CN106434803A

CN106434803A - 一种羊胎盘抗氧化多肽及其酶解制备方法与应用

Info

Publication number: CN106434803A
Application number: CN201610815036.4A
Authority: CN
Inventors: 李明; 曹光群; 杨成; 姜惠敏
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangsu Emmas Biotechnology Co ltd
Priority date: 2016-09-09
Filing date: 2016-09-09
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2036-09-09
Also published as: CN106434803B

Abstract

本发明提供了一种羊胎盘抗氧化多肽及其酶解制备方法与应用，以羊胎盘下脚料为原料，通过木瓜蛋白酶酶解，再经过大孔吸附树脂、超滤膜、葡聚糖凝胶色谱和半制备RP‑HPLC反相高效液相色谱进行分离纯化，收集后冷冻干燥，得到高抗氧化活性的羊胎盘多肽，其氨基酸序列为：Glu‑Pro‑Val‑Ser‑His‑Phe。采用本发明的方法能有效利用羊胎盘加工的废弃物，提高附加值，增加经济效益，且具有产品活性高、制备过程方便可行、环保等优点，通过本发明的方法能够获得具有高抗氧化活性的天然多肽，可替代人工合成的抗氧化剂使用，例如作为抗衰老化妆品中的功能原料，制成乳液、晚霜、眼霜、凝露、精华素、面膜等。

Description

一种羊胎盘抗氧化多肽及其酶解制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物肽及其制备方法与应用，具体涉及一种羊胎盘抗氧化多肽及其酶解制备方法与应用。

背景技术

自古以来，胎盘以其药用价值为历代名医重视，并被视为中药珍品。与其它动物胎盘相比，羊胎盘与人胎盘的结构和成分最为相似，具有良好的营养价值。现代医学研究发现，羊胎盘中含有大量的表皮细胞生长因子、透明质酸刺激因子等生物活性因子，多种促进、改善组织新陈代谢的酶，17种氨基酸和14种矿物元素。而利用科学方法从羊胎盘中提取、纯化的活性物质，其主要成分为小分子多肽，具有提高机体免疫力、抗衰老、抗癌等作用，广泛应用于医疗保健、食品、化妆品等领域(Kovo M,Schreiber L,Ben-Haroush A,etal.Placenta,2013,34:320-324)。

我国是养羊第一大国，羊资源丰富，目前羊存栏数达到4亿只，每年可被开发的羊胎盘潜藏量高达450万个。目前，羊胎盘抗氧化肽主要通过匀浆、低温离心、超滤的工艺从羊胎盘中提取得到，但产率极低且浸提液中的多肽及氨基酸含量甚微。绝大多数研究工作对提取过程中离心后的沉淀直接舍弃(刘隆兴,任兴宏,汤禾静,等.食品科学,2013,34:273-276；刘旺旺,侯银臣,程永霞.中国酿造,2014,33:89-93；吴开平,魏泓,刘宇.药物生物科技,2005,12:393-396)，而此物料富含蛋白质，若进一步水解成小分子活性肽，可使胎盘的应用价值得到充分的利用，具有广阔的市场经济效益。

蛋白质水解产生活性肽主要有酶法和化学法。化学法采用酸碱水解制备活性肽，对氨基酸会产生破坏作用，并且水解产物分子组成差异大、生产费用高。而酶法水解蛋白质的生产条件温和、安全性高、易于控制，因此已成为目前制备生物活性肽的主流方法(Nazeer R A,Srividhya T S.International Journal of Peptide Research andTherapeutics,2011,17:231-237；Tanzadehpanah H,Asoodeh A,Chamani J.FoodResearch International,2012,49:105-111；Naqash S Y,Nazeer R A.Peptides,2012,43:337-345)。

综上可知，目前尚未存在以羊胎盘下脚料作为原料，对其进一步利用，并通过优化工艺操作而获得具有功能活性特别是抗氧化活性的多肽产物；因此，如何实现资源的充分利用、提高产品附加值，并获得更加天然、高效的化妆品，成为本领域急需解决的一大技术难题。

