TWI881585B - 羊胎組織水解胜肽、其製法、包含其的組成物及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種羊胎組織水解胜肽的製法，包含：混合羊胎組織粉和溶劑，以得羊胎組織混合液；將該羊胎組織混合液離心、分離，分別得到第一上清液和第一沉澱物；將第一水解酶溶液加入該第一沉澱物混合，以得到第一水解液；將第二水解酶加入該第一水解液，以得到第二水解液；將該第二水解液離心、分離，以分別得到第二上清液和第二沉澱物，且該第二上清液包含該羊胎組織水解胜肽。前述羊胎組織水解胜肽具有抗氧化、肌膚美白、抗肌膚老化、抗發炎及抗過敏之功效。

Description

羊胎組織水解胜肽、其製法、包含其的組成物及其用途

本發明涉及一種製備方法，尤指一種羊胎組織中水解胜肽的製備方法。本發明另涉及一種以前述製法製成之羊胎組織水解胜肽、包含羊胎組織水解胜肽的醫藥組成物或化妝品組成物，以及該羊胎組織水解胜肽的用途。

胎盤是哺乳動物妊娠期間生成的過渡性器官，一部分自胚胎的胚模分化出來和胚胎相連，另一部分來自母體的子宮內膜。胎盤內層是羊膜囊，其包含羊水。胎盤附著於子宮壁，並且從母體的血液獲取營養與氧氣，排出廢物。胎兒出生後，子宮會收縮並排出胎盤。

胎盤入藥已有長遠歷史，胎盤於中藥上名為紫河車，藥典中記載其味甘、鹹，性溫，且被認為有益氣養血、補腎益精之功效。在台灣，人類產後的胎盤都當作醫療廢棄物處理，但仍可透過屠宰場取得豬的胎盤。目前市售含有胎盤成分(如胎盤素)的藥品、保健品，其成分主要來自豬胎盤。

瑞士 Paul Niehend診所以羊胚胎作為針劑及美容化妝品，在歐美上流社會及貴族圈享譽近百年，連羅馬教宗及英國女王都曾接受過羊胚胎針劑的回春療法，由於羊胚胎來源稀少，導致無法廣泛推廣至較大的市場，只是珍稀的奢侈產品，如果能夠有足夠產量的羊胚胎來源，一定可以造福更多的百姓跟消費者。

因此開發一個由胎盤及胚胎組織的有效成分組成的化妝品原料，肯定極具市場潛力。

有鑑於此，本發明提供一種製備方法，其可萃取並水解出羊胎組織(包括胎盤及胚胎)中具有多種功效之物質。

為達前述目的，本發明提供一種羊胎組織水解胜肽的製法，包含： 步驟(A)：混合一羊胎組織粉和一溶劑，並在大於0 ^○C至小於或等於10 ^○C的溫度下萃取，以得到一羊胎組織混合液，其中，該溶劑的重量為該羊胎組織粉的重量8倍以上，且該溶劑包含水； 步驟(B)：將該羊胎組織混合液離心、分離，以分別得到一第一上清液和一第一沉澱物； 步驟(C)：將一第一水解酶溶液加入該第一沉澱物混合，以得到一第一水解液，其中，該第一水解酶溶液包含一第一水解酶，且以該第一水解液的總重為基準，該第一水解酶的含量為0.4重量百分比至0.6重量百分比； 步驟(D)：將一第二水解酶加入該第一水解液，以得到一第二水解液，其中，以該第一水解液的總重為基準，該第二水解酶的含量為0.1重量百分比至10重量百分比；以及 步驟(E)：將該第二水解液離心、分離，以分別得到一第二上清液和一第二沉澱物，且該第二上清液包含該羊胎組織水解胜肽。

較佳的，前述步驟(A)中，該溶劑的重量為該羊胎組織粉的重量8至15倍。較佳的，該溶劑的重量為該羊胎組織粉的重量9至12倍。

較佳的，前述步驟(A)中，前述萃取，是萃取5小時至10小時。較佳的，前述萃取是萃取6小時至8小時。

較佳的，前述步驟(A)中，萃取溫度是在大於0 ^○C至小於或等於10 ^○C的溫度下進行。例如可為：2 ^○C、4 ^○C、6 ^○C、8 ^○C。

較佳的，該羊胎組織粉包含羊胚胎粉、羊胎盤粉或其組合。

較佳的，該羊胎組織粉包含60重量百分比至80重量百分比的羊胚胎粉及20重量百分比至40重量百分比的羊胎盤粉。在一實施態樣中，該羊胎組織粉包含65重量百分比至75重量百分比的羊胚胎粉及25重量百分比至35重量百分比的羊胎盤粉。

