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TWI805665B - 結合hla-a2/wt1之抗體 - Google Patents

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TWI805665B
TWI805665B TW107146108A TW107146108A TWI805665B TW I805665 B TWI805665 B TW I805665B TW 107146108 A TW107146108 A TW 107146108A TW 107146108 A TW107146108 A TW 107146108A TW I805665 B TWI805665 B TW I805665B
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帕伯羅 優瑪那
莉迪亞 潔斯敏 漢尼斯克
亞歷山大 布喬茲克
偉 徐
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Abstract

本發明大體上係關於結合於HLA-A2/WT1之抗體，包括例如用於使T細胞活化之雙特異性抗原結合分子。另外，本發明係關於編碼此類抗體之聚核苷酸，及包含此類聚核苷酸之載體及宿主細胞。本發明進一步係關於用於產生抗體之方法，及使用該等抗體治療疾病之方法。

Description

結合HLA-A2/WT1之抗體
本發明大體上係關於結合於HLA-A2/WT1之抗體，包括例如用於使T細胞活化之雙特異性抗原結合分子。另外，本發明係關於編碼此類抗體之聚核苷酸，及包含此類聚核苷酸之載體及宿主細胞。本發明進一步係關於用於產生抗體之方法，及使用該等抗體治療疾病之方法。
WT1(威爾姆斯腫瘤1(Wilms tumor 1)，威爾姆斯腫瘤蛋白質)為涉及細胞增殖、分化以及細胞凋亡及器官發育之致癌性轉錄因子，其在正常成人組織中之表現極少(Hinrichs及Restifo,Nat Biotechnol(2013)31,999-1008)。然而，據報導，WT1在若干類型之血液惡性病及廣泛範圍之實體腫瘤中過度表現(Van Driessche等人，Oncologist(2012)17,250-259)。WT1為定位於細胞內之核蛋白質。細胞內蛋白質可在蛋白酶體中降解，在細胞表面上由主要組織相容性複合體(MHC)I處理及以T細胞抗原決定基形式呈遞，且由T細胞受體(TCR)識別。因此，諸如WT1RMF(RMFPNAPYL)及WT1VLD(VLDFAPPGA)之WT1源性肽在HLA-A2的情形下在細胞表面上進行呈遞且可觸發T細胞識別。
已採取若干方法來利用WT1作為癌症(免疫)療法之標靶，包括基於WT1源性肽及授受性T細胞轉移或WT1特異性T細胞來研發癌症疫 苗。亦已產生針對HLA-A2/WT1RMF複合物之TCR樣抗體，包括其雙特異性衍生物(Dao等人，Sci Transl Med(2013)5,176ra33；WO2012/135854；Dao等人，Nat Biotechnol(2015)33,1079-1086；WO 2015/070061；WO 2017/060201)。
結合於靶細胞上之表面抗原及活化性T細胞抗原(諸如T細胞上之CD3)的雙特異性抗體(在本文中亦稱為T細胞雙特異性抗體或「TCB」)擁有用於治療各種癌症之巨大前景。此類抗體與其兩個標靶之同時結合將在靶細胞與T細胞之間強制實現暫時相互作用，引起T細胞受體之交聯及任何細胞毒性T細胞之後續活化及靶細胞之後續溶解。鑒於其在靶細胞殺滅中之效力，對於T細胞雙特異性抗體避免命中及脫靶毒性而言，對標靶及靶向抗體之特異性的選擇最重要。諸如WT1之細胞內蛋白質代表有吸引力之標靶，但僅由T細胞受體(TCR)樣抗體可達，該等抗體結合呈遞來源於細胞表面上細胞內蛋白質之肽抗原的主要組織相容性複合體(MHC)。TCR樣抗體之固有問題為與本身MHC分子或與呈遞除所要肽以外之肽的MHC分子的潛在交叉反應性，其可能損害器官或組織選擇性。
本發明提供新穎抗體，包括雙特異性抗體，其結合HLA-A2/WT1且具有用於治療目的之尤其有利特性。
本發明人已研發出具有出人意料之改良特性的新穎抗體，其結合於HLA-A2/WT1。詳言之，抗體以良好親和力及出色特異性結合HLA-A2/WT1。此外，本發明人已研發出並有該新穎HLA-A2/WT1抗體的結合於HLA-A2/WT1及活化性T細胞抗原之雙特異性抗原結合分子，且將良好功效及可製造性與低毒性及有利藥物動力學特性相組合。
在一個第一態樣中，本發明提供一種結合於HLA-A2/WT1之抗體，其中該抗體包含(i)包含SEQ ID NO：1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：2之HCDR 2及SEQ ID NO：3之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：5之LCDR 2及SEQ ID NO：6之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)；(ii)包含SEQ ID NO：9之HCDR 1、SEQ ID NO：10之HCDR 2及SEQ ID NO：11之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：12之LCDR 1、SEQ ID NO：13之LCDR 2及SEQ ID NO：14之LCDR 3的VL；(iii)包含SEQ ID NO：17之HCDR 1、SEQ ID NO：18之HCDR 2及SEQ ID NO：19之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：20之LCDR 1、SEQ ID NO：21之LCDR 2及SEQ ID NO：22之LCDR 3的VL；(iv)包含SEQ ID NO：25之HCDR 1、SEQ ID NO：26之HCDR 2及SEQ ID NO：27之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：28之LCDR 1、SEQ ID NO：29之LCDR 2及SEQ ID NO：30之LCDR 3的VL；(v)包含SEQ ID NO：33之HCDR 1、SEQ ID NO：34之HCDR 2及SEQ ID NO：35之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：36之LCDR 1、SEQ ID NO：37之LCDR 2及SEQ ID NO：38之LCDR 3的VL；(vi)包含SEQ ID NO：41之HCDR 1、SEQ ID NO：42之HCDR 2及SEQ ID NO：43之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：44之LCDR 1、SEQ ID NO：45之LCDR 2及SEQ ID NO：46之LCDR 3的VL；(vii)包含SEQ ID NO：49之HCDR 1、SEQ ID NO：50之HCDR 2及SEQ ID NO：51之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：52之LCDR 1、SEQ ID NO：53之LCDR 2及SEQ ID NO：54之LCDR 3的VL；(viii)包含SEQ ID NO：57之HCDR 1、SEQ ID NO：58之HCDR 2及SEQ ID NO：59之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：60之LCDR 1、SEQ ID NO：61之LCDR 2及SEQ ID NO：62之LCDR 3的VL；或(ix)包含SEQ ID NO：65之HCDR 1、SEQ ID NO：66之HCDR 2及SEQ ID NO：67之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：68之LCDR 1、SEQ ID NO：69之LCDR 2及SEQ ID NO：70之LCDR 3的VL。
在一個實施例中，抗體包含(i)包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(ii)包含與SEQ ID NO：15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(iii)包含與SEQ ID NO：23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(iv)包含與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (v)包含與SEQ ID NO：39之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：40之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(vi)包含與SEQ ID NO：47之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：48之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(vii)包含與SEQ ID NO：55之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：56之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(viii)包含與SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；或(ix)包含與SEQ ID NO：71之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：72之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在一個實施例中，抗體為IgG抗體，特定言之，IgG1抗體。在一個實施例中，抗體為全長抗體。在另一個實施例中，抗體為選自Fv分子、scFv分子、Fab分子及F(ab')2分子之群的抗體片段。在一個實施例中， 抗體為多特異性抗體。
本發明亦提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含(a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，且該第一抗原結合部分包含(i)包含SEQ ID NO：1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：2之HCDR 2及SEQ ID NO：3之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：5之LCDR 2及SEQ ID NO：6之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)；(ii)包含SEQ ID NO：9之HCDR 1、SEQ ID NO：10之HCDR 2及SEQ ID NO：11之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：12之LCDR 1、SEQ ID NO：13之LCDR 2及SEQ ID NO：14之LCDR 3的VL；(iii)包含SEQ ID NO：17之HCDR 1、SEQ ID NO：18之HCDR 2及SEQ ID NO：19之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：20之LCDR 1、SEQ ID NO：21之LCDR 2及SEQ ID NO：22之LCDR 3的VL；(iv)包含SEQ ID NO：25之HCDR 1、SEQ ID NO：26之HCDR 2及SEQ ID NO：27之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：28之LCDR 1、SEQ ID NO：29之LCDR 2及SEQ ID NO：30之LCDR 3的VL；(v)包含SEQ ID NO：33之HCDR 1、SEQ ID NO：34之HCDR 2及SEQ ID NO：35之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：36之LCDR 1、SEQ ID NO：37之LCDR 2及SEQ ID NO：38之LCDR 3的VL；(vi)包含SEQ ID NO：41之HCDR 1、SEQ ID NO：42之HCDR 2及SEQ ID NO：43之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：44之LCDR 1、SEQ ID NO：45之LCDR 2及SEQ ID NO：46之LCDR 3的VL； (vii)包含SEQ ID NO：49之HCDR 1、SEQ ID NO：50之HCDR 2及SEQ ID NO：51之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：52之LCDR 1、SEQ ID NO：53之LCDR 2及SEQ ID NO：54之LCDR 3的VL；(viii)包含SEQ ID NO：57之HCDR 1、SEQ ID NO：58之HCDR 2及SEQ ID NO：59之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：60之LCDR 1、SEQ ID NO：61之LCDR 2及SEQ ID NO：62之LCDR 3的VL；或(ix)包含SEQ ID NO：65之HCDR 1、SEQ ID NO：66之HCDR 2及SEQ ID NO：67之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：68之LCDR 1、SEQ ID NO：69之LCDR 2及SEQ ID NO：70之LCDR 3的VL；及(b)特異性結合於第二抗原之第二抗原結合部分。
在一個實施例中，第一抗原結合部分包含(i)包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(ii)包含與SEQ ID NO：15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(iii)包含與SEQ ID NO：23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(iv)包含與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、 98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(v)包含與SEQ ID NO：39之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：40之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(vi)包含與SEQ ID NO：47之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：48之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(vii)包含與SEQ ID NO：55之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：56之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(viii)包含與SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；或(ix)包含與SEQ ID NO：71之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：72之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在一個實施例中，第二抗原為CD3，特定言之，CD3ε。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：115之HCDR 1、SEQ ID NO：116之HCDR 2及SEQ ID NO：117之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：118之LCDR 1、SEQ ID NO：119之LCDR 2及SEQ ID NO：120之LCDR 3的VL。在一個實施例中，第二抗原結合部分之VH包含與SEQ ID NO：121之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，且第二抗原結合部分之VL包含與SEQ ID NO：122之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一個實施例中，第一及/或第二抗原結合部分為Fab分子。在一個實施例中，第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1(特定言之，可變域VL及VH)進行相互置換的Fab分子。在一個實施例中，第一抗原結合部分為以下Fab分子，其中在恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。在一個實施例中，第一及第二抗原結合部分彼此融合，視情況經由肽連接子而融合。在一個實施例中，第一及第二抗原結合部分各自為Fab分子，且(i)第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，或(ii)第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子包含第三抗原結合部分。在一個實施例中，第三抗原部分與第一抗原結合部分完 全相同。在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子包含由第一及第二次單元(subunit)構成之Fc域。在一個實施例中，第一、第二及(當存在時)第三抗原結合部分各自為Fab分子；且(i)第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與Fc域之第一次單元的N端融合，或(ii)第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與Fc域之第一次單元的N端融合；且第三抗原結合部分(當存在時)在Fab重鏈之C端與Fc域之第二次單元的N端融合。在一個實施例中，Fc域為IgG Fc域，特定言之，IgG1 Fc域。在一個實施例中，Fc域為人類Fc域。在一個實施例中，Fc域之第一次單元之CH3域中的胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，藉此在該第一次單元之該CH3域內產生隆凸，該隆凸可定位於第二次單元之CH3域內的凹穴中，且Fc域之第二次單元之CH3域中的胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，藉此在該第二次單元之該CH3域內產生凹穴，該第一次單元之該CH3域內的隆凸可定位於該凹穴內。在一個實施例中，Fc域包含使與Fc受體之結合減弱及/或效應功能減低的一或多個胺基酸取代。
根據本發明之另一態樣，提供一或多種編碼本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子的經分離之聚核苷酸。本發明進一步提供一或多種包含本發明經分離之聚核苷酸的表現載體，及一種包含本發明經分離之聚核苷酸或表現載體的宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞為真核生物細胞，特定言之，哺乳動物細胞。
在另一態樣中，提供一種產生結合於HLA-A2/WT1之抗體的方法，該方法包含以下步驟：a)在適合於表現抗體之條件下培養本發明 之宿主細胞及b)回收該抗體。本發明亦涵蓋藉由本發明之方法產生的結合於HLA-A2/WT1之抗體。
本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子及醫藥學上可接受之載劑。
本發明亦涵蓋使用本發明之抗體、雙特異性抗原結合分子及醫藥組合物的方法。在一個態樣中，本發明提供根據本發明之抗體、雙特異性抗原結合分子或醫藥組合物，其用作藥劑。在一個態樣中，提供根據本發明之抗體、雙特異性抗原結合分子或醫藥組合物，其用於治療疾病。在一個具體實施例中，疾病為癌症。
亦提供根據本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子的用途，其用於製造用於治療疾病之藥劑；以及一種在個體中治療疾病之方法，其包含向該個體投與治療有效量的呈醫藥學上可接受之形式的包含根據本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子的組合物。在一個具體實施例中，疾病為癌症。在任一上文實施例中，個體較佳為哺乳動物，特定言之，人類。
圖1. 本發明之雙特異性抗原結合分子的例示性組態。(A，D)「1+1互換單抗(CrossMab)」分子的圖解說明。(B，E)具有替代性互換Fab與Fab組分次序之「2+1 IgG互換Fab」分子的圖解說明(「反向」)。(C，F)「2+1IgG互換Fab」分子的圖解說明。(G，K)具有替代性互換Fab與Fab組分次序之「1+1 IgG互換Fab」分子的圖解說明(「反向」)。(H，L)「1+1 IgG互換Fab」分子的圖解說明。(I，M)具有兩個互換Fab之「2+1 IgG互換Fab」分子的圖解說明。(J，N)具有兩個互換Fab及替代性互換Fab與Fab組分次 序之「2+1 IgG互換Fab」分子的圖解說明(「反向」)。(O，S)「Fab-互換Fab」分子的圖解說明。(P，T)「互換Fab-Fab」分子的圖解說明。(Q，U)「(Fab)2-互換Fab」分子的圖解說明。(R，V)「互換Fab-(Fab)2」分子的圖解說明。(W，Y)「Fab-(互換Fab)2」分子的圖解說明。(X，Z)「(互換Fab)2-Fab」分子的圖解說明。黑點：Fc域中視情況存在的促進雜二聚化之修飾。++、--：視情況引入CH1及CL域中的帶有相反電荷之胺基酸。互換Fab分子描繪為包含VH及VL區之交換，但在CH1及CL域中未引入電荷修飾的實施例中，可替代地包含CH1及CL域之交換。
圖2. 在實例中製備之T細胞雙特異性(TCB)抗體分子的圖解說明。所測試之所有TCB抗體分子均以具有電荷修飾之「反向2+1 IgG互換Fab」的形式產生(在CD3結合子中進行VH/VL交換，在WT1結合子中進行電荷修飾，EE=147E，213E；RK=123R，124K)。
圖3. HLA-A2/WT1 IgG抗體與經肽脈衝衝擊之T2細胞的結合。(A)1ID06 IgG，(B)33H09-IgG，(C)11B09-IgG，(D)13B04-IgG，(E)5E11-IgG，(F)5C01-IgG，(G)11G06-IgG。
圖4. 在結合於經肽脈衝衝擊之T2細胞後，HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(TCB)對T細胞之活化(NFAT報導體分析)。(A)11D06-TCB，(B)33H09-TCB，(C)11B09-TCB，(D)13B04-TCB，(E)ESK1-TCB，(F)5E11-TCB。(G)5C01-TCB，(H)DP47GS-TCB。
圖5. 由HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(TCB)介導的對經肽脈衝衝擊之T2細胞的殺滅。(A)11D06-TCB，(B)33H09-TCB，(C)13B04-TCB，(D)11B09-TCB，(E)33F05-TCB，(F)5C01-TCB。
圖6. 由HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(TCB)介導的對 HLA-A2+WT1+腫瘤細胞株之殺滅(A)細胞株之概覽。(B-E)(B)11D06-TCB，(C)33H09-TCB，(D)11B09-TCB，(E)13B04-TCB對細胞株之殺滅。(F)不同TCB對SKM-1細胞之殺滅。(G)不同TCB對BJAB細胞之殺滅。
圖7. 在結合於HLA-A2+WT1+腫瘤細胞株後，HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(TCB)對T細胞之活化。(A)SKM-1 cells，(B)BJAB cells。
圖8. 所選HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(TCB)不結合於脫靶肽。(A-C)(A)11D06-TCB，(B)33H09-TCB，(C)ESK1-TCB與經肽脈衝衝擊之T2細胞的結合。(D-E)(D)11D06-TCB及(E)33H09-TCB在結合於經肽脈衝之T2細胞後對T細胞之活化。(F)肽之概覽。
圖9. 所選HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(TCB)不結合於額外脫靶肽。(A-B)(A)11D06-TCB及(B)33H09-TCB在結合於經肽脈衝之T2細胞後對T細胞之活化。測試所指示之6種脫靶肽以及RMF肽。(C-G)(C，E)11D06-TCB，(D，F)33H09-TCB及(G)ESK1-TCB對經肽脈衝之T2細胞的殺滅。測試所指示之19種脫靶肽以及RMF及VLD肽。
圖10. 由所選HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(TCB)介導而不殺滅正常骨髓源性CD34+幹細胞。(A)11D06-TCB，(B)33H09-TCB。
圖11. 藉由對RMF肽中之結合殘基進行丙胺酸掃描來鑑別所選HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(TCB)。(A)RMF原生肽，(B)RMF R1Y肽，(C)RMF R1A肽，(D)RMF M2A肽，(E)RMF F3A肽，(F)RMF P4A肽，(G)RMF N5A肽，(H)RMF A6G肽，(I)RMF P7A肽，(J)RMF Y8A肽，(K)RMF L9A肽。(L)肽之概覽。(M)EC50相對於RMF原生肽之EC50的變化倍數。(N)關鍵性接觸殘基。
圖12. 在於NSG小鼠中單次注射之後，HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(11D06-TCB及33H09-TCB)之藥物動力學概況。
圖13. 用HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(「TCB」)在人類化小鼠中之SKM-1異種移植物中進行的功效研究。(A)研究設計。(B)處理組。(C)在所有處理組中之腫瘤生長動力學(平均值)。(D)在媒劑組中之單個腫瘤生長動力學。(E)在11D06-TCB組中之單個腫瘤生長動力學。(F)在33H09-TCB組中之單個腫瘤生長動力學。(G)統計。基於第38天進行計算(媒劑作為對照組)。腫瘤生長抑制(TGI)：TGI>100→腫瘤消退，TGI=100→腫瘤停滯。處理與對照物之比率(TCR)：TCR=1→無作用，TCR=0→完全消退。
圖14. HLA-A2/WT1抗體-pMHC複合物之晶體結構的概覽。抗體(Fab片段)展示於頂部，其中重鏈為深灰色而輕鏈為淺灰色。未展示結晶溶劑原子。(A)5C01 Fab與HLA-A02/VLD pMHC複合之1.98Å解析度晶體結構。Fab-pMHC接觸面積：
Figure 107146108-A0305-02-0015-1
476Å2，肽貢獻：
Figure 107146108-A0305-02-0015-2
68Å2。(B)11D06 Fab與HLA-A02/RMF pMHC複合之2.60Å解析度晶體結構。Fab-pMHC接觸面積：
Figure 107146108-A0305-02-0015-3
397Å2，肽貢獻：
Figure 107146108-A0305-02-0015-4
107Å2。(C)ESK1 Fab與HLA-A02/RMF pMHC複合之3.05Å解析度晶體結構(已公佈，PDB ID 4WUU)。Fab-pMHC接觸面積：
Figure 107146108-A0305-02-0015-5
505Å2，肽貢獻：
Figure 107146108-A0305-02-0015-6
60Å2。
圖15. 5C01 Fab-HLA-A2/WT1VLD pMHC結合界面之近距視圖。突出顯示藉由BIOVIA Discovery Studio 4.5所鑑別的Fab與pMHC之間的主要化學相互作用。未展示溶劑原子。
圖16. 5C01 Fab殘基(列)與HLA-A2/WT1VLD pMHC殘基(行)之界面及相互作用矩陣。N=接近/鄰近，H=H鍵，Pi=π相互作用，SB=鹽橋。界 面殘基定義為在不存在/存在相互作用搭配物的情況下，在溶劑可達之表面區域中經歷變化的殘基。
圖17. 11D06 Fab-HLA-A2/WT1RMF pMHC結合界面之近距視圖。突出顯示藉由BIOVIA Discovery Studio 4.5所鑑別的Fab與pMHC之間的主要化學相互作用。未展示溶劑原子。
圖18. 11D06 Fab殘基(列)與HLA-A2/WT1RMF pMHC殘基(行)之界面及相互作用矩陣。N=接近/鄰近，H=H鍵，Pi=π相互作用，SB=鹽橋。界面殘基定義為在不存在/存在相互作用搭配物的情況下，在溶劑可達之表面區域中經歷變化的殘基。
圖19. ESK1 Fab-HLA-A2/WT1RMF pMHC結合界面之近距視圖(PDB ID 4WUU)。突出顯示藉由BIOVIA Discovery Studio 4.5所鑑別的Fab與pMHC之間的主要化學相互作用。未展示溶劑原子。
圖20. ESK1 Fab殘基(列)與HLA-A2/WT1RMF pMHC殘基(行)之界面及相互作用矩陣。N=接近/鄰近，H=H鍵，Pi=π相互作用，SB=鹽橋。界面殘基定義為在不存在/存在相互作用搭配物的情況下，在溶劑可達之表面區域中經歷變化的殘基。
圖21. 由具有不同CD3結合子之HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體介導的對HLA-A2+/WT1+ SKM-1細胞之殺滅。
圖22. 由HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(TCB)介導的對經RMF肽脈衝衝擊之T2細胞的殺滅。
圖23. 對HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(TCB)Aali-TCB(A)，Daniel-TCB(B)，ESK1-TCB(C)及11D06-TCB(D)與脫靶肽之結合的評定。
圖24. 在於NSG小鼠中單次注射之後，HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體11D06-TCB(V9)之藥物動力學概況。
圖25. 用HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體11D06-TCB(V9)在人類化小鼠中之SKM-1異種移植物進行的功效研究。(A)在所有處理組中之腫瘤生長動力學(平均值)。(B)在媒劑組中之單個腫瘤生長動力學。(C)在11D06-TCB(V9)組中之單個腫瘤生長動力學。(D)統計。基於第48天進行計算(媒劑作為對照組)。腫瘤生長抑制(TGI)：TGI>100→腫瘤消退，TGI=100→腫瘤停滯。處理與對照物之比率(TCR)：TCR=1→無作用，TCR=0→完全消退。
圖26. 在結合於表現HLA-A02/WT1RMF pMHC複合物之CHO-K1細胞後，HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(TCB)對T細胞之活化(NFAT報導體分析)。實線：11D06-TCB(V9)(「2+1」形式)。虛線：呈「1+1互換單抗」形式之類似分子(11D06及V9結合子)。
定義
除非下文中另外定義，否則術語在本文中的使用如此項技術一般所用。
如本文所用，術語「抗原結合分子」在其最廣泛之意義上係指特異性結合抗原決定子之分子。抗原結合分子之實例為免疫球蛋白及其衍生物，例如片段。
術語「雙特異性」意謂抗原結合分子能夠特異性結合於至少兩個不同的抗原決定子。通常，雙特異性抗原結合分子包含兩個抗原結 合位點，其中之每一者對不同抗原決定子具有特異性。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩個抗原決定子，特定言之，在兩個不同細胞上所表現之兩個抗原決定子。
如本文所用，術語「價」表示抗原結合分子中存在指定數目個抗原結合位點。因而，術語「單價結合於抗原」表示抗原結合分子中存在一個(且不超過一個)對該抗原具有特異性之抗原結合位點。
「抗原結合位點」係指抗原結合分子中提供與該抗原之相互作用的位點，亦即，一或多個胺基酸殘基。舉例而言，抗體之抗原結合位點包含來自互補決定區(CDR)之胺基酸殘基。原生免疫球蛋白分子通常具有兩個抗原結合位點，Fab分子通常具有單個抗原結合位點。
如本文所用，術語「抗原結合部分」係指特異性結合於抗原決定子之多肽分子。在一個實施例中，抗原結合部分能夠使其所附接之實體(例如第二抗原結合部分)指向靶位點，例如攜有抗原決定子的特定類型之腫瘤細胞。在另一個實施例中，抗原結合部分能夠經由其靶抗原(例如T細胞受體複合物抗原)而使信號傳導活化。抗原結合部分包括如本文進一步定義之抗體及其片段。特定抗原結合部分包括抗體之抗原結合域，包含抗體重鏈可變區及抗體輕鏈可變區。在某些實施例中，抗原結合部分可包含如本文進一步定義及此項技術中已知的抗體恆定區。適用之重鏈恆定區包括五種同型中之任一者：α、δ、ε、γ或μ。適用之輕鏈恆定區包括兩種同型中之任一者：κ及λ。
如本文所用，術語「抗原決定子」或「抗原」係指抗原結合部分所結合以形成抗原結合部分-抗原複合物的多肽大分子上之位點。適用之抗原決定子可發現於例如腫瘤細胞表面上、病毒所感染細胞之表面 上、其他患病細胞表面上、免疫細胞之表面上、游離於血清中及/或細胞外基質(ECM)中。
術語「抗原決定基」表示抗原結合部分所結合的抗原上之蛋白質位點或非蛋白質位點。抗原決定基可由以下兩種方式形成：連續胺基酸鏈段(線性抗原決定基)；或包含例如由於抗原之摺疊(亦即，藉由蛋白質抗原之三級摺疊)而在空間上鄰近的非連續胺基酸(構形抗原決定基)。線性抗原決定基通常在蛋白質抗原暴露於變性劑之後仍與抗原結合部分結合，而構形抗原決定基通常在用變性劑處理之後受到破壞。抗原決定基在獨特空間構形中包含至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個或8-10個胺基酸。
除非另外指示，否則「CD3」係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))的任何原生CD3。該術語涵蓋「全長」未經處理之CD3以及由在細胞中處理而產生的任何形式之CD3。該術語亦涵蓋天然存在之CD3變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一個實施例中，CD3為人類CD3，特定言之，人類CD3之ε次單元(CD3ε)。人類CD3ε之胺基酸序列展示於UniProt(www.uniprot.org)寄存編號P07766(189版)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_000724.1中。亦參見SEQ ID NO：107。食蟹獼猴[食蟹猴]CD3ε之胺基酸序列展示於NCBI GenBank編號BAB71849.1中。亦參見SEQ ID NO：108。
「WT1」亦稱為「威爾姆斯腫瘤1」或「威爾姆斯腫瘤蛋白質」，除非另外指示，否則其係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物 (例如小鼠及大鼠))的任何原生WT1。該術語涵蓋「全長」未經處理之WT1以及由在細胞中處理而產生的任何形式之WT1。該術語亦涵蓋天然存在之WT1變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一個實施例中，WT1為人類WT1，特定言之，SEQ ID NO：106之蛋白質。人類WT1描述於UniProt(www.uniprot.org)寄存編號P19544(項目版本215)中，並且人類WT1之胺基酸序列亦展示於SEQ ID NO：106中。
「VLD」、「VLD肽」或「WT1VLD」意謂具有胺基酸序列VLDFAPPGA(SEQ ID NO：77；SEQ ID NO：106之WT1蛋白質的位置37-45)的WT1源性肽。
「RMF」、「RMF肽」或「WT1RMF」意謂具有胺基酸序列RMFRNAPYL(SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：106之WT1蛋白質的位置126-134)的WT1源性肽。
「HLA-A2」、「HLA-A*02」、「HLA-A02」或「HLA-A*2」(可互換地使用)係指HLA-A血清型組中之人類白細胞抗原血清型。HLA-A2蛋白質(由各別HLA基因編碼)構成各別I類MHC(主要組織相容性複合體)蛋白質之α鏈，該I類MHC蛋白質進一步包含β2微球蛋白次單元。特定HLA-A2蛋白質為HLA-A201(亦稱為HLA-A0201、HLA-A02.01或HLA-A*02：01)。在具體實施例中，本文所描述之HLA-A2蛋白質為HLA-A201。
「HLA-A2/WT1」係指HLA-A2分子與WT1源性肽(在本文中亦稱為「WT1肽」)之複合物，具體而言，與RMF或VLD肽之複合物(分別為「HLA-A2/WT1RMF」及「HLA-A2/WT1VLD」)。本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子特異性結合於HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD 複合物。
「特異性結合」意謂結合對抗原具有選擇性且可與非所需或非特異性相互作用區分。抗原結合部分結合於特定抗原決定子之能力可經由酶聯免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉之其他技術量測，例如表面電漿子共振(SPR)技術(例如在BIAcore儀器上分析)(Liljeblad等人.，Glyco J 17,323-329(2000))及傳統結合分析(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。適合用於確定本發明之抗體及雙特異性抗原結合分子之特異性的分析描述於本文中，例如下文實例4、9及10中。在一個實施例中，如藉由例如SPR所量測，抗原結合部分與不相關蛋白質結合之程度小於該抗原結合部分與抗原結合的約10%。在某些實施例中，結合於抗原之抗原結合部分或包含該抗原結合部分之抗原結合分子的解離常數(KD)
Figure 107146108-A0305-02-0021-7
1μM，
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100nM，
Figure 107146108-A0305-02-0021-9
10nM，
Figure 107146108-A0305-02-0021-10
1nM，
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0.1nM，
Figure 107146108-A0305-02-0021-12
0.01nM或
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0.001nM(例如為10-8M或小於10-8M，例如為10-8M至10-13M，例如為10-9M至10-13M)。
「親和力」係指在分子(例如受體)之單個結合位點與其結合搭配物(例如配位體)之間的非共價相互作用總和的強度。除非另外指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對成員(例如抗原結合部分與抗原，或受體與其配位體)之間1：1相互作用的固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(KD)表示，該解離常數為解離速率常數與締合速率常數(分別為koff及kon)之比率。因此，相等親和力可包含不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同即可。親和力可藉由此項技術中已知的沿用已久之方法，包括本文所描述之彼等方法來進行量測。一種用於量測親和力之特定方法為表面電漿子共振(SPR)。
「結合減弱」(例如與Fc受體之結合減弱)係指如藉由例如 SPR所量測，各別相互作用之親和力降低。為了清楚起見，該術語亦包括親和力降低至零(或低於分析方法之偵測極限)，亦即，相互作用完全消除。相反，「結合增強」係指各別相互作用之結合親和力增加。
如本文所用，「活化性T細胞抗原」係指在T淋巴球(特定言之，細胞毒性T淋巴球)表面上所表現之抗原性決定子，其在與抗原結合分子相互作用時能夠誘導T細胞活化。具體而言，抗原結合分子與活化性T細胞抗原之相互作用可藉由觸發T細胞受體複合物之信號級聯來誘導T細胞活化。在一個特定實施例中，活化性T細胞抗原為CD3，特定言之，CD3之ε次單元(人類序列參見UniProt編號P07766(189版)，NCBI RefSeq編號NP_000724.1，SEQ ID NO：107；或食蟹獼猴[食蟹猴]序列參見UniProt編號Q95LI5(49版)，NCBI GenBank編號BAB71849.1，SEQ ID NO：108)。
如本文所用，「T細胞活化」係指T淋巴球(特定言之，細胞毒性T淋巴球)之一或多種細胞反應，其選自：增殖、分化、細胞介素分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒活性及活化標記物表現。適合於量測T細胞活化之分析為此項技術中已知的且描述於本文中。
如本文所用之「靶細胞抗原」係指在靶細胞(例如腫瘤中之細胞，諸如癌細胞或腫瘤基質細胞)之表面上所呈遞的抗原決定子。在一個特定實施例中，靶細胞抗原為HLA-A2/WT1，特定言之，HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD，最特定言之，HLA-A2/WT1RMF。
如本文所用，當各類型之部分超過一種時，為了便於區別，結合Fab分子等使用術語「第一」、「第二」或「第三」。除非明確如此陳述，否則使用此等術語並不意欲賦予雙特異性抗原結合分子之特定次序或定向。
「融合」意謂組分(例如Fab分子及Fc域次單元)藉由肽鍵，直接或經由一或多個肽連接子連接。
「Fab分子」係指由免疫球蛋白之重鏈(「Fab重鏈」)之VH及CH1域及輕鏈(「Fab輕鏈」)之VL及CL域組成的蛋白質。
「互換型」Fab分子(亦稱為「互換Fab」)意謂其中Fab重鏈與輕鏈之可變域或恆定域進行交換(亦即，相互置換)的Fab分子，亦即，互換型Fab分子包含由輕鏈可變域VL及重鏈恆定域1 CH1構成之肽鏈(在N端至C端方向上，VL-CH1)及由重鏈可變域VH及輕鏈恆定域CL構成之肽鏈(在N端至C端方向上，VH-CL)。為了清楚起見，在其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域交換的互換型Fab分子中，包含重鏈恆定域1 CH1之肽鏈在本文中稱為(互換型)Fab分子之「重鏈」。相反，在其中Fab輕鏈與Fab重鏈之恆定域交換的互換型Fab分子中，包含重鏈可變域VH之肽鏈在本文中稱為(互換型)Fab分子之「重鏈」。
與此對比，「習知」Fab分子意謂呈其天然形式之Fab分子，亦即，包含由重鏈可變及恆定域構成之重鏈(在N端至C端方向上，VH-CH1)及由輕鏈可變及恆定域構成之輕鏈(在N端至C端方向上，VL-CL)。
術語「免疫球蛋白分子」係指具有天然存在之抗體結構的蛋白質。舉例而言，IgG類免疫球蛋白為約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚糖蛋白，其由經二硫鍵鍵結之兩條輕鏈及兩條重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變域(VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變區；後接三個恆定域(CH1、CH2及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變域(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變區，後接恆定輕鏈(CL)域，亦稱為輕鏈恆定區。免疫球蛋白之重鏈可歸為五種類型中之一者，該 五種類型稱為α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中一些可進一步分成亞型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)及α2(IgA2)。免疫球蛋白之輕鏈基於其恆定域之胺基酸序列可歸為兩種類型中之一者，該兩種類型稱為kappa(κ)及lambda(λ)。免疫球蛋白基本上由兩個Fab分子及一個Fc域經由免疫球蛋白鉸鏈區連接而組成。
術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所要抗原結合活性即可。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自基本上同質之抗體群體獲得的抗體，亦即，除可能之變異型抗體，例如含有天然存在之突變或在單株抗體製劑產生期間出現的變異型抗體之外，該群體中所包含之個別抗體為完全相同的及/或結合相同抗原決定基，此類變異體一般以少量存在。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑對比，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾語「單株」指示抗體之特徵為自基本上同質之抗體群體獲得，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，待根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製得，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法及利用含有全部或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法、用於製得單株抗體之此類方法及其他例示性方法描述於本文中。
「經分離之」抗體為已與其天然環境之組分分離(亦即，不存在於其天然環境中)的抗體。不需要特定的純化水準。舉例而言，經分離之抗體可自其原生或天然環境中移除。出於本發明之目的，宿主細胞中所表 現之重組產生型抗體視為經分離，已藉由任何適合技術分離、分級分離或部分或基本上純化的原生或重組抗體亦視為經分離。因而，本發明之抗體及雙特異性抗原結合分子經分離。在一些實施例中，抗體純化至大於95%或99%之純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細電泳法)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)方法所測定。對用於評定抗體純度之方法的綜述參見例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換使用，其係指結構與原生抗體結構基本上類似的抗體。
「抗體片段」係指除完整抗體之外的包含完整抗體之一部分的分子，該部分結合該完整抗體所結合之抗原。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)及單域抗體。對某些抗體片段之綜述參見Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。對scFv片段之綜述參見例如Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。對包含救助受體結合抗原決定基殘基且活體內半衰期延長之Fab及F(ab')2片段的論述參見美國專利第5,869,046號。雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點之抗體片段，其可為二價或雙特異性的。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)中。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或一 部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見例如美國專利第6,248,516B1號)。如本文所描述，抗體片段可藉由各種技術來製得，包括(但不限於)完整抗體之蛋白分解消化以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生。
術語「抗原結合域」係指抗體中包含特異性結合於抗原之一部分或全部且與其互補之區域的部分。抗原結合域可由例如一或多個抗體可變域(亦稱為抗體可變區)提供。特定言之，抗原結合域包含抗體輕鏈可變域(VL)及抗體重鏈可變域(VH)。
術語「可變區」或「可變域」係指涉及抗體結合於抗原的抗體重鏈或輕鏈域。原生抗體之重鏈及輕鏈可變域(分別為VH及VL)一般具有類似的結構，其中各結構域均包含四個保守性構架區(FR)及三個高變區(HVR)。參見例如Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007)。單個VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。如本文關於可變區序列所用，「Kabat編號」係指Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.公共衛生署(Public Health Service)，美國國家衛生研究院(National Institutes of Health),Bethesda,MD(1991)所闡述之編號系統。
如本文所用，重鏈及輕鏈之所有恆定區及恆定域的胺基酸位置均根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，公共衛生署，美國國家衛生研究院，Bethesda,MD(1991)中所描述之Kabat編號系統進行編號，在本文中稱為「根據Kabat編號」或「Kabat編號」。具體而言，Kabat編號系統(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，公共衛生署，美國國家衛生研究院，Bethesda,MD(1991)之第647-660頁)用於κ及λ同型之輕鏈恆定域CL，且Kabat EU索引編號系統(參見第661-723頁)用於重鏈恆定域(CH1、鉸鏈、CH2及CH3)，在此情況下，在本文中藉由提及「根據Kabat EU索引編號」來進一步澄清。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中序列高變(「互補決定區」或「CDR」)及/或形成結構上限定之環(「高變環」)及/或含有抗原接觸性殘基(「抗原觸點」)的各區。一般而言，抗體包含六個HVR；三個在VH中(H1、H2、H3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。本文中之例示性HVR包括：(a)存在於胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)處之高變環(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；(b)存在於胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)處之CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.公共衛生署，美國國家衛生研究院，Bethesda,MD(1991))；(c)存在於胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及93-101(H3)處之抗原觸點(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；及(d)(a)、(b)及/或(c)之組合，包括HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)及94-102(H3)。
除非另外指示，否則可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)在本文中根據Kabat等人，同前文獻進行編號。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基之外的可變域殘基。可變域之FR一般由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列一般按以下次序出現在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域中之基本上全部，其中全部或基本上全部HVR(例如CDR)對應於非人類抗體之彼等HVR，且全部或基本上全部FR對應於人類抗體之彼等FR。此類可變域在本文中稱為「人類化可變區」。人類化抗體視情況可包含來源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，HVR殘基所來源於之抗體)的對應之殘基取代，以例如恢復或改良抗體特異性或親和力。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已經歷人類化之抗體。本發明所涵蓋之「人類化抗體」的其他形式為其中恆定區已經另外修飾或相對於原始抗體之恆定區已發生變化以產生根據本發明之特性(尤其在C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合方面)的彼等抗體。
「人類抗體」為所具有之胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源的抗體之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。在某些實施例中，人類抗體來源於非人類轉殖基因哺乳動物，例如小鼠、大鼠或兔。在某些實施例中，人類抗體來源於融 合瘤細胞株。自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段在本文中亦視為人類抗體或人類抗體片段。
抗體或免疫球蛋白之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。存在五種主要抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干者可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
