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TWI658052B - 抗－ｒｓｐｏ抗體及使用方法 - Google Patents

抗－ｒｓｐｏ抗體及使用方法 Download PDF

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TWI658052B
TWI658052B TW103136065A TW103136065A TWI658052B TW I658052 B TWI658052 B TW I658052B TW 103136065 A TW103136065 A TW 103136065A TW 103136065 A TW103136065 A TW 103136065A TW I658052 B TWI658052 B TW I658052B
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碩維基 費德列克Ｊ 德
傑瑞米Ｍ 穆瑞
卡麥隆Ｌ 諾蘭
彥 吳
克利斯丁 譚
喬安 宏格
永梅 陳
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Abstract

本發明提供抗-RSPO抗體，特定言之是抗-RSPO2抗體及/或抗-RSPO3抗體，及其使用方法。

Description

抗-RSPO抗體及使用方法
相關申請案之交叉參考
本申請案根據35 U.S.C.§119主張2013年10月18日申請之美國臨時申請案第61/893,141號及2014年9月26日申請之美國臨時申請案第62/056,324號的權益，其內容以全文引用的方式併入本文中。
序列表
本申請案含有已經由EFS網(EFS-Web)提交並由此以全文引用的方式併入本文中之序列表。在2014年10月14日建立之該ASCII複本命名為P5719R1-WO_SequenceListing.txt且大小為122千位元組。
本發明提供抗-RSPO抗體，特定言之是抗-RSPO2抗體及/或抗-RSPO3抗體，及其使用方法。
R-反應素(RSPO)家族為在脊椎動物胚胎及成體中廣泛表現之一小群四種分泌蛋白質(RSPO1-RSPO4)。RSPO藉由強力地增強Wnt路徑活化而在發育及幹細胞生長中具有多效功能(Kazanskaya等人Dev.Cell 7：525-534(2004)；Kim等人，Cell Cycle 5：23-26(2006)；WO 2005/040418)。哺乳動物RSPO1-RSPO4共享40%-60%胺基酸序列一致性且由信號肽、兩個相鄰弗林樣富含半胱胺酸結構域(FU-CRD)、接著血小板反應素I型重複序列(TSR)結構域及帶正電之C端區域組成。 兩個FU-CRD不可或缺且足以促進Wnt/β-連環蛋白信號傳導(Kazanskaya等人，Dev.Cell 7：525-534(2004)；WO 2005/040418)。
LGR4(含有富含白胺酸重複序列[LRR]之G蛋白質偶合受體[GPCR]4)、LGR5及LGR6(Hsu等人，Mol.Endocrinol.12：1830-1845(1998)及Hsu等人，Mol.Endocinol.14：1257-1271(2000))為RSPO受體。LGR4/5/6受體之一個共同特徵為其在不同類型之成體幹細胞中表現。LGR5已描述為Wnt依賴性隔室中駐留幹細胞之標記物，包括小腸、結腸、胃及毛囊(Barker及Clevers Gastroenterology 138：1681-1696(2010)；Seshagiri等人，Nature 488：660-664(2012))。LGR6亦充當表皮層中多潛能幹細胞之標記物(Snippert等人，Science 327：1385-1389(2010))。LGR4在增殖性細胞中廣泛表現(Van Schoore等人，Histochem Cell Biol.124：35-50(2005))，且其基因剔除小鼠展示包括骨骼、腎臟、睾丸、皮膚及膽囊之許多器官中之發育缺陷(Mustata等人，EMBO Rep 12：558-564(2011))。LGR4/5/6受體具有17個LRR之中心陣列，在細胞外域中七跨膜螺旋前N端與C端側接富含半胱胺酸序列，且細胞外域為與RSPO之高親和力結合所不可或缺及足夠的(de Lau等人，Genome Biol.13：242(2011)及Wang等人，Genes & Dev.27：1339-1344(2013))。
在RSPO識別之後LGR4/5/6受體可實體上與低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/6)相互作用，從而RSPO及Wnt配位體一起工作以活化Wnt/β-連環蛋白信號傳導(de Lau等人，Genome Biol.13：242(2011)；Carmon等人，Proc Natl Acad Sci 108：11452-11457(2012))。 RSPO亦能夠藉由穩定化捲曲受體及LRP5/6受體而促進Wnt/β-連環蛋白信號傳導(Hao等人，Nature 485：195-200(2012))。鋅及環指3(ZNRF3)及其同源物環指43(RNF43)為跨膜E3泛素接合酶，促進細胞表面上捲曲及LRP6受體之更新(Hao等人，Nature 485：195-200(2012)； Koo等人，Nature 488：665-669(2012))。RSPO可藉由與LGR4/5/6及ZNRF3/RNF43之細胞外域相互作用，誘發ZNRF3自膜清除，此使捲曲及LRP6受體穩定，從而增強Wnt/β-連環蛋白信號傳導(Hao等人，Nature 485：195-200(2012))。
本文中引用之包括專利申請案及公開案的所有參考文獻均以全文引用的方式併入。
本發明提供抗-RSPO抗體、尤其結合RSPO2、RSPO3及/或RSPO2與RSPO3之抗體，及其使用方法。
本文提供結合於RSPO2之分離抗體，其中該抗體抑制RSPO2與跨膜E3泛素酶之相互作用。在一些實施例中，跨膜E3泛素酶為ZNRF3及/或RNF43。
在一些實施例中，抗體不抑制RSPO2與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用(例如增強RSPO2與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用)。舉例而言，本文提供結合於RSPO2之分離抗體，其中該抗體包含：(a)輕鏈可變域(VL)，其包含(i)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的高變區-L1(HVR-L1)，(ii)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的HVR-L2，及(iii)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的HVR-L3；及(b)重鏈可變域(VH)，其包含(i)包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的HVR-H3。在一些實施例中，抗體包含(a)SEQ ID NO：105之VL序列及SEQ ID NO：106之VH序列。
在一些實施例中，抗體抑制RSPO2與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用。舉例而言，本文提供結合於RSPO2之分離抗體，其中該抗體包含：(a)包含(i)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的 HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的HVR-H3的VH；(b)包含(i)包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列的HVR-H3的VH；或(c)包含(i)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的HVR-H3的VH。在一些實施例中，該分離抗體包含(a)SEQ ID NO：107之VL序列及SEQ ID NO：108之VH序列；(b)SEQ ID NO：109之VL序列及SEQ ID NO：110之VH序列；或(c)SEQ ID NO：111之VL序列及SEQ ID NO：112之VH序列。
本文亦提供結合於RSPO3之分離抗體，其中該抗體抑制RSPO3與跨膜E3泛素酶之相互作用。在一些實施例中，跨膜E3泛素酶為ZNRF3及/或RNF43。
在一些實施例中，抗體不抑制RSPO3與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用(例如增強RSPO3與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的結合)。
在一些實施例中，抗體抑制RSPO3與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用。舉例而言，本文提供結合於RSPO3之分離抗體，其中該抗體包含：(a)包含(i)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的 HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的HVR-H3的VH；(b)包含(i)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-H3的VH；(c)包含(i)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的HVR-H3的VH；(d)包含(i)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-H3的VH；(e)包含(i)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的HVR-H3的VH；(f)包含(i)包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：39之胺 基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的HVR-H3的VH；或(g)包含(i)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的HVR-H3的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含(i)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-H3的VH。在一些實施例中，抗體包含：包含(i)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的HVR-L3的VL；及包含(i)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的HVR-H3的VH。此外，本文提供結合RSPO3之分離抗體，其中該抗體包含：(a)包含(i)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：188之胺基酸序列的HVR-H3的VH；或(b)包含(i)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：189之胺基酸序列的HVR-H3的VH。 在一些實施例中，結合RSPO之分離抗體包含：包含(i)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-H3的VH。在一些實施例中，結合RSPO之分離抗體包含：包含(i)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：188之胺基酸序列的HVR-H3的VH。在一些實施例中，結合RSPO之分離抗體包含：包含(i)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：189之胺基酸序列的HVR-H3的VH。
在一些實施例中，抗體包含(a)SEQ ID NO：89之VL序列及SEQ ID NO：90之VH序列；(b)SEQ ID NO：91之VL序列及SEQ ID NO：92之VH序列；(c)SEQ ID NO：93之VL序列及SEQ ID NO：94之VH序列；(d)SEQ ID NO：95之VL序列及SEQ ID NO：96之VH序列；(e)SEQ ID NO：97之VL序列及SEQ ID NO：98之VH序列；(f)SEQ ID NO：99之VL序列及SEQ ID NO：100之VH序列；或(g)SEQ ID NO：101之VL序列及SEQ ID NO：102之VH序列。在一些實施例中，結合RSPO3之分離抗體包含：(a)SEQ ID NO：208之VL序列及SEQ ID NO：209之VH序列、(b)SEQ ID NO：212之VL序列及SEQ ID NO：213之VH序列，或(c)SEQ ID NO：214之VL序列及SEQ ID NO：205之VH序列。在一些實施例中，結 合RSPO3之分離抗體包含：(a)SEQ ID NO：208之VL序列及SEQ ID NO：209之VH序列。在一些實施例中，結合RSPO3之分離抗體包含：(a)SEQ ID NO：212之VL序列及SEQ ID NO：213之VH序列。在一些實施例中，結合RSPO3之分離抗體包含：(a)SEQ ID NO：214之VL序列及SEQ ID NO：215之VH序列。
本文提供結合於RSPO2及RSPO3之分離抗體(抗-RSPO2/3抗體)。 在一些實施例中，抗體抑制RSPO2及RSPO3與跨膜E3泛素酶之相互作用。在一些實施例中，跨膜E3泛素酶為ZNRF3及/或RNF43。在一些實施例中，抗體抑制RSPO3與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用。在一些實施例中，抗體不抑制RSPO3與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用(例如增強RSPO3與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的結合)。在一些實施例中，抗體抑制RSPO2與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用。在一些實施例中，抗體不抑制RSPO2與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用(例如增強RSPO2與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的結合)。
舉例而言，本文提供結合於RSPO2及RSPO3之抗體，其中該抗體包含：(a)包含(i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列的HVR-L3的VL；及(b)包含(i)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列的HVR-H3的VH。在一些實施例中，抗體包含(a)SEQ ID NO：103之VL序列及SEQ ID NO：104之VH序列。
在任何抗-RSPO2/3抗體之一些實施例中，該抗體包含第一可變域及第二可變域，其中該第一可變域包含第一組六個HVR，且該第二 可變域包含第二組六個HVR，且其中該第一與第二組六個HVR一致。 在一些實施例中，第一組六個HVR及第二組六個HVR為26E11之六個HVR。
在任何抗-RSPO2/3抗體之一些實施例中，該抗體包含第一可變域及第二可變域，其中該第一可變域包含第一組六個HVR，且該第二可變域包含第二組六個HVR，且其中該第一與第二組六個HVR不同。 在一些實施例中，第一組六個HVR為4H1、4D4、5C2、5D6、5E11、6E9及21C2中任一者之六個HVR，且第二組六個HVR為1A1、11F11、36D2及49G5中任一者之六個HVR。在一些實施例中，第一組六個HVR為4H1、4D4、5C2、5D6、5E11、6E9及21C2中任一者之六個HVR，且第二組六個HVR為1A1之六個HVR。
本文亦提供結合於RSPO3之分離抗體，其中該抗體包含：(a)包含(i)包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的HVR-H3的VH；或(b)包含(i)包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的HVR-H3的VH。本文亦提供結合於RSPO3之分離抗體，其中該抗體包含：(a)包含(i)包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列的HVR-L3的VL，及包含(i)包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的HVR-H2及(iii) 包含SEQ ID NO：216之胺基酸序列的HVR-H3的VH。
本文亦提供結合於RSPO3之分離抗體，其中該抗體結合於RSPO3胺基酸47-108(例如49-108)內之區域。
本文亦提供結合於RSPO3抗原決定基且在一些實施例中，任何抗體之分離抗體，其中該RSPO3抗原決定基包含以下RSPO3胺基酸殘基：Gln72、Pro90、Asp91及Lys94。在一些實施例中，RSPO3抗原決定基包含RSPO3胺基酸：Asn 52、Leu55、Phe63、Gln72、Tyr89、Pro90、Asp91、Lys94及Lys97。在一些實施例中，RSPO3抗原決定基包含以下RSPO3胺基酸殘基：Ser49、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Ile73、Gly74、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Lys94、Lys97及Lys108。
本文亦提供結合於RSPO3抗原決定基且在一些實施例中任何抗體之分離抗體，其中該RSPO3抗原決定基包含以下RSPO3胺基酸：Thr47、Leu55、Gln72、Pro90、Asp91及Lys94。在一些實施例中，RSPO3抗原決定基包含以下RSPO3胺基酸：Thr47、Asn52、Leu55、Phe63、Gln72、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Lys94及Lys97。在一些實施例中，RSPO3抗原決定基包含以下RSPO3胺基酸殘基：Thr47、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Asn93、Lys94、Lys97及Lys108。
本文亦提供結合於RSPO3抗原決定基且在一些實施例中任何抗體之分離抗體，其中該RSPO3抗原決定基包含選自以下之一或多個RSPO3胺基酸：Ser49、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Ile73、Gly74、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Lys94及Lys108。在一些實施例中，RSPO3抗原決定基包含以下RSPO3胺基酸殘基：Ser49、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、 Phe63、Leu65、Gln72、Ile73、Gly74、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Lys94及Lys108。
本文亦提供結合於RSPO3抗原決定基且在一些實施例中任何抗體之分離抗體，其中該RSPO3抗原決定基包含選自以下之一或多個RSPO3胺基酸：Ser49、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Ile73、Gly74、Tyr84、Tyr89、Pro9O、Asp91、Ile92、Lys94、Lys97及Lys108。在一些實施例中，RSPO3抗原決定基包含以下RSPO3胺基酸殘基：Ser49、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Ile73、Gly74、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Lys94、Lys97及Lys108。
本文亦提供結合於RSPO3抗原決定基之分離抗體，其中該RSPO3抗原決定基包含選自以下之一或多個RSPO3胺基酸：Thr47、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Asn93、Lys94、Lys97及Lys108。在一些實施例中，RSPO3抗原決定基包含以下RSPO3胺基酸殘基：Thr47、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Asn93、Lys94、Lys97及Lys108。
在任何抗體之一些實施例中，抗體抑制RSPO2及RSPO3與跨膜E3泛素酶之相互作用。在一些實施例中，跨膜E3泛素酶為ZNRF3及/或RNF43。在一些實施例中，抗體抑制RSPO3與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用。
在任何抗-RSPO抗體之一些實施例中，抗體抑制RSPO2及/或RSPO3介導之wnt信號傳導。在任何抗-RSPO抗體之一些實施例中，抗體為結合RSPO2及/或RSPO3之抗體片段。在任何抗-RSPO抗體之一些實施例中，抗體片段抑制RSPO2及/或RSPO3介導之wnt信號傳導。 在任何抗-RSPO抗體之一些實施例中，抗體抑制癌症幹細胞生長。在 任何抗-RSPO抗體之一些實施例中，抗體誘發及/或促進癌細胞(例如癌症幹細胞)分化(例如終末分化及/或分化成祖細胞)。
在任何抗-RSPO抗體之一些實施例中，抗體為單株抗體。在任何抗-RSPO抗體之一些實施例中，抗體為人類、人類化或嵌合抗體。在任何抗-RSPO抗體之一些實施例中，抗體為全長IgG1抗體。在任何抗-RSPO抗體之一些實施例中，抗體具有減少或耗盡之效應功能。在任何抗-RSPO抗體之一些實施例中，抗-RSPO抗體包含在根據EU編號慣例之胺基酸位置297經工程改造之丙胺酸。在任何抗-RSPO抗體之一些實施例中，抗-RSPO抗體包含在根據EU編號慣例之胺基酸位置265經工程改造之丙胺酸。
在任何抗-RSPO抗體之一些實施例中，抗體用作藥劑。在任何抗-RSPO抗體之一些實施例中，抗體用於治療癌症。在一些實施例中，癌症為腸胃癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌或直腸癌。在一些實施例中，癌症特徵為與參考相比，一或多種RSPO(例如RSPO2及/或RSPO3)表現增加。在一些實施例中，癌症特徵為RSPO易位(例如RSPO2易位及/或RSPO3易位)。在任何抗-RSPO抗體之一些實施例中，抗體用於抑制wnt信號傳導，抑制血管生成及/或血小管生成，及/或抑制細胞增殖。
本文亦提供編碼本文中所述之抗體的分離核酸。本文進一步提供包含本文中所述之抗體之核酸的宿主細胞。本文提供產生本文中所述之抗體之方法，其包含培養包含本文中所述之抗體之核酸的宿主細胞，使得抗體產生。在一些實施例中，產生方法進一步包含自宿主細胞回收抗體。
本文提供包含本文中所述之抗體及細胞毒性劑的免疫結合物。
本文進一步提供包含本文中所述之抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥調配物。在一些實施例中，醫藥調配物進一步包含額外治療 劑。在一些實施例中，額外治療劑為紫杉烷(taxane)。在一些實施例中，紫杉烷為太平洋紫杉醇(paclitaxel)或多烯紫杉醇(docetaxel)。在一些實施例中，額外治療劑為鉑劑。在一些實施例中，鉑劑為卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)及/或順鉑(cisplatin)。在一些實施例中，額外治療劑為拓撲異構酶抑制劑。在一些實施例中，拓撲異構酶抑制劑為伊立替康(irinotecan)、拓朴替康(topotecan)、依託泊苷(etoposide)及/或米托蒽醌(mitoxantrone)。在一些實施例中，額外治療劑為醛葉酸(例如甲醯四氫葉酸)。在一些實施例中，額外治療劑為核苷代謝抑制劑。在一些實施例中，核苷代謝抑制劑為氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡培他濱(capecitabine)及/或吉西他濱(gemcitabine)。 在一些實施例中，額外治療劑為醛葉酸、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)及/或奧沙利鉑。在一些實施例中，額外治療劑為5-氟尿嘧啶及伊立替康。在一些實施例中，額外治療劑為紫杉烷及鉑劑。在一些實施例中，額外治療劑為太平洋紫杉醇及卡鉑。在一些實施例中，額外治療劑為培美曲塞(pemetrexate)。在一些實施例中，額外治療劑為刺蝟抑制劑(例如維莫德吉(vismodegib))。
本文提供本文中所述之抗體的用途，其用於製造供治療癌症之藥劑。在一些實施例中，癌症為腸胃癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌或直腸癌。在一些實施例中，癌症為肺癌。在一些實施例中，癌症特徵為與參考相比，一或多種RSPO(例如RSPO2及/或RSPO3)表現增加。在一些實施例中，癌症特徵為RSPO易位(例如RSPO2易位及/或RSPO3易位)。此外，本文提供本文中所述之抗體的用途，其用於製造供抑制wnt信號傳導、抑制血管生成及/或血小管生成及/或抑制細胞增殖之藥劑。在一些實施例中，抗-RSPO抗體與額外治療劑組合使用(例如依序或同時投與)。在一些實施例中，額外治療劑為紫杉烷。在一些實施例中，紫杉烷為太平洋紫杉醇或多烯紫杉醇。在一些實施例 中，額外治療劑為鉑劑。在一些實施例中，鉑劑為卡鉑、奧沙利鉑及/或順鉑。在一些實施例中，額外治療劑為拓撲異構酶抑制劑。在一些實施例中，拓撲異構酶抑制劑為伊立替康、拓朴替康、依託泊苷及/或米托蒽醌。在一些實施例中，額外治療劑為醛葉酸(例如甲醯四氫葉酸)。在一些實施例中，額外治療劑為核苷代謝抑制劑。在一些實施例中，核苷代謝抑制劑為氟尿嘧啶、卡培他濱及/或吉西他濱。在一些實施例中，額外治療劑為醛葉酸、5-氟尿嘧啶及/或奧沙利鉑。 在一些實施例中，額外治療劑為5-氟尿嘧啶及伊立替康。在一些實施例中，額外治療劑為紫杉烷及鉑劑。在一些實施例中，額外治療劑為太平洋紫杉醇及卡鉑。在一些實施例中，額外治療劑為培美曲塞。在一些實施例中，額外治療劑為刺蝟抑制劑(例如維莫德吉)。
本文提供治療患有癌症之個體之方法，其包含向該個體投與有效量之本文中所述之抗體。在一些實施例中，癌症為腸胃癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌或直腸癌。在一些實施例中，癌症為肺癌。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投與額外治療劑。在一些實施例中，癌症特徵為與參考相比，一或多種RSPO(例如RSPO2及/或RSPO3)表現增加。在一些實施例中，癌症特徵為RSPO易位(例如RSPO2易位及/或RSPO3易位)。本文亦提供在個體中抑制wnt信號傳導、抑制血管生成及/或血小管生成及/或抑制細胞增殖之方法，其包含向該個體投與有效抑制wnt信號傳導、抑制血管生成及/或血小管生成及/或抑制細胞增殖之量的本文中所述之抗體。在一些實施例中，該方法包含投與額外治療劑。在一些實施例中，額外治療劑為紫杉烷。在一些實施例中，紫杉烷為太平洋紫杉醇或多烯紫杉醇。在一些實施例中，額外治療劑為鉑劑。在一些實施例中，鉑劑為卡鉑、奧沙利鉑及/或順鉑。在一些實施例中，額外治療劑為拓撲異構酶抑制劑。在一些實施例中，拓撲異構酶抑制劑為伊立替康、拓朴替康、依 託泊苷及/或米托蒽醌。在一些實施例中，額外治療劑為醛葉酸(例如甲醯四氫葉酸)。在一些實施例中，額外治療劑為核苷代謝抑制劑。 在一些實施例中，核苷代謝抑制劑為氟尿嘧啶、卡培他濱及/或吉西他濱。在一些實施例中，額外治療劑為醛葉酸、5-氟尿嘧啶及/或奧沙利鉑。在一些實施例中，額外治療劑為5-氟尿嘧啶及伊立替康。在一些實施例中，額外治療劑為紫杉烷及鉑劑。在一些實施例中，額外治療劑為太平洋紫杉醇及卡鉑。在一些實施例中，額外治療劑為培美曲塞。在一些實施例中，額外治療劑為刺蝟抑制劑(例如維莫德吉)。