較佳的，前述步驟(B)中的離心是在大於0 ^○C至小於或等於10 ^○C的溫度下進行。例如可為：2 ^○C、4 ^○C、6 ^○C、8 ^○C。

依據本發明，前述第一上清液中含有白蛋白(albumin)。

較佳的，前述步驟(B)中的離心是以4000 重力加速度(g)至6000 g離心20分鐘至40分鐘。

較佳的，該第一水解酶溶液與該第一沉澱物的體積比為5：1至10：1。更佳的，該第一水解酶溶液與該第一沉澱物的體積比為8：1至10：1。

在一實施態樣中，該第一水解溶液是包含水及第一水解酶。

較佳的，該第一水解酶以及第二水解酶選自木瓜蛋白酶、鳳梨蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、鹼性蛋白酶之任一及其組合。第一水解酶可與第二水解酶相同或不同。

較佳的，該第一水解酶為木瓜蛋白酶，而能降低本發明之成本。

較佳的，該第一水解酶與該第一沉澱混合後進行一第一水解反應以得到一第一水解液，該第一水解反應的反應溫度為40 ^○C至70 ^○C。更佳的，該第一水解反應的反應溫度為55 ^○C至65 ^○C。

較佳的，該第一水解反應的反應時間為2至6天。例如可為2、3、4、5或6天。

較佳的，該第二水解酶為鳳梨蛋白酶，而能降低本發明之成本。

較佳的，以該第一水解液的總重為基準，該第二水解酶的量為之0.5重量百分比至5。較佳的，以該第一水解液的總重為基準，該第二水解酶的量為之0.8重量百分比至2。例如，以該第一水解液的總重為基準，該第二水解酶的量可為0.9重量百分比、1重量百分比、1.1重量百分比、1.3重量百分比、1.5重量百分比

較佳的，將一第二水解酶加入該第一水解液後進行一第二水解反應，以得到一第二水解液，其中，該第二水解反應的反應時間為2至6天。例如可為2、3、4、5或6天。

較佳的，該步驟(E)中的離心是在大於0 ^○C至小於或等於12 ^○C的溫度下進行。

較佳的，該步驟(E)中的離心是以4000 g至6000 g離心20分鐘至40分鐘。

為達前述目的，本發明另外提供一種羊胎組織水解胜肽，其係由前述製法製備而得。

為達前述目的，本發明另外提供一種化妝品組成物，其包含前述之羊胎組織水解胜肽。

較佳的，所述化妝品之劑型包含溶液、懸浮劑、噴霧、液體洗劑、慕絲(mousse)、精華液、凝膠、乳液、微乳液(microemulsion)、乳霜、軟膏、膏棒、粉劑或貼片。

為達前述目的，本發明另外提供一種醫藥組成物，其包含如前述之羊胎組織水解胜肽，其中所述醫藥組成物含有有效劑量之所述羊胎組織水解胜肽以及藥學上可接受的載劑。

本發明所述之「有效劑量」係指在劑量上及對於所需要之時間段而言能夠達成所要達成功效的有效之量；依據本發明，係指透過施予特定範圍量之羊胎組織水解胜肽，能夠能降低經脂多醣(Lipopolysaccharide，LPS)誘導產生的IL-6、能促進膠原蛋白I型-C肽增生而具有抗老化功效、能清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基、能降低β-氨基己糖苷酶的釋放、能降低黑色素腫瘤細胞的黑色素含量、或能抑制酪胺酸酶活性。

在一實施例中，所述羊胎組織水解胜肽之濃度為0.1 wt%至10 wt%。在另一實施例中，所述羊胎組織水解胜肽之濃度為3 wt%至10 wt%。在另一實施例中，所述羊胎組織水解胜肽之濃度為1.5 wt%至8 wt%。在另一實施例中，所述羊胎組織水解胜肽之濃度為1.5 wt%至7 wt%。在另一實施例中，所述羊胎組織水解胜肽之濃度為0.1 wt%至7 wt%。在另一實施例中，所述羊胎組織水解胜肽之濃度為7.5 wt%至15 wt%。在另一實施例中，所述羊胎組織水解胜肽之濃度為0.2 wt%至2.5 wt%。在另一實施例中，所述羊胎組織水解胜肽之濃度為0.2 wt%至1 wt%。在另一實施例中，所述羊胎組織水解胜肽之濃度為0.2 wt%至7.5 wt%。

所述載劑包含，但不限於溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、潤滑劑(lubricant)、表面活性劑(surfactant)，及其他類似或適用本發明之載劑。

為達前述目的，本發明另外提供一種前述羊胎組織水解胜肽之用途，其係用於抗氧化。

為達前述目的，本發明另外提供一種前述羊胎組織水解胜肽之用途，其係用於美白皮膚。

為達前述目的，本發明另外提供一種前述羊胎組織水解胜肽之用途，其係用於製備治療或抑制發炎疾病之藥物。

為達前述目的，本發明另外提供一種前述羊胎組織水解胜肽之用途，其係用於製備抗過敏或輔助調整過敏體質之藥物。

本發明製備方法所製得的羊胎組織水解胜肽因能降低經LPS誘導產生的IL-6，而具有抗發炎功效；因能促進膠原蛋白I型-C肽增生而具有抗老化功效；因能清除DPPH自由基而具有抗氧化功效；因能降低β-氨基己糖苷酶的釋放而具有抑制過敏的功效；以及因能降低黑色素腫瘤細胞的黑色素含量、抑制酪胺酸酶活性而具有肌膚美白的功效。