本文術語「Fc域」或「Fc區」用於定義含有恆定區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈C端區。該術語包括原生序列Fc區及變異型Fc區。儘管IgG重鏈之Fc區的邊界可能稍微變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，宿主細胞所產生之抗體可能在重鏈C端經歷一或多個(特定言之，一或兩個)胺基酸之轉譯後切割。因此，宿主細胞藉由表現編碼全長重鏈之特定核酸分子而產生的抗體可包括該全長重鏈，或其可包括該全長重鏈的經切割之變異體(在本文中亦稱為「經切割之變異型重鏈」)。此可為重鏈之最後兩個C端胺基酸為甘胺酸(G446)及離胺酸(K447，根據Kabat EU索引編號)的情況。因此，Fc區之C端離胺酸(Lys447)或C端甘胺酸(Gly446)及離胺酸(K447)可能存在或可能不存在。若未另外指示，則包括Fc域(或如本文所定義之Fc域之次單元)之重鏈的胺基酸序列在本文中表示無C端甘胺酸-離胺酸二肽。在本發明之一個實施例中，根據本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子中所包含的包括如本文所說明之Fc域之次單元的重鏈包含另一個C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。在本發明之一個實施例中，根據本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子中所包含的包括如本文所說明 之Fc域之次單元的重鏈包含另一個C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)。本發明之組合物(諸如本文所描述之醫藥組合物)包含本發明抗體或雙特異性抗原結合分子之群體。抗體或雙特異性抗原結合分子之群體可包含具有全長重鏈的分子及具有經切割之變異型重鏈的分子。抗體或雙特異性抗原結合分子之群體可由具有全長重鏈之分子及具有經切割之變異型重鏈之分子的混合物組成，其中至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%之抗體或雙特異性抗原結合分子具有經切割之變異型重鏈。在本發明之一個實施例中，包含本發明抗體或雙特異性抗原結合分子之群體的組合物包含以下抗體或雙特異性抗原結合分子，其包含包括如本文所說明之Fc域之次單元的重鏈，該重鏈具有另一個C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。在本發明之一個實施例中，包含本發明抗體或雙特異性抗原結合分子之群體的組合物包含以下抗體或雙特異性抗原結合分子，其包含包括如本文所說明之Fc域之次單元的重鏈，該重鏈具有另一個C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)。在本發明之一個實施例中，此類組合物包含以下抗體或雙特異性抗原結合分子之群體，其包含：包含包括如本文所說明之Fc域之次單元的重鏈的分子；包含包括如本文所說明之Fc域之次單元的重鏈的分子，該重鏈具有另一個C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)；及包含包括如本文所說明之Fc域之次單元的重鏈的分子，該重鏈具有另一個C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基的編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國公共衛生署，國家衛生研究院，Bethesda,MD(1991)中所描述(亦參 見上文)。如本文所用之Fc域的「次單元」係指形成二聚Fc域之兩個多肽中的一者，亦即，能夠穩定自締合的包含免疫球蛋白重鏈之C端恆定區的多肽。舉例而言，IgG Fc域之次單元包含IgG CH2及IgG CH3恆定域。
「促進Fc域之第一及第二次單元之締合的修飾」為肽主鏈之操縱或Fc域次單元之轉譯後修飾，其減少或阻止包含Fc域次單元之多肽與完全相同之多肽締合形成均二聚體。特定言之，如本文所用的促進締合之修飾包括對期望締合之兩個Fc域次單元(亦即，Fc域之第一及第二次單元)中之每一者進行的單獨修飾，其中該等修飾彼此互補，以便促進該兩個Fc域次單元之締合。舉例而言，促進締合之修飾可改變Fc域次單元中之一或兩者的結構或電荷，以便分別使其締合在空間上或靜電上有利。因此，在包含第一Fc域次單元之多肽與包含第二Fc域次單元之多肽之間發生(雜)二聚化，該等多肽在與該等次單元中之每一者融合之其他組分(例如抗原結合部分)不相同的意義上可能不完全相同。在一些實施例中，促進締合之修飾包含Fc域中之胺基酸突變，具體而言，胺基酸取代。在一個特定實施例中，促進締合之修飾包含Fc域之兩個次單元中之每一者中的單獨胺基酸突變，具體而言，胺基酸取代。
術語「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區的彼等生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、細胞介素分泌、免疫複合體介導的抗原呈遞細胞之抗原攝取、細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調及B細胞活化。
如本文所用，術語「工程改造 (engineer/engineered/engineering)」視為包括肽主鏈之任何操縱或天然存在或重組多肽或其片段之轉譯後修飾。工程改造包括胺基酸序列、糖基化型態或個別胺基酸之側鏈基團的修飾，以及此等方法之組合。
如本文所用之術語「胺基酸突變」意欲涵蓋胺基酸取代、缺失、插入及修飾。可進行取代、缺失、插入及修飾之任何組合以達成最終構築體，其限制條件為該最終構築體具有所要特徵，例如與Fc受體之結合減弱或與另一種肽之締合增強。胺基酸序列缺失及插入包括胺基酸之胺基端及/或羧基端缺失及插入。特定胺基酸突變為胺基酸取代。出於改變例如Fc區之結合特徵的目的，非保守胺基酸取代尤其較佳，亦即，用具有不同結構及/或化學特性之另一種胺基酸置換一種胺基酸。胺基酸取代包括經非天然存在之胺基酸置換或經二十種標準胺基酸的天然存在之胺基酸衍生物(例如4-羥基脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥基離胺酸)置換。胺基酸突變可使用此項技術中熟知之遺傳學或化學方法產生。遺傳學方法可包括定點突變誘發、PCR、基因合成及其類似方法。預期藉由除基因工程改造之外的方法(諸如化學修飾)改變胺基酸之側鏈基團的方法亦可為適用的。本文中可使用不同名稱指示相同之胺基酸突變。舉例而言，將Fc域之位置329處的脯胺酸取代為甘胺酸可表示為329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將任何保守取代視為序列一致性之一部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基的百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以此項技術中之技 能範圍內的各種方式達成，例如使用公開可獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)軟體或FASTA套裝程式。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何演算法。然而，出於本文之目的，胺基酸序列一致性%值係使用FASTA套裝36.3.8c版或更近版中之ggsearch程式，用BLOSUM50比較矩陣來產生。FASTA套裝程式的作者為W.R.Pearson及D.J.Lipman(1988),「Improved Tools for Biological Sequence Analysis」,PNAS 85：2444-2448；W.R.Pearson(1996)「Effective protein sequence comparison」Meth.Enzymol.266：227-258；及Pearson等人(1997)Genomics 46：24-36，且公開可獲自http：//fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml。或者，可使用在http：//fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi可存取之公共伺服器來比較序列，其中使用ggsearch(全域蛋白質：蛋白質)程式及預設選項(BLOSUM50；開端：-10；ext：-2；Ktup=2)以確保執行全域比對而非局域比對。胺基酸一致性百分比在輸出比對標題中給出。
術語「聚核苷酸」係指經分離之核酸分子或構築體，例如信使RNA(mRNA)、病毒源性RNA或質體DNA(pDNA)。聚核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如肽核酸(PNA)中所發現)。術語「核酸分子」係指存在於聚核苷酸中之任一或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。
「經分離之」核酸分子或聚核苷酸意指已自原生環境中移除之核酸分子、DNA或RNA。舉例而言，出於本發明之目的，編碼載體中所含有之多肽的重組聚核苷酸視為經分離。經分離之聚核苷酸的其他實例包 括異源宿主細胞中所維持之重組聚核苷酸或溶液中經純化(部分或基本上)之聚核苷酸。經分離之聚核苷酸包括通常含有聚核苷酸分子之細胞中所含有的聚核苷酸分子，但該聚核苷酸分子存在於染色體外或與其天然染色體位置不同之染色體位置處。經分離之RNA分子包括本發明之活體內或活體外RNA轉錄物，以及正股及負股形式，及雙股形式。根據本發明的經分離之聚核苷酸或核酸進一步包括以合成方式產生之此類分子。另外，聚核苷酸或核酸可為或可包括調節元件，諸如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。
「編碼[例如本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子]的經分離之聚核苷酸(或核酸)」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個聚核苷酸分子，包括處於單個載體或單獨載體中的此類聚核苷酸分子，及存在於宿主細胞中之一或多個位置處的此類核酸分子。
術語「表現卡匣」係指以重組或合成方式產生之聚核苷酸，其具有容許特定核酸在靶細胞中發生轉錄的一系列特定核酸元件。重組表現卡匣可併入質體(plasmid)、染色體、粒線體DNA、色素體(plastid)DNA、病毒或核酸片段中。通常，表現載體之重組表現卡匣部分包括待轉錄之核酸序列及啟動子，以及其他序列。在某些實施例中，表現卡匣包含編碼本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子其片段的聚核苷酸序列。
術語「載體」或「表現載體」係指用於引入特定基因且導引該特定基因之表現的DNA分子，該DNA分子在細胞中與該特定基因可操作地結合。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及併入已引入其之宿主細胞之基因組中的載體。本發明之表現載體包含表現卡匣。表現載體允許大量的穩定mRNA發生轉錄。一旦表現載體處於細胞內，則藉由細胞轉 錄及/或轉譯機構產生由該基因編碼之核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施例中，本發明之表現載體包含表現卡匣，該表現卡匣包含編碼本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換地使用且係指已向其中引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初代轉型細胞及來源於其之後代(不考慮繼代次數)。後代之核酸含量與母細胞可能不完全相同，而可能含有突變。本文包括針對原始轉型細胞篩選或選擇的具有相同功能或生物活性之突變型後代。宿主細胞為可用於產生本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子的任何類型之細胞系統。宿主細胞包括經培養之細胞，例如經培養之哺乳動物細胞，諸如HEK細胞、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞(僅舉數例)，且亦包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或經培養之植物或動物組織內所包含的細胞。
「活化性Fc受體」為在與抗體Fc域接合之後，引發信號傳導事件，刺激攜有受體之細胞執行效應功能的Fc受體。人類活化性Fc受體包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及FcαRI(CD89)。
抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)為引起免疫效應細胞溶解經抗體塗佈之靶細胞的免疫機制。靶細胞為包含Fc區之抗體或其衍生物特異性結合(一般經由處於Fc區N端之蛋白質部分來結合)的細胞。如本文所用，術語「ADCC降低」定義為藉由如上文所定義之ADCC機制，在圍繞靶細胞之介質中，在既定抗體濃度下，在既定時間內溶解之靶細胞 的數目減少，及/或藉由ADCC機制，在圍繞靶細胞之介質中，在既定時間內達成既定數目個靶細胞之溶解所需的抗體濃度增加。ADCC之降低係相對於由相同類型之宿主細胞使用相同之標準生產、純化、調配及儲存方法(熟習此項技術者已知)所產生、但尚未經工程改造之相同抗體介導的ADCC而言。舉例而言，由在Fc域中包含降低ADCC之胺基酸取代的抗體所介導之ADCC的降低係相對於由在Fc域中無此胺基酸取代之相同抗體所介導的ADCC而言。適合於量測ADCC之分析為此項技術中熟知的(參見例如PCT公開案第WO 2006/082515號或PCT公開案第WO 2012/130831號)。
藥劑之「有效量」係指在所投與之細胞或組織中產生生理變化所需的量。
藥劑(例如醫藥組合物)之「治療有效量」係指在必要劑量及必要時間段下有效達成所要治療或預防結果的量。舉例而言，治療有效量之藥劑消除、減輕、延遲、最小化或預防疾病之不良作用。
「個體(individual/subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、家兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。特定言之，個體為人類。
術語「醫藥組合物」係指呈容許其中所含活性成分之生物活性有效之形式且不含對該組合物將投與之個體具有不可接受毒性之額外組分的製劑。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥組合物中除活性成分之外的對個體無毒之成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所用，「治療(treatment)」(及其文法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之自然病程的臨床介入，且可為了實現預防或在臨床病理學病程中進行。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病出現或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性後果、預防癌轉移、降低疾病進展速率、改善(amelioration)或緩和疾病病況及緩解或改善(improved)預後。在一些實施例中，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子用於延遲疾病發展或減緩疾病進展。
術語「藥品說明書」用以指通常包括於治療性產品之商業包裝中的說明書，其含有關於與使用此類治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌症及/或警告的資訊。
實施例之詳細描述
本發明提供抗體及雙特異性抗原結合分子，其結合HLA-A2/WT1，特定言之HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD，最特定言之HLA-A2/WT1RMF，且具有如治療目的所需之良好親和力及特異性。另外，分子亦具有用於治療應用之其他有利特性，例如關於功效及/或安全性以及可製造性的有利特性。
HLA-A2/WT1抗體
本發明人已研發出以尤其良好之親和力及特異性結合於HLA-A2/WT1的新穎抗體。舉例而言，如實例中所示，本發明人以研發出相對於HLA-A2與其他結構上類似之肽的複合物，對HLA-A2/WT1(具體而言，HLA-A2/WT1RMF)具有顯著選擇性的抗體。
因此，在某些態樣中，本發明提供一種結合於HLA-A2/WT1且具有任一以下特徵之抗體。
在一個實施例中，抗體與HLA-A2/WT1之單價親和力的解離常數(KD)低於約100nM，低於約75nM或低於約50nM。在一個實施例中，抗體與HLA-A2/WT1之二價親和力(親合力)的表觀KD低於約1.5nM，低於約1nM或低於約0.75nM。在一個實施例中，在(表觀)KD方面，抗體之二價親和力(親合力)比該抗體之單價親和力高10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。
在一個實施例中，在25℃下藉由表面電漿子共振(SPR)來測定親和力。在一個實施例中，在Fab分子形式之抗體中測定單價親和力。在一個實施例中，在IgG分子形式之抗體中測定二價親和力(親合力)。
在一個具體實施例中，抗體之親和力如下測定：實驗在25℃下使用PBST作為操作緩衝液(10mM PBS，pH 7.4及0.005%(v/v)Tween 20)來執行。使用來自BioRad Inc.(Hercules,CA)的配備有GLC及GLM感測器晶片及偶合試劑(10mM乙酸鈉，pH 4.5，磺基-N-羥基丁二醯亞胺[磺基-NHS]，1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽[EDC]及乙醇胺)之ProteOn XPR36生物感測器。固定化以30μl/min在GLM晶片上執行。使用標準胺偶合程序使pAb(山羊)抗人類IgG F(ab)2特異性抗體(Jackson ImmunoResearch)在豎直方向上偶合：用EDC(200mM)及磺基-NHS(50mM)之混合物使所有六個配位體通道活化5分鐘。緊接在使表面活化之後，在所有六個通道內注射pAb(山羊)抗人類IgG F(ab)2特異性抗體(50μg/ml，10mM乙酸鈉，pH 5)持續5分鐘。最後，注射1M乙醇胺-HCl(pH 8.5)5分鐘使通道阻斷。藉由沿著五個單獨水平通道同時注 射(30μl/min)持續5分鐘而自大腸桿菌上清液捕獲Fab變異體。沿著第六通道注射條件培養基以提供用於雙重參考目的之『管線內』空白。一次性動力學量測藉由沿著豎直通道注射一系列HLA-WT1(例如HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)稀釋液(100、50、25、12.5、6.25、0nM，50μl/min)持續2分鐘來執行。監測解離持續3分鐘。在ProteOn管理器2.1版中分析動力學資料。處理反應點資料涉及應用點間參考步驟及使用管線內緩衝液空白之雙重參考步驟(Myszka,J Mol Recognit(1999)12,279-284)。在不進行質量傳遞的情況下，將來自重複一次性注射的經處理之資料相對於簡單1：1朗格繆爾結合模型(Langmuir binding model)進行擬合(O'Shannessy等人，Anal Biochem(1993)212,457-468)。
本發明之抗體特異性結合於HLA-A2/WT1(亦即，HLA-A2分子與WT1源性肽之複合物)。在一些實施例中，本發明之抗體特異性結合於HLA-A2/WT1RMF(亦即，HLA-A2分子與WT1RMF肽之複合物)。在一個更具體實施例中，抗體特異性結合於HLA-A201/WT1RMF(亦即，HLA-A201分子與WT1RMF肽之複合物)。結合於HLA-A2/WT1RMF的本發明之抗體包括本文所描述之抗體11D06、33H09及5E11。在其他實施例中，本發明之抗體特異性結合於HLA-A2/WT1VLD(亦即，HLA-A2分子與WT1VLD肽之複合物)。在一個更具體實施例中，抗體特異性結合於HLA-A201/WT1VLD(亦即，HLA-A201分子與WT1VLD肽之複合物)。結合於HLA-A2/WT1VLD的本發明之抗體包括本文所描述之抗體11B09、13B04及5C01。
在一個實施例中，抗體之特異性結合藉由流式細胞量測術使用HLA-A2/肽(例如WT1RMF或WT1VLD肽)表現性細胞，特定言之，經肽 脈衝衝擊之T2細胞來加以測定。
在一個具體實施例中，抗體之特異性結合如下測定：將T2細胞在補充有10% FBS(Gibco，目錄號16140-071)+1%青黴素-鏈黴素(Gibco，目錄號15070-063)之IMDM培養基(Life Technologies之Gibco，目錄號31980-048)(完全培養基)中以106個細胞/毫升製備為細胞懸浮液。將細胞以總體積10ml保持在試管中，且在37℃與5% CO2下與10μl之10-2M肽(例如WT1 VLD肽(SEQ ID NO：77)或RMF肽(SEQ ID NO：78))(該肽之最終濃度：10-5M)一起培育2小時。在洗滌之後，將細胞懸浮於冷PBS中，且在4℃下與經滴定之濃度的呈IgG形式之抗體(例如10μg/ml至0.00064μg/ml)一起培育1小時，後接與二級抗人類IgG-Fc藻紅素(PE)結合之抗體(Jackson Laboratories，目錄號109-116-098)一起培育30分鐘。在FACS LSR II(BD)上獲取細胞，且資料在Graphpad Prism中呈現為PE之平均螢光強度(MFI)。
在一個實施例中，本發明之抗體不明顯結合於單獨HLA-A2(亦即，不具有肽)或具有除WT1源性肽(諸如WT1RMF或WT1VLD)以外之肽的HLA-A2。
在一個實施例中，抗體不明顯結合於不存在WT1源性肽(特定言之，WT1RMF或WT1VLD)之HLA-A2。在一個實施例中，抗體結合於HLA-A2/WT1(具體而言，HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)之EC50比結合於不存在WT1源性肽(具體而言，WT1RMF或WT1VLD)之HLA-A2的EC50低至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少50、至少75或至少100倍。
在一個實施例中，抗體結合於HLA-A2/WT1(具體而言， HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)，但不明顯結合於具有選自表5中之肽(SEQ ID NO 79-105之肽)之肽的HLA-A2。在一個實施例中，抗體結合於HLA-A2/WT1(具體而言，HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)，但不明顯結合於具有表5中之肽(SEQ ID NO 79-105之肽)中之任一者的HLA-A2。
在一個實施例中，抗體結合於HLA-A2/WT1(具體而言，HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)之EC50比結合於具有選自表5中之肽(SEQ ID NO 79-105之肽)之肽的HLA-A2之EC50低至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少50、至少75或至少100倍。在一個實施例中，抗體結合於HLA-A2/WT1(具體而言，HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)之EC50比結合於具有表5中之肽(SEQ ID NO 79-105之肽)中之任一者的HLA-A2之EC50低至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少50、至少75或至少100倍。
在一個實施例中，EC50藉由流式細胞量測術使用HLA-A2/肽(例如WT1RMF或WT1VLD肽)表現性細胞，特定言之，經肽脈衝衝擊之T2細胞來加以測定。
在一個具體實施例中，EC50如下測定：將T2細胞(ATCC，目錄號CRL-1992)在補充有10% FBS(Gibco，目錄號16140-071)+1%青黴素-鏈黴素(Gibco，目錄號15070-063)之IMDM培養基(Life Technologies之Gibco，目錄號31980-048)(完全培養基)中以106個細胞/毫升製備為細胞懸浮液。將細胞以總體積10ml保持在試管中，且在37℃與5% CO2下與10μl之10-2M肽(例如WT1 VLD肽(SEQ ID NO：77)或RMF肽(SEQ ID NO：78))(該肽之最終濃度：10-5M)一起培育2小時。 在洗滌之後，將細胞懸浮於冷PBS中，且在4℃下與經滴定之濃度的呈IgG形式之抗體(例如10μg/ml至0.00064μg/ml)一起培育1小時，後接與二級抗人類IgG-Fc藻紅素(PE)結合之抗體(Jackson Laboratories，目錄號109-116-098)一起培育30分鐘。在FACS LSR II(BD)上獲取細胞，且資料在Graphpad Prism中呈現為PE之平均螢光強度(MFI)。EC50值在Microsoft® Excel中使用XLfit®加載項(ID Business Solutions,Guildford,UK)來加以計算。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其與包含SEQ ID NO：7之重鏈可變區(VH)序列及SEQ ID NO：8之輕鏈可變區(VL)序列的抗體競爭結合於HLA-A2/WT1，特定言之，HLA-A201/WT1RMF。
競爭分析可用於鑑別與包含SEQ ID NO：7之VH序列及SEQ ID NO：8之VL序列的抗體(參考抗體)競爭結合於HLA-A2/WT1的抗體。在某些實施例中，此類競爭性抗體結合於參考抗體所結合之相同抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)。用於定位抗體所結合之抗原決定基的詳細例示性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中，且亦描述於本文實例中。在例示性競爭分析中，在以下溶液中培育固定化HLA-A2/WT1，該溶液包含結合於HLA-A2/WT1的經標記之第一抗體(例如，包含SEQ ID NO：7之VH序列及SEQ ID NO：8之VL序列的抗體)及測試與該第一抗體競爭結合於HLA-A2/WT1之能力的未標記之第二抗體。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照物，在包含經標記之第一抗體但無未標記之第二抗體的溶液中培育固定化HLA-A2/WT1。在於容許第一抗體與HLA-A2/WT1結合之條件下培育之後，移除過量未結合之抗體，且 量測與固定化HLA-A2/WT1締合之標記的量。若測試樣品中與固定化HLA-A2/WT1締合之標記的量相對於對照樣品中大量減少，則其指示第二抗體與第一抗體競爭結合於HLA-A2/WT1。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其與包含SEQ ID NO：7之重鏈可變區(VH)序列及SEQ ID NO：8之輕鏈可變區(VL)序列的抗體結合於HLA-A2/WT1(特定言之，HLA-A2/WT1RMF)的相同抗原決定基。
對結合於特定抗原決定基之抗體(亦即，結合於相同抗原決定基之彼等抗體)的篩選可使用此項技術中之常規方法進行，該等方法諸如(但不限於)丙胺酸掃描、肽墨點法(參見Meth.Mol.Biol.248(2004)443-463)、肽切割分析、抗原決定基切除、抗原決定基提取、抗原之化學修飾(參見Prot.Sci.9(2000)487-496)及交叉阻斷(參見「Antibodies」，Harlow及Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY))。
基於抗原結構之抗體譜分析(Antigen Structure-based Antibody Profiling；ASAP)亦稱為修飾輔助譜分析(Modification-Assisted Profiling；MAP)，允許基於特異性結合於HLA-A2/WT1之多種單株抗體中之每一抗體與經化學修飾或經酶修飾之抗原表面的結合譜來對該多種單株抗體進行分組(參見例如US 2004/0101920)。每一組中之抗體結合於相同抗原決定基，該抗原決定基可為與由另一組所表示之抗原決定基完全不同或部分重疊的獨特抗原決定基。
此外，競爭性結合可用於容易地判定抗體是與參考抗HLA-A2/WT1抗體結合於HLA-A2/WT1之相同抗原決定基還是抗體與參 考抗HLA-A2/WT1抗體競爭結合。舉例而言，與參考抗體「結合於相同抗原決定基之抗體」係指以下抗體，其在競爭分析中阻斷參考抗體與其抗原之結合達50%或超過50%，且反之，參考抗體在競爭分析法中阻斷該抗體與其抗原之結合達50%或超過50%。亦舉例而言，為了判定抗體是否與參考抗體結合於HLA-A2/WT1之相同抗原決定基，允許參考抗體在飽和條件下結合於HLA-A2/WT1。在移除過量之參考抗體之後，評定所討論之抗HLA-A2/WT1抗體結合於HLA-A2/WT1的能力。若抗體在參考抗體飽和結合之後能夠結合於HLA-A2/WT1，則可得出結論，所討論之抗體結合於與參考抗體不同之抗原決定基。但，若所討論之抗體在參考抗體飽和結合之後不能結合於HLA-A2/WT1，則所討論之抗體可能結合於與參考抗體所結合之抗原決定基相同的抗原決定基。為了確認所討論之抗體是結合於相同抗原決定基還是僅由於空間原因而結合受阻，可使用常規實驗(例如，使用ELISA之肽突變及結合分析、RIA、表面電漿子共振、流式細胞量測術或在此項技術中可獲得之任何其他定量或定性抗體結合分析)。此分析應在兩個設置下進行，亦即，在兩種抗體均為飽和抗體的情況下進行。若在兩個設置下，僅第一(飽和)抗體能夠結合於HLA-A2/WT1，則可得出結論，所討論之抗HLA-A2/WT1抗體及參考抗HLA-A2/WT1抗體競爭結合於HLA-A2/WT1。
在一些實施例中，如在競爭性結合分析中所量測，若1倍、5倍、10倍、20倍或100倍過量的一種抗體抑制另一種抗體之結合達至少50%、至少75%、至少90%或甚至99%或超過99%，則認為兩種抗體結合於相同或重疊抗原決定基(參見例如Junghans等人，Cancer Res.50(1990)1495-1502)。
在一些實施例中，若抗原中減弱或消除一種抗體之結合的基本上所有胺基酸突變亦減弱或消除另一種抗體之結合，則認為兩種抗體結合於相同抗原決定基。若減弱或消除一種抗體之結合的胺基酸突變的僅一個子集減弱或消除另一種抗體之結合，則認為兩種抗體具有「重疊抗原決定基」。
在一個態樣中，根據任一以下實施例，本發明提供一種結合於HLA-A2/WT1之抗體，其中該抗體結合於HLA-A2/WT1(特定言之，HLA-A2/WT1RMF)之抗原決定基。特定言之，抗原決定基可藉由晶體結構分析來加以確定。
在一個實施例中，該抗原決定基包含WT1肽(特定言之，SEQ ID NO：78中所示之WT1RMF肽)的至少三個胺基酸殘基。
在一個實施例中，該抗原決定基包含WT1肽(特定言之，SEQ ID NO：78中所示之WT1RMF肽)的至少四個胺基酸殘基。
在一個實施例中，該抗原決定基包含WT1肽(特定言之，SEQ ID NO：78中所示之WT1RMF肽)的至少五個胺基酸殘基。
在一個實施例中，該抗原決定基包含WT1肽(特定言之，SEQ ID NO：78中所示之WT1RMF肽)的至少六個胺基酸殘基。
在一個實施例中，該抗原決定基包含WT1肽之至少三個胺基酸殘基，其中該至少三個胺基酸殘基係選自對應於SEQ ID NO：78中所示之WT1RMF肽之胺基酸殘基R1、M2、P4、N5、A6及Y8的胺基酸殘基。
在一個實施例中，該抗原決定基包含WT1肽之至少四個胺基酸殘基，其中該至少四個胺基酸殘基係選自對應於SEQ ID NO：78中所示之WT1RMF肽之胺基酸殘基R1、M2、P4、N5、A6及Y8的胺基酸殘基。
在一個實施例中，該抗原決定基包含WT1肽之至少五個胺基酸殘基，其中該至少五個胺基酸殘基係選自對應於SEQ ID NO：78中所示之WT1RMF肽之胺基酸殘基R1、M2、P4、N5、A6及Y8的胺基酸殘基。
在一個實施例中，該抗原決定基包含WT1肽之至少六個胺基酸殘基，其中該至少六個胺基酸殘基係選自對應於SEQ ID NO：78中所示之WT1RMF肽之胺基酸殘基R1、M2、P4、N5、A6及Y8的胺基酸殘基。
在一個實施例中，該抗原決定基包含對應於SEQ ID NO：78中所示之WT1RMF肽之胺基酸殘基R1、N5及A6的胺基酸殘基。
在一個實施例中，該抗原決定基包含對應於SEQ ID NO：78中所示之WT1RMF肽之胺基酸殘基R1、M2、P4、N5、A6及Y8的胺基酸殘基。
在一個實施例中，該抗原決定基包含對應於SEQ ID NO：138中所示之HLA-A2序列之胺基酸殘基E58、R65、K66及Q155的胺基酸殘基。
在一個實施例中，該抗原決定基包含對應於SEQ ID NO：138中所示之HLA-A2序列之胺基酸殘基E58、R65、K66及Q155的胺基酸殘基，及對應於SEQ ID NO：78中所示之WT1RMF肽之胺基酸殘基R1、N5及A6的胺基酸殘基。
在一個實施例中，該抗原決定基包含對應於SEQ ID NO：138中所示之HLA-A2序列之胺基酸殘基E58、R65、K66、Q155及D61的胺基酸殘基。在一個實施例中，該抗原決定基包含對應於SEQ ID NO：138中所示之HLA-A2序列之胺基酸殘基E58、R65、K66、Q155及A69的胺基酸殘基。在一個實施例中，該抗原決定基包含對應於SEQ ID NO：138中所 示之HLA-A2序列之胺基酸殘基EE58、R65、K66、Q155及A150的胺基酸殘基。
在一個實施例中，該抗原決定基包含對應於SEQ ID NO：138中所示之HLA-A2序列之胺基酸殘基E58、R65、K66、Q155以及D61、A69及A150中之一或多者的胺基酸殘基，及對應於SEQ ID NO：78中所示之WT1RMF肽之胺基酸殘基R1、M2、P4、N5、A6及/或Y8的胺基酸殘基。
在一個實施例中，該抗原決定基包含對應於SEQ ID NO：138中所示之HLA-A2序列之胺基酸殘基E58、D61、G62、R65、K66、A69、A150、Q155、A158、T163、E166、W167及R170的胺基酸殘基。
在一個實施例中，該抗原決定基包含對應於SEQ ID NO：138中所示之HLA-A2序列之胺基酸殘基E58、D61、G62、R65、K66、A69、A150、Q155、A158、T163、E166、W167及R170的胺基酸殘基，及對應於SEQ ID NO：78中所示之WT1RMF肽之胺基酸殘基R1、M2、P4、N5、A6及/或Y8的胺基酸殘基。
在一個實施例中，該抗原決定基不包含對應於SEQ ID NO：138中所示之HLA-A2序列之胺基酸殘基G56、D106、W107、R108、E161、G162及/或R169的胺基酸殘基。
在另一態樣中，本發明提供一種結合於HLA-A2/WT1之抗體，其中該抗體包含(i)包含SEQ ID NO：1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：2之HCDR 2及SEQ ID NO：3之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：5之LCDR 2及SEQ ID NO：6之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)； (ii)包含SEQ ID NO：9之HCDR 1、SEQ ID NO：10之HCDR 2及SEQ ID NO：11之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：12之LCDR 1、SEQ ID NO：13之LCDR 2及SEQ ID NO：14之LCDR 3的VL；(iii)包含SEQ ID NO：17之HCDR 1、SEQ ID NO：18之HCDR 2及SEQ ID NO：19之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：20之LCDR 1、SEQ ID NO：21之LCDR 2及SEQ ID NO：22之LCDR 3的VL；(iv)包含SEQ ID NO：25之HCDR 1、SEQ ID NO：26之HCDR 2及SEQ ID NO：27之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：28之LCDR 1、SEQ ID NO：29之LCDR 2及SEQ ID NO：30之LCDR 3的VL；(v)包含SEQ ID NO：33之HCDR 1、SEQ ID NO：34之HCDR 2及SEQ ID NO：35之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：36之LCDR 1、SEQ ID NO：37之LCDR 2及SEQ ID NO：38之LCDR 3的VL；(vi)包含SEQ ID NO：41之HCDR 1、SEQ ID NO：42之HCDR 2及SEQ ID NO：43之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：44之LCDR 1、SEQ ID NO：45之LCDR 2及SEQ ID NO：46之LCDR 3的VL；(vii)包含SEQ ID NO：49之HCDR 1、SEQ ID NO：50之HCDR 2及SEQ ID NO：51之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：52之LCDR 1、SEQ ID NO：53之LCDR 2及SEQ ID NO：54之LCDR 3的VL；(viii)包含SEQ ID NO：57之HCDR 1、SEQ ID NO：58之HCDR 2及SEQ ID NO：59之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：60之LCDR 1、SEQ ID NO：61之LCDR 2及SEQ ID NO：62之LCDR 3的VL；或(ix)包含SEQ ID NO：65之HCDR 1、SEQ ID NO：66之HCDR 2及SEQ ID NO：67之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：68之LCDR 1、SEQ ID NO： 69之LCDR 2及SEQ ID NO：70之LCDR 3的VL。
在一個特定實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：1之HCDR 1、SEQ ID NO：2之HCDR 2及SEQ ID NO：3之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：4之LCDR 1、SEQ ID NO：5之LCDR 2及SEQ ID NO：6之LCDR 3的VL。
在另一個實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：9之HCDR 1、SEQ ID NO：10之HCDR 2及SEQ ID NO：11之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：12之LCDR 1、SEQ ID NO：13之LCDR 2及SEQ ID NO：14之LCDR 3的VL。
在另一實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：17之HCDR 1、SEQ ID NO：18之HCDR 2及SEQ ID NO：19之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：20之LCDR 1、SEQ ID NO：21之LCDR 2及SEQ ID NO：22之LCDR 3的VL。
在再另一實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：25之HCDR 1、SEQ ID NO：26之HCDR 2及SEQ ID NO：27之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：28之LCDR 1、SEQ ID NO：29之LCDR 2及SEQ ID NO：30之LCDR 3的VL。
在一些實施例中，抗體為人類抗體。在一個實施例中，VH為人類VH，且/或VL為人類VL。在一個實施例中，抗體包含如任一上文實施例中之CDR，且進一步包含人類構架，例如人類免疫球蛋白構架。
在一個實施例中，抗體包含(i)包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：8之胺基酸序 列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(ii)包含與SEQ ID NO：15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(iii)包含與SEQ ID NO：23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(iv)包含與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(v)包含與SEQ ID NO：39之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：40之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(vi)包含與SEQ ID NO：47之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：48之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(vii)包含與SEQ ID NO：55之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：56之胺 基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(viii)包含與SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；或(ix)包含與SEQ ID NO：71之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：72之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在一個特定實施例中，抗體包含有包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在另一個實施例中，抗體包含有包含與SEQ ID NO：15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在另一實施例中，抗體包含有包含與SEQ ID NO：23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在再另一實施例中，抗體包含有包含與SEQ ID NO：31之胺 基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在一個實施例中，抗體包含(i)與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(ii)與SEQ ID NO：15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(iii)與SEQ ID NO：23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(iv)與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(v)與SEQ ID NO：39之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：40之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(vi)與SEQ ID NO：47之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：48之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(vii)與SEQ ID NO：55之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、 99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：56之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(viii)與SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；或(ix)與SEQ ID NO：71之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：72之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。
在一個特定實施例中，抗體包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。
在另一個實施例中，抗體包含與SEQ ID NO：15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。
在另一實施例中，抗體包含與SEQ ID NO：23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。
在再另一實施例中，抗體包含與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致 的VL序列。
在某些實施例中，具有至少95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH或VL序列含有相對於參考序列之取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗體保留結合於HLA-A2/WT1之能力。在某些實施例中，在VH(SEQ ID NO：7、15、23、31、39、47、55、63或71)中，總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失，且/或在VL(SEQ ID NO：8、16、24、32、40、48、56、64或72)中，總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外側之區中(亦即，在FR中)。視情況，抗體包含上文所指示之VH序列及/或VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。
在一個實施例中，抗體包含(i)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的VL；(ii)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的VL；(iii)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的VL；(iv)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的VL；(v)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的VL；(vi)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的VL； (vii)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列的VL；(viii)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的VL；或(ix)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的VL。
在一個實施例中，抗體包含(i)SEQ ID NO：7之VH序列，及SEQ ID NO：8之VL序列；(ii)SEQ ID NO：15之VH序列，及SEQ ID NO：16之VL序列；(iii)SEQ ID NO：23之VH序列，及SEQ ID NO：24之VL序列；(iv)SEQ ID NO：31之VH序列，及SEQ ID NO：32之VL序列；(v)SEQ ID NO：39之VH序列，及SEQ ID NO：40之VL序列；(vi)SEQ ID NO：47之VH序列，及SEQ ID NO：48之VL序列；(vii)SEQ ID NO：55之VH序列，及SEQ ID NO：56之VL序列；(viii)SEQ ID NO：63之VH序列，及SEQ ID NO：64之VL序列；或(ix)SEQ ID NO：71之VH序列，及SEQ ID NO：72之VL序列。
在一個特定實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的VL。
在另一個實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的VL。
在另一實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的VL。
在再另一實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO：31之胺基 酸序列的VH及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的VL。
在一個特定實施例中，抗體包含SEQ ID NO：7之VH序列及SEQ ID NO：8之VL序列。
在另一個實施例中，抗體包含SEQ ID NO：15之VH序列及SEQ ID NO：16之VL序列。
在另一實施例中，抗體包含SEQ ID NO：23之VH序列及SEQ ID NO：24之VL序列。
在再另一實施例中，抗體包含SEQ ID NO：31之VH序列及SEQ ID NO：32之VL序列。
在一個實施例中，抗體包含人類恆定區。在一個實施例中，抗體為包含人類恆定區之免疫球蛋白分子，特定言之，包含人類CH1、CH2、CH3及/或CL域之IgG類免疫球蛋白分子。人類恆定域之例示性序列在SEQ ID NO 112及113(分別為人類κ及λ CL域)及SEQ ID NO：114(人類IgG1重鏈恆定域CH1-CH2-CH3)中給出。在一些實施例中，抗體包含有包含與SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：113之胺基酸序列，特定言之與SEQ ID NO：112之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的輕鏈恆定區。在一些實施例中，抗體包含有包含與SEQ ID NO：114之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的重鏈恆定區。特定言之，如本文所描述，重鏈恆定區可包含Fc域中之胺基酸突變。
在一個實施例中，抗體為單株抗體。
在一個實施例中，抗體為IgG抗體，特定言之，IgG1抗體。在一個實施例中，抗體為全長抗體。
在一個實施例中，抗體包含Fc域，特定言之，IgG Fc域，更特定言之，IgG1 Fc域。在一個實施例中，Fc域為人類Fc域。抗體之Fc域可單獨或組合地併有本文與本發明雙特異性抗原結合分子之Fc域相關描述的任一特徵。
在另一個實施例中，抗體為選自Fv分子、scFv分子、Fab分子及F(ab')2分子之群的抗體片段；特定言之，Fab分子。在另一實施例中，抗體片段為雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體。
在另一態樣中，根據任一上文實施例之抗體可單獨或組合地併有如下文各部分中所描述之任一特徵。
糖基化變異體
在某些實施例中，對本文所提供之抗體進行改變以增加或降低該抗體經糖基化之程度。向抗體中添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點來便利地實現。
在抗體包含Fc區之情況下，可改變附接於其上之寡醣。由哺乳動物細胞產生之原生抗體通常包含分支鏈雙觸角寡醣，其一般藉由N鍵附接於Fc區之CH2域的Asn297上。參見例如Wright等人TIBTECH 15：26-32(1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及附接於雙觸角寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc上的海藻糖。在一些實施例中，可對本發明之抗體中的寡醣進行修飾以便產生具有某些改良之特性的抗體變異體。
在一個實施例中，提供具有非海藻糖基化寡醣之抗體變異 體，亦即，缺少(直接地或間接)附接於Fc區上之海藻糖的寡醣結構。特定言之，此類非海藻糖基化寡醣(亦稱作「無海藻糖基化」寡醣)為缺少附接於雙觸角寡醣結構之主幹中之第一GlcNAc上的海藻糖殘基的N鍵聯之寡醣。在一個實施例中，提供Fc區中之非海藻糖基化寡醣之比例相比於原生或親本抗體增加的抗體變異體。舉例而言，非海藻糖基化寡醣之比例可為至少約20%、至少約40%、至少約60%、至少約80%或甚至約100%(亦即，不存在海藻糖基化寡醣)。非海藻糖基化寡醣之百分比為如例如WO 2006/082515中所描述，如藉由MALDI-TOF質譜分析所量測，相對於附接於Asn 297上之所有寡醣(例如複合、雜交及高甘露糖結構)的總和，不含海藻糖殘基之寡醣的(平均)量。Asn297係指位於Fc區中之約位置297處的天冬醯胺殘基(Fc區殘基之EU編號)；然而，歸因於抗體中之輕微序列變化，Asn297亦可位於位置297上游或下游之約±3個胺基酸處，亦即，處於位置294與300之間。Fc區中之非海藻糖基化寡醣之比例增加的此類抗體可具有FcγRIIIa受體結合改良及/或效應功能改良，尤其ADCC功能改良。參見例如US 2003/0157108；US 2004/0093621。
能夠產生海藻糖基化減少之抗體的細胞株之實例包括缺乏蛋白質海藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；US 2003/0157108及WO 2004/056312，尤其在實例11處)，及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因、FUT8、基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614-622(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；以及WO2003/085107)，或者GDP-海藻糖合成或轉運蛋白之活性降低或消除的細胞(參見例如US2004259150、US2005031613、US2004132140、 US2004110282)。
在另一實施例中，提供具有平分寡醣之抗體變異體，例如其中附接於抗體Fc區上之雙觸角寡醣經GlcNAc平分。此類抗體變異體可滿足如上文所描述之海藻糖基化降低及/或ADCC改良。此類抗體變異體之實例描述於例如Umana等人，Nat Biotechnol 17,176-180(1999)；Ferrara等人，Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540、WO 2003/011878中。
亦提供寡醣中之至少一個半乳糖殘基附接於Fc區上的抗體變異體。此類抗體變異體可具有CDC功能改良。此類抗體變異體描述於例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；及WO 1999/22764中。
經半胱胺酸工程改造之抗體變異體
在某些實施例中，可能產生經半胱胺酸工程改造之抗體，例如「硫基單抗」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在於抗體之可達位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基藉此定位於抗體之可達位點處且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生如本文進一步描述之免疫結合物。經半胱胺酸工程改造之抗體可如例如美國專利第7,521,541號、第8,30,930號、第7,855,275號、第9,000,130號或WO2016040856中所描述來產生。
抗體衍生物
