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TWI673361B - 重組肉毒桿菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神經毒素 - Google Patents

重組肉毒桿菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神經毒素 Download PDF

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TWI673361B
TWI673361B TW107110108A TW107110108A TWI673361B TW I673361 B TWI673361 B TW I673361B TW 107110108 A TW107110108 A TW 107110108A TW 107110108 A TW107110108 A TW 107110108A TW I673361 B TWI673361 B TW I673361B
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艾咪 克森斯
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英商益普生生物創新公司
英商益普生生物製藥公司
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Abstract

本發明提供一種包含連續核苷酸之序列的核酸序列，其中該連續核苷酸之序列與SEQ ID NO：1之核酸序列具有至少90%之序列一致性，且其中該連續核苷酸之序列編碼單鏈BoNT/E1蛋白。本發明亦提供在大腸桿菌(E.coli)宿主細胞中產製可溶性單鏈BoNT/E1蛋白之方法以及產製可溶性雙鏈BoNT/E1蛋白之方法。

Description

重組肉毒桿菌(Clostridium botulinum)神經毒素
本專利申請案主張於西元2012年10月31日提出申請之GB 1219602.8的優先權，其以參照方式整體納入本文。
本發明關於編碼血清型E型肉毒桿菌(C.botulinum)神經毒素(BoNT/E)之核酸序列及用於產製重組BoNT/E之方法。本發明亦關於重組BoNT/E之對應醫藥用途。
肉毒神經毒素係由肉毒桿菌以大型蛋白複合體之形式產製，該大型蛋白複合體係由BoNT本身複合多種附屬蛋白組成。目前有七種不同的肉毒神經毒素血清型，即肉毒神經毒素A型、B型、C1型、D型、E型、F型及G型，它們皆有類似結構及作用模式。不同的BoNT血清型可根據特定中和抗血清之失活區別，該血清型分類與胺基酸層級之序列一致性百分比有關。給定血清型之BoNT蛋白可根據胺基酸之序列一致性百分比進一步分成不同亞型。
BoNT是已知最強之毒素，對小鼠之中位致死劑量(LD50)依血清型而定自0.5至5ng/kg不等。BoNT於消化道吸收，在進入循環系統之後，與膽鹼神經末稍之突觸前 膜結合而防止神經末梢釋放神經傳遞物質乙醯膽鹼。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F及BoNT/G切割突觸囊泡相關膜蛋白(VAMP)；BoNT/C、BoNT/A及BoNT/E切割突觸相關蛋白25(SNAP-25)；且BoNT/C切割突觸融合蛋白。
在天然中，肉毒桿菌神經毒素係形成為單鏈多肽，在轉譯後經蛋白水解切割修飾形成由雙硫鍵連接之二條多肽鏈。切割發生於通常被稱為活化位點之特定切割位點，其係位於提供鏈間雙硫鍵之半胱胺酸殘基之間。此雙鏈形式為該毒素之活化形式。這二條鏈被稱為重鏈(H鏈)及輕鏈(L鏈)，分子量大約分別為100kDa及50kDa。該H鏈包含C端靶向成分(HC結構域)及N端轉位成分(HN結構域)。切割位點位於L鏈及轉位成分之間。在HC結構域與彼之目標神經元結合且經由核內體將該結合之毒素內化至細胞內之後，該HN結構域將該L鏈轉位穿過核內體膜至細胞質液，且該L鏈提供蛋白酶功能(又稱為非細胞毒性蛋白酶)。
非細胞毒性蛋白酶係藉由SNARE蛋白(例如SNAP-25、VAMP或Syntaxin)之蛋白水解切割胞內轉運蛋白作用-見Gerald K(2002)"Cell and Molecular Biology”(4th edition)John Wiley & Sons,Inc。縮寫字SNARE源自可溶性(Soluble)NSF連接(Attachment)受體(Receptor)，其中NSF代表N-乙基順丁烯二醯亞胺敏感性因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白為胞內囊泡融合所必須，因此也是自細胞經由囊泡運輸分泌分子所 需。該蛋白酶功能為鋅依賴性內肽酶活性且展現對SNARE蛋白之高受質特異性。因此，一旦被遞送至所欲標靶細胞，該非細胞毒性蛋白酶能抑制該標靶細胞之細胞分泌。肉毒桿菌神經毒素之L鏈蛋白酶係切割SNARE蛋白之非細胞毒性蛋白酶。
肉毒桿菌神經毒素廣為周知的能力為造成肌肉弛緩性痲痺。該肌肉弛緩效果導致肉毒桿菌神經毒素(如BoNT/A)被用於各種醫學及美容用途，包括處理眉間皺紋或運動過度型皺紋、頭痛、半邊顏面不自主痙攣、膀胱過動症、多汗症、法令紋、頸肌張力異常、瞼痙攣及肌痙攣。
傳統上，BoNT之產製係藉由培養肉毒桿菌然後分離及純化該肉毒桿菌神經毒素複合物進行。然而，以此方式產製BoNT之效率不彰，提供低蛋白產率。此外，肉毒桿菌係孢子形成細菌，因此需要特殊培養器具及場所，若培養像是大腸桿菌(E.coli)之類的細菌則無此需求。BoNT使用之增加因此導致產製及純化BoNT之其他及/或改善方法之需求。
US 20080103098描述用於產製雙鏈形式之重組BoNT蛋白之方法，該方法包含在大腸桿菌宿主細胞中表現重組核酸建構體。然而，該方法需要插入特定、非天然(即非梭菌性)五肽序列至該神經毒素之圈環結構域。該插入之五肽序列形成在細胞溶解時由內源性大腸桿菌蛋白酶切割之活化切割位點。因此US 20080103098之方法揭示為了 達到最佳BoNT表現，該BoNT序列必須藉由插入非天然切割位點加以修飾。
US 7132259描述編碼BoNT蛋白之重組核酸分子。然而，US 7132259之核酸分子係經修飾以利用非天然切割位點取代天然切割位點。因此，US 7132259之方法亦揭示插入非天然切割位點為最佳BoNT表現所需。
