Бпе меї АІВ Аій Уві іво БгОо фу р Бі бу5 Твгоїу5 Агв гу а жа жа тує сем те тро бір Аве Тук іву Те дій Меє дій Ммеє вве бів вве я «а 235 чав
Бне Меї Ап о іец іву біл дія Уві тує їв іву Тує бе баб баг Рг зах 5 55
Туб ВРо бух ВНе 118 АїВ біб іва їБи Уаї Уві Туб Мех Уаії Те і во в Бо а іви Меї іо Ре піу Аа ВВе Тує Тує МежЖ їух ніх Ні АЇЗз бвб о гук я5 28 КІ уз іп бух ев дів Заг Бу іх Фів ай 235 «2105 26 «211» 288 «212» Білок «213» Ругашішопав согааєва «4005 26
Меї бій Бе діз зій го Гео уві іа Ме Аза Бій бі: бів Туб Віз ї з ІВ 15
Аїа тів Ав ойіз Уа Узі АТЗ бро діЗз Ті вне звб дів ТВг дер бек за Кз ЗВ їі біу Тер бБіу ів бух БРО Ті бег бее Аїда Тв оф Ар ог во
Зх 48 45 ів Уві Біб бЗег обеа ТВе реб о сез Ті сер зве Коб Бей діз Тує ВНе а 5 да
Аіа Се чаї 5іу баб біу сей Маї Ту Абе Бу ЧІ Впе Ве Ак ОТАК
Бо а 75 на
Уі цу ЗУ Бій Ав оркОа вва ре) ви ух Аза іеу Мас без діа Ні пе аа З ахп Узі вне ібн Ті біу ву Бег ібу Тук МОЖ Су5 івч бух бе Уаї ' за тах 19
Ту? ЧІ Аа Ту УВІ Акт ух Туб бБег вна ТгРо 1у Аха ді Тук Аки 115 338 195
Вго дів бій Твеобіц Мет Афа буз Уві біб Тер; бі Ве Туб мі Баг
Му Ще Ту ій рн Меї АЗр о їве рве Щіе Меж Себе; рух Су дав їх5 ї5а ї55 168 чаї Ак бів узі 5ег не Ген» Ні Мі Тує Мі ніх біу бек Тів бер іБ5 78 ТУ
Яіж тів ТгРо Тер оМеї 715 Те їуб Діз Аза ро біу зі Ар дів Туг їх 185 іч зве бек дій дів ви АБ беб Тк Уві Ні УЩі Суб Мб тує Тве тує й 155 ОВ 25
ТУ Ва Мей Аїіа Аза ді ву го УЗ вер біо Су ТР Сує Аг бух
Же 835 а
Тук цец їв ТР 5іУ АБ Ту Бе Те бій МежЖ бій МеЖХ вав бій вве а За 235 24
БМе Мет Ахпоіву сво бій Аіз Уші Ту ви фей Туб бек звеб бег Вго а Ба ав
Тут бео ух Вне Т1є ліз бій без бен Уві Узі Тук Меє аж Тиг Се ' жа 55 ав мес мес їец не зу Ахап Ре Ту Ту Меї ух Ні НІХ АХ его гу»
Ка ява ай5 «2105 27 «2115 1278 «2125» ДНК «213» Раміоуа заіїїпа «4005 27 зтвеквссвс всвисавста сескЕзевсє вссссвеКих срЕсссвЕкх незсваввЕє ва вактасєсссвк зевавсатея сваєзаввав стсеїсавсв шсТвассвсвс всаКНасеТЕ еВ пссваЄккін сваевсвсса сссвваІвно аавассВксв свсзссаВВх сТЕвсасадех 188 вкнпасвваси срсасвавса весссакеси свижствсся зсесквасва весеєтеаає А
ТСВССНССІЄ срсвсКсвВЕ всаславнес ТВетсрсссс весвсвсува сс аКвсє за жвсттссввре анттїсвссав всввстввас всвваввеса беЕеттвансс вТсВСЕВессВ за їх СТЮ ЕХ Без БЕЕ БОС ЕНК БУМУвеще 5 моедує ее вах жасвтввсиї зссвсствЕс Вена коша вссВ їТвЕссввсвс сВсВсТКакс ага ївЕсССВККІ Всасскксвс висо ствес вТвстсвнсВ СисвсзвиВ ссЕсисвНе 58
Твкстсятвс ВсВаЕвЕсЕВ сезстастев стсвВсвЕЕса ВоВЕТЕсСЕ сЕвссвсисе За асссзавтсвВ свЕвстасви сов сТес ввсаївІсвЕй ВеВсрівВІВ ВсвезаєсаВ ав слсавсвавс зссасвсває вссвсаваав СТасвдеовск всоксввосю свасассске Ба совстсвісв ссссссВвсва воевЕлічакс вссваеЕтїва аелросссво васввавасе в сЕВСТТлЕКа свсавесЕВа ВеССКТсвсВ ссзвевасса СВТ Є сВсВсТЕнис ТВ їввсвистВт асстеєвссс вевссатахтв ссвсреасся вдеасєтаскя сввестсвсв а зІвстКЕвса сІсвстеасае ссттвесвес бассссасве сваасссвЕ сесввЕвхВе зе нідсіснсові небассївск кізсибвсав сісввсвсса скбасеК севевасТКЕ за вссрівссвс зееєасвсстї ВссВЕСТКс вашсстазасєв зесасвовас Всвоетевав 28 засвкексва вссвсвсває сайассвсксК сессисвВї веснсввоств всяваїкісВ лова ївесісвавсї зссараїтсва всвссвестк ївоссвтска твесвкеекЕ севссасске 1148 зекактвсвс сЕсрЕвівав всвисЕсКІс васазнисасв всствсаста свасеТесВх 19508 кастниев аввссазсвВс квасасвукК весвассув ясаасвктсвс весно 12658 вапалвавна сЕсавТвя ї598 «2105 28 «2115 1281 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Рау1оуа заі1іїіпа 5 десатурази в рослинах (версія 1) «4005 28
Вевсстствя верастєтта стсттаїве весбссскеКх стрєтсваст їсасваавеї ва ваїзстсстс яаквиєасва свавизана стсвсїассЕ вакасодвВс сезсвасвіх ї28 вкссзастїсв ісавеврасз ссствЕтвеа авезосят в схївссзниї сСеравстваї 15 всхаєсЕвтЕ сттасвався ВТТссаТеКЄ. вевіствЕстя вевствасва васесссвВе дай що ссЕ сісти ссзсаавева састстссзев взанвиства сеЕСаКсВсх За вастсссази зкїссассвя рсзаскУвав весверенваз сЕсссканес ССС зе сів зсввасїТес сСравноуаЕс весасвсвув Єфассвисво вес ха сквсозтядає аоВссктсвс сринассвох асвесевнак СтесссаваВ зеваТктева ща сере есеїв Е всвесасссх стсвстЕкає зсаЕсЕсЕЄс свасаианех ад птссваискв ств ссасвВ все: везе зсессївеТе верічассни БО сабЄаасваис зссатветвє бсєбсвазав сіжсвесаск зсветеаксх скатассесЕ ва сексі тв ссСЕКссатва вяравтсксї всбаввеста звістєстВЄє сатевавеке тав
КВТ ста свсаавссна ВСЕ свсЄ сестистассв сессссКих сестсєкева а іввсанКіЇ сс свісс Сарасзвсвїв сссвинаств звсвстасва сваисясу ав зтвстсвреаа ссзвасасвв восссросвез тассткестВ стааєтасри светра ще втсстсвсту вЕстасстес сСсасвсвсве сттвЕавека сдссакете ссдоасе оо всжнТттшКс ас еТ сссБЕКТеТх свксстаасв звсаїнстає Стрес няк їаха
ХвсвстЕсївВ зссвасаствс саастТесЕеЄ ссаїстітнвВЕ соїінікаств вувнатвЕсЄ така тассттавсї вссзвнаєсна всвссзвесеЄ ївсссеств сиссбсватт сарасасссх ща зараєсвсїс ствравіїаз кс тїс даеазевсасв васіїсаств сеазїнотави 1588 кваїзсттсов зврсгаєвис раїастсіс вестзаасссів абнвовієво ссвсвстесї 1258 вацазвавеав свсавсваКи В ї1х81 «213» 29 «2115 1281 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Рау1оуа заі1іїіпа 5 десатурази в рослинах (версія 2) «4005 29 зсвесісста вввастссув сКсттасвеХ встссіссКо стнстсваЄх Єсзсвавнії 5 васаєтсстс зававсасва савизазвав ст таєсе вакасавввс сгасвац В весявсттсв гбзадавасєв сессвитвва завеїсвети сткВссваиЄ кевавсткиах їна встТассвати сетаслався вОЗссасвсв звассввесз аввстваєва васвссквав за песто ставасствї ссвсазанає есте Тсста вааварства кестасевех зага ввсттксазв янессаєстав дсласствав вставив сВЖтсваВкК КТС ЗМ сВСвТтВстЄ всевЕсСЕсЕс сеаввссисс всовсвсВія ОВК ЕЕне Со акс 42о
КвЕсВсВВаї ВсеВсЇКЕсвс сСвезаїсвоЄ асвсїєсвав Кв сввее завасвовеВ з88 їввсттаїнс втвасеЕвівВ зсассаКТсЕ СсстаєсвЕяа ЗсВТХВСЕЄХ сватання зай астсєзавеси сствссасви асттядасис вва ВТЕсстветТв надавассае вва спе свв ас тсстсвавне сіссввсасв ЗбеЕСвасЄ Трави БВ свснасвавс жксвсвссас Жестсазавив стссавсасе ЗбеЕсваесе сваквККЄке БА ссКсТсВісТв ссскссвтка вавватсвсї есевавикття зажсжестяЄ свт ваВВсЕ ав синстстссо тнсаавстаа ЗССКОСЕсЄ ссбдітвссвВ СТЕ ТТВЕ бас оеа хна твйсавстЕ ассттсвссс бараєзсвтв ссзеааста зрозстасва свавстевсх пай зівстсвета ссзвасазКек вста свева хассссвств стзаєтасвв свствКатас зав
ВУСТ стх встасетеВ ствсвЕссав сствровестВ бесвсаїсте ствевастте оба шкХАКстссс зЄсзсссоВКсЄ СеСЕВТСВСХ Кавсстаеєв авсаєвстає СТЕвЕСВеВ Аехе басистксїв дссаєвстас саасонеК сс сттрех веУкЕвясо веввакеаиє тане тасстсвесЄ зссавесєсва веазсвскЕ тасссссст сСвКсксавсе свавсатессх 15 зависснекс ссававікча все сксс варависяся васкЕсаста сввтвЕнсВЕ їхав квасасттсв звессасвво Сезіактус встаассієв ззасветвс гсаснскссї 1дев вацицшаваз сесвисваїв З 1 «2105 30 «211» 425 «212» Білок «213» Рау1і1оуа ваііпа «4005 30
Мег вео вро АгБй Дер озЗек Ту бев Тувк Ата Аа бро бро Зеб дів Бій ї 5 ЩА їх це НІВ 5із Маії АЖО пе БгОо ів бл Ні Ахо бух бу віп Бей Узі а 5 30
Іі 1у аБр Аг Аіз Тук АхроУуві ТМе Аза Ве мі вух дев Ні вро і 35 За 85 сЗЕу сі ге 16 ТІ АТЗ тує бій Уаі о4у Те Ахр діа Таб о АХВ АВ пе 5 БА
Ту буз піт вне ні Узі АРК Зег віз бух Аїв АБО бує Меб сви ух 5 В т ва ек бач ВкО его Аг ого У) НІ БУух Бу Ту» его Рго АгЕ оАге лів ща ча З аер іви їі діа Або вне БА біб Ре Тнг бух біп ів б) діз о
Та 105 110 бі Мет Рнае іш его бек Кеш РКО Ні Уві Аіз Ту Аг іви ліва Щи 15О 155
Маї Іів із Ме ні уаі Аза 51Уу Аїз діа ізо сіе Тер нії бір тує 138 135 тав
Те овнЕ Аза Бі; ГБ АТа Мет ецз біу мат уві бій біу АгЕ Сух у 145 ї5е 155 ї6а
Тероіву Меб ні б 5Бу бу Ні Тує бе бе Те б01у Абе Ще діа у, їа5 Тл 175
Ве Ах оАгв о Аіа Ті біп уві Аза Сух Ту іу сез Біу бух біу Моє кпе АБ аг оАча ше З зі Але Су Буг щу с щу Су У шк ї88 185 Та ек Біу Аза Тер ої дев Ахп бій Ні йбп іу5 НІб Ніх дів Те Бро ниви ва ща5
Чі бук іви біз Міз Ах Уві Ахо ів Ах о ТвБ се Бго ме уві діз іа кіз зе йме нії біб Абе іє Аівз Аза 15 Уві бух 5ег Бго діа Мет бух Аа
ТУ 3 235 ав
Ткрїви Зев Меї ій Аз бу5 во БВе Аза бго Узі ТНе тн зву во ах 5 ха
Уа дів сь біу Тео бій Бей тує бе ніх БгРо два Ні Меб сей де зва 55 Уа
ТнБ о їуз Ні Тук Ар Бін бер дів Меї без біу Хі Аква Ту біу 25 а И «85 чаї Біу тут івь йіз Аза Аа їв бі іа БІ» Ту Уві фец лів Сух за 255 зав
Тук ін бец тує Уві іп їец О31у Айфа Меб Тубк Вів Бве Сух Аби Бе
Зх Зв З ЗВ діз уві 5еє ні їнНгеомі5 сви рго Узі Узі бів Бго Ахай біз нів Аіа
Зх зо 335 їБе оїбр уві бій Ту Аїа АЇЗ Аєп Ні Те ТБге Аа Сух бак орг бек зав 5 ї5а
ТРротко Су АхроївБ о ТброМеб баб оТує Бе да ТУуб ів бів щи НІВ ї55 зва 355
Мі ін о Тує Бко Заб МеЄ Бгро бів Бе Аве Ні РРО фу ів Ата бко ї7а 375 зо аАгЕоУВі ух бін оіви вне іч бух Ні сіу ве Ні тує Або омаі дев
Зх ЗИ 95 «не пі ТУ вне біз Афв МеЄ Аза йБо о їВг о РБе Аа дав ву АБО Ахп Уві
Б 418 415
Аів Ні Аішж Рго біб о бу5 су Ме б1о яв 425 «2105 31 «211» 1329 «2125» ДНК «213» Ругкашішопав согаатга «4005 31 аквнвзазЕк варрсавтвс Сересвстсст австнсвнара знака вассваввве Ба завткттасв аскссзссва сттсварсас сссввІвисе сваісВссаа БІС 128 писсствеск сквасвяскас ссссессзс свсвавсїсс всвібавяхс зкерааввсв ї8а пасавнстсЄ грявевовст вссессссвс ваввссвоїс сссвнрансї кавресевнЕсВ ЗАЗ пута ТЕЕ ссвадсїсва сссвсссїсс вевобевавів сстсевсткс ссЕрдасснає зва пітЕссваавв теБазвсвсї вазсзаевас ісвявесу сссвтвавсов вотсаїтсяв БІ ваВЕВсККХ Сгаавосеєза Себсксвсех втвеЕсаянс всеїсесниа авссВсНЕсе ев зкеваткисси савсежсств вагвасветв свеассВасЕ СССЕЕВЕКЕХ кассстевев ча вІсствассс все зсарввссве свсвассвас СтагеЕсасва вБЕЕсЕвссас за їзізатсттв стввезавах стссвтвас зарсвтствс знрантсват ТКасНЕаЄКс ща вестотвваз хВсссвНсВс ств сЕвсвс авссавсяса зсазвсасса свсаВВсссса Ой сзвалЕствВс висесваснї свасстннав ассстсссєх бТраївкстЕ савсвасесх еВ вітассвася засисвавих назвсествет звістссавВо стеКиїнвоЕ савекассав ще
Вест КЕсТЕТ тТесієсссве ваєсіксєскЕ ствЕТсвевсЄ їхевЕсреаВс свосвссКе ак сжтсксєарес зсавстжвев свесвансяс тасїїсвавЄ сКсЕстВсаЄ висТиссЕх лав
Хасвовзвії Тсвсївететї жВКжсветссс авЕїзсвваЄ свсаввавс все ав
Івестсврссв соте сТеХ сврохвсвас каса тсв севасКссКс весстстсас зала застсвсствс ссесвансве свокаксеви їасссвсаЕс сесісвтвта сс сасе їока сасвссвста всессвавкх сзксвсвсс СнсКаТВВЕ двасвусвкк сосок іа севассквакс асевессВК сссбтсватв ссссВиТсс вссяснавак ївістесеся ї28а8 свевсееаке ССЕСВСссва дазвсасввх сссЕсЕСаси зсвсвсвссс Стас НеЕЕ ї208 цдесасвисте звсасссссва ваасствзах касеттвесв сосна те тсастсслав 1338 вівсастае 1555 «2105 32 «211» 442 «212» Білок «213» Ругашішопав согааєва «4005 32
Че Бір у пбіу біу дзп Ай бек Аза РКО ТВголіа уз бує бі: Уві ї З їа 15 їец Щі бі: Біу бує РНе Тук Ахр Ууді тТвг Або рве Абе Ні вро біу за ах за
Ту бег І16 Т1е ух Ре ів бек біу б5еє б1у Аїа кр дів Твг Аїа їй 48 45
Щеб тує дев біз Ве Ні Узі АбвобЗев Аз ух Аза Азро бух ВНе Ге цу ТвВг обеу бе бек Аба ій Афа ївВе о Бго зів Біб Бей бух бій дів а 75 ва
Уві бій Ве Явг суб бе дай Бго Бко бег Аа бій бев Аза бек діз вх за 25
ВгО бец тео аби сен Аза бує чаї біз ліз ів Аз обу й5р Ре 01 180 їх що
Аїв Вне акв біз бів їв Ті Біб ЗБ біу Ре бпв о фух Бер Ай Те це та 355 пра нів узі УВі бух дев Ті Тве Бір Уві Уві йіз Меє Меї Аїа Уві : М 135 148
Афа Звег Те Меб Меб Уві бів Так о Акз вів Гез Уві Уві Тпгоігц у 145 5 155 ї6о маї мер Ків Агв обі іс дів Бій біу АЄБ Сух біу Те гео Меб нів і655 Уа 175 сі: а3іу Бі Ні Туб бзек Бву Твгб оБіу бух Т18 бек Ті Або АБ о АгЕ їі 35 ща
Кец бів діб беб Ті Тув обі Ве Я1у Су» бу Меб бек 51у Аа теВ та еВ «5
Тг АР Ап бій Ні Аза бух НІ Ні діа Твеобго бій Куб сей оди 3 215 ха іх др омві Ахо о їво біб Тв обеву Бго ів Меї ДІЗ вне Авй Аа дів тах «4 35 ее
Уа Те Ав Агв о агв вуз Уві іух Рез бфу ев вву бів АЇВ Геч Тео ах Ба ай
МБ Куб Тує ЯМИ АЗа Ре бе вве ББе Бере УВІ Пе Зевс ви ги Уві за с за біу ів біу Тер ої» Тв о Уаї Без Нія РКО Абе Ні беб без Абе о тТве
ТУ ек зно у5 Ні Тук Вне бій Кеш се Суб Мет Аїв Аіз Аге Тук Аза его Бпе ше 235 зво
Атїа віз Бей Ре АТ РРО бу тТуб щ1у ве Аїв БіУ Аа Аз щіУ ви
За» КУ 315 ЗИ
Тув уви біз ТНК РНе діз Уві (ТїУ Сух дДвп о Туб КЗ Рне (ів Аа вве 325 33а 335 ха" Уді Хее Ніє Те Ні зіву Бго Мяї бек обі Ата ее бу Туг бе 34о 5 з5а
НІ Тер оУді Уаї Тук Заг Аза тів Ні ТР отТне Аха бів Кух бек бат ! 355 ще ща5
Меї івц Суб Ао Тео оїго Меб беє Ре бец Аби Бе бій (ів 030 ні
З 75 зща
Ні сей вве окго баб Меє рго біп вве Абе Ні бух Гі іє Зб Рго 35 За зах ака сх ч як ху фокж Вау щчд о сухе я і ну сь
Атв У Гуз діа ви рве сто бу Ні 1у цеб Уві Ту дав уаі лев
АД за що ко тує Тгб о 0іу віз Ме Афаз АБО Те Бе бух Аша Бец Аза Ах Уді ав 455 ща пі ТВе Ні дів зас Ніх бев гук дів Кіх ах я «2105» 33 «211» 804 «212» ДНК «213» Ругашішопав согааєва «4005 33 зіресвтста ЕСВсВасТес вессвсвсїВ всзбравастє ЗкеетЕВКеї ваствоаяХ аз ї же тв уу у пу ре ек утри ун зо вісесавасс сарисасесс сеЕсяхссвВаК завЕТВессе сєккЗсККЕаї всвввссває за таєтвеоврс савсраєств: вассаїсрекх саеетістеї їсовтссвесЕ греїблавсее 1858 щої ї у рю ж зем и. ря ух у М фр у гу У орки Я ту хх ту тує А зЕсасвсаза зсвЕравсска вссасссВас сСтезаваасе стае ТеВК вівспасте а тажсваасюх бестсавсте всаствсесв Сас ссавсвосвса секерстсая а г еру туту Хоб и их дур курсу Мухи ик и ек г еф ух січ зд вийсевааз Сстввреказа сасссссвах зсвасівссв асевссввне акстсвсаЕ ЗБЕ шікакствис свсастясаа сзасзавтас версти свБасЗсВЕЕ ССС 30 пжксисивва ЗВжсЄваскса Вест Ко стосвсвикт вссассвіво сок Аа тЕВХсісвВЕ Зсвурвивах ваза ав єссвсіїнвЕв ЗсТВСКасКЕ брас свве зва вісласасеу ЗбВтвсасвт савтсатвтає ссетастатв Веста ссвс носок вва ватжвсстст дрвазазеааета сассзсвсве астсввдасвс трсаексств Тасствсвсї ве тесерсеастсва сстаєвссвс стасетакав аасвссдКех бЄтеввїквсс ссасттрвсав т? стВскВВтва сявсдвасах вібсвЕвесе сСісвссавсу Ссівісвсва всясбасане ва чЕсвавдики ссазизарса най ЕЕ «2105» 34 «211» 807 «212» ДНК
«2135 Штучна послідовність «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії
Рухкашішопав согдага 5 елонгази в рослинах (версія 1) «4005 34 зЕвЕесТстВ бевстВіесе Есе стЕ ветввавстс бтревтвсвї тасобаєтах ща
Вівнствисс сікаїатссс авссесткак заввстсост сттасессаї вставні ткав їх
ТествяЕВас стастаКсвв застасєтвев КассвестТех Тезсссисс севазавсвх іо вісвувсзва апсанасстса асо ссвва стсвававсв стВовВетсвЕ сасаавсе жа вассвЕассї Естісвасво сіасівсЗЕс бас ТсК ЄСВ Ксїса сарвВсссве за квас їаавЕ Стрия вааа свісс аз аізествссз аесестнини вВЕсЕстсяе ва віхассЕвве «Хсастівсвзз сазсвнавтає екран ссвасасссХ ска свете ве втївзайаява зестсввсосВ ВСЕ ЖВСЕЕКс скКезсяєкх ассзссикає бесЕстеяе ще твнІсаївиї СВТ вї ваавоствав соц енав зссветаст свв па вчсззсассу ссвівсасну веабсаївтас с тастасв васссиотис ТС тввавс ав
ВастТвТЖЕсЄ рвазавазвта сабСсасссав асссзкатес стсвВтТТете сатствсвсЄ 558 тсссассста сссвзсвссвс сттасвсссан аажВсеЕеЖе ссслесттсс сс саЗ тв
КОСТВЕЕстИ среТвплсая ЩОСевІТсЄК сссвссвасх стівссвсаа ваввсасаце та їсізавеетв сбзавазвсвВ втКатай ВУ «2105 35 «211» 867 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії
Рухкашішопав согдага 5 елонгази в рослинах (версія 2) «4005 35 зІвйзатссв стсавссскт сетсвесасв веїксазивис зеіасвосве батсдасВсх а вія вссє сЕВсТВКСТЕ сбствстасе вЗсСстаїтЕ васвереВст сваассТаКе їх кет сівстВ ставрраїсЕ сеесстсвВІв вавустеств сессскхвЕ сс ї8О стснетіансх тсвссаксях ТвВЕсстрив стсВстнеє шівазеВтТеєЕ ссстадааке дя піїзавиває звЕабссухЕ сеКсстсаак вста рК ссвексзсва св сс тав зісивасссв всссЄсасеяу вівссісавв сссвссЕвсв авесссВсвЄ вавсаавкає 358 їесіїстнрвЕ взасснохка сваессєтвстї сазассвада света касок 496 тіствсксві ссввкаЕстВ севВКЕссасн висаскітсв ссаТнсссеї сваввиааає а вЕтглнассввв ТЕСССЕЕсСЕК ссабЕТЕтас сассаскрах ссвбєтстве васстТКЕсЕе аа зівнассвсїї втретвеєтес звеквваКат Вс сЄ КВК СсСХ савстоКЕвЕ БО всссзївівт вгсаївжеясає сіті Крессвств сс тах веасвазаае БМВ зссзсовакаа чис всвквваава сассусвссс зваївсяааЕ всссаВє ще стсСесврашєє ссссссавВс ТеЕбтсСвесос ссстастесю сс сестаавКе тщо віївстсває сесксвіїаї сага їнвте зссстектса ХЕ ссве завсстстає За тасаКеанис зссасвеуке тазетеа ва? «2105 36 «2115» 807 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії
Рухкашішопав согдага 5 елонгази в рослинах (версія 3) «4005 36 атвисстста СсвссвЄссс сВСТВсЖеСЕЕ вествезасіє сеКабвсеЄ васстасває по відвсївасс ствасавктсс сростсткав заввосссзв сс ак всзавснвне ща таствивизе сіасівесве застассвих сзесбестст гсатессасЄ свезааВеех Ко зісатрсвза зсзнзазВссх рестфїсвви сттазваасв скаївсїсвЕ веозаєтте аа тессввассе сскссаасав стаствеакс тасссоктЕв ссасстстсв ставвееса За неасіїадав «СтрвЕкайа савКсстваЄ ВКассвска ЗсТсСсТтврвиие заестессая ЗБ вистассствЕс сссассвсав сзасзавтнс втвеавоссЕ Єсраїтасессо сттсаїявЕе ЕВ зівайвазро зеЕстссвассв все сткс сттсаєвЕст ассвссвсас КсБТсКсЗТе ща
Тввтсатвиї ствах вазвсссеве сессстсвав згсвотастх саряссевеє ча віхваєвссє ссвівсвсво весаквївс сесзетасв вас сВК стих ав відс двазкаавта свїсвсскав вїссавасво сви ся Касове веї вав їстсяєсста їстасассвс Ктасвсссвев засастескх сесрЕеуКсс сЕасст са 72 сТстЕваисва свеТтласас ВсбеВтТвсєс сстсВсТаасо сСтассвева завевтвсани 788 авсазивитЕ ссаазвазися всакав ка? «2105 37 «2115» 267 «212» Білок «213» Ругашішопав согааєва «4005 37 мес віз его ів дій тіє го діа Аїз Би Аз біу ТВг без бу Тут х 5 18 15
Уаї тве Ту Аяп уві Діз А5п Ро дхв Ті бро Аа ее Б30 ух ма й яв ЗО
Мго Аія Тук вве Меї піп Ма бій Тує тро Зіу Бго Тв ів Лу твк 35 аа 5 їі біб тує іем оїео вне (16 Туг Бе біу ух Ягве Сів МеЄ Бій деп й ЗВ ща
Ага оБегс сів о Вго РНе о сіу їаи о фу5 Аха АїЗ МеЖЄ рез Ууаі Туб де" Ве
Туг бій Тве Ре Бе деп обег Тук Сух Ті Туб ву ББе мані Твб о5етб за зЗ5 ні Ага Аіз Бій біу се Су маії Теб оБіу Аа ї1а Реє АвроМмеє тве їао 155 що дів дхп бее Тго оіу Ї16 бег бій уаї їі тб оіеу Мія Ту Ахо Аби
У 1938 їх5
Муз Туг аї біш бем цео Або Те РК Ббе Меб уаі Ме Аге бух гук 138 135 ЗО
Раб А5рооівЗ Гей озеєК Бе ре) НІХ Хе Туєб Ні Ніх ТвБ осеу без гів 145 ї56 155 ївБа
Теробає Тер орне узі Уві Мебє уз йео (іш БгРО МЗХ бі» АБрв обух Ту - 1655 178 175
Впе 5Ру бег бе" Маїф Ахи Тк Бе узі ні Уаі Ге Меї тує бек Тук ще ї85 ща
Тут Бі без Аза дів се біу маф дха Су РВе о тТррогух Куб Туб 216 135 за я
Так бій Те біб Меї ів бін бве Сух Хі Суз йіз ве Ні беб Ті я 5 ке
Ту тв» Аїз Ту чваі бій айва Твгойів бне Тер Бен Бе Туб 85 ів
КЗ ЗО 235 за си Тк Уві Ме Узі Ай Меї Бне Уві із Ба А)зЗ дай БВ тТук АгЕ 45 я 5 іч АгВ Ту" уз Бе уз СТУ Аіа бух Бух ІВ зе ох «2105 38 «2115» 1344 «2125» ДНК «213» Рау1іоуа ваіїіпа «4005 38 атВссжссвя неВсвясвОа всавасвиес ВеВлнсВсви ВсВТВСВсВС ВАДсВКсасе а васісвісни сессссасвсв сВваввасвВЕс вссвасавас сенс сає ваТсесвОВХ ща васавситеї асвратвсеза весестссво бссварсаїс сраптевсвс вс В 155 тТЕвстВІТср БсвивВсвсра Твссвсвоав КосВтТсатве ветасеВсся Все ствВ 248 сссварісво всасексвсв сстссасвіс вееєїстссви сатсвессна деавсосеке зай
Зжсвссватв зпрявстасх сспвствтвс всссвсаксв ссазватвиє вескбсвеКе еВ авсвЕсвену їТсксвссвВс вІсніаствЕ ВУКЗаЕВСОК ВЕСсваїссВ свв севВсКЕ вай віснсвстсв зеЕснтасвї вотеїасвск ввсовавовеє тесссссетс вас сВссЕ ай пврівнстнї КсВсЕссвВаї бввсствняєЄ зіссвисасвВ йбдесазсса сввсвсвсїс заа хссявиїсвв ссїсввїсиВ ссТввЄвВсЕс ВеКХсВбВсс ЗЕКастеваї сЕвснинаве ова птваїсстсХ вествсавка всасвссегс асвевссасї ТесасассаЗ скасрттває Ба падаввсссви зссзваарис возвсКвЕдес ствсЕнстсЗ зассКВссКа сс де та псватнесвст вествсався ссхствосссвВ ствсстрове акасваксвоа света Уа її З Книч З хх 5 Ка ДІ 8 їщ з ке їх
ТІДЄВЕТСТК совасессак сЕВистядівВ ЗТЕЖККНСНВЕ яКБавЕАсВа ВсссВЕсяВе дай пашствесск ветаєсссте саїтрессеси ствсксстса зВстсвссїх сеанс всве зво ств сЕКЕс свссвесета сстсовсвссс звсетвсаса сеесвЕсвсвВ кассвсвисе о зсввівасавз сввЕнавсЕХ ссвостсвос СТЕК УеЄ саксксвса сзастсскав 1898 ввсЕтввсва ворксввасс веВсввслро ексзссарса Трасрерсве среакссїЄ їв88 стєзвадсявє авдеснарає стсвсксаас ВТК сввсс сестЕсЕсиК сасвстсаВе 1145
ВЕсКВесСкса зоба свавсвссВс сет ссссз ввВсвсасса св ає 12858 скеісвссхсв свссвесвВВЕ сааншевеВае сесваврсвс всврсастнаЇ втасаавсве ї1хБа зассссвассв саВбденесва сстврсаксєс Зевс ванне асасвкасво вебсввоссве 1555 чзврссвсвкВ сан свна ВВ їжа «2105 39 «2115» 1347 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Рахіоуа заі1ііїіпа 4 десатурази в рослинах (версія 1) «4005 39 щЩоессзссса всвствстаа всззасвееа всессстаств вв сакес свт Ба кастстЕств сс сєвссвв вазвеаівЇх вссвасавас ствасстсєве сассевеувиа Іа
ЕВТХЄТВЕСІ асваїнстаз вве совна бстезвовкс сбдеснетвс сова Ба ст сиМтсеЕ вейвазезва Твстассван Ввсссссасев аасассвїви вази Е ав сставвісєта дачсвсстай актссвсвВуу везісЕсста стістасєня вЕзасотвЕ зве всївсстнасв звивитассе ссзасес восавкаїса стзЗВиасЕвО вес ТеТЕ ЗБ
Тесс тЕвВаЄ їсвстсствс ЄЕсттастее Встазевсто васстатесї два ВеЕ За
ПЕСВЕЖСТТВ звесттасВе Все ЗсВсЄ сказадявяє ККстссСККє бвсовеКох аща вватЕвкеккк тсвсссн свЕссснс вссзсасЕ зсЕЄТавссо тес е 540 тствавтсти ства сосну ввассствсс зввассЕваС сивая вав
ВТвВИТссТКЕ весїтсавва веатріТвеК асеєвосВск сессвсастав СЕЗ стяВХЕ БО завваїсств агсланаввс фслсвзвсвсї стбавастса чзвсеїаствяа ДСС ТЕЙ хскатвсеЄ вкстЕснисв бсКЕБасеКЄ ктвествекАи звастаЕВКа сво свав тва
КК тсс совасаксос базове зсетвВсВсК КЕваКаВсКа есе щав ззвсстнств вятассісТ фТабзоскеЕ Стас ксСа зносі ссвнвстаня зав
ТісвіївеХ свссссссса ссоствстссю сесвгтїсвса ссВсТвтвс СКС ЗОВ зобнттвЕка сиві сККК стасстонеск СЕКС сСВ са сссв свассуснвЕ таза вБЕСВОХЕСТ ссвВствеасс Твасвриссю аїсвсстста твастявайе ТЕсТВВСКЕе їава стКаавевас заретвадає тс ставс носвеаенас стекжексес СассЄставє В вабвнасїса зстассавак свавсяЄсає їв Есскса навсЕсяска сиве сЕВе ав сствизВсктЕ ссссжстевІ газЕвЕстиаи сстЕавистЗ варваЗксва вгасаарсве ї3Б5а твссстаєта їствдестаа ссутЕстТес зссстсвеас віаЕвтасво ссстнвазна їх звассівнаї совзаввесва діяасив їі «2105 40 «2115» 1347 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Рау1оуа заі1ііїіпа 4 десатурази в рослинах (версія 2) «4005 40
ВівсЄєтссВЕ сгВстестяа зсвезтвЕна ВТС асте Вбестласис текТВІївес Ба вису їстн стСтТсвссве зайквасисв вствасавас сбватсикас сесовеКВх ха кассствІйс асватвехаз вЕсЄссскзеа сствавсаск ссветвВКвс сах Ме бсвоїсїіїсе рекрзвванз сксбасстван нсскісвїви ваївссзсеве вававсссне «48 сстаовіст» ввасаесссва еКтссатвіс вас ссествссва враасстВКЕ зва ветисївасв звввасаскх ксаЕсіїТрі восВЕвоїсВ созавасвок вестіствтк зей їсеїсткнак Севесбссввс СтссхВстВВ вісааввотв взеттасссю свиассхВеЕ зга зІсдетсств звестзсзк вссстасесх везазнаває ЕЖСТессвтс Сас «ва внаснветек ссвосссссаХ серастєаас атссзвсасВ асестааска ТЕТ сЕсох ж їсбвавісбїв ствисвЕсва ссттвсКеїї овасествтє авезксбевас свизавахеї ПО сотвавсєЄсв ства таа сстевсКессЄ веастттвтє ввеаствваЄ севаннакеї вав вве сКЕК вистссвава са сиеквУХ всрсзесвсс сосвсассва срасВеКеває 5 заввиассств зісвапевнс сеаТввсВсЄ сотавасссх Зесстассва СеСТТЕКсВ ха сстасвсвії ввстісадсвя сті зесКЕ стссссвива вззсЕаЕвКя сс сВах тво кстасвсВ вветтсавев «сТКЕаессВЕ стссствите вазсїВЗЕВта сесЕтїсазе тва сус с севиаївВісє сравсесВкв асаєвааваї ВаБаКВВїва вес ав вавстснств вабасетстї свЕвсстЕст стестеєтеа авеєтасстх сберкетавв ЕТ
СсвіївстЄ ККсстсКеса ссохсвеїссх сота строїв ас реївс й вседєтасна ссввааассю ссассКвех СЕС ЖсТ секс авеюа свасгсвав таз
ВВС твеЄт ствствеасс ТевЕвважсЄ аїєвесстсся Свассазвиви ВЕССсессЕе зав «скКззнашнс знестнавяс сс зах всвеваврас сЕстсссЕК Хастсттаве Мій ватевастса астсеєсаваї свавсассяє ЄТЖЕТссстз варбїєзвссв сввясуссаАє ве ссхависткв сМссІссВс паска сссвавКсто вена ссна втасвавсвс т965 кассствсса сствВКсЕла сосКВКТс дсссссавас зуатасаске сЕтнЕЗава 1350 авншсіавяї СбзавевоКва вівасве За «2105 41 «211» 447 «212» БІЛОК «213» Рау1оуа за1ііпа «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Рау1оуа заіїпа 4 десатурази в рослинах (версія 2) «4005 40
Щеж Бго Ре его одів АТа Куз БІЙ Меб сіу Ай баб те БУ мМяі НІВ ї 5 18 ї5 іа сі Уві о їНе Ар озебБ бек Азфв Бе Твг АгББ оїух Ах Уві Аїд АхІЗ за вх за
АК о Рго Ах беи ТВгОїіВ Уві бБіу бр о бве Маї Ту дб діз вух ів ав 45 не дошхтю Кожух 8 КЕР Крихех йти віх З З де а Ж Ж куує Ко на КК; не аКЕ бе бів Ні вРОо бі і дів Ні вне Уа! бек бе) Рв щ1у а ща 5 піу "Б Ахрв діз Таб бів Аїа вне о Мек біз Ту Ніж АРЕ св АТа Тер 55 та 75 ва рез Бує фен др Меї бек Авв о РВе ніх Уві бі» бег бе АТ его тре чо за 5
Збій го Узі ліз АЇа Ах сів б3іу Туб ів біб сво Су дів АеЕ 188 їо5 318
Ті вів ух Меї Уа бро зер оуУлі беб о беб БІіУу Ве діз БгОо Аа бек зла ща5
Тервотео Уві КУ ДіЗ БіУ ів Ті із 631У Хев Аза хіе АЇВ без Б - Ва 135 з4а кіз Ту Ме іо Туб дів Бі туз Або іву іву Бко ЗвК оїї8 Уві Ге
БУ їз 155 їв
ОЗу тго Бей Ре Аів їец Бі сіУ бео йзп Ті бів Ні Ар АТя дей 155 178 5
Ні біу віз іви бег о гу5 5вгобіз За" уві Ахп ів Аа гео біу їву
Ка 5 ча був спів дев Тер Те біу Біу баб Меї Тів без ТР обву бів Бі Ні
М зав за
Уукі Уа Меє нія мів ей НіЄ ТБе йзв Ах о УЗі 85 уз Ар го АЮ
КІ а з2а сів бух Аів нів сіу ія се АБЕ огСе) суб Бер Те й5о Аза ТР о Бее ях а 35 зав
Бка мес Ні тро Бей БІВ Ні5 сей тує бе бе Рго біу 515 Те мех 45 а 55
Тук Аза Би бух без без БВе івц йо іє бе біз івои Узі Меж їго за Фга5 а дРе їго піц біУ бів бро (1 бек бух їви йіа Щ3іу їуб іву Бе мех
Ка 288 «85
Бгб баг обу без бе тує Кен ТАМ ОРБЕ їгв АТЗ Ага Бе таї АЇвВ Бе ща 255 ЗО зго Бей Туг ги Аїв Ро бек Уві Ні ТвбоАів УВІ Суб Зїе Азїа лів лав З ЗВ зва
Тне маї Меї Тнгбобіу бек Рне Тук івгу Аза РН Бе Ре Ба (18 бек
За за 335
МІ5 Аха РН Сів Бі Уві Аїз бек УВІ Біу Бео Азо бфу ев щі тТНе з4а 5 58
ЗекгоМеї ТВгоаАби біу віз баб Ре іван Куб АКЕ бів Аза біц ТВе о 5вК
У зба 55
Заг одяа УВІ біу Біу Рго уви фей Аїа ТБ осеу ап БІіуУ біу ре дав і Зув 375 ке
Тїжв вій бів (бу Ні НІ5 іа РНе го Абе уві Ні Ніх бІ1Уу РН тує 35 аа ЗЗ5 зва бич АгЕ Бей Аза Ре їву уні бух Аза іш во біо Аі8 Ага б1у Ме і ва що 415
Ти Тебе бує НІХ ТукоБрРО Те гів Ткро баг Ах бен Аза беб ТНБ ви аа 425 38
Ав нії Меї Ту Аза і8у Білу АКЕ АЄВ БРО АРЕ беБ о фух аїа 01
З35 за 45 «2105 42 «2115 792 «2125 ДНК
«213» Івоспгувів да1рапа «4005 42 згідисссссв саласряєвс ведазвявсво Вісівевсвв сСтвінассва сесвдаавее по «жсвттввКа ксттсссвтя єжтвреїасбс вазссвотвс їссвовВЖТс сеевсТеВІВ ї28 сефіклваху ск ся сп фукіму ту туї ен и НН НН и пе и ших вавінававве знвдонсЗіа севваесвтсс Вас аск Ксх Вес се їн
ТЕСтТЄЖвсвсІ ТВаВссїЄЄЗ сЕсЕасЕЕсВ зссЕссстсв ЕстквЕАЄТЄа СЕВтсВсевЕс за
КЕ с іш жКЕ. д -х Е пе с ТОЮ. й як д па огелук З и крук ТХ их ще шосе Ес Є пи ї зав вІнтвнес всих СЕКС КОКС МКС КОКС о кістах сразвскосо сесасвевсс шссааквсво скссвукаскс савевевсвки зва
ЕписаВссїсЕ всзсввесїв вот увс: авависаака вес сссссаВВКе хо тЕссаковсї Стросвсвсс ВтввЕасесК ївсстсряса сЕсВиссвов свасдавВЕе ща втатвшатих тсаЕВЕЄСТ сазвсєсвстє зетевсвсса тсабеевсВс стастасеве зай сксзссвссв ссоввисВсза вІсснаввеє авасевстев бсассевсває все шскее НЕ сапржтсвсвиЕ ВОВБЄЖТссЄ ВОсввіствЕ десізевжся зсвтсссста «кктсзасвсВ вка ззсозазення анттвЕксав сік засбзснсву всЕЕсвроїс ВВЕ СККя Та «тт єтнсс все ссявовсВас їстрсваска вразассвво сеазвесввиє тва завсаветсх ак 782 «2105 43 «2115» 263 «212» Білок «213» Івоспгувів да1рапа «4005 43 до Кі За Мир схе З р соку В я дня З р жах
Меї ліз сец Аіз АЗбй АЗо Аіз біу Зі Абе Ті Тер дів Аїів Уві Тв
З З ії 15
АЖ оБго біб Ті сти 015 біу Те Бе бек Туб ів ви фе був Вге а як за зву вен аАср вк оБег БіУ сец Уві йо бін ух бух піу дів Тук АгБ її «а 45
Так овегє Мет 118 ТР оТує Ах Уві сечо їоеи діз Бей РБе бек дя Гео
За ще Ба
Зак рве Тугв Уві Те Аза Тве Ав Гео бі Тер оАбр тує у Тв о о1у
Бо та 5 ща та тр обен АРЕ Аг зів ТвеобіУ А тїве Без бів гро без Бе бій
З 5 ча З
Сух Вго 5еє Бго Уві Тр Ар обесв ух ва вне Ти Тер отйк АтТа бух
Її 05 ма
Дів вне ТУує Тує бее ух Тум УЩ1 30 ТУує Бе Ар о тТве АЇВ Те обец 115 1 ї25
Узі сви суб білу уз АгЕ Уві бек Вій сво бій Аза рНе нНіє нів вне ї538 ї35 їла йіу віз Бго То Азо Уві Туб ви Біу Ті Або сво Нів А5а Зіб іх 145 ї5а 155 ї156 чаї Тер бів бив Меї Бне ВНе Аяа беє вва їі1е нів Те тів Мех Тук їв5 зуУв 175
Те Тую Тут су Гец ТНгб Аз Аза 01Уу Тут уз БНе ух Аїа Був РКО на Зах за ей сі ТвгодДів Мет Бій Ще Суб Фів РН чаї Біу БУ Ре Ге во 95 ща 5
Ма ї"О АБО Туг (316 йб5а Узі РКО Сже Бе Ах бог Де груз 01уУ Гуз а щі ей ен Бне бає Тер одів Бе йх5й Туг йіз Туг Узі 01у бог узі РБе їв аа я еВ ча
Мее Бве Су НІХ ББе вне о Тук БІ дб одхи бе Дів ТВгобух уз бе . ав ЗОВ 55 дів уз дів бі бух Бій їец е5О «2105 44
«2115 801 «2125» ДНК «213» Еті1іїапіа Ппихіеуї «4005 44 атвктсвяке вевсстсвВОс свасиснвсс СТВІ В серівуссца Тссвранае ев ствассввса сТссстеста сссветветс завссвествЄ сасвсазсто ЕСЕ ла ввсввесека азебсвесів ссреасстсв аіраіствех возасеснЕЄ всссневее за
ТтЕлесвсЕн ЄБаВстТЄта свЕВЯстВси ВссЕЕрсТсВ БЕТКККасяа весен свЕс а вавтвисісс всватстсас вевсеаслес ссвсавсевс сЕсвисазтв сссвіснаВВ зай
БІЗЕрежаАст ссвавеКиту сссЕТАвасв Ессе Сстасєнеєє звавсасвск зва вавівссіси зсвсвесвЕк ВСтсвКестс авевиваниа ЗКВЕСТКСсТЄ сствсавЕВ: зе
Мтсслсекастх СтевсКсКсс ясЕвВаснів сассжнвеся СТсвветВай дазсваввке «во всвткЕватст ссасвукстЄ кавсїтсвЕєс атссвсасев їсвтеВоВс КтастасвеЄ аа стїсзссвссе сеядаствовза ваессвсевс алвскваїса ссассвсвах шсазатавис ва сЕВКЕсвссн неКВосссвВу ссбантясне кестасаєсв асвсаесВКВ сТссасВсє щаО ше нссвино зпвеїстсвзи СЄСривОсККЕ васівсвссо всвтсвеске свтссЕКеси а
СТВІ сстТвсоє ВебтстІствВ сабвраєває вЕсвесразве ссверессва дипвессвє ува ксжасссвса ЗКЕсЕСЕВЕК З ХО. «2105 45 «2115 801 «2125» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії
Ешті1іапіа пихіеуі 9 елонгази в рослинах «4005 45 зІясссвеаєз вавссстакс твасветвсх зоесввавев ста сства ссссвивВаке їй сіхвісвдав Кеті стеста ссссКесЄЄ завестссс Ссавааастє СВ Тесе з2о пасванкаван звинавссев ссосастусв взсезісткеЄ асазсвессат Ссссвстст ї188 сІстссвста сстоссссска свЕсаєтвиї аствесссксв васввивЕза рвав Е ав
Павтнвсстя васстстКас свв ссх сстсвасансо УКТвЕсансв ссстістава 398 вістквизси всеазастсєї сссоитевастї всбаававссє сСсіасівссе сваріасвЕє зва вавштассств асасєсессКе воестестстс завввавава зве стсаї сстссвВвва 28 ттссвісвжт товЕтТесттє аїввкивтетх ївссствва тсздессїаз кзасвавеа ща вІіЖтЕдИссТ їсВЗЕВЕСсЄ савсаестЕс зкесвсаВсте твір свсис стае аєвЕВ аа сухасствсів ствнаїасаз вассавовна вадсстасса їсассвеї8ї всваассе Ба свИСісаужЖк всвражїсих ЕСЕЕВТетре квстасаєЄка зовтссеєєвВ кКссзЗЕВсЕ па втасвеснвак аавстстстк сстеЕвЕТВстс застасвостє зівіввваєс сте сТх Уа
СЕКС твВсс вок бств савбдкасває вісвствани ссзаввстав аззинеБККЕ тва вехассава: ЕКС КССІВ в ва «2105» 46 «211» 266 «212» Білок «213» Ештші1іїапіа Ппихіеуї «400» 46
Мехс беи АБ АБВ Афа Бек Звее Аз Аз йіа ГО ТРрозег АївВ Уві 5ег ії 5 їз і5
Аа го біб їі без ї31е 6325 Твне оббе бве ТУуБ ев без бец Суб бра з. 25 за