在某些實施例中，可對本文所提供之抗體進行進一步修飾以含有此項 技術中已知且可易於獲得之額外非蛋白質部分。適合於抗體衍生化之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為支化或未支化的。附接於抗體上之聚合物的數目可變化，且若附接超過一個聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物的數目及/或類型可基於包括(但不限於)所改良抗體之特定特性或功能、抗體衍生物是否將用於限定條件下之療法等的考慮因素來加以確定。
在另一個實施例中，提供抗體與可藉由暴露於輻射中而選擇性地加熱之非蛋白質部分的結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。輻射可具有任何波長，且包括(但不限於)不損害普通細胞但將非蛋白質部分加熱至殺死抗體-非蛋白質部分近側之細胞之溫度的波長。
免疫結合物
本發明亦提供免疫結合物，其包含如本文所描述之抗HLA-A2/WT1抗體與一或多種治療劑結合(化學鍵結)，該等治療劑諸如細胞毒性劑、化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之蛋白質毒素、酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。
在一個實施例中，免疫結合物為抗體-藥物結合物(ADC)，其中抗體與上文所提及之一或多種治療劑結合。抗體通常使用連接子連接至一或多種該等治療劑。包括治療劑及藥物及連接子之實例的ADC技術之概覽闡述於Pharmacol Review 68：3-19(2016)中。
在另一個實施例中，免疫結合物包含如本文所描述之抗體與酶活性毒素或其片段結合，該酶活性毒素或其片段包括(但不限於)白喉A鏈(diphtheria A chain)、白喉毒素(diphtheria toxin)之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈(ricin A chain)、相思子毒素A鏈(abrin A chain)、莫迪素A鏈(modeccin A chain)、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨(dianthin)蛋白、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯族毒素(tricothecene)。
在另一個實施例中，免疫結合物包含如本文所描述之抗體與放射性原子結合以形成放射性結合物。多種放射性同位素可供用於產生放射性結合物。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。當放射性結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如tc99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，又諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
可使用多種雙功能蛋白質偶合劑製得抗體與細胞毒性劑之 結合物，該等雙功能蛋白質偶合劑諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙功能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所描述來製備。碳14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見WO94/11026。連接子可為促進細胞毒性藥物在細胞中釋放之「可切割連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫鍵連接子(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
本文之免疫結合物或ADC明確涵蓋(但不限於)用交聯試劑製備之此類結合物，該等交聯試劑包括(但不限於)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB，及SVSB(丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，該等交聯試劑可商購(例如購自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
多特異性抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為具有針對至少兩個不同位點(亦即，不同抗原上之不同抗原決定基或同一抗原上之不同抗原決定基)之結合特異性的單株抗體。在某些實施例中，多特異性抗體具有三個或超過三個結合特異性。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對HLA-A2/WT1，且另一個(兩個或超過兩個)特異性係針對任何其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合於HLA-A2/WT1之兩個(或超過兩個)不同抗原決定基。多特異性(例如雙特異性)抗體亦可用於將細胞毒性劑或細胞定位於表現HLA-A2/WT1之細胞。多特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段。
用於製得多特異性抗體之技術包括(但不限於)對具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對進行重組共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))；以及「杵臼結構(knob-in-hole)」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號，及Atwell等人，J.Mol.Biol.270：26(1997))。多特異性抗體亦可藉由以下方式製得：工程改造靜電轉向效應以用於製得抗體Fc異二聚體分子(參見例如WO 2009/089004)；使兩種或超過兩種抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號，及Brennan等人，Science 229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈來產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992)，及WO 2011/034605)；使用共同輕鏈技術以避免輕鏈錯配問題(參見例如WO 98/50431)；使用「雙功能抗體」技術來製得雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；以及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))；以及如例如Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)中所描述製備三 特異性抗體。
本文亦包括具有三個或超過三個抗原結合位點的經工程改造之抗體，包括例如「章魚抗體」或DVD-Ig(參見例如WO 2001/77342及WO 2008/024715)。具有三個或超過三個抗原結合位點之多特異性抗體的其他實例可見於WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO2010/145792及WO 2013/026831中。雙特異性抗體或其抗原結合片段亦包括「雙重作用FAb」或「DAF」，其包含結合於HLA-A2/WT1以及另一個不同抗原或結合於HLA-A2/WT1之兩個不同抗原決定基的抗原結合位點(參見例如US 2008/0069820及WO 2015/095539)。
多特異性抗體亦可以在一或多個具有相同抗原特異性之結合臂中具有結構域交叉的不對稱形式提供，亦即，藉由交換VH/VL域(參見例如WO 2009/080252及WO 2015/150447)、CH1/CL域(參見例如WO 2009/080253)或完整Fab臂(參見例如WO 2009/080251、WO 2016/016299，亦參見Schaefer等人，PNAS,108(2011)1187-1191，及Klein等人，MAbs 8(2016)1010-20)來提供。不對稱Fab臂亦可藉由將帶電或非帶電胺基酸突變引入結構域界面中以導引正確Fab配對來進行工程改造。參見例如WO 2016/172485。
多特異性抗體之各種其他分子形式為此項技術中已知的且包括於本文中(參見例如Spiess等人，Mol Immunol 67(2015)95-106)。
亦包括於本文中的一種特定類型之多特異性抗體為經設計以同時結合於靶細胞(例如腫瘤細胞)上之表面抗原及T細胞受體(TCR)複合物(諸如CD3)之活化性不變組分來再靶向T細胞以殺滅靶細胞的雙特異性抗體。因此，在某些實施例中，本文所提供之抗體為多特異性抗體，特 定言之，雙特異性抗體，其中結合特異性中之一者係針對HLA-A2/WT1且另一者係針對CD3。
可能適用於此目的之雙特異性抗體形式的實例包括(但不限於)所謂的「BiTE」分子(雙特異性T細胞接合分子)，其中兩個scFv分子藉由柔性連接子而融合(參見例如WO2004/106381、WO2005/061547、WO2007/042261及WO2008/119567，Nagorsen及Bäuerle,Exp Cell Res 317,1255-1260(2011))；雙功能抗體(Holliger等人，Prot Eng 9,299-305(1996))及其衍生物，諸如串聯雙功能抗體(「TandAb」；Kipriyanov等人，J Mol Biol 293,41-56(1999))；「DART」(雙重親和力再靶向)分子，其係基於雙功能抗體形式但以用於額外穩定化之C端二硫橋鍵為特徵(Johnson等人，J Mol Biol 399,436-449(2010))，及所謂的三功能單抗(triomab)，其為完全雜合小鼠/大鼠IgG分子(綜述於Seimetz,Cancer Treat Rev 36,458-467(2010)中)。本文所包括之特定T細胞雙特異性抗體形式描述於WO 2013/026833、WO2013/026839、WO 2016/020309；Bacac等人，Oncoimmunology 5(8)(2016)e1203498中。
結合於HLA-A2/WT1及第二抗原之雙特異性抗原結合分子
本發明亦提供一種雙特異性抗原結合分子，亦即，包含能夠特異性結合於兩個不同抗原決定子(第一及第二抗原)之至少兩個抗原結合部分的抗原結合分子。
基於其所研發之HLA-A2/WT1抗體，本發明人已研發出結合於HLA-A2/WT1及另一抗原(特定言之，活化性T細胞抗原，諸如CD3)的雙特異性抗原結合分子。
如實例中所示，此等雙特異性抗原結合分子具有多種出色特性，包括良好功效及低毒性。
因此，在某些態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含(a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，及(b)特異性結合於第二抗原之第二抗原結合部分，其中該雙特異性抗原結合分子具有任一以下特徵。
本發明之雙特異性抗原結合分子特異性誘導T細胞介導的對表現HLA-A2/WT1(亦即，HLA-A2分子與WT1源性肽之複合物)之細胞的殺滅。在一些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子特異性誘導T細胞介導的對表現HLA-A2/WT1RMF(亦即，HLA-A2分子與WT1RMF肽之複合物)之細胞的殺滅。在一個更具體實施例中，雙特異性抗原結合分子特異性誘導T細胞介導的對表現HLA-A2.01/WT1RMF(亦即，HLA-A201分子與WT1RMF肽之複合物)之細胞的殺滅。
在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子對T細胞介導之殺滅的誘導按以下測定：使用HLA-A2/肽(例如WT1RMF或WT1VLD肽)表現性細胞(特定言之，經肽脈衝衝擊之T2細胞)，且在與雙特異性抗原結合分子一起在T細胞存在下培育之後量測來自該等細胞之乳酸脫氫酶(LDH)釋放。
在一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子對T細胞介導之殺滅的誘導如下測定：將T2細胞(ATCC，目錄號CRL-1992)在補充有10% FBS(Gibco，目錄號16140-071)+1%青黴素-鏈黴素(Gibco，目錄號15070-063)之IMDM培養基(Life Technologies之Gibco，目錄號31980-048)(完全培養基)中以106個細胞/毫升製備為細胞懸浮液。將細胞以總體積10ml保持在試管中， 且在37℃與5% CO2下與10μl之10-2M肽(例如WT1 VLD肽(SEQ ID NO：77)或RMF肽(SEQ ID NO：78))(該肽之最終濃度：10-5M)一起培育2小時。泛CD3+細胞純化自藉由Ficoll(GE Healthcare，目錄號17-1440-03)梯度離心自膚色血球層(buffy coat)分離之PBMC。總CD3+ T細胞藉由MACS(Miltenyi Biotec)，使用人類泛T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec，目錄號130-096-535)來純化。細胞毒性分析如下執行：將經肽脈衝衝擊之細胞(100μl)接種至96孔微量滴定圓底培養盤中(3×105個細胞/毫升)，在37℃與5% CO2下，與50μl T細胞(6×106個細胞/毫升)且與50μl經滴定之雙特異性抗原結合分子(例如為40μg/ml至0.00004μg/ml)一起在完全培養基中共同培養18小時。此後，將50μl上清液轉移至新白色培養盤中，且添加每孔25μl CytoTox-Glo螢光素酶分析實驗品(Promega，目錄號G9291)以用於在室溫(RT)下培育15分鐘。藉由EnVision(PerkinElmer)讀取發光信號(用於量測指示細胞死亡之LDH釋放)。資料以相對發光單位(RLU)形式呈現。
本發明之雙特異性抗原結合分子在表現HLA-A2/WT1(亦即，HLA-A2分子與WT1源性肽之複合物)之細胞存在下特異性使T細胞活化。在一些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子在表現HLA-A2/WT1RMF(亦即，HLA-A2分子與WT1RMF肽之複合物)之細胞存在下特異性使T細胞活化。在一個更具體實施例中，雙特異性抗原結合分子在表現HLA-A201/WT1RMF(亦即，HLA-A201分子與WT1RMF肽之複合物)之細胞存在下特異性使T細胞活化。
在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子對T細胞之活化藉由以下來加以測定：在與該雙特異性抗原結合分子一起在HLA-A2/肽(例如WT1RMF或WT1VLD肽)表現性細胞(特定言之，經肽脈衝衝擊之T2細胞)存在 下培育之後，量測(特定言之，藉由流式細胞量測術來量測)T細胞之CD25及/或CD69表現。
在一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子對T細胞之活化如下測定：將T2細胞(ATCC，目錄號CRL-1992)在補充有10% FBS(Gibco，目錄號16140-071)+1%青黴素-鏈黴素(Gibco，目錄號15070-063)之IMDM培養基(Life Technologies之Gibco，目錄號31980-048)(完全培養基)中以106個細胞/毫升製備為細胞懸浮液。將細胞以總體積10ml保持在試管中，且在37℃與5% CO2下與10μl之10-2M肽(例如WT1 VLD肽(SEQ ID NO：77)或RMF肽(SEQ ID NO：78))(該肽之最終濃度：10-5M)一起培育2小時。泛CD3+細胞純化自藉由Ficoll(GE Healthcare，目錄號17-1440-03)梯度離心自膚色血球層(buffy coat)分離之PBMC。總CD3+ T細胞藉由MACS(Miltenyi Biotec)，使用人類泛T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec，目錄號130-096-535)來純化。細胞毒性分析如下執行：將經肽脈衝衝擊之細胞(100μl)接種至96孔微量滴定圓底培養盤中(3×105個細胞/毫升)，在37℃與5% CO2下，與50μl T細胞(6×106個細胞/毫升)且與50μl經滴定之雙特異性抗原結合分子(例如為40μg/ml至0.00004μg/ml)一起在完全培養基中共同培養18小時。在共同培育18小時之後採集細胞，且用針對CD3(Biolegend目錄號300321)、CD25(Biolegend目錄號302606)及CD69(Biolegend目錄號310914)之抗體染色，以藉由流式細胞量測術來量測T細胞活化。
在另一個實施例中，雙特異性抗原結合分子對T細胞之活化使用HLA-A2/肽(例如WT1RMF或WT1VLD肽)表現性細胞(特定言之，經肽脈衝衝擊之T2細胞)及表現由NFAT(活化T細胞之核因子)反應元件驅動之螢 光素酶報導體的報導T細胞株(特定言之Jurkat T細胞株)來加以測定。
在一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子對T細胞之活化如下測定：將T2細胞(ATCC，目錄號CRL-1992)在補充有10% FBS(Gibco，目錄號16140-071)+1%青黴素-鏈黴素(Gibco，目錄號15070-063)之IMDM培養基(Life Technologies之Gibco，目錄號31980-048)(完全培養基)中以106個細胞/毫升製備為細胞懸浮液。將細胞以總體積10ml保持在試管中，且在37℃與5% CO2下與10μl之10-2M肽(例如WT1 VLD肽(SEQ ID NO：77)或RMF肽(SEQ ID NO：78))(該肽之最終濃度：10-5M)一起培育2小時。在洗滌之後，將90μl含2.2×105個細胞/毫升之經肽脈衝衝擊之細胞的細胞懸浮液接種至96孔微量滴定圓底培養盤中(20,000個細胞/孔，TPP，目錄號92097)，在37℃與5% CO2下，與50μl在NFAT啟動子下表現螢光素酶之Jurkat細胞(Jurkat-NFAT；Promega，目錄號CS176501)(2×106個細胞/毫升之細胞懸浮液)且與10μl經滴定之雙特異性抗原結合分子(例如為100μg/ml至0.0064μg/ml於PBS中)共同培養16小時。此後，移除50μl上清液，且用每孔100μl Bright-Glo螢光素酶分析實驗品(Promega，目錄號E2620)置換以用於在室溫(RT)下培育。五分鐘後，將180μl上清液轉移至新白色培養盤中以藉由EnVision(PerkinElmer)量測發光信號。資料以相對發光單位(RLU)形式呈現。
在一個實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子不明顯誘導T細胞介導的對表現單獨HLA-A2(亦即，不具有肽)或具有除WT1源性肽(諸如WT1RMF或WT1VLD)以外之肽之HLA-A2的細胞的殺滅，或不在該等細胞存在下明顯使T細胞活化。
在一個實施例中，雙特異性抗原結合不明顯誘導T細胞介導的對表現不存在WT1源性肽(特定言之，WT1RMF或WT1VLD)之HLA-A2之細胞的殺滅，或不在該等細胞存在下明顯使T細胞活化。在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子誘導T細胞介導的對表現HLA-A2/WT1(具體而言，HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)之細胞的殺滅及/或在該等細胞存在下使T細胞活化的EC50比誘導T細胞介導的對表現不存在WT1源性肽(具體而言，WT1RMF或WT1VLD)之HLA-A2的細胞的殺滅或在該等細胞存在下使T細胞活化的EC50低至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少50、至少75或至少100倍。
在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子誘導T細胞介導的對表現HLA-A2/WT1(具體而言，HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)之細胞的殺滅及/或在該等細胞存在下使T細胞活化，但不明顯誘導T細胞介導的對表現具有選自表5中之肽(SEQ ID NO 79-105之肽)之肽之HLA-A2的細胞的殺滅或不在該等細胞存在下明顯使T細胞活化。在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子誘導T細胞介導的對表現HLA-A2/WT1(具體而言，HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)之細胞的殺滅及/或在該等細胞存在下使T細胞活化，但不明顯誘導T細胞介導的對表現具有表5中之肽(SEQ ID NO 79-105之肽)中之任一者之HLA-A2的細胞的殺滅或不在該等細胞存在下明顯使T細胞活化。
在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子誘導T細胞介導的對表現HLA-A2/WT1(具體而言，HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)之細胞的殺滅及/或在該等細胞存在下使T細胞活化的EC50比誘導T細胞介導的對表現具有選自表5中之肽(SEQ ID NO 79-105之肽)之肽之HLA-A2 的細胞的殺滅或在該等細胞存在下使T細胞活化的EC50低至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少50、至少75或至少100倍。在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子誘導T細胞介導的對表現HLA-A2/WT1(具體而言，HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD)之細胞的殺滅及/或在該等細胞存在下使T細胞活化的EC50比誘導T細胞介導的對表現具有表5中之肽(SEQ ID NO 79-105之肽)中之任一者之HLA-A2的細胞的殺滅或在該等細胞存在下使T細胞活化的EC50低至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少50、至少75或至少100倍。
在一個實施例中，T細胞介導之殺滅的誘導及/或T細胞之活化如上文所描述來加以測定，且EC50在Microsoft® Excel中使用XLfit®加載項(ID Business Solutions,Guildford,UK)來加以計算。
根據本發明之特定實施例，雙特異性抗原結合分子中所包含之抗原結合部分為Fab分子(亦即，由各自包含可變域及恆定域之重鏈及輕鏈構成的抗原結合域)。在一個實施例中，第一及/或第二抗原結合部分為Fab分子。在一個實施例中，該Fab分子為人類Fab分子。在一個特定實施例中，該Fab分子為人類化Fab分子。在又另一個實施例中，該Fab分子包含人類重鏈及輕鏈恆定域。
較佳地，抗原結合部分中之至少一者為互換型Fab分子。此類修飾減少來自不同Fab分子之重鏈及輕鏈的錯配，藉此改良本發明之雙特異性抗原結合分子在重組產生中的產量及純度。在適用於本發明之雙特異性抗原結合分子的特定互換型Fab分子中，Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域(分別為VL及VH)進行交換。然而，即使存在此結構域交換，雙特異性抗原結合分子之製劑仍可包含由於錯配之重鏈與輕鏈之間的所謂的本斯-瓊斯型 (Bence Jones-type)相互作用而產生的某些副產物(參見Schaefer等人，PNAS,108(2011)11187-11191)。為了進一步減少來自不同Fab分子之重鏈及輕鏈的錯配且因此增加所要雙特異性抗原結合分子之純度及產量，如本文進一步描述，可在結合於第一抗原(HLA-A2/WT1)之Fab分子或結合於第二抗原(例如活化性T細胞抗原，諸如CD3)之Fab分子的CH1及CL域中之特定胺基酸位置處引入具有相反電荷之帶電胺基酸。電荷修飾在雙特異性抗原結合分子中所包含之習知Fab分子(諸如在例如圖1 A-C、G-J中所示)中或在雙特異性抗原結合分子中所包含之VH/VL互換型Fab分子(諸如在例如圖1 D-F、K-N中所示)中進行(但不在兩者中進行)。在特定實施例中，電荷修飾在雙特異性抗原結合分子中所包含之習知Fab分子(其在特定實施例中結合於第一抗原，亦即，HLA-A2/WT1)中進行。
在根據本發明之一個特定實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合於第一抗原(亦即，HLA-A2/WT1)及第二抗原(例如活化性T細胞抗原，特定言之，CD3)。在一個實施例中，抗體能夠藉由同時結合HLA-A2/WT1及活化性T細胞抗原來使T細胞及靶細胞交聯。在一個甚至更特定實施例中，此類同時結合引起靶細胞(特定言之，HLA-A2/WT1表現性腫瘤細胞)溶解。在一個實施例中，此類同時結合引起T細胞活化。在其他實施例中，此同時結合引起T淋巴球(特定言之，細胞毒性T淋巴球)之細胞反應，該細胞反應選自以下之群：增殖、分化、細胞介素分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒活性及活化標記物表現。在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子與活化性T細胞抗原(特定言之，CD3)結合而不同時結合於HLA-A2/WT1不會引起T細胞活化。
在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠將T細胞之細 胞毒活性再導引至靶細胞。在一個特定實施例中，該再導引不依賴於MHC介導的靶細胞之肽抗原呈遞及/或T細胞之特異性。
特定言之，根據本發明之任一實施例的T細胞為細胞毒性T細胞。在一些實施例中，T細胞為CD4+或CD8+ T細胞，特定言之，CD8+ T細胞。
第一抗原結合部分
本發明之雙特異性抗原結合分子包含至少一個結合於HLA-A2/WT1(第一抗原)之抗原結合部分，特定言之，Fab分子。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子包含兩個結合於HLA-A2/WT1之抗原結合部分，特定言之，Fab分子。在一個特定此類實施例中，此等抗原結合部分中之每一者均結合於相同抗原決定子。在一個甚至更特定實施例中，所有此等抗原結合部分均完全相同，亦即，如本文所描述，其包含相同胺基酸序列，包括在CH1及CL域中之相同胺基酸取代(若存在)。在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子包含不超過兩個結合於HLA-A2/WT1之抗原結合部分，特定言之，Fab分子。
在特定實施例中，結合於HLA-A2/WT1之抗原結合部分為習知Fab分子。在此類實施例中，結合於第二抗原之抗原結合部分為如本文所描述之互換型Fab分子，亦即，其中Fab重鏈與輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL進行交換/相互置換的Fab分子。
在替代性實施例中，結合於HLA-A2/WT1之抗原結合部分為如本文所描述之互換型Fab分子，亦即，其中Fab重鏈與輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL進行交換/相互置換的Fab分子。在此類實施例中， 結合第二抗原之抗原結合部分為習知Fab分子。
HLA-A2/WT1結合部分能夠將雙特異性抗原結合分子導引至靶位點，例如導引至表現HLA-A2/WT1的特定類型之腫瘤細胞。
除非科學上明確不合理或不可能，否則雙特異性抗原結合分子之第一抗原結合部分可單獨或組合地併有本文與結合HLA-A2/WT1之抗體相關描述的任一特徵。
因此，在一個態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含(a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，且該第一抗原結合部分包含(i)包含SEQ ID NO：1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：2之HCDR 2及SEQ ID NO：3之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：5之LCDR 2及SEQ ID NO：6之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)；(ii)包含SEQ ID NO：9之HCDR 1、SEQ ID NO：10之HCDR 2及SEQ ID NO：11之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：12之LCDR 1、SEQ ID NO：13之LCDR 2及SEQ ID NO：14之LCDR 3的VL；(iii)包含SEQ ID NO：17之HCDR 1、SEQ ID NO：18之HCDR 2及SEQ ID NO：19之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：20之LCDR 1、SEQ ID NO：21之LCDR 2及SEQ ID NO：22之LCDR 3的VL；(iv)包含SEQ ID NO：25之HCDR 1、SEQ ID NO：26之HCDR 2及SEQ ID NO：27之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：28之LCDR 1、SEQ ID NO：29之LCDR 2及SEQ ID NO：30之LCDR 3的VL；(v)包含SEQ ID NO：33之HCDR 1、SEQ ID NO：34之HCDR 2及SEQ ID NO：35之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：36之LCDR 1、SEQ ID NO：37之LCDR 2及SEQ ID NO：38之LCDR 3的VL；(vi)包含SEQ ID NO：41之HCDR 1、SEQ ID NO：42之HCDR 2及SEQ ID NO：43之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：44之LCDR 1、SEQ ID NO：45之LCDR 2及SEQ ID NO：46之LCDR 3的VL；(vii)包含SEQ ID NO：49之HCDR 1、SEQ ID NO：50之HCDR 2及SEQ ID NO：51之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：52之LCDR 1、SEQ ID NO：53之LCDR 2及SEQ ID NO：54之LCDR 3的VL；(viii)包含SEQ ID NO：57之HCDR 1、SEQ ID NO：58之HCDR 2及SEQ ID NO：59之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：60之LCDR 1、SEQ ID NO：61之LCDR 2及SEQ ID NO：62之LCDR 3的VL；或(ix)包含SEQ ID NO：65之HCDR 1、SEQ ID NO：66之HCDR 2及SEQ ID NO：67之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：68之LCDR 1、SEQ ID NO：69之LCDR 2及SEQ ID NO：70之LCDR 3的VL，及(b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分。
在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：1之HCDR 1、SEQ ID NO：2之HCDR 2及SEQ ID NO：3之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：4之LCDR 1、SEQ ID NO：5之LCDR 2及SEQ ID NO：6之LCDR 3的VL。
在另一個實施例中，第一抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：9之HCDR 1、SEQ ID NO：10之HCDR 2及SEQ ID NO：11之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：12之LCDR 1、SEQ ID NO：13之LCDR 2及SEQ ID NO：14之LCDR 3的VL。
在另一實施例中，第一抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：17之HCDR 1、SEQ ID NO：18之HCDR 2及SEQ ID NO：19之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：20之LCDR 1、SEQ ID NO：21之LCDR 2及SEQ ID NO：22之LCDR 3的VL。
在再另一實施例中，第一抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：25之HCDR 1、SEQ ID NO：26之HCDR 2及SEQ ID NO：27之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：28之LCDR 1、SEQ ID NO：29之LCDR 2及SEQ ID NO：30之LCDR 3的VL。
在一些實施例中，第一抗原結合部分為(來源於)人類抗體。在一個實施例中，VH為人類VH，且/或VL為人類VL。在一個實施例中，第一抗原結合部分包含如任一上文實施例中之CDR，且進一步包含人類構架，例如人類免疫球蛋白構架。
在一個實施例中，第一抗原結合部分包含(i)包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(ii)包含與SEQ ID NO：15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(iii)包含與SEQ ID NO：23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列 的VL；(iv)包含與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(v)包含與SEQ ID NO：39之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：40之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(vi)包含與SEQ ID NO：47之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：48之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(vii)包含與SEQ ID NO：55之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：56之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(viii)包含與SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；或(ix)包含與SEQ ID NO：71之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：72之胺 基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含有包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在另一個實施例中，第一抗原結合部分包含有包含與SEQ ID NO：15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在另一實施例中，第一抗原結合部分包含有包含與SEQ ID NO：23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在再另一實施例中，第一抗原結合部分包含有包含與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。在一個實施例中，第一抗原結合部分包含(i)與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(ii)與SEQ ID NO：15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、 99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(iii)與SEQ ID NO：23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(iv)與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(v)與SEQ ID NO：39之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：40之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(vi)與SEQ ID NO：47之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：48之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(vii)與SEQ ID NO：55之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：56之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(viii)與SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；或(ix)與SEQ ID NO：71之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：72之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。
在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。
在另一個實施例中，第一抗原結合部分包含與SEQ ID NO：15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。
在另一實施例中，第一抗原結合部分包含與SEQ ID NO：23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。
在再另一實施例中，第一抗原結合部分包含與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。
在一個實施例中，第一抗原結合部分包含(i)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的VL；(ii)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的VL；(iii)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的VL； (iv)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的VL；(v)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的VL；(vi)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的VL；(vii)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列的VL；(viii)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的VL；或(ix)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的VL。
在一個實施例中，第一抗原結合部分包含(i)SEQ ID NO：7之VH序列，及SEQ ID NO：8之VL序列；(ii)SEQ ID NO：15之VH序列，及SEQ ID NO：16之VL序列；(iii)SEQ ID NO：23之VH序列，及SEQ ID NO：24之VL序列；(iv)SEQ ID NO：31之VH序列，及SEQ ID NO：32之VL序列；(v)SEQ ID NO：39之VH序列，及SEQ ID NO：40之VL序列；(vi)SEQ ID NO：47之VH序列，及SEQ ID NO：48之VL序列；(vii)SEQ ID NO：55之VH序列，及SEQ ID NO：56之VL序列；(viii)SEQ ID NO：63之VH序列，及SEQ ID NO：64之VL序列；或(ix)SEQ ID NO：71之VH序列，及SEQ ID NO：72之VL序列。
在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的VL。
在另一個實施例中，第一抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的VL。
在另一實施例中，第一抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的VL。
在再另一實施例中，第一抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的VL。
在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：7之VH序列及SEQ ID NO：8之VL序列。
在另一個實施例中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：15之VH序列及SEQ ID NO：16之VL序列。
在另一實施例中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：23之VH序列及SEQ ID NO：24之VL序列。
在再另一實施例中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO：31之VH序列及SEQ ID NO：32之VL序列。
在一個實施例中，第一抗原結合部分包含人類恆定區。在一個實施例中，第一抗原結合部分為包含人類恆定區(特定言之，人類CH1及/或CL域)的Fab分子。人類恆定域之例示性序列在SEQ ID NO 112及113(分別為人類κ及λ CL域)及SEQ ID NO：114(人類IgG1重鏈恆定域CH1-CH2-CH3)中給出。在一些實施例中，第一抗原結合部分包含有包含與SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：113之胺基酸序列，特定言之與SEQ ID NO：112之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的輕鏈恆定區。特定言之，輕鏈恆定區可包含如本文在「電 荷修飾」下所描述之胺基酸突變，且/或可包含互換型Fab分子中之一或多個(特定言之，兩個)N端胺基酸的缺失或取代。在一些實施例中，第一抗原結合部分包含有包含與SEQ ID NO：114之胺基酸序列中所包含之CH1域序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的重鏈恆定區。特定言之，重鏈恆定區(具體而言，CH1域)可包含如本文在「電荷修飾」下所描述之胺基酸突變。
第二抗原結合部分
本發明之雙特異性抗原結合分子包含至少一個結合於第二抗原(與HLA-A2/WT1不同)之抗原結合部分，特定言之，Fab分子。
在特定實施例中，結合第二抗原之抗原結合部分為如本文所描述之互換型Fab分子，亦即，其中Fab重鏈與輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL進行交換/相互置換的Fab分子。在此類實施例中，結合於第一抗原(亦即，HLA-A2/WT1)之抗原結合部分較佳為習知Fab分子。在其中存在超過一個抗原結合部分(特定言之，Fab分子)結合於雙特異性抗原結合分子中所包含之HLA-A2/WT1的實施例中，結合於第二抗原之抗原結合部分較佳為互換型Fab分子，且結合於HLA-A2/WT1之抗原結合部分為習知Fab分子。
在替代性實施例中，結合於第二抗原之抗原結合部分為習知Fab分子。在此類實施例中，結合於第一抗原(亦即，HLA-A2/WT1)之抗原結合部分為如本文所描述之互換型Fab分子，亦即，其中Fab重鏈與輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL進行交換/相互置換的Fab分子。在其中存在超過一個抗原結合部分(特定言之，Fab分子)結合於雙特異性抗原結 合分子中所包含之第二抗原的實施例中，結合於HLA-A2/WT1之抗原結合部分較佳為互換型Fab分子，且結合於第二抗原之抗原結合部分為習知Fab分子。
在一些實施例中，第二抗原為活化性T細胞抗原(在本文中亦稱為「活化性T細胞抗原結合部分，或活化性T細胞抗原結合Fab分子」)。在一個特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含不超過一個能夠特異性結合於活化性T細胞抗原之抗原結合部分。在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子提供與活化性T細胞抗原之單價結合。
在特定實施例中，第二抗原為CD3，特定言之，人類CD3(SEQ ID NO：107)或食蟹獼猴CD3(SEQ ID NO：108)，最特定言之，人類CD3。在一個實施例中，第二抗原結合部分對人類及食蟹獼猴CD3具有交叉反應性(亦即，特異性結合於人類及食蟹獼猴CD3)。在一些實施例中，第二抗原為CD3之ε次單元(CD3ε)。
在一個實施例中，第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：115之HCDR 1、SEQ ID NO：116之HCDR 2、SEQ ID NO：117之HCDR 3、SEQ ID NO：118之LCDR 1、SEQ ID NO：119之LCDR 2及SEQ ID NO：120之LCDR 3。
在一個實施例中，第二抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：115之HCDR 1、SEQ ID NO：116之HCDR 2及SEQ ID NO：117之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：118之LCDR 1、SEQ ID NO：119之LCDR 2及SEQ ID NO：120之LCDR 3的VL。
在一些實施例中，第二抗原結合部分為(來源於)人類化抗體。在一個實施例中，VH為人類化VH，且/或VL為人類化VL。在一個實 施例中，第二抗原結合部分包含如任一上文實施例中之CDR，且進一步包含接受體人類構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。
在一個實施例中，第二抗原結合部分包含與SEQ ID NO：121之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含與SEQ ID NO：122之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。
在一個實施例中，第二抗原結合部分包含與SEQ ID NO：121之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：122之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。
在一個實施例中，第二抗原結合部分之VH包含與SEQ ID NO：121之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，且第二抗原結合部分之VL包含與SEQ ID NO：122之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在一個實施例中，第二抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：121之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：122之胺基酸序列的VL。
在一個實施例中，第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：121之VH序列，及SEQ ID NO：122之VL序列。
在一個特定實施例中，第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：130之HCDR 1、SEQ ID NO：131之HCDR 2、SEQ ID NO：132之HCDR 3、SEQ ID NO：133之LCDR 1、SEQ ID NO：134之LCDR 2及SEQ ID NO：135之LCDR 3。
在另一個特定實施例中，第二抗原結合部分包含有包含 SEQ ID NO：130之HCDR 1、SEQ ID NO：131之HCDR 2及SEQ ID NO：132之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：133之LCDR 1、SEQ ID NO：134之LCDR 2及SEQ ID NO：135之LCDR 3的VL。
在一些實施例中，第二抗原結合部分為(來源於)人類化抗體。在一個實施例中，VH為人類化VH，且/或VL為人類化VL。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含如任一上文實施例中之CDR，且進一步包含接受體人類構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。
在一個實施例中，第二抗原結合部分包含與SEQ ID NO：136之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含與SEQ ID NO：137之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。
在一個特定實施例中，第二抗原結合部分包含與SEQ ID NO：136之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：137之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。
在另一個特定實施例中，第二抗原結合部分之VH包含與SEQ ID NO：136之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，及第二抗原結合部分之VL包含與SEQ ID NO：137之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在一個實施例中，第二抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列的VL。
在一個實施例中，第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：136 之VH序列，及SEQ ID NO：137之VL序列。
在一個實施例中，第二抗原結合部分包含人類恆定區。在一個實施例中，第二抗原結合部分為包含人類恆定區(特定言之，人類CH1及/或CL域)的Fab分子。人類恆定域之例示性序列在SEQ ID NO 112及113(分別為人類κ及λ CL域)及SEQ ID NO：114(人類IgG1重鏈恆定域CH1-CH2-CH3)中給出。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含有包含與SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：113之胺基酸序列，特定言之與SEQ ID NO：112之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的輕鏈恆定區。特定言之，輕鏈恆定區可包含如本文在「電荷修飾」下所描述之胺基酸突變，且/或可包含互換型Fab分子中之一或多個(特定言之，兩個)N端胺基酸的缺失或取代。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含有包含與SEQ ID NO：114之胺基酸序列中所包含之CH1域序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的重鏈恆定區。特定言之，重鏈恆定區(具體而言，CH1域)可包含如本文在「電荷修飾」下所描述之胺基酸突變。
在一些實施例中，第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1(特定言之，可變域VL及VH)進行相互置換的Fab分子(亦即，根據此類實施例，第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域或恆定域進行交換的互換型Fab分子)。在一個此類實施例中，第一(及若存在，第三)抗原結合部分為習知Fab分子。
在一個實施例中，不超過一個結合於第二抗原(例如活化性T細胞抗原，諸如CD3)之抗原結合部分存在於雙特異性抗原結合分子中(亦即，雙特異性抗原結合分子提供與第二抗原之單價結合)。
電荷修飾
本發明之雙特異性抗原結合分子可包含存在於其中所包含之Fab分子中的胺基酸取代，該等胺基酸取代尤其高效地減少輕鏈與不匹配重鏈之錯配(本斯-瓊斯型副產物)，其可在產生基於Fab之雙特異性/多特異性抗原結合分子時發生，該等分子在其結合臂中之一者(或在分子包含超過兩個抗原結合性Fab分子的情況下，多者)中存在VH/VL交換(亦參見PCT公開案第WO 2015/150447號，尤其其中之實例，該案以全文引用之方式併入本文中)。所要雙特異性抗原結合分子與非所要副產物(尤其，存在於雙特異性抗原結合分子中之本斯-瓊斯型副產物，該等分子在其結合臂中之一者中存在VH/VL域交換)相比的比率可藉由在CH1及CL域中之特定胺基酸位置處引入具有相反電荷之帶電胺基酸(在本文中有時稱為「電荷修飾」)而改良。
因此，在其中雙特異性抗原結合分子之第一及第二抗原結合部分均為Fab分子且在抗原結合部分中之一者(特定言之，第二抗原結合部分)中，Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH進行相互置換的一些實施例中，i)在第一抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經帶正電胺基酸取代(根據Kabat編號)，且其中在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸經帶負電胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)；或ii)在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經帶正電胺基酸取代(根據Kabat編號)，且其中在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸經帶負電胺基酸取代(根據 Kabat EU索引編號)。