US 6495143描述用於誘導免疫反應(如免疫接種)之編碼BoNT之重鏈(HC)的片段之重組核酸分子。然而，該核酸分子不編碼全長BoNT序列。在大腸桿菌中表現及純化破傷風毒素及BoNT之個別H及L鏈係可達成；這些經分離之鏈本身不具毒性。在分離產製這些肽鏈之後，在嚴格控制條件下該H及L次單位可藉由氧化雙硫鍵結組合以形成活性雙鏈。不幸的是，此策略具有許多缺點。首先，表現及分離大量之個別鏈並不實際；特別是，當H鏈不存在時，該經分離之L鏈相當不溶於水性溶液，因此高度易受蛋白水解降解。第二，在試管內氧化該等經個別表現及純化之H及L鏈以產製活性雙鏈的效率相當低，導致低產率之活性毒素及產生許多無活性之不正確摺疊或氧化形式。純化含有該正確摺疊及氧化之H及L鏈的毒素非常困難，如同自該些不活化形式及未反應之分開H及L鏈分離一樣困難。因此，US 6495143之方法有許多重大缺點。
因此該領域需要有用於產製重組BoNT之改善方法，特別是活化雙鏈BoNT重組BoNT/E。
本發明藉由提供申請專利範圍中提及之核酸序列及方法以解決一或多種上述問題。
在一態樣中，本發明提供一種包含連續核苷酸之序列之核酸序列，其中該連續核苷酸之序列與SEQ ID NO：1之核酸序列具有至少80%(例如至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9或100%)之序列一致性，且其中該連續核苷酸之序列編碼單鏈BoNT/E1蛋白。
BoNT/E血清型分成八種亞型：BoNT/E1至BoNT/E8，它們具有至少90%胺基酸序列一致性；一給定亞型中之BoNT/E蛋白具有更高之胺基酸序列一致性百分比(例如至少95%或更高)。如上所述，本發明之核酸序列編碼BoNT/E1蛋白。BoNT/E1蛋白的一例為由UniParc胺基酸序列UPI000016EA7F編碼之蛋白。BoNT/E1蛋白的另一例為由SEQ ID NO：2之胺基酸序列所編碼之蛋白。
本發明之核酸序列經設計為在大腸桿菌細胞中有利地提供高量表現。
許多因素影響給定蛋白之表現量。其中的一個因素為編碼該蛋白之mRNA序列的轉譯速率。此因素本身受到mRNA使用何種特定密碼子表現蛋白之各個胺基酸的影響。有些密碼子的轉譯比其他密碼子更快。各胺基酸的密碼子選擇可能各異，因為mRNA密碼子在天然中有簡併性。許多不同的密碼子皆可定義相同的胺基酸；因此許多 不同的mRNA序列可編碼該相同蛋白。定義相同胺基酸之不同密碼子被稱為同義密碼子。在特定mRNA中同義密碼子的精準混合影響該經編碼之蛋白的轉譯速率。
許多不同的原因造成有些密碼子比其他密碼子更快被轉譯。每個密碼子藉由招募一個與胺基酸附著之tRNA分子以定義該胺基酸。轉譯速度受到各種不同tRNA分子之相對豐度影響、受到每個特定tRNA分子與招募其之密碼子結合的親和性影響，也受到其他因素像是該密碼子-tRNA分子對與轉譯機轉之其他元件的交互作用影響。密碼子的大概轉譯速率可藉由測定不同密碼子在高度表現基因中出現的頻率預估。然而，不是所有頻繁出現之密碼子皆導致理想表現。
不希望被任何特定理論束縛，本發明人相信BoNT/E1核酸序列之理想表現可藉由減少某些密碼子的頻率(即在序列中的發生次數)達成，該等密碼子以下稱為「緩慢密碼子」並詳述。在這方面，本發明人相信該等緩慢密碼子與減少之轉譯速率有關。
本發明人採用合理序列設計之方法產製本發明之核酸序列。其中讓本發明之核酸序列得以提供該編碼BoNT/E1蛋白之高度表現量的一種方法，係具有理想數量之緩慢密碼子(例如減少緩慢密碼子出現在序列中的頻率)。
在一實施態樣中，該核酸序列具有最多160個緩慢密碼子(例如最多160、150、140、130、120、110、100、90、95、94、93、92、91、90、89、88或87個緩慢密碼子)。
因此，在一實施態樣中，該核酸序列具有0至160個緩慢密碼子(例如0至160、0至150、0至140、0至130、0至120、0至110、0至100、0至90、0至95、0至94、0至93、0至92、0至91、0至90、0至89、0至88或0至87個緩慢密碼子)。
在一實施態樣中，該核酸序列具有60至160個緩慢密碼子(例如60至160、60至150、60至140、70至 150、70至140、70至130、70至120、70至110、70至100、70至90、80至130、80至120、80至110、80至100或80至90個緩慢密碼子)。
在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中，該核酸序列的前50%相較於該核酸序列的後50%具有較少緩慢密碼子。該核酸序列的前50%係定義為參照核苷酸位置編號1為起點，因此包含轉譯開始之位點；該核酸序列的後50%包含轉譯終止之位點。舉例來說，以SEQ ID NO：1為例(總長為3759個核苷酸)，該序列之前半可由核苷酸位置1至1881表示(包含627個核苷酸三連體)，該序列之後半可由位置1882至3759表示(包含626個核苷酸三連體)；或者，該序列之前半可由核苷酸位置1至1878表示(包含626個核苷酸三連體)，該序列之後半可由位置1879至3759表示(包含627個核苷酸三連體)。
在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中，該核酸序列(如上述)包含最多30個(例如30、25、20、15或10個)苯丙胺酸緩慢密碼子(RNA=UUU；DNA=TTT)。在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中，該核酸序列(如上述)包含最多10個苯丙胺酸緩慢密碼子(RNA=UUU；DNA=TTT)。
在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中(包括前述關於苯丙胺酸緩慢密碼子之實施 態樣)，該核酸序列(如上述)包含最多30個(例如30、25、20、19或18個)酪胺酸緩慢密碼子(RNA=UAU；DNA=TAT)。在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中(包括前述關於苯丙胺酸緩慢密碼子之實施態樣)，該核酸序列(如上述)包含最多18個酪胺酸緩慢密碼子(RNA=UAU；DNA=TAT)。
在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中(包括前述關於苯丙胺酸及/或酪胺酸緩慢密碼子之實施態樣)，該核酸序列(如上述)包含最多19個(例如19、18、17、16、15、12、10、9、8、7、6或5個)白胺酸緩慢密碼子(RNA=UUA及/或CUA；DNA=TTA及/或CTA)。在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中(包括前述關於苯丙胺酸及/或酪胺酸緩慢密碼子之實施態樣)，該核酸序列(如上述)包含最多5個白胺酸緩慢密碼子(RNA=UUA及/或CUA；DNA=TTA及/或CTA)。
