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CN119930832A - 结合HLA-A02/HBsAg复合体的多种抗体及其用途 - Google Patents

结合HLA-A02/HBsAg复合体的多种抗体及其用途 Download PDF

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CN119930832A
CN119930832A CN202311448695.5A CN202311448695A CN119930832A CN 119930832 A CN119930832 A CN 119930832A CN 202311448695 A CN202311448695 A CN 202311448695A CN 119930832 A CN119930832 A CN 119930832A
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antigen
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刘志刚
周晓巍
刘玉兰
郝小勃
胡俊杰
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Chongqing Zhixiang Jintai Biopharmaceutical Co ltd
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Beijing Wisdomab Biotechnology Co ltd
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Abstract

本申请提供了包含结合HLA‑A02/HBsAg复合体的第一抗原结合片段和结合活化性T细胞抗原的第二抗原结合片段的双特异性抗体、结合HLA‑A02/HBsAg复合体的单域抗体、包含所述双特异性抗体或所述单域抗体的药物组合物及它们的用途。

Description

结合HLA-A02/HBsAg复合体的多种抗体及其用途
发明领域
本发明通常涉及基因工程和生物医药领域；具体而言，本申请涉及结合HLA-A02/HBsAg复合体的双特异性抗体、结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体及它们的用途。
发明背景
乙型肝炎病毒HBV(Hepatitis B virus)是引起乙型肝炎(简称乙肝)的病原体。乙肝病毒在电子显微镜下可呈3种形态的颗粒结构：直径约42nm的大球形颗粒、直径约22nm的小球形颗粒以及管型颗粒[1,2]。大球形颗粒(Dane颗粒)为完整的病毒颗粒，由包膜和核壳体组成，包膜含乙肝表面抗原(HBsAg)、糖蛋白和细胞脂质，核壳体内含核心蛋白(HBcAg)、环状部分双链HBV-DNA和HBV-DNA多聚酶，是病毒的完整形态，有感染性[3]。
HBV基因型的分型至少有9种，A至I型，还有一种不确定的J型[4]。基因亚型的分布有一定的地域性，A型主要分布在北欧、北美和中非；B、C型主要在亚洲；D型主要分布在地中海地区、中东及印度；其他型在南美及非洲大陆[5-7]。我国感染HBV的人群中，约60％为B基因型，30％为C基因型，另有少数为D基因型和B、C基因型混合感染[8]。
据WHO报道，2019年全球一般人群HBsAg流行率为3.8％，约有150万新发HBV感染者，2.96亿慢性感染者，82万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化或肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)等相关疾病[9]。根据Polaris国际流行病学合作组织推算，2016年我国一般人群HBsAg流行率为6.1％，慢性HBV感染者为8600万例[8]。目前临床中关于慢性HBV感染的治疗主要有两类药物，一类是核苷酸类似物(NA)，一类是干扰素[8]。基于不同的疾病表现和治疗策略，目前能达到约30％的临床治愈率，但不能彻底清除HBV病毒，无法实现完全治愈。基于疾病控制的需求，多种新的药物不断开发中，如：反义RNA、siRNA、衣壳抑制剂、靶向HBsAg的单抗、治疗性疫苗和免疫检查靶点等，大部分单药效果不理想，联用是目前临床研究主要方向[10]。
T细胞(抗原)受体(T cell receptor，TCR)，是所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR的作用是识别抗原，即肽-MHC复合物(p-MHC)。细胞内的蛋白被蛋白酶体降解加工，产生的肽段被运输到内质网与MHC-I组装成复合物，再通过高尔基体运输最终呈现在细胞表面，以便形成可被TCR识别的抗原。其中有些蛋白为肿瘤或者疾病中特异性表达的蛋白，可成为治疗中特异性靶向抗原。研究者们通过研究发现制备TCR模拟抗体(TCRm)可以有效模拟TCR，识别肿瘤特异性抗原的MHC复合物，借助T细胞发挥生物学活性[11-13]。因此开发TCRm×CD3的双特异性抗体药物成为又一重要的药物开发领域。乙肝表面抗原(HBsAg)既是分泌性蛋白也存在于细胞内，被降解后的肽段也可被递呈到细胞表面[14]。经鉴定，HLA-A2限定型肽段HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)可作为靶向抗原肽进行药物的开发[15]。迫于新的治疗策略和药物的需要，靶向HBsAg抗原肽可能会为乙肝病毒的彻底清除治疗带来新的方向。
基于临床需求，探索和开发靶向HBsAg-MHC的CD3双特异性抗体有重要的生物学意义和临床意义。
发明概述
第一方面，本申请提供了双特异性抗体，其包含结合HLA-A02/HBsAg复合体的第一抗原结合片段和结合活化性T细胞抗原的第二抗原结合片段。
在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体能够介导HLA-A02+/HBsAg+肿瘤细胞激活T细胞，和/或所述双特异性抗体能够介导PBMC杀伤HLA-A02+/HBsAg+肿瘤细胞。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:32所示的HCDR1、如SEQ ID NO:33所示的HCDR2和如SEQ ID NO:34所示的HCDR3；其中，HCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段为单域抗体的形式。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含单价或多价的结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段包含如SEQ ID NO:37所示的HCDR1，如SEQ ID NO:38所示的HCDR2，如SEQ ID NO:39所示的HCDR3，如SEQ ID NO:40所示的LCDR1，如SEQ ID NO:41所示的LCDR2和如SEQ ID NO:42所示的LCDR3；其中，HCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段为单链抗体(scFv)或者Fab片段的形式。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含双价的结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体；任选地，所述第一抗原结合片段包含两个结合HLA-A02/HBsAg复合体的单价单域抗体的重链可变区。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:35、36、71或72所示的氨基酸序列；和/或
所述第二抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的轻链可变区。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；以及所述第二抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的轻链可变区；
所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列；以及所述第二抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ IDNO:44所示的轻链可变区；
所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列；以及所述第二抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ IDNO:44所示的轻链可变区；或者
所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列；以及所述第二抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ IDNO:44所示的轻链可变区。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段通过抗体重链恒定区Fc片段相连，所述抗体重链恒定区Fc片段包括第一Fc片段和第二Fc片段，其中所述第一Fc片段的第354和366位的氨基酸分别为C和W，或者所述第一Fc片段的第349、366、368和407位的氨基酸分别为C、S、A和V；以及所述第二Fc片段的第354和366位的氨基酸分别为C和W，或者所述第二Fc片段的第349、366、368和407位的氨基酸分别为C、S、A和V；其中，抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段通过抗体重链恒定区Fc片段相连，所述抗体重链恒定区Fc片段包括第一Fc片段和第二Fc片段，其中所述第一Fc片段和所述第二Fc片段的第234、235和331位的氨基酸分别为F、E和S；其中，抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段通过抗体重链恒定区Fc片段相连，所述抗体重链恒定区Fc片段包括第一Fc片段和第二Fc片段，其中所述第一Fc片段和所述第二Fc片段之一与所述第一抗原结合片段连接，并且所述第一Fc片段和所述第二Fc片段中的另一者与所述第二抗原结合片段连接。
在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体包含结合HLA-A02/HBsAg复合体的第一臂以及结合活化性T细胞抗原的第二臂，其中
所述第一臂包含如SEQ ID NO:45或46所示的氨基酸序列；和
所述第二臂包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
第二方面，本申请提供了结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体，其包含
如SEQ ID NO:32所示的HCDR1，
如SEQ ID NO:33所示的HCDR2，和
如SEQ ID NO:34所示的HCDR3；
其中，HCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第二方面的一些实施方案中，所述单域抗体与HLA-A02/HBsAg复合体的结合表位包括参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第348-357位中的一个或多个残基。
在第二方面的一些实施方案中，所述单域抗体为单价或多价的结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体形式。
在第二方面的一些实施方案中，所述单域抗体为双价的结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体形式。
在第二方面的一些实施方案中，所述单域抗体包含如SEQ ID NO:35、36、71或72所示的氨基酸序列。
第三方面，本申请提供了核酸分子，其编码第一方面所述的双特异性抗体或第二方面所述的单域抗体。
第四方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的双特异性抗体或第二方面所述的单域抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
第五方面，本申请提供了第一方面所述的双特异性抗体、第二方面所述的单域抗体或第四方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗HLA-A02/HBsAg阳性的HBV感染引起的疾病的药物中的用途。
第六方面，本申请提供了第一方面所述的双特异性抗体或第二方面所述的单域抗体在制备检测HLA-A02/HBsAg阳性细胞的产品中的用途。
附图简述
图1显示了ELISA检测抗HLA-A02/HBsAg复合体的TCRm抗体N1B5与重组蛋白MIP-H1-01结合的结果。
图2显示了抗HLA-A02/HBsAg复合体的TCRm抗体N1B5与抗原肽段HBsAg348-357脉冲的T2细胞结合的结果。
图3显示了抗HLA-A02/HBsAg复合体的TCRm抗体N1B5与HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)的丙氨酸扫描突变肽脉冲的T2细胞结合的结果。
图4显示了ELISA检测TCRm×CD3双特异性抗体同时识别MIP-H1-01和CD3的结果。
图5显示了TCRm×CD3双特异性抗体介导抗原肽段脉冲的T2细胞激活Jurkat-Dual细胞的结果。
图6显示了TCRm×CD3双特异性抗体介导HLA-A02+/HBsAg+细胞激活Jurkat-Dual细胞的结果。
图7显示了TCRm×CD3双特异性抗体介导PBMC细胞杀伤抗原肽脉冲的T2细胞的结果。
图8显示了TCRm×CD3双特异性抗体介导PBMC细胞对HLA-A02+/HBsAg+细胞杀伤的结果。
图9显示了TCRm×CD3双特异性抗体介导HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)丙氨酸扫描突变肽脉冲的T2细胞激活Jurkat-Dual细胞的结果。
图10显示了TCRm×CD3双特异性抗体介导相似肽脉冲的T2细胞激活Jurkat-Dual细胞的结果。
图11显示了TCRm×CD3双特异性抗体不介导抗原阴性靶细胞激活Jurkat-Dual细胞。
图12显示了TCRm×CD3双特异性抗体抑制hPBMC免疫重建小鼠中HepG2-HBsAg肿瘤细胞生长的结果。
图13显示了蛋白复合体MIP-H1-01和NIB5-h4形成氢键和盐桥作用的示意图。其中，形成氢键和盐桥相互作用的氨基酸残基显示为棒状模型。
序列说明