圖1A-B. 測試一組抗-RSPO2及抗-RSPO3抗體阻斷重組人類(rh)RSPO2刺激(A)及/或rhRSPO3刺激(B)之WNT報導體活性的能力。抗體子集阻斷rhRSPO2及/或rhRSPO3刺激之WNT報導體活性。WNT報導細胞用10ng/ml重組小鼠(rm)Wnt3a、50pM rhRSPO2(A)或rhRSPO3(B)及增加濃度之指示抗體純系刺激。資料相對於在缺乏抗體下存在之刺激量校正。
圖2A-I. 測試一組抗-RSPO2及抗-RSPO3抗體對RSPO3表現細胞小球(A-C)、RSPO2表現細胞小球(D-F)、RSPO1表現細胞小球(G)、RSPO4表現細胞小球(H)及非RSPO1-4表現細胞(293細胞)(I)之IHC反應。如圖2中所示，如藉由IHC反應性確定，抗體49G5識別RSPO2表現細胞小球，而不識別RSPO3、RSPO1、RSPO4及非RSPO1-4表現細胞小球。測試IHC反應性之抗體的完整表展示在表4中。如藉由IHC反應性確定，表4中所有測試之抗體不識別RSPO1、RSPO4及非RSPO1-4表現細胞小球。
圖3A-D. 測試一組抗-RSPO2及抗-RSPO3抗體抑制rhRSPO2(A)、重組獼猴(rcyno)RSPO2(B)、小鼠(m)RSPO2(C)及rhRSPO2 L186P變異體(D)之wnt報導體活性刺激的能力。WNT報導細胞用10 ng/ml rmWnt3a、50pM rhRSPO2(A)、8pM rcynoRSPO2(Genentech)(B)、90pM mRSPO2(R&D Systems)(C)或38pM rhRSPO2 L186P(Genentech)(D)及增加濃度之指示抗體純系刺激。
圖4A-D. 測試一組抗-RSPO2及抗-RSPO3抗體抑制由rhRSPO3(A)、rcynoRSPO3(B)、mRSPO3(C)及PTPRK融合物-RSPO3(D)刺激之WNT報導體活性的能力。WNT報導細胞用10ng/ml rmWnt3a、50pM rhRSPO3(A)、13pM cynoRSPO3(Genentech)(B)或17pM mRSPO3(R&D Systems)(C)及增加濃度之指示抗體純系刺激。圖4D中，WNT報導細胞在5μg/ml抗-RSPO3不存在或存在下用10ng/ml rmWNT3a、自經指示DNA轉染之293T細胞製備的條件培養基刺激。
圖5. 九種抗-RSPO2及抗-RSPO3純系之親和力及IC50量測。藉由表面電漿子共振測定指示純系之Fab對指示重組(r)RSPO2及rRSPO3之親和性。藉由用EC50之指示rRSPO及增加濃度之各抗體刺激WNT報導體分析物，測定指示純系之IC50量測。H，人類；C，獼猴；M，小鼠；-，無結合或IC50>500nM。
圖6A-B. 測試一組抗-RSPO2及抗-RSPO3抗體抑制LGR4與rhRSPO2(A)及rhRSPO3(B)結合之能力。藉由競爭性結合ELISA，測試個別抗體純系抑制LGR4-ECD與rhRSPO2(A)或rhRSPO3(B)結合之能力。在LGR5下見到類似結果(資料未圖示)。結果概述參見表5。
圖7A-B. 測試一組抗-RSPO2及抗-RSPO3抗體抑制RNF43與rhRSPO2(A)及rhRSPO3(B)結合之能力。藉由競爭性結合ELISA，測試個別抗體純系抑制RNF43-ECD與rhRSPO2(A)或rhRSPO3(B)結合之能力。在LGR5下見到類似結果(資料未圖示)。結果概述參見表5。
圖8A-B. 結晶RSPO3(33-210)與Fab 26E11(A)複合之模型。 Fab26E11/RSPO3相互作用之放大展示在(B)中。
圖9A-B. 5D6、26E11、4H1、5C2、5E11、4D4、6E9及21C2之可 變輕鏈區序列(A)及可變重鏈區序列(B)之對準。根據Kabat定義之CDR序列帶下劃線。
圖10A-B. 11F11、1A1、36D2及49G5之可變輕鏈區序列(A)及可變重鏈區序列(B)之對準。根據Kabat定義之CDR序列帶下劃線。
圖11A-D. 在用30mg/kg抗-RSPO3抗體(5D6)或抗豚草抗體(對照)處理後四種結腸直腸癌患者來源模型(A-D)之平均腫瘤體積改變(mm3)。圖11D亦展示在用抗-RSPO3抗體(5D6)與伊立替康(100mg/kg，第0天及第3天)或抗豚草抗體(對照)與伊立替康(100mg/kg，第0天及第3天)組合處理後CRCD結腸直腸癌患者來源模型之平均腫瘤體積改變(mm3)。
圖12A-D. 在最後給藥之後2-3週用蘇木精及曙紅染色劑(H&E stain)(A及C)及愛爾斯藍染色劑(Alcian Blue stain)(B及D)染色30mg/kg抗豚草抗體(對照)或抗-RSPO3抗體(5D6)處理之結腸直腸癌患者來源模型腫瘤。抗-RSPO3處理之腫瘤具有不同病理組織學，尤其如藉由愛爾斯藍染色指示，與抗豚草抗體對照相比，黏液顯著增加。
圖13A-C. (A)展示在用(i)抗-RSPO3抗體(5D6)、(ii)抗豚草抗體(對照)、(iii)抗-RSPO3抗體(5D6)與伊立替康(100mg/kg，第0天)或抗豚草抗體(對照)與伊立替康(100mg/kg，第0天)組合處理後CRCC結腸直腸癌患者來源模型之平均腫瘤體積(mm3)。(B-C)展示結腸直腸癌患者來源模型(a)用抗-RSPO3抗體(5D6)或抗豚草抗體(對照；30mg/kg)處理及(b)移植且用抗-RSPO3抗體(5D6)或抗豚草抗體(對照)處理的連續移植實驗。(B)展示最初或連續移植時用抗-RSPO3抗體(5D6)處理後連續移植腫瘤之腫瘤(移植)移植速率實質減少百分比。(C)展示最初或在連續移植時用抗-RSPO3抗體(5D6)處理後連續移植腫瘤之平均腫瘤體積改變顯著減少。
圖14A-B. 5D6、5D6v1、5D6v2.1、5D6v2.2、5D6v2.3、 5D6v2.4、5D6v2.8、5D6v2.10、5D6v3.2、5D6v3.3、5D6v4.1、5D6v4.3、5D6v5.1及5D6v5.2之可變輕鏈區序列(A)及可變重鏈區序列(B)之對準。根據Kabat定義之序列帶下劃線。
I. 定義
除非另外指示，否則如本文所用，術語「R-反應素」及「RSPO」係指來自任何脊椎動物來源，包括諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)之哺乳動物的任何天然RSPO(例如RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4)。該術語涵蓋「全長」未經加工RSPO以及由細胞中加工產生之任何RSPO形式。該術語亦涵蓋天然存在之RSPO變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一些實施例中，示例性人類RSPO之胺基酸序列為例如如SEQ ID NO：3中所示之RSPO1。在一些實施例中，示例性人類RSPO之胺基酸序列為例如如SEQ ID NO：1中所示之RSPO2。在一些實施例中，示例性人類RSPO之胺基酸序列為例如如SEQ ID NO：2中所示之RSPO3。在一些實施例中，示例性人類RSPO之胺基酸序列為例如如SEQ ID NO：4中所示之RSPO4。
除非另外指示，否則如本文所用，術語「R-反應素2」及「RSPO2」係指來自任何脊椎動物來源，包括諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)之哺乳動物的任何天然RSPO2。該術語涵蓋「全長」未經加工RSPO2以及由細胞中加工產生之任何RSPO2形式。該術語亦涵蓋天然存在之RSPO2變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一些實施例中，示例性人類RSPO2之胺基酸序列為截至2013年10月18日之UNIPROT Q6UXX9-1。在一些實施例中，示例性人類RSPO2之胺基酸序列為截至2013年10月18日之UNIPROT Q6UXX9-2。在一些實施例中，示例性人類RSPO2之胺基酸 序列為截至2013年10月18日之UNIPROT Q6UXX9-3。在一些實施例中，示例性人類RSPO2之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：1中。
除非另外指示，否則如本文所用，術語「R-反應素3」及「RSPO3」係指來自任何脊椎動物來源，包括諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)之哺乳動物的任何天然RSPO3。該術語涵蓋「全長」未經加工RSPO3以及由細胞中加工產生之任何RSPO3形式。該術語亦涵蓋天然存在之RSPO3變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一些實施例中，示例性人類RSPO2之胺基酸序列為截至2013年10月18日之UNIPROT Q9BXY4-1。在一些實施例中，示例性人類RSPO2之胺基酸序列為截至2013年10月18日之UNIPROT Q9BXY4-2。在一些實施例中，示例性人類RSPO3之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：2中。
出於本文之目的，「接受體人類構架」為包含來源於人類免疫球蛋白構架或人類共同構架(如以下所定義)之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「來源於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10個或10個以下、9個或9個以下、8個或8個以下、7個或7個以下、6個或6個以下、5個或5個以下、4個或4個以下、3個或3個以下、或2個或2個以下。在一些實施例中，VL接受體人類構架序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列在序列上一致。
「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用總和之強度。除非另外指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1：1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一 般可由解離常數(Kd)表示。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所述之方法)量測親和力。量測結合親和力之具體說明性及示例性實施例描述於下文中。
「親和力成熟」抗體係指相較於在一或多個高變區(HVR)中不具有一或多個變化之親本抗體，在一或多個高變區(HVR)中具有一或多個變化之抗體，此等變化使抗體對抗原之親和力得到提高。
術語「抗-RSPO2抗體」及「結合於RSPO2之抗體」係指能夠以足夠親和力結合RSPO2之抗體，使得抗體適用作靶向RSPO2之診斷劑及/或治療劑。在一個實施例中，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測，抗-RSPO2抗體與非RSPO2蛋白質之結合程度小於該抗體與RSPO2之結合的約10%。在某些實施例中，結合於RSPO2之抗體的解離常數(Kd)1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或10-8M以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗-RSPO2抗體結合於在來自不同物種的RSPO2中保守的RSPO2抗原決定基。
術語「抗-RSPO3抗體」及「結合於RSPO3之抗體」係指能夠以足夠親和力結合RSPO3的抗體，使得該抗體適用作靶向RSPO3之診斷劑及/或治療劑。在一個實施例中，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測，抗-RSPO3抗體與非RSPO3蛋白質之結合程度小於該抗體與RSPO3之結合的約10%。在某些實施例中，結合於RSPO3之抗體的解離常數(Kd)1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或10-8M以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗-RSPO3抗體結合於在來自不同物種之RSPO3中保守的RSPO3抗原決定基。
術語「抗-RSPO2/3抗體」及「結合於RSPO2及RSPO3之抗體」係指能夠以足夠親和力結合RSPO2及RSPO3之抗體，使得該抗體適用作 靶向RSPO2及RSPO3之診斷劑及/或治療劑。在一個實施例中，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測，抗-RSPO2/3抗體與非RSPO2或非RSPO3蛋白質之結合程度小於該抗體與RSPO2及RSPO3之結合的約10%。在某些實施例中，結合於RSPO2及RSPO3之抗體的解離常數(Kd)1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或10-8M以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗-RSPO2/3抗體結合於在來自不同物種之RSPO2及/或RSPO3中保守的RSPO2及/或RSPO3抗原決定基。
術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所要抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指不同於完整抗體之分子，其包含完整抗體中結合該完整抗體所結合之抗原的部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
與參考抗體「競爭結合之抗體」係指在競爭分析中，阻斷參考抗體與其抗原之結合50%或50%以上之抗體，且相反地，在競爭分析中，參考抗體阻斷抗體與其抗原之結合50%或50%以上。本文提供一種示例性競爭分析。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同來源或物種之抗體。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區之類型。 存在5個主要抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中數個類別可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱作 α、δ、ε、γ及μ。
「效應功能」係指可歸因於抗體Fc區之彼等生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
本文中術語「Fc區」用以定義含有至少一部分恆定區的免疫球蛋白重鏈C端區。該術語包括天然序列Fc區及變異Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。 然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基的編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外的可變域殘基。 可變域之FR通常由4個FR域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，HVR及FR序列一般按以下順序出現在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換使用，係指結構實質上類似於天然抗體結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且指已引入了外源性核酸之細胞，包括此等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初級轉型細胞及由其獲得之子代而不考慮繼代次數。子代在核酸含量上可能不完全與母細胞相同，而是可能含有突變。本文中包括具有與關於在原始轉型細胞中 所篩選或選擇相同之功能或生物活性的突變型子代。
「人類抗體」為胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源的抗體之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義尤其排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共同構架」為代表所選人類免疫球蛋白VL或VH構架序列中最常出現之胺基酸殘基的構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之亞群。一般而言，序列亞群為如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中之亞群。在一個實施例中，對於VL，亞組為如Kabat等人，上文中之亞群κI。在一個實施例中，對於VH，亞群為如Kabat等人，上文中之亞群III。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中全部或實質上全部HVR(例如CDR)皆對應於非人類抗體之HVR，且全部或實質上全部FR皆對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含來源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已進行人類化之抗體。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中序列高變(「互補決定區」或「CDR」)及/或形成結構上定義環(「高變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原觸點」)之各個區域。一般而言，抗體包含六個HVR：三個在VH(H1、H2、H3)中，且三個在VL(L1、L2、L3)中。本文中之示例性HVR包括： (a)出現在胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)處之高變環(Chothia及Lesk,J.Mol. Biol.196：901-917(1987))；(b)出現在胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)處之CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；(c)出現在胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及93-101(H3)處之抗原觸點(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；及(d)(a)、(b)及/或(c)之組合，包括HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)及94-102(H3)。
在一個實施例中，HVR殘基包含圖9A-B及/或圖10A-B或本說明書中其他地方鑑別之彼等殘基。
除非另外指示，否則本文中可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)係根據Kabat等人，上文進行編號。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原結合之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈的可變域(分別為VH及VL)一般具有類似結構，其中各結構域包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(HVR)(參見例如Kindt等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007))。單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，可分別使用來自結合抗原之抗體的VH或VL結構域篩選互補VL或VH結構域之文庫來分離結合特定抗原之抗體。參見例如Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
如本文所用，術語「載體」係指一種核酸分子，其能夠傳播其所連接之另一核酸。該術語包括呈自我複製型核酸結構形式之載體以 及併入其所引入之宿主細胞之基因組中的載體。某些載體能夠引導其可操作地連接之核酸之表現。此等載體在本文中稱為「表現載體」。
「免疫結合物」為與一或多個異源分子，包括(但不限於)細胞毒性劑結合之抗體。
「分離」抗體為與其天然環境之組分分離之抗體。在一些實施例中，抗體純化至大於95%或99%純度，如由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)所測定。關於評定抗體純度之方法的綜述，參見例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
「分離」核酸係指已與其天然環境之組分分離之核酸分子。分離核酸包括如下核酸分子，該核酸分子含於通常含有該核酸分子之細胞中，但該核酸分子存在於染色體外或不同於其天然染色體位置之染色體位置上。
「編碼抗-RSPO2抗體之分離核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)的一或多個核酸分子，包括處於單個載體或分開載體中之該(該等)核酸分子，及存在於宿主細胞中之一或多個位置上的該(該等)核酸分子。
「編碼抗-RSPO3抗體之分離核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)的一或多個核酸分子，包括處於單個載體或分開載體中之該(該等)核酸分子，及存在於宿主細胞中之一或多個位置上的該(該等)核酸分子。
如本文所用，術語「單株抗體」係指自實質上均質抗體之群體獲得的抗體，亦即除可能之變異抗體(例如含有天然存在之突變或在產生單株抗體製劑期間出現之變異抗體，此等變異體通常以較小量存在)之外，構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑形 成對比，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單個決定子。因此，修飾語「單株」指示抗體係自實質上均質之抗體群體獲得之特性，且不應解釋為需要藉由任何特定方法來產生該抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製備，該等技術包括(但不限於)融合瘤法、重組DNA法、噬菌體呈現法及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法，此類方法及製備單株抗體之其他示例性方法在本文中描述。
「裸抗體」係指未與異源部分(例如細胞毒性部分)或放射性標記結合之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「天然抗體」係指具有不同結構之天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體為約150,000道爾頓之雜四聚醣蛋白，由經二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重域或重鏈可變域，繼而為3個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕域或輕鏈可變域，繼而為恆定輕(CL)域。抗體輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型中之一種，稱為κ及λ。
術語「藥品說明書」用於指通常包括於治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於與使用該等治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌症及/或警告之資訊。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將任何保守性取代視為序列一致性之一部分之情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。可以此項技術內之多種方式，例如使用公開可得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟 體，達成比對以測定胺基酸序列一致性百分比。熟習此項技術者可確定適於比對序列之參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需之任何演算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2來產生胺基酸序列一致性百分比值。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech,Inc.創作且原始碼已與使用說明書一起在美國版權局(U.S.Copyright Office)(Washington D.C.,20559)存檔，其中其以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程式可自Genentech,Inc.(South San Francisco,California)公開獲得，或可由原始碼編譯。 ALIGN-2程式應經編譯以供在UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)上使用。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不變。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情況下，如下計算既定胺基酸序列A對於、與、或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可稱為既定胺基酸序列A具有或包含某一對於、與、或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%)：100乘以分數X/Y
其中X為利用序列比對程式ALIGN-2在該程式對A與B進行比對時評為一致匹配的胺基酸殘基之數目，且其中Y為B中胺基酸殘基的總數。應瞭解，當胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A與B之胺基酸序列一致性%將不等於B與A之胺基酸序列一致性%。除非另外具體說明，否則本文中使用之所有胺基酸序列一致性%值均係使用ALIGN-2電腦程式如剛剛前一段落中所述來獲得。
術語「R-反應素易位」及「RSPO易位」在本文中係指如下R-反應素，其中包括例如R-反應素、其變異體或片段或第二基因、其變異體或片段的破裂染色體一部分再次附著在不同染色體位置，例如不同於R-反應素天然位置之染色體位置或R-反應素天然位置中及/或周圍之不同於第二基因天然位置之染色體位置。R-反應素易位可為RSPO1 易位、RSPO2易位、RSPO3易位及/或RSPO4易位。
術語「R-反應素易位融合聚核苷酸」及「RSPO易位融合聚核苷酸」在本文中係指R-反應素易位基因產物或融合聚核苷酸之核酸序列。R-反應素易位融合聚核苷酸可為RSPO1易位融合聚核苷酸、RSPO2易位融合聚核苷酸、RSPO3易位融合聚核苷酸及/或RSPO4易位融合聚核苷酸。術語「R-反應素易位融合多肽」及「RSPO易位融合多肽」在本文中係指R-反應素易位基因產物或融合聚核苷酸之胺基酸序列。R-反應素易位融合多肽可為RSPO1易位融合多肽、RSPO2易位融合多肽、RSPO3易位融合多肽及/或RSPO4易位融合多肽。