以下搭配圖式，以便說明本發明之實施方式；熟習此技藝者可經由本說明書之內容輕易地了解本創作所能達成之優點與功效，並且於不悖離本發明之精神下進行各種修飾與變更，以施行或應用本發明之內容。

製備例1 製備羊胎組織水解胜肽

本發明之羊胎組織水解胜肽的製備方法如圖1，首先進行如圖1所示的步驟S1：混合一羊胎組織粉和一溶劑，萃取，以得到一羊胎組織混合液。具體而言，於本實施例，100公克(g)的羊胎組織粉是由30 g羊胎盤粉(臻悅博國際有限公司)與70 g羊胚胎粉混合所組成，將該羊胎組織粉懸浮在1200 g的水中，並在4 ^○C下緩慢攪拌混合8小時進行萃取，以得到一羊胎組織混合液。

隨後，進行如圖1所示之步驟S2，將該羊胎組織混合液離心、分離，以分別得到一第一上清液和一第一沉澱物。具體而言，是將前述的羊胎組織混合液，在10 ^○C的溫度下以5500 g連續離心30分鐘後，分離得到第一上清液及剩餘的沉澱部分－－93.77 g第一沉澱物。其中，該第一上清液的體積約為890毫升(mL)，並根據Bradford蛋白質定量法及西方墨點法測得的蛋白量約為7.0毫克(mg)/mL，其中含有大量白蛋白。

接著，進行如圖1所示之步驟S3，將一第一水解酶溶液加入該第一沉澱物混合，以得到一第一水解液。具體而言，將步驟S2所得到的第一沉澱物體積之9倍體積的含木瓜蛋白酶(DSM，Collupulin 200MG)的第一水解酶溶液加入前述第一沉澱物中，在60 ^○C下進行第一水解反應3天，並得到一重量為844 g的第一水解液，且以該第一水解液的總重為基準，該第一水解酶的含量為0.5 wt%。

再來，進行如圖1所示之步驟S4，將一第二水解酶加入該第一水解液，以得到一第二水解液。具體而言，是將8.44 g第二水解酶－－鳳梨蛋白酶(和司特股份有限公司，Bromelain)加入前述第一水解液中，而以該第一水解液的總重為基準，該第二水解酶的含量為1 wt%，在60 ^○C下進行第二水解反應3天，並得到一第二水解液，其重量約為852 g。

最後，進行如圖1所示之步驟S5，將該第二水解液離心、分離，以分別得到一第二上清液和一第二沉澱物，且該第二上清液包含該羊胎組織水解胜肽。具體而言，是將該第二水解液於10 ^○C的溫度下以5500 g連續離心30分鐘後分離，分別得到約950 mL第二上清液及第二沉澱物。其中，該第二上清液即為本發明的羊胎組織水解胜肽，其根據Bradford蛋白質定量法測得的蛋白量約為6.9 mg/mL。而所述第二沉澱物經乾燥後約為23 g。而第二上清液為了後續測試，添加苯氧乙醇及戊二醇進行保存，以供後續試驗使用，其中，添加苯氧乙醇及戊二醇的羊胎組織水解胜肽樣品中苯氧乙醇的濃度為1 wt%、戊二醇的濃度為5 wt%。

試驗例 1 ：細胞毒性試驗

為了測試製備例1的羊胎組織水解胜肽是否會影響細胞之生長，取製備例1的羊胎組織水解胜肽樣品，以磷酸緩衝溶液序列稀釋後以不同稀釋組別：50重量百分比(wt%)、25 wt%、12.5 wt%、6.25 wt%、3.125 wt%、1.5625 wt%、0.78125 wt%、0.390625 wt%進行細胞毒性試驗。並以杜氏改良Eagle培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM, GIBCO)為空白對照組；以含有10%二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide，DMSO)的細胞培養液為陽性對照組。

依據ISO10993-5的方式進行試驗，於細胞培養盤中每孔種植小鼠纖維母細胞(NIH-3T3)6000顆後，其中每孔含有180微升(μL)的細胞培養液，對每組細胞處理20 μL的不同序列稀釋組別的羊胎組織水解胜肽、空白對照組或陽性對照組並在5%二氧化碳、37 ^○C環境下培養24小時後，置換為MTT溶液，再於5%二氧化碳、37 ^○C環境下培養2小時，以盤式酵素免疫分析儀偵測570 nm波長之吸收値，將每組的吸光值除以空白對照組的吸光值(即以空白對照組的吸光值為100%)，換算出細胞存活率。

此外，在小鼠纖維母細胞分別處理不同序列稀釋組別的羊胎組織水解胜肽、細胞培養液(空白對照組)以及含10% DMSO之細胞培養液(陽性對照組)，在5%二氧化碳、37 ^○C環境下培養24小時後，以顯微鏡下觀察、根據下表1的標準，並記錄細胞外觀並給予評分。