Пец гени Ас Аа бек біу без Узі йбробім АгЕ бух Біу віз Ту дгв 35 ча 5
Те обек МЕЖ 316 ТБ о Тук Аха Узі Уві се АЗа во вве Заг Аза Тек ща 55 ща
Зав о Вне Туб Уві Тве Аза ТВ о Аїз їв 01уУ Тер Абросузх ЩіУу ТБ обу пх а 75 5 бів тївБроуен айс баг фев ТВг о біу до бее Вго бін біб ей тТго бів 5 за з су Бго бек Аг уві ТероАха о Беб бух Бе вне із Тевоїне АтТа бух ме 5 зт
МІЖ вве Тук Тув зЗвеофув Тук чаї 3 Ту" беб Ар о Тве АТа тер обец ! М їх 125
Уаі іви бук Біу уз бух чаї бее о Бйе беи бів біу Бо Мі НІ вне ї38 ї35 148
Сіу дів Бе Тер о АЖв о МВі Тук їв Бі 038 АКБ Бей вуз дай БЦ ОТу їй іа 155 16
Маї їв Ті Бпе Меб рве Ре Аби баб Ре тів Ні ТвгоМмаі Меї Туг їб5 16 75
ТвКотТук Ту ЧіУ ес тТНе Аїз дів б1у Гук о буз ТІ АгЕ БіуУ Суб Бгеа що їх чо їі ті ТБе Аза мес бій Те бЗеб бів ве Уві бі» біу вне уаі во ах ЖК «Ох
Чаї Те Ах тує Ті дя уаї го Суб ВЕ Ні ді Або Аза піу бій м 15 аа уві вна бек Тго Узі Бве Ах Туг Іа Туг Уа) біу бек УВІ РЕ ей ка е3а 235 аа сер РН Су Ні Бе Бл Ту Меї А5рз Ап тів Аіз уз Аія буз дів 45 ай з55 ув ув АЇЗ Маї Аза Те АБЕ бух діа Се "ао 5 «2105» 47 «211» 819 «212» ДНК «213» Рау1іоуа ріпдців «4005 47
ЗІВЕСсвсвс сасссетсвВу всїсвавсии сІКсТЕСсвс сказисссав явзенеВнЕв БО
ТТсКЕТЕВБАН ЗБЕТВСЕССА «СКсТссВвЕЕ ВСЄЖаСССВЕ СЕС се ваан 128 свкассссвЕ сХвнЕннасас все Ннс всвсасзана вснесаСВаК сесясасаао 158 вірша вес схс ВстветиКес ЇТсаКстесє зрежтсвКарЄ сствввСяЄ АВ квсатдЕВсВ асттрсвЕсЕ кЕсвсВІВас сісасаевВвВ зав аїЕВЕ сс ає зав сзввасвсву ссссвТсссс свосістес васаввсїЄї света ес всссасвсс Зев їтссвсївст ссаазесаТр свавіжаки вавсвсснках вестввВіваї ваавивсане да сссЕЕВТссК свстссЗвв СЕсссвссас тв ревссв сствевасас ство ке агкасстісє зизасвовин сакствсвся ТТсВТВЕЄНЄ Єсвасвеєте сзсссвсаеЕ аа зіснеувсв сасастасвс вЕссастВсв всЕВВТсіса веїссвсвех ваветеедее цев зЕсаквстся сшсзватсвс сесзастсвас йсввветсвВ баасвЕеВса ссастасвс 5Б5Ба зссствжант асссссвсаа стеассвеае стсвСККЕсх сс санок аквсв т8в
Тясріствев срЕТесТесЕ сетсвТсаЕВ саБЕТсВесЄ зсатввакае сте ВсйвЕ ява зарязивесв ствссвссес врЕсвавазв давав щ1ч «2105» 48 «2115 272 «212» Білок «213» Рау1іоуа ріпдців «4005 48
Ме Уві бій рРго га Ті ТВе о їез Біб ТРОо бе бе) бее вро Бу ву
А 5 18 ї5 сУух Ай Аза маії ве зЗіу СТУ біб Улі сви Туг РКе боб Дів Аїа тує а я за змен Бе гео Аза МБО Фів Се Куб АБй о ТВб оБко виь Уві АвроТне Аге 48 45 мує бі АТа Тує бук зЗегб бі Меї Ті5 Аза Ту Аза Уві Ті Має Сук зи 55 БО
Уа вне заб обеу УВІ Сух ББе 38 Суб бій без Аза дів без бу ту та ї5 ва
А Мет 01у Ту во ЗіБ ТК Уві ге Азроїао Тв о оіуУу Аз ж Ще ць за З
Маї РКО їви Туб сій Азр УВІ бве Ве бек Бр дів ВНе беб йха ув 188 85 ке
Гео Бе бух Тує бек хвгб Ї1е Азія Рве о мНіз Тукозвеб Був Туб Узі 51ц що за 135
Тує Меї Ахо ївгб Аза Тер бен Уаї Меї бу5 Біу буз бго уві бек цер а 35 ї4й меу бів лу Рне Ні Ні вне біу Аза АЇВЗ Тер оАхв тав туго Ве у тах 5 ї55 ща їі твР о вбе піл аби біб Ф1у Те Тебе УВЕ вне уві Уві зво АБа Аа 165 7 175 пе 118 Мі Те Ті Меї Ту Аза Ту Туг Дів Азія ТВе Аза Аїа о1у ї5а ї85 Те сви губ ве бек сен їух БВе Уві Тіз Те ве Ме боїв 0316 Твеовів 1955 зо ях ие дхп уВі біу Ве Уві Меб мМаі Туб Ніз Ту ТІВ Те о бецу біо Тук же 15 еВ
БМе Агро Депо баг ого бів бе чаї Ре бек Туб ке РМ АяА тує Аїа 225 я 235 4
Те Маї Суб ТА УЩ Бец бе без Бе Мет оп ве пе Ту МОХ АБО -х45 У 258
Азпорвне біу ух ух був Аза ліз Аів ліз діа бу уз Бу бух Був ща 55 ха «210» 49 «211» 840 «212» ДНК «213» Рау1іоуа ваіїіпа «400» 49 яскесвастк зааевиЗсвВос Бесвасяасе стає свес ТВсТстснсс севЕсхвавя ца васяссвіва ссвесвеева вхо кас сстксвсвсн векассєнсЄ встсвашеєс ї15а кісстсвевс всссаєсвЕХ Севбреасвви свросзаввасв сасассвсва свасавівате іа псвтасваси сссїсвснЕвВ сКВІТТсЕси Стринжа сх сТсвТвтнсса датввсвнсВ ве сісвВсо в ассксевеса собнсВеКЇТ зссовсвасс ссасєвввсва савсвевасе ЗО схансксінсс знавства сесавїсоссю всастсвсва асазвсТсїї ссвасветеса зе вКЕВІВЕВсВЕ тссастаєтс зааЕтесете вавтаєабтев асзсвасвсв ВеТТВЕКеТЕ ау варероснник ссВЕстКрвІї ссбвсавевс ТсСссассасх їснвсвсснє КтВдвакаке зна твВекіскасз їсасва воннваввис зосжасВТс Тв иссвех сласасВке аа віссвасвесва:а ТеВівтВвсяс схВсотзсвес всазевесав свенсвтсва засстсватВ «Ва авеєсвства їсвесстеаї всанатсвск савіжсствс сввВесесиЄ вес ає Ба ссвтетакєтк асстсввета сс е їсвсссвавс тсвтвсввяВ са ТВКЕС зе авствтвсву зсевтасскак вЕтвесеКкс стсстсВас ст ссоса ссвсвясВає ща тїжБвнсянис всваресвяє сісвсесвіс вастсєсаксв вссрсатвав вассрансай да «2105 50 «2115 279 «212» Білок «213» Рау1іоуа ваіїіпа «4005 50 меж Адіз Те що бі Меї Без Афа Ті пк осео аеро ТР о Сеу ви 5еє 1 З за ї5 дим Я візок АЖ свя Ж ші ку во я фі свом вих єв
Рео піу ен вуз Я5р діа Узі Ті бі БіуУу біш Уві беу Тук Ре бек
В а а км, КОТУ СК спі вм; їні: руху ЖК екю фі і ку ше Кз тич й ге ви Щі Ту бе кеш о їео біб Рго Хі Гео фу Аква баб обро Бе Уві : 5 Б ду
Ах Гуз АРВ бух ФІУ Аза Тук АКБ Ах спіу Мет Тіє Аіз Тук Аха Ті за 55 ка
СИ к я. и не. З у кві деко к пуф «7 стук їх жк Ж їду ух Вр - вч
МБ Мет бух б3іу Бо 5ег Бей Узі Суб РН Уаї Суб біб Меї Аїа Аїа 55 7 75 ще їви бБіу сеу Ахор АБ бі Мік і6ц бія бе Узі Ас Ах ви ТНгеоФфіу 5 ча 55 се Фо У А огУут мі Жізую Ту св а й чих се З Же
Аз озає уві Узі чі без Тує біб б5р Уві бе обро бЗеб бро дІЗ вве : ВА 185 ща
Аіа АБп бух Бе бе АБЕ о Ту бег діз чаї діз Бе Ні Ту зег о Гув 128 125
ТУук Уді сім Бук МЕТ о АзО ТВР о Аза бо іец Уві бе бух Чу бух Бго їз 355 їла
УЯІ бак оБве їви бій йіу Ра Ні Ніх ББе бБіуУу Аїз дід Тео Ак о тТВе 145 ї58 У» ї65О
Тук вав діру 118 Те вне біз аа біб сїу Те тує Уа) Ве Уві гец 155 ТВ ї75 рез ави із Бе Тіз НІ Те гів МеЄ Ту Те ТУ Туб Ту Аза тТвк ва ї5 ї3а піз Аїв 515 Ті Суб їБе бе Меї бує Бго Сеу Щ1є Те без Меб БІВ 195 за за
Ті Іве біб Ве оїеу фез сіУ Ре Аїв бе Уа Туб Бго Тує Т1е Або 18 -ії5 зв сви Оіу Тує Бе Агев діа Зве бко бір ів Уві гр обее Тув гів; ВВЕ 218 3 зав
АБп Лук дів Туг Узі цей МЕ Уаї іву Бе бе бе Мет Агв вп Ре г е5а 255
Тук ніх Або да Бе бек ух Ні Бу Рг ів беб Аге 316 Ар о5ве за КЕея ка заг Аба Ав Меї бух Тео
Зт5 5 «2105 51 «211» 1284 «212» ДНК «213» Рау1іоуа ваіїіпа «4005 51 зтнЕдесЕсн дсВЕАНнасан савсовннеВн ВККСЗЕССВЕ СВЕСВЕЗНЄЕ ВВС КСВ ща звсвассвсв свЕнвВтвав савсвстрас ввсззавсес гтесасвісвї встав 1-6 завсденікВ зсиїнассяя встссаясво зсвсесесни ВтКЕїавсая ЕКС ТСсВЕ що вксткєсяви зссвскекнє васваеневи ЄсСсаадісєсс вссвсссвва вевсвскяке аа завасвасев аЕКВСВКВсЄ сезвазевтс вазвкатеЕссе севоснаеВе всссттносе ВО хсссввіїс Єдаївелнаа ввасєсісвак всрехваїся звсввеасиЄ тЕсавсвинх 35 касссквіс сасвссснс свасвевсєти їбсавЕстсВ ВссСссВЇКсК сстссскВос ах ттсвЕвиЕса ЗВКасетвст свавесввКс Втевестссс свстствЕквв свое з5а
ВІДС тТтВ деЕТВЕЕлссТ соте КнВ СссвсвсяеЕ Зстассївсв сеаЄтесВсє ав сісзаввиі ссвссвезск свесКтсвВя іїввавсвасв сресквдета сте свве БВ тжсктвеави ВЕТЗІБсСКЕТ СЕКТИ Тви сесвевевиє атавсасвся сеасвсКТаЄ ва нссваікави зсдстсвва сссствасате завасвиєвс светксїсаї ЗЕВС е З засазниссна вкаїсвссва вевсстравс весттссвво всбассввся втастастях тва нІдссвнтша Хвоя кесї свакствтас севсвветоВ Вріскаєсеє стиск сВ вав зірсвсствс свевиазквст несвевеиск стсвсасТсВ ТеВсвсвВста Вест сВІЄ ЗИ
ВСЯСЕБНЕСС усЕсвенсВа ссвссвостЕ сте сасесВ таазсввТст всвсвиВЕхХ ЗБЕ
ЕЕсЗствЕКа КсассЕККТх свскасдсас бвсватвеавв збасссссва свсвезсеая їж вівсвусзса квасвстсВХ свадснвасв веастсосх сесвКазсаЄ СусВВЕсВЕЄ за8а тТЕжстсВївВа зсдівсЕєВс сврсїтсяте Ксвствсвна соеВдесвкса сети 11583 акватгЕксав ссевсаассЄ саївастаїс свосссканв СведеНЕсеЕ ссісзававе 128 тасвнвссїв звізссЕсва деясавссіс зствавінеВ БеспЕсоваз саТссвуНоВ за «сво вЕссн звснсссве кеВ 1584 «2105 52 «2115» 427 «212» Білок «213» Рау1іоуа ваіїіпа «4005 52
Меї піу Ага біу Ту Ахо бек бег біт Бій дів МНіх го АТ АїТя 1
А 5 16 ке ви віз Уа бро бег Або АРЕ дів біз уві его Аза Аза А5о Зегогух аа 5 БІ
Аз еи Мі Хі Уві іву ТУук б1У у Аве Уві Ах) Уаї Тве бух ВНЕ 35 аа 45
Пів йгЕ Те Ні без Б1Уу біу бев фух Ма) Не Ага Т16 бБне бів вер
БВ За БО агв ав Аїа Те біз біб не біб бек Тук Ні его ух Ав дів Ше
Теж зи У на щук Мес Ме піц Ооїу Межї іо ух Кук беР Бій йбр Аза ввОо Аа Ав : 5 чо ЗБ
Те оБРо іо Бго беб чЧій Зеб РКО МеЄ б3іу бух Або Бе Сук Аза мех
М 5 ха їі біб Ага Мі маі Аза Аза біу Ту Туб деробро Сух Вго беб А5О 158 їз піц іа Бае гух Гео бегр бе) уві їв бо Бео тТве вне віз 1у Мет 3 135. 14О
Туг Межї Ме бух АТв о біу Уві бфу бан Бр ів бух ЧіУ Аа Бер Мех 145 5 155 5
Уві бек Рне біуУу ТгРр Ту" бер Ах біу тр іо Афз нів Аа оТує ев 178 175
Ні Ні бее чаї вне був бір беє ак дів АбРЕ Те Уві іу го Ав їі88 385 та й«п" дів дів біу Тує Бе гео піу Ра Узі бін бі Тує аБа маї Фу 135 ща за5
Тер оТРОо Абе Аза Аве Ні Аби Те Мі ні Уві Су Ве Ап 030 Ар : аа і иа бі Бак оАха вгРОо АБО Кі Бу Твгодів Бе ін огеу Тіз Ту УВІ Ак бя 238 5 ча
Аяп обу Бко бе Хі Аба бух Абе беу Ахп дів Ве бій Агро тує бів 245 за 255 бів Ту тує Бум Ухі БРо Узі Мет аб бів ва Аз о Бенц о тук Те АгЕ 288 зах Уа іви піч бек 16 Аз Тук Узі Аза Мет Аге і бро бух Меаї ву Рго ва вх ців Аїа Бе) Аіз бо) Узі Ата Ні Туб Аз Сі УВІ Аз Тер о мві вне ча жах 38
АТБ оіу Аби тує Ні ев фер бго іо Уаі Те маї гео АРв Оу Рне 305 зе ЗІВ ї2а щі ТвгР ОЧІ їі тТве Узі бве дів ТВе НіяЯ Ту 01у 53іб вхо Ті цес 325 ЗО 335 ше дів ахо бій Уаі дк Ні Меб Тве оіев УДіІ біб бій Тве АТа ву зав зах 358
ТкРБоХег Або Ави Ї1о бек 0іу БІУ їкБроцео Уві Аве УВІ Бе Те б1у
ХЕ За 385 вве жїв Бек оби бін ТВе біб Ні Ні їеу БВе бго Меб Мет БРо ТвБе зт З За сіу йхи БВ Меж Тве Те ів Ре бів ач Абв Аза бе Ре бух Гуз 55 зче 395 «ав нів чім бео зіЧчЧ тТугб вв Бін біу А5п їв Це 51 Суб УЗ АгЕ бів зів 415
Аз їі ЯБЕ ліз Кез Ата ББе візу Ні їем їв ка 5 «2105 53 «2115 172 «2125» Білок 5 «213» Вірус кущистої карликовості томату «4005 53
Мр 1 Дах Аг її ів ух йо ех де ж дев 33: т Мід кг ку чес пі лев Аа БА БІ Ол ва Ар дія АГ ОБ ОЛ АТВ АБИ З ї 5 зо ї5 іш АРЕ те Ар о Оіу су баг оБіу ХУ Тве ТР обек го вве уз Еео ка 5 За га Ащ ід бве о бго бек ТбБ ївг ЗІ їго дБ іс Ні Я5а др о
Б ща 45 те дп ев Ап бій АБ Аа ко ів біу Ме о бу5 01 бек То зіу а 55 Ба вне лу Суб чаї Уаі Бе вух АРЕ ОТук СБ АРК ОТУК АБО АгБЕ ТР щу ах та 75 ща діа беб іви Ні Аве омаі би Біу ее ТР оТвВеобіу йо баб Уві дев 85 хна 25
Ту А1в віз бек дев Бе Бне Зі рне дер бів Ті біу бує ТНготук 138 та а
Зак 112 дге вв АБ біу Уві баг Ті ТнгоУві бег біу біу 5ев дев 15 іа ї25 їн Сеу бів Ні сей Су бій беб віз 038 АБ бе рух ЗіБ Бі Гео 13 35 148 іви Бій іву Аза Бе їі бій Узі біб бек оАхйа Уві беб Агв оіу Су 145 ї58 ще 1.8
Перо Бі зу Те біб тТие вве б БУ 030 ев 10 аз в «2105 54 «2115» 116 «212» Білок «213» Вірус жовтої кучерявості листя томату «4005 54
Меї тб о яБр о РгОо Себ сво Аби ої БВе рго Бід зеб Уві ні аіїу рве ї 5 їв 15
Ав Су Меї іо Аза Ті Куб Ту іец бій бек узі «фі бі Тве о Тує
ХВ 5 38 пі: вро АБИ ТВе дев о Фіу Ні АБ бе Ті Асе Аа ер бів бек 5 «а Як
Маї Агв дів Аг Ар тує УВІ Зір Аа їне Ага Аве о Туг дев Нія РНе
За Ух Ба
Ні Аза АРв о Цео о сіс біу бегб о бго бух Аїа бів ів Аве бів бе ї1е
Тв У5 на біп сій РРО Суб Суб Сух Бго Ні Суб РРО АРВОНіх Ку ім о АМЇА тТНе
Я5 за З5 їі Меї азр Уві біл діа МНіх Уві рго біб бів біп й5а ТІВ біз деп їх 185 МЕ
Чаї ее гу Ври
І 5 «2105 55 «2115» 351 «212» Білок «213» Вірус складчастості ріпи «4005 55
Меї Бі Аби АБО ге Аг оуа! йгвоїух Бе Ав бее (10 іУ Абе ої ї 5 їв ї5 те оАій бів Гу5 тк обій бу бух Біу Тео бек Баг оіви ТВР обеб др ва Ж за піп бух бій твпе Ада дев діа Аа Меї Ту 16 бух зви беб Бго Уві чо а дів сій бе Маї бів бух мазі Те одесі Бе о АТа бро Уві АТа ев ща Зх ва дів Тут ав Яіц Уві бек о Твг Вів РРО Аг Уві бЗеє Те ліз Абе Ар 5 а У ка сіу 15 Твеб АБ беб ЧУ зеб біцч Без Щі ТР ОТве фев був ух Ав що В ЗУ
Тне Яр Тв бів рка Гуз Тує Те Те ДіЗ Уві гбец да бро ее пі що ї85 ще
Бгоа о бБіу ТНе рн дя" сів Сем 116 вуз Б Аа Аза бій Ту" Бім вух
М15 їхо ї25
Тук дгЕ РНе Тйе бег оїсз Абе РВе АгВ Ту бегоРго Ме бег о Бго бере : 13а 135 що
Твботнеобіу Біу ух Уві Аза їви із Рв Ахр аб Ах Віз Аз ух 143 ї5а 355 зва вго Вго БгОо Ай Ав оїе) Аз бек оїво тує два їі із сіу Су5 чаї 155 Уа 175 заг оБег Маі во їгр о ївгбозіу бе ТЗ Без Тв Уві го ТВгоАБо ет ї8а ї55 ща
ТР о АЗв Аг рве УВІ Аїз Або Біу Хе бег о абр РеО Ку без Уді АБИ ще за за ке бБіу бук іво Ті Мет Аза Те Ту" Фі піз Бі діа два Ахр ді ка 45 екв дій Фів без бі біб Уа3 Агв Узі Ху Туб ТВе Узі бій їни суб Ада аж ха 235 вав
Аби о Тне (у бек о Тне бек Ах АТ бів Ті бір Аво РВЕ АХа біу Уді 2 за 55
Ту Ар іу бро дев огїен Уві бек о Тго бек бух ТВК о Сух ХУ ТАг АїВ і 50 285 278 пі Тев біс Мі й5р о Сух Ні Бйе фев бі їйе біу Азп Ре 5Зег їв сх Аа еЯ5
ТВк фе рре Тує біз зуб Ав го Узі ее а1у во Зіц Акй віз Ахо зе 325 зав діз его Акв о Рбе бек Уві сви Ф1у бів йів Аїв Аза бі бек Уві бів
За За З 338
Тв Аїа щу уУаї ух Маї Аза Зі Аве пі бій зеб Уві бує Меж МВ 355 338 35
ТВе Тв" БІіШ Фіз сій рРго Аг біу Суб Те обіп йіз цез двв Се зай 345 З «2105 56 «2115» 303 «212» Білок
«213» Вірус мозаїки гороху «4005 56
Ме Ні ФіУ біо ів Бівп Рго зі 2 го сео АБО Туг уві Ні дв ї 5 1 5 пує Ді бек їне дев о Бне фер оіву йіз бегб ву дер пі бев о їву бе за 5 за біз Аіз Абе біз бео 5ег щіу ВРО івгц Аза ів Ті5 Тве оЗве бек тує о я 45
Тут ви іа Ууді Беб щі діа без Суб5 їв о діз Сі бго бі баб вне ве 55 «а
Тебе Ту древо бе пі Су ТР без бів бко уві Заеб біх АСВ Аве йх ка та ва
Ті Бе Суз біу БгОо тв осів із ви бій Абе вне Авб ів Тук АВ
Ве за З5
Аіва АРЕ ів о біу бе маї Геч бег біз Аза Сух Бго Ав о ніє 03уУ бів ща і85 ще заг А1а АІя 01е Те о геу бій беб тує тб Аї18 веб рго Ах Ахп Те
БЕ їх 25
То мех Ахо Ме Аїа бій гео АЗробев іву ТВе Ре баб Меї Рг Ті 38 ї35 148 іа Ава Тне БВе Аз тує беи бів Ахо Су біз азів Аг вве бро вка ця їв ї55 168 їїв аз ФІ біу Уві бі Бек Аа тує Туг Щі Рго ТаБогфез сер; біу їа5 ща ЖУ5
Яви Так Ні Фі» Ах рез АБв ів ТБ іїеу АїаЗ без АР АСК Ага АВ їха ї85 158 ін оАроіву Заг обіж 63Ї9 БКо мів Ака Уві Ак Бго пі Уві ви би 135 Ва ща
Зек Мет Аїда йви Гей Су беб обБеб маб Ага ее Таб обее Абе бек Ар ож 215 Іа сі кі вгОо вКОо Це) тує б31у 5еб Маї гео Ніб ніз Узі сво 1у ву 2-5 за КЕ зав ліз бів АбБ о А5р Суб Ті фез Бне й5ротТве аА5В беб одха Туб бак дат
Як а5а 255
Тук Ти Міх дрЕ Узі іБи бін бів Аз» Аве о Аха бе дів йо бій ЗР ца 5 вів мес рве бес Ті Азов іез бій Туб Уаі нів АБр о бец біб Сео Зіе А18 ке ке а цу Ту зег о дьи Бін Ар о АЗо бів Ар іви Абр ой Бве рне за 255 ма «2105 57 «211» 256 «212» Білок «213» Вірус жовтої карликовості злакових «4005 57
Марі ще іч Аз та Вк мук Ор у ху Ж ом г їз шк їх то
Мес вне сів Аа бів го буз щіу АРЕ УВІ їси Уві Бе дер уві вів ї 5 18 15
Хек оАва Твк обро Хек обне ВНе Твб Абе оТує бвб Узі бід бен о бег ге о 25 за
Ага Уві без Ак Бго БНе ББе ТР о Абе діа уві ТР ОАарД Ве Ака Тук
Я ща 45 їн обБій дкп сі Ті Ар огви вве Куб Уві аб ге бі Ве ви ей і За 55 Ва вчу 16 Бер фев Тве о БіУ біб его Ту баг Тер Абе БіУу Мі ву Ав та 75 на це Вго сви Зб тує ТВ обів геу сер Уві Абе Тр обіу іви із мі 85 Ов 5
Оіу тує ББе Вго Тве рРНе беб Тне о Ахи Біу а5р Ті Або обіп Ап РКО 108 5 що під їв Аг Ті Дюроіву беє Тне Меї баб Тве Ага бек Ра Тує б1у 115 ТВ їз
Чіп вне фен іс) древо Туг дей Те бее Бім сво Аза ух Аїв Ті Узі за 135 14 у іп бій БЦ: Сух вне бів бек біу Мех бів 5еб Рне Суб АБЕ РНе 145 ї5а 155 ї5а
Ми Ні Тугб аск сец Те Сух Вне бій Бе? Су ви вРОо Ага БО Аг 65 чув 175 тТРе Я Зае вво ізн Афа Рго бі Ро Туг без Ахо ев Ата Ре Біо