術語「偵測」包括任何偵測方式，包括直接及間接偵測。
如本文所用，術語「生物標記物」係指可在樣品中偵測到之指示物，例如預測性、診斷性及/或預後性指示物。生物標記物可充當特徵在於某些分子、病理學、組織學及/或臨床特徵之疾病或病症(例如癌症)之特定亞型的指示物。在一些實施例中，生物標記物為基因。在一些實施例中，生物標記物為基因變異(例如突變及/或多形現象)。在一些實施例中，生物標記物為易位。生物標記物包括(但不限於)聚核苷酸(例如DNA及/或RNA)、多肽、多肽及聚核苷酸修飾(例如轉譯後修飾)、碳水化合物及/或基於醣脂之分子標記物。
與對個體之臨床益處增加相關的生物標記物之「存在」、「量」或「水準」為在樣品中可偵測之水準。此等可藉由熟習此項技術者已知且本文亦揭示之方法量測。所評估之生物標記物之表現水準或量可用於確定對治療之反應。
術語「表現之水準」或「表現水準」一般可互換使用且一般係指樣品中生物標記物之量。「表現」一般係指資訊(例如基因編碼及/或表觀遺傳)轉換成細胞中存在及操作之結構的過程。因此，如本文所用，「表現」可指轉錄成聚核苷酸、轉譯成多肽或甚至聚核苷酸及/ 或多肽修飾(例如多肽之轉譯後修飾)。轉錄聚核苷酸、轉譯多肽或聚核苷酸及/或多肽修飾(例如多肽之轉譯後修飾)之片段亦應被視為表現，無論其來源於由替代性剪接產生之轉錄物或降解之轉錄物，還是來源於例如藉由蛋白分解之多肽轉譯後加工。「表現基因」包括轉錄成如mRNA之聚核苷酸，接著轉譯成多肽之基因，且亦包括轉錄成RNA，但未轉譯成多肽(例如轉移及核糖體RNA)之基因。
「升高表現」、「升高表現水準」或「升高水準」係指個體中，相對於對照，諸如未患疾病或病症(例如癌症)之個體或內部對照(例如管家生物標記物)，生物標記物之表現增加或水準增加。
「減少表現」、「減少表現水準」或「減少水準」係指個體中，相對於對照，諸如未患疾病或病症(例如癌症)之個體或內部對照(例如管家生物標記物)，生物標記物之表現減少或水準減少。
術語「管家生物標記物」係指通常類似地存在於所有細胞類型中的生物標記物或生物標記物群(例如聚核苷酸及/或多肽)。在一些實施例中，管家生物標記物為「管家基因」。「管家基因」在本文中係指編碼對於細胞功能維持來說不可或缺且通常類似地存在於所有細胞類型中之蛋白質的基因或基因群。
如本文所用，「擴增」一般係指產生所需序列之多個複本的過程。「多個複本」意謂至少兩個複本。「複本」不一定意謂與模板序列互補或一致之完美序列。舉例而言，複本可包括核苷酸類似物，諸如去氧肌苷、有意序列改變(諸如經由包含與模板可雜交但不互補之序列之引子引入的序列改變)及/或在擴增期間發生之序列誤差。
術語「診斷」在本文中用以指分子或病理學病況、疾病或病狀(例如癌症)之鑑別或分類。舉例而言，「診斷」可指特定類型癌症之鑑別。「診斷」亦可指例如藉由組織病理學標準，或藉由分子特徵(例如特徵在於表現生物標記物(例如特定基因或由該等基因編碼之蛋白 質)之一或組合的亞型)將癌症特定亞型分類。
樣品包括(但不限於)初級或培養細胞或細胞株、細胞上清液、細胞溶解物、血小板、血清、血漿、玻璃狀液、淋巴液、滑液、濾泡液、精液、羊膜液、乳汁、全血、血液來源細胞、尿、腦脊液、唾液、痰、淚液、汗、黏液、腫瘤溶解物及組織培養基、組織提取物(諸如均質化組織)、腫瘤組織、細胞提取物及其組合。
如本文所用，「參考樣品」、「參考細胞」、「參考組織」、「對照樣品」、「對照細胞」或「對照組織」係指用於達成比較目的之樣品、細胞、組織、標準或水準。在一個實施例中，參考樣品、參考細胞、參考組織、對照樣品、對照細胞或對照組織自相同受試者或個體身體之健康及/或未患病部分(例如組織或細胞)獲得。舉例而言，健康及/或未患病細胞或組織靠近患病細胞或組織(例如靠近腫瘤之細胞或組織)。在另一實施例中，參考樣品自相同受試者或個體身體之未處理組織及/或細胞獲得。在又一實施例中，參考樣品、參考細胞、參考組織、對照樣品、對照細胞或對照組織自不為受試者或個體之個體身體之健康及/或未患病部分(例如組織或細胞)獲得。在另一實施例中，參考樣品、參考細胞、參考組織、對照樣品、對照細胞或對照組織自不為受試者或個體之個體身體之未處理組織及/或細胞獲得。
如本文所用，短語「實質上類似」係指兩個數值(一般一者與一種分子相關且另一者與參考/比較分子相關)之間足夠高程度之類似性，使得在藉由該等值(例如Kd值)量測之生物特徵的背景下，熟習此項技術者將認為該兩個值之間的差異不具有統計顯著性。該兩個值之間的差異可為例如低於約20%、低於約10%及/或低於約5%，隨參考/比較值而變。
短語「實質上不同」係指兩個數值(一般一者與一種分子相關且另一者與參考/比較分子相關)之間足夠高程度之差異，使得在藉由該 等值(例如Kd值)量測之生物特徵的背景下，熟習此項技術者將認為該兩個值之間的差異具有統計顯著性。該兩個值之間的差異可例如大於約10%、大於約20%、大於約30%、大於約40%及/或大於約50%，隨參考/比較分子之值而變。
如本文所用，術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、阿德力黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷)、小紅莓(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他插入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素，包括其片段及/或變異體；以及以下所揭示之各種抗腫瘤或抗癌劑。
「化學治療劑」係指適用於治療癌症之化合物。化學治療劑之實例包括烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(cyclosphosphamide；CYTOXAN®)；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；乙烯亞胺(ethylenimine)及甲基三聚氰胺，包括六甲密胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺；乙醯精寧(acetogenin)(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL®)；β-拉帕酮(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙 鹼(colchicine)；樺木酸(betulinic acid)；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物拓朴替康(HYCAMTIN®)、CPT-11(伊立替康；CAMPTOSAR®)、乙醯基喜樹鹼、東莨菪素(scopolectin)及9-胺基喜樹鹼)；苔蘚抑素(bryostatin)；卡利斯塔叮(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；足葉草毒素(podophyllotoxin)；足葉草酸；替尼泊苷(teniposide)；念珠藻環肽(cryptophycin)(尤其念珠藻環肽1及念珠藻環肽8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡米辛(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；盤克斯塔叮(pancratistatin)；沙考的汀(sarcodictyin)；海綿抑素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺、雙氯乙基甲胺、雙氯乙基甲胺氧化物鹽酸鹽、美法侖、新恩比興(novembichin)、膽固醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如刺孢黴素(calicheamicin)，尤其刺孢黴素γ1I及刺孢黴素ωI1(參見例如Nicolaou等人，Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33：183-186(1994))；CDP323(一種口服α-4整合素抑制劑)；達米辛(dynemicin)，包括達米辛A；艾斯帕米辛(esperamicin)；以及新制癌菌素髮色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素、地托 比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓(包括ADRIAMYCIN®、嗎啉基-小紅莓、氰基嗎啉基-小紅莓、2-吡咯啉基-小紅莓、鹽酸小紅莓脂質體注射液(DOXIL®)、脂質體小紅莓TLC D-99(MYOCET®)、聚乙二醇化脂質體小紅莓(CAELYX®)及去氧小紅莓(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤、吉西他濱(GEMZAR®)、喃氟啶(tegafur；UFTORAL®)、卡培他濱(XELODA®)、埃坡黴素(epothilone)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱(enocitabine)、氮尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如夫羅林酸(frolinic acid)；乙醯葡醛酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍思塔布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達 曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗鳥胺酸(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡黴素；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；羅尼達寧(lonidainine)；類美登素(maytansinoid)，諸如美登素(maytansine)及胺沙托辛(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比達摩(mopidanmol)；硝拉維林(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®多醣複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌；2,2',2'-三氯三乙胺；單端孢黴烯族毒素(trichothecene)(尤其T-2毒素、弗納庫林A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及蛇形菌毒素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE®、FILDESIN®)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside；「Ara-C」)；噻替派；紫杉烷類(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel；TAXOL®)、白蛋白工程改造之太平洋紫杉醇之奈米顆粒調配物(ABRAXANETM)及多西他賽(TAXOTERE®)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫代鳥嘌呤；巰嘌呤；甲胺喋呤；鉑試劑，諸如順鉑、奧沙利鉑(例如ELOXATIN®)及卡鉑；防止微管蛋白聚合形成微管的長春花(vinca)，包括長春鹼(VELBAN®)、長春新鹼(ONCOVIN®)、長春地辛(ELDISINE®、FILDESIN®)及長春瑞賓(vinorelbine；NAVELBINE®)；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；甲醯四氫葉酸；諾凡特龍(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素；胺基喋呤；伊班膦 酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視黃素，諸如視黃酸，包括貝瑟羅汀(bexarotene；TARGRETIN®)；雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS®或OSTAC®)、依替膦酸鹽(etidronate；DIDROCAL®)、NE-58095、唑來膦酸(zoledronic acid)/唑來膦酸鹽(zoledronate；ZOMETA®)、阿侖膦酸鹽(alendronate；FOSAMAX®)、帕米膦酸鹽(pamidronate；AREDIA®)、替魯膦酸鹽(tiludronate；SKELID®)或利塞膦酸鹽(risedronate；ACTONEL®)；曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其抑制與異常細胞增殖有關之信號傳導路徑中之基因表現的反義寡核苷酸，諸如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERATOPE®疫苗及基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗及VAXID®疫苗；拓撲異構酶1抑制劑(例如LURTOTECAN®)；rmRH(例如ABARELIX®)；BAY439006(索拉非尼(sorafenib)；Bayer)；SU-11248(舒尼替尼(sunitinib)，SUTENT®，Pfizer)；哌立福新(perifosine)、COX-2抑制劑(例如塞來昔布(celecoxib)或依託昔布(etoricoxib))、蛋白體抑制劑(例如PS341)；硼替佐米(bortezomib；VELCADE®)；CCI-779；替吡法尼(tipifarnib；R11577)；索拉非尼(orafenib)、ABT510；Bcl-2抑制劑，諸如奧利默森鈉(oblimersen sodium；GENASENSE®)；匹克生瓊(pixantrone)；EGFR抑制劑(參見以下定義)；酪胺酸激酶抑制劑(參見以下定義)；絲胺酸-蘇胺酸激酶抑制劑，諸如雷帕黴素(rapamycin)(西羅莫司(sirolimus)，RAPAMUNE®)；法尼基轉移酶(farnesyltransferase)抑制劑，諸如洛那法尼(lonafarnib；SCH 6636，SARASARTM)；及任何上述藥劑之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及兩種或兩種以上上述藥劑之組合，諸如CHOP，其為環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼及潑尼龍之組合 療法之縮寫；及FOLFOX，其為奧沙利鉑(ELOXATINTM)與5-FU及甲醯四氫葉酸之組合之治療方案的縮寫。
如本文所定義之化學治療劑包括用以調控、減少、阻斷或抑制可促進癌症生長之激素作用的「抗激素劑」或「內分泌治療劑」。其可為激素本身，包括(但不限於)：具有混合促效/拮抗型態之抗雌激素，包括他莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX®)、4-羥基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene，FARESTON®)、艾多昔芬(idoxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、雷諾昔酚(raloxifene)(EVISTA®)、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，諸如SERM3；不具有促效特性之純抗雌激素，諸如氟維司群(fulvestrant)(FASLODEX®)，及EM800(此類藥劑可阻斷雌激素受體(ER)二聚合、抑制DNA結合、增加ER更新及/或抑制ER含量)；芳香酶抑制劑，包括類固醇芳香酶抑制劑，諸如福美司坦(formestane)及依西美坦(exemestane)(AROMASIN®)，及非類固醇芳香酶抑制劑，諸如阿那曲唑(ARIMIDEX®)、來曲唑(FEMARA®)及胺魯米特(aminoglutethimide)，及其他芳香酶抑制劑，包括伏羅唑(RIVISOR®)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate，MEGASE®)、法屈唑(fadrozole)及4(5)-咪唑；黃體激素釋放激素促效劑，包括亮丙立德(leuprolide)(LUPRON®及ELIGARD®)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)及曲特瑞林(tripterelin)；性類固醇，包括助孕素(諸如乙酸甲地孕酮及乙酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate))、雌激素(諸如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)及普雷馬林(premarin))，及雄激素/類視黃素，諸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、所有反式視黃酸及非瑞替尼(fenretinide)；奧那司酮(onapristone)；抗孕酮；雌激素受體下調劑(ERD)；抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)及比卡魯胺(bicalutamide)；以及任何上述藥劑之醫藥學上 可接受之鹽、酸或衍生物；以及兩種或兩種以上上述藥劑之組合。
術語「細胞生長抑制劑」係指使活體外或活體內細胞生長停滯之化合物或組合物。因此，細胞生長抑制劑可為顯著降低S期細胞百分比之藥劑。細胞生長抑制劑之其他實例包括藉由誘導G0/G1停滯或M期停滯阻斷細胞週期進程之藥劑。人類化抗-Her2抗體曲妥珠單抗(trastuzumab)(HERCEPTIN®)為誘導G0/G1停滯之細胞生長抑制劑的一個實例。經典M期阻斷劑包括長春花(長春新鹼及長春鹼)、紫杉烷及拓撲異構酶II抑制劑(諸如小紅莓、表柔比星、道諾黴素、依託泊苷及博萊黴素)。使G1停滯之某些藥劑亦外溢引起S期停滯，例如DNA烷化劑，諸如他莫西芬、潑尼松(prednisone)、達卡巴嗪、氮芥、順鉑、甲胺喋呤、5-氟尿啶及ara-C。進一步資訊可見於Mendelsohn及Israel編輯，The Molecular Basis of Cancer，第1章，標題「Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs」Murakami等人(W.B.Saunders,Philadelphia,1995)，例如第13頁中。紫杉烷(太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇)均為來源於紫杉樹之抗癌藥物。源自歐洲紫杉之多烯紫杉醇(TAXOTERE®,Rhone-Poulenc Rorer)為太平洋紫杉醇(TAXOL®,Bristol-Myers Squibb)之半合成類似物。太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇促進自微管蛋白二聚體組裝成微管且藉由防止解聚作用而使微管穩定，此將抑制細胞有絲分裂。
如本文所用，術語「EGFR抑制劑」係指結合於或以其他方式直接與EGFR相互作用且防止或降低其信號傳導活性之化合物，且或者稱為「EGFR拮抗劑」。該等藥劑之實例包括結合於EGFR之抗體及小分子。結合於EGFR之抗體之實例包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)、MAb 455(ATCC CRL HB8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(參見美國專利第4,943,533號，Mendelsohn等人)及其變異體，諸如嵌合225(C225或西妥昔單抗 (Cetuximab)；ERBUTIX®)及再成形人類225(H225)(參見WO 96/40210,Imclone Systems Inc.)；IMC-11F8，一種完全人類EGFR靶向抗體(Imclone)；結合II型突變EGFR之抗體(美國專利第5,212,290號)；如描述於美國專利第5,891,996號中之結合EGFR之人類化及嵌合抗體；以及結合EGFR之人類抗體，諸如ABX-EGF或帕尼單抗(參見WO98/50433,Abgenix/Amgen)；EMD 55900(Stragliotto等人Eur.J.Cancer 32A：636-640(1996))；EMD7200(馬妥珠單抗(matuzumab))，一種針對EGFR之與EGF及TGF-α競爭結合EGFR的人類化EGFR抗體(EMD/Merck)；人類EGFR抗體HuMax-EGFR(GenMab)；稱為E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3及E7.6.3且描述於US 6,235,883中之全人類抗體；MDX-447(Medarex Inc)；以及mAb 806或人類化mAb 806(Johns等人，J.Biol.Chem.279(29)：30375-30384(2004))。抗EGFR抗體可結合細胞毒性劑，因此產生免疫結合物(參見例如EP659,439A2，Merck Patent GmbH)。EGFR拮抗劑包括小分子，諸如美國專利號5,616,582號、第5,457,105號、第5,475,001號、第5,654,307號、第5,679,683號、第6,084,095號、第6,265,410號、第6,455,534號、第6,521,620號、第6,596,726號、第6,713,484號、第5,770,599號、第6,140,332號、第5,866,572號、第6,399,602號、第6,344,459號、第6,602,863號、第6,391,874號、第6,344,455號、第5,760,041號、第6,002,008號及第5,747,498號，以及以下PCT公開案WO98/14451、WO98/50038、WO99/09016及WO99/24037中所描述之化合物。特定小分子EGFR拮抗劑包括OSI-774(CP-358774，埃羅替尼(erlotinib)，TARCEVA® Genentech/OSI Pharmaceuticals)；PD 183805(CI 1033，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)胺基]-7-[3-(4-嗎啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-2-丙烯醯胺二鹽酸鹽，Pfizer Inc.)；ZD1839、吉非替尼(gefitinib)(IRESSA®)4-(3'-氯-4'-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉基丙 氧基)喹唑啉，AstraZeneca)；ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-胺基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺，Boehringer Ingelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯乙基)胺基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羥基苯基)-4-[(1-苯乙基)胺基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)胺基]-6-喹唑啉基]-2-丁醯胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)胺基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲胺基)-2-丁烯醯胺)(Wyeth)；AG1478(Pfizer)；AG1571(SU 5271；Pfizer)；雙EGFR/HER2酪胺酸激酶抑制劑，諸如拉帕替尼(lapatinib)(TYKERB®、GSK572016或N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]6[5[[[2甲基磺醯基)乙基]胺基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉基胺；Glaxo-SmithKline)。
術語「腫瘤」係指所有贅生性細胞生長及增殖(無論為惡性還是良性)及所有癌前及癌性細胞及組織。如本文中所引述，術語「癌症」、「癌」、「細胞增殖病症」、「增殖病症」及「腫瘤」互相並不排斥。
術語「細胞增殖病症」及「增殖病症」係指與某種程度之異常細胞增殖相關之病症。在一個實施例中，細胞增殖病症為癌症。
術語「癌症」及「癌的」係指或描述哺乳動物中通常以無限制細胞生長/增殖為特徵的生理性病狀。癌症之實例包括但不限於癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤)、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。此類癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰臟癌、神經膠質瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝 癌、白血病及其他淋巴組織增生性病症，以及各種類型之頭頸癌。
術語「結腸腫瘤」或「結腸癌」係指結腸之任何腫瘤或癌症(盲腸至直腸之大腸)。
術語「結腸直腸腫瘤」或「結腸直腸癌」係指大腸(其包括結腸(自盲腸至直腸之大腸)及直腸)之任何腫瘤或癌症，包括例如腺癌及較不普遍形式，諸如淋巴瘤及鱗狀細胞癌。
藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在必需劑量下且持續必需時間有效達成所要治療或防治結果之量。
術語「醫藥調配物」係指呈某種形式以允許所含活性成分之生物活性有效且不含對該調配物所投與之受試者有不可接受之毒性之其他組分的製劑。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外的對受試者無毒之成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
「個體(individual)」或「受試者(subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如母牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴子)、兔子及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體或受試者為人類。
如本文所用，「治療(treatment)」(及其語法變體，諸如「治療(treat)」或「治療(treating」)係指試圖改變所治療之個體的自然病程之臨床介入，且可用於預防或在臨床病理學病程中進行。合乎需要之治療作用包括(但不限於)預防疾病出現或復發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、降低疾病進展率、改善或減輕疾病病況，及緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明抗體用於延遲疾病出現或減緩疾病進展。
「降低」或「抑制」意謂能夠使整體減少20%、30%、40%、 50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或95%以上。在一些實施例中，降低或抑制可指與參考(例如生物活性(例如wnt信號傳導)或結合之參考水準)相比之相對減少。在一些實施例中，降低或抑制可指所治療病症之症狀、癌轉移之存在或規模或原發性腫瘤之大小。