表1：細胞毒性試驗評分標準

等級	細胞反應性	外觀變化
0	無	與空白對照組相比無明顯外觀變化
1	細微	＜20%的細胞外觀發生改變或變圓
2	輕微	＜50%的細胞外觀發生改變或變圓
3	中度	＜70%的細胞外觀發生改變或變圓
4	嚴重	重度改變，幾乎所有細胞都有型態上的改變

試驗結果如下表2所示：

表2：羊胎組織水解胜肽細胞毒性試驗結果

組別	試驗濃度	24小時細胞存活率(%)	細胞外觀評分	細胞毒性評估
本發明羊胎組織水解胜肽	0.390625%	100.5 ±1.25	0	無細胞毒性
0.78125%	107.7 ±2.17	0	無細胞毒性
1.5625%	111.7 ±1.79 ＊	0	無細胞毒性
3.125%	114.8 ±1.84 ＊	0	無細胞毒性
6.25%	130.5 ±0.33 ＊	1	無細胞毒性
12.5%	100.3 ±2.12	3	有細胞毒性
25%	64.3 ±4.68 ＊	4	有細胞毒性
50%	34.1 ±5.67 ＊	4	有細胞毒性
陽性對照組 DMSO	10%	2.6 ±0.16 ＊	4	有細胞毒性
空白對照組	--	100 ±1.74	0	無細胞毒性

因此根據上表2可以得知，本發明羊胎組織水解胜肽於6.25%之濃度範圍以下不會降低細胞存活率、不會影響細胞形態，而對纖維母細胞無細胞毒性。其中，羊胎組織水解胜肽於6.25%濃度下僅使＜20%的細胞外觀發生改變或變圓，僅為細微的改變。

試驗例 2 ：眼部刺激性試驗

為了測試製備例1的羊胎組織水解胜肽是否會對眼部造成刺激性，取製備例1的羊胎組織水解胜肽樣品進行OECD TG 492重建人類角膜上皮細胞標準試驗。並以水為空白對照組；以乙酸甲酯(Methyl Acetate)為陽性對照組。

分別將前述羊胎組織水解胜肽、水(空白對照組)與乙酸甲酯(陽性對照組)加入已通過OECD TG 492 試驗標準的市售產品EpiOcular™ 重建人類角膜上皮組織模型，處理30分鐘後，用杜氏磷酸鹽緩衝液(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline，DPBS)清洗EpiOcular™ 並加入DMEM培養基(GIBCO)置於5%二氧化碳、37℃細胞培養箱培養2小時。再將細胞培養液置換成MTT溶液，置於5%二氧化碳、37℃ 細胞培養箱培養3小時，最後以盤式酵素免疫分析儀偵測 70 nm 波長之吸收値。將每組的吸光值除以空白對照組的吸光值，換算細胞存活率即以空白對照組的吸光值為100%。依據下表3之判定標準(即，OECD TG 492之判定標準)判斷該實驗物質是否具有眼部刺激性。

表3：OECD 492眼部刺激性試驗判定標準

體外試驗結果	刺激性評估
平均細胞存活率≤ 60%	刺激性
平均細胞存活率＞ 60%	非刺激性

試驗結果如圖2所示，根據圖2之結果可得知，經羊胎組織水解胜肽 (蛋白質含量6.9 mg/mL)處理之細胞存活率＞60%，而無眼部刺激性。

試驗例 3 ：皮膚刺激性試驗

為了測試製備例1的羊胎組織水解胜肽是否會對皮膚造成刺激性，取製備例1的羊胎組織水解胜肽樣品進行OECD TG 439標準試驗。並以DPBS為空白對照組；以5%十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)為陽性對照組。

將前述羊胎組織水解胜肽、DPBS(空白對照組)與5% SDS(陽性對照組)加入已通過OECD TG 439試驗標準驗證的市售產品EpiDerm™重建人類表皮組織模型處理1小時後，用杜氏磷酸緩衝液(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline，DPBS)清洗前述EpiDerm™並加入DMEM培養基(GIBCO)置於5%二氧化碳、37℃細胞培養箱培養42小時。再將細胞培養液置換成MTT溶液後，置於5%二氧化碳、37℃ 細胞培養箱培養3小時，最後以盤式酵素免疫分析儀偵測570 nm波長之吸收値。將每組的吸光值除以空白對照組的吸光值(即以空白對照組的吸光值為100%)，換算出細胞存活率。依據下表4之判定標準判斷該實驗物質是否具有皮膚刺激性。

表4：OECD 439皮膚刺激性試驗判定標準

體外試驗結果	刺激性評估
平均細胞存活率≤ 50%	刺激性
平均細胞存活率＞ 50%	非刺激性

試驗結果如圖3所示，根據圖3之結果可得知，處理羊胎組織水解胜肽之細胞存活率＞50%，為89.98%因此無皮膚刺激性，且與空白對照組相近。

試驗例 4 ：抗發炎試驗

為了測試製備例1的羊胎組織水解胜肽是否具有抗發炎、降低發炎因子之功效，取製備例1的羊胎組織水解胜肽為樣品，以磷酸緩衝溶液序列稀釋後以不同稀釋組別：5 wt%、2.5 wt%、1.25 wt%、0.625 wt%以及0.3125 wt%。並以DMEM培養基(GIBCO)為空白對照組；以含0.011%之p38 MAPK抑制劑：SB203580(Sigma)的細胞培養液為陽性對照組。

