TWI698445B - 微型ｒｎａ化合物及調控ｍｉｒ－２１活性之方法 - Google Patents

Abstract

本文描述用於抑制miR-21活性之組合物及方法。該等組合物具有某些產生miR-21活性之有效抑制劑的核苷修飾型態。該等組合物可用於抑制miR-21，以及治療與miR-21之異常表現相關之疾病，諸如纖維化及癌症。

Description

微型RNA化合物及調控MIR-21活性之方法

本文提供用於調節miR-21活性之方法及組合物。

本申請案主張2011年4月25日申請之美國臨時申請案第61/478,767號及2011年12月1日申請之美國臨時申請案第61/565,779號之優先權益，該等申請案出於任何目的以全文引用之方式併入本文中。

微小RNA(microRNA)亦稱為「成熟微小RNA」，為在植物及動物之基因組中編碼之小型(長約18-24個核苷酸)非編碼RNA分子。在某些情況下，高度保守的內源性表現之微小RNA藉由結合至特定mRNA之3'-非轉譯區(3'-UTR)來調控基因之表現。已在植物及動物中鑒別出超過1000種不同的微小RNA。某些成熟微小RNA似乎來源於長度通常為數百個核苷酸的長內源性初級微小RNA轉錄物(亦稱為初級微小RNA、初級mir、初級miR或初級微小RNA前體)(Lee等人，EMBO J.,2002,21(17),4663-4670)。

對微小RNA的功能性分析揭示，此等小型非編碼RNA促進動物的不同生理過程，包括發育時序、器官發生、分化、成型(patterning)、胚胎發生、生長控制及漸進式細胞死亡。微小RNA參與之特定過程之實例包括幹細胞分化、神經生成、血 管生成、造血作用及胞吐作用(由Alvarez-Garcia及Miska,Development,2005,132,4653-4662評述)。

本文提供包含經修飾寡核苷酸之化合物，其中經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與miR-21互補且經修飾寡核苷酸具有本文所述之核苷型態。

本文提供抑制miR-21活性之方法，其包括使細胞與本文所述之化合物接觸。在某些實施例中，細胞在活體內。在某些實施例中，細胞在活體外。

本文提供治療與miR-21相關之疾病之方法，其包括向患有與miR-21相關之疾病之個體投與本文所述之化合物。在某些實施例中，動物為人類。

本文所述之化合物係提供用於療法中。

本文提供包含由8至22個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸的化合物，其中該經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與miR-21(SEQ ID NO：1)互補且其中該經修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態I之至少8個連續核苷：(R)_X-N^B-N^Q-N^Q-N^B-(N^Q-N^Q-N^Q-N^B)₃-N^Q-N^Z其中各R獨立地為非雙環核苷；X為1至4；各N^B獨立地為雙環核苷；各N^Q獨立地為非雙環核苷；且各N^Z獨立地為經修飾之核苷。

本文提供包含由8至19個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸的化合物，其中該經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與miR-21(SEQ ID NO：1)互補且其中該經修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態II之至少8個連續核苷：N^M-N^B-N^Q-N^Q-N^B-(N^Q-N^Q-N^Q-N^B)₃-N^Q-N^Z其中N^M獨立地為不為雙環核苷之經修飾核苷；各N^B獨立地為 雙環核苷；各N^Q獨立地為非雙環核苷；且N^Z獨立地為經修飾之核苷。

本文提供包含由8至19個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸的化合物，其中該經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與miR-21(SEQ ID NO：1)互補且其中該經修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態III之至少8個連續核苷： (R)_X-N^B-N^Q-N^Q-N^B-(N^Q-N^Q-N^Q-N^B)₃-N^Y-N^Z其中各R為非雙環核苷；X為1至4；各N^B為雙環核苷；各N^Q為非雙環核苷；N^Y為經修飾之核苷或未經修飾之核苷；且各N^Z為經修飾之核苷。

本文提供包含由8至19個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸的化合物，其中該經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與miR-21(SEQ ID NO：1)互補且其中該經修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態IV之至少8個連續核苷： N^M-N^B-N^Q-N^Q-N^B-(N^Q-N^Q-N^Q-N^B)₃-N^Y-N^Z其中N^M為不為雙環核苷之經修飾核苷；各N^B為雙環核苷；各N^Q為非雙環核苷；N^Y為經修飾之核苷或未經修飾之核苷；且N^Z為經修飾之核苷。

本文提供包含由8至19個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸的化合物，其中該經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與miR-21(SEQ ID NO：1)互補且其中該經修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態V之至少8個連續核苷： N^M-N^B-(N^Q-N^Q-N^B-N^B)₄-N^Z其中N^M為不為雙環核苷之經修飾核苷；各N^B為雙環核苷；各N^Q為非雙環核苷；且N^Z為經修飾之核苷。

在核苷型態I或III之某些實施例中，X為1，X為2，X為3，或X為4。

在本文提供之任何化合物之某些實施例中，經修飾之寡核 苷酸包含核苷型態I、II、III、IV或V之至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個或22個連續核苷。在本文提供之任何化合物之某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由核苷型態I、II、III、IV或V之8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個連接之核苷組成。

在本文提供之任何化合物之某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與miR-21之核苷鹼基序列(SEQ ID NO：1)至少90%互補、至少95%互補或100%互補。

在本文提供之任何化合物之某些實施例中，miR-21位置1上之核苷鹼基與經修飾寡核苷酸之3’端上之第一核苷鹼基配對。

在本文提供之任何化合物之某些實施例中，各雙環核苷獨立地選自LNA核苷、cEt核苷及ENA核苷。

在本文提供之任何化合物之某些實施例中，至少兩個非雙環核苷包含彼此不同之糖部分。在本文提供之任何化合物之某些實施例中，各非雙環核苷具有相同類型之糖部分。

在本文提供之任何化合物之某些實施例中，各雙環核苷為cEt核苷。在某些實施例中，cEt核苷為S-cEt核苷。在某些實施例中，cEt核苷為R-cEt核苷。在本文提供之任何化合物之某些實施例中，各雙環核苷為LNA核苷。

在本文提供之任何化合物之某些實施例中，各非雙環核苷獨立地選自β-D-去氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2’-O-甲基核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷及2’-氟核苷。在本文提供之任何化合物之某些實施例中，各非雙環核苷獨立地選自β-D-去氧核糖核苷及2’-O-甲氧基乙基核苷。在本文提供之任何化合物之某些實施例中，各非雙環核苷為β-D-去氧核糖核苷。在本文提供 之任何化合物之某些實施例中，各非雙環核苷為2’-O-甲氧基乙基核苷。

在本文提供之任何化合物之某些實施例中，各雙環核苷包含非甲基化核苷。

在本文提供之任何化合物之某些實施例中，不超過2個非雙環核苷為2’-O-甲氧基乙基核苷。在某些該等實施例中，各其他非雙環核苷為β-D-去氧核糖核苷。

在本文提供之任何化合物之某些實施例中，5’最末端非雙環核苷及3’最末端非雙環核苷為2’-O-甲氧基乙基核苷且其他各非雙環核苷為β-D-去氧核糖核苷。在本文提供之任何化合物之某些實施例中，兩個非雙環核苷為2’-MOE核苷且各其他非雙環核苷為β-D-去氧核糖核苷。

在核苷型態I或III之某些實施例中，各核苷R為2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型態I或III之某些實施例中，三個核苷R為2’-O-甲氧基乙基核苷且一個核苷R為β-D-去氧核糖核苷。

在本文提供之任何化合物之某些實施例中，至少一個核苷間鍵結為經修飾之核苷間鍵結。在本文提供之任何化合物之某些實施例中，各核苷間鍵結均為經修飾之核苷間鍵結。在某些實施例中，經修飾之核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。

在本文提供之任何化合物之某些實施例中，至少一個核苷間鍵結包含經修飾之核苷鹼基。在本文提供之任何化合物之某些實施例中，至少一個胞嘧啶為5-甲基胞嘧啶。在本文提供之任何化合物之某些實施例中，各胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶。在本文提供之任何化合物之某些實施例中，經修飾寡核苷酸之位置2上之胞嘧啶為5-甲基胞嘧啶。

在核苷型態I之某些實施例中，R由四個連接之核苷N^R1-N^R2-N^R3-N^R4組成，其中N^R1為2’-O-甲氧基乙基核苷且 N^R2-N^R3-N^R4各自為β-D-去氧核糖核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型態I之某些實施例中，各R為2’-O-甲氧基乙基核苷；X為1；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型態I之某些實施例中，各R為2’-O-甲氧基乙基核苷；X為1；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為2’-O-甲氧基乙基核苷；且N^Z為2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型態I之某些實施例中，各R為2’-O-甲氧基乙基核苷；X為1；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為S-cEt核苷。在核苷型態I之某些實施例中，各R為2’-O-甲氧基乙基核苷；X為1；各N^B為LNA核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型態I之某些實施例中，各R為2’-O-甲氧基乙基核苷；X為1；各N^B為LNA核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為LNA核苷。

在核苷型態II之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型態II之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為2’-O-甲氧基乙基核苷；且N^Z為2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型態I之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；各N為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為S-cEt核苷。在核苷型態II之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為LNA核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型態II之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為LNA核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為LNA核苷。

在核苷型態III之某些實施例中，各R為2’-O-甲氧基乙基 核苷；X為1；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；N^Y為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型態III之某些實施例中，各R為2’-O-甲氧基乙基核苷；X為1；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；N^Y為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為S-cEt核苷。在核苷型態III之某些實施例中，各R為2’-O-甲氧基乙基核苷；X為1；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；N^Y為S-cEt核苷；且N^Z為S-cEt核苷。

在核苷型態IV之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；N^Y為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為2’-O-甲氧基乙基核苷。在核苷型態IV之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；N^Y為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為S-cEt核苷。在核苷型態IV之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；N^Y為S-cEt核苷；且N^Z為S-cEt核苷。

在核苷型態V之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為2’-O-甲氧基乙基核苷。

在本文提供之任何化合物之某些實施例中，經修飾之寡核苷酸具有SEQ ID NO：3之核苷鹼基序列。在本文提供之任何化合物之某些實施例中，經修飾之寡核苷酸具有SEQ ID NO：4之核苷鹼基序列。

本文提供抑制miR-21活性之方法，其包括使細胞與本文提供之化合物接觸。在某些實施例中，細胞在活體內。在某些實施例中，細胞在活體外。在某些實施例中，細胞為纖維母細胞、過度增殖性細胞、角化細胞或乏氧細胞。在某些實施例中，纖維母細胞為過度增殖性纖維母細胞。

本文提供減少細胞中之膠原蛋白表現之方法，其包括使細胞與本文提供之化合物接觸。

本文提供治療與miR-21相關之疾病、預防或延遲其發作之方法，其包括向患有該種疾病之個體投與本文提供之任何化合物。

在某些實施例中，疾病為纖維化。在某些實施例中，纖維化為腎纖維化、肺纖維化、肝纖維化、心臟纖維化、皮膚纖維化、年齡相關性纖維化、脾纖維化、硬皮病或移植後纖維化。

在某些實施例中，纖維化為腎纖維化且存在於患有選自以下之疾病的個體中：腎絲球硬化、小管間質性纖維化、IgA腎病、間質性纖維化/腎小管萎縮；慢性腎損傷、腎絲球疾病、腎絲球腎炎、糖尿病、特發性局部區段性腎絲球硬化、膜性腎病、塌陷性腎絲球病、慢性復發性腎臟感染及末期腎病。在某些實施例中，腎纖維化由腎臟之急性或反復性創傷引起。

在某些實施例中，纖維化為肝纖維化且存在於患有選自以下之疾病的個體中：慢性肝損傷、肝炎感染、非酒精性脂肪變性肝炎及肝硬化。

在某些實施例中，肺纖維化為特發性肺纖維化，或個體患有慢性阻塞性肺病。

在某些實施例中，疾病為發炎性疾病。

本文提供促進個體之傷口癒合之方法，其包括向具有急性或慢性傷口之個體投與本文提供之任何化合物。在某些實施例中，慢性傷口為急性或慢性手術傷口、穿透傷口、撕脫傷、擠壓傷、剪力損傷、燒傷、撕裂、咬傷、動脈性潰瘍、靜脈性潰瘍、褥瘡及糖尿病性潰瘍。在某些實施例中，化合物係局部投與傷口。

本文提供治療個體之纖維增生性病症之方法，其包括向個體投與本文提供之任何化合物。

本文提供之任何方法可包括選擇一或多種組織中之miR-21表現升高之個體。

在某些實施例中，向個體投與本文提供之任何化合物減少膠原蛋白表現。

在某些實施例中，個體需要改善之器官功能，其中該器官功能係選自心臟功能、肺功能、肝功能及腎功能。在某些實施例中，投與本文提供之任何化合物改善個體之器官功能，其中該器官功能係選自心臟功能、肺功能、肝功能及腎功能。

本文提供之任何方法包括評估個體之腎功能，其可包括量測個體血液中之血液尿素氮；量測個體血液中之肌酸酐；量測個體之肌酸酐清除率；量測個體之蛋白尿；量測個體之微白蛋白：Cr比率；及/或量測個體之尿排泄量。

本文提供之任何方法可包括評估個體之肝功能，其可包括量測個體血液中之丙胺酸轉胺酶含量；量測個體血液中之天冬胺酸轉胺酶含量；量測個體血液中之膽紅素含量；量測個體血液中之白蛋白含量；量測個體之凝血酶原時間；量測個體之腹水；及/或量測個體之腦病。

本文提供之任何方法可包括評估個體之肺功能，其可量測個體之肺活量；量測個體之用力肺活量；量測個體之一秒內用力呼氣量；量測個體之峰值呼氣流速；量測個體之用力呼氣流量；量測個體之最大隨意通氣量；測定個體之一秒內用力呼氣量與用力肺活量之比率；量測個體之通氣/灌注比率；量測個體之氮氣廓清；量測個體一或多個肺中之絕對空氣容積。

本文提供之任何方法可包括評估個體之心臟功能，其可包括量測個體之心輸出量；量測個體之心搏排血量；量測個體之平均收縮期射血率；量測個體之收縮期血壓；量測個體之左心室射血分數；測定個體之心搏指數；測定個體之心臟指數；量測個體之左心室縮短百分率；量測個體之周徑纖維平均縮短速 度；量測個體之左心室流入血流速度圖；量測個體之肺靜脈血流速度圖；量測個體二尖瓣環之舒張早期峰值速度。

本文提供之任何方法可包括向個體投與至少一種選自以下之治療劑：消炎劑、免疫抑制劑、抗糖尿病劑、地高辛(digoxin)、血管舒張藥、血管緊張素II轉化酶(ACE)抑制劑、血管緊張素II受體阻斷劑(ARB)、鈣通道阻斷劑、異山梨醇二硝酸酯、肼屈嗪(hydralazine)、硝酸酯、肼屈嗪、β-阻斷劑、利鈉肽、類肝素及結締組織生長因子抑制劑。在某些實施例中，消炎劑為非類固醇消炎劑，其中該非類固醇消炎劑任意地選自布洛芬(ibuprofen)、COX-1抑制劑或COX-2抑制劑。在某些實施例中，免疫抑制劑係選自皮質類固醇、環磷醯胺(cyclophosphamide)及黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)。在某些實施例中，消炎劑為皮質類固醇，其中該皮質類固醇任意地為強的松(prednisone)。在某些實施例中，血管緊張素II轉化酶(ACE)抑制劑係選自卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、賴諾普利(lisinopril)、貝那普利(benazepril)、喹那普利(quinapril)、福辛普利(fosinopril)及雷米普利(ramipril)。在某些實施例中，血管緊張素II受體阻斷劑(ARB)係選自坎地沙坦(candesartan)、伊貝沙坦(irbesartan)、奧美沙坦(olmesartan)、洛沙坦(losartan)、纈沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisartan)及依普沙坦(eprosartan)。

在某些實施例中，疾病為癌症。在某些實施例中，癌症為肝癌、乳癌、膀胱癌、前列腺癌、結腸癌、肺癌、腦癌、血液系統癌症、胰臟癌、頭頸癌、舌癌、胃癌、皮膚癌或甲狀腺癌。在某些實施例中，肝癌為肝細胞癌。在某些實施例中，腦癌為多形性神經膠母細胞瘤。在某些實施例中，血液系統癌症為急性骨髓性白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性單核細胞性白血病、多發性骨髓瘤、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白 血病、霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin’s lymphoma)或非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin’s lymphoma)。

在某些實施例中，本文提供之方法包括向個體投與至少一種其他抗癌療法。在某些實施例中，抗癌療法為DNA損傷劑、增殖抑制劑、抗葉酸劑、生長因子受體抑制劑、抗血管生成劑、受體酪胺酸激酶抑制劑、激酶抑制劑、生長因子抑制劑、細胞毒性劑、放射療法或手術切除腫瘤。在某些實施例中，DNA損傷劑為1,3-雙(2-氯乙基)-1-亞硝基脲、白消安(busulfan)、卡鉑(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑(cisplatin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、達卡巴嗪(dacarbazine)、道諾黴素(daunorubicin)、小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依託泊苷(etoposide)、伊達比星(idarubicin)、異環磷醯胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、洛莫司汀(lomustine)、氮芥(mechlorethamine)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、替莫唑胺(temozolomide)或拓撲替康(topotecan)。在某些實施例中，抗葉酸劑為甲胺蝶呤(methotrexate)、胺基喋呤(aminopterin)、胸苷酸合成酶、絲胺酸羥甲基轉移酶、葉酸聚麩胺醯基合成酶、g-麩胺醯基水解酶、甘胺醯胺-核糖核苷酸轉甲醯基酶、甲醯四氫葉酸、胺基-咪唑-甲醯胺-核糖核苷酸轉甲醯基酶、5-氟尿嘧啶或葉酸轉運體。在某些實施例中，生長因子受體抑制劑為埃羅替尼(erlotinib)或吉非替尼(gefitinib)。在某些實施例中，血管生成抑制劑為貝伐單抗(bevacizumab)、沙利度胺(thalidomide)、羧醯胺基三唑、TNP-470、CM101、IFN-α、血小板因子-4、蘇拉明(suramin)、SU5416、血小板反應蛋白(thrombospondin)、VEGFR拮抗劑、軟骨源性血管生成抑制因子、基質金屬蛋白酶抑制劑、血管生成抑制素(angiostatin)、內皮抑素(endostatin)、 2-甲氧基雌二醇、替可加蘭(tecogalan)、四硫鉬酸鹽、催乳激素或利諾胺(linomide)。在某些實施例中，激酶抑制劑為貝伐單抗、BIBW 2992、西妥昔單抗(cetuximab)、伊馬替尼(imatinib)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、吉非替尼、蘭尼單抗(ranibizumab)、哌加他尼(pegaptanib)、索拉菲尼(sorafenib)、達沙替尼(dasatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、尼羅替尼(nilotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、帕尼單抗(panitumumab)、凡德他尼(vandetanib)、E7080、帕唑帕尼(pazopanib)、莫立替尼(mubritinib)或福馬替尼(fostamatinib)。

在某些實施例中，向患有癌症之個體投與使得腫瘤尺寸及/或腫瘤數減小。在某些實施例中，向患有癌症之個體投與預防或延遲腫瘤尺寸及/或腫瘤數增加。在某些實施例中，向患有癌症之個體投與預防或減緩轉移性進展。在某些實施例中，向患有癌症之個體投與延長個體之總體存活時間及/或無進展存活期。在某些實施例中，本文提供之方法包括選擇血清α-胎蛋白升高及/或血清消-γ-羧基凝血酶原升高之個體。在某些實施例中，本文提供之方法包括使血清α-胎蛋白及/或血清消-γ-羧基凝血酶原降低。在某些實施例中，本文提供之方法包括選擇肝功能異常之動物。

在本文提供之任何方法中，個體為人類。

在本文提供之任何方法中，化合物以醫藥組合物形式存在。

本文提供之任何化合物可用於療法中。本文提供之任何化合物可用於治療纖維化。本文提供之任何化合物可用於促進傷口癒合。本文提供之任何化合物可用於治療癌症。本文提供之任何化合物可用於預防及/或延遲轉移發作。

本文提供之任何化合物可用於治療心臟病。

本文提供之任何化合物可用於製備藥物。本文提供之任何 化合物可用於製備用於治療纖維化之藥物。本文提供之任何化合物可用於製備用於促進傷口癒合之藥物。本文提供之任何化合物可用於製備用於治療癌症之藥物。本文提供之任何化合物可用於製備用於預防及/或延遲轉移發作之藥物。

圖1展示如實例5中所述，投與抗miR21化合物的缺血再灌注/腎切除術(IR/Nx)模型小鼠之尿白蛋白：肌酸酐比率(ACR，μgAlb/mgCr)。

圖2展示如實例6中所述，投與抗miR21化合物的UUO模型小鼠腎中之(A)膠原蛋白1A1及(B)膠原蛋白3A1表現。

除非另外規定，否則本文中所用的所有技術及科學術語具有與熟習本發明所屬技術者通常所瞭解相同的意義。除非提供特定定義，否則結合本文所述之分析化學、合成有機化學以及醫療及醫藥化學使用的命名法以及該等領域之程序及技術為此項技術中所熟知及常用者。在本文中之術語存在複數個定義之情況下，以本部分中之定義為準。可使用化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞以及治療個體之標準技術。某些此類技術及程序可見於例如以下文獻中：「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」,Sangvi及Cook編，American Chemical Society,Washington D.C.,1994；及「Remington's Pharmaceutical Sciences」,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，第18版，1990；且其出於任何目的以引用之方式併入本文中。除非另外說明，否則本文整篇揭示內容中提及之所有專利、專利申請案、公開申請案及公開案、GENBANK序列、網站及其他公開材料在允許時均以全文引用之方式併入本 文中。在提及URL或其他類似識別符或位址的情況下，應瞭解該等識別符可改變並且網際網路上之特定資訊可改變，但可藉由搜尋網際網路找到等效資訊。對其之提及證明該資訊之可用性及公開傳播。