如熟習此項技術者所瞭解，本文中提及「約」值或參數包括(且描述)針對該值或參數本身之實施例。舉例而言，提及「約X」之描述包括「X」之描述。
應瞭解本文中所述之本發明之態樣及實施例包括「由態樣及實施例組成」及/或「主要由態樣及實施例組成」。如本文中所使用，除非另外指出，否則單數形式「一」及「該」包括複數參考。
II. 組合物及方法
本文提供抗-RSPO抗體及其用途。在某些實施例中，提供結合於RSPO2及/或RSPO3之抗體。所提供之抗體適用於例如診斷或治療諸如結腸直腸癌之癌症。
在一些態樣中，本文提供一組抗-RSPO抗體。鑑別該組抗體及子集，其中包括(但不限於)基於以下能力針對多個特性表徵：結合於RSPO2及/或RSPO3之能力、藉由IHC偵測RSPO2及/或RSPO3之能力、抑制RSPO2及/或RSPO3與LGR多肽(例如LGR4及/或LGR5)之相互作用的能力、抑制RSPO2及/或RSPO3與E3泛素酶多肽(例如RNF43及/或ZNRF3)之相互作用的能力及抑制由RSPO2、RSPO3、RSPO2多形現象刺激之wnt信號傳導的能力，及/或RSPO2易位產物。
在一個態樣中，本文提供結合於RSPO2及/或RSPO3之分離抗體。在一些實施例中，抗體結合於RSPO2。在一些實施例中，抗體結合於RSPO2且不顯著結合於RSPO3。在一些實施例中，抗體結合於RSPO3。在一些實施例中，抗體結合於RSPO3且不顯著結合於 RSPO2。在一些實施例中，抗體結合於RSPO2與RSPO3。在一些實施例中，抗體為多特異性抗體。在一些實施例中，多特異性抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，雙特異性抗體包含結合於RSPO2之第一可變域及結合於RSPO3之第二可變域。
在某些實施例中，結合於RSPO2及/或RSPO3之抗體為結合RSPO2之抗體。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體結合RSPO2，其中RSPO2具有SEQ ID NO：1中給出之序列。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體結合RSPO2，其中RSPO2缺乏信號傳導肽序列(例如結合於SEQ ID NO：1之胺基酸22-243內之胺基酸)。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體結合於RSPO2之一或多個弗林樣富含半胱胺酸結構域。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體結合SEQ ID NO：1之胺基酸34至134內之區域。 在一些實施例中，抗-RSPO2抗體結合SEQ ID NO：1之胺基酸39至134內之區域。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體結合SEQ ID NO：1之胺基酸34至84內之區域。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體結合SEQ ID NO：1之胺基酸90至134內之區域。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體不結合RSPO2之血小板反應素1型結構域(例如不結合SEQ ID NO：1之胺基酸144至204內之區域)。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體結合於RSPO2之血小板反應素1型結構域。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體結合SEQ ID NO：1之胺基酸144-204內之區域。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體抑制wnt信號傳導。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體抑制具有RSPO2多形現象(例如RSPO2 L186P多形現象)之個體及/或癌症中之wnt信號傳導。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體抑制RSPO2與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體不抑制RSPO2與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用(例如增強RSPO2與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的結合)。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體抑制RSPO2與跨膜E3 泛素酶(例如ZNRF3及/或RNF43中之一或多者)之相互作用。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體抑制RSPO2與多配體蛋白聚糖(例如Sdc4)之相互作用。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體抑制RSPO2與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用且抑制RSPO2與跨膜E3泛素酶(例如ZNRF3及/或RNF43中之一或多者)(例如11F11、36D2、49G5及/或26E11)之相互作用。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體抑制RSPO2與跨膜E3泛素酶(例如ZNRF3及/或RNF43中之一或多者)之相互作用且不抑制RSPO2與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用(例如增強RSPO2與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者之結合)(例如1A1)。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體抑制癌症幹細胞生長。在一些實施例中，抗-RSPO2抗體誘發及/或促進癌細胞(例如癌症幹細胞)分化(例如終末分化及/或分化成祖細胞)。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體誘發及/或促進癌細胞(例如癌症幹細胞)分化成腸上皮細胞、杯狀細胞及/或腸內分泌細胞。
在某些實施例中，結合於RSPO2及/或RSPO3之抗體為結合RSPO3之抗體。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體結合RSPO3，其中RSPO3具有SEQ ID NO：2中闡述之序列。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體結合RSPO3，其中RSPO3缺乏信號傳導肽序列(例如結合於SEQ ID NO：2之胺基酸22-272內之胺基酸)。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體結合於RSPO3之一或多個弗林樣富含半胱胺酸結構域。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體結合SEQ ID NO：2之胺基酸35至135內之區域。 在一些實施例中，抗-RSPO3抗體結合SEQ ID NO：2之胺基酸35至86內之區域。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體結合SEQ ID NO：2之胺基酸92至135內之區域。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體不結合於RSPO3之血小板反應素1型結構域(例如不結合SEQ ID NO：2之胺基酸147-207內之胺基酸)。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體結合於RSPO3之血小 板反應素1型結構域。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體結合SEQ ID NO：2之胺基酸147至207內之區域。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體抑制wnt信號傳導。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體抑制RSPO3與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體不抑制RSPO3與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用(例如增強RSPO3與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的結合)。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體抑制RSPO3與跨膜E3泛素酶(例如ZNRF3及/或RNF43中之一或多者)之相互作用。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體抑制RSPO3與多配體蛋白聚糖(例如Sdc4)之相互作用。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體抑制RSPO3與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用且抑制RSPO3與跨膜E3泛素酶(例如ZNRF3及/或RNF43中之一或多者)之相互作用。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體抑制癌症幹細胞生長。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體誘發及/或促進癌細胞(例如癌症幹細胞)分化(例如終末分化及/或分化成祖細胞)。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體誘發及/或促進癌細胞(例如癌症幹細胞)分化成短期擴增細胞。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體誘發及/或促進癌細胞(例如癌症幹細胞)分化成腸上皮細胞、杯狀細胞及/或腸內分泌細胞。
在一些實施例中，抗-RSPO3抗體結合於SEQ ID NO：2之胺基酸49至108內之區域。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體結合於包含一或多個選自RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之Ser49、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Ile73、Gly74、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Lys94及Lys108之胺基酸的抗原決定基。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體結合於包含RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之胺基酸Ser49、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Ile73、Gly74、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Lys94 及Lys108之抗原決定基。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體結合於包含以下RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之胺基酸殘基之抗原決定基：Ser49、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Ile73、Gly74、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Lys94及Lys 108。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體結合於包含一或多個選自RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之Ser49、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Ile73、Gly74、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Lys94、Lys97及Lys108之胺基酸的抗原決定基。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體結合於包含RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之胺基酸Ser49、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、G1n72、Ile73、Gly74、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Lys94、Lys97及Lys108之抗原決定基。在一些實施例中，當結合於RSPO3時抗-RSPO3抗體位於離RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之一或多個胺基酸Ser49、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Ile73、Gly74、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Lys94及Lys108 4埃或不足4埃。在一些實施例中，當結合於RSPO3時抗-RSPO3抗體位於離以下RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之胺基酸殘基4埃或不足4埃處：Ser49、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Ile73、Gly74、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Lys94及Lys108。在一些實施例中，當結合於RSPO3時抗-RSPO3抗體位於離RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之一或多個胺基酸Ser49、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Ile73、Gly74、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Lys94、Lys97及Lys108 4埃或不足4埃處。在一些實施例中，當結合於RSPO3時抗-RSPO3抗體位於離以下RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之胺基酸殘基4埃或不足4埃處：Ser49、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、 Ile73、Gly74、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Lys94、Lys97及Lys108。在一些實施例中，當結合於RSPO3時抗-RSPO3抗體位於離RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之一或多個胺基酸Asn 52、Leu55、Phe63、Gln72、Tyr89、Pro90、Asp91、Lys94及Lys97 3.5埃或不足3.5埃處。在一些實施例中，當結合於RSPO3時抗-RSPO3抗體位於離RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之Asn 52、Leu55、Phe63、Gln72、Tyr89、Pro90、Asp91、Lys94及Lys97 3.5埃或不足3.5埃處。在一些實施例中，當結合於RSPO3時抗-RSPO3抗體位於離RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之一或多個胺基酸Gln72、Pro90、Asp91及Lys94 3埃或不足3埃處。在一些實施例中，當結合於RSPO3時抗-RSPO3抗體位於離RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之Gln72、Pro90、Asp91及Lys94 3埃或不足3埃處。在一些實施例中，當結合於RSPO3時抗-RSPO3抗體位於離一或多個以上所提供之胺基酸4、3.75、3.5、3.25或3埃或不足4、3.75、3.5、3.25或3埃處。在一些實施例中，一或多個胺基酸及/或一或多個胺基酸殘基為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及/或12個胺基酸及/或胺基酸殘基中之任一者。在一些實施例中，抗原決定基藉由結晶學(例如實例中所描述之結晶學方法)測定。
在一些實施例中，抗-RSPO3抗體結合於SEQ ID NO：2之胺基酸47至108內之胺基酸。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體結合於包含一或多個選自RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之Thr47、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Asn93、Lys94、Lys97及Lys108之胺基酸的抗原決定基。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體結合於包含RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之胺基酸Thr47、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Asn93、Lys94、Lys97及Lys108的抗原決定基。在一些實施例中，抗-RSPO3 抗體結合於包含以下RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之胺基酸殘基的抗原決定基：Thr47、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Asn93、Lys94、Lys97及Lys108。在一些實施例中，當結合於RSPO3時抗-RSPO3抗體位於離RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之一或多個胺基酸Thr47、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Asn93、Lys94、Lys97及Lys108 4埃或不足4埃處。在一些實施例中，當結合於RSPO3時抗-RSPO3抗體位於離以下RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之胺基酸殘基4埃或不足4埃處：Thr47、Asn52、Cys54、Leu55、Ser56、Phe63、Leu65、Gln72、Tyr84、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Asn93、Lys94、Lys97及Lys108。在一些實施例中，當結合於RSPO3時抗-RSPO3抗體位於離RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之一或多個胺基酸Thr47、Asn52、Leu55、Phe63、Gln72、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Lys94及Lys97 3.5埃或不足3.5埃處。在一些實施例中，當結合於RSPO3時抗-RSPO3抗體位於離RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之胺基酸Thr47、Asn52、Leu55、Phe63、Gln72、Tyr89、Pro90、Asp91、Ile92、Lys94及Lys97 3.5埃或不足3.5埃處。在一些實施例中，當結合於RSPO3時抗-RSPO3抗體位於離RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之一或多個胺基酸Thr47、Leu55、Gln72、Pro90、Asp91及Lys943埃或不足3埃處。在一些實施例中，當結合於RSPO3時抗-RSPO3抗體位於離RSPO3(例如SEQ ID NO：2)之胺基酸Thr47、Leu55、Gln72、Pro90、Asp91及Lys94 3埃或不足3埃處。在一些實施例中，當結合於RSPO3時抗-RSPO3抗體位於離一或多個上文所提供之胺基酸4、3.75、3.5、3.25或3埃或不足4、3.75、3.5、3.25或3埃處。在一些實施例中，一或多個胺基酸及/或一或多個胺基酸殘基為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及/或12個胺基酸及/ 或胺基酸殘基中之任一者。在一些實施例中，抗-RSPO3抗體亦結合RSPO2。在一些實施例中，抗原決定基藉由結晶學(例如實例中所描述之結晶學方法)測定。
在一些實施例中，如藉由結晶學確定之抗原決定基使用RSPO3之胺基酸M33-E210確定。在一些實施例中，如藉由結晶學確定之抗原決定基藉由使用Labcyte Echo液體處置器設置若干稀少基質晶體篩網，使用100nL沉滴進行。篩網儲存在18℃下。在一些實施例中，晶體可在含有100mM MIB pH 9及25% PEG 1500作為母液之液滴中獲得。在一些實施例中，晶體可在含有200mM甲酸鈉及20%(w/v)PEG 3,350作為母液之液滴中獲得。在一些實施例中，晶體可收穫且浸沒在冷凍保護溶液中10秒並在液氮中快速冷凍。在一些實施例中，冷凍保護溶液可藉由將1μL 70%甘油與1.8μL儲槽溶液混合而製得。在一些實施例中，晶體可在基於PEG之條件，例如約20-25% PEG 3,350中增長。在一些實施例中，晶體可在約20% PEG 6,000、約20-25% PEG 4,000及約25% PEG 1,500中增長。在一些實施例中，pH值可在約3.5-9範圍內，例如約7與約8之間。在一些實施例中，鹽濃度為約200mM。
在某些實施例中，結合於RSPO2及/或RSPO3之抗體為結合RSPO2及RSPO3之抗體(例如抗-RSPO2/3抗體)。在一些實施例中，抗-RSPO2/3抗體結合RSPO2，其中RSPO2具有SEQ ID NO：1中闡述之序列且結合RSPO3，其中RSPO3具有SEQ ID NO：2中闡述之序列。在一些實施例中，抗-RSPO2/3抗體抑制wnt信號傳導。
在一些態樣中，鑑別能夠與RSPO2及RSPO3均交叉反應之抗體。 此等抗-RSPO2/3抗體之活性之一非限制性實例可包括能夠結合於RSPO2及RSPO3、藉由IHC偵測RSPO2及RSPO3、抑制RSPO2及RSPO3與LGR多肽(例如LGR4及/或LGR5)之相互作用、抑制RSPO2及 RSPO3與E3泛素酶多肽(例如RNF43及/或ZNRF3)之相互作用，及/或抑制藉由RSPO2、RSPO3、RSPO2多形現象及RSPO2易位產物刺激之信號傳導。
熟習此項技術者將進一步瞭解在一些實施例中，任何抗-RSPO2抗體及/或抗-RSPO3抗體可經工程改造成抗體格式，尤其雙特異性格式，其將允許與RSPO2及RSPO3兩者反應。此等抗-RSPO2/3雙特異性抗體之能力可包括能夠結合於RSPO2及RSPO3、藉由IHC偵測RSPO2及RSPO3、抑制RSPO2及RSPO3與LGR多肽(例如LGR4及/或LGR5)之相互作用、抑制RSPO2及RSPO3與E3泛素酶多肽(例如RNF43及/或ZNRF3)之相互作用，及/或抑制藉由RSPO2、RSPO3、RSPO2多形現象及RSPO2易位產物刺激之信號傳導。
在任何抗-RSPO2/3抗體之一些實施例中，抗-RSPO2/3抗體抑制RSPO2及RSPO3與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用。在一些實施例中，抗體為雙臂抗體。在一些實施例中，抗-RSPO2/3抗體包含在各可變域上包含26E11之六個HVR的第一及第二可變域。在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，抗-RSPO2/3抗體包含含有5D6或5E11之六個HVR之第一可變域及含有36D2之六個HVR之第二可變域。
在任何抗-RSPO2/3抗體之一些實施例中，抗-RSPO2/3抗體抑制RSPO3與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者之相互作用且不抑制RSPO2與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的相互作用(例如增強RSPO2與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者之結合)。在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，抗-RSPO2/3抗體包含含有5D6或5E11之六個HVR之第一可變域及含有1A1之六個HVR之第二可變域。
在任何抗-RSPO2/3抗體之一些實施例中，抗-RSPO2/3抗體抑制 RSPO2及RSPO3與跨膜E3泛素酶(例如ZNRF3及/或RNF43中之一或多者)之相互作用。在一些實施例中，抗體為雙臂抗體。在一些實施例中，抗-RSPO2/3抗體包含在各可變域上包含26E11之六個HVR之第一及第二可變域。在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，抗-RSPO2/3抗體包含含有5D6或5E11之六個HVR之第一可變域及含有36D2或1A1之六個HVR之第二可變域。
在任何抗-RSPO2/3抗體之一些實施例中，抗-RSPO2/3抗體抑制RSPO2及RSPO3與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者之相互作用且抑制RSPO2及RSPO3與跨膜E3泛素酶(例如ZNRF3及/或RNF43中之一或多者)之相互作用。在一些實施例中，抗體為雙臂抗體。在一些實施例中，抗-RSPO2/3抗體包含在各可變域上包含26E11之六個HVR的第一及第二可變域。在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，抗-RSPO2/3抗體包含含有5D6或5E11之六個HVR之第一可變域及含有36D2之六個HVR之第二可變域。
在任何抗-RSPO2/3抗體之一些實施例中，抗-RSPO2/3抗體抑制RSPO3與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者之相互作用且抑制RSPO2及RSPO3與跨膜E3泛素酶(例如ZNRF3及/或RNF43中之一或多者)之相互作用且不抑制RSPO2與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者之相互作用(例如增強RSPO2與LGR4、LGR5及/或LGR6中之一或多者的結合)。在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，抗-RSPO2/3抗體包含含有5D6或5E11之六個HVR之第一可變域及含有1A1之六個HVR之第二可變域。