雙特異性抗原結合分子不同時包含i)及ii)項下所提及之兩種修飾。具有VH/VL交換之抗原結合部分的恆定域CL及CH1不相互置換(亦即，保持不交換)。
在一個更具體實施例中，i)在第一抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；或ii)在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個此類實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個特定實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域CL 中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個更特定實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個甚至更特定實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在特定實施例中，若根據上文實施例之胺基酸取代在第一抗原結合部分之恆定域CL及恆定域CH1中進行，則第一抗原結合部分之恆定域CL具有κ同型。
或者，根據上文實施例之胺基酸取代可在第二抗原結合部分之恆定域CL及恆定域CH1中進行，而非在第一抗原結合部分之恆定域CL及恆定域CH1中進行。在特定此類實施例中，第二抗原結合部分之恆定域CL具有κ同型。
因此，在一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在再另一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺 基酸經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含(a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，具體而言，HLA-A2/WT1RMF，且該第一抗原結合部分為以下Fab分子，其包含有包含SEQ ID NO：1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：2之HCDR 2及SEQ ID NO：3之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：5之LCDR 2及SEQ ID NO：6之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)，及(b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH進行相互置換的Fab分子；其中在第一抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個特定實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且位置123處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個特定實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含 (a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，具體而言，HLA-A2/WT1RMF，且該第一抗原結合部分為以下Fab分子，其包含有包含SEQ ID NO：9之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：10之HCDR 2及SEQ ID NO：11之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：12之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：13之LCDR 2及SEQ ID NO：14之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)，及(b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH進行相互置換的Fab分子；其中在第一抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個特定實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且位置123處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個特定實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
雙特異性抗原結合分子形式
根據本發明之雙特異性抗原結合分子的組分可以多種組態彼此融合。例示性組態描繪於圖1中。
在特定實施例中，雙特異性抗原結合分子中所包含之抗原結合部分為Fab分子。在此類實施例中，第一、第二、第三抗原結合部分等在本文中可分別稱為第一、第二、第三Fab分子等。
在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子之第一及第二抗原結合部分彼此融合，視情況經由肽連接子而融合。在特定實施例中，第一及第二抗原結合部分各自為Fab分子。在一個此類實施例中，第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。在另一個此類實施例中，第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。在其中(i)第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合或(ii)第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合的實施例中，另外，第一抗原結合部分之Fab輕鏈及第二抗原結合部分之Fab輕鏈可彼此融合，視情況經由肽連接子而融合。
具有能夠能夠特異性結合於靶細胞抗原(諸如HLA-A2/WT1)之單個抗原結合部分(諸如Fab分子)的雙特異性抗原結合分子(例如，如圖1A、D、G、H、K、L中所示)適用，特定言之，在預期靶細胞抗原在高親和性抗原結合部分結合之後發生內化的情況下適用。在此類情況下，存在超過一個對靶細胞抗原具有特異性之抗原結合部分可增強靶細胞抗原之內化，藉此降低其可用性。
然而，在其他情況下，有利的是具有包含兩個或超過兩個對靶細胞抗原具有特異性之抗原結合部分(諸如Fab分子)的雙特異性抗原結合分子(參見圖1B、1C、1E、1F、1I、1J、1M或1N中所示之實例)，以例如使對靶位點之靶向最佳化或允許靶細胞抗原之交聯。
因此，在特定實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含第三抗原結合部分。
在一個實施例中，第三抗原結合部分結合於第一抗原，亦 即，HLA-A2/WT1。在一個實施例中，第三抗原結合部分為Fab分子。
在特定實施例中，第三抗原部分與第一抗原結合部分完全相同。
除非科學上明確不合理或不可能，否則雙特異性抗原結合分子之第三抗原結合部分可單獨或組合地併有本文與第一抗原結合部分及/或結合HLA-A2/WT1之抗體相關描述的任一特徵。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含(i)包含SEQ ID NO：1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：2之HCDR 2及SEQ ID NO：3之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：5之LCDR 2及SEQ ID NO：6之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)；(ii)包含SEQ ID NO：9之HCDR 1、SEQ ID NO：10之HCDR 2及SEQ ID NO：11之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：12之LCDR 1、SEQ ID NO：13之LCDR 2及SEQ ID NO：14之LCDR 3的VL；(iii)包含SEQ ID NO：17之HCDR 1、SEQ ID NO：18之HCDR 2及SEQ ID NO：19之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：20之LCDR 1、SEQ ID NO：21之LCDR 2及SEQ ID NO：22之LCDR 3的VL；(iv)包含SEQ ID NO：25之HCDR 1、SEQ ID NO：26之HCDR 2及SEQ ID NO：27之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：28之LCDR 1、SEQ ID NO：29之LCDR 2及SEQ ID NO：30之LCDR 3的VL；(v)包含SEQ ID NO：33之HCDR 1、SEQ ID NO：34之HCDR 2及SEQ ID NO：35之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：36之LCDR 1、SEQ ID NO：37之LCDR 2及SEQ ID NO：38之LCDR 3的VL； (vi)包含SEQ ID NO：41之HCDR 1、SEQ ID NO：42之HCDR 2及SEQ ID NO：43之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：44之LCDR 1、SEQ ID NO：45之LCDR 2及SEQ ID NO：46之LCDR 3的VL；(vii)包含SEQ ID NO：49之HCDR 1、SEQ ID NO：50之HCDR 2及SEQ ID NO：51之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：52之LCDR 1、SEQ ID NO：53之LCDR 2及SEQ ID NO：54之LCDR 3的VL；(viii)包含SEQ ID NO：57之HCDR 1、SEQ ID NO：58之HCDR 2及SEQ ID NO：59之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：60之LCDR 1、SEQ ID NO：61之LCDR 2及SEQ ID NO：62之LCDR 3的VL；或(ix)包含SEQ ID NO：65之HCDR 1、SEQ ID NO：66之HCDR 2及SEQ ID NO：67之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：68之LCDR 1、SEQ ID NO：69之LCDR 2及SEQ ID NO：70之LCDR 3的VL。
在一個特定實施例中，第三抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：1之HCDR 1、SEQ ID NO：2之HCDR 2及SEQ ID NO：3之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：4之LCDR 1、SEQ ID NO：5之LCDR 2及SEQ ID NO：6之LCDR 3的VL。
在另一個實施例中，第三抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：9之HCDR 1、SEQ ID NO：10之HCDR 2及SEQ ID NO：11之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：12之LCDR 1、SEQ ID NO：13之LCDR 2及SEQ ID NO：14之LCDR 3的VL。
在另一實施例中，第三抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：17之HCDR 1、SEQ ID NO：18之HCDR 2及SEQ ID NO：19之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：20之LCDR 1、SEQ ID NO：21之LCDR 2及 SEQ ID NO：22之LCDR 3的VL。
在再另一實施例中，第三抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：25之HCDR 1、SEQ ID NO：26之HCDR 2及SEQ ID NO：27之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：28之LCDR 1、SEQ ID NO：29之LCDR 2及SEQ ID NO：30之LCDR 3的VL。
在一些實施例中，第三抗原結合部分為(來源於)人類抗體。在一個實施例中，VH為人類VH，且/或VL為人類VL。在一個實施例中，第三抗原結合部分包含如任一上文實施例中之CDR，且進一步包含人類構架，例如人類免疫球蛋白構架。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含(i)包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(ii)包含與SEQ ID NO：15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(iii)包含與SEQ ID NO：23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(iv)包含與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：32之胺 基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(v)包含與SEQ ID NO：39之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：40之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(vi)包含與SEQ ID NO：47之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：48之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(vii)包含與SEQ ID NO：55之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：56之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；(viii)包含與SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；或(ix)包含與SEQ ID NO：71之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：72之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在一個特定實施例中，第三抗原結合部分包含有包含與 SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在另一個實施例中，第三抗原結合部分包含有包含與SEQ ID NO：15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在另一實施例中，第三抗原結合部分包含有包含與SEQ ID NO：23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在再另一實施例中，第三抗原結合部分包含有包含與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含(i)與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(ii)與SEQ ID NO：15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(iii)與SEQ ID NO：23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、 99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(iv)與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(v)與SEQ ID NO：39之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：40之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(vi)與SEQ ID NO：47之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：48之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(vii)與SEQ ID NO：55之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：56之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；(viii)與SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列；或(ix)與SEQ ID NO：71之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：72之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。
在一個特定實施例中，第三抗原結合部分包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、 99%或100%一致的VL序列。
在另一個實施例中，第三抗原結合部分包含與SEQ ID NO：15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。
在另一實施例中，第三抗原結合部分包含與SEQ ID NO：23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。
在再另一實施例中，第三抗原結合部分包含與SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO：32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含(i)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的VL；(ii)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的VL；(iii)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的VL；(iv)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的VL；(v)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：40 之胺基酸序列的VL；(vi)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的VL；(vii)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列的VL；(viii)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的VL；或(ix)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的VH，及包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的VL。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含(i)SEQ ID NO：7之VH序列，及SEQ ID NO：8之VL序列；(ii)SEQ ID NO：15之VH序列，及SEQ ID NO：16之VL序列；(iii)SEQ ID NO：23之VH序列，及SEQ ID NO：24之VL序列；(iv)SEQ ID NO：31之VH序列，及SEQ ID NO：32之VL序列；(v)SEQ ID NO：39之VH序列，及SEQ ID NO：40之VL序列；(vi)SEQ ID NO：47之VH序列，及SEQ ID NO：48之VL序列；(vii)SEQ ID NO：55之VH序列，及SEQ ID NO：56之VL序列；(viii)SEQ ID NO：63之VH序列，及SEQ ID NO：64之VL序列；或(ix)SEQ ID NO：71之VH序列，及SEQ ID NO：72之VL序列。
在一個特定實施例中，第三抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的VL。
在另一個實施例中，第三抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的VL。
在另一實施例中，第三抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的VL。
在再另一實施例中，第三抗原結合部分包含有包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的VL。
在一個特定實施例中，第三抗原結合部分包含SEQ ID NO：7之VH序列及SEQ ID NO：8之VL序列。
在另一個實施例中，第三抗原結合部分包含SEQ ID NO：15之VH序列及SEQ ID NO：16之VL序列。
在另一實施例中，第三抗原結合部分包含SEQ ID NO：23之VH序列及SEQ ID NO：24之VL序列。
在再另一實施例中，第三抗原結合部分包含SEQ ID NO：31之VH序列及SEQ ID NO：32之VL序列。
在一個實施例中，第三抗原結合部分包含人類恆定區。在一個實施例中，第三抗原結合部分為包含人類恆定區(特定言之，人類CH1及/或CL域)的Fab分子。人類恆定域之例示性序列在SEQ ID NO 112及113(分別為人類κ及λ CL域)及SEQ ID NO：114(人類IgG1重鏈恆定域CH1-CH2-CH3)中給出。在一些實施例中，第三抗原結合部分包含有包含與SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：113之胺基酸序列，特定言之與SEQ ID NO：112之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的輕鏈恆定區。特定言之，輕鏈恆定區可包含如本文在「電荷修飾」下所描述之胺基酸突變，且/或可包含互換型Fab分子中之一或多個(特定言之，兩個)N端胺基酸的缺失或取代。在一些實施例中，第三抗原結合部分包含有包含與SEQ ID NO：114之胺基酸序列中所包含之CH1域 序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的重鏈恆定區。特定言之，重鏈恆定區(具體而言，CH1域)可包含如本文在「電荷修飾」下所描述之胺基酸突變。
在特定實施例中，第三及第一抗原結合部分各自為Fab分子，且該第三抗原結合部分與該第一抗原結合部分完全相同。因此，在此等實施例中，第一及第三抗原結合部分包含相同重鏈及輕鏈胺基酸序列且具有相同結構域排列(亦即，習知或互換型))。此外，在此等實施例中，第三抗原結合部分包含與第一抗原結合部分相同之胺基酸取代(若存在)。舉例而言，本文描述為「電荷修飾」之胺基酸取代將在第一抗原結合部分及第三抗原結合部分中之每一者的恆定域CL及恆定域CH1中進行。或者，該胺基酸取代可在第二抗原結合部分(其在特定實施例中亦為Fab分子)之恆定域CL及恆定域CH1中進行，但不在第一抗原結合部分及第三抗原結合部分之恆定域CL及恆定域CH1中進行。
如第一抗原結合部分，第三抗原結合部分尤其為習知Fab分子。然而，亦涵蓋其中第一及第三抗原結合部分為交換型Fab分子(且第二抗原結合部分一種習知Fab分子)的實施例。因此，在特定實施例中，第一及第三抗原結合部分各自為習知Fab分子，且第二抗原結合部分為如本文所描述之互換型Fab分子，亦即，其中Fab重鏈與輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1進行交換/相互置換的Fab分子。在其他實施例中，第一及第三抗原結合部分各自為互換型Fab分子，且第二抗原結合部分為習知Fab分子。
若存在第三抗原結合部分，則在一個特定實施例中，第一及第三抗原部分結合於HLA-A2/WT1，且第二抗原結合部分結合於第二抗 原，特定言之，活化性T細胞抗原，更特定言之，CD3，最特定言之，CD3ε。
在特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含由第一及第二次單元構成之Fc域。Fc域之第一及第二次單元能夠穩定締合。
根據本發明之雙特異性抗原結合分子可具有不同組態，亦即，第一、第二(及視情況存在之第三)抗原結合部分可以不同方式彼此融合及與Fc域融合。組分可彼此直接融合或較佳地，經由一或多個適合之肽連接子而融合。在Fab分子與Fc域之次單元的N端融合的情況下，其通常經由免疫球蛋白鉸鏈區進行。
在一些實施例中，第一及第二抗原結合部分各自為Fab分子，且第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與Fc域之第一或第二次單元的N端融合。在此類實施例中，第一抗原結合部分可在Fab重鏈之C端與第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端或與Fc域之另一次單元的N端融合。在特定此類實施例中，該第一抗原結合部分為習知Fab分子，且第二抗原結合部分為如本文所描述之互換型Fab分子，亦即，其中Fab重鏈與輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1進行交換/相互置換的Fab分子。在其他此類實施例中，該第一Fab分子為互換型Fab分子，且第二Fab分子為習知Fab分子。
在一個實施例中，第一及第二抗原結合部分各自為Fab分子，且第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與Fc域之第一或第二次單元的N端融合，且第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。在一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一及第二Fab分子、由第一及第二次單元構成之Fc域以及視情況存在之一或多個肽連接子，其中該第一Fab分子在Fab重鏈之C端與該第二Fab分子之Fab重鏈的N端融合，且該第二Fab分子在Fab重鏈之C端與 該Fc域之第一或第二次單元的N端融合。此類組態示意性地描繪於圖1G及1K中(其中此等實例中之第二抗原結合域為VH/VL互換型Fab分子)。視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈及第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在另一個實施例中，第一及第二抗原結合部分各自為Fab分子，且該第一及該第二抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端與Fc域之一個次單元的N端融合。在一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一及第二Fab分子、由第一及第二次單元構成之Fc域以及視情況存在之一或多個肽連接子，其中該第一及該第二Fab分子各自在Fab重鏈之C端與該Fc域之一個次單元的N端融合。此類組態示意性地描繪於圖1A及1D中(其中在此等實例中，第二抗原結合域為VH/VL互換型Fab分子，且第一抗原結合部分為習知Fab分子)。第一及第二Fab分子可與Fc域直接融合或經由肽連接子而融合。在一個特定實施例中，第一及第二Fab分子各自經由免疫球蛋白鉸鏈區而與Fc域融合。在一個具體實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人類IgG1鉸鏈區，在其中Fc域為IgG1 Fc域的情況下尤其如此。
在一些實施例中，第一及第二抗原結合部分各自為Fab分子，且第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與Fc域之第一或第二次單元的N端融合。在此類實施例中，第二抗原結合部分可在Fab重鏈之C端與第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端或(如上文所描述)與Fc域之另一個次單元的N端融合。在特定此類實施例中，該第一抗原結合部分為習知Fab分子，且第二抗原結合部分為如本文所描述之互換型Fab分子，亦即，其中Fab重鏈與輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1進行交換/相互置換的Fab分子。在其他此類實施例中，該第一Fab分子為互換型Fab分子，且第二Fab分子 為習知Fab分子。
在一個實施例中，第一及第二抗原結合部分各自為Fab分子，且第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與Fc域之第一或第二次單元的N端融合，且第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。在一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一及第二Fab分子、由第一及第二次單元構成之Fc域以及視情況存在之一或多個肽連接子，其中該第二Fab分子在Fab重鏈之C端與該第一Fab分子之Fab重鏈的N端融合，且該第一Fab分子在Fab重鏈之C端與該Fc域之第一或第二次單元的N端融合。此類組態示意性地描繪於圖1H及1L中(其中在此等實例中，第二抗原結合域為VH/VL互換型Fab分子，且第一抗原結合部分為習知Fab分子)。視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈及第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在一些實施例中，第三抗原結合部分(特定言之，第三Fab分子)在Fab重鏈之C端與Fc域之第一或第二次單元的N端融合。在特定此類實施例中，該第一及第三Fab分子各自為習知Fab分子，且第二抗原結合部分為如本文所描述之互換型Fab分子，亦即，其中Fab重鏈與輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1進行交換/相互置換的Fab分子。在其他此類實施例中，該第一及第三Fab分子各自為互換型Fab分子，且第二Fab分子為習知Fab分子。
在一個特定此類實施例中，第二及第三抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端與Fc域之一個次單元的N端融合，且第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第二Fab分子之Fab重鏈的N端融合。在一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一、第二及第三Fab分子、 由第一及第二次單元構成之Fc域以及視情況存在之一或多個肽連接子，其中該第一Fab分子在Fab重鏈之C端與該第二Fab分子之Fab重鏈的N端融合，且該第二Fab分子在Fab重鏈之C端與該Fc域之第一次單元的N端融合，且其中該第三Fab分子在Fab重鏈之C端與該Fc域之第二次單元的N端融合。此類組態示意性地描繪於圖1B及1E中(其中在此等實例中，第二抗原結合部分為VH/VL互換型Fab分子，且第一及第三抗原結合部分為習知Fab分子)以及圖1J及1N中(其中在此等實例中，第二抗原結合部分為習知Fab分子，且第一及第三抗原結合部分為VH/VL互換型Fab分子)。第二及第三Fab分子可與Fc域直接融合或經由肽連接子而融合。在一個特定實施例中，第二及第三Fab分子各自經由免疫球蛋白鉸鏈區而與Fc域融合。在一個具體實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人類IgG1鉸鏈區，在其中Fc域為IgG1 Fc域的情況下尤其如此。視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈及第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在另一個此類實施例中，第一及第三抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端與Fc域之一個次單元的N端融合，且第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。在一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一、第二及第三Fab分子、由第一及第二次單元構成之Fc域以及視情況存在之一或多個肽連接子，其中該第二Fab分子在Fab重鏈之C端與該第一Fab分子之Fab重鏈的N端融合，且該第一Fab分子在Fab重鏈之C端與該Fc域之第一次單元的N端融合，且其中該第三Fab分子在Fab重鏈之C端與該Fc域之第二次單元的N端融合。此類組態示意性地描繪於圖1C及1F中(其中在此等實例中，第二抗原結合部分為VH/VL互換型Fab分子，且第一及第三抗原結合部分為習 知Fab分子)以及圖1I及1M中(其中在此等實例中，第二抗原結合部分為習知Fab分子，且第一及第三抗原結合部分為VH/VL互換型Fab分子)。第一及第三Fab分子可與Fc域直接融合或經由肽連接子而融合。在一個特定實施例中，第一及第三Fab分子各自經由免疫球蛋白鉸鏈區而與Fc域融合。在一個具體實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人類IgG1鉸鏈區，在其中Fc域為IgG1 Fc域的情況下尤其如此。視情況，第一Fab分子之Fab輕鏈及第二Fab分子之Fab輕鏈可另外彼此融合。
在其中Fab分子在Fab重鏈之C端經由免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域之每一次單元的N端融合的雙特異性抗原結合分子組態中，兩個Fab分子、鉸鏈區及Fc域基本上形成免疫球蛋白分子。在一個特定實施例中，免疫球蛋白分子為IgG類免疫球蛋白。在一個甚至更特定實施例中，免疫球蛋白為IgG1子類免疫球蛋白。在另一個實施例中，免疫球蛋白為IgG4子類免疫球蛋白。在另一特定實施例中，免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。在其他實施例中，免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人類化免疫球蛋白。在一個實施例中，免疫球蛋白包含人類恆定區，特定言之，人類Fc區。
在本發明之一些雙特異性抗原結合分子中，第一Fab分子之Fab輕鏈及第二Fab分子之Fab輕鏈彼此融合，視情況經由肽連接子而融合。視第一及第二Fab分子之組態而定，第一Fab分子之Fab輕鏈可在其C端與第二Fab分子之Fab輕鏈的N端融合，或第二Fab分子之Fab輕鏈可在其C端與第一Fab分子之Fab輕鏈的N端融合。第一及第二Fab分子之Fab輕鏈的融合進一步減少不匹配Fab重鏈及輕鏈之錯配，且亦減少為了表現本發明之一些雙特異性抗原結合分子所需的質體數目。
抗原結合部分可直接或經由包含一或多個胺基酸(通常約 2-20個胺基酸)之肽連接子而與Fc域融合或彼此融合。肽連接子為此項技術中已知的且描述於本文中。適合之非免疫原性肽連接子包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽連接子。「n」一般為1至10，通常2至4之整數。在一個實施例中，該肽連接子之長度為至少5個胺基酸，在一個實施例中，長度為5至100個胺基酸，在另一個實施例中，10至50個胺基酸。在一個實施例中，該肽連接子為(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸，且(x=3，n=3、4、5或6，且m=0、1、2或3)或(x=4，n=2、3、4或5，且m=0、1、2或3)，在一個實施例中，x=4且n=2或3，在另一個實施例中，x=4且n=2。在一個實施例中，該肽連接子為(G4S)2。尤其適合於使第一Fab分子及第二Fab分子之Fab輕鏈彼此融合的肽連接子為(G4S)2。適合於連接第一及第二Fab片段之Fab重鏈的例示性肽連接子包含序列(D)-(G4S)2(SEQ ID NO 110及111)。另一種適合之此類連接子包含序列(G4S)4。另外，連接子可包含免疫球蛋白鉸鏈區(之一部分)。特定言之，在Fab分子與Fc域次單元之N端融合的情況下，其可在存在或不存在額外肽連接子之情況下經由免疫球蛋白鉸鏈區或其一部分而融合。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))；及其中第一Fab分子之Fab重鏈與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕 鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VH(2)-CL(2))，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))。在某些實施例中，多肽經共價連接，例如藉由二硫鍵連接。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)、該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4))；及其中第一Fab分子之Fab重鏈與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VL(2)-CH1(2))，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))。在某些實施例中，多肽經共價連接，例如藉由二硫鍵連接。
在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵、該第一Fab分子之Fab重鏈又與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在其他實施例中，雙特異性抗原結合分子包含其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基端肽鍵、該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第二Fab分子包含互 換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。
在一些此等實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵的第二Fab分子之互換型Fab輕鏈多肽(VH(2)-CL(2))，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))。在其他此等實施例中，適當時，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵、該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab輕鏈多肽共用羧基端肽鍵的多肽(VH(2)-CL(2)-VL(1)-CL(1))；或其中第一Fab分子之Fab輕鏈多肽與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵、該第二Fab分子之Fab重鏈可變區又與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2))。
根據此等實施例之雙特異性抗原結合分子可進一步包含(i)Fc域次單元多肽(CH2-CH3(-CH4))；或(ii)其中第三Fab分子之Fab重鏈與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))，及第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3)-CL(3))。在某些實施例中，多肽經共價連接，例如藉由二硫鍵連接。
在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)、該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用 羧基端肽鍵、該第一Fab分子之Fab重鏈又與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在其他實施例中，雙特異性抗原結合分子包含其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵、該第二Fab分子之Fab重鏈可變區又與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)、該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4))。
在一些此等實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵的第二Fab分子之互換型Fab輕鏈多肽(VL(2)-CH1(2))，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))。在其他此等實施例中，適當時，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵、該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab輕鏈多肽共用羧基端肽鍵的多肽(VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1))；或其中第一Fab分子之Fab輕鏈多肽與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵、該第二Fab分子之Fab重鏈可變區又與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2))。
根據此等實施例之雙特異性抗原結合分子可進一步包含(i)Fc域次單元多肽(CH2-CH3(-CH4))；或(ii)其中第三Fab分子之Fab重鏈與Fc域次單元共用羧基端肽鍵的多肽(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))，及第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3)-CL(3))。在某些實施例中，多肽經共價連 接，例如藉由二硫鍵連接。
在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子不包含Fc域。在特定此類實施例中，該第一及(若存在)第三Fab分子各自為習知Fab分子，且第二Fab分子為如本文所描述之互換型Fab分子，亦即，其中Fab重鏈與輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1進行交換/相互置換的Fab分子。在其他此類實施例中，該第一及(若存在)第三Fab分子各自為互換型Fab分子，且第二Fab分子為習知Fab分子。
在一個此類實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一及第二抗原結合部分以及視情況存在之一或多個肽連接子，其中該第一及該第二抗原結合部分均為Fab分子，且該第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與該第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。此類組態示意性地描繪於圖1O及1S中(其中在此等實例中，第二抗原結合域為VH/VL互換型Fab分子，且第一抗原結合部分為習知Fab分子)。
在另一個此類實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一及第二抗原結合部分以及視情況存在之一或多個肽連接子，其中該第一及該第二抗原結合部分均為Fab分子，且該第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與該第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。此類組態示意性地描繪於圖1P及1T中(其中在此等實例中，第二抗原結合域為VH/VL互換型Fab分子，且第一抗原結合部分為習知Fab分子)。
在一些實施例中，第一Fab分子在Fab重鏈之C端與第二Fab分子之Fab重鏈的N端融合，且雙特異性抗原結合分子進一步包含第三抗原結合部分(特定言之，第三Fab分子)，其中該第三Fab分子在Fab重鏈之C端與第一Fab分子之Fab重鏈的N端融合。在某些此類實施例中，雙特異性抗 原結合分子基本上由以下組成：第一、第二及第三Fab分子以及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第一Fab分子在Fab重鏈之C端與第二Fab分子之Fab重鏈的N端融合，且第三Fab分子在Fab重鏈之C端與第一Fab分子之Fab重鏈的N端融合。此類組態示意性地描繪於圖1Q及1U中(其中在此等實例中，第二抗原結合部分為VH/VL互換型Fab分子，且第一及第三抗原結合部分各自為習知Fab分子)或圖1X及1Z中(其中在此等實例中，第二抗原結合部分為習知Fab分子，且第一及第三抗原結合部分各自為VH/VL互換型Fab分子)。
在一些實施例中，第二Fab分子在Fab重鏈之C端與第一Fab分子之Fab重鏈的N端融合，且雙特異性抗原結合分子進一步包含第三抗原結合部分(特定言之，第三Fab分子)，其中該第三Fab分子在Fab重鏈之N端與第一Fab分子之Fab重鏈的C端融合。在某些此類實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一、第二及第三Fab分子以及視情況存在之一或多個肽連接子，其中第二Fab分子在Fab重鏈之C端與第一Fab分子之Fab重鏈的N端融合，且第三Fab分子在Fab重鏈之N端與第一Fab分子之Fab重鏈的C端融合。此類組態示意性地描繪於圖1R及1V中(其中在此等實例中，第二抗原結合部分為VH/VL互換型Fab分子，且第一及第三抗原結合部分各自為習知Fab分子)或圖1W及1Y中(其中在此等實例中，第二抗原結合部分為習知Fab分子，且第一及第三抗原結合部分各自為VH/VL互換型Fab分子)。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含其中第一Fab分子之Fab重鏈與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基端肽鍵、該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab重鏈恆定 區共用羧基端肽鍵(亦即，該第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)的多肽(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VH(2)-CL(2))，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵的多肽(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VH(2)-CL(2))，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)、該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵的多肽(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VL(2)-CH1(2))，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共 用羧基端肽鍵(亦即，該第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵的多肽(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VH(2)-CL(2))，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含其中第三Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵、該第一Fab分子之Fab重鏈又與第二Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基端肽鍵、該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)的多肽(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VH(2)-CL(2))，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含其中第三Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵、該第一Fab分子之Fab重鏈又與第二Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵、該第二Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)的多肽(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2))。 在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VL(2)-CH1(2))，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵、該第一Fab分子之Fab重鏈又與第三Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵的多肽(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VH(2)-CL(2))，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)、該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵、該第一Fab分子之Fab重鏈又與第三Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵的多肽(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))。在一些實施例中，雙特異性抗 原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VL(2)-CH1(2))，及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1)-CL(1))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含第三Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(3)-CL(3))。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含其中第二Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基端肽鍵、該第一Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第一Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、該第一Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第三Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基端肽鍵、該第三Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第三Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)的多肽(VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-VL(3)-CH1(3))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VH(1)-CL(1))，及第二Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(2)-CL(2))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第三Fab分子之Fab重鏈可變區與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VH(3)-CL(3))。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含其中第二Fab分子之Fab重鏈與第一Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵、該第一Fab分子之Fab重鏈可變區又與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第一Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)、該第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第三Fab分 子之Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵、該第三Fab分子之Fab重鏈可變區又與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第三Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)的多肽(VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-VH(3)-CL(3))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VL(1)-CH1(1))，及第二Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(2)-CL(2))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第三Fab分子之Fab輕鏈可變區與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VL(3)-CH1(3))。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含其中第三Fab分子之Fab輕鏈可變區與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第三Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、該第三Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab輕鏈可變區共用羧基端肽鍵、該第一Fab分子之Fab輕鏈可變區又與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第一Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、該第一Fab分子之Fab重鏈恆定區又與第二Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵的多肽(VL(3)-CH1(3)-VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VH(1)-CL(1))，及第二Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(2)-CL(2))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第三Fab分子之Fab重鏈可變區與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VH(3)-CL(3))。