SEQ ID NO:1显示了来源于人(homo sapiens)的抗原肽HBsAg348-357的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S4的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S5的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S6的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S7的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S8的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S9的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S10的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S11的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S12的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S13的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S14的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S15的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17显示了来源于人(homo sapiens)的HBSAG-S16的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S17的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S18的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S19的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S20的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S21的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S22的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S23的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S24的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S25的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S26的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S27的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S28的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S29的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31显示了来源于人(homo sapiens)的HBsAg-S30的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32-34分别显示了骆驼(Camelus)单域抗体N1B5和N1B5-h4的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35显示了骆驼(Camelus)单域抗体N1B5的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36显示了人源化单域抗体N1B5-h4的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37-39分别显示了抗人CD3抗体IMCR的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:40-42分别显示了抗人CD3抗体IMCR的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43显示了抗人CD3抗体IMCR的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:44显示了抗人CD3抗体IMCR的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45显示双特异性抗体2N1B5+IMCR中的臂2N1B5-G1m3-FcH1n1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:46显示了双特异性抗体2N1B5-h4+IMCR中的臂2N1B5-h4-G1m3-FcH1n1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47显示了2N1B5-h4+IMCR中的臂IMCR-anti-CD3-ScFv-G1m3-FcKn1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48显示了人(homo sapiens)CD3E胞外区(hCD3E)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:49显示了人(homo sapiens)CD3D胞外区(hCD3D)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:50显示了GLSPTVWLSV的HLA-A02复合物(MIP-H1-01)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:51显示了乙肝表面抗原(HBsAg)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:52显示了连接子的氨基酸序列。
SEQ ID NO:53显示了引物PCal-CH2R的核苷酸序列。
SEQ ID NO:54显示了His标签的氨基酸序列。
SEQ ID NO:55显示了小鼠(mus musculus)IgG2a抗体的Fc段(mFc)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:56显示了人(homo sapiens)IgG1亚型重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:57显示了人IgG1亚型抗体重链恒定区突变体IgG1H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:58显示了人IgG1亚型抗体重链恒定区突变体IgG1K的氨基酸序列。
SEQ ID NO:59显示了人IgG1亚型抗体重链恒定区突变体IgG1m3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:60显示了人IgG1亚型抗体重链恒定区突变体IgG1m3-K的氨基酸序列。
SEQ ID NO:61显示了人IgG1亚型抗体重链恒定区突变体IgG1m3-H1n1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:62显示了人IgG1亚型抗体重链恒定区突变体IgG1m3-Kn1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:63显示了人(homo sapiens)λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:64显示了人(homo sapiens)κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列
SEQ ID NO:65显示了胚系基因抗体DP47重链可变区(VH)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:66显示了胚系基因抗体DP47轻链可变区(VK)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:67显示了对照H1-TCR的α链可变区(Vα)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:68显示了对照H1-TCR的β链可变区(Vβ)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:69显示了对照H1-TCR中H1-TCRA-Des-G1m3-FcKn1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:70显示了对照H1-TCR中H1-TCRB-Des-G1m3-FcH1n1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:71显示了两个骆驼单域抗体N1B5的重链可变区串联的氨基酸序列。
SEQ ID NO:72显示了两个骆驼单域抗体N1B5-h4的重链可变区串联的氨基酸序列。
SEQ ID NO:73显示了人IgG1亚型抗体Fc段突变体IgG1m3-FcH1n1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:74显示了抗人CD3E抗体IMCR单链抗体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:75显示了人IgG1亚型抗体Fc段突变体IgG1m3-FcKn1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:76显示了对照IMC-I109V双功能分子中的第二结合臂IMCR-anti-CD3-scFv-TCRB-Des-G1m3-FcH1n1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:77显示HBsAg348-357 G1位丙氨酸扫描突变肽段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:78显示HBsAg348-357 L2位丙氨酸扫描突变肽段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:79显示HBsAg348-357 S3位丙氨酸扫描突变肽段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:80显示HBsAg348-357 P4位丙氨酸扫描突变肽段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:81显示HBsAg348-357 T5位丙氨酸扫描突变肽段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:82显示HBsAg348-357 V6位丙氨酸扫描突变肽段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:83显示HBsAg348-357 W7位丙氨酸扫描突变肽段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:84显示HBsAg348-357 L8位丙氨酸扫描突变肽段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:85显示HBsAg348-357 S9位丙氨酸扫描突变肽段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:86显示HBsAg348-357 V10位丙氨酸扫描突变肽段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:87显示无关肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:88显示N1B5-h4-Twin-Strep-tag的氨基酸序列。
发明详述
本申请的发明人通过基因工程手段将结合HLA-A02/HBsAg复合体的第一抗原结合片段和结合活化性T细胞抗原(例如CD3分子)的第二抗原结合片段制备成双特异性抗体(例如TCRm双特异性抗体)，通过结合HLA-A02/HBsAg复合体的第一抗原结合片段结合呈递在靶细胞(例如HBV感染的细胞)表面的HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)与HLA-A02的复合体，同时第二抗原结合片段结合活化性T细胞抗原(例如CD3分子)，从而将靶细胞与T细胞之间建立相互作用，引起细胞毒性T细胞激活，以非组织相容性复合体(MHC)依赖方式，裂解靶细胞(例如HBV感染的细胞)，达到治疗疾病(例如HBV感染引起的疾病)的目的。在本申请的多个方面，提供了新的包含结合HLA-A02/HBsAg复合体的第一抗原结合片段和结合活化性T细胞抗原(例如CD3分子)的第二抗原结合片段的双特异性抗体、结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体，编码所述双特异性抗体或所述单域抗体的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、包含所述核酸分子或载体的宿主细胞、制备和纯化所述双特异性抗体或所述单域抗体的方法及所述双特异性抗体或所述单域抗体的医学和生物学应用。根据本申请提供的双特异性抗体或单域抗体的序列，可构建结合HLA-A02/HBsAg复合体的双特异性抗体或单域抗体作为药物在临床上用于预防或治疗HLA-A02/HBsAg阳性的HBV感染引起的疾病。
除非另外指明，本申请的实施采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。
除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
定义
如本文所用的术语“HLA-A02/HBsAg复合体”是指HLA-A02分子与HBsAg的复合体。在本申请的具体实施方案中，“HLA-A02/HBsAg复合体”是指HLA-A02分子与SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第348-357位(HBsAg348-357)的HLA-A02/HBsAg348-357复合体。
如本文所用的术语“活化性T细胞抗原”是指在T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞表面表达的抗原决定簇，其在与抗原结合分子相互作用时能够诱导T细胞活化。具体而言，抗原结合分子与活化性T细胞抗原的相互作用可通过触发T细胞受体复合体的信号传导级联来诱导T细胞活化。在特定方面，活化性T细胞抗原是CD3分子。
如本文所用的术语“抗体”是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到靶标的免疫球蛋白分子。靶标包括但不限于碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还包括其结合片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、线性抗体、单链抗体、单域抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。
通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链可变区(VH)和第一、第二及第三恒定区(CH1、CH2及CH3)。每个轻链含有轻链可变区(VL)和恒定区(CL)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定区的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。