在揭示及描述本發明之組合物及方法之前，應瞭解本文所用之術語僅出於描述特定實施例之目的而不欲具有限制性。須注意，除非上下文另外明確規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一」、「一種」及「該」包括複數個參考物。

定義

「纖維化」意謂在器官或組織中形成或產生過量纖維結締組織。在某些實施例中，纖維化作為修復或反應性過程出現。在某些實施例中，纖維化回應於損害或損傷而出現。術語「纖維化」應理解為在器官或組織中作為修復或反應性過程形成或產生過量纖維結締組織，而非形成纖維組織作為器官或組織的正常組分。

「懷疑患有......之個體」意謂展現疾病之一或多種臨床指標的個體。

「懷疑患有纖維化之個體」意謂展現纖維化之一或多種臨床指標的個體。

「纖維母細胞」意謂產生結締組織之細胞。

「纖維增生性病症」意謂特徵在於纖維母細胞之過度增殖及/或活化之病症。

「肝癌」意謂肝臟之惡性腫瘤，為原發癌抑或轉移癌。在某些實施例中，肝癌包括(但不限於)起因於肝細胞之癌症，諸如肝細胞瘤及肝細胞癌；纖維板層癌；及膽管細胞癌(或膽管癌)。

「轉移」意謂癌症自其首先產生為原發性腫瘤之位置擴散至體內其他位置之過程。原發性腫瘤之轉移性進展反映多個階段，包括自相鄰原發性腫瘤細胞解離、在循環中存活及在繼發位置生長。

「總體存活時間」意謂個體在診斷出疾病或針對疾病進行治療後存活之時間。在某些實施例中，疾病為癌症。在一些實施例中，總體存活時間為診斷後之存活期。在一些實施例中，總體存活時間為治療開始後之存活期。

「無進展存活期」意謂患有疾病之個體在疾病不發生惡化之情況下存活的時間。在某些實施例中，無進展存活期係藉由對疾病進行分期或評分來評定。在某些實施例中，患有肝癌之個體的無進展存活期係藉由評估腫瘤尺寸、腫瘤數及/或轉移來評定。

「抗miR劑」意謂具有與微小RNA互補之核苷鹼基序列的寡核苷酸。在某些實施例中，抗miR劑為經修飾之寡核苷酸。

當「miR-X」表示特定微小RNA時，「抗miR-X劑」意謂具有與miR-X互補之核苷鹼基序列的寡核苷酸。在某些實施例中，抗miR-X劑與miR-X完全互補。在某些實施例中，抗miR-X劑與miR-X至少80%、至少85%、至少90%或至少95%互補。在某些實施例中，抗miR-X劑為經修飾之寡核苷酸。

「miR-21」意謂具有核苷鹼基序列UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO：1)之成熟miRNA。

「miR-21莖-環序列」意謂具有核苷鹼基序列UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA(SEQ ID NO：2)之莖-環序列。

「目標核酸」意謂寡聚化合物設計用來雜交之核酸。

「定標」意謂設計及選擇將與目標核酸雜交之核苷鹼基序列的過程。

「靶向」意謂具有允許與目標核酸雜交之核苷鹼基序列。

「目標嚙合」意謂寡核苷酸同與其互補之微小RNA以改變該微小RNA之活性、表現或含量之方式相互作用。在某些實施例中，目標嚙合意謂抗miR劑同與其互補之微小RNA相互作用，使得該微小RNA之活性受到抑制。

「調節」意謂擾動功能、量或活性。在某些實施例中，調節意謂功能、量或活性增加。在某些實施例中，調節意謂功能、量或活性降低。

「表現」意謂基因所編碼之資訊藉以轉化為細胞中存在及運轉之結構的任何功能及步驟。

「5'目標位點」意謂目標核酸中與特定寡核苷酸之3'最末端核苷鹼基互補的核苷鹼基。

「3'目標位點」意謂目標核酸中與特定寡核苷酸之5'最末端核苷鹼基互補的核苷鹼基。

「區」意謂核酸內一部分連接之核苷。在某些實施例中，寡核苷酸具有與目標核酸之區互補的核苷鹼基序列。舉例而言，在某些該等實施例中，寡核苷酸與微小RNA莖-環序列之區互補。在某些該等實施例中，寡核苷酸與微小RNA莖-環序列之區完全互補。

「區段」意謂區之較小部分或子部分。

「核苷鹼基序列」意謂寡聚化合物或核酸中連續核苷鹼基之次序，通常按5'至3'方向列出，而與任何糖、鍵結及/或核苷鹼基修飾無關。

「連續核苷鹼基」意謂核酸中彼此緊鄰之核苷鹼基。

「核苷鹼基互補性」意謂兩個核苷鹼基經由氫鍵結非共價配對之能力。

「互補」意謂一個核酸能夠與另一核酸或寡核苷酸雜交。在某些實施例中，互補係指寡核苷酸能夠與目標核酸雜交。

「完全互補」意謂寡核苷酸之各核苷鹼基皆能夠與目標核酸中各相應位置處之核苷鹼基配對。在某些實施例中，寡核苷酸與微小RNA完全互補，亦即寡核苷酸之各核苷鹼基與微小RNA中相應位置處之核苷鹼基皆互補。在某些實施例中，各核苷鹼基與微小RNA莖-環序列之區內之核苷鹼基皆具有互補性之寡核苷酸與該微小RNA莖-環序列完全互補。

「互補性百分比」意謂寡核苷酸中與目標核酸之等長部分互補之核苷鹼基的百分率。互補性百分比藉由將寡核苷酸中與目標核酸中相應位置處之核苷鹼基互補之核苷鹼基的數目除以寡核苷酸中核苷鹼基之總數來計算。

「一致性百分比」意謂第一核酸中與第二核酸中相應位置處之核苷鹼基一致之核苷鹼基的數目除以第一核酸中核苷鹼基之總數。在某些實施例中，第一核酸為微小RNA且第二核酸為微小RNA。在某些實施例中，第一核酸為寡核苷酸且第二核酸為寡核苷酸。

「雜交」意謂經由核苷鹼基互補性將互補核酸進行黏接。

「失配」意謂第一核酸中之核苷鹼基不能與第二核酸中相應位置處之核苷鹼基配對。

「一致」在核苷鹼基序列之情況下意謂具有相同核苷鹼基序列，而與糖、鍵結及/或核苷鹼基修飾無關且與所存在之任何嘧啶之甲基狀態無關。

「微小RNA」意謂長度在18與25個核苷鹼基之間的內源性非編碼RNA，其為由酶Dicer裂解微小RNA前體之產物。成熟微小RNA之實例可見於稱為miRBase之微小RNA資料庫中(http：//microrna.sanger.ac.uk/)。在某些實施例中，微小RNA縮寫為「微小RNA」或「miR」。

「微小RNA前體」或「miR前體」意謂具有髮夾結構之非編碼RNA，其為由稱為Drosha之雙股RNA特異性核糖核酸酶裂解初級miR之產物。

「莖-環序列」意謂具有髮夾結構且含有成熟微小RNA序列之RNA。微小RNA前體序列及莖-環序列可能重疊。莖-環序列之實例可見於稱為miRBase之微小RNA資料庫中(http：//microrna.sanger.ac.uk/)。

「初級微小RNA」或「初級miR」意謂具有髮夾結構之非編碼RNA，其為雙股RNA特異性核糖核酸酶Drosha之受質。

「微小RNA前驅體」意謂來源於基因組DNA且包含含一或多個微小RNA序列之非編碼結構化RNA的轉錄物。舉例而言，在某些實施例中，微小RNA前驅體為微小RNA前體。在某些實施例中，微小RNA前驅體為初級微小RNA。

「微小RNA調控之轉錄物」意謂受微小RNA調控之轉錄物。

「單順反子轉錄物」意謂含有單一微小RNA序列之微小RNA前驅體。

「多順反子轉錄物」意謂含有兩個或兩個以上微小RNA序列之微小RNA前驅體。

「種子序列」意謂包含成熟微小RNA序列之5'端之核苷鹼基1至9中6至8個連續核苷鹼基的核苷鹼基序列。

「種子匹配序列」意謂與種子序列互補並且長度與種子序列相同的核苷鹼基序列。

「寡聚化合物」意謂包含複數個連接之單體次單元的化合物。寡聚化合物包括寡核苷酸。

「寡核苷酸」意謂包含複數個連接之核苷的化合物，其中各核苷可彼此獨立地經修飾或未經修飾。

「天然存在之核苷間鍵結」意謂核苷之間的3'至5'磷酸二 酯鍵結。

「天然糖」意謂DNA(2'-H)或RNA(2'-OH)中存在之糖。

「核苷間鍵結」意謂相鄰核苷之間的共價鍵結。

「連接之核苷」意謂由共價鍵連接之核苷。

「核苷鹼基」意謂能夠與另一核苷鹼基非共價配對之雜環部分。

「核苷」意謂連接於糖部分之核苷鹼基。

「核苷酸」意謂具有共價連接於核苷之糖部分之磷酸酯基的核苷。

「包含由多個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸的化合物」意謂包括具有指定數目之連接之核苷之經修飾寡核苷酸的化合物。因此，該化合物可包括另外之取代基或結合物。除非另外說明，否則該化合物不包括除寡核苷酸之彼等核苷以外的任何其他核苷。

「包含由多個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸的化合物」意謂包括具有指定數目之連接之核苷之經修飾寡核苷酸的化合物。因此，該化合物可包括另外之取代基或結合物。除非另外說明，否則該化合物不包括除經修飾寡核苷酸之彼等核苷以外的任何其他核苷。

「經修飾之寡核苷酸」意謂相對於天然存在之末端、糖、核苷鹼基及/或核苷間鍵結具有一或多處修飾之寡核苷酸。經修飾之寡核苷酸可包含未經修飾之核苷。

「單股經修飾寡核苷酸」意謂未與互補股雜交之經修飾寡核苷酸。

「經修飾之核苷」意謂與天然存在之核苷相比具有任何變化之核苷。經修飾之核苷可具有經修飾之糖及未經修飾之核苷鹼基。經修飾之核苷可具有經修飾之糖及經修飾之核苷鹼基。經修飾之核苷可具有天然糖及經修飾之核苷鹼基。在某些實施 例中，經修飾之核苷為雙環核苷。在某些實施例中，經修飾之核苷為非雙環核苷。

「經修飾之核苷間鍵結」意謂與天然存在之核苷間鍵結相比存在任何變化。

「硫代磷酸酯核苷間鍵結」意謂核苷間一個非橋連原子為硫原子之鍵結。

「經修飾之糖部分」意謂與天然糖相比之取代及/或任何變化。

「未經修飾之核苷鹼基」意謂RNA或DNA的天然存在之雜環鹼基：嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基胞嘧啶)及尿嘧啶(U)。

「5-甲基胞嘧啶」意謂包含連接於5位之甲基的胞嘧啶。

「非甲基化胞嘧啶」意謂不具有連接於5位之甲基的胞嘧啶。

「經修飾之核苷鹼基」意謂不為未經修飾之核苷鹼基的任何核苷鹼基。

「呋喃醣基」意謂包含由四個碳原子及一個氧原子組成之5員環的結構。

「天然存在之呋喃醣基」意謂如在天然存在之RNA中所發現的呋喃核糖基或如在天然存在之DNA中所發現的去氧呋喃核糖基。

「糖部分」意謂天然存在之呋喃醣基或經修飾之糖部分。

「經修飾之糖部分」意謂經取代之糖部分或糖替代物。

「經取代之糖部分」意謂不為天然存在之呋喃醣基的呋喃醣基。經取代之糖部分包括(但不限於)在天然存在之呋喃醣基的2'位、5'位及/或4'位包含修飾的糖部分。某些經取代之糖部分為雙環糖部分。

「糖替代物」意謂不包含呋喃醣基且能夠置換核苷中天然 存在之呋喃醣基的結構，所述置換使得所得核苷能夠(1)併入寡核苷酸中及(2)與互補核苷雜交。該等結構包括呋喃醣基之相對簡單的變化，諸如包含不同數目之原子的環(例如4員、6員或7員環)；呋喃醣基之氧置換為非氧原子(例如碳、硫或氮)；或原子數變化及置換氧兩者。該等結構亦可包含對應於針對經取代之糖部分所述之取代的取代(例如任意地包含其他取代基之6員碳環雙環糖替代物)。糖替代物亦包括更複雜之糖置換(例如肽核酸之非環系統)。糖替代物包括(但不限於)嗎啉基、環己烯基及環己醣醇(cyclohexitol)。

「2'-O-甲基糖」或「2'-OMe糖」意謂在2'位具有O-甲基修飾之糖。

「2'-O-甲氧基乙基糖」或「2'-MOE糖」意謂在2'位具有O-甲氧基乙基修飾之糖。

「2'-O-氟」或「2'-F」意謂在2'位具有氟修飾之糖。

「雙環糖部分」意謂包含4至7員環之經修飾糖部分(包括(但不限於)呋喃醣基)，其包含連接該4至7員環之兩個原子之橋鍵以形成第二環，從而產生雙環結構。在某些實施例中，4至7員環為糖環。在某些實施例中，4至7員環為呋喃醣基。在某些該等實施例中，橋鍵連接呋喃醣基之2'碳與4'碳。

「鎖核酸(LNA)糖部分」意謂在4'與2'呋喃醣環原子之間包含(CH₂)-O橋的經取代之糖部分。

「ENA糖部分」意謂在4'與2'呋喃醣環原子之間包含(CH₂)₂-O橋的經取代之糖部分。

「限制性乙基(cEt)糖部分」意謂在4'與2'呋喃醣環原子之間包含CH(CH₃)-O橋的經取代之糖部分。在某些實施例中，CH(CH₃)-O橋限制呈S型取向。在某些實施例中，(CH₂)₂-O限制呈R型取向。

「S-cEt糖部分」意謂在4'與2'呋喃醣環原子之間包含S 型限制性CH(CH₃)-O橋的經取代之糖部分。

「R-cEt糖部分」意謂在4'與2'呋喃醣環原子之間包含R型限制性CH(CH₃)-O橋的經取代之糖部分。

「2'-O-甲基」核苷意謂具有2'-O-甲基糖修飾之2'位上經修飾之核苷。

「2'-O-甲氧基乙基核苷」意謂具有2'-O-甲氧基乙基糖修飾之2'位上經修飾之核苷。2'-O-甲氧基乙基核苷可包含經修飾或未經修飾之核苷鹼基。

「2'-氟核苷」意謂具有2'-氟糖修飾之2'位上經修飾之核苷。2'-氟核苷可包含經修飾或未經修飾之核苷鹼基。

「雙環核苷」意謂具有雙環糖部分的2'位上經修飾之核苷。雙環核苷可具有經修飾或未經修飾之核苷鹼基。

「cEt核苷」意謂包含cEt糖部分之核苷。cEt核苷可包含經修飾或未經修飾之核苷鹼基。

「S-cEt核苷」意謂包含S-cEt糖部分之核苷。

「R-cEt核苷」意謂包含R-cEt糖部分之核苷。

「非雙環核苷」意謂具有除雙環糖以外之糖的核苷。在某些實施例中，非雙環核苷包含天然存在之糖。在某些實施例中，非雙環核苷包含經修飾之糖。在某些實施例中，非雙環核苷為β-D-去氧核糖核苷。在某些實施例中，非雙環核苷為2'-O-甲氧基乙基核苷。

「β-D-去氧核糖核苷」意謂天然存在之DNA核苷。β-D-去氧核糖核苷可包含經修飾或未經修飾之核苷鹼基。

「β-D-核糖核苷」意謂天然存在之RNA核苷。β-D-核糖核苷可包含經修飾或未經修飾之核苷鹼基。

「LNA核苷」意謂包含LNA糖部分之核苷。

「ENA核苷」意謂包含ENA糖部分之核苷。

「基元」意謂寡核苷酸中經修飾及/或未經修飾之核苷鹼 基、糖及/或核苷間鍵結的型態。在某些實施例中，基元為核苷型態。

「核苷型態」意謂經修飾之寡核苷酸或其區中核苷修飾的型態。核苷型態為描述寡核苷酸中核苷修飾之排列的基元。

「完全修飾之寡核苷酸」意謂各核苷鹼基、各糖及/或各核苷間鍵結均經修飾。

「均一修飾之寡核苷酸」意謂在整個經修飾之寡核苷酸中各核苷鹼基、各糖及/或各核苷間鍵結均具有相同修飾。

「穩定化修飾」意謂使經修飾之寡核苷酸在核酸酶存在下的穩定性相對於由磷酸二酯核苷間鍵結連接之2'-去氧核苷所提供之穩定性有所增強的核苷修飾。舉例而言，在某些實施例中，穩定化修飾為穩定化核苷修飾。在某些實施例中，穩定化修飾為核苷間鍵結修飾。

「穩定化核苷」意謂經修飾以使寡核苷酸之核酸酶穩定性相對於由2'-去氧核苷提供之穩定性有所增強的核苷。在一個實施例中，穩定化核苷為2'位上經修飾之核苷。

「穩定化核苷間鍵結」意謂使寡核苷酸之核酸酶穩定性相對於由磷酸二酯核苷間鍵結提供之穩定性有所改良的核苷間鍵結。在一個實施例中，穩定化核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。

「個體」意謂選用於治療或療法的人類或非人類動物。

「有需要之個體」意謂個體被鑒別為需要療法或治療之狀態。

「懷疑患有......之個體」意謂展現疾病之一或多種臨床指標的個體。

「投與」意謂向個體提供醫藥藥劑或組合物，且包括(但不限於)由醫學專業人員投與及自投與。

「非經腸投與」意謂經由注射或輸注投與。

非經腸投與包括(但不限於)皮下投與、靜脈內投與或肌肉內投與。

「皮下投與」意謂恰投與於皮膚下方。

「靜脈內投與」意謂投與至靜脈中。

「心臟內投與」意謂投與至心臟中。在某些實施例中，心臟內投與藉助於導管進行。在某些實施例中，心臟內投與藉助於開心手術進行。

「肺部投與」意謂投與至肺部。

「並行投與」係指兩種藥劑以其兩者之藥理學作用在患者體內同時表現之任何方式共同投與。並行投與不需要該兩種藥劑於單一醫藥組合物中、以相同劑型或藉由相同投藥途徑投與。兩種藥劑的作用本身無需同時表現。該等作用僅需重疊一段時間而無需共同延長。

「持續時間」意謂活性或事件持續的時段。在某些實施例中，治療之持續時間為投與醫藥藥劑或醫藥組合物之劑量的時段。

「療法」意謂疾病治療方法。在某些實施例中，療法包括(但不限於)化學療法、放射療法或投與醫藥藥劑。

「治療」意謂施用一或多種用於治癒或改善疾病之特定程序。在某些實施例中，特定程序為投與一或多種醫藥藥劑。

「改善」意謂減輕病狀或疾病之至少一種指標的嚴重性。在某些實施例中，改善包括延遲或減緩病狀或疾病之一或多種指標的進展。指標之嚴重性可藉由熟習此項技術者已知之主觀或客觀量度來確定。

「有產生......之風險」意謂個體易於產生病狀或疾病之狀態。在某些實施例中，有產生病狀或疾病之風險的個體展現該病狀或疾病之一或多種症狀，但並不展現足以診斷為患有該病狀或疾病之數目的症狀。在某些實施例中，有產生病狀或疾病 之風險的個體展現該病狀或疾病之一或多種症狀，但程度輕於診斷為患有該病狀或疾病所需之程度。

「預防......發作」意謂預防有產生疾病或病狀之風險的個體產生該病狀或疾病。在某些實施例中，有產生疾病或病狀之風險的個體接受與已患該疾病或病狀之個體所接受之治療類似的治療。

「延遲......發作」意謂延遲有產生疾病或病狀之風險的個體產生該病狀或疾病。在某些實施例中，有產生疾病或病狀之風險的個體接受與已患該疾病或病狀之個體所接受之治療類似的治療。

「治療劑」意謂用於治癒、改善或預防疾病之醫藥藥劑。

「劑量」意謂單次投藥中所提供之醫藥藥劑之指定量。在某些實施例中，劑量可以兩次或兩次以上快速注射(boluse)、錠劑或注射來投與。舉例而言，在需要皮下投與之某些實施例中，所要劑量所需之體積不易藉由單次注射提供。在該等實施例中，可使用兩次或兩次以上注射來達成所要劑量。在某些實施例中，劑量可以兩次或兩次以上注射投與以使個體之注射部位反應最小。在某些實施例中，劑量係以緩慢輸注形式投與。