在一個態樣中，本文提供結合與抗體4H1、4D4、5C2、5D6、5E11、6E9、21C2及/或26E11中之一或多者相同或重疊之抗原決定基的抗-RSPO3抗體。此外，在一個態樣中，本文提供與抗體4H1、4D4、5C2、5D6、5E11、6E9、21C2及/或26E11中之一或多者競爭結 合於RSPO3的抗-RSPO3抗體。在一個態樣中，本文提供結合與抗體1A1、11F11、26E11、36D2及/或49G5中之一或多者相同或重疊之抗原決定基的抗-RSPO2抗體。此外，在一個態樣中，本文提供與抗體1A1、11F11、26E11、36D2及/或49G5中之一或多者競爭結合於RSPO2之抗-RSPO2抗體。在一個態樣中，本文提供結合與1A1相同或重疊之抗原決定基的抗-RSPO2抗體。此外，在一個態樣中，本文提供與1A1競爭結合於RSPO2的抗-RSPO2抗體。在一些實施例中，藉由BIACORE、競爭性ELISA及/或本文中描述及此項技術中已知之任何其他方法，抗體與另一抗體競爭結合。此項技術中已知且本文中描述確定抗原決定基之方法。在一些實施例中，抗原決定基為線性抗原決定基。在一些實施例中，抗原決定基為構形抗原決定基。在一些實施例中，抗原決定基藉由抗體與肽片段之結合確定。在一些實施例中，抗原決定基藉由質譜分析確定。在一些實施例中，抗原決定基藉由結晶學(例如分析晶體結構)確定。
單株抗體4H1及某些其他抗體實施例
在一個態樣中，本發明提供一種抗-RSPO3抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：6胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的HVR-H3。在另一個實 施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的HVR-H3及包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的HVR-L3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的HVR-L3及包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的HVR-H2。在另一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的HVR-L3。在一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含：(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-H3的VH HVR序列；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的HVR-L3的VL HVR序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：6之胺基酸 序列的HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：7之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-RSPO3抗體，其中該抗體包含如以上提供之任何實施例中的VH，及如以上提供之任何實施例中的VL。在一個實施例中，抗體分別包含SEQ ID NO：89及SEQ ID NO：90中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
單株抗體4D4及某些其他抗體實施例
在一個態樣中，本發明提供一種抗-RSPO3抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-H3及包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-L3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-L3及包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-H2。在另一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-L3。在一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含：(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-H3的VH HVR序列；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-L3的VL HVR序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含：(a)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：13之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-RSPO3抗體，其中該抗體包含：如以上提供之任何實施例中的VH，及如以上提供之任何實施例中的VL。在一個實施例中，抗體分別包含SEQ ID NO：91及SEQ ID NO：92中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
單株抗體5C2及某些其他抗體實施例
在一個態樣中，本發明提供一種抗-RSPO3抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的HVR-H3及包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的HVR-L3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的HVR-L3及包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的HVR-H2。在另一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的HVR-L3。在一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的HVR-I3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含：(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：22之胺基酸序列的HVR-H3的VH HVR序列；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的HVR-L3的VL HVR序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含：(a)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：19之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-RSPO3抗體，其中該抗體包含：如以上提供之任何實施例中的VH，及如以上提供之任何實施例中的VL。在一個實施例中，抗體分別包含SEQ ID NO：93及SEQ ID NO：94中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
單株抗體5D6及某些其他抗體實施例
在一個態樣中，本發明提供一種抗-RSPO3抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-H3及包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2。在另一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3。在一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含：(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-H3的VH HVR序列；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含SEO ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3的 VL HVR序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗-RSPO3抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：188或SEQ ID NO：189之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，HVR-H3包含SEQ ID NO：188之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H3包含SEQ ID NO：189之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：188或SEQ ID NO：189之胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：188或SEQ ID NO：189之胺基酸序列的HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：188或SEQ ID NO：189之胺基酸序列的HVR-H3及包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：188或SEQ ID NO：189之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3及包含SEQ ID NO：27之胺 基酸序列的HVR-H2。在另一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：188或SEQ ID NO：189之胺基酸序列的HVR-H3。在一些實施例中，HVR-H3包含SEQ ID NO：188之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H3包含SEQ ID NO：189之胺基酸序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3。在一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含：(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：188或SEQ ID NO：189之胺基酸序列的HVR-H3的VH HVR序列；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3之VL HVR序列。在一些實施例中，HVR-H3包含SEQ ID NO：188之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H3包含SEQ ID NO：189之胺基酸序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：188或SEQ ID NO：189之胺基酸序列的 HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3。在一些實施例中，HVR-H3包含SEQ ID NO：188之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H3包含SEQ ID NO：189之胺基酸序列。
在另一個態樣中，提供一種抗-RSPO3抗體，其中該抗體包含：如以上提供之任何實施例中的VH，及如以上提供之任何實施例中的VL。在一個實施例中，抗體分別包含SEQ ID NO：95及SEQ ID NO：96中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在任一上述實施例中，抗-RSPO3抗體人類化。在一個實施例中，抗-RSPO3抗體包含如任一上述實施例中之HVR，且另外包含人類接受體構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在某些實施例中，人類接受體構架為人類VL κI共同(VLKI)構架及/或VH構架VH1。在某些實施例中，人類接受體構架為包含任一以下突變之人類VL κI共同(VLKI)構架及/或VH構架VH1。
在另一個態樣中，抗-RSPO3抗體包含與SEQ ID NO：191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213或215之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，與SEQ ID NO：191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213或215之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-RSPO3抗體保留結合於RSPO3之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213或215中總共1至10個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施 例中，SEQ ID NO：191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213或215中總共1至5個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-RSPO3抗體包含SEQ ID NO：191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213或215之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-H1、(b)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-H2及(c)包含SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：188或SEQ ID NO：189之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一個態樣中，提供一種抗-RSPO3抗體，其中抗體包含與SEQ ID NO：190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212或214之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與SEQ ID NO：190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212或214之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-RSPO3抗體保留結合於RSPO3之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212或214中總共1至10個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212或214中總共1至5個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-RSPO3抗體包含SEQ ID NO：190、192、194、196、198、200、202、204、 206、208、210、212或214之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一態樣中，提供一種抗-RSPO3抗體，其中該抗體包含如上文所提供之任何實施例中的VH，及如上文所提供之任何實施例中的VL。
在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO：190及SEQ ID NO：191中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO：192及SEQ ID NO：193中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO：194及SEQ ID NO：195中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO：196及SEQ ID NO：197中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO：198及SEQ ID NO：199中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO：200及SEQ ID NO：201中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO：202及SEQ ID NO：203中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO：204及SEQ ID NO：205中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO：206及SEQ ID NO：207中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO：208及SEQ ID NO：209中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO：210及 SEQ ID NO：211中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO：212及SEQ ID NO：213中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體分別包含SEQ ID NO：214及SEQ ID NO：215中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中，本文提供結合於與本文提供之抗-RSPO3抗體相同之抗原決定基的抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供一種結合於與抗-RSPO3抗體相同之抗原決定基的抗體，其分別包含SEQ ID NO：191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213或215之VH序列及SEQ ID NO：190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212或214之VL序列。在一些實施例中，抗原決定基藉由結晶學確定。
在本發明之另一態樣中，根據任一上述實施例之抗-RSPO3抗體為單株抗體，包括人類抗體。在一個實施例中，抗-RSPO3抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一實施例中，抗體為實質上全長抗體，例如IgG1抗體、IgG2a抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。
單株抗體5E11及某些其他抗體實施例
在一個態樣中，本發明提供一種抗-RSPO3抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少 兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的HVR-H3及包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的HVR-L3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的HVR-L3及包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的HVR-H2。在另一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的HVR-L3。在一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含：(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：34之胺基酸序列的HVR-H3的VH HVR序列；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的HVR-L3的VL HVR序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：31之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-RSPO3抗體，其中該抗體包含：如以上提供之任何實施例中的VH，及如以上提供之任何實施例中的VL。在一個實施例中，抗體分別包含SEQ ID NO：97及SEQ ID NO：98中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
單株抗體6E9及某些其他抗體實施例
在一個態樣中，本發明提供一種抗-RSPO3抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的HVR-H3及包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的HVR-L3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的HVR-L3及包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的HVR-H2。在另一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的HVR-L3。在一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含：(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：40之胺基酸序列的HVR-H3的VH HVR序列；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的HVR-L3的VL HVR序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：37之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-RSPO3抗體，其中該抗體包含： 如以上提供之任何實施例中的VH，及如以上提供之任何實施例中的VL。在一個實施例中，抗體分別包含SEQ ID NO：99及SEQ ID NO：100中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
單株抗體21C2及某些其他抗體實施例
在一個態樣中，本發明提供一種抗-RSPO3抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的HVR-H3及包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的HVR-L3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的HVR-L3及包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列的HVR-H2。在另一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的HVR- L2；及(c)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的HVR-L3。在一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含：(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：46之胺基酸序列的HVR-H3的VH HVR序列；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的HVR-L3的VL HVR序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：43之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-RSPO3抗體，其中該抗體包含：如以上提供之任何實施例中的VH，及如以上提供之任何實施例中的VL。在一個實施例中，抗體分別包含SEQ ID NO：101及SEQ ID NO：102中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
單株抗體26E11及某些其他抗體實施例
在一個態樣中，本發明提供一種抗-RSPO2/3抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序 列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列的HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列的HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列的HVR-H3及包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列的HVR-L3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列的HVR-L3及包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的HVR-H2。在另一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列的HVR-L3。在一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含：(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的HVR-H2及(iii) 包含選自SEQ ID NO：52之胺基酸序列的HVR-H3的VH HVR序列；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列的HVR-L3的VL HVR序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：49之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-RSPO2/3抗體，其中該抗體包含：如以上提供之任何實施例中的VH，及如以上提供之任何實施例中的VL。在一個實施例中，抗體分別包含SEQ ID NO：103及SEQ ID NO：104中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
抗-RSPO3單株抗體及某些其他抗體實施例