З що ї855 щча дій твгРобец се бі дге Мей Узі біб Ні Аби бій ів ів Ре Тве 195 за 25
Фіу цви Зв обек абр гів Те дев тує тує дя біз їеу узі мді 51
Кая 5 р і узі Бго Узі Атїа Рбе Тер Ахродів Ада 1у їі Те зіву Ні НіЄ ких 23 235 4 дів бі Бі СТ Туб ВБне зЗеєб Депо Зає ТУ Ті бій Ух Ті ву щі 245 БО ав 5 «2105 58 «2115» 519 «212» ДНК «213» Вірус кущистої карликовості томату «4005 58 пня тр ж хг гук, зе у у з ожк у я пефи с ох пу у жк пилу туге ОО чіжЕЕансвав ссаїзсавЕв заасвасвсх аввезасвав ссання асвКквядах що пЕавЕНісаи канисзссас ТсСхессттс вазсттсетв зсваазитсс вавттвиасї зб кхавтевсввс сасаїаясвв Квакасввах ссрааїсааи асаавессссЄ ВЕС ар їва казвессввв вестсевваа зве аску завианасисс тсввасВсва савеЗсвиаа аб веЕсісавстнЄ зсвЕДЯСссТ СвЕаСссСтнв асвеваваст сеї аВКка тво за св тсв вЕстсдВсся вабсвваКях зсстасанта їсвиїїся зрив тввх ЗО зієвссЕЕЇї скрварввис всравстсКЕ садевієтст ябевавасивс зас КХ Зо завсаавває бисувВсЗВсх твссссавіс вазесрава втаасвтатс зеаавезтвс зва пи ку ж Ух му у кр му туру и ходу лульмом жах жи уч фу ся ж у ссікзавеса сгвашасстї свадазаняа ввевавтав ще «2105 5 «2115» 351 «2125» ДНК «213» Вірус жовтої кучерявості листя томату «4005 5 зівіввватс сассїссева сТкавїксссс вазсствстс есвеаветтсв ссвтаста Ба всївстанає акхтвсВВЕс свсїЕзнваз астїазсизве ссвасвсВіЕ вевссасває ха
Сбазсосвеви зссхтВсаКс ТВЕсЕсзаве вессвсвасх зодесваевс кассввисКи їіхе сабвассясту сссзсвсссв сетсвзавеї ссвссвааввВ стравстїсв асавессаха я саксавссву детвехвісс ссабсиКссз авясВсазає вадсваєвве сасвеакека кю серрсссатвВ сассреазнс ссвизасвса сзкаатвтах сдаавсестВ З БО «2105 60 «2115» 1056 «2125» ДНК «213» Вірус складчастості ріпи «4005 60 нснвазаатв ассстававх ссвеаавутс всасссвадви вовсссаакв висватааая пе їжисававвз аевнсївЕїс аїссссавсс звсаасвиа васаравссКс ссвсЕсвисе 128 вВівннщяиссв вкстстсссс бетвКсвсяя ссївтвсавя аавевастсв зстевВисвее 188 севАтЕНесо овес тассв сВЯВЕЄТсЄ весовЕестс ВЕС Кство сВссВКЕКаЄ АВ висаївассзЗ виарсввВсхЄ твааствакс зсалесеєсва адлававсає свасастваа Зо сетайввтаса сесзслвстТеХ встівассса арбевасссе ввасаттсав ссавстсате ев взежаввкви состава яяяааекасскя стсвосдеКквВє ссадесктад вас я атвакскесте саазссвсснв пядсвакисе ВстствесВЕ Секвссввва сЕсТЕесваВ зва ссіссиссса всвавсетТсвс ЕКсссістис засаєнваеє ВесЕсВІВс СВО заз терасаввВЕ КВ трНає свссссваса вассстасєв зесвсссТщХ есе Х БИ зісвиенаєте сазаксткЕЕ сааїсЕсекс вавсксихса їрвсевсста свЕссавЕВУ БИ весаВтТватТВ ссдсссавсх СЕЕсЕВаВІх свавтсдеавЄ зсассвсвса ВСтсалева ТЕО звааствесЕ савссарсєва свессВваКЕ сввиЗстскВ сревувЕкаа врасаваксе тва вве ївнЕсї свївЕсссаз касеааввка веавБстТевеХ вЕБавсВсвЯ ТЕСТ ав сїскввассв вазаєхтєтс ветшасаста стстасвива зашевессвЕ УсСвЕБЕСТя зав назаяснсав зсвестстна сіїстсВвЕс сктвиеанВав севсвЕсяяе ЗаВКЕКссВа зов тввестЕвае Твзарисавс звазавоква сеззисвсва ззасвнесає заставка їх «звссзанни КазеаЕнеся зрезстсвВки ЗЕСТаЄ чаза
«2105 61
«2115 912
«2125 ДНК
«213» Вірус мозаїки гороху
«4005 61 чкіЕсасвкаВ соравсааес бсазвосассие ствзвассвов Сссвссвкке свозЕсаасе ца есте твс ссрсвссвсх звативестсе сії ствазе сссвтваанех сотсавевссх 125 «сТввсссссвВ стасгістов сові асьта стбетттста Ствоессесте ссдввсзвІс 18 ствЕВсКу сствеІасав ВсссНЕсТвс севесвсавс санссСтсаве ясенавісхе чав я Кіївсв шесствсска ввсосутвсав свасссквсс Євбасествс сзвассхеее ша ттншссст сазвЗаваеств сссвавасас веесзатсав совсааксвс ссттсаатка зе бастленеве тсетвВасва сатствркасе васвеввксс захснвасє встсвсстте «аа ссваїдссва Мтвсївасвс зсібвсстас сСінвсзвасх невазвсзав аск яко актЕЕтванк везеїкЕнясс Свої асїзї всрссавсвс свсжскКасє тастсвссав ще пассссвиис сссаксттво вотесвсени зааавсссся зісксавеви сееасстсах 5 ват ссввтвсссК виавтстасв вок Кветс вес тавтвх асесавесвов Ба авссвттссв висаяляКссе фест ВЕВК песеревттЕ тЕсескасве ТЕСТ та вссвавевав звствсаТссК ссбінасвсн васавсвзасх асісстста сао све тва
ЕКС Тідвяс зарассввав ссввЕссКеХ садесясти КтавсасЄєва ссскеааках їхав швіїсзеваВсс бїреавокОву свосствЕнї сассстрасв зараскаїва зве зов мс ТКЕсї аЕ Ії «2105 62 «2115 771 «2125» ДНК «213» Вірус жовтої карликовості злакових «4005 62 зтвітсзКтсв сссессКсЕ снвнсшВК сТТвЇвБссв асЕссвессК свв БА
Хевітїстїїсаз стсвітбатав сествавстс ссвскссвтв Жтстзвассс аїсссссвея зх свізвсавтїза савасїссв вівсвоссва засвазватсв вста СЕС ща ввів Свссавітсе сессасавва вас сСтевсвсвЕ сао АВ «ІсссеКїїт сстасассва аттастсек свасвеввис ссвсововее вгасЄсессї 380 зосЕЕстссз стяВХважка сесусвасви завсссанаас бесвсажевв сетежесаєе зва вівссвассс вис ств свавсавЕке сузсссвнаї зідасаєвав ср сввса аа ззваивстсв їсавзсзвса пато сзалеснеса КреВВТеКе свапаваско зва стасвоскнсс вестсасвтн сс кваааВЄ есе ссасЄ Вас кВ вазах ещ
СТКВСсКсЄтК ВЕССТсаКеТ вресаЕеесЄ СтТваннсва СТВ ссвіаТввтЄ вав дЕЇсВЕчнес Ззвстастсу Кассивіскв себістваєа сассвввсв сСбасазаскав БО
СТВВЕсЕсКЕ ааввовтнсс вес севЕасВств ссеввсаїсас СКС св ЕВ ветввЕтнаай азс Казтсесає ястсавазна тестова тЕ а т «2105 63 «211» 389 «212» Білок «213» Агарідорвів ЄПпа1іїапа «4005 63
Меб уаї їі Аза Аза АТа Уаї Ціе Уві Рго во сту ев Сем РНе вав 1 5 їв 15 їі бЗаеб б1у їви Аїз чаї й5п сви Бе бій віз Уві Сув Ту Уві Без ! а еВ за
Та йги оБгбо бен баб рух дав о тне тує Абе Гуз Кі А5й Аг маїф Маї ав 45
Аіш бій Те о бео Тер обен бів бе уаї Те Те Узі Ар о тТкр оте Ата
В 5 ще
Біу чаї бух Тіе з5ів узі РН АТа Ар одой біб Те РНЕ дев Аг мех
Б5 за 75 ща
ЧЕУу уз Бі ні Афз Сен Узі Уві Сух АзпоНіз двв о беб Авр о Гіе Ах : 35 за 5
Теа бе) уві сіу Тко ів бецш віз бін аге бвб Біу Сух беу біу бе ща їх 118 дів во Аіз УВІ МеХ ух ух беб о бек бух РАБ сво) Кго узі їів біу
МТ 128 5 тгробек МЕ То о ВНе бее біб Ту Беб ББе реи БЦ Ак Ап Тез дід 138 35 ї48
У АБ Оіц Зб ТїКе Бей бух бек Біу се) ів Аве Гео бек Або ВВЕ 145 ї158 ї55 15 го ав о Бго БВе Тер Сев Аза Бей ре узі біз Чіу Те дев вве оте 155 178 175 піц йів сук се уз діа ді бі біз Ту АТ діа деб бен бів ген ї5о 155 їза
Бго їі го Або А5поуві ів Те ВРо Або Тв огух біу вне Уві черг
Ох аа ра
Аіа Узі бек ден Меї дРЕ бек Вп уві Бго діа Ті Ту др Мек таг
За і5 Ра
Узі твг оті йо бух ТВае зве бро вро Вго ТР ОМеЖ фви агБе фа РНе ак За 285 аа у» Біу ів го Зав оуді уві ні Уві Мі їі руб сСуз Мі бек мех
АВ 5 55
УЖ Ар ів го Бій ев Або Або Азїа 1165 Аза бій тер Суб Аго АБ зво век Уа ціп вне Уві Аза Бу до Віз Бей без Ах бе НІ Ті АІТа віз АБО
Зв ака 285 тВе вве Бо озіу чів бій Біб бів да бі Бі АБ Бво Ті бух бек 2 за ще іви діа Уві Уві ів; бек Тїго бів Суб Маі ем о їве о іво (іу Аїа їв
ЗУ зів ЗЕ ЗВ
МУ БВ о іви Ні тер оАів біп бейб Бе бе заг Тер оїу5 БЩіУу бе тТве 325 КЗ З
Ті его Ата іеовіу їв аїУ ів С3е Таб фец о Сух Мек бій тів ев
За 345 за і12 Аг оЗек Бек обіп бек Зі Ав оба ТНе бро йіз уз Уві Уві вро
ЗУ» за З55 дів ух Рг ух дви дав Мі Ні Бго біб Зеб бек ее бів ТР Бі
Бе 5 ЗВО
Тв ти БУ; пів Сух «2105» 64 «2115» 281 «212» Білок 5 «213» тішютпапспев а1тра «4005 64 меї аіз бу тнє Ак о Тве баб бек ій АгБЕ Аха АБВ АБИ бів ев суб ї З 18 ї5 твк А) уаї дів діа так одіз Або АВ дев бух Адхо БіУу ів вна Меї 28 25 В
УВК ев офеу бек су РН уз ЩІ Бе Уві Суб РНе дів бів Уві ее за йо тів ТНК Аїв Мі дів Тгбо бі» во Ті6 Меї Уві зво ву ве Бго Те ща 5 8
Бей Ту Меб Агро 118 АР фер цзіу дп феу Туб біу Ні Кі ів бу 65 за 75 ча біу зав УВІ Ті Теровбво Туб Бім іє Рго Сів біб бів 51 б1у бер хз зв 5
Зі Ні Таб офу« су АгРВ Аїа То Туб Го 5ег А5а Ні Ді дег ВКО ій 105 Іа
Ті вхо дів вВе рре Уві Мет їв бе) Аза без Ге біу ТВе Уві Ту 115 а 125
Уаї Аза бу5 бух Зі маї Ті ТБ Туг БРО їву Ген біу Бій Еву Тук 138 5 ї48
Тве о іфецз Аа Ні Ні ТТ АкЕ Ті дер Аг бек оАха Рго Аза дів АТа 145 158 ї55 ї5е 12 бів зас Меї вуз бін йіз Маї Агев Уві Фів Те 01 вух дп оїев : їв5 178 їв а" їви ТіЄ МОЖ вне Вго Бін бір Тебе Аве заг Ту Ах біу Аг оте зва за за вв то Бе вух бух пі Бе УВІ Ні їн Аз Бен бін бек Ні Бе
Ох ва 258 вго Ті УВЕ РРО Мет ів ів Твне біу Те Ніз ів Аіз їго АгЕ Гув зів 45 же піу Те вне АкЕ Уві Агв бро Уа бро фе Тве уві рух Туб бву Рга їа 25 не аа
Бе ів дхй Тв оАхв Ар отТго Те Убі йБр бух Те АхроАБр тує У) 35 ВО а чуУу5 МеЖ ТТ Ні дов іс тує Уві йге дп оїви Рго Аїв зегб зів вух
Ой за З
Ре їв) БІу Зак Те лей Аки обев Гу 25 зва «2105» 65 «2115 303 «212» Білок «213» б5Басспакошусев сегеуївіаеєе «4005 65
Ммеї Бае УВІ Ті бі АбБ вне ву Тук Тук во аби бек УВІ ви Уві і 5 ча ї5 узі Кец Аіїз без Аїаз (3у Суз Чіу Бе Ту Біб мві Ті Аїа Зее Те ж 25 Зо меш оСух Тв без Сі Бім бух бій НЄ бе Аза бій Тео Те Те АТЗ їх 8 45
АгЕ Су Ва Тує Ні УВІ Меї КУ Бей Меї бен бі зей ар уві Ту а 55 ва
Уві уві бі бі: бі Ахпобеу віз бух бух БкКо Туб ее Меї їі діз 78 ув ща
Ази нів щіа бе Тв ока дав ї18 Ре МежЖ ів біу Абе Т16 вне ББо
Во я З5 вге зу Су ТВк Уві Те дід Ух КУ бе ви БУ Тує Уаі БрРОо вБе ча зО5 ца їви 1у Тер оБне Меї дів їви бев біу ТВгб оТує Рве фвоу Азр Абе бек 115 128 15
Ту5 Аги Бій Зі і ЩіЄ АБО Те цею Аа буз ЗУ Ки Бій А5а Узі 132 Ух їла їж ГУ Ап о СУуХ АГ АЇЗ Ка; о їкБ Уві ве БрРМ Зі бі ТНК осАрв бек 145 ща 155 1658
Ту Те баг ові Вей ТВе Меб ву го Бе бу» уз 51у Діз пе ніх це а 175 вин іа біп Бій біУу бу ЯТІ Бко Ті УЗ) Бгро Узі Уві Уді бак АБп їве 85 і938
Те баб Тв обе) Уві бен Бе Гу тує 3у Мзі Бе дхй дв бі Су ї95 ОО З
Меї 115 У АгвоїТте веб обу РеО іє бЗегб ТВК бір оАяп се ТАК обух 21 І 22
Ази був 1165 біу Біб бе Аза біб бу Уві АР Азо бів МеТ Уві Ав їх ї З в; к ї І;
ЗВ -їа ах В
ТБ бе) їуз біз Ті Б1у Туб заг обро Аза Хі6 Ах" 5 тТве ТР сво 45 5 аа
Бге вго бій ів Ті бр був дів Аза гео сів Ні АхОо бух був Уві зва а5 Б
Акп бух ух Ме ух Ап Бі Ре Узі Ро бЗеб Узі заб їі бек дев в 23 85 дер о чаі йбп отТве Ні дев Бій біу зЗек обек Уві уз бух Мет Ні жна 295 зва «2105» 66 «2115 373 «212» Білок «213» Місгоштопавз ривії1а «4005» 66
Мей ТНе о Бко Тук БІ Тев Ре дхн Уві Уві бЗег бвк іви п1у Тук Уві ї 5 ча ї5 іївц вне Твге Аіз Тве Те о5ек о їве Узі ТВеоМеЄ ви Уві Бе дів її8 16 ви іву АБ о БКОо уві бек діа Ах оре тує дів Ак Суб Тне бер те вів вне Аза Сух Тер тк о тТве обее Сух Ббеб о бпе Т1е ТВРОБф АгЕ (БВ 55 БЕ іви дБ біу Маї був уаі АбБ уві Тве обі Або Аза вн Брови Ай
І. ТВ 5 що дів рео івс іє 16 Ме бек одха Ні5 уз Суб Ах беу Ахо Тер о Меї ща ЗЕ
Бе вец тгр бек беб дія фіе дб Так обіу бек Меб Бе ніх Уві біу їіва їх 115
Уві Ре о їУу5 Ага Узі Аіз бух бе БІ) Се Яга Уві Ті бБго ів вве ще а 155
Зі ТероЗіУ Су БЖ сви й5и бі ве Аза Ту Маї АБЕ АРо дев ОоТРо ж ІЗ 1
Зак Заг оАБр дід бек Ні Сер ївб о Зегоїго Сів бій бек бій 0) о Аре 145 158 155 їв
АБЕ Агроїви Аза дів Аа То Таб обви їі рве бро Біб «3у Тве Аг їх що 175 тв ве йкви де дай іх ців ва щем кв їв дам Ук дів Ії 5 вк
Же озБпи вав АгЕ ви Су жа г ог аа Ве ом Ух ва ув кВ 1858 ї85 19й іу ви бі го Меб дів біу БІ їі іву ке бго дее ТВгб бує Бі ї95 ав 05 іви Аів їв» іву іви Аг Біб бек дів уз ВіУу біу Біу Тут Туг Ага з Ма 215 В їж Піє Ма Ахо Ме ТОгб їі ія Ту Тме й5у Аза Ах пфу Бу БгО 225 з38 25 248 іви був «Чі АТО Аза гео бі ТВК Ак обу РВЕ біу бі Беви ді бує
МАХ аа 55 сі бій ів обго Уаії діа Тег оСуб НІВ Май Ні Бе Ах о Уді Ве бек
ЕВ дао а ніх бух ар Уві вБО Аза Зі Я ар біз й5о бів Уві 530 лів го
Бе ФВ з
Ма. тер обу дея ТРО Аб"в їм Сук Аза дз Ме еВ Зі Аза Суб Аїв шого а 308
Зек Аза зі Бій вне Біб біу Уві Аге о бБіч Тео бе Те Зевб 01у Те
За ЗІ Ки
Аів чаї бро без обу5 ТВгобій ТБ оАів Без Абв Су РНе РБе уві це 335 за З
Фів бі сен і Суб Ма1Т Ту Уві віз Суз дев Заг Тве Аза Ре бе
Бк 345 За вій ТУ Узі Аїз Сух АТЗ Аза Уві Оїу діа АТО Маї тів Аз б3п тТВе 5 за ЗБ вер ово Аза Тк твор «2105 67 «2115 314 5 «212» Білок «213» Могбіеге1!1іа а1ріпа «4005 67
Меб Заг Ті біу бег обебБ о Ажха РКО Уві еп ів АТв йіз ів бе рве ї З КТ ї5
Ві Тук се Не УЗ іо бро абЕ УВІ Це Аїа бе фе бро обі ув о «а за іш іп Бне бен Азв Куб Сух Хіе Ма УаЗЇ фев Те АЇВ о тТйе Бе Те аа Я
Меж бек Узі Аів біт бух Бе тів зЗег Її Узі Сух віз Бей бе) дв за 55 «а чу Ага Тут Уаї Се Ави Бук Узі Уві баб йгБЕ Сен о БВе зЗее рн Гей в те 75 ва
Аіз віз АРЕ БРо бух бі Маї Тнб Туб іуб їі Узі бі біб Біб Міз я за ч5 іецс Ахробує туго рго аїа тів Уві УВІ Суб хв Ні Бій баб Зегб Ме їди ще що
Аво мес Мет Узі це Біб АгРвоОУНі Бе Рго Куз Ні Суб Уві ув) Мет ї15 128 285 іа Був бух БІ Бер їву Тугб Ве бро ВН іа біу Меї Ре Мет Гуз п 138 35 148 івн баг дав Аїа Ї16 БВе Зв дер Ага Бу Аа Ні гух У АЇВ ГЕ 145 Іа ї55 їБО сів хек Таб о тТве біз діа маї АЇв дер оМеї Гуз бух Ні йхпобеє Чі 188 198 175
Ті їв бів не о Бго біб Бу Твгодке о бег АК ів Ав Ку діа Абр тка 155 158 ів Кей беО вве ух бух БІУ Афз Бе Ні ви ЗВ Се бів АТЗ бій 7 їх за 285
Сер Вге бів мац Бео їі Ті Хев бій Єіу Туб бег Ні БГів Туг кр жа 5 аа ев озекК бух йгбЕ Туб Бе вро БіуУ біт БМ ев БІО ТІВ Аве о УЗІ ец ай КТ 35 ча
Бі Ве Ше бео Те Те ощіУу ес о тве Тиг оАбов Ар о уаі АБИ дав Кей
Я 25 255
Ме АБ бух ТР АКА АБИ беу Меб беб Бу Ні Кв фу 3) меж Або; ; Ба Кок та зжегоцій тТуг бе Заг бек Те Аза бій Ах 51у бек о тТве Ніх Тв Ав аЯ5 КІ ях зів АЖ бі АТ суб его Твеодіз тик Зае біе бу дев тн Аби оАзо аа зах ще діа 16 ТвК обу АКе о дрЕ ТВ ОВРо губ бір 05 зів «2105 68 «2115 391 «212» Білок «213» Вгассіва парив «4005 68
Меб віз Меї дів Аіз йів Аіз Мі Ті Уа)і Рг ів БІіУ Т16 ви Ре і 5 ї8 5 на (тв бе біУу бе Уві Уві деп їви Се Бій Аїа УВІ Кує Ту Уві 28 «5 о ів Ті Аг орг без Беб бух дай Тве оТує АБк вуз Кі Ах АгЕ Уві
ЗУ чо я чаі Аіш щі Твгосеб їгв о сец біб Се Маї те 18 УВІ Ахо тк отТво за дк БО діа ЩІ1у Ма уз ЇТе бів ві Бе АїЗ йзроАхр бій ТВг ВВЕ Ахп дере
Уа 75 88 мес щіу Буш 30 Ні дів Мей Уві Маї Сух Ап Ні АРК бебР дар тів 7 д5 За 5 да ТР во Уві біу ТРо їі і дів Бій Ягве баб бі Був ву віх зва 145 ма
За" лід сви віз уві Меї ух суб зегб оБеак іух Бра сец вго Уві Те 115 їза 385
Щі тТРробве МеєЄ ТевБовВнНе бек Бій Ту ій РН їв Віз Абе Ан Тер
Уха 5 ї4а діа вуз Або біб бек ТВе реи фуб заг о біу се (іп дсв ген Аза Вр ї45 їча 155 ї58
Ве БеРо АБв обео Ве Теросез Аїв ем Бе Уві 3» Бу ТР дев вве т ув 175 тве оці Аз огУує фео Бу» АтТа Аза бів біо Тук дів Аза бек Заг бій їва 185 із іви Бго Маі го Ага Аво Уві із Тів Бо деЕ Те Гуз фу Ба Уві
МУ ща 5
Зав дів Уві Чег Ав Меї АгРе обеб Бе маї ВгРо ІЗ її Туб АхВ мех 1 15 о
Тае УВІ Аза ів бро Куб їве Бог Бга БрРо БРо ТвбоМеЄ ви Абе ев вах 38 35 Дав ие ух У біз Ро Зег Уві Уві Ні Уаї НІ Хів бук бух Ні бек і ах 5 аз
Мас уз до ви РеО бід бек Ах АБО йіз бі бів Біа ТР Суб АгЕ з5а з ато в кт ТУ ціх лю ска Моя же її їж: Дод ти ії Ж Ж З г
Азв ій Бе уві Аза Бух Аа А їй іез АБО бух Ні Те дія Аа 75 ща -ЩУ
Ахо о їВе Бпе рео БІУ БІВ уз Бі Мі Ахи (16 біу АРЕоргОо лів фу 2 зо95 ще
Зев оіви вів Узі Узі Уві бек Тго Аза Сжа ів їв Тнгб осв оіу вів
Зах 318 335 Зх
Меб фу РЕ фе Ні ТКроЗве Або ви РБе зЗаб бБек їв їУу5 бБіу Ті 355 зза за5 лів ви ев А1а8 Бе біу ів) біу Щі ів Твг?Роївн о Сух мех бій тів
ЗАВ 45 за цен хі де бек бегв бій бек бі: Абе о 5ве Те Бго віз Туз Уві АТа 355 за ЗБ
Рей дів бух Рго бух Авроїуз Ні бій бегв біт бак беє оба бів отТве 398 375 38
Сн маї зі зір ух Бій губ зи а «2105 69 «2115 390 «212» Білок «213» Вгассіва парив «4005 69
Ме Аза Мек Аїа віз Аїа Узі їі Уві РКО сем БІУ Щ3іе Бе) Ре вне
А р щ ї5
Тія Хве о біу ву Уаі Уві Аяп ів їбзи біб Аїа Ї165 Суб Тук Уві їв а 5 За
Ме АР РгОо фев бек губ дк ТК оТуб Аки о їфух Фів лез АРЖ Уві Уві 4в 45
Вів ФІ те без їв осез Біб бе) уві Тк бів У АБО тва о їБр АїВ