「劑量單位」意謂提供醫藥藥劑時所採用之形式。在某些實施例中，劑量單位為容納凍乾寡核苷酸之小瓶。在某些實施例中，劑量單位為容納復原寡核苷酸之小瓶。

「治療有效量」係指醫藥藥劑向動物提供治療效益之量。

「醫藥組合物」意謂包括醫藥藥劑的適於投與個體之物質之混合物。舉例而言，醫藥組合物可包含無菌水溶液。

「醫藥藥劑」意謂在投與個體時提供治療作用之物質。

「活性醫藥成分」意謂醫藥組合物中提供所要作用之物質。

「器官功能改善」意謂器官功能朝向正常限度變化。在某 些實施例中，藉由量測個體血液中存在之分子來評定器官功能。舉例而言，在某些實施例中，肝功能改善係藉由血液肝轉胺酶含量降低來量測。

「可接受之安全性概況」意謂臨床上可接受之限度內的副作用型態。

「副作用」意謂除所要作用以外的歸因於治療之生理反應。在某些實施例中，副作用包括(但不限於)注射部位反應、肝功能測試異常、腎功能異常、肝中毒、腎中毒、中樞神經系統異常及肌病。該等副作用可直接或間接偵測。舉例而言，血清中之轉胺酶含量升高可指示肝中毒或肝功能異常。舉例而言，膽紅素增加可指示肝中毒或肝功能異常。

「注射部位反應」意謂個體之注射部位處皮膚之炎症或異常發紅。

「個體順應性」意謂個體遵循推薦或規定之療法。

「順應」意謂個體遵循推薦之療法。

「推薦之療法」意謂醫學專業人員關於治療、改善、延遲或預防疾病所推薦之治療。

概論

miR-21為廣泛表現之微小RNA，其與多種細胞過程有關，包括細胞分化、增殖、細胞凋亡及基質周轉。另外，miR-21與多種疾病相關。miR-21在癌症中常常上調，且抑制miR-21已在若干癌症動物模型中展現出腫瘤生長抑制作用。在心臟肥大動物模型中抑制miR-21表明miR-21在心臟病中之作用。已在心臟纖維化、腎纖維化及肺纖維化之動物模型中表明在纖維化中之作用。在組織外植體模型中抑制miR-21之研究說明抑制miR-21會促進傷口癒合。因此，miR-21之抑制劑適用於多種研究及臨床配置中。

為鑒別miR-21之有效抑制劑，設計了大量抗miR-21化合物。該等化合物在長度以及雙環核苷及非雙環核苷之數目、位置及身份方面不同。最初之一系列化合物在活體外螢光素酶分析中進行測試，其鑒別出一個化合物子集為活性化合物活體外活性化合物。接著在活體內分析中測試該等活體外活性化合物以鑒別在活體內作為miR-21之有效抑制劑的彼等化合物。根據最初之活體外及活體內篩選，選擇某些化合物作為設計其他化合物的基礎。使用結構與活性(活體外活性及活體內活性兩者)之間根據實驗觀測到之相關性來預測此等其他化合物的設計，該等化合物在長度及雙環及非雙環核苷之選擇及排列方面具有進一步之變化。接著對此等其他化合物重復活體外及活體內篩選分析。亦測試某些化合物之其他性質，例如對核酸外切酶活性之敏感性。觀察到在活體外最具活性之化合物在活體外最具活性並不一定為在活體內最具活性之化合物在活體內最具活性者，且亦觀測到一些在活體外具中等活性之化合物在活體外具中等活性為在活體內具高度活性之化合物。在此過程中活體外篩選之178種化合物中，60種鑒別為在螢光素酶分析中具活性。在此等60種活性活體外化合物中，鑒別出一個子集在活體內具活性。經由設計及篩選化合物之此重複過程，觀察到具有特定雙環及非雙環型態之化合物在活體內為miR-21之有效抑制劑。因此，此等化合物適用於調節由miR-21活性促進之細胞過程。此外，該等化合物適用於治療與miR-21相關之疾病、預防及/或延遲該等疾病發作。該等疾病之特徵可在於相對於無病樣品異常高的miR-21表現。該等疾病包括(但不限於)纖維化、急性腎損傷、心臟肥大、心肌梗塞及癌症。另外，本文提供之組合物及方法可用於促進傷口癒合。

靶向miR-21的某些經修飾寡核苷酸

本文提供具有某些雙環及非雙環核苷型態之經修飾寡核苷酸。具有本文鑒別之型態的經修飾寡核苷酸為miR-21活性之有效抑制劑。

本文說明之各核苷型態按5'至3'方向展示。

在某些實施例中，本文提供包含由8至22個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸的化合物，其中經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與miR-21(SEQ ID NO：1)互補且其中經修飾寡核苷酸按5'至3'方向包含以下核苷型態I之至少8個連續核苷：(R)_X-N^B-N^Q-N^Q-N^B-(N^Q-N^Q-N^Q-N^B)₃-N^Q-N^Z其中各R為非雙環核苷；X為1至4；各N^B為雙環核苷；各N^Q為非雙環核苷；且各N^Z為經修飾之核苷。

在核苷型態I之某些實施例中，X為1。在核苷型態I之某些實施例中，X為2。在核苷型態I之某些實施例中，X為3。在核苷型態I之某些實施例中，X為4。

在某些實施例中，本文提供包含由8至19個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸的化合物，其中經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與miR-21(SEQ ID NO：1)互補且其中經修飾寡核苷酸按5'至3'方向包含以下核苷型態II之至少8個連續核苷：N^M-N^B-N^Q-N^Q-N^B-(N^Q-N^Q-N^Q-N^B)₃-N^Q-N^Z其中N^M為不為雙環核苷之經修飾核苷；各N^B為雙環核苷；各N^Q為非雙環核苷；且N^Z為經修飾之核苷。

在某些實施例中，本文提供包含由8至22個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸的化合物，其中經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與miR-21(SEQ ID NO：1)互補且其中經修飾寡核苷酸 按5'至3'方向包含以下核苷型態III之至少8個連續核苷：(R)_X-N^B-N^Q-N^Q-N^B-(N^Q-N^Q-N^Q-N^B)₃-N^Y-N^Z其中各R為非雙環核苷；X為1至4；各N^B為雙環核苷；各N^Q為非雙環核苷；N^Y為經修飾之核苷或未經修飾之核苷；且各N^Z為經修飾之核苷。

在核苷型態III之某些實施例中，X為1。在核苷型態I之某些實施例中，X為2。在核苷型態III之某些實施例中，X為3。在核苷型態III之某些實施例中，X為4。

在某些實施例中，本文提供包含由8至19個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸的化合物，其中經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與miR-21(SEQ ID NO：1)互補且其中經修飾寡核苷酸按5'至3'方向包含以下核苷型態IV之至少8個連續核苷：N^M-N^B-N^Q-N^Q-N^B-(N^Q-N^Q-N^Q-N^B)₃-N^Y-N^Z其中N^M為不為雙環核苷之經修飾核苷；各N^B為雙環核苷；各N^Q為非雙環核苷；N^Y為經修飾之核苷或未經修飾之核苷；且N^Z為經修飾之核苷。

在某些實施例中，本文提供包含由8至19個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸的化合物，其中經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與miR-21(SEQ ID NO：1)互補且其中經修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態V之至少8個連續核苷：N^M-N^B-(N^Q-N^Q-N^B-N^B)₄-N^Z其中N^M為不為雙環核苷之經修飾核苷；各N^B為雙環核苷；各N^Q為非雙環核苷；且 N^Z為經修飾之核苷。

以下實施例適用於本文所述之任何核苷型態，包括核苷型態I至V。

在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸包含本文所述核苷型態之至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個或22個連續核苷。

在本文所述之任何核苷型態之某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與miR-21(SEQ ID NO：1)至少90%互補。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與(SEQ ID NO：1)至少95%互補。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與(SEQ ID NO：1)100%互補。

在本文所述之任何核苷型態之某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與miR-21互補以使得微小RNA之位置1與該寡核苷酸之3'端核苷鹼基配對。舉例而言：

在本文所述之任何核苷型態之某些實施例中，各雙環核苷獨立地選自LNA核苷、cEt核苷及ENA核苷。在某些實施例中，至少兩個雙環核苷之糖部分彼此不同。在某些實施例中，所有雙環核苷均具有彼此相同之糖部分。在某些實施例中，各雙環核苷為cEt核苷。在某些實施例中，各雙環核苷為LNA核苷。

在本文所述之任何核苷型態之某些實施例中，cEt核苷為 S-cEt核苷。在本文所述之任何核苷型態之某些實施例中，cEt核苷為R-cEt核苷。

在本文所述之任何核苷型態之某些實施例中，各非雙環核苷獨立地選自β-D-去氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2'-O-甲基核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷及2'-氟核苷。

在本文所述之任何核苷型態之某些實施例中，各非雙環核苷獨立地選自β-D-去氧核糖核苷及2'-O-甲氧基乙基核苷。

在本文所述之任何核苷型態之某些實施例中，至少兩個非雙環核苷包含彼此不同之糖部分且獨立地選自β-D-去氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2'-O-甲基核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷及2'-氟核苷。

在本文所述之任何核苷型態之某些實施例中，至少兩個非雙環核苷包含彼此不同之糖部分且獨立地選自β-D-去氧核糖核苷及2'-O-甲氧基乙基核苷。

在本文所述之任何核苷型態之某些實施例中，各非雙環核苷具有相同類型之糖部分且選自β-D-去氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2'-O-甲基核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷及2'-氟核苷。

在本文所述之任何核苷型態之某些實施例中，各非雙環核苷為β-D-去氧核糖核苷。在某些實施例中，各非雙環核苷為2'-O-甲基核苷。

在本文所述之任何核苷型態之某些實施例中，不超過3個非雙環核苷為2'-O-甲氧基乙基核苷。在某些實施例中，不超過2個非雙環核苷為2'-O-甲氧基乙基核苷。在某些實施例中，不超過1個非雙環核苷為2'-O-甲氧基乙基核苷。

在本文所述之任何核苷型態之某些實施例中，一個非雙環核苷為2'-MOE核苷且其他各非雙環核苷為β-D-去氧核糖核苷。在某些實施例中，兩個非雙環核苷為2'-O-甲氧基乙基核苷且其他各非雙環核苷為β-D-去氧核糖核苷。在某些實施例 中，三個非雙環核苷為2'-O-甲氧基乙基核苷且其他各非雙環核苷為β-D-去氧核糖核苷。

在本文所述之任何核苷型態之某些實施例中，5'最末端非雙環核苷及3'最末端非雙環核苷為2'-O-甲氧基乙基核苷且其他各非雙環核苷為β-D-去氧核糖核苷。

在X為4之任何核苷型態I之某些實施例中，各核苷R為2'-O-甲氧基乙基核苷。在X為4之核苷型態I之某些實施例中，兩個核苷R為β-D-去氧核糖核苷且兩個核苷R為2'-O-甲氧基乙基核苷。在X為4之核苷型態I之某些實施例中，三個核苷R為β-D-去氧核糖核苷且一個核苷R為2'-O-甲氧基乙基核苷。

在核苷型態I之某些實施例中，R為N^R1-N^R2-N^R3-N^R4，其中N^R1為2'-MOE核苷，N^R2為β-D-去氧核糖核苷，N^R3為β-D-去氧核糖核苷，且N^R4為β-D-去氧核糖核苷。

在核苷型態I之某些實施例中，R由四個連接之核苷N^R1-N^R2-N^R3-N^R4組成，其中N^R1為2'-O-甲氧基乙基核苷且N^R2-N^R3-N^R4各自為β-D-去氧核糖核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為2'-O-甲氧基乙基核苷。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸具有核苷鹼基序列SEQ ID NO：4。

在核苷型態I之某些實施例中，X為1且各核苷R為2'-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為2'-O-甲氧基乙基核苷；且N^Z為2'-O-甲氧基乙基核苷。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸具有核苷鹼基序列SEQ ID NO：3。

在核苷型態I之某些實施例中，X為4且各核苷R為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為2’-O-甲氧基乙基核苷；且N^Z為2’-O-甲氧基乙基核苷。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸具有核苷鹼基序列SEQ ID NO：4。

在核苷型態II之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為2’-O-甲氧基乙基核苷。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸具有核苷鹼基序列SEQ ID NO：3。

在核苷型態II之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為S-cEt核苷。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸具有核苷鹼基序列SEQ ID NO：3。

在核苷型態II之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為LNA核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為2’-O-甲氧基乙基核苷。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸具有核苷鹼基序列SEQ ID NO：3。

在核苷型態II之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為LNA核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為LNA核苷。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸具有核苷鹼基序列SEQ ID NO：3。

在核苷型態III之某些實施例中，R為不為雙環核苷之經修飾核苷；且x為1。在核苷型態III之某些實施例中，R為不為雙環核苷之經修飾核苷；x為1；且各N^Q為未經修飾之核苷。在核苷型態III之某些實施例中，R為不為雙環核苷之經修飾核苷；x為1；各N^Q為未經修飾之核苷；各N^B獨立地選自S-cEt核苷及LNA核苷；且N^Y選自β-D-去氧核糖核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷、S-cEt核苷及LNA核苷。在核苷型態III之某些實施例中，R為不為雙環核苷之經修飾核苷；x為1；且各N^Q為β-D-去氧核糖核苷。在核苷型態III之某些實施例中，R為不為雙環核苷之經修飾核苷；x為1；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；各N^B獨立地選自S-cEt核苷及LNA核苷；且N^Y選自β-D-去氧核糖核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷、S-cEt核苷及LNA核苷。 在核苷型態III之某些實施例中，R為不為雙環核苷之經修飾核苷；x為1；各N^Q為未經修飾之核苷；各N^B為S-cEt核苷；且N^Y選自β-D-去氧核糖核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷及S-cEt核苷。在核苷型態III之某些實施例中，R為不為雙環核苷之經修飾核苷；x為1；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；各N^B為S-cEt核苷；且N^Y選自β-D-去氧核糖核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷及S-cEt核苷。在某些實施例中，型態III之經修飾寡核苷酸具有核苷鹼基序列SEQ ID NO：3。

在核苷型態IV之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B選自S-cEt核苷及LNA核苷；各N^Q選自β-D-去氧核糖核苷及2’-O-甲氧基乙基核苷；N^Y選自2’-O-甲氧基乙基核苷、S-cEt核苷、LNA核苷及β-D-去氧核糖核苷；且N^Z選自2’-O-甲氧基乙基核苷、LNA核苷及S-cEt核苷。在某些實施例中，型態IV之經修飾寡核苷酸具有核苷鹼基序列SEQ ID NO：3。

在核苷型態IV之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q選自β-D-去氧核糖核苷及2’-O-甲氧基乙基核苷；N^Y選自2’-O-甲氧基乙基核苷、S-cEt核苷及β-D-去氧核糖核苷；且N^Z選自2’-O-甲氧基乙基核苷及S-cEt核苷。在某些實施例中，型態IV之經修飾寡核苷酸具有核苷鹼基序列SEQ ID NO：3。

在核苷型態IV之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；N^Y為S-cEt核苷；且N^Z為S-cEt核苷。在某些實施例中，型態IV之經修飾寡核苷酸具有核苷鹼基序列SEQ ID NO：3。

在核苷型態V之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B選自S-cEt核苷及LNA核苷；各N^Q選自β-D-去氧核糖核苷及2’-O-甲氧基乙基核苷；且N^Z選自2’-O-甲氧基乙 基核苷、LNA核苷及S-cEt核苷。在某些實施例中，型態V之經修飾寡核苷酸具有核苷鹼基序列SEQ ID NO：3。

在核苷型態V之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z選自2’-O-甲氧基乙基核苷及S-cEt核苷。在某些實施例中，型態V之經修飾寡核苷酸具有核苷鹼基序列SEQ ID NO：3。

在核苷型態V之某些實施例中，N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為2’-O-甲氧基乙基核苷。在某些實施例中，型態V之經修飾寡核苷酸具有核苷鹼基序列SEQ ID NO：3。在某些實施例中，本文提供之化合物具有如表1中所示之核苷鹼基序列及修飾。核苷修飾如下指示：之後未接下標之核苷指示β-D-去氧核糖核苷；之後接有下標「E」之核苷指示2’-MOE核苷；之後接有下標「L」之核苷為LNA核苷；之後接有下標「S」之核苷指示S-cEt核苷。各核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。上標「Me」指示核苷之鹼基上的5-甲基。

在本文所述之任何核苷型態之某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸包含核苷型態I中所述核苷型態之至少8個連接之核苷。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸包含核苷型態II中所述核苷型態之至少8個連接之核苷。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸包含核苷型態III中所述核苷型態之至少8個連接之核苷。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸包含核苷型態IV中所述核苷型態之至少8個連接之核苷。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸包含核苷型態V中所述核苷型態之至少8個連接之核苷。

在某些實施例中，具有本文所述之任何核苷型態之經修飾寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷間鍵結。在某些實施例中，各核苷間鍵結為經修飾之核苷間鍵結。在某些實施例中，經修飾之核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。

在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸具有至少一個核苷鹼基為胞嘧啶之核苷鹼基序列。在某些實施例中，至少一個胞嘧啶為5-甲基胞嘧啶。在某些實施例中，各胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶。在某些實施例中，至少一個核苷包含經修飾之核苷鹼基。

經修飾之寡核苷酸可在整個經修飾寡核苷酸之各個位置上由核酸外切酶及/或核酸內切酶裂解。該酶促裂解之產物可保留miR-21抑制活性，並因而視為活性代謝物。因此，在本文所述之方法中可使用經修飾寡核苷酸之代謝產物。

在某些實施例中，靶向miR-21之經修飾寡核苷酸具有選自表2A之核苷型態，其中N^M為不為雙環核苷之經修飾核苷； 各N^B為雙環核苷；各N^Q為非雙環核苷；且N^Z為經修飾之核苷。

在某些實施例中，靶向miR-21之經修飾寡核苷酸具有選自表2B之核苷型態，其中N^M為不為雙環核苷之經修飾核苷；各N^B為雙環核苷；各N^Q為非雙環核苷；N^Y為經修飾之核苷或未經修飾之核苷；且N^Z為經修飾之核苷。

在某些實施例中，靶向miR-21之經修飾寡核苷酸具有選自表2C之核苷型態，其中N^M為不為雙環核苷之經修飾核苷；各N^B為雙環核苷；各N^Q為非雙環核苷；且N^Z為經修飾之核苷。

在某些實施例中，靶向miR-21之經修飾寡核苷酸具有選自表3A之核苷型態及核苷鹼基序列。之後未接下標之核苷指示β-D-去氧核糖核苷。之後接有下標「E」之核苷指示2'-MOE核苷。之後接有下標「S」之核苷指示S-cEt核苷。各核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。核苷鹼基在5'位可包含或可不包含甲基。

在某些實施例中，靶向miR-21之經修飾寡核苷酸具有選自表3B之核苷型態及核苷鹼基序列。之後未接下標之核苷指示β-D-去氧核糖核苷。之後接有下標「E」之核苷指示2'-MOE核苷。之後接有下標「S」之核苷指示S-cEt核苷。各核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。核苷鹼基在5'位可包含或可不包含甲基。

在某些實施例中，靶向miR-21之經修飾寡核苷酸具有選自表3C之核苷型態及核苷鹼基序列。之後未接下標之核苷指示β-D-去氧核糖核苷。之後接有下標「E」之核苷指示2'-MOE核苷。之後接有下標「S」之核苷指示S-cEt核苷。各核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。核苷鹼基在5'位可包含或可不包含甲基。

在某些實施例中，靶向miR-21之經修飾寡核苷酸具有選自表3D之核苷型態及核苷鹼基序列。之後未接下標之核苷指示β-D-去氧核糖核苷。之後接有下標「E」之核苷指示2'-MOE核苷。之後接有下標「S」之核苷指示S-cEt核苷。各核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。核苷鹼基在5'位可包含或可不包含甲基。

在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由超過19個連接之核苷組成，且包含本文所述之核苷型態。除由該核苷型態描述之核苷外亦存在之核苷為經修飾或未經修飾之核苷。舉例而言，由21個連接之核苷組成且具有與miR-21互補之核苷鹼基序列的經修飾寡核苷酸可具有長度為19個連接之核苷的核苷型態II。另外兩個核苷可包含經修飾或未經修飾之糖部分。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由19個連接之核苷組成，且包含本文所述之任何核苷型態。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由20個連接之核苷組成，且包含本文所述之任何核苷型態。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由21個連接之核苷組成，且包含本文所述之任何核苷型態。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由22個連接之核苷組成，且包含本文所述之任何核苷型態。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由23個連接之核苷組成，且包含本文所述之任何核苷型態。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由24個連接之核苷組成，且包含本文所述之任何核苷型態。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由25個連接之核苷組成，且包含本文所述之任何核苷型態。

本發明之某些用途 調節miR-21活性

本文提供之化合物為miR-21活性之有效且具特異性之抑制劑，且因此適用於調節miR-21活性。

微小RNA結合至信使RNA並阻遏信使RNA表現。在某些情況下，抑制微小RNA之活性會導致信使RNA去阻遏，亦即信使RNA表現在RNA及/或蛋白質之層面上增加。本文提供調節miR-21調控之轉錄物表現的方法，其包括使細胞與本發明之化合物接觸，其中該化合物包含具有與miR-21互補之序列的經修飾寡核苷酸。

在某些實施例中，miR-21調控之轉錄物為YOD1，且抑制miR-21使得YOD1 mRNA之含量增加。在某些實施例中，miR-21調控之轉錄物為PPAR-α，且抑制miR-21使得PPAR-α mRNA之含量增加。在某些實施例中，miR-21調控之轉錄物為RNF167。