如本文所用的术语“双特异性抗体”是指同时具有两种抗原表位结合能力的抗体。两种抗原表位可以在不同抗原上，也可以在同一抗原上。双特异性抗体可以具有多种结构构型。例如，双特异性抗体可以由两个Fc片段以及分别与其融合的两个结合部分组成(与天然抗体相似，区别在于两个臂结合不同的抗原靶标或表位)，抗原结合部可以为单域抗体、单链抗体(scFv)或者Fab片段。当针对给定的两个抗原的表位时，双特异性抗体的两个不同的结合部各自与一个Fc片段的N端结合，两个臂的抗原结合部配置可以具有四种组合方式：单域抗体+Fab片段、单域抗体+scFv、scFv+单域抗体和Fab片段+单域抗体。Fc片段可以包含能够确保重链异聚化的突变，KIH技术(knob-in-hole，KIH)是解决重链异聚化的一种策略。通常，KIH技术是指通过改造CH3区的氨基酸序列，形成有利于异种半抗体相互配对的结构，可以在构成双特异性抗体的同时又尽可能地保持正常抗体的结构。关于KIH技术的指导，例如可参见“An efficient route to human bispecific IgG”,A.Margaret Merchant etal.,Nature Biotechnology,Volume 16,1998[16]，通过引用的方式将该文献全文并入本文。
如本文所用的术语“结合部分”或“结合片段”可互换使用，是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区域。抗原结合域可以包含重链变异区(VH)、轻链变异区(VL)或上述两者。VH和VL中的每个通常含有三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3。
本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即Kabat定义和Chothia定义。(参阅例如Kabat,“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”，National Institutes of Health,Bethesda，Md.(1991)[17]；A1-Lazikani etal.，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)[18]；以及Martin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989))[19]。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定VH和VL序列中CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR序列。
对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http://www.abysis.org/)。
对于一般抗体而言，抗原结合片段的实例包括但不限于：(1)Fab片段，其可以是具有VL-CL链和VH-CH1链的单价片段；(2)F(ab’)2片段，其可以是具有两个Fab’片段的二价片段，该两个Fab’片段由铰链区的二硫桥(即Fab’的二聚物)连接；(3)具有抗体的单臂的VL和VH域的Fv片段；(4)单链Fv(scFv)，其可以是由VH域和VL域经由肽连接符组成的单一多肽链；(5)(scFv)2，其可以包含两个由肽连接符连接的VH域和两个VL域，该两个VL域是经由二硫桥与该两个VH域组合；以及(6)单域抗体形式。
在双特异性抗体构建中，“结合部分”包括但不限于单域抗体形式、Fab片段形式和/或单链抗体(scFv)形式。
如本文所用的术语“单链抗体(scFv,single chain fragment variable)”是指一般利用基因工程技术构建的单链结构的抗体，包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的一条多肽链。在重链可变区和轻链可变区之间通常会设计一段柔性的连接肽(linker)以便重链可变区和轻链可变区可以折叠成为能够结合抗原的正确构象。
如本文所用的术语“Fab(fragment antigen binding)片段”、“Fab部分”或类似的术语是指完整的抗体用木瓜蛋白酶处理后产生的能够与抗原结合的抗体片段，包括完整的轻链(VL-CL)、重链可变区和CH1片段(VH-CH1)。
如本文所用的术语“单域抗体”是指一种天然缺失轻链的重链单可变域抗体，此类抗体包含重链可变区(VHH)和常规的CH2与CH3区(例如一组或两组(重链可变区(VHH)和常规的CH2与CH3区))。单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位。单域抗体也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。
如本文所用的术语“Fc片段”、“Fc结构域”和“Fc部分”可互换地使用，是指抗体重链恒定区的一部分，包括铰链区(hinge)、重链恒定区的CH2片段和CH3片段，并且参照人IgG1抗体的EU numbering确定。
如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。
如本文所用术语“肿瘤”是指由异常细胞生长形成的赘生物或实体病变。肿瘤可以是良性的、恶变前的或恶性的。在本申请的一些实施方案中，所述肿瘤为肝癌，例如HBV感染引起的肝癌。
第一方面，本申请提供了双特异性抗体，其包含结合HLA-A02/HBsAg复合体的第一抗原结合片段和结合活化性T细胞抗原的第二抗原结合片段。
在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体能够介导HLA-A02+/HBsAg+肿瘤细胞激活T细胞，和/或所述双特异性抗体能够介导PBMC杀伤HLA-A02+/HBsAg+肿瘤细胞。
在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体能够介导HLA-A02+/HBsAg+肿瘤细胞激活Jurkat-Dual细胞。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段与HLA-A02/HBsAg复合体的结合表位包括参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第348-357位中的一个或多个残基。在一些实施方案中，参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第348-357位的氨基酸序列为GLSPTVWLSV(SEQ ID NO:1)。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段与HLA-A02/HBsAg复合体的结合表位包括参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第349、351、352、353、354、355、356和357位残基中的至少一个。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述第一抗原结合片段与HLA-A02/HBsAg复合体的结合表位包括参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第349、352、353、354、355、356和357位残基。在一些实施方案中，参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第349、352、353、354、355、356和357位残基对应于参照SEQ ID NO:1所示的HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)多肽的第2、5、6、7、8、9和10位的氨基酸残基。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述第一抗原结合片段与HLA-A02/HBsAg复合体的结合表位包括参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第351、352、353、354、355、356和357位残基。在一些实施方案中，参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第351、352、353、354、355、356和357位残基对应于参照SEQ ID NO:1所示的HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)多肽的第4、5、6、7、8、9和10位的氨基酸残基。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述第一抗原结合片段与HLA-A02/HBsAg复合体的结合表位包括参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第349、351、352、353、354、355、356和357位残基。在一些实施方案中，参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第349、351、352、353、354、355、356和357位残基对应于参照SEQ ID NO:1所示的HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)多肽的第2、4、5、6、7、8、9和10位的氨基酸残基。
在第一方面的一些实施方案中，所述活化性T细胞抗原为CD3分子。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:32所示的HCDR1、如SEQ ID NO:33所示的HCDR2和如SEQ ID NO:34所示的HCDR3；其中，HCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段为单域抗体的形式。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含单价或多价(例如1、2、3、4、5或6价)的结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述第一抗原结合片段包含双价的结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体。在一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含两个结合HLA-A02/HBsAg复合体的单价单域抗体的重链可变区。在一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含直接融合的两个结合HLA-A02/HBsAg复合体的单价单域抗体的重链可变区。在一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含通过连接子连接的两个结合HLA-A02/HBsAg复合体的单价单域抗体的重链可变区。在一些实施方案中，所述连接子为包含GS型柔性肽的连接子，例如(GGGGS)n，其中n为≥1的整数。在一些具体的实施方案中，所述连接子为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:52)。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列包含两个SEQ IDNO:35所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列包含两个SEQ IDNO:36所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段包含如SEQ ID NO:37所示的HCDR1，如SEQ ID NO:38所示的HCDR2，如SEQ ID NO:39所示的HCDR3，如SEQ ID NO:40所示的LCDR1，如SEQ ID NO:41所示的LCDR2和如SEQ ID NO:42所示的LCDR3；其中，HCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段为单链抗体(scFv)或者Fab片段的形式。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段为scFv的形式。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ IDNO:43所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的轻链可变区。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；以及所述第二抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的轻链可变区。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列；以及所述第二抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的轻链可变区。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列；以及所述第二抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的轻链可变区。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列；以及所述第二抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的轻链可变区。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段的氨基酸序列与SEQ IDNO:35、36、71或72所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段的氨基酸序列与SEQ IDNO:35、36、71或72所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:35、36、71或72所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述第一抗原结合片段的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:35、36、71或72所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述第一抗原结合片段的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:35、36、71或72所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述第一抗原结合片段的功能。