在某些實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含其中第三Fab分子之Fab重鏈可變區與第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第三Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)、該第三Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第一Fab分子之Fab重鏈可變區共用羧基端肽鍵、該第一Fab分子之Fab重鏈可變區又與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共用羧基端肽鍵(亦即，該第一Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)、該第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與第二Fab分子之Fab重鏈共用羧基端肽鍵的多肽(VH(3)-CL(3)-VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VL(1)-CH1(1))，及第二Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(2)-CL(2))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第三Fab分子之Fab輕鏈可變區與第三Fab分子之Fab重鏈恆定區共用羧基端肽鍵的多肽(VL(3)-CH1(3))。
在一個實施例中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，特定言之，HLA-A2/WT1RMF，且該第一抗原結合部分為以下Fab分子，其包含有包含SEQ ID NO：1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：2之HCDR 2及SEQ ID NO：3之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：5之LCDR 2及SEQ ID NO：6之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)；b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化性T 細胞抗原，特定言之，CD3，更特定言之，CD3ε，且該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1進行相互置換的Fab分子；c)由第一及第二次單元構成之Fc域；其中(i)a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與b)項下之第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該b)項下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一個次單元的N端融合，或(ii)b)項下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與a)項下之第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一個次單元的N端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，特定言之，HLA-A2/WT1RMF，且該第一抗原結合部分為以下Fab分子，其包含有包含SEQ ID NO：1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：2之HCDR 2及SEQ ID NO：3之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：5之LCDR 2及SEQ ID NO：6之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)；b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化性T細胞抗原，特定言之，CD3，更特定言之，CD3ε，且該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1進行相互置換的Fab分子； c)結合於第一抗原且與第一抗原結合部分完全相同的第三抗原結合部分；及d)由第一及第二次單元構成之Fc域；其中(i)a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與b)項下之第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該b)項下之第二抗原結合部分及c)項下之第三抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端與d)項下之Fc域之一個次單元的N端融合，或(ii)b)項下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與a)項下之第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該a)項下之第一抗原結合部分及c)項下之第三抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端與d)項下之Fc域之一個次單元的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，特定言之，HLA-A2/WT1RMF，且該第一抗原結合部分為以下Fab分子，其包含有包含SEQ ID NO：1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：2之HCDR 2及SEQ ID NO：3之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：5之LCDR 2及SEQ ID NO：6之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)；b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化性T細胞抗原，特定言之，CD3，更特定言之，CD3ε，且該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1進行相互 置換的Fab分子；c)由第一及第二次單元構成之Fc域；其中(i)a)項下之第一抗原結合部分及b)項下之第二抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一個次單元的N端融合。
在一個實施例中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，特定言之，HLA-A2/WT1RMF，且該第一抗原結合部分為以下Fab分子，其包含有包含SEQ ID NO：9之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：10之HCDR 2及SEQ ID NO：11之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：12之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：13之LCDR 2及SEQ ID NO：14之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)；b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化性T細胞抗原，特定言之，CD3，更特定言之，CD3ε，且該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1進行相互置換的Fab分子；c)由第一及第二次單元構成之Fc域；其中(i)a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與b)項下之第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該b)項下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一個次單元的N端融合，或(ii)b)項下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與a)項下之第一抗原 結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一個次單元的N端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，特定言之，HLA-A2/WT1RMF，且該第一抗原結合部分為以下Fab分子，其包含有包含SEQ ID NO：9之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：10之HCDR 2及SEQ ID NO：11之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：12之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：13之LCDR 2及SEQ ID NO：14之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)；b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化性T細胞抗原，特定言之，CD3，更特定言之，CD3ε，且該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1進行相互置換的Fab分子；c)結合於第一抗原且與第一抗原結合部分完全相同的第三抗原結合部分；及d)由第一及第二次單元構成之Fc域；其中(i)a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與b)項下之第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該b)項下之第二抗原結合部分及c)項下之第三抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端與d)項下之Fc域之一個次單元的N端融合，或(ii)b)項下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與a)項下之第一抗原 結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該a)項下之第一抗原結合部分及c)項下之第三抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端與d)項下之Fc域之一個次單元的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，特定言之，HLA-A2/WT1RMF，且該第一抗原結合部分為以下Fab分子，其包含有包含SEQ ID NO：9之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：10之HCDR 2及SEQ ID NO：11之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：12之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：13之LCDR 2及SEQ ID NO：14之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)；b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化性T細胞抗原，特定言之，CD3，更特定言之，CD3ε，且該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1進行相互置換的Fab分子；c)由第一及第二次單元構成之Fc域；其中(i)a)項下之第一抗原結合部分及b)項下之第二抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一個次單元的N端融合。
在根據本發明之雙特異性抗原結合分子的所有不同組態中，本文所描述之胺基酸取代(若存在)可處於第一及(若存在)第三抗原結合部分/Fab分子之CH1及CL域中，或處於第二抗原結合部分/Fab分子之CH1及CL域中。較佳地，其處於第一及(若存在該第三抗原結合部分/Fab分子之CH1及CL 域中。根據本發明之概念，若如本文所描述之胺基酸取代在第一(及若存在，第三)抗原結合部分/Fab分子中進行，則此類胺基酸取代不在第二抗原結合部分/Fab分子中進行。相反，若如本文所描述之胺基酸取代在第二抗原結合部分/Fab分子中進行，則此類胺基酸取代不在第一(及若存在，第三)抗原結合部分/Fab分子中進行。胺基酸取代尤其在包含其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1進行相互置換之Fab分子的雙特異性抗原結合分子中進行。
在根據本發明之雙特異性抗原結合分子的特定實施例中，特定言之，在其中如本文所描述之胺基酸取代在第一(及若存在，第三)抗原結合部分/Fab分子中進行的特定實施例中，第一(及若存在，第三)Fab分子之恆定域CL具有κ同型。在根據本發明之雙特異性抗原結合分子的其他實施例中，特定言之，在其中如本文所描述之胺基酸取代在第二抗原結合部分/Fab分子中進行的實施例中，第二抗原結合部分/Fab分子之恆定域CL具有κ同型。在一些實施例中，第一(及若存在，第三)抗原結合部分/Fab分子之恆定域CL及第二抗原結合部分/Fab分子之恆定域CL具有κ同型。
在一個實施例中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，特定言之，HLA-A2/WT1RMF，且該第一抗原結合部分為以下Fab分子，其包含有包含SEQ ID NO：1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：2之HCDR 2及SEQ ID NO：3之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：5之LCDR 2及SEQ ID NO：6之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)； b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化性T細胞抗原，特定言之，CD3，更特定言之，CD3ε，且該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH進行相互置換的Fab分子；c)由第一及第二次單元構成之Fc域；其中在a)項下之第一抗原結合部分的恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最特定言之，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)項下之第一抗原結合部分的恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；且其中(i)a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與b)項下之第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該b)項下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一個次單元的N端融合，或(ii)b)項下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與a)項下之第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一個次單元的N端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，特定言之，HLA-A2/WT1RMF，且該第一抗原結合部分為以下Fab分子，其包含有包含SEQ ID NO：1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：2之HCDR 2及SEQ ID NO：3之HCDR 3的重鏈可變區(VH)， 及包含SEQ ID NO：4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：5之LCDR 2及SEQ ID NO：6之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)；b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化性T細胞抗原，特定言之，CD3，更特定言之，CD3ε，且該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH進行相互置換的Fab分子；c)結合於第一抗原且與第一抗原結合部分完全相同的第三抗原結合部分；及d)由第一及第二次單元構成之Fc域；其中在a)項下之第一抗原結合部分及c)項下之第三抗原結合部分的恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最特定言之，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)項下之第一抗原結合部分及c)項下之第三抗原結合部分的恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；且其中(i)a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與b)項下之第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該b)項下之第二抗原結合部分及c)項下之第三抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端與d)項下之Fc域之一個次單元的N端融合，或(ii)b)項下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與a)項下之第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該a)項下之第一抗原結合部分及c)項下之第三抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端與d)項下之Fc域之一個次單元 的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，特定言之，HLA-A2/WT1RMF，且該第一抗原結合部分為以下Fab分子，其包含有包含SEQ ID NO：1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：2之HCDR 2及SEQ ID NO：3之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：5之LCDR 2及SEQ ID NO：6之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)；b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化性T細胞抗原，特定言之，CD3，更特定言之，CD3ε，且該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH進行相互置換的Fab分子；c)由第一及第二次單元構成之Fc域；其中在a)項下之第一抗原結合部分的恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最特定言之，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)項下之第一抗原結合部分的恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；且其中a)項下之第一抗原結合部分及b)項下之第二抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一個次單元的N端融合。
在一個實施例中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含 a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，特定言之，HLA-A2/WT1RMF，且該第一抗原結合部分為以下Fab分子，其包含有包含SEQ ID NO：9之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：10之HCDR 2及SEQ ID NO：11之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：12之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：13之LCDR 2及SEQ ID NO：14之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)；b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化性T細胞抗原，特定言之，CD3，更特定言之，CD3ε，且該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH進行相互置換的Fab分子；c)由第一及第二次單元構成之Fc域；其中在a)項下之第一抗原結合部分的恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最特定言之，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)項下之第一抗原結合部分的恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；且其中(i)a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與b)項下之第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該b)項下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一個次單元的N端融合，或(ii)b)項下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與a)項下之第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一個次單元的N端融合。
在一個特定實施例中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，特定言之，HLA-A2/WT1RMF，且該第一抗原結合部分為以下Fab分子，其包含有包含SEQ ID NO：9之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：10之HCDR 2及SEQ ID NO：11之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：12之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：13之LCDR 2及SEQ ID NO：14之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)；b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化性T細胞抗原，特定言之，CD3，更特定言之，CD3ε，且該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH進行相互置換的Fab分子；c)結合於第一抗原且與第一抗原結合部分完全相同的第三抗原結合部分；及d)由第一及第二次單元構成之Fc域；其中在a)項下之第一抗原結合部分及c)項下之第三抗原結合部分的恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最特定言之，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)項下之第一抗原結合部分及c)項下之第三抗原結合部分的恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；且其中(i)a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與b)項下之第二抗原 結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該b)項下之第二抗原結合部分及c)項下之第三抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端與d)項下之Fc域之一個次單元的N端融合，或(ii)b)項下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與a)項下之第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該a)項下之第一抗原結合部分及c)項下之第三抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端與d)項下之Fc域之一個次單元的N端融合。
在另一個實施例中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，特定言之，HLA-A2/WT1RMF，且該第一抗原結合部分為以下Fab分子，其包含有包含SEQ ID NO：9之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：10之HCDR 2及SEQ ID NO：11之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：12之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：13之LCDR 2及SEQ ID NO：14之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)；b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為活化性T細胞抗原，特定言之，CD3，更特定言之，CD3ε，且該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH進行相互置換的Fab分子；c)由第一及第二次單元構成之Fc域；其中在a)項下之第一抗原結合部分的恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最特定言之，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)項下之第一抗原結合部分的恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩 胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；且其中a)項下之第一抗原結合部分及b)項下之第二抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一個次單元的N端融合。
根據任一上文實施例，雙特異性抗原結合分子(例如Fab分子、Fc域)之組分可直接或經由本文所描述或此項技術中已知之各種連接子，特定言之，包含一或多個胺基酸(通常約2-20個胺基酸)之肽連接子而融合。適合之非免疫原性肽連接子包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽連接子，其中n一般為1至10，通常2至4之整數。
在一個特定態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含a)結合於第一抗原之第一及第三抗原結合部分；其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，特定言之，HLA-A2/WT1RMF，且其中該第一及第三抗原結合部分各自為以下(習知)Fab分子，其包含有包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈可變區；b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分；其中該第二抗原為CD3，且其中該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH進行相互置換的Fab分子，該Fab分子包含(i)包含SEQ ID NO：121之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：122之胺基酸序列的輕鏈可變區或(ii)包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列的輕鏈可變區(特定言之，包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列的輕鏈可變區)；c)由第一及第二次單元構成之Fc域； 其中在a)項下之第一及第三抗原結合部分的恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最特定言之，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)項下之第一及第三抗原結合部分的恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；且其中進一步a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與b)項下之第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該b)項下之第二抗原結合部分及a)項下之第三抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一個次單元的N端融合。
在另一態樣中，本發明提供一種雙特異性抗原結合分子，其包含a)結合於第一抗原之第一及第三抗原結合部分；其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，特定言之，HLA-A2/WT1RMF，且其中該第一及第三抗原結合部分各自為以下(習知)Fab分子，其包含有包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的輕鏈可變區；b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分；其中該第二抗原為CD3，且其中該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH進行相互置換的Fab分子，該Fab分子包含(i)包含SEQ ID NO：121之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：122之胺基酸序列的輕鏈可變區或(ii)包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：137 之胺基酸序列的輕鏈可變區(特定言之，包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列的輕鏈可變區)；c)由第一及第二次單元構成之Fc域；其中在a)項下之第一及第三抗原結合部分的恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最特定言之，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)項下之第一及第三抗原結合部分的恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；且其中進一步a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與b)項下之第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該b)項下之第二抗原結合部分及a)項下之第三抗原結合部分各自在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一個次單元的N端融合。
在根據本發明之此等態樣的一個實施例中，在Fc域之第一次單元中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在Fc域之第二次單元中，位置407處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)，且視情況，位置366處之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換(T366S)，且位置368處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A)(根據Kabat EU索引編號)。
在根據本發明之此等態樣的另一個實施例中，在Fc域之第一次單元中，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(S354C)，或位置356處之麩胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(E356C)(特定言之，位置354 處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換)，且在Fc域之第二次單元中，另外，位置349處之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)。
在根據本發明之此等態樣的再另一實施例中，在Fc域之第一及第二次單元中的每一者中，位置234處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L234A)，位置235處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L235A)，且位置329處之脯胺酸殘基經甘胺酸殘基置換(P329G)(根據Kabat EU索引編號)。
在根據本發明之此等態樣的再另一實施例中，Fc域為人類IgG1 Fc域。
在特定具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含有包含與SEQ ID NO：123之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽、包含與SEQ ID NO：125之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽、包含與SEQ ID NO：139之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽及包含與SEQ ID NO：140之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽。在另一特定具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含有包含SEQ ID NO：123之胺基酸序列的多肽、包含SEQ ID NO：125之胺基酸序列的多肽、包含SEQ ID NO：139之胺基酸序列的多肽及包含SEQ ID NO：140之胺基酸序列的多肽。
在另一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含有包含與SEQ ID NO：123之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽、包含與SEQ ID NO：124之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽、包含與SEQ ID NO：125之序列至少 95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽及包含與SEQ ID NO：129之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽。在另一特定具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含有包含SEQ ID NO：123之胺基酸序列的多肽、包含SEQ ID NO：124之胺基酸序列的多肽、包含SEQ ID NO：125之胺基酸序列的多肽及包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列的多肽。
在另一個具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含有包含與SEQ ID NO：126之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽、包含與SEQ ID NO：127之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽、包含與SEQ ID NO：128之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽及包含與SEQ ID NO：129之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽。在另一具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含有包含SEQ ID NO：126之胺基酸序列的多肽、包含SEQ ID NO：127之胺基酸序列的多肽、包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列的多肽及包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列的多肽。
Fc域
在特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含由第一及第二次單元構成之Fc域。應理解，本文與雙特異性抗原結合分子相關描述的Fc域之特徵之可同等地適用於本發明之抗體中所包含的Fc域。
雙特異性抗原結合分子之Fc域由包含免疫球蛋白分子之重鏈域的一對多肽鏈組成。舉例而言，免疫球蛋白G(IgG)分子之Fc域為二聚 體，其各次單元包含CH2及CH3 IgG重鏈恆定域。Fc域之兩個次單元能夠彼此穩定締合。在一個實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含不超過一個Fc域。
在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子之Fc域為IgG Fc域。在一個特定實施例中，Fc域為IgG1 Fc域。在另一個實施例中，Fc域為IgG4 Fc域。在一個更具體實施例中，Fc域為包含位置S228(Kabat EU索引編號)處之胺基酸取代(特定言之，胺基酸取代S228P)的IgG4 Fc域。此胺基酸取代減少活體內IgG4抗體之Fab臂交換(參見Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在另一特定實施例中，Fc域為人類Fc域。在一個甚至更特定實施例中，Fc域為人類IgG1 Fc域。人類IgG1 Fc區之例示性序列在SEQ ID NO：109中給出。
促進雜二聚化之Fc域修飾
根據本發明之雙特異性抗原結合分子包含不同抗原結合部分，其可與Fc域之兩個次單元中的一者或另一者融合，該Fc域之兩個次單元由此通常包含於兩個不完全相同之多肽鏈中。此等多肽之重組共表現及後續二聚化產生兩種多肽之若干種可能的組合。為了改良雙特異性抗原結合分子在重組產生中之產量及純度，因此將有利的是在雙特異性抗原結合分子之Fc域中引入促進所要多肽之締合的修飾。
因此，在特定實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子的Fc域包含促進Fc域之第一及第二次單元之締合的修飾。人類IgG Fc域之兩個次單元之間的大部分廣泛蛋白質-蛋白質相互作用之位點處於該Fc域之CH3域中。因此，在一個實施例中，該修飾處於Fc域之CH3域中。
存在若干種用於在Fc域之CH3域中進行修飾以便強制執行雜二聚化的方法，該等方法充分描述於例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291中。通常，在所有此類方法中，Fc域之第一次單元的CH3域與Fc域之第二次單元的CH3域均以互補方式進行工程改造，以使得各CH3域(或包含其之重鏈)本身不可再發生均二聚，而是被迫與以互補方式經工程改造之另一CH3域雜二聚(以使得第一及第二CH3域雜二聚，而不在兩個第一或兩個第二CH3域之間形成均二聚體)。涵蓋用於改良重鏈雜二聚化之此等不同方法與雙特異性抗原結合分子中之重鏈-輕鏈修飾(例如，在一個結合臂中進行VH及VL交換/置換及將具有相反電荷之帶電胺基酸取代引入CH1/CL界面中)的組合作為不同替代方案，從而減少重鏈/輕鏈錯配及本斯-瓊斯型副產物。
在一個具體實施例中，促進Fc域之第一及第二次單元之締合的該修飾為所謂的「臼包杵(knob-into-hole)」型修飾，包含Fc域之兩個次單元中之一者中的「杵」型修飾及Fc域之兩個次單元中之另一者中的「臼」型修飾。
臼包杵技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9,617-621(1996)及Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。一般而言，該方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)及在第二多肽之界面處引入對應之凹穴(「臼」)，以使得該隆凸可定位於該凹穴中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。隆凸藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽之界面中的小胺基酸側鏈來構築。 大小與隆凸相同或類似之補償性凹穴係在第二多肽之界面中藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈來產生。
因此，在一個特定實施例中，在雙特異性抗原結合分子之Fc域之第一次單元的CH3域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，藉此在該第一次單元之CH3域內產生隆凸，該隆凸可定位於第二次單元之CH3域內的凹穴中，且在Fc域之第二次單元的CH3域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，藉此在第二次單元之CH3域內產生凹穴，第一次單元之CH3域內的隆凸可定位於該凹穴內。
較佳地，具有較大側鏈體積之該胺基酸殘基選自由精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)組成之群。
較佳地，具有較小側鏈體積之該胺基酸殘基選自由丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)組成之群。
隆凸及凹穴可藉由改變編碼多肽之核酸，例如藉由位點特異性突變誘發或藉由肽合成來製得。
在一個具體實施例中，在Fc域之第一次單元(「杵」次單元)(之CH3域)中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在Fc域之第二次單元(「臼」次單元)(之CH3域)中，位置407處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)。在一個實施例中，在Fc域之第二次單元中，另外，位置366處之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換(T366S)，且位置368處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A)(根據Kabat EU索引編號)。
在又另一實施例中，在Fc域之第一次單元中，另外，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(S354C)，或位置356處之麩胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(E356C)(特定言之，位置354處之絲胺酸殘基經 半胱胺酸殘基置換)，且在Fc域之第二次單元中，另外，位置349處之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)。引入此兩個半胱胺酸殘基使得在Fc域之兩個次單元之間形成二硫橋鍵，從而進一步使二聚體穩定(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在一個特定實施例中，Fc域之第一次單元包含胺基酸取代S354C及T366W，且Fc域之第二次單元包含胺基酸取代Y349C、T366S、L368A及Y407V(根據Kabat EU索引編號)。
在一個特定實施例中，結合於第二抗原(例如活化性T細胞抗原)之抗原結合部分(視情況經由結合於HLA-A2/WT1之第一抗原結合部分，及/或肽連接子)而與Fc域之第一次單元(包含「杵」型修飾)融合。在不希望受理論束縛的情況下，結合第二抗原(諸如活化性T細胞抗原)之抗原結合部分與Fc域之含杵次單元的融合將(進一步)使包含兩個結合於活化性T細胞抗原之抗原結合部分的抗原結合分子的產生最小化(兩個含杵多肽之立體
涵蓋用於強制執行雜二聚化的CH3修飾之其他技術作為本發明之替代方案，且此等技術描述於例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中。
在一個實施例中，替代地使用EP 1870459中所描述之雜二聚化方法。此方法係基於在Fc域之兩個次單元之間的CH3/CH3域界面中的特定胺基酸位置處引入具有相反電荷之帶電胺基酸。本發明之雙特異性抗原結合分子的一個較佳實施例為處於(Fc域之)兩個CH3域中之一者中的胺 基酸突變R409D、K370E；及處於Fc域之另一個CH3域中的胺基酸突變D399K、E357K(根據Kabat EU索引編號)。
在另一個實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含處於Fc域之第一次單元之CH3域中的胺基酸突變T366W及處於Fc域之第二次單元之CH3域中的胺基酸突變T366S、L368A、Y407V；且另外包含處於Fc域之第一次單元之CH3域中的胺基酸突變R409D、K370E及處於Fc域之第二次單元之CH3域中的胺基酸突變D399K、E357K(根據Kabat EU索引編號)。
在另一個實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子包含處於Fc域之第一次單元之CH3域中的胺基酸突變S354C、T366W及處於Fc域之第二次單元之CH3域中的胺基酸突變Y349C、T366S、L368A、Y407V；或該雙特異性抗原結合分子包含處於Fc域之第一次單元之CH3域中的胺基酸突變Y349C、T366W及處於Fc域之第二次單元之CH3域中的胺基酸突變S354C、T366S、L368A、Y407V；且另外包含處於Fc域之第一次單元之CH3域中的胺基酸突變R409D、K370E及處於Fc域之第二次單元之CH3域中的胺基酸突變D399K、E357K(所有編號均根據Kabat EU索引)。
在一個實施例中，替代地使用WO 2013/157953中所描述之雜二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變T366K，且第二CH3域包含胺基酸突變L351D(根據Kabat EU索引編號)。在另一實施例中，第一CH3域進一步包含胺基酸突變L351K。在另一實施例中，第二CH3域進一步包含選自Y349E、Y349D及L368E之胺基酸突變(較佳為L368E)(根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，替代地使用WO 2012/058768中所描述之 雜二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變L351Y、Y407A，且第二CH3域包含胺基酸突變T366A、K409F。在另一實施例中，第二CH3域包含位置T411、D399、S400、F405、N390或K392處之另一胺基酸突變，例如選自以下之胺基酸突變：a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W；b)D399R、D399W、D399Y或D399K；c)S400E、S400D、S400R或S400K；d)F405I、F405M，F405T、F405S、F405V或F405W；e)N390R、N390K或N390D；f)K392V、K392M，K392R、K392L、K392F或K392E(根據Kabat EU索引編號)。在另一實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變L351Y、Y407A，且第二CH3域包含胺基酸突變T366V、K409F。在另一實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變Y407A，且第二CH3域包含胺基酸突變T366A、K409F。在另一實施例中，第二CH3域進一步包含胺基酸突變K392E、T411E、D399R及S400R(根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，替代地使用WO 2011/143545中所描述之雜二聚化方法，例如使用選自由368及409組成之群之位置處的胺基酸修飾(根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，替代地使用WO 2011/090762中所描述之雜二聚化方法，其亦使用上文所描述之臼包杵技術。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變T366W，且第二CH3域包含胺基酸突變Y407A。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變T366Y，且第二CH3域包含胺基酸突變Y407T(根據Kabat EU索引編號)。
在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子或其Fc域屬於IgG2子類，且替代地使用WO 2010/129304中所描述之雜二聚化方法。
在一個替代性實施例中，促進Fc域之第一及第二次單元之締合的修飾包含介導靜電轉向作用之修飾，例如，如PCT公開案WO 2009/089004中所描述。一般而言，此方法涉及用帶電胺基酸殘基置換兩個Fc域次單元之界面處的一或多個胺基酸殘基，以使得均二聚體形成變得在靜電上不利，但雜二聚化在靜電上有利。在一個此類實施例中，第一CH3域包含用帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，較佳為K392D或N392D)對K392或N392進行的胺基酸取代，且第二CH3域包含用帶正電胺基酸(例如離胺酸(K)或精胺酸(R)，較佳為D399K、E356K、D356K或E357K，且更佳為D399K及E356K)對D399、E356、D356或E357進行的胺基酸取代。在另一實施例中，第一CH3域進一步包含用帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，較佳為K409D或R409D)對K409或R409進行的胺基酸取代。在另一實施例中，第一CH3域進一步或替代地包含用帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D))對K439及/或K370進行的胺基酸取代(所有編號均根據Kabat EU索引)。
在又另一實施例中，替代地使用WO 2007/147901中所描述之雜二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變K253E、D282K及K322D，且第二CH3域包含胺基酸突變D239K、E240K及K292D(根據Kabat EU索引編號)。
在再另一個實施例中，可替代地使用WO 2007/110205中所描述之雜二聚化方法。
在一個實施例中，Fc域之第一次單元包含胺基酸取代K392D及K409D，且Fc域之第二次單元包含胺基酸取代D356K及D399K(根據Kabat EU索引編號)。
使Fc受體結合減弱及/或使效應功能減低之Fc域修飾
Fc域賦予雙特異性抗原結合分子(或抗體)有利的藥物動力學特性，包括較長血清半衰期，其有助於良好聚積於靶組織中及有利的組織-血液分佈比率。然而，其同時可能導致雙特異性抗原結合分子(或抗體)非所需地靶向表現Fc受體之細胞，而非靶向較佳的攜有抗原之細胞。此外，Fc受體信號傳導路徑之共同活化可能引起細胞介素釋放，其與雙特異性抗原結合分子之T細胞活化特性(例如，在其中第二抗原結合部分結合於活化性T細胞抗原之雙特異性抗原結合分子的實施例中)及長半衰期組合，在全身投藥後導致細胞介素受體之過量活化及嚴重副作用。對除T細胞以外之(攜有Fc受體之)免疫細胞的活化可能甚至由於(例如NK細胞)對T細胞之可能破壞而減低雙特異性抗原結合分子(特定言之，其中第二抗原結合部分結合於活化性T細胞抗原之雙特異性抗原結合分子)的功效。