將小鼠巨噬細胞株(Raw264.7)種於細胞培養盤中，使每孔具有6000個細胞以及180 μL的細胞培養液。對每孔小鼠巨噬細胞分別處理20 μL不同序列稀釋組別的羊胎組織水解胜肽、細胞培養液(空白對照組)與陽性對照組(含0.011% SB203580細胞培養液)後，加入20 μL脂多醣誘導小鼠巨噬細胞株發生發炎反應，在5%二氧化碳、37°C環境下培養24小時，取上層細胞培養液並測定Alpha型腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)及介白質6(Interleukin 6，IL-6)含量。具體而言，是利用小鼠TNF-α套組(Mouse TNF-alpha ELISA kit, ab208348, abcam)及小鼠IL-6套組(Mouse IL-6 ELISA kit, ab222503, abcam)搭配盤式酵素免疫分析儀，測定每組於450 nm下的吸光值。將每組的吸光值除以空白對照組的吸光值，換算每組細胞激素含量，即以空白對照組的吸光值為100%。

並在前述上層細胞培養液進行TNF-α、IL-6測試後，對培養盤中剩餘的細胞進行細胞毒性試驗，以確認本試驗之羊胎組織水解胜肽濃度確實不會對小鼠巨噬細胞的存活率造成影響。具體而言，細胞毒性試驗方法類似於試驗例1所述：對前述經各組別處理過的小鼠巨噬細胞置換20 μL MTT溶液，在5%二氧化碳、37°C環境下進行培養2小時，最後以盤式酵素免疫分析儀偵測570 nm 波長之吸收値。將每組的吸光值除以空白對照組的吸光值(即以空白對照組的吸光值為100%)，換算出細胞存活率。

試驗結果如下表5，及圖4所示：

表5：羊胎組織水解胜肽抗發炎試驗結果

組別	試驗濃度	TNF-α含量 (%)	IL-6 含量 (%)	細胞存活率 (%)
本發明羊胎組織水解胜肽	0.3125 wt%	99.63 ±0.24	110.76 ±0.93	100.73 ±2.83
0.625 wt%	100.31 ±0.06	108.12 ±2.25	108.32 ±2.52
1.25 wt%	100.91 ±0.87	99.58 ±0.33	107.53 ±2.3
2.5 wt%	101.15 ±0.13	85.51 ±0.4	107.86 ±0.22
5 wt%	101.37 ±0.37	63.44 ±1.18 ＊	110.73 ±1.39
陽性對照組 SB203580	0.011 wt%	50.27 ±0.58 ＊	8.56 ±0.15 ＊	81.96 ±3.49
空白對照組	--	100 ±0.09	100 ±2.93	101.27 ±3.94

根據表5、圖4之結果可知，本發明的羊胎組織水解胜肽在濃度為5%時對LPS誘導小鼠巨噬細胞所產生的介白質6具有抑制效果。此結果意味著本發明的羊胎組織水解胜肽在濃度5%時可抑制LPS誘導小鼠巨噬細胞株造成的發炎反應，即本發明的羊胎組織水解胜肽具有抗發炎之效果。

試驗例 5 ：抗老化試驗

為了測試製備例1的羊胎組織水解胜肽是否具有抗老化的功效，取製備例1的羊胎組織水解胜肽為樣品，以磷酸緩衝溶液序列稀釋後以不同稀釋組別：4 wt%、2 wt%、1 wt%、0.5 wt%、0.25 wt%、0.125 wt%進行膠原蛋白增生試驗。並以細胞培養液為空白對照組；以含有0.000001 wt%的TGF-β之DMEM培養基(GIBCO)為陽性對照組。

將人類纖維母細胞(Hs68)以每孔10000顆的密度種於細胞培養盤後，分別處理不同序列稀釋組別的羊胎組織水解胜肽、DMEM培養基(GIBCO) (空白對照組)與含有0.000001 wt%的TGF-β之DMEM細胞基(GIBCO)(陽性對照組)後，在5%二氧化碳、37°C環境下培養72小時，取上層細胞培養液利用前膠原蛋白I型-C肽(Procollagen Type I C-Peptide)套組(Procollagen Type I C-Peptide(PIP) EIA kit，TAKARA)偵測每組於450 nm下的吸光值，以換算前膠原蛋白I型-C肽含量。將每組的吸光值除以空白對照組的吸光值(即以空白對照組的吸光值為100%)，換算前膠原蛋白增生量。

並在前述上層細胞培養液進行前膠原蛋白含量測試後，對培養盤中剩餘的細胞進行細胞毒性試驗，以確保本試驗之羊胎組織水解胜肽濃度確實不會對人類纖維母細胞存活率造成影響。細胞毒性試驗方法如試驗例1所述：對前述已經各組別處理過的人類纖維母細胞置換為MTT溶液在5%二氧化碳、37°C環境下進行培養2小時，最後以盤式酵素免疫分析儀偵測570 nm波長之吸收値，將每組的吸光值除以空白對照組的吸光值(即以空白對照組的吸光值為100%)，換算出細胞存活率。