在某些實施例中，miR-21調控之轉錄物為SPG20。在某些實施例中，在肝臟中抑制miR-21使得SPG20 mRNA之含量增加。

在某些實施例中，在使細胞與本發明之化合物接觸後，觀測到miR-21調控之轉錄物之mRNA含量增加至至少1.5倍。在某些實施例中，在使細胞與本發明之化合物接觸後，觀測到miR-21調控之轉錄物之mRNA含量增加至至少2.0倍。在某些實施例中，微小RNA調控之轉錄物之mRNA含量增加至至少2.5倍。在某些實施例中，微小RNA調控之轉錄物之mRNA含量增加至至少3.0倍。在某些實施例中，微小RNA調控之轉錄物之mRNA含量增加至至少3.5倍。在某些實施例中，微小RNA調控之轉錄物之mRNA含量增加至至少4.0倍。在某些實施例中，微小RNA調控之轉錄物之mRNA含量增加至至 少4.5倍。在某些實施例中，微小RNA調控之轉錄物之mRNA含量增加至至少5.0倍。

已知某些微小RNA靶向若干信使RNA，在一些情況下，靶向數百種信使RNA。抑制單一微小RNA之活性可使得許多微小RNA標靶之表現發生可偵測之變化。本文提供調節多種由miR-21調控之轉錄物的方法，其包括抑制miR-21之活性，其中發生廣泛基因表現變化。

在某些實施例中，在用本發明之化合物抑制miR-21後可觀測到表型變化。該等表型變化可在miR-21調控之轉錄物之表現有或無可偵測變化之情況下出現。

纖維增生性病症

器官或組織中對損害或損傷之正常生理反應涉及受損組織修復，其為存活所必需之基本生物學過程。在修復過程中，在外來物質、細菌及受損組織消除後，纖維母細胞遷移至損傷部位以沈積新的細胞外基質，接著作為組織重塑期之一部分，在結構上組織化。

纖維母細胞為結締組織中存在之最常見細胞，且負責合成網硬蛋白(reticulin)及其他支撐細胞外基質且在正常傷口癒合中起重要作用之彈性纖維(Sempowski,G.D.等人，2002.Wound Repair Regeneration.3：120-131)。纖維母細胞負責沈積膠原蛋白，此為修復受損組織及恢復其結構及功能所必需。在傷口癒合過程中，活化之纖維母細胞轉型成肌纖維母細胞，其為膠原蛋白分泌性α-SMA+纖維母細胞。在傷口癒合過程之最初階段，肌纖維母細胞產生基質金屬蛋白酶，其破壞基底膜並且允許發炎性細胞有效募集至損傷部位。在損傷修復之稍後階段中，肌纖維母細胞促進傷口收縮，該過程為傷口邊緣朝向傷口中心遷移之過程。因此，纖維母細胞活性對正常癒合過程而言必不可少。

參與正常損傷修復過程之纖維母細胞可來源於局部間質細胞，自骨髓募集，或由上皮-間質轉化產生。上皮-間質轉化(EMT)描述細胞表型之一系列快速變化(Kalluri,R.及Neilson,E.G.2003.J.Clin.Invest.112：1776-1784)，期間靜態上皮細胞喪失細胞-細胞接觸，獲取間質特徵並且表現出遷移性表型。常駐纖維母細胞、浸潤纖維細胞或外膜細胞樣細胞亦可參與損傷修復過程。

在一些情況下，組織修復過程過度進行，從而導致細胞外基質(ECM)組分過度積聚及ECM實質性重塑，引起永久性纖維變性瘢痕形成。此過量纖維結締組織之形成(稱為纖維化之過程)造成組織架構之異常變化且干擾正常器官功能。

纖維化可在身體之任何部分發生，並且可由多種物理性、代謝性、缺血性、感染性、發炎性或免疫性損傷引起。儘管纖維化之解剖學位置、起因及臨床表現可多種多樣，但所有類型之纖維化存在共同之重要病理學特徵。與發生纖維化之位置無關，纖維變性過程涉及促纖維變性細胞激素分泌及活化、間質細胞群體擴增及活化以及細胞外基質合成及組織化，並且最終導致正常組織破壞。若不加治療，則纖維化可導致心臟、肺、腎、肝臟、眼睛及皮膚以及其他組織之多種病狀。

如本文所證明，在纖維化模型中抑制miR-21會使膠原蛋白沈積減少。因此，本文提供用於治療纖維化、預防及/或延遲纖維化發作之組合物及方法，其包括向個體投與包含經修飾寡核苷酸之化合物，其中該經修飾寡核苷酸與miR-21互補。該個體可能已接受到纖維化之診斷，可能具有產生纖維化之風險，或可能懷疑患有纖維化。

在某些實施例中，患有纖維化之個體患有腎纖維化、肺纖維化、肝纖維化、心臟纖維化、皮膚纖維化、年齡相關性纖維化、脾纖維化、硬皮病或移植後纖維化。

腎臟之許多疾病或異常之特徵為存在纖維化。因而，本文提供之化合物適用於治療、改善特徵在於存在纖維化之任何腎臟疾病、預防及/或延遲其發作。在某些實施例中，患有纖維化之個體患有腎臟疾病或病狀。在某些實施例中，具有產生纖維化之風險的個體患有腎臟疾病或病狀。在某些實施例中，懷疑患有纖維化之個體患有腎臟疾病或病狀。因此，本文提供用於治療患有纖維化、具有產生纖維化之風險或懷疑患有纖維化之個體的方法，其中該個體患有腎臟疾病或病狀。腎臟疾病或病狀可為(但不限於)以下一或多者：腎絲球疾病、腎小管間質性纖維化、IgA腎病、間質性纖維化/腎小管萎縮、腎絲球硬化、腎絲球腎炎、糖尿病、特發性局部區段性腎絲球硬化、膜性腎病、塌陷性腎絲球病、慢性復發性腎臟感染、糖尿病、糖尿病性腎病、慢性復發性腎臟感染、高血壓、全身性高血壓、腎絲球內高血壓或末期腎病。

慢性腎病之特徵可在於存在纖維化。因此，在某些實施例中，腎臟疾病或病狀為慢性腎病。在某些實施例中，個體具有產生慢性腎病之風險。在某些實施例中，患有急性腎損傷之個體具有產生纖維化及/或慢性腎病之風險。因此，本文提供之組合物及方法可投與患有急性腎損傷之個體以預防或延遲纖維化及/或慢性腎病之發作。

在某些實施例中，患有纖維化之個體患有由腎臟之急性或反復性創傷引起之腎纖維化。創傷可由手術、化學療法、放射治療、同種異體移植排斥反應、慢性移植排斥反應及急性移植排斥反應導致。

在某些實施例中，腎纖維化可由暴露於可能在短期或長期暴露後具腎毒性之任何藥劑引起。該等藥劑包括醫藥藥劑，包括(但不限於)止痛劑、非類固醇消炎藥、抗生素、鋰、環孢菌素、美沙拉嗪(mesalazine)、造影介質、化學治療劑；職業性毒 素，包括(但不限於)重金屬；及環境毒素，包括(但不限於)重金屬(例如鎘、氯化汞)或植物腎毒素(例如馬兜鈴酸)。

肝臟之許多疾病或異常之特徵為存在纖維化。因此，在某些實施例中，患有纖維化之個體患有肝臟疾病或病狀。在某些實施例中，具有產生纖維化之風險的個體患有肝臟疾病或病狀。在某些實施例中，懷疑患有纖維化之個體患有肝臟疾病或病狀。因此，本文提供用於治療患有纖維化、具有產生纖維化之風險或懷疑患有纖維化之個體的方法，其中該個體患有肝臟疾病或病狀。在某些實施例中，肝臟疾病或病狀可為(但不限於)以下一或多者：慢性肝損傷、肝炎病毒感染(包括C型肝炎病毒感染及B型肝炎病毒感染)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、酒精性肝病(ALD)、酒精性脂肪變性肝炎、橋接纖維化或肝硬化。在某些實施例中，肝臟疾病或病狀與暴露於毒性化學品相關。在某些實施例中，肝臟疾病或病狀由暴露於醫藥藥劑(例如乙醯胺苯酚)引起。在某些實施例中，接受化學療法之個體具有肝纖維化及/或慢性肝損傷之風險。

在肺之許多疾病或異常中可存在纖維化。因此，在某些實施例中，患有纖維化之個體患有肺部疾病或病狀。在某些實施例中，具有產生纖維化之風險的個體患有肺部疾病或病狀。在某些實施例中，懷疑患有纖維化之個體患有肺部疾病或病狀。因此，本文提供用於治療患有纖維化、具有產生纖維化之風險或懷疑患有纖維化之個體的方法，其中該個體患有肺部疾病或病狀。在某些實施例中，肺部疾病或病狀可為(但不限於)以下一或多者：肺纖維化、特發性肺纖維化或慢性阻塞性肺病。在某些實施例中，肺纖維化可由吸入微粒物質，諸如矽膠、石棉、空氣污染物或捲煙煙氣中存在之微粒物質引起。

在某些實施例中，纖維化為心臟纖維化。

在某些實施例中，纖維化為皮膚纖維化。在某些實施例中，纖維化為年齡相關性纖維化。在某些實施例中，纖維化為脾纖維化。

硬皮病為特徵在於纖維化以及其他症狀之慢性自體免疫性疾病。在某些實施例中，患有纖維化之個體患有硬皮病。在某些實施例中，患有硬皮病之個體除皮膚之纖維化外亦在內部器官中具有纖維化。

纖維化常發生於移植之器官中，從而導致器官功能喪失並最終引起所移植器官之慢性排斥反應。預防或治療所移植器官之纖維化可預防或延遲所移植器官之慢性排斥反應，或換言之，可延長所移植器官之功能。因此，在某些實施例中，個體患有移植後纖維化。在某些實施例中，移植後纖維化為腎臟移植後纖維化。在某些實施例中，移植相關性纖維化為肝臟移植後纖維化。在某些實施例中，在移植之前投與本文所述之化合物。在某些實施例中，本文所述之化合物與移植同時投與。在某些實施例中，在移植之後投與本文所述之化合物。

本文提供治療患有纖維增生性病症之個體的方法。在某些實施例中，該等方法包括向患有或懷疑患有纖維增生性病症之個體投與具有與miRNA或其前驅體互補之核苷鹼基序列的經修飾寡核苷酸。在某些實施例中，miRNA為miR-21。

癌症及轉移

已在眾多類型之癌症中證明異常高的miR-21表現。此外，在活體外及活體內模型中抑制miR-21已證明miR-21之抑制劑適用於抑制支持癌細胞生長之細胞過程以及適用於治療癌症。

因此，在某些實施例中，本文提供之化合物用於治療、預防、改善癌症及/或延遲癌症發作。在某些實施例中，癌症為肝癌、乳癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌、子宮頸癌、白血病、淋 巴瘤、腦癌、食道癌、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、腎癌、黑素瘤、骨髓瘤、口腔癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、胃癌、膀胱癌、甲狀腺癌或睾丸癌。在某些實施例中，肝癌為肝細胞癌。在某些實施例中，肝癌係歸因於起源於身體另一部分之癌症，例如骨癌、結腸癌或乳癌之轉移。

在某些實施例中，在肝癌中，miR-21升高且一或多種由miR-21調控之轉錄物之含量降低。在某些實施例中，降低之miR-21調控之轉錄物為SPG20。

在某些實施例中，肝癌為肝細胞癌(HCC)。通常藉由肝臟成像測試對肝細胞癌作出診斷，諸如腹部超音波、螺旋電腦斷層攝影(CT)掃描或三相CT掃描。該等成像測試可與量測α-胎蛋白之血液含量及/或消-γ-羧基凝血酶原之血液含量結合進行。在某些個體中，可使用MRI來替代CT掃描。肝臟成像測試允許評定腫瘤尺寸、數目、位置、肝外轉移、開放性及/或腫瘤對肝臟之動脈及靜脈的侵襲。此評定有助於決定適當之治療性或姑息性介入模式。最終診斷通常藉由針穿刺活組織檢查及組織病理學檢查來證實。

因此，在某些實施例中，肝癌根據偵測腫瘤之電腦斷層攝影(CT)掃描進行偵測。在某些實施例中，肝癌根據磁共振成像(MRI)進行偵測。在某些實施例中，HCC表徵為單一原發性腫瘤。在某些實施例中，HCC表徵為多個原發性腫瘤。在某些實施例中，HCC表徵為具有浸潤性生長模式之界定不良原發性腫瘤。在某些實施例中，HCC為具血管侵襲性之單一原發性腫瘤。在某些實施例中，HCC表徵為具血管侵襲性之多個原發性腫瘤。在某些實施例中，HCC已轉移至一或多個淋巴結。在某些該等實施例中，淋巴結為局部淋巴結。在某些實施例中，HCC已轉移至一或多個遠端組織。在某些實施例中，HCC已轉移至 肝臟之其他區域、門靜脈、淋巴結、腎上腺、骨或肺部。在某些實施例中，存在纖維化。

已採用多種系統來預測HCC之預後，包括TNM系統、奧田系統(Okuda system)、巴塞羅那臨床肝癌(Barcelona Clinic Liver Cancer；BCLC)及CLIP評分。此等系統各自併有四種已公認為存活之重要決定因素的特徵：潛在肝臟疾病之嚴重性、腫瘤尺寸、腫瘤擴展至相鄰結構中之程度及轉移之存在。TNM系統將HCC分類為第I期、第II期、第III期、第IV期或第V期。BCLC將HCC分類為A1期、A2期、A3期、A4期、B期、C期及D期，且包括對Child-Pugh評分之考慮。

在某些實施例中，肝癌分類為第1期、第2期、第3A期、第3B期、第3C期或第4期。第1期之特徵在於癌症之尺寸不大於2cm並且尚未開始擴散。在第2期，癌症正侵襲肝臟中之血管，或者肝臟中存在多於一個腫瘤。在第3A期，癌症之尺寸大於5cm或已擴散至肝臟附近之血管。在第3B期，癌症已擴散至附近器官，諸如腸或胃，但尚未擴散至淋巴結。在第3C期，癌症可具有任何尺寸並且已擴散至附近之淋巴結。在第4期，癌症已擴散至身體中更加遠離肝臟之部分，諸如肺部。

可使用個體血液中之生物標記來增強肝癌之診斷、對肝癌進行分期或產生關於存活之預後。該等生物標記包括血液腫瘤生物標記，諸如α-胎蛋白及消-γ羧基凝血酶原。在某些該等實施例中，個體之血液α-胎蛋白升高。在某些該等實施例中，個體之血液消-γ羧基凝血酶原升高。

患有肝癌之個體亦可能罹患肝功能異常。肝功能可藉由肝功能測試進行評定，該等肝功能測試尤其量測肝轉胺酶之血液含量。在某些實施例中，肝功能異常之個體之血液肝轉胺酶升高。血液肝轉胺酶包括丙胺酸轉胺酶(ALT)及天冬胺酸轉胺酶 (AST)。在某些實施例中，肝功能異常之個體之血液膽紅素升高。在某些實施例中，個體具有異常血液白蛋白含量。

在某些實施例中，個體之肝功能藉由Child-Pugh分類系統來評定，該Child-Pugh分類系統定義肝功能之三個類別。在此分類系統中，對以下五個類別中之一者的量測結果指定分數：膽紅素含量、白蛋白含量、凝血酶原時間、腹水及腦病。將存在以下各特徵每一者指定一分：血液膽紅素低於2.0mg/dl；血液白蛋白高於3.5mg/dl；凝血酶原時間低於1.7國際標準化比值(INR)；不存在腹水；或不存在腦病。將存在以下各特徵每一者指定兩分：血液膽紅素為2-3mg/dl；血液膽紅素為3.5至2.8mg/dl；凝血酶原時間為1.7-2.3INR；腹水輕度至中度；或腦病輕度。將存在以下各特徵每一者指定三分：膽紅素高於3.0mg/dl；血液白蛋白低於2.8mg/dl；凝血酶原時間高於2.3INR；腹水重度至難治；或腦病重度。將得分相加，且得分5-6分指定為類別A，得分7-9分指定為類別B，且得分10-15分指定為類別C。

患有肝癌之個體可能先前已罹患或可能當前正罹患慢性C型肝炎感染、慢性B型肝炎感染、非酒精性脂肪性肝病或肝硬化。患有伴有C型肝炎感染、B型肝炎感染、非酒精性脂肪性肝病或肝硬化及/或由其引起之肝癌的個體可藉由本文所述之方法治療。

個體對治療之反應可藉由與診斷肝癌所用測試類似之測試來評估，包括(但不限於)CT掃描、MRI及針穿刺活組織檢查。對治療之反應亦可藉由量測血液中之生物標記以與治療前之生物標記含量比較來評定。

miR-21亦與轉移過程相關。雖然EMT確實在正常生理過程中存在，但已將EMT與轉移過程聯繫起來。已在若干研究中研究EMT在腫瘤進展中之相關性(Greenburg,G.及Hay,E. 1986.Dev.Biol.115：363-379；Boyer,B.等人，1989.J.Cell.Biol.109：1495-1509；Uehara,Y.等人，1992.J.Cell.Biol.117：889-894)。上皮細胞經由整合素(integrin)與稱為基底膜之下層細胞外基質(ECM)保持在一起。另一方面，間質細胞能夠侵入並移動穿過ECM之三維結構。因此，EMT至少表面上類似於正常黏附細胞轉型為轉移表型。

本文提供治療、預防、改善轉移及/或延遲轉移發作的方法。轉移可由癌細胞自任何癌症原發部位遷移至任何癌症繼發部位引起。

急性腎損傷

急性腎損傷為腎功能快速喪失，其可能由多種原因導致，包括低血容量、暴露於毒素及尿路梗阻。已在急性腎損傷模型中觀測到miR-21升高。因此，在某些實施例中，本文提供之化合物用於治療、預防、改善急性腎損傷及/或延遲急性腎損傷發作。在某些實施例中，急性腎損傷可為暴露於毒性物質之結果，該等毒性物質為諸如環境毒素或癌症治療劑。急性腎損傷可由對腎臟本身之損害引起，例如在諸如腎絲球腎炎、急性腎小管壞死及急性間質性腎炎之病狀中。在某些實施例中，急性腎損傷由尿路阻塞引起，諸如與良性前列腺增生、腎結石、尿導管阻塞、膀胱結石、膀胱、輸尿管或腎臟惡性疾病有關之尿路阻塞。在某些實施例中，急性腎損傷可發展為纖維化及/或慢性腎病。因此，在一些實施例中，將本文提供之化合物投與患有急性腎損傷之個體以預防或延遲纖維化及/或慢性腎病之發作。在一些實施例中，將本文提供之化合物投與個體以增強自急性腎損傷之恢復。

心臟病

已在人類心臟病中發現miR-21表現升高，並且在相關動物模型中抑制miR-21已展現出使心臟纖維化及心臟功能得到改善。因此，在某些實施例中，本文提供之化合物用於治療、預防、改善一或多種心臟病及/或延遲其發作。在某些實施例中，心臟病為心臟纖維化、心臟增大、心臟肥大、心臟擴張、肥厚型心肌病、心臟衰竭、心肌梗塞後重塑、心肌梗塞、心肌病(例如肥厚型心肌病、限制型心肌病、擴張型心肌病(DCM)、特發性擴張型心肌病或伴有心律不整之擴張型心肌病)、舒張性心臟衰竭、慢性心房纖維性顫動、原發性肺循環血壓過高、急性呼吸窘迫症候群、布魯戈登症候群(brugada syndrome)、進行性心臟傳導疾病、尿毒症性心包炎、蒽環黴素心肌病(anthracycline cardiomyopathy)、動脈纖維化、輻射後淋巴纖維化、類肉瘤病、硬皮病、心內膜彈性纖維增生病、血清素激導性過度(serotonergic excess)、心臟瓣膜病、心房纖維化、心房纖維性顫動、二尖瓣病、高血壓、慢性心室功能不全、壓力及容量超負荷或心肌纖維化。

細胞過程

本文提供用於減少或防止纖維母細胞增殖或活化之組合物及方法。本文亦提供用於抑制細胞外基質合成的組合物及方法，該合成包括(但不限於)膠原蛋白、纖維結合蛋白、膠原蛋白酶或金屬蛋白酶組織抑制因子合成。

本文提供調節與上皮-間質轉化(EMT)相關之細胞過程之方法。該等方法包括使上皮細胞與由經修飾之寡核苷酸組成之化合物接觸，其中經修飾之寡核苷酸與miR-21互補。在某些實施例中，該接觸會延遲上皮細胞向纖維母細胞轉化。在某些實施例中，該接觸會阻止上皮細胞轉化為纖維母細胞。

在某些實施例中，本文提供之化合物可阻止、減緩或減少 癌細胞增殖。在某些實施例中，本文提供之化合物可在癌細胞中誘導細胞凋亡。在某些實施例中，本文提供之化合物可減少癌細胞存活。

在某些實施例中，上皮細胞為癌細胞。在某些實施例中，接觸延遲癌細胞之轉移。在某些實施例中，接觸阻止癌細胞之轉移。

某些臨床結果

在某些實施例中，投與本文提供之化合物或方法會對個體產生一或多種臨床上合意之結果。該等改善可用於確定個體對治療產生反應之程度。

在某些實施例中，臨床上合意之結果為纖維化改善。在某些實施例中，臨床上合意之結果為纖維化進一步進展減緩。在某些實施例中，臨床上合意之結果為纖維化停止進一步進展。在某些實施例中，臨床上合意之結果為纖維化減少。在某些實施例中，臨床上合意之結果為患有纖維化之器官中的膠原蛋白含量降低。