因此，在特定實施例中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子的Fc域展現相比於原生IgG1 Fc域，與Fc受體之結合親和力減弱及/或效應功能減低。在一個此類實施例中，Fc域(或包含該Fc域之雙特異性抗原結合分子)展現與Fc受體之結合親和力相比於原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域之雙特異性抗原結合分子)小於50%、較佳小於20%、更佳小於10%且最佳小於5%，及/或效應功能相比於原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域之雙特異性抗原結合分子)小於50%、較佳小於20%、更佳小於10%且最佳小於5%。在一個實施例中，Fc域(或包含該Fc域之雙特異性抗原結合分子)基本上不結合於Fc受體及/或誘導效應功能。在一個特定實施例中，Fc受體為Fcγ受體。在一個實施例中，Fc受體為人類Fc受體。在一個實施 例中，Fc受體為活化性Fc受體。在一個具體實施例中，Fc受體為活化性人類Fcγ受體，更具體而言，人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具體而言，人類FcγRIIIa。在一個實施例中，效應功能為選自CDC、ADCC、ADCP及細胞介素分泌之群的一或多者。在一個特定實施例中，效應功能為ADCC。在一個實施例中，Fc域展現與新生兒Fc受體(FcRn)之結合親和力相比於原生IgG1 Fc域基本上類似。當Fc域(或包含該Fc域之雙特異性抗原結合分子)展現與FcRn之結合親和力為原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域之雙特異性抗原結合分子)的大於約70%、特定言之大於約80%、更特定言之大於約90%時，達成基本上類似的與FcRn之結合。
在某些實施例中，Fc域經工程改造以滿足相比於未經工程改造之Fc域，與Fc受體之結合親和力減弱及/或效應功能減低。在特定實施例中，雙特異性抗原結合分子之Fc域包含一或多個使該Fc域與Fc受體之結合親和力減弱及/或使效應功能減低的胺基酸突變。通常，在Fc域之兩個次單元中之每一者中均存在相同的一或多個胺基酸突變。在一個實施例中，胺基酸突變使Fc域與Fc受體之結合親和力減弱。在一個實施例中，胺基酸突變使Fc域與Fc受體之結合親和力減弱至少2倍、至少5倍或至少10倍。在其中存在超過一個使Fc域與Fc受體之結合親和力減弱之胺基酸突變的實施例中，此等胺基酸突變之組合可使Fc域與Fc受體之結合親和力減弱至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。在一個實施例中，包含經工程改造之Fc域的雙特異性抗原結合分子展現與Fc受體之結合親和力相比於包含未經工程改造之Fc域的雙特異性抗原結合分子小於20%、特定言之小於10%、更特定言之小於5%。在一個特定實施例中，Fc受體為Fcγ受體。在一些實施例中，Fc受體為人類Fc受體。在一些實施例中，Fc受體為活化性Fc受體。 在一個具體實施例中，Fc受體為活化性人類Fcγ受體，更具體而言，人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具體而言，人類FcγRIIIa。較佳地，與此等受體中之每一者的結合減弱。在一些實施例中，與補體組分之結合親和力(特定言之，與C1q之特異性結合親和力)亦減弱。在一個實施例中，與新生兒Fc受體(FcRn)之結合親和力不減弱。當Fc域(或包含該Fc域之雙特異性抗原結合分子)展現與FcRn之結合親和力為未經工程改造之形式之Fc域(或包含該未經工程改造之形式之Fc域的雙特異性抗原結合分子)的大於約70%時，達成基本上類似的與FcRn之結合。Fc域或包含該Fc域的本發明之雙特異性抗原結合分子可展現此類親和力之大於約80%及甚至大於約90%。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子之Fc域經工程改造以滿足相比於未經工程改造之Fc域，效應功能減低。減低之效應功能可包括(但不限於)以下中之一或多者：補體依賴性細胞毒性(CDC)降低、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)降低、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)減少、細胞介素分泌減少、免疫複合體介導的抗原呈遞細胞之抗原攝取減少、與NK細胞之結合減弱、與巨噬細胞之結合減弱、與單核球之結合減弱、與多形核細胞之結合減弱、誘導細胞凋亡之直接信號傳導減少、標靶所結合抗體之交聯減少、樹突狀細胞成熟減少或T細胞激活減少。在一個實施例中，效應功能減低為選自以下之群的一或多者：CDC降低、ADCC降低、ADCP減少及細胞介素分泌減少。在一個特定實施例中，效應功能減低為ADCC降低。在一個實施例中，ADCC降低量為由未經工程改造之Fc域(或包含未經工程改造之Fc域的雙特異性抗原結合分子)誘導之ADCC的小於20%。
在一個實施例中，使Fc域與Fc受體之結合親和力減弱及/或效應功能減低的胺基酸突變為胺基酸取代。在一個實施例中，Fc域包含處 於選自以下之群之位置處的胺基酸取代：E233、L234、L235、N297、P331及P329(根據Kabat EU索引編號)。在一個更具體實施例中，Fc域包含處於選自以下之群之位置處的胺基酸取代：L234、L235及P329(根據Kabat EU索引編號)。在一些實施例中，Fc域包含胺基酸取代L234A及L235A(根據Kabat EU索引編號)。在一個此類實施例中，Fc域為IgG1 Fc域，特定言之，人類IgG1 Fc域。在一個實施例中，Fc域包含位置P329處之胺基酸取代。在一個更具體實施例中，胺基酸取代為P329A或P329G，特定言之，P329G(根據Kabat EU索引編號)。在一個實施例中，Fc域包含位置P329處之胺基酸取代以及選自E233、L234、L235、N297及P331之位置處的另一胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在一個具體實施例中，該另一胺基酸取代為E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定實施例中，Fc域包含位置P329、L234及L235處之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在更多特定實施例中，Fc域包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G(「P329G LALA」、「PGLALA」或「LALAPG」)。具體而言，在特定實施例中，Fc域中之各次單元包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G(Kabat EU索引編號)，亦即，在Fc域之第一及第二次單元中之每一者中，位置234處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L234A)，位置235處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L235A)，且位置329處之脯胺酸殘基經甘胺酸殘基置換(P329G)(根據Kabat EU索引編號)。
在一個此類實施例中，Fc域為IgG1 Fc域，特定言之，人類IgG1 Fc域。「P329G LALA」之胺基酸取代組合幾乎完全消除人類IgG1 Fc域與Fcγ受體(以及補體)之結合，如PCT公開案第WO 2012/130831號中所描述，該案以全文引用之方式併入本文中。WO 2012/130831亦描述製備 此類突變型Fc域之方法及用於測定其特性(諸如Fc受體結合或效應功能)之方法。
IgG4抗體展現相比於IgG1抗體，與Fc受體之結合親和力減弱及/或效應功能減低。因此，在一些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合分子的Fc域為IgG4 Fc域，特定言之，人類IgG4 Fc域。在一個實施例中，IgG4 Fc域包含位置S228處之胺基酸取代，具體而言，胺基酸取代S228P(根據Kabat EU索引編號)。為了進一步使其與Fc受體之結合親和力減弱及/或使其效應功能減低，在一個實施例中，IgG4 Fc域包含位置L235處之胺基酸取代，具體而言，胺基酸取代L235E(根據Kabat EU索引編號)。在另一個實施例中，IgG4 Fc域包含位置P329處之胺基酸取代，具體而言，胺基酸取代P329G(根據Kabat EU索引編號)。在一個特定實施例中，IgG4 Fc域包含位置S228、L235及P329處之胺基酸取代，具體而言，胺基酸取代S228P、L235E及P329G(根據Kabat EU索引編號)。此類IgG4 Fc域突變體及其Fcγ受體結合性質描述於PCT公開案第WO 2012/130831號中，該案以全文引用之方式併入本文中。
在一個特定實施例中，展現相比於原生IgG1 Fc域，與Fc受體之結合親和力減弱及/或效應功能減低的Fc域為包含胺基酸取代L234A、L235A及視情況存在之P329G的人類IgG1 Fc域，或包含胺基酸取代S228P、L235E及視情況存在之P329G的人類IgG4 Fc域(根據Kabat EU索引編號)。
在某些實施例中，Fc域之N-糖基化已消除。在一個此類實施例中，Fc域包含位置N297處之胺基酸突變，特定言之，丙胺酸置換天冬醯胺之胺基酸取代(N297A)或天冬胺酸置換天冬醯胺之胺基酸取代 (N297D)(根據Kabat EU索引編號)。
除上文及在PCT公開案第WO 2012/130831號中所描述之Fc域以外，Fc受體結合減弱及/或效應功能減低之Fc域亦包括具有對Fc域殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者的取代的彼等Fc域(美國專利第6,737,056號)(根據Kabat EU索引編號)。此類Fc突變體包括具有胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或超過兩者處的取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂的「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
突變型Fc域可使用此項技術中熟知之遺傳學或化學方法，藉由胺基酸缺失、取代、插入或修飾來製備。遺傳學方法可包括DNA編碼序列之位點特異性突變誘發、PCR、基因合成及其類似方法。恰當的核苷酸變化可藉由例如定序來檢驗。
與Fc受體之結合可容易地加以測定，例如藉由ELISA，或藉由表面電漿子共振(SPR)，使用諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)之標準儀器及諸如可藉由重組表現來獲得之Fc受體來加以測定。或者，Fc域或包含Fc域之細雙特異性抗原結合分子對Fc受體的結合親和力可使用已知表現特定Fc受體之細胞株(諸如表現FcγIIIa受體之人類NK細胞)來加以評估。
Fc域或包含Fc域之雙特異性抗原結合分子的效應功能可藉由此項技術中已知之方法來進行量測。用於評定所關注分子之ADCC活性的活體外分析實例描述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)及Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)中。或者，可採用非放射性分析方法 (參見例如用於流式細胞量測術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。或者或另外，可在活體內評定所關注分子之ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中所揭示之動物模型中。
在一些實施例中，Fc域與補體組分(具體而言，與C1q)之結合減弱。因此，在其中Fc域經工程改造以滿足效應功能減低的一些實施例中，該效應功能減低包括CDC降低。可進行C1q結合分析以確定Fc域或包含該Fc域之雙特異性抗原結合分子是否能夠結合C1q且因此具有CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評定補體活化，可執行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；及Cragg及Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
FcRn結合及活體內清除率/半衰期測定亦可使用此項技術中已知之方法來執行(參見例如Petkova,S.B.等人，Int.Immunol.18(12)：1759-1769(2006)；WO 2013/120929)。
聚核苷酸
本發明進一步提供編碼如本文所描述之抗體或雙特異性抗原結合分子或其片段的經分離之聚核苷酸。在一些實施例中，該片段為抗原結合片段。
編碼本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子的聚核苷酸可以編碼整 個抗體或雙特異性抗原結合分子之單個聚核苷酸形式或以共表現之多個(例如兩個或超過兩個)聚核苷酸形式表現。由共表現之聚核苷酸編碼的多肽可經由例如二硫鍵或其他方式締合以形成功能性抗體或雙特異性抗原結合分子。舉例而言，抗體或雙特異性抗原結合分子之輕鏈部分可由與包含該抗體或雙特異性抗原結合分子之重鏈的該抗體或雙特異性抗原結合分子之部分分開的單獨聚核苷酸編碼。當共表現時，重鏈多肽將與輕鏈多肽締合以形成抗體或雙特異性抗原結合分子。在另一個實例中，包含兩個Fc域次單元中之一者及視情況存在之一或多個Fab分子(之一部分)的抗體或雙特異性抗原結合分子之部分可由與包含該兩個Fc域次單元中之另一者及視情況存在之Fab分子(之一部分)的該抗體或雙特異性抗原結合分子之部分分開的單獨聚核苷酸編碼。當共表現時，Fc域次單元將締合以形成Fc域。
在一些實施例中，經分離之聚核苷酸編碼如本文所描述的根據本發明之整個抗體或雙特異性抗原結合分子。在其他實施例中，經分離之聚核苷酸編碼如本文所描述的根據本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子中所包含的多肽。
在某些實施例中，聚核苷酸或核酸為DNA。在其他實施例中，本發明之聚核苷酸為RNA，例如呈信使RNA(mRNA)形式。本發明之RNA可為單股或雙股RNA。
重組方法
本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子可例如藉由固態肽合成(例如梅里菲爾德固相合成法(Merrifield solid phase synthesis))或重組產生來獲得。對於重組產生，分離出一或多種編碼抗體或雙特異性抗原結合分子(片 段)之聚核苷酸(例如，如上文所描述之聚核苷酸)，且將其插入至一或多個載體中以用於在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此類聚核苷酸可使用習知程序容易地加以分離及定序。在一個實施例中，提供包含本發明之一或多種聚核苷酸的載體，較佳為表現載體。熟習此項技術者熟知之方法可用於構築含有抗體或雙特異性抗原結合分子(片段)之編碼序列以及適當轉錄/轉譯控制信號的表現載體。此等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/基因重組。參見例如Maniatis等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；及Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)中所描述之技術。表現載體可為質體、病毒之一部分，或可為核酸片段。表現載體包括其中選殖有與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件可操作締合的編碼抗體或雙特異性抗原結合分子(片段)之聚核苷酸(亦即編碼區)的表現卡匣。如本文所用，「編碼區」為由轉譯成胺基酸之密碼子組成的核酸之一部分。儘管「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)未轉譯成胺基酸，但其(若存在)可視為編碼區之一部分，但任何側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5'及3'非轉譯區及類似序列)不為編碼區之一部分。兩個或超過兩個編碼區可存在於單個聚核苷酸構築體中，例如單個載體上或單獨聚核苷酸構築體中，例如單獨(不同)載體上。此外，任何載體均可含有單個編碼區，或可包含兩個或超過兩個編碼區，例如本發明之載體可編碼一或多個多肽，其經由蛋白水解切割而轉譯後或共轉譯分離成最終蛋白質。另外，本發明之載體、聚核苷酸或核酸可編碼異源編碼區，該異源編碼區與編碼本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子 (片段)或其變異體或衍生物的聚核苷酸融合或未融合。異源編碼區包括(但不限於)專用元件或基元，諸如分泌性信號肽或異源功能域。可操作締合為基因產物(例如多肽)之編碼區與一或多個調節序列締合的方式使該基因產物之表現處於該(等)調節序列之影響或控制下。若誘導啟動子功能引起編碼所要基因產物之mRNA轉錄且若兩個DNA片段之間連接的性質不干擾表現調節序列導引基因產物之表現的能力或不干擾DNA模板進行轉錄之能力，則該兩個DNA片段(諸如多肽編碼區及與其締合之啟動子)係「可操作地締合」。因此，若啟動子能夠實現核酸轉錄，則啟動子區將與編碼多肽之核酸可操作地締合。啟動子可為僅在預定細胞中導引DNA之實質性轉錄的細胞特異性啟動子。除啟動子以外之其他轉錄控制元件(例如強化子、操縱子、抑制子及轉錄終止信號)可與導引細胞特異性轉錄之聚核苷酸可操作地締合。適合之啟動子及其他轉錄控制區揭示於本文中。多個轉錄控制區為熟習此項技術者已知的。此等區包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，諸如(但不限於)啟動子及強化子區段，其來自巨細胞病毒(例如即刻早期啟動子，與內含子A結合)、猿猴病毒40(例如早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因之彼等區(諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔β-血球蛋白)，以及能夠在真核細胞中控制基因表現之其他序列。額外適合之轉錄控制區包括組織特異性啟動子及強化子以及誘導性啟動子(例如啟動子誘導性四環素)。類似地，多種轉譯控制元件為一般技術者已知的。此等元件包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，以及來源於病毒系統之元件(特定言之，內部核糖體入口位點或IRES，亦稱為CITE序列)。表現卡匣亦可包括其他特徵，諸如複製起點，及/或染色 體整合元件，諸如反轉錄病毒長末端重複序列(LTR)，或腺相關聯病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)。
本發明之聚核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌肽或信號肽之額外編碼區締合，該等額外編碼區導引由本發明聚核苷酸編碼之多肽的分泌。舉例而言，若需要分泌抗體或雙特異性抗原結合分子，則可將編碼信號序列之DNA置於編碼本發明抗體或雙特異性抗原結合分子或其片段之核酸的上游。根據信號假設，哺乳動物細胞所分泌之蛋白質具有信號肽或分泌性前導序列，一旦生長蛋白質鏈跨越粗糙內質網之輸出已起始，該信號肽或分泌性前導序列自成熟蛋白質切割。一般技術者認識到，脊椎動物細胞分泌之多肽一般具有與該多肽之N端融合的信號肽，該信號肽自經轉譯之多肽切割而產生分泌或「成熟」形式之多肽。在某些實施例中，使用原生信號肽，例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽，或保留導引與其可操作締合之多肽之分泌的能力的該序列之功能衍生物。或者，可使用異源哺乳動物信號肽或其功能衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶之前導序列取代。
編碼可用以促進抗體或雙特異性抗原結合分子之稍後純化之短蛋白質序列(例如組胺酸標籤)或有助於對該抗體或雙特異性抗原結合分子進行標記之短蛋白質序列的DNA可包括於編碼該抗體或雙特異性抗原結合分子(片段)之聚核苷酸內或其末端處。
在另一實施例中，提供包含本發明之一或多種聚核苷酸的宿主細胞。在某些實施例中，提供包含本發明之一或多種載體的宿主細胞。聚核苷酸及載體可單獨或組合地併有本文分別與聚核苷酸及載體相關描述之任一特徵。在一個此類實施例中，宿主細胞包含有包含編碼本發明抗體 或雙特異性抗原結合分子(之一部分)之一或多種聚核苷酸的一或多種載體(例如，已經其轉型或經其轉染)。如本文所用，術語「宿主細胞」係指可經工程改造以產生本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子或其片段的任何種類之細胞系統。適合於複製及支持抗體或雙特異性抗原結合分子之表現的宿主細胞在此項技術中已熟知。此類細胞適當時可經特定表現載體轉染或轉導，且可使大量含有載體之細胞生長而用於接種大型醱酵器，以獲得足以用於臨床應用之量的抗體或雙特異性抗原結合分子。適合之宿主細胞包括原核微生物，諸如大腸桿菌，或各種真核細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞或其類似物。舉例而言，多肽可在細菌中產生，尤其在不需要糖基化時如此產生。在表現之後，多肽可在可溶性級分中自細菌細胞糊狀物中分離，且可進一步進行純化。除原核生物以外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適合於編碼多肽之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而產生具有部分或完全人類糖基化型態之多肽的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)，及Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。適合於表現(糖基化)多肽之宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出許多可與昆蟲細胞結合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述用於在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術)。脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適應在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用之哺乳動物宿主細胞株的其他實例為經SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7)；人 類胎腎細胞株(293或293T細胞，如例如Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中所描述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell)(TM4細胞，如例如Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所描述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞(MMT 060562)；TRI細胞(如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所描述)；MRC 5細胞及FS4細胞。其他適用之哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr- CHO細胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。對適合於蛋白質產生之某些哺乳動物宿主細胞株的綜述參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。宿主細胞包括經培養之細胞，例如經培養之哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞及植物細胞(僅舉數例)，以及轉基因動物、轉基因植物或經培養之植物或動物組織中所包含的細胞。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，較佳為哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。
在此等系統中表現外來基因之標準技術為此項技術中已知的。表現包含抗原結合域之重鏈或輕鏈的多肽(諸如抗體)的細胞可經工程改造以便亦表現抗體鏈中之另一者，以使得所表現之產物為具有重鏈及輕鏈兩者之抗體。
在一個實施例中，提供一種產生本發明之抗體或雙特異性 抗原結合分子的方法，其中該方法包含在適合於表現該抗體或雙特異性抗原結合分子的條件下培養如本文所提供的包含編碼抗體或雙特異性抗原結合分子之聚核苷酸的宿主細胞，及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體或雙特異性抗原結合分子。
本發明之雙特異性抗原結合分子(或抗體)的組分可彼此基因融合。雙特異性抗原結合分子可經設計以使得其組分彼此直接融合或經由連接序列間接融合。連接子之組成及長度可根據此項技術中熟知之方法確定且可測試其功效。本文提供雙特異性抗原結合分子之不同組分之間的連接序列之實例。亦可包括額外序列以併有切割位點，從而在必要時分離融合體之個別組分，該等額外序列例如肽鏈內切酶識別序列。
本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子一般包含至少一個能夠結合抗原決定子之抗體可變區。可變區可形成天然或非天然存在之抗體及其片段的一部分且來源於天然或非天然存在之抗體及其片段。產生多株抗體及單株抗體之方法為此項技術中熟知的(參見例如Harlow及Lane,「Antibodies,a laboratory manual」,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在之抗體可使用固相肽合成法來構築，可以重組方式產生(例如，如美國專利第4,186,567號中所描述)或可藉由例如篩選包含可變重鏈及可變輕鏈之組合文庫來獲得(參見例如McCafferty之美國專利第5,969,108號)。
任何動物物種之抗體、抗體片段、抗原結合域或可變區均可用於本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子中。適用於本發明之非限制性抗體、抗體片段、抗原結合域或可變區可具有鼠類、靈長類動物或人類來源。若抗體或雙特異性抗原結合分子意欲用於人類使用，則可使用嵌合 形式之抗體，其中抗體之恆定區來自人類。人類化或完全人類形式之抗體亦可根據此項技術中熟知之方法來製備(參見例如Winter之美國專利第5,565,332號)。人類化可藉由各種方法達成，包括(但不限於)(a)將非人類(例如供體抗體)CDR移植至人類(例如受者抗體)構架區及恆定區上，保留或不保留關鍵構架殘基(例如對於保留良好抗原結合親和力或抗體功能而言具有重要作用之彼等殘基)；(b)僅將非人類特異性決定區(SDR或a-CDR；對於抗體-抗原相互作用而言具有關鍵作用之殘基)移植至人類構架區及恆定區上；或(c)移植整個非人類可變域，但藉由表面殘基置換而用人類類似區段對其進行「遮掩」。人類化抗體及其產生方法綜述於例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且進一步描述於例如Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述特異性決定區(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述「表面再塑」)；Dall'Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述FR改組之「導引選擇」方法)中。可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合(best-fit)」法選擇之構架區(參見例如Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993))；來源於具有輕鏈或重鏈可變區特定子組之人類抗體的共同序列之構架區(參見例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,Front.Biosci. 13：1619-1633(2008))；及來源於篩選FR文庫之構架區(參見例如Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
可使用此項技術中已知之各種技術來產生人類抗體。人類抗體大體上描述於van Dijk及van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)及Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)中。人類抗體可藉由向已經修飾以響應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的轉殖基因動物投與免疫原來製備。此類動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，其置換內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此類轉殖基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座一般已失活。對用於自轉殖基因動物獲得人類抗體之方法的綜述參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。亦參見例如，描述XENOMOUSETM技術之美國專利第6,075,181號及第6,150,584號；描述HUMAB®技術之美國專利第5,770,429號；描述K-M MOUSE®技術的美國專利第7,041,870號；及描述VELOCIMOUSE®技術之美國專利申請公開案第US 2007/0061900號。由此類動物產生之完整抗體的人類可變區可進一步經修飾，例如藉由與不同人類恆定區組合而修飾。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製得。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜骨髓瘤細胞株。(參見例如Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991)。)經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。額外方法包括描述於例如美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue 26(4)：265-268(2006)(描述人類-人類融合瘤)中之彼等方法。人類融合瘤技術(三源融合瘤技術(Trioma technology))亦描述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3)：927-937(2005)及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)中。
如本文所描述，人類抗體亦可藉由自人類抗體文庫分離而產生。
適用於本發明中之抗體可藉由自組合文庫中篩選出具有所要一或多種活性之抗體來分離。用於篩選組合文庫之方法綜述於例如Lerner等人之Nature Reviews 16：498-508(2016)中。舉例而言，此項技術中已知多種方法用於產生噬菌體呈現文庫及自此類文庫篩選出具有所要結合特徵之抗體。此類方法綜述於例如Frenzel等人之mAbs 8：1177-1194(2016)；Bazan等人之Human Vaccines and Immunotherapeutics 8：1817-1828(2012)，及Zhao等人之Critical Reviews in Biotechnology 36：276-289(2016)，以及Hoogenboom等人之Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,2001)，以及Marks及Bradbury之Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編，Human Press,Totowa,NJ,2003)。
在某些噬菌體呈現方法中，VH及VL基因之譜系分別藉由聚合酶鏈反應(PCR)選殖且在噬菌體文庫中隨機重組，隨後可如Winter等人之Annual Review of Immunology 12：433-455(1994)中所描述，自其中篩 選出抗原結合性噬菌體。噬菌體通常以單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。來自經免疫來源之文庫提供針對免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，可選殖(例如自人類選殖)原始譜系以提供針對廣泛範圍之非自體抗原以及自體抗原的單一抗體來源而無需任何免疫接種，如Griffiths等人在EMBO Journal 12：725-734(1993)中所描述。最終，原始文庫亦可以合成方式藉由自幹細胞選殖未經重排之V基因區段，且使用含有隨機序列以編碼高度可變CDR3區及實現活體外重排之PCR引子來製得，如由Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)所描述。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號、第7,985,840號、第7,785,903號及第8,679,490號以及美國專利公開案第2005/0079574號、第2007/0117126號、第2007/0237764號及第2007/0292936號。此項技術中已知的用於自組合文庫篩選出具有一或多種所要活性之抗體的方法之其他實例包括核糖體及mRNA呈現，以及用於在細菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母細胞上進行抗體呈現及選擇之方法。用於酵母表面呈現之方法綜述於例如Scholler等人之Methods in Molecular Biology 503：135-56(2012)及Cherf等人之Methods in Molecular biology 1319：155-175(2015)以及Zhao等人之Methods in Molecular Biology 889：73-84(2012)中。用於核糖體呈現之方法描述於例如He等人之Nucleic Acids Research 25：5132-5134(1997)及Hanes等人之PNAS 94：4937-4942(1997)。
如本文所描述而製備之抗體或雙特異性抗原結合分子可藉由此項技術已知之技術來進行純化，諸如高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、尺寸排阻層析及其類似技術。用於純化特定蛋白質 之實際條件將部分地視諸如淨電荷、疏水性、親水性等因素而定，且對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的。對於親和層析純化，可使用抗體或雙特異性抗原結合分子結合之抗體、配位體、受體或抗原。舉例而言，對於本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子的親和層析純化，可使用具有蛋白A或蛋白G之基質。依序進行之蛋白A或G親和層析及尺寸排阻層析可用於基本上如實例中所描述來分離抗體或雙特異性抗原結合分子。抗體或雙特異性抗原結合分子之純度可藉由多種熟知分析方法(包括凝膠電泳、高壓液相層析及其類似方法)中之任一者來加以測定。
組合物、調配物及投藥途徑
在另一態樣中，本發明提供包含本文所提供之抗體或雙特異性抗原結合分子中之任一者的醫藥組合物，其例如用於任一以下治療方法。在一個實施例中，醫藥組合物包含本文所提供之抗體或雙特異性抗原結合分子中之任一者及醫藥學上可接受之載劑。在另一個實施例中，醫藥組合物包含本文所提供之抗體或雙特異性抗原結合分子中之任一者及至少一種額外治療劑，例如，如下文所描述之治療劑。
進一步提供一種以適合於活體內投藥之形式產生本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子的方法，該方法包含(a)獲得根據本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子，及(b)用至少一種醫藥學上可接受之載劑調配該抗體或雙特異性抗原結合分子，藉此調配出用於活體內投藥的抗體或雙特異性抗原結合分子之製劑。
本發明之醫藥組合物包含治療有效量之抗體或雙特異性抗原結合分子溶解或分散於醫藥學上可接受之載劑中。片語「醫藥學上或藥 理學上可接受」係指分子實體及組合物在所用劑量及濃度下對於接受者而言一般無毒性，亦即當適當時向動物(諸如人類)投與時，不會產生有害、過敏或其他不良反應。含有抗體或雙特異性抗原結合分子及視情況存在之額外活性成分的醫藥組合物的製備將為熟習此項技術者鑒於本發明已知的，如由Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990所例示，該文獻以引用之方式併入本文中。此外，關於動物(例如人類)投藥，應理解，製劑應滿足FDA生物學標準局(FDA Office of Biological Standards)或其他國家之相應機關所要求的無菌性、發熱性、總體安全及純度標準。較佳組合物為凍乾調配物或水溶液。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、緩衝劑、分散介質、塗料、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等張劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、抗氧化劑、蛋白質、藥物、藥物穩定劑、聚合物、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料、此類類似材料及其組合，如一般技術者將已知的(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990，第1289-1329頁，該文獻以引用之方式併入本文中)。除非任何習知載劑與活性成分不相容，否則涵蓋其在治療或醫藥組合物中之用途。
本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子(及任何額外治療劑)可藉由任何適合之方式來進行投與，包括非經腸、肺內及鼻內投藥以及在對於局部治療必要時，病灶內投藥。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。部分地視投藥之短期或長期性而定，給藥可藉由任何適合之途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)來進行。
非經腸組合物包括經設計以用於藉由注射(例如皮下、皮 內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹膜內注射)投藥的彼等組合物。對於注射，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子可於水溶液中進行調配，較佳於生理學上相容之緩衝液(諸如漢克氏溶液(Hanks' solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理鹽水緩衝液)中進行調配。溶液可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，抗體或雙特異性抗原結合分子可呈用於在使用之前用適合之媒劑(例如無菌無熱原質水)復原的粉末形式。無菌可注射溶液係藉由以所需量將本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子製備併入視需要具有下文所列舉之各種其他成分的適當溶劑中來製備。無菌性可藉由例如經由無菌過濾膜過濾來容易地實現。一般而言，分散液係藉由將各種經滅菌之活性成分併入含有基本分散介質及/或其他成分之無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液、懸浮液或乳液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，其由活性成分加任何額外所要成分的預先無菌過濾之液體介質得到該活性成分加任何額外所要成分之粉末。必要時，液體介質宜經緩衝，且在注射之前，首先用足量鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑呈等張性。組合物在製造及儲存條件下必須為穩定的，且必須避免諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。應瞭解，內毒素污染應最低限度地保持在安全水準，例如每毫克蛋白質低於0.5ng。適合的醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚 合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之化合物，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、聚葡萄糖或其類似物。視情況，懸浮液亦可含有適合的穩定劑或增加化合物溶解性之藥劑以允許製備高度濃縮之溶液。另外，活性化合物之懸浮液可製備為適當之油性注射懸浮液。適合之親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯；或脂質體。
活性成分可包覆於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微囊中，分別例如羥甲基纖維素或明膠微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊中；包覆於膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或包覆於巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)中。可製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有多肽之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如膜或微膠囊。在特定實施例中，可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來達成。
除先前所描述之組合物以外，抗體或雙特異性抗原結合分子亦可調配為儲槽式製劑。此類長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內植入)或藉由肌肉內注射來進行投與。因此，舉例而言，抗體或雙特異性抗原結合分子可用適合之聚合性或疏水性材料(例如呈可接受之油中的乳液 形式)或離子交換樹脂進行調配，或調配為微溶性衍生物，例如調配為微溶性鹽。
包含本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子的醫藥組合物可藉助於習知混合、溶解、乳化、囊封、包覆或凍乾法來製造。醫藥組合物可使用有利於將蛋白質處理成可在醫藥學上使用之製劑的一或多種生理學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑，以習知方式進行調配。適當調配物視所選投藥途徑而定。
抗體或雙特異性抗原結合分子可調配為呈游離酸或鹼、中性或鹽形式之組合物。醫藥學上可接受之鹽為基本上保留游離酸或鹼之生物活性的鹽。此等鹽包括酸加成鹽，例如與蛋白質組合物之自由胺基形成的彼等鹽，或與無機酸(諸如鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、乙二酸、酒石酸或杏仁酸)形成的鹽。與自由羧基形成之鹽亦可衍生自無機鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)。醫藥鹽傾向於比對應之游離鹼形式更可溶於水性及其他質子溶劑中。
治療方法及組合物
本文所提供之抗體或雙特異性抗原結合分子中之任一者均可用於治療方法中。本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子可用作免疫治療劑，例如用於治療癌症。
對於在治療方法中使用，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子可以與良好醫學實踐相符之方式進行調配、給藥及投與。在此情形下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者 之臨床病狀、病症起因、藥劑遞送位點、投藥方法、投藥時程及醫學從業者已知之其他因素。
在一個態樣中，提供本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子，其用作藥劑。在其他態樣中，提供本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子，其用於治療疾病。在某些實施例中，提供本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子，其用於治療方法中。在一個實施例中，本發明提供一種如本文所描述之抗體或雙特異性抗原結合分子，其用於在有需要之個體中治療疾病。在某些實施例中，本發明提供一種抗體或雙特異性抗原結合分子，其用於治療患有疾病之個體的方法中，該方法包含向該個體投與治療有效量之該抗體或雙特異性抗原結合分子。在某些實施例中，待治療之疾病為增生性病症。在一個特定實施例中，疾病為癌症。在某些實施例中，該方法進一步包含向個體投與治療有效量之至少一種額外治療劑，例如若待治療之疾病為癌症，則投與抗癌劑。在其他實施例中，本發明提供一種如本文所描述之抗體或雙特異性抗原結合分子，其用於誘導靶細胞(特定言之，腫瘤細胞)之溶解。在某些實施例中，本發明提供一種抗體或雙特異性抗原結合分子，其用於在個體中誘導靶細胞(特定言之，腫瘤細胞)之溶解的方法中，該方法包含向該個體投與有效量之該抗體或雙特異性抗原結合分子以誘導靶細胞之溶解。根據任一上文實施例之「個體」為哺乳動物，較佳為人類。
在另一態樣中，本發明提供本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子的用途，其用於製造或製備藥劑。在一個實施例中，藥劑係用於在有需要之個體中治療疾病。在另一實施例中，藥劑係用於治療疾病之方法中，該方法包含向患有該疾病之個體投與治療有效量之該藥劑。在某些 實施例中，待治療之疾病為增生性病症。在一個特定實施例中，疾病為癌症。在一個實施例中，該方法進一步包含向個體投與治療有效量之至少一種額外治療劑，例如若待治療之疾病為癌症，則投與抗癌劑。在另一實施例中，藥劑係用於誘導靶細胞(特定言之，腫瘤細胞)之溶解。在再另一實施例中，藥劑係用於在個體中誘導靶細胞(特定言之，腫瘤細胞)之溶解的方法中，該方法包含向該個體投與有效量之該藥劑以誘導靶細胞之溶解。根據任一上文實施例之「個體」可為哺乳動物，較佳為人類。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療疾病之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有此類疾病之個體投與治療有效量的本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，向該個體投與包含本發明本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子、呈醫藥學上可接受之形式的組合物。在某些實施例中，待治療之疾病為增生性病症。在一個特定實施例中，疾病為癌症。在某些實施例中，該方法進一步包含向個體投與治療有效量之至少一種額外治療劑，例如若待治療之疾病為癌症，則投與抗癌劑。根據任一上文實施例之「個體」可為哺乳動物，較佳為人類。
在另一態樣中，本發明提供一種用於誘導靶細胞(特定言之，腫瘤細胞)之溶解的方法。在一個實施例中，該方法包含使靶細胞與本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子在T細胞(特定言之，細胞毒性T細胞)存在下接觸。在另一態樣中，提供一種用於在個體中誘導靶細胞(特定言之，腫瘤細胞)之溶解的方法。在一個此類實施例中，該方法包含向個體投與有效量之抗體或雙特異性抗原結合分子以誘導靶細胞之溶解。在一個實施例中，「個體」為人類。
在某些實施例中，待治療之疾病為增生性病症，特定言之， 癌症。癌症之非限制性實例包括血液癌症(諸如白血病)、膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰臟癌、膽癌、甲狀腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、肉瘤、骨癌及腎癌。可使用本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子治療的其他細胞增殖病症包括(但不限於)定位於以下部位中之贅瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系統、肝臟、胰臟、腹膜、內分泌腺體(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睾丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼部、頭頸部、神經系統(中樞及周邊)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾臟、胸部以及泌尿生殖系統。亦包括癌前病狀或病變及癌症轉移。在某些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：血液癌症(諸如白血病)、腎癌、膀胱癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、腦癌、頭頸癌及前列腺癌。在一個實施例中，癌症為血液癌症，特定言之，白血病，最特定言之，急性淋巴母細胞性白血病(ALL)或急性骨髓性白血病(AML)。熟練技術人員容易認識到，在許多情況下，抗體或雙特異性抗原結合分子可能不會提供治癒，而僅可提供部分益處。在一些實施例中，具有一些益處之生理學變化亦視為治療上有益的。因此，在一些實施例中，提供生理學變化的抗體或雙特異性抗原結合分子之量視為「有效量」或「治療有效量」。個體(subject)、患者或需要治療之個體(individual)通常為哺乳動物，更具體而言，人類。
在一些實施例中，向細胞投與有效量的本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子。在其他實施例中，向個體投與治療有效量的本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子以用於治療疾病。
對於預防或治療疾病，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子的適當劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視以 下而定：待治療之疾病的類型、投藥途徑、患者體重、抗體或雙特異性抗原結合分子之類型、疾病之嚴重程度及病程、投與抗體或雙特異性抗原結合分子是出於預防還是治療目的、先前或並行治療介入、患者之臨床病史及對抗體或雙特異性抗原結合分子之反應、以及主治醫師之判斷。負責投藥之從業者將在任何情況下確定組合物中活性成分之濃度及適用於個別個體之劑量。本文涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或經各個時間點多次投藥、快速投藥(bolus administration)及脈衝式輸注。
抗體或雙特異性抗原結合分子宜一次性或歷經一系列治療向患者投與。視疾病之類型及嚴重程度而定，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)之抗體或雙特異性抗原結合分子可為用於例如藉由一或多次獨立投與或藉由連續輸注來向患者投與之初始候選劑量。視上文所提及之因素而定，一種典型日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或超過100mg/kg之範圍內。對於歷經數日或更長時間之重複投與，視病狀而定，治療一般將持續至發生疾病症狀之所要抑制為止。抗體或雙特異性抗原結合分子之一個例示性劑量將在約0.005mg/kg至約10mg/kg範圍內。在其他非限制性實例中，每次投藥時的劑量亦可包含每公斤體重約1微克、每公斤體重約5微克、每公斤體重約10微克、每公斤體重約50微克、每公斤體重約100微克、每公斤體重約200微克、每公斤體重約350微克、每公斤體重約500微克、每公斤體重約1毫克、每公斤體重約5毫克、每公斤體重約10毫克、每公斤體重約50毫克、每公斤體重約100毫克、每公斤體重約200毫克、每公斤體重約350毫克、每公斤體重約500毫克至每公斤體重約1000毫克或超過1000毫克，及可自其中推導之任何範圍。在本文所列數字之可推導範圍的非限制性實例中，基於上文所描述之數字，可投與之範圍為每公斤體 重約5mg至每公斤體重約100mg、每公斤體重約5微克至每公斤體重約500毫克等。因此，可向患者投與約0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或其任何組合)之一或多個劑量。此類劑量可為間歇地，例如每週或每三週進行投與(例如，使得患者接受約兩個至約二十個，或例如約六個劑量之抗體或雙特異性抗原結合分子)。可投與初始較高起始劑量，後接一或多個較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程易於藉由習知技術及分析來監測。
本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子一般將以有效達成預期目的之量進行使用。對於用以治療或預防疾病病狀，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子或其醫藥組合物以治療有效量進行投與或施用。治療有效量之確定完全屬於熟習此項技術者之能力範圍內，尤其根據本文所提供之詳細揭示內容。
對於全身性投藥，治療有效劑量可首先由活體外分析(諸如細胞培養分析)估算。可隨後在動物模型中調配劑量以達成循環濃度範圍，包括如在細胞培養物中所測定之IC50。此類資訊可用於更準確地確定適用於人類之劑量。
初始劑量亦可由活體內資料(例如動物模型)，使用此項技術中熟知之技術估算。一般熟習此項技術者容易基於動物資料而使向人類投藥最佳化。
給藥量及時間間隔可個別地進行調整以提供足以維持治療作用的抗體或雙特異性抗原結合分子之血漿含量。常見的患者注射投藥劑量在每天約0.1至50mg/kg，通常每天約0.5至1mg/kg之範圍內。治療有效血漿含量可藉由每天投與多次劑量來達成。血漿含量可藉由例如HPLC來 進行量測。
在局部投藥或選擇性攝取之情況下，抗體或雙特異性抗原結合分子之有效局部濃度可能不與血漿濃度相關。熟習此項技術者能夠使治療有效局部劑量最佳化而無需不當實驗。
