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TWI829064B - 採用pd1-lag3雙特異性抗體及cd20 t細胞雙特異性抗體的組合療法 - Google Patents

採用pd1-lag3雙特異性抗體及cd20 t細胞雙特異性抗體的組合療法 Download PDF

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TWI829064B
TWI829064B TW111100374A TW111100374A TWI829064B TW I829064 B TWI829064 B TW I829064B TW 111100374 A TW111100374 A TW 111100374A TW 111100374 A TW111100374 A TW 111100374A TW I829064 B TWI829064 B TW I829064B
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克里斯汀 克萊
馬利歐 佩洛
派翠克 亞歷山大 亞倫 偉伯
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Abstract

本發明係關於採用抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體及 CD20 T 細胞活化雙特異性抗體的組合療法，該等組合療法用於治療癌症的用途，以及使用該等組合療法的方法。

Description

採用　PD1-LAG3　雙特異性抗體及　CD20　T　細胞雙特異性抗體的組合療法
本發明涉及採用 PD1-LAG3 雙特異性抗體及 CD20 T 細胞活化雙特異性抗體之組合療法，此等組合療法用於治療癌症之用途以及使用該等組合療法的方法。
B 細胞增生性失調描述惡性腫瘤的一個異質性群體，包括白血病及淋巴瘤。淋巴瘤由淋巴細胞發展而來，並且包括兩大類：何杰金氏淋巴瘤 (HL) 及非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)。在美國，B 細胞起源的淋巴瘤佔所有非何杰金氏淋巴瘤病例之大約 80-85%，並且基於起源 B 細胞之基因型及表現型表現模式，B 細胞亞群內存在相當大之異質性。例如，B 細胞淋巴瘤亞組包括生長緩慢的和緩性的及不治之症，諸如濾泡性淋巴瘤 (FL) 或慢性淋巴球性白血病 (CLL)，以及更具侵襲性的亞型，被套細胞淋巴瘤 (MCL) 及彌漫型大 B 細胞淋巴瘤 (DLBCL)。儘管多種藥物可用於治療 B 細胞增生性失調，但仍需要開發安全有效的療法以延長患者之緩解期並提高治癒率。
抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體為一種分子，其靶向於 B 細胞上表現之 CD20 及於 T 細胞上存在之 CD3 ε 鏈 (CD3ε)。同時結合導致 T 細胞活化及 T 細胞媒介之 B 細胞毒殺。於 CD20 +B 細胞存在下，無論循環亦或於組織中，藥理上活性劑量之 CD20-CD3 雙特異性抗體將觸發 T 細胞活化及相關細胞激素之釋放。與周邊血液中 B 細胞耗竭平行，CD20 T 細胞活化雙特異性抗體導致周邊血液中之 T 細胞在首次投予後 24 小時內短暫減少，並導致細胞激素釋放達到峰值，隨後 T 細胞快速回收並且細胞激素含量在 72 小時內恢復至基線。報導的在用 T 細胞活化雙特異性抗體治療期間的兩種主要逸脫機制包括調節性 T 細胞 (T regs) 之頻率增加及 B 前驅細胞上之 PD-L1 表現水平增加。T regs透過 CTLA4 及其他機制抑制效應 T 細胞活化。然而，即使當 T 細胞被完全活化時，PD1 之上調亦將在與由腫瘤細胞表現之 PD-L1 結合後導致抑制性傳訊。此等機制誘導效應 T 細胞抑制及衰竭或功能不良，其可以使用核查點阻斷予以治療。
衰竭之 T 細胞的特徵係抑制性分子 PD-1 (計畫性細胞死亡蛋白 1) 之持續表現，並且已經發現阻斷 PD-1 及 PD-L1 (PD-1 配體) 交互作用可以逆轉 T 細胞衰竭且復原抗原特異性 T 細胞反應。然而，單獨靶向 PD-1-PD-L1 路徑並不一律引起 T 細胞衰竭之逆轉，可能是由於抗性機制、MDSC 之免疫抑制活性及/或調節性 T 細胞。
淋巴球活化基因-3 (LAG3 或 CD223) 最初係於一項旨在選擇性分離於 IL-2 依賴性 NK 細胞株中表現之分子的實驗中發現 (Triebel F 等人，Cancer Lett.235 (2006), 147–153)。LAG3 為一種獨特的跨膜蛋白，其與具有四個細胞外免疫球蛋白超家族樣域 (D1-D4) 之 CD4 具有結構同源性。膜遠端 IgG 域包含一個短胺基酸序列，亦即在其他 IgG 超家族蛋白中未發現的所謂額外環。細胞內域包含唯一胺基酸序列 (KIEELE，SEQ ID NO:103)，該胺基酸序列為 LAG3 對於 T 細胞功能產生負面影響所必需者。LAG3 可以在連接肽 (CP) 處藉由金屬蛋白酶切割以產生可溶形式，該可溶形式可在血清中偵測到。類似 CD4，LAG3 蛋白與 MHC II 類分子結合，但以更高之親和力且於與 CD4 不同之位點處結合 (Huard 等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 5744-5749)。LAG3 由 T 細胞、B 細胞、NK 細胞及漿細胞樣樹突細胞 (pDC) 表現，且在 T 細胞活化後上調。它調節 T 細胞功能以及 T 細胞恆定。應變性缺失或展示受損之功能的習知 T 細胞子集表現 LAG3。LAG3 +T 細胞在腫瘤部位處及慢性病毒感染期間富集 (Sierro 等人 Expert Opin. Ther. Targets 15 (2011), 91-101)。已經表明 LAG3 在 CD8 T 細胞衰竭中起作用 (Blackburn 等人 Nature Immunol. 10 (2009), 29-37)。因此，需要拮抗 LAG3 活性並可用於產生及復原對於腫瘤之免疫反應的抗體。
藉由同時位於靶向功能不良之腫瘤特異性 T 淋巴球上之 PD-1 及 LAG-3 兩者，PD1-LAG3 旨在復原有效的抗腫瘤免疫反應，並且與當下可用之查核點抑制劑相比，為更多癌症患者提供生存益處。藉由優先靶向共表現 PD-1/LAG-3 之功能不良之 T 細胞並且可能減少靶向腫瘤微環境中之表現 LAG-3 之 Treg，PD1-LAG3 BsAb 可避免重振 Treg 媒介之免疫抑制作用，同時復原抗腫瘤免疫反應。
儘管存在有效的 CD20 表現癌症療法，但次優反應、復發難治性疾病及/或對一種或多種治療劑之抗性仍是挑戰。再者，具有較高風險及細胞遺傳學異常的患者對獲批之療法的反應仍然低於最佳，且反應持續時間及無進展存活期較短。據此，需要更有效、安全且持久的靶向組合療法來治療血液系統惡性腫瘤。
本發明涉及組合療法，該等組合療法採用抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體以及包含與計畫性細胞死亡蛋白 1 (PD1) 特異性地結合之第一抗原結合域及與淋巴球活化基因-3 (LAG3) 特異性地結合之第二抗原結合域的雙特異性抗體。已經發現，本文所述之抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體優於抗 PD1 抗體，蓋因它們提供更好的選擇性及療效。此等抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體之進一步特徵在於它們顯示出減少的吸收效應 (sink effect) (如藉由 T 細胞之內化減少所示)，它們優先與習知 T 細胞而非 Treg 結合並且能夠從 Treg 抑制中復原 T 細胞效應子功能，它們顯示出增加的腫瘤特異性 T 細胞效應子功能及增加的活體內腫瘤根除。基於此等特性，它們有利於與 T 細胞雙特異性抗體 (特定而言抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體) 組合使用。
本文描述一種用於在治療癌症 (特定而言 CD20 表現癌症) 之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體與抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體組合使用。
本發明提供一種用於在前文定義之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含特異性地結合至計畫性細胞死亡蛋白 1 的第一抗原結合域 (PD1) 及特異性地結合至淋巴球活化基因-3 (LAG3) 的第二抗原結合域，其中特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域包含：VH 域，該 VH 域包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列； (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列。
於一個態樣中，提供一種用於在治療 CD20 表現癌症之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體係於單一組成物中一起投予或於兩種或更多種不同的組成物中分開地投予。
此外，提供一種用於在治療 CD20 表現癌症之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體與抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體組合使用抗體，並且其中抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含 Fc 域，該 Fc 域為 IgG Fc 域，特定而言 IgG1 Fc 域或 IgG4 Fc 域，並且其中該 Fc 域包含一個或多個降低與 Fc 受體 (特定而言 Fcγ 受體) 之結合的胺基酸取代。更特定而言，抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含人類 IgG1 亞類之 Fc 域，該 Fc 域含有胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)。
於一個態樣中，提供一種用於在前文所述之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含 (a) VH 域，其包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列， (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列；或 (b) VH 域，其包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列， (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列。
於另一態樣中，提供一種用於在本文所揭露之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列，且該 VL 域包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列。
於又一態樣中，提供一種用於本文所述之用途的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含特異性地結合至 LAG3 的第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含 (a) VH 域，其包含 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO:18 之胺基酸序列，或者 (b) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列。
於再一態樣中，提供一種用於在本文所述之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含特異性地結合至 LAG3 的第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含 (a) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 27 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 28 之胺基酸序列，或 (b) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 29 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 30 之胺基酸序列，或 (c) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列，或 (d) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列。
此外，提供一種用於在本文所揭露之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含 特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列的 VH 域及包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列的 VL 域， 以及特異性地結合至 LAG3 的第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列的 VH 域及包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列的 VL 域。
於又一態樣中，提供一種用於在治療 CD20 表現癌症之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含特異性地結合至 PD1 的 Fab 片段及與 LAG3 特異性地結合之 Fab 片段。於一個態樣中，該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含特異性地結合至 PD1 的 Fab 片段，其中可變域 VL 與 VH 彼此替換，使得 VL 為重鏈之一部分且 VH 為輕鏈之一部分。
於另一態樣中，提供一種用於在前文所揭露之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含與 PD-1 之單價結合及與 LAG3 之單價結合。
於又一態樣中，提供一種用於在前文所揭露之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體為人源化抗體或嵌合抗體。特定而言，該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體為人源化抗體。此外，提供一種如前文所述之抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含 Fc 域，該 Fc 域包含促進該 Fc 域之第一次單元與第二次單元之締合的修飾。於一個態樣中，提供一種抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，其中根據杵入臼 (knobs into holes) 方法，該 Fc 域之第一次單元包含杵且該 Fc 域之第二次單元包含臼。特定而言，該 Fc 域之第一次單元包含胺基酸取代 S354C 及 T366W (EU 編號)，且該 Fc 域之第二次單元包含胺基酸取代 Y349C、T366S 及 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。
於特定態樣中，提供一種用於在治療 CD20 表現癌症之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含 (a) 第一重鏈，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列；第一輕鏈，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；第二重鏈，其包含有 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列；以及第二輕鏈，其包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列；或者 (b) 第一重鏈，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列；第一輕鏈，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；第二重鏈，其包含有 SEQ ID NO: 39 之胺基酸序列；以及第二輕鏈，其包含 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列。
更特定而言，該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含：第一重鏈，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列；第一輕鏈，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；第二重鏈，其包含有 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列；以及第二輕鏈，其包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列。
此外，提供一種用於在治療 CD20 表現癌症之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體用於與抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體組合使用，並且其中該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第一抗原結合域及第二抗原結合域，該第一抗原結合域包含重鏈可變區 (V HCD3) 及輕鏈可變區 (V LCD3)，且該第二抗原結合域包含重鏈可變區 (V HCD20) 及輕鏈可變區 (V LCD20)。於一個態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD3)，其包含 SEQ ID NO:41 之 CDR-H1 序列、SEQ ID NO:42 之 CDR-H2 序列及 SEQ ID NO:43 之 CDR-H3 序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD3)，其包含 SEQ ID NO:44 之 CDR-L1 序列、SEQ ID NO:45 之 CDR-L2 序列及 SEQ ID NO:46 之 CDR-L3 序列。更特定而言，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD3)，其包含 SEQ ID NO:47 之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD3)，其包含 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列。於一個態樣中，該用於在治療CD20 表現癌症之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD20)，其包含 SEQ ID NO:49 之 CDR-H1 序列、SEQ ID NO:50 之 CDR-H2 序列及 SEQ ID NO:51 之 CDR-H3 序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD20)，其包含 SEQ ID NO:52 之 CDR-L1 序列、SEQ ID NO:53 之 CDR-L2 序列及 SEQ ID NO:54 之 CDR-L3 序列。特定而言，該第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD20)，其包含 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD20)，其包含 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列。於又一態樣中，該用於在治療CD20 表現癌症之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含與 CD20 結合之第三抗原結合域。於另一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含 Fc 域，該 Fc 域包含降低與 Fc 受體之結合及/或效應子功能的一個或多個胺基酸取代。
於一個特定態樣中，該用於在治療 CD20 表現癌症之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體為格菲妥單抗 (glofitamab)。於另一特定態樣中，該用於在治療CD20 表現癌症之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體為莫蘇妥珠單抗 (mosunetuzumab)。
於又一態樣中，提供一種用於在治療 CD20 表現癌症之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體與抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體組合使用，並且其中該組合係以約一週至三週之間隔投予。
於又一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體用於在治療CD20 表現癌症之方法中使用，其中在組合治療之前用第 II 型抗 CD20 抗體 (較佳奧比妥珠單抗 (obinutuzumab)) 進行預治療，其中該預治療與該組合治療之間的時間段足以因應該第 II 型抗 CD20 抗體而減少個體中之 B 細胞。較佳的是，該第 II 型抗 CD20 抗體為奧比妥珠單抗。
於又一態樣中，提供一種用於治療 CD20 表現癌症之包含抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體之組成物，其中該治療包含將包含抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體之該組成物與包含抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體之組成物組合投予，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含特異性地結合至計畫性細胞死亡蛋白 1 (PD1) 的第一抗原結合域及特異性地結合至淋巴球活化基因-3 (LAG3) 的第二抗原結合域，其中特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域包含：VH 域，該 VH 域包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列； (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列。
於一個態樣中，該組成物包含抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列，且該 VL 域包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列。於又一態樣中，該組成物包含抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含與​LAG3​特異性地結合之第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含 (a) VH 域，其包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列， (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列；或 (b) VH 域，其包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列， (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列。
於一個態樣中，該組成物包含抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含特異性地結合至 LAG3 的抗原結合域，該抗原結合域包含 (a) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列，或 (b) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列。
於一個特定態樣中，該組成物包含抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含 特異性地結合至 PD1 的第一 Fab 片段，該第一 Fab 片段包含：包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列的 VH 域及包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列的 VL 域， 以及特異性地結合至 LAG3 的第二 Fab 片段，該第二 Fab 片段包含：包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列的 VH 域及包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列的 VL 域。
此外，提供一種用於治療 CD20 表現癌症之包含抗 CD20/抗 LAG3 雙特異性抗體之組成物，其中該治療包含將包含抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體之該組成物與包含抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體之組成物組合投予，其中該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第一抗原結合域及第二抗原結合域，該第一抗原結合域包含重鏈可變區 (V HCD3) 及輕鏈可變區 (V LCD3)，且該第二抗原結合域包含重鏈可變區 (V HCD20) 及輕鏈可變區 (V LCD20)。於一個態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD3)，其包含 SEQ ID NO:41 之 CDR-H1 序列、SEQ ID NO:42 之 CDR-H2 序列及 SEQ ID NO:43 之 CDR-H3 序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD3)，其包含 SEQ ID NO:44 之 CDR-L1 序列、SEQ ID NO:45 之 CDR-L2 序列及 SEQ ID NO:46 之 CDR-L3 序列。更特定而言，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD3)，其包含 SEQ ID NO:47 之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD3)，其包含 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列。於一個態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD20)，其包含 SEQ ID NO:49 之 CDR-H1 序列、SEQ ID NO:50 之 CDR-H2 序列及 SEQ ID NO:51 之 CDR-H3 序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD20)，其包含 SEQ ID NO:52 之 CDR-L1 序列、SEQ ID NO:53 之 CDR-L2 序列及 SEQ ID NO:54 之 CDR-L3 序列。特定而言，該第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD20)，其包含 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD20)，其包含 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列。於又一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含與​CD20​結合之第三抗原結合域。於另一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含 Fc 域，該 Fc 域包含降低與 Fc 受體之結合及/或效應子功能的一個或多個胺基酸取代。於一個特定態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體為格菲妥單抗。於另一特定態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體為莫蘇妥珠單抗。
於又一態樣中，提供一種用於治療 CD20 表現癌症之包含抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體之組成物，其中該治療包含將包含抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體之該組成物與包含抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體之組成物組合投予，其中在該組合治療之前，使用第 II 型抗 CD20 抗體 (較佳為奧比妥珠單抗) 進行預治療，其中該預治療與該組合治療之間的時間段足以因應該第 II 型抗 CD20 抗體而減少個體中之 B 細胞。較佳的是，該第 II 型抗 CD20 抗體為奧比妥珠單抗。
於又一態樣中，提供一種醫藥產品，其包含 (A) 第一組成物，其包含作為活性成分之抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及醫藥上可接受之載劑；及 (B) 第二組成物，其包含作為活性成分之抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體及醫藥上可接受之載劑，該醫藥產品用於組合、依序或同時治療疾病，特定而言CD20 表現癌症。
於另一態樣中，提供了一種醫藥組成物，其包含抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體與抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體之組合，該醫藥組成物用於組合、依序或同時治療疾病，特定而言CD20 表現癌症。特定而言，該醫藥組成物用於治療 B 細胞增生性失調，特定而言選自由以下所組成之群組的疾病：非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)、急性淋巴球性白血病 (ALL)、慢性淋巴球性白血病 (CLL)、彌漫型大 B 細胞淋巴瘤 (DLBCL)、濾泡性淋巴瘤 (FL)、被套細胞淋巴瘤 (MCL)、緣帶淋巴瘤 (MZL)、多發性骨髓瘤 (MM) 及何杰金氏淋巴瘤 (HL)。
於另一態樣中，提供抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體與抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體之組合在製造用於治療增生性疾病或延緩增生性疾病進展 (特定而言用於治療CD20 表現癌症) 之藥物中的用途，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含特異性地結合至計畫性細胞死亡蛋白 1 (PD1) 的第一抗原結合域及特異性地結合至淋巴球活化基因-3 (LAG3) 的第二抗原結合域，其中與 PD1 特異性地結合之第一抗原結合域包含：VH 域，該 VH 域包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列； (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列。
於又一態樣中，該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含 (a) VH 域，其包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列， (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列；或 (b) VH 域，其包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列， (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列。
於另一態樣中，提供抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體與抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體之組合在製造用於治療增生性疾病或延緩增生性疾病進展 (特定而言治療CD20 表現癌症) 之藥物中的用途，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含特異性地結合至 PD1 的第一 Fab 片段及特異性地結合至 LAG3 的第二Fab 片段，該第一 Fab 片段包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列，及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列；且該第二 Fab 片段包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列，及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列。
於又一態樣中，提供抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體與抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體之組合在製造用於治療增生性疾病或延緩增生性疾病進展 (特定而言用於治療CD20 表現癌症) 之藥物中的用途，其中在該組合治療之前用第 II 型抗 CD20 抗體 (較佳奧比妥珠單抗) 進行預治療，其中該預治療與該組合治療之間的時間段足以因應該第 II 型抗 CD20 抗體而減少個體中之 B 細胞。較佳的是，該第 II 型抗 CD20 抗體為奧比妥珠單抗。
於又一態樣中，提供一種用於在受試者中治療 CD20 表現癌症之方法，該方法包含投予該受試者有效量之抗 CD20/抗 CD3 抗體及有效量之抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含特異性地結合至計畫性細胞死亡蛋白 1 (PD1) 的第一抗原結合域及特異性地結合至淋巴球活化基因-3 (LAG3) 的第二抗原結合域，其中特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域包含：VH 域，該 VH 域包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列； (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列。
於一個態樣中，提供該方法，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含 (a) VH 域，其包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列， (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列；或 (b) VH 域，其包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列， (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列。
於另一態樣中，提供該方法，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含特異性地結合至 PD1 的 Fab 片段及特異性地結合至 LAG3 的第二 Fab 片段，該第一 Fab 片段包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列，及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列；且該第二 Fab 片段包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列，及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列。
於一個態樣中，提供該方法，其中該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第一抗原結合域及第二抗原結合域，該第一抗原結合域包含重鏈可變區 (V HCD3) 及輕鏈可變區 (V LCD3)，且該第二抗原結合域包含重鏈可變區 (V HCD20) 及輕鏈可變區 (V LCD20)。於一個態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD3)，其包含 SEQ ID NO:41 之 CDR-H1 序列、SEQ ID NO:42 之 CDR-H2 序列及 SEQ ID NO:43 之 CDR-H3 序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD3)，其包含 SEQ ID NO:44 之 CDR-L1 序列、SEQ ID NO:45 之 CDR-L2 序列及 SEQ ID NO:46 之 CDR-L3 序列。更特定而言，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD3)，其包含 SEQ ID NO:47 之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD3)，其包含 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列。於一個態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD20)，其包含 SEQ ID NO:49 之 CDR-H1 序列、SEQ ID NO:50 之 CDR-H2 序列及 SEQ ID NO:51 之 CDR-H3 序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD20)，其包含 SEQ ID NO:52 之 CDR-L1 序列、SEQ ID NO:53 之 CDR-L2 序列及 SEQ ID NO:54 之 CDR-L3 序列。特定而言，該第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD20)，其包含 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD20)，其包含 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列。於又一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含與​CD20​結合之第三抗原結合域。於另一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含 Fc 域，該 Fc 域包含降低與 Fc 受體之結合及/或效應子功能的一個或多個胺基酸取代。於一個特定態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體為格菲妥單抗。於另一特定態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體為莫蘇妥珠單抗。
在又一態樣中，提供一種用於在受試者中治療 CD20 表現癌症之方法，該方法包含投予該受試者有效量之抗 CD20/抗 CD3 抗體及有效量之抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，其中在該組合治療之前，使用第 II 型抗 CD20 抗體 (較佳奧比妥珠單抗) 進行預治療，其中該預治療與該組合治療之間的時間段足以因應該第 II 型抗 CD20 抗體而減少個體中之 B 細胞。較佳的是，該第 II 型抗 CD20 抗體為奧比妥珠單抗。
於一個態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體與該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體係於單一組成物中一起投予或於兩種或更多種不同的組成物中分開地投予。於又一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體與該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體係經靜脈內或皮下投予。於另一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體係與該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體同時投予，或於其之前或之後投予。
於任何上述態樣中，該受試者較佳為哺乳動物，特定而言人類。
定義
除非另有定義，否則本文所使用之技術及科學術語具有與本發明所屬技術中通常使用的含義相同。為了解釋本說明書的目的，將應用以下定義，並且只要合適，以單數形式使用的術語亦將包括複數，反之亦然。
本文中的術語「 抗體」以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、單特異性抗體及多特異性抗體 (例如，雙特異性抗體) 及抗體片段，只要其等呈現期望的抗原結合活性即可。
如本文所用的術語「 單株抗體」是指獲自實質上同源抗體群體的抗體，即構成群體的受試者抗體是相同的及/或結合相同的表位，除了可能的變異體抗體，例如，包含天然發生的突變或在單株抗體製劑的生產過程中產生的，此類變異體通常以少量存在。與通常包括針對不同決定位 (抗原決定基) 之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定位。
如本文所用，術語「 單特異性」抗體表示具有一個或多個結合位點的抗體，各結合位點結合相同抗原的相同表位。術語「 雙特異性」意指抗體能夠與至少兩個不同的抗原決定位特異性地結合，例如兩個結合位點，每個結合位點均由一對抗體重鏈可變域 (VH) 及抗體輕鏈可變域 (VL) 形成，該等結合點與不同抗原結合或與同一抗原上之不同表位結合。該雙特異性抗體為 1+1 格式。其他雙特異性抗體形式為 2+1 格式 (包含針對第一抗原或表位之兩個結合位點以及針對第二抗原或表位之一個結合位點) 或 2+2 格式 (包含針對第一抗原或表位之兩個結合位點以及針對第二抗原或表位之兩個結合位點)。通常，雙特異性抗體包含兩個抗原結合位點，其中每個抗原結合位點對不同抗原決定位具有特異性。
如本申請案中所使用，術語「 價」表示抗原結合分子內存在的特定數目個結合域。因此，術語「二價」、「四價」及「六價」表示抗原結合分子內分別存在兩個結合域、四個結合域及六個結合域。根據本發明的雙特異性抗體至少為「二價的」，並可以是「三價的」或「多價的」(例如「四價的」或「六價的」)。於特定態樣中，本發明之抗體具有兩個或更多個結合位點並且為雙特異性的。即，即使在存在多於兩個結合位點的情況下 (即抗體是三價或多價的)，抗體也可是雙特異性的。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，是指具有與天然抗體結構實質上類似之結構的抗體。「 天然抗體」指代具有不同結構的天然生成之免疫球蛋白分子。例如，天然 IgG 級抗體為約 150,000 個道耳頓的異四聚體醣蛋白，其由二條輕鏈及二條重鏈經雙硫鍵鍵合所構成。從 N 端至 C 端，每條重鏈具有可變區 (VH)，亦稱為可變重域或重鏈可變域，接著為三個恆定域 (CH1、CH2 及 CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，從 N 端至 C 端，各輕鏈具有可變區 (VL)，亦稱為可變輕域或輕鏈可變域，接著為輕鏈恆定域 (CL)，亦稱為輕鏈恆定區。抗體的重鏈可歸為五種類型之一，稱為α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG) 或 μ (IgM)，其中的一些可再區分為亞型，例如 γ1 (IgG1)、γ2 (IgG2)、γ3 (IgG3)、γ4 (IgG4)、α1 (IgA1) 和α2 (IgA2)。基於其恆定域之胺基酸序列，抗體之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。
「 抗體片段」是指除完整抗體以外的分子，其包含完整抗體的一部分，該完整抗體結合完整抗體所結合的抗原。抗體片段之示例包括，但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab') 2；雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、cross-Fab 片段、線性抗體；單鏈抗體分子 (例如 scFv)；由抗體片段形成之多特異性抗體及單域抗體。關於某些抗體片段的綜述，參見 Hudson 等人，Nat Med 9，129-134 (2003)。關於 scFv 片段的綜述，請參見 Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113 卷，Rosenburg 及 Moore 編，Springer-Verlag，New York，第 269-315 頁 (1994)；亦可參見 WO 93/16185；及美國專利第 5,571,894 號及第 5,587,458 號。關於包含補救受體結合表位殘基且具有增加的活體內半衰期之 Fab 及 F(ab')2 片段的論述，參見美國專利號 5,869,046。雙功能抗體為具有兩個抗原結合域之抗體片段，其可為二價或雙特異性的，參見例如 EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson 等人，Nat Med 9, 129-134 (2003)；及 Hollinger 等人，Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)。Hudson 等人，Nat Med 9，129-134 (2003) 中亦描述三功能抗體及四功能抗體。單域抗體為包含抗體之全部或部分重鏈可變域或抗體之全部或部分輕鏈可變域的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體 (Domantis, Inc.，Waltham, MA；參見例如美國第 6,248,516 B1 號專利)。此外，抗體片段包含單鏈多肽，其具有 VH 域 (亦即能與 VL 域一起組裝至功能性抗原結合位點) 或 VL 域 (亦即能與 VH 域一起組裝至功能性抗原結合位點) 之特徵，且藉此提供全長抗體之抗原結合性質。抗體片段可透過各種技術製造，包括但不限於如本文所述之完整抗體的蛋白水解消化以及重組宿主細胞 (例如大腸桿菌或噬菌體) 的產生。
木瓜酵素對完整抗體之消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自包含重鏈可變域及輕鏈可變域以及輕鏈之恆定域和重鏈之第一恆定域 (CH1)。因此，如本文所使用，術語「 Fab 片段」指代包含輕鏈片段的抗體片段，該輕鏈片段包含 VL 域及輕鏈之恆定域 (CL)，以及 VH 域及重鏈之第一恆定域 (CH1)。Fab' 片段與 Fab 片段不同之處在於，在重鏈 CH1 域之羧基端添加少數殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab’-SH 為 Fab’ 片段，其中恆定域之半胱胺酸殘基攜帶一個游離硫醇基團。胃蛋白酶處理產生 F(ab') 2片段，該片段具有兩個抗原結合位點 (兩個 Fab 片段) 及一部分 Fc 區。
術語「 cross-Fab 片段」或「xFab 片段」或「交叉 Fab 片段」指代其中重鏈與輕鏈之可變區或恆定區發生交換的 Fab 片段。可能存在交叉 Fab 分子之兩種不同鏈組成且包含於本發明之雙特異性抗體中：一方面，Fab 重鏈及輕鏈之可變區交換，亦即交叉 Fab 分子包含由輕鏈可變區 (VL) 及重鏈恆定區 (CH1) 構成之肽鏈，及由重鏈可變區 (VH) 及輕鏈恆定區 (CL) 構成之肽鏈。此互換型 Fab 分子亦稱為交叉 Fab (VLVH)。另一方面，當 Fab 重鏈與輕鏈之恆定區交換時，交叉 Fab 分子包含由重鏈可變區 (VH) 及輕鏈恆定區 (CL) 構成之肽鏈，及由輕鏈可變區 (VL) 及重鏈恆定區 (CH1) 構成之肽鏈。這種互換型 Fab 分子亦稱為交叉 Fab (CLCH1)。
「單鏈 Fab 片段」或「 scFab」為由抗體重鏈可變域 (VH)、抗體恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域 (VL)、抗體輕鏈恆定域 (CL) 及連接子組成之多肽，其中該抗體域及該連接子按 N 端至 C 端方向之次序具有以下中之一者：a) VH-CH1-連接子-VL-CL，b) VL-CL-連接子-VH-CH1，c) VH-CL-連接子-VL-CH1 或 d) VL-CH1-連接子-VH-CL；且其中該連接子為至少 30 個胺基酸，較佳為 32 與 50 個胺基酸之間的多肽。該單鏈 Fab 片段通過 CL 域與 CH1 域之間的天然雙硫鍵達到穩定。此外，此等單鏈 Fab 分子可經由插入半胱胺酸殘基 (例如可變重鏈中之位置 44 及可變輕鏈中之位置 100，根據 Kabat 編號) 而產生鏈間雙硫鍵來進一步穩定化。
「交叉單鏈 Fab 片段」或「 x-scFab」為由抗體重鏈可變域 (VH)、抗體恆定域 1 (CH1)、抗體輕鏈可變域 (VL)、抗體輕鏈恆定域 (CL) 及連接子組成之多肽，其中該等抗體域及該連接子按 N 端至 C 端方向之次序具有以下中之一者：a) VH-CL-連接子-VL-CH1 及 b) VL-CH1-連接子-VH-CL；其中 VH 與 VL 一起形成與抗原特異性地結合之抗原結合域，且其中該連接子為至少 30 個胺基酸之多肽。此外，此等 x-scFab 分子可經由插入半胱胺酸殘基 (例如可變重鏈中之位置 44 及可變輕鏈中之位置 100，根據 Kabat 編號) 而產生鏈間雙硫鍵來進一步穩定化。
「 單鏈可變片段( scFv)」為抗體之重鏈 (V H) 及輕鏈 (V L) 之可變區之融合蛋白質，其與十至約 25 個胺基酸之短連接子肽連接。連接子通常富含甘胺酸以具有可撓性，以及絲胺酸或蘇胺酸以具有可溶性，且可連接 V H之 N 端與 V L之 C 端，或 反之亦然。儘管移除恆定區且引入連接子，但此蛋白質保持原始抗體之特異性。scFv 抗體例如描述於 Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96)。此外，抗體片段包含單鏈多肽，其具有 VH 域 (亦即能與 VL 域一起組裝至功能性抗原結合位點) 或 VL 域 (亦即能與 VH 域一起組裝至功能性抗原結合位點) 之特徵，且藉此提供全長抗體之抗原結合性質。
「 支架抗原結合蛋白」為技術中已知的，例如纖網蛋白及經設計之錨蛋白重複蛋白質 (DARPins) 已用作抗原結合域之替代性支架，參見例如 Gebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009) and Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics.Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)。在本發明之一個態樣中，支架抗原結合蛋白係選自由以下所組成之群組：CTLA-4 (艾維伯迪 (Evibody))；脂質運載蛋白(抗運載蛋白 (Anticalin))；蛋白質 A 衍生之分子，諸如蛋白質 A 之 Z 域 (親和抗體)；A 域 (高親和性多聚體/最大抗體)；血清運鐵蛋白( 反式-抗體)；經設計之錨蛋白重複蛋白質 (DARPin)；抗體輕鏈或重鏈之可變域(單域抗體，sdAb)；抗體重鏈之可變域(奈米抗體，aVH)；V NAR片段；纖網蛋白(阿耐克汀(AdNectin))；C 型凝集素域(四連接素 (Tetranectin))；新型抗原受體β-內醯胺酶之可變域(V NAR片段)；人類γ-晶狀體球蛋白或泛素(阿菲林 (Affilin) 分子)；人類蛋白酶抑制劑之庫尼茨 (kunitz) 型域，微體，諸如來自knottin家族之蛋白質、肽適體及纖網蛋白(阿耐克汀 (adnectin))。CTLA-4 (細胞毒性 T 淋巴球相關抗原 4) 為表現於主要 CD4+ T 細胞上之 CD28 家族受體。其細胞域具有可變域類 Ig 摺疊。對應於抗體之 CDR 之環可經異源序列取代以賦予不同結合特性。經工程改造以具有不同結合特異性之 CTLA-4 分子亦稱為艾維伯迪 (Evibodies) (例如 US7166697B1)。艾維伯迪 (Evibody) 與抗體 (例如結構域抗體) 之經分離之可變區之尺寸大致相同。關於其他細節，參見 Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)。脂質運載蛋白為細胞外蛋白質之家族，其傳遞小型疏水性分子，諸如類固醇、後膽色素 (bilins)、類視色素及脂質。其具有剛性 β-片狀第二結構，其在圓錐結構之開放端具有許多環，其可經工程改造以結合不同標靶抗原。抗運載蛋白 (Anticalin) 的大小在 160-180 個胺基酸之間，且來源於脂質運載蛋白。關於其他細節，參見 Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、US7250297B1 及 US20070224633。親和抗體為來源於金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 之蛋白質 A 的支架，其可經工程化以結合於抗原。結構域由具有約 58 個胺基酸的三螺旋束組成。已藉由表面殘基之隨機化產生文庫。關於其他細節，參見 Protein Eng. Des. Sel.2004, 17, 455-462 及 EP 1641818A1。高親合性多聚體 (Avimers) 為來源於 A-域支架家族之多域蛋白質。約 35 個胺基酸之原生結構域採用既定雙硫鍵鍵結之結構。藉由改組由 A-域之家族呈現之天然變化來產生多樣性。關於其他細節，參見 Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005) 及 Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)。運鐵蛋白為單體血清運送醣蛋白。運鐵蛋白可藉由在允許的表面環中插入肽序列而經工程化以結合不同標靶抗原。經工程化之運鐵蛋白支架之實例包括反式體。關於其他細節，參見 J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)。經設計之錨蛋白重複蛋白質 (DARPins) 來源於錨蛋白，錨蛋白為介導整合膜蛋白質與細胞骨架之連接的蛋白質之家族。單一錨蛋白重複為由兩個 α 螺旋及 β 迴旋 (beta-turn) 組成之 33 殘基積蓄模體。其可藉由隨機化各重複之第一個 α 螺旋及 β 迴旋中之殘基而經工程化以結合不同標靶抗原。可藉由增加模組數目來增加其結合界面 (親和力成熟方法)。關於其他細節，參見 J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) 及 J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) 及 US20040132028A1。
單域抗體為由單一單體可變抗體域組成之抗體片段。第一個單域源自來自駱駝之抗體重鏈之可變域 (奈米抗體或 V HH 片段)。此外，術語單域抗體包括自主人類重鏈可變域 (aVH) 或來源於鯊魚之 V NAR片段。纖網蛋白為可經工程化結合於抗原之支架。纖連蛋白由 第三型人類纖網蛋白 (FN3) 之 15 個重複單元的第 10 個域的天然胺基酸序列之主鏈組成。β-夾層結構之一端處的三個環可經工程化以使阿耐克汀 (Adnectin) 能夠特異性地識別感興趣之治療標靶。關於其他細節，參見 Protein Eng. Des. Sel.18, 435- 444 (2005)、US20080139791、WO2005056764 及 US6818418B1。肽適體為組合性識別分子，其由恆定支架蛋白質 (通常為硫氧還蛋白 (TrxA)) 組成，該恆定支架蛋白質含有在活性位點處插入之限制性可變肽環。關於其他細節，參見 Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)。微體來源於天然存在之長度為 25-50 個胺基酸之微型蛋白質，其含有 3-4 個半胱胺酸橋，微型蛋白質之實例包括 KalataBI 及芋螺毒素 (conotoxin) 及打結素 (knottin)。微型蛋白質具有環，其可經工程化以包括至多25個胺基酸而不影響微型蛋白質之整體摺疊。關於經工程改造之打結素結構域之其他細節，參見 WO2008098796。