在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中(包括前述關於苯丙胺酸、酪胺酸及/或白胺酸緩慢密碼子之實施態樣)，該核酸序列(如上述)包含最多14個(例如14、12、10、8、6、5、4或3個)麩醯胺酸緩慢密碼子(RNA=CAA；DNA=CAA)。在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中(包括前述關於苯丙胺酸、酪胺酸及/或白胺酸緩慢密碼子之實施態樣)，該核酸序列(如上述)包含最多3個麩醯胺酸緩慢密碼 子(RNA=CAA；DNA=CAA)。
在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中(包括前述關於苯丙胺酸、酪胺酸、白胺酸及/或麩醯胺酸緩慢密碼子之實施態樣)，該核酸序列(如上述)包含最多20個(例如20、19、18、17或16個)絲胺酸緩慢密碼子(RNA=UCA及/或UCG；DNA=TCA及/或TCG)。在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中(包括前述關於苯丙胺酸、酪胺酸、白胺酸及/或麩醯胺酸緩慢密碼子之實施態樣)，該核酸序列(如上述)包含最多16個絲胺酸緩慢密碼子(RNA=UCA及/或UCG；DNA=TCA及/或TCG)。
在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中(包括前述關於苯丙胺酸、酪胺酸、白胺酸、麩醯胺酸及/或絲胺酸緩慢密碼子之實施態樣)，該核酸序列(如上述)包含最多23個(例如23、22、21、20或19個)脯胺酸緩慢密碼子(RNA=CCA及/或CCG；DNA=CCA及/或CCG)。在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中(包括前述關於苯丙胺酸、酪胺酸、白胺酸、麩醯胺酸及/或絲胺酸緩慢密碼子之實施態樣)，該核酸序列(如上述)包含最多19個脯胺酸緩慢密碼子(RNA=CCA及/或CCG；DNA=CCA及/或CCG)。
在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中(包括前述關於苯丙胺酸、酪胺酸、白胺 酸、麩醯胺酸、絲胺酸及/或脯胺酸緩慢密碼子之實施態樣)，該核酸序列(如上述)包含最多3個(例如3或2個)半胱胺酸緩慢密碼子(RNA=UGU；DNA=TGT)。在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中(包括前述關於苯丙胺酸、酪胺酸、白胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸及/或脯胺酸緩慢密碼子之實施態樣)，該核酸序列(如上述)包含最多2個半胱胺酸緩慢密碼子(RNA=UGU；DNA=TGT)。
在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中(包括前述關於苯丙胺酸、酪胺酸、白胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、脯胺酸及/或半胱胺酸緩慢密碼子之實施態樣)，該核酸序列(如上述)包含最多5個(例如5或4個)組胺酸緩慢密碼子(RNA=CAU；DNA=CAT)。在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中(包括前述關於苯丙胺酸、酪胺酸、白胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、脯胺酸及/或半胱胺酸緩慢密碼子之實施態樣)，該核酸序列(如上述)包含最多4個組胺酸緩慢密碼子(RNA=CAU；DNA=CAT)。
在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中(包括前述關於苯丙胺酸、酪胺酸、白胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、脯胺酸、半胱胺酸及/或組胺酸緩慢密碼子之實施態樣)，該核酸序列(如上述)包含5至10個(例如5、6、7、8、9或10個)精胺酸緩慢密碼子(RNA=CGG；DNA=CGG)。在可任意選擇地與上述實施態 樣之任一或多者組合之一實施態樣中(包括前述關於苯丙胺酸、酪胺酸、白胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、脯胺酸、半胱胺酸及/或組胺酸緩慢密碼子之實施態樣)，該核酸序列(如上述)包含10個精胺酸緩慢密碼子(RNA=CGG；DNA=CGG)。
在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中，該核酸序列(如上述)包含最多30個(例如30、25、20、15或10個；較佳10個)苯丙胺酸緩慢密碼子(RNA=UUU；DNA=TTT)，及最多30個(例如30、25、20、19或18個；較佳18個)酪胺酸緩慢密碼子(RNA=UAU；DNA=TAT)。
在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中，該核酸序列(如上述)包含最多30個(例如30、25、20、15或10個；較佳10個)苯丙胺酸緩慢密碼子(RNA=UUU；DNA=TTT)、最多30個(例如30、25、20、19或18個；較佳18個)酪胺酸緩慢密碼子(RNA=UAU；DNA=TAT)及最多19個(例如19、18、17、16、15、12、10、9、8、7、6或5個；較佳5個)白胺酸緩慢密碼子(RNA=UUA及/或CUA；DNA=TTA及/或CTA)。
在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中，該核酸序列(如上述)包含最多30個(例如30、25、20、15或10個；較佳10個)苯丙胺酸緩慢密碼子(RNA=UUU；DNA=TTT)、最多30個(例如30、 25、20、19或18個；較佳18個)酪胺酸緩慢密碼子(RNA=UAU；DNA=TAT)、最多19個(例如19、18、17、16、15、12、10、9、8、7、6或5個；較佳5個)白胺酸緩慢密碼子(RNA=UUA及/或CUA；DNA=TTA及/或CTA)及最多14個(例如14、12、10、8、6、5、4或3個；較佳3個)麩醯胺酸緩慢密碼子(RNA=CAA；DNA=CAA)。
在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中，該核酸序列(如上述)包含：最多10個苯丙胺酸緩慢密碼子；最多18個酪胺酸緩慢密碼子；最多2個半胱胺酸緩慢密碼子；最多4個組胺酸緩慢密碼子；最多3個麩醯胺酸緩慢密碼子；最多19個脯胺酸緩慢密碼子；最多16個絲胺酸緩慢密碼子；及最多5個白胺酸緩慢密碼子。