在第一方面的一些实施方案中，其中所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述第二抗原结合片段的重链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述第二抗原结合片段的重链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述第二抗原结合片段的重链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，其中所述第二抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述第二抗原结合片段的轻链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述第二抗原结合片段的轻链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述第二抗原结合片段的轻链可变区的功能。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段通过抗体重链恒定区Fc片段相连，所述抗体重链恒定区Fc片段包括第一Fc片段和第二Fc片段，其中所述第一Fc片段的第354和366位的氨基酸分别为C和W，或者所述第一Fc片段的第349、366、368和407位的氨基酸分别为C、S、A和V；以及所述第二Fc片段的第354和366位的氨基酸分别为C和W，或者所述第二Fc片段的第349、366、368和407位的氨基酸分别为C、S、A和V；其中，抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段通过抗体重链恒定区Fc片段相连，所述抗体重链恒定区Fc片段包括第一Fc片段和第二Fc片段，其中所述第一Fc片段的第354和366位的氨基酸分别为C和W，所述第二Fc片段的第349、366、368和407位的氨基酸分别为C、S、A和V；其中，抗体恒定区氨基酸位置按照EUnumbering确定。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段通过抗体重链恒定区Fc片段相连，所述抗体重链恒定区Fc片段包括第一Fc片段和第二Fc片段，其中所述第一Fc片段和所述第二Fc片段的第234、235和331位的氨基酸分别为F、E和S；其中，抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段通过抗体重链恒定区Fc片段相连，所述抗体重链恒定区Fc片段包括第一Fc片段和第二Fc片段，其中所述第一Fc片段和所述第二Fc片段之一与所述第一抗原结合片段连接，并且所述第一Fc片段和所述第二Fc片段中的另一者与所述第二抗原结合片段连接。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一抗原结合片段(例如在C端)与所述第一Fc片段(例如氨基酸序列如SEQ ID NO:73)的N末端连接。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二抗原结合片段(例如在C端)与所述第二Fc片段(例如氨基酸序列如SEQ ID NO:75)的N末端连接。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体重链恒定区Fc片段为IgG1亚型的Fc片段。在一些实施方案中，所述第一Fc片段为IgG1亚型的Fc片段；和/或所述第二Fc片段为IgG1亚型的Fc片段。
在第一方面的一些实施方案中，所述抗体重链恒定区Fc片段为IgG1m3亚型的Fc片段。在一些实施方案中，所述第一Fc片段为IgG1m3亚型的Fc片段；和/或所述第二Fc片段为IgG1m3亚型的Fc片段。
在第一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体包含结合HLA-A02/HBsAg复合体的第一臂以及结合活化性T细胞抗原的第二臂，其中
所述第一臂包含如SEQ ID NO:45或46所示的氨基酸序列；和
所述第二臂包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些实施方案中，其中所述第一臂的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:45或46所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一臂的氨基酸序列与SEQ ID NO:45或46所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第一方面的一些实施方案中，所述第一臂的氨基酸序列与SEQ ID NO:45或46所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:45或46所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述第一臂的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:45或46所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述第一臂的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:45或46所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的第一臂的功能。
在第一方面的一些实施方案中，其中所述第二臂的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二臂的氨基酸序列与SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第一方面的一些实施方案中，所述第二臂的氨基酸序列与SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第一方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述第二臂的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述第二臂的功能。
在第一方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述第二臂的功能。
第二方面，本申请提供了结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体，其包含
如SEQ ID NO:32所示的HCDR1，
如SEQ ID NO:33所示的HCDR2，和
如SEQ ID NO:34所示的HCDR3；
其中，HCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
在第二方面的一些实施方案中，所述单域抗体与HLA-A02/HBsAg复合体的结合表位包括参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第348-357位中的一个或多个残基。在一些实施方案中，参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第348-357位的氨基酸序列为GLSPTVWLSV(SEQ IDNO:1)。
在第二方面的一些实施方案中，所述单域抗体与HLA-A02/HBsAg复合体的结合表位包括参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第349、351、352、353、354、355、356和357位残基中的至少一个。
在第二方面的一些具体的实施方案中，所述单域抗体与HLA-A02/HBsAg复合体的结合表位包括参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第349、352、353、354、355、356和357位残基。在一些实施方案中，参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第349、352、353、354、355、356和357位残基对应于参照SEQ ID NO:1所示的HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)多肽的第2、5、6、7、8、9和10位的氨基酸残基。
在第二方面的一些具体的实施方案中，所述单域抗体与HLA-A02/HBsAg复合体的结合表位包括参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第351、352、353、354、355、356和357位残基。在一些实施方案中，参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第351、352、353、354、355、356和357位残基对应于参照SEQ ID NO:1所示的HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)多肽的第4、5、6、7、8、9和10位的氨基酸残基。
在第二方面的一些具体的实施方案中，所述单域抗体与HLA-A02/HBsAg复合体的结合表位包括参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第349、351、352、353、354、355、356和357位残基。在一些实施方案中，参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第349、351、352、353、354、355、356和357位残基对应于参照SEQ ID NO:1所示的HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)多肽的第2、4、5、6、7、8、9和10位的氨基酸残基。
在第二方面的一些实施方案中，所述单域抗体为单价或多价的结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体形式。
在第二方面的一些实施方案中，所述单域抗体为单价的结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体形式。
在第二方面的一些实施方案中，所述单域抗体为双价的结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体形式。
在第二方面的一些实施方案中，所述单域抗体包含两个单价形式的结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体的重链可变区。
在第二方面的一些具体实施方案中，所述单域抗体包含直接融合的两个单价形式的结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体的重链可变区。
在第二方面的一些具体实施方案中，所述单域抗体包含通过连接子连接的两个单价形式的结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体的重链可变区。在一些实施方案中，所述连接子为包含GS型柔性肽的连接子，例如(GGGGS)n，其中n为≥1的整数。在一些具体的实施方案中，所述连接子为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:52)。
在第二方面的一些实施方案中，所述单域抗体包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
在第二方面的一些实施方案中，所述单域抗体包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在第二方面的一些实施方案中，所述单域抗体包含如SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。
在第二方面的一些实施方案中，所述单域抗体包含如SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列。
在第二方面的一些实施方案中，所述单域抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO:35、36、71或72所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。
在第二方面的一些实施方案中，所述单域抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO:35、36、71或72具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在第二方面的一些实施方案中，SEQ ID NO:35、36、71或72所示的氨基酸序列的C端或N端区域还可以被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，而仍然保持类似的所述单域抗体的功能。
在第二方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:35、36、71或72所示的氨基酸序列的C端或N端区域添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，得到的氨基酸序列仍然保持类似的所述单域抗体的功能。
在第二方面的一些实施方案中，还可以在SEQ ID NO:35、36、71或72所示的氨基酸序列的C端或N端以外的区域添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸，只要改变后的氨基酸序列基本上保持类似的所述单域抗体的功能。
第三方面，本申请提供了核酸分子，其编码第一方面所述的双特异性抗体或第二方面所述的单域抗体。
在第三方面的一些实施方案中，所述核酸分子可以包括DNA分子及RNA分子。所述核酸分子可以为单链或双链，且可为cDNA。
在第三方面的一些实施方案中，所述核酸分子可操作地连接到调控核苷酸序列，调控核苷酸序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。
第四方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面所述的双特异性抗体或第二方面所述的单域抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在第四方面的一些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗HLA-A02/HBsAg阳性的HBV感染引起的疾病。
在第四方面的一些实施方案中，所述HLA-A02/HBsAg阳性的HBV感染引起的疾病选自：乙型肝炎、肝硬化、肝纤维化和肝癌。
在第四方面的一些实施方案中，所述药物组合物还可包含下述物质中的一种或多种:润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，如苯甲酸、山梨酸和丙酸钙；增甜剂和/或调味剂等。
在第四方面的一些实施方案中，可以将本申请中的药物组合物配制为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、栓剂或胶囊等形式。
在第四方面的一些实施方案中，可以利用任何生理上可接受的给药方式递送本申请的药物组合物，这些给药方式包括但不限于:口服给药、肠胃外给药、经鼻给药、直肠给药、腹膜内给药、血管内注射、皮下给药、经皮给药、吸入给药等。
在第四方面的一些实施方案中，可以通过混合具有所需纯度的试剂与视情况的药学上可接受的载体、赋形剂等，以冻干制剂或水溶液的形式配制用于治疗用途的药物组合物用于存储。
第五方面，本申请提供了第一方面所述的双特异性抗体、第二方面所述的单域抗体或第四方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗HLA-A02/HBsAg阳性的HBV感染引起的疾病的药物中的用途。
在第五方面的一些实施方案中，所述HLA-A02/HBsAg阳性的HBV感染引起的疾病选自：乙型肝炎、肝硬化、肝纤维化和肝癌。
第六方面，本申请提供了预防或治疗HLA-A02/HBsAg阳性的HBV感染引起的疾病的方法，其包括向有需要的个体给予第一方面所述的双特异性抗体、第二方面所述的单域抗体、或第四方面所述的药物组合物。
在第六方面的一些实施方案中，所述HLA-A02/HBsAg阳性的HBV感染引起的疾病选自：乙型肝炎、肝硬化、肝纤维化和肝癌。