Ба ь Ба
Зіу уві (У їі Зіч Улі Рв ліз АхО Аяа біб Тве РВЕ Аа дгв Ме й а тй хо піу су біш Ні Аіз гео узі Уві Суб Аби оНі АгББоЗагб йо о Кі1е Ахр ча ч
Ткробве Уві Біу ТРро о ї16 ївц Аза біб Ага о беб біж Сух во віу Бак
ТЕЗ 195 ща
Аійж ів дів Уві Меб бух уз бек Зег бух Бе гео го Уві Пе о1у
Й 15 ї28 125 ітвобес МеЄ Тр оБНе Боб б3іб Ту баці БВе їз сім йгеоАбп тро ліз 8 135 148
Був АзробБіц 5еєб ТВе офі) суб Баг о Фіу їв Біб Агш о беи дл АБ вве 15а 55 їве бро дев обро вне тро Бен Аза бу Бе Узі біб фу ТВР Абе вва тТНне 155 КЗ 175
Фіз віз їУ5 ен бух ліз Аіз 01 біз Туб діз Аз ев бек бій ев за і8х їч8
Ве мі Бго аг Ахп УВІ бе її Рго Абе Тв Бук бі Бне маї деб їа5 ЖЕ еВ
Аза Уві Бег дан Меї АРЕ бек Ве Узі ВгО АЇа Ї1е Тук А5в о Меб тТвК . 18 Мі5 ей чзаї Мів ї1е Рко фух ТНе бек оБко Ро Бко Тве МеєЄ во Аве ви РНе й з аа КО у Ху іп о БгРо баб уві Узі нів Ма1і Ні іє суб Су НІВ Бег Мех ах 5 255
БУБ А ВО Бео бій 5еВе Азов Азрв лі Сі віз бій ТР Сув АВ Ах
Би 05 та бів вне Узі Афа Суб Ах Аза тек іви дк бу Ні іє АЗіз Аїа вав
ЇВ в В їБеоБйе Ркообіу чів бів біз бів ди Ті бі Або бко їі бух бек аа З що іги дз Уяі Уві їен бек Те о бюв бух іву во їі їм 5іу Аїа мех
ЗІ» з18 315 328 ук вне їв Ні ТО бЗег дай фе) не Зак хе ТРр обу Бі» Ті Аїа 325 з3а ЖК вве бев АЇв сен біу ем БУ ів Ті ТВбоїев Сує МебЄ ія Ті фев
ЗАВ За З5а
Се АгЕ зе Бек біб Бек бій Аг бек Те Кго із уз Узі Маі рео 355 за 655 дій суб РРО Сух Ар ода Мія деп АхО бее біу бек беб бев бій Те 178 375 зва зі чаї Біб був бін був
Зо За «2105 70 «2115 361 «212» Білок «213» Рруєорпєпога іптевтапвь «4005 70
Ме діа тТне гує бі) Аїа Туг Уві БО РРО ТВР Се ТР Осо іа ух ї з їз 15
Аг Заг осей бго ух дхо Сух Ре біз діа бБег УВІ Бо бе о Зег Гей 2 5 за
Тук Тує ТР Уві АРЕ Сув іво Уаї 138 Аза уві їз без тТве Рв Ту о 45 їзи Аза Ту Аїа АБЕ АЇЗ ви Бе а УЗ ОО беє Бе Тер АТа бе 58 25 ца лезроАіа Аїа сви Суб Тйг оБіУ Ту Ті фра їв бів б1у гів Узі Бе їтчЧо БіУу вне рн тТнге о Уді біу ні5 А5р діа біу Ні біу Аів Ра бек 5 що ча дев оТук нів сез сез дай вне УР Уві Бі ТНе РВе МеЄ НІХ Зеб беу 188 185 а
Їів сво Тве Рго Бе біз Бек Тгр вух Геу Те ніх Абе Ніз Ні нів
115 ї20 155 т Би Тег обіу дя» їі АБр одгв АБО біо уаі Ре ТУб Бко бій йка 13е 135 ї4а іуз Віз АБО Ах Ні Бго ви бев АРЕ деп фев (12 їву АїЗ їв бу
ЇЖУ ї5а ї55 ща із Аїа гр оБез АТїа тТугб Бе) Уві З1ц б3іу Ве го Бго Абвобух Уві їх іа 195
Авп Ні Рів дев Бге Рее БЦ бро бер БНе Уві БЕ бів Узі баб дів їча 185 138
Уві Маї 116 бег о сез іеу діа Ні рве бе Узі Аїз біу беи беє Те 155 зай 25
ТУуківи бБев іви ЗіБ іо 3у ве бух ТВ Мет Аза Сів Туб Ту? Тук 23 аї5 в біу Бко Маї Бне Узі Рне О1у Заг Меї іо ма! 16 Тве Таб Ре Бей и 3 235 чав
НІ Мі дн Азо бій іш Тег оРеОо То Туб АТ Ар обеє Щі) Тк оте
Ах з5а ще
Тук чаї суб 01у дей ви Бек бек уяї Ав АБИ Хек Туб щіу Аїа Ге
Ба 255 аа
Ті Або Ай фео ес Ніє дхз Те Бішж ТвВе Мі Ів 16 нів НІ се л5 2ща ТЕ фе бо Ті. Те Бгео Ні Туб фу бво бух вух із ТВг о Аіа Аа вве за Зх зав
Міх бій Аіш ВНе Бе Біб ев Уві Агв оїуз Заг йо 01) вго5 т1в Тіе 385 ща 15 зх ув Аіа Ре Ре Ак; Уві біу Аг во тТук Абе дей Туб Бім Уві ді
325 350 35
Ах бів бБІШ дів ух Св РН Те ої уз Біб Аїз бух дів дів ТВе з48 345 358 щі Аз Аза Аза бух ТР ої в дек Те 355 за «2105 71 «211» 418 «212» Білок «213» Тпаіїіазввіовіга ргецшдопапа «4805 71
Меї Туг Агв во Тве бек Тв вне іву Ті« Ав ео дів Ра бег бек 1 5 їв 15 заг Кі6 Ахп Аза ВБе бек Бго Біб АБ о Бебе Бго дев ТВе ЇТе Таб огух за 5 за зег Куб Уві бів 5ег ТВе оуаі фей обго бі Бко ТвеБ бух АБродв (ву 35 зла 45 деп овне ви бій РБео бій їв Ар бів Аа АВ сво Ту сви Яр Ар
Уа АБ Тне бго го АероАЇа ЗРу Тебе 116 Меб вух Меб сей рго ух та 78 75 ще
Зіц Твгбовне Аа Ті Ахро Те Аїа Те 5ев бе) оіїу Туб РВе ту мех ще за 5 ах Ме Аїв бів Уві Маї бек бер Мей Тнгб ген о бец АБп Аїа Ті Уві) їй 185 мВ
Те о Бее АхВ Бін Тук нія дів Бей ре івц РБО іви бів діа дів так що 125
Маї іє рео Рве біз ге без дів Ту Ре дія Мет ТРВ Сух Мет Тго 1 Те ії
Суб Це оБіу Ні Абе Аза сіу нів бБеботйг Мазі зве бує ТВе бух Тео їх ї58 їв5 168 їіс й5а Аг Уві Уві біу Зі Мі Азз Ні баб Узі Уві Су сви тТаг їх зу 175
Бей вве уві веОо ТКрозів Мес зек Ні ДРЕ фу Мі НІ без Аа НІ зва їд5 ща
Ап НІЖ Є бід уз АбротТук бек Мі5 бує Тер тує баб АР Ахр ові 135 зав за
Мне йхр або ів Бео бій їецу Туб ух Таб вп О1у Тук Аа Рео АгЕ гій 15 еВ
Мас меб бів уез Бкео Бе беб Ту Ре Меє Тук зо) Аза зво зЯіУ Тв а КУ 35 а т ав обу біу нія Уві Уві Ре Ту 031У агЕ МеЖ Тго 835 БІу Уві 5 258
Зев осей бів бує бух БНе Ар Аза Аїа Її бЗег уві Аза Уві баб Сух
Й ща Б а віза тТвг о АТа бір бек бе) ТРе ОМеЖ Аки Мет біу Те дів Ар вне тТве яка «ва 285 чаї Уві Сух Мет Маї Бео ТР во Уаф бу БебоТер о ТРО сви Бе мех я Фах зо
Уві ївг оту Бе) бій Ні ніх Заб бів Абр о біу бух беи Ту Тис дар
Зах що 315 338 ій Тве рве тве вне бій бух біу Аза вве 01 ТВБ Узі АЗроАгЕ бек 325 з3за 35
Ту 01у гу ве Її Ай Аг Меї Зег» ніх нії Меї Меб Ахр біу нів зав 45 з5а заї маї ніх Мія ей Бе вне біб Ав Уві без Ні Туб Ак ївь и
Зх Ба їа5 дів дів тигобБіц віз Сез о уві ух бі Меб А5о Ба ТВБ обі біл ух
ЗВ Зу5 ЗО
Мі бе Тут рух Туг Се дер твгобго Ахробре дкй Аза бі іє чаї
За Зах ща
Ахпи пі вне АРЕ Ахо АБ Тео Не зи УВІ Бів ім бій вза (Те ух
Зах БК чії5 ев Б «2105 72 «2115 363 «212» Білок 5 «213» Руєпіцют іггедиіаге «4005 72
МеЄ Аїд 5вб Те беб йіз Аза Бій Ахв Аіа Аїа бро Тує 530 Бе ро ї 5 та ї5
За сец Тве Бі: Т16 Куб Абе ВІЗ фе) Рге 5еб бій Сух вве біз дів я йо за
Зав оМаї Бко бе бек бе) Туєб Ту Те Аа АгЕ бЗеб ге Аза гео їз ча 45 біу бак ів Аїв Маф дів ви бен Тує біз Абе йіз ївеи Бго без Уві
ЗО 55 о, піп Аа Ахи Аїа ен Бей дев віз Тс оте Су: ТВ" ООІу Тум УВІ ву 7а 75 о їви іп б1у Тіз Уві Ве їер о біу Ре бБе Те уві 01у Ні Ав Суз це за 5
1 ніх зіу Аіз Ре зег дгРе баб Ні Узі Сей ха Бе б5ег узі іу 185 їа5 Ще
Тне осей Меб Нія его Кі Тіе бец Те рве Бе біб баб їБробу5 бе
ТЗ 158 ТЗ бек Нік Адгв Ніх Ні Ні Суб дп Те біу Аби 18 АБр ух Ав бів 136 135 Та
Ше овре Тук Рго біп Агре бів АЇа Ахр бек НІВ Бго Узі бек Агв Міх 145 158 155 ї5а8
Бен мазі Меї Бек гео Фу беб Атз ТРО Ре АЗа Тук ев вне Азїа щу 198 ту внме го РРО АБИ ТвгОМеК Ах Ні Бпе бай БрРО Те Бі Аівз Меї тує ї88 155 ї13а чаі дев Аге У ді Аа Уві ТіЄ Ті бек обец біу Узі ей РБе дід їз а ща5 вне вів Бі іо ТУубБ зе? оїук во Тве вва узі іви біу Ве ТвкеотТве їв їй з2В
Меї Аїа її Тує Тук вне бі Вго Бе Бве (18 вве Аза тТвнБ о Меж ву ку 3 35 за чаї Уві Те Тве вве ген нів Ні дай Ар обіц біб тТве вВко ТеротТує ай ва
Аів Аква Бін тер о Тве Тує Узі бух БІУ Або гео бек бег мах Ар 7 ява 55 за
Агнобев о туг Ч1у АТ бецу Тіє дер АБ ес бег нів Ап о Її1і6 б1уУ тн 275 зва 255
Ні5 бів іе ні Ні Гео Бе о вго Се ФІ во нів Тук Бу ви Авт я 95 Зо дер Аза Тве Аіз АЇв Рне дів фу Діз Бе Ро бі) ес ущі Аквогує 505 За іх З
Ахп ді дів вго Кі Т18 Бго тТве о Ббе вне АР Ме Аїв Аза Мет губ
Аіа їує тує щіу уйї уаії Авр ТР Ар Аа бує ТК ВБе їнк обеи фуз зав Зх 358 «б АЇВ ух Аза Аза АТа ух ТБ сук бер о5ер

Claims (17)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Рекомбінантна клітина Вгавзіса парив, яка містить екзогенні полінуклеотиди, які кодують Д12- десатуразу, ф3-десатуразу або Д15-десатуразу, Аб-десатуразу, А5-десатуразу, Л4-десатуразу, Аб-елонгазу і Аб-елонгазу, де кожний полінуклеотид функціонально зв'язаний з одним або декількома промоторами, які здатні спрямовувати експресію вказаних полінуклеотидів в клітині, і де клітина містить ліпід, який містить жирні кислоти в естерифікованій формі, жирні кислоти, які містять олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, Фб-жирні кислоти, які містять лінолеву кислоту (ЛК), ФфЗ3-жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК), докозагексаєнову кислоту (ДГК), стеаридонову кислоту (СДК), ейкозапентаєнову кислоту (ЕПК), докозапентаєнову кислоту (ДПК) і ейкозатетраєнову кислоту (ЕТК), і де щонайменше 70 95 ДГК, естерифікованої в формі триацилгліцерину (ТАГ), знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ.
2. Клітина за п. 1, в якій ФЗ-десатураза і/або А15-десатураза є грибковою десатуразою.
3. Клітина за п. 1 або 2, яка має одну або більше з наступних ознак: ї) загальна сума арахідонової кислоти (АРК), ЕПК, ДПК і ДГК становить від 7 до 25 95 від загального вмісту жирних кислот в ліпідах; ії) рівень нових Ф3-жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить від 9 до З бо; ії) щонайменше 80 95 ДГК, естерифікованої в формі ТАГ, знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3
ТАГ.
4. Клітина за будь-яким із пп. 1-3, яка має одну або більше, або всі з наступних ознак: ї) рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить від 2 до 16 95 або від 2 до 15 95, ії) рівень олеїнової кислоти в загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить від 1 до 30 95, Зо від З до 30 95 або від 6 до 30 95, або від 1 до 20 95, або від 30 до 60 95, ії) рівень ЛК в загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить від 4 до 35 95 або від 4 до 20 95, або від 4 до 17 95, їм) рівень АЛК в загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить від 4 до 40 905, від 7 до 40 95 або від 10 до 35 95, або від 20 до 35 95, або від 4 до 16 95, або від 2 до 16 95, м) рівень у-ліноленової кислоти (ГЛК) в загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить менше 4 9о, менше 3 95, менше 2 95, менше 1 90, менше 0,5 95, від 0,05 до 7 9б, від 0,05 до 4 95 або від 0,05 до З 95, або від 0,05 до 2 95, мі) рівень СДК в загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить менше 7 9о, менше 6 95, менше 4 95, менше 3 95, від 0,05 до 7 95, від 0,05 до 6 95, від 0,05 до 4 95, від 0,05 до З 95 або від 0,05 до 2 95, мії) рівень ЕТК в загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить менше 6 9о, менше 5 95, менше 4 95, менше 1 95, менше 0,5 95, від 0,05 95 до 6 95, від 0,05 до 5 95, від 0,05 до 4 95, від 0,05 до З 95 або від 0,05 до 2 95, мії) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТгА) в загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить менше 4 95, менше 2 95, менше 1 95, від 0,05 до 4 95, від 0,05 до З 95 або від 0,05 до 2 У або від 0,05 до 1 95, їх) рівень ЕПК в загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить менше 4 9о, менше 3 95, менше 2 95, від 0,05 до 10 95, від 0,05 до 5 95 або від 0,05 до З 95, або від 0,05 до 2 95, х) рівень ДПК в загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить менше 4 95, менше 3 95, менше 2 965, від 0,05 до 8 95, від 0,05 до 5 95 або від 0,05 до З 95, або від 0,05 до 2 95, хі) рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить від 8 до 20 95, від 10 до 20 9в, від 11 до 20 95, від 10 до 16 95 або від 14 до 20 95, хії) ліпід містить Фб-докозапентаєнову кислоту (22:5А57и10и13,16) у вмісті жирних кислот або ліпід не містить об-докозапентаєнової кислоти (22:525710и13и16) у вмісті жирних кислот, хії) рівень загального вмісту насичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить від 4 до 25 95 або від 4 до 20 95, від 6 до 20 95, від 4 до 60 95, від ЗО до 60 95 або від 45 до 60 95, хім) рівень загального вмісту мононенасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот у ліпідах становить від 4 до 35 95 або від 8 до 25 95, або від 8 до 22 95, Хм) рівень загального вмісту поліненасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить від 20 до 75 95 або від 50 до 75 95, або від 60 до 75 95, хмі) рівень загального вмісту Фб-жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить від 35 до 50 9б, від 20 до 35 905, від б до 20 95, менше 20 95, менше 16 905, менше 10 95, від 1 95 до 16 95, від 2 до 10 95 або від 4 до 10 95, хмії) рівень вмісту нових Фб-жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить менше 10 95, менше 8 95, менше 6 95, менше 4 95, від 1 до 20 9б, від 1 до 10 9б, від 0,5 до 8 95 або відО,5 до 4 95, хміїї) рівень загального вмісту 0З-жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить від 36 до 65 9б, від 40 до 60 9б, від 20 до 35 9б, від 10 до 20 95, хіх) рівень вмісту нових Фф3-жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот у ліпідах становить від 9У до 33 9б, від 10 до 20 Об, від 20 до 30 9б, від 12 до 25 9б, хх) співвідношення загальний вміст Фб-жирних кислот:загальний вміст 0З-жирних кислот у вмісті жирних кислот в ліпідах становить від 1,0 до 3,0, від 0,1 до 1, від 0,1 до 0,5, менше 0,50, менше 0,40, менше 0,30, менше 0,20, менше 0,15, ххі) співвідношення вміст нових Фб-жирних кислот:вміст нових Фф3-жирних кислот у вмісті жирних кислот в ліпідах становить від 1,0 до 3,0, від 0,1 до 1, від 0,1 до 0,5, менше 0,50, менше 0,40, менше 0,30, менше 0,20, менше 0,15, ххії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти в ЛК Д12-десатуразою щонайменше 60 95, щонайменше 70 95, щонайменше 80 95, від 60 до 98 95, від 70 до 95 95 або від 75 до 90 95, ххії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК в СДК дб- десатуразою щонайменше 30 9065, щонайменше 40 956, щонайменше 50 906, щонайменше 60 95, щонайменше 70 905, від 30 до 70 95, від 35 до 60 95 або від 50 до 70 95, ххім) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення СДК в ЕТК-кислоту дб-елонгазою щонайменше 60 95, щонайменше 70 95, щонайменше 75 905, від 60 до 95 9б, від 70 до 88 95 або від 75 до 85 95, ххм) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЕТК в ЕПК А5Б- десатуразою щонайменше 60 95, щонайменше 70 95, щонайменше 75 905, від 60 до 99 95, від 70 до 99 95 або від 75 до 98 95, ххмі) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЕПК в ДПК АБ- елонгазою щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, від 50 до 95 95 або від 85 до 95 95, ххмії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ДПК в ДГК даі- десатуразою щонайменше 80 95, щонайменше 90 95, щонайменше 93 95, від 50 до 95 905, від 80 до 95 95 або від 85 до 95 95, ххмії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти в ДГК щонайменше 10 95, щонайменше 15 95, щонайменше 20 95, від 10 до 50 95, від 10 до 30 95 або від 10 до 25 95, ххіх) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЛК в ДГК щонайменше 15 95, щонайменше 20 965, щонайменше 22 9565, щонайменше 25 95, від 15 до 50 95, від 20 до 40 95 або від 20 до 30 95, ххх) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК в ДГК щонайменше 17 95, щонайменше 22 95, щонайменше 24 95, від 17 до 55 95, від 22 до 35 95 або 60 від 24 до 35 96,
хххі) загальний вміст жирних кислот в ліпідах має менше 1 95 С20:1, хххії) вміст ТАГ в ліпіді становить щонайменше 70 95, щонайменше 80 956, щонайменше 90 95, щонайменше 95 95, від 70 до 99 95 або від 90 до 99 95, хххії) ліпід включає ДАГ, хххім) ліпід містить менше 1095, менше 595, менше 195 або від 0,001 до 595 вільних (неестерифікованих) жирних кислот і/або фосфоліпіду або по суті не містить їх, ххху) найбільш поширеними видами ДГК-вмісних ТАГ в ліпіді є ДГК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12), ххумі) ліпід включає три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18), ххумії) рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот в екстрагованих ліпідах становить менше 1 95, ххумії) рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот в ліпідах становить від 7 до 20 95.