在可任意選擇地與上述實施態樣之任一或多者組合之一實施態樣中，該核酸序列(如上述)包含：最多10個苯丙胺酸緩慢密碼子；最多18個酪胺酸緩慢密碼子；最多2個半胱胺酸緩慢密碼子；最多4個組胺酸緩慢密碼子；最多3個麩醯胺酸緩慢密碼子； 最多19個脯胺酸緩慢密碼子；最多16個絲胺酸緩慢密碼子；最多5個白胺酸緩慢密碼子；及最多10個精胺酸緩慢密碼子。
在一實施態樣中，其中該核酸序列係如上述之核酸序列，該單鏈BoNT/E1蛋白包含連續胺基酸之序列，且其中該連續胺基酸之序列與SEQ ID NO：2之胺基酸序列具有至少95%(例如至少95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%)之序列一致性。
在一實施態樣中，其中該核酸序列係如上述之核酸序列，該單鏈BoNT/E1蛋白包含由選自下列之胺基酸序列提供之天然活化部位：KGIRK、VKGIRKS、SVKGIRKSI、VSVKGIRKSI、IVSVKGIRKSI、NIVSVKGIRKSI、KNIVSVKGIRKSI、CKNIVSVKGIRKSI、KNIVSVKGIRKSIC及CKNIVSVKGIRKSIC。
在一實施態樣中，該核酸序列係如上述之核酸序列，唯該如上述之單鏈BoNT/E1或上述之連續胺基酸序列包括下列胺基酸(其中該胺基酸位置編號始於該BoNT/E1蛋白之N端胺基酸殘基且終於C端胺基酸殘基)之一或多者(例如一或多者、二或多者、三或多者、四或多者、五或多者、六或多者、七或多者或八者)：位置177之甘胺酸、位置198之絲胺酸、位置340之丙胺酸、位置773之白胺酸、位置963之白胺酸、位置964之麩醯胺酸、位置967之丙胺酸、位置1195之天冬 醯胺酸。
在一實施態樣中，該一或多個胺基酸包含(或由下列組成)位置177之甘胺酸、位置198之絲胺酸、位置340之丙胺酸、位置773之白胺酸、位置963之白胺酸、位置964之麩醯胺酸、位置967之丙胺酸及位置1195之天冬醯胺酸。
在一實施態樣中，該一或多個胺基酸包含(或由下列組成)位置177之甘胺酸、位置340之丙胺酸、位置773之白胺酸、位置963之白胺酸、位置964之麩醯胺酸、位置967之丙胺酸及位置1195之天冬醯胺酸。
在一實施態樣中，該一或多個胺基酸包含(或由下列組成)位置177之甘胺酸及下列一或多者(例如一或多者、二或多者、三或多者、四或多者、五或多者、六或多者或七者)：位置198之絲胺酸、位置340之丙胺酸、位置773之白胺酸、位置963之白胺酸、位置964之麩醯胺酸、位置967之丙胺酸、位置1195之天冬醯胺酸。
在一實施態樣中，該一或多個胺基酸包含(或由下列組成)位置198之絲胺酸及下列一或多者(例如一或多者、二或多者、三或多者、四或多者、五或多者、六或多者或七者)：位置177之甘胺酸、位置340之丙胺酸、位置773之白胺酸、位置963之白胺酸、位置964之麩醯胺酸、位置967之丙胺酸及位置1195之天冬醯胺酸。
在一實施態樣中，該一或多個胺基酸包含(或由下列組成)位置340之丙胺酸及下列一或多者(例如一或多者、 二或多者、三或多者、四或多者、五或多者、六或多者或七者)：位置177之甘胺酸、位置198之絲胺酸、位置773之白胺酸、位置963之白胺酸、位置964之麩醯胺酸、位置967之丙胺酸、位置1195之天冬醯胺酸。
在一實施態樣中，該一或多個胺基酸包含(或由下列組成)位置773之白胺酸及下列一或多者(例如一或多者、二或多者、三或多者、四或多者、五或多者、六或多者或七者)：位置177之甘胺酸、位置198之絲胺酸、位置340之丙胺酸、位置963之白胺酸、位置964之麩醯胺酸、位置967之丙胺酸、位置1195之天冬醯胺酸。
在一實施態樣中，該一或多個胺基酸包含(或由下列組成)位置963之白胺酸及下列一或多者(例如一或多者、二或多者、三或多者、四或多者、五或多者、六或多者或七者)：位置177之甘胺酸、位置198之絲胺酸、位置340之丙胺酸、位置773之白胺酸、位置964之麩醯胺酸、位置967之丙胺酸、位置1195之天冬醯胺酸。
在一實施態樣中，該一或多個胺基酸包含(或由下列組成)位置964之麩醯胺酸及下列一或多者(例如一或多者、二或多者、三或多者、四或多者、五或多者、六或多者或七者)：位置177之甘胺酸、位置198之絲胺酸、位置340之丙胺酸、位置773之白胺酸、位置963之白胺酸、位置967之丙胺酸、位置1195之天冬醯胺酸。
在一實施態樣中，該一或多個胺基酸包含(或由下列組成)位置967之丙胺酸及下列一或多者(例如一或多者、 二或多者、三或多者、四或多者、五或多者、六或多者或七者)：位置177之甘胺酸、位置198之絲胺酸、位置340之丙胺酸、位置773之白胺酸、位置963之白胺酸、位置964之麩醯胺酸、位置1195之天冬醯胺酸。
在一實施態樣中，該一或多個胺基酸包含(或由下列組成)位置1195之天冬醯胺酸及下列一或多者(例如一或多者、二或多者、三或多者、四或多者、五或多者、六或多者或七者)：位置177之甘胺酸、位置198之絲胺酸、位置340之丙胺酸、位置773之白胺酸、位置963之白胺酸、位置964之麩醯胺酸、位置967之丙胺酸。
在一實施態樣中，如上所述之該一或多種胺基酸之存在提供BoNT/E1蛋白相較於缺乏該等胺基酸之BoNT/E1蛋白具有改善之溶解性。該改善之溶解性增加該蛋白於異源性(E.coli)表現系統之產率。
在一實施態樣中，其中該核酸序列係如上述之核酸序列，該連續核苷酸之序列相較於野生型BoNT/E1(SEQ ID NO：3)之核酸序列具有至少770個(例如至少770、775、780、785、790、795、800、810、820、830、840、850、860、870或880個)同義密碼子。因此，在一實施態樣中，該核酸序列包含至少770個與該野生型BoNT/E1(SEQ ID NO：3)之核酸序列中對應之密碼子不同但編碼相同胺基酸之密碼子。
在一實施態樣中，該核酸序列(如上述)具有至少41%(例如至少41或42%)之GC含量。在一實施態樣中， 該核酸序列(如上述)具有至少42%之GC含量。核酸GC含量(又稱為G-C含量或G+C含量)之概念關於給定核酸序列中G(鳥嘌呤)或C(胞嘧啶)核苷酸的比例。因此，在一實施態樣中，本發明之核酸序列的GC含量係經改變(例如藉由取代同義密碼子)以更密切符合優先表現於大腸桿菌宿主細胞中之核酸的GC含量，因此改善該序列之表現及提供增加之蛋白產量。
在一態樣中，本發明提供編碼如上述之核酸序列的表現載體。在一實施態樣中，該表現載體係pET-26b(+)載體。
在一態樣中，本發明提供包含如上述之核酸序列或如上述之表現載體的宿主細胞。在一實施態樣中，該宿主細胞是大腸桿菌(E.coli)。在一實施態樣中，該大腸桿菌宿主細胞是大腸桿菌BLR(DE3)細胞。