在某些實施例中，臨床上合意之結果為任何器官或組織中之纖維化改善。在某些實施例中，臨床上合意之結果為纖維化進一步進展減緩。在某些實施例中，臨床上合意之結果為纖維化停止進一步進展。在某些實施例中，臨床上合意之結果為纖維化減少。在某些實施例中，臨床上合意之結果為受侵害器官中之膠原蛋白含量降低。

在某些實施例中，臨床上合意之結果為腎功能改善。腎功能可藉由通常在臨床配置中進行之一或多種已知方法來評定，該等方法包括(但不限於)：量測個體血液中之血液尿素氮；量測個體血液中之肌酸酐；量測個體之肌酸酐清除率；量測個體之蛋白尿；量測個體之微白蛋白：肌酸酐比率；量測個體之尿 排泄量；量測尿液中之腎損傷分子-1(KIM-1)mRNA含量；及/或量測尿液中之成簇蛋白(clusterin)含量。

在某些實施例中，臨床上合意之結果為肝功能改善。肝功能可藉由通常在臨床配置中進行之一或多種已知方法來評定，該等方法包括(但不限於)：量測個體血液中之丙胺酸轉胺酶含量；量測個體血液中之天冬胺酸轉胺酶含量；量測個體血液中之膽紅素含量；量測個體血液中之白蛋白含量；量測個體之凝血酶原時間；量測個體之腹水；及/或量測個體之腦病。

在某些實施例中，臨床上合意之結果為患有肺纖維化之個體之肺功能改善。在某些實施例中，個體患有特發性肺纖維化。肺功能可藉由通常在臨床配置中進行之一或多種已知方法來評定，該等方法包括(但不限於)：量測個體之肺活量；量測個體之用力肺活量；量測個體之一秒內用力呼氣量；量測個體之峰值呼氣流速；量測個體之用力呼氣流量；量測個體之最大隨意通氣量；測定個體之一秒內用力呼氣量與用力肺活量之比率；量測個體之通氣/灌注比率；量測個體之氮氣廓清；量測個體一或多個肺中之絕對空氣容積；及投與6分鐘步行測試。

在某些實施例中，臨床上合意之結果為患有心臟纖維化之個體之心臟功能改善。心臟功能可藉由通常在臨床配置中進行之一或多種已知方法來評定，該等方法包括(但不限於)：量測個體之心輸出量；量測個體之心搏排血量；量測個體之平均收縮期射血率；量測個體之收縮期血壓；量測個體之左心室射血分數；測定個體之心搏指數；測定個體之心臟指數；量測個體之左心室縮短百分率；量測個體之周徑纖維平均縮短速度；量測個體之左心室流入血流速度圖；量測個體之肺靜脈血流速度圖；量測個體二尖瓣環之舒張早期峰值速度。

在某些實施例中，臨床上合意之結果為患有癌症之個體之腫瘤數減少及/或腫瘤尺寸減小。在某些實施例中，臨床上合 意之結果為患有癌症之個體之癌細胞數減少。其他臨床上合意之結果包括個體之總體存活時間延長及/或個體之無進展存活時間延長。在某些實施例中，投與本文提供之化合物可防止腫瘤尺寸及/或腫瘤數增加。在某些實施例中，投與本文提供之化合物可預防轉移性進展。在某些實施例中，投與本文提供之化合物可減緩或阻止轉移性進展。在某些實施例中，投與本文提供之化合物可預防腫瘤復發。在某些實施例中，投與本文提供之化合物可預防腫瘤轉移復發。

某些合意之臨床結果可藉由量測血液生物標記來評定。在某些實施例中，投與本文提供之化合物可使得血液α-胎蛋白及/或血液消-γ羧基凝血酶原降低。此外，投與本文提供之化合物可使得肝功能得到改善，如由血液ALT及/或AST含量降低所證明。

某些其他療法

對纖維化或本文列出之任何病狀之治療可包含一種以上療法。因此，在某些實施例中，本文提供治療患有或懷疑患有纖維化之個體的方法，其包括除投與具有與miR-21互補之核苷鹼基序列之經修飾寡核苷酸外亦投與至少一種療法。

在某些實施例中，至少一種其他療法包含醫藥藥劑。

在某些實施例中，醫藥藥劑包括消炎劑。在某些實施例中，消炎劑為類固醇消炎劑。在某些實施例中，類固醇消炎劑為皮質類固醇。在某些實施例中，皮質類固醇為強的松(prednisone)。在某些實施例中，消炎劑為非類固醇消炎藥。在某些實施例中，非類固醇消炎劑為布洛芬(ibuprofen)、COX-I抑制劑或COX-2抑制劑。

在某些實施例中，醫藥藥劑包括免疫抑制劑。在某些實施例中，免疫抑制劑為皮質類固醇、環磷醯胺(cyclophosphamide) 或黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)。

在某些實施例中，醫藥藥劑包括抗糖尿病劑。抗糖尿病劑包括(但不限於)雙胍、葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素、磺醯脲及噻唑啶二酮。

在某些實施例中，醫藥藥劑包括血管緊張素II受體阻斷劑(ARB)。在某些實施例中，血管緊張素II受體阻斷劑為坎地沙坦(candesartan)、伊貝沙坦(irbesartan)、奧美沙坦(olmesartan)、洛沙坦(losartan)、纈沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisartan)或依普沙坦(eprosartan)。

在某些實施例中，醫藥藥劑包括(但不限於)利尿劑(例如螺內酯(sprionolactone)、依普利酮(eplerenone)、呋喃苯胺酸(furosemide))、收縮影響劑(inotrope)(例如多巴酚丁胺(dobutamine)、米力農(milrinone))、地高辛(digoxin)、血管舒張藥、血管緊張素II轉化酶(ACE)抑制劑(例如為卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、賴諾普利(lisinopril)、貝那普利(benazepril)、喹那普利(quinapril)、福辛普利(fosinopril)及雷米普利(ramipril))、鈣通道阻斷劑、異山梨醇二硝酸酯、肼屈嗪(hydralazine)、硝酸酯(例如異山梨醇單硝酸酯、異山梨醇二硝酸酯)、肼屈嗪、β-阻斷劑(例如卡維地洛(carvedilol)、美托洛爾(metoprolol))及利鈉肽(例如奈西利肽(nesiritide))。

在某些實施例中，醫藥藥劑包括類肝素。在某些實施例中，類肝素為戊聚醣多硫酸酯(pentosan polysulfate)。

在某些實施例中，醫藥藥劑為阻斷對纖維發生信號之一或多種反應的醫藥藥劑。

在某些實施例中，醫藥藥劑為抗結締組織生長因子療法。在某些實施例中，抗CTGF療法為針對CTGF之單株抗體。

在某些實施例中，其他療法可為增強身體免疫系統之醫藥藥劑，包括低劑量環磷醯胺、胸腺刺激素、維生素及營養補充 劑(例如抗氧化劑，包括維生素A、C、E、β-胡蘿蔔素、鋅、硒、麩胱甘肽、輔酶Q-10及紫花馬蘭菊(echinacea))，以及疫苗，例如免疫刺激性複合物(ISCOM)，其包含組合抗原之多聚呈現形式與佐劑之疫苗調配物。

在某些實施例中，其他療法選用於治療或改善本發明之一或多種醫藥組合物之副作用。該等副作用包括(但不限於)注射部位反應、肝功能測試異常、腎功能異常、肝中毒、腎中毒、中樞神經系統異常及肌病。舉例而言，血清中之轉胺酶含量升高可指示肝中毒或肝功能異常。舉例而言，膽紅素增加可指示肝中毒或肝功能異常。

其他醫藥藥劑之其他實例包括(但不限於)：免疫球蛋白，包括(但不限於)靜脈內免疫球蛋白(IVIg)；止痛劑(例如乙醯胺苯酚(acetaminophen))；水楊酸鹽；抗生素；抗病毒劑；抗真菌劑；腎上腺素激導性調節劑；激素(例如同化類固醇、雄激素、雌激素、降血鈣素、孕酮、生長抑素及甲狀腺激素)；免疫調節劑；肌肉鬆弛劑；抗組織胺劑；骨質疏鬆劑(例如雙膦酸鹽、降血鈣素及雌激素)；前列腺素、抗贅生物劑；精神治療劑；鎮靜劑；毒葛或毒漆樹產物；抗體；及疫苗。

癌症治療通常包含一種以上療法。因此，在某些實施例中，本發明提供減少或預防轉移之方法，其包括向個體投與包含經修飾之寡核苷酸之化合物，其中經修飾之寡核苷酸與miR-21互補，及投與作為抗癌療法之至少一種其他療法。

在某些實施例中，抗癌療法為化學療法。適合化學治療劑包括多西紫杉醇(docetaxel)、環磷醯胺、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲胺蝶呤(methotrexate)、長春花鹼(vinblastine)、順鉑(cisplatin)、5-氟尿嘧啶、吉西他濱(gemcitabine)、小紅莓(doxorubicin)、絲裂黴素C(mitomycin c)、索拉菲尼(sorafenib)、依託泊苷(etoposide)、卡鉑(carboplatin)、表柔比星(epirubicin)、 伊立替康(irinotecan)及奧沙利鉑(oxaliplatin)。其他適合化學治療劑包括除本文所提供之靶向miR-21之組合物以外的用於治療癌症之寡聚化合物。

在某些實施例中，抗癌療法為放射療法。在某些實施例中，抗癌療法為手術切除腫瘤。在某些實施例中，抗癌療法為DNA損傷劑、增殖抑制劑、抗葉酸劑、生長因子受體抑制劑、抗血管生成劑、受體酪胺酸激酶抑制劑、激酶抑制劑、生長因子抑制劑或細胞毒性劑。

在某些實施例中，DNA損傷劑為1,3-雙(2-氯乙基)-1-亞硝基脲、白消安(busulfan)、卡鉑、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑、環磷醯胺、達卡巴嗪(dacarbazine)、道諾黴素(daunorubicin)、小紅莓、表柔比星、依託泊苷、伊達比星(idarubicin)、異環磷醯胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥(mechlorethamine)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C、米托蒽醌(mitoxantrone)、奧沙利鉑、替莫唑胺(temozolomide)或拓撲替康(topotecan)。

在某些實施例中，抗葉酸劑為甲胺蝶呤、胺基喋呤(aminopterin)、胸苷酸合酶、絲胺酸羥甲基轉移酶、葉醯聚麩胺醯基合成酶(folyilpolyglutamyl synthetase)、g-麩胺醯基水解酶、甘胺醯胺-核糖核苷酸轉甲醯基酶、甲醯四氫葉酸、胺基-咪唑-甲醯胺-核糖核苷酸轉甲醯基酶、5-氟尿嘧啶或葉酸轉運體。

在某些實施例中，生長因子受體為埃羅替尼(erlotinib)或吉非替尼(gefitinib)。

在某些實施例中，血管生成抑制劑為貝伐單抗(bevacizumab)、沙利度胺(thalidomide)、羧醯胺基三唑、TNP-470、CM101、IFN-α、血小板因子-4、蘇拉明(suramin)、SU5416、血小板反應蛋白(thrombospondin)、VEGFR拮抗劑、 軟骨源性血管生成抑制因子、基質金屬蛋白酶抑制劑、血管生成抑制素(angiostatin)、內皮抑素(endostatin)、2-甲氧基雌二醇、替可加蘭(tecogalan)、四硫鉬酸鹽、催乳激素或利諾胺(linomide)。

在某些實施例中，激酶抑制劑為貝伐單抗、BIBW 2992、西妥昔單抗(cetuximab)、伊馬替尼(imatinib)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、吉非替尼、蘭尼單抗(ranibizumab)、哌加他尼(pegaptanib)、索拉菲尼、達沙替尼(dasatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、尼羅替尼(nilotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、帕尼單抗(panitumumab)、凡德他尼(vandetanib)、E7080、帕唑帕尼(pazopanib)、莫立替尼(mubritinib)或福馬替尼(fostamatinib)。

某些微小RNA核苷鹼基序列

具有本文所述之核苷型態之經修飾寡核苷酸具有與miR-21(SEQ ID NO：1)或其前驅體(SEQ ID NO：2)互補之核苷鹼基序列。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之各核苷鹼基能夠與miR-21或其前驅體之核苷鹼基序列中各相應位置處之核苷鹼基進行鹼基配對。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列相對於miR-21之核苷鹼基序列或其前驅體序列可具有一或多個失配鹼基對，並且仍能夠與其目標序列雜交。

因為miR-21序列含於miR-21前驅體序列內，所以具有與miR-21互補之核苷鹼基序列之經修飾寡核苷酸亦與miR-21前驅體之區互補。

在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由等於miR-21長度之數目的連接之核苷組成。

在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之連接之核苷的數目小於miR-21之長度。具有小於miR-21長度之數目的連接之核苷 之經修飾寡核苷酸在該經修飾寡核苷酸之各核苷鹼基與miR-21相應位置上之各核苷鹼基互補的情況下係視為具有與miR-21序列之區完全互補的核苷鹼基序列之經修飾寡核苷酸。舉例而言，由19個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸在各核苷鹼基與長度為22個核苷鹼基之miR-21之相應位置互補的情況下與miR-21之具有19個核苷鹼基之區完全互補。該經修飾寡核苷酸與miR-21之整個長度具有約86%總體互補性，並且與miR-21之具有19個核苷鹼基之部分具有100%互補性。

在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸包含與種子序列互補之核苷鹼基序列，亦即經修飾之寡核苷酸包含種子匹配序列。在某些實施例中，種子序列為六聚體種子序列。在某些該等實施例中，種子序列為miR-21之核苷鹼基1-6。在某些該等實施例中，種子序列為miR-21之核苷鹼基2-7。在某些該等實施例中，種子序列為miR-21之核苷鹼基3-8。在某些實施例中，種子序列為七聚體種子序列。在某些該等實施例中，七聚體種子序列為miR-21之核苷鹼基1-7。在某些該等實施例中，七聚體種子序列為miR-21之核苷鹼基2-8。在某些實施例中，種子序列為八聚體種子序列。在某些該等實施例中，八聚體種子序列為miR-21之核苷鹼基1-8。在某些實施例中，八聚體種子序列為miR-21之核苷鹼基2-9。

在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸具有相對於miR-21或其前驅體之核苷鹼基序列具有一處失配之核苷鹼基序列。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸具有相對於miR-21或其前驅體之核苷鹼基序列具有兩處失配之核苷鹼基序列。在某些該等實施例中，經修飾之寡核苷酸具有相對於miR-21或其前驅體之核苷鹼基序列具有不超過兩處失配之核苷鹼基序列。在某些該等實施例中，失配之核苷鹼基為連續的。在某些該等實施例中，失配之核苷鹼基不連續。 在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之連接之核苷的數目大於miR-21之長度。在某些該等實施例中，額外核苷之核苷鹼基與miR-21莖-環序列之核苷鹼基互補。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之連接之核苷的數目比miR-21之長度多一個。在某些該等實施例中，額外核苷位於寡核苷酸之5'端。在某些該等實施例中，額外核苷位於寡核苷酸之3'端。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之連接之核苷的數目比miR-21之長度多兩個。在某些該等實施例中，兩個額外核苷位於寡核苷酸之5'端。在某些該等實施例中，兩個額外核苷位於寡核苷酸之3'端。在某些該等實施例中，一個額外核苷位於寡核苷酸之5'端且一個額外核苷位於寡核苷酸之3'端。在某些實施例中，寡核苷酸之區可與miR-21之核苷鹼基序列完全互補，但整個經修飾寡核苷酸並不與miR-21完全互補。舉例而言，由24個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸在核苷1至23之核苷鹼基各自與長度為22個核苷鹼基之miR-21之相應位置互補的情況下具有與miR-21之核苷鹼基序列完全互補之具22個核苷之部分且與miR-21之核苷鹼基序列具有約96%總體互補性。

某些經修飾之寡核苷酸

在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由8至30個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由15至30個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由15至25個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由15至19個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由15至16個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由19至24個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由21至24個連接之核苷組成。

在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由8個連接之核苷組 成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由9個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由10個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由11個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由12個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由13個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由14個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由15個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由16個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由17個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由18個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由19個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由20個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由21個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由22個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由23個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由24個連接之核苷組成。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸由25個連接之核苷組成。

某些修飾

在某些實施例中，本文提供之寡核苷酸可包含一或多處核苷鹼基、糖及/或核苷間鍵結修飾，且因此為經修飾之寡核苷酸。經修飾之核苷鹼基、糖及/或核苷間鍵結可因諸如細胞吸收增強、對其他寡核苷酸或核酸目標之親和力增強及在核酸酶存在下之穩定性增強的合意特性而優先於未經修飾形式加以選擇。

在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸包含一或多個經修飾之核苷。在某些該等實施例中，經修飾之核苷為穩定化核苷。 穩定化核苷之實例為糖經修飾之核苷。

在某些實施例中，經修飾之核苷為糖經修飾之核苷。在某些該等實施例中，糖經修飾之核苷可進一步包含天然或經修飾之雜環鹼基部分及/或天然或經修飾之核苷間鍵結且可獨立於糖修飾包括其他修飾。在某些實施例中，糖經修飾之核苷為2'位上經修飾之核苷，其中糖環在天然核糖或2'-去氧-核糖之2'碳上經修飾。

在某些實施例中，2'位上經修飾之核苷具有雙環糖部分。在某些該等實施例中，雙環糖部分為呈α組態之D型糖。在某些該等實施例中，雙環糖部分為呈β組態之D型糖。在某些該等實施例中，雙環糖部分為呈α組態之L型糖。在某些該等實施例中，雙環糖部分為呈β組態之L型糖。

在某些實施例中，雙環糖部分在2'與4'碳原子之間包含橋基。在某些該等實施例中，橋基包含1至8個連接之雙基。在某些實施例中，雙環糖部分包含1至4個連接之雙基。在某些實施例中，雙環糖部分包含2或3個連接之雙基。在某些實施例中，雙環糖部分包含2個連接之雙基。該等4'至2'糖取代基之實例包括(但不限於)：-[C(R_a)(R_b)]_n-、-[C(R_a)(R_b)]_n-O-、-C(R_aR_b)-N(R)-O-或-C(R_aR_b)-O-N(R)-；4'-CH₂-2'、4'-(CH₂)₂-2'、4'-(CH₂)₃-2'；4'-(CH₂)-O-2'(LNA)；4'-(CH₂)-S-2'；4'-(CH₂)₂-O-2'(ENA)；4'-CH(CH₃)-O-2'(cEt)及4'-CH(CH₂OCH₃)-O-2'及其類似物(參見例如美國專利7,399,845，2008年7月15日頒予)；4'-C(CH₃)(CH₃)-O-2'及其類似物(參見例如WO2009/006478，2009年1月8日公開)；4'-CH₂-N(OCH₃)-2'及其類似物(參見例如WO2008/150729，2008年12月11日公開)；4'-CH₂-O-N(CH₃)-2'(參見例如US2004/0171570，2004年9月2日公開)；4'-CH₂-O-N(R)-2'及4'-CH₂-N(R)-O-2'-，其中各R獨立地為H、保護基或C₁-C₁₂ 烷基；4'-CH₂-N(R)-O-2'，其中R為H、C₁-C₁₂烷基或保護基(參見美國專利7,427,672，2008年9月23日頒予)；4'-CH₂-C(H)(CH₃)-2'(參見例如Chattopadhyaya等人，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；及4'-CH₂-C(=CH₂)-2'及其類似物(參見公開之PCT國際申請案WO 2008/154401，2008年12月8日公開)。

在某些實施例中，該等4'至2'橋基獨立地包含1個或2至4個獨立地選自以下之連接之基團：-[C(R_a)(R_b)]_n-、-C(R_a)=C(R_b)-、-C(R_a)=N-、-C(=NR_a)-、-C(=O)-、-C(=S)-、-O-、-Si(R_a)₂-、-S(=O)_x-及-N(R_a)-；其中：x為0、1或2；n為1、2、3或4；各R_a及R_b獨立地為H、保護基、羥基、C₁-C₁₂烷基、經取代之C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、經取代之C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、經取代之C₂-C₁₂炔基、C₅-C₂₀芳基、經取代之C₅-C₂₀芳基、雜環基、經取代之雜環基、雜芳基、經取代之雜芳基、C₅-C₇脂環基、經取代之C₅-C₇脂環基、鹵素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、COOJ₁、醯基(C(=O)-H)、經取代之醯基、CN、磺醯基(S(=O)₂-J₁)或碸基(S(=O)-J₁)；且各J₁及J₂獨立地為H、C₁-C₁₂烷基、經取代之C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、經取代之C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、經取代之C₂-C₁₂炔基、C₅-C₂₀芳基、經取代之C₅-C₂₀芳基、醯基(C(=O)-H)、經取代之醯基、雜環基、經取代之雜環基、C₁-C₁₂胺基烷基、經取代之C₁-C₁₂胺基烷基或保護基。

包含該等雙環糖部分之核苷稱為雙環核苷或BNA。在某些實施例中，雙環核苷包括(但不限於)如下文所描繪之(A)α-L-亞甲氧基(4'-CH₂-O-2')BNA；(B)β-D-亞甲氧基 (4'-CH₂-O-2')BNA；(C)伸乙氧基(4'-(CH₂)₂-O-2')BNA；(D)胺氧基(4'-CH₂-O-N(R)-2')BNA；(E)氧胺基(4'-CH₂-N(R)-O-2')BNA；(F)甲基(亞甲氧基)(4'-CH(CH₃)-O-2')BNA(亦稱為限制性乙基或cEt)；(G)亞甲基-硫基(4'-CH₂-S-2')BNA；(H)亞甲基-胺基(4'-CH2-N(R)-2')BNA；(I)甲基碳環(4'-CH₂-CH(CH₃)-2')BNA；(J)c-MOE(4'-CH₂-OMe-2')BNA；及(K)伸丙基碳環(4'-(CH₂)₃-2')BNA。