在一個態樣中，本發明提供一種抗-RSPO3抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列的HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的HVR- H2；及(c)包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的HVR-H3及包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列的HVR-L3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列的HVR-L3及包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的HVR-H2。在另一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列的HVR-L3。在一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含：(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：82之胺基酸序列的HVR-H3的VH HVR序列；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列的HVR-L3的VL HVR序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列 的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：79之胺基酸序列的HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗-RSPO3抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的HVR-H3及包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的HVR-L3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的HVR-L3及包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的HVR-H2。在另一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的HVR- L2；及(c)包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的HVR-L3。在一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含：(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：88之胺基酸序列的HVR-H3的VH HVR序列；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的HVR-L3的VL HVR序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：85之胺基酸序列的HVR-L3。
單株抗體1A1及某些其他抗體實施例
在一個態樣中，本發明提供一種抗-RSPO2抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的HVR-H3及包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的HVR-L3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的HVR-L3及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的HVR-H2。在另一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的HVR-L3。在一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含：(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：58之胺基酸序列的HVR-H3的VH HVR序列；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的HVR-L3的 VL HVR序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：55之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-RSPO2抗體，其中該抗體包含：如以上提供之任何實施例中的VH，及如以上提供之任何實施例中的VL。在一個實施例中，抗體分別包含SEQ ID NO：105及SEQ ID NO：106中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
單株抗體11F11及某些其他抗體實施例
在一個態樣中，本發明提供一種抗-RSPO2抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列的HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的HVR-H3及包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列的HVR-L3。在另一個實施例中， 抗體包含：包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列的HVR-L3及包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列的HVR-H2。在另一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列的HVR-L3。在一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含：(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：64之胺基酸序列的HVR-H3的VH HVR序列；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列的HVR-L3的VL HVR序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：61之胺基酸序列的HVR-I3。
在另一個態樣中，提供一種抗-RSPO2抗體，其中該抗體包含：如以上提供之任何實施例中的VH，及如以上提供之任何實施例中的VL。在一個實施例中，抗體分別包含SEQ ID NO：107及SEQ ID NO：108中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
單株抗體36D2及某些其他抗體實施例
在一個態樣中，本發明提供一種抗-RSPO2抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列的HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列的HVR-H3及包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的HVR-L3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的HVR-L3及包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的HVR-H2。在另一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：65之 胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的HVR-L3。在一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含：(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：70之胺基酸序列的HVR-H3的VH HVR序列；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的HVR-L3的VL HVR序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：67之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-RSPO2抗體，其中該抗體包含：如以上提供之任何實施例中的VH，及如以上提供之任何實施例中的VL。在一個實施例中，抗體分別包含SEQ ID NO：109及SEQ ID NO：110中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
單株抗體49G5及某些其他抗體實施例
在一個態樣中，本發明提供一種抗-RSPO2抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的HVR-H3。在一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的HVR-H3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的HVR-H3及包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的HVR-L3。在另一個實施例中，抗體包含：包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的HVR-L3及包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的HVR-H2。在另一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的HVR-L3。在一個實施例中，抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含：(a)VH結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序 列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含選自SEQ ID NO：76之胺基酸序列的HVR-H3的VH HVR序列；及(b)VL結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自(i)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的HVR-L2及(c)包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的HVR-L3的VL HVR序列。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：73之胺基酸序列的HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-RSPO2抗體，其中該抗體包含：如以上提供之任何實施例中的VH，及如以上提供之任何實施例中的VL。在一個實施例中，抗體包含分別SEQ ID NO：111及SEQ ID NO：112中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在任一上述實施例中，抗-RSPO抗體人類化。舉例而言，任一上述抗-RSPO抗體之人類化形式。在一個實施例中，抗-RSPO抗體包含如任一上述實施例中之HVR，且另外包含人類接受體構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。
在本發明之另一態樣中，根據任一上述實施例之抗-RSPO抗體為單株抗體，包括嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一個實施例中，抗-RSPO抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一實施例中，抗體為全長抗體，例如完整IgG1或IgG2a抗體或如本文中定義之其他抗體類別或同型。
在另一態樣中，根據任一上述實施例之抗-RSPO抗體可併有如以 下1-7部分中所述之任何特徵(單獨或組合)。
1. 抗體親和力
在某些實施例中，本文所提供之抗體的解離常數(Kd)1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或10-8M以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一個實施例中，藉由放射性標記抗原結合分析(RIA)量測Kd。 在一個實施例中，用所關注之抗體之Fab型式及其抗原進行RIA。舉例而言，藉由在一系列滴定之未經標記抗原存在下使Fab與最小濃度之經(125I)標記抗原平衡，隨後使用經抗-Fab抗體塗佈之盤捕獲所結合之抗原來量測Fab對抗原之溶液結合親和力(參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為確立分析條件，將MICROTITER®多孔盤(Thermo Scientific)用含5μg/ml捕獲抗-Fab抗體(Cappel Labs)之50mM碳酸鈉(pH 9.6)塗佈隔夜，且隨後在室溫(約23℃)下用含2%(w/v)牛血清白蛋白之PBS阻斷二至五小時。在無吸附劑培養盤(Nunc #269620)中，將100pM或26pM[125I]-抗原與所關注之Fab之連續稀釋液混合(例如與抗-VEGF抗體Fab-12之評定一致，Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997))。隨後培育所關注之Fab隔夜；然而，可持續培育較長時間(例如約65小時)以確保達到平衡。此後，在室溫下將混合物轉移至捕捉盤中以進行培育(例如1小時)。隨後移除溶液且用含0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20®)之PBS洗滌盤八次。當盤乾燥時，每孔添加150微升閃爍體(MICROSCINT-20TM；Packard)，且在TOPCOUNTTM γ計數器(Packard)上對盤計數十分鐘。選擇提供小於或等於20%最大結合之各Fab的濃度用於競爭性結合分析。
根據另一實施例，使用BIACORE®表面電漿子共振分析量測Kd。 舉例而言，使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，在25℃下用固定抗原CM5晶片以約10反應單位(RU) 進行分析。在一個實施例中，根據供應商之說明書，用N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)來活化羧基甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5,BIACORE,Inc.)。抗原用10mM乙酸鈉pH 4.8稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，隨後在5微升/分鐘之流動速率下注射以獲得大約10反應單元(RU)之偶合蛋白質。繼注射抗原之後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應基團。對於動力學量測，在25℃下，以約25μl/min之流速注射含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)界面活性劑之PBS(PBST)中的Fab兩倍連續稀釋液(0.78nM至500nM)。使用簡單的一比一朗繆爾結合模型(one-to-one Langmuir binding model)(BIACORE®評估軟體3.2版)，同時擬合締合及解離感測器圖譜來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。以koff/kon比率來計算平衡解離常數(Kd)。參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若藉由上述表面電漿子共振分析，締合速率超過106M-1s-1，則可藉由使用螢光淬滅技術來測定締合速率，該技術係在如分光計(諸如配備停流之分光光度計(Aviv Instruments)或具有經攪拌比色管的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic))中所量測，遞增濃度之抗原存在下，在25℃下量測PBS(pH 7.2)中之20nM抗-抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)的增大或減小。
2. 抗體片段
在某些實施例中，本文提供之抗體為抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv及scFv片段及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參看Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基及具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的討論，參見美國專利第5,869,046號。
雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點之可具有二價或雙特異性的抗體片段。參看例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
單域抗體為包含抗體之全部或部分重鏈可變域或全部或部分輕鏈可變域的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見例如美國專利第6,248,516號)。
抗體片段可藉由各種技術製備，包括(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生，如本文所述。
3. 嵌合及人類化抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利第4,816,567號；以及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或子類已自親本抗體之類別或子類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體為人類化抗體。通常，對非人類抗體進行人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)來源於非人類抗體，且FR(或其部分)來 源於人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如HVR殘基所來源之抗體)之相應殘基取代例如以恢復或提高抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製造方法綜述於例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)，且進一步描述於例如Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述特異性決定區(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述「表面重塑」)；Dall'Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述FR改組之「引導選擇」方法)中。
可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之構架區(參見例如Sims等人J.Immunol.151：2296(1993))；來源於具有特定子群輕鏈或重鏈可變區之人類抗體的共同序列之構架區(參見例如Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及來源於篩選FR文庫之構架區(參見例如Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4. 人類抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術產生。人類抗體一般描述於van Dijk及 van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。
人類抗體可藉由向轉殖基因動物投與免疫原來製備，該轉殖基因動物已經修飾以回應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體。此類動物通常含有置換內源性免疫球蛋白基因座或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中之全部或部分人類免疫球蛋白基因座。在此類轉殖基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常不活化。關於由轉殖基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。亦參見例如美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，描述XENOMOUSETM技術；美國專利第5,770,429號，描述HUMAB®技術；美國專利第7,041,870號，描述K-M MOUSE®技術，及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，描述VELOCIMOUSE®技術。來自由此類動物產生之完整抗體之人類可變區可例如藉由與不同人類恆定區組合來進一步修飾。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製備。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤細胞株(參見例如Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991))。經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。其他方法包括例如於以下中描述之方法：美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(描述人類-人類融合瘤)。人類融合瘤技術(三體雜交瘤(Trioma)技術)亦描述於以下中：Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3)：927-937(2005)以及Vollmers及Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)。
人類抗體亦可藉由分離自人類來源噬菌體呈現文庫選擇之Fv純系可變域序列產生。此類可變域序列可接著與所要人類恆定域組合。下文描述自抗體文庫選擇人類抗體之技術。
5. 自文庫獲得之抗體
本發明之抗體可藉由篩選組合文庫中具有所要活性之抗體來分離。舉例而言，此項技術中已知多種方法可用於產生噬菌體呈現文庫及篩選此類文庫中具有所需結合特徵之抗體。此類方法例如綜述於Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,2001)中且進一步描述於例如McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)中。
在某些噬菌體呈現方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)分別選殖VH及VL基因之譜系且隨機重組於噬菌體文庫中，可接著如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述篩選該等噬菌體文庫中之抗原結合噬菌體。噬菌體通常呈現呈單鏈Fv(scFv)片段形式或呈Fab片段形式之抗體片段。來自免疫接種來源之文庫提供對免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，可選殖天然譜系(例如自人類)，以便在不進行任何免疫接種的情況下提供針對多種非自身抗原以及自身抗原的單一抗體來源，如Griffiths等人，EMBO J,12：725-734 (1993)所述。最後，亦可藉由自幹細胞選殖未重排之V基因區段且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高度可變CDR3區且達成活體外重排來以合成方式製備天然文庫，如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)所述。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段在本文中視為人類抗體或人類抗體片段。
6. 多特異性抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性之一為RSPO(例如RSPO2及/或RSPO3)。且其他係針對任何其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合於RSPO之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位至表現RSPO(例如RSPO2及/或RSPO3)之細胞。 在一些實施例中，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)結合於RSPO2及RSPO3。在一些實施例中，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)包含含有5E11 HVR之第一可變域及含有36D2 HVR之第二可變域。在一些實施例中，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)包含含有5D6 HVR之第一可變域及含有36D2 HVR之第二可變域。在一些實施例中，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)包含含有5E11 HVR之第一可變域及含有1A1 HVR之第二可變域。在一些實施例中，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)包含含有5D6 HVR之第一可變域及含有1A1 HVR之第二可變域。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段。
製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)使具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對以重組方式共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983)；WO 93/08829；及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))，及「杵入臼式(knob-in-hole)」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由以下來製備：工程改造靜電導引作用以製備抗體Fc雜二聚分子(WO 2009/089004A1)；使兩種或兩種以上抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用「雙功能抗體」技術用於製造雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；以及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))；以及製備三特異性抗體，如例如Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)中描述。