在一態樣中，本發明提供用於在大腸桿菌宿主細胞中產製可溶性單鏈BoNT/E1蛋白之方法，該方法包含：在大腸桿菌表現系統中表現核酸序列(如上述)。
用於在大腸桿菌表現系統中表現異源性蛋白之方法及技術係該領域廣為周知。
在一實施態樣中，該可溶性單鏈BoNT/E1蛋白係於該大腸桿菌宿主細胞之細胞質中表現。
在一實施態樣中，該可溶性單鏈BoNT/E1蛋白係以至少3mg/L(例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、25、40、45或50mg/L)之量表現。
在一實施態樣中，如上述之用於產製可溶性單鏈BoNT/E1蛋白之方法包含溶解該大腸桿菌宿主細胞以提供包含該可溶性單鏈BoNT/E1蛋白之大腸桿菌宿主細胞均質液。用於溶解宿主細胞如大腸桿菌宿主細胞之方法及技術係該領域所知。實例包括超音波震盪及使用高壓均質機。
在一態樣中，本發明提供用於產製可溶性雙鏈BoNT/E1蛋白之方法，該方法包含：提供包含連續胺基酸之序列的可溶性單鏈BoNT/E1蛋白，其中該連續胺基酸之序列與SEQ ID NO：2之胺基酸序列具有至少95%(例如至少95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%)之序列一致性，且使該BoNT/E1蛋白於溶液中與胰蛋白酶接觸。
當本發明之單鏈BoNT/E1蛋白與胰蛋白酶接觸時，該胰蛋白酶之蛋白水解作用切割該單鏈蛋白在該L-鏈蛋白酶成分與該轉位成分之間的位點以產生雙鏈蛋白，其中該雙鏈藉由雙硫鍵結連接(更詳細地說，在切割單鏈BoNT/E1之活化位點後形成的雙鏈為胺基酸殘基1至419之第一鏈及胺基酸殘基423至1252之第二鏈，殘基420、421及422在切割時被移除)。因此，胰蛋白酶可藉由將單鏈多肽轉換成活性雙鏈形式以用於活化該單鏈多肽。因此使用胰蛋白酶有利地表示不一定需要將外源性(非天然)切割位點以工程化手段加入本發明之BoNT/E1。
在一實施態樣中，提及胰蛋白酶包含切割與胰蛋白酶 相同之蛋白酶切割位點的胰蛋白酶樣酶。
胰蛋白酶切割其中特定胺基酸位於該經切割之肽鍵兩側的某些位置之蛋白序列。該等序列可以P4-P3-P2-P1-切割鍵-P’1-P’2-P’3-P’4命名表示；其中P1至P4分別表示位於該切割肽鍵N端側之位置1至4的胺基酸，P’1至P’4分別表示位於該切割肽鍵C端側之位置1至4的胺基酸。
最重要的是，胰蛋白酶切割其中由精胺酸或離胺酸佔據該P1位置之蛋白序列。當離胺酸位於該P1位置，有三種主要序列類型對胰蛋白酶不敏感：位於P’1位置之脯胺酸通常減少對胰蛋白酶切割之感受性(但色胺酸位於位置P2時則否)。
位於P2位置之半胱胺酸或天冬胺酸與位於P’1位置之天冬胺酸一起減少對胰蛋白酶切割之感受性。
位於P2位置之半胱胺酸與位於P’1位置之組胺酸或色胺酸一起減少對胰蛋白酶切割之感受性。
當精胺酸位於該P1位置，也有三種主要序列類型對胰蛋白酶不敏感： 位於P’1位置之脯胺酸通常減少對胰蛋白酶切割之感受性(但甲硫胺酸或可能的麩胺酸位於位置P2時則否)。
位於P2位置之半胱胺酸與位於P’1位置之離胺酸一起減少對胰蛋白酶切割之感受性。
位於P2位置之精胺酸與位於P’1位置之組胺酸或精胺酸一起減少對胰蛋白酶切割之感受性。
在一實施態樣中，本發明提供用於產製可溶性雙鏈BoNT/E1蛋白之方法(如上述)，唯該連續胺基酸序列包括一或多個(例如一或多個、二或多個、三或多個、四或多個、五或多個、六或多個或七個)下列胺基酸(其中該胺基酸位置編號始於該BoNT/E1蛋白之N端胺基酸且終於C端胺基酸殘基)：位置177之甘胺酸、位置198之絲胺酸、位置340之丙胺酸、位置773之白胺酸、位置963之白胺酸、位置964之麩醯胺酸、位置967之丙胺酸、位置1195之天冬醯胺酸。
在一實施態樣中，如上所述之該一或多種胺基酸之存在(及參考如上述之該一或多種胺基酸之多種排列組合)提供BoNT/E1蛋白相較於缺乏該等胺基酸之BoNT/E1蛋白具有改善之溶解性。該改善之溶解性可增加該蛋白於異源性表現系統之產率。
在一實施態樣中，其中本發明提供(如上述之)用於產製可溶性雙鏈BoNT/E1蛋白之方法，該可溶性單鏈BoNT/E1蛋白係由如上述之用於在大腸桿菌宿主細胞中產製可溶性單鏈BoNT/E1蛋白之方法提供。
在一實施態樣中，其中本發明提供(如上述之)用於產製可溶性雙鏈BoNT/E1蛋白之方法，該方法包含藉由使包含可溶性BoNT/E1蛋白與胰蛋白酶之該溶液與疏水性表面接觸以使該可溶性BoNT/E1蛋白與該胰蛋白酶分離，其中該可溶性BoNT/E1蛋白優先地與該疏水性表面結合。
本發明人發現高產率之活性雙鏈BoNT/E1蛋白可藉由使用疏水性純化之方法分離該活性雙鏈多肽與胰蛋白酶獲得。令人意外的是，此方法相較於使用離子交換層析之標準純化提供優異純化效果，本發明人發現離子交換層析無法有效分離該活性雙鏈多肽與胰蛋白酶。此外，該方法有利地提供不含活性蛋白酶之雙鏈BoNT/E1蛋白，該活性蛋白酶為一般純化方法的一部份。
產製活性重組BoNT/E1需要切割該分子成為活性雙鏈形式之蛋白水解步驟。此切割可藉由使用蛋白酶(胰蛋白酶)之試管內活化步驟達成。在該活化步驟之後，很重要的是自終產物移除該蛋白酶，如此亦可進一步防止對BoNT/E1之任何非特異性切割。
胰蛋白酶與BoNT/E1的等電點(pI)分別是9.32及6.2，這表示這二種蛋白的分離應藉由離子交換(IEX)層析達成，充分利用這二種分子之間的電荷差異。蛋白的靜電荷受到其周圍環境之pH的影響，將根據其獲得或失去質子而變得攜帶更多正電荷或負電荷。等電點係分子不帶電荷時之pH值，因此將不與帶電IEX培養基交互作用。這表示若蛋白在高於其pI之pH時將攜帶靜負電，且將與帶正電培養基如陰離子交換劑結合。類似地，若緩衝液pH低於該pI，該蛋白將攜帶靜正電且將不與陰離子交換劑結合。
根據此原則在pH 8時，可預期BoNT/E(其pI為6.2)將與陰離子交換管柱結合，然而pI為9.32之胰蛋白酶將 不結合，因此能分離這二種蛋白。IEX係簡單便宜的層析方法，其不需要將欲充填至管柱之蛋白以高鹽緩衝液配製，因此不會有因沉澱導致蛋白流失。
本發明人測試多種陰離子交換管柱，包括在pH 8時與交聯洋菜糖珠附著之強官能基及弱官能基。在每種情況，發明人皆發現大比例之胰蛋白酶如預期般未與管柱結合而出現在流出液。然而當以離子強度漸增之線性梯度洗脫管柱時，胰蛋白酶自管柱洗脫出來，表示有部分之胰蛋白酶能與管柱結合。當與BoNT/E1之洗脫比較時，發現胰蛋白酶非預期地以類似離子強度洗脫(表1；圖1)，顯示胰蛋白酶不如預期般分離，其存在於最終BoNT/E1純化產物，因此可能進一步降解BoNT/E1。
本發明人解決上述問題。詳細地說，本發明人意外發現理想的胰蛋白酶-BoNT/E1分離可藉由使用疏水分離表面達成(例如疏水交互作用層析(HIC)，其根據彼等之表面 疏水性差異，藉由利用這些蛋白與HIC介質之疏水性表面之間的可逆交互作用分離蛋白)。