5. Клітина за будь-яким із пп. 1-4, яка має одну або більше або всі з наступних ознак: ії) Д12-десатураза перетворює олеїнову кислоту в лінолеву кислоту в клітині з ефективністю щонайменше 60 95, щонайменше 70 95, щонайменше 80 95, від 60 до 95 95, від 70 до 90 95 або від 75 до 85 95, ії) Ф3-десатураза перетворює Фб-жирні кислоти в ФфЗ3-жирні кислоти в клітині з ефективністю щонайменше 65 95, щонайменше 75 95, щонайменше 85 95, від 65 до 95 95, від 75 до 91 95 або від 80 до 91 95, ії) Дб-десатураза перетворює АЛК в СДК в клітині з ефективністю щонайменше 30 95, щонайменше 40 956, щонайменше 50 96, щонайменше 60 96, щонайменше 70 95, від ЗО до 70 95, від 35 до 60 95 або від 50 до 70 95, їм) Аб-десатураза перетворює лінолеву кислоту в у-ліноленову кислоту в клітині з ефективністю менше 5 95, менше 2,5 95, менше 1 95, від 0,1 до 5 95, від 0,5 до 2,5 95 або від 0,5 до 1 95, м) Аб-елонгаза перетворює СДК в ЕТК в клітині з ефективністю щонайменше 60 95, щонайменше 70 95, щонайменше 75 95, від 60 до 95 95, від 70 до 80 95 або від 75 до 80 95, мі) А5-десатураза перетворює ЕТК в ЕПК в клітині з ефективністю щонайменше 60 95, щонайменше 70 956, щонайменше 75 96, щонайменше 80 9565, щонайменше 90 95, від 60 до 95 95, від 70 до 95 95 або від 75 до 95 95, мії) Аб-елонгаза перетворює ЕПК в ДОК в клітині з ефективністю щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, від 50 до 90 95 або від 85 до 95 95, мії) А4-десатураза перетворює ДПК в ДГК в клітині з ефективністю щонайменше 80 95, щонайменше 90 95, щонайменше 93 95, від 50 до 95 95, від 80 до 95 95 або від 85 до 95 9, їх) ефективність перетворення олеїнової кислоти в ДГК в клітині становить щонайменше 10 95, щонайменше 15 95, щонайменше 20 95, від 10 до 50 95, від 10 до 30 95 або від 10 до 25 9, х) ефективність перетворення ЛК в ДГК в клітині становить щонайменше 15 9о, щонайменше 20 956, щонайменше 22 95, щонайменше 25 905, від 15 до 50 905, від 20 до 40 95 або від 20 до 30 95, хі) ефективність перетворення АЛК в ДГК в клітині становить щонайменше 17 956, щонайменше 22 Уо6, щонайменше 24 95, від 17 до 55 90, від 22 до 35 95 або від 24 до 35 95, хії) клітина містить на щонайменше 15 95, щонайменше 20 95, від 15 до 30 95 або від 22,5 до 27,5 95 більше д3-жирних кислот, ніж відповідні клітини, позбавлені екзогенних полінуклеотидів, хії) Аб-десатураза переважно десатурує а-ліноленову кислоту (АЛК) відносно лінолевої кислоти (Лю, хім) Дб-елонгаза також має активність Л9-елонгази, Хм) А12-десатураза також має активність А15-десатурази, хмі) Аб-десатураза також має активність Ав-десатурази, хмії) Ав-десатураза також має активність Аб-десатурази або не має активності Аб-десатурази, хміїї) А15-десатураза також має активність Ф03-десатурази щодо ГЛК, хіх) Ф3-десатураза також має активність Д15-десатурази щодо ЛК, хх) Ф3-десатураза десатурує як ЛК так і/або ГЛК, ххі) фо3-десатураза переважно десатурує ГЛК порівняно з ЛК, ххії) рівень ДГК у клітині базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти в ДГК в клітині щонайменше 10 95, щонайменше 15 95, щонайменше 20 95, від 10 до 50 905, від 15 до 30 95 або від 20 до 25 95, ххіїї) рівень ДГК у клітині базується на ефективності перетворення ЛК в ДГК в клітині щонайменше 15 95, щонайменше 20 95, щонайменше 22 95, від 15 до 60 95, від 20 до 40 95 або від 22 до 30 965, ххім) рівень ДГК у клітині базується на ефективності перетворення АЛК в ДГК в клітині щонайменше 17 95, щонайменше 22 95, щонайменше 24 95, від 17 до 65 95, від 22 до 35 95 або від 24 до 35 96, 60 ххх) одна або більше або всі десатурази мають більш високу активність щодо субстрату ацил-
КоА, ніж щодо відповідного субстрату адцил-фосфатидилхоліну (ацил-ФХ), хххі) Аб-десатураза має більш високу активність Аб-десатурази щодо АЛК, ніж щодо ЛК як жирнокислотного субстрату, хххії)) Аб-десатураза має більш високу активність Лб-десатурази щодо АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж щодо АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, хххії) Аб-десатураза має щонайменше в 2 рази більш високу активність Аб-десатурази, щонайменше в З рази більш високу активність, щонайменше в 4 рази більш високу активність або щонайменше в 5 разів більш високу активність щодо АЛК як субстрату, порівняно з ЛК, хххім) Аб-десатураза має більш високу активність щодо АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж щодо АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, хххм) Аб-десатураза має щонайменше в 5 разів більш високу активність Аб-десатурази або щонайменше в 10 разів більш високу активність щодо АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж щодо АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, хххмі) десатураза являє собою фронтенд-десатуразу, ххумії) Аб-десатураза не має активності Д5-десатурази щодо ЕТК, що виявляється.
6. Клітина за будь-яким із пп. 1-5, в якій екзогенні полінуклеотиди ковалентно зв'язані в молекулі ДНК, такій як молекула Т-ДНК, інтегрованій в геном клітини.
7. Клітина за будь-яким із пп. 1-6, яка містить щонайменше два різні екзогенні полінуклеотиди, кожний з яких кодує Дб-десатурази, які мають однакові або різні амінокислотні послідовності.
8. Трансгенна рослина Вгаззіса паривх, яка містить одну або більше клітин за будь-яким із пп. 1-
7.
9. Трансгенне насіння трансгенної рослини Вгазв5іса пари5, що містить одну або більше клітин за будь-яким із пп. 1-7.
10. Спосіб отримання екстрагованого ліпіду рослин, що включає стадії: ї) отримання насіння за п. 9, і) витягування ліпіду з насіння.
11. Спосіб за п. 10, який додатково включає очищення ліпіду.
12. Ліпід, отриманий способом за п. 10 або 11. Зо
13. Макуха, отримана з насіння за п. 9.
14. Спосіб отримання харчового продукту для споживання людиною або твариною, що включає змішування одного або декількох з клітини за будь-яким із пп. 1-7, трансгенної рослини за п. 8, насіння за п. 9, ліпіду за п. 12 або макухи за п. 13 щонайменше з одним іншим харчовим інгредієнтом.
15. Харчовий продукт для споживання людиною або твариною, що містить один або більше з клітини за будь-яким із пп. 1-7, трансгенної рослини за п. 8, насіння за п. 9, ліпіду за п. 12 або макухи за п. 13.
16. Клітина за будь-яким із пп. 1-7, трансгенна рослина за п. 8, насіння за п. 9, ліпід за п. 12, макуха за п. 13 або харчовий продукт, отриманий способом за п. 14, для застосування при лікуванні або попередженні стану, при якому ПНЖК надають сприятливий вплив.
17. Спосіб отримання етилового ефіру поліненасичених жирних кислот, що включає переестерифікацію ТАГ в ліпідах, екстрагованих з насіння за п. 9, з отриманням етилового ефіру. Зоо
ЗЦЕТИКОА у фен 1ТАВ маланій-КоА ' ! М 12 дес ра 1 У ТюЮ чим Ї Зб дес му у-- 1я:3АВБВИ З (ГПЮ М 1азАВОИВАЛЮ. нен ЗУ вло де епа х Ї о Авело са «Ме дес | ву . ) І аб А КаАТЯ 0 хазАВЛ ТА ДОЮ (о3 ія іБісСЛюЮ ЗАЛА Ме | ла дес Або | АВ »/ я ОА ЛЯ АРЮ МАЛЯТ ЛОТ я пе БАБА ТЛА Я 3 вис | А ера З2ЗАЗАВЛЗЛЕОЛОІДПЮ ння ЗАБАВИ ЗВ дя дає ! | де де гола АВ 369 ДОЮ. фен УВА ВА ВВ . ЇХ окисвенмя
Фіг. 1 їх пий КЕ : УЕОХ т ще «ех во же 7 ж КН ; М Ен аВО с Пшклакй йеречаяо ска ОНЕУ я Мана КЕН КАК У І З яю ї Вино В БАК З : ; ї КОЖЕН ї годна, ВЕК : я ШОВ ОО щ ї їх х х ж . ї БО сн ВК м хх как -Е ї З і : ЩЖОсЕ ВЕН ВУ а а» Ох : . 3 х 1 ї Ж НКИ ВК КО ПА «Ох х х З ї ї Е пе Ко САМО М жо Жук Ж х У ук : З З Е КЕКВ КЕКВ ОМ СЕ КАК ее й З х х 5 В ЩО І Ж ОК ЖАХ ШИ МКК КК КК КК вдмонккнв ВО ВХ ХХ тЕвов АК ря ль я ше ОО ООН о ШЕ Й 0. фев Кін о -- їі ш. АК УЖ КЕН И М кока З ЖЕ їх хх З ик КДУ УООї по КІ Іа КУ З 3 Ота х 5 А ОД ВО СИС ОА що МИ сао кі Я КІЗ Кі Е щ Уа . СКК ТК ще ди ще КМ е (о ї зе гук КІ щі дея -о ВХ ж х ВИ Ся 13 МУ не ЯКЕ Св Е ГА яке т 3 фіг. 2 їх ЩЕ бом І скЕ не Я ПевекадЕ тес кКМх ЗЕ . х УРАЛУ. ЖАН жень у 5 З НУ Я 0 Мокра Х 1 і : У ККУ Ю Он КВ - че 3; ї ї МХОСяКХ МНН ВЮ БО ФУ ВАК ІВ о ВО ЕЧВ О й. Кф г ! ; і ОК вк 5 МЕ ке шо ші ве З с Х, : і Ї у Ма свое ОДЖИКЕ, ве не; их ЩЕ АХ ші 5 Ї ї Е ОК В КК од Хе хх же КЗ гу : х х ї ГІ З КОС Ж ЕКО ЕОМ ЕК я СК КК М ОХ, ЕВ; тррею МОХ лин ЕС а МОНА М и те сю ж св ши и ії ге шк і МОЗ їв Ге я АЛІ Кв КО как Ї Ж 7 х ЩО х пі" й я ! ТЗ АКЕ гоз сук пух їй Щі ж ши тих ТАКІ КВ ще Як х Ж 3 і ОБР ДЕ гм Ще що КА: М КЕ М обо
Фіг. 5 км 53 пе їх БА М Ку 7 ге ех мк КО Ш ХК Тс г ОТКЕ - ху сгх ик РКО В Ки й 5 фдждиї ї й ї ї х З Мета Шо х пн ГАННУ Ї ї ГКІ І х 7 ї з їх з з | | це що я . ї З Х 5. і ; і і Я З кое Ж ї - й ї її 7 с ИМЯ о 5 онов ш ія х х : і ї Се ОО о ООН ен ех 5 5 хіх й ; Її ші ЯН я їх хх вижив хх ій в 5 ЕК їй в ЕН КМ ОО КК КВ о. | ще де ШЕ я і ж в: се шк жі їх її у о МІК КК: МЕНЕ їх ЖЕ МОЯ ХЕ ПО Ж оч і х гу Її КЗ ОКХ М Я: ОК З го КО Ж ЗА ВО чу І БИ 3 ів 4 | на Ем їх У м вох о НН Ї М ; ще . х ї І Б. Ну КО х 5 її 5 Мох а хх - Тож ? и г ЕВ зве ГЕ БК ва 1 КИ МАТ ях ВК
Фіг. 4
Фо ої »
! . БЕ | - а Ж « - ! . » з о : і ж . і ж " с
8 г. па 8 | Ї Ко тече що « т . ! і Гейв жо ше що1000фт | І . в й пи ва пря дгвхмханни нн 0008 : ке 2 ж . ж Ух . 0 а то ЯМ; Собтіія А Ту соїютьа Та Покоління. Агабіборвів Тз і Та
Фіг. 5 міт ой ма масо проти вмісту ДГК . у панеганному насінні ДизекОоре палала . Мак, у тео А ХУ ук со УКХ ут те ТАКУ У те АРКУ У кет ОКА ХУ кет у ух тку няні, . вн ння - ------ шт Е : КОХ ща 00 Ї У ОВ З Ї 1 ї хв Не ни кни и ХК Кк ххх З их ох зн ххх я а що 3 ай КК нях зн ня ОХ дження рн уже ше ше й Еш не її. я ш ш ш шк . . мне і. с ДК від загальних жирних КиелеУІ
Фіг. 5
ДІД ОО ОО 5 З ОККО ОО Ох ж п ДАВЕН ОХ ЗК ОКО УКОМ ПЕ За МО ОХ ХХ МЖК ОМ Й ШИ о о о. 55 . о : а : п
Фіг. 7 І; в їх : А ї Еш ший С ж : З ; еВ ; рю ч ан ФО СТЕЛІ Площа піку шара: вх е «т ї А ва а М | і ще х Б те -- Де ОСІ Площа піку УК | у г св м шщш «й. ще ше Вінійна (СВ) З - з пит вові Щи Площа НКУ о, ; щі Тл -е Дінійна СВ ; ! ще с Площа тку ї і 5 в ;
ге. ши | В. ! а 5 М 15 о 5 30 ; ї З ВО (олеатова кислота у загальних жирних кислетах)
Фіг. 8
ЩІ А ще - Ди кальфа ДЕСбета і ; А й Ц і 5 В 1 Тк 3175 ЕРИЯ ЗА 4 пу й та -е-д М (пропроміла) ж Дгклальфа А дгкебета : и ке А дл МАЛІ у У ще Удай Кене З кер сш х , Ж , зва їле с Зк ке т МЕ пе таз М (пропроміпе)
Фіг. 9
ОНА. ща ї М ск х ЕВ ! ОВ ЕІ . ши шиї її. ї в-во о и. ви «КО В. «В ХВ В ож нон нно Б БО жк Ж Вже Є Ж М о те а -х чо Я ж Б ою ою в ОВ о о б в со ша ж сб дО Кк ок ск оку Ком а с ха ОО чавзвввааввааа:ававачаав ка
Фіг. 10
КЕ РКО МАО Ре МЕНІ І х І ї Ї ї ї . 2 ї ї Ха , . . . . о. . , «Її Же Я с ОК одне йо ХХХ нев кове ке сви жен М я ВО пе а РЕ ов і ве Ба ї ї мем Ми еВ ес о щеців і: М КО виз ее СЕ ча ех ЕК ВОев х ях ЇМО МО
Фіг. 11 ФЕМ кінцевий з 4 інтрон ем ЗФЕнцений ра Фнгналоенрації 35 інтром каталази 5 3 01000 МОВ термінатор Бепайкі праметюр 55 4 00700000 Т-ДНЕ ліва меяів є КК МО5 термінатор. У м ль в дднннн НКО ОЙМ мегміцнн фосфотранефервза К що тк як те и я кн ВН он ввоміцин-канаміцин фосфотванофераза типу ВИТСМРУ прометор м Ще 7 х А ни фосфрано й х ЕС Я щу. є У КУ х о. ча ТИ МОБ термінатор Х пиши, ї шт. ВІРИ СК рова 3 й 19551 пара освов КК прин бісранніку ї сайт ЛЮЙ й ; що я н го є ТУДНК "Межа тМу дев в. : вк. з ех х лк права: леж и ж У. що у. Ж де ЗО. с и Ка вв Термінатор вв В яко я до В кое ШИН "оон Х х х х у вка я Ух ЯМУ лідер їх Е хх ТУ лідер і КК х і у х х : ОВ промотор ї г х 3 х ШИ гу ; . і У бюкедіни Вірна ва! У МАЯ, обернений (спейсер) у і й чаї МЕССМРІМОЮВО (необов'язковий!
Фіг. 12 о 204 в насінні Т2 м . я « су я 0 Значення, ; ж що різко відхиляються во он роееннтеь КУ " і С ; : їх ну МН й ! ! ! ; "за і нн КОМ Я-Й процентиль. п мені уххаханАКі кі . ! се с ; ї : же Я Медійна в т т ; , і ЩІ Фо 5 ; : ЩА 3-й працентиль чЕ ї ! ї є пдкх ол і т Що і шк Ж ой процентийь
В . « « 7 ро вав рт: ЗБЕ РЕМ Без УВЕ:
Фіг. 13 Ж уех 5 аиче о а КЕ та хо є І я в Середнє значення для 204 з насіння ТУ Ду пре тен Бе Ф . ще хіх 2 ї СЕ ав в
ФО . Фе ; | ; кл шо КІ ' ї ж ' ! с | : Фо Мей ! г г й МУК М Ко ди Кк фо КК фун кто фон ютер поосеоовння РЕ ща різ ЗБЕ У КРІМ базУюи
Фіг. 14 їй бу з рек та 0 в насінні 15 нн НК и КН НК ї ї ; о ї їЗ я Же Н « ; пд ї : ; о : ; с ; реє « з ї ; я : Ї Ж й р ; о : : їх : Е
3 . : ;
щ В. ! гз і м ! ; їх і : і | ! ще 5 і ще ї т. жи ї щЕ хк і ї ; ї : ! Ж Що фени : пяннкккдннннкну : ї йо х фх Її днях ї реле : жу ії Їееюкжюучнникий і і пий ї ! -х Кл з | : кино : 1 хх Ех т : фитит сеї т о. ї щих ; : і і ї пи ї її : : ї : жк : : ї ї ї ве І : ї мини : » ї Я « ї Ех ; ; ; ; Ж х ї роя І ж ; М " : ; : : : ; ; ; У нн ку нн рн Кк к у ес А А А нн нн нс дн сно осо фосс осо чан А тр нн нн роя Ух Ух Ех. ух ге сек ЕХ в БУВ 15 ЖМКУЄ ОКРЕМЕ без МОХ а
Фіг. 15 У ру. с ях ві х тА Ж» 20 Я в насінні 15 В ни а ве І і Ж х Ки Ж і 5 р ях ще х є лю дк х х ЖЕ з - кд ї ШО оф. ї й ТЕ ком 5 ї : : » «кХ сспклкйня длллляядляллАня пен нннк в печеня і І ; : і : : 5 ! ! рення і і рн нені ун м : Е і і Міжн і : 1 і їх Тл Кен і жжежєютюнннї ї с й. м ТЕ : ТА т фихліітмх 4 се у дн : ; де т й : і в Фисиицці ї ; і е і К с- г длпнннннномй і -У се ї : а : !