本文中亦包括具有三個或三個以上功能抗原結合位點之工程改造抗體，包括「章魚抗體(Octopus antibody)」(參見例如US 2006/0025576)。
本文中之抗體或片段亦包括「雙效FAb(Dual Acting FAb)」或「DAF」，其包含結合於多種RSPO(例如RSPO2及/或RSPO3)之抗原結合位點(例如參見US 2008/0069820)。
7. 抗體變異體
在某些實施例中，涵蓋本文提供之抗體之胺基酸序列變異體。舉例而言，可需要提高抗體之結合親和力及/或其他生物特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成進行製備。此類修飾包括例如在抗體之胺基酸序列內進行殘基之缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任 何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所要特徵，例如抗原結合。
a)取代、插入及缺失變異體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。用於進行取代突變誘發之相關位點包括HVR及FR。保守性取代展示於表1中標題「較佳取代」下。更實質性變化提供於表1中標題「示例性取代」下且如下文關於胺基酸側鏈類別所進一步描述。胺基酸取代可引入相關抗體中且篩選具有所要活性，例如保留/提高之抗原結合、降低之免疫原性或提高之ADCC或CDC的產物。
胺基酸可根據共同側鏈性質進行分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將需要將此等類別中之一者之成員換成另一類別。
一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體(例如人類化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選用於進一步研究之所得變異體相對於親本抗體將在某些生物特性方面進行修改(例如改良)(例如增加之親和力、降低之免疫原性)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物特性。一種示例性取代變異體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所述之技術)便利地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且在噬菌體上呈現變異抗體並篩選具有特定生物活性(例如結合親和力)之變異抗體。
可在HVR中進行改變(例如取代)例如以提高抗體親和力。可在HVR「熱點」(亦即由在體細胞成熟過程期間經歷高頻率突變之密碼子所編碼之殘基(參見例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))，及/或接觸抗原之殘基)中用待測試結合親和力之所得變異VH或VL進行此類改變。藉由構築並自二級文庫再選擇來進行親和力成熟已描述於例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法中之任一者(例如易出錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之突變誘發)將多樣性引入選用於成熟之可變基因中。接著產生二級文庫。接著篩選文庫以鑑別具有所要親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導方法，其中使若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。參與抗原結合之 HVR殘基可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來逐一鑑別。尤其常以CDR-H3及CDR-L3為目標。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此類改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守性改變(例如如本文所提供之保守性取代)。此類改變例如可在接觸HVR中殘基之抗原之外。在以上提供之變異VH及VL序列之某些實施例中，各HVR未改變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
一種適用於鑑別可作為突變誘發之標靶的抗體殘基或區域之方法稱作「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085所述。在此方法中，鑑別殘基或標靶殘基群組(例如帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且用中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換來確定抗體與抗原之相互作用是否受影響。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置引入其他取代。或者或另外，利用抗原-抗體複合物之晶體結構來鑑別抗體與抗原之間的觸點。此等接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物之目標或排除在取代候選物之外。可篩選變異體以確定其是否含有所要性質。
胺基酸序列插入物包括長度為一個殘基至含有一百個或更多殘基之多肽範圍內之胺基及/或羧基端融合物，以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內插入物。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N端或C端與酶(例如，對於ADEPT而言)或可延長抗體之血清半衰期之多肽的融合物。
b)糖基化變異體
在某些實施例中，對本文提供之抗體進行改變以增加或減小抗體糖基化之程度。在抗體上添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點 可藉由改變胺基酸序列以產生或移除一或多個糖基化位點來便利地達成。
在抗體包含Fc區之情況下，可變化附著於其上之碳水化合物。 哺乳動物細胞所產生之原生抗體通常包含一般經N鍵與Fc區之CH2域之Asn297連接的分支雙觸寡醣。參見例如Wright等人TIBTECH 15：26-32(1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以便形成具有某些改良特性之抗體變異體。
在一個實施例中，提供具有缺乏與Fc區連接(直接或間接)之岩藻糖之碳水化合物結構的抗體變異體。舉例而言，此抗體中岩藻糖之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。如例如WO 2008/077546中所述，藉由相對於如藉由MALDI-TOF質譜分析所量測的與Asn 297連接之所有醣結構(例如複合、雜交及高甘露糖結構)之總和計算Asn297處糖鏈內岩藻糖的平均量來測定岩藻糖之量。Asn297係指大致位於Fc區中位置297(Fc區殘基之Eu編號)處之天冬醯胺殘基；然而，歸因於抗體中之微小序列變化，Asn297亦可能位於位置297之上游或下游約±3個胺基酸處，亦即介於位置294與300之間。此等岩藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta,L.)；第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。關於「去岩藻糖化」或「岩藻糖缺乏」抗體變異體之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人 J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能夠產生去岩藻糖基化抗體之細胞株之實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；及WO 2004/056312 A1,Adams等人，尤其在實例11中)及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
進一步提供具有平分型寡醣之抗體變異體，例如，其中連接至抗體Fc區之雙觸寡醣係由GlcNAc平分。此類抗體變異體可具有減少之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能。此類抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美國專利第6,602,684號(Umana等人)及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供在連接至Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變異體。此類抗體變異體可具有提高之CDC功能。此類抗體變異體描述於例如WO 1997/30087(Patel等人)、WO 1998/58964(Raju,S.)及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc區變異體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文提供之抗體之Fc區中，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些而非所有效應功能之抗體變異體，此使得該抗體成為其中活體內抗體半衰期重要，而某些效應功能(諸如補體及ADCC)為不必要或有害的應用中合乎需要之候選 物。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/缺乏。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析，以確保抗體缺乏FcγR結合能力(從而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現概括於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)之第464頁之表3中。評估所關注分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例描述於以下中：美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；第5,821,337號(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可使用非放射性分析方法(參見例如流動式細胞測量術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI)。用於此類分析之適用效應細胞包括周圍血液單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。或者或另外，可在活體內，例如在動物模型(諸如在Clynes等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中揭示之動物模型)中，評估所關注分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合分析以確認抗體無法與C1q結合且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。 亦可使用此項技術中已知之方法進行FcRn結合及活體內清除率/半衰期測定(參見例如Petkova,S.B.等人，Int'l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
效應功能降低之抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代的抗體(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或兩者以上處具有取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代成丙胺酸之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。在一些實施例中，抗體在根據EU編號慣例之胺基酸位置265包含工程改造之丙胺酸。在一些實施例中，抗體在根據EU編號慣例之胺基酸位置297包含工程改造之丙胺酸。
與FcR之結合得到改良或減弱之某些抗體變異體已有描述。(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312；及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在某些實施例中，抗體變異體包含具有提高ADCC之一或多個胺基酸取代，例如Fc區之位置298、333及/或334(殘基之EU編號)處之取代的Fc區。
在一些實施例中，在Fc區中進行改變，引起C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即改良或減弱)，例如，如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人J.Immunol.164：4178-4184(2000)中描述。
US2005/0014934(Hinton等人)中描述具有增加之半衰期及經改良之與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的抗體，FcRn負責將母體IgG轉移至胎兒體內(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。彼等抗體包含其中具有改良Fc區與FcRn之結合之一或多個取代的Fc區。此類Fc變異體包括在以下Fc區殘基中之一或多者處具有取代的變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如取代Fc區殘基434(美國專利第7,371,826 號)。關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan及Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。
d)半胱胺酸工程改造之抗體變異體
在某些實施例中，可能需要產生半胱胺酸工程改造之抗體，例如「硫基Mab(thioMAb)」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基在抗體之可達位點處出現。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基藉此定位於抗體之可達位點且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生如本文中進一步描述之免疫結合物。在某些實施例中，任一或多個以下殘基可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。半胱胺酸工程改造之抗體可如例如美國專利第7,521,541號中所述來產生。
e)抗體衍生物
在某些實施例中，本文提供之抗體可進行進一步修飾以含有此項技術中已知且易於獲得之其他非蛋白質部分。適於衍生化抗體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可於製造時具有優點。聚合物可具有任何分子量，且可具支鏈或不具支鏈。與抗體連接之聚合物的數目可變化，且若連接一個以上聚合物，則聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物之數目及/或類型可基於包括 (但不限於)待改良抗體之特定特性或功能，抗體衍生物是否將用於界定條件下之療法等因素來確定。
在另一實施例中，提供抗體與可藉由暴露於輻射來選擇性加熱之非蛋白部分的結合物。在一個實施例中，非蛋白部分為碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.102：11600-11605(2005))。此輻射可具有任一波長，且包括但不限於不損傷一般細胞但能將非蛋白部分加熱至可殺死抗體-非蛋白部分近側之細胞之溫度的波長。
B. 重組方法及組合物
舉例而言，可使用如美國專利第4,816,567號中所述之重組法及組合物來產生抗體。在一個實施例中，提供編碼本文所述之抗-RSPO抗體的分離核酸。此類核酸可編碼包含抗體VL之胺基酸序列及/或包含抗體VH之胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供一或多種包含此類核酸之載體(例如表現載體)。在另一實施例中，提供包含此類核酸之宿主細胞。在一個此類實施例中，宿主細胞包含(例如已經以下轉型)：(1)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列及包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的載體，或(2)包含編碼包含抗體VL之胺基酸序列之核酸的第一載體，及包含編碼包含抗體VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供一種製備抗-RSPO抗體之方法，其中該方法包含在適於表現該抗體之條件下培養如上文所提供之包含編碼該抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。
對於重組產生抗-RSPO抗體，分離編碼例如如上所述之抗體之核酸且插入一或多個載體中以供在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此類核酸可易於使用習知程序(例如藉由使用能夠與編碼抗體之重鏈 及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)分離及定序。
適於選殖或表現抗體編碼載體之宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可於細菌中產生，尤其在不需要糖基化及Fc效應功能時。關於在細菌中表現抗體片段及多肽，參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁，描述大腸桿菌中抗體片段之表現)。在表現之後，抗體可自細菌細胞糊狀物分離在可溶性溶離份中且可進一步經純化。
除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適於抗體編碼載體之選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已「人類化」，從而使得所產生之抗體具有部分或完全人類糖基化型態的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)，及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
適於表現糖基化抗體之宿主細胞亦可自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)獲得。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出眾多可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。
植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術)。
脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40(COS-7)轉型之猴腎CV1細胞株；人類胚腎細胞株(如例如在Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所述之293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell)(如例如在 Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述之TRI細胞；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞株的評述，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第255-268頁。
C. 分析
本文提供之抗-RSPO抗體可藉由此項技術中已知之各種分析針對其物理/化學性質及/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。
1. 結合分析及其他分析
在一個態樣中，例如藉由已知方法(諸如ELISA、西方墨點法等)測試本發明抗體之抗原結合活性。
測定結合親和力之方法為此項技術中已知。在一些實施例中，結合親和力可根據如本文實例1中所述之BIAcore®分析測定。特定言之，在一些實施例中，Kd可使用BIACORE®-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)使用表面電漿子共振分析量測。
測定抗-RSPO抗體破壞及/或抑制RSPO與LGR(例如LGR4、5及/或6)、多配體蛋白聚糖(例如SDC4)及/或E3泛素酶(例如ZNRF3及/或RNF43)之結合的能力之方法為此項技術中已知。參見例如WO2011/076932、WO2013012747、Lau等人Nature 476：293-297 (2011)、Hao等人Nature 485：195-200(2012)，其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，抗-RSPO抗體顯著破壞R-反應素(RSPO)與LGR、多配體蛋白聚糖及/或E3泛素酶之結合的能力可藉由流動式細胞測量術、BIAcore分析及/或ELISA(例如競爭性結合ELISA)測定。在一些實施例中，抗-RSPO抗體破壞及/或抑制RSPO與LGR(例如LGR4、5及/或6)、多配體蛋白聚糖(SDC4)及/或E3泛素酶(例如ZNRF3及/或RNF43)之結合的能力可根據如本文實例1中所述之競爭性結合ELISA測定。
在另一個態樣中，競爭分析可用以鑑別與4H1、4D4、5C2、5D6、5E11、6E9、21C2、26E11、1A1、11F11、36D2及/或49G5競爭結合於RSPO(例如RSPO2及/或RSPO3)之抗體。
測定抗體競爭之方法為此項技術中已知。在一個示例性競爭分析中，固定RSPO(例如RSPO2及/或RSPO3)在包含結合於RSPO(例如RSPO2及/或RSPO3)之第一標記抗體(例如4H1、4D4、5C2、5D6、5E11、6E9、21C2、26E11、1A1、11F11、36D2及/或49G5)及測試與第一抗體競爭結合於RSPO(例如RSPO2及/或RSPO3)之能力之第二未標記抗體的溶液中培育。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，固定RSPO(例如RSPO2及/或RSPO3)在包含第一標記抗體但不包含第二未標記抗體之溶液中培育。在允許第一抗體與RSPO(例如RSPO2及/或RSPO3)結合的條件下培育之後，移除過量未結合抗體且量測與固定RSPO(例如RSPO2及/或RSPO3)相關之標記之量。若測試樣品中，相對於對照樣品，與固定RSPO(例如RSPO2及/或RSPO3)相關之標記之量實質上減少，則此指示第二抗體與第一抗體競爭結合於RSPO(例如RSPO2及/或RSPO3)。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
另一示例性競爭分析描述於實例1中，其適用於抗原決定基分組及/或確定兩個抗體是否競爭結合。在一些實施例中，抗原決定基分組及/或確定兩個抗體是否競爭結合可根據如本文實例1中所述之Octet®分析來確定。
在某些實施例中，抗體結合於4H1、4D4、5C2、5D6、5E11、6E9、21C2、26E11、1A1、11F11、36D2及/或49G5所結合之相同抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)。Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology，第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中提供定位抗體所結合之抗原決定基的詳細示例性方法。在一些實施例中，抗原決定基藉由肽競爭確定。在一些實施例中，抗原決定基藉由質譜分析確定。在一些實施例中，抗原決定基藉由結晶學確定。結晶學之一種示例性方法描述於實例1中。
2. 活性分析
在一個態樣中，提供用於鑑別具有生物活性之抗-RSPO抗體的分析。生物活性可包括例如抑制wnt信號傳導、抑制血管生成、抑制細胞增殖、抑制癌症幹細胞增殖及/或消耗癌症幹細胞。亦提供在活體內及/或活體外具有此類生物活性之抗體。
測定抗-RSPO抗體破壞wnt/β-連環蛋白信號傳導之能力的方法為此項技術中已知。參見例如WO2005/040418及WO2013/012747，其以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，抗-RSPO抗體顯著破壞wnt/β-連環蛋白信號傳導之能力可使用報導基因分析來測定。在一些實施例中，舉例而言，在wnt/β-連環蛋白反應啟動子(諸如包含多聚TCF/LEF DNA結合位點之啟動子)控制下，包含報導基因(諸如螢光素酶基因)之報導構築體可轉染至細胞中。隨後細胞與諸如Wnt3a之Wnt配位體及諸如RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之RSPO在RSPO抗體存在及不存在下接觸，並量測螢光素酶表現。
測定抗-RSPO抗體抑制血管生成及/或血小管生成之能力的方法為此項技術中已知。參見例如WO2008/046649，其以全文引用的方式併入本文中。分析之實例包括活體內基質膠塞及角膜新血管生成分析、活體內/活體外雞絨毛膜尿囊膜(CAM)分析、活體外細胞(增殖、遷移、管形成)及器官型(主動脈環)分析、雞主動脈弧分析及基質膠海綿分析。
測定抗-RSPO抗體誘發幹細胞分化及/或癌症幹細胞消耗之能力的方法為此項技術中已知。參見例如WO2013/036867，其以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，幹細胞分化可藉由測定在抗-RSPO抗體存在及不存在下，隱窩底部柱狀細胞(CBC)分化成例如腸上皮細胞、杯狀細胞及/或腸內分泌細胞之能力來分析，隱窩底部柱狀細胞為小腸中之快速循環幹細胞。
在某些實施例中，藉由本文及WO2005/040418、WO2008/046649、WO2011/076932、WO2013/012747、WO2013/054307、Lau等人Nature 476：293-297(2011)、Hao等人Nature 485：195-200(2012)(以全文引用的方式併入本文中)中描述之分析測試本發明之抗體之此類生物活性及/或結合相互作用。