與參考分子「 結合於相同表位之抗原結合分子」係指一種抗原結合分子，其在競爭分析中阻斷參考分子與其抗原之結合達 50% 或更多，且相反地，參考分子在競爭分析中阻斷抗原結合分子與其抗原之結合達50%或更多。
如本文所用，術語「 抗原結合域」或「 抗原結合位點」指代抗原結合分子的與抗原決定位特異性地結合之部分。更特定而言，術語「抗原結合域」指代抗體之部分，其包含與抗原之部分或全部特異性地結合且與其互補之區域。當抗原較大時，抗原結合分子可僅結合於抗原之特定一部分，該部分稱為表位。抗原結合域可由例如一或多個可變域 (亦稱為可變區) 提供。較佳地，抗原結合域包含抗體輕鏈可變區 (VL) 及抗體重鏈可變區 (VH)。於一個態樣中，抗原結合域能夠與其抗原結合且阻斷或部分地阻斷其功能。與 PD1 或 LAG3 特異性地結合之抗原結合域包括本文所進一步定義的抗體及其片段。此外，抗原結合域可包括支架抗原結合蛋白，例如基於經設計之重複蛋白或經設計之重複域的結合域 (參見例如 WO 2002/020565)。
如本文所使用，術語「 抗原決定位」與「抗原」及「表位」同義，且是指多肽大分子上與抗原結合部分結合，形成抗原結合部分-抗原錯合物的位點(例如，胺基酸之相鄰延伸或由非相鄰胺基酸之不同區域組成的構形組態)。例如，可用之抗原決定位可存在於腫瘤細胞之表面上、受病毒感染之細胞之表面上、其他患病細胞之表面上、免疫細胞的表面上，不存在於血清中，及/或存在於細胞外基質 (ECM) 中。除非另有指示，否則本文中適用作抗原之蛋白質可為來自任何脊椎動物來源 (包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如人類) 及嚙齒動物 (例如小鼠及大鼠)) 之蛋白質的任何原生形式。在特定實施例中，該抗原為人蛋白質。在本文中提及特定蛋白質的情況下，該術語涵蓋「全長」、未處理之蛋白質及由在細胞中處理所產生之任何蛋白質形式。該術語亦涵蓋天然生成之蛋白質變異體例如剪接變異體或對偶基因變異體。
「 特異性結合」意謂結合對於抗原而言具有選擇性且可與非所需或非特異性相互作用區分。抗原結合分子結合特異性抗原之能力可藉由酶聯免疫吸附分析 (ELISA) 或所屬領域知識者所熟悉的其他技術，例如表面電漿子共振 (SPR) 技術 (於 BIAcore 儀器上分析) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) 及傳統的結合測定 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)) 來量測。在一個實施例中，抗原結合分子結合不相關的蛋白質之程度小於抗原結合分子結合抗原的約 10%，例如藉由 SPR。在某些實施例中，結合至抗原之分子具有解離常數 (Kd) 為 ≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM、或≤ 0.001 nM (例如 10 -7M 或更低，例如 10 -7M 至 10 -13M，例如 10 -9至 10 -13M)。
「 親和力」或「結合親和力」是指分子 (例如抗體) 之單一結合位點與其結合配偶體 (例如抗原) 之間的非共價相互作用之總和強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力」係指反映結合對成員 (例如抗體及抗原) 之間 1:1 交互作用之內在結合親和力。分子 X 對其搭配物 Y 之親和力通常可由解離常數 (Kd) 表示，解離常數為解離速率常數與締合速率常數 (分別為 koff 及 kon) 之比率。因此，等效親和力可包括不同速率常數，只要速率常數比保持相同即可。可以藉由本領域已知的習知方法測量親和力，包括彼等本文所述之方法。用於測定親和力之特定方法為表面電漿子共振 (SPR)。
如本文所用，術語「 高親和力」之抗體指代對標靶抗原具有 10 -9M 或更小，甚至更特定而言 10 -10M 或更小之 Kd 的抗體。術語「 低親和力」之抗體指代 Kd 為 10 -8或更高的抗體。
術語「 親和力成熟」之抗體指代在一或多個高度可變區 (HVR) 中具有一種或多種變化之抗體，與不具有該等變化之親本抗體相比，該等變化引起該抗體對於抗原之親和力的改善。
除非另有說明，否則「 CD20」指代 B 淋巴球抗原 CD20，亦稱為 B 淋巴球表面抗原 B1 或白血球表面抗原 Leu-16，且包括來自任何脊椎動物來源之任何天然 CD20，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如人類)、非人靈長類動物 (例如食蟹獼猴) 及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。人類 CD20 之胺基酸序列顯示在 Uniprot 登錄編號 P11836 (149 版，SEQ ID NO：61)。CD20 為一種疏水性跨膜蛋白，分子量為約 35 kD，於前 B 淋巴球及成熟 B 淋巴球上表現。相應之人類基因為跨膜 4 域次家族 A 成員 1，亦稱為 MS4A1。此基因編碼跨膜 4A 基因家族的成員。該新生蛋白家族的成員的特徵在於共同的結構特徵和相似的內含子/外顯子剪接邊界，並在造血細胞和非淋巴組織之間顯示出獨特的表現模式。該基因編碼 B 淋巴球表面分子，該分子在 B 細胞發育和分化為漿細胞中起作用。該家庭成員位於 11q12，在一簇家庭成員中。該基因的選擇式剪接導致編碼相同蛋白質的兩個轉錄本變異體。術語「CD20」涵蓋「全長」未經加工的 CD20 以及在細胞中加工所產生的任何形式之 CD20。該術語亦涵蓋天然生成之 CD20 變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。
術語「 抗 CD20 抗體」及「與 CD20 結合之抗體」指代一種抗體，該抗體能夠以足夠親和力與 CD20 結合，從而使得該抗體可用作靶向 CD20 之診斷劑及/或治療劑。在一個實施例中，抗 CD20 拮抗劑抗體與無關、非 CD20 蛋白質結合之程度低於該抗體與 CD20 結合約 10%，其藉由例如放射免疫測定 (RIA) 所量測。在某些實施例中，結合至 CD20 的抗體具有 ≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM、或 ≤ 0.001 nM (例如，10 -8M 或更小，例如 10 -8M 至 10 -13M，例如，10 -9M 至 10 -13M) 之解離常數 (Kd)。在某些實施例中，抗 CD20 拮抗劑抗體結合至 CD20 之抗原決定基，其在不同物種之 CD20 是保守性。
「 第 II 型抗 CD20 抗體」指代具有第 II 型抗 CD20 抗體之結合特性及生物學活性的抗 CD20抗體，如 Cragg 等人，Blood 103 (2004) 2738-2743；Cragg 等人，Blood 101 (2003) 1045-1052；Klein 等人，mAbs 5 (2013), 22-33 中所述，並總結在下表 1 中。 表 A 第 I 型及第 II 型抗 CD20 抗體的特性
第 I 型抗 CD20 抗體 第 II 型抗 CD20 抗體
結合第 I 類 CD20 抗原決定基 結合第 II 類 CD20 抗原決定基
將 CD20 定位在脂膜筏 不將 CD20 定位在脂膜筏
高 CDC* 低 CDC*
ADCC 活性* ADCC 活性*
與 B 細胞之完全結合能力 與 B 細胞之結合能力的大約一半
弱的同型聚集 同型聚集
低細胞死亡誘導 強細胞死亡誘導
* 如果 IgG 1同種型
第 II 型抗 CD20 抗體之示例包括例如奧比妥珠單抗 (GA101)、托西木單抗 (tositumumab) (B1)、人源化 B-Ly1 抗體 IgG1 (如 WO 2005/044859 中所揭露之嵌合人源化 IgG1 抗體)、11B8 IgG1 (如 WO 2004/035607 中所揭露) 以及 AT80 IgG1。
於一個態樣中，該第 II 型抗 CD20 抗體包含 SEQ ID NO: 55 之重鏈可變區序列 (V HCD20) 及 SEQ ID NO: 56 之輕鏈可變區序列 (V LCD20)。於另一態樣中，相較於非工程化抗體，該第 II 型抗 CD20 抗體經工程化以在 Fc 區具有增加比例之非岩藻糖苷化寡醣。於一個態樣中，該第 II 型抗 CD20 抗體之 Fc 區中至少約 40% 的 N-連接寡醣為非岩藻糖苷化者。
於特定態樣中，該第 II 型抗 CD20 抗體為奧比妥珠單抗 (建議 INN, WHO Drug Information，第 26 卷，第 4 期，2012，第 453 頁)。如本文所用，奧比妥珠單抗為 GA101 的同義詞。商品名為 GAZYVA® 或 GAZYVARO®。該版本取代了所有以前的版本 (例如，第 25 卷，第 1 期，2011，第 75-76 頁)，並且以前稱為阿夫土珠單抗 (afutuzumab) (建議 INN, WHO Drug Information，第 23 卷，第 2 期，2009 年，第 176 頁；第 22 卷，第 2 期，2008 年，第 124 頁)。於一個態樣中，該第 II 型抗 CD20 抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含 SEQ ID NO:62 之胺基酸序列，且該輕鏈包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列。於一個態樣中，該第 II 型抗 CD20 抗體為托珠單抗 (tositumomab)。
第 I 型抗 CD20 抗體之示例包括例如利妥昔單抗 (rituximab)、奧法木單抗 (ofatumumab)、維妥珠單抗 (veltuzumab)、奧卡妥珠單抗 (ocaratuzumab)、奧瑞珠單抗 (ocrelizumab)、PRO131921、烏妥昔單抗 (ublituximab)、HI47 IgG3 (ECACC，融合瘤)、2C6 IgG1 (如 WO 2005/103081 中所揭露)、2F2 IgG1 (如 WO 2004/035607 及 WO 2005/103081 中所揭露) 以及 2H7 IgG1 (如 WO 2004/056312 中所揭露)。
術語「人源化 B-Ly1 抗體」是指如 WO 2005/044859 和 WO 2007/031875 中所揭示的人源化 B-Ly1 抗體，其獲自鼠單株抗 CD20 抗體 B-Ly1 (鼠重鏈之可變區 (VH) 之：SEQ ID NO:64；鼠輕鏈之可變區 (VL)：SEQ ID NO:65 (參見 Poppema, S. 與 Visser, L., Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139)，其藉由與來自人類 IgG1 恆定域嵌合化且隨後人源化 (參見 WO 2005/044859 及 WO 2007/031875)。此等「人源化 B-Ly1 抗體」在 WO 2005/044859 及 WO 2007/031875 中詳細揭露。
術語「 減少」(及其語法變體，例如動詞或動名詞形式)，例如 B 細胞數量或細胞激素釋放的減少，指代相應數量的降低，如藉由本領域中已知之適當方法所測量者。為清楚起見，該術語亦包括降低至零 (或低於分析方法之偵測限值)，亦即完全廢除或消除。相反，「 增加」指代相應數量的增加。
如本文所使用，「 T 細胞抗原」是指存在於 T 淋巴球，特別是細胞毒性 T 淋巴球表面上的抗原決定位。
如本文所使用，「 T 細胞活化治療劑」是指能夠在個體中誘導 T 細胞活化的治療劑，特別是設計用於在個體中誘導 T 細胞活化的治療劑。T 細胞活化治療劑之示例包括與活化 T 細胞抗原 (例如 CD3) 及標靶細胞抗原 (例如 CD20 或 CD19) 特異性地結合之雙特異性抗體。其他示例包括嵌合抗原受體 (CAR)，其包含 T 細胞活化域及與標靶細胞抗原 (例如 CD20 或 CD19) 特異性地結合之抗原結合部分。
如本文中所使用的「 活化 T 細胞抗原」是指藉由 T 淋巴球 (特定而言是細胞毒性 T 淋巴球) 表現的抗原決定位，其能夠在與抗原結合分子相互作用時誘導或增強 T 細胞活化。具體而言，抗原結合分子與活化 T 細胞抗原之相互作用可藉由觸發 T 細胞受體錯合物之傳訊級聯來誘導 T 細胞活化。例示性的活化 T 細胞抗原為 CD3。
除非另有說明，否則術語「 CD3」是指來自任何脊椎動物來源之任何天然 CD3，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如，人類)、非人靈長類 (例如，食蟹獼猴) 和囓齒類動物 (例如，小鼠和大鼠)。該術語涵蓋「全長」、未處理之 CD3 以及在細胞處理中得到的任何形式的 CD3。該術語亦涵蓋天然生成之 CD3 變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。在一實施例中，CD3 是人類 CD3，特別是人類 CD3 的 ε 次單元 (CD3ε)。人類 CD3ε 的胺基酸序列顯示於 UniProt (www.uniprot.org) 登錄號 P07766 (版本 144) 或 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_000724.1。亦可參見 SEQ ID NO: 66。食蟹獼猴 [Macaca fascicularis] CD3ε 的胺基酸序列顯示於 NCBI GenBank 號 BAB71849.1。亦可參見 SEQ ID NO: 67。
術語「 包含特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域及特異性地結合至 LAG3 的第二抗原結合域的雙特異性抗體」、「特異性地結合 PD1 及 LAG3 的雙特異性抗體」、「對 PD1 及 LAG3 具特異性之雙特異性抗體」或「抗 PD1/抗 LAG3 抗體」在本文中可互換使用，並且指代一種雙特異性抗體，該雙特異性抗體能夠以足夠親和力結合 PD1 及 LAG3，使得該抗體可用為靶向 PD1 及 LAG3 的診斷劑及/或治療劑。
術語「 PD1」，亦稱為計畫性細胞死亡蛋白 1，為 288 個胺基酸的第 I 型膜蛋白，於 1992 年首次描述 (Ishida 等人，EMBO J., 11 (1992), 3887–3895)。PD-1 為 T 細胞調節物的擴充之 CD28/CTLA-4 家族之成員，並且具有兩個配體，PD-L1 (B7-H1、CD274) 及 PD-L2 (B7-DC、CD273)。該蛋白質之結構包括細胞外 IgV 域，然後係跨膜區及細胞內尾部。細胞內尾部包含兩個磷酸化位點，該等位點位於基於免疫受體酪胺酸之抑制模體中及基於免疫受體酪胺酸之開關模體中，表明 PD-1 負向調節 TCR 訊號。這與 SHP-1 及 SHP-2 磷酸酶在配體結合後與 PD-1 細胞質尾部的結合一致。雖然 PD-1 在初始 T 細胞上不表現，但它在 T 細胞受體 (TCR) 媒介之活化後上調，並且在活化及衰竭之 T 細胞上皆觀察到 (Agata 等人，Int. Immunology 8 (1996), 765-772)。該等衰竭之 T 細胞具有功能不良表型，且無法做出適當之反應。儘管 PD-1 具有相對廣泛的表現模式，但其最重要的作用可能是作為 T 細胞上之共抑制受體 (Chinai 等人，Trends in Pharmacological Sciences 36 (2015), 587-595)。因此，目前之治療方法側重於阻斷 PD-1 與其配體之交互作用以增強 T 細胞反應。術語「計畫性死亡 1」、「計畫性細胞死亡 1」、「蛋白質 PD-1」、「PD-1」、「PD1」、「PDCD1」、「hPD-1」及「hPD-I」可互換使用，且包括人類 PD-1 之變異體、同功型、物種同源物，以及與 PD-1 具有至少一個共同表位的類似物。人類 PD1 的胺基酸序列顯示於 UniProt (www.uniprot.org) 登錄號 Q15116 (SEQ ID NO:68)。
術語「 抗 PD1 抗體」及「包含與 PD1 結合之抗原結合域的抗體」指代一種抗體，該抗體能夠以足夠親和力結合 PD1 (尤其在細胞表面上表現之 PD1 多肽)，使得該抗體可用作靶向 PD1 之診斷劑及/或治療劑。於一個態樣中，該抗 PD1 抗體與無關之非 PD1 蛋白之結合程度小於抗體與 PD1 之結合程度的約 10%，例如藉由放射免疫檢定 (RIA) 或流式細胞分析技術 (FACS) 或藉由表面電漿子共振檢定，使用生物感測器系統例如 Biacore® 系統所測量。於某些態樣中，與人類 PD1 結合之抗原結合蛋白與人類 PD1 結合的結合親和力之 K D值為 ≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM、或 ≤ 0.001 nM (例如 10 -8M 或更低，例如 10 -8M 至 10 -13M，例如 10 -9M 至 10 -13M)。在一個較佳實施例中，對於 PD1 結合親和力，結合親和力之相應 K D值在表面電漿子共振檢定中使用人類 PD1 之細胞外域 (ECD) (PD1-ECD) 作為抗原來確定。術語「抗 PD1 抗體」亦包括能夠結合 PD1 及第二抗原之雙特異性抗體。
於具體態樣中，該抗 PD1 抗體係選自由 MDX 1106 (納武利尤單抗)、MK-3475 (帕博利珠單抗)、CT-011 (匹定利珠單抗 (pidilizumab))、PDR001 (斯帕利珠單抗 (spartalizumab))、SHR1210 (卡瑞利珠單抗 (camrelizumab))、MEDI-0680 (AMP-514)、REGN2810 及 BGB-108 所組成之群組。於一個特定態樣中，該抗 PD1 抗體為帕博利珠單抗或包含重鏈及輕鏈之抗體，該重鏈包含 SEQ ID NO:75 之胺基酸序列，且該輕鏈包含 SEQ ID NO:76 之胺基酸序列。帕博利珠單抗 (Merck)，亦稱為 MK-3475、Merck 3475、派姆單抗 (lambrolizumab)、SCH-900475 及 KEYTRUDA®，為 WO 2009/114335 所述之抗 PD-1 抗體 (CAS 登記號 1374853-91-4)。於一個特定態樣中，該抗 PD1 抗體為納武利尤單抗或包含重鏈及輕鏈之抗體，該重鏈包含 SEQ ID NO:77 之胺基酸序列，且該輕鏈包含 SEQ ID NO:78 之胺基酸序列。納武利尤單抗 (CAS 登記號：946414-94-4, Bristol-Myers Squibb/Ono)，亦稱為 MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558 及 OPDIVO®，為 WO 2006/121168 中所述之抗 PD-1 抗體 (CAS 登記號 946414-94-4)。於另一特定態樣中，該抗 PD-1 抗體包含：重鏈可變域 VH，其包含 SEQ ID NO:7 之胺基酸序列，及輕鏈可變域 VL，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；或其人源化變異體。於特定態樣中，該抗 PD-1 抗體包含：重鏈可變域 VH，其包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列，以及輕鏈可變域 VL，其包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列。
如本文所使用，除非另有說明，否則術語「 LAG3」或「Lag-3」或「淋巴球活化基因-3」或「CD223」指代來自任何脊椎動物來源之任何天然 LAG3，該脊椎動物包括哺乳動物，例如靈長類動物 (例如人類) 及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」、未處理之 LAG3 以及在細胞處理中得到的任何形式之 LAG3。該術語亦涵蓋天然生成之 LAG3 變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。於一個較佳實施例中，術語「LAG3」指代人類 LAG3。示例性經處理 (不含訊號序列) 之 LAG3 之胺基酸序列如 SEQ ID NO:69 所示。示例性細胞外域 (ECD) LAG3 之胺基酸序列如 SEQ ID NO:70 所示。
術語「 抗 LAG3 抗體」及「 與 LAG3 結合之抗體」指代一種抗體，該抗體能夠以足夠親和力與 LAG3 結合，使得該抗體可用作靶向 LAG3 之診斷劑及/或治療劑。於一個態樣中，該抗 LAG3 抗體與無關之非 LAG3 蛋白質結合之程度低於該抗體與 LAG3 結合的約 10%，其藉由例如放射免疫檢定 (RIA) 所測量。在某些實施例中，結合至 LAG3 的抗體具有 ≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM、或 ≤ 0.001 nM (例如 10 -8M 或更低，例如 10 -8M 至 10 -13M，例如 10 -9至 10 -13M) 之解離常數 (Kd) 。於某些態樣中，抗 LAG3 抗體結合至 LAG3 之表位，其在不同物種之 LAG3 是保守性。在一個較佳實施例中，「 抗 LAG3 抗體」「 特異性地結合至人類 LAG3 的抗體」及「 特異性地結合至人類 LAG3 的抗體」指代特異性地結合至人類 LAG3 抗原或其細胞外域 (ECD) 之抗體，結合親和力之 K D值為 1.0 x 10 -8mol/l 或更低，在一個實施例中，K D值為 1.0 x 10 ‑9mol/l 或更低，在一個實施例中，K D值為 1.0 x 10 ‑9mol/l 至 1.0 x 10 -13mol/l。於該語境下，以標準結合檢定確定結合親和力，例如以表面電漿子共振技術 (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Sweden) 例如使用 LAG3 細胞外域確定。術語「抗 LAG3 抗體」亦包括能夠結合 LAG3 及第二抗原之雙特異性抗體。於一個態樣中，該抗 LAG3 抗體為瑞拉利單抗 (relatlimab) 或 BMS-986016，或為包含重鏈可變域及輕鏈可變域之抗體，該重鏈可變域包含 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列，且該輕鏈可變域包含 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列。
「 阻斷」抗體或「拮抗劑」抗體為一種抑制或降低與其結合之抗原之生物學活性的抗體。在一些實施例中，某些阻斷抗體或拮抗劑抗體實質上或完全地抑制抗原的生物學活性。例如，本發明之雙特異性抗體阻斷透過 PD-1 及 LAG3 進行之傳訊，從而使藉由 T 細胞進行之功能性反應 (例如，增生、細胞激素生成、標靶細胞毒殺) 從功能不良狀態復原到抗原刺激。
術語「 可變區」或「可變域」指代抗體重鏈或輕鏈中涉及抗原結合分子與抗原之結合的域。天然抗體之重鏈及輕鏈 (分別為 VH 及 VL) 之可變域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保守性骨架區 (FR) 及三個高度可變區 (HVR)。參見例如 Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)。單個 VH 或 VL 域可能足以賦予抗原結合特異性。
如本文所用，術語「 高度可變區」或「 HVR」指代抗體可變域中序列高度可變並決定抗原結合特異性的各個區，例如「互補決定區」(「CDR」)。通常，抗體包括六個 CDR：三個在 VH 中 (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，及三個在 VL 中 (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。在本文中，例示性 CDR 包括： (a) 高度可變環存在於胺基酸殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、及 96-101 (H3) 處 (Chothia 與 Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))； (b) CDR 存在於胺基酸殘基 24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、及 95-102 (H3) 處 (Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；及 (c) 抗原接觸存在於胺基酸殘基 27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、及 93-101 (H3) 處 (MacCallum 等人 J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))。
除非另有說明，否則 CDR 根據 Kabat 等人之上述文獻中所述之方法確定。本領域之技術人員將理解，也可以根據 Chothia 之上述文獻、McCallum 之上述文獻中所述之方法或任何其他科學上接受之命名系統確定 CDR 名稱。
術語「如 Kabat 中之可變域殘基編號」或「如 Kabat 中之胺基酸位置編號」及其變化形式指代用於 Kabat 等人中抗體之編譯之重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用該編號系統，實際線性胺基酸序列可包含較少或額外的胺基酸，其對應於可變域的 FR 或 HVR 的縮短或插入。例如，重鏈可變域可包括在 H2 之殘基 52 之後的單個胺基酸插入 (根據 Kabat 為殘基 52a) 以及在重鏈 FR 殘基 82 之後的插入殘基 (例如，根據 Kabat 為殘基 82a、82b 及 82c 等)。可藉由比對給定抗體之序列同源性區域與「標準」Kabat 編號序列來確定該抗體之殘基的 Kabat 編號。一般而言，天然四鏈抗體包含六個 HVR；三個在 VH 中 (H1、H2、H3)，且三個在 VL 中 (L1、L2、L3)。
「 骨架」或「FR」是指除高度可變區 (HVR) 殘基之外的可變域殘基。可變域之 FR 通常由四個 FR 域組成：FR1、FR2、FR3、及 FR4。因此，HVR 及 FR 序列通常以如下順序出現在 VH (或 VL) 中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
就本文目的而言，「 接受者人類骨架」是包含源自人類免疫球蛋白骨架或人類共通骨架的輕鏈可變域 (VL) 骨架或重鏈可變域 (VH) 骨架的胺基酸序列的骨架，如下定義。「衍生自 (derived from)」人免疫球蛋白骨架或人共通骨架的受體人骨架可包含與此等為相同的胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列的變更。在一些實施例中，胺基酸變化數為 10 或更少、9 或更少、8 或更少、7 或更少、6 或更少、5 或更少、4 或更少、3 或更少、或 2 或更少。在一些實施例中，VL 受體人類骨架與 VL 人類免疫球蛋白骨架序列或人類共同骨架序列的序列相同。
術語「 嵌合」抗體是指其中重鏈及/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分源自不同來源或物種的抗體。
抗體之「 類 (class)」是指其重鏈所具有的恆定域或恆定區的類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG 及 IgM，且彼等中的幾種可進一步分為子類 (同型 (isotype))，例如 IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4、IgA 1及 IgA 2。對應於不同類之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。
「 人源化」抗體是指包含來自非人類 HVR 之胺基酸殘基及來自人類 FR 之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人源化抗體將包括實質上所有至少一個 (且通常兩個) 可變域，其中所有或實質上所有 HVR (例如 CDR) 對應於非人抗體之其等，及所有或實質上所有 FR 對應對於人抗體之其等。人源化抗體視情況可包含衍生自人抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體 (例如非人類抗體) 之「 人源化形式」是指已經歷人源化的抗體。本發明所涵蓋的「人源化抗體 (humanized antibody)」之其他形式為其中恆定區已自原始抗體之形式另外修飾或改變者，以產生根據本發明之性質、尤其關於 C1q 結合及/或 Fc 受體 (FcR) 結合之性質。
「 人類」抗體為一種抗體，其具有之胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生的胺基酸序列或來自利用人類抗體譜系 (antibody repertoire) 或其他人類抗體編碼序列之非人類來源所衍生之胺基酸序列。人抗體的該定義特定地排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。
如本文所用的術語「 單株抗體」指代獲自實質上同源抗體群體的抗體，亦即構成群體之個體抗體為相同的及/或結合相同的表位，除了可能的變異體抗體，例如，包含天然發生之突變或在單株抗體製劑之生產過程中產生的變異體抗體，此類變異體通常以少量存在。與通常包括針對不同決定位 (抗原決定基) 之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定位。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，意欲根據本發明使用的單株抗體可藉由多種技術來製造，包括但不限於融合瘤方法、重組 DNA 方法、噬菌體展示方法、及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法，本文描述此等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法。
本文之術語「Fc 域」或「 Fc 區」用於定義抗體重鏈的 C 端區域，該區域含有恆定區之至少一部分。該術語包括天然序列 Fc 區域和變異體 Fc 區域。特定而言，人類 IgG 重鏈 Fc 區域從 Cys226 或 Pro230 延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc 區域的 C 端離胺酸 (Lys447) 可以存在或可以不存在。重鏈之胺基酸序列總是呈現為具有 C 端離胺酸，但本發明包括沒有 C 端離胺酸的變異體。
IgG Fc 區包含 IgG CH2 和 IgG CH3 域。人類 IgG Fc 區的「CH2 域」通常從約位置 231 處之胺基酸殘基延伸至約位置 340 處之胺基酸殘基。在一實施例中，碳水化合物鏈附接至 CH2 域。本文的 CH2 域可為天然序列 CH2 域或變異體 CH2 域。「CH3 域」包含 Fc 區中 CH2 域之 C 端殘基段 (亦即從 IgG 的約位置 341 處之胺基酸殘基到約位置 447 處之胺基酸殘基)。本文中，CH3 區可為天然序列 CH3 域或變異體 CH3 域 (例如在其一個鏈中具有引入之「隆凸」(「杵」)且在其另一個鏈中具有對應的引入之「凹穴」(「臼」) 之 CH3 域，參見美國專利號 5,821,333，其藉由引用方式明確併入本文中)。此類變異體 CH3 域可用於促進如本文中所描述之兩個非一致抗體重鏈之異二聚化。除非本文另有說明，否則 Fc 區或恆定區中胺基酸殘基之編號根據 EU 編號系統 (也稱為 EU 指數) 進行，如 Kabat 等人所述 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)。
「 杵臼 (knob-into-hole)」技術描述於例如：US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)；及 Carter，J Immunol Meth 248，7-15 (2001)。通常，該方法包括在第一多肽之界面處引入一個突起 (「杵」)，並且在第二多肽之界面中引入一個對應的空腔 (「臼」)，以使該突起可定位於空腔中，從而促進異源二聚體形成並阻礙同源二聚體形成。透過用較大側鏈 (例如酪胺酸或色胺酸) 替換第一多肽界面上之較小的胺基酸側鏈來構建突起。透過將較大胺基酸側鏈替換為較小的胺基酸側鏈 (例如丙胺酸或蘇胺酸)，在第二多肽之界面中形成與突起具有相同或相近大小的互補空腔。可透過改變編碼多肽的核酸 (例如透過針對特定位點之突變或透過胜肽合成) 來製備突起和空腔。在一特定實施例中，杵修飾包含 Fc 域之兩個次單元中之一者中的胺基酸取代 T366W，且臼修飾包含 Fc 域之兩個次單元中之另一者中的胺基酸取代 T366S、L368A 及 Y407V。在另一特定實施例中，包含杵修飾之 Fc 域之子單元額外包含胺基酸取代 S354C，且包含臼修飾之 Fc 域的次單元額外包含胺基酸取代 Y349C。引入此等兩個半胱胺酸殘基使得 Fc 區之兩個子單元之間形成雙硫鍵結，由此進一步穩定二聚體 (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。
「與免疫球蛋白之 Fc 區等效之區域」意指包括免疫球蛋白之 Fc 區的天然存在之對偶基因變異體以及具有變化之變異體，該等變化產生取代、添加或缺失，但不實質上降低免疫球蛋白媒介效應子功能 (例如抗體依賴性細胞毒性) 的能力。例如，免疫球蛋白 Fc 區之 N 端或 C 端可缺失一個或多個胺基酸而不實質上損失生物功能。該等變異體可根據本領域中已知的一般法則選擇以對活性具有最小影響 (參見例如， Bowie, J. U. 等人，Science 247:1306-10 (1990))。
術語「 效應子功能」是指歸因於抗體的 Fc 區域的那些生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效用功能的實例包括：C1q 結合及補體依賴性細胞毒性 (CDC)、Fc 受體結合、抗體依賴型細胞媒介的細胞毒性 (ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP)、細胞激素分泌、抗原呈現細胞攝取之免疫錯合物媒介抗原、細胞表面受體 (例如，B 細胞受體) 降調及 B 細胞活化。
「 活化 Fc 受體」為 Fc 受體在與抗體之 Fc 區接合之後，引發信號傳導事件，刺激攜帶受體之細胞以執行效應子功能。活化 Fc 受體包括 FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32) 及 FcαRI (CD89)。特定活化 Fc 受體為人類 FcγRIIIa (參見 UniProt 寄存編號 P08637，版本 141)。
術語「 肽連接子」是指包含一個或多個胺基酸，通常約 2 至 20 個胺基酸的肽。肽連接子為此項技術中已知或描述於本文中。適合的非免疫原性連接子肽為，例如，(G 4S) n、(SG 4) n或 G 4(SG 4) n肽連接子，其中「n」通常為介於 1 至 10 之間 (通常介於 2 至 4 之間，特定而言 2) 的數字。特別感興趣之肽連接子為(G4S) (SEQ ID NO:71)、(G 4S) 2或 GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:72)、(G4S) 3(SEQ ID NO:73) 及 (G 4S) 4(SEQ ID NO:74)，更特定而言 (G 4S) 2或 GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:72)。
「融合至」或「連結至」意指組分 (例如抗原結合域或 FC 域) 藉由肽鍵直接或經由一個或多個肽連接子連接。
如本申請案所載之術語「 胺基酸」表示天然存在之羧基 α-胺基酸之群組，其包含丙胺酸 (三字母代碼：ala，一字母代碼：A)、精胺酸 (arg，R)、天冬醯胺酸 (asn，N)、天冬胺酸 (asp，D)、半胱胺酸 (cys，C)、麩醯胺酸 (gln，Q)、麩胺酸 (glu，E)、甘胺酸 (gly，G)、組胺酸 (his，H)、異白胺酸 (ile，I)、白胺酸 (leu，L)、離胺酸 (lys，K)、甲硫胺酸 (met，M)、苯丙胺酸 (phe，F)、脯胺酸 (pro，P)、絲胺酸 (ser，S)、蘇胺酸 (thr，T)、色胺酸 (trp，W)、酪胺酸 (tyr，Y) 及纈胺酸(val，V)。
相對於參考多肽序列 (蛋白質) 之「 胺基酸序列同一性百分比 (%)」定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入間隙以達成最大序列同一性百分比之後，且在不將保守性取代視為序列同一性之一部分之情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。出於測定胺基酸序列同一性百分比之目的之比對可以此項技術內之各種方式實現，例如使用公開可用之電腦軟體，例如 BLAST、BLAST-2、ALIGN.SAWI 或 Megalign (DNASTAR) 軟體。本領域之技術人員可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大比對所需之任何演算法。然而，出於本文的目的，使用序列比較電腦程式 ALIGN-2 產生 ％ 胺基酸序列同一性值。ALIGN-2 序列比較電腦程式由建南德克公司 (Genentech，Inc.) 編寫，原始程式碼已與用戶文檔一起存檔於美國版權局，華盛頓特區，20559，並以美國版權註冊號 TXU510087 進行註冊。ALIGN-2 程式可從加利福尼亞南三藩市的建南德克公司 (Genentech，Inc.) 公眾可取得，亦可以從原始程式碼進行編譯。ALIGN-2 程式應編譯為在 UNIX 作業系統（包括數位 UNIX V4.0D）上使用。所有序列比較參數均由 ALIGN-2 程式設置，並且沒有變化。在使用 ALIGN-2 進行胺基酸序列比較的情況下，既定胺基酸序列 A 對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 的 % 胺基酸序列同一性（其視情況表述為既定胺基酸序列 A，其對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 具有或包含一定 % 的胺基酸序列同一性）計算如下： 100 乘以分數 X/Y 其中 X 為序列排列程式 ALIGN-2 在 A 與 B 程式排列中評分為同一匹配的胺基酸殘基數，Y 為 B 中胺基酸殘基的總數。應當理解的是，在胺基酸序列 A 的長度不等於胺基酸序列 B 的長度的情況下，A 與 B 的 % 胺基酸序列同一性將不等於 B 與 A 的 % 胺基酸序列同一性。除非另有特別說明，否則如前一段所述，使用 ALIGN-2 電腦程式獲得本文使用的所有 % 胺基酸序列同一性值。
於某些態樣中，考慮到本文提供的本發明之雙特異性抗體之 胺基酸序列變異體。例如，可能希望改善該等雙特異性抗體之結合親和力及/或其他生物學特性。可藉由將適當的修飾引入編碼該等分子之核苷酸序列中，或藉由肽合成來製備雙特異性抗體之胺基酸序列變異體。此等修飾包括例如抗體之胺基酸序列中的殘基的缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入和取代之任意組合以得到最終構建體，前提條件是最終構建體具有所需之特徵，例如抗原結合特徵。用於取代性誘變之感興趣的位點包括 HVR 及骨架 (FR)。保守性取代以標題「較佳取代」提供於表 C 中，並在下文中參考胺基酸側鏈分類 (1) 至 (6) 進一步描述。可將胺基酸取代引入相關分子且針對所需活性篩選產物，例如保持/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之 ADCC 或 CDC。 表 B
原始 殘基 例示性 取代 較佳 取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據常見的側鏈特性進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp，Glu； (4) 鹼性：His，Lys，Arg; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly，Pro； (6) 芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代需要將這些類別中之一類的成員交換為另一類的成員。
術語「 胺基酸序列變異體」包括實質性變異體，其中在親本抗原結合分子 ( 例如人源化或人類抗體) 之一個或多個高度可變區殘基中存在胺基酸取代。通常，所選擇用於進一步研究的所產生之變異體與親代抗原結合分子相比將具有某些生物特性之修飾 (例如改良) (例如提高的親和力、降低的免疫原性) 及/或將實質上保持親本抗原結合分子之某些生物特性。例示性取代變體是親和性成熟的抗體，其可以方便地產生，例如，使用基於噬菌體展示的親和性成熟技術，例如本文所述的那些。簡言之，一個或多個 HVR 殘基突變且變異體抗原結合分子在噬菌體上呈現並針對特定生物活性 (例如結合親和力) 進行篩選。在某些實施例中，一個或多個 HVR 內可存在取代、插入或缺失，只要此類變化不實質上降低抗原結合分子結合抗原之能力即可。例如，可在 HVR 中實施基本上不降低結合親和力的保守修改（例如，本文所提供之保守性替換）。鑑定可以靶向誘變的抗體的殘基或區域的可用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如下列所述：Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085。在該方法中，識別殘基或目標殘基組（例如，帶電荷的殘基，如 Arg、Asp、His、Lys 和 Glu），並用中性或帶負電荷的胺基酸（例如，丙胺酸或聚丙胺酸）取代以確定抗體與抗原之交互作用是否受到影響。可在胺基酸位置引入更多取代，表明對初始取代具有良好的功能靈敏度。或者或另外地，抗原-抗原結合分子之晶體結構複合以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基和鄰近殘基可靶向或消除為取代的候選物。可篩選變異體以確定它們是否包含所欲之特性。
胺基酸序列插入包括胺基及/或羧基末端融合體之長度，從一個殘基到包含一百個或更多殘基之多肽，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入之示例包括具有 N 端甲硫胺醯基殘基的雙特異性抗體。該分子之其他插入性變異體包括與多肽之 N 端或 C 端的融合，該多肽延長該雙特異性抗體之血清半衰期。
於某些態樣中，改變本文提供的雙特異性抗體以增加或減弱該抗體發生醣基化之程度。藉由改變胺基酸序列 (例如可改變附接至 Fc 域之碳水化合物) 從而產生或移除一個或多個醣基化位點，可便利地獲得分子之醣基化變異體。由哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含分支的雙觸角寡醣，該寡醣通常藉由 N-鍵聯附接至 Fc 區之 CH2 域的 Asn297。例如參見 Wright 等人， TIBTECH15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露醣、N-乙醯基葡醣胺 (GlcNAc)、半乳醣及唾液酸以及在雙觸角寡醣結構之「莖」中附接至 GlcNAc 的岩藻醣。在一些實施例中，可對本發明之雙特異性抗體中之寡醣進行修飾，以產生具有某些改善之特性的變異體。於一個態樣中，提供具有缺少 (直接或間接地) 附接至 Fc 區之岩藻糖的碳水化合物結構之雙特異性抗體變異體。此類岩藻醣基化變異體可具有改良之 ADCC 功能，參見例如，美國專利公開號 US 2003/0157108 (Presta, L.) 或 US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。本發明之雙特異性抗體之其他變異體包括具有平分寡醣之變異體，例如，其中附接至 Fc 區之雙觸角寡醣藉由 GlcNAc 平分。該等變異體可具有降低之岩藻糖苷化及/或改良之 ADCC 功能，參見例如，WO 2003/011878 (Jean-Mairet 等人)；美國專利號 6,602,684 (Umana 等人)；及 US 2005/0123546 (Umana 等人)。亦提供寡醣中之至少一個半乳糖殘基與 Fc 區連接之變異體。該等抗體變異體可具有改良的 CDC 功能且描述於例如，WO 1997/30087 (Patel 等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及 WO 1999/22764 (Raju, S.) 中。
於某些態樣中，可能需要產生本發明之雙特異性抗體的 經半胱胺酸工程化之變異體，例如「thioMAb」，其中分子之一個或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在於分子之可達位點處。藉由用半胱胺酸取代此等殘基，藉此將反應性硫醇基置於抗體可達的位點，並可用於使抗體與其他部分 (諸如藥物部分或連接子-藥物部分) 結合以產生免疫結合物。在某些實施例中，以下任何一個或多個殘基可被半胱胺酸取代：輕鏈的 V205 (Kabat 編號)；重鏈的 A118 (EU 編號)；及重鏈 Fc 區的 S400 (EU 編號)。可例如美國專利號 7,521,541 中所述產生經半胱胺酸工程化的抗原結合分子。
於某些態樣中，可進一步修飾本文所提供之雙特異性抗體，以使其含有本技術領域中已知且容易獲得的附加的非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇 (PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸 (均聚物或隨機共聚物) 以及葡聚醣或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇 (例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，且可聚支鏈或無支鏈。連接至抗體的聚合物之數量可以變化，並且如果連接的聚合物超過一種，則它們可以為相同或不同之分子。通常，用於衍生化的聚合物之數量及/或類型可基於以下考慮因素來確定，此等考慮因素包括但不限於待改善之抗體的特定性質或功能、雙特異性抗體衍生物是否將用於指定條件下的治療中等。
於另一態樣中，提供可藉由曝露於輻射而選擇性加熱之抗體與非蛋白質部分的結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管 (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605)。輻射可具有任何波長，且包括，但不限於不損害一般細胞但將非蛋白質部分加熱至殺死抗體-非蛋白質部分附近之細胞之溫度的波長。
「 免疫結合物」為結合於一個或多個異源分子之抗體，該異源分子包括，但不限於細胞毒性劑。
術語「 多核苷酸」是指分離之核酸分子或構建體，例如訊息 RNA (mRNA)、病毒源 RNA 或質體 DNA (pDNA)。多核苷酸可包含習知的磷酸二酯鍵或非習知的鍵 (例如醯胺鍵，諸如胜肽核酸 (PNA) 中所見)。術語「核酸分子」，是指任何存在於多核苷酸中之一個或多個核酸片段，例如 DNA 或 RNA 片段。
藉由「 分離的」核酸分子或多核苷酸旨在自原生環境中移出的核酸分子、DNA 或 RNA。例如，就本發明而言，編碼載體中所含之多肽的重組多核苷酸被視為是經分離。經分離之多核苷酸之更多實例包括在異源性宿主細胞中保持之重組多核苷酸或溶液中經純化之 (部分或基本上) 多核苷酸。經分離之多核苷酸包括通常包含多核苷酸分子之細胞中所含之多核苷酸分子，但是多核苷酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。分離的 RNA 分子包括本發明之活體內或活體外 RNA 轉錄物，以及正股及負股形式，及雙股形式。根據本發明之經分離之多核苷酸或核酸進一步包括合成產生之此等分子。此外，多核苷酸或核酸可以為或可以包括調控元件，諸如啟動子、核醣體結合位點或轉錄終止子。
藉由與本發明的參考核苷酸序列具有至少例如 95% 的「同一性」的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，意指該多核苷酸的核苷酸序列與參考序列具有同一性，除了參考核苷酸序列的每 100 個核苷酸，多核苷酸序列最多可包含五個點突變。換句話說，為了獲得與參考核苷酸序列具有至少 95% 的同一性的核苷酸序列的多核苷酸，可以刪除參考序列中最多 5% 的核苷酸或用另一個核苷酸取代，或者將參考序列中核苷酸總數最多 5% 的核苷酸數插入到參考序列中。參考序列的這些改變可能發生在參考核苷酸序列的 5’ 端或 3’ 端位置或這些末端位置之間的任何位置，既散佈在參考序列的殘基之間，也散佈在參考序列內的一個或多個連續基團中。實際上，任何特定的多核苷酸序列是否與本發明的核苷酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性可以使用已知的電腦程式習知地確定，諸如如上討論用於多肽的程式 (例如，ALIGN-2)。
術語「 表現匣」是指以重組或合成方式產生的多核苷酸，其具有允許標靶細胞中之特定核酸發生轉錄的一系列特定核酸元件。重組表現匣可被引入質體、染色體、粒線體 DNA、色素體 DNA、病毒或核酸片段中。通常，表現載體之重組表現匣部分除其他序列外還包括待轉錄之核酸序列和啟動子。在某些實施例中，本發明之表現匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的多核苷酸序列。
術語「 載體」或「表現載體」與「表現構建體」同義，且是指用於導入特定基因並導引該基因表現的 DNA 分子，該 DNA 分子與該基因在標靶細胞中可操作地連接。該術語包括作為自我複制核酸結構之載體以及摻入已引入該宿主細胞的基因體中的載體。本發明之表現載體包含表現匣。表現載體轉錄大量穩定的 mRNA。一旦表現載體進入標靶細胞內，則藉由細胞轉錄及/或轉譯機構產生由該基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施例中，本發明之表現載體包含表現匣，該表現匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的多核苷酸序列。
術語「 宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用，且是指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉化子」和「轉化細胞」，其包括原代轉化細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文包括與自原始轉變細胞中所篩選或選擇具有相同功能或生物活性的突變子代細胞。宿主細胞為可用於產生本發明之雙特異性抗原結合分子的任何類型之細胞系統。特定而言，宿主細胞為原核或真核宿主細胞。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，諸如 CHO 細胞、BHK 細胞、NS0 細胞、SP2/0 細胞、YO 骨髓瘤細胞、P3X63 小鼠骨髓瘤細胞、PER 細胞、PER.C6 細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞 (僅舉數例)，但亦包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或培養植物或動物組織內所含的細胞。
藥劑之「 有效量」是指使其所投與之細胞或組織中產生生理學變化所需的量。
藥劑 (例如醫藥組成物) 之「 治療有效量」是指在必需的劑量及時段情況下，有效達成所需治療或預防結果的量。治療有效量的藥劑例如消除、減少、延遲、最小化或防止疾病的不利影響。
「 個體」或「受試者」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物 (例如人及非人類靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒類動物 (例如小鼠及大鼠)。特別地，個體或受試者為人類。
術語「 醫藥組成物」是指所呈形式允許其中所含活性成分之生物活性有效發揮的製劑，且其不含對調配物將投與之個體具有不可接受毒性之其他組分。
「 醫藥上可接受之賦形劑」是指醫藥組成物中之除活性成分以外的對個體無毒的成分。醫藥上可接受之賦形劑包含，但不限於緩衝劑、穩定劑或防腐劑。
術語「 藥品仿單」用於指通常包括於治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於與使用此類治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌及/或警告之資訊。
如本文所使用，「 治療 (treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療 (treat)」或「治療 (treating)」) 係指試圖改變所治療受試者之自然病程的臨床介入，並可出於防治目的或在臨床病理學之病程期間進行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之分子用於延遲疾病發展或減慢疾病之進程。
如本文所用，術語「 癌症」包括淋巴瘤、淋巴球性白血病、肺癌、非小細胞肺 (NSCL) 癌、細支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌 (stomach cancer)、胃癌 (gastric cancer)、大腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、何杰金氏病 (Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎臟或尿管之癌症、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽癌、中樞神經系統 (CNS) 之贅瘤、脊柱軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、脊膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤，包括以上癌症中之任一者之頑抗性版本，或以上癌症中之一或多者之組合。在一個實施例中，術語癌症指代CD20 表現癌症。
術語「 CD20 之表現」旨在表示 CD20 於細胞中，較佳於 T 細胞或 B 細胞 (更佳分別在來自腫瘤或癌症 (較佳非實性瘤) 之 B 細胞) 之細胞表面上的顯著表現水平。可以藉由本領域已知之標準檢定法來確定患有「CD20 表現癌症」的患者。例如，可以使用免疫組織化學 (IHC) 偵檢、FACS 或經由基於 PCR 之相應 mRNA 偵檢來測量 CD20 抗原之表現。
如本文所用，術語「 CD20 表現癌症」指代其中癌細胞顯示 CD20 抗原表現的全部癌症。較佳的是，如本文所用，CD20 表現癌症指代淋巴瘤 (較佳 B 細胞非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)) 及淋巴球性白血病。該等淋巴瘤及淋巴球性白血病包括例如 a) 濾泡性淋巴瘤，b) 小的非裂解細胞淋巴瘤/伯奇氏淋巴瘤 (包括地方性伯奇氏淋巴瘤、散發性伯奇氏淋巴瘤及非伯奇氏淋巴瘤)，c) 緣帶淋巴瘤 (包括結外邊緣區 B 細胞淋巴瘤 (粘膜相關淋巴組織淋巴瘤，MALT)、淋巴結邊緣區 B 細胞淋巴瘤及脾緣帶淋巴瘤)、d) 被套細胞淋巴瘤 (MCL)、e) 大細胞淋巴瘤 (包括 B 細胞彌漫型大細胞淋巴瘤 (DLCL)、彌漫型混合細胞淋巴瘤、免疫母細胞淋巴瘤、原發性縱隔 B 細胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤-肺 B 細胞淋巴瘤)，f) 毛細胞白血病，g) 淋巴球性淋巴瘤、華氏巨球蛋白血症，h) 急性淋巴球性白血病 (ALL)、慢性淋巴球性白血病 (CLL)/小淋巴球性淋巴瘤 (SLL)、B 細胞幼淋巴球性白血病，i) 漿細胞腫瘤、漿細胞骨髓瘤、多發性骨髓瘤、漿細胞瘤，j) 何杰金氏病。
於一個態樣中，CD20 表現癌症為 B 細胞非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)。於另一態樣中，CD20 表現癌症選自由以下所組成之群組：被套細胞淋巴瘤 (MCL)、急性淋巴球性白血病 (ALL)、慢性淋巴球性白血病 (CLL)、B 細胞彌漫型大細胞淋巴瘤 (DLCL)、伯奇氏淋巴瘤、毛細胞白血病、濾泡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、緣帶淋巴瘤、移植後淋巴組織增生性失調 (PTLD)、HIV 相關淋巴瘤、華氏巨球蛋白血症或原發性 CNS 淋巴瘤。
「 B 細胞增生性失調」意指一種疾病，其中患者之 B 細胞數量相較於健康受試者之 B 細胞數量有所增加，並且特定而言其中 B 細胞數量之增加係該疾病之原因或標誌。「CD20 陽性 B 細胞增生性失調」為 B 細胞增生性失調，其中 B 細胞，特別是惡性 B 細胞（除了正常 B 細胞之外），表現 CD20。示例性 B 細胞增生失調包括非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)、急性淋巴球性白血病 (ALL)、慢性淋巴球性白血病 (CLL)、彌漫型大 B 細胞淋巴瘤 (DLBCL)、濾泡性淋巴瘤 (FL)、被套細胞淋巴瘤 (MCL)、緣帶淋巴瘤 (MZL)、以及以下類型之多發性骨髓瘤 (MM) 及何杰金氏淋巴瘤 (HL)。
術語「 治療方法」、「治療的方法」或其等效詞，當應用於例如癌症時，指代旨在減少或消除患者體內癌細胞數量或減輕癌症之症狀的程序或行動過程。「治療」癌症或另一種增生性失調的方法並不一定意味著癌細胞或其他疾病實際上會被消除，細胞或疾病的數量實際上會減少，或癌症或其他疾病實際上會得到緩解。通常，即使成功的可能性很低，也會執行治療癌症之方法，但是，鑑於患者之病史及估計之存活預期，仍然認為該方法會誘導總體有益的行動過程。