发明内容

为了解决上述现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种羊胎盘抗氧化多肽及其酶解制备方法与应用。本发明能有效利用羊胎盘加工的废弃物，提高附加值，增加经济效益，且具有产品活性高、制备过程方便可行、环保等优点。通过本发明的方法能够获得高抗氧化活性的天然多肽，可替代人工合成的抗氧化剂使用，例如作为抗衰老化妆品中的功能原料，制成眼霜、乳液、晚霜、凝露、精华素、面膜等。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下所述：

本发明首先提供了一种羊胎盘抗氧化多肽的酶解制备方法，包括以下步骤：

(1)原料选择与酶解：选择羊胎盘下脚料为原料，采用木瓜蛋白酶对其进行酶解；

(2)除糖脱盐处理：将步骤(1)中获得的酶解产物通过大孔吸附树脂，先用去离子水洗脱层析柱，以除去其中的无机盐，接着用20～60％的乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱处理；

(3)超滤分离：将步骤(2)中的洗脱液富集，浓缩后采用截留分子量为1～100KDa的超滤膜进行分离；

(4)色谱分离：收集步骤(3)中的透过液，经过Sephadex G-10型葡聚糖凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，洗脱速度为0.4～0.6mL/min，洗脱峰在220nm下进行测量；

(5)再次分离：富集步骤(4)中的高活性洗脱液，利用半制备RP-HPLC反相高效液相色谱进一步分离，RP-HPLC的分离条件是用8～12％(v/v)的乙腈水溶液作为洗脱液，流速为1.5～2.5mL/min；

(6)收集步骤(5)中得到的高活性洗脱液，冷冻干燥，得到羊胎盘抗氧化多肽。

优选地，上述步骤(1)中的羊胎盘下脚料为提取天然羊胎盘肽过程中低温离心所得残渣，即为将羊胎盘匀浆、反复冻融、冷冻离心后所得沉淀残渣；酶解条件为：底物质量浓度为15～50mg/mL、pH为6.0～8.0、酶解温度为40～60℃、加酶量为2000～6000U/g、酶解时间为50～150min；更优选地，上述酶解条件为：底物质量浓度为33mg/mL、pH为6.5、酶解温度为55℃、加酶量为5000U/g、酶解时间为120min。

优选地，上述步骤(2)中大孔吸附树脂为DA201-B型、DA201-C型或者DA201-D型大孔吸附树脂，更优选地，为DA201-C型大孔吸附树脂，所述洗脱液为50％的乙醇水溶液，流速为3mL/min。

优选地，上述步骤(3)中超滤膜的截留分子量为1KDa，超滤条件：压力为0.3MPa、pH为7、温度为25℃。

优选地，上述步骤(5)中富集高活性洗脱液为富集Sephadex G-10型葡聚糖凝胶色谱柱中的第2个吸收峰的洗脱组分。

优选地，上述步骤(6)中收集高活性洗脱液为收集半制备RP-HPLC反相高效液相色谱柱中的第2个吸收峰的洗脱组分。

另一方面，本发明还提供了采用上述制备方法制备得到的羊胎盘抗氧化多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体为：谷氨酸-脯氨酸-缬氨酸-丝氨酸-组氨酸-苯丙氨酸(Glu-Pro-Val-Ser-His-Phe)。

此外，本发明还提供了上述羊胎盘抗氧化多肽在制备具有抗衰老功效的化妆品方面的应用，所述化妆品为乳液、晚霜、眼霜、凝露、精华素、面膜等。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1.目前绝大多数对羊胎盘的利用仅限于羊胎盘本身，剩余的残渣直接被丢弃，没有得到充分的利用；而本发明选择羊胎盘加工之后的下脚料作为原料，对常规的废弃资源进行了二次回收利用，大大提高了产品的附加值，具有极大的环保意义。

2.本发明在酶解制备抗氧化多肽的工艺过程中，从原料的选择与处理、酶解条件的优化调整、分离纯化条件的联合使用等多个方面进行了极为细致地研究，采用大孔吸附树脂、超滤膜、葡聚糖凝胶色谱分离以及RP-HPLC分离，将上述各技术手段耦合使用，步步密切相关，共同作为一个有机整体发挥高效地分离纯化的作用，从而获得纯度高、活性好的优质产物。