0. , є ф і дн чан рун А у дк пн няно няння какая ятати яння тн нтнн ння М й іс да КУ ух Ку ЗА ро р ІЗ ЗУ КРУ Бе«е У фіг. 16
UAA201803576A 2012-06-15 2013-06-14 Рекомбінантна клітина brassica napus, яка містить довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти, трансгенна рослина та насіння brassica napus, спосіб отримання екстрагованого ліпіду рослин, харчового продукту та етилового ефіру поліненасичених жирних кислот UA127917C2 (uk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261660392P 2012-06-15 2012-06-15
US201261663344P 2012-06-22 2012-06-22
US201261697676P 2012-09-06 2012-09-06
US201361782680P 2013-03-14 2013-03-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA127917C2 true UA127917C2 (uk) 2024-02-14

Family

ID=49756497

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201500277A UA117223C2 (uk) 2012-06-15 2013-06-14 Спосіб продукування довголанцюгових поліненасичених жирних кислот у рослинній клітині
UAA201803576A UA127917C2 (uk) 2012-06-15 2013-06-14 Рекомбінантна клітина brassica napus, яка містить довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти, трансгенна рослина та насіння brassica napus, спосіб отримання екстрагованого ліпіду рослин, харчового продукту та етилового ефіру поліненасичених жирних кислот

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201500277A UA117223C2 (uk) 2012-06-15 2013-06-14 Спосіб продукування довголанцюгових поліненасичених жирних кислот у рослинній клітині

Country Status (26)

Country Link
US (16) US8946460B2 (uk)
EP (2) EP2861059B1 (uk)
JP (3) JP6242882B2 (uk)
KR (2) KR102197208B1 (uk)
CN (2) CN104853596B (uk)
AU (4) AU2013273934B2 (uk)
BR (2) BR112014031362A8 (uk)
CA (2) CA3082388A1 (uk)
CL (2) CL2014003402A1 (uk)
DK (1) DK2861059T3 (uk)
EA (1) EA036786B1 (uk)
ES (1) ES2636487T3 (uk)
HK (1) HK1248989A1 (uk)
HU (1) HUE033766T2 (uk)
IL (1) IL236288A (uk)
MX (1) MX349678B (uk)
MY (1) MY187101A (uk)
NZ (1) NZ631702A (uk)
PE (2) PE20200448A1 (uk)
PH (1) PH12014502795A1 (uk)
PL (1) PL2861059T3 (uk)
PT (1) PT2861059T (uk)
SG (2) SG11201408362SA (uk)
UA (2) UA117223C2 (uk)
WO (1) WO2013185184A2 (uk)
ZA (1) ZA201500015B (uk)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7807849B2 (en) 2004-04-22 2010-10-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
CA3023314C (en) 2004-04-22 2019-12-10 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
AU2007291937B2 (en) 2006-08-29 2014-05-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of fatty acids
EP2283137A4 (en) * 2008-04-25 2011-12-14 Commw Scient Ind Res Org RECOMBINANT CELLS AND METHOD FOR THE HYDROXYLATION OF FATTY ACIDS
NO2358882T3 (uk) 2008-11-18 2017-12-23
EP2454278B1 (en) 2009-07-17 2019-06-19 BASF Plant Science Company GmbH Novel fatty acid desaturases and elongases and uses thereof
BR112014031362A8 (pt) 2012-06-15 2022-06-28 Commw Scient Ind Res Org Lipídeo de planta extraído, processo para produzir lipídeo de planta extraído, célula hospedeira, método de produzir semente, farinha de semente, método para produzir um produto alimentício, uso e processo para produzir ésteres etílicos de ácidos graxos poli-insaturados
US9701989B2 (en) * 2012-12-21 2017-07-11 E I Du Pont De Nemours And Company Recombinant microbial cells that produce at least 28% eicosapentaenoic acid as dry cell weight
US11718577B2 (en) * 2013-12-18 2023-08-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid compositions comprising triacylglycerol with long-chain polyunsaturated fatty acids
US9725399B2 (en) 2013-12-18 2017-08-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
US9752165B2 (en) * 2014-02-10 2017-09-05 Cellulosic Ethanol Technologies, Llc Processes and systems for recovering oil from fermentation products
SG11201610596PA (en) 2014-06-27 2017-01-27 Commw Scient Ind Res Org Lipid comprising docosapentaenoic acid
EA037184B1 (ru) * 2014-06-27 2021-02-16 Коммонвелт Сайнтифик Энд Индастриэл Рисерч Организэйшн Липид, содержащий докозапентаеновую кислоту
CA3228580A1 (en) * 2014-06-27 2015-12-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid comprising docosapentaenoic acid
BR112016030971B1 (pt) 2014-07-07 2022-09-27 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processo para produzir um produto de óleo e processo para produzir um produto de óleo a partir do óleo da planta
US10760089B2 (en) * 2014-11-14 2020-09-01 Basf Plant Science Company Gmbh Materials and methods for increasing the tocopherol content in seed oil
CN105029096B (zh) * 2015-08-27 2018-08-17 广州市优百特饲料科技有限公司 一种幼禽脂肪粉及其制备方法
CN105053569B (zh) * 2015-08-27 2018-12-18 广州市优百特饲料科技有限公司 一种功能性脂肪饲料添加剂及其制备方法
AR109245A1 (es) * 2016-05-12 2018-11-14 Basf Plant Science Co Gmbh Métodos para optimizar la producción de metabolitos en plantas genéticamente modificadas y para procesar estas plantas
WO2017210426A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Cargill, Incorporated Fish feed prepared from oilseed plants producing omega-3 fatty acids
CN114836567A (zh) * 2016-06-16 2022-08-02 纽希得营养澳大利亚私人有限公司 优良种事件油菜ns-b50027-4
NZ749656A (en) * 2016-06-16 2022-12-23 Nuseed Nutritional Australia Pty Ltd Inbred transgenic canola line ns-b50027-4 and seeds thereof
WO2018039740A1 (en) 2016-09-02 2018-03-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Plants with modified traits
US10951422B2 (en) 2017-02-22 2021-03-16 CTIA—The Wireless Association Mobile message source authentication
CN107114369B (zh) * 2017-03-24 2020-01-21 浙江大学 植物磺肽素-α在提高植物灰霉病抗性中的应用
KR101976468B1 (ko) * 2017-11-30 2019-05-10 주식회사이맥솔루션 요소수 점적 결정법을 이용한 고산가 유지 폐자원 활용 고순도 불포화 지방산 메틸 에스테르의 제조방법
US11913006B2 (en) 2018-03-16 2024-02-27 Nuseed Global Innovation Ltd. Plants producing modified levels of medium chain fatty acids
CN108315394A (zh) * 2018-04-23 2018-07-24 沈阳师范大学 甜高粱蔗糖合成酶基因的表达检测方法及扩增引物
PL3560342T3 (pl) 2018-04-25 2021-02-22 Nuseed Nutritional Us Inc. Kompozycje wielonienasyconych kwasów tłuszczowych wzbogacone w dha
EP3784044B1 (en) 2018-04-25 2025-07-09 Nuseed Nutritional US Inc. Dha enriched polyunsaturated fatty acid compositions
CN108452156A (zh) * 2018-05-02 2018-08-28 郭书安 一种治疗冠心病的口服液
EP3586642A1 (en) 2018-06-21 2020-01-01 Nuseed Pty Ltd Ala enriched polyunsaturated fatty acid compositions
EP3586640A1 (en) * 2018-06-21 2020-01-01 Nuseed Pty Ltd Dha enriched polyunsaturated fatty acid compositions
EP3586641A1 (en) 2018-06-21 2020-01-01 Nuseed Pty Ltd Dha enriched polyunsaturated fatty acid compositions
EP3586643A1 (en) 2018-06-21 2020-01-01 Nuseed Pty Ltd Dha enriched polyunsaturated fatty acid compositions
US12037652B2 (en) 2018-09-11 2024-07-16 Nuseed Nutritional Australia Pty Ltd Methods of identifying DHA Canola NS-B50027-4
WO2020055763A1 (en) * 2018-09-11 2020-03-19 Nuseed Pty Ltd Methods of identifying dha canola ns-b50027-4
KR102216753B1 (ko) * 2018-11-27 2021-02-17 주식회사이맥솔루션 팜유 또는 동물성 폐유지를 이용한 고순도 불포화 지방산 메틸 에스테르 제조방법
CN109796328B (zh) * 2019-03-14 2022-03-25 浙江工业大学 一种高纯度香榧籽油金松酸的分离方法
WO2021041570A1 (en) * 2019-08-26 2021-03-04 Nuseed Pty Ltd. Brassica juncea line nubj1207
CN110476816B (zh) * 2019-09-29 2022-10-14 西南大学 一种快速获得葡萄桐幼苗的方法
TW202523283A (zh) 2019-10-25 2025-06-16 美商努賽德營養美國股份有限公司 富集的多元不飽和脂肪酸組成物
CN111235170A (zh) * 2020-01-17 2020-06-05 华中农业大学 qMYR2基因在调节或筛选稻米中油脂组分含量的应用
BR112022015690A2 (pt) * 2020-02-07 2022-10-18 Isca Tech Métodos de produção de feromônios de insetos
WO2021211990A1 (en) * 2020-04-17 2021-10-21 Wake Forest University Lipid compositions and methods of preparation thereof
JP7162352B2 (ja) * 2020-05-01 2022-10-28 株式会社東洋発酵 外用組成物
WO2021226242A1 (en) 2020-05-05 2021-11-11 Nuseed Pty Ltd Aquafeed for improved fish health
JP2023539686A (ja) * 2020-09-01 2023-09-15 ザ ステイト オブ イスラエル ミニストリー オブ アグリカルチャー アンド ルーラル ディベロップメント アグリカルチュラル リサーチ オーガニゼイション （エー．アール．オー．） （ボルカニ インスティテュート） ナツメヤシの木から単離した組成物
AU2021399149A1 (en) * 2020-12-18 2023-07-13 Rothamsted Research Limited Increasing the accumulation of epa and dha in recombinant camelina
CN112816635B (zh) * 2020-12-31 2023-08-18 绿城农科检测技术有限公司 一种黑木耳中测定脂肪酸的方法
CN114208843A (zh) * 2021-12-03 2022-03-22 浙江万里学院 一种植物生长调节剂、提高香蕉果实耐冷性的处理方法及验证方法
CN115786370B (zh) * 2022-09-29 2025-09-05 华中科技大学 一种促进植物种子超长链脂肪酸积累的基因的应用
GB202217740D0 (en) 2022-11-25 2023-01-11 No Regrets 2050 Ltd Modified plants and plant cells
EP4512395A1 (en) 2023-08-21 2025-02-26 Bio Even Composition comprising flavin adenine dinucleotide (fad), l-gsh, atp and myristic acid, alone or with a drug
EP4559470A1 (en) 2023-11-22 2025-05-28 State Research Institute Centre for Innovative Medicine Use of bacillus subtilis lysate for the immunomodulation of the respiratory system cells
WO2025207712A1 (en) * 2024-03-26 2025-10-02 Cargill, Incorporated Lipid enriched oleosome composition
WO2025207721A1 (en) * 2024-03-26 2025-10-02 Cargill, Incorporated Lc-pufa enriched oleosome composition

Family Cites Families (286)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3484155A (en) 1966-02-07 1969-12-16 Donald L Praeger Head mounted electric squint light
FR1564863A (uk) 1968-03-12 1969-04-25
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
EP0131623B2 (en) 1983-01-17 1999-07-28 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
US5504200A (en) 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
EP0154204B1 (en) 1984-03-06 1994-01-12 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US5420034A (en) 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
ZA871352B (en) 1986-02-27 1987-08-12 The General Hospital Corporation Plant cells resistant to herbicidal glutamine synthetase inhibitors
MA20977A1 (fr) 1986-05-19 1987-12-31 Ciba Geigy Ag Plantes tolerant les herbicides contenant le gene de gluthathione S-Transferase
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5177010A (en) 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
SE455438B (sv) 1986-11-24 1988-07-11 Aga Ab Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
CN87100603A (zh) 1987-01-21 1988-08-10 昂科公司 抗黑素瘤疫苗
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
US5932479A (en) 1988-09-26 1999-08-03 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
WO1991002071A2 (en) 1989-08-09 1991-02-21 Dekalb Plant Genetics Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
EP0472712B1 (en) 1990-03-16 2001-09-12 Calgene LLC Novel sequences preferentially expressed in early seed development and methods related thereto
US5451513A (en) 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
US5877402A (en) 1990-05-01 1999-03-02 Rutgers, The State University Of New Jersey DNA constructs and methods for stably transforming plastids of multicellular plants and expressing recombinant proteins therein
US7135614B1 (en) 1990-08-30 2006-11-14 Cargill, Incorporated Brassica or helianthus plants having mutant delta-12 or delta-15 sequences
US5861187A (en) 1990-08-30 1999-01-19 Cargill, Incorporated Oil from canola seed with altered fatty acid profiles and a method of producing oil
US5518908A (en) 1991-09-23 1996-05-21 Monsanto Company Method of controlling insects
PH31293A (en) 1991-10-10 1998-07-06 Rhone Poulenc Agrochimie Production of y-linolenic acid by a delta6-desaturage.
US6683232B1 (en) 1991-10-10 2004-01-27 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of γ linolenic acid by a Δ6-desaturase
US5614393A (en) 1991-10-10 1997-03-25 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase
US6355861B1 (en) 1991-10-10 2002-03-12 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of gamma linolenic acid by a Δ6-desaturase
EP0616644B1 (en) 1991-12-04 2003-07-02 E.I. Du Pont De Nemours And Company Fatty acid desaturase genes from plants
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
CA2113557A1 (en) 1992-05-15 1993-11-25 Kazunaga Yazawa Gene which codes for eicosapentaenoic acid synthetase group and process for producing eicosapentaenoic acid
US5683898A (en) 1992-05-15 1997-11-04 Sagami Chemical Research Center Gene coding for eicosapentaenoic acid synthesizing enzymes and process for production of eicosapentaenoic acid
US5798259A (en) 1992-05-15 1998-08-25 Sagami Chemical Research Center Gene coding for eicosapentaenoic acid synthesizing enzymes and process for production of eicosapentaenoic acid
US6372965B1 (en) 1992-11-17 2002-04-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants
US6872872B1 (en) 1992-11-17 2005-03-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
DE69410247T2 (de) 1993-03-11 1998-09-03 Canada Nat Res Council Verbessertes regenerationssystem für getreide
CA2092588C (en) 1993-03-26 2008-07-08 Narender S. Nehra Enhanced regeneration system for cereals
US5362865A (en) 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
GB9324707D0 (en) 1993-12-02 1994-01-19 Olsen Odd Arne Promoter
GB9403512D0 (en) 1994-02-24 1994-04-13 Olsen Odd Arne Promoter
US5545818A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene Inc. Expression of Bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids
DE4435392B4 (de) 1994-10-04 2008-02-07 Immuno Ag Verfahren zur Trennung von vWF in hochmolekularen vWF und niedermolekularen vWF
GB9515941D0 (en) 1995-08-03 1995-10-04 Zeneca Ltd DNA constructs
WO1997004881A1 (en) 1995-07-28 1997-02-13 Henkel Corporation Polyester oligomer acrylates
ATE319296T1 (de) 1995-12-14 2006-03-15 Cargill Inc Pflanzen mit mutierten sequenzen, welche ein veränderten fettsäuregehalt vermitteln
US6342658B1 (en) 1995-12-14 2002-01-29 Cargill, Incorporated Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof
US7541519B2 (en) 1995-12-14 2009-06-02 Cargill, Incorporated Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof
EP0856060A2 (en) 1996-06-21 1998-08-05 Monsanto Company METHODS FOR THE PRODUCTION OF STABLY-TRANSFORMED, FERTILE WHEAT EMPLOYING $i(AGROBACTERIUM)-MEDIATED TRANSFORMATION AND COMPOSITIONS DERIVED THEREFROM
WO1998001565A1 (en) 1996-07-10 1998-01-15 Sagami Chemical Research Center Process for producing icosapentaenoic acid by genetic recombination
US7109392B1 (en) 1996-10-09 2006-09-19 Cargill, Incorporated Methods for increasing oleic acid content in seeds from transgenic plants containing a mutant delta 12 desaturase
WO1998018952A1 (en) 1996-10-30 1998-05-07 Nippon Suisan Kaisha, Ltd. Process for producing fats containing highly unsaturated fatty acids containing selectively concentrated docosahexaenoic acid
US6194167B1 (en) 1997-02-18 2001-02-27 Washington State University Research Foundation ω-3 fatty acid desaturase
AT406373B (de) 1997-02-27 2000-04-25 Immuno Ag Verfahren zur reinigung von faktor viii/vwf-komplex mittels kationenaustauscherchromatographie
EP2175031A3 (en) 1997-03-04 2010-07-07 Suntory Holdings Limited Process for preparing highly unsaturated fatty acid and lipid containing highly unsaturated fatty acid
US5977436A (en) 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
US6432684B1 (en) 1997-04-11 2002-08-13 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
CN1253588A (zh) * 1997-04-11 2000-05-17 艾博特公司 在植物中合成长链多不饱和脂肪酸的方法和组合物
US6075183A (en) 1997-04-11 2000-06-13 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6051754A (en) 1997-04-11 2000-04-18 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
US6428990B1 (en) 1997-04-11 2002-08-06 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
US5968809A (en) 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US7589253B2 (en) 1997-04-15 2009-09-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Fatty acid epoxygenase genes from plants and uses therefor in modifying fatty acid metabolism
US6235529B1 (en) 1997-04-29 2001-05-22 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for plant transformation and regeneration
US6566583B1 (en) 1997-06-04 2003-05-20 Daniel Facciotti Schizochytrium PKS genes
US6140486A (en) 1997-06-04 2000-10-31 Calgene Llc Production of polyunsaturated fatty acids by expression of polyketide-like synthesis genes in plants
EP0987936A4 (en) 1997-06-12 2001-03-14 Cargill Inc FATTY ACID DESATURASES AND MUTED SEQUENCES THEREOF
ZA986574B (en) 1997-07-23 2000-01-12 Sanford Scient Inc Improved plastid transformation of higher plants and production of transgenic plants with herbicide resistance.
US5912416A (en) 1997-08-05 1999-06-15 California Oils Corporation Safflower products with very high levels of unsaturated fatty acids
ES2321248T3 (es) 1997-09-12 2009-06-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Regulacion de la expresion genica en plantas.
DE69836552T3 (de) 1997-09-30 2014-10-09 The Regents Of The University Of California Herstellung von proteinen in pflanzensamen
GB9724783D0 (en) 1997-11-24 1998-01-21 Inst Arable Crops Research Novel polypeptides
CN1283230A (zh) 1997-12-23 2001-02-07 布利斯脱大学 去饱和酶
US20030152983A1 (en) 1997-12-23 2003-08-14 University Of Bristol Desaturase
US6100447A (en) 1998-02-12 2000-08-08 Applied Phytologics, Inc. Method of barley transformation
US6838594B1 (en) 1998-03-20 2005-01-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Limnanthes oil genes
JP2002528048A (ja) 1998-03-20 2002-09-03 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー リムナンテス属油の遺伝子
US6492108B1 (en) 1998-03-26 2002-12-10 Incyte Genomics, Inc. Delta-6 desaturase homologs
JP2002516093A (ja) 1998-05-29 2002-06-04 オハイオ ユニバーシティー 脂肪酸、その誘導体および下流産物を合成するための組成物および方法
AU4564399A (en) 1998-06-12 1999-12-30 Abbott Laboratories Polyunsaturated fatty acids in plants
PT1086236E (pt) 1998-06-12 2007-12-12 Calgene Llc Ácidos gordos poliinsaturados em plantas
JP2002523048A (ja) 1998-08-20 2002-07-30 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 共役二重結合の形成に関係する植物脂肪酸改質酵素の遺伝子
EP1107975A4 (en) 1998-08-24 2003-07-16 Univ Rutgers SYNTHETIC FATTY ACID DESATURASEGEN FOR EXPRESSION IN PLANTS
US6403349B1 (en) 1998-09-02 2002-06-11 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
US6913916B1 (en) 1998-09-02 2005-07-05 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US20030163845A1 (en) 1998-09-02 2003-08-28 Pradip Mukerji Elongase genes and uses thereof
US6677145B2 (en) 1998-09-02 2004-01-13 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
AU1097900A (en) 1998-10-05 2000-04-26 Abbott Laboratories Delta 6 and delta 12 desaturases and modified fatty acid biosynthesis and products produced therefrom
AU6503699A (en) 1998-10-05 2000-04-26 Abbott Laboratories Altered fatty acid biosynthesis in insect cells using delta five desaturase
US6609661B1 (en) 1998-10-06 2003-08-26 Kabushiki Kaisha Nippon Conlux Bank-note processing device
EP1121150A4 (en) 1998-10-09 2003-06-04 Merck & Co Inc DELTA-6 FATTY ACID DESATURASE
JP4182192B2 (ja) 1998-11-26 2008-11-19 独立行政法人産業技術総合研究所 イコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸の生合成に関与する酵素群をコードする遺伝子
US6864077B1 (en) 1998-12-03 2005-03-08 Edgar B. Cahoon Membrane-bound desaturases
JP2001095588A (ja) 1998-12-04 2001-04-10 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth 緑藻のω３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及びその利用
US6825017B1 (en) 1998-12-07 2004-11-30 Washington State University Research Foundation Desaturases and methods of using them for synthesis of polyunsaturated fatty acids
US8003772B2 (en) 1999-01-14 2011-08-23 Martek Biosciences Corporation Chimeric PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7247461B2 (en) 1999-01-14 2007-07-24 Martek Biosciences Corporation Nucleic acid molecule encoding ORFA of a PUFA polyketide synthase system and uses thereof
US7217856B2 (en) 1999-01-14 2007-05-15 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US20070244192A1 (en) 1999-01-14 2007-10-18 Martek Biosciences Corporation Plant seed oils containing polyunsaturated fatty acids
US7211418B2 (en) 1999-01-14 2007-05-01 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7271315B2 (en) 1999-01-14 2007-09-18 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US6448473B1 (en) 1999-03-05 2002-09-10 Monsanto Technology Llc Multigene expression vectors for the biosynthesis of products via multienzyme biological pathways
EP1035207A1 (en) 1999-03-09 2000-09-13 MultiGene Biotech GmbH cDNA molecules of the members of gene family encoding human fatty acid desaturases and their use in diagnosis and therapy
JP2002538826A (ja) 1999-03-18 2002-11-19 ザ ユニバーシティ オブ ブリストル カエノラブジチス・エレガンス由来の多飽和脂肪酸（ｐｕｆａ）エロンガーゼ
IL146782A0 (en) 1999-06-07 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh 6-acetylenase and 6-desaturase from ceratodon purpureus
WO2001002591A1 (de) 1999-07-06 2001-01-11 Basf Plant Science Gmbh Δ6-desaturasegene exprimierende pflanzen und pufas enthaltende öle aus diesen pflanzen und ein verfahren zur herstellung ungesättigter fettsäuren
WO2001004636A1 (en) 1999-07-12 2001-01-18 Ohio University Mammalian cells expressing desaturases and elongases
JP3648134B2 (ja) 1999-07-13 2005-05-18 Ａｂｂ株式会社 自動塗装装置
US7070970B2 (en) 1999-08-23 2006-07-04 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US7531718B2 (en) 1999-08-26 2009-05-12 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
ATE383433T1 (de) 1999-08-26 2008-01-15 Calgene Llc Pflanzen mit veränderten mehrfachungesättigten fettsäuren
US7067722B2 (en) 1999-08-26 2006-06-27 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
EP1214418B1 (de) 1999-09-10 2008-03-05 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients GmbH Nukleinsäure aus tetrahymena kodierend fuer eine delta 6-desaturase, ihre herstellung und verwendung
FR2798391B1 (fr) 1999-09-15 2001-12-14 Inst Nat Sante Rech Med Enzyme thyroidienne nadph oxydase, acide nucleique codant pour cette enzyme et leurs applications
DE19950589A1 (de) 1999-10-20 2001-05-23 Gvs Ges Fuer Erwerb Und Verwer Elongasepromotoren für gewebespezifische Expression von Transgenen in Pflanzen
JP4221476B2 (ja) 1999-11-19 2009-02-12 独立行政法人産業技術総合研究所 イコサペンタエン酸生合成遺伝子群をクローニングしたプラスミド及びイコサペンタエン酸を産生するラン藻
AU782788B2 (en) 1999-11-22 2005-08-25 Plant Bioscience Limited Enhanced transgene expression by co-expression with a suppressor of post-transcriptional gene silencing (PTGS)
US6620986B1 (en) 1999-11-23 2003-09-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Transformation of Ricinus communis, the castor plant
AU1499601A (en) 1999-11-25 2001-06-04 Basf Plant Science Gmbh Moss genes from physcomitrella patents encoding proteins involved in the synthesis of polyunsaturated fatty acids and lipids
GB9929681D0 (en) 1999-12-15 2000-02-09 Implyx Ltd Transgenic insect
JP2001169780A (ja) 1999-12-15 2001-06-26 Natl Inst Of Advanced Industrial Science & Technology Meti ドコサヘキサエン酸生産細菌の遺伝子
GB9929897D0 (en) 1999-12-18 2000-02-09 Slabas Antoni R Improvements in or relating to conjugated fatty acids and related compounds
US20030172398A1 (en) 1999-12-21 2003-09-11 Browse John A. Novel delta-12 desaturase and methods of using it for synthesis of polyunsaturated fatty acids
EP1254238B1 (de) 2000-02-09 2009-09-16 Basf Se Neues elongasegen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren
US20040157221A9 (en) 2000-03-07 2004-08-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 25869, 25934, 26335, 50365, 21117, 38692, 46508, 16816, 16839, 49937, 49931 and 49933 molecules and uses therefor
US6686185B1 (en) 2000-03-07 2004-02-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 25934, a novel fatty acid desaturase and uses therefor
US7411054B2 (en) 2000-03-07 2008-08-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 25869, 25934, 26335, 50365, 21117, 38692, 46508, 16816, 16839, 49937, 49931 and 49933 molecules and uses therefor
US20020115178A1 (en) 2000-07-17 2002-08-22 Rachel Meyers 16816 and 16839, novel human phospholipase C molecules and uses therefor
US6492577B1 (en) 2000-03-16 2002-12-10 The Regents Of The University Of California Leafy cotyledon2 genes and their uses
CA2301158A1 (en) 2000-03-24 2001-09-24 Stephen J. Allen Screening methods for compounds useful for modulating lipid metabolism in disease
WO2002000859A2 (en) 2000-06-23 2002-01-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 46508, a novel human peptidyl-trna hydrolase family member and uses thereof
WO2001073060A2 (en) 2000-03-24 2001-10-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 18221, dual specificity phosphatase and uses thereof
AU2000234588A1 (en) 2000-03-31 2001-10-15 Idemitsu Petrochemical Co. Ltd. Process for producing lipids and lipid-secreting microorganisms
AU5016301A (en) 2000-04-18 2001-10-30 Commw Scient Ind Res Org Method of modifying the content of cottonseed oil
US7091005B2 (en) 2000-05-16 2006-08-15 Merck & Co., Inc. Gene responsible for Stargardt-like dominant macular dystrophy
US20040195512A1 (en) 2000-05-16 2004-10-07 Crosetto Dario B. Method and apparatus for anatomical and functional medical imaging
EP1404820A2 (en) 2000-05-19 2004-04-07 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 50365, a hexokinase family member and uses therefor
WO2001092489A2 (en) 2000-05-26 2001-12-06 Washington State University Research Foundation Palmitate desaturase gene
WO2001096363A1 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Boyce Thompson Institute For Plant Research Fatty acid desaturase gene and protein for modulating activation of defense signaling pathways in plants
EP1297155A2 (en) 2000-06-29 2003-04-02 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 25869, a human carboxylesterase and uses thereof
GB0316629D0 (en) 2003-07-16 2003-08-20 Univ York Transgenic cell
WO2002016591A2 (en) 2000-08-21 2002-02-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Human transporter family members and uses thereof
ATE402262T1 (de) 2000-09-26 2008-08-15 Xenon Pharmaceuticals Inc Verfahren und zusammensetzungen, die eine stearoyl-coa desuturase-hscd5 verwenden
AU2002218447C9 (en) 2000-09-28 2008-04-17 Bioriginal Food & Science Corporation Fad4, Fad5, Fad5-2, and Fad6, fatty acid desaturase family members and uses thereof
WO2002090993A2 (en) 2000-11-27 2002-11-14 Focus Technologies, Inc. Functional protein expression for rapid cell-free phenotyping
WO2002044320A2 (en) 2000-11-29 2002-06-06 Xenon Genetics Inc. Human elongase genes and uses thereof
DE10102337A1 (de) 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte
DE10102338A1 (de) 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Expression von Biosynthesegenen in pflanzlichen Samen unter Verwendung von neuen multiplen Expressionskonstrukten
BR0205508A (pt) 2001-01-25 2005-05-03 Abbott Lab Genes para dessaturase e usos dos mesmos
US6635451B2 (en) 2001-01-25 2003-10-21 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
DE10106660A1 (de) 2001-02-12 2002-08-29 Celanese Ventures Gmbh Verfahren zur Herstellung von gamma-Linolensäure aus einer Ciliaten-Kultur durch Zusatz geeigneter Vorläufermoleküle zu dem Kulturmedium
GB0107510D0 (en) 2001-03-26 2001-05-16 Univ Bristol New elongase gene and a process for the production of -9-polyunsaturated fatty acids
WO2002081702A1 (fr) 2001-04-05 2002-10-17 Idemitsu Technofine Co., Ltd. Genes de desaturase en position $g(d)6 d'acide gras, plasmides et transformants contenant ces genes
TWI324181B (en) 2001-04-16 2010-05-01 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
TWI426127B (zh) 2001-04-16 2014-02-11 Dsm Ip Assets Bv 多不飽和脂肪酸（ｐｕｆａ）聚乙醯合成酶系統及其用途（三）
US7045683B2 (en) 2001-05-04 2006-05-16 Abbott Laboratories Δ4-desaturase genes and uses thereof
US20030082754A1 (en) 2001-05-04 2003-05-01 Pradip Mukerji Delta4 - desaturase genes and uses thereof
CA2451116C (en) 2001-05-14 2013-04-09 Martek Biosciences Corporation Production and use of a polar lipid-rich fraction containing omega-3 and/or omega-6 highly unsaturated fatty acids from microbes, genetically modified plant seeds and marine organisms
ATE404672T1 (de) 2001-06-06 2008-08-15 Bioriginal Food & Science Corp Samen-spezifische sequenzen aus flachs (linum usitatissimum l.)