術語「 組合」、「 共同投予」或「 共投予」指代將抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體與抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體作為兩個單獨之調配物 (或作為一個單一調配物) 投予。共同投予可以以任一順序同時或順序地進行，其中，較佳在一段時間內兩種 (或全部) 活性劑同時發揮其生物學活性。抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體與抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體同時或依序 (例如經靜脈內 (i.v.) 透過連續輸注 (一者用於抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，且一者用於抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體) 投予。當兩種治療劑依序共同投予時，給藥或者在同一天分兩次單獨投予進行投予，或者一種藥物在第 1 天投予且第二種藥物在第 2 天至第 7 天 (較佳在第 2 天至到第 4 天) 共同投予。因此，術語「依序」指代在第一組分 (抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體或抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體) 給藥後 7 天內，較佳在第一組分給藥後 4 天內；並且「同時」意指同一時間。關於抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體之維持劑量的術語「共同投予」意指維持劑量可以或者同時共同投予，如果治療週期適用於兩種藥物，則例如每週投予。或者抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體係每兩週投予，而抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體係每三週投予。或者維持劑量或在一天內或在幾天內依序共同投予。
用於本發明的示例性抗 CD20/ 抗 CD3 雙特異性抗體
本發明涉及抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及其與抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體組合使用之用途，特定而言涉及它們在用於治療或延緩CD20 表現癌症之進展 (更特定而言用於治療或延緩 B 細胞增生性失調之進展) 之方法中的用途。如本文所使用之抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體為包含與 CD3 結合之第一抗原結合域及與 CD20 結合之第二抗原結合域的雙特異性抗體。因此，它們靶向表現 CD20 之 B 細胞。
因此，如本文所使用之抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第一抗原結合域及第二抗原結合域，該第一抗原結合域包含重鏈可變區 (V HCD3) 及輕鏈可變區 (V LCD3)，且該第二抗原結合域包含重鏈可變區 (V HCD20) 及輕鏈可變區 (V LCD20)。
於特定態樣中，用於在組合中使用之抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD3)，其包含 SEQ ID NO:41 之 CDR-H1 序列、SEQ ID NO:42 之 CDR-H2 序列及 SEQ ID NO:43 之 CDR-H3 序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD3)，其包含 SEQ ID NO:44 之 CDR-L1 序列、SEQ ID NO:45 之 CDR-L2 序列及 SEQ ID NO:46 之 CDR-L3 序列。更特定而言，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD3)，其與 SEQ ID NO:47 之胺基酸序列為至少90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同；及/或輕鏈可變區 (V LCD3)，其與 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列為至少 90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同。於又一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含：重鏈可變區 (V HCD3)，其包含 SEQ ID NO:47 之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD3)，其包含 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列。
於一個態樣中，與 CD3 特異性地結合之抗體為全長抗體。於一個態樣中，與 CD3 特異性地結合之抗體為人類 IgG 類抗體，特定而言人類 IgG 1類抗體。於一個態樣中，與 CD3 特異性地結合之抗體為抗體片段，特定而言 Fab 分子或 scFv 分子，更特定而言 Fab 分子。於特定態樣中，與 CD3 特異性地結合之抗體為交叉型 Fab 分子，其中 Fab 重鏈與 Fab 輕鏈之可變域或恆定域被交換 (亦即彼此替換)。於一個態樣中，與 CD3 特異性地結合之抗體為人源化抗體。
於另一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD20)，其包含 SEQ ID NO:49 之 CDR-H1 序列、SEQ ID NO:50 之 CDR-H2 序列及 SEQ ID NO:51 之 CDR-H3 序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD20)，其包含 SEQ ID NO:52 之 CDR-L1 序列、SEQ ID NO:53 之 CDR-L2 序列及 SEQ ID NO:54 之 CDR-L3 序列。更特定而言，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性包含第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD20)，其與 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列為至少90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同；及/或輕鏈可變區 (V LCD20)，其與 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列為至少 90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同。於又一態樣中，抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含含有 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HCD20) 及/或含有 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LCD20) 的第二抗原結合域。
於另一特定態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含與​CD20​結合之第三抗原結合域。特定而言，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第三抗原結合域，該第三抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD20)，其包含 SEQ ID NO:49 之 CDR-H1 序列、SEQ ID NO:50 之 CDR-H2 序列及 SEQ ID NO:51 之 CDR-H3 序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD20)，其包含 SEQ ID NO:52 之 CDR-L1 序列、SEQ ID NO:53 之 CDR-L2 序列及 SEQ ID NO:54 之 CDR-L3 序列。更特定而言，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性包含第三抗原結合域，該第三抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD20)，其與 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列為至少90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同；及/或輕鏈可變區 (V LCD20)，其與 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列為至少 90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同。於又一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第三抗原結合域，該第三抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD20)，其包含 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD20)，其包含 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列。
於又一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體為一種雙特異性抗體，其中該第一抗原結合域為交叉型 Fab 分子，其中 Fab 重鏈與 Fab 輕鏈的可變域或恆定域被交換，並且第二抗原結合域及第三抗原結合域 (如果存在) 為習知 Fab 分子。
於另一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體為一種雙特異性抗體，其中 (i) 第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端融合至第一抗原結合域之 Fab 重鏈之 N 端，第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端融合至 Fc 域之第一次單元之 N 端，且第三抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端融合至 Fc 域之第二次單元之 N 端，或者 (ii) 第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端融合至第二抗原結合域之 Fab 重鏈之 N 端，第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端融合至 Fc 域之第一次單元之 N 端，並且第三抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端融合至 Fc 域之第二次單元之 N 端。
Fab 分子可直接融合至 Fc 域或彼此融合，或者透過胜肽連接基融合至 Fc 或彼此融合，該胜肽連接基包含一個或多個胺基酸，通常約 2 至 20 個胺基酸。胜肽連接子為本領域中所公知的並且如本文所述。適合的非免疫原性肽連接子包括例如 (G4S) (SEQ ID NO:71)、(G 4S) 2或 GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:72)、(G4S) 3(SEQ ID NO:73) 及 (G 4S) 4(SEQ ID NO:74)，更特定而言 (G 4S) 2或 GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:72)。一種用於使第一 Fab 分子及第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈彼此融合的特別合適的胜肽連接子為 (G 4S) 2。另一適合的連接子包含序列 (G 4S) 4(G 4S) 4(SEQ ID NO:74)。另外，連接子可包含免疫球蛋白鉸鏈區 (的一部分)。特定而言，在其中 Fab 分子與 Fc 域次單元之 N 端融合的情況下，可透過包含附加的胜肽連接子或不含附加的胜肽連接子的免疫球蛋白鉸鏈區或其一部分融合。
於又一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含 Fc 域，該 Fc 域包含降低與 Fc 受體之結合及/或效應子功能的一個或多個胺基酸取代。特定而言，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含 IgG1 Fc 域，該域包含胺基酸取代 L234A、L235A 及 P329G (根據 EU 編號)。
於特定態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含：與 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列為至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽，與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列為至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽，與 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列為至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽，以及與 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列為至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽。在又一特定實施例中，該雙特異性抗體包含 SEQ ID NO: 57 之多肽序列、SEQ ID NO: 58 之多肽序列、SEQ ID NO: 59 之多肽序列及 SEQ ID NO: 60 (CD20 TCB) 之多肽序列。
於特定態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體為格菲妥單抗。
格菲妥單抗（提議的 INN：List 121 WHO Drug Information，第 33 卷，第 2 期，2019，亦稱為 CD20-TCB、RO7082859 或 RG6026) 為新穎 T 細胞接合之雙特異性全長抗體，其具有與 B 細胞上之 CD20 二價結合且與 T 細胞上之 CD3、特定而言 CD3e 鏈 (CD3e) 單價結合的 2:1 分子組態。其 CD3 結合區經由柔性連接基以頭‑到尾的方式融合至 CD20 結合區之一。該結構賦予格菲妥單抗優於其他具有 1:1 組態之 CD20-CD3 雙特異性抗體的體外效力，且在臨床前 DLBCL 模型中產生顯著的抗腫瘤功效。CD20 二價在競爭性抗 CD20 抗體存在下保留了這種效力，為使用此等藥物進行預治療或共同治療提供了機會。格菲妥單抗包含一個工程改造之異二聚體 Fc 區，與 FcgR 及 C1q 的結合完全消失。藉由與表現人類 CD20 的腫瘤細胞及 T 細胞上的 T 細胞受體 (TCR) 錯合物之 CD3ε 同時結合，除了 T 細胞活化、增生及細胞激素釋放外，它亦誘導腫瘤細胞裂解。由格菲妥單抗媒介之 B 細胞裂解為 CD20 特異性，在 CD20 表現不存在下或在 T 細胞與表現 CD20 之細胞同時結合（交聯）不存在下不會發生。除了毒殺之外，T 細胞由於 CD3 交聯而經歷活化，如藉由 T 細胞活化標記 (CD25 及 CD69)、細胞激素釋放 (IFNγ、TNFα、IL-2、IL-6、IL-10)、細胞毒性顆粒釋放 (顆粒酶 B) 及 T 細胞增生所偵檢。
於另一態樣中，用於在組合中使用之抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD3)，其包含 SEQ ID NO:83 之 CDR-H1 序列、SEQ ID NO:84 之 CDR-H2 序列及 SEQ ID NO:85 之 CDR-H3 序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD3)，其包含 SEQ ID NO:86 之 CDR-L1 序列、SEQ ID NO:87 之 CDR-L2 序列及 SEQ ID NO:88 之 CDR-L3 序列。更特定而言，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD3)，其與 SEQ ID NO:89 之胺基酸序列為至少90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同；及/或輕鏈可變區 (V LCD3)，其與 SEQ ID NO:90 之胺基酸序列為至少 90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同。於又一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含：重鏈可變區 (V HCD3)，其包含 SEQ ID NO:89 之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD3)，其包含 SEQ ID NO:90 之胺基酸序列。
於又一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD20)，其包含 SEQ ID NO:91 之 CDR-H1 序列、SEQ ID NO:92 之 CDR-H2 序列及 SEQ ID NO:93 之 CDR-H3 序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD20)，其包含 SEQ ID NO:94 之 CDR-L1 序列、SEQ ID NO:95 之 CDR-L2 序列及 SEQ ID NO:96 之 CDR-L3 序列。更特定而言，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性包含第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD20)，其與 SEQ ID NO:97 之胺基酸序列為至少90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同；及/或輕鏈可變區 (V LCD20)，其與 SEQ ID NO:98 之胺基酸序列為至少 90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同。於又一態樣中，抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含含有 SEQ ID NO:97 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HCD20) 及/或含有 SEQ ID NO:98 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LCD20) 的第二抗原結合域。
於特定態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含：與 SEQ ID NO: 99 之胺基酸序列為至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽，與 SEQ ID NO: 100 之胺基酸序列為至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽，與 SEQ ID NO: 101 之胺基酸序列為至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽，以及與 SEQ ID NO: 102 之胺基酸序列為至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽。於一個進一步之實施例中，雙特異性抗體包含 SEQ ID NO:99 之多肽序列、SEQ ID NO:100 之多肽序列、SEQ ID NO:101 之多肽序列及 SEQ ID NO:102 之多肽序列。
於特定態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體為莫蘇妥珠單抗。莫蘇妥珠單抗 (RO7030816；亦稱 BTCT4465A) 為人類 IgG1 類之人源化全長抗 CD20/CD3 T 細胞依賴性雙特異性 (TDB) 抗體，其在片段可結晶 (Fc) 區包含胺基酸取代 N297G (根據 EU 編號)。該取代導致非糖苷化重鏈與 Fc γ (FC-γ) 受體最低限度地結合，因此降低了 Fc 效應子功能。莫蘇妥珠單抗之作用機制包括經由 CD3 使 T 細胞與 CD20 表現細胞接合，導致 T 細胞活化及 T 細胞媒介之表現 CD20 之細胞的細胞溶解。基於其作為全長抗體之結構及非臨床資料，莫蘇妥珠單抗之藥物動力學 (PK) 特性允許在臨床環境中間歇投予，類似於其他單株抗體。
特定之雙特異性抗體描述於 PCT 公開號 WO 2016/020309 A1或 WO 2015/095392 A1 中。
於又一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體亦可包含雙特異性 T 細胞接合物 (BiTE®)。於又一態樣中，該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體為 XmAb ®13676。於另一態樣中，該雙特異性抗體為 REGN1979。於另一態樣中，該雙特異性抗體為 FBTA05 (Lymphomun)。
用於本發明的示例性雙特異性抗 PD1/ 抗 LAG3 抗體
對於本文提供之組合，使用新穎雙特異性抗體，其包含與計畫性細胞死亡蛋白 1 (PD1) 特異性地結合之的第一抗原結合域及與淋巴球活化基因-3 (LAG3) 特異性地結合之第二抗原結合域，具有特別有利之特性，例如可生產性、穩定性、結合親和性、生物活性、某些 T 細胞之特異性靶向、靶向效率及降低的毒性。用於本文的特定雙特異性抗 PD1/抗 LAG3 抗體於 WO 2018/185043 A1 中描述。
於某些態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包含與 PD1 特異性地結合之第一抗原結合域及與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域，該雙特異性抗體在與 T 細胞表面結合時顯示降低的內化。內化代表對於分子的一種重要匯集，該分子可以在幾小時內降解，而靶向受體在細胞表面被迅速地重新表現，準備抑制 TCR 訊號。於又一些態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包含與 PD1 特異性地結合之第一抗原結合域及與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域，該雙特異性抗體優先與習知 T 細胞而非 Treg 結合。這是有利的，因為用阻斷性抗體靶向 Treg 上之 LAG-3 可能會藉由增加它們的抑制功能並最終掩蓋對其他 T 細胞之陽性阻斷作用而是有害的。於又一態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包含與 PD1 特異性地結合之第一抗原結合域及與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域，該雙特異性抗體能夠將 T 細胞效應子功能從 Treg 抑制中拯救出來。於另一態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包含與 PD1 特異性地結合之第一抗原結合域及與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域，當與腫瘤細胞株 ARH77 共同培養時，該雙特異性抗體能夠誘導 CD4 T 細胞分泌顆粒酶 B，如本文所提供之檢定中所示。於又一態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包含與 PD1 特異性地結合之第一抗原結合域及與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域，該雙特異性抗體顯示增加的腫瘤特異性 T 細胞效應子功能及/或增強 T 細胞之細胞毒效應。於另一態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包含與 PD1 特異性地結合之第一抗原結合域及與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域，該雙特異性抗體顯示增加的活體內腫瘤根除。
於一個態樣中，本發明提供一種雙特異性抗體，其包含特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域及特異性地結合至 LAG3 的第二抗原結合域，其中特異性地結合至 PD1 的該第一抗原結合域包含 VH 域，其包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列； (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列。
於一個態樣中，該雙特異性抗體包含 Fc 域，該 Fc 域為 IgG，特定而言 IgG1 Fc 域或 IgG4 Fc 域，並且其中該 Fc 域具有降低的或甚至消除的效應子功能。特定而言，該 Fc 域包含一個或多個胺基酸取代，該胺基酸取代降低與 Fc 受體之結合，特定而言與 Fcγ 受體之結合。
於又一態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包含與 PD1 特異性地結合之第一抗原結合域及與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域，其中該雙特異性抗體包含 Fc 域，該 Fc 域為 IgG，特定而言 IgG1 Fc 域或 IgG4 Fc 域，並且其中該 Fc 域包含一個或多個胺基酸取代，該一個或多個胺基酸取代降低與 Fc 受體之結合，特定而言與 Fcγ 受體之結合。
於另一態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包含與 PD1 特異性地結合之第一抗原結合域及與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域，其中與 LAG3 特異性地結合之該第二抗原結合域包含 (a) VH 域，其包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列， (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列；或 (b) VH 域，其包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列， (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列。
於又一態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包含特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域及特異性地結合至 LAG3 的第二抗原結合域，其中特異性地結合至 PD1 的該第一抗原結合域包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列，以及 VL 域，其包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列。
於另一態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包含特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域及特異性地結合至 LAG3 的第二抗原結合域，其中特異性地結合至 LAG3 的該第二抗原結合域包含 (a) VH 域，其包含 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO:18 之胺基酸序列，或者 (b) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列。
於又一態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包含特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域及特異性地結合至 LAG3 的第二抗原結合域，其中特異性地結合至 LAG3 的該第二抗原結合域包含 (a) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 27 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 28 之胺基酸序列，或 (b) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 29 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 30 之胺基酸序列，或 (c) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列，或 (d) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列。
於另一態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包含特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域及特異性地結合至 LAG3 的第二抗原結合域，其中特異性地結合至 LAG3 的該第二抗原結合域包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 81 之胺基酸序列，以及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 82 之胺基酸序列。
於特定態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包含與 PD1 特異性地結合之第一抗原結合域及與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域，其中 特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域的第一抗原結合域包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列，及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列， 並且特異性地結合至 LAG3 的第二抗原結合域包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列，及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列；或者，VH 域，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列，及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列。
於一個態樣中，本發明之雙特異性抗體包含特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域及特異性地結合至 LAG3 的第二抗原結合域，該第一抗原結合域包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列，及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列；且該第二抗原結合域包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列，及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列。
於又一態樣中，本發明之雙特異性抗體包含特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域及特異性地結合至 LAG3 的第二抗原結合域，該第一抗原結合域包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列，及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列；且該第二抗原結合域包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列，及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列。
於又一態樣中，包含與 PD1 特異性地結合之第一抗原結合域及與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域的雙特異性抗體為人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。特定而言，其為人源化抗體或嵌合抗體。
於一個態樣中，包含與 PD1 特異性地結合之第一抗原結合域及與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域的雙特異性抗體為雙價的。這意指該雙特異性抗體包含與 PD1 特異性地結合之第一抗原結合域及與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域 (1+1 格式)。
於一個態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包含與 PD1 特異性地結合之第一抗原結合域及與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域，其中該雙特異性抗體包含 Fc 域、包含與 PD1 特異性地結合之抗原結合域的第一 Fab 片段以及包含與 LAG3 特異性地結合之抗原結合域的第二 Fab 片段。於特定態樣中，在該等 Fab 片段之一者中，可變域 VL 與 VH 彼此替換，使得 VH 域為輕鏈之一部分並且 VL 域為重鏈之一部分。於特定態樣中，在包含與 PD1 特異性地結合之抗原結合域的第一 Fab 片段中，可變域 VL 與 VH 彼此替換。
於特定態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包含與 PD1 特異性地結合之第一抗原結合域及與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域，其中該雙特異性抗體包含 (a) 第一重鏈，其包含與 SEQ ID NO: 35 之序列具有至少 95% 序列同一性的胺基酸序列，第一輕鏈，其包含與 SEQ ID NO: 36 之序列具有至少 95% 序列同一性的胺基酸序列， 第二重鏈，其包含與 SEQ ID NO: 37 之序列具有至少 95% 序列同一性的胺基酸序列，及第二輕鏈，其包含與 SEQ ID NO: 38 之序列具有至少 95% 序列同一性的胺基酸序列，或者 (b) 第一重鏈，其包含與 SEQ ID NO: 35 之序列具有至少 95% 序列同一性的胺基酸序列，第一輕鏈，其包含與 SEQ ID NO: 36 之序列具有至少 95% 序列同一性的胺基酸序列， 第二重鏈，其包含與 SEQ ID NO: 39 之序列具有至少 95% 序列同一性的胺基酸序列，及第二輕鏈，其包含與 SEQ ID NO:40 之序列具有至少 95% 序列同一性的胺基酸序列。
更特定而言，該雙特異性抗體包含：第一重鏈，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列；第一輕鏈，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；第二重鏈，其包含有 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列；以及第二輕鏈，其包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列。
減少 Fc 受體結合及 / 或效應子功能之 Fc 域修飾
於某些態樣中，提供一種抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含 Fc 域，該 Fc 域包含一個或多個胺基酸修飾，該一個或多個胺基酸修飾減少與 Fc 受體之結合，特定而言與 Fcγ 受體之結合，並減少或消除效應子功能。
於某些態樣中，可在本文所提供之抗體的 Fc 區域中引入一個或多個胺基酸修飾，從而產生 Fc 區變異體。Fc 區域變異體可包含人 Fc 區域序列 (例如，人 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 Fc 區域)，其在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾 (例如，取代)。
以下部分描述本發明之雙特異性抗原結合分子的較佳態樣，其包含 Fc 域修飾，該等修飾降低 Fc 受體結合及/或效應子功能。於一個態樣中，本發明涉及一種抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，其中 Fc 域包含一個或多個胺基酸取代，該一個或多個胺基酸取代降低與 Fc 受體之結合，特定而言與 Fcγ 受體之結合。特定而言，該 Fc 域屬於人類 IgG1 亞類，其具有胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)。
該 Fc 域賦予本發明之雙特異性抗體有利的藥物動力學特性，包括有助於在標靶組織中良好積累的長的血清半衰期及有利的組織-血液分佈比。然而，同時，它可能導致本發明之雙特異性抗體不期望地靶向表現 Fc 受體之細胞，而非較佳的攜帶抗原之細胞。據此，在特定實施例中，相較於天然 IgG Fc 域，特定而言 IgG1 Fc 域或 IgG4 Fc 域，本發明之雙特異性抗體的 Fc 域展現出降低的與 Fc 受體之結合親和力及/或降低的效應子功能。更特定而言，該 Fc 域為 IgG1 FC 域。
在一個此態樣中，該 Fc 域 (或包含該 Fc 域的本發明之雙特異性抗原結合分子) 相較於天然 IgG1 Fc 域 (或包含 IgG1 Fc 域的本發明之雙特異性抗原結合分子) 展現出小於 50%、較佳小於 20%、更佳小於 10% 且最佳小於 5% 的與 Fc 受體之結合親和力，及/或相比於天然 IgG1 Fc 域 (或包含 IgG1 Fc 域的本發明之雙特異性抗原結合分子) 展現出小於 50%、較佳小於 20%、更佳小於 10% 且最佳小於 5% 的效應子功能。於一個態樣中，該 Fc 域 (或包含該 Fc 域的本發明之雙特異性抗原結合分子) 基本上不與 Fc 受體結合及/或誘導效應子功能。於特定態樣中，Fc 受體為 Fcγ 受體。於一個態樣中，Fc 受體為人類 Fc 受體。於一個態樣中，該 Fc 受體為活化性 Fc 受體。於具體態樣中，Fc 受體為活化人 Fcγ 受體，更具體而言人 FcγRIIIa、FcγRI 或 FcγRIIa，最具體而言人 FcγRIIIa。於一個態樣中，該 Fc 受體為抑制性 Fc 受體。於具體態樣中，該 Fc 受體為抑制性人類 Fcγ 受體，更具體而言人類 FcγRIIB。於一個態樣中，該效應子功能為 CDC、ADCC、ADCP 及細胞激素分泌中之一者或多者。於特定態樣中，該效應子功能為 ADCC。於一個態樣中，相較於天然 IgG1 Fc 域，該 Fc 域展現出基本類似的與新生兒 Fc 受體 (FcRn) 之結合親和力。當 Fc 域 (或包含該 Fc 域的本發明之雙特異性抗原結合分子) 展現出天然 IgG1 Fc 域 (或包含 IgG1 Fc 域的本發明之雙特異性抗原結合分子) 與 FcRn 之結合親和力的大於約 70%、特定而言大於約 80%、更特定而言大於約 90% 時，達成基本上類似的與 FcRn 之結合。
於特定態樣中，相較於非工程化之 Fc 域，經工程化之 Fc 域具有降低的與 Fc 受體之結合親和力及/或降低的效應子功能。於特定態樣中，本發明之雙特異性抗原結合分子的 Fc 域包含一個或多個胺基酸突變，該一個或多個胺基酸突變降低 Fc 域與 Fc 受體之結合親和力及/或效應子功能。通常，在 Fc 域之兩個次單元中的每個中都存在相同的一個或多個胺基酸突變。於一個態樣中，胺基酸突變降低了 Fc 域與 Fc 受體的結合親和性。於另一態樣中，該胺基酸突變將 Fc 域與 Fc 受體之結合親和力降低至少 2 倍、至少 5 倍或至少 10 倍。於一個態樣中，相較於包含非工程化之 Fc 域的本發明之雙特異性抗體，包含經工程化之 Fc 域的本發明之雙特異性抗原結合分子展現出小於 20%、特定而言小於 10%、更特定而言小於 5% 的與 Fc 受體之結合親和力。於特定態樣中，該 Fc 受體為 Fcγ 受體。於其他態樣中，該 Fc 受體為人類 Fc 受體。於一個態樣中，該 Fc 受體為抑制性 Fc 受體。於具體態樣中，該 Fc 受體為抑制性人類 Fcγ 受體，更具體而言人類 FcγRIIB。於一些態樣中，該 Fc 受體為活化性 Fc 受體。於具體態樣中，Fc 受體為活化人 Fcγ 受體，更具體而言人 FcγRIIIa、FcγRI 或 FcγRIIa，最具體而言人 FcγRIIIa。較佳地，減少與這些受體中的每個之結合。於一些態樣中，也降低了與補體組分的結合親和性，具體而言與 C1q 的結合親和性。於一個態樣中，不降低與新生 Fc 受體 (FcRn) 之結合親和性。當 Fc 域 (或包含該 Fc 域的本發明之雙特異性抗原結合分子) 展現出非工程化形式之 Fc 域 (或包含該非工程形式之 Fc 域的本發明之雙特異性抗原結合分子) 與 FcRn 之結合親和力的大於約 70% 時，達成基本上類似的與 FcRn 之結合，亦即 Fc 域與該受體之結合親和性得以保持。該 Fc 域或包含該 Fc 域的本發明之雙特異性抗原結合分子可展現出此親和力的大於約 80% 且甚至大於約 90%。在某些實施例中，相較於非工程化之 Fc 域，對本發明之雙特異性抗原結合分子之 Fc 域進行工程化以獲得降低的效應子功能。降低之效應子功能可包括，但不限於以下中之一或多者：降低之補體依賴性細胞毒性 (CDC)、降低之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 (ADCC)、降低之抗體依賴性細胞吞噬 (ADCP)、降低之細胞激素分泌、降低之免疫錯合物介導之抗原呈現細胞之抗原捕捉、降低之與 NK 細胞之結合、降低之與巨噬細胞之結合、降低之與單核細胞之結合、降低之與多形核細胞之結合、降低之誘導細胞凋亡之直接信號傳導、降低之樹突狀細胞成熟或降低之T細胞活化。
效應子功能下降的抗體包括一個或多個 Fc 區域殘基 238、265、269、270、297、327 和 329 被取代之抗體 (美國第 6,737,056 號專利)。此等 Fc 突變體包括具有在胺基酸位置 265、269、270、297 及 327 中的兩者或更多者處的取代之 Fc 突變體，包括所謂的「DANA」Fc 突變體，其中殘基 265 及 297 被丙胺酸取代 (美國專利號 7,332,581)。描述了某些與 FcR 之結合得到改善或減弱的抗體變體。(參見美國專利第 6,737,056 號；WO 2004/056312 及 Shields, R.L. 等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。
於本發明之一個態樣中，該 Fc 域在位置 E233、L234、L235、N297、P331 及 P329 處包含胺基酸取代。於一些態樣中，該 Fc 域包含胺基酸取代 L234A 及 L235A (「LALA」)。在一個此類實施例中，該 Fc 域為 IgG1 Fc 域，特定而言人類 IgG1 Fc 域。於一個態樣中，Fc 域包含在位置 P329 的胺基酸取代。於更具體之態樣中，該胺基酸取代為 P329A 或 P329G，特定而言 P329G。在一個實施例中，該 Fc 域包含在位置 P329 處之胺基酸取代，以及選自由 E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D 或 P331S 所組成之群組的又一胺基酸取代。在更特定之實施例中，該 Fc 域包含胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G (「P329G LALA」)。胺基酸取代之「P329G LALA」組合幾乎完全消除了人類 IgG1 Fc 域的 Fcγ 受體結合，如 PCT 專利申請號 WO 2012/130831 A1 中所述。該檔案亦描述製備該等突變 Fc 域之方法及用於確定其特性例如 Fc 受體結合或效應子功能的方法。該等抗體為具有突變 L234A 及 L235A 或具有突變 L234A、L235A 及 P329G 的 IgG1 (根據 Kabat 等人之 EU 索引編號，Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)。
於一個態樣中，該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含 (全部位置皆根據 Kabat 之 EU 索引編號)：(i) 人類 IgG1 亞類之同源二聚 Fc 區，其視情況具有突變 P329G、L234A 及 L235A，或者 (ii) 人類 IgG4 亞類之同源二聚 Fc 區，其視情況具有突變 P329G、S228P 及 L235E，或者 (iii) 人類 IgG1 亞類之同源二聚 Fc 區，其視情況具有突變 P329G、L234A、L235A、I253A、H310A 及 H435A，或視情況具有突變 P329G、L234A、L235A、H310A、H433A 及 Y436A，或者 (iv) 異源二聚 Fc 區，其中一個 Fc 區多肽包含突變 T366W 且另一個 Fc 區多肽包含突變 T366S、L368A 及 Y407V，或其中一個 Fc 區多肽包含突變 T366W 及 Y349C 且另一個 Fc 區多肽包含突變 T366S、L368A、Y407V 及 S354C，或其中一個 Fc 區多肽包含突變 T366W 及 S354C 且另一個 Fc 區多肽包含突變 T366S、L368A、Y407V 及 Y349C，或者 (v) 人類 IgG1 亞類之異源二聚 Fc 區，其中兩個 Fc 區多肽皆包含突變 P329G、L234A 及 L235A，並且一個 Fc 區多肽包含突變 T366W 且另一個 Fc 區多肽包含突變 T366S、L368A 及 Y407V，或其中一個 Fc 區多肽包含突變 T366W 及 Y349C 且另一個 Fc 區多肽包含突變 T366S、L368A、Y407V 及 S354C，或其中一個 Fc 區多肽包含突變 T366W 及 S354C 且另一個 Fc 區多肽包含突變 T366S、L368A、Y407V 及 Y349C。
於一個態樣中，該 Fc 域為 IgG4 Fc 域。於更具體之態樣中，該 Fc 域為 IgG4 Fc 域，其包含位置 S228 (Kabat 編號) 處之胺基酸取代，特定而言胺基酸取代 S228P。在更具體之實施例中，該 Fc 域為 IgG4 Fc 域，其包含胺基酸取代 L235E 及 S228P 及 P329G。該胺基酸取代減少活體內 IgG4 抗體之 Fab 臂交換 (參見 Stubenrauch 等人，Drug Metabolism and Disposition 38，84-91 (2010))。因此，於一個態樣中，提供一種雙特異性抗體，其包含 (全部位置皆根據 Kabat 之 EU 索引編號)：人類 IgG4 亞類之異源二聚 Fc 區，其中兩個 Fc 區多肽皆包含突變 P329G、S228P 及 L235E，並且一個 Fc 區多肽包含突變 T366W 且另一個 Fc 區多肽包含突變 T366S、L368A 及 Y407V，或者其中一個 Fc 區多肽包含突變 T366W 及 Y349C，且另一個 Fc 區多肽包含突變 T366S、L368A、Y407V 及 S354C，或者其中一個 Fc 區多肽包含突變 T366W 及 S354C，且另一個 Fc 區多肽包含突變 T366S、L368A、Y407V 及 Y349C。
具有增加的半衰期及改善的與新生兒 Fc 受體 (FcRn) (其負責將母體 IgG 轉移給胎兒 (Guyer, R.L. 等人J. Immunol. 117 (1976) 587-593，及 Kim, J.K. 等人，J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434)) 之結合的抗體描述於 US 2005/0014934 中。那些抗體包含其中具有一個或多個取代之 Fc 區域，其改善了 Fc 區域與 FcRn 之結合。此類 Fc 變體包括在一個或多個 Fc 區域殘基上發生取代之 Fc 變體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424 或 434，例如，Fc 區殘基 434 的取代（美國專利號 7,371,826）。關於 Fc 區變異體的其他實例，亦參見 Duncan, A.R. 與 Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；US 5,648,260；US 5,624,821 及 WO 94/29351。
與 Fc 受體之結合可易於透過 ELISA 確定，或透過表面電漿子共振 (SPR) 使用標準儀器例如 BIAcore 儀器 (GE Healthcare) 進行確定，並且 Fc 受體可透過例如重組表現來獲得。本文揭示了合適的該等結合分析法。可替代地，Fc 域或包含 Fc 域的細胞活化雙特異性抗原結合分子對 Fc 受體的結合親和性可使用已知表現特定 Fc 受體的細胞系（例如表現 FcγIIIa 受體的人 NK 細胞）進行評估。Fc 域或包含 Fc 域之本發明之雙特異性抗體的效應子功能可藉由本領域已知之方法量測。適用於量測 ADCC 之分析描述於本文中。用於評估目標分子之 ADCC 活性的活體外測定的實例敘述於例如：美國專利號 5,500,362；Hellstrom 等人 Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)；及 Hellstrom 等人，Proc Natl Acad Sci USA 82，1499-1502 (1985)；美國專利號 5,821,337；Bruggemann 等人，J Exp Med 166，1351-1361 (1987)。可替代地，可採用非放射性分析方法 (參見例如用於流式細胞技術之 ACTI™ 非放射性細胞毒性分析 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及 CytoTox 96 ®非放射性細胞毒性分析 (Promega, Madison, WI))。用於此等分析的有用的效應細胞包括周邊血液單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。可替代地或另外地，可在例如 Clynes 等人在 Proc Natl Acad Sci USA 95，652-656 (1998) 中公開的動物模型中在活體內評估目標分子之 ADCC 活性。
以下部分描述本發明之雙特異性抗體的較佳態樣，其包含 Fc 域修飾，該等修飾降低 Fc 受體結合及/或效應子功能。於一個態樣中，提供一種抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，其中 Fc 域包含一個或多個胺基酸取代，該一個或多個胺基酸取代降低該抗體與 Fc 受體之結合親和力，特定而言與 Fcγ 受體之結合親和力。於另一態樣中，提供一種抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，其中該 Fc 域包含一個或多個胺基酸取代，該一個或多個胺基酸取代降低效應子功能。於特定態樣中，該 Fc 域屬於人類 IgG1 亞類，其具有胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)。
促進異源二聚化的 Fc 域修飾
如本文所述之雙特異性抗原結合分子包含不同的抗原結合域，融合至 Fc 域之兩個次單元中的一個或另一個，因此該 Fc 域之兩個次單元可包含在兩條不同的多肽鏈中。這些多肽的重組共表現及隨後的二聚化導致兩種多肽具有若干可能的組合。為改善重組生產中本發明之雙特異性抗體之產率及純度，在如本文所述之雙特異性抗原結合分子的 Fc 域中引入促進所需之多肽締合的修飾將是有利的。
據此，於特定態樣中，提供一種抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，其中 Fc 域包含促進該 Fc 域之第一及第二次單元之締合的修飾。人類 IgG Fc 域之兩個次單元之間最廣泛的蛋白質-蛋白質相互作用位點在 Fc 域之 CH3 域中。因此，於一個態樣中，該修飾在 Fc 域之 CH3 域中進行。
於具體態樣中，該修飾為所謂的「杵臼 (knob-into-hole)」修飾，其包含 Fc 域的兩個次單元中之一者中的「杵 (knob)」修飾及 Fc 域之兩個次單元之另一者中的「臼 (hole)」。因此，本發明涉及一種雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含與 PD1 特異性地結合之第一抗原結合域及與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合位點，其中根據杵入臼方法，Fc 域之第一次單元包含杵且 Fc 域之第二次單元域包含臼。於特定態樣中，Fc 域的第一次單元包含胺基酸取代 S354C 和 T366W (EU 編號)，且 Fc 域的第二次單元包含胺基酸取代 Y349C、T366S 及 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。
「杵臼」技術描述於例如：US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway 等人，Prot Eng 9，617-621 (1996)；及 Carter，J Immunol Meth 248，7-15 (2001)。通常，該方法包括在第一多肽之界面處引入一個突起 (「杵」)，並且在第二多肽之界面中引入一個對應的空腔 (「臼」)，以使該突起可定位於空腔中，從而促進異源二聚體形成並阻礙同源二聚體形成。透過用較大側鏈 (例如酪胺酸或色胺酸) 替換第一多肽界面上之較小的胺基酸側鏈來構建突起。透過將較大胺基酸側鏈替換為較小的胺基酸側鏈 (例如丙胺酸或蘇胺酸)，在第二多肽之界面中形成與突起具有相同或相近大小的互補空腔。
因此，於一個態樣中，在雙特異性抗原結合分子之 Fc 域的第一次單元的 CH3 域中，胺基酸殘基被具有較大側鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在第一次單元之 CH3 域內產生突起，該突起可定位在第二次單元之 CH3 域內的空腔中，且在 Fc 域的第二次單元的 CH3 域中，胺基酸殘基被具有較小側鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在第二次單元之 CH3 域內產生空腔，第一次單元之 CH3 域內的突起可定位在該空腔內。可透過改變編碼多肽的核酸 (例如透過針對特定位點之突變或透過胜肽合成) 來製備突起和空腔。於具體態樣中，在 Fc 域的第一次單元之 CH3 域中，位置 366 處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換 (T366W)，且在 Fc 域的第二次單元之 CH3 域中，位置 407 處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換 (Y407V)。於一個態樣中，另外在 Fc 域之第二次單元中，位置 366 處之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換 (T366S)，且位置 368 處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換 (L368A)。
於再一態樣中，另外在 Fc 域的第一次單元中，位置 354 處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換 (S354C)，且另外在 Fc 域的第二次單元中，位置 349 處之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換 (Y349C)。引入此等兩個半胱胺酸殘基導致在 Fc 域的兩個次單元之間形成二硫鍵橋，進一步穩定二聚體 (Carter (2001), J Immunol Methods 248，7-15)。於特定態樣中，Fc 域的第一次單元包含胺基酸取代 S354C 和 T366W (EU 編號)，且 Fc 域的第二次單元包含胺基酸取代 Y349C、T366S 及 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。
但是亦可替代性地或額外地使用如 EP 1 870 459 所述之其他杵入臼技術。在一個實施例中，該多特異性抗體包含「杵鏈」之 CH3 域中的突變 R409D 及 K370E 以及「臼鏈」之 CH3 域中的突變 D399K 及 E357K (根據 Kabat EU 索引編號)。
於一個態樣中，該雙特異性抗體包含「杵鏈」之 CH3 域中的 T366W 突變及「臼鏈」之 CH3 域中的突變 T366S、L368A 及 Y407V，並且額外地包含「杵鏈」之 CH3 域中的突變 R409D 及 K370E 以及「臼鏈」之 CH3 域中的突變 D399K 及 E357K (根據 Kabat EU 索引編號)。
於一個態樣中，該雙特異性抗體包含兩個 CH3 域之一者中的突變 Y349C 及 T366W 以及兩個 CH3 域之另一者中的突變 S354C、T366S、L368A 及 Y407V；或者該多特異性抗體包含兩個 CH3 域之一者中的突變 Y349C 及 T366W 以及兩個 CH3 域之另一者中的突變 S354C、T366S、L368A 及 Y407V，並且額外地包含「杵鏈」之 CH3 域中的突變 R409D 及 K370E 以及「臼鏈」之 CH3 域中的突變 D399K 及 E357K (根據 Kabat EU 索引編號)。