3.通过活性肽数据库BIOPEP检索发现，采用本发明的制备方法获得的羊胎盘多肽(氨基酸序列为：Glu-Pro-Val-Ser-His-Phe)，是一种新发现的肽。其中的谷氨酸Glu是酸性氨基酸，其羧基可供电子，有清除自由基及铁离子还原能力；组氨酸His含有咪唑基团可以参与氢原子和单电子转移反应，从而可中和或清除自由基、抑制活性氧、清除羟基自由基并螯合金属离子；苯丙氨酸Phe为芳香族氨基酸，通过共轭作用维持自由基的稳定；脯氨酸Pro和缬氨酸Val都有一定的抗氧化性能。多种抗氧化性氨基酸存在于一个多肽中有协同作用发挥更高的抗氧化性能。抗氧化肽的抗氧化活性与分子量大小、氨基酸组成及疏水性有密切的关系，小分子多肽(分子量集中在500-5000)较易透过各种细胞和组织，充分与自由基或基质金属酶等接触，从而有较高的抗氧化性。

高抗氧化活性的多肽有两个基本结构特征：第一，有多余的电子或者芳香环。多余的电子可以中和自由基，而芳香环保证丢失的电子不会使多肽变为自由基。第二，有疏水性。疏水氨基酸能从细胞膜转移到细胞质和线粒体中(生成自由基的重要场所)，并作用在多元不饱和的脂肪酸上，抑制脂质过氧化。采用本发明的制备方法获得的羊胎盘多肽中含有芳香环，并有苯丙氨酸、缬氨酸、组氨酸和脯氨酸等多个疏水氨基酸，符合高抗氧化活性多肽的两个基本结构特征，因此具有高抗氧化活性。

4.采用本发明的制备方法获得一种新型的羊胎盘多肽，其作为一种天然抗氧化多肽活性极高，应用于抗氧化抗衰老的化妆品制备中，可替代人工合成的抗氧化剂使用，所制备获得的各种化妆品经评价测定具有极好的润肤保湿、抗氧化、抗衰老的功效。

附图说明

图1为采用不同蛋白酶对羊胎盘下脚料的酶解进程曲线图；

图2为不同pH值对羊胎盘下脚料的酶解情况图；

图3为不同温度对羊胎盘下脚料的酶解情况图；

图4为不同加酶量对羊胎盘下脚料的酶解情况图；

图5为不同底物浓度对羊胎盘下脚料的酶解情况图；

图6为不同乙醇浓度对DPPH·清除能力和多糖去除的影响图；

图7为酶解产物过Sephadex G-10凝胶色谱柱的分离峰情况图；

图8为酶解产物过半制备RP-HPLC反相高效液相色谱的分离峰情况图；

图9为纯化羊胎盘抗氧化多肽的MALDI-TOF MS质谱图；

图10为纯化羊胎盘抗氧化多肽的结构鉴定图；

图11为使用添加羊胎盘抗氧化多肽的润肤乳液60天后角质层含水量的变化；

图12为使用添加羊胎盘抗氧化多肽的润肤乳液60天后皮肤TEWL的变化；

图13为使用添加羊胎盘抗氧化多肽的润肤乳液60天后皮肤弹性的变化；

图14为使用添加羊胎盘抗氧化多肽的护肤晚霜60天后角质层含水量的变化；

图15为使用添加羊胎盘抗氧化多肽的护肤晚霜60天后皮肤TEWL的变化；

图16为使用添加羊胎盘抗氧化多肽的护肤晚霜60天后皮肤弹性的变化。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明所用羊胎盘由江苏小尾羊牧业科技有限公司提供；木瓜蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司；碱性蛋白酶购自广西南宁庞博生物工程有限公司；胰蛋白酶购自国药集团化学试剂有限公司；中性蛋白酶购自苏柯汉生物工程科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼购自阿法埃莎(天津)化学有限公司；其余试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