試驗結果如下表6及圖5所示：

表6：羊胎組織水解胜肽前膠原蛋白含量試驗結果

組別	試驗濃度	前膠原蛋白含量(%)	細胞存活(增生)率(%)
本發明羊胎組織水解胜肽	0.125 wt%	98.5 ±9.1	118.4 ±6.8
0.25 wt%	99.7 ±3.1	111.6 ±20.4
0.5 wt%	112.9 ±6.1	138.5 ±9.1*
1 wt%	123.4 ±1.4	153 ±12.4*
2 wt%	139 ±9.9*	159.5 ±16.1*
4 wt%	156.8 ±12.7*	201.7 ±21.1*
陽性對照組	0.000001 wt%	132.9 ±16.8*	113.8 ±7.8*
空白對照組	--	100 ±9.3	100 ±6.2

根據表6及圖5之結果可知，本發明的羊胎組織水解胜肽在濃度高於2 wt%時可誘發人類纖維母細胞表現前膠原蛋白I型-C肽，因此具有抗肌膚老化效果。且在濃度高於2 wt%時不會降低細胞存活率。

試驗例 6 ：抗氧化活性試驗

為了測試製備例1的羊胎組織水解胜肽是否具有抗氧化之功效，取製備例1的羊胎組織水解胜肽為樣品，以磷酸緩衝溶液序列稀釋後以不同稀釋組別：5 wt%、2.5 wt%、1.25 wt%、0.625 wt%、0.3125 wt%、0.15625 wt%進行DPPH自由基清除能力試驗。並以水為空白對照組；以0.05 wt%的維生素C為陽性對照組。

將不同序列稀釋組別的羊胎組織水解胜肽、水(空白對照組)與0.05 wt%的維生素C(陽性對照組)利用DPPH抗氧化試驗套組(DPPH Antioxidant Assay kit, ab289847，abcam)進行DPPH自由基清除試驗，具體而言，取每一處理組各160 μL分別與40 μL的DPPH溶液反應30分鐘，以盤式酵素免疫分析儀偵測570 nm波長之吸收値並計算DPPH自由基清除能力。其中DPPH清除能力係以以下算式計算：[1-(樣品於517 nm之吸光值)/(空白對照組於517 nm之吸光值)] × 100 %。並將空白對照組DPPH自由基清除能力為0%。

試驗結果如圖6所示，羊胎組織水解胜肽在濃度高於0.15625%時即具有DPPH自由基清除能力，且隨著羊胎組織水解胜肽的濃度越高，DPPH自由基清除能力越強，呈現劑量依存之正比關係。

試驗例 7 ：抑制過敏試驗

為了測試製備例1的羊胎組織水解胜肽是否具有抑制過敏之功效，取製備例1的羊胎組織水解胜肽為樣品，以磷酸緩衝溶液序列稀釋後以不同稀釋組別：10 wt%、5 wt%、2.5 wt%、1.25 wt%以及0.625 wt%進行抑制過敏試驗。並以伊格爾最低限度必需培養基(Eagle's Minimum Essential Medium，EMEM，GIBCO)為空白對照組；以含有0.003 wt%槲皮素(Quercetin)的細胞培養液為陽性對照組。

將大鼠肥大細胞(RBL-2H3)種於細胞培養盤中，使每孔具有6000個細胞。每孔加入40 μL濃度為100 μM的鈣離子載體A23187作為免疫促進劑，誘導大鼠肥大細胞去顆粒化、釋放β-氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase)處理60分鐘後，分別處理20 μL不同序列稀釋組別的羊胎組織水解胜肽、細胞培養液(空白對照組)與含有0.003 wt%槲皮素的細胞培養液(陽性對照組)，在5%二氧化碳、37°C環境下進行培養2小時，取上層細胞培養液並測定β-氨基己糖苷酶含量。具體而言，是利用小鼠β-氨基己糖苷酶套組(Mouse beta-hexosaminidase A/ Beta Hex A ELISA kit，Assay Genie)搭配盤式酵素免疫分析儀，測定每組於450 nm下的吸光值。將每組的吸光值除以空白對照組的吸光值(即以空白對照組的吸光值為100%)，換算出每組β-氨基己糖苷酶含量。

並在前述上層細胞培養液進行β-氨基己糖苷酶含量測試後，對培養盤中剩餘的細胞進行細胞毒性試驗，以確保本試驗之羊胎組織水解胜肽濃度確實不會對大鼠肥大細胞的存活率造成影響，細胞毒性試驗方法如試驗例1所述：對前述經各組別處理過的大鼠肥大細胞置換為MTT溶液後，在5%二氧化碳、37°C環境下進行培養2小時，最後以盤式酵素免疫分析儀偵測570 nm波長之吸收値(即以空白對照組的吸光值為100%)，將每組的吸光值除以空白對照組的吸光值，換算出細胞存活率。