本文所描述之抗體或雙特異性抗原結合分子的治療有效劑量一般將提供治療益處而不會導致實質性毒性。抗體或雙特異性抗原結合分子之毒性及治療功效可在細胞培養物或實驗動物中藉由標準醫藥程序來加以確定。可使用細胞培養分析及動物研究來確定LD50(50%群體致死劑量)及ED50(50%群體治療有效劑量)。毒性作用與治療作用之間的劑量比率為治療指數，其可表示為比率LD50/ED50。展現較大治療指數之抗體或雙特異性抗原結合分子為較佳的。在一個實施例中，根據本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子展現高治療指數。自細胞培養分析及動物研究獲得之資料可用於調配適用於人類之劑量範圍。劑量較佳在循環濃度範圍內，其包括毒性極小或無毒性之ED50。劑量可視多種因素而在此範圍內變化，該等因素例如所用劑型、所用投藥途徑、個體之條件及其類似因素。準確之調配物、投藥途徑及劑量可由個別醫師鑒於患者之條件來選擇(參見例如Fingl等人，1975,The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1頁，該文獻以全文引用之方式併入本文中)。
用本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子治療之患者的主治醫師應知曉由於毒性、器官功能異常及類似因素而如何及何時終止、中斷或調整投藥。相反，主治醫師亦應知曉若臨床反應不充足(排除毒性)，則將治療調整至較高水準。管理所關注病症時所投與之劑量的量值將隨待治療之病狀的嚴重度、投藥途徑及其類似因素而變化。病狀之嚴重度可例 如部分地藉由標準預後評估方法來加以評估。此外，劑量及可能之給藥頻率亦將根據個別患者之年齡、體重及反應而變化。
其他藥劑及治療
本發明之抗體及雙特異性抗原結合分子可在療法中與一或多種其他藥劑組合進行投與。舉例而言，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子可與至少一種額外治療劑共同投與。術語「治療劑」涵蓋為了在需要此類治療之個體中治療症狀或疾病而投與的任何藥劑。此類額外治療劑可包含適合於所治療之特定適應症的任何活性成分，較佳為具有互補活性、彼此間無不利影響的彼等活性成分。在某些實施例中，額外治療劑為免疫調節劑、細胞生長抑制劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性劑、細胞凋亡活化劑或增加細胞對細胞凋亡誘導劑之敏感性的藥劑。在一個特定實施例中，額外治療劑為抗癌劑，例如微管中斷劑、抗代謝物、拓樸異構酶抑制劑、DNA嵌入劑、烷化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡活化劑，或抗血管生成劑。
此類其他藥劑宜以有效用於預期目的之量組合存在。此類其他藥劑之有效量視所用抗體或雙特異性抗原結合分子之量、病症或治療之類型及上文所論述其他因素而定。抗體或雙特異性抗原結合分子一般以與本文所描述相同之劑量及投藥途徑進行使用，或以本文所描述之劑量的約1%至99%進行使用，或以憑經驗/臨床上確定為適當之任何劑量及任何途徑進行使用。
上述此類組合療法涵蓋組合投藥(其中在同一或分開之組合物中包括兩種或超過兩種治療劑)以及單獨投藥，在此情況下，本發明之抗 體或雙特異性抗原結合分子或抗體的投與可在額外治療劑及/或助劑投與之前、同時及/或之後進行。本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子亦可與放射線療法組合使用。
製品
在本發明之另一態樣中，提供一種含有適用於治療、預防及/或診斷上文所描述之病症之材料的製品。製品包含容器及處於容器上或容器隨附之標籤或藥品說明書。適合之容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。容器容納單獨組合物或與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一種組合物組合的組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子。標籤或藥品說明書指示組合物用於治療所選病狀。此外，製品可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一種細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中的製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病狀之藥品說明書。或者或另外，製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
用於診斷及偵測之方法及組合物
在某些實施例中，本文所提供之任一抗HLA-A2/WT1抗體均適用於偵測HLA-A2/WT1在生物樣品中之存在。如本文所用之術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織，諸如前列腺組織。
在一個實施例中，提供一種抗HLA-A2/WT1抗體，其用於診斷或偵測方之法中。在另一態樣中，提供一種偵測HLA-A2/WT1在生物樣本中之存在的方法。在某些實施例中，該方法包含使生物樣品與如本文所描述之抗HLA-A2/WT1抗體在容許該抗HLA-A2/WT1抗體與HLA-A2/WT1結合之條件下接觸，及偵測在該抗HLA-A2/WT1抗體與HLA-A2/WT1之間是否形成複合物。此類方法可為活體外或活體內方法。在一個實施例中，抗HLA-A2/WT1抗體用於選擇符合用抗HLA-A2/WT1抗體進行治療之條件的個體，例如其中HLA-A2/WT1為用於選擇患者之生物標記物。
可使用本發明之抗體來診斷的例示性病症包括癌症，特定言之，前列腺癌。
在某些實施例中，提供經標記之抗HLA-A2/WT1抗體。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光及放射性標記)，以及例如經由酶反應或分子相互作用間接偵測之部分(諸如酶或配位體)。例示性標記包括(但不限於)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I；螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；若丹明(rhodamine)及其衍生物；丹醯基(dansyl)；傘酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號)；螢光素；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶； 溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與採用過氧化氫使染料前驅物氧化之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)偶合；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基及其類似標記。
實例
以下為本發明之方法及組合物的實例。應理解，考慮到上文所提供之一般描述，可實踐各種其他實施例。
實例1. 產生結合於HLA-A2/WT1之Fab結合子 選擇及篩選抗HLA-A2/WT1 Fab
基於在VL域(3種不同長度)及VH域(6種不同長度)之CDR3中具有序列多樣性的完全人類構架，藉由噬菌體呈現自合成Fab文庫選擇抗HLA-A2/WT1 Fab。
選擇輪(生物淘選(biopanning))在溶液中根據以下方案來執行：1.在塗佈有500nM之生物素化不相關HLA-A2/WT1VLD複合物的經中性抗生物素蛋白塗佈之96孔培養盤上對每文庫池約1012個噬菌粒顆粒進行預清除(pre-clearing)；2.將非HLA-A2/WT1VLD結合性噬菌粒顆粒與100nM生物素化HLA-A2/WT1RMF複合物一起在800μl之總體積中培育0.5小時；3.藉由在震盪器上添加80μl經抗生蛋白鏈菌素塗佈之磁性顆粒持續20分鐘來捕獲生物素化HLA-A2/WT1RMF及特異性結合性噬菌體；4.使用磁性顆粒分離器，用1ml PBS/Tween 20洗滌各別磁性顆粒5-10次且用1ml PBS洗滌5-10次；5.藉由添加1ml 100mM三乙胺(TEA)持續5-10分鐘來使 噬菌體顆粒溶離，且藉由添加1/2體積之1M Tris/HCl pH 7.4來進行中和；6.用經溶離之噬菌體顆粒再感染對數期大腸桿菌TG1細胞，用輔助噬菌體VCSM13感染，在震盪器上於30℃下培育隔夜，且對待用於下一選擇輪之噬菌粒顆粒進行後續PEG/NaCl沈澱。
選擇歷經3至4輪使用100nM之恆定抗原濃度來進行。
除用恆定抗原濃度進行之選擇活動以外，其他選擇活動用遞減之抗原濃度100nM、50nM、10nM及5nM進行以便選擇具有較低親和力之抗體。
HLA-A2/WT1結合分析：用於對藉由噬菌體呈現來獲得之Fab進行表徵的夾心ELISA
將個別純系以細菌方式表現為96孔形式之1ml培養物，且藉由ELISA對上清液進行篩選。特異性結合子定義為對於HLA-A2/WT1RMF信號高於5×背景信號且對於HLA-A2/WT1VLD信號低於3×背景信號。更精確地，在37℃下用10nM HLA-A2/WT1RMF或50nM HLA-A2/WT1VLD塗佈中性抗生物素蛋白96孔條狀培養盤持續30分鐘，後接在室溫下用2%(w/v)牛奶-磷酸鹽緩衝鹽水(MPBS)(200微升/孔)使培養盤阻斷持續1小時。用PBS洗滌培養盤3次，隨後添加含有Fab之細菌上清液，且將該培養盤在室溫下培育1小時。在再用PBS進行3個洗滌步驟之後，添加抗FLAG-HRP二級抗體(Sigma，目錄號A8592)(1：4000)，且在室溫下將培養盤在震盪器上培育1小時。用PBS洗滌培養盤3次，且藉由添加每孔100μl BM Blue POD(Roche)來顯影。藉由添加每孔50μl 1 H2SO4來使酶反應停止。在450nm下讀取OD(參考處於650nm下)，得到最終讀數OD450-650。對ELISA陽性純系進 行下文所描述之動力學篩選實驗。
HLA-A2/WT1結合分析：用於對藉由噬菌體呈現來獲得之Fab進行動力學表徵的表面電漿子共振
藉由使用ProteOn XPR36生物感測器(BioRad)對含Fab之細菌培養上清液進行表面電漿子共振篩選來鑑別特異性結合子。簡言之，在用經溶離之噬菌體顆粒感染對數期大腸桿菌TG1細胞之後，接種單個菌落形成單位(cfu)，且選取其用於在96深孔培養盤中接種1ml表現培養物。
所有實驗均在25℃下使用PBST作為操作緩衝液(10mM PBS，pH 7.4及0.005%(v/v)Tween 20)來執行。使用來自BioRad Inc.(Hercules,CA)的配備有GLC及GLM感測器晶片及偶合試劑(10mM乙酸鈉，pH 4.5，磺基-N-羥基丁二醯亞胺[磺基-NHS]，1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽[EDC]及乙醇胺)之ProteOn XPR36生物感測器。
固定化以30μl/min在GLM晶片上執行。使用標準胺偶合程序使pAb(山羊)抗人類IgG F(ab)2特異性抗體(Jackson ImmunoResearch)在豎直方向上偶合：用EDC(200mM)及磺基-NHS(50mM)之混合物使所有六個配位體通道活化5分鐘。緊接在使表面活化之後，在所有六個通道內注射pAb(山羊)抗人類IgG F(ab)2特異性抗體(50μg/ml，10mM乙酸鈉，pH 5)持續5分鐘。最後，注射1M乙醇胺-HCl(pH 8.5)5分鐘使通道阻斷。最終固定化水準在所有通道上類似，其介於11000至11500RU範圍內。藉由沿著五個單獨水平通道同時注射(30μl/min)持續5分鐘而自大腸桿菌上清液捕獲Fab變異體，且視上清液中Fab之濃度而定，得到介於200至900RU範圍內的含量。沿著第六通道注射條件培養基以提供用於雙重參考目的之 『管線內』空白。一次性動力學量測藉由沿著豎直通道注射一系列HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD稀釋液(100、50、25、12.5、6.25、0nM，50μl/min)持續2分鐘來執行。監測解離持續3分鐘。在ProteOn管理器2.1版中分析動力學資料。處理反應點資料涉及應用點間參考步驟及使用管線內緩衝液空白之雙重參考步驟(Myszka,J Mol Recognit(1999)12,279-284)。在不進行質量傳遞的情況下，將來自重複一次性注射的經處理之資料相對於簡單1：1朗格繆爾結合模型進行擬合(O'Shannessy等人，Anal Biochem(1993)212,457-468)。
對於量測來自以6孔形式進行之HEK生產之上清液的IgG，藉由沿著五個單獨水平通道同時注射(30μl/min)持續5分鐘而自HEK293上清液捕獲IgG變異體，且得到介於200至400RU範圍內的含量。沿著第六通道注射條件培養基以提供用於雙重參考目的之『管線內』空白。一次性動力學量測藉由沿著豎直通道注射一系列HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD稀釋液(100、50、25、12.5、6.25、0nM，50μl/min)持續3分鐘來執行。監測解離持續5分鐘。如上文所描述分析動力學資料。
基於結合概況及與抗原結合之特異性量測值，將結合子列入候選清單，且在細胞結合分析中對其進行量測。
所選所有結合子(11D06、33H09、13B04、11B09、33F05、5E11、13E08、5C01、11G06)之序列提供於本文所包括之序列表中，且概述於下表1中。
Figure 107146108-A0305-02-0181-1
Figure 107146108-A0305-02-0182-2
實例2. 製備HLA-A2/WT1 IgG及HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體選殖
使用習知(非基於PCR)選殖技術將編碼蛋白質之cDNA選殖至載體系統(Evitria)中。載體質體為基因合成的。質體DNA基於陰離子交換層析在低內毒素條件下製備。DNA濃度藉由量測在260nm波長下之吸收來加以確定。序列之正確性用桑格定序(Sanger sequencing)來檢驗(具有視cDNA之大小而定，每質體至多進行兩個定序反應)。
產生
IgG抗體及雙特異性抗體藉由對HEK293 EBNA細胞(在Excell培養基中之無血清懸浮液中培養)進行暫時轉染來產生。將細胞離心且由預溫熱之CD CHO培養基替代培養基。將表現載體在CD CHO培養基中混合，添加聚乙亞胺(PEI)，使溶液渦動且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至搖瓶中，且在具有5% CO2氛圍之培育箱中在37℃下培育3小時。在培育之後，添加具有補充劑之Excell培養基。在轉染之後一天時，添加補充劑。在7天之後，採集細胞上清液，且藉由標準方法來純化。
或者，適應懸浮之CHO K1細胞(原先來自ATCC，且適應在懸浮培養物中無血清生長)用於產生。使種細胞在eviGrow培養基中生長，該eviGrow 培養基為化學成分確定的無動物組分之無血清培養基。用eviFect轉染劑對細胞進行轉染，且在轉染之後使細胞在eviMake2中生長，該eviMake2為無動物組分之無血清培養基。藉由離心及後續過濾(0.2μm過濾器)來採集上清液。
純化
參考標準方案，自經過濾之細胞培養物上清液純化蛋白質。簡言之，藉由使用蛋白A之親和層析(HiTrap ProteinA HP管柱，GE Healthcare)自細胞培養物上清液純化含Fc之蛋白質。在pH 3.0下達成溶離，後接立即中和樣品。濃縮蛋白質，且藉由尺寸排阻層析(HiLoad Superdex 200管柱，GE Healthcare)在20mM組胺酸、140mM氯化鈉，pH 6.0中使聚集之蛋白質與單體蛋白質分離。
分析
根據Pace等人(Protein Science,1995,4,2411-1423)，經純化之蛋白質的濃度藉由使用基於胺基酸序列所計算之莫耳消光係數在280nm下量測光學密度(OD)來加以確定。蛋白質之純度及分子量使用LabChipGXII系統(Caliper Lifescience)在存在及不存在還原劑的情況下藉由CE-SDS來分析。對聚集物含量之測定在25℃下，藉由HPLC層析使用在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精胺酸單鹽酸鹽，pH 6.7操作緩衝液中平衡之分析型尺寸排阻管柱(TSKgel G3000 SW XL，Tosoh)來執行。
CD3雙特異性抗體在本文中亦稱為「T細胞雙特異性抗體」或「TCB」。在此實例中製備之雙特異性抗體的示意圖給出於圖2中。
TCB之例示性序列給出於SEQ ID NO 123、124、125及129(11D06 TCB)以及SEQ ID NO 126、127、128及129(33H09-TCB)中。其他TCB使用對應之HLA-A2/WT1結合子的VH及VL序列，以類似方式進行構築。
作為對照物，製備基於與抗體ESK1類似之結合子的HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(TCB)(Dao等人，Sci Transl Med(2013)5,176ra33；WO2012/135854)(在本文中稱為「ESK1-TCB」，可變區序列參見SEQ ID NO 73及74)以及非目標TCB(可變區序列參見SEQ ID NO 75及76)。
所有分子均遵循相同方法來產生及純化。所有分子之最終品質均極好，其在CE-SDS上之單體含量為幾乎100%且純度為100%。
實例3. 對HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體之親和力及親合力的生化分析
對於測定HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體與HLA-A2/WT1RMF之親和力，在25℃下在Biacore T200上使用HBS-EP作為操作緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，0.005% Surfactant P20(GE Healthcare))來執行表面電漿子共振(SPR)實驗。藉由胺偶合將抗人類Fc特異性抗體(GE Healthcare，目錄號BR-1008-39)直接固定在CM5晶片(GE Healthcare)上。在5nM下捕獲雙特異性構築體持續30秒。使一系列HLA-A2/WT1RMF複合物於HBS-EP中之三倍稀釋液(1.03至250nM)以30μl/min傳遞通過配位體持續120秒以記錄締合階段。監測解離階段持續120秒，且藉由自樣品溶液轉換至HBS-EP來進行觸發。在每個循環之後，以10μl/min注射3M MgCl2 持續30秒來使晶片表面再生。藉由減去在含有抗人類Fc抗體但上方未捕獲有雙特異性構築體之參考流槽上所獲得的反應來對整體折射率差異進行校正。親和力常數藉由使用BIAeval軟體(GE Healthcare)相對於1：1朗格繆爾結合進行擬合而由動力學速率常數推導。
對於測定HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體與HLA-A2/WT1RMF之親合力及特異性，再次在25℃下在Biacore T200上使用HBS-EP作為操作緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，0.005% Surfactant P20(GE Healthcare))來執行SPR實驗。藉由胺偶合將抗His抗體(Penta His，Qiagen目錄號34660)直接固定在CM5晶片(GE Healthcare)上。在5或10nM(分別用於雙特異性抗體或IgG量測)下以10μl/min捕獲HLA-A2/WT1RMF或HLA-A2/WT1VLD持續30秒。使一系列雙特異性構築體於HBS-EP中之3倍稀釋液(1.23至100nM)以30μl/min傳遞通過配位體持續120秒以記錄締合階段。監測解離階段持續240秒，且藉由自樣品溶液轉換至HBS-EP來進行觸發。在每個循環之後，注射10mM甘胺酸，pH 2持續60秒來使晶片表面再生。藉由減去在參考流槽(其含有抗His抗體，但上方未捕獲有HLA-A2/WT1RMF)上所獲得的反應來對整體折射率差異進行校正。儘管其為2：1相互作用(分析物為二價)，但親和力常數藉由使用BIAeval軟體(GE Healthcare)相對於1：1朗格繆爾結合進行擬合而由動力學速率常數推導。此得到表示相互作用之親合力的表觀KD。
此等實驗之結果概述於下表2中。所測試之兩種HLA-A2/WT1抗體以兩位數奈莫耳濃度(單價)親和力/三位數皮莫耳(二價)親和力(親合力)結合於HLA-A2/WT1RMF，且當自IgG轉化成雙特異性形式時保持相同親和力/親合力。雖然所測試之兩種抗體的親和力相差兩倍，但 兩種分子之親合力處於相同範圍。
未偵測到所測試之HLA-A2/WT1抗體與HLA-A2/WT1VLD的結合(資料未示出)。
Figure 107146108-A0305-02-0186-3
對於測定HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體與CD3之親和力，在25℃下在Biacore T200上使用HBS-EP作為操作緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，0.005% Surfactant P20(GE Healthcare))來執行表面電漿子共振(SPR)實驗。藉由胺偶合將抗人類Fab特異性抗體(GE Healthcare，目錄號28-9583-25)直接固定在CM5晶片(GE Healthcare)上。在5nM下捕獲雙特異性構築體持續40秒。使一系列CD3εδ-Fc融合分子於HBS-EP中之三倍稀釋液(12.35至3000nM)以30μl/min傳遞通過雙特異性抗體持續240秒以記錄締合階段。監測解離階段持續240秒，且藉由自樣品溶液轉換至HBS-EP來進行觸發。在每個循環之後，以30μl/min雙重注射10mM甘胺酸-HCl，pH 2.1持續60秒來使晶片表面再生藉由減去在參考流槽(其含有抗人類Fab抗體但上方未捕獲有雙特異性構築體)上所獲得的反應來對整體折射率差異進行校正。親和力常數藉由使用BIAeval軟體 (GE Healthcare)相對於1：1朗格繆爾結合進行擬合而由動力學速率常數推導。
結果概述於表3中。因為CD3結合子在所測試之兩種雙特異性分子中完全相同，故正如預期的，其與CD3之親和力基本上相同。
Figure 107146108-A0305-02-0187-4
實例4. 選擇IgG結合子對HLA-A2/WT1肽RMF或VLD之特異性
吾人首先藉由流式細胞量測術來量測由噬菌體呈現產生之IgG結合子對經肽脈衝衝擊之T2細胞的結合特異性。簡言之，將T2細胞在補充有10% FBS(Gibco，目錄號16140-071)+1%青黴素-鏈黴素(Gibco，目錄號15070-063)之IMDM培養基(Life Technologies之Gibco，目錄號31980-048)(完全培養基)中以106個細胞/毫升製備為細胞懸浮液。將細胞以總體積10ml保持在試管中，且在37℃與5% CO2下與10μl之10-2M肽(WT1 p37-45 VLD肽(SEQ ID NO：77)或p126-134 RMF肽(SEQ ID NO：78))(該肽之最終濃度：10-5M)一起培育2小時。在洗滌之後，將細胞懸浮於冷PBS中，且在4℃下與經滴定之濃度的IgG結合子(例如10μg/ml至0.00064μg/ml)一起培育1小時，後接與二級抗人類IgG-Fc藻紅素(PE)結合之抗體(Jackson Laboratories，目錄號109-116-098)一起培育30分鐘。在FACS LSR II(BD)上獲取細胞，且資料在Graphpad Prism中呈現為PE之平 均螢光強度(MFI)。
如圖3中所示，11D06-IgG、33H09-IgG及5E11-IgG均結合於經RMF肽脈衝衝擊之T2細胞，但不結合於未經脈衝衝擊或經VLD肽脈衝衝擊之T2細胞。相比之下，11B09-IgG、13B04-IgG及5C01-IgG(但非11G06-IgG)均特異性地結合於VLD肽，但不結合於RMF肽基於此等資料，選擇用於轉化成CD3雙特異性抗體(TCB)之結合子。
實例5. 在HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(「TCB」)與經肽脈衝衝擊之T2細胞結合後，NFAT-Jurkat報導體分析中之T細胞活化
為了檢驗HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(「TCB」)之特異性，使用在NFAT之啟動子下表現螢光素酶的Jurkat細胞(Jurkat-NFAT；Promega目錄號CS176501)來量測當TCB結合於經肽脈衝衝擊之T2細胞(ATCC，目錄號CRL-1992)時的T細胞之活化。簡言之，將T2細胞在補充有10% FBS(Gibco，目錄號16140-071)+1%青黴素-鏈黴素(Gibco，目錄號15070-063)之IMDM培養基(Life Technologies之Gibco，目錄號31980-048)(完全培養基)中以106個細胞/毫升製備為細胞懸浮液。將細胞以總體積10ml保持在試管中，且在37℃與5% CO2下與10μl之10-2M肽(WT1 p37-45 VLD肽或p126-134 RMF肽)(該肽之最終濃度：10-5M)一起培育2小時。在洗滌之後，將90μl含2.2×105個細胞/毫升之經肽脈衝衝擊之細胞的細胞懸浮液接種至96孔微量滴定圓底培養盤中(20,000個細胞/孔，TPP，目錄號92097)，在37℃與5% CO2下，與50μl Jurkat-NFAT(2×106個細胞/毫升之細胞懸浮液)且與10μl經滴定之TCB(100μg/ml至0.0064μg/ml於PBS中)共同培養16小時。此後，移除50μl上清液，且用每孔100μl Bright-Glo螢光素酶分析 實驗品(Promega，目錄號E2620)置換以用於在室溫(RT)下培育。五分鐘後，將180μl上清液轉移至新白色培養盤中以藉由EnVision(PerkinElmer)量測發光信號。資料以相對發光單位(RLU)形式呈現。
如圖4中所示，基於11D06及33H09結合子之TCB(分別為11D06-TCB及33H09-TCB)特異性識別HLA-A2/WT1RMF複合物，且僅在經RMF肽脈衝衝擊之T2細胞存在下使報導Jurkat細胞上之NFAT活化。與此對比，基於ESK1樣結合子之對照TCB(ESK1-TCB)不展示對RMF肽之特異性。此外，基於5E11結合子之TCB(5E11-TCB)展示在經RMF及VLD肽兩者脈衝衝擊之T2細胞存在下，NFAT報導T細胞均活化，因此，下一輪篩選排除此TCB。亦鑑別出一些VLD肽特異性TCB，諸如基於11B09及13B04結合子之TCB(分別為11B09-TCB及13B04-TCB)。作為陰性對照物，在分析中使用非目標TCB(DP47GS-TCB)，其在經RMF或VLD肽脈衝衝擊之T2細胞存在下，不使報導Jurkat細胞上之NFAT活化。5C01-TCB展示對VLD肽之識別，但在較高濃度下與RMF肽交叉反應。
實例6. 在結合於經肽脈衝衝擊之T2細胞後，由HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(「TCB」)介導之T細胞細胞毒性
接下來，吾人量測TCB之細胞毒性。靶細胞為如實例5中所描述的經肽脈衝衝擊之T2細胞。效應細胞為純化自藉由Ficoll(GE Healthcare，目錄號17-1440-03)梯度離心自膚色血球層分離之PBMC的泛CD3+細胞。總CD3+ T細胞藉由MACS(Miltenyi Biotec)，使用人類泛T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec，目錄號130-096-535)來純化。細胞毒性分析如下執行：將經肽脈衝衝擊之細胞(100μl)接種至96孔微量滴定圓底培養盤中(3×105 個細胞/毫升)，在37℃與5% CO2下，與50μl T細胞(6×106個細胞/毫升)且與50μl經滴定之TCB(40μg/ml至0.00004μg/ml)一起在完全培養基中共同培養18小時。此後，將50μl上清液轉移至新白色培養盤中，且添加每孔25μl CytoTox-Glo螢光素酶分析實驗品(Promega，目錄號G9291)以用於在室溫(RT)下培育15分鐘。藉由EnVision(PerkinElmer)讀取發光信號(用於量測指示細胞死亡之LDH釋放)。資料以相對發光單位(RLU)形式呈現。
圖5展示TCB介導的T細胞對RMF或VLD表現性靶細胞之特異性殺滅。吾人發現，11D06-TCB及33H09-TCB均展示對經RMF肽脈衝衝擊之T2細胞的特異性殺滅。33F05-TCB不介導對經RMF或VLD肽脈衝衝擊之細胞的特異性殺滅。另外，13B04-TCB及11B09-TCB介導對經VLD肽脈衝衝擊之T2細胞的強效殺滅。5C01-TCB展示對經VLD脈衝衝擊之T2細胞的殺滅以及在較高濃度下對經RMF脈衝衝擊之細胞的殺滅，與NFAT報導體分析(圖4)中之觀測結果相符。
實例7. 在結合於WT1 + 細胞株後，由HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(「TCB」)介導之T細胞細胞毒性
為了確認TCB之特異性殺滅，吾人執行對WT1+腫瘤細胞株之細胞毒性分析。HLA-A2+WT1+細胞株為SKM-1細胞(DZMZ編號ACC 547)及經HLA-A2/WT1RMF複合物轉染之CHO細胞(CHO-WT1)(內部自製)。陰性對照物為HLA-A2+WT1-細胞：BJAB(DZMZ編號ACC 757)、ARH-77(DZMZ編號ACC 512)及經HLA-A2/MAGE-A4複合物轉染之CHO細胞(CHO-MAGEA4)(內部自製)，以及HLA-A2-WT1+細胞株：K562(ATCC編號CLL-243)(圖6A)。細胞毒性分析如實例6中所描述執行。11D06-TCB 及33H09-TCB均展示對SKM-1及CHO-WT1細胞之強效殺滅，但不殺滅任何HLA-A2+WT1-細胞及HLA-A2-WT1+細胞，指示此兩種TCB對WT1肽RMF具有特異性(圖6B、C)。與此對比，VLD肽特異性TCB均不展示對HLA-A2+WT1+細胞株之殺滅，且若其在高濃度(10μg/ml)下展示對WT1+細胞株之低效力殺滅，則亦發現對WT1-細胞株之殺滅程度相同(圖6D、E)。基於此等功能資料，吾人選擇11D06-TCB及33H09-TCB用於進一步評估。
吾人亦比較吾人所選TCB與ESK1-TCB對腫瘤靶細胞之殺滅活性。有趣地，儘管ESK1-TCB在介導SKM-1細胞之殺滅中達成相比於11D06-TCB及33H09-TCB類似的效力，但其亦誘導對HLA-A2+WT-1-BJAB細胞之殺滅，指示ESK1-TCB結合不限於HLA-A2/WT1RMF複合物(圖6F、G)。
吾人測試對多個HLA-A2+WT1+腫瘤細胞株之殺滅。基於殺滅之EC50值，將細胞株分類成以EC50<1μM殺滅之彼等細胞株(在表4中用「++」標記)，以EC50>1μM且<5μM殺滅之彼等細胞株(在表4中用「+」標記)，及基本上不殺滅之彼等細胞株(在表4中用「否」標記)。
總計，所選TCB，即11D06-TCB及33H09-TCB介導對13種HLA-A2+WT1+細胞株中之6種的T細胞細胞毒性。不對其他細胞株進行殺滅很可能係歸因於MHC I在細胞表面上呈遞之WT1表現較低。表4展示11D06-TCB之結果。33H09-TCB之結果類似(其中EC50值略高於11D06-TCB)。
Figure 107146108-A0305-02-0192-5
實例8. 在結合於WT1 + 細胞株後，由HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(「TCB」)介導之T細胞活化
TCB介導的對WT1+靶細胞之細胞毒性的前提條件為T細胞得到活化以獲取效應功能。在如實例7中所描述之活體外殺滅分析期間，吾人藉由流式細胞量測術在T細胞與HLA-A2+WT1-細胞SKM-1或HLA-A2+WT1-細胞BJAB之共同培養物中，在兩種所選TCB，即33H09-TCB及11D06-TCB存在下量測T細胞之活化狀態。在共同培育18小時之後採集細胞，且用針對CD3(Biolegend目錄號300321)、CD25(Biolegend目錄號302606)及CD69(Biolegend目錄號310914)之抗體染色，以藉由流式細胞量測術來量測T細胞活化。
如圖7中所示，兩種TCB均在結合於SKM-1細胞後誘導 CD3+ T細胞上之CD69及CD25的上調，但在結合於BJAB細胞後不如此誘導，指示TCB對由SKM-1細胞呈遞之HLA-A2/WT1RMF複合物的特異性識別觸發CD3介導之T細胞活化，最終引起靶細胞之特異性溶解。
實例9. 所選HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(「TCB」)不與所報導之脫靶肽結合
研發T細胞受體(TCR)樣抗體之主要潛在風險為該抗體與由正常組織表現之蛋白質所呈遞之肽同系物的交叉反應性。如由Ataie等人(J Mol Biol.(2016)428：194-205)所報導，ESK1抗體結合於來源於蛋白質MED13L及PIGQ的序列類似之肽，吾人測試吾人之TCB與此兩種肽之交叉反應性。此等肽之序列展示於圖8F及SEQ ID NO 79及80中在基於流式細胞量測術之結合分析中，如實例4中所描述，吾人發現11D06-TCB及33H09-TCB均不結合於PIGQ肽。兩種TCB與MED13L肽之結合均比原生WT1 RMF肽小接近100倍(圖8A、B)。儘管ESK1-TCB以低親和力結合於RMF肽，但其以類似方式結合於PIGQ肽且甚至更強地結合於MED13L(圖8C)，與所報導的ESK1 IgG之結合活性相符(Ataie等人，J Mol Biol.(2016)428：194-205)。
吾人亦使用如實例5中所描述之NFAT-報導體分析來測試交叉反應性。與結合資料一致地，在11D06-TCB及33H09-TCB結合於MED13L及PIGQ後的Jurkat細胞上NFAT活化之強度比在11D06-TCB及33H09-TCB結合於WT1 RMF肽後的活化弱至少100倍(圖8D、E)。
實例10. 所選HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(「TCB」)不與未鑑別之脫靶肽結合
針對來源於正常組織之同源肽(共享關鍵識別殘基)的交叉反應性可能由TCR樣抗體或基於TCR之T細胞療法引起嚴重且不易預測之毒性(參見例如Linette等人，Blood(2013)122：863-71；報導MAGE A3-TCR療法因針對由心臟組織表現之蛋白質的脫靶反應性所致的致命毒性)。因此，此等藥劑之特異性至關重要。為了充分地界定吾人之抗體的特異性，基於證實RMF肽中涉及11D06結合之位置的晶體結構資料(參見實例15)，吾人藉由在肽組資料庫(Swissprot及TrEMBL)中遮蔽RxxPNxxYx來將吾人之檢索擴展至具有與WT1 RMF肽(SEQ ID NO：78)類似之胺基酸序列的潛在脫靶肽。吾人發現來源於據預測與HLA-A2之親和力均較高之不同蛋白質的額外25種肽(表5)。吾人隨後如上文所描述，使用NFAT-報導體分析(肽1-6)或T細胞細胞毒性分析(肽7-25)來測試吾人所選之TCB對經肽脈衝衝擊之T2細胞的交叉反應性。
對於所測試之前6種肽，11D06-TCB對該6種肽中之任一者均不存在交叉反應性。33H09-TCB展示對ARHGEF11之一定識別，但NFAT活化之程度比原生RMF肽低>100倍(圖9A、B)。類似地，如藉由對經肽脈衝衝擊之T2細胞的直接T細胞殺滅所量測，與其他19種脫靶肽之交叉反應性比原生RMF肽低至少100倍(圖9C、D)。此結果在第二實驗中得到確認，其中亦測試ESK1-TCB(圖9E-G)。
綜合而言，吾人確認11D06及33H09展示(但ESK1樣結合子不展示)對WT1 RMF肽，而不對肽組中所偵測之潛在脫靶肽的特異性，
Figure 107146108-A0305-02-0194-6
Figure 107146108-A0305-02-0195-7
實例11. 所選HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(「TCB」)不介導對CD34 + 幹細胞之細胞毒性
已報導CD34+造血幹細胞為WT1陽性(Ramani及Cowell,J.Path(1996)179：162-8)，因此，TCB結合該等細胞可能潛在地有害。為了研究CD34+細胞是否內源性呈遞RMF肽，吾人自來自Lonza之3個供體獲得HLA-A2+骨髓源性CD34+細胞，且在如上文在實例7中所描述之殺滅分析中測試吾人選擇之TCB。儘管11D06-TCB及33H09-TCB介導對SKM-1之強效殺滅，但其對CD34+幹細胞無殺滅活性，指示此等幹細胞在HLA-A2的情形下可能不呈遞RMF肽(圖10)。
實例12. 藉由丙胺酸掃描分析來界定所選HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(「TCB」)之結合殘基
相比於ESK1-TCB，吾人之TCB顯然具有不同的與RMF肽之結合及功 能活性。為了表徵TCB之潛在RMF肽結合基元，吾人設置使用來源於原生序列之肽陣列藉由用丙胺酸個別地置換各胺基酸來進行的丙胺酸掃描分析，且量測經此等肽脈衝衝擊之T2細胞的NFAT-報導體信號(圖11A-L)。資料以TCB濃度逐漸增加時之RLU的形式呈現。吾人相對於原生肽之EC50繪製EC50變化倍數，且將變化倍數
Figure 107146108-A0305-02-0196-220
10視為明顯的，其意謂RMF肽之各別胺基酸殘基對於11D06-TCB及33H09-TCB之識別可能至關重要(圖11M)。吾人得出結論，11D06-TCB及33H09-TCB均具有與殘基R1、F3、N5及A6之重要接觸(圖11N)，而展示ESK1具有與RMF肽R1、P4及N5之緊密接觸(Ataie等人，J Mol Biol.(2016)428：194-205)。
實例13. 在於NSG小鼠中單次注射之後，HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(「TCB」)之藥物動力學概況
向NSG小鼠中注射單劑量之每公斤0.5mg 33H09-TCB或11D06-TCB。對所有小鼠均靜脈內注射200μl適當溶液。為了獲得每200μl適當量之化合物，用組胺酸緩衝液稀釋儲備溶液。在10分鐘、1小時、3小時、6小時、24小時、48小時、72小時、96小時、6天、8天、10天及12天時，在每個時間點對三隻小鼠進行抽血。藉由ELISA在血清樣本中分析所注射之化合物。向經抗生蛋白鏈菌素塗佈之96孔微量滴定盤中逐步地添加生物素化抗huCD3-CDR抗體(Roche Diagnostics,Penzberg,Germany)、測試樣品、經地高辛(digoxigenin)標記之抗huFc抗體及抗地高辛偵測抗體(過氧化酶(POD))，且在每個步驟之後，在室溫下培育1小時。在各步驟之後，洗滌培養盤三次以移除未結合之物質。最後，藉由添加ABTS(2,2'-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)受質溶液以形成有色反應產物來使過氧 化酶結合之複合物可視化。在405nm下(其中參考波長處於490nm下)以光度測定之反應產物強度與血清中之分析物濃度成正比。結果(圖12)展示所測試之兩種純系的穩定PK行為，其推薦每週一次時程用於後續功效研究。
實例14. 用HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(「TCB」)在人類化小鼠中之SKM-1異種移植物中進行的功效研究
HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體之第一功效研究旨在在完全人類化NSG小鼠中之人類急性骨髓性白血病(AML)異種移植物(SKM-1；HLA-A2+，WT-1+)中的功效方面比較兩種不同WT1結合子(11D06及33H09)。
SKM-1細胞(人類AML)原先獲自ATCC，且寄存於Roche Glycart內部細胞庫中。在水飽和之氛圍中，在5% CO2下，在RPMI+10% FCS+1%麩醯胺酸中培養細胞。活體外第15代用於以98%之活力與基質膠(1：1比率)一起進行皮下注射。
根據提交之指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)，將在實驗開始時4-5週齡之雌性NSG小鼠(Jackson Laboratory)以12小時亮/12小時暗之每日循環維持在無特定病原體之條件下。實驗研究方案由當地政府審查且批准。在到達之後，將動物維持一週以使其適應新環境且進行觀察。在常規基礎上進行連續健康監測。
對雌性NSG小鼠腹膜內注射15mg/kg白消安(busulfan)，一天後接著靜脈內注射1×105個自臍帶血分離之人類造血幹細胞。在幹細胞注射後第14-16週，對小鼠進行舌下抽血，且藉由流式細胞量測術來分析血液是否成功人類化。將經有效移植之小鼠根據其人類T細胞出現概率隨機分 入不同處理組中。在該時刻，如圖13A中所說明，對小鼠皮下注射SKM-1腫瘤細胞，且當腫瘤大小達到大致150mm3(第10天)時，每週一次用化合物或組胺酸緩衝液(媒劑)進行處理。對所有小鼠均靜脈內注射200μl適當溶液。為了獲得每200μl適當量之化合物，必要時用組胺酸緩衝液稀釋儲備溶液。使用測徑規每週量測腫瘤生長三次，且腫瘤體積如下計算：Tv：(W2/2)×L (W：寬度，L：長度)
腫瘤生長抑制(TGI)以及腫瘤與對照物比率(TCR)如下計算：TGI：
Figure 107146108-A0305-02-0198-8
* 100
TCR：
Figure 107146108-A0305-02-0198-9
圖13展示所有處理組中之腫瘤生長動力學(平均值)(圖13C)以及各組中之單個腫瘤生長動力學(圖13D-F)。如圖所示，兩種TCB均展現腫瘤生長抑制，其中純系11D06展示最強腫瘤生長抑制，其TGI為101.3(圖13G)。
實例15. HLA-A2/WT1抗體/pMHC複合物之晶體結構
藉由以下來製備Fab片段：將抗體在25℃下在具有每毫克1.05U纖維蛋白溶酶之50mM Tris pH 8.0、150mM NaCl(Roche，目錄號602361)中培育72小時。使用經50mM Tris、100mM甘胺酸、150mM NaCl，pH 8.0平衡之4.5mL CaptureSelect CH1-親和管柱(BAC BV，目錄號191.3120)使經切割之Fc與Fab片段分離。用50mM Tris、100mM甘胺酸、150mM NaCl，pH 2.0自管柱溶離出Fab片段，且用0.5M磷酸鈉pH 8.0中和，隨後將其負載在經20mM Tris、150mM NaCl，pH 7.4平衡之尺寸排 阻管柱S75(GE Healthcare)上。品質控制藉由在非還原及還原條件下進行分析型尺寸排阻(管柱Tosoh，TSK-Gel G3000SWXL，在Agilent HPLC 1200系統上)及CE-SDS(Caliper LabChip GXII，Perkin Elmer)來執行。將經純化之Fab片段在液氮中冷凍，且儲存於-80℃下。
5C01抗體/pMHC複合物之結晶、資料收集及結構確定
結晶. 抗體/pMHC複合物(Fab 5C01 HLA-A02/WT1VLD pMHC)藉由以下來製備：將按5C01結合子(Fab 5C01)計1.2倍莫耳過量之HLA-A2/WT1 Fab片段與HLA-A2/WT1VLD肽複合物(HLA-A02/WT1VLD pMHC)混合。在於4℃下培育1小時之後，將混合物濃縮至10mg/ml。在沉滴式蒸氣擴散設置中於21℃下執行初始結晶試驗。晶體在1天內自0.2M酒石酸鈉、20%聚乙二醇(PEG)3350出現，其中在結晶液滴中添加有10% 2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)以改良晶體品質。自篩選盤直接採集晶體，而不經任何其他最佳化步驟。
資料收集及結構確定. 對於資料收集，將晶體在含有15%甘油之沈澱劑溶液中於100K下急驟冷凍。在Swiss Light Source(Villigen,Switzerland)之射束線X10SA下使用PILATUS 6M檢測器在1.0000Å之波長下收集繞射資料。用XDS(Kabsch,W.Acta Cryst.D66,133-144(2010))處理資料，且用SADABS(BRUKER)進行按比例調整。複合物之晶體屬於空間群P21212，其中細胞軸為a=158.94Å，b=49.12Å，c=128.63Å，且繞射解析度為1.98Å。使用蛋白質資料庫(PDB)第4NO5項及內部自製Fab結構之晶體結構座標作為檢索模型，藉由用PHASER(McCoy,A.J,Grosse-Kunstleve,R.W.,Adams,P.D.,Storoni,L.C.及Read,R.J.J.Appl. Cryst.40,658-674(2007))進行分子置換來確定結構。差異電子密度圖用於置放肽及根據序列差異藉由實空間精修來改變胺基酸。使用來自CCP4套件(Collaborative Computational Project,Number 4 Acta Cryst.D50,760-763(1994))及BUSTER(Bricogne,G.,Blanc,E.,Brandl,M.,Flensburg,C.,Keller,P.,Paciorek,W.,Roversi,P.,Sharff,A.,Smart,O.S.,Vonrhein,C.,Womack,T.O.(2011).Buster 2.9.5版Cambridge,United Kingdom：Global Phasing Ltd)之程式來對結構進行精修。人工重建用COOT(Emsley,P.,Lohkamp,B.,Scott,W.G.及Cowtan,K.Acta Cryst D66,486-501(2010))來進行。
資料收集及精修統計資料概述於表6中。
Figure 107146108-A0305-02-0200-10
Figure 107146108-A0305-02-0201-11
與HLA-A02/WT1 VLD 複合之Fab 5C01的結構
為了表徵VLD肽與Fab 5C01、5C01之結合抗原決定基及互補位與HLA-A02相互作用的細節，吾人以1.98Å之解析度確定5C01與HLA A02/WT1VLD pMHC之複合物的晶體結構(圖14A)。該結構揭露，Fab 5C01主要藉助於輕鏈之CDR1及CDR3且藉由重鏈之所有CDR而結合於pMHC。自VLD肽(SEQ ID NO：77)，具有殘基Val1、Phe4及Pro7之側鏈與Fab直接接觸。該肽之所有其他側鏈均朝向HLA-A02分子。該肽對接觸表面積之貢獻為約68Å2，而觀測到總Fab-pMHC接觸面積為約476Å2。Fab 5C01-pMHC界面之近視圖展示於圖15中。
使用程序PISA(E.Krissinel及K.Henrick(2007),J.Mol.Biol.372,774-797)對結合界面之分析揭露Fab 5C01經由8個氫鍵、數個π-π相互作用及凡得瓦接觸(van der Waals contact)與HLA-A02相互作用之模式。在重鏈CDR3殘基(Trp97)及CDR2殘基(Ser52、Ser53)與HLA-A02之Glu63及Glu166之間形成側鏈氫鍵。由Tyr91及Ile93之輕鏈主鏈原子與Gln155建立其他氫鍵。另外，複合物經由形成輕鏈殘基Trp32及Trp94與HLA-A02中具有Gln155及His151之側鏈的π-π相互作用而得到穩定化。VLD肽之N端纈胺酸擁有經由主鏈氮與HLA-A02之Tyr171形成的氫鍵。其側鏈朝向由HLA-A02之Glu63及Trp167以及Fab 5C01重鏈之Trp97形成的袋定向。另外，肽之Phe4與重鏈之Tyr100進行邊緣與表面相互作用。概述接觸之示意性Fab 5C01-pMHC相互作用矩陣展示於圖16中。
11D06抗體/pMHC複合物之結晶、資料收集及結構確定
結晶. 抗體/pMHC複合物(Fab 11D06 HLA-A02/WT1VLD pMHC)藉由以下來製備：將按11D06結合子(Fab 11D06)計1：1莫耳量之HLA-A2/WT1 Fab片段與HLA-A2/WT1RMF肽複合物(HLA-A02/WT1RMF pMHC)混合。在於21℃下培育4小時之後，將混合物濃縮至20mg/ml。在沉滴式蒸氣擴散設置中於21℃下執行初始結晶試驗。晶體在4天內自0.1M Tris pH 8.0、20% PEG 4000出現。自篩選盤直接採集晶體，而不經任何其他最佳化步驟。
資料收集及結構確定. 如上文所描述收集資料、處理及按比例調整。複合物之晶體屬於空間群P21，其中細胞軸為a=54.11Å，b=67.00Å，c=139.36Å，其中β=90.57°，且繞射解析度為2.64Å。使用內部自製Fab及MHC複合物結構之結構座標作為檢索模型，藉由用PHASER進行分子置換來確定結構。差異電子密度圖用於置放肽及根據序列差異藉由實空間精修來改變胺基酸。結構精修及人工重建如上文所描述進行。
資料收集及精修統計資料概述於表7中。
Figure 107146108-A0305-02-0202-12
Figure 107146108-A0305-02-0203-13
與HLA-A02/RMF pMHC複合之Fab 11D06的結構
吾人以2.64Å之解析度確定Fab 11D06與HLA A02/RMF pMHC之複合物的晶體結構(圖14B)。該結構展示Fab 11D06藉助於所有CDR結合於pMHC。RMF肽(SEQ ID NO：78)中具有殘基Arg1、Met2、Pro4、Asn5、Ala6及Tyr8之側鏈與Fab之輕鏈及重鏈直接接觸。該肽之其餘側鏈朝向HLA-A02分子。該肽對接觸表面積之貢獻為約107Å2。總Fab-pMHC接觸面積對應於約397Å2。Fab 11D06-pMHC界面之近視圖展示於圖17中。
使用程序PISA對結合界面之分析揭露Fab 11D06經由4個氫鍵、許多π-π相互作用及凡得瓦接觸與HLA-A02相互作用之模式。在重鏈CDR1殘基(Ser30、Ser31)及CDR3殘基(Gly100A)與HLA-A02之Glu58及Arg65之間觀測到氫鍵。由輕鏈殘基Asp50與HLA-A02 Arg65建立其他氫鍵。此外，重鏈之Trp100提供與HLA-A02之Arg65及Lys66以及與RMF肽之Pro4的凡得瓦爾力及π-π接觸。RMF肽之N端精胺酸的側鏈指向由Ser31、Glu97及11D06重鏈Ile96之主鏈羰基形成的極性袋中。RMF肽殘基Asn5擁有與11D06及HLA-A02之額外極性接觸，其為與輕鏈CDR1之Trp32、輕鏈CDR3之Glu92以及HLA-A02之Gln155的氫鍵網絡之一部分。 概述接觸之示意性Fab 11D06-pMHC相互作用矩陣展示於圖18中。
自公開資料庫擷取的ESK1之3D結構：
為了比較，公開可獲得的結合於HLA-A02/RMF pMHC之抗體(Fab)ESK1的晶體結構(PDB ID 4WUU；http：//www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId=4WUU)關於其Fab-pMHC接觸類似地進行分析。圖14C以與Fab 5C01與HLA-A02/VLD pMHC及Fab 11D06與HLA-A02/RMF pMHC之晶體結構(圖14A及B)相同的角度展示Fab ESK1與HLA-A02/RMF pMHC晶體結構(在HLA-A02部分上對準)。Fab ESK1-pMHC界面之近視圖展示於圖19中，且概述接觸之示意性Fab ESK1-pMHC相互作用矩陣展示於圖20中。
該結構比較揭露，5C01及(特定言之)11D06所覆蓋及結合的各別WT1肽之部分比ESK1大，該ESK1僅僅與RMF肽之N端Arg形成特異性接觸，而結合界面之其餘部分由HLA-A02提供。基於此等觀測結果，吾人可得出結論，5C01及11D06應比ESK1更不可能耐受脫靶肽，此係由於其對在暴露位置具有非VLD樣或非RMF樣側鏈之肽產生明顯更之位阻。
晶體結構之所有圖形表示均用BIOVIA Discovery Studio 4.5,Dassault Systèmes BIOVIA產生。
抗原決定基及互補位殘基(5Å半徑)
下文展示對用於結合子5C01、11D06及ESK1之抗原決定基及互補位的概述。抗原決定基及互補位(基於5Å鄰域界定)殘基以粗斜體文字突出顯示。CDR殘基以灰色背景突出顯示。
HLA-A02
Figure 107146108-A0305-02-0205-15
肽
Figure 107146108-A0305-02-0205-19
Fab重鏈
Figure 107146108-A0305-02-0206-17
Fab輕鏈
Figure 107146108-A0305-02-0206-18
涉及化學相互作用之殘基
下文展示對涉及與結合子5C01、11D06及ESK1之化學相互作用的殘基的概述。涉及特異性化學相互作用之殘基(比較圖16、18及20)以粗斜體 文字突出顯示。CDR殘基以灰色背景突出顯示。
HLA-A02
Figure 107146108-A0305-02-0207-20
肽
Figure 107146108-A0305-02-0207-21
Fab重鏈
Figure 107146108-A0305-02-0208-22
Fab輕鏈
Figure 107146108-A0305-02-0208-23
實例16. 比較具有不同CD3結合子之HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(「TCB」)
吾人在如上文(實例7)所描述之分析中使用SKM-1細胞來比較具有不 同CD3結合子之11D06-TCB的殺滅活性效力。CH2527為在先前實驗中所用的TCB之CD3結合子(VH及VL序列參見SEQ ID NO 121及122)。V9為Rodrigues等人，Int J Cancer Suppl(1992)7,45-50及WO 1992/22653所描述之CD3結合子(VH及VL序列參見SEQ ID NO 136及137)，且40G5C描述於WO 2015/095392中(VH及VL序列參見WO 2015/095392之SEQ ID NO 184及185(「hu40G5c」))。
CD3結合子CH2527、40G5C及V9之親和力展示於表8中。
如圖21中所示，吾人觀測到11D06-TCB(CH2527)展示T細胞介導的對HLA-A2+WT1+ SKM-1細胞株之殺滅的效力與11D06-TCB(V9)相同，而11D06-TCB(40G5C)展示殺滅效力強烈減弱。
Figure 107146108-A0305-02-0209-24
實例17. 在結合於經RMF肽脈衝衝擊之T2細胞後，由HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(「TCB」)介導之T細胞細胞毒性
將11D06-TCB(V9)(全序列參見SEQ ID NO 123、125、139、140)之殺滅活性與具有不同HLA/WT1結合子(「Aali」及「Daniel」，分別參見WO 2017/060201，SEQ ID NO 5(VH)及6(VL)以及SEQ ID NO 35(VH)及36(VL))之類似TCB相比。亦包括ESK1-TCB及非目標DP47-TCB作為對照物。實驗如實例6中所描述執行。在37℃與5% CO2下，將經RMF肽脈衝衝擊之細胞(100μl，2×105個細胞/毫升)與50μl T細胞(2×106個細胞/毫升) 且與TCB之連續稀釋液(50μl)一起共同培養24小時。
圖22展示TCB介導的對RMF表現性靶細胞之特異性T細胞殺滅。吾人發現11D06-TCB及ESK1-TCB介導對經RMF肽脈衝衝擊之T2細胞的強效殺滅，而基於HLA/WT1結合子「Aali」及「Daniel」之TCB(Aali-TCB及Daniel-TCB)展示僅在最高濃度下對經RMF脈衝衝擊之細胞進行弱殺滅。
實例18. 所選HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(「TCB」)不與脫靶肽結合
吾人亦用實例9及10中所描述之脫靶肽來比較11D06-TCB(V9)、Aali-TCB、Daniel-TCB及ESK1-TCB之交叉反應性。
對於此實驗，使用表現抗PGLALA嵌合抗原受體(CAR)之Jurkat NFAT報導細胞(CAR J分析，參見主張歐洲專利申請案第EP17209201.7號之優先權的PCT申請，其以全文引用之方式併入本文中)。抗PGLALA CAR識別TCB之Fc區中的P329G L234A L235A(「PGLALA」，EU編號)突變。如上文所描述的經肽脈衝衝擊之T2細胞用作靶細胞。該分析之原理為將經NFAT工程改造之Jurkat效應細胞與靶細胞一起共同培養。僅在TCB與CAR(經由PGLALA突變)及靶抗原同時結合後，NFAT啟動子得到活化且引起Jurkat效應細胞中之螢光素酶表現增加。在添加恰當受質後，活性螢火蟲螢光素酶引起發光發射，其可量測作為CAR介導之活化的信號。