(1)将羊胎盘用组织匀浆机制成10％匀浆液，反复冻融3次后低温离心，收集残渣，冷冻干燥后用粉碎机绞碎，过60目筛，得到羊胎盘下脚料干粉；

(2)蛋白酶的筛选

准确称取一定质量的羊胎盘下脚料粉末，加入去离子水配成一定质量浓度的底物溶液，迅速升温至90℃，恒温15min后，调节温度和pH值，加入蛋白酶酶解一定时间。由于各种蛋白酶的作用位点不同以及底物特异性的差异，根据羊胎盘蛋白的氨基酸组成，选择木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶4种常见的蛋白酶，并在其最适条件下对羊胎盘下脚料进行水解，所得酶解进程曲线如图1所示。其中，水解度(DH)是指蛋白质水解过程中裂解肽键的百分比，可以量化地反映酶解反应的进程。采用pH-Stat法测定DH，公式如下：

式中：N_b——标准NaOH的浓度，mol/L；

B——滴定时消耗标准NaOH的量，mL；

1/α——NH₂的平均解离度，按7.0计；

H_tot——蛋白质的肽键克当量，动物蛋白的值为8.0；

M_p——蛋白质质量，g。

由图1可知，四种酶在开始的30min内酶解反应快速，而在120min之后，DH趋于平缓，综合考虑反应效率和成本，选择酶解的时间为120min。水解结束后升温至90℃，保持20min进行灭酶处理，冷却至室温，调节pH至中性，6500r/min下离心20min，取上清液，冷冻干燥后进行抗氧化活性的测定。

上述抗氧化活性的测定采用清除二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)法对羊胎盘多肽的抗氧化活性进行评价，DPPH·清除率的测定采用分光光度法，具体如下所述：

DPPH·是带有单电子的一种高化学活性的自由基，特征吸收峰为517nm，其醇溶液非常稳定呈深紫色。抗氧化剂能与DPPH·的单电子发生配对反应，使其在517nm处的吸收降低，颜色变浅。吸取2.0mL不同浓度的待测样品，加入2.0mL DPPH·溶液(溶剂为无水乙醇)，混合后在25℃避光反应1h，在517nm处测其吸光度A_i；对照组为2.0mL乙醇溶液和2.0mL样品，测其吸光度为A_j；空白组为2.0mL乙醇溶液和2.0mL DPPH·溶液，测其吸光度为A₀。

各酶解产物的DPPH·清除率和DH见表1。

表1羊胎盘下脚料不同酶解产物的水解度和DPPH·清除率

由图1和表1可知，4种蛋白酶对羊胎盘下脚料蛋白的酶解效果存在较大的差异。其中，碱性蛋白酶的酶解能力最高，但其酶解产物没有抗氧化活性；而木瓜蛋白酶酶解产物的抗氧化活性最高，且水解度适中。这是因为在不同的条件下，蛋白酶对肽键的切割程度不同，会使相应的小分子多肽在质量浓度及性质上有所区别。本实验中，酶解羊胎盘下脚料的最终目的是获取具有抗氧化活性的小分子多肽，因此，确定以抗氧化活性作为第一指标，DH为第二指标进行研究。此外，木瓜蛋白酶的最适pH值为中性，不需要在反应前后加入过多的碱来调节pH值，工艺简单、成本小，所以选用木瓜蛋白酶作为水解用酶。

(3)羊胎盘下脚料酶解条件的优化

称取3.3g羊胎盘下脚料干粉，加入1000mL去离子水，迅速升温至90℃，恒温15min后，降温至需要温度，用0.2mol/L HCl(或NaOH)调节pH，加入木瓜蛋白酶酶解，水解结束后升温至90℃，保持20min进行灭酶处理，冷却至室温，用0.2mol/L NaOH(或HCl)调pH至中性，在4℃、8000r/min条件下低温离心20min，收集上清液，冷冻干燥后，分别用DPPH法对其抗氧化活性进行测定，以确定最佳酶解条件。

根据上述步骤(2)中的实验结果，固定酶解时间为120min，然后对木瓜蛋白酶的酶解工艺参数进行单因素优化试验，包括pH值、酶解温度、加酶量和底物质量浓度。

具体操作如下：

固定底物浓度20mg/mL，加酶量5000U/g，在55℃下，改变酶解pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，考察pH对羊胎盘下脚料酶解的影响。