其中Bx為核苷鹼基部分且R獨立地為H、保護基或C₁-C₁₂烷基。

在某些實施例中，2'位上經修飾之核苷包含選自以下之2'-取代基：鹵基、烯丙基、胺基、疊氮基、SH、CN、OCN、CF₃、OCF₃、O-、S-或N(R_m)-烷基；O-、S-或N(R_m)-烯基；O-、S-或N(R_m)-炔基；O-伸烷基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH₂)₂SCH₃、O-(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n) 或O-CH₂-C(=O)-N(R_m)(R_n)，其中各R_m及R_n獨立地為H、胺基保護基或經取代或未經取代之C₁-C₁₀烷基。此等2'-取代基可進一步經一或多個獨立地選自以下之取代基取代：羥基、胺基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基(NO₂)、硫醇、硫烷氧基(S-烷基)、鹵素、烷基、芳基、烯基及炔基。

在某些實施例中，2'位上經修飾之核苷包含選自以下之2'-取代基：F、NH₂、N₃、OCF₃、O-CH₃、O(CH₂)₃NH₂、CH₂-CH=CH₂、O-CH₂-CH=CH₂、OCH₂CH₂OCH₃、O(CH₂)₂SCH₃、O-(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n)、-O(CH₂)₂O(CH₂)₂N(CH₃)₂及N上經取代之乙醯胺(O-CH₂-C(=O)-N(R_m)(R_n)，其中各R_m及R_n獨立地為H、胺基保護基或經取代或未經取代之C₁-C₁₀烷基。

在某些實施例中，2'位上經修飾之核苷包含選自以下之2'-取代基：F、OCF₃、O-CH₃、OCH₂CH₂OCH₃、2'-O(CH₂)₂SCH₃、O-(CH₂)₂-O-N(CH₃)₂、-O(CH₂)₂O(CH₂)₂N(CH₃)₂及O-CH₂-C(=O)-N(H)CH₃。

在某些實施例中，2'位上經修飾之核苷包含選自以下之2'-取代基：F、O-CH₃及OCH₂CH₂OCH₃。

在某些實施例中，糖經修飾之核苷為4'-硫基修飾之核苷。在某些實施例中，糖經修飾之核苷為4'-硫基-2'-修飾之核苷。4'-硫基修飾之核苷具有4'-O置換為4'-S之β-D-核糖核苷。4'-硫基-2'-修飾之核苷為2'-OH置換為2'-取代基之4'-硫基修飾之核苷。適合2'-取代基包括2'-OCH₃、2'-O-(CH₂)₂-OCH₃及2'-F。

在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸包含一或多個核苷間修飾。在某些該等實施例中，經修飾寡核苷酸之各核苷間鍵結為經修飾之核苷間鍵結。在某些實施例中，經修飾之核苷間鍵結包含磷原子。

在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵結。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之各核苷 間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。

在某些實施例中，經修飾之核苷間鍵結不包含磷原子。在某些該等實施例中，核苷間鍵結由短鏈烷基核苷間鍵結形成。在某些該等實施例中，核苷間鍵結由環烷基核苷間鍵結形成。在某些該等實施例中，核苷間鍵結由混合雜原子及烷基核苷間鍵結形成。在某些該等實施例中，核苷間鍵結由混合雜原子及環烷基核苷間鍵結形成。在某些該等實施例中，核苷間鍵結由一或多個短鏈雜原子核苷間鍵結形成。在某些該等實施例中，核苷間鍵結由一或多個雜環核苷間鍵結形成。在某些該等實施例中，核苷間鍵結具有醯胺主鏈。在某些該等實施例中，核苷間鍵結具有混合之N、O、S及CH₂組成部分。

在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸包含一或多個經修飾之核苷鹼基。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸包含一或多個5-甲基胞嘧啶。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之各胞嘧啶包含5-甲基胞嘧啶。

在某些實施例中，經修飾之核苷鹼基係選自5-羥甲基胞嘧啶、7-去氮鳥嘌呤及7-去氮腺嘌呤。在某些實施例中，經修飾之核苷鹼基係選自7-去氮-腺嘌呤、7-去氮鳥苷、2-胺基吡啶及2-吡啶酮。在某些實施例中，經修飾之核苷鹼基係選自5位上經取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及O-6經取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。

在某些實施例中，經修飾之核苷鹼基包含多環雜環。在某些實施例中，經修飾之核苷鹼基包含三環雜環。在某些實施例中，經修飾之核苷鹼基包含啡噁嗪衍生物。在某些實施例中，啡噁嗪可經進一步修飾以形成此項技術中稱為G形鉗(G-clamp)之核苷鹼基。

某些醫藥組合物

本文提供包含寡核苷酸之醫藥組合物。在某些實施例中，該等醫藥組合物用於治療代謝性病症及相關病狀。在某些實施例中，本文提供之醫藥組合物包含含由8至30個連接之核苷組成且具有與miR-21或其前驅體互補之核苷鹼基序列之經修飾寡核苷酸的化合物。在某些實施例中，本文提供之醫藥組合物包含由經修飾寡核苷酸組成之化合物，該經修飾寡核苷酸由8至30個連接之核苷組成且具有與miR-21或其前驅體互補之核苷鹼基序列。

適合投藥途徑包括(但不限於)經口、直腸、經黏膜、經腸、腸內、局部、栓劑、經由吸入、鞘內、心內、心室內、腹膜內、鼻內、眼內、腫瘤內及非經腸(例如靜脈內、肌肉內、髓內及皮下)。在某些實施例中，投與鞘內醫藥藥劑以達成局部暴露而非全身性暴露。舉例而言，醫藥組合物可直接注射於所要作用之區域中(例如注射至肝臟中)。

在某些實施例中，醫藥組合物以劑量單位形式投與(例如錠劑、膠囊、快速注射等)。在一些實施例中，醫藥組合物包含劑量在選自以下之範圍內的經修飾寡核苷酸：25mg至800mg、25mg至700mg、25mg至600mg、25mg至500mg、25mg至400mg、25mg至300mg、25mg至200mg、25mg至100mg、100mg至800mg、200mg至800mg、300mg至800mg、400mg至800mg、500mg至800mg、600mg至800mg、100mg至700mg、150mg至650mg、200mg至600mg、250mg至550mg、300mg至500mg、300mg至400mg及400mg至600mg。在某些實施例中，該等醫藥組合物包含選自以下之劑量的經修飾寡核苷酸：25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、 155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、270mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg、350mg、355mg、360mg、365mg、370mg、375mg、380mg、385mg、390mg、395mg、400mg、405mg、410mg、415mg、420mg、425mg、430mg、435mg、440mg、445mg、450mg、455mg、460mg、465mg、470mg、475mg、480mg、485mg、490mg、495mg、500mg、505mg、510mg、515mg、520mg、525mg、530mg、535mg、540mg、545mg、550mg、555mg、560mg、565mg、570mg、575mg、580mg、585mg、590mg、595mg、600mg、605mg、610mg、615mg、620mg、625mg、630mg、635mg、640mg、645mg、650mg、655mg、660mg、665mg、670mg、675mg、680mg、685mg、690mg、695mg、700mg、705mg、710mg、715mg、720mg、725mg、730mg、735mg、740mg、745mg、750mg、755mg、760mg、765mg、770mg、775mg、780mg、785mg、790mg、795mg及800mg。在某些該等實施例中，醫藥組合物包含選自以下之劑量的經修飾寡核苷酸：25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、600mg、700mg及800mg。

在某些實施例中，醫藥藥劑為用適合稀釋劑(例如無菌注射用水或無菌注射用生理食鹽水)復原之無菌凍乾經修飾寡核苷酸。復原之產物在於生理食鹽水中稀釋後以皮下注射形式或以靜脈內輸注形式投與。凍乾之藥品由已於注射用水或注射用生理食鹽水中製備、在製備期間用酸或鹼調整至pH 7.0-9.0且接著凍乾之經修飾寡核苷酸組成。凍乾之經修飾寡核苷酸可為 25-800mg寡核苷酸。應瞭解，此涵蓋25mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg及800mg之經修飾凍乾寡核苷酸。此外，在一些實施例中，凍乾之經修飾寡核苷酸為選自以下之範圍內之量的寡核苷酸：25mg至800mg、25mg至700mg、25mg至600mg、25mg至500mg、25mg至400mg、25mg至300mg、25mg至200mg、25mg至100mg、100mg至800mg、200mg至800mg、300mg至800mg、400mg至800mg、500mg至800mg、600mg至800mg、100mg至700mg、150mg至650mg、200mg至600mg、250mg至550mg、300mg至500mg、300mg至400mg及400mg至600mg。凍乾之藥品可包裝於用溴丁基橡膠蓋塞住且用鋁FLIP-OFF®頂封密封之2mL I型透明玻璃小瓶(經硫酸銨處理)中。

在某些實施例中，本文提供之醫藥組合物可另外含有此項技術中已確定之用量的習知見於醫藥組合物中之其他輔助組分。因此，舉例而言，組合物可含有其他相容性醫藥活性物質，諸如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或消炎劑，或可含有適用於以物理方式調配本發明組合物之各種劑型之其他物質，諸如染料、調味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑及穩定劑。然而，該等物質在添加時應不會不適當地干擾本發明組合物之組分之生物活性。調配物可滅菌且必要時可與不會與調配物之寡核苷酸不利地相互作用之助劑混合，該等助劑為例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、影響滲透壓之鹽、緩衝劑、著色劑、調味劑及/或芳香物質及其類似物。

已在多種方法中在核酸療法中使用脂質部分。在一種方法 中，將核酸引入預成型之脂質體或由陽離子性脂質與中性脂質之混合物製成之脂質複合物(lipoplex)中。在另一方法中，在無中性脂質存在之情況下形成DNA與單陽離子性脂質或聚陽離子性脂質之複合物。在某些實施例中，脂質部分選用於增加醫藥藥劑向特定細胞或組織中之分佈。在某些實施例中，脂質部分選用於增加醫藥藥劑向脂肪組織中之分佈。在某些實施例中，脂質部分選用於增加醫藥藥劑向肌肉組織中之分佈。

在某些實施例中，使用英托利匹特(INTRALIPID)來製備包含寡核苷酸之醫藥組合物。英托利匹特為製備用於靜脈內投與之脂肪乳液。其由10%大豆油、1.2%卵黃磷脂、2.25%甘油及注射用水構成。此外，添加氫氧化鈉來調節pH值以使最終產物pH值範圍為6至8.9。

在某些實施例中，本文提供之醫藥組合物包含與核酸複合之多元胺化合物或脂質部分。在某些實施例中，該等製劑包含一或多種各自個別地具有由式(Z)定義之結構的化合物或其醫藥學上可接受之鹽，

其中各X^a及X^b在每次出現時獨立地為C_1-6伸烷基；n為0、1、2、3、4或5；各R獨立地為H，其中製劑中之至少約80%式(Z)化合物分子中至少n+2個R部分不為H；m為1、2、3或4；Y為O、NR²或S；R¹為烷基、烯基或炔基；其各自任意地經一或多個取代基取代；且R²為H、烷基、烯基或炔基；其各自任意地經一或多個取代基取代；其限制條件為，若n=0，則至少n+3個R部分不為H。該等製劑描述於PCT公開案WO/2008/042973中，該案對脂質製劑之揭示內容以全文引用 之方式併入本文中。某些其他製劑描述於Akinc等人，Nature Biotechnology 26,561-569(2008年5月1日)中，該文獻對脂質製劑之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。

在某些實施例中，本文提供之醫藥組合物包含一或多種經修飾之寡核苷酸及一或多種賦形劑。在某些該等實施例中，賦形劑係選自水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、澱粉酶、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、羥甲基纖維素及聚乙烯吡咯啶酮。

在某些實施例中，本文提供之醫藥組合物係使用已知技術製備，該等已知技術包括(但不限於)混合、溶解、造粒、製糖衣藥丸、水磨、乳化、囊封、覆埋或製錠製程。

在某些實施例中，本文提供之醫藥組合物為液體(例如懸浮液、酏劑及/或溶液)。在某些該等實施例中，液體醫藥組合物係使用此項技術中已知之成分製備，該等成分包括(但不限於)水、二醇、油、醇、調味劑、防腐劑及著色劑。

在某些實施例中，本文提供之醫藥組合物為固體(例如散劑、錠劑及/或膠囊)。在某些該等實施例中，包含一或多種寡核苷酸之固體醫藥組合物係使用此項技術中已知之成分製備，該等成分包括(但不限於)澱粉、糖、稀釋劑、造粒劑、潤滑劑、黏合劑及崩解劑。

在某些實施例中，本文提供之醫藥組合物係調配成儲槽式製劑。某些該等儲槽式製劑之作用時間通常比非儲槽式製劑長。在某些實施例中，該等製劑藉由植入(例如皮下或肌肉內)或藉由肌肉內注射投與。在某些實施例中，儲槽式製劑係使用適合聚合物質或疏水性物質(例如於可接受之油中之乳液)或離子交換樹脂製備，或製備成微溶性衍生物，例如製備成微溶性鹽。

在某些實施例中，本文提供之醫藥組合物包含傳遞系統。 傳遞系統之實例包括(但不限於)脂質體及乳液。某些傳遞系統適用於製備某些醫藥組合物，包括包含疏水性化合物之醫藥組合物。在某些實施例中，使用某些有機溶劑，諸如二甲亞碸。

在某些實施例中，本文提供之醫藥組合物包含一或多種經設計以將本發明之一或多種醫藥藥劑傳遞至特定組織或細胞類型的組織特異性傳遞分子。舉例而言，在某些實施例中，醫藥組合物包括包覆有組織特異性抗體之脂質體。

在某些實施例中，本文提供之醫藥組合物包含共溶劑系統。某些該等共溶劑系統包含例如苄醇、非極性界面活性劑、水可混溶性有機聚合物及水相。在某些實施例中，該等共溶劑系統用於疏水性化合物。該共溶劑系統之非限制性實例為VPD共溶劑系統，其為包含3% w/v苄醇、8% w/v非極性界面活性劑Polysorbate 80^TM及65% w/v聚乙二醇300之絕對乙醇溶液。該等共溶劑系統之比例可在不實質性改變其溶解度及毒性特徵之情況下顯著變化。此外，共溶劑組分之身份可變化：例如，可使用其他界面活性劑替代Polysorbate 80^TM；聚乙二醇之大小分率可變化；其他生物相容性聚合物可替代聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯啶酮；及其他糖或多醣可取代右旋糖。

在某些實施例中，本文提供之醫藥組合物包含持續釋放系統。該持續釋放系統之非限制性實例為固體疏水性聚合物之半透性基質。在某些實施例中，持續釋放系統可視其化學性質而定在數小時、數天、數週或數月之時間內釋放醫藥藥劑。

在某些實施例中，本文提供之醫藥組合物製備用於經口投與。在某些該等實施例中，醫藥組合物係藉由將一或多種包含經修飾寡核苷酸之化合物與一或多種醫藥學上可接受之載劑組合來進行調配。某些該等載劑使得醫藥組合物能夠調配成錠劑、丸劑、糖衣藥丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿料、懸浮液及其類似物，以供個體經口攝取。在某些實施例中，用於經 口使用之醫藥組合物藉由混合寡核苷酸與一或多種固體賦形劑而獲得。適合賦形劑包括(但不限於)填充劑，諸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纖維素製劑，諸如玉米澱粉、小麥澱粉、稻米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉及/或聚乙烯吡咯啶酮(PVP)。在某些實施例中，任意地研磨該混合物並且任意地添加助劑。在某些實施例中，使醫藥組合物成型以獲得錠劑或糖衣藥丸核心。在某些實施例中，添加崩解劑(例如交聯聚乙烯吡咯啶酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，諸如海藻酸鈉)。

在某些實施例中，糖衣藥丸核心具有包衣。在某些該等實施例中，可使用濃縮糖溶液，其可任意地含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯啶酮、卡巴浦爾凝膠(carbopol gel)、聚乙二醇及/或二氧化鈦、漆溶液及適合有機溶劑或溶劑混合物。可添加染料或顏料至錠劑或糖衣藥丸包衣中。

在某些實施例中，用於經口投與之醫藥組合物為由明膠製成之配合插入型膠囊。某些該等配合插入型膠囊包含一或多種本發明之醫藥藥劑與一或多種填充劑(諸如乳糖)、黏合劑(諸如澱粉)及/或潤滑劑(諸如滑石或硬脂酸鎂)及任意地選用之穩定劑的混合物。在某些實施例中，用於經口投與之醫藥組合物為由明膠及塑化劑(諸如甘油或山梨糖醇)製成之軟密封膠囊。在某些軟膠囊中，一或多種本發明之醫藥藥劑溶解或懸浮於適合液體(諸如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇)中。此外，可添加穩定劑。

在某些實施例中，醫藥組合物係製備用於經頰投與。某些該等醫藥組合物為以習知方式調配之錠劑或口含劑。

在某些實施例中，醫藥組合物係製備用於藉由注射投與(例如靜脈內、皮下、肌肉內等)。在某些該等實施例中，醫藥組合物包含載劑且於水溶液中調配，諸如水或生理上相容之緩 衝液，諸如漢克氏溶液(Hanks's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理食鹽水緩衝液。在某些實施例中，包括其他成分(例如有助於溶解或充當防腐劑之成分)。在某些實施例中，可注射懸浮液係使用適當液體載劑、懸浮劑及其類似物製備。某些注射用醫藥組合物以單位劑型存在於例如安瓿或多劑量容器中。某些注射用醫藥組合物為於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液，且可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。某些適用於注射用醫藥組合物中之溶劑包括(但不限於)親脂性溶劑及脂肪油，諸如芝麻油、合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯，以及脂質體。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液之黏度之物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或聚葡萄糖。任意地，該等懸浮液亦可含有適合穩定劑或增加醫藥藥劑之溶解度以允許製備高度濃縮溶液的試劑。

在某些實施例中，醫藥組合物係製備用於經黏膜投與。在某些該等實施例中，在調配物中使用適於欲滲透之障壁之滲透劑。該等滲透劑通常為此項技術中所已知。

在某些實施例中，醫藥組合物係製備用於藉由吸入投與。某些該等吸入用醫藥組合物製備成於加壓包裝或霧化器中之氣霧劑噴霧形式。某些該等醫藥組合物包含推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適合氣體。在使用加壓氣霧劑之某些實施例中，劑量單位可用傳遞計量之量的閥門確定。在某些實施例中，可調配供吸入器或吹入器中使用之膠囊及藥筒。某些該等調配物包含本發明醫藥藥劑與適合粉末基質(諸如乳糖或澱粉)之粉末混合物。

在某些實施例中，醫藥組合物係製備用於直腸投與，諸如栓劑或保留灌腸劑。某些該等醫藥組合物包含已知成分，諸如可可脂及/或其他甘油酯。

在某些實施例中，醫藥組合物係製備用於局部投與。某些 該等醫藥組合物包含溫和保濕基質，諸如軟膏或乳膏。例示性適合軟膏基質包括(但不限於)礦脂、礦脂加揮發性聚矽氧，及羊毛脂及油包水乳液。例示性適合乳膏基質包括(但不限於)冷乳膏及親水性軟膏。

在某些實施例中，本文提供之醫藥組合物包含治療有效量之經修飾寡核苷酸。在某些實施例中，治療有效量足以預防、減輕或緩解疾病之症狀或延長所治療個體之存活期。治療有效量之確定完全在熟習此項技術者之能力範圍內。

在某些實施例中，本文提供之一或多種經修飾寡核苷酸係調配成前藥。在某些實施例中，活體內投與時，前藥化學轉化為寡核苷酸之生物學上、醫藥學上或治療上更具活性之形式。在某些實施例中，前藥因其比相應活性形式更易投與而適用。舉例而言，在某些情況下，前藥之生物可用率(例如經由經口投與)可比相應活性形式高。在某些情況下，前藥相比於相應活性形式可具有改良之溶解度。在某些實施例中，前藥之水溶性低於相應活性形式。在某些情況下，該等前藥具有較佳之跨細胞膜傳遞，其中水溶性不利於遷移。在某些實施例中，前藥為酯。在某些該等實施例中，酯在投與時代謝水解為羧酸。在某些情況下，含羧酸化合物為相應活性形式。在某些實施例中，前藥包含結合於酸基之短肽(聚胺基酸)。在某些該等實施例中，肽在投與時裂解以形成相應活性形式。

在某些實施例中，藉由對醫藥活性化合物進行修飾而產生前藥，以使得活性化合物在活體內投與時再生。前藥可經設計以改變藥物之代謝穩定性或轉運特徵，遮蔽副作用或毒性，改良藥物之風味或改變藥物之其他特徵或特性。借助於對活體內藥效動力學過程及藥物代謝之瞭解，熟習此項技術者在已知醫藥活性化合物後即可設計該化合物之前藥(參見例如Nogrady(1985)Medicinal Chemistry A Biochemical Approach,Oxford University Press,New York，第388-392頁)。