在一實施態樣中，該疏水性表面係附著由芳基或烷基所組成之配體之惰性基材。
用語「芳基」係指芳香族基，例如苯基、萘基、噻吩基及吲哚基。
用語「烷基」係指脂肪族基，包括直鏈、支鏈、環狀基及彼等之組合。烷基可能具有1至12個碳原子。烷基之實例包括但不限於諸如甲基、乙基、丙基(例如正丙基、異丙基)、丁基(例如正丁基、異丁基、二級丁基、三級丁基)、戊基、己基、庚基及辛基之基。
在一實施態樣中，該疏水性表面係選自丁基、苯基或辛基配體。
在一實施態樣中，該疏水性表面包含丁基配體。在一實施態樣中，該疏水性表面包含苯基配體。在一實施態樣中，該疏水性表面包含辛基配體。
本發明人發現特別較佳之分離胰蛋白酶與BoNT/E之結果得自使用包含與惰性基材(諸如交聯洋菜糖或聚苯乙烯珠)偶合之烷基或芳基(例如丁基、苯基及辛基配體)的層析樹脂之HIC(表2；圖2)。
在一實施態樣中，分離該活性雙鏈BoNT/E1蛋白與胰蛋白酶之疏水性純化方法減少胰蛋白酶濃度至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少250倍、至少300倍、至少350倍、至少400倍、至少450倍或至少500倍。在較佳之實施態樣中，分離該活性雙鏈BoNT/E1蛋白與胰蛋白酶之疏水性純化方法減少胰蛋白酶濃度至少350倍。
在另一態樣中，本發明提供活性雙鏈BoNT/E1蛋白，其中第一鏈包含連續胺基酸之序列，且其中該連續胺基酸之序列與SEQ ID NO：2之位置1至419的胺基酸序列具有至少95%(例如至少95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%)之序列一致性；其中第二鏈包含連續胺基酸之序列，且其中該連續胺基酸之序列與SEQ ID NO：2之位置 423至1252的胺基酸序列具有至少95%(例如至少95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%)之序列一致性；其中該第一及第二鏈藉由該第一鏈上之半胱胺酸412與該第二鏈上之半胱胺酸426之間的雙硫鍵連接；唯該連續胺基酸序列包括一或多個(例如二或多個、三或多個、四或多個、五或多個、六或多個、七或多個或八個)下列胺基酸(其中該胺基酸位置編號始於該BoNT/E1蛋白之N端胺基酸且終於C端胺基酸殘基)：位置177之甘胺酸、位置198之絲胺酸、位置340之丙胺酸、位置773之白胺酸、位置963之白胺酸、位置964之麩醯胺酸、位置967之丙胺酸、位置1195之天冬醯胺酸。
在相關態樣中，本發明提供可由用於產製可溶性雙鏈BoNT/E1蛋白之(如上述之)方法獲得之活性雙鏈BoNT/E1蛋白。
在一態樣中，本發明提供包含(如上述之)活性雙鏈BoNT/E1蛋白之組成物，其中該組成物係實質上不含胰蛋白酶。
因此，該組成物係有利地實質上不含(用於藉由將單鏈多肽轉換成活性雙鏈形式以活化該單鏈多肽之)胰蛋白酶蛋白酶，因此防止非所欲之非特異性切割BoNT/E1蛋白。
在一實施態樣中，其中該(如上述之)組成物係實質上不含胰蛋白酶，該組成物包含每100奈克(ng)BoNT/E1蛋 白少於100皮克(pg)胰蛋白酶；例如每100ng BoNT/E1蛋白少於50、20、10、9、8、7、6或5pg胰蛋白酶。在一實施態樣中，該(如上述之)組成物包含每100ng BoNT/E1蛋白少於10pg胰蛋白酶，或每100ng BoNT/E1蛋白少於7pg胰蛋白酶，或每100ng BoNT/E1蛋白少於5pg胰蛋白酶。在較佳之實施態樣中，該(如上述之)組成物包含每100ng BoNT/E1蛋白少於10pg胰蛋白酶，或每100ng BoNT/E1蛋白少於7pg胰蛋白酶。
因此，在一實施態樣中，用語「實質上不含胰蛋白酶」表示每100ng BoNT/E1蛋白少於100pg胰蛋白酶；例如每100ng BoNT/E1蛋白少於50、20、10、9、8、7、6或5pg胰蛋白酶，較佳地每100ng BoNT/E1蛋白少於10pg胰蛋白酶，或每100ng BoNT/E1蛋白少於7pg胰蛋白酶。
用於測定組成物中之胰蛋白酶濃度之方法係該領域所知。舉例來說，本發明之組成物中的胰蛋白酶濃度可利用三明治式酶連接免疫吸附法(ELISA)測定。
在另一態樣中，本發明提供固體或液體醫藥組成物，其包含：(a)如上述之活性雙鏈BoNT/E1蛋白，及(b)安定劑。
在一實施態樣中，該(如上述之)組成物係實質上不含胰蛋白酶。在一實施態樣中，該組成物包含每100ng BoNT/E1蛋白少於100pg胰蛋白酶，例如每100ng BoNT/E1蛋白少於50、20、10、9、8、7、6或5pg胰蛋白酶。在一實施態樣中，該組成物包含每100ng BoNT/E1蛋白少於10pg胰蛋白酶，或每100ng BoNT/E1蛋白少於7pg胰蛋白酶。
可用於本發明之組成物中的安定劑包括蛋白安定劑，諸如白蛋白特別是人血清白蛋白(HSA)，及非蛋白安定劑。
可用於本發明之組成物中的非蛋白安定劑包括表面活性劑，特別是非離子性表面活性劑。非離子性表面活性劑之實例包括聚山梨醇酯，諸如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，及團聯共聚物諸如泊洛沙姆(poloxamer)(即聚乙烯與丙二醇之共聚物)。
在特定實施態樣中，該組成物不包含作為安定劑之蛋白。
根據本發明之特定實施態樣，該醫藥組成物係液體醫藥組成物，其包含：(a)如上述之活性雙鏈BoNT/E1蛋白；(b)為表面活性劑之非蛋白安定劑；及(c)水；其中該液體醫藥組成物不包含蛋白安定劑；且其中該液體醫藥組成物係實質上不含胰蛋白酶(例如該液體醫藥組成物包含每100ng BoNT/E1蛋白少於100pg胰蛋白酶，或每100ng BoNT/E1蛋白少於10pg胰蛋白酶，或每100ng BoNT/E1蛋白少於7pg胰蛋白酶，或 每100ng BoNT/E1蛋白少於5pg胰蛋白酶；較佳地其中該液體醫藥組成物包含每100ng BoNT/E1蛋白少於10pg胰蛋白酶，或每100ng BoNT/E1蛋白少於7pg胰蛋白酶)。
在一實施態樣中，該活性雙鏈BoNT/E1蛋白係以1至100ng/ml之濃度存在於該(如上述之)組成物中。在一實施態樣中，該活性雙鏈BoNT/E1蛋白係以5至50ng/ml之濃度存在於該(如上述之)組成物中，例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50ng/ml。在較佳之實施態樣中，該活性雙鏈BoNT/E1蛋白係以約20ng/ml之濃度存在。
在一實施態樣中，該(如上述之)表面活性劑係聚山梨醇酯，諸如平均聚合程度為20至100個單體單位之聚山梨醇酯，可能為例如聚山梨醇酯80。在較佳之實施態樣中，該聚山梨醇酯係蔬菜來源。該表面活性劑之濃度較佳係低於1%v/v，例如以聚山梨醇酯80為例約0.005%至0.02%v/v。