固定酶解pH 6.5，底物浓度20mg/mL，温度55℃，改变加酶量为2000U/g、3000U/g、4000U/g、5000U/g、6000U/g，考察加酶量对羊胎盘下脚料酶解的影响。

固定酶解pH 6.5，加酶量5000U/g，底物浓度20mg/mL，改变温度为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，考察温度对羊胎盘下脚料酶解的影响。

固定酶解pH 6.5，加酶量5000U/g，温度为50℃，酶解120min，改变底物浓度分别为50g/mL、33g/mL、25g/mL、20g/mL、17g/mL，考察底物浓度对羊胎盘下脚料酶解的影响。

测定结果见说明书附图2～5所示，通过分析可知具有最大抗氧化活性的酶解液的酶解条件为：底物质量浓度33mg/mL、pH 6.5、酶解温度55℃、加酶量为5000U/g、酶解时间为120min。

(4)酶解产物的分离、纯化

在最佳酶解条件下进行酶解，得到的酶解产物首先经过DA201-C型大孔吸附树脂进行除糖脱盐处理，先用去离子水洗脱层析柱，以除去其中的无机盐，接着分别用浓度为20％、30％、40％、50％和60％的乙醇水溶液进行洗脱，流速为3mL/min；反复进样，收集洗脱液，浓缩后再用截留分子量为1KDa的超滤膜进行分离，超滤条件为压力0.3MPa、pH 7、温度25℃；收集透过液，再经过Sephadex G-10型葡聚糖凝胶色谱(长50cm，直径2.6cm)进行分离，洗脱液为去离子水，洗脱速度为0.5mL/min，洗脱峰在220nm下进行测量；富集SephadexG-10型葡聚糖凝胶色谱柱中的第2个吸收峰的洗脱组分，从而得到高活性洗脱液；再利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱(长25cm，直径1.0cm)进行进一步的分离，RP-HPLC的分离条件是用10％(v/v)乙腈水溶液作为洗脱液，流速为2mL/min，收集具有最高抗氧化活性的吸收峰的洗脱组分即半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱柱中的第2个吸收峰的洗脱组分，冷冻干燥，得到所述抗氧化多肽。

分别测定用不同浓度的乙醇水溶液进行洗脱所得抗氧化多肽的DPPH清除率与多糖的含量，结果见说明书附图6，分析可知，当采用50％的乙醇水溶液进行洗脱时，所制得抗氧化多肽的DPPH清除率最高、多糖含量最低，也就是说，所得多肽的抗氧化活性最强并且分离纯化的效果最好。

为了进一步了解本发明内容、特点及功效，兹例举以下具体实施例：

实施例1

将羊胎盘用组织匀浆机制成10％的匀浆液，反复冻融3次后低温离心，收集残渣，冷冻干燥后用粉碎机绞碎，过60目筛，制得羊胎盘下脚料干粉。

称取3.3g羊胎盘下脚料干粉，加入1000mL去离子水，迅速升温至90℃，恒温15min后，降温至55℃，用0.2mol/L HCl调节pH为6.5，加入1.27g木瓜蛋白酶酶解120min，水解结束后升温至90℃，保持20min进行灭酶处理，冷却至室温，用0.2mol/L NaOH调pH至中性，在4℃、8000r/min条件下低温离心20min，收集上清液，冷冻干燥，备用。

配制10mg/mL的多肽溶液，用DA201-C型大孔吸附树脂进行除糖脱盐处理，先用去离子水洗脱层析柱，以除去其中的无机盐，接着用50％乙醇水溶液进行洗脱，流速为3mL/min；反复进样，收集洗脱液，浓缩后再用截留分子量为1KDa的超滤膜进行分离，超滤条件为压力0.3MPa、pH 7、温度25℃；收集透过液，再经过Sephadex G-10型葡聚糖凝胶色谱(长50cm，直径2.6cm)进行分离，洗脱液为去离子水，洗脱速度为0.5mL/min，洗脱峰在220nm下进行测量；收集Sephadex G-10型葡聚糖凝胶色谱柱中的第2个吸收峰的洗脱组分(如说明书附图7所示的S12峰)，反复进样，富集后再利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱(长25cm，直径1.0cm)进行进一步的分离，RP-HPLC的分离条件是用10％(v/v)乙腈水溶液作为洗脱液，流速为2mL/min，收集RP-HPLC色谱柱中的第2个吸收峰的洗脱组分(如说明书附图8所示的S12-2峰)，冷冻干燥，得到所述抗氧化多肽，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行结构鉴定，其一级质谱如说明书附图9所示，其母离子质荷比(m/z)为679.6，采用Waters Masslynx软件中Peptide Sequence模块进行数据处理，结果见说明书附图 10所示，得到其氨基酸序列为：Glu-Pro-Val-Ser-His-Phe。