某些投藥途徑

在某些實施例中，向個體投藥包含非經腸投藥。在某些實施例中，向個體投藥包含靜脈內投藥。在某些實施例中，向個體投藥包含皮下投藥。

在某些實施例中，向個體投藥包含動脈內投藥。在某些實施例中，向個體投藥包含心內投藥。心內投藥之適合方式包括使用導管或在開心手術期間投藥。在某些實施例中，投藥包含使用支架。

在某些實施例中，投藥包括肺部投藥。在某些實施例中，肺部投藥包含藉由吸入將氣霧化寡核苷酸傳遞至個體之肺部。個體吸入氣霧化寡核苷酸後，寡核苷酸分佈至正常與發炎肺組織之細胞，包括肺泡巨噬細胞、嗜伊紅血球、上皮細胞、血管內皮細胞及細支氣管上皮細胞。適用於傳遞包含經修飾寡核苷酸之醫藥組合物之裝置包括(但不限於)標準霧化器裝置。用於使用霧化器裝置調節小液滴之大小以靶向呼吸道及肺之特定部分的調配物及方法為熟習此項技術者所熟知。其他適合裝置包括乾粉吸入器或定劑量吸入器。

在某些實施例中，投與醫藥組合物以達成局部暴露而非全身性暴露。舉例而言，肺部投與將醫藥組合物傳遞至肺部，而使全身性暴露達到最低。

其他適合投藥途徑包括(但不限於)經口、直腸、經黏膜、經腸、腸內、局部、栓劑、鞘內、心室內、腹膜內、鼻內、眼內、肌肉內、髓內及腫瘤內。

某些化合物

本文提供包含具有某些核苷型態之經修飾寡核苷酸之化 合物，及該等化合物用於調節目標核酸之活性、含量或表現之用途。在某些實施例中，化合物包含寡核苷酸。在某些該等實施例中，化合物由寡核苷酸組成。在某些實施例中，寡核苷酸為經修飾之寡核苷酸。在某些實施例中，經修飾之寡核苷酸與小型非編碼RNA互補。在某些實施例中，小型非編碼RNA為miR-21。

在某些該等實施例中，化合物包含與互補股雜交之經修飾寡核苷酸，亦即化合物包含雙股寡聚化合物。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸與互補股雜交會形成至少一個鈍端。在某些該等實施例中，經修飾寡核苷酸與互補股雜交會在雙股寡聚化合物之各末端形成鈍端。在某些實施例中，經修飾寡核苷酸之末端相對於互補股之連接之核苷之數目包含一或多個額外之連接之核苷。在某些實施例中，一或多個額外核苷位於寡核苷酸之5'端。在某些實施例中，一或多個額外核苷位於寡核苷酸之3'端。在某些實施例中，一或多個額外核苷之核苷之至少一個核苷鹼基與目標RNA互補。在某些實施例中，一或多個額外核苷各自之各核苷鹼基與目標RNA互補。在某些實施例中，互補股之末端相對於寡核苷酸之連接之核苷之數目包含一或多個額外之連接之核苷。在某些實施例中，一或多個額外之連接之核苷位於互補股之3'端。在某些實施例中，一或多個額外之連接之核苷位於互補股之5'端。在某些實施例中，兩個額外之連接之核苷連接於末端。在某些實施例中，一個額外之核苷連接於末端。

在某些實施例中，化合物包含與一或多個增強所得反義寡核苷酸之活性、細胞分佈或細胞吸收之部分結合的經修飾寡核苷酸。在某些該等實施例中，該部分為膽固醇部分。在某些實施例中，該部分為脂質部分。用於結合之額外部分包括碳水化合物、磷脂、生物素、啡嗪、葉酸鹽、啡啶、蒽醌、吖啶、螢 光素、若丹明(rhodamine)、香豆素及染料。在某些實施例中，結合基團直接連接於寡核苷酸。在某些實施例中，結合基團藉由選自以下之連接部分連接至經修飾寡核苷酸：胺基、羥基、羧酸、硫醇、不飽和度(例如雙鍵或三鍵)、8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯(SMCC)、6-胺基己酸(AHEX或AHA)、經取代之C1-C10烷基、經取代或未經取代之C2-C10烯基及經取代或未經取代之C2-C10炔基。在某些該等實施例中，取代基係選自羥基、胺基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫烷氧基、鹵素、烷基、芳基、烯基及炔基。

在某些該等實施例中，化合物包含經修飾之寡核苷酸，該寡核苷酸具有一或多個穩定化基團連接於經修飾寡核苷酸之一端或兩端以增強諸如核酸酶穩定性之特性。在穩定化基團中包括帽結構。此等末端修飾保護經修飾之寡核苷酸免遭核酸外切酶降解，且可有助於傳遞及/或定位於細胞內。帽可存在於5'端(5'帽)或3'端(3'帽)，或可存在於兩個末端上。帽結構包括例如反轉去氧無鹼基帽。

適合帽結構包括4',5'-亞甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃醣基)核苷酸、4'-硫核苷酸、碳環核苷酸、1,5-去水己醣醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、經修飾鹼基核苷酸、二硫代磷酸酯鍵結、蘇-戊呋喃醣基核苷酸、無環3',4'-斷核苷酸、無環3,4-二羥基丁基核苷酸、無環3,5-二羥基戊基核苷酸、3'-3'-反轉核苷酸部分、3'-3'-反轉無鹼基部分、3'-2'-反轉核苷酸部分、3'-2'-反轉無鹼基部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3'-胺基磷酸酯、己基磷酸酯、胺基己基磷酸酯、3'-磷酸酯、3'-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、橋連甲基膦酸酯部分及非橋連甲基膦酸酯部分、5'-胺基-烷基磷酸酯、1,3-二胺基-2-丙基磷酸酯、3-胺基丙基磷酸酯、6-胺基己基磷酸酯、1,2-胺基十二烷基磷酸酯、羥基丙基磷酸酯、 5'-5'-反轉核苷酸部分、5'-5'-反轉無鹼基部分、5'-胺基磷酸酯、5'-硫代磷酸酯、5'-胺基、橋連及/或非橋連5'-胺基磷酸酯、硫代磷酸酯及5'-巰基部分。

某些其他療法

對與miR-21相關之疾病之治療可包含一種以上療法。因此，在某些實施例中，本文提供治療患有或懷疑患有與miR-21相關之疾病之個體之方法，其包括除投與具有與微小RNA互補之核苷鹼基序列之經修飾寡核苷酸外亦投與至少一種療法。

在某些實施例中，至少一種其他療法包含醫藥藥劑。

在某些實施例中，醫藥藥劑包括消炎劑。在某些實施例中，消炎劑為類固醇消炎劑。在某些實施例中，類固醇消炎劑為皮質類固醇。在某些實施例中，皮質類固醇為強的松。在某些實施例中，消炎劑為非類固醇消炎藥。在某些實施例中，非類固醇消炎劑為布洛芬、COX-I抑制劑或COX-2抑制劑。

在某些實施例中，醫藥藥劑包括抗糖尿病劑。抗糖尿病劑包括(但不限於)雙胍、葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素、磺醯脲及噻唑啶二酮。

在某些實施例中，醫藥藥劑包括(但不限於)利尿劑(例如螺內酯、依普利酮、呋喃苯胺酸)、收縮影響劑(例如多巴酚丁胺、米力農)、地高辛、血管舒張藥、血管緊張素II轉化酶(ACE)抑制劑(例如為卡托普利、依那普利、賴諾普利、貝那普利、喹那普利、福辛普利及雷米普利)、血管緊張素II受體阻斷劑(ARB)(例如坎地沙坦、伊貝沙坦、奧美沙坦、洛沙坦、纈沙坦、替米沙坦、依普沙坦)、鈣通道阻斷劑、異山梨醇二硝酸酯、肼屈嗪、硝酸酯(例如異山梨醇單硝酸酯、異山梨醇二硝酸酯)、肼屈嗪、β-阻斷劑(例如卡維地洛、美托洛爾)及利鈉肽(例如奈西利肽)。

在某些實施例中，醫藥藥劑包括類肝素。在某些實施例中，類肝素為戊聚醣多硫酸酯。

在某些實施例中，醫藥藥劑為阻斷對纖維發生信號之一或多種反應的醫藥藥劑。

在某些實施例中，醫藥藥劑為抗結締組織生長因子療法。在某些實施例中，抗CTGF療法為針對CTGF之單株抗體。

在某些實施例中，其他療法可為增強身體免疫系統之醫藥藥劑，包括低劑量環磷醯胺、胸腺刺激素、維生素及營養補充劑(例如抗氧化劑，包括維生素A、C、E、β-胡蘿蔔素、鋅、硒、麩胱甘肽、輔酶Q-10及紫花馬蘭菊)，以及疫苗，例如免疫刺激性複合物(ISCOM)，其包含組合抗原之多聚呈現形式與佐劑之疫苗調配物。

在某些實施例中，其他療法選用於治療或改善本發明之一或多種醫藥組合物之副作用。該等副作用包括(但不限於)注射部位反應、肝功能測試異常、腎功能異常、肝中毒、腎中毒、中樞神經系統異常及肌病。舉例而言，血清中之轉胺酶含量升高可指示肝中毒或肝功能異常。舉例而言，膽紅素增加可指示肝中毒或肝功能異常。

其他醫藥藥劑之其他實例包括(但不限於)：免疫球蛋白，包括(但不限於)靜脈內免疫球蛋白(IVIg)；止痛劑(例如乙醯胺苯酚)；水楊酸鹽；抗生素；抗病毒劑；抗真菌劑；腎上腺素激導性調節劑；激素(例如同化類固醇、雄激素、雌激素、降血鈣素、孕酮、生長抑素及甲狀腺激素)；免疫調節劑；肌肉鬆弛劑；抗組織胺劑；骨質疏鬆劑(例如雙膦酸鹽、降血鈣素及雌激素)；前列腺素、抗贅生物劑；精神治療劑；鎮靜劑；毒葛或毒漆樹產物；抗體；及疫苗。

某些套組

本發明亦提供套組。在一些實施例中，套組包含一或多種包含經修飾寡核苷酸之本發明化合物，其中寡核苷酸之核苷鹼基序列與miR-21之核苷鹼基序列互補。與miR-21互補之化合物可具有本文所述之任何核苷型態。在一些實施例中，與miR-21互補之化合物可存在於小瓶內。複數個小瓶(諸如10個)可存在於例如分配包裝中。在一些實施例中，小瓶經製造以可用注射器出入。套組亦可含有與miR-21互補之化合物的使用說明書。

在一些實施例中，套組可用於向個體投與與miR-21互補之化合物。在該等情況下，除與miR-21互補之化合物外，套組亦可進一步包含以下一或多者：注射器、酒精藥簽、棉球及/或網墊。在一些實施例中，與miR-21互補之化合物可存在於預先填充藥品之注射器(諸如具有例如具針套之27號½吋針的單次劑量注射器)而非小瓶中。複數個預先填充藥品之注射器(諸如10個)可存在於例如分配包裝中。套組亦可含有投與與miR-21互補之化合物的說明書。

某些實驗模型

在某些實施例中，本發明提供在實驗模型中使用及/或測試本發明之經修飾寡核苷酸的方法。熟習此項技術者能夠選擇及修改該等實驗模型之方案以評估本發明之醫藥藥劑。

一般而言，首先在培養細胞中測試經修飾之寡核苷酸。適合細胞類型包括與需要在活體內傳遞經修飾寡核苷酸之細胞類型相關的細胞類型。舉例而言，適用於本文所述方法之研究的細胞類型包括初級細胞或培養細胞。

在某些實施例中，在培養細胞中評定經修飾寡核苷酸干擾miR-21活性之程度。在某些實施例中，可藉由量測微小RNA之含量來評定對微小RNA活性之抑制。或者，可量測預測或 確定之由微小RNA調控之轉錄物之含量。抑制微小RNA活性可使得miR-21調控之轉錄物及/或由miR-21調控之轉錄物編碼之蛋白質增加。此外，在某些實施例中，可量測某些表型結果。

熟習此項技術者可獲得若干動物模型用於在人類疾病之模型中研究miR-21。舉例而言，miR-21抑制劑可在以下癌症模型中研究，諸如原位異種移植模型、毒素誘發之癌症模型或遺傳誘發之癌症模型。在該等癌症模型中，可進行研究以評估miR-21抑制劑對腫瘤尺寸、腫瘤數目、總體存活期及/或無進展存活期之影響。

miR-21抑制劑對心臟功能及纖維化之影響可在經主動脈結紮或心肌梗塞之模型中研究，該等模型各自誘發異常心臟功能及纖維化。腎纖維化模型包括單側輸尿管梗阻及缺血/再灌注損傷。在早期時間點，可使用腎臟缺血再灌注損傷模型作為急性腎損傷之模型，而稍後時間點用作腎纖維化模型。肝纖維化模型由例如四氯化碳中毒或膽管切除誘發。miR-21對肺纖維化之影響可在例如博來黴素(bleomycin)誘發之肺纖維化模型中研究。傷口癒合模型亦可由熟習此項技術者獲得，例如C57Bl/KsJ-db/db小鼠，其展現成年發作型糖尿病之若干特徵，諸如傷口閉合顯著延遲。

某些定量分析

投與經修飾之寡核苷酸後對miR-21之反義抑制作用可藉由此項技術中已知之多種方法來評定。在某些實施例中，此等方法用於在活體外或活體內定量細胞或組織中之微小RNA含量。在某些實施例中，微小RNA含量之變化藉由微陣列分析來量測。在某些實施例中，微小RNA含量之變化藉由若干市售PCR分析之一者來量測，諸如TaqMan®微小RNA分析 (Applied Biosystems)。在某些實施例中，對miR-21之反義抑制作用藉由量測miR-21之目標之mRNA及/或蛋白質含量來評定。對miR-21之反義抑制作用通常使得微小RNA之目標之mRNA及/或蛋白質含量增加。

目標嚙合分析

用抗miR劑或微小RNA模擬物調節微小RNA活性可藉由量測目標嚙合來評定。在某些實施例中，藉由mRNA之微陣列概況分析來量測目標嚙合。搜尋由抗miR劑或微小RNA模擬物調節(增加或減少)之mRNA之序列中的微小RNA種子序列，以比較對作為微小RNA之目標之mRNA的調節作用與對不為微小RNA之目標之mRNA的調節作用。以此方式，可評估抗miR劑與miR-21或miR-21模擬物與其目標之相互作用。在抗miR劑之情況下，篩選表現量增加之mRNA中包含與抗miR劑所互補之微小RNA匹配之種子的mRNA序列。

實例

提供以下實例以便更充分地說明本發明之一些實施例。然而，其不應以任何方式視作限制本發明之廣泛範疇。

此項技術中之一般技術人員將容易地採用本發明之基本原理來設計各種化合物而不背離本發明之精神。

實例1：抗miR-21化合物之活體外篩選

評估靶向miR-21且包含cEt核苷之各種抗miR劑對miR-21活性之抑制作用。如表A中所示，此等化合物之長度以及經修飾核苷之數目、類型及位置不同。25919包含2'-MOE及2'-氟核苷且已知抑制miR-21，且因此納入作為陽性對照。 其餘化合物包含cEt核苷與2'-MOE核苷及/或β-D-去氧核糖核苷之組合。

在上表A中，之後未接下標之核苷指示β-D-去氧核糖核苷。之後接有下標「E」之核苷指示2'-MOE核苷。之後接有下標「S」之核苷指示S-cEt核苷。之後接有下標「F」之核苷指示2'-氟核苷。各核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。上標「Me」指示核苷之嘧啶鹼基上的5-甲基。

在螢光素酶分析中評定該等化合物之miR-21抑制活性。使用pGL3-MCS2(Promega)對微小RNA螢光素酶感測構築體進行工程改造。將該構築體引入Hela細胞中以測試抗miR化合物抑制miR-21活性之能力。在此分析中，存在於Hela細胞中之miR-21結合至其在螢光素酶感測構築體中之同源位點，並抑制螢光素酶表現。當將適當抗miR劑引入細胞中時，其結合至miR-21並且減輕對螢光素酶表現之抑制。因此，在此分 析中，作為miR-21表現之有效抑制劑的抗miR劑將使螢光素酶表現增加。

第1天：將用經工程改造以含有與miR-21互補之序列之螢光素酶構築體穩定轉染的Hela細胞(ATCC)以3.5×10⁶個細胞/燒瓶接種於T-170燒瓶(BD Falcon)中。在高糖杜貝卡氏改良伊格培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium with High Glucose)(Invitrogen)中培養Hela細胞。

第2天：用0.5μg表現用於校正之海腎(Renilla)的phRL感測質體(Promega)轉染各燒瓶之Hela細胞。使用20μl脂染胺2000(Lipofectamine 2000)/燒瓶(Invitrogen)對Hela細胞進行轉染。轉染4小時後，用PBS洗滌細胞且以胰蛋白酶處理。將Hela細胞以每孔40k個接種於24孔培養盤(BD Falcon)中且靜置隔夜。

第3天：使用Lipofectin(Invitrogen)用抗miR劑以2.5μl Lipofectin/100nM ASO/ml Opti-MEM I血清減少型培養基(Invitrogen)轉染Hela細胞4小時。ASO轉染後，向Hela細胞中再饋入高糖杜貝卡氏改良伊格培養基(Invitrogen)。

第4天：將Hela細胞被動溶解且使用雙重螢光素酶報導體分析系統(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(Promega)量測螢光素酶活性。

進行螢光素酶分析以測試具有本文所述核苷型態之抗miR劑抑制miR-21活性之能力。將結果與『空白對照』處理進行比較，在『空白對照』處理中細胞未接受抗miR劑處理。重複實驗且兩次重複實驗之結果於下表B中展示為針對β-半乳糖苷酶活性校正之螢光素酶值。

如表B中所示，以下若干含cEt化合物以劑量依賴性方式展示出對miR-21之抑制作用：25068、25070、25072及25082。

實例2：抗miR-21化合物25070之經修飾核苷變化

如上述實例中所示，25070在螢光素酶分析中為miR-21活性之有效抑制劑。為評估25070之各位置處經修飾核苷之類型的變化，如表C中所示設計其他抗miR-21化合物。

在上表F中，之後未接下標之核苷指示β-D-去氧核糖核苷。之後接有下標「E」之核苷指示2'-MOE核苷。之後接有下標「S」之核苷指示S-cEt核苷。之後接有下標「F」之核苷指示2'-氟核苷。各核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。上標「Me」指示核苷之嘧啶鹼基上的5-甲基。

如本文所述進行螢光素酶分析以測試表F中之抗miR劑抑制miR-21活性之能力。將結果與『空白對照』處理進行比較，在『空白對照』處理中細胞未接受抗miR劑處理。重複實驗且兩次重複實驗之結果於下表D中展示為螢光素酶值相對於空白對照處理之倍數變化。

如表D中所示，除25070外，以下若干含cEt化合物亦以劑量依賴性方式展示出對miR-21之抑制作用：25922、25923及25924。各自在各核苷處具有糖修飾且各胞嘧啶為5-甲基胞嘧啶之抗miR-21化合物25116及25117不為miR-21之有效抑制劑。

實例3：對賦予抗miR-21化合物以活性之核苷型態的比較

為確定賦予抗miR-21化合物以活性之核苷型態之間的關係，比較經修飾及未經修飾核苷在活性抗miR-21化合物中的位置，其展示於表E中。

對經修飾及未經修飾核苷之位置的比較(上表F)揭示各高活性抗miR-21化合物所共有之某些核苷型態。

舉例而言，對各化合物5'端結構之比較揭示長度在1至4個核苷範圍內之區，該等核苷各自為非雙環核苷(下表G中之欄『R』)。下一區具有一個雙環核苷，接著為兩個非雙環核苷，接著為一個雙環核苷(下表G中之欄『1』)。

緊接著為具有四個核苷之重複區塊，該四個核苷為三個非雙環核苷，繼而一個雙環核苷，並且此具有四個核苷之區塊總共出現三次(下表G中之欄『2』)。

在各活性抗miR-21劑中，兩個3'端核苷為非雙環核苷(下表G中之欄『T』)。

此核苷型態按5'至3'方向由下式I表示：(R)_X-N^B-N^Q-N^Q-N^B-(N^Q-N^Q-N^Q-N^B)₃-N^Q-N^Z其中各R為非雙環核苷；X為0至4；各N^B為雙環核苷；各N^Q為非雙環核苷；且各N^Z為經修飾之核苷。

此式涵蓋活性抗miR-21化合物25068、25070、25072、25082、25922、25923及25924之各核苷型態，表明核苷型態I產生活性抗miR活性，且使得對雙環核苷、非雙環核苷及經 修飾核苷之選擇具有靈活性。因此，本文提供包含與miR-21具有核苷鹼基互補性且具有由式I描述之核苷型態之經修飾寡核苷酸的組合物。

為確定賦予長度為19個連接之核苷之活性抗miR-21化合物以活性之核苷型態之間的關係，比較經修飾及未經修飾核苷在所有高活性化合物中的位置，其展示於表H中。為說明某些核苷之相似位置，該等化合物再次展示於表I中。

對經修飾及未經修飾核苷之位置的比較(上表I)揭示長度為19個連接之核苷之各高活性抗miR-21化合物所共有之某些核苷型態。

舉例而言，對各化合物5'端結構之比較揭示一個不為雙環核苷之經修飾核苷(下表J中之欄『N^M』)。下一區具有一個雙環核苷，接著為兩個非雙環核苷，接著為一個雙環核苷(下表J中之欄『1』)。