於一替代態樣中，促進 Fc 域之第一次單元及第二次單元的締合的修飾包括介導靜電轉向作用的修飾，例如 PCT 公開 WO 2009/089004 中所述。通常，此方法涉及用帶電荷的胺基酸殘基取代兩個 Fc 域次單元界面上的一個或多個胺基酸殘基，從而使同源二聚體形成在靜電上不利，但異源二聚化在靜電上有利。
除了「杵入臼技術」之外，用於修飾多特異性抗體之重鏈的 CH3 域以強制異源二聚化的其他技術係本領域已知者。此等技術，尤其 WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954 及 WO 2013/096291 中描述之技術在本文中被考慮作為「杵入臼技術」之替代方案與雙特異性抗體組合使用。
於一個態樣中，於雙特異性抗體中，EP 1870459 中所述之方法係用以支持該多特異性抗體之第一重鏈與第二重鏈之異源二聚化。該方法係基於將帶有相反電荷之胺基酸引入兩者 (亦即該第一重鏈與第二重鏈) 之間的 CH3/CH3 域界面之特定胺基酸位置處。
據此，於多特異性抗體之三級結構的該態樣中，第一重鏈之 CH3 域與第二重鏈之 CH3 域形成位於相應抗體 CH3 域之間的界面，其中第一重鏈之 CH3 域的胺基酸序列及第二重鏈之 CH3 域的胺基酸序列各自包含位於該抗體之三級結構內之該界面內的一組胺基酸，其中在一條重鏈之 CH3 域內的位於該界面內之該組胺基酸經帶正電之胺基酸取代，並且在另一條重鏈之 CH3 域內的位於該界面內之該組胺基酸經帶負電之胺基酸取代。根據該態樣之雙特異性抗體在本文中指代為「CH3(+/-)- 工程化之雙特異性抗體」(其中縮寫「+/-」代表被引入相應 CH3 域內的帶相反電荷之胺基酸)。
於一個態樣中，在 CH3(+/-) 工程化之雙特異性抗體中，帶正電荷之胺基酸選自 K、R 及 H，且帶負電荷之胺基酸選自 E 或 D。
於一個態樣中，在 CH3(+/-) 工程化之雙特異性抗體中，帶正電荷之胺基酸選自 K 及 R，且帶負電荷之胺基酸選自 E 或 D。
於一個態樣中，在 CH3(+/-) 工程化之雙特異性抗體中，帶正電荷之胺基酸為 K，且帶負電荷之胺基酸為 E。
於一個態樣中，在 CH3(+/-) 工程化之雙特異性抗體中，一條重鏈之 CH3 域中的位置 409 處之胺基酸 R 被 D 取代且位置處的胺基酸 K 被 E 取代，並且另一條重鏈之 CH3 域中的位置 399 處之胺基酸 D 被 K 取代且位置 357 處之胺基酸 E 被 K 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
於一個態樣中，WO 2013/157953 中所述之方法係用以支持該多特異性抗體之第一重鏈與第二重鏈之異源二聚化。在一個實施例中，一條重鏈之 CH3 域中的位置 366 處之胺基酸 T 被 K 取代，並且另一條重鏈之 CH3 域中的位置 351 處之胺基酸 L 被 D 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。在另一實施例中，一條重鏈之 CH3 域中的位置 366 處之胺基酸 T 被 K 取代且位置 351 處之胺基酸 L 被 K 取代，並且另一條重鏈之 CH3 域中的位置 351 處之胺基酸 L 被 D 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
於另一態樣中，一條重鏈之 CH3 域中的位置 366 處之胺基酸 T 被 K 取代且位置 351 處之胺基酸 L 被 K 取代，並且另一條重鏈之 CH3 域中的位置 351 處之胺基酸 L 被 D 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。此外，另一條重鏈之 CH3 域中包含以下取代之至少一者：位置 349 處之胺基酸 Y 被 E 取代，位置 349 處之胺基酸 Y 被 D 取代，且位置 368 處之胺基酸 L 被 E 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。在一個實施例中，位置 368 處之胺基酸 L 被 E 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
於一個態樣中，WO 2012/058768 中所述之方法係用以支持該多特異性抗體之第一重鏈與第二重鏈之異源二聚化。於一個態樣中，一條重鏈之 CH3 域中的位置 351 處之胺基酸 L 被 Y 取代且位置 407 處之胺基酸 Y 被 A 取代，並且另一條重鏈之 CH3 域中的位置 366 處之胺基酸 T 被 A 取代且位置 409 處之胺基酸 K 被 F 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。在另一實施例中，除了上述取代之外，另一條重鏈之 CH3 域中的位置 411 (原為 T)、399 (原為 D)、400 (原為 S)、405 (原為 F)、390 (原為 N) 及 392 (原為 K) 處之胺基酸中的至少一者被取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。較佳之取代為： -    用選自 N、R、Q、K、D、E 及 W 之胺基酸取代位置 411 處之胺基酸 T (根據 Kabat EU 索引編號)， -    用選自 R、W、Y 及 K 之胺基酸取代位置 399 處之胺基酸 D (根據 Kabat EU 索引編號)， -    用選自 E、D、R 及 K 之胺基酸取代位置 400 處之胺基酸 S (根據 Kabat EU 索引編號)， -    用選自 I、M、T、S、V 及 W 之胺基酸取代位置 405 處之胺基酸 F (根據 Kabat EU 索引編號)； -    用選自 R、K 及 D 之胺基酸取代位置 390 處之胺基酸 N (根據 Kabat EU 索引編號)；以及 -    用選自 V、M、R、L、F 及 E 之胺基酸取代位置 392 處之胺基酸 K (根據 Kabat EU 索引編號)。
於另一態樣中，該雙特異性抗體係根據 WO 2012/058768 進行工程化，亦即，一條重鏈之 CH3 域中的位置 351 處之胺基酸 L 被 Y 取代且位置 407 處之胺基酸 Y 被 V 取代，並且另一條重鏈之 CH3 域中的位置 366 處之胺基酸 T 被 A 取代且位置 409 處之胺基酸 K 被 F 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。在多特異性抗體的另一實施例中，一條重鏈之 CH3 域中的位置 407 處之胺基酸 Y 被 A 取代，並且另一條重鏈之 CH3 域中的位置 366 處之胺基酸 T 被 A 取代且位置 409 處之胺基酸 K 被 F 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。在上述最後一個實施例中，另一條重鏈之 CH3 域中的位置 392 處之胺基酸 K 被 E 取代，位置 411 處之胺基酸 T 被 E 取代，位置 399 處之胺基酸 D 被 R 取代且位置 400 處之胺基酸 S 被 R 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
於一個態樣中，WO 2011/143545 中所述之方法係用以支持該多特異性抗體之第一重鏈與第二重鏈之異源二聚化。於一個態樣中，兩條重鏈之 CH3 域中的胺基酸修飾在位置 368 及/或 409 (根據 Kabat EU 索引編號) 處引入。
於一個態樣中，WO 2011/090762 中所述之方法係用以支持該雙特異性抗體之第一重鏈與第二重鏈之異源二聚化。WO 2011/090762 涉及根據「杵入臼」(KiH) 技術的胺基酸修飾。在一個實施例中，一條重鏈之 CH3 域中的位置 366 處之胺基酸 T 被 W 取代，並且另一條重鏈之 CH3 域中的位置 407 處之胺基酸 Y 被 A 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。在另一實施例中，一條重鏈之 CH3 域中的位置 366 處之胺基酸 T 被 Y 取代，並且另一條重鏈之 CH3 域中的位置 407 處之胺基酸 Y 被 T 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
於一個態樣中，WO 2009/089004 中所述之方法係用以支持該雙特異性抗體之第一重鏈與第二重鏈之異源二聚化。在一個實施例中，一條重鏈之 CH3 域中的位置 392 處之胺基酸 K 或 N 被帶負電荷的胺基酸取代 (在一個實施例中被 E 或 D 取代，在一個較佳實施例中被 D 取代)，並且另一條重鏈之 CH3 域中的位置 399 處之胺基酸 D、位置 356 處之胺基酸 E 或 D 或者位置 357 處之胺基酸 E 被帶正電荷的胺基酸取代 (在一個實施例中被 K 或 R 取代，在一個較佳實施例中被 K 取代；在一個較佳實施例中，位置 399 或 356 處之胺基酸被 K 取代) (根據 Kabat EU 索引編號)。在又一實施例中，除了上述取代之外，一條重鏈之 CH3 域中的位置 409 處之胺基酸 K 或 R 被帶負電荷的胺基酸取代 (在一個實施方案中被 E 或 D 取代，在一個較佳實施例中被 D 取代) (根據 Kabat EU 索引編號)。於再又一態樣中，除了上述取代之外或者替代上述取代，一條重鏈之 CH3 域中的位置 439 處之胺基酸 K 及/或位置 370 處之胺基酸 K 彼此獨立地被帶負電荷的胺基酸取代 (在一個實施方案中被 E 或 D 取代，在一個較佳實施例中被 D 取代) (根據 Kabat EU 索引編號)。
於一個態樣中，WO 2007/147901 中所述之方法係用以支持該多特異性抗體之第一重鏈與第二重鏈之異源二聚化。在一個實施例中，一條重鏈之 CH3 域中的位置 253 處之胺基酸 K 被 E 取代，位置 282 處之胺基酸 D 被 K 取代且位置 322 處之胺基酸 K 被 D 取代，並且另一條重鏈之 CH3 域中的位置 239 處之胺基酸 D 被 K 取代，位置 240 處之胺基酸 D 被 K 取代且位置 292 處之胺基酸 K 被 D 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
如本文所報導之雙特異性抗體的重鏈的 C 端可以為以胺基酸殘基 PGK 結尾的完整 C 端。重鏈的 C 端可以是縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。於一個優選態樣中，重鏈之 C 端是縮短的 C 端結尾 PG。
於本文所報導之全部態樣中之一個態樣中，包含包括如本文指定之 C 端 CH3 域之重鏈的雙特異性抗體包含 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 及 K447，根據 Kabat EU 索引編號)。於本文所報導之全部態樣中之一個態樣中，包含包括如本文指定之 C 端 CH3 域之重鏈的雙特異性抗體包含 C 端甘胺酸殘基 (G446，根據 Kabat EU 索引編號)。
Fab 域中的修飾
於一個態樣中，提供一種抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，其中在 Fab 片段中之一者中，可變域 VH 與 VL 交換或者恆定域 CH1 與 CL 交換。雙特異性抗體係根據 Crossmab 技術製備。
在一個結合臂 (CrossMabVH-VL 或 CrossMabCH-CL) 中具有域置換/交換之多特異性抗體在 WO2009/080252、WO2009/080253 及 Schaefer, W. 等人，PNAS, 108 (2011) 11187-1191 中詳細描述。它們明顯減少了由針對第一種抗原的輕鏈與針對第二種抗原的錯誤重鏈的錯配所引起的副產物 (與沒有這種域互換的方法相比)。
於特定態樣中，提供一種抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，其中在 Fab 片段中之一者中，可變域 VL 與 VH 彼此替換，使得 VH 域為輕鏈之一部分並且 VL 域為重鏈之一部分。於特定態樣中，該雙特異性抗體為這樣一種雙特異性抗體，其中在包含與 PD1 特異性地結合之抗原結合域的第一 Fab 片段中，可變域 VL 與 VH 彼此替換。
於另一態樣中，並且為了進一步提高正確配對，該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體可以包含不同的帶電胺基酸取代 (所謂「帶電殘基」)。這些修飾被導入交叉或非交叉的 CH1 和 CL 域中。例如，該等修飾描述於 WO2015/150447、WO2016/020309 及 PCT/EP2016/073408 中。
於特定態樣中，提供一種抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，其中在 Fab 片段中之一者中，恆定域 CL 中的位置 124 處之胺基酸獨立地被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)，並且恆定域 CH1 中的位置 147 及 213 處之胺基酸獨立地被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。於特定態樣中，該雙特異性抗體為這樣一種雙特異性抗體，其中在包含與 TIM3 特異性地結合之抗原結合域的第二 Fab 片段中，恆定域 CL 中的位置 124 處之胺基酸獨立地被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)，並且恆定域 CH1 中的位置 147 及 213 處之胺基酸獨立地被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
於特定態樣中，提供一種抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，其中 CL 域中之一者中的位置 123 (EU 編號) 處之胺基酸已經被精胺酸 (R) 替換且位置 124 (EU 編號) 處之胺基酸已經被離胺酸 (K) 替換，並且其中 CH1 域中之一者中的位置 147 (EU 編號) 及位置 213 (EU 編號) 處之胺基酸已經被麩胺酸 (E) 取代。於特定態樣中，該雙特異性抗體為這樣一種雙特異性抗體，其中在包含與 LAG3 特異性地結合之抗原結合域的 Fab 片段中，位置 123 (EU 編號) 處之胺基酸已經被精胺酸 (R)替換且位置 124 (EU 編號) 處之胺基酸已經被離胺酸 (K) 替換，並且其中 CH1 域中之一者中的位置 147 (EU 編號) 及位置 213 (EU 編號) 處之胺基酸已經被麩胺酸 (E) 取代。
於又一態樣中，該雙特異性抗體為一種雙價抗體，其包含 a) 特異性地結合至第一抗原的抗體的第一輕鏈及第一重鏈，以及 b) 特異性地結合至第二抗原的抗體的第二輕鏈及第二重鏈，其中第二輕鏈及第二重鏈的可變域 VL 與 VH 彼此替換。
a) 下之抗體不包含 b) 下報導之修飾，並且 a) 下之重鏈及輕鏈為分離之鏈。
在 b) 下之抗體中，輕鏈內的可變輕鏈域 VL 被該抗體之可變重鏈域 VH 替換，並且重鏈內的可變重鏈域 VH 被該抗體之可變輕鏈域 VL 替換。
於一個態樣中，(i) a) 下之第一輕鏈之恆定域 CL 中的位置 124 (根據 Kabat 編號) 處之胺基酸被帶正電荷的胺基酸取代，並且其中 a) 下之第一重鏈之恆定域 CH1 中的位置 147 處之胺基酸或位置 213 (根據 Kabat EU 索引編號) 處之胺基酸被帶負電荷的氨基酸取代，或者 (ii) b) 下 之第二輕鏈中之恆定域 CL 中的位置 124 (根據 Kabat 編號) 處之胺基酸被帶正電荷的胺基酸取代，並且其中 b) 下之第二重鏈之恆定域 CH1 中的位置 147 處之胺基酸或位置 213 (根據 Kabat EU 索引編號) 處之胺基酸被帶負電荷的胺基酸取代。
於另一態樣中，(i) a) 下之第一輕鏈之恆定域 CL 中的位置 124 處之胺基酸獨立地被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 取代 (根據 Kabat 編號) (在一個較佳實施例中獨立地被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 取代)，並且其中 a) 下之第一重鏈之恆定域 CH1 中的位置 147 處之胺基酸或位置 213 處之胺基酸獨立地被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)，或者 (ii) b) 下之第二輕鏈之恆定域 CL 的位置 124 處之胺基酸獨立地被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 取代 (根據 Kabat 編號) (在一個較佳實施例中獨立地被離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 取代)，並且其中 b) 下之第二重鏈之恆定域 CH1 中的位置 147 處之胺基酸或位置 213 處之胺基酸獨立地被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
於一個態樣中，第二重鏈之恆定域 CL 中的位置 124 及 123 處之胺基酸被 K 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
於一個態樣中，第二重鏈之恆定域 CL 中的位置 123 處之胺基酸被 R 取代且位置 124 處之胺基酸被 K 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
於一個態樣中，第二輕鏈之恆定域 CH1 中的位置 147 及 213 處之胺基酸被 E 取代 (根據 Kabat 之 EU 索引編號)。
於一個態樣中，第一輕鏈之恆定域 CL 中的位置 124 及 123 處之胺基酸被 K 取代，且第一重鏈之恆定域 CH1 中的位置 147 及 213 處之胺基酸被 E 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
於一個態樣中，第一輕鏈之恆定域 CL 中的位置 123 處之胺基酸被 R 取代且位置 124 處之胺基酸被 K 取代，且第一重鏈之恆定域 CH1 中的位置 147 及 213 處之胺基酸被 E 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
於一個態樣中，第二重鏈之恆定域 CL 中的位置 124 及 123 處之胺基酸被 K 取代，並且其中第二輕鏈之恆定域 CH1 中的位置 147 及 213 處之胺基酸被 E 取代，且第一輕鏈之可變域 VL 中的位置 38 處之胺基酸被 K 取代，第一重鏈之可變域 VH 中的位置 39 處之胺基酸被 E 取代，第二重鏈之可變域 VL 中的位置 38 處之胺基酸被 K 取代，且第二輕鏈之可變域 VH 中的位置 39 處之胺基酸被 E 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
於一個態樣中，該雙特異性抗體為一種雙價抗體，其包含 a) 特異性地結合至第一抗原的抗體的第一輕鏈及第一重鏈，以及 b) 特異性地結合至第二抗原的抗體的第二輕鏈及第二重鏈，其中第二輕鏈及第二重鏈的可變域 VL 與 VH 彼此替換，並且其中第二輕鏈及第二重鏈的恆定域 CL 與 CH1 彼此替換。
a) 下之抗體不包含 b) 下報導之修飾，並且 a) 下之重鏈及輕鏈為分離之鏈。在 b) 下之抗體中，輕鏈內的可變輕鏈域 VL 被該抗體之可變重鏈域 VH 替換，且恆定輕鏈域 CL 被該抗體之恆定重鏈域 CH1 替換；並且重鏈內的可變重鏈域 VH 被該抗體之可變輕鏈域 VL 替換，且恆定重鏈域 CH1 被該抗體之恆定輕鏈域 CL 替換。
於一個態樣中，該雙特異性抗體為一種雙價抗體，其包含 a) 特異性地結合至第一抗原的抗體的第一輕鏈及第一重鏈，以及 b) 特異性地結合至第二抗原的抗體的第二輕鏈及第二重鏈，其中第二輕鏈及第二重鏈的恆定域 CL 與 CH1 彼此替換。
a) 下之抗體不包含 b) 下報導之修飾，並且 a) 下之重鏈及輕鏈為分離之鏈。在 b) 下之抗體中，輕鏈內的恆定輕鏈域 CL 被該抗體之恆定重鏈域 CH1 替換，並且重鏈內的恆定重鏈域 CH1 被該抗體之恆定輕鏈域 CL 替換。
於一個態樣中，該雙特異性抗體為這樣一種雙特異性抗體，其包含 a) 特異性地結合至第一抗原並且由兩條抗體重鏈及兩條抗體輕鏈組成之全長抗體，以及 b) 一個、兩個、三個或四個特異性地結合至第二抗原的單鏈 Fab 片段， 其中 b) 下之該單鏈 Fab 片段經由肽連接子在 a) 下之該全長抗體之重鏈或輕鏈的 C 端或 N 端融合至該全長抗體。
於一個態樣中，一個或兩個與第二抗原結合之相同的單鏈 Fab 片段經由肽連接子在該全長抗體之重鏈或輕鏈的 C 端融合至該全長抗體。
於一個態樣中，一個或兩個與第二抗原結合之相同的單鏈 Fab (scFab) 片段經由肽連接子在該全長抗體之重鏈的 C 端融合至該全長抗體。
於一個態樣中，一個或兩個與第二抗原結合之相同的單鏈 Fab (scFab) 片段經由肽連接子在該全長抗體之輕鏈的 C 端融合至該全長抗體。
於一個態樣中，兩個與第二抗原結合之相同的單鏈 Fab (scFab) 片段經由肽連接子在該全長抗體之每條重鏈或輕鏈的 C 端融合至該全長抗體。
於一個態樣中，兩個與第二抗原結合之相同的單鏈 Fab (scFab) 片段經由肽連接子在該全長抗體之每條重鏈的 C 端融合至該全長抗體。
於一個態樣中，兩個與第二抗原結合之相同的單鏈 Fab (scFab) 片段經由肽連接子在該全長抗體之每條輕鏈的 C 端融合至該全長抗體。
於一個態樣中，該雙特異性抗體為一種三價抗體，其包含 a) 特異性地結合至第一抗原並且由兩條抗體重鏈及兩條抗體輕鏈組成之全長抗體， b) 由以下組成的第一多肽 ba) 抗體重鏈可變域 (VH)，或 bb) 抗體重鏈可變域 (VH) 及抗體恆定域 1 (CH1)， 其中該第一多肽在其 VH 域之 N 末端經由肽連接子融合至該全長抗體之兩條重鏈之一者的 C 端， c) 由以下組成的第二多肽 ca) 抗體輕鏈可變域 (VL)，或 cb) 抗體輕鏈可變域 (VL) 及抗體輕鏈恆定域 (CL)， 其中該第二多肽在 VL 域之 N 末端經由肽連接子融合至該全長抗體之兩條重鏈之另一者的 C 端，並且 其中第一多肽之抗體重鏈可變域 (VH) 與第二多肽之抗體輕鏈可變域 (VL) 一起形成特異性地結合至第二抗原的抗原結合域。
於一個態樣中，b) 下之多肽的抗體重鏈可變域 (VH) 與 c) 下之多肽的抗體輕鏈可變域 (VL) 藉由在以下位置之間引入二硫鍵而經由鏈間二硫鍵橋連接並穩定化： (i) 重鏈可變域位置 44 至輕鏈可變域位置 100，或 (ii) 重鏈可變域位置 105 至輕鏈可變域位置 43，或 (iii) 重鏈可變域位置 101 至輕鏈可變域位置 100 (始終根據 Kabat EU 索引編號)。
引入非天然二硫鍵進行穩定化之技術描述於例如 WO 94/029350；Rajagopal, V., 等人，Prot. Eng. (1997) 1453-1459；Kobayashi, H., 等人，Nucl. Med. Biol. 25 (1998) 387-393；以及 Schmidt, M., 等人，Oncogene 18 (1999) 1711-1721 中。在一個實施例中，b) 與 c) 下之多肽的可變域之間的視情況選用之二硫鍵在重鏈可變域位置 44 與輕鏈可變域位置 100 之間。在一個實施例中，b) 與 c) 下之多肽的可變域之間的視情況選用之二硫鍵在重鏈可變域位置 105 與輕鏈可變域位置 43 之間 (始終根據 Kabat 編號)。在一個實施例中，在單鏈 Fab 片段之可變域 VH 與 VL 之間沒有該視情況選用之二硫鍵穩定化的三價雙特異性抗體係較佳者。
於一個態樣中，該雙特異性抗體為一種三特異性或四特異性抗體，其包含 a) 與第一抗原特異性地結合之全長抗體的第一輕鏈及第一重鏈，以及 b) 與第二抗原特異性地結合之全長抗體的第二 (經修飾之) 輕鏈及第二 (經修飾之) 重鏈，其中可變域 VL 與 VH 彼此替換，及/或其中恆定域 CL 與 CH1 彼此替換，並且 c) 其中與一種或兩種其他抗原 (即第三及/或第四抗原) 特異性地結合之一個至四個抗原結合域經由肽連接子融合至 a) 及/或 b) 之輕鏈或重鏈的 C 端或 N 端。
a) 下之抗體不包含 b) 下報導之修飾，並且 a) 下之重鏈及輕鏈為分離之鏈。
於一個態樣中，該三特異性或四特異性抗體包含 c) 下之與一種或兩種其他抗原特異性地結合之一個或兩個抗原結合域。
於一個態樣中，抗原結合域選自 scFv 片段及 scFab 片段之群組。
於一個態樣中，抗原結合域為 scFv 片段。
於一個態樣中，抗原結合域為 scFab 片段。
於一個態樣中，抗原結合域融合至 a) 及/或 b) 之重鏈的 C 端。
於一個態樣中，該三特異性或四特異性抗體包含 c) 下之與一種其他抗原特異性地結合之一個或兩個抗原結合域。
於一個態樣中，該三特異性或四特異性抗體包含 c) 下之與第三抗原特異性地結合之兩個相同的抗原結合域。在一個較佳實施例中，該等兩個相同的抗原結合域兩者皆經由相同的肽連接子融合至 a) 及 b) 之重鏈的 C 端。在一個較佳實施例中，兩個相同的抗原結合域為 scFv 片段或 scFab 片段。
於一個態樣中，該三特異性或四特異性抗體包含 c) 下之與第三及第四抗原特異性地結合之兩個抗原結合域。在一個實施例中，該等兩個抗原結合域兩者皆經由相同的肽連結基融合至 a) 及 b) 之重鏈的 C 端。在一個較佳實施例中，該等兩個抗原結合域為 scFv 片段或 scFab 片段。
於一個態樣中，該雙特異性抗體為這樣一種雙特異性四價抗體，其包含 a) 抗體之兩條輕鏈及兩條重鏈，它們與第一抗原特異性地結合 (且包含兩個 Fab 片段)， b) 抗體之兩個額外的 Fab 片段，其與第二抗原特異性地結合，其中該等額外的 Fab 片段兩者皆經由肽連接子融合至 a) 之重鏈的 C 端或 N 端，並且 其中在 Fab 片段中進行了以下修飾 (i) 在 a) 之兩個 Fab 片段中，或在 b) 之兩個 Fab 片段中，可變域 VL 與 VH 彼此替換，及/或恆定域 CL 與 CH1 彼此替換，或者 (ii) 在 a) 之兩個 Fab 片段中，可變域 VL 與 VH 彼此替換，且恆定域 CL 與 CH1 彼此替換，並且在 b) 之兩個 Fab 片段中，可變域 VL 與 VH 彼等替換，或恆定域 CL 與 CH1 彼此替換，或者 (iii) 在 a) 之兩個 Fab 片段中，可變域 VL 與 VH 彼此替換，或恆定域 CL 與 CH1 彼此替換，並且在 b) 之兩個 Fab 片段中，可變域 VL 與 VH 彼等替換，且恆定域 CL 與 CH1 彼此替換，或者 (iv) 在 a) 之兩個 Fab 片段中，可變域 VL 與 VH 彼此替換，並且在 b) 之兩個 Fab 片段中，恆定域 CL 與 CH1 相互替換，或者 (v) 在 a) 之兩個 Fab 片段中，恆定域 CL 與 CH1 彼此替換，並且在 b) 之兩個 Fab 片段中，可變域 VL 與 VH 彼此替換。
於一個態樣中，該等額外的Fab片段兩者皆經由肽連接子融合至 a) 之重鏈的 C 端或 a) 之重鏈的 N 端。
於一個態樣中，該等額外的Fab片段兩者皆經由肽連接子融合至 a) 之重鏈的 C 端。
於一個態樣中，該等額外的Fab片段兩者皆經由肽連接子融合至 a) 之重鏈的 N 端。
於一個態樣中，在 Fab 片段中進行以下修飾：在 a) 之兩個 Fab 片段中，或在 b) 之兩個 Fab 片段中，可變域 VL 與 VH 彼此替換，及/或恆定域 CL 與 CH1 彼此替換。
於一個態樣中，該雙特異性抗體為一種四價抗體，其包含： a) 第一抗體之 (經修飾之) 重鏈，其與第一抗原特異性地結合並且包含第一 VH-CH1 域對，其中該第一抗體之第二 VH-CH1 域對的 N 端經由肽連接子融合至該重鏈之 C 端， b) a) 之該第一抗體的兩條輕鏈， c) 第二抗體之 (經修飾之) 重鏈，其與第二抗原特異性地結合並且包含第一 VH-CL 域對，其中該第二抗體之第二 VH-CL 域對的 N 端經由肽連接子融合至該重鏈之 C 端，以及 d) c) 之該第二抗體的兩條 (經修飾之) 輕鏈，其各自包含 CL-CH1 域對。
於一個態樣中，該雙特異性抗體包含 a) 與第一抗原特異性地結合之第一全長抗體的重鏈及輕鏈，以及 b) 與第二抗原特異性地結合之第二全長抗體的重鏈及輕鏈，其中該重鏈之 N 端經由肽連接子連結至該輕鏈之 C 端。
a) 下之抗體不包含 b) 下報導之修飾，並且該重鏈及輕鏈為分離之鏈。
於一個態樣中，該雙特異性抗體包含 a) 特異性地結合至第一抗原並且由兩條抗體重鏈及兩條抗體輕鏈組成之全長抗體，以及 b) 特異性地結合至第二抗原的 Fv 片段，該片段包含 VH2 域及 VL2 域，其中兩個域經由二硫鍵橋彼此連結， 其中僅 VH2 域或 VL2 域經由肽連接子融合至特異性地結合至第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈。
在該雙特異性抗體中，a) 下之重鏈及輕鏈為分離之鏈。
於一個態樣中，VH2 域或 VL2 域中之另一者不經由肽連接子融合至特異性地結合至第一抗原的全長抗體的重鏈或輕鏈。
在本文報導之全部態樣中，第一輕鏈包含 VL 域及 CL 域並且第一重鏈包含 VH 域、CH1 域、鉸鏈區、CH2 域及 CH3 域。
於一個態樣中，該雙特異性抗體為一種三價抗體，其包含 a) 兩個與第一抗原特異性地結合之 Fab 片段， b) 一個與第二抗原特異性地結合之 CrossFab 片段，該片段中之 CH1 與 CL 域彼此交換， c) 一個 Fc 區，其包含第一 Fc 區重鏈及第二 Fc 區重鏈， 其中兩個 Fab 片段之 CH1 域的 C 端連結至重鏈 Fc 區多肽之 N 端，並且其中 CrossFab 片段之 CL 域的 C 端連結至 Fab 片段中之一者之 VH 域的 N 端。
於一個態樣中，該雙特異性抗體為一種三價抗體，其包含 a) 兩個與第一抗原特異性地結合之 Fab 片段， b) 一個與第二抗原特異性地結合之 CrossFab 片段，該片段中之 CH1 與 CL 域彼此交換， c) 一個 Fc 區，其包含第一 Fc 區重鏈及第二 Fc 區重鏈， 其中第一 Fab 片段之 CH1 域的 C 端連結至重鏈 Fc 區多肽中之一者的 N 端，且 CrossFab 片段之 CL 域的 C 端連結至另一重鏈 Fc 區多肽之 N 端，並且其中第二 Fab 片段之 CH1 的 C 端連結至第一 Fab 片段之 VH 域的 N 端或 CrossFab 片段之 VH 域的 N 端。
於一個態樣中，該雙特異性抗體包含 a) 特異性地結合至第一抗原並且由兩條抗體重鏈及兩條抗體輕鏈組成之全長抗體，以及 b) 特異性地結合至第二抗原的 Fab 片段，該片段包含 VH2 域及 VL2 域並且包含重鏈片段及輕鏈片段，其中該輕鏈片段內的可變輕鏈域 VL2 被該抗體之可變重鏈域 VH2 替換，且該重鏈片段內的可變重鏈域 VH2 被該抗體之可變輕鏈與 VL2 替換 其中該重鏈 Fab 片段插入在全長抗體之重鏈中之一者的 CH1 域與全長抗體之相應 Fc 區之間，並且該輕鏈 Fab 片段之 N 端結合至該全長抗體之輕鏈的 C 端，該輕鏈與該全長抗體之重鏈配對，並且重鏈 Fab 片段已經插入在該重鏈中。
於一個態樣中，該雙特異性抗體包含 a) 特異性地結合至第一抗原並且由兩條抗體重鏈及兩條抗體輕鏈組成之全長抗體，以及 b) 特異性地結合至第二抗原的 Fab 片段，該片段包含 VH2 域及 VL2 域且包含重鏈片段及輕鏈片段，其中該輕鏈片段內的可變輕鏈域 VL2 被該抗體之可變重鏈域 VH2 替換，且該重鏈片段內的可變重鏈域 VH2 被該抗體之可變輕鏈域 VL2 替換，並且其中該 Fab 片段之重鏈片段的 C 端結合至全長抗體之重鏈中之一者的 N 端，且該 Fab 片段之輕鏈片段的 C 端結合至全長抗體之輕鏈的 N 端，該輕鏈域全長抗體之重鏈配對，且該 Fab 片段之重鏈片段結合至該重鏈。
多核苷酸
此外，提供編碼如本文所述之雙特異性抗體或其片段的分離之多核苷酸。
術語「核酸分子」或「多核苷酸」包括任何包含核苷酸聚合物的化合物及/或物質。每個核苷酸由鹼基具體而言嘌呤或嘧啶鹼基 (即，胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U))、糖 (即，脫氧核糖或核糖) 及磷酸基團構成。通常，核酸分子通過鹼基序列進行描述，其中所述鹼基代表核酸分子的一級結構 (線性結構)。鹼基序列通常由 5’ 至 3’ 表示。在本文中，術語核酸分子包括：去氧核糖核酸 (DNA)，其包括例如互補 DNA (cDNA) 和基因體 DNA；核糖核酸 (RNA)，特定而言信使 RNA (mRNA)；DNA 或 RNA 的合成形式；以及包含兩個或更多個這些分子的混合聚合物。核酸分子可以是線性或環狀的。此外，術語核酸分子包括有義股和反義股，以及單股和雙股形式。此外，本文所述之核酸分子可包含天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸的例子包括帶有衍生糖、磷酸鹽連接或化學修飾殘基的經修飾之核苷酸鹼基。核酸分子還包括適於在體外及/或活體內例如在宿主或患者體內直接表現本發明之抗體的載體的 DNA 和 RNA 分子。此等 DNA (例如，cDNA) 或 RNA (例如，mRNA) 載體可以是未修飾的或經過修飾的。例如，mRNA 可經過化學修飾以增強 RNA 載體之穩定性及/或編碼分子之表達，從而將 mRNA 注入個體內以產生活體內抗體 (參見例如 Stadler 等人，Nature Medicine 2017，線上發表于 2017 年 6 月 12 日，doi:10.1038/nm.4356 或 EP 2 101 823 B1)。
「分離之」多核苷酸指代已經與其天然環境的組分分離的核酸分子。分離之多核苷酸包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。
編碼本發明之雙特異性抗體的分離之多核苷酸可表現為編碼整個抗原結合分子的單個多核苷酸或表現為共表現的多個 (例如兩個或更多個) 多核苷酸。由共表現之多核苷酸所編碼的多肽可經由例如雙硫鍵或其他方式締合，以形成功能性抗原結合分子。舉例而言，免疫球蛋白的輕鏈部分可由來自免疫球蛋白之重鏈部分的單獨多核苷酸編碼。當共表現時，重鏈多肽將與輕鏈多肽締合以形成免疫球蛋白。
於一些態樣中，分離之多核苷酸編碼根據本發明之雙特異性抗體中包含的多肽，如本文所述。
於一個態樣中，提供編碼抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體的分離之多核苷酸，其中特異性地結合至 PD1 的該第一抗原結合域包含：VH 域，其包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列，(ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列，和 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列；以及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列，(ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列，和 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列。
用於本發明之雙特異性抗體的製備
可使用重組方法和組成物來生產抗體，例如 US 4,816,567 中所述。對於這些方法，提供了一個或多個編碼抗體的分離之核酸。
如果是天然抗體或天然抗體片段，則需要兩個核酸，一個用於輕鏈或其片段，且另一個用於重鏈或其片段。此等核酸編碼包含 VL 之胺基酸序列及/或包含抗體的 VH 之胺基酸序列 (例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。這些核酸可以在同一表現載體上，也可以在不同表現載體上。在某些具有異源二聚體重鏈之雙特異性抗體的情況下，需要四個核酸，一個用於第一輕鏈，一個用於第一重鏈 (其包含第一異源單體 Fc 區多肽)，一個用於第二輕鏈，且一個用於第二重鏈 (其包含第二異源單體 Fc 區多肽)。這四個核酸可包含在一個或多個核酸分子或表現載體中。例如，該核酸編碼包含第一 VL 之胺基酸序列、及/或包含第一 VH (其包括第一異源單體 Fc 區) 之胺基酸序列、及/或包含第二 VL 之胺基酸序列、及/或包含第二 VH (其包括抗體之第二異源單體 Fc 區域) 之胺基酸序列 (例如，抗體之第一及/或第二輕鏈、及/或第一及/或第二重鏈)。這些核酸可以在同一表現載體上，也可以在不同表現載體上，通常這些核酸位於兩個或三個表現載體上，即一個載體可包含一個以上的這些核酸。此等雙特異性抗體之實例為 CrossMabs 及 T 細胞雙特異性者 (參見例如 Schaefer, W. 等人，PNAS, 108 (2011) 11187-1191)。例如，異源單體重鏈之一包含所謂「杵突變」 (T366W，視情況為 S354C 或 Y349C 之一)，且另一個包含所謂「臼突變」 (T366S、L368A 及 Y407V，以及視情況 Y349C 或 S354C) (參見例如 Carter, P. 等人，Immunotechnol.2 (1996) 73)。
於一個態樣中，提供編碼本文所述之雙特異性抗體的分離之核酸。該核酸可編碼包含 VL 之胺基酸序列及/或包含抗原結合域之 VH 之胺基酸序列 (例如，抗體之輕鏈及/或重鏈中)，該等抗原結合域分別與 PD1 及 LAG3 特異性地結合。於又一態樣中，提供一種或多種包含此核酸之載體 (例如，表現載體)。於又一態樣中，提供包含此核酸之宿主細胞。於一個此態樣中，宿主細胞包含 (例如，已使用其轉化)：(1) 第一載體，其包含第一對編碼胺基酸序列之核酸，該等胺基酸序列之一者包含抗體之第一 VL 且另一者包含第一 VH；以及第二載體，其包含第二對編碼胺基酸序列之核酸，該等胺基酸序列之一者包含抗體之第二 VL 且另一者包含第二 VH，或者 (2) 第一載體，其包含第一核酸，該第一核酸編碼包含可變域中之一者 (較佳輕鏈可變域) 的胺基酸序列；第二載體，其包含一對編碼胺基酸序列之核酸，該等胺基酸序列中之一者包含輕鏈可變域且另一者包含第一重鏈可變域；以及第三載體，其包含一對編碼胺基酸序列之核酸，該等胺基酸序列中之一者包含如第二載體中相應另一輕鏈可變域且另一者包含第二重鏈可變域；或者 (3) 第一載體，其包含編碼包含抗體之第一 VL 之胺基酸序列的核酸；第二載體，其包含編碼包含抗體之第一 VH 之胺基酸序列的核酸；第三載體，其包含編碼包含抗體之第二 VL 之胺基酸序列的核酸；以及第四載體，其包含編碼包含抗體之第二 VH 之胺基酸序列的核酸。於一個態樣中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞或淋巴球性細胞 (例如，Y0、NS0、Sp20 細胞)。於一個態樣中，提供一種製備雙特異性抗體之方法，其中該方法包含在適合於抗體表現的條件下培養包含如上所述之編碼抗體之核酸的宿主細胞，並視情況從宿主細胞 (或宿主細胞培養基) 中回收該抗體。
對於本文所述之抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體或抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體的重組生產，將例如上述之編碼雙特異性抗體之核酸分離並且插入至一種或多種載體中，以在宿主細胞內進一步選殖及/或表現。此等核酸可藉由習知方法 (例如，使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針) 輕易地分離並定序。
適用於選殖或表現編碼抗體之載體的宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。例如，抗體可能在細菌中產生，特別是在無需醣基化和 Fc 效應子功能的情況下。有關抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見例如 US 5,648,237、US 5,789,199 及 US 5,840,523。(另請參見 Charlton, K.A.，在：Methods in Molecular Biology，第 248 卷，Lo, B.K.C. (編輯)，Humana Press, Totowa, NJ (2003), 第 245-254 頁，其中描述了抗體片段在大腸桿菌中之表現。)在表現後，抗體可與可溶性部分中的細菌細胞糊分離，並可經過進一步純化。
除原核生物以外，真核微生物（諸如絲狀真菌或酵母菌）也為合適的抗體編碼載體的選殖或表現宿主，包括其醣基化途徑已被「人源化」的真菌和酵母菌株，從而導致具有部分或完全人醣基化模式的抗體的產生。參見 Gerngross, T.U.，Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及 Li, H. 等人，Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215。
用於表現經醣基化之抗體的適合之宿主細胞亦來源於多細胞生物 (無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑定出許多桿狀病毒株，它們可以與昆蟲細胞結合使用，特別是用於轉染草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda) 細胞。
植物細胞培養物亦可以用作宿主。例如參見美國專利第 5,959,177 號、第 6,040,498 號、第 6,420,548 號、第 7,125,978 號及第 6,417,429 號 (闡述了在轉基因植物中產生抗體的 PLANTIBODIESTM 技術)。
脊椎動物細胞也可用作宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞系。可用之哺乳動物宿主細胞株的其他實例包括：由 SV40 (COS-7) 轉化之猴腎 CV1 株；人胚胎腎株 (如 Graham, F.L. 等人，J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 中所述之 293 或 293 細胞)；幼地鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (如 Mather, J.P.，Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 中所述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞 (MMT 060562)；TRI 細胞 (如 Mather, J.P. 等人，Annals N.Y.Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 所述)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他可用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 DHFR- CHO 細胞 (Urlaub, G. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)；及骨髓瘤細胞系，例如 Y0、NS0 和 Sp2/0。有關某些適用於抗體生產的哺乳動物宿主細胞系的綜述，參見例如：Yazaki, P. 和 Wu, A.M.，Methods in Molecular Biology，第 248 卷，Lo, B.K.C. 主編，Humana Press，Totowa，NJ (2004)，第 255-268 頁。
分析
可藉由本領域中已知之各種檢定法對本文所提供之雙特異性抗體的物理/化學特性及/或生物活性進行鑑定、篩選或表徵。
1. 親和力測定
可使用標準測試設備 (例如 Biacore® 儀器 (GE Healthcare)) 及受體或標靶蛋白質 (例如可藉由重組表現獲得)，根據實例中所闡述之方法，藉由表面電漿子共振 (SPR) 確定本文中所提供之雙特異性抗原結合分子、抗體及抗體片段對於相對應之抗原的親和力。用於測量結合親和力之具體說明性及示例性實施例已經在 WO WO 2018/185043 中之實例 2、8 或 11 中描述。根據一個態樣，在 25℃ 使用 BIACORE® T100 儀器 (GE Healthcare) 藉由表面電漿子共振法測量 K D。
2. 結合測定及其他測定
於一個態樣中，藉由已知方法例如 ELISA、西方墨點法等測試本發明之雙特異性抗體的抗原結合活性。本文中所提供之抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體與相對應之重組抗原或與表現抗原之分子的結合可藉由 ELISA 評估，如 WO 2018/185043 之實例 8 或 11 中所述。於又一態樣中，新鮮周邊血液單核細胞 (PBMC) 可用於結合檢定中以顯示與不同的周邊血液單核細胞 (PBMC) 例如單核細胞、NK 細胞及 T 細胞之結合。
於另一態樣中，細胞二聚化檢定係用以證明兩種不同受體 PD1 及 LAG3 之二聚化或至少結合/交互作用，當與針對兩種標靶之雙特異性抗體連接或交聯時，該等受體與酶之兩個片段在胞質中融合。因此僅單獨一種受體不顯示酶活性。對於該特異性交互作用，兩種受體之胞質 C 端分別融合至報告者酶之異源次單元。單獨的單個酶次單元不顯示報告者活性。然而，同時與兩種受體結合預計會導致兩種受體在胞質中之局部蓄積、兩種異源酶次單元之互補，並最終形成一種特異性及功能性之酶，該酶將受質水解，從而產生化學發光訊號 (WO 2018/185043 之實例 11)。
3. 活性測定
於一個態樣中，提供用於鑑定具有生物活性之抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體的檢定法。生物活性可以包括，例如，增強不同免疫細胞 (尤其 T 細胞) 之活化及/或增生的能力，分泌免疫調節細胞激素例如 IFNγ 或 TNF-α，阻斷 PD1 路徑，阻斷 LAG3 路徑，毒殺腫瘤細胞。亦提供於活體內及/或體外具有此等生物活性之抗體。於某些態樣中，對本發明之抗體進行了此等生物學活性試驗。於一個態樣中，提供一種免疫細胞檢定法，該檢定法測量來自一個個體 (供體 X) 之淋巴球對於來自另一個體 (供體 Y) 之淋巴球的活化。混合淋巴球反應 (MLR) 可以證明阻斷 PD1 路徑對於淋巴球效應細胞的作用。在本發明之雙特異性抗體存在或不存在下，於該檢定中測試 T 細胞之活化及它們的 IFN-γ 分泌。該檢定在 WO 2018/185043 之實例 9 中更詳細地描述。
醫藥組成物、調配物及投藥途徑
於又一態樣中，本發明提供包含本文所提供之抗 CD20/抗 CD3 抗體及抗 PD1/抗 LAG3 抗體的醫藥組成物，其例如用於任何下述治療方法。在一個實施例中，醫藥組成物包含本文所提供之抗 CD20/抗 CD3 抗體及抗 PD1/抗 LAG3 抗體以及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。在另一實施例中，醫藥組成物包含本文所提供之抗體及至少一種另外治療劑，例如，如下文所述。
本發明之醫藥組成物包含治療有效量之一種或多種溶解或分散於醫藥上可接受之賦形劑中的雙特異性抗體。短語「醫藥上或藥理學上可接受」是指在採用的劑量和濃度下通常對受體無毒的分子實體和組成物，即投予動物 (例如人) 時不產生不利的、過敏或其他不良反應 (在適當情況下)。根據本揭露，本領域技術人員將認識到包含至少一種抗體及視情況存在之額外活性成分的醫藥組成物的製備方法，如 Remington's Pharmaceutical Sciences 第 18 版 Mack Printing Company, 1990 所例示，該文獻以引用方式併入本文中。特別是，組成物為凍乾調配物或水性溶液。如本文中所使用，「醫藥上可接受之賦形劑」包括任何及所有溶劑、緩衝液、分散介質、塗料、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑 (例如抗菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、鹽、穩定劑及其組合，如一般熟習此項技術者已知。
腸胃外組成物包括那些設計用於注射投予的組成物，例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹腔內注射。對於注射，本發明之抗原結合分子可以配製在水溶液中，較佳在生理相容性緩衝液例如 Hanks 溶液、Ringer 溶液或生理鹽水緩衝液中。該溶液可包含配製劑，例如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。替代性地，融合蛋白可以呈粉末形式，以便在使用前與適合之媒液 (例如無菌無熱原水) 一起構建。藉由將所需量之本發明之融合蛋白質併入視需要具有多種下文列舉之其他成分之適當溶劑中來製備無菌可注射溶液。無菌性可易於例如藉由無菌濾膜過濾來實現。通常，透過將各種滅菌后的活性成分摻入含有基本分散介質及/或其他成分的無菌媒液中來製備分散液。對於用於製備無菌注射液、混懸劑或乳劑的無菌粉末，優選的製備方法是真空乾燥或冷凍乾燥技術，該技術可從先前過濾後的無菌液體介質中得到活性成分與任何其他所需成分的粉末。如有必要，應適當緩衝液體介質，並且在註射足夠的鹽水或葡萄糖之前先使液體稀釋劑等滲。組成物必須在製造和儲存條件下保持穩定，並且必須能夠抵抗諸如細菌和真菌等微生物的污染作用。應當理解，內毒素污染應最小限度地保持在安全濃度，例如，小於 0.5 ng/mg 蛋白質。適合的醫藥上可接受之賦形劑包括，但不限於：緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子性界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可包含提高混懸劑黏度的化合物，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、右旋葡萄聚糖等。視情況，懸浮液還可包含合適的穩定劑或提高化合物溶解度的試劑，以製備高濃度溶液。另外，可將活性化合物的懸浮液製備為合適的油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或載劑包括脂肪油 (例如芝麻油) 或合成脂肪酸酯 (例如油酸乙酯或甘油三酯) 或脂質體。
活性成分可以包載在例如透過凝聚技術或透過介面聚合製備的微囊 (例如，分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊) 中、膠體藥物遞送系統 (例如脂質體、白蛋白微球、微乳、奈米顆粒和奈米囊 (nanocapsule)) 中或粗滴乳狀液中。此等技術公開於 Remington’s Pharmaceutical Sciences (第 18 版，Mack Printing Company，1990) 中。可以製備緩釋製劑。緩釋製劑的適宜的實例包括含有多肽的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質是成形物品的形式，例如膜或微囊。在特定實施例中，可以透過在組成物中使用延遲吸收的物質 (例如單硬脂酸鋁、明膠或其組合) 來產生可注射組成物的延長吸收。
本文中之例示性醫藥上可接受的載劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白 (sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，例如 rHuPH20 (HYLENEX®，Baxter International, Inc.)。某些例示性 sHASEGP 及用法 (包括 rHuPH20) 描述於美國專利公開號 2005/0260186 和 2006/0104968 中。於一個態樣中，sHASEGP 與一種或多種附加的醣胺聚醣酶諸如軟骨素酶結合在一起。
例示性凍乾抗體製劑如美國第 6,267,958 號專利所述。水溶性抗體調配物包括美國專利號 6,171,586 和 WO2006/044908 中所述的那些，後者之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
除先前描述之組成物外，該等雙特異性抗體亦可配製為儲存製劑。此等長效製劑可以透過植入 (例如皮下或肌內) 或透過肌內注射投予。因此，例如，融合蛋白可以用適合之聚合物質或疏水物質 (例如作為可用油中的乳狀液) 或離子交換樹脂配製，或配製為微溶的衍生物，例如配製為微溶的鹽類。
包含本發明之雙特異性抗原結合分子的醫藥組成物可以利用習用的混合、溶解、乳化、包封、包載或凍乾方法來製備。可使用一種或多種有助於將蛋白質加工成可藥用製劑的生理上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑以習用方式配製醫藥組成物。適宜的製劑視所選的投藥途徑而定。
本文所揭露之雙特異性抗體可以以游離酸或鹼、中性或鹽形式配製成組成物。醫藥上可接受之鹽是基本上保留游離酸或鹼的生物活性的鹽。此等鹽包括酸加成鹽，例如與蛋白質組成物之游離胺基形成的鹽，或與無機酸 (例如鹽酸或磷酸) 或有機酸 (例如乙酸、草酸、酒石酸或杏仁酸) 形成的鹽。與游離羧基形成的鹽類還可以衍生自：無機鹼，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因。藥用鹽趨向於比對應的游離鹼形式更易溶於水性溶劑和其他質子性溶劑。
本文之組成物亦可含有一種以上為治療特定適應症所需之活性成分，較佳為具有互補活性不會對彼此產生不利影響之活性成分。此等活性成分適宜地以對預期目的有效的量組合存在。
於一個態樣中，提供一種包含抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物，以及包含本文所述之抗 PD1/抗 LAG3 抗體的第二藥物。於一個態樣中，該醫藥組成物用於治療CD20 表現癌症。於特定態樣中，該醫藥組成物用於治療 B 細胞增生性失調，特定而言選自由以下所組成之群組的疾病：非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)、急性淋巴球性白血病 (ALL)、慢性淋巴球性白血病 (CLL)、彌漫型大 B 細胞淋巴瘤 (DLBCL)、濾泡性淋巴瘤 (FL)、被套細胞淋巴瘤 (MCL)、緣帶淋巴瘤 (MZL)、多發性骨髓瘤 (MM) 及何杰金氏淋巴瘤 (HL)。
用於活體內投予的調配物通常是無菌的。無菌性可易於例如藉由無菌濾膜過濾來實現。
抗 CD20/ 抗 CD3 雙特異性抗體及抗 PD1/ 抗 LAG3 抗體之投予
抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及抗 PD1/抗 LAG3 抗體兩者 (兩者在本文中皆稱為物質) 皆可以藉由任何適合方式投予，包括腸胃外、肺內及鼻內投予，並且如果需要，用於局部治療、病灶內投予。然而，本文所述之方法對於藉由腸胃外 (特定而言靜脈內) 輸注投予之治療劑特別有用。
腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。投藥可藉由任何適宜途徑進行，例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射，此部分地取決於短暫投予抑或長期投予。本文中考慮各種給藥方案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次投予、快速注射投予和脈衝輸注。於一個態樣中，治療劑係經腸胃外投予，特定而言經靜脈內投予。於特定態樣中，該物質係藉由靜脈內輸注投予。於另一態樣中，該物質係經皮下投予。
抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及抗 PD1/抗 LAG3 抗體兩者將按照與良好醫學實踐一致的方式進行配製、給藥及投予。在這種情況下，考慮的因素包括待治療的具體障礙、待治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床病症、障礙的原因、遞送藥物的部位、施用方法、施用日程及醫療從業者已知的其他因素。抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及抗 PD1/抗 LAG3 抗體兩者不必但視情況與一種或多種目前用於預防或治療所討論之疾患的藥劑一起配製。此等其他治療劑之有效量取決於存在於調配物中的治療劑之量、疾患或治療之類型以及上文討論的其他因素。這些藥物通常以與本文中所述相同的劑量及投予途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任意劑量且藉由任意途徑使用。
對於疾病的預防或治療，抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及抗 PD1/抗 LAG3 抗體的適合劑量 (以其組合使用或與一種或多種其他另外治療劑組合使用) 將取決於待治療疾病之類型、抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體之類型、疾病之嚴重度及病程、該抗體係用於預防亦或治療目的而投予、既往療法、患者之臨床病史及對該抗體之反應及主治醫師的判斷。每種物質係一次性或歷經一系列治療而適合地投予患者。根據疾病之類型及嚴重程度，約 1 µg/kg 至 15 mg/kg (例如 0.1 mg/kg – 10 mg/kg) 之該物質可為例如藉由一次或多次分開投予或藉由連續輸注而投予受試者的初始候選劑量。根據上述因素，一種典型的日劑量可在約 1 µg/kg 至 100 mg/kg 或更多的範圍內。對於在幾天或更長時間內重複投予，視病狀而定，治療通常將持續至出現期望的疾病症狀阻抑。雙特異性抗體的一種例示性劑量將在約 0.005 mg/kg 至約 10 mg/kg 之範圍內。在其他實例中，劑量亦可包含每次投予從約 1 μg/kg 體重、約 5 μg/kg 體重、約 10 μg/kg 體重、約 50 μg/kg 體重、約 100 μg/kg 體重、約 200 μg/kg 體重、約 350 μg/kg 體重、約 500 μg/kg 體重、約 1 mg/kg 體重、約 5 mg/kg 體重、約 10 mg/kg 體重、約 50 mg/kg 體重、約 100 mg/kg 體重、約 200 mg/kg 體重、約 350 mg/kg 體重、約 500 mg/kg 體重至約 1000 mg/kg 體重或更多及可自其衍生的任意範圍。在自本文中所列之數字衍生的範圍的實例中，可基於上述數字投予約 5 mg/kg 體重至約 100 mg/kg 體重、約 5 μg/kg 體重至約 500 mg/kg 體重等範圍內的劑量。因此，可向患者投予約 0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg 或 10 mg/kg 中的一種或多種劑量 (或其任何組合)。此等劑量可以間歇施用，例如每週或每三週施用 (例如，使得患者接受約 2 種至約 20 種或例如約 6 種劑量的抗體)。可投予初始較高的負載劑量，隨後投予一個或多個較低劑量。然而，可以使用其他劑量方案。該療法的進展很容易藉由習知技術及檢定法進行監測。然而，其他劑量方案可能是有用的。藉由習用技術和測定很容易監測此治療的進展。