本發明之醫藥組成物亦可包含結晶劑。
所謂結晶劑係指尤其是維持凍乾肉毒桿菌神經毒素複合物(A、B、C、D、E、F或G型)或高純度肉毒桿菌神經毒素(A、B、C、D、E、F或G型)之機械強度餅狀結構之劑。當包含於固體調製劑中時，結晶劑亦具有膨脹效果。結晶劑特別包含氯化鈉。結晶劑之濃度可為例如0.1至0.5M，較佳地0.1至0.4M，特別是約0.15至0.3M。
本發明之醫藥組成物亦可包含緩衝劑以維持介於5.5至7.5或介於6.0至7.0之pH值。該緩衝劑可為任何能維持該適當pH之緩衝劑。舉例來說，用於本發明之組成物的緩衝劑可選自琥珀酸鹽、磷酸氫二鈉/檸檬酸及胺基酸如組胺酸。緩衝劑之濃度可為例如1至50mM，較佳地5至20mM，較佳約10mM。
本發明之醫藥組成物亦可包含雙醣。
用於本發明之組成物中的雙醣可選自蔗糖、海藻糖、甘露醇及乳糖。在特定實施態樣中，該雙醣係蔗糖。雙醣之濃度可為例如5至50mM，較佳地5至25mM，更佳地10至20mM，最佳約11.7mM。
在特定實施態樣中，該醫藥組成物係液體醫藥組成物，其包含：(a)如上述之活性雙鏈BoNT/E1蛋白；(b)為表面活性劑之非蛋白安定劑；(c)氯化鈉；(d)維持pH介於5.5至7.5之緩衝劑；(e)雙醣；及(f)無菌水其中該液體醫藥組成物不包含蛋白安定劑；且其中該液體醫藥組成物係實質上不含胰蛋白酶(例如該液體醫藥組成物包含每100ng BoNT/E1蛋白少於100pg胰蛋白酶，或每100ng BoNT/E1蛋白少於10pg胰蛋白酶，或每100ng BoNT/E1蛋白少於7pg胰蛋白酶，或 每100ng BoNT/E1蛋白少於5pg胰蛋白酶；較佳地其中該液體醫藥組成物包含每100ng BoNT/E1蛋白少於10pg胰蛋白酶，或每100ng BoNT/E1蛋白少於7pg胰蛋白酶)。
根據特定實施態樣，本發明之呈液體形式之醫藥組成物係密封於小瓶或立即可用之裝置，如針筒，不含液體/氣體介面，且於23至27℃維持穩定至少三個月或至少六個月，於2至8℃維持穩定至少12個月。
在一態樣中，本發明提供用於治療之如上述之活性雙鏈BoNT/E1蛋白，或可藉由蛋白水解切割該如上述之單鏈BoNT/E1蛋白獲得之活性雙鏈BoNT/E1蛋白，或如上述之組成物，或如上述之液體醫藥組成物。
本發明人已經證實本發明之活性雙鏈BoNT/E1蛋白及其組成物及液體醫藥組成物可被用於治療。適當治療可能包括美容醫療及醫學治療之方法。
SEQ ID NO索引
SEQ ID NO：1 理想化之BoNT/E1核酸序列
SEQ ID NO：2 BoNT/E1胺基酸序列
SEQ ID NO：3 野生型BoNT/E1核酸序列
SEQ ID NO：1 理想化之BoNT/E1核酸序列
SEQ ID NO：2 BoNT/E1胺基酸序列
SEQ ID NO：3 野生型BoNT/E1核酸序列
圖1來自陰離子交換管柱之洗脫組分，以評估胰蛋白酶與BoNT/E1之分離。胰蛋白酶、BoNT/E1之尖峰及鹽梯度係經標示。圖1A：Q-瓊脂糖HP；圖1B：DEAE瓊脂糖。
圖2來自疏水性交互作用管柱之洗脫組分，以評估胰蛋白酶與BoNT/E1之分離。胰蛋白酶、BoNT/E1之尖峰及鹽梯度係經標示。圖2A：苯基瓊脂糖HP；圖2B：丁基瓊脂糖HP；圖2C：辛基瓊脂糖FF。
圖3以西方墨點法測定之rBoNT/E1培養的可溶性表現量，與商用BoNT/E1比較。
圖4在非還原及還原條件下，rBoNT/E1的SDS-PAGE證實形成雙鏈結構。
實施例1 建構理想化的BoNT/E1核酸序列
首先藉由反轉譯BoNT/E1胺基酸序列(SEQ ID NO：2)以設計DNA序列。在N端加入限制序列(PstI)，在C端加入終止密碼子及其他限制序列(XbaI-終止密碼子-HindIII)。接著根據(如上述之)緩慢密碼子的數量及位置調整最佳化表現之DNA序列。
序列經理想化以選擇緩慢密碼子。特別是在序列開始處以得到理想的起始及開始轉譯。當緩慢密碼子被包括(根據表現宿主之密碼子偏性允許使用)，這些朝向序列終點(其中序列起點被定義為轉譯開始之處)。
一旦序列設計完成，利用獨特/天然PstI位點分二部分合成該理想化之DNA序列以供後續組裝成全長毒素基因。該第一基因之序列包括在胺基端之NdeI位點及在羧基端之PstI位點。此部分之基因長2895bp，編碼BoNT/E1 LC及HC之胺基部分。該第二基因之序列包括在N端之PstI位點及在羧基端之HindIII位點，常為882bp，編碼BoNT/E1 HC之羧基部分。
實施例2 建構表現載體BoNT/E1核酸序列
使用以載體pET-26b(+)(Novagen)為基礎之表現載體，其包括位於編碼BoNT/E1 ORF之DNA的起點及終點 之選殖限制位點NdeI及HindIII。pET-26b(+)載體為不可移動載體，但若與其他可移動質體共存則可移動。pET-26b(+)載體係經修飾以移除移動基因，使其無可移動性。
該表現載體係經NdeI及PstI消化，該經純化之載體主鏈與經相同限制酶消化之BoNT/E1 DNA的第一片段接合以產生中間產物。在第二選殖步驟中，經PstI及HindIII消化之來自第二片段的BoNT/E1 DNA係與步驟一之中間產物(亦經相同限制酶消化)接合。此導致產生表現載體中之BoNT/E1 DNA終產物。
實施例3 將BoNT/E1表現載體插入宿主
此實施例以使用大腸桿菌BLR(DE3)細胞為基礎，不過這些程序方法同樣適用於任何其他大腸桿菌表現菌株。大腸桿菌BLR(DE3)勝任細胞在使用前儲存於-70℃以下。細胞轉形係利用經修改之廠商程序進行。細胞於冰上解凍，製備10μL之次等分。取一等分加入1μL之質體DNA於42℃熱休克處理80秒。在冰上回復5分鐘後，添加90μL無動物成分SOC肉汁至該轉形物，然後移至震盪培養箱於37℃及250rpm下培養1小時。在培養後，取90μL各轉形物轉移塗抹至添加50μg/mL卡那黴素(kanamycin)之無動物成分LB洋菜膠板。該板於37℃培養16小時。
實施例4 宿主培養及可溶性rBoNT/E1蛋白表現
單一BoNT/E1轉形BLR(DE3)細胞菌落被用於接種包含100ml改良Terrific Broth(mTB)並添加0.2%葡萄糖胺及30μg/ml卡那黴素的250ml三角錐瓶。當使用Microbank珠或甘油原液(10-100μl)接種錐瓶時，此方法同樣適用。
該錐瓶於37℃以250RPM震盪培養16小時。取10ml之此起始培養液，用於接種各包含1L添加0.2%葡萄糖胺及30μg/ml卡那黴素之2L三角錐瓶。細胞於37℃以225RPM生長大約2小時直到到達OD600 0.5。此時，培養溫度降至16℃。1小時後，細胞藉由添加1mM IPTG 20小時以誘導BoNT/E1表現。藉由在4℃離心20分鐘以收集細胞，秤重，然後儲存於-20℃。