第七方面，本申请提供了第一方面所述的双特异性抗体或第二方面所述的单域抗体在制备检测HLA-A02/HBsAg阳性细胞的产品中的用途。
在第七方面的一些实施方案中，所述产品为试剂盒、试纸条、检测卡或微流控装置。
在第七方面的一些实施方案中，所述产品还可以包含检测标记，如胶体金、化学发光标记、荧光标记、纳米颗粒标记等。
在第七方面的一些实施方案中，所述产品还可以包括用于检测的其它试剂，例如酶或胶体金标记抗原或抗体、底物、参考标准品、稀释液、洗涤液等。
在第七方面的一些实施方案中，所述产品还可以包括用于处理生物样品以进行检测的试剂，所述生物样品可以为血液。
在第七方面的一些实施方案中，所述产品还可以包括产品使用说明书。
本申请还提供包含编码第一方面所述的双特异性抗体、或第二方面所述的单域抗体的核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或载体的宿主细胞。在其他方面，本申请还提供产生第一方面所述的双特异性抗体或第二方面所述的单域抗体的方法。在一些实施方案中，产生第一方面所述的双特异性抗体或第二方面所述的单域抗体的方法包括培养宿主细胞以便于表达核酸分子。在一些实施方案中，产生第一方面所述的双特异性抗体、或第二方面所述的单域抗体的方法还包括从宿主细胞培养基中回收所述双特异性抗体或所述单域抗体。
应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。
实施例
实施例1:重组蛋白的制备
制备基于HLA-A02/HBsAg和CD3双特异性抗体的过程中，需要用到多种不同的重组蛋白，包括人CD3E胞外区(hCD3E，SEQ ID NO:48)和人CD3D胞外区(hCD3D，SEQ ID NO:49)。同时，参照文献[20]制备抗原肽HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)的二硫键捕获型单链三聚体(disulfide trap single chain trimer，dtSCT)结构MHCⅠ复合体，即GLSPTVWLSV的HLA-A02复合物(MIP-H1-01，SEQ ID NO:50)。这些重组蛋白都有大量的翻译后修饰(如糖基化或二硫键等)，因而利用哺乳动物细胞表达系统将更有利于保持重组蛋白的结构和功能。在这些重组蛋白的C端添加His标签(His，SEQ ID NO:54)或者鼠抗体IgG2a的Fc段(mFc，SEQ IDNO:55)，将更有利于重组蛋白的纯化和单克隆抗体功能的鉴定。在制备重组抗体时，抗体重链恒定区可以是人IgG1亚型(SEQ ID NO:56)或者选定的人IgG1亚型的各种突变体，如：IgG1H(SEQ ID NO:57)、IgG1K(SEQ ID NO:58)、IgG1m3-H(SEQ ID NO:59)、IgG1m3-K(SEQID NO:60)、IgG1m3-H1n1(SEQ ID NO:61)或者IgG1m3-Kn1(SEQ ID NO:62)，轻链恒定区可以是人λ亚型(SEQ ID NO:63)或人κ亚型(SEQ ID NO:64)。
根据Uniprot数据库的各种目的重组蛋白的氨基酸序列，设计并合成上述重组蛋白的基因(包含His标签或者mFc编码基因)。利用常规的分子生物学技术将合成的各种重组蛋白基因克隆至合适的真核表达载体(如Invitrogen公司的pcDNA3.1等)，然后利用脂质体(如Invitrogen公司的293fectin等)或者其他阳离子转染试剂(如PEI等)将制备的重组蛋白表达质粒转染入HEK293细胞(如invitrogen公司的HEK293F细胞)，在无血清悬浮培养条件下培养3-4天。然后通过离心等方式收获培养上清。
His标签融合表达的重组蛋白利用金属螯合亲和层析柱(如GE公司的HisTrap FF等)对培养上清中的重组蛋白进行一步纯化。mFc融合表达的重组蛋白用ProteinA/G亲和层析柱(如GE公司的Mabselect SURE等)进行一步纯化。然后利用脱盐柱(如GE公司的Hitrapdesaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为PBS(pH7.0)或者其他合适的缓冲液。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃。
实施例2:从骆驼免疫库筛选结合HLA-A02/HBsAg复合体的抗体
2.1骆驼免疫库的构建
选取健康的成年双峰骆驼1只，免疫之前采血留本底血清。首次免疫取1mg的MIP-H1-01融合蛋白以费氏完全佐剂乳化后，皮下多点注射；间隔两周加强免疫，取1mg的MIP-H1-01融合蛋白以费氏不完全佐剂乳化后，皮下多点注射，共进行5次加强免疫，每次免疫前采血用于抗体滴度分析；第七次免疫不加佐剂，取1mg的MIP-H1-01融合蛋白作为抗原，皮下多点注射冲击免疫，3天后收集200mL外周血用于淋巴细胞分离。
使用骆驼外周血淋巴细胞分离试剂盒(Solarbio，CAT#P5750)从200mL骆驼外周血中分离淋巴细胞；利用细胞总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，CAT#DP430)提取淋巴细胞总RNA；以提取的总RNA为模板，利用第一链cDNA合成试剂盒(Thermoscientific，CAT#K1621)合成骆驼单域抗体重链可变区(VHH)cDNA，反转录引物采取基因特异性引物，引物配对区位于抗体重链恒定区CH2结构域，具体序列为PCal-CH2R：TCCTTCCCCGTCAGCCAGTCCT(SEQ ID NO:53)。合成的cDNA立即存放于-70℃保存备用；然后以反转录得到的cDNA为模板，参考文献[21]合成引物，并利用巢氏PCR扩增分离骆驼单域抗体VHH基因。最后将扩增得到的VHH基因克隆至载体pADSCFV-S(参见第201510097117.0号中国专利申请[22])，构建VHH库，库容达到1.41E+08，正确率为65.20％。
2.2骆驼免疫库的筛选
以实施例1中制备的重组MIP-H1-01为抗原，利用固相筛选策略(实验方案参考噬菌体展示：通用实验指南，(美)克拉克森(Clackson,T.)，(美)洛曼(Lowman,H.B.)编；马岚等译，化学工业出版社，2008.5[23])筛选实施例2.1构建的展示骆驼单域抗体的噬菌体库，通过结合、洗脱、中和、感染、扩增的方式共进行三轮筛选，最终获得特异结合MIP-H1-01的TCRm(TCR模拟)抗体N1B5。
利用常规的分子生物学手段，将编码N1B5重链可变区(SEQ ID NO:35)的核苷酸序列克隆至融合有编码人抗体IgG1的Fc段的核苷酸序列真核表达载体(如invitrogen公司pcDNA3.1等)，表达N1B5-Fc重组蛋白。同时，制备DP47(胚系基因抗体，参照美国专利申请US20160200833A1[24]，DP47VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:65所示；DP47VK的氨基酸序列如SEQID NO:66所示)单克隆抗体DP47-IgG1作为阴性对照。参照专利WO2020193745 A1[25]，合成IMC-I109V的TCR的Vα(TCRA，SEQ ID NO:67)和Vβ(TCRB，SEQ ID NO:68)可变区基因，分别克隆至融合有Cα的包含Knob突变的Fc片段核苷酸序列的真核表达载体和融合有Cβ的包含Hole突变的Fc片段核苷酸序列的真核表达载体，二者共转染表达结合MIP-H1-01的TCR对照分子，命名为H1-TCR。H1-TCR的两条链分别为H1-TCRA-Des-FcKn1(SEQ ID NO:69)和H1-TCRB-Des-G1m3-FcH1n1(SEQ ID NO:70)。
实施例3:结合HLA-A02/HBsAg复合体的TCRm抗体的鉴定
3.1抗HLA-A02/HBsAg复合体的TCRm抗体的亲和力分析
利用Biacore T200通过表面等离子共振技术测定抗HLA-A2/HBsAg的TCRm抗体N1B5的亲和力。氨基偶联试剂盒(BR-1000-50)、人抗体捕获试剂盒(BR-1008-39)，S系列CM5芯片(14100530)和pH7.4的10×HBS-EP(BR100669)等相关试剂和耗材均购自GEhealthcare。依照试剂盒中的说明书，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)对羧基化CM5芯片表面进行活化，将抗人IgG(Fc)抗体(捕获抗体)用10mM pH5.0乙酸钠稀释至25μg/mL，之后以流速10μL/min注射以实现大约10000个响应单位(RU)的偶联量。注射捕获抗体之后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将TCRm抗体N1B5-稀释至1μg/mL，10μL/min注射，保证70RU左右的抗体被抗人Fc的抗体捕获。然后将MIP-H1-01设置一系列的浓度梯度(例如1.23nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM和100nM)，以流速30μL/min从低浓度到高浓度进行注射，结合时间为90s，解离时间为1200s，以流速10μL/min注射3M的MgCl2溶液30s对芯片表面进行再生。使用Biacore T200评估软件第3.2.1版，通过1:1结合模型拟合结合和解离传感图来计算结合速率(Ka)和解离速率(Kd)。以比率Kd/Ka计算解离平衡常数(KD)。拟合结果如表1所示。
表1.抗HLA-A02/HBsAg复合体的TCRm抗体N1B5结合MIP-H1-01亲和力
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
N1B5 6.921E+5 9.696E-5 1.401E-10
3.2抗HLA-A02/HBsAg复合体的TCRm抗体与重组蛋白MIP-H1-01的结合
将抗HLA-A02/HBsAg复合体的TCRm抗体N1B5包被于96孔ELISA板，5μg/mL，每孔100μL，4℃包被过夜。利用封闭液PBS-0.1％吐温20-3％脱脂乳，在37℃下封闭1小时。用PBS对重组蛋白MIP-H1-01进行稀释，起始浓度为10μg/mL，3倍梯度稀释，共11个浓度梯度，每孔100μL加入封闭好的96孔ELISA板中，37℃孵育1小时。PBS-0.1％吐温20洗涤ELISA板，加入HRP标记的抗His标签鼠单克隆抗体(北京康为世纪生物科技有限公司，CW0285M)，37℃孵育1小时。PBS-0.1％吐温20洗涤ELISA板，加入OPD底物显色液，5-10分钟后用1M的H2SO4终止显色，酶标仪492nm/630nm双波长测定光密度值。图1结果显示：N1B5特异性地结合MIP-H1-01，即N1B5特异性地结合HLA-A02/HBsAg复合体。
3.3抗HLA-A02/HBsAg复合体的TCRm抗体与抗原肽脉冲的T2细胞的结合
收集生长对数期的T2细胞(人淋巴瘤细胞，HLA-A02+，购自上海弘顺生物科技有限公司)，离心后用生长培养基重悬至1×106个/mL，每孔1mL铺板于24孔板。化学合成肽段HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)(金斯瑞生物科技股份有限公司)，并以50μg/mL的终浓度加入到24孔板中，过夜脉冲。16小时后离心，离心后用含1％BSA的PBS缓冲液重悬至2×106个/mL，每孔100μL铺于96孔V底板中，离心后去掉上清。用PBS将抗体N1B5，阳性对照样品H1-TCR和阴性对照DP47-IgG1分别配制为200nM终浓度起始，4倍稀释的样品，共计10个浓度。每孔100μL加入含细胞的孔中，4℃孵育1小时。然后用200μL PBS洗3遍，孵育羊抗人IgG-FITC(北京中杉金桥生物技术有限公司，ZF-0308)，每孔100μL，4℃避光孵育30分钟。然后用200μL PBS洗3遍，100μL PBS重悬后用流式细胞仪(ACEA，Novocyte)检测FITC通道。图2结果显示：N1B5能特异性地结合抗原肽HBsAg348-357脉冲的T2细胞，即N1B5结合细胞表面的HLA-A02/HBsAg复合体。
3.4抗HLA-A02/HBsAg复合体的TCRm抗体结合HBsAg的关键氨基酸
化学合成HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)的丙氨酸扫描突变肽段。参考实施例3.3检测N1B5与HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)的丙氨酸扫描突变肽脉冲的T2细胞的结合，其中无关肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:87所示。计算N1B5与丙氨酸扫描突变肽的结合相对于原始肽的值。图3结果显示：HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)的2、4、5、6、7、8、9和10位被丙氨酸取代后，TCRm抗体N1B5的结合能力下降70％以上，即HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)的第2、4、5、6、7、8、9和10位是N1B5结合的关键氨基酸。
实施例4:抗HLA-A02/HBsAg复合体的TCRm抗体的人源化及鉴定
4.1抗HLA-A02/HBsAg复合体的TCRm抗体的人源化
对TCRm抗体N1B5进行人源化以降低其免疫原性。人源化方案采取经典的框架移植策略[26]。将N1B5的氨基酸序列与IMGT数据库中的人抗体胚系基因序列相比较，选择合适的胚系基因序列以提供抗体的框架区1至3(FR1+FR2+FR3)，选择合适的J区基因序列以提供框架区4(FR4)。这个模板可以根据多种因素选出，如：抗体的相对总长度、CDR的大小、位于抗体框架区(FR)和超变区(CDR)之间连接处的氨基酸残基、序列整体的同源性等。所选的模板可以是多个序列的混合物或者可以是共有模板，目的是尽可能维持亲本互补决定区(CDR)的合适构象。同时，考虑到人源化抗体的可溶性、稳定性和表达产量等特性，分别对其FR2中4个热点氨基酸37F/44E/45R/47F进行回复突变，最终得到人源化分子N1B5-h4。
利用常规的分子生物学手段，将编码N1B5-h4可变区(SEQ ID NO：36)的核苷酸序列克隆至融合有编码人抗体IgG1的Fc段的核苷酸序列真核表达载体(如invitrogen公司pcDNA3.1等)，表达N1B5-h4-Fc重组蛋白。
4.2抗HLA-A02/HBsAg复合体的TCRm抗体人源化分子亲和力分析
参照实施例3.1，使用Biacore T200对重组抗HLA-A02/HBsAg复合体的TCRm抗体N1B5-h4进行亲和力分析，结果如表2所示。表2.抗HLA-A02/HBsAg复合体的TCRm抗体N1B5-h4结合MIP-H1-01亲和力
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
N1B5-h4 6.556E+5 1.252E-4 1.910E-10
实施例5：TCRm×CD3双特异性抗体的制备和鉴定
5.1TCRm×CD3双特异性抗体的制备
分别将编码抗HLA-A02/HBsAg复合体的双价N1B5或双价N1B5-h4单域抗体的重链可变区核苷酸序列和编码抗CD3的单链抗体(IMCR-anti-CD3-scFv，参见申请第美国专利US5821337A号[27]的anti-CD3 v9)的核苷酸序列克隆至合适的真核表达载体，共表达抗HLA-A02/HBsAg复合体和CD3的双特异性抗体。即将编码2N1B5(SEQ ID NO:71)或2N1B5-h4(SEQID NO:72)的核苷酸序列分别克隆至融合有编码Hole突变的Fc片段IgG1m3-FcH1n1(SEQ IDNO:73)核苷酸序列的真核表达载体，将编码IMCR-anti-CD3-ScFv(SEQ ID NO:74)的核苷酸序列克隆至融合有编码Knob突变的Fc片段IgG1m3-FcKn1(SEQ ID NO:75)核苷酸序列的真核表达载体。同时，制备基于相同结构的DP47双特异性抗体2DP47+IMCR作为阴性对照。