实施例2

采用实施例1中制备得到的抗氧化多肽配制添加羊胎盘抗氧化多肽的抗衰老润肤乳液，配方如表2所示。护肤乳液的制备工艺如下：

(1)记录空杯重量，按照配方表依次称取A相成分，在沸水中杀菌15min，后补齐蒸发掉的水分；

(2)按照配方表依次称量B相成分，在沸水中充分溶解15min；

(3)两相溶解充分后，降温至80℃，将B相缓慢倒入A相中，4000r/min均质5min，冷却至45℃，加入香精、防腐剂和羊胎盘抗氧化多肽；

(4)抽真空脱气泡，搅拌冷却，即可出料灌装。

用德国CK公司的MC 750皮肤测试仪对添加羊胎盘抗氧化多肽的润肤乳液进行人体功效评价，在60天内连续监测受试者角质层含水量、皮肤水分流失量(TEWL)和弹性的变化，从而评价其抗衰老功效。

德国CK公司的MC 750皮肤测试仪是一个多性能的皮肤测试平台，可连接水分测试探头(Corneometer CM 825)、水分流失测试探头(Tewameter TM 300)和弹性纤维组织测试探头(MPA 580)等，将皮肤的角质层含水量、皮肤水分流失量及弹性组织量化，赋予权值得到皮肤性能的数据。

选择女性志愿者15人，年龄段23-28岁。受试者在近2个月内未在测试部位涂抹任何护肤品。测试温度为25℃，湿度40％～50％。测试前，受试者统一用清水清洗前手臂内侧，并做好测量标记。试验区域间隔1cm，每处试验区域为3cm×3cm，按2mg/cm²的用量称取护肤品，使用乳胶指套将护肤品均匀涂抹于试验区内，等待15min进行测量。

(1)角质层含水量的测定

水分测试采用电容法。测试探头中的电容器与皮肤接触后，电容值的变化可以反映角质层含水量的大小。

(2)皮肤水分流失量的测定

皮肤水分流失量(Transepidermal Water Loss,TEWL)是评估皮肤水分保护层功能的重要参数，在国际上认可度高。TEWL即为一定时间内在单位区域皮肤水分蒸发的量，TEWL数值越低，表示皮肤水分保护层完好，角质层含水量就越高。TEWL测试仪的测试原理是基于菲克扩散定律，如下式：

式中：m——水分的扩散量，g；

T——时间，h；

D——扩散常数，0.0877g/m·h·mmHg；

A——面积，m²；

P——蒸汽压力，mmHg；

X——皮肤表面测量点的距离，m。

测试探头为两端开放的圆柱形腔体，可在测试皮肤形成稳定的小环境，通过温度和湿度传感器测试由角质层水分散失形成的不同蒸气压梯度，得到经表皮蒸发的水分量。

(3)皮肤弹性测试

皮肤弹性测试仪采用吸力法测试弹性。在测试的皮肤施加负压(2000～5000Pa)将皮肤吸入探头(MPA580，探头测试孔直径4mm)内，非接触式光学测试仪可测得吸入探头的皮肤深度，探头内有光的发射器和接收器，通过计算发射光和接受光的比例与被吸入的皮肤深度的关系，得到反映皮肤弹性的参数。恒定负压作用时，皮肤最大拉升量用U_f表示，取消测试负压到下次施加负压时的皮肤恢复值用U_a表示，R₂＝U_a/U_f，R₂即皮肤弹性参数，其数值越大，皮肤弹性越好。