於一個態樣中，抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及抗 PD1/抗 LAG3 抗體兩者之投予為單次投予。於某些態樣中，治療劑之投予為兩次或更多次投予。於一個此態樣中，該等物質係每週、每兩週或每三週投予，特定而言每兩週投予。於一個態樣中，該物質係以治療有效量投予。於一個態樣中，該物質係以約 10 µg/kg、約 100 µg/kg、約 200 µg/kg、約 300 µg/kg、約 400 µg/kg、約 500 µg/kg、約 600 µg/kg、約 700 µg/kg、約 800 µg/kg、約 900 µg/kg 或約 1000 µg/kg 之劑量投予。在一個實施例中，抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體之投予劑量高於相對應治療方案中抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體的劑量，而不投予抗 PD1/抗 LAG3 抗體。於一個態樣中，抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體之投予包含初始投予第一劑量之抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體以及一次或多次後續投予第二劑量之抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該第二劑量高於該第一劑量。於一個態樣中，抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體之投予包含初始投予第一劑量之抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體以及一次或多次後續投予第二劑量之抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該第一劑量不低於該第二劑量。
於一個態樣中，在根據本發明之治療方案中，抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體之投予為第一次將抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體投予受試者 (至少在同一療程內)。於一個態樣中，在投予抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體之前，不對受試者投予抗 PD1/抗 LAG3 抗體。於另一態樣中，在投予抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體之前，不投予抗 PD1/抗 LAG3 抗體。
於另一態樣中，抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體用於與抗 PD1/抗 LAG3 抗體組合使用，其中在組合治療之前用第 II 型抗 CD20 抗體 (較佳奧比妥珠單抗) 進行預治療，其中該預治療與該組合治療之間的時間段足以因應該第 II 型抗 CD20 抗體 (較佳奧比妥珠單抗) 而減少個體中之 B 細胞。
T 細胞之活化可導致嚴重的細胞激素釋放症候群 (CRS)。在由 TeGenero 執行的第 1 階段研究 (Suntharalingam等人，N Engl J Med (2006) 355,1018-1028) 中，全部 6 位健康志願者在輸注不當劑量的刺激 T 細胞之超‑激動劑抗 CD28 單株抗體後快速地經歷近乎致命的嚴重的細胞激素釋放症候群 (CRS)。藉由用第 II 型抗 CD20 抗體 (例如奧比妥珠單抗) 預治療該受試者，可以顯著降低與對受試者投予 T 細胞活化治療劑 (例如抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體) 相關的細胞激素釋放。使用 GAZYVA® 預治療 (Gpt) 應有助於快速耗竭周邊血液及次級淋巴器官兩者中的 B 細胞，使得藉由 T 細胞活化治療劑 (例如 CRS) 進行之強烈全身性 T 細胞活化所致之高度相關不良事件 (AE) 的風險，同時支持 T 細胞活化治療劑的暴露水平，該等暴露水平自給藥開始起即足夠高以媒介腫瘤細胞消除。迄今為止，在正在進行的奧比妥珠單抗臨床試驗中，已經在數百名患者中評估並管理奧比妥珠單抗之安全性（包括細胞激素釋放）。最後，除了支持 T 細胞活化治療劑 (例如抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，特定而言格菲妥單抗) 的安全性外，Gpt 亦應幫助防止針對此等關鍵分子之抗藥物抗體 (ADA) 的形成。
在本發明中，抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及抗 PD1/抗 LAG3 抗體之組合可與一種或多種其他藥劑組合用於療法中。例如，可以共同投予至少一種另外的治療劑。於某些態樣中，另外的治療劑為免疫治療劑。
上述此類組合療法包括組合投予 (其中兩種或更多種治療劑包含在相同或分開的調配物中) 及分開投予，在此情況下，治療劑可在投予另外的一種或多種治療劑之前、同時及/或隨後投予。在一個實施例中，投予治療劑及投予額外的治療劑彼此發生在約一個月內，或發生在約一週、兩週或三週內，或發生在約一天、兩天、三天、四天、五天、或六天內。
治療方法及組成物
CD20 在除幹細胞及漿細胞外的大多數 B 細胞上表現 (泛 B 細胞標記)，並且經常在大多數人類 B 細胞惡性腫瘤 (例如除多發性骨髓瘤外的淋巴瘤及白血病，例如在非何杰金氏淋巴瘤及急性淋巴母細胞性白血病中) 上表現 (腫瘤相關抗原)。
於一個態樣中，提供一種用於在受試者中治療CD20 表現癌症或延緩其進展的方法，包含對受試者投予有效量之抗 CD20/抗 CD3 抗體及有效量之抗 PD1/抗 LAG3 抗體。
於一個此態樣中，該方法進一步包含投予該受試者有效量的至少一種另外的治療劑。在又一些實施例中，本文提供一種耗竭 B 細胞之方法，包含對受試者投予有效量之抗 CD20/抗 CD3 抗體及有效量之抗 PD1/抗 LAG3 抗體。根據上述任一態樣之「個體」或「受試者」較佳地為人。
於又一些態樣中，提供一種用於癌症免疫療法中之組成物，其包含抗 CD20/抗 CD3 抗體及抗 PD1/抗 LAG3 抗體。在某些實施例中，提供一種包含抗 CD20/抗 CD3 抗體及有效量之抗 PD1/抗 LAG3 抗體的組成物，該組成物用於癌症免疫療法中。
於又一態樣中，本文提供包含抗 CD20/抗 CD3 抗體及有效量之抗 PD1/抗 LAG3 抗體的組成物在製造或製備藥物中的用途。於一個態樣中，該藥物用於治療CD20 表現癌症。於一個態樣中，該藥物用於治療 B 細胞增生性失調。於又一態樣中，該藥物用於治療 B 細胞增生性失調之方法中，該方法包含對患有 B 細胞增生性失調之個體投予治療有效量的藥物。於一個此態樣中，該方法進一步包含對該個體投予有效量的至少一種另外的治療劑。於又一態樣中，該藥物係用於耗竭 B 細胞。B 細胞增生性失調係選自由以下所組成之群組：非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)、急性淋巴球性白血病 (ALL)、慢性淋巴球性白血病 (CLL)、彌漫型大 B 細胞淋巴瘤 (DLBCL)、濾泡性淋巴瘤 (FL)、被套細胞淋巴瘤 (MCL)、緣帶淋巴瘤 (MZL)、多發性骨髓瘤 (MM) 及何杰金氏淋巴瘤 (HL)。於一個特定態樣中，該 B 細胞癌症為非何杰金氏淋巴瘤或急性淋巴母細胞性白血病。
於又一態樣中，本文提供一種用於治療 B 細胞癌症的方法。在一個實施例中，該方法包含對患有此 B 細胞癌症之個體投予有效量之抗 PD1/抗 LAG3 抗體。在一個該等實施例中，該方法進一步包含將有效量之至少一種額外的治療劑 (如下文所述) 投予個體。根據上述任一實施例的「個體」可以是人。特定而言，該 B 細胞癌症為 B 細胞淋巴瘤或 B 細胞白血病。於一個態樣中，該 B 細胞癌症為非何杰金氏淋巴瘤或急性淋巴母細胞性白血病。
上述該等組合療法涵蓋組合投予 (其中兩種或更多種治療劑包括在相同或分開的調配物中)；及分開投予，在此情況下，本文中所報導之抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體可在投予一種或多種另外的治療劑之前、同時及/或之後投予。於一個態樣中，有效量之抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體之投予、有效量之抗 PD1/抗 LAG3 抗體之投予以及另外的治療劑之投予彼此發生在約一個月內，或發生在約一週、兩週或三週內，或發生在約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內。
本文中所報導之抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及抗 PD1/抗 LAG3 抗體兩者 (及任何另外的治療劑) 皆可以藉由任何適合方式投予，包括腸胃外、肺內及鼻內投予，並且如果需要，用於局部治療、病灶內投予。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。投藥可藉由任何適宜途徑進行，例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射，此部分地取決於短暫投予抑或長期投予。本文中考慮各種給藥方案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次投予、快速注射投予和脈衝輸注。
本文中所報導之抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及抗 PD1/抗 LAG3 抗體兩者將按照與良好醫學實踐一致的方式進行配製、給藥及投予。在這種情況下，考慮的因素包括待治療的具體障礙、待治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床病症、障礙的原因、遞送藥物的部位、施用方法、施用日程及醫療從業者已知的其他因素。該等抗體並非必須、但可以視情況與一種或多種目前用於預防或治療所述疾病之藥劑一起配製。此等其他劑之有效量取決於存在於調配物中的抗體之量、疾患或治療的類型以及上文討論的其他因素。這些藥物通常以與本文中所述相同的劑量及投予途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任意劑量且藉由任意途徑使用。
熟練技術人員容易地認識到，在許多情況下，該雙特異性分子可能無法提供治癒，而只能提供部分益處。在一些實施例中，具有某些益處的生理變化也被認為是治療上有益的。因此，於一些態樣中，提供生理變化的雙特異性抗體之量被認為是「有效量」或「治療有效量」。
本文所定義之抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及抗 PD1/抗 LAG3 抗體兩者係一次性或歷經一系列治療而適合地投予患者。根據疾病之類型及嚴重程度，約 1 µg/kg 至 15 mg/kg (例如 0.1 mg/kg – 10 mg/kg) 的雙特異性抗體可為例如藉由一次或多次分開投予或藉由連續輸注而投予患者的初始候選劑量。根據上述因素，一種典型的日劑量可在約 1 µg/kg 至 10 mg/kg 或更多的範圍內。對於在幾天或更長時間內重複投予，視病狀而定，治療通常將持續至出現期望的疾病症狀阻抑。抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體之一個示例性劑量將會在從約 0.05 μg/kg 至約 1000 μg/kg 的範圍內。對於抗 PD1/抗 LAG3 抗體，劑量亦可包含每次投予從約 0.01 mg/kg 體重、約 0.05 mg/kg 體重、約 2 mg/kg 體重、約 4 mg/kg 體重、約 10 mg/kg 體重、約 20 mg/kg 體重、約 30 mg/kg 體重、約 40 mg/kg 體重、約 45 mg/kg 體重、約 50 mg/kg 體重、約 100 mg/kg 體重、約 200 mg/kg 體重、約 300 mg/kg 體重、約 400 mg/kg 體重、約 500 mg/kg 體重、約 600 mg/kg 體重、約 800 mg/kg 體重、約 1000 mg/kg 體重至約 1200 mg/kg 體重或更多，以及可自其中衍生的任何範圍。在自本文中所列之數字衍生的範圍的實例中，可基於上述數字投予約 5 mg/kg 體重至約 100 mg/kg 體重、約 0.05 μg/kg 體重至約 500 mg/kg 體重等範圍內的劑量。於一個態樣中，抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體可以以從約 0.01 mg、從 2.5 mg 至約 10 mg 或約 20 mg 或約 30 mg 之劑量投予患者。此等劑量可以間歇投予，例如每週或每三週投予 (例如，使得患者接受約兩個至約二十個，或例如約六個劑量之融合蛋白)。可投予初始較低的負載劑量，隨後投予一個或多個較高劑量。然而，可以使用其他劑量方案。藉由習用技術和測定很容易監測此治療的進展。於一個態樣中，抗 PD1/抗 LAG3 抗體可以以約 100 mg、約 200 mg、約 300 mg、約 400 mg、約 500 mg、約 600 mg、約 700 mg、約 800 mg、約 900 mg、約 1000 mg、約 1100 mg、約 1200 mg、約 1300 mg、約 1400 mg 或約 1500 mg 的劑量投予患者。
如本文所定義之包含與 PD1 特異性地結合之第一抗原結合域及與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域的雙特異性抗體通常將以有效達成預期目標之量使用。對於用於治療或預防疾病狀況，本發明之雙特異性抗體或其醫藥組成物係以治療有效量投予。尤其是鑒於本文中提供的詳細揭露，確定治療有效量完全在本技術領域具有通常知識者的能力範圍之內。
對於全身性投予，最初可以從體外檢定 (例如細胞培養物檢定) 估計治療有效劑量。然後可以在動物模型中製定劑量，以達到包括細胞培養物中確定的 IC 50在內的循環濃度範圍。此等資訊可用於更準確地確定對人體有用的劑量。
亦可使用本技術領域中熟知的技術從活體內資料 (例如動物模型) 估計初始劑量。該技術領域中具有通常知識者可以根據動物資料易於優化對人類的投予。
可以單獨地調節劑量及間隔以提供足以維持治療效果的雙特異性抗體之血漿含量。透過注射投予的常見患者劑量在約 0.1-50 mg/kg/天的範圍內，典型範圍為 0.5-1 mg/kg/天。可以透過每天投予多種劑量來達到治療有效的血漿濃度。血漿中的濃度可以例如透過 HPLC 來測量。
在局部投予或選擇性吸收的情況下，雙特異性抗體的有效局部濃度可能與血漿濃度無關。本技術領域習知者將能夠在無需過度實驗的情況下優化治療有效的局部劑量。
本文所述之雙特異性抗體的治療有效劑量通常將提供治療益處而不會引起實質性毒性。可藉由標準藥學過程在細胞培養物或實驗動物中確定抗體的毒性及治療功效。可以用細胞培養物測定和動物研究來測定 LD 50(致死群體的 50% 的劑量) 和 ED 50(在群體的 50% 中治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數，其可以表示為比值 LD 50/ED 50。展現出大治療指數之雙特異性抗體係較佳者。在一個實施例中，根據本發明之雙特異性抗體展現出高治療指數。從細胞培養測定法和動物研究中得到的資料可用於配製適用於人類的一系列劑量。劑量較佳地在包括很小毒性或無毒性之 ED50 的循環濃度範圍內。劑量可根據多種因素 (例如所採用的劑型、所利用的投予途徑、個體的狀況等) 在此範圍內變化。精確的製劑、給藥途徑和劑量可以由個別醫師基於患者的病症來選擇 (參見例如 Fingl 等人，1975，在：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第 1 章第 1 頁，該文獻全文以引用方式併入本文)。
用本發明之雙特異性抗體治療的患者的主治醫師將指導如何及何時由於毒性、器官功能障礙等而終止、中斷或調整投予。相反，主治醫師還將知道在臨床反應不充分 (排除毒性) 時如何將治療調整至更高的水平。在目標疾病的治療中，投予劑量的大小將隨待治療疾病的嚴重程度、投予途徑等而變化。病症的嚴重程度可部分地透過例如標準預後評價法來評價。此外，劑量以及可能的給藥頻率也將根據個體患者的年齡、體重和反應而變化。
此等其他藥物適宜地以對預期目的有效的量組合存在。此類其他藥劑之有效量視所使用之融合蛋白質之量、病症或治療之類型及如上文所述之其他因素而定。該等雙特異性抗體通常以與本文中所述者相同之劑量及投予途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任意劑量和透過任意途徑使用。
上述該等組合療法涵蓋組合投予 (其中兩種或多種治療劑包含在同一組成物中或分開的組成物中) 以及分開投予，在這種情況下，雙特異性抗體之投予可在投予另外的治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後發生。
H. 製品
在本發明之另一態樣中，提供含有可用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料的製品。該製品包括容器及容器上或與容器相關的標籤或藥品說明書。合適的容器包括例如，瓶、小瓶、注射器、IV 溶液袋等。該等容器可以由多種材料例如，玻璃或塑膠形成。容器裝有單獨或與有效治療、預防及/或診斷症狀之另一組成物組合的組成物，且可具有無菌出入孔 (例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組成物中之至少一種活性劑為前文所定義之抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體。
標籤或包裝插頁指示，該組成物可用於治療所選病狀。此外，該製品可包含 (a) 其內部容納有組成物之第一容器，其中該組成物包含本文所述之抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體；及 (b) 其內部容納有組成物之第二容器，其中該組成物包含抗 PD1/抗 LAG3 抗體。本發明之此實施例中的製成品可以進一步包含指示組成物可以用於治療具體疾病的藥品說明書。
可替代地或另外地，製成品可以進一步包含第二 (或第三) 容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝劑，例如抑菌注射用水 (BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer 溶液和葡萄糖溶液。從商業和使用者的角度來看，它可以進一步包含其他材料，其中包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。 表 C ( 序列 ) ：
SEQ ID NO: 名稱 序列
1 重鏈 HVR-H1，PD1-0103 GFSFSSY
2 重鏈 HVR-H2，PD1-0103 GGR
3 重鏈 HVR-H3，PD1-0103 TGRVYFALD
4 輕鏈 HVR-L1，PD1-0103 SESVDTSDNSF
5 輕鏈 HVR-L2，PD1-0103 RSS
6 輕鏈 HVR-L3，PD1-0103 NYDVPW
7 重鏈可變域 VH，PD1-0103 EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFSFSSYTMSWVRQTPEKRLDWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLMSEDTALYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTSVTVSS
8 輕鏈可變域 VL，PD1-0103 KIVLTQSPASLPVSLGQRATISCRASESVDTSDNSFIHWYQQRPGQSPKLLIYRSSTLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDVATYYCQQNYDVPWTFGGGTKLEIK
9 PD1-0103_01 (PD1 0376) 之人源化變異體-重鏈可變域 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSS
10 PD1-0103_01 (PD1 0376) 之人源化變異體-輕鏈可變域 VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRSSTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIK
11 重鏈 HVR-H1，aLAG3(0414) DYTMN
12 重鏈 HVR-H2，aLAG3(0414) VISWDGGGTY YTDSVKG
13 重鏈 HVR-H3，aLAG3(0414) GLTDTTLYGS DY
14 輕鏈 HVR-L1，aLAG3(0414) RASQSISSYL N
15 輕鏈 HVR-L2，aLAG3(0414) AASTLQS
16 輕鏈 HVR-L3，aLAG3(0414) QQTYSSPLT
17 重鏈可變域 VH，aLAG3(0414) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFDDYTMNWVRQAPGKGLEWVAVISWDGGGTYYTDSVKGRFTISRDDFKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGLTDTTLYGSDYWGQGTLVTVSS
18 輕鏈可變域 VL，aLAG3(0414) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSSPLTFGGGTKVEIK
19 重鏈 HVR-H1，aLAG3(0416) DYAMS
20 重鏈 HVR-H2，aLAG3(0416) GIDNSGYYTY YTDSVKG
21 重鏈 HVR-H3，aLAG3(0416) THSGLIVNDA FDI
22 輕鏈 HVR-L1，aLAG3(0416) RASQSISSYL N
23 輕鏈 HVR-L2，aLAG3(0416) DASSLES
24 輕鏈 HVR-L3，aLAG3(0416) QQSYSTPLT
25 重鏈可變域 VH，aLAG3(0416) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLACAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIDNSGYYTYYTDSVKGRFTISRDDVKNTLYLQMNSLRAEDTAVYLCTKTHSGLIVNDAFDIWGQGTMVTVSS
26 輕鏈可變域 VL，aLAG3(0416) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDATLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
27 重鏈可變域 VH，BMS-986016 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSS
28 輕鏈可變域 VL，BMS-986016 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIK
29 重鏈可變域 VH，MDX25F7 (25F7) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHNGNTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSS
30 輕鏈可變域 VL，MDX25F7 (25F7) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIK
31 重鏈可變域 VH，人源化 BAP050 (LAG525) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTLTNYGMNWVRQARGQRLEWIGWINTDTGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARNPPYYYGTNNAEAMDYWGQGTTVTVSS
32 輕鏈可變域 VL，人源化 BAP050 (LAG525) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSSSQDISNYLNWYLQKPGQSPQLLIYYTSTLHLGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYNLPWTFGQGTKVEIK
33 重鏈可變域 VH，MDX26H10 (26H10) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREWAVASWDYGMDVWGQGTTVTVSS
34 輕鏈可變域 VL，MDX26H10 (26H10) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPFTFG PGTKVDIK
35 基於 PD1(0376) 之 1+1 PD1/LAG3 0927 的重鏈 1 divmtqspdslavslgeratinckasesvdtsdnsfihwyqqkpgqspklliyrsstlesgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqnydvpwtfgqgtkveikssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslsp
36 基於 PD1(0376) 之 1+1 PD1/LAG3 0927 的輕鏈 1 evqllesggglvqpggslrlscaasgfsfssytmswvrqapgkglewvatisgggrdiyypdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvlltgrvyfaldswgqgtlvtvssasvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
37 基於 aLAG3(0414) 之 1+1 PD1/LAG3 0927 的重鏈 2 Evqllesggglvqpggslrlscaasgfifddytmnwvrqapgkglewvaviswdgggtyytdsvkgrftisrddfkntlylqmnslraedtavyycakgltdttlygsdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslsp
38 基於 aLAG3(0414) 之 1+1 PD1/LAG3 0927 的輕鏈 2 diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliyaastlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqtysspltfgggtkveikrtvaapsvfifppsdrklksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
39 基於 aLAG3(0416) 之 1+1 PD1/LAG3 0799 的重鏈 2 evqlvesggglvqpggslrlacaasgftfsdyamswvrqapgkglewvsgidnsgyytyytdsvkgrftisrddvkntlylqmnslraedtavylctkthsglivndafdiwgqgtmvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvedyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdekvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslsp
40 基於 aLAG3(0416) 之 1+1 PD1/LAG3 0799 的輕鏈 2 diqltqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliydasslesgvpsrfsgsgsgtdatltisslqpedfatyycqqsystpltfgggtkveikrtvaapsvfifppsdrklksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
41 CD3-HCDR1 TYAMN
42 CD3-HCDR2 RIRSKYNNYATYYADSVKG
43 CD3-HCDR3 HGNFGNSYVSWFAY
44 CD3-LCDR1 GSSTGAVTTSNYAN
45 CD3-LCDR2 GTNKRAP
46 CD3-LCDR3 ALWYSNLWV
47 CD3 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
48 CD3 VL QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
49 CD20-HCDR1 YSWIN
50 CD20-HCDR2 RIFPGDGDTDYNGKFKG
51 CD20-HCDR3 NVFDGYWLVY
52 CD20-LCDR1 RSSKSLLHSNGITYLY
53 CD20-LCDR2 QMSNLVS
54 CD20-LCDR3 AQNLELPYT
55 CD20 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSS
56 CD20 VL DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIK
57 CD20 VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc (杵，P329G LALA) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
58 CD20 VH-CH1(EE)-Fc (臼，P329G LALA) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
59 CD20 VL-CL(RK) DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
60 CD3 VH-CL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
61 CD20 UniProt accession No. P11836
62 奧比妥珠單抗重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
63 奧比妥珠單抗輕鏈 DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
64 鼠抗 CD20 B-Ly1 VH GPELVKPGASVKISCKASGYAFSYSWMNWVKLRPGQGLEWIGRIFPGDGDTDYNGKFKGKATLTADKSSNTAYMQLTSLTSVDSAVYLCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSA
65 鼠抗 CD20 B-Ly1 VL NPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIKR
66 人 CD3ε UniProt accession no. P07766
67 食蟹獼猴 CD3ε NCBI GenBank no. BAB71849.1
68 人 PD-1 UniProt accession no. Q15116
69 示例性人類 LAG3 序列 (無訊號序列) VPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL
70 人類 LAG3 細胞外域 (ECD) VPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHL
71 肽連接子 G 4S GGGGS
72 肽連接子 (G 4S) 2 GGGGSGGGGS
73 肽連接子 (G 4S) 3 GGGGSGGGGSGGGGS
74 肽連接子 (G 4S) 4 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
75 帕博利珠單抗重鏈 QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
76 帕博利珠單抗輕鏈 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
77 納武利尤單抗重鏈 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
78 納武利尤單抗輕鏈 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
79 抗 Lag3 重鏈 QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNDGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
80 抗 Lag3 輕鏈 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
81 抗 Lag3 重鏈可變域 VH QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNDGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSS
82 抗 Lag3 輕鏈可變域 VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIK
83 CD3 (40G5c)-HCDR1 NYYIH
84 CD3 (40G5c)-HCDR2 WIYPGDGNTKYNEKFKG
85 CD3 (40G5c)-HCDR3 DSYSNYYFDY
86 CD3 (40G5c)-LCDR1 KSSQSLLNSRTRKNYLA
87 CD3 (40G5c)-LCDR2 WASTRES
88 CD3 (40G5c)-LCDR3 TQSFILRT
89 CD3 (40G5c) VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGNTKYNEKFKGRATLTADTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCARDSYSNYYFDYWGQGTLVTVSS
90 CD3 (40G5c) VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGQGTKVEIK
91 CD20 (2H7.v16)-HCDR1 GYTFTSYNMH
92 CD20 (2H7.v16)-HCDR2 AIYPGNGDTSYNQKFKG
93 CD20 (2H7.v16)-HCDR3 VVYYSNSYWYFD V
94 CD20 (2H7.v16)-LCDR1 RASSSVSYMH
95 CD20 (2H7.v16)-LCDR2 APSNLAS
96 CD20 (2H7.v16)-LCDR3 QQWSFNPPT
97 CD20 (2H7.v16) VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS
98 CD20 (2H7.v16) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIK
99 CD3 (40G5c) 輕鏈 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
100 CD3 (40G5c) 重鏈 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGNTKYNEKFKGRATLTADTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCARDSYSNYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 
101 CD20 (2H7.v16) 輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
102 CD20 (2H7.v16) 重鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
103 KIEELE (LAG 細胞內域之一部分) KIEELE
有關人免疫球蛋白輕鍊和重鏈核苷酸序列的一般資訊，請參見：Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991)。抗體鏈的胺基酸根據 Kabat 的編號系統如上述定義進行編號和引用 (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。
本發明之態樣
下文列示本發明之一些態樣。 1.一種用於在治療CD20 表現癌症之方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體與抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體組合使用。 2.如段落 (para) 1 之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體係於單一組成物中一起投予或於兩種或更多種不同的組成物中分開地投予。 3.如段落 1 或 2 之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含 Fc 域，該 Fc 域為 IgG Fc 域，特定而言 IgG1 Fc 域或 IgG4 Fc 域，並且其中該 Fc 域包含一個或多個降低與 Fc 受體 (特定而言 Fcγ 受體) 之結合的胺基酸取代。 4.如段落 1 至 3 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含具有胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G (根據 Kabat EU 索引編號) 之人類 IgG1 亞類的 Fc 域。 5.如段落 1 至 4 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含特異性地結合至計畫性細胞死亡蛋白 1 的第一抗原結合域 (PD1) 及特異性地結合至淋巴球活化基因-3 (LAG3) 的第二抗原結合域，其中特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域包含： VH 域，該 VH 域包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:1 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列； (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列。 6.如段落 1 至 4 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含與 LAG3 特異性地結合之第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含 (a) VH 域，其包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列， (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列；或 (b) VH 域，其包含 (i) HVR-H1，其包含 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列， (ii) HVR-H2，其包含 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-H3，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 (i) HVR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列， (ii) HVR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (iii) HVR-L3，其包含 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列。 7.如段落 1 至 6 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列，且該 VL 域包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列。 8.如段落 1 至 7 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含特異性地結合至 LAG3 的第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含 (a) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列，或 (b) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列。 9.如段落 1 至 5 或段落 7 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含特異性地結合至 LAG3 的第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含 (a) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 27 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 28 之胺基酸序列，或 (b) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 29 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 30 之胺基酸序列，或 (c) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列，或 (d) VH 域，其包含 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列。 10.如段落 1 至 9 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含 特異性地結合至 PD1 的第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列的 VH 域及包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列的 VL 域， 以及特異性地結合至 LAG3 的第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列的 VH 域及包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列的 VL 域。 11.如段落 1 至 10 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含特異性地結合至 PD1 的 Fab 片段及特異性地結合至 LAG3 的 Fab 片段。 12.如段落 1 至 11 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含特異性地結合至 PD1 的 Fab 片段，其中可變域 VL 與 VH 彼此替換，使得 VL 為重鏈之一部分且 VH 為輕鏈之一部分。 13.如段落 1 至 12 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含與 PD-1 之單價結合及與 LAG3 之單價結合。 14.如段落 1 至 13 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含 (a) 第一重鏈，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列；第一輕鏈，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；第二重鏈，其包含有 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列；以及第二輕鏈，其包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列；或者 (b) 第一重鏈，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列；第一輕鏈，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；第二重鏈，其包含有 SEQ ID NO: 39 之胺基酸序列；以及第二輕鏈，其包含 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列。 15.如段落 1 至 14 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體包含：第一重鏈，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列；第一輕鏈，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；第二重鏈，其包含有 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列；以及第二輕鏈，其包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列。 16.如段落 1 至 15 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含第一抗原結合域及第二抗原結合域，該第一抗原結合域包含重鏈可變區 (V HCD3) 及輕鏈可變區 (V LCD3)，且該第二抗原結合域包含重鏈可變區 (V HCD20) 及輕鏈可變區 (V LCD20)。 17.如段落 1 至 16 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD3)，其包含 SEQ ID NO:41 之 CDR-H1 序列、SEQ ID NO:42 之 CDR-H2 序列及 SEQ ID NO:43 之 CDR-H3 序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD3)，其包含 SEQ ID NO:44 之 CDR-L1 序列、SEQ ID NO:45 之 CDR-L2 序列及 SEQ ID NO:46 之 CDR-L3 序列。 18.如段落 1 至 17 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD3)，其包含 SEQ ID NO:47 之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD3)，其包含 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列。 19.如段落 1 至 18 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD20)，其包含 SEQ ID NO:49 之 CDR-H1 序列、SEQ ID NO:50 之 CDR-H2 序列及 SEQ ID NO:51 之 CDR-H3 序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD20)，其包含 SEQ ID NO:52 之 CDR-L1 序列、SEQ ID NO:53 之 CDR-L2 序列及 SEQ ID NO:54 之 CDR-L3 序列。 20.如段落 1 至 19 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD20)，其包含 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區 (V LCD20)，其包含 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列。 21.如段落 1 至 20 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含與 CD20 特異性地結合之第三抗原結合域。 22.如段落 1至 21 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體包含 Fc 域，該 Fc 域包含一個或多個胺基酸取代，該一個或多個胺基酸取代降低與 Fc 受體之結合及/或效應子功能。 23.如段落 1 至 22 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體與抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體組合使用，並且其中該組合係以約一週至三週之間隔投予。 24.如段落 1 至 23 中任一者之用於在方法中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其中在組合治療之前用第 II 型抗 CD20 抗體 (較佳奧比妥珠單抗) 進行預治療，其中該預治療與該組合治療之間的時間段足以因應該第 II 型抗 CD20 抗體 (較佳奧比妥珠單抗) 而減少個體中之 B 細胞。 25.一種醫藥組成物，其包含抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體之組合，該醫藥組成物用於疾病，特定而言 CD20 表現癌症之組合、依序或同時治療。 26.一種包含抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物，以及包含抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體之第二藥物。 27.如段落 26 之醫藥組成物，該醫藥組成物用於治療CD20 表現癌症，特定而言選自由以下所組成之群組的血液癌症：非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)、急性淋巴球性白血病 (ALL)、慢性淋巴球性白血病 (CLL)、彌漫型大 B 細胞淋巴瘤 (DLBCL)、濾泡性淋巴瘤 (FL)、被套細胞淋巴瘤 (MCL)、緣帶淋巴瘤 (MZL)、多發性骨髓瘤 (MM) 或何杰金氏淋巴瘤 (HL)。 28.抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體之組合在製備用於治療CD20 表現癌症之藥物中的用途。 29.一種用於在受試者中治療CD20 表現癌症的方法，包含對受試者投予有效量之抗 CD20/抗 CD3 抗體及有效量之抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體。 30.如段落 29 之方法，其中該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體與該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體係於單一組成物中一起投予或於兩種或更多種不同的組成物中分開地投予。 31.如段落 29 或 30 之方法，其中該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體與該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體係經靜脈內或皮下投予。 32.如段落 29 至 31 中任一者之方法，其中該抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體係與該抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體同時投予，或於其之前或之後投予。 實例
重組 DNA 技術
使用標準方法操作 DNA，如敘述於 Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989。根據製造商之說明使用分子生物試劑。關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊提供於：Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242。
DNA 測序
透過雙股測序測定 DNA 序列。
基因合成
所需之基因片段可藉由使用適當模板的 PCR 產生，或由 Geneart AG (Regensburg, Germany) 從合成的寡核苷酸及 PCR 產物藉由自動基因合成來合成。在確切之基因序列不可用的情況下，寡核苷酸引子基於最接近的同源物之序列來設計，並藉由 RT-PCR 從來源於適當組織的 RNA 中分離出基因。將位於單個限制內切酶切割位點側翼的基因片段選殖到標準選殖/測序載體中。從轉化的細菌中純化質體 DNA，並透過 UV 光譜確定濃度。透過 DNA 測序確認亞克隆基因片段的 DNA 序列。基因片段設計有合適的限制位點，以允許亞選殖到各自的表現載體中。所有構建體均設計有用於前導肽的 5’ 端 DNA 序列編碼，該前導肽靶向蛋白質以在真核細胞中分泌。
細胞培養技術
使用標準細胞培養技術，如敘述於 Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc。
蛋白質純化
參照標準方案從過濾的細胞培養上清液中純化蛋白質。簡而言之，將抗體施用於蛋白質 A 瓊脂糖凝膠管柱 (GE Healthcare) 並以 PBS 洗滌。在 pH 2.8 下實現抗體之溶離，接著立即中和樣品。在 PBS 或 20 mM 組胺酸、150 mM NaCl pH 6.0 中藉由粒徑排阻層析 (Superdex 200，GE Healthcare) 將聚集的蛋白質與單體抗體分離。收集單體抗體濾份，(必要時) 使用例如 MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO) 離心濃縮器濃縮，冷凍並在 -20℃ 或 -80℃ 下儲存。提供部分樣品用於後續蛋白質分析及分析型特徵化，例如藉由 SDS-PAGE、粒徑排阻層析 (SEC) 或質譜分析。
SDS-PAGE
根據製造商說明使用 NuPAGE® Pre-Cast 凝膠系統 (Invitrogen)。特別是，使用 10% 或 4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast 凝膠 (pH 6.4) 及 NuPAGE® MES (還原性凝膠，具有 NuPAGE® Antioxidant 操作緩衝液添加劑) 或 MOPS (非還原性凝膠) 操作緩衝液。
分析型粒徑排阻層析
藉由HPLC層析進行用於測定抗體之聚集及寡聚狀態之粒徑排阻層析(SEC)。簡言之，將蛋白質 A 純化抗體施用於 Agilent HPLC 1100 系統上 300 mM NaCl、50 mM KH 2PO 4/K 2HPO 4，pH 7.5 中之 Tosoh TSKgel G3000SW 管柱或 Dionex HPLC 系統上 2×PBS 中之 Superdex 200 管柱 (GE Healthcare)。藉由 UV 吸光度及峰值面積之積分來定量溶離之蛋白質。BioRad Gel 過濾標準 151-1901 用作標準。
使用表面電漿子共振 (SPR)(BIACORE) 測定多特異性抗體與各別抗原之結合及結合親和力
使用 BIACORE 儀器 (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Sweden) 藉由表面電漿子共振研究所產生之抗體與各別抗原之結合。簡言之，對於親和力量測，山羊抗人類 IgG、JIR 109-005 -098 抗體經由胺偶合固定在 CM5 晶片上以用於針對各別抗原之抗體之呈現。在 HBS 緩衝液 (HBS-P)(10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.005% Tween 20，ph 7.4)中，在 25℃ 下 (或在 37℃ 下) 量測結合。在溶液中以多種濃度添加抗原 (R&D Systems 或內部純化)。藉由 80 秒至 3 分鐘之抗原注射來量測締合；藉由用 HBS 緩衝液洗滌晶片表面 3 - 10 分鐘來量測解離且使用 1:1 朗格繆爾結合模型 (Langmuir binding model) 來評估 KD 值。自樣品曲線減去陰性對照資料 (例如緩衝液曲線) 以用於系統內源性基線偏移之校正及雜訊信號降低。使用各別 Biacore Evaluation 軟體進行感測圖譜之分析及親和力資料之計算。 實例 1 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體之製備、純化及表徵
TCB 分子已根據 WO 2016/020309 A1 中所述之方法製備。