簡言之，採集靶細胞切測定其活力。將20 000個靶細胞/孔接種在圓底96孔培養盤(Greiner bio-one，#650180)中之100μl培養基中。未經脈衝衝擊之T2細胞用作陰性對照物。向靶細胞中添加每孔50μl經稀釋 之TCB。隨後，採集Jurkat-NFAT報導細胞且對其進行活力評定，將其再懸浮於細胞培養基中且以100 000個細胞/孔(50微升/孔)添加至腫瘤細胞中，以獲得5：1之最終效應細胞比靶細胞(E：T)比率及每孔200μl之最終體積。將細胞在增濕保溫箱中於37℃下培育20小時。在培育時間結束時，使培養盤適應室溫(約15分鐘)。自頂部移除每孔125μl培養基，且添加每孔25μl One-Glo螢光素酶(Promega #E6120)，且混合。隨後將每孔100μl混合物轉移至96孔平底培養盤(Greiner bio-one，#655098)中，且將該培養盤在暗處培育15分鐘，隨後使用Perkin Elmer來偵測發光。
如圖23中所示，與11D06-TCB(V9)(D)相比，Aali-TCB(A)、Daniel-TCB(B)及ESK1-TCB(C)引起NFAT報導細胞株之活化較弱(對應於圖22中所示之殺滅較弱)，且此外，在RMF肽與其他脫靶肽之間的識別窗較小。
實例19. 在於NSG小鼠中單次注射之後，HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(11D06-TCB(V9))之藥物動力學概況
向人類化且攜有腫瘤之NSG小鼠中注射單劑量之每公斤1mg 11D06-TCB(V9)。對小鼠靜脈內注射200μl用組胺酸緩衝液稀釋之TCB。在10分鐘、6小時、24小時、72小時及7天時，在每個時間點對三隻小鼠進行抽血。如實例13中所描述，藉由ELISA在血清樣本中分析所注射之化合物。
結果(圖24)展示所測試之TCB的穩定PK行為，其推薦每週一次時程用於後續功效研究。
實例20. 用HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(11D06-TCB(V9))在人類化小鼠中之SKM-1異種移植物中進行的功效研究
此功效研究旨在在完全人類化NSG小鼠中之人類AML異種移植物(SKM-1)中評估11D06-TCB(V9)之功效。實驗如實例14中所描述執行。
圖25展示腫瘤生長動力學(平均值，圖25A)以及各組中之單個腫瘤生長動力學(圖25B、C)。如圖所示，TCB展現在研究第48天，腫瘤生長抑制TGI為78(圖25D)。
實例21. 比較具有不同分子形式之HLA-A2/WT1 x CD3雙特異性抗體(「TCB」)
吾人比較具有呈「1+1互換單抗」形式(如圖1A中所描繪)之類似分子的11D06-TCB(V9)的活性。使用基於細胞之功能分析來監測活性，該功能分析以劑量依賴性方式偵測TCB介導的報導細胞株(Jurkat NFAT)在靶細胞存在下之活化。分析基本上如上文實例5中所描述，使用表現HLA-A02/WT1RMF pMHC複合物之CHO-K1細胞作為靶細胞來執行。報導細胞活化在TCB與靶細胞上之HLA-A02/WT1RMF pMHC複合物及報導細胞上T細胞受體(TCR)之CD3ε單元同時結合後發生，其引起CD3過度簇聚且藉此引起TCR活化。對應之細胞內信號傳導路徑的後續起始引起轉錄因子NFAT之活化，其誘導NFAT驅動之螢光素酶報導基因的表現。在添加受質後，藉由發光讀取來量測螢光素酶報導體之活性。
此實驗之結果展示於圖26中。針對抗體濃度繪製反映靶向依賴性報導細胞活化之相對光單位(RLU)。如圖26中可見，在此分析中，呈「1+1」形式之分子展示其活性比「2+1」形式低。
胺基酸序列
Figure 107146108-A0305-02-0213-25
Figure 107146108-A0305-02-0214-26
Figure 107146108-A0305-02-0215-27
Figure 107146108-A0305-02-0216-28
Figure 107146108-A0305-02-0217-29
Figure 107146108-A0305-02-0218-30
Figure 107146108-A0305-02-0219-31
Figure 107146108-A0305-02-0220-221
Figure 107146108-A0305-02-0221-33
* * *
儘管出於清楚理解之目的，已藉助於說明及實例相當詳細地描述前述本發明，但該等描述及實例不應解釋為限制本發明之範疇。本文所引用的所有專利及科學文獻之揭示內容均以全文引用之方式明確併入。
<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司(F.HOFFMANN-LA ROCHE AG)
<120> 結合HLA-A2/WT1之抗體
<130> P34563
<140> TW 107146108
<141> 2018-12-20
<150> EP17209205.8
<151> 2017-12-21
<160> 140
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D06 HCDR1
<400> 1
Figure 107146108-A0305-02-0222-34
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D06 HCDR2
<400> 2
Figure 107146108-A0305-02-0222-35
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D06 HCDR3
<400> 3
Figure 107146108-A0305-02-0223-36
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D06 LCDR1
<400> 4
Figure 107146108-A0305-02-0223-37
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D06 LCDR2
<400> 5
Figure 107146108-A0305-02-0223-38
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D06 LCDR3
<400> 6
Figure 107146108-A0305-02-0223-39
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D06 VH
<400> 7
Figure 107146108-A0305-02-0224-40
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11D06 VL
<400> 8
Figure 107146108-A0305-02-0224-41
Figure 107146108-A0305-02-0225-42
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 9
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<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 33H09 HCDR2
<400> 10
Figure 107146108-A0305-02-0225-44
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 11
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<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 12
Figure 107146108-A0305-02-0226-46
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 13
Figure 107146108-A0305-02-0226-47
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 33H09 LCDR3
<400> 14
Figure 107146108-A0305-02-0226-48
<210> 15
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 33H09 VH
<400> 15
Figure 107146108-A0305-02-0227-49
<210> 16
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 33H09 VL
<400> 16
Figure 107146108-A0305-02-0227-50
Figure 107146108-A0305-02-0228-51
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 17
Figure 107146108-A0305-02-0228-52
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13B04 HCDR2
<400> 18
Figure 107146108-A0305-02-0228-53
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<211> 8
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 19
Figure 107146108-A0305-02-0229-54
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13B04 LCDR1
<400> 20
Figure 107146108-A0305-02-0229-55
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 21
Figure 107146108-A0305-02-0229-56
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 22
Figure 107146108-A0305-02-0229-57
<210> 23
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13B04 VH
<400> 23
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 107146108-A0305-02-0230-59
Figure 107146108-A0305-02-0231-60
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 25
Figure 107146108-A0305-02-0231-61
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 26
Figure 107146108-A0305-02-0231-62
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 28
Figure 107146108-A0305-02-0232-64
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 107146108-A0305-02-0232-65
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 107146108-A0305-02-0232-66
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 107146108-A0305-02-0233-67
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 107146108-A0305-02-0233-68
Figure 107146108-A0305-02-0234-69
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 33
Figure 107146108-A0305-02-0234-71
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 107146108-A0305-02-0234-72
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 33F05 HCDR3
<400> 35
Figure 107146108-A0305-02-0235-73
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 36
Figure 107146108-A0305-02-0235-74
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 37
Figure 107146108-A0305-02-0235-75
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 38
Figure 107146108-A0305-02-0235-76
<210> 39
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 107146108-A0305-02-0236-78
Figure 107146108-A0305-02-0237-79
<210> 41
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<220>
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<400> 41
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<210> 42
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
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<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 107146108-A0305-02-0238-83
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 46
Figure 107146108-A0305-02-0238-85
<210> 47
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 107146108-A0305-02-0239-86
<210> 48
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5E11 VL
<400> 48
Figure 107146108-A0305-02-0239-87
Figure 107146108-A0305-02-0240-88
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 49
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<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
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<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 107146108-A0305-02-0241-92
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13E08 LCDR2
<400> 53
Figure 107146108-A0305-02-0241-93
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 13E08 LCDR3
<400> 54
Figure 107146108-A0305-02-0241-94
Figure 107146108-A0305-02-0242-95
<210> 55
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
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<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 107146108-A0305-02-0243-97
<210> 57
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<210> 58
<211> 17
<212> PRT
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<220>
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Figure 107146108-A0305-02-0243-99
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<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 107146108-A0305-02-0244-102
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5C01 LCDR2
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Figure 107146108-A0305-02-0244-103
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 107146108-A0305-02-0245-104
<210> 63
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<213> 人工序列
<220>
<223> 5C01 VH
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Figure 107146108-A0305-02-0245-105
<210> 64
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5C01 VL
<400> 64
Figure 107146108-A0305-02-0246-106
<210> 65
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 11G06 HCDR1
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Figure 107146108-A0305-02-0246-107
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11G06 HCDR2
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Figure 107146108-A0305-02-0247-108
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11G06 HCDR3
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Figure 107146108-A0305-02-0247-109
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11G06 LCDR1
<400> 68
Figure 107146108-A0305-02-0247-110
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11G06 LCDR2
<400> 69
Figure 107146108-A0305-02-0247-111
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11G06 LCDR3
<400> 70
Figure 107146108-A0305-02-0248-112
<210> 71
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11G06 VH
<400> 71
Figure 107146108-A0305-02-0248-113
<210> 72
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 11G06 VL
<400> 72
Figure 107146108-A0305-02-0249-114
<210> 73
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ESK1 VH
<400> 73
Figure 107146108-A0305-02-0249-115
Figure 107146108-A0305-02-0250-116
<210> 74
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ESK1 VL
<400> 74
Figure 107146108-A0305-02-0250-117
Figure 107146108-A0305-02-0251-118
<210> 75
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 非目標VH
<400> 75
Figure 107146108-A0305-02-0251-119
<210> 76
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 非目標VL
<400> 76
Figure 107146108-A0305-02-0252-120
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
Figure 107146108-A0305-02-0252-121
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Figure 107146108-A0305-02-0252-122
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Figure 107146108-A0305-02-0253-123
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 80
Figure 107146108-A0305-02-0253-124
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 81
Figure 107146108-A0305-02-0253-125
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 82
Figure 107146108-A0305-02-0253-126
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 83
Figure 107146108-A0305-02-0253-127
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
Figure 107146108-A0305-02-0254-129
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 85
Figure 107146108-A0305-02-0254-130
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
Figure 107146108-A0305-02-0254-131
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
Figure 107146108-A0305-02-0254-132
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 88
Figure 107146108-A0305-02-0254-133
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 89
Figure 107146108-A0305-02-0255-134
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 90
Figure 107146108-A0305-02-0255-135
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 91
Figure 107146108-A0305-02-0255-136
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
Figure 107146108-A0305-02-0255-137
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 93
Figure 107146108-A0305-02-0255-138
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 94
Figure 107146108-A0305-02-0256-139
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 95
Figure 107146108-A0305-02-0256-140
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213>
<400> 96
Figure 107146108-A0305-02-0256-141
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 97
Figure 107146108-A0305-02-0256-143
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 98
Figure 107146108-A0305-02-0256-144
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 99
Figure 107146108-A0305-02-0257-145
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 100
Figure 107146108-A0305-02-0257-146
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 101
Figure 107146108-A0305-02-0257-147
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 102
Figure 107146108-A0305-02-0257-148
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 103
Figure 107146108-A0305-02-0257-149
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 104
Figure 107146108-A0305-02-0258-150
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 105
Figure 107146108-A0305-02-0258-151
<210> 106
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 106
Figure 107146108-A0305-02-0258-152
Figure 107146108-A0305-02-0259-153
Figure 107146108-A0305-02-0260-154
<210> 107
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人
<400> 107
Figure 107146108-A0305-02-0260-155
Figure 107146108-A0305-02-0261-156
<210> 108
<211> 198
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 108
Figure 107146108-A0305-02-0261-157
Figure 107146108-A0305-02-0262-158
<210> 109
<211> 225
<212> PRT
<213> 智人
<400> 109
Figure 107146108-A0305-02-0262-159
Figure 107146108-A0305-02-0263-222
<210> 110
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 110
Figure 107146108-A0305-02-0264-161
<210> 111
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 111
Figure 107146108-A0305-02-0264-162
<210> 112
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 112
Figure 107146108-A0305-02-0264-163
Figure 107146108-A0305-02-0265-164
<210> 113
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 113
Figure 107146108-A0305-02-0265-165
<210> 114
<211> 328
<212> PRT
<213> 智人
<400> 114
Figure 107146108-A0305-02-0265-166
Figure 107146108-A0305-02-0266-168
Figure 107146108-A0305-02-0267-169
<210> 115
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 HCDR1
<400> 115
Figure 107146108-A0305-02-0267-170
<210> 116
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 HCDR2
<400> 116
Figure 107146108-A0305-02-0267-171
<210> 117
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 HCDR3
<400> 117
Figure 107146108-A0305-02-0268-172
<210> 118
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 LCDR1
<400> 118
Figure 107146108-A0305-02-0268-173
<210> 119
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 LCDR2
<400> 119
Figure 107146108-A0305-02-0268-174
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 LCDR3
<400> 120
Figure 107146108-A0305-02-0268-175
<210> 121
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VH
<400> 121
Figure 107146108-A0305-02-0269-176
<210> 122
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VL
<400> 122
Figure 107146108-A0305-02-0269-177
Figure 107146108-A0305-02-0270-178
<210> 123
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT1 11D06 VH-CH1(EE)-Fc(臼，PGLALA)
<400> 123
Figure 107146108-A0305-02-0270-179
Figure 107146108-A0305-02-0271-180
Figure 107146108-A0305-02-0272-181
<210> 124
<211> 673
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT1 11D06 VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc(杵，PGLALA)
<400> 124
Figure 107146108-A0305-02-0272-182
Figure 107146108-A0305-02-0273-183
Figure 107146108-A0305-02-0274-184
Figure 107146108-A0305-02-0275-185
<210> 125
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT1 11D06 VL-CL(RK)
<400> 125
Figure 107146108-A0305-02-0276-186
Figure 107146108-A0305-02-0277-187
<210> 126
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT1 33H09 VH-CH1(EE)-Fc(臼，PGLALA)
<400> 126
Figure 107146108-A0305-02-0277-188
Figure 107146108-A0305-02-0278-189
Figure 107146108-A0305-02-0279-190
<210> 127
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT1 33H09 VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc(杵，PGLALA)
<400> 127
Figure 107146108-A0305-02-0279-191
Figure 107146108-A0305-02-0280-192
Figure 107146108-A0305-02-0281-193
Figure 107146108-A0305-02-0282-194
<210> 128
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT1 33H09 VL-CL(RK)
<400> 128
Figure 107146108-A0305-02-0282-195
Figure 107146108-A0305-02-0283-196
<210> 129
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VH-CL
<400> 129
Figure 107146108-A0305-02-0283-197
Figure 107146108-A0305-02-0284-198
Figure 107146108-A0305-02-0285-199
<210> 130
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 HCDR1(V9)
<400> 130
Figure 107146108-A0305-02-0285-200
<210> 131
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 HCDR2(V9)
<400> 131
Figure 107146108-A0305-02-0285-201
<210> 132
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 HCDR3(V9)
<400> 132
Figure 107146108-A0305-02-0285-202
<210> 133
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 LCDR1(V9)
<400> 133
Figure 107146108-A0305-02-0286-203
<210> 134
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 LCDR2(V9)
<400> 134
Figure 107146108-A0305-02-0286-204
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 LCDR3(V9)
<400> 135
Figure 107146108-A0305-02-0286-205
<210> 136
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VH(V9)
<400> 136
Figure 107146108-A0305-02-0286-206
Figure 107146108-A0305-02-0287-207
<210> 137
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VL(V9)
<400> 137
Figure 107146108-A0305-02-0287-208
Figure 107146108-A0305-02-0288-209
<210> 138
<211> 275
<212> PRT
<213> 智人
<400> 138
Figure 107146108-A0305-02-0288-210
Figure 107146108-A0305-02-0289-211
<210> 139
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WT1 11D06 VH-CH1(EE)-CD3(V9)VL-CH1-Fc(杵，PGLALA)
<400> 139
Figure 107146108-A0305-02-0289-212
Figure 107146108-A0305-02-0290-213
Figure 107146108-A0305-02-0291-214
Figure 107146108-A0305-02-0292-215
<210> 140
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3(V9)VH-CL
<400> 140
Figure 107146108-A0305-02-0292-216
Figure 107146108-A0305-02-0293-218
Figure 107146108-A0305-02-0294-219

Claims (48)

  1. 一種結合於HLA-A2/WT1之抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：2之HCDR 2及SEQ ID NO：3之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：5之LCDR 2及SEQ ID NO：6之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含：包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
  3. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體為IgG抗體。
  4. 如請求項3之抗體，其中該抗體為IgG1抗體。
  5. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體為全長抗體。
  6. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體為選自Ev分子、scFv分子、Fab分子及F(ab')2分子之群的抗體片段。
  7. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體為多特異性抗體。
  8. 一種雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)結合於第一抗原之第一抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，且該第一抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO：1之重鏈互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：2之HCDR 2及SEQ ID NO：3之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO：4之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：5之LCDR 2及SEQ ID NO：6之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)；及(b)特異性結合於第二抗原之第二抗原結合部分。
  9. 如請求項8之雙特異性抗原結合分子，其中該第一抗原結合部分包含：包含與SEQ ID NO：7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
  10. 如請求項8或9之雙特異性抗原結合分子，其中該第二抗原為CD3。
  11. 如請求項10之雙特異性抗原結合分子，其中該第二抗原為CD3ε。
  12. 如請求項10之雙特異性抗原結合分子，其中該第二抗原結合部分包含：(i)包含SEQ ID NO：115之HCDR 1、SEQ ID NO：116之HCDR 2及SEQ ID NO：117之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：118之LCDR 1、SEQ ID NO：119之LCDR 2及SEQ ID NO：120之LCDR 3的VL；或(ii)包含SEQ ID NO：130之HCDR 1、SEQ ID NO：131之HCDR 2及SEQ ID NO：132之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO：133之LCDR 1、SEQ ID NO：134之LCDR 2及SEQ ID NO：135之LCDR 3的VL。
  13. 如請求項12之雙特異性抗原結合分子，其中該第二抗原結合部分包含：(i)包含與SEQ ID NO：121之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：122之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；或(ii)包含與SEQ ID NO：136之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及包含與SEQ ID NO：137之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
  14. 如請求項8或9之雙特異性抗原結合分子，其中該第一及/或該第二抗原結合部分為Fab分子。
  15. 如請求項8或9之雙特異性抗原結合分子，其中該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1進行相互置換的Fab分子。
  16. 如請求項15之雙特異性抗原結合分子，其中該Fab輕鏈與該Fab重鏈之可變域VL及VH進行相互置換。
  17. 如請求項8或9之雙特異性抗原結合分子，其中該第一抗原結合部分為以下Fab分子，其中在恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
  18. 如請求項8或9之雙特異性抗原結合分子，其中該第一及該第二抗原結合部分彼此融合。
  19. 如請求項18之雙特異性抗原結合分子，其中該第一及該第二抗原結合部分經由肽連接子而融合。
  20. 如請求項8或9之雙特異性抗原結合分子，其中該第一及該第二抗原結合部分各自為Fab分子，且其中(i)該第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與該第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，或(ii)該第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與該第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合。
  21. 如請求項8或9之雙特異性抗原結合分子，其包含由第一及第二次單元 構成之Fc域。
  22. 如請求項21之雙特異性抗原結合分子，其包含結合於該第一抗原之第三抗原結合部分。
  23. 如請求項22之雙特異性抗原結合分子，其中該第三抗原結合部分與該第一抗原結合部分完全相同。
  24. 如請求項22之雙特異性抗原結合分子，其中該第一抗原結合部分、該第二抗原結合部分及該第三抗原結合部分各自為Fab分子；且其中(i)該第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與該第一抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與該Fc域之該第一次單元的N端融合，或(ii)該第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與該第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且該第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與該Fc域之該第一次單元的N端融合；且其中該第三抗原結合部分在Fab重鏈之C端與該Fc域之該第二次單元的N端融合。
  25. 如請求項21之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域為IgG Fc域。
  26. 如請求項25之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域為IgG1 Fc域。
  27. 如請求項21之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域為人類Fc域。
  28. 如請求項21之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域為人類IgG1 Fc域。
  29. 如請求項21之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域之該第一次單元之CH3域中的胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，藉此在該第一次單元之該CH3域內產生隆凸，該隆凸可定位於該第二次單元之CH3域內的凹穴中，且該Fc域之該第二次單元之該CH3域中的胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，藉此在該第二次單元之該CH3域內產生凹穴，該第一次單元之該CH3域內的該隆凸可定位於該凹穴內。
  30. 如請求項21之雙特異性抗原結合分子，其中在該Fc域之該第一次單元之CH3域中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在該Fc域之該第二次單元之CH3域中，位置407處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)(根據Kabat EU索引編號)。
  31. 如請求項30之雙特異性抗原結合分子，其中在該Fc域之該第二次單元中，額外於位置366處之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換(T366S)及於位置368處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A)(根據Kabat EU索引編號)。
  32. 如請求項30之雙特異性抗原結合分子，其中在該Fc域之該第一次單元中，額外於位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(S354C)，或於位置356處之麩胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(E356C)，且在該Fc域之該第二次單元中，額外於位置349處之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)。
  33. 如請求項31之雙特異性抗原結合分子，其中在該Fc域之該第一次單元中，額外於位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(S354C)，或於位置356處之麩胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(E356C)，且在該Fc域之該第二次單元中，額外於位置349處之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)。
  34. 如請求項21之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域包含使與Fc受體之結合減弱及/或效應功能減低的一或多個胺基酸取代。
  35. 如請求項34之雙特異性抗原結合分子，其中該一或多個胺基酸取代選自以下之群：E233、L234、L235、N297、P331及P329(根據Kabat EU索引編號)。
  36. 如請求項21之雙特異性抗原結合分子，其中該Fc域之每個次單位包含L234A、L235A及P329G胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。
  37. 如請求項8之雙特異性抗原結合分子，其包含：(a)結合於第一抗原之第一及第三抗原結合部分，其中該第一抗原為HLA-A2/WT1，且其中該第一及該第三抗原結合部分各為包含重鏈可變區及輕鏈可變區之(習知)Fab分子，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)結合於第二抗原之第二抗原結合部分，其中該第二抗原為CD3， 且其中該第二抗原結合部分為其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL及VH進行相互置換的Fab分子，其包含含有SEQ ID NO：136之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：137之胺基酸序列之輕鏈可變區；(c)由第一及第二次單元構成之人類IgG1 Fc域；其中(i)在(a)項之該第一及該第三抗原結合部分之恆定域中，於位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且於位置123處之胺基酸經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且其中在該第一及該第三抗原結合部分之恆定域CH1中，於位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且於位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；(ii)(a)項之該第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與(b)項之該第二抗原結合部分之Fab重鏈的N端融合，且(b)項之該第二抗原結合部分及(a)項之該第三抗原結合部分各在Fab重鏈之C端與(c)項之該Fc域之其中一個次單元的N端融合；以及(iii)該Fc域之該第一次單元包含S354C及T3366W胺基酸取代，以及該Fc域之該第二次單元包含Y349C、T366S、L368A及Y407V胺基酸取代，且該Fc域之每個次單元進一步包含L234A、L235A及P329G胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。
  38. 如請求項8或37之雙特異性抗原結合分子，其包含與SEQ ID NO：123之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的多肽、包含與SEQ ID NO：125之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或 100%一致之胺基酸序列的多肽、包含與SEQ ID NO：139之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的多肽及包含與SEQ ID NO：140之序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的多肽。
  39. 一種一或多個經分離之聚核苷酸，其編碼如請求項1至7中任一項之抗體或如請求項8至38中任一項之雙特異性抗原結合分子。
  40. 一種一或多個載體，其包含如請求項39之聚核苷酸。
  41. 一種宿主細胞，其包含如請求項39之聚核苷酸或如請求項40之載體。
  42. 一種產生結合於HLA-A2/WT1之抗體的方法，其包含以下步驟：a)在適合於表現該抗體之條件下培養如請求項41之宿主細胞。
  43. 如請求項42之方法，其進一步包含步驟b)回收該抗體。
  44. 一種結合於HLA-A2/WT1之抗體，其藉由如請求項42或43之方法產生。
  45. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至7及44中任一項之抗體或如請求項8至38中任一項之雙特異性抗原結合分子及醫藥學上可接受之載劑。
  46. 一種如請求項1至7中任一項之抗體或如請求項8至38中任一項之雙特異性抗原結合分子的用途，其用於製造用於治療疾病之藥劑，其中該疾病為癌症。
  47. 如請求項46之用途，其中該疾病為白血病。
  48. 如請求項47之用途，其中該疾病為急性淋巴母細胞性白血病(ALL)或急性骨髓性白血病(AML)。
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