将构建的表达2N1B5-IgG1m3-FcH1n1(SEQ ID NO:45)或2N1B5-h4-IgG1m3-FcH1n1(SEQ ID NO:46)的真核表达载体与表达IMCR-anti-CD3-ScFv-IgG1m3-FcKn1(SEQ ID NO:47)的真核表达载体利用脂质体共转染入HEK293F细胞，在无血清悬浮培养条件下培养3-5天，然后通过离心等方式收获培养上清。培养上清中双特异性抗体用ProteinA亲和层析柱(如GE公司的Mabselect SURE等)进行纯化，然后利用脱盐柱(如GE公司的Hitrapdesaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为PBS(pH7.0)或者其它合适的缓冲液。将脱盐后蛋白溶液通过尺寸排阻层析(SEC)使用Superdex200(GE)纯化得到目的蛋白。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃备用。
制备基于TCR和CD3的双功能分子IMC-I109V。将CD3的单链抗体IMCR-anti-CD3-scFv融合在H1-TCRB-Des-G1m3-FcH1n1链的N端。组成IMC-I109V的两条链分别为H1-TCRA-Des-G1m3-FcKn1(SEQ ID NO:69)和IMCR-anti-CD3-scFv-TCRB-Des-G1m3-FcH1n1(SEQ IDNO:76)。上述IMC-I109V的表达和纯化参照双特异性抗体2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR的表达和纯化，之后对样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃备用。
5.2 TCRm×CD3双特异性抗体的亲和力分析
参照实施例3.1，使用Biacore T200对重组TCRm×CD3双特异性抗体2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR进行亲和力分析，结果如表3和表4所示。
表3.TCRm×CD3双特异性抗体结合MIP-H1-01亲和力
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
2N1B5+IMCR 6.132E+5 1.452E-4 2.367E-10
2N1B5-h4+IMCR 2.629E+5 1.397E-4 5.314E-10
IMC-I109V 5.241E+4 8.693E-5 1.659E-9
表4.TCRm×CD3双特异性抗体结合CD3D-CD3E-mFc亲和力
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
2N1B5+IMCR 5.918E+4 1.753E-4 2.962E-9
2N1B5-h4+IMCR 6.469E+4 1.32E-4 2.041E-9
IMC-I109V 7.019E+4 2.591E-4 3.692E-9
5.3TCRm×CD3双特异性抗体同时识别抗原MIP-H1-01和CD3
利用常规ELISA方法检测TCRm×CD3双特异性抗体同时结合双方向抗原CD3和MIP-H1-01。
将CD3D-CD3E-mFc抗原包被96孔ELISA板(3μg/mL，每孔100μL)，4℃包被过夜。利用封闭液PBS-0.1％吐温20-3％脱脂乳在37℃下封闭1小时。用PBS将TCRm×CD3双特异性抗体稀释至10μg/mL，每孔100μL加入封闭好的96孔ELISA板中，37℃孵育1小时。PBS-0.1％吐温20洗涤ELISA板，加入MIP-H1-01抗原(10μg/mL，每孔100μL)，37℃孵育1小时。PBS-0.1％吐温20洗涤ELISA板，然后加入HRP标记的抗His标签鼠单克隆抗体(北京康为世纪生物科技有限公司，cw0285M)，37℃孵育1小时。PBS-0.1％吐温20洗涤ELISA板，加入OPD底物显色液，5-10分钟后用1M的H2SO4终止显色，酶标仪492nm/630nm双波长测定光密度值。ELISA分析结果如图4所示：TCRm×CD3双特异性抗体2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR能够同时识别CD3和MIP-H1-01双方向抗原。
5.4 TCRm×CD3双特异性抗体介导Jurkat-Dual细胞激活
5.4.1 TCRm×CD3双特异性抗体介导抗原肽脉冲的T2细胞激活Jurkat-Dual细胞
收集生长对数期的T2细胞，离心后用生长培养基重悬至1×106个/mL，每孔1mL铺板于24孔板。肽段HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)以50μg/mL的终浓度加入到24孔板中，过夜脉冲。16小时后离心，用RPMI1640培养基重悬至4×105个/mL，每孔50μL铺于细胞板中。收集生长对数期的Jurkat-Dual细胞(购自Invivogen)，离心后用RPMI1640培养基重悬至4×105个/mL，每孔50μL加入以上接种了T2细胞的细胞板中以获得1:1的最终E:T比例。然后加入双特异性抗体2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR(起始浓度为10nM，3倍梯度稀释，11个浓度点，每孔100μL)。阴性对照样品2DP47+IMCR，阳性对照样品IMC-I109V，使用浓度均同双特异性抗体2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR的浓度。孵育24h，取上清，参照QUANTI-LucTM说明书(QUANTI-LucTM，Invivogen，rep-qlc2)检测和分析TCRm×CD3双特异性抗体介导抗原肽脉冲的T2细胞对Jurkat-Dual细胞的特异性激活。图5中的结果显示：双特异性抗体2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR可以特异性介导抗原肽脉冲的T2细胞激活Jurkat-Dual细胞；并且与IMC-I109V相比，2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR双特异性抗体对Jurkat-Dual细胞的激活更明确，EC50值见表5。
表5.TCRm×CD3双特异性抗体介导抗原肽脉冲的T2细胞激活Jurkat-Dual细胞EC50值
2N1B5+IMCR 2N1B5-h4+IMCR IMC-I109V
EC50(nM) 0.002413 0.002758 0.06414
5.4.2 TCRm×CD3双特异性抗体介导HLA-A02+/HBsAg+肿瘤细胞激活Jurkat-Dual细胞
HepG2(人肝癌细胞，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)，HepG2为HLA-A02阳性细胞，基于HepG2细胞构建了稳定表达HBsAg(乙肝表面抗原)的细胞株HepG2-HBsAg。收集对数生长期的HepG2-HBsAg，消化离心后用RPMI1640培养基重悬至4×105个/mL，每孔50μL铺于细胞板中。收集生长对数期的Jurkat-Dual细胞，离心后用RPMI1640培养基重悬至4×105个/mL，每孔50μL加入细胞板中以获得1:1的最终E:T比例。然后加入双特异性抗体2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR(起始浓度为50nM，4倍梯度稀释，10个浓度点的，每孔100μL)。阴性对照样品2DP47+IMCR，阳性对照样品IMC-I109V，使用浓度均同双特异性抗体2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR的浓度。孵育48小时后，取上清，参照QUANTI-LucTM说明书(QUANTI-LucTM，Invivogen，rep-qlc2)检测和分析HLA-A02+/HBsAg+细胞对Jurkat-Dual细胞的特异性激活。图6中的结果显示，TCRm×CD3双特异性抗体2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR可以介导HLA-A02+/HBsAg+细胞HepG2-HBsAg激活Jurkat-Dual细胞；并且与IMC-I109V相比，TCRm×CD3双特异性抗体2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR对Jurkat-Dual细胞的激活活性更强，EC50值见表6。
表6.TCRm×CD3双特异性抗体介导HLA-A02+/HBsAg+细胞激活Jurkat-Dual细胞
2N1B5+IMCR 2N1B5-h4+IMCR IMC-I109V
EC50(nM) 0.3894 0.4088 0.6211
5.5 TCRm×CD3双特异性抗体介导PBMC特异性杀伤靶细胞
5.5.1人外周血单核细胞(PBMC)的分离
采集正常志愿者的血液(各50mL)，所有志愿者均已签订知情同意书。志愿者入选标准为：
年龄大于18周岁；
无HIV、HBV感染；
血常规检测正常；
非孕妇或哺乳期妇女；
利用Ficoll密度梯度离心法从志愿者全血中分离得到PBMC，并培养于RPMI1640培养基中。
5.5.2 TCRm×CD3双特异性抗体介导PBMC杀伤抗原肽脉冲的T2细胞
收集生长对数期的T2细胞，离心后用生长培养基重悬至1×106个/mL，每孔1mL铺板于24孔板。肽段HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)以50μg/mL的终浓度加入到24孔板中，过夜脉冲。16小时后离心，用RPMI1640培养基重悬至4×105个/mL，每孔50μL铺于96孔细胞板中。然后加入双特异性抗体2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR(起始浓度为2nM，4倍梯度稀释，11个浓度点的，每孔100μL)。阴性对照样品2DP47+IMCR，阳性对照样品IMC-I109V，使用浓度均同双特异性抗体2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR的浓度。PBMC(效应细胞)重悬至4×106个/mL，加入以上细胞版，每孔50μL，最终效靶比为10:1。同时设置单独靶细胞对照(抗原肽脉冲T2细胞)、单独效应细胞对照(PBMC)、单独培养基空白对照，并用培养基将每孔体积补齐至200μL。孵育24小时后，取上清，参照非放射性细胞毒性检测试剂(Non-Radioactive Cytotoxicity Assay，Promega，G1780)说明书检测和分析TCRm×CD3双特异性抗体介导的PBMC细胞对抗原肽脉冲的T2细胞的杀伤率。结果显示：TCRm×CD3双特异性抗体2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR可以特异性介导PBMC细胞对抗原肽脉冲的T2细胞的杀伤；与IMC-I109V相比，双特异性抗体2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR介导PBMC细胞杀伤抗原肽脉冲的T2细胞的活性更高(表7和图7)。
表7.TCRm×CD3双特异性抗体介导PBMC细胞杀伤抗原肽脉冲的T2细胞
2N1B5+IMCR 2N1B5-h4+IMCR IMC-I109V
EC50(nM) 0.000278 0.0002095 0.001455
5.5.3 TCRm×CD3双特异性抗体介导PBMC杀伤HLA-A02+/HBsAg+细胞
收集对数生长期的HepG2-HBsAg，消化离心后用RPMI1640培养基重悬至4×105个/mL，每孔50μL铺于细胞板中。然后加入双特异性抗体2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR(起始浓度为12.5nM，4倍梯度稀释，9个浓度点，每孔100μL)。阴性对照样品2DP47+IMCR，阳性对照样品IMC-I109V，使用浓度均同双特异性抗体2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR的浓度。PBMC(效应细胞)重悬至4×106个/mL，加入以上细胞版，每孔50μL，最终效靶比为10:1。同时设置单独靶细胞对照、单独效应细胞对照(PBMC)、单独培养基空白对照，并用培养基将每孔体积补齐至200μL。孵育48小时后，取上清，参照非放射性细胞毒性检测试剂(Non-Radioactive Cytotoxicity Assay，Promega，G1780)说明书检测和分析TCRm×CD3双特异性抗体介导的PBMC细胞对HLA-A02+/HBsAg+细胞的杀伤率。结果显示：2N1B5+IMCR和2N1B5-h4+IMCR特异性介导PBMC细胞对HLA-A02+/HBsAg+细胞的杀伤，杀伤活性强于IMC-I109V(图8，EC50值见表8)
表8.TCRm×CD3双特异性抗体介导PBMC细胞对HepG2-HBsAg细胞杀伤的EC50值
2N1B5+IMCR 2N1B5-h4+IMCR IMC-I109V
EC50(nM) 0.008834 0.00952 0.1273
实施例6：TCRm×CD3双特异性抗体识别HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)的关键氨基酸分析
化学合成HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)的丙氨酸扫描肽段。参考实施例5.4.1检测和分析丙氨酸扫描肽段脉冲的T2细胞对Jurkat-Dual细胞的特异性激活。结果显示，2N1B5-h4+IMCR不能有效介导第2、5、6、7、8、9和10位的丙氨酸扫描突变肽脉冲的T2细胞激活Jurkat-Dual细胞(图9)，即HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)的第2、5、6、7、8、9和10位的氨基酸是2N1B5-h4+IMCR结合的关键氨基酸。
实施例7：TCRm×CD3双特异性抗体与相似肽的相互作用分析
化学合成表9中的HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)的相似肽段。
表9.HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)相似肽段信息
参考实施例5.4.1检测和分析不同相似肽脉冲的T2细胞对Jurkat-Dual细胞的激活。图10结果显示2N1B5-h4+IMCR只特异性地介导抗原肽HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)脉冲的T2细胞激活Jurkat-Dual细胞，不介导其他加载了相似肽的T2细胞对Jurkat-Dual激活。
实施例8：TCRm×CD3双特异性抗体与不同的抗原阴性肿瘤细胞的相互作用分析
收集不同的肿瘤细胞，细胞的抗原信息如表10。参照5.4.1和5.4.2，进行双特异性抗体2N1B5-h4+IMCR介导肿瘤细胞激活Jurkat-Dual细胞的特异性评价。结果显示，2N1B5-h4+IMCR只特异性介导HLA-A02+/HBsAg+的靶细胞激活Jurkat-Dual，不介导抗原阴性细胞对Jurkat-Dual的激活(图11)。
表10.不同细胞抗原表达信息
注：“+”代表阳性，“-”代表阴性。
实施例9：TCRm×CD3双特异性抗体在hPBMC免疫重建小鼠中的抑瘤作用
参照实施例5.5.1进行分选获得PBMC。