實施例5 自宿主萃取BoNT/E1蛋白及分析表現量
使表現rBoNT/E1之細胞團於室溫中解凍，以微量吸管將每克細胞重懸於添加10μl benzonase核酸酶之3ml Tris-NaCL重懸緩衝液。細胞以4μm振幅之超音波溶解-10x 30s開+>45s關。細胞溶解液於4℃以4000g離心1h以獲得在上清液中之可溶性rBoNT/E1。
Bradford試驗測定製備溶解液之總蛋白濃度
經稀釋之rBoNT/E1溶解液或BSA標準物樣本(50μL)被添加於1mL塑膠比色管。於各比色管中添加450μL之 Coomassie Bradford試驗試劑，使其在室溫中培養10分鐘然後讀取OD600。使用BSA標準物之值決定該溶解液中之蛋白量。
製備用於半定量性西方墨點分析之溶解物樣本
使用購自Metabiologics之商用BoNT/E1蛋白作為SDS-PAGE標準物。接著自表現細胞培養物之溶解液製備成已知總蛋白濃度之SDS-PAGE樣本。
西方墨點法
將樣本加入膠體並以200V電泳55分鐘，在不含甲醇之轉印緩衝液中以0.4mA處理1小時以轉印至硝化纖維素膜。該硝化纖維素轉印膜以0.5%BSA於PBS-0.1%Tween 20封閉1小時，然後與抗BoNT/E1抗體作用1小時。該轉印膜利用HRP共軛二級抗體偵測，以SuperSignal DuraWest受質顯影。該經顯影之轉印膜利用Syngene成像儀器成像(圖3)。
實施例6 初步純化及活化目標BoNT/E1蛋白成雙鏈形式
此實施例係根據捕捉及中間物管柱步驟之組合，不過該組合可更改或倒反以不同順序使用相同性質。該澄清之上清液被調製成高鹽濃度，加入疏水性捕捉管柱(丁基瓊脂糖)。利用低鹽Tris緩衝液之梯度將與管柱結合 之rBoNT/E1洗脫出。接著利用離子交換管柱如Q瓊脂糖進一步純化該洗脫出之蛋白，使用高鹽Tris緩衝液之梯度洗脫。然後加入胰蛋白酶至該洗脫出之rBoNT/E1樣本至終濃度2.5μg/ml，於37℃培養40分鐘。此啟動BoNT/E1活化環，形成最終BoNT/E1雙鏈結構，如還原性SDS-PAGE所證實(圖4)。
實施例7 最後純化不含活化蛋白酶之目標BoNT/E1蛋白
該活化之rBoNT/E1樣本立刻被加入高鹽緩衝液以加入疏水性管柱(丁基瓊脂糖)。管柱以高鹽緩衝液沖洗以移除微弱結合之胰蛋白酶，然後利用低鹽Tris緩衝液梯度進一步將胰蛋白酶移出管柱及該結合之rBoNT/E1蛋白。該rBoNT/E1蛋白接著於梯度後期洗脫出，遠離胰蛋白酶。
測定胰蛋白酶量之試驗
發展胰蛋白酶ELISA以測定存在於管柱組分及最終BoNT/E1樣本中之胰蛋白酶的量。於37℃下將抗胰蛋白酶捕捉抗體包覆至微量板上。達1小時將胰蛋白酶標準物及測試樣本添加至板上(100μL/孔)，在37℃下培養1小時，然後以二級抗胰蛋白酶抗體檢測。各樣本/管柱組分中之胰蛋白酶的量接著自標準物內插得到，將其疊加在純化層析圖上以證實胰蛋白酶與BoNT/E1分離(圖2B)。
實施例8 包含實質上不含胰蛋白酶之活性雙鏈BoNT/E1的調製劑
製備下列六種包含活性雙鏈BoNT/E1之液體組成物(表3)。
所有六種組成物儲存於25℃ 12周。在此期間利用非細胞內肽酶試驗測定雙鏈BoNT/E1蛋白酶功能之穩定性。在12周期間，六種調製劑的每月降解率皆低於每月5%，顯示這六種組成物的雙鏈BoNT/E1蛋白酶功能在25℃下維持穩定至少12周。
<110> 益普生生物創新公司(IPSEN BIOINNOVATION LIMITED)益普生生物製藥公司(IPSEN BIOPHARM LIMITED)
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<210> 1
<211> 3759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 理想化之BoNT/E1核酸序列
<400> 1
<210> 2
<211> 1252
<212> PRT
<213> 肉毒桿菌(Clostridium botulinum)
<400> 2
<210> 3
<211> 3759
<212> DNA
<213> 肉毒桿菌(Clostridium botulinum)
<400> 3

Claims (5)

  1. 一種包含連續核苷酸之序列之核酸序列，其中該連續核苷酸之序列與SEQ ID NO：1之核酸序列具有至少90%之序列一致性，且其中該連續核苷酸之序列編碼單鏈BoNT/E1蛋白。
  2. 如申請專利範圍第1項之核酸序列，其中該核酸具有最多160個緩慢密碼子。
  3. 如申請專利範圍第1項之核酸序列，其中該單鏈BoNT/E1蛋白包含連續胺基酸之序列，且其中該連續胺基酸之序列與SEQ ID NO：2之胺基酸序列具有至少95%之序列一致性。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之核酸序列，其中如申請專利範圍第1或2項之該單鏈BoNT/E1或如申請專利範圍第3項之該連續胺基酸之序列包括下列胺基酸之一或多者(其中該胺基酸位置編號始於該BoNT/E1蛋白之N端胺基酸殘基且終於C端胺基酸殘基)：位置177之甘胺酸位置198之絲胺酸位置340之丙胺酸位置773之白胺酸位置963之白胺酸位置964之麩醯胺酸位置967之丙胺酸位置1195之天冬醯胺酸。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之核酸序列，其中該連續核苷酸之序列與野生型BoNT/E1之核酸序列(SEQ ID NO：3)相比時具有至少785個同義密碼子。
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Angov E1, "Codon usage: nature's roadmap to expression and folding of proteins.", Biotechnol J. 2011 Jun;6(6):650-9. Navon S1 et al, "The role of codon selection in regulation of translation efficiency deduced from synthetic libraries.", Genome Biol. 2011;12(2):R12. *
Navon S1 et al, "The role of codon selection in regulation of translation efficiency deduced from synthetic libraries.", Genome Biol. 2011;12(2):R12.

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