實驗中使用的抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體 (CD20 CD3 TCB 或 CD20 TCB) 對應於 WO 2016/020309 A1 之實例 1 中所述的分子 B。分子 B 為「2+1 IgG CrossFab」抗體，由兩條不同的重鏈及兩條不同的輕鏈組成。引入 CH3 域中之點突變 (「杵入臼」) 以促進兩條不同的重鏈之組裝。根據 WO 2012/130831 中所述之方法，將 Pro329Gly、Leu234Ala 及 Leu235Ala 突變引入至杵及臼重鏈之恆定區內以廢除與 Fcγ 受體之結合。作成 CD3 結合 Fab 中的 VH 與 VL 域之交換以及 CD20 結合 Fab 中的 CH 與 CL 域中之點突變，以促進兩種不同的輕鏈之正確組裝。2 +1 意指該分子具有兩個對 CD20 具特異性之抗原結合域及一個對 CD3 具特異性之抗原結合域。
CD20 TCB 包含 SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59 及 SEQ ID NO:60 之胺基酸序列。 圖 1B中顯示 2+1 格式之雙特異性抗體的示意圖。
該分子在 WO 2016/020309 A1 之實例 1 中進一步表徵。 實例 2 雙特異性抗 PD1/ 抗 LAG3 抗體之製備、純化及表徵
產生與人類 PD1 及人類 LAG3 結合且在一個結合臂中具有 VH/VL 域交換/替換 ( CrossMAb Vh-VL ) 的雙特異性抗體，如 WO 2018/185043 之實例 10.1 中所述。多特異性 1+1 CrossMAb Vh-Vl 抗體的製備亦在 WO 2009/080252 中描述。使用含有編碼 表 1中所示之胺基酸序列之核酸的表現質體來表現該等雙特異性抗體。1+1 CrossMAb Vh-Vl 雙特異性抗體的示意性結構示於圖 1A 中。 表 1 ：輕鏈 (LC) 及重鏈 (HC) 的胺基酸序列，具有 VH/VL 域交換 / 替換 (1+1 CrossMAb Vh-Vl)
1+1 抗體 HC1 HC2 LC1 LC2
PD1/LAG3 0799 PD1(0376)/ aLAG3(0416) SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO: 40
PD1/LAG3 0927 PD1(0376)/ aLAG3(0414) SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO: 38
對於全部構建體，使用杵入臼異源二聚化技術，在第一 CH3 域中使用典型的杵 (T366W) 取代，在第二 CH3 域中使用相對應之臼取代 (T366S、L368A 及 Y410V) (以及兩個另外的引入之半胱胺酸殘基 S354C/Y349) (包含在上述各自對應的重鏈 (HC) 序列中)。根據 WO 2012/130831 中所述之方法，將 Pro329Gly、Leu234Ala 及 Leu235Ala 突變引入至杵及臼重鏈之恆定區內以廢除與 Fcγ 受體之結合。為了提高正確配對，在習知 Fab (帶電變異體) 之 CH 及 CL 域中另外引入了胺基酸取代。
藉由蛋白 A 親和層析術與粒徑篩析層析術之組合從上清液中純化如上表現的雙特異性抗體。所得產物藉由質譜及分析特性 (例如藉由 SDS-PAGE 獲得的純度、單體含量及穩定性) 表徵以進行鑑定。
用於比較之親本 PD1 抗體 PD1(0376) IgG1 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列，以及 VL 域，其包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列。 實例 3 PD-1/LAG-3 雙特異性抗體與 CD20 CD3 TCB 組合對與 B 細胞淋巴樣細胞株 (ARH77) 共培養之人類 CD4 T 細胞釋放之細胞毒性顆粒酶 B 的影響
為了探究 PD-1/LAG-3 雙特異性抗體與 CD20-TCB 至組合性，我們開發了一種檢定法，於該檢定法中，將新鮮純化之 CD4 T 細胞在 EBV 永生化 B 細胞淋巴母細胞瘤細胞株 (ARH77) 存在下共培養 5 天。我們選擇 ARH77 細胞株，蓋因其 PD-1 配體 PD-L1 之中等表現水平及高水平之 LAG-3 配體 MHC-II，允許評估除 PD-1 之外，LAG-3 阻斷的貢獻。
CD4 T 細胞藉由微珠套組 (Miltenyi Biotec) 從 5 位健康供體獲得的 10 8個 PBMC 中富集。在培養之前，CD4 T 細胞用 5 μM 之羧基螢光素琥珀亞醯胺酯 (CFSE) 標記。然後在濃度介於 10 -7與 10 μg/ml 之間的阻斷性抗 PD1 抗體 (親本抗 PD-1、納武利尤單抗或帕博利珠單抗) 或 PD-1/LAG-3 雙特異性抗體 PD1/LAG3 0927 (PD1-LAG3 BsAb) 以及固定濃度之 CD20-TCB (66pM)存在或不存在下，將 10 5個 CD4 T 細胞與 B 細胞株 (5:1) 一起接種於 96 孔板中。五天后，在孵化之最後五個小時，我們添加 Golgi-plug 及 Golgi-stop 以阻斷蛋白質運輸並允許細胞激素在細胞內蓄積。
有趣的是，我們觀察到 PD-1 阻斷性抗體與 CD20-TCB 組合對顆粒酶 B 之 CD4 T 細胞分泌的劑量依賴性效應 (參見 圖 2)。然而，等莫耳之 PD1-LAG3 BsAb 在以劑量依賴性方式增加 CD4 T 細胞分泌之顆粒酶 B 方面比 PD-1 阻斷性抗體更有效 (E max)，使其成為 CD20-TCB 的適合組合夥伴。相對應之 EC50 值顯示於下 表 2中： 表 2 ：當與 PD1-LAG3 BsAb 或阻斷性抗 PD1 抗體與 CD20 CD3 TCB 之組合一起接種時，將 CD4 T 細胞分泌之顆粒酶 B 與 ARH77 共培養
分子 EC 50
帕博利珠單抗 n.d.
納武利尤單抗 4.039
親本 aPD-1 抗體 PD1(0376) 0.3318
PD1-LAG3 BsAb (PD1/LAG3 0927) 0.2162
實例 4 PD1/LAG3 雙特異性抗體與 CD20 CD3 TCB 之組合療法在 人源化 NSG 小鼠中之 WSU-DLCL2 移植物模型中的活體內強效抗腫瘤效應
PD-1/LAG-3 雙特異性抗體 PD1/LAG3 0927 (PD1-LAG3 BsAb) 與 CD20 CD3 TCB (CD20 TCB) 組合的抗腫瘤活性在植入了人類彌漫型大 B 細胞淋巴瘤模型 WSU-DLCL2 的 HSC-NSG 小鼠活體內評估，經 s.c. 注射。將該組合之功效與單一治療 CD20 CD3 TCB 及其與納武利尤單抗之組合或與納武利尤單抗加抗 LAG3 參考抗體之組合進行比較。 a) 實驗材料與方法
WSU-DLCL2 細胞株之製備：WSU-DLCL2 細胞 (人類彌漫型大 B 細胞淋巴瘤) 最初從 ECACC (歐洲細胞培養物保藏中心) 獲得，並在擴增後存放於 Roche Glycart 內部細胞庫中。細胞在含有 10% FCS 及 1x Glutamax 之 RPMI 中培養。將細胞置於水飽和大氣環境及 5 % CO 2中於 37 °C 進行培養。以每隻動物 1.5 x 10 6個細胞 (體外傳代 P13) 的濃度，將 RPMI 細胞培養基 (Gibco) 及 GFR matrigel (1:1，總體積為 100 μl) 中的細胞經 s.c. 注射到每隻小鼠體內，細胞活力為 98.6%。
完全人源化之小鼠的產生：根據規定指南 (GV-Solas；Felasa；TierschG) 將在實驗開始時為 4-5 週齡的雌性 NSG 小鼠 (Jackson Laboratory) 維持於無特定病原體條件下，其中使用每天光照 12 小時/黑暗 12 小時之循環。實驗研究方案已經由地方政府審查及批准 (P 2011/128)。收到動物後，將動物飼養一周以適應新環境並進行觀察。定期進行持續的健康狀況監測。向 NSG 小鼠經腹膜腔內注射 15 mg/kg 硫酸布他卡因 (busulfan)，隨後在一天後經靜脈內注射自臍帶血分離之 1 x 10 5個人類造血幹細胞。在幹細胞注射後第 14-16 週，在舌下對人源化免疫缺陷小鼠 (HSC-NSG) 放血且藉由流式細胞技術分析血液是否成功地人源化。將有效植入之小鼠根據其人類 T 細胞頻率隨機分入不同治療組中。
功效實驗：在第 0 天，用 1.5 x 10 6個 WSU-DLCL2 細胞 (人彌漫型大 B 細胞淋巴瘤，其表現 CD20) 在 matrigel 存在下以 1:1 比率對完全人源化之 HSC-NSG 小鼠進行皮下激發。在整個實驗過程中，藉由卡尺每週測量腫瘤 3 次。在第 14 天 (腫瘤平均約為 350-400 mm 3)，將小鼠隨機分為七組 ( 圖 3) 並給予第一療法。開始每週計畫療法：A 組接受媒液 (磷酸鹽緩衝鹽液，PBS)，B 組接受 CD20 TCB (0.15 mg/kg，每週一次，i.v.)，C 組接受 CD20 TCB (0.15 mg/kg，每週一次，i.v.)+ 納武利尤單抗 (1.5 mg/kg，每週一次，i.v.)，D 組接受 CD20 TCB (0.15 mg/kg，每週一次，i.v.)+ 納武利尤單抗 (1.5 mg/kg，每週一次，i.v.)+ 抗 LAG3 (BMS-986016，1.5 mg/kg，每週一次，i.v.)，E 組接受 CD20 TCB (0.15 mg/kg，每週一次，i.v.)+ PD1-LAG3 BsAb (1.5 mg/kg，每週一次，i.v.)，並且 F 組接受 CD20 TCB (0.15 mg/kg，每週一次，i.v.)+ PD1-LAG3 BsAb (3 mg/kg，每週一次，i.v.)。藉由腹腔內注射最大 400 μl 進行治療。使用卡尺每週測量腫瘤生長 3 次，並且腫瘤體積計算如下： T v：(W 2/2) x L               (W：寬；L：長)
研究在第 45 天終止。
因此，藉由測量腫瘤大小來評估療法之影響，並將其顯示為腫瘤生長隨時間之變化，或以平均值之形式 ( 圖 4)，或以每隻小鼠的腫瘤生長隨時間之變化的形式 ( 圖 5A至 5F)。對於統計分析，最後觀察到的每隻動物之腫瘤體積用作終點，並評估其是否低於 800 mm³。然後基於 Chi² 檢驗對該終點進行各組間之兩兩比較 ( 圖 6)。 b) 結果
在該設定下，發現與媒液相比，用 CD20 TCB 治療攜帶 WSU-DCLC2 之小鼠係媒介從第 30 天開始的強烈腫瘤生長抑制 ( 圖 4)。眾所周知，透過 TCB 進行活化係誘導 T 細胞上之 PD1 表現以及 LAG3 表現，因此 CD20 TCB 與納武利尤單抗組合或與納武利尤單抗加抗 LAG3 抗體組合以試圖進一步提高功效。然而，與單一治療相比，該組合並未將腫瘤生長減少到統計學顯著水平 ( 圖 4及 6)。相比之下，用 1.5 及 3 mg/kg 兩種劑量之 PD1-LAG3 BsAb 與 CD20 TCB 組合治療導致了強烈腫瘤保護，到第 42 天時腫瘤消退。當考慮到最後觀察到的腫瘤大小並將閾值固定為 800 mm 3而應用統計分析時，相較於使用 CD20 TCB 與納武利尤單抗及抗 LAG3 抗體之組合進行治療，當用 3 mg/kg PD1-LAG3 BsAb 與 CD20 TCB 之組合治療動物時，觀察到抗腫瘤功效顯著增加。
每隻動物的腫瘤生長在 圖 5A至 5F的蜘蛛圖中描繪。該等圖顯示，在媒液中，除兩個以外，全部腫瘤皆在整個實驗窗口內進展。當 CD20-TCB 與納武利尤單抗組合或與納武利尤單抗加抗 LAG3 組合使用時，未觀察到抗腫瘤功效的重大改善。相比之下，CD20-TCB 與 3mg/kg 及 1.5mg/kg 之 PD1-LAG3 BsAb 的組合在大多數小鼠中顯示出一致的腫瘤控制，除了一隻。 實例 5 PD1/LAG3 雙特異性抗體與 CD20 CD3 TCB 之組合療法在 人源化 NSG 小鼠中之 OCI-Ly18 移植物模型中的活體內強效抗腫瘤效應
為了評估 PD-1 及 LAG-3 共阻斷與 CD20 CD3 雙特異性抗體組合的貢獻，在攜帶 OCI-Ly18 之 huHSC-NSG 小鼠中評估了與 CD20 TCB (格菲妥單抗) 之組合。OCI-Ly18 為一種人類 DLBC 淋巴瘤模型，其對 CD20-TCB 治療不太敏感，作為單一療法，該治療無法控制腫瘤生長。 a) 實驗材料與方法
完全人源化之小鼠的產生：根據規定指南 (GV-Solas；Felasa；TierschG) 將在實驗開始時為 4-5 週齡的雌性 NSG 小鼠 (Jackson Laboratory) 維持於無特定病原體條件下，其中使用每天光照 12 小時/黑暗 12 小時之循環。實驗研究方案已經由地方政府審查及批准 (P 2011/128)。收到動物後，將動物飼養一周以適應新環境並進行觀察。定期進行持續的健康狀況監測。向 NSG 小鼠經腹膜腔內注射 15 mg/kg 硫酸布他卡因 (busulfan)，隨後在一天後經靜脈內注射自臍帶血分離之 1 x 10 5個人類造血幹細胞。在幹細胞注射後第 14-16 週，在舌下對小鼠放血且藉由流式細胞術分析血液是否成功實現人類化。將有效植入之小鼠根據其人類 T 細胞頻率隨機分入不同治療組中。
OCI-Ly18 細胞株之製備 ： OCI-Ly18細胞 (人類彌漫型大 B 細胞淋巴瘤) 最初從 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) 獲得，並在擴增後存放於 Glycart 內部細胞庫中。 OCI-Ly18細胞在含有 10% 胎牛血清 (FCS，Gibco) 及 1% Glutamax (Invitrogen/Gibco # 35050- 038) 之 RPMI 1640 培養基 (Gibco/Lubioscience # 42401-042) 中培養。將細胞置於水飽和大氣環境及 5 % CO 2中於 37 °C 進行培養。
功效實驗 ：在第 0 天，用 5 x 10 6個 OCI-Ly18 細胞 (人彌漫型大 B 細胞淋巴瘤) 在 matrigel 存在下以 1:1 比率對完全人源化之 HSC-NSG 小鼠 (每組 20 隻小鼠) 進行皮下激發。在第 11 天 (腫瘤平均約為 200 mm 3)，投予使用奧比妥珠單抗進行之第一治療以消除周邊 B 細胞並避免細胞激素釋放症候群。用奧比妥珠單抗 (30 mg/kg) 進行預治療後，進行每週計畫療法：媒液 (組胺酸緩衝液)、CD20 TCB (0.5 mg/kg)、PD1-LAG3 BsAb (3 mg/kg)、帕博利珠單抗 (1.5 mg/kg) 及抗 LAG3 抗體 (1.5 mg/kg；包含 SEQ ID NO:79 及 SEQ ID NO:80 之胺基酸序列的抗體) (i.v.)(參見 圖 7)。使用卡尺每週測量 2-3 次腫瘤生長，並且腫瘤體積計算如下： T v：(W 2/2) x L (W ：寬； L ：長 )
研究在第 35 天終止。 b) 結果
在該實驗中，與媒液組相比，CD20 TCB (0.5 mg/kg) 至單一療法導致腫瘤生長延遲 ( 圖 8)。然而，CD20 TCB 與 PD1-LAG3 BsAb (3 mg/kg) 之組合提供腫瘤控制，並且在一些小鼠中促進腫瘤排斥 ( 圖 9C)。有趣的是，CD20 TCB 與帕博利珠單抗 (1.5 mg/kg) 及抗 LAG3 抗體 (1.5 mg/kg) 之組合與 CD20 TCB 單一療法沒有區別。
此等資料證明，在淋巴瘤異種移植模型的背景下，PD1-LAG3 BsAb 以優於標準護理抗 PD-1 抗體與以 1.5 mg/kg 投予之單特異性抗 LAG-3 抗體組合的方式改善 CD20 TCB 之抗腫瘤活性，為了匹配 PD-1 及 LAG-3 結合位點，對比 3 mg/kg 的 PD1-LAG3 BsAb。此等研究確立 PD1-LAG3 BsAb 對於 LAG-3 抑制的貢獻超過 PD-1 抑制，並支持其與競爭對手抗 PD-1 抗體與抗 LAG-3 抗體之組合的差異化作用機制。 實例 6 在用奧比妥珠單抗預治療後， PD1/LAG3 雙特異性抗體與 CD20 CD3 TCB 之組合療法在 人源化 NSG 小鼠中之 OCI-Ly18 移植物模型中的活體內抗腫瘤效應
在該另外的實驗中，進一步評估了用奧比妥珠單抗 (一種抗 CD20 耗竭抗體) 進行之預治療，該預治療係用以減少由周邊 B 細胞與由格菲妥單抗媒介之 T 細胞接合所誘導的細胞激素釋放症候群 (CRS) ( 圖 10)。 a) 實驗材料與方法
完全人源化之小鼠的產生：根據規定指南 (GV-Solas; Felasa; TierschG) 將在實驗開始時 4-5 週齡的雌性 NSG 小鼠 (Jackson 實驗室) 維持於無特定病原體條件下，其中每天使用光照 12 小時/黑暗 12 小時之循環。實驗研究方案已經由地方政府審查及批准 (P 2011/128)。收到動物後，將動物飼養一周以適應新環境並進行觀察。定期進行持續的健康狀況監測。向 NSG 小鼠經腹膜腔內注射 15 mg/kg 硫酸布他卡因 (busulfan)，隨後在一天後經靜脈內注射自臍帶血分離之 1 x 10 5個人類造血幹細胞。在幹細胞注射後第 14-16 週，在舌下對小鼠放血且藉由流式細胞術分析血液是否成功實現人類化。將有效植入之小鼠根據其人類 T 細胞頻率隨機分入不同治療組中。
OCI-Ly18 細胞株之製備 ： OCI-Ly18細胞 (人類彌漫型大 B 細胞淋巴瘤) 最初從 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) 獲得，並在擴增後存放於 Glycart 內部細胞庫中。 OCI-Ly18細胞在含有 10% 胎牛血清 (FCS，Gibco) 及 1% Glutamax (Invitrogen/Gibco # 35050- 038) 之 RPMI 1640 培養基 (Gibco/Lubioscience # 42401-042) 中培養。將細胞置於水飽和大氣環境及 5 % CO 2中於 37 °C 進行培養。
功效實驗 ：在第 0 天，用 5 x 10 6個 OCI-Ly18 細胞 (人彌漫型大 B 細胞淋巴瘤) 在 matrigel 存在下以 1:1 比率對完全人源化之 HSC-NSG 小鼠 (每組 14 隻小鼠) 進行皮下激發。在第 17 天 (腫瘤平均約為 400 mm 3)，投予使用奧比妥珠單抗 (30 mg/kg) 進行之第一治療以消除周邊 B 細胞並避免細胞激素釋放症候群。奧比妥珠單抗預治療之後為每週計畫療法：媒液 (組胺酸緩衝液)、CD20 TCB (0.5 mg/kg)、PD1-LAG3 BsAb (3 mg/kg)，全部 i.v.。(參見 圖 10)。使用卡尺每週測量 2-3 次腫瘤生長，並且腫瘤體積計算如下： T v：(W 2/2) x L (W ：寬； L ：長 )
研究在第 35 天終止。 b) 結果
在該實驗中，與媒液組相比，CD20 TCB (0.5 mg/kg) 單一療法及奧比妥珠單抗 (30 mg/kg) 預治療導致部分的腫瘤控制 ( 圖 11以及 圖 12A及 12B)。然而，CD20 TCB 與 PD1-LAG3 BsAb (3 mg/kg) 之組合提供強烈的腫瘤控制 ( 圖 11)。在一些小鼠中觀察到腫瘤排斥 ( 圖 12C)。此等資料證明，當使用奧比妥珠單抗進行預治療以降低 CRS 時，PD1-LAG3 BsAb 在淋巴瘤異種移植模型的背景下亦改善 CD20 TCB 的抗腫瘤活性。
本研究確立在奧比妥珠單抗預治療的背景下，PD1-LAG3 BsAb 對於 PD-1 及 LAG-3 的抑制作用超過 CD20-TCB 單一療法。 ***
圖 1A及 1B為實例中使用之特定抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體 (圖 1A) 及特定抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體 (圖 1B) 的示意圖。此等分子分別於實例 2 及 1 中更詳細地描述。 圖 1A顯示 1+1 格式之抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體，其中該 PD1 結合域包含 crossFab (具有 VH/VL 域交換)，且該 LAG3 結合域包含具有胺基酸突變以支持正確配對的 CH1 及 CK域 (「帶電變體」)。該 Fc 部分包括杵入臼突變 (黑色箭頭所示) 以及胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G，幾乎完全消除了與人類 IgG1 Fc 域之 Fcγ 受體結合。在 圖 1B中，顯示 2+1 格式之示例性雙特異性抗 CD20/抗 CD3 抗體 (命名為 CD20 TCB)。 圖 2顯示抗 PD1/抗 LAG3 雙特異性抗體 (PD1-LAG3 BsAb) 與 CD20 TCB 之組合對於與 B 細胞-類淋巴母細胞株 (ARH77) 共培養之人類 CD4 T 細胞所釋放之細胞毒性顆粒酶 B 的影響。PD1-LAG3 BsAb 與 PD-1 抗體 (納武利尤單抗 (nivolumab)、帕博利珠單抗 (pembrolizumab) 及親本 PD-1 抗體) 進行比較。 圖 3顯示 PD1-LAG3 BsAb 對比 PD1 抗體與 CD20 TCB 組合在攜帶 WSU-DLCL2 之完全人源化之 NSG 小鼠中之活體內療效研究的方案。接受不同組合之小鼠亞組定義於下表中。該實驗如實例 4 中所述。 圖 4顯示研究之結果。人源化 NSG 小鼠係經皮下注射 1.5 x 10 6個表現 CD20 之 WSU-DLCL2 細胞。在腫瘤達到約 350-400 mm 3之平均體積後 (於第 14 天)，將小鼠隨機分為 6 組，接受：A) 磷酸鹽緩衝鹽液 (PBS；媒液) 作為對照； B) CD20-TCB (0.15 mg/kg，每週一次，i.v.)；C) CD20-TCB (0.15 mg/kg，每週一次，i.v.)+ 納武利尤單抗 (1.5 mg/kg，每週一次，i.v.)；D) CD20-TCB (0.15 mg/kg，每週一次，i.v.)+ 納武利尤單抗 (1.5 mg/kg，每週一次，i.p.)+ 抗 LAG3 (1.5 mg/kg，每週一次，i.v.)；E) CD20-TCB (0.15 mg/kg，每週一次，i.v.)+ PD1-LAG3 BsAb (1.5 mg/kg，每週一次，i.v.)；F) CD20-TCB (0.15 mg/kg，每週一次，i.v.)+ PD1-LAG3 BsAb (3 mg/kg，每週一次，i.v.)。每週 3 次用數位卡尺測量腫瘤體積。資料顯示為平均腫瘤體積及平均值之標準誤差 (+/-SEM)。 在 圖 5A至 5F中，顯示在第 14 天至第 45 天的時間段內每一個體動物的腫瘤體積測量值 (mm 3+/- SEM)，顯示了在使用 PD1-LAG3 BsAb 治療的組中抗腫瘤反應之均一性。 圖 5A顯示媒液組的腫瘤生長曲線， 圖 5B顯示單獨使用 CD20 CD3 TCB (0.15 mg/kg) 時的腫瘤生長曲線， 圖 5C顯示 CD20 CD3 TCB 與納武利尤單抗 (1.5 mg/kg) 之組合的腫瘤生長曲線， 圖 5D顯示 CD20 CD3 TCB 與納武利尤單抗 (1.5 mg/kg) 及抗 LAG3 (1.5 mg/kg) 之組合的腫瘤生長曲線， 圖 5E顯示 CD20 CD3 TCB 與 PD1/LAG3 BsAb (1.5 mg/kg) 之組合的腫瘤生長曲線，且 圖 5F中顯示與 PD1/LAG3 BsAb (3 mg/kg) 之組合的腫瘤生長曲線。 圖 6顯示，相較於使用與納武利尤單抗之組合或與納武利尤單抗 + 抗 LAG3 之組合進行的治療，CD20 CD3 TCB 與 3 mg/kg 之 PD1/LAG3 BsAb 之組合產生了統計學顯著之腫瘤保護。對於該分析，將腫瘤體積資料轉換以引入一個新的終點：我們評估了每隻動物最後觀察到之腫瘤體積是否小於 800 mm³ 或不提供二進制讀數及小尺寸腫瘤的百分比。然後基於 Chi² 檢驗對該終點進行各組間之兩兩比較。 圖 7顯示 CD20 TCB 與 PD1-LAG3 BsAb 之組合或與帕博利珠單抗 + 抗 LAG3 之組合在攜帶 OCI-Ly18 之完全人源化之 NSG 小鼠中之活體內療效研究的方案。接受不同組合之小鼠亞組定義於下表中。該實驗如實例 5 中所述。 圖 8顯示研究之結果。人源化 NSG 小鼠係經皮下注射表現 CD20 之 OCI-Ly18 淋巴瘤細胞。在腫瘤達到約 200 mm 3之平均體積後 (於第 10 天)，將小鼠隨機分組且行注射療法。腫瘤體積的測量值 (mm 3+/- SEM) 顯示為該組小鼠之平均體積。測量腫瘤大小直到至少有 6 隻 (對於媒液) 或 7 隻 (對於治療組) 小鼠/組/時間點。跟蹤媒液組直至第 26 天，而治療組直至第 35 天。資料顯示為平均腫瘤體積及平均值之標準誤差 (+/-SEM)。 在 圖 9A至 9D中，顯示在第 10 天至第 35 天的時間段內每一個體動物的腫瘤體積測量值 (mm 3+/- SEM)。 圖 9A中顯示媒液組的腫瘤生長曲線， 圖 9B中顯示單獨使用 CD20 CD3 TCB 時的腫瘤生長曲線， 圖 9C中顯示 CD20 CD3 TCB 與 PD1-LAG3 BsAb 之組合的腫瘤生長曲線，以及 圖 9D中顯示 CD20 CD3 TCB 與帕博利珠單抗及抗 LAG3 之組合的腫瘤生長曲線。 圖 10顯示當使用奧比妥珠單抗進行預治療時，單獨使用 CD20 TCB 對比與 PD1-LAG3 BsAb 之組合在攜帶 OCI-Ly18 之完全人源化之 NSG 小鼠之活體內療效研究的方案。接受不同組合之小鼠亞組定義於下表中。該實驗如實例 6 中所述。 圖 11顯示研究之結果。人源化 NSG 小鼠係經皮下注射表現 CD20 之 OCI-Ly18 淋巴瘤細胞。在腫瘤達到約 400 mm 3之平均體積後 (於第 17 天)，根據實驗配置將小鼠隨機分組且行注射療法。腫瘤體積的測量值 (mm 3+/- SEM) 顯示為該組小鼠之平均體積。對於治療組，測量腫瘤大小直至第 35 天，而對於媒液組直至第 26 天。 在 圖 12A至 12C中，顯示在第 17 天至第 35 天的時間段內每一個體動物的腫瘤體積測量值 (mm 3+/- SEM)。 圖 12A中顯示媒液組的腫瘤生長曲線， 圖 12B中顯示奧比妥珠單抗及 CD20 CD3 TCB 的腫瘤生長曲線，以及 圖 12C中顯示奧比妥珠單抗及 CD20 CD3 TCB 與 PD1-LAG3 BsAb 之組合的腫瘤生長曲線。 
<![CDATA[<110>  瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 (F. Hoffmann-La Roche AG)]]>
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                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Glu Met Ser Ser Leu Met Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，PD1-0103]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Lys Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr 
                          85                  90                  95      
          Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110     
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD1-0103_01 (PD1 0376) 之人源化變異體-重鏈可變域 VH ]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PD1-0103_01 (PD1 0376) 之人源化變異體-輕鏈可變域 VL ]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr 
                          85                  90                  95      
          Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110     
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 HVR-H1，aLAG3(0414)]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Asp Tyr Thr Met Asn 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 HVR-H2，aLAG3(0414)]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Val Ile Ser Trp Asp Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 HVR-H3，aLAG3(0414)]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Gly Leu Thr Asp Thr Thr Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈 HVR-L1，aLAG3(0414)]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈 HVR-L2，aLAG3(0414)]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈 HVR-L3，aLAG3(0414)]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Gln Gln Thr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈可變域 VH，aLAG3(0414)]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asp Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Ile Ser Trp Asp Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Phe Lys Asn Thr Leu Tyr 
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          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Gly Leu Thr Asp Thr Thr Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，aLAG3(0414)]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Ser Pro Leu 
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          <![CDATA[<211>  5]]>
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          <![CDATA[<223>  重鏈 HVR-H1，aLAG3(0416)]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Asp Tyr Ala Met Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 HVR-H2，aLAG3(0416)]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Gly Ile Asp Asn Ser Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  13]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 HVR-H3，aLAG3(0416)]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Thr His Ser Gly Leu Ile Val Asn Asp Ala Phe Asp Ile 
          1               5                   10              
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈 HVR-L1，aLAG3(0416)]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 
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          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈 HVR-L2，aLAG3(0416)]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<400>  24]]>
          Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr 
          1               5                   
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          <![CDATA[<223>  重鏈可變域 VH，aLAG3(0416)]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Ile Asp Asn Ser Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Val Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Lys Thr His Ser Gly Leu Ile Val Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120         
          <![CDATA[<210>  26]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，aLAG3(0416)]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈可變域 VH，BMS-986016]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL BMS-986016]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  29]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈可變域 VH，MDX25F7 (25F7)]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Asn His Asn Gly Asn Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  30]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  30]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  31]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  31]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Leu Thr Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asn Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Asn Asn Ala Glu Ala Met 
                      100                 105                 110         
          Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125 
          <![CDATA[<210>  32]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  32]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Leu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Leu Pro Trp 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  33]]>
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          <![CDATA[<400>  33]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Glu Trp Ala Val Ala Ser Trp Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120         
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  108]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，MDX26H10 (26H10)]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 
                          85                  90                  95      
          Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 
                      100                 105             
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  441]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  基於 PD1(0376) 之 1+1 PD1/LAG3 0927 的重鏈 1]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr 
                          85                  90                  95      
          Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 
                  115                 120                 125             
          Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 
              130                 135                 140                 
          Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 
                          165                 170                 175     
          Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 
                      180                 185                 190         
          Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 
                  195                 200                 205             
          Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 
              210                 215                 220                 
          Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 
                          245                 250                 255     
          Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 
                      260                 265                 270         
          Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 
                  275                 280                 285             
          Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 
              290                 295                 300                 
          Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 
                          325                 330                 335     
          Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp 
                      340                 345                 350         
          Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe 
                  355                 360                 365             
          Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 
              370                 375                 380                 
          Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 
                          405                 410                 415     
          Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 
                      420                 425                 430         
          Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440     
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  227]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  基於 PD1(0376) 之 1+1 PD1/LAG3 0927 的輕鏈 1]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 
              130                 135                 140                 
          Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val 
                          165                 170                 175     
          Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 
                      180                 185                 190         
          Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 
                  195                 200                 205             
          Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg 
              210                 215                 220                 
          Gly Glu Cys 
          225         
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  449]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  基於 aLAG3(0414) 之 1+1 PD1/LAG3 0927 的重鏈 2]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asp Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Ile Ser Trp Asp Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Phe Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Gly Leu Thr Asp Thr Thr Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 
                  195                 200                 205             
          Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 
              210                 215                 220                 
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                          245                 250                 255     
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                      260                 265                 270         
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                  275                 280                 285             
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
              290                 295                 300                 
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                      340                 345                 350         
          Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                  355                 360                 365             
          Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
              370                 375                 380                 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 
                          405                 410                 415     
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                      420                 425                 430         
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro 
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  基於 aLAG3(0414) 之 1+1 PD1/LAG3 0927 的輕鏈 2]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Ser Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<211>  450]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  基於 aLAG3(0416) 之 1+1 PD1/LAG3 0799 的重鏈 2]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Ile Asp Asn Ser Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Val Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Lys Thr His Ser Gly Leu Ile Val Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                  195                 200                 205             
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser 
              210                 215                 220                 
          Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                      260                 265                 270         
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                  275                 280                 285             
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 
              290                 295                 300                 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                      340                 345                 350         
          Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
              370                 375                 380                 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro 
              450 
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  基於 aLAG3(0416) 之 1+1 PD1/LAG3 0799 的輕鏈 2]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3-HCDR1]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          Thr Tyr Ala Met Asn 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3-HCDR2]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Gly 
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3-HCDR3]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3-LCDR1]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3-LCDR2]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3-LCDR3]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  125]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 VH]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 
                      100                 105                 110         
          Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125 
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<211>  109]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 VL]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 
                          85                  90                  95      
          Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD20-HCDR1]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          Tyr Ser Trp Ile Asn 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD20-HCDR2]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD20-HCDR3]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD20-LCDR1]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD20-LCDR2]]>
          <![CDATA[<400>  53]]>
          Gln Met Ser Asn Leu Val Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  54]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD20-LCDR3]]>
          <![CDATA[<400>  54]]>
          Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  55]]>