选取30只5-6周龄雌性B-NDG小鼠(购自百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司)，在B-NDG小鼠右侧背部皮下接种1×107个HepG2-HBsAg细胞，隔天每只小鼠腹腔接种8×106个人PBMC。待肿瘤平均体积达到90mm3时，根据肿瘤大小随机分组，分组当天定义为第0天，并进行给药。试验分为2N1B5-h4+IMCR双特异抗体组、2DP47+IMCR阴性对照组和IMC-I109V阳性对照组3组，每组7只小鼠；尾静脉注射给药，剂量为1mg/kg，一周两次，共给药六次，持续观察。根据肿瘤抑制率TGI进行疗效评价。
实验过程中动物精神状态普遍良好。双特异性抗体2N1B5-h4+IMCR在1mg/kg剂量下(第3组)，具有显著抑制肿瘤生长的作用。第11天的相对肿瘤抑制率TGI(％)为76.01％，与阴性对照组(第1组)相比具有极显著差异(p<0.0001)。双特异性抗体2N1B5-h4+IMCR有效抑制HLA-A02+/HBsAg+阳性肿瘤的生长，并且效果好于IMC-I109V(第2组)(图12)。治疗组均无动物死亡，没有表现明显的药物毒性。
实施例10：TCRm抗体N1B5-h4与HLA-A02/HBsAg复合体中HBsAg第348-357位肽的结合位点分析
为了研究TCRm抗体N1B5-h4与HLA-A02/HBsAg复合体中HBsAg第348-357位肽的结合位点，利用HEK293细胞制备重组蛋白N1B5-h4-Twin-Strep-tag(SEQ ID NO:88)以及重组蛋白MIP-H1-01，二者以1:1分子比共孵育，形成N1B5-h4/MIP-H1-01抗原抗体复合物，在0.2M氯化钙+0.1M HEPES+28％PEG400条件下形成复合物晶体，对复合物晶体进行X射线衍射实验，收集到分辨率的数据，并通过分子置换法解析N1B5-h4/MIP-H1-01抗原抗体复合物的晶体结构。
N1B5-h4与MIP-H1-01的相互作用面积约为相互作用方式包括氢键、盐键、范德华力以及疏水相互作用。抗体N1B5-h4重链可变区的CDR3参与了对MIP-H1-01中HBsAg第348-357位肽(MIP-H1-01的第1-10位氨基酸残基)的识别(图13)。其中，N1B5-h4识别HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)的P4、T5、V6、W7、L8、S9和V10(表11)。
表11.参与N1B5-h4/HBsAg348-357肽相互作用的氨基酸以及作用方式
在实施例3.4中鉴定的关键氨基酸是HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)的第2、4、5、6、7、8、9和10位，在实施例6中鉴定的关键氨基酸是HBsAg348-357(GLSPTVWLSV)的第2、5、6、7、8、9和10位。实施例3.4和实施例6所采用的方法不能区分抗体与丙氨酸扫描突变肽的结合能力下降是由于氨基酸残基突变为丙氨酸后的肽不能正确加载到HLA上(即与HLA结合)，还是影响了突变后的肽与抗体的结合。HBsAg348-357第2位的氨基酸残基通常是抗原肽与HLA结合的位点(即加载位点)，HBsAg348-357的第2位亮氨酸(L)突变为丙氨酸(A)后，可能不再与HLA结合，因此虽然在实施例3.4和实施例6中检测该肽介导的活性显著下降，但第2位亮氨酸可能并未参与与抗体的结合。
实施例10中的晶体结构显示N1B5-h4结合HBsAg348-357的第4位脯氨酸残基(4P)，实施例6中4P突变为4A后所介导的活性并未显著降低，说明N1B5-h4与复合物中HBsAg348-357第4位的结合不严苛，性质相似的氨基酸取代对二者之间的作用影响较弱，尤其是对于双特异性抗体结构的分子。
在本申请中提及和/或列出的所有专利、专利申请公开和非专利文献均通过引用整体并入本文中。上文对本申请的各项发明的示例性实施方案进行了描述，但是，在不脱离本申请的实质和范围的情况下，本领域技术人员能够对本申请描述的示例性实施方案进行修改或改进，由此得到的变形方案或等同方案也属于本申请的范围。
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QQGNTLPWT
SEQ ID NO:43
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:44
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:45
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASDDTYMTNCMGWFRQAPGKEREGVAAIYTGGGRAVYA
DSVRGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADWLGPDMTDIQVLGALPWFNYWGQ
GTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASDDTYMTNCMGWFR
QAPGKEREGVAAIYTGGGRAVYADSVRGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADW
LGPDMTDIQVLGALPWFNYWGQGTLVTVSSASERKSSVECPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDT
LMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD
WLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSD
IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK
SEQ ID NO:46
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDDTYMTNCMGWFRQAPGKERVGVAAIYTGGGRAVYAD
SVRGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADWLGPDMTDIQVLGALPWFNYWGQG
TLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDDTYMTNCMGWFRQA
PGKERVGVAAIYTGGGRAVYADSVRGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADWLG
PDMTDIQVLGALPWFNYWGQGTLVTVSSASERKSSVECPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMI
SRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL
NGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAV
EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSPGK
SEQ ID NO:47
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGS
GSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
GGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVST
YNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVS
SASERKSSVECPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQP
REPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY
SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:48
QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKE
FSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMD
SEQ ID NO:49
FKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQ
VHYRMCQSCVELDPATVA
SEQ ID NO:50
GLSPTVWLSVGCGGSGGGGSGGGGSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDL
LKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGG
GSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRME
PRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGCYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDW
RFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWL
RRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELV
ETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWE
SEQ ID NO:51
MGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDQWPEANQVGAGAFGPGFTPPHGG
LLGWSPQAQGILTTVPAAPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTTFHQALLDPRVRG
LYFPAGGSSSGTVNPVPTIVSPISSIFSRTGDPAPNMESTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLD
SWWTSLNFLGEAPTCPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDY
QGMLPVCPLLPGTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWA
SVRFSWLSLLVPFVQWFAGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPIFFCLWVYI
SEQ ID NO:52
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:53
TCCTTCCCCGTCAGCCAGTCCT
SEQ ID NO:54
HHHHHH
SEQ ID NO:55
ASPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVN
NVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSV
RAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYF
MYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO:56
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP
KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL
HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF
YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH
YTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:57
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP
KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL
HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGF
YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH
YTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:58
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP
KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL
HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGF
YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH
YTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:59
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKP
KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL
HQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGF
YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH
YTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:60
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKP
KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL
HQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGF
YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH
YTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:61
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSEGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
SSVVTVPSSSLGTQTYICNVDHKPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDT
LMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD
WLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSD
IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK
SEQ ID NO:62
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVERKSCVECPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDT
LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD
WLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPS
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ
KSLSLSPGK
SEQ ID NO:63
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNN
KYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO:64
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS
TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:65
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADS
VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSGFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:66
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:67
AKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKGPELIMSIYSDGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAARNYKTDLLIFGTGTRLQVFP
SEQ ID NO:68
NAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMSHGYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYATGGTGDLFFGEGSRLTVL
SEQ ID NO:69
AKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKGPELIMSIYSDGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAARNYKTDLLIFGTGTRLQVFPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKFVCLFTDFDSQINVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFTCANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCGGGGSASERKSSVECPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:70
NAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMSHGYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYATGGTGDLFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSKAEISRTQKATLVCLATGFYPPHVELSWWVNGKEVHDGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQDPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGGGGSASERKSCVECPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:71
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASDDTYMTNCMGWFRQAPGKEREGVAAIYTGGGRAVYADSVRGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADWLGPDMTDIQVLGALPWFNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASDDTYMTNCMGWFRQAPGKEREGVAAIYTGGGRAVYADSVRGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADWLGPDMTDIQVLGALPWFNYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:72
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDDTYMTNCMGWFRQAPGKERVGVAAIYTGGGRAVYADSVRGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADWLGPDMTDIQVLGALPWFNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDDTYMTNCMGWFRQAPGKERVGVAAIYTGGGRAVYADSVRGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADWLGPDMTDIQVLGALPWFNYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:73
ASERKSSVECPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:74
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:75
ASERKSSVECPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:76
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVS
SGGGGSNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMSHGYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGIT
DQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYATGGTGDLFFGEGSRLTVLEDLKN
VFPPEVAVFEPSKAEISRTQKATLVCLATGFYPPHVELSWWVNGKEVHDGVCTDPQPLKEQPAL
NDSRYALSSRLRVSATFWQDPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADC
GGGGSASERKSCVECPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISK
AKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:77
ALSPTVWLSV
SEQ ID NO:78
GASPTVWLSV
SEQ ID NO:79
GLAPTVWLSV
SEQ ID NO:80
GLSATVWLSV
SEQ ID NO:81
GLSPAVWLSV
SEQ ID NO:82
GLSPVAWLSV
SEQ ID NO:83
GLSPTVALSV
SEQ ID NO:84
GLSPTVWASV
SEQ ID NO:85
GLSPTVWLAV
SEQ ID NO:86
GLSPTVWLSA
SEQ ID NO:87
FLLTRILTI
SEQ ID NO:88
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDDTYMTNCMGWFRQAPGKERVGVAAIYTGGGRAVYAD
SVRGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADWLGPDMTDIQVLGALPWFNYWGQG
TLVTVSSSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK
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27.US 5821337A。

Claims (10)

1.双特异性抗体，其包含结合HLA-A02/HBsAg复合体的第一抗原结合片段和结合活化性T细胞抗原的第二抗原结合片段；
优选地，所述第一抗原结合片段与HLA-A02/HBsAg复合体的结合表位包括参照SEQ IDNO:51所示的HBsAg的第348-357位中的一个或多个残基；更优选地，所述第一抗原结合片段与HLA-A02/HBsAg复合体的结合表位包括参照SEQ ID NO:51所示的HBsAg的第349、351、352、353、354、355、356和357位残基中的至少一个；和/或
优选地，所述活化性T细胞抗原为CD3分子。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中
所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:32所示的HCDR1、如SEQ ID NO:33所示的HCDR2和如SEQ ID NO:34所示的HCDR3；优选地，所述第一抗原结合片段为单域抗体的形式；更优选地，所述第一抗原结合片段包含单价或多价的结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体；和/或
所述第二抗原结合片段包含如SEQ ID NO:37所示的HCDR1，如SEQ ID NO:38所示的HCDR2，如SEQ ID NO:39所示的HCDR3，如SEQ ID NO:40所示的LCDR1，如SEQ ID NO:41所示的LCDR2和如SEQ ID NO:42所示的LCDR3；优选地，所述第二抗原结合片段为单链抗体(scFv)或者Fab片段的形式；更优选地，所述第二抗原结合片段为scFv的形式；
其中，HCDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
3.如权利要求1或2所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合片段包含双价的结合HLA-A02/HBsAg复合体的单域抗体；
任选地，所述第一抗原结合片段包含两个结合HLA-A02/HBsAg复合体的单价单域抗体的重链可变区；优选地，所述第一抗原结合片段包含直接融合的两个结合HLA-A02/HBsAg复合体的单价单域抗体的重链可变区或通过连接子连接的两个结合HLA-A02/HBsAg复合体的单价单域抗体的重链可变区；更优选地，所述连接子为包含GS型柔性肽的连接子，例如(GGGGS)n，其中n为≥1的整数。
4.如权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体，其中
所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:35、36、71或72所示的氨基酸序列；和/或
所述第二抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的轻链可变区。
5.如权利要求1-4中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；以及所述第二抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ IDNO:43所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的轻链可变区；
所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列；以及所述第二抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的轻链可变区；或者
所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列；以及所述第二抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的轻链可变区；或者
所述第一抗原结合片段包含如SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列；以及所述第二抗原结合片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示的轻链可变区。
6.如权利要求1-5中任一项所述的双特异性抗体，其中
所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段通过抗体重链恒定区Fc片段相连，所述抗体重链恒定区Fc片段包括第一Fc片段和第二Fc片段；优选地，所述抗体重链恒定区Fc片段为IgG1亚型的Fc片段；更优选地，所述抗体重链恒定区Fc片段为IgG1m3亚型的Fc片段；其中
所述第一Fc片段的第354和366位的氨基酸分别为C和W，或者所述第一Fc片段的第349、366、368和407位的氨基酸分别为C、S、A和V；以及所述第二Fc片段的第354和366位的氨基酸分别为C和W，或者所述第二Fc片段的第349、366、368和407位的氨基酸分别为C、S、A和V；优选地，所述第一Fc片段的第354和366位的氨基酸分别为C和W，所述第二Fc片段的第349、366、368和407位的氨基酸分别为C、S、A和V；和/或
所述第一Fc片段和所述第二Fc片段的第234、235和331位的氨基酸分别为F、E和S；和/或
所述第一Fc片段和所述第二Fc片段之一与所述第一抗原结合片段连接，并且所述第一Fc片段和所述第二Fc片段中的另一者与所述第二抗原结合片段连接；
其中，抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
7.如权利要求1-6中任一项所述的双特异性抗体，其包含结合HLA-A02/HBsAg复合体的第一臂以及结合活化性T细胞抗原的第二臂，其中
所述第一臂包含如SEQ ID NO:45或46所示的氨基酸序列；和
所述第二臂包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
8.核酸分子，其编码权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体。
9.药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
10.权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体或权利要求9所述的药物组合物在制备用于预防或治疗HLA-A02/HBsAg阳性的HBV感染引起的疾病的药物中的用途；优选地，HLA-A02/HBsAg阳性的HBV感染引起的疾病选自：乙型肝炎、肝硬化、肝纤维化和肝癌。
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