試驗結果如下表7及圖7所示：

表7：羊胎組織水解胜肽之抗過敏試驗結果

組別	試驗濃度	β-氨基己糖苷酶	細胞存活率(%)
本發明羊胎組織水解胜肽	0.625 wt%	102.1 ±2.14	97.21 ±3.34
1.25 wt%	105.3 ±0.83	94.58 ±1.77
2.5 wt%	99.3 ±6.3	94.46 ±2.77
5 wt%	95.9 ±4.33	97.06 ±2.1
10 wt%	48.2 ±1.75 ＊	97.37 ±2.4
陽性對照組 槲皮素	0.003 wt%	3.3 ±1.2 ＊	106.17 ±6.39
空白對照組	--	100 ±6.13	100 ±3.04

根據表7及圖7的結果可知，當本發明的羊胎組織水解胜肽在濃度達10 wt%時，經免疫促進劑A23187誘導老鼠肥大細胞株表現β-氨基己糖苷酶的量顯著下降至48.2±1.75%。因此，當本發明的羊胎組織水解胜肽在濃度達10%時有抑制過敏的功效。

試驗例 8 ：美白試驗 I

為了測試製備例1的羊胎組織水解胜肽是否具有美白的功效，取製備例的1的羊胎組織水解胜肽樣品，以磷酸緩衝溶液序列稀釋後以不同稀釋組別：1.25 wt%、0.625 wt%以及0.3125 wt%進行小鼠黑色素瘤細胞黑色素含量試驗。並以DMEM培養基為空白對照組；以含0.0125 wt%熊果素的細胞培養液為陽性對照組。

將小鼠黑色素瘤細胞(B16-F10)種於細胞培養盤中，每孔具有7000顆細胞。對每孔小鼠黑色素瘤細胞分別20 μL之不同序列稀釋組別的羊胎組織水解胜肽、細胞培養液(空白對照組)與含0.0125 wt%熊果素的細胞培養液(陽性對照組)，使用α-黑色素細胞刺激素 (α-Melanocyte- stimulating hormone，α-MSH)誘導 B16-F10後，在5%二氧化碳、37 °C 環境下進行培養48小時，使用胰蛋白酶/EDTA將小鼠黑色素瘤細胞取出並溶解於氫氧化鈉(NaOH)溶液，以盤式酵素免疫分析儀偵測405 nm波長之吸收値。將每組的吸光值除以空白對照組的吸光值，換算每組黑色素含量，即以空白對照組的吸光值為100%。

並進行細胞毒性試驗，具體而言，根據Sissolak, Bernhard, et al. (2019). Application of the bradford assay for cell lysis Quantification: Residual protein content in cell culture supernatants. Biotechnology Journal, 14(7), 1800714，將溶解於氫氧化鈉之細胞溶液加入布拉德福(Bradford)蛋白質定量檢測試劑置於室溫震盪反應5分鐘，以盤式酵素免疫分析儀偵測595 nm波長之吸收値。將每組的吸光值除以空白對照組的吸光值(即以空白對照組的吸光值為100%)，換算出每組細胞存活率。

試驗結果如下表8及圖8所示：

表8：羊胎組織水解胜肽之黑色素瘤細胞之黑色素含量試驗

組別	試驗濃度	黑色素含量(%)	細胞存活率
本發明羊胎組織水解胜肽	0.3125 wt%	72.8 ±1.8*	105.5 ±2.1
0.625 wt%	59.7 ±2.6*	98.4 ±2.4
1.25 wt%	46.7 ±2.6*	89.9 ±1.6
陽性對照組 熊果素	0.0125 wt%	41 ±4.3*	85.3 ±0.5
空白對照組	--	100 ±6.7	100 ±1

根據表8及圖8的結果可知，當本發明的羊胎組織水解胜肽在濃度0.3125%以上即有良好抑制黑色素產生之效果，即有皮膚美白效果，且抑制效果呈現劑量依存性。

試驗例 9 ：美白試驗 II

為了測試製備例1的羊胎組織水解胜肽是否具有美白的功效，取製備例的1的羊胎組織水解胜肽樣品，以磷酸緩衝溶液序列稀釋後以不同稀釋組別：1.25 wt%、0.625 wt%以及0.3125 wt%進行酪胺酸酶之抑制試驗。並以細胞培養液為空白對照組；以含0.136 wt%熊果素之細胞培養液為陽性對照組。

將不同序列稀釋組別的羊胎組織水解胜肽、細胞培養液(空白對照組)與含0.136 wt%熊果素之細胞培養液(陽性對照組)分別與調控黑色素生成酵素－－酪胺酸酶(Mushroom Tyrosinase，Sigma，10 Units)溶液反應20分鐘，再加入L-酪胺基酸溶液為基質反應20分鐘，最後以盤式酵素免疫分析儀偵測475 nm波長之吸收値並計算酪胺酸酶活性。將每組的吸光值除以空白對照組的吸光值(即以空白對照組的吸光值為100%)，換算出每組細胞存活率。

試驗結果如圖9所示，可看出每一組稀釋組處理後，酪胺酸酶的活性均較空白對照組低，因此本發明羊胎組織水解胜肽具有美白效果。且濃度在0.3125 wt%以上即與空白對照組具有顯著差異。而濃度在0.625 wt%可以達到與陽性對照組類似的效果，且1.25 wt%以上優於陽性對照組。