          <![CDATA[<211>  119]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD20 VH]]>
          <![CDATA[<400>  55]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 
                      20                  25                  30          
          Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210>  56]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD20 VL]]>
          <![CDATA[<400>  56]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 
                          85                  90                  95      
          Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  57]]>
          <![CDATA[<211>  672]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD20 VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc (杵，P329G LALA)CD20 ]]>
                 VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc (杵，P329G LALA)
          <![CDATA[<400>  57]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 
                      20                  25                  30          
          Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 
                  115                 120                 125             
          Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 
              130                 135                 140                 
          Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 
                          165                 170                 175     
          Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 
                  195                 200                 205             
          Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly 
              210                 215                 220                 
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly 
                          245                 250                 255     
          Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln 
                      260                 265                 270         
          Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys 
                  275                 280                 285             
          Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly 
              290                 295                 300                 
          Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly 
                          325                 330                 335     
          Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
                      340                 345                 350         
          Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 
                  355                 360                 365             
          Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
              370                 375                 380                 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                          405                 410                 415     
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
                      420                 425                 430         
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 
                  435                 440                 445             
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 
              450                 455                 460                 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                          485                 490                 495     
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                      500                 505                 510         
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
                  515                 520                 525             
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
              530                 535                 540                 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 
          545                 550                 555                 560 
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                          565                 570                 575     
          Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                      580                 585                 590         
          Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
                  595                 600                 605             
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
              610                 615                 620                 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
          625                 630                 635                 640 
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                          645                 650                 655     
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                      660                 665                 670         
          <![CDATA[<210>  58]]>
          <![CDATA[<211>  447]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD20 VH-CH1(EE)-Fc (臼，P329G LALA)]]>
          <![CDATA[<400>  58]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 
                      20                  25                  30          
          Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 
                  115                 120                 125             
          Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 
              130                 135                 140                 
          Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 
                          165                 170                 175     
          Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 
                  195                 200                 205             
          Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 
              210                 215                 220                 
          Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 
                          245                 250                 255     
          Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 
                      260                 265                 270         
          Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 
                  275                 280                 285             
          Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 
              290                 295                 300                 
          Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys 
                          325                 330                 335     
          Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr 
                      340                 345                 350         
          Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser 
                  355                 360                 365             
          Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 
              370                 375                 380                 
          Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 
                          405                 410                 415     
          Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 
                      420                 425                 430         
          Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445         
          <![CDATA[<210>  59]]>
          <![CDATA[<211>  219]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD20 VL-CL(RK)]]>
          <![CDATA[<400>  59]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 
                          85                  90                  95      
          Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg 
                  115                 120                 125             
          Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 
              130                 135                 140                 
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 
                          165                 170                 175     
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 
                      180                 185                 190         
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 
                  195                 200                 205             
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215                 
          <![CDATA[<210>  60]]>
          <![CDATA[<211>  232]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 VH-CL]]>
          <![CDATA[<400>  60]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 
                      100                 105                 110         
          Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 
              130                 135                 140                 
          Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 
                          165                 170                 175     
          Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 
                      180                 185                 190         
          Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 
                  195                 200                 205             
          Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 
              210                 215                 220                 
          Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
          225                 230         
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  61]]>
          Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro 
          1               5                   10                  15      
          Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg 
                      20                  25                  30          
          Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu 
                  35                  40                  45              
          Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile 
              50                  55                  60                  
          Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile 
                          85                  90                  95      
          Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile 
                  115                 120                 125             
          Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser 
              130                 135                 140                 
          His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn 
                          165                 170                 175     
          Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly 
                      180                 185                 190         
          Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile 
                  195                 200                 205             
          Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys 
              210                 215                 220                 
          Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro 
                          245                 250                 255     
          Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu 
                      260                 265                 270         
          Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser 
                  275                 280                 285             
          Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro 
              290                 295         
          <![CDATA[<210>  62]]>
          <![CDATA[<211>  447]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  奧比妥珠單抗重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  62]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 
                      20                  25                  30          
          Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 
                  115                 120                 125             
          Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 
              130                 135                 140                 
          Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 
                          165                 170                 175     
          Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 
                  195                 200                 205             
          Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 
              210                 215                 220                 
          Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 
                          245                 250                 255     
          Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 
                      260                 265                 270         
          Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 
                  275                 280                 285             
          Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 
              290                 295                 300                 
          Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 
                          325                 330                 335     
          Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 
                      340                 345                 350         
          Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 
                  355                 360                 365             
          Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 
              370                 375                 380                 
          Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 
                          405                 410                 415     
          Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 
                      420                 425                 430         
          Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445         
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  63]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 
                          85                  90                  95      
          Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 
              130                 135                 140                 
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 
                          165                 170                 175     
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 
                      180                 185                 190         
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 
                  195                 200                 205             
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215                 
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  鼠抗 CD20 B-Ly1 VH]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Leu 
                      20                  25                  30          
          Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp 
                  35                  40                  45              
          Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 
              50                  55                  60                  
          Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly 
                          85                  90                  95      
          Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  65]]>
          <![CDATA[<211>  102]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  鼠抗 CD20 B-Ly1 VL]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          Asn Pro Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 
          1               5                   10                  15      
          Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu 
                      20                  25                  30          
          Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn 
                  35                  40                  45              
          Leu Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr 
              50                  55                  60                  
          Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 
                          85                  90                  95      
          Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100         
          <![CDATA[<210>  66]]>
          <![CDATA[<211>  207]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr 
                      20                  25                  30          
          Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 
                  35                  40                  45              
          Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys 
              50                  55                  60                  
          Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp 
          65                  70                  75                  80  
          His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu 
                      100                 105                 110         
          Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu 
              130                 135                 140                 
          Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn 
                          165                 170                 175     
          Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg 
                      180                 185                 190         
          Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile 
                  195                 200                 205         
          <![CDATA[<210>  67]]>
          <![CDATA[<211>  198]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  食蟹獼猴]]>
          <![CDATA[<400>  67]]>
          Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr 
                      20                  25                  30          
          Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 
                  35                  40                  45              
          Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys 
              50                  55                  60                  
          Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn 
                      100                 105                 110         
          Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp 
                  115                 120                 125             
          Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys 
              130                 135                 140                 
          Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly 
                      180                 185                 190         
          Leu Asn Gln Arg Arg Ile 
                  195             
          <![CDATA[<210>  68]]>
          <![CDATA[<211>  288]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  68]]>
          Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 
          1               5                   10                  15      
          Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 
                      20                  25                  30          
          Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 
                  35                  40                  45              
          Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 
              50                  55                  60                  
          Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 
                          85                  90                  95      
          Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 
                      100                 105                 110         
          Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 
                  115                 120                 125             
          Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly 
                          165                 170                 175     
          Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys 
                      180                 185                 190         
          Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 
                  195                 200                 205             
          Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 
              210                 215                 220                 
          Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly 
                          245                 250                 255     
          Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 
                      260                 265                 270         
          Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 
                  275                 280                 285             
          <![CDATA[<210>  69]]>
          <![CDATA[<211>  497]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp 
              50                  55                  60                  
          Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu 
                          85                  90                  95      
          Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg 
                      100                 105                 110         
          Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg 
                  115                 120                 125             
          Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg 
                          165                 170                 175     
          Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His 
                      180                 185                 190         
          Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser 
                  195                 200                 205             
          Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser 
              210                 215                 220                 
          Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu 
                          245                 250                 255     
          Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro 
                      260                 265                 270         
          Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe 
                  275                 280                 285             
          Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr 
              290                 295                 300                 
          Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu 
                          325                 330                 335     
          Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe 
                      340                 345                 350         
          Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro 
                  355                 360                 365             
          Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys 
              370                 375                 380                 
          Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr 
          385                 390                 395                 400 
          Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala 
                          405                 410                 415     
          Leu Pro Ala Gly His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser 
                      420                 425                 430         
          Leu Leu Leu Leu Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg 
                  435                 440                 445             
          Gln Trp Arg Pro Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro 
              450                 455                 460                 
          Pro Gln Ala Gln Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro 
          465                 470                 475                 480 
          Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln 
                          485                 490                 495     
          Leu 
          <![CDATA[<210>  70]]>
          <![CDATA[<211>  422]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  70]]>
          Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp 
              50                  55                  60                  
          Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu 
                          85                  90                  95      
          Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg 
                      100                 105                 110         
          Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg 
                  115                 120                 125             
          Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg 
                          165                 170                 175     
          Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His 
                      180                 185                 190         
          Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser 
                  195                 200                 205             
          Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser 
              210                 215                 220                 
          Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu 