緊接著為具有四個核苷之重複區塊，該四個核苷為三個非雙環核苷，繼而一個雙環核苷，並且此具有四個核苷之區塊總共出現三次(下表J中之欄『2』)。

在各活性抗miR-21劑中，3'端倒數第二個核苷為未經修飾之核苷(下表J中之欄『N』)。3'端上與miR-21之位置1上之核苷鹼基互補的核苷為經修飾之核苷(下表J中之欄『N^Z』)。

此核苷型態按5'至3'方向由下式II表示：N^M-N^B-N^Q-N^Q-N^B-(N^Q-N^Q-N^Q-N^B)₃-N^Q-N^Z其中N^M為不為雙環核苷之經修飾核苷；各N^B為雙環核苷；各N^Q為非雙環核苷；且N^Z為經修飾之核苷。

本文提供之資料證明此核苷型態賦予抗miR-21化合物以活性，且另外證明多種經修飾之核苷使化合物之活性得到維持。因此，本文提供包含具有與miR-21互補之核苷鹼基序列且具有式II之核苷型態之經修飾寡核苷酸的組合物。

利用一組抗miR-21化合物進行類似分析，該等化合物包括25211及25220。作為前述分析之結果，建立式III至V。

實例3：在腎纖維化模型中抑制miR-21

單側輸尿管梗阻(UUO)為已確立之導致間質性纖維化之腎損傷實驗模型且因此用作反映人類腎臟疾病之實驗模型。UUO藉由手術結紮單個輸尿管誘發。因為纖維化之特徵在於膠原蛋白增加，所以可藉由量測膠原蛋白含量來確定腎纖維化之存在及程度。量測膠原蛋白1A1(Col 1A1)及膠原蛋白3A1(Col 3A1)以評定膠原蛋白含量。腎纖維化可藉由用天狼星紅(picro-sirius red)對組織樣品進行染色以偵測膠原蛋白含量之增加來觀測。腎纖維化亦可藉由量測樣品中作為膠原蛋白主要組分之羥基脯胺酸之量來觀測。在腎纖維化之UUO模型中測試在螢光素酶分析中發現具有活性之含cEt抗miR-21化合物。包含2'-MOE及2'-氟修飾之25919已知在活體內抑制miR-21活性，且納入作為陽性對照。如下處理各組8隻動物：僅UUO，UUO與PBS，或UUO與抗miR-21化合物。相對於UUO程序當天，PBS或抗miR-21化合物在第-3天、第-1天及第+5天投與。抗miR-21化合物以20mg/kg之劑量投與。因為抗miR化合物在UUO程序之前投與，所以此給藥方案視為預防性處理。在第11天時，將動物犧牲且分離腎臟用於量測膠原蛋白表現。膠原蛋白表現藉由即時PCR進行量測並且首先針對GAPDH進行校正且接著針對假手術對照組(sham control)動物進行校正。膠原蛋白1A1及膠原蛋白3A1表現展示於下表K中。

此研究用上述各處理組重複2至3次。研究之統合分析(meta-analysis)揭示如藉由膠原蛋白表現所判定，25070處理顯示最高效能，產生40%膠原蛋白1A1抑制作用及30%膠原蛋白3A1抑制作用。25068在減少膠原蛋白表現方面亦具有活性，但程度低於25070。25072及25082雖然在本文所述之活體外測試中為miR-21之活性抑制劑，但並不始終展現出膠原蛋白表現減少作用。

重複UUO研究以證實25070之活性。抗miR劑以20mg/kg之劑量皮下投與。下表L中之結果證實25070為膠原蛋白1A1及膠原蛋白3A1表現之有效抑制劑。

對UUO研究之比較揭示25070在UUO模型中為膠原蛋白表現之高效抑制劑，因此25070為用於治療包括腎纖維化在內之纖維化的候選治療劑。

實例4：抗miR-21劑與血管緊張素受體阻斷劑之比較

血管緊張素受體阻斷劑伊貝沙坦已經展示可阻斷特徵為纖維化之慢性腎損傷模型之腎小管間質性纖維化形成。在UUO纖維化模型中比較25070與伊貝沙坦之作用。

對照處理組包括僅UUO(假手術對照組)及UUO與皮下投與PBS。另一對照組包括UUO與吐溫(Tween)-MC/20載劑(經口)。25070在UUO程序之前5天、之前2天及之後3天以20mg/kg之劑量皮下投與。伊貝沙坦在UUO程序後第0至7天每日一次經口投與。動物在UUO程序後第10天犧牲。收集腎臟組織用於量測膠原蛋白1A1及膠原蛋白3A1表現。結果展示於下表M中，且說明經25070處理之動物相對於經生理食鹽水處理之動物Col1A1表現存在統計顯著性減少(藉由單因子ANOVA，p<.05)。伊貝沙坦未使Col1A1表現產生統計顯著性減少。伊貝沙坦及25070均使Col3a1表現產生統計顯著性減少，其中25070產生之減少作用大於伊貝沙坦。

纖維化之另一指標為UUO程序後展示出膠原蛋白表現之腎臟組織的百分率。因此，亦收集腎臟組織用於進行組織學分析，以評定展示出膠原蛋白表現增加之腎臟組織的分率；結果展示於下表N中。『膠原蛋白面積分率』經由對由天狼星紅染料染成紅色之腎臟組織的面積進行定量影像處理而以組織學方式量測；偵測為紅色之百分比係由腎臟切片面積來校正。因為組織切片係以盲法方式分析，而表M及N中之樣品係來自同一研究，所以下表N中樣品之編號未必對應於上表M中樣品之編號。

此等結果表明用25070抑制miR-21對膠原蛋白表現之抑制活性高於伊貝沙坦，進一步證實25070為用於治療、預防及/或改善纖維化之候選藥劑。

實例5：在缺血/再灌注損傷模型中抑制miR-21

在小鼠中經由對腎動脈進行單側或雙側夾閉建立缺血再灌注損傷(IRI)模型，該夾閉導致腎小管損害、炎症及纖維化。腎功能不全可在此模型之早期(<5天)或後期(>7天)出現，其中早期時間點適用於測試用於治療急性腎損傷之候選藥劑，且後期時間點適用於模擬慢性纖維化。

在單側IRI模型中測試抗miR-21化合物。誘發單側IRI持續30分鐘的時間。處理組如下：IRI程序假手術對照組；IRI與皮下投與PBS；IRI與以20mg/kg之劑量腹膜內投與抗miR-21化合物25070；以20mg/kg之劑量腹膜內投與2'-氟/2'-MOE修飾之抗miR-21劑25919；及以20mg/kg之劑量腹膜內投與2'-氟/2'修飾之失配抗miR-21劑(與miR-21之序列有三處失配)25319。PBS或抗miR化合物在IRI後第5、6及7天投與，且動物在IRI後14天犧牲。因為抗miR化合物係在腎損傷後第5天或稍後投與，而此時纖維化已在一定程度上出現，所以此處理方案視為治療性方案，而非預防性方案。

收集腎臟組織用於分析膠原蛋白1A1及膠原蛋白3A1表 現(展示於表O中)以及膠原蛋白面積分率(展示於表P中)。『膠原蛋白面積分率』以盲法方式分析，而表O及P中之樣品係來自同一研究，所以表O中樣品之編號並不對應於表P中樣品之編號。樣品處理誤差導致不能對抗miR-21劑失配對照處理之膠原蛋白面積分率進行分析，因此此處理組之結果僅提供用於膠原蛋白1A1及膠原蛋白3A1表現。在此研究中，25070使膠原蛋白面積分率產生統計顯著性降低。

利用相同處理組且再處理數天來進行類似研究。在此研究中，在IRI程序後第5、6、7、14及21天腹膜內投與處理。動物在第27天犧牲，且收集腎臟組織用於分析膠原蛋白1A1及膠原蛋白3A1表現，以及膠原蛋白面積分率。『膠原蛋白面積分率』以盲法方式分析，而表Q及R中之樣品係來自同一研究，所以表Q中樣品之編號並不對應於表R中樣品之編號。在此研究中，25070使膠原蛋白面積分率產生統計顯著性降低。

此等研究表明在急性腎損傷模型中抑制miR-21後膠原蛋白含量降低。因此，抗miR-21化合物25070為用於治療急性腎損傷之治療劑。舉例而言，預防或延遲急性腎損傷後之纖維化發作可預防或延遲慢性腎病發作。

為評定投與抗miR-21化合物25070之靈活性，該化合物在於IRI程序後第3、5及7天投與抗miR-21劑之上述14天研究中的活性相比於在於IRI程序後第3、5及7天腹膜內投與抗miR-21劑之另一14天研究中的活性。表S中之資料表明在任一研究中均觀測到對膠原蛋白表現之類似抑制作用，指示給藥時程可為靈活的。膠原蛋白1A1或膠原蛋白3A1表現相對於假手術對照組動物之倍數變化展示於表S中，並且說明在任一給藥時程之情況下膠原蛋白表現均產生統計顯著性降低。

實例6：在缺血再灌注損傷/腎切除模型中抑制miR-21

在小鼠中經由以下建立缺血再灌注損傷/腎切除(IR/Nx)模型：在一隻腎中對動脈進行暫時單側夾閉，該夾閉導致腎小管損害、炎症及纖維化，接著在稍後時間點移除第二隻腎。在此模型中，急性腎功能不全期適用於測試用於治療急性腎損傷之候選藥劑(亦即直至約前5天)，且稍後之腎功能不全期適用於模擬慢性纖維化(亦即在約前5天以後)。

在IR/Nx模型中測試抗miR-21化合物。使用與miR-21有6鹼基失配之25109作為對照化合物(A_EA_SATC_STGTC_STCAU_SAATA_SAA_E；其中之後未接下標之核苷指示β-去氧核苷；之後接有下標「E」之核苷指示2’-MOE核苷；之後接有下標「S」之核苷指示S-cEt核苷；且所有核苷間鍵結均為硫代磷酸酯核苷間鍵結)。

誘發單側IRI持續30分鐘的時間。處理組如下：IR程序假手術對照組；IR與皮下投與PBS；IR與以20mg/kg之劑量皮下投與失配對照25109；IR與以20mg/kg之劑量皮下投與抗miR-21化合物25070；及IR與以20mg/kg之劑量皮下投與抗miR-21化合物25923。PBS或抗miR劑在IR後第2、3、4及8天時投與。第8天，藉由腎切除術自各動物移除健康腎，且在第9天犧牲動物。犧牲前，藉由直接膀胱穿刺收集尿液。

量測來自各小鼠之尿液中的尿白蛋白與肌酸酐比率。該實驗之結果展示於圖1中。在此研究中，25070及25923均使尿白蛋白：肌酸酐比率出現統計顯著性降低。各組小鼠之白蛋白：肌酸酐比率之幾何平均值為16μgAlb/mgCr(單獨腎切除術對照組)、127μgAlb/mgCr(IR/Nx-PBS對照組)、140μgAlb/mgCr(IR/Nx-25109對照組)、40μgAlb/mgCr(IR/Nx-25070組)及31μgAlb/mgCr(IR/Nx-25923組)。所有IR/Nx小鼠之血液尿素氮及血清肌酸酐含量相似，且相對於單獨腎切除術對照組小鼠有所升高(資料未示)。

實例7：投與抗miR-21化合物後IR/Nx模型小鼠之存活率

在6個不同實驗中測定腎切除術後兩天IR/Nx模型小鼠之存活率，以確定投與抗miR-21化合物是否使存活率增加。在前三個實驗中，在缺血再灌注損傷後第5、6及7天投與抗miR-21化合物，並且在第10天或第11天進行腎切除術。在其次三個實驗中，在第2、3及4天投與抗miR-21化合物且在第7天進行腎切除術。各實驗中IR/Nx小鼠之存活率展示於表T中。

在腎切除術於第10天或第11天進行之前三個實驗中，經PBS處理之小鼠之存活率為55%，而經25070處理之小鼠之存活率為80%(P=0.02，使用單側費希爾精確檢驗(1-sided Fisher's Exact Test))。在腎切除術於第7天進行之其次三個實驗中，經PBS處理之小鼠之存活率為52%，而經25070處理之小鼠之存活率為69%(P=0.11，使用單側費希爾精確檢驗)。

實例7：其他抗miR-21化合物之設計

在向小鼠投與化合物25070後，發現存在於腎臟組織中之約50%化合物到注射後第7天缺乏3’端核苷。在離體肝臟勻漿分析中評定25070及25923之穩定性。在此分析中，將5μM寡核苷酸在肝臟勻漿(每毫升50mg組織)中在37℃下培育24小時。在此培育後，藉由液-液萃取(LLE)接著進行固相萃取(SPE)進行寡核苷酸萃取。藉由高效液相層析飛行時間質譜法(HPLC-TOF MS)量測寡核苷酸長度及量。藉由使用參考寡核苷酸證實肝組織勻漿中之核酸酶活性，該等參考寡核苷酸包括具有已知核酸酶活性抗性之化合物、對3’-核酸外切酶活性敏感之化合物及對核酸內切酶活性敏感之化合物。使用內部標準化合物作為萃取效率之對照。在此分析中，約58%之化合物25070以全長化合物形式存在，且約27%之化合物25070缺乏3’端核苷。約68%之化合物25923以全長化合物形式存在，且約18%之該化合物缺乏3’端核苷。

設計其他化合物，且離體及活體內測試此等化合物之穩定性。如上文所述進行離體測試。對於活體內測試，將化合物投與小鼠，分離腎臟組織，且如關於離體分析所述進行化合物之萃取 及偵測。表U展示化合物25923、25220及25221之結構，及穩定性量測之結果。

在UUO模型中測試化合物25220及25221以及25923對纖維化之作用。如下處理各組8只動物：假手術對照組、UUO與PBS、UUO與25220、UUO與25221，或UUO與25923。相對於UUO程序當天，PBS或抗miR-21化合物在第-5天、第-3天及第+3天投與。抗miR-21化合物以20mg/kg之劑量投與。因為抗miR化合物在UUO程序之前投與，所以此給藥方案視為預防性處理。在第10天時，犧牲動物且分離腎臟用於量測膠原蛋白表現。膠原蛋白表現藉由即時PCR量測且針對GAPDH進行校正。

該實驗之結果展示於圖2中。膠原蛋白1A1及膠原蛋白3A1分別展示於圖2A及2B中。投與化合物25220或25221使膠原蛋白1A1及膠原蛋白3A1表現減少統計顯著之量(*=p<0.05；**=p<0.01；***=p<0.001)，投與化合物25923亦如此。

除本文所述外，對本發明之各種修改對於熟習此項技術者而言根據前述描述亦顯而易見。該等修改亦意欲處於隨附申請專利範圍之範疇內。本申請案中引用之各參考文獻(包括(但不限於)期刊文章、美國及非美國專利、專利申請公開案、國際專利申請公開案、GENBANK®寄存編號及其類似物)明確以全文引用之方式併入本文中。

<110> 瑞格勒斯治療學公司

<120> 微型RNA化合物及調控MIR-21活性之方法

<130> REGUL-32423/TW-1/ORD

<150> US 61/478,767

<151> 2011-04-25

<150> US 61/565,779

<151> 2011-12-01

<160> 4

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 72

<212> RNA

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 3

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 4

Claims (31)

1. 一種化合物，其包含由16至19個連接之核苷組成之經修飾寡核苷酸，其中該經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與miR-21(SEQ ID NO：1)互補，且其中該經修飾寡核苷酸按5’至3’方向包含以下核苷型態II之至少16個連續核苷：N^M-N^B-N^Q-N^Q-N^B-(N^Q-N^Q-N^Q-N^B)₃-N^Q-N^Z其中N^M為非雙環核苷之經修飾核苷；各N^B獨立地為雙環核苷；各N^Q獨立地為非雙環核苷；且N^Z為經修飾之核苷；且其中(i)各雙環核苷包含非甲基化之核苷鹼基，或(ii)不多於二個非雙環核苷為2-O’-甲氧基乙基核苷且非雙環核苷彼此為β-D-去氧核糖核苷。
2. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸包含核苷型態II之至少17個、至少18個或至少19個連續核苷。
3. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸之核苷鹼基序列與miR-21之核苷鹼基序列(SEQ ID NO：1)至少90%互補、至少95%互補或100%互補。
4. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中各雙環核苷獨立地選自LNA核苷、cEt核苷及ENA核苷。
5. 如申請專利範圍第4項之化合物，其中各雙環核苷為S-cEt核苷。
6. 如申請專利範圍第4項之化合物，其中各雙環核苷為LNA核苷。
7. 如申請專利範圍第4項之化合物，其中各非雙環核苷獨立地選自β-D-去氧核糖核苷及2’-O-甲氧基乙基核苷。
8. 如申請專利範圍第7項之化合物，其中各非雙環核苷為β-D-去氧核糖核苷。
9. 如申請專利範圍第7項之化合物，其中各非雙環核苷為2’-O-甲氧基乙基核苷。
10. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸由核苷型態II之17、18或19個連接之核苷組成。
11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項之化合物，其中至少一個核苷間鍵結為經修飾核苷間鍵結，或其中各核苷間鍵結均為經修飾核苷間鍵結，且其中該經修飾核苷間鍵結任意地為硫代磷酸酯核苷間鍵結。
12. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中至少一個胞嘧啶為5-甲基胞嘧啶，或其中各胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶。
13. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中：a. N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為2’-O-甲氧基乙基核苷；b. N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為2’-O-甲氧基乙基核苷；且N^Z為2’-O-甲氧基乙基核苷；c. N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為S-cEt核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；各N為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為S-cEt核苷；d. N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為LNA核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為2’-O-甲氧基乙基核苷；或 e. N^M為2’-O-甲氧基乙基核苷；各N^B為LNA核苷；各N^Q為β-D-去氧核糖核苷；且N^Z為LNA核苷。
14. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該經修飾寡核苷酸具有核苷鹼基序列SEQ ID NO：3，或其中該經修飾寡核苷酸具有核苷鹼基序列SEQ ID NO：4，且其中序列中各T獨立選自T及U。
15. 一種如申請專利範圍第1至14項中任一項之化合物之用途，其用於製造抑制細胞內miR-21之活性的醫藥品。
16. 如申請專利範圍第15項之用途，其中該細胞在活體內，或其中該細胞在活體外。
17. 如申請專利範圍第15項或第16項之用途，其中該細胞為纖維母細胞、過度增殖性細胞、角化細胞或乏氧細胞。
18. 一種如申請專利範圍第1至14項中任一項之化合物之用途，其用於製造減少細胞中之膠原蛋白表現之醫藥品。
19. 一種如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物之用途，其用於製造治療、預防或延遲與miR-21相關之疾病之發作之醫藥品。
20. 如申請專利範圍第19項之用途，其中該疾病為纖維化。
21. 如申請專利範圍第20項之用途，其中該纖維化係選自腎纖維化、肺纖維化、肝纖維化、心臟纖維化、皮膚纖維化、年齡相關性纖維化、脾纖維化、硬皮病及移植後纖維化。
22. 如申請專利範圍第21項之用途，其中：a.該腎纖維化存在於患有選自以下之疾病的個體中：腎絲球硬化、腎小管間質性纖維化、IgA腎病、間質性纖維化/腎小管萎縮；慢性腎損傷、腎絲球疾病、腎絲球腎炎、糖尿病、特發性局部區段性腎絲球硬化、膜性腎病、塌陷性腎絲球病、慢性復發性腎臟感染及末期腎病； b.該腎纖維化由腎臟之急性或反復性創傷引起；c.該肝纖維化存在於患有選自以下之疾病的個體中：慢性肝損傷、肝炎感染、非酒精性脂肪變性肝炎及肝硬化；d.該肺纖維化為特發性肺纖維化；及/或e.該個體患有慢性阻塞性肺病。
23. 一種如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之化合物之用途，其用於製造治療纖維增生性病症之醫藥品。
24. 如申請專利範圍第19項至第23項中任一項之用途，其中該醫藥品用於投予至一或多種組織中miR-21表現升高之個體。
25. 如申請專利範圍第19項至第23項中任一項之用途，其中該醫藥品用於投予至需要改善器官功能之個體，其中該器官功能係選自心臟功能、肺功能、肝功能及腎功能。
26. 如申請專利範圍第19項至第23項中任一項之用途，其中該醫藥品與至少一種選自以下之治療劑一起投予：消炎劑、免疫抑制劑、抗糖尿病劑、地高辛(digoxin)、血管舒張藥、血管緊張素II轉化酶(ACE)抑制劑、血管緊張素II受體阻斷劑(ARB)、鈣通道阻斷劑、異山梨醇二硝酸酯、肼屈嗪(hydralazine)、硝酸酯、肼屈嗪、β-阻斷劑、利鈉肽、類肝素及結締組織生長因子抑制劑。
27. 如申請專利範圍第26項之用途，其包含投予至少一種ACE抑制劑。
28. 如申請專利範圍第27項之用途，其中該ACE抑制劑選自卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、賴諾普利(lisinopril)、貝那普利(benazepril)、喹那普利(quinapril)、福辛普利(fosinopril)及雷米普利(ramipril)。
29. 如申請專利範圍第26項之用途，其包含投予至少一種ARB抑制劑。
30. 如申請專利範圍第29項之用途，其中該ARB抑制劑選自坎地 沙坦(candesartan)、伊貝沙坦(irbesartan)、奧美沙坦(olmesartan)、洛沙坦(losartan)、纈沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisartan)及依普沙坦(eprosartan)。
31. 如申請專利範圍第19項至第23項中任一項之用途，其中該醫藥品投予至人類。

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