结果表明，使用添加羊胎盘抗氧化多肽的润肤乳液60天后，角质层含水量增长了27，皮肤TEWL降低了12g/m²h，弹性系数R升高了38％，如说明书附图11～13所示。因此，添加羊胎盘抗氧化多肽的润肤乳液具有明显的保湿、减少皮肤水分流失、提高皮肤弹性的功效，从而延缓衰老。

表2添加羊胎盘抗氧化多肽的抗衰老润肤乳液配方

实施例3

采用实施例1中制备得到的抗氧化多肽配制添加羊胎盘抗氧化多肽的抗衰老护肤晚霜，配方如表3所示。

护肤晚霜的制备工艺如下：

(2)按照配方表依次称量B相成分，在沸水中充分溶解15min；

(4)加入0.1mol/mL NaOH将膏霜的pH调至6.5左右；

(5)静置24h，抽真空脱气泡，即可出料灌装。

用德国CK公司的MC 750皮肤测试仪对添加羊胎盘抗氧化多肽的护肤晚霜进行人体功效评价，在60天内连续监测受试者角质层含水量、皮肤水分流失量(TEWL)和弹性的变化，具体方法同实施例2。

结果表明(如说明书附图14～16所示)，使用添加羊胎盘抗氧化多肽的护肤晚霜60天后，角质层含水量增长了31，皮肤TEWL降低了14g/m²h，弹性系数R升高了45％。添加羊胎盘抗氧化多肽的护肤晚霜具有明显的保湿、减少皮肤水分流失、提高皮肤弹性的功效，从而延缓衰老。

表3添加羊胎盘抗氧化多肽的抗衰老护肤晚霜配方

综上可知，本发明所提供的羊胎盘多肽抗氧化活性高、性能良好，可以替代人工合成的抗氧化剂使用，并能作为抗衰老化妆品中的功能原料。添加所述抗氧化多肽制备而得的化妆品，能够明显的提高皮肤角质层的含水量、减少皮肤水分的流失、提高皮肤的弹性，从而有效地发挥抗氧化、延缓衰老的功能。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种羊胎盘抗氧化多肽的酶解制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(2)除糖脱盐处理：将步骤(1)中获得的酶解产物通过大孔吸附树脂，选择20～60％的乙醇水溶液作为洗脱液；

(5)再次分离：富集步骤(4)中的高活性洗脱液，利用半制备RP-HPLC反相高效液相色谱进一步分离，选择8～12％的乙腈水溶液作为洗脱液，流速为1.5～2.5mL/min；

2.根据权利要求1所述的酶解制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的羊胎盘下脚料为提取天然羊胎盘肽过程中低温离心所得残渣，即为将羊胎盘匀浆、反复冻融、冷冻离心后所得沉淀残渣。

3.根据权利要求1所述的酶解制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的酶解条件为：底物质量浓度为15～50mg/mL、pH为6.0～8.0、酶解温度为40～60℃、加酶量为2000～6000U/g、酶解时间为50～150min。

4.根据权利要求3所述的酶解制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的酶解条件优选为：底物质量浓度为33mg/mL、pH为6.5、酶解温度为55℃、加酶量为5000U/g、酶解时间为120min。

5.根据权利要求1所述的酶解制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中大孔吸附树脂为DA201-B型、DA201-C型或者DA201-D型大孔吸附树脂，所述洗脱液为50％的乙醇水溶液，流速为3mL/min。

6.根据权利要求1所述的酶解制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中超滤膜的截留分子量为1KDa，超滤条件：压力为0.3MPa、pH为7、温度为25℃。

7.根据权利要求1所述的酶解制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中富集高活性洗脱液为富集Sephadex G-10型葡聚糖凝胶色谱柱中的第2个吸收峰的洗脱组分。

8.根据权利要求1所述的酶解制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中收集高活性洗脱液为收集半制备RP-HPLC反相高效液相色谱柱中的第2个吸收峰的洗脱组分。

9.由上述任一项权利要求所述的酶解制备方法制备得到的羊胎盘抗氧化多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

10.权利要求9中所述的羊胎盘抗氧化多肽在制备具有抗衰老功效的化妆品方面的应用。