DE10134660A1 (de) 2001-07-20 2003-02-06 Basf Plant Science Gmbh Fettsäure-Desaturase-Gene aus Granatapfel und Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren
US20050089879A1 (en) 2001-07-31 2005-04-28 Ivo Feussner Method for producing arachidonic acid in transgenic organisms
US6875595B2 (en) 2001-09-13 2005-04-05 Divergence, Inc. Nematode fatty acid desaturase-like sequences
JP2003116566A (ja) 2001-10-12 2003-04-22 Osamu Suzuki ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法
US7211656B2 (en) 2002-01-30 2007-05-01 Abbott Laboratories Desaturase genes, enzymes encoded thereby, and uses thereof
DE50312241D1 (de) 2002-01-30 2010-01-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter f
GB2385852A (en) 2002-02-27 2003-09-03 Rothamsted Ex Station Delta 6-desaturases from Primulaceae
US7700833B2 (en) 2002-03-01 2010-04-20 Cornell University Process for the production of unsaturated fatty acids
DE60335708D1 (de) 2002-03-16 2011-02-24 Univ York E exprimieren
US7566813B2 (en) 2002-03-21 2009-07-28 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
DE10219203A1 (de) 2002-04-29 2003-11-13 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen
BR122014000528B1 (pt) 2002-05-22 2016-02-16 Monsanto Technology Llc polinucleotídeo e vetor com atividade dessasturase no carbono 12 de molécula de ácido graxo, bem como método para produção de planta com óleo de semente contendo níveis alterados de ácidos graxos de ômega-3
US20050262588A1 (en) 2002-06-21 2005-11-24 Katayoon Dehesh Thioesterase-related nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified fatty acid composition
WO2004005442A1 (de) 2002-07-03 2004-01-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur herstellung von konjugierten mehrfach ungesättigten fettsäuren mit mindestens zwei doppelbindungen in pflanzen
NZ537752A (en) 2002-07-29 2006-12-22 Rigel Pharmaceuticals Inc Use of 2,4-pyrimidinediamine compounds in the preparation of medicaments for treating autoimmune diseases
BR0313722A (pt) 2002-08-12 2007-08-14 Monsanto Technology Llc método para aumentar os nìveis totais de óleos em plantas
CN1675802A (zh) 2002-08-19 2005-09-28 安德森电工产品公司 用于电连接器的手柄锁定系统及其方法
DE10246125A1 (de) 2002-10-01 2004-04-15 Aventis Behring Gmbh Konzentrat eines Faktor VIII:C-haltigen von-Willebrand-Faktors und das dazu gehörige Verfahren
CA2510462A1 (en) * 2002-12-19 2004-07-08 University Of Bristol Method for producing polyunsaturated fatty acids in a transgenic plant or microorganism comprising an introduced delta-9-elongase and a delta-8-desaturase
US8084074B2 (en) 2003-02-12 2011-12-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oil seed plants
US20040172682A1 (en) 2003-02-12 2004-09-02 Kinney Anthony J. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants
BRPI0407138A (pt) 2003-02-27 2006-01-10 Basf Plant Science Gmbh Sequência de ácido nucleico isolada, sequência de aminoácido, construção de gene, vetor, organismo transgênico não humano, processo para produzir ácidos graxos poliinsaturados, óleo, lipìdeo, ou um ácido graxo poliinsaturado ou uma fração dos mesmos, composições de óleo, de lipìdeos, ou de ácido graxo, e, uso do óleo, lipìdeos ou ácidos graxos ou de composições de óleo, de lipìdeos ou de ácido graxo
WO2004087902A2 (de) 2003-03-31 2004-10-14 University Of Bristol Neue pflanzliche acyltransferasen spezifisch für langkettige mehrfach ungesättigte fettsäuren
DE10315026A1 (de) 2003-04-02 2004-10-14 Bioplanta Arzneimittel Gmbh Zusammensetzungen enthaltend omega-3-fettsäurehaltige Öle und Pflanzenextrakte
WO2004090123A2 (de) 2003-04-08 2004-10-21 Basf Plant Science Gmbh Δ-4-desaturasen aus euglena gracilis, exprimierende pflanzen und pufa enthaltende öle
DE602004013569D1 (de) 2003-04-16 2008-06-19 Basf Plant Science Gmbh N pflanzen
US8313911B2 (en) 2003-05-07 2012-11-20 E I Du Pont De Nemours And Company Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US7125672B2 (en) 2003-05-07 2006-10-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Codon-optimized genes for the production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US7238482B2 (en) 2003-05-07 2007-07-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US20110059496A1 (en) 2003-06-25 2011-03-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoglycerate mutase promoters for gene expression in oleaginous yeast
US7267976B2 (en) 2003-07-02 2007-09-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous yeasts
US7208590B2 (en) 2003-07-15 2007-04-24 Abbott Laboratories Genes involved in polyketide synthase pathways and uses thereof
ES2590077T3 (es) 2003-08-01 2016-11-18 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la producción de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos
MXPA06002028A (es) 2003-08-21 2006-05-17 Monsanto Technology Llc Desaturasas de acido graso de primula.
US20050132441A1 (en) 2003-11-12 2005-06-16 Damude Howard G. Delta15 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oilseed plants and oleaginous yeast
US7504259B2 (en) 2003-11-12 2009-03-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ12 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeast
MY140210A (en) 2003-12-22 2009-11-30 Suntory Holdings Ltd Marchantiales-derived unsaturated fatty acid synthetase genes and use of the same
CA2554932A1 (en) * 2004-01-30 2005-08-11 Bionovate Limited Solvent extraction of lipids such as essential fatty acids
BRPI0507716A (pt) 2004-02-17 2007-07-03 Univ York célula transgênica, planta, semente, vaso de reação, e, método para dessaturar um substrato de ácido graxo
EP3543324B1 (de) 2004-02-27 2022-11-30 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigten fettsäuren in transgenen pflanzen
PL1720988T3 (pl) 2004-02-27 2012-05-31 Basf Plant Science Gmbh Sposób wytwarzania nienasyconych kwasów tłuszczowych omega-3 w organizmach transgenicznych
AU2005217079C1 (en) 2004-02-27 2016-02-04 Basf Plant Science Gmbh Method for producing polyunsaturated fatty acids in transgenic plants
DE102004017369A1 (de) 2004-04-08 2005-11-03 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh Screeningverfahren zur Identifizierung von PUFA-PKS in Proben
DE102004017370A1 (de) 2004-04-08 2005-10-27 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh PUFA-PKS Gene aus Ulkenia
ES2541537T3 (es) 2004-04-16 2015-07-21 Monsanto Technology, Llc Expresión de desaturasas de ácido graso en maíz
US7807849B2 (en) 2004-04-22 2010-10-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
AU2005235627B2 (en) 2004-04-22 2011-07-07 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
CA3023314C (en) 2004-04-22 2019-12-10 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
CN101018862B (zh) * 2004-04-22 2013-10-09 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
AU2005250074B2 (en) 2004-06-04 2011-04-14 Fluxome Sciences A/S Metabolically engineered cells for the production of polyunsaturated fatty acids
BRPI0512481A (pt) 2004-06-25 2008-03-11 Du Pont polinucleotìdeo isolado, polipeptìdeo, construção recombinante, célula, yarrowia sp.transformada, métodos para transformar uma célula, produzir uma planta transformada, produzir levedura, produzir ácidos graxos poliinsaturados e produzir pelo menos um ácido graxo poliinsaturados, sementes, óleos, plantas de sementes oleaginosa e alimentos ou rações
DE102004060340A1 (de) 2004-07-16 2006-02-09 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an mehrfach ungesättigten langkettigen Fettsäuren in transgenen Organismen
JP4587451B2 (ja) 2004-08-20 2010-11-24 サントリーホールディングス株式会社 ω３脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびにそれらの利用
DE102004044421B4 (de) 2004-09-14 2010-06-24 Biotest Ag Verfahren zur Trennung eines von Willebrand Faktors mit einer spezifischen VWF-Aktivität von wenigstens 50 E/mg VWF-Antigen von einem von Willebrand Faktor mit niedriger Aktivität und Verwendung von Hydroxylapatit dafür
GB0421937D0 (en) 2004-10-02 2004-11-03 Univ York Acyl CoA synthetases
US8685679B2 (en) 2004-11-04 2014-04-01 E I Du Pont De Nemours And Company Acyltransferase regulation to increase the percent of polyunsaturated fatty acids in total lipids and oils of oleaginous organisms
US7198937B2 (en) 2004-11-04 2007-04-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina diacylglycerol acyltransferase for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7273746B2 (en) 2004-11-04 2007-09-25 E.I. Dupont De Nemours And Company Diacylglycerol acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7879591B2 (en) 2004-11-04 2011-02-01 E.I. Du Pont De Nemours And Company High eicosapentaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
US20060094102A1 (en) 2004-11-04 2006-05-04 Zhixiong Xue Ammonium transporter promoter for gene expression in oleaginous yeast
US7588931B2 (en) 2004-11-04 2009-09-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
US7192762B2 (en) 2004-11-04 2007-03-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina glycerol-3-phosphate o-acyltransferase for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7189559B2 (en) 2004-11-04 2007-03-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina lysophosphatidic acid acyltransferase homolog for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US20100120103A1 (en) 2004-12-14 2010-05-13 Avesthagen Limited Recombinant Production Docosahexaenoic Acid (DHA) in Yeast
DE102004063326A1 (de) 2004-12-23 2006-07-06 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen Organismen
DE102004062294A1 (de) 2004-12-23 2006-07-06 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten langkettigen Fettsäuren in transgenen Organismen
DE102005013779A1 (de) 2005-03-22 2006-09-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen
AU2006249983B2 (en) 2005-05-23 2011-03-17 Arcadia Biosciences, Inc. Safflower with elevated gamma-linolenic acid
WO2006135866A2 (en) 2005-06-10 2006-12-21 Martek Biosciences Corporation Pufa polyketide synthase systems and uses thereof
WO2007005882A2 (en) 2005-07-05 2007-01-11 North Carolina State University Methods and compositions for expressing proteins in plants
DE102005038036A1 (de) 2005-08-09 2007-02-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen
GB2431158A (en) 2005-10-13 2007-04-18 Rothamsted Res Ltd Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid
DE102005052551A1 (de) 2005-11-02 2007-05-16 Rothamsted Res Harpenden Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae
BRPI0620552A2 (pt) 2005-11-23 2011-11-22 Du Pont polinucleotìdeo isolado, polipeptìdeo delta-9 elongase, construção recombinante, célula vegetal, método para transformar uma célula, método para produção de uma planta transgênica, sementes transgênicas, método para fabricar ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa, óleos, método para produzir pelo menos um ácido graxo poliinsaturado, plantas de semente oleaginosa, sementes, alimentos, fragmento de ácido nucléico isolado e progênies de plantas
WO2007092460A2 (en) 2006-02-03 2007-08-16 The Texas A & M University System Enhancing expression of value-added genes by transgenic expression of tombusvirus-based p19 gene mutants
GB0603160D0 (en) 2006-02-16 2006-03-29 Rothamsted Res Ltd Nucleic acid
AR059376A1 (es) 2006-02-21 2008-03-26 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados
MX339812B (es) 2006-03-15 2016-06-08 Dsm Ip Assets B V * Produccion de acido graso poli-insaturado en organismos heterologos usando sistemas de sintasa de policetido pufa.
US7943823B2 (en) 2006-04-28 2011-05-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Delta-8 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
EP2013335A2 (en) 2006-05-01 2009-01-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company Fungal delta12 desaturase and delta15 desaturase motifs
AU2007267359B2 (en) 2006-05-29 2013-03-14 Icon Genetics Gmbh Plant virus-based inducible expression system
UA107442C2 (uk) * 2006-06-28 2015-01-12 Nucelis Inc Суміш жирних кислот та її застосування
DE102006034313A1 (de) 2006-07-21 2008-01-24 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure
AU2007287585B2 (en) 2006-08-24 2013-08-29 Basf Plant Science Gmbh Isolation and characterization of a novel Pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains
AU2007291937B2 (en) 2006-08-29 2014-05-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of fatty acids
US8710299B2 (en) 2006-10-06 2014-04-29 Basf Plant Science Gmbh Processes for producing polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
US8916361B2 (en) 2006-11-17 2014-12-23 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
US7709239B2 (en) 2006-12-07 2010-05-04 E.I. Du Pont De Nemours And Company Mutant Δ8 desaturase genes engineered by targeted mutagenesis and their use in making polyunsaturated fatty acids
CN101765658B (zh) 2007-04-03 2013-11-20 纳幕尔杜邦公司 复合酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途
US7794701B2 (en) 2007-04-16 2010-09-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company Δ-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids
US8957280B2 (en) 2007-05-03 2015-02-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-5 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
US8785163B2 (en) 2007-07-31 2014-07-22 Basf Plant Science Gmbh Desaturases and methods for producing polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
AU2008281760B2 (en) 2007-07-31 2014-07-17 Basf Plant Science Gmbh Elongases and methods for producing polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
US9506075B2 (en) * 2007-08-01 2016-11-29 Bioglow, Llc Bioluminescent plants comprising bacterial LUX operon and methods of making same
US8119784B2 (en) 2008-04-02 2012-02-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-4 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
AU2009240794A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation Polypeptides and methods for producing triacylglycerols comprising modified fatty acids
AU2009239949A1 (en) * 2008-04-25 2009-10-29 Basf Plant Science Gmbh Plant seed oil
AU2009242130B2 (en) 2008-04-30 2013-09-19 Rothamsted Research Ltd. Desaturase and method for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
US8901374B2 (en) 2008-06-03 2014-12-02 Basf Plant Science Gmbh Fatty acid dehydratases and uses thereof
US8168858B2 (en) 2008-06-20 2012-05-01 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-9 fatty acid elongase genes and their use in making polyunsaturated fatty acids
CA2729496C (en) 2008-07-01 2018-02-13 Basf Plant Science Gmbh Promoters from brassica napus for seed specific gene expression
ES2603530T3 (es) 2008-07-21 2017-02-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Aceite de semilla de algodón mejorado y usos
AU2009273755A1 (en) 2008-07-21 2010-01-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved vegetable oils and uses therefor
EP2156744A1 (en) * 2008-08-11 2010-02-24 Nestec S.A. Oil containing one or more long-chain polyunsaturated fatty acids phospholipids derived from biomass
DE112009002048T5 (de) 2008-08-26 2012-01-26 Basf Plant Science Gmbh Nukleinsäure, die Desaturasen kodieren, und modifiziertes Planzenöl
BRPI0919707B1 (pt) 2008-10-14 2021-08-17 Monsanto Technology Llc Cassete de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificadora de ácido graxo dessaturases de hemiselmis spp., produto comercial e método de produção de uma composição alimentar ou de ração
NO2358882T3 (uk) * 2008-11-18 2017-12-23
CA2744930C (en) 2008-12-12 2018-03-20 Basf Plant Science Gmbh Desaturases and process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
WO2010130725A1 (en) 2009-05-13 2010-11-18 Basf Plant Science Company Gmbh Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
CN102459627B (zh) 2009-06-16 2015-07-29 纳幕尔杜邦公司 通过酰基-辅酶A溶血磷脂酰基转移酶的表达对长链ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸的生物合成的改善
US8188335B2 (en) 2009-07-17 2012-05-29 Abbott Laboratories Δ9-elongase for production of polyunsaturated fatty acid-enriched oils
EP2454278B1 (en) 2009-07-17 2019-06-19 BASF Plant Science Company GmbH Novel fatty acid desaturases and elongases and uses thereof
CN112011566B (zh) 2009-08-31 2023-12-05 巴斯夫植物科学有限公司 用于在植物中增强种子特异性基因表达而促进增强的多不饱和脂肪酸合成的调节性核酸分子
WO2011064181A1 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid desaturase and uses thereof
CA2781559C (en) 2009-11-24 2018-09-04 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid elongase and uses thereof
TW201144442A (en) 2010-05-17 2011-12-16 Dow Agrosciences Llc Production of DHA and other LC-PUFAs in plants
CA2837011C (en) * 2010-05-25 2023-01-17 Cargill Incorporated Brassica plants yielding oils with a low alpha linolenic acid content
AU2011274301B2 (en) 2010-06-28 2015-06-11 Nuseed Global Innovation Ltd Methods of producing lipids
KR101964168B1 (ko) 2010-10-01 2019-04-01 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠 스트라메노파일의 형질 전환 방법
DE112011103527T5 (de) 2010-10-21 2013-10-17 Basf Plant Science Company Gmbh Neue Fettsäure-Desaturasen, -Elongasen, -Elongations-Komponenten und Anwendungen davon
JP5150814B2 (ja) * 2010-10-29 2013-02-27 オプテックス株式会社 三角測距方式の距離検出回路
TW201307553A (zh) 2011-07-26 2013-02-16 Dow Agrosciences Llc 在植物中生產二十二碳六烯酸（ｄｈａ）及其他長鏈多元不飽和脂肪酸（ｌｃ－ｐｕｆａ）之技術
CA2869738C (en) 2012-04-12 2022-04-05 Rothamsted Research Ltd Production of omega-3 long chain polyunsaturated fatty acids
BR112014031362A8 (pt) * 2012-06-15 2022-06-28 Commw Scient Ind Res Org Lipídeo de planta extraído, processo para produzir lipídeo de planta extraído, célula hospedeira, método de produzir semente, farinha de semente, método para produzir um produto alimentício, uso e processo para produzir ésteres etílicos de ácidos graxos poli-insaturados
CN104520313A (zh) 2012-08-03 2015-04-15 巴斯夫植物科学有限公司 新的酶、酶组合物及其用途
GB201217524D0 (en) 2012-10-01 2012-11-14 Rothamsted Res Ltd Recombinant organisms
US9725399B2 (en) 2013-12-18 2017-08-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
SG11201610596PA (en) 2014-06-27 2017-01-27 Commw Scient Ind Res Org Lipid comprising docosapentaenoic acid

Also Published As

Publication number Publication date
PL2861059T3 (pl) 2017-10-31
PE20200448A1 (es) 2020-02-28
US20130338388A1 (en) 2013-12-19
US20200369980A1 (en) 2020-11-26
US10335386B2 (en) 2019-07-02
US12421472B2 (en) 2025-09-23
US10655082B2 (en) 2020-05-19
BR112014031362A2 (pt) 2017-07-25
AU2021269427A1 (en) 2021-12-16
PE20150769A1 (es) 2015-06-11
CL2019002477A1 (es) 2019-12-06
AU2017201411A1 (en) 2017-03-23
CA2876519C (en) 2020-09-15
AU2018247287A1 (en) 2018-11-01
AU2018247287B2 (en) 2021-08-19
US20150203788A1 (en) 2015-07-23
AU2017201411B2 (en) 2018-07-12
US9932541B2 (en) 2018-04-03
US20130338387A1 (en) 2013-12-19
IL236288A0 (en) 2015-02-26
US11834621B2 (en) 2023-12-05
HK1209581A1 (en) 2016-04-08
KR20200083595A (ko) 2020-07-08
US20180008568A1 (en) 2018-01-11
US20170349526A1 (en) 2017-12-07
CL2014003402A1 (es) 2015-12-11
MX349678B (es) 2017-08-08
BR112014031362A8 (pt) 2022-06-28
US20240084214A1 (en) 2024-03-14
PH12014502795A1 (en) 2015-02-09
SG11201408362SA (en) 2015-01-29
JP2015528027A (ja) 2015-09-24
BR122019026149A8 (pt) 2022-06-28
ZA201500015B (en) 2016-04-28
NZ631702A (en) 2017-01-27
PT2861059T (pt) 2017-08-08
US20170320806A1 (en) 2017-11-09
WO2013185184A2 (en) 2013-12-19
US20180311200A1 (en) 2018-11-01
EA201590026A1 (ru) 2015-05-29
CN104853596A (zh) 2015-08-19
BR122019026149A2 (uk) 2017-07-25
JP6784656B2 (ja) 2020-11-11
EP2861059B1 (en) 2017-05-03
AU2013273934A1 (en) 2015-01-22
US10899992B2 (en) 2021-01-26
CN104853596B (zh) 2018-10-09
MX2014015375A (es) 2016-02-18
KR102197208B1 (ko) 2021-01-04
US11306271B2 (en) 2022-04-19
US20170349528A1 (en) 2017-12-07
DK2861059T3 (en) 2017-08-28
US9556102B2 (en) 2017-01-31
UA117223C2 (uk) 2018-07-10
EP2861059A4 (en) 2016-03-09
US20170334826A1 (en) 2017-11-23
JP2018075003A (ja) 2018-05-17
CN109294730A (zh) 2019-02-01
KR20150037771A (ko) 2015-04-08
US20210139809A1 (en) 2021-05-13
US9932289B2 (en) 2018-04-03
US20170349527A1 (en) 2017-12-07
US20150045569A1 (en) 2015-02-12
US9550718B2 (en) 2017-01-24
EP3266316A1 (en) 2018-01-10
JP7254744B2 (ja) 2023-04-10
CN109294730B (zh) 2021-09-21
EP2861059A2 (en) 2015-04-22
IL236288A (en) 2016-06-30
US9932290B2 (en) 2018-04-03
US8816111B2 (en) 2014-08-26
JP6242882B2 (ja) 2017-12-06
AU2013273934B2 (en) 2016-12-01
MY187101A (en) 2021-08-31
US20220356414A1 (en) 2022-11-10
JP2020172643A (ja) 2020-10-22
US9999607B2 (en) 2018-06-19
WO2013185184A3 (en) 2014-02-13
HUE033766T2 (en) 2018-01-29
US20180258026A1 (en) 2018-09-13
US8946460B2 (en) 2015-02-03
EA036786B1 (ru) 2020-12-21
ES2636487T3 (es) 2017-10-05
CA3082388A1 (en) 2013-12-19
SG10201810439SA (en) 2018-12-28
CA2876519A1 (en) 2013-12-19
AU2021269427B2 (en) 2024-08-22
US9969954B2 (en) 2018-05-15
HK1248989A1 (en) 2018-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA127917C2 (uk) Рекомбінантна клітина brassica napus, яка містить довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти, трансгенна рослина та насіння brassica napus, спосіб отримання екстрагованого ліпіду рослин, харчового продукту та етилового ефіру поліненасичених жирних кислот
CA2933909C (en) Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
CN107858204B (zh) 产生ω-3脂肪酸的酶和方法
AU2020203743A1 (en) Lipid comprising docosapentaenoic acid
JP6186463B2 (ja) 植物種子の飽和脂肪酸含量の低減
US20180030463A1 (en) Certain plants with "no saturate" or reduced saturate levels of fatty acids in seeds, and oil derived from the seeds
GB2461820A (en) Methods of identifying sterol acyltransferase genes
JP2017537633A (ja) 低飽和脂肪酸または無飽和脂肪酸トランスジェニックキャノーラの生成
AU2024204837A1 (en) Lipid comprising docosapentaenoic acid
UA120172C2 (uk) Одержання омега 3 довголанцюжкових поліненасичених жирних кислот з олійних культур при використанні синтаз pufa траустохідридів
US10975380B2 (en) Seed-specific and endosperm-preferental promoters and uses thereof
EP3847264A1 (en) Improved method for the production of high levels of pufa in plants
US20240254500A1 (en) Increasing the accumulation of epa and dha in recombinant camelina
EP3847263A1 (en) Improved method for the production of high levels of pufa in plants
BR112012033692A2 (pt) Métodos para produzir lipídios
Rommel Genetic modification of fatty acid profiles in cotton