綜上，利用本發明製備方法所製得的羊胎組織水解胜肽因能降低經LPS誘導產生的IL-6，而具有抗發炎功效；因能促進原膠原蛋白I型-C肽增生而具有抗老化功效；因能清除DPPH自由基而具有抗氧化功效；因能降低β-氨基己糖苷酶的釋放而具有抑制過敏的功效；以及因能降低黑色素腫瘤細胞的黑色素含量、抑制酪胺酸酶而具有肌膚美白的功效。

因此以上所述僅是本發明的實施例而已，並非對本發明做任何形式上的限制，雖然本發明已以實施例揭露如上，然而並非用以限定本發明，任何熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案的範圍內，當可利用上述揭示的技術內容作出些許更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬於本發明技術方案的範圍內。

無

圖1為本發明羊胎組織水解胜肽製備方法之流程圖； 圖2為本發明羊胎組織水解胜肽之眼部刺激性試驗結果，* P＜0.05，表示與空白對照組有統計上的顯著差異； 圖3為本發明羊胎組織水解胜肽之皮膚刺激性試驗結果，* P＜0.05，表示與空白對照組有統計上的顯著差異； 圖4為本發明羊胎組織水解胜肽之抗發炎試驗結果，* P＜0.05，表示與空白對照組有統計上的顯著差異； 圖5為本發明羊胎組織水解胜肽之前膠原蛋白增生試驗結果，* P＜0.05，表示與空白對照組有統計上的顯著差異； 圖6為本發明羊胎組織水解胜肽之DPPH清除能力試驗結果，* P＜0.05，表示與空白對照組有統計上的顯著差異； 圖7為本發明羊胎組織水解胜肽之抑制β-氨基己糖苷酶含量試驗結果，* P＜0.05，表示與空白對照組有統計上的顯著差異； 圖8為本發明羊胎組織水解胜肽之抑制黑色素腫瘤黑色素生成試驗結果，* P＜0.05，表示與空白對照組有統計上的顯著差異； 圖9為本發明羊胎組織水解胜肽之酪胺酸酶抑制試驗結果，* P＜0.05，表示與空白對照組有統計上的顯著差異。

無

Claims (10)

1. 一種羊胎組織水解胜肽的製法，包含： 步驟(A)：混合一羊胎組織粉和一溶劑，並在大於0 ^○C至小於或等於10 ^○C的溫度下萃取，以得到一羊胎組織混合液，其中，該羊胎組織粉包含60重量百分比至80重量百分比的羊胚胎粉及20重量百分比至40重量百分比的羊胎盤粉，該溶劑的重量為該羊胎組織粉的重量8倍以上，且該溶劑包含水； 步驟(B)：將該羊胎組織混合液離心、分離，以分別得到一第一上清液和一第一沉澱物； 步驟(C)：將一第一水解酶溶液加入該第一沉澱物進行第一水解反應2天至6天，以得到一第一水解液，其中，該第一水解酶溶液包含一第一水解酶，以該第一水解液的總重為基準，該第一水解酶的含量為0.4重量百分比至0.6重量百分比，以及該第一水解酶為木瓜蛋白酶； 步驟(D)：將一第二水解酶加入該第一水解液進行第二水解反應2天至6天，以得到一第二水解液，其中，以該第一水解液的總重為基準，該第二水解酶的含量為0.1重量百分比至10重量百分比，以及該第二水解酶為鳳梨蛋白酶；以及 步驟(E)：將該第二水解液離心、分離，以分別得到一第二上清液和一第二沉澱物，且該第二上清液包含該羊胎組織水解胜肽。
2. 一種羊胎組織水解胜肽，其係由如請求項1所述之製法製備而得。
3. 一種化妝品組成物，其包含如請求項2所述之羊胎組織水解胜肽。
4. 如請求項3所述之化妝品組成物，其中該化妝品組成物之劑型包含溶液、懸浮劑、噴霧、液體洗劑、慕絲、精華液、凝膠、乳液、微乳液、乳霜、軟膏、膏棒、粉劑或貼片。
5. 一種醫藥組成物，其包含如請求項2所述之羊胎組織水解胜肽，其中所述醫藥組成物含有有效劑量之所述羊胎組織水解胜肽以及藥學上可接受的載劑。
6. 一種如請求項2所述之羊胎組織水解胜肽之用途，其係用於製備抗氧化藥物或化妝品。
7. 一種如請求項2所述之羊胎組織水解胜肽之用途，其係用於製備肌膚美白藥物或化妝品。
8. 一種如請求項2所述之羊胎組織水解胜肽之用途，其係用於製備抗肌膚老化藥物或化妝品。
9. 一種如請求項2所述之羊胎組織水解胜肽之用途，其係用於製備治療或抑制發炎疾病之藥物。
10. 一種如請求項2所述之羊胎組織水解胜肽之用途，其係用於製備抗過敏或輔助調整過敏體質之藥物。