                          245                 250                 255     
          Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro 
                      260                 265                 270         
          Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe 
                  275                 280                 285             
          Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr 
              290                 295                 300                 
          Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu 
                          325                 330                 335     
          Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe 
                      340                 345                 350         
          Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro 
                  355                 360                 365             
          Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys 
              370                 375                 380                 
          Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr 
          385                 390                 395                 400 
          Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala 
                          405                 410                 415     
          Leu Pro Ala Gly His Leu 
                      420         
          <![CDATA[<210>  71]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子 G4S]]>
          <![CDATA[<400>  71]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  72]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子 (G4S)2]]>
          <![CDATA[<400>  72]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  73]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子 (G4S)3]]>
          <![CDATA[<400>  73]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  74]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子 (G4S)4]]>
          <![CDATA[<400>  74]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser 
                      20  
          <![CDATA[<210>  75]]>
          <![CDATA[<211>  446]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  帕博利珠單抗重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  75]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 
              210                 215                 220                 
          Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 
                          245                 250                 255     
          Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 
                      260                 265                 270         
          Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 
                  275                 280                 285             
          Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 
              290                 295                 300                 
          Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 
                          325                 330                 335     
          Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 
                      340                 345                 350         
          Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 
                  355                 360                 365             
          Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 
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          Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 
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                      420                 425                 430         
          His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 
                  435                 440                 445     
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          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
          Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 
                          85                  90                  95      
          Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 
                      100                 105                 110         
          Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 
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          Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 
                          165                 170                 175     
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          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
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                          85                  90                  95      
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                          325                 330                 335     
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                      340                 345                 350         
          Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 
                  355                 360                 365             
          Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 
              370                 375                 380                 
          Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 
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                      420                 425                 430         
          Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 
                  435                 
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          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
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          Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
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          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
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          Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr 
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          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 
                  115                 120                 125             
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              130                 135                 140                 
          Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 
                          165                 170                 175     
          Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 
                  195                 200                 205             
          Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 
              210                 215                 220                 
          Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 
                          245                 250                 255     
          Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 
                      260                 265                 270         
          Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 
                  275                 280                 285             
          Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 
              290                 295                 300                 
          Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys 
                          325                 330                 335     
          Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 
                      340                 345                 350         
          Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 
                  355                 360                 365             
          Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 
              370                 375                 380                 
          Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 
                          405                 410                 415     
          Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 
                      420                 425                 430         
          Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445         
          <![CDATA[<210>  80]]>
          <![CDATA[<211>  218]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗 Lag3 輕鏈]]>
          <![CDATA[<400>  80]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Leu Asp Tyr Glu 
                      20                  25                  30          
          Gly Asp Ser Asp Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 
                  35                  40                  45              
          Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 
                      100                 105                 110         
          Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 
                  115                 120                 125             
          Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 
              130                 135                 140                 
          Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 
                          165                 170                 175     
          Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 
                      180                 185                 190         
          His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 
                  195                 200                 205             
          Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215             
          <![CDATA[<210>  81]]>
          <![CDATA[<211>  119]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗 Lag3 重鏈可變域 VH]]>
          <![CDATA[<400>  81]]>
          Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asp Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210>  82]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  抗 Lag3 輕鏈可變域 VL]]>
          <![CDATA[<400>  82]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Leu Asp Tyr Glu 
                      20                  25                  30          
          Gly Asp Ser Asp Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 
                  35                  40                  45              
          Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110     
          <![CDATA[<210>  83]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (40G5c)-HCDR1]]>
          <![CDATA[<400>  83]]>
          Asn Tyr Tyr Ile His 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  84]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (40G5c)-HCDR2]]>
          <![CDATA[<400>  84]]>
          Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  85]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (40G5c)-HCDR3]]>
          <![CDATA[<400>  85]]>
          Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  86]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (40G5c)-LCDR1]]>
          <![CDATA[<400>  86]]>
          Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ala 
          <![CDATA[<210>  87]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (40G5c)-LCDR2]]>
          <![CDATA[<400>  87]]>
          Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  88]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (40G5c)-LCDR3]]>
          <![CDATA[<400>  88]]>
          Thr Gln Ser Phe Ile Leu Arg Thr 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  89]]>
          <![CDATA[<211>  119]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (40G5c) VH]]>
          <![CDATA[<400>  89]]>
          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210>  90]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (40G5c) VL]]>
          <![CDATA[<400>  90]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln 
                          85                  90                  95      
          Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  91]]>
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          <![CDATA[<400>  91]]>
          Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  92]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  92]]>
          Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  93]]>
          <![CDATA[<211>  13]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<400>  93]]>
          Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 
          1               5                   10              
          <![CDATA[<210>  94]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD20 (2H7.v16)-LCDR1]]>
          <![CDATA[<400>  94]]>
          Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 
          1               5                   10  
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          <![CDATA[<400>  95]]>
          Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  96]]>
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          <![CDATA[<400>  96]]>
          Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  97]]>
          <![CDATA[<211>  122]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD20 (2H7.v16) VH]]>
          <![CDATA[<400>  97]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120         
          <![CDATA[<210>  98]]>
          <![CDATA[<211>  106]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD20 (2H7.v16) VL]]>
          <![CDATA[<400>  98]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 
                      20                  25                  30          
          His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105     
          <![CDATA[<210>  99]]>
          <![CDATA[<211>  219]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (40G5c) 輕鏈]]>
          <![CDATA[<400>  99]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln 
                          85                  90                  95      
          Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 
                  115                 120                 125             
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 
              130                 135                 140                 
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 
                          165                 170                 175     
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 
                      180                 185                 190         
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 
                  195                 200                 205             
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215                 
          <![CDATA[<210>  100]]>
          <![CDATA[<211>  447]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (40G5c) 重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  100]]>
          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 
                  115                 120                 125             
          Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 
              130                 135                 140                 
          Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 
                          165                 170                 175     
          Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 
                  195                 200                 205             
          Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 
              210                 215                 220                 
          Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 
                          245                 250                 255     
          Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 
                      260                 265                 270         
          Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 
                  275                 280                 285             
          Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val 
              290                 295                 300                 
          Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 
                          325                 330                 335     
          Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 
                      340                 345                 350         
          Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser 
                  355                 360                 365             
          Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 
              370                 375                 380                 
          Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 
                          405                 410                 415     
          Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 
                      420                 425                 430         
          Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445         
          <![CDATA[<210>  101]]>
          <![CDATA[<211>  213]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD20 (2H7.v16) 輕鏈]]>
          <![CDATA[<400>  101]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 
                      20                  25                  30          
          His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 
              130                 135                 140                 
          Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 
                          165                 170                 175     
          Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 
                      180                 185                 190         
          Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 
                  195                 200                 205             
          Asn Arg Gly Glu Cys 
              210             
          <![CDATA[<210>  102]]>
          <![CDATA[<211>  450]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD20 (2H7.v16) 重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  102]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                  195                 200                 205             
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 
              210                 215                 220                 
          Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                      260                 265                 270         
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                  275                 280                 285             
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr 
              290                 295                 300                 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                      340                 345                 350         
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
              370                 375                 380                 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro 
              450 
          <![CDATA[<210>  103]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  103]]>
          Lys Ile Glu Glu Leu Glu 
          1               5
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
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Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065
Figure 12_A0101_SEQ_0066
Figure 12_A0101_SEQ_0067
Figure 12_A0101_SEQ_0068
Figure 12_A0101_SEQ_0069
Figure 12_A0101_SEQ_0070
Figure 12_A0101_SEQ_0071
Figure 12_A0101_SEQ_0072
Figure 12_A0101_SEQ_0073
Figure 12_A0101_SEQ_0074
Figure 12_A0101_SEQ_0075
Figure 12_A0101_SEQ_0076
Figure 12_A0101_SEQ_0077
Figure 12_A0101_SEQ_0078
Figure 12_A0101_SEQ_0079
Figure 12_A0101_SEQ_0080
Figure 12_A0101_SEQ_0081
Figure 12_A0101_SEQ_0082
Figure 12_A0101_SEQ_0083
Figure 12_A0101_SEQ_0084
Figure 12_A0101_SEQ_0085
Figure 12_A0101_SEQ_0086
Figure 12_A0101_SEQ_0087
Figure 12_A0101_SEQ_0088
Figure 12_A0101_SEQ_0089
Figure 12_A0101_SEQ_0090

Claims (20)

  1. 一種抗CD20/抗CD3雙特異性抗體的用途，其用於製備治療表現CD20之癌症的藥物，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體係與抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體組合使用，其中該抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體包含特異性地結合至計畫性細胞死亡蛋白1(PD1)的第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：VH域，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及特異性地結合至淋巴球活化基因-3(LAG3)的第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：VH域，其包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，且其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區(VHCD3)，其包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VLCD3)，其包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列；及第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：重鏈可變區(VHCD20)，其包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區(VLCD20)，其包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體與該抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體係以單一組成物一起投予，或以兩種或更多種不同的組成物分開地投予。
  3. 如請求項1或2之用途，其中該抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體包含Fc域，該Fc域為IgG1 Fc域或IgG4 Fc域，且其中該Fc域包含減弱與Fc受體之結合的一個或多個胺基酸取代。
  4. 如請求項1或2之用途，其中該抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體包含特異性地結合至PD1的Fab片段及特異性地結合至LAG3的Fab片段。
  5. 如請求項1或2之用途，其中該抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體包含：包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的第一重鏈，包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的第一輕鏈，包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的第二重鏈，及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的第二輕鏈。
  6. 如請求項1或2之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含SEQ ID NO：57之多肽序列、SEQ ID NO：58之多肽序列、SEQ ID NO：59之多肽序列及SEQ ID NO：60之多肽序列。
  7. 如請求項1或2之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體為格菲妥單抗(glofitamab)。
  8. 如請求項1或2之用途，其中在組合治療之前進行使用第II型抗CD20抗體之預治療，其中在該預治療與該組合治療之間的時間段足以在個體中減少對該第II型抗CD20抗體反應的B細胞。
  9. 如請求項8之用途，其中該第II型抗CD20抗體為奧比妥珠單抗(obinutuzumab)。
  10. 一種用於治療表現CD20之癌症之包含抗PD1/抗LAG3雙特異性抗 體之組成物，其中該治療包含：組合投予該包含抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體之組成物及包含抗CD20/抗CD3雙特異性抗體之組成物，其中該抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體包含特異性地結合至計畫性細胞死亡蛋白1(PD1)的第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：VH域，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及特異性地結合至淋巴球活化基因-3(LAG3)的第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：VH域，其包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，且其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區(VHCD3)，其包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VLCD3)，其包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列；及第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：重鏈可變區(VHCD20)，其包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區(VLCD20)，其包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列。
  11. 如請求項10之組成物，其中該抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體包含：包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的第一重鏈，包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的第一輕鏈，包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的第二重鏈，及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的第二輕鏈。
  12. 如請求項10或11之組成物，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體為格菲妥單抗(glofitamab)。
  13. 一種包含抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體之組合的醫藥組成物用於製備藥物之用途，該藥物用於組合、依序 或同時治療表現CD20之癌症，其中該抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體包含特異性地結合至計畫性細胞死亡蛋白1(PD1)的第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：VH域，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及特異性地結合至淋巴球活化基因-3(LAG3)的第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：VH域，其包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，且其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區(VHCD3)，其包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VLCD3)，其包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列；及第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：重鏈可變區(VHCD20)，其包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區(VLCD20)，其包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列。
  14. 如請求項13之用途，其中該藥物用於治療選自由以下所組成之群組之血液癌症：非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫型大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、被套細胞淋巴瘤(MCL)、緣帶淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及何杰金氏淋巴瘤(HL)。
  15. 一種抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體之組合的用途，其用於製備治療表現CD20之癌症的藥物，其中該抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體包含特異性地結合至計畫性細胞死亡蛋白1(PD1)的第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：VH域，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及特異性 地結合至淋巴球活化基因-3(LAG3)的第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：VH域，其包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列；及VL域，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，且其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區(VHCD3)，其包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列；及輕鏈可變區(VLCD3)，其包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列；及第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：重鏈可變區(VHCD20)，其包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區(VLCD20)，其包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列。
  16. 如請求項15之用途，其中該抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體包含：包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的第一重鏈，包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的第一輕鏈，包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的第二重鏈，及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的第二輕鏈。
  17. 如請求項15或16之用途，該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體為格菲妥單抗。
  18. 如請求項15或16之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體與該抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體係以單一組成物一起投予，或以兩種或更多種不同的組成物分開地投予。
  19. 如請求項15或16之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體及該抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體係經靜脈內或經皮下投予。
  20. 如請求項15或16之用途，其中該抗CD20/抗CD3雙特異性抗體係在投予該抗PD1/抗LAG3雙特異性抗體之同時、之前或之後投予。
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