在一些實施例中，抗原決定基藉由結晶學確定。在一些實施例中，如藉由結晶學確定之抗原決定基使用RSPO3之胺基酸M33-E210確定。在一些實施例中，如藉由結晶學確定之抗原決定基，藉由使用Labcyte Echo液體處置器設置若干稀少基質晶體篩網，使用100nL沉滴進行。篩網儲存在18℃下。在一些實施例中，晶體可在含有100mM MIB pH 9及25% PEG 1500作為母液之液滴中獲得。在一些實施例中，晶體可在含有200mM甲酸鈉及20%(w/v)PEG 3,350作為母液之液滴中獲得。在一些實施例中，晶體可收穫且浸沒在冷凍保護溶液中10秒並在液氮中快速冷凍。在一些實施例中，冷凍保護溶液可藉由 將1μL 70%甘油與1.8μL儲槽溶液混合而製得。在一些實施例中，晶體可在基於PEG之條件，例如約20-25% PEG 3,350中增長。在一些實施例中，晶體可在約20% PEG 6,000、約20-25% PEG 4,000及約25% PEG 1,500中增長。在一些實施例中，pH值可在約3.5-9範圍內，例如約7與約8之間。在一些實施例中，鹽濃度為約200mM。
D. 免疫結合物
本發明亦提供免疫結合物，其包含本文中之抗-RSPO抗體與一或多種細胞毒性劑，諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素結合。
在一個實施例中，免疫結合物為抗體-藥物結合物(ADC)，其中抗體結合於一或多個藥物，包括(但不限於)類美登素(參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1)；阿瑞他汀(auristatin)，諸如單甲基阿瑞他汀藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(參見美國專利第5,635,483號及第5,780,588號及第7,498,298號)；海兔毒素(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號；Hinman等人，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.58：2925-2928(1998)；蒽環黴素(anthracycline)，諸如道諾黴素或小紅莓(參見Kratz等人，Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美國專利第6,630,579號)；甲胺 喋呤；長春地辛；紫杉烷，諸如多烯紫杉醇、太平洋紫杉醇、拉洛他賽(larotaxel)、替司他賽(tesetaxel)及奧他賽(ortataxel)；單端孢黴烯族毒素；以及CC1065。
在另一實施例中，免疫結合物包含如本文所述之抗體與酶促活性毒素或其片段結合，該等毒素包括(但不限於)白喉(diphtheria)A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素(exotoxin)A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素(ricin)A鏈、相思子毒素(abrin)A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecene)。
在另一實施例中，免疫結合物包含如本文所述之抗體與放射性原子結合以形成放射性結合物。多種放射性同位素可用於產生放射性結合物。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。當結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍造影研究的放射性原子，例如Tc99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱磁共振成像，MRI)之自旋標記物，又諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體與細胞毒性劑之結合物可使用多種雙官能蛋白質偶合劑製備，該等偶合劑諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺基酯之雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺基 酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對二重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science,238：1098(1987)中所述來製備。碳14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸與抗體結合之示例性螯合劑。參見WO94/11026。連接子可為有助於細胞毒性藥物在細胞中釋放之「可裂解連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含有二硫鍵之連接子(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
本文之免疫結合物或ADC明確涵蓋(但不限於)用以下可購得(例如購自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)之交聯試劑製備的此類結合物，該等交聯試劑包括(但不限於)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB、及SVSB(丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)。
E. 用於診斷及偵測之方法及組合物
在某些實施例中，本文提供之抗-RSPO抗體中之任一者適用於偵測樣品中RSPO之存在。如本文所用之術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。在某些實施例中，樣品包含細胞或組織，諸如腸胃、胃、食道、結腸、直腸及/或結腸直腸組織。在一些實施例中，樣品包含細胞或組織，諸如腎上腺、膀胱、腦、乳房、子宮頸、結腸、頭頸部、腎臟、白血病、肝、肺、淋巴、卵巢、胰臟、前列腺、直腸、皮膚、胃、甲狀腺及/或子宮組織。在一些實施例中，樣品包含細胞或組 織，諸如肺、卵巢、乳房、肝或多發性骨髓瘤組織。
在一個實施例中，提供一種用於診斷或偵測方法之抗-RSPO抗體。在另一態樣中，提供一種偵測樣品中RSPO之存在的方法。在某些實施例中，該方法包含使樣品與如本文中所述之抗-RSPO抗體在允許抗-RSPO抗體與RSPO結合之條件下接觸且偵測在抗-RSPO抗體與RSPO之間是否形成複合物。此類方法可為活體外或活體內方法。在一個實施例中，使用抗-RSPO抗體選擇適於用抗-RSPO抗體治療之受試者，例如其中RSPO為患者選擇之生物標記物。在一些實施例中，RSPO為RSPO2。在一些實施例中，RSPO為RSPO3。在一些實施例中，RSPO為RSPO2及RSPO3。在一些實施例中，個體及/或癌症具有增加之一或多種幹細胞生物標記物表現。在一些實施例中，幹細胞生物標記物包含Myc、Axin2、LGR5、TERT、BIRC5及/或Ascl2。在一些實施例中，個體及/或癌症具有減少之一或多種分化生物標記物表現。在一些實施例中，分化生物標記物包含CEACAM7、SLC26A3、CA1、SYTl5、CA4、TFF1及/或KRT20。
舉例而言，本文提供治療個體之癌症的方法，其中該癌症包含一或多種生物標記物，該方法包含向該個體投與有效量之抗-RSPO抗體。本文亦提供治療個體之癌症的方法，其包含向該個體投與有效量之抗-RSPO抗體，其中治療係基於個體患有包含一或多種生物標記物之癌症。
易位為特別強大之癌症突變，因為其常常對標靶基因具有多種作用：在單一『突變』中，其可顯著改變表現、移除調節結構域、迫使低聚合、改變蛋白質之亞細胞位置或將其與新穎結合結構域接合。此在臨床上反映在一些贅瘤根據特定融合基因之存在而分類或管理。在任一方法之一些實施例中，一或多種生物標記物包含表2中所列之一或多種基因之易位(例如染色體內易位、染色體間易位、重排及/或 融合)。
在任一方法之一些實施例中，易位為PVT1。在一些實施例中，PVT1易位包含PVT1及MYC。在一些實施例中，RSPO2易位包含PVT1及IncDNA。在任一方法之一些實施例中，易位為R-反應素易位。在一些實施例中，R-反應素易位為RSPO1易位。在一些實施例中，R-反應素易位為RSPO2。在一些實施例中，RSPO2易位包含EMC2及RSPO2。在一些實施例中，RSPO2易位包含EIF3E及RSPO2。在一些實施例中，RSPO2易位包含EIF3E外顯子1及RSPO2外顯子2。在一些實施例中，RSPO2易位包含EIF3E外顯子1及RSPO2外顯子3。在一些實施例中，RSPO2易位包含SEQ ID NO：71。在一些實施例中，RSPO2易位藉由包括SEQ ID NO：114、143及/或145之引子可偵測。在一些實施例中，RSPO2易位藉由EIF3E啟動子驅動。在一些實施例中，RSPO2易位藉由RSPO2啟動子驅動。在一些實施例中，R-反應素易位為RSPO3易位。在一些實施例中，RSPO3易位包含PTPRK及RSPO3。在一些實施例中，RSPO3易位包含PTPRK外顯子1及RSPO3外顯子2。在一些實施例中，RSPO3易位包含PTPRK外顯子7及RSPO3外顯子2。在一些實施例中，RSPO3易位包含SEQ ID NO：171及/或SEQ ID NO：172。在一些實施例中，RSPO3易位藉由包括SEQ ID NO：115、116、145及/或146之引子可偵測。在一些實施例中，RSPO3易位藉由PTPRK啟動子驅動。在一些實施例中，RSPO3易位藉由RSPO3啟動子驅動。在一些實施例中，RSPO3易位包含PTPRK分泌信號序列(及/或不包含RSPO3分泌信號序列)。
在一些實施例中，R-反應素易位為RSPO4易位。在一些實施例中，R-反應素易位導致R-反應素之表現水準升高(例如與無R-反應素易位之參考相比)。在一些實施例中，R-反應素易位導致R-反應素之活性升高及/或活化(例如與無R-反應素易位之參考相比)。在一些實施例中，一或多種生物標記物之存在包含R-反應素易位，諸如表2中之易位，及KRAS及/或BRAF。在一些實施例中，一或多種生物標記物之存在為R-反應素易位(例如重排及/或融合)之存在，表2中之易位，及KRAS及/或BRAF之變異(例如多形現象或突變)。在一些實施例中，個體及/或癌症包含KRAS及/或BRAF之變異(多形現象或突變)。在一些實施例中，一或多種生物標記物之存在為諸如表2中之易位的R-反應素易位之存在，且一或多種生物標記物之不存在為CTNNB1及/或APC之變異(例如多形現象或突變)之不存在。
在任一易位(例如染色體內易位、染色體間易位、重排及/或融合)之一些實施例中，易位(例如染色體內易位、染色體間易位、重排及/或融合)為體細胞易位(例如染色體內易位、染色體間易位、重排及/或融合)。在一些實施例中，易位為染色體內易位。在一些實施例中，易位為染色體間的。在一些實施例中，易位為倒置。在一些實施例中，易位為缺失。在一些實施例中，易位為功能性易位融合聚核苷酸(例如功能性R-反應素易位融合聚核苷酸)及/或功能性易位融合多肽(例如功能性R-反應素易位融合多肽)。在一些實施例中，功能性易位融合多肽(例如功能性R-反應素易位融合多肽)活化已知藉由易位基因之一調節之路徑(例如wnt信號傳導路徑)。在一些實施例中，路徑為典型wnt信號傳導路徑。在一些實施例中，路徑為非典型wnt信號傳導路徑。在一些實施例中，確定路徑活化之方法為此項技術中已知且包括如本文中所述之螢光素酶報導體分析。在一些實施例中，方法為以全文引用之方式併入的Seshagiri等人，Nature 488：660-664(2012)及/或 WO 2013/120056中所描述之一或多種方法。
可使用本發明之抗體診斷的示例性病症包括腫瘤、細胞增殖病症、癌症、腸胃癌、胃癌、結腸直腸癌、結腸癌及/或直腸癌。可使用本發明之抗體診斷的示例性病症進一步包括腎上腺癌、膀胱癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌(例如NSCLC)、淋巴癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、皮膚癌(例如黑色素瘤)、胃癌、甲狀腺癌及/或子宮癌。可使用本發明之抗體診斷的示例性病症亦包括肺癌(例如NSCLC)、卵巢癌、乳癌、肝癌或多發性骨髓瘤。
樣品包括(但不限於)初級或培養細胞或細胞株、細胞上清液、細胞溶解物、血小板、血清、血漿、玻璃狀液、淋巴液、滑液、濾泡液、精液、羊膜液、乳汁、全血、血液來源細胞、尿、腦脊液、唾液、痰、淚液、汗、黏液、腫瘤溶解物及組織培養基、組織提取物(諸如均質化組織)、腫瘤組織、細胞提取物及其組合。在一些實施例中，樣品為來自腸胃、胃、食道、結腸、直腸及/或結腸直腸組織之樣品。在一些實施例中，樣品為來自腎上腺、膀胱、腦、乳房、子宮頸、結腸、頭頸部、腎臟、白血病、肝、肺、淋巴、卵巢、胰臟、前列腺、直腸、皮膚、胃、甲狀腺及/或子宮組織之樣品。在一些實施例中，樣品為來自肺、卵巢、乳房、肝或多發性骨髓瘤組織之樣品。
在某些實施例中，提供標記之抗-RSPO抗體。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光及放射性標記)，以及例如經由酶促反應或分子相互作用間接偵測之部分(諸如酶或配位體)。示例性標記包括(但不限於)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I；螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素(fluorescein)及其衍生物；若丹明(rhodamine)及其衍生物；丹醯基(dansyl)；傘酮(umbelliferone)；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美 國專利第4,737,456號)；螢光素(luciferin)；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，與採用過氧化氫來氧化染料前驅物之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)偶合；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基；及其類似物。
在任一方法之一些實施例中，表現升高係指藉由標準技術已知之方法，諸如本文中描述之彼等方法所偵測，與參考樣品、參考細胞、參考組織、對照樣品、對照細胞或對照組織相比，生物標記物(例如蛋白質或核酸(例如基因或mRNA))水準整體增加約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上中之任一者。在某些實施例中，表現升高係指樣品中生物標記物之表現水準/量增加，其中增加為參考樣品、參考細胞、參考組織、對照樣品、對照細胞或對照組織中相應生物標記物之表現水準/量的至少約1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍、50倍、75倍或100倍中之任一者。在一些實施例中，表現升高係指與參考樣品、參考細胞、參考組織、對照樣品、對照細胞、對照組織或固有對照(例如管家基因)相比，整體增加超過約1.5倍、約1.75倍、約2倍、約2.25倍、約2.5倍、約2.75倍、約3.0倍或約3.25倍。
在任一方法之一些實施例中，表現減少係指藉由標準技術已知之方法，諸如本文中描述之彼等方法所偵測，與參考樣品、參考細胞、參考組織、對照樣品、對照細胞或對照組織相比，生物標記物(例如蛋白質或核酸(例如基因或mRNA))水準整體減少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、 98%、99%或99%以上中之任一者。在某些實施例中，表現減少係指樣品中生物標記物之表現水準/量減少，其中減少為參考樣品、參考細胞、參考組織、對照樣品、對照細胞或對照組織中相應生物標記物之表現水準/量的至少約0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6倍、0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍或0.01倍中之任一者。
樣品中各種生物標記物之存在及/或表現水準/量可藉由大量方法分析，其中許多方法為此項技術中已知且熟習此項技術者瞭解，包括(但不限於)免疫組織化學(「IHC」)、西方墨點分析、免疫沈澱、分子結合分析、ELISA、ELIFA、螢光活化細胞分選術(「FACS」)、MassARRAY、蛋白質組研究、基於血液之定量分析(如例如血清ELISA)、生物化學酶活性分析、原位雜交、南方分析、北方分析、全基因組測序、聚合酶鏈反應(「PCR」)(包括定量即時PCR(「qRT-PCR」)及其他擴增類型偵測方法，諸如分支鏈DNA、SISBA、TMA及其類似物)、RNA-Seq、FISH、微陣列分析、基因表現概況分析及/或基因表現之連續分析(「SAGE」)以及可藉由蛋白質、基因及/或組織陣列分析進行的各種分析中之任一者。用於評估基因及基因產物之狀態的典型方案可見於例如Ausubel等人編輯，1995,Current Protocols In Molecular Biology，單元2(北方墨點法)、4(南方墨點法)、15(免疫墨點法)及18(PCR分析)。亦可使用多工免疫分析，諸如可自Rules Based Medicine或Meso Scale Discovery(「MSD」)獲得之免疫分析。
在一些實施例中，生物標記物之存在及/或表現水準/量使用包含以下之方法確定：(a)對樣品(諸如受試者癌症樣品)進行基因表現概況分析、PCR(諸如rtPCR)、RNA-seq、微陣列分析、SAGE、MassARRAY技術或FISH；以及b)確定樣品中生物標記物之存在及/或表現水準/量。在一些實施例中，微陣列方法包含使用微陣列晶片，該微陣列晶片具有可在嚴格條件下與編碼上述基因之核酸分子雜交的 一或多種核酸分子，或具有可結合於由上述基因編碼之一或多種蛋白質的一或多種多肽(諸如肽或抗體)。在一個實施例中，PCR方法為qRT-PCR。在一個實施例中，PCR方法為多工PCR。在一些實施例中，基因表現藉由微陣列量測。在一些實施例中，基因表現藉由qRT-PCR量測。在一些實施例中，表現藉由多工PCR量測。
F. 醫藥調配物
如本文所述之抗-RSPO抗體之醫藥調配物係藉由混合具有所要純度之此類抗體與一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980))而製備成凍乾調配物或水溶液形式。醫藥學上可接受之載劑在所採用之劑量及濃度下一般對接受者無毒性，且包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨；苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如鋅-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文中之示例性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20(HYLENEX®，Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)係描述於美國 專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種額外葡萄糖胺聚糖(諸如硫酸軟骨素酶)組合。
示例性凍乾抗體調配物描述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中所述之調配物，WO2006/044908中之調配物包括組胺酸乙酸鹽緩衝劑。
本文中之調配物亦可含有一種以上為所治療之特定適應症所必需的活性成分，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之補充性活性的活性成分。此等活性成分適合以有效達成預定目的之量組合存在。
活性成分可包覆在例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中；膠態藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中；或巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物的半透性基質，此等基質呈成形物品(例如薄膜或微膠囊)之形式。
欲用於活體內投藥之調配物通常無菌。無菌性可易於例如藉由經由無菌過濾膜過濾來達成。
G. 治療方法及組合物
本文所提供之任一抗-RSPO抗體可用於治療方法中。
在一個態樣中，提供一種用作藥劑之抗-RSPO抗體。在另一態樣中，提供一種用於治療腫瘤、細胞增殖病症及/或癌症的抗-RSPO抗體。在一些實施例中，提供一種抗-RSPO抗體，其用於促進細胞分化，包括癌細胞之終末分化。在某些實施例中，提供一種用於治療方法中之抗-RSPO抗體。在某些實施例中，本發明提供一種抗-RSPO抗 體，其用於治療患有腫瘤、細胞增殖病症及/或癌症之個體之方法中，該方法包含向該個體投與有效量之抗-RSPO抗體。在一些實施例中，癌症為結腸直腸癌。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種例如如下文所述之額外治療劑。在一些實施例中，RSPO為RSPO2。在一些實施例中，RSPO為RSPO3。在一些實施例中，RSPO為RSPO2及RSPO3。在其他實施例中，本發明提供一種抗-RSPO抗體，其用於抑制wnt信號傳導、抑制血管生成、抑制細胞增殖、抑制癌症幹細胞增殖及/或消耗癌症幹細胞。在某些實施例中，本發明提供一種抗-RSPO抗體，其用於在個體中抑制wnt信號傳導、抑制血管生成、抑制細胞增殖、抑制癌症幹細胞增殖及/或消耗癌症幹細胞之方法中，該方法包含向該個體投與有效抑制wnt信號傳導、抑制血管生成、抑制細胞增殖、抑制癌症幹細胞增殖及/或消耗癌症幹細胞的抗-RSPO抗體。根據任何上述實施例之「個體」較佳為人類。在一些實施例中，個體及/或癌症具有一或多種生物標記物。在一些實施例中，一或多種生物標記物包含RSPO易位。在一些實施例中，RSPO易位包含RSPO2及/或RSPO3易位。在一些實施例中，個體及/或癌症具有增加之一或多種生物標記物表現。在一些實施例中，一或多種生物標記物包含RSPO，例如RSPO2及/或RSPO3。 在一些實施例中，一或多種生物標記物包含幹細胞生物標記物。在一些實施例中，幹細胞生物標記物包含Myc、Axin2、LGR5、TERT、BIRC5及/或Ascl2。在一些實施例中，個體及/或癌症具有減少之一或多種分化生物標記物表現。在一些實施例中，分化生物標記物包含CEACAM7、SLC26A3、CA1、SYTl5、CA4、TFF1及/或KRT20。在一些實施例中，用抗-RSPO抗體治療減少例如Myc、Axin2、LGR5、TERT、BIRC5及/或Ascl2之一或多種幹細胞生物標記物之表現。在一些實施例中，用抗-RSPO抗體治療增加例如CEACAM7、SLC26A3、 CA1、SYTl5、CA4、TFF1及/或KRT20之一或多種分化生物標記物之表現。在一些實施例中，癌症為腎上腺癌、膀胱癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌(例如NSCLC)、淋巴癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、皮膚癌(例如黑色素瘤)、胃癌、甲狀腺癌及/或子宮癌。在一些實施例中，癌症為肺癌(例如NSCLC)、卵巢癌、乳癌、肝癌或多發性骨髓瘤。在一些實施例中，癌症為結腸直腸癌。
在另一態樣中，本發明提供抗-RSPO抗體之用途，其係用於製造或製備藥劑。在一個實施例中，藥劑係用於治療腫瘤、細胞增殖病症及/或癌症。在另一實施例中，藥劑係用於治療腫瘤、細胞增殖病症及/或癌症之方法中，其包含向患有腫瘤、細胞增殖病症及/或癌症之個體投與有效量之藥劑。在一些實施例中，癌症為結腸直腸癌。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種例如如下文所述之額外治療劑。在另一實施例中，藥劑係用於抑制wnt信號傳導、抑制血管生成、抑制細胞增殖、抑制癌症幹細胞增殖及/或消耗癌症幹細胞。在另一實施例中，藥劑係用於在個體中抑制wnt信號傳導、抑制血管生成、抑制細胞增殖、抑制癌症幹細胞增殖及/或消耗癌症幹細胞之方法中，該方法包含向該個體投與有效抑制wnt信號傳導、抑制血管生成、抑制細胞增殖、抑制癌症幹細胞增殖及/或消耗癌症幹細胞之量的藥劑。根據上述任何實施例之「個體」可為人類。在一些實施例中，個體及/或癌症具有一或多種生物標記物。在一些實施例中，一或多種生物標記物包含RSPO易位。在一些實施例中，RSPO易位包含RSPO2及/或RSPO3易位。在一些實施例中，個體及/或癌症具有增加之一或多種生物標記物表現。在一些實施例中，一或多種生物標記物包含RSPO，例如RSPO2及/或RSPO3。在一些實施例中，一或多種生物標記物包含幹細胞生物標記物。在一 些實施例中，幹細胞生物標記物包含Myc、Axin2、LGR5、TERT、BIRC5及/或Ascl2。在一些實施例中，個體及/或癌症具有減少之一或多種分化生物標記物表現。在一些實施例中，分化生物標記物包含CEACAM7、SLC26A3、CA1、SYTl5、CA4、TFF1及/或KRT20。在一些實施例中，用抗-RSPO抗體治療減少例如Myc、Axin2、LGR5、TERT、BIRC5及/或Ascl2之一或多種幹細胞生物標記物之表現。在一些實施例中，用抗-RSPO抗體治療增加例如CEACAM7、SLC26A3、CA1、SYTl5、CA4、TFF1及/或KRT20之一或多種分化生物標記物之表現。在一些實施例中，癌症為腎上腺癌、膀胱癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌(例如NSCLC)、淋巴癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、皮膚癌(例如黑色素瘤)、胃癌、甲狀腺癌及/或子宮癌。在一些實施例中，癌症為肺癌(例如NSCLC)、卵巢癌、乳癌、肝癌或多發性骨髓瘤。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療腫瘤、細胞增殖病症及/或癌症之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有此類腫瘤、細胞增殖病症及/或癌症之個體投與有效量之抗-RSPO抗體。在一些實施例中，癌症為結腸直腸癌。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種如下文所述之額外治療劑。根據上述任何實施例之「個體」可為人類。在一些實施例中，個體及/或癌症具有一或多種生物標記物。在一些實施例中，一或多種生物標記物包含RSPO易位。在一些實施例中，RSPO易位包含RSPO2及/或RSPO3易位。在一些實施例中，個體及/或癌症具有增加之一或多種生物標記物表現。在一些實施例中，一或多種生物標記物包含RSPO，例如RSPO2及/或RSPO3。在一些實施例中，一或多種生物標記物包含幹細胞生物標記物。在一些實施例中，幹細胞生物標記物包含Myc、Axin2、LGR5、TERT、BIRC5及/或Ascl2。在一些實施例中，個體及/ 或癌症具有減少之一或多種分化生物標記物表現。在一些實施例中，分化生物標記物包含CEACAM7、SLC26A3、CA1、SYTl5、CA4、TFF1及/或KRT20。在一些實施例中，用抗-RSPO抗體治療減少例如Myc、Axin2、LGR5、TERT、BIRC5及/或Ascl2之一或多種幹細胞生物標記物之表現。在一些實施例中，用抗-RSPO抗體治療增加例如CEACAM7、SLC26A3、CA1、SYTl5、CA4、TFF1及/或KRT20之一或多種分化生物標記物之表現。在一些實施例中，癌症為腎上腺癌、膀胱癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌(例如NSCLC)、淋巴癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、皮膚癌(例如黑色素瘤)、胃癌、甲狀腺癌及/或子宮癌。在一些實施例中，癌症為肺癌(例如NSCLC)、卵巢癌、乳癌、肝癌或多發性骨髓瘤。
在另一態樣中，本發明提供一種在個體中抑制wnt信號傳導、抑制血管生成、抑制細胞增殖、抑制癌症幹細胞增殖及/或消耗癌症幹細胞之方法。在一個實施例中，該方法包含向該個體投與有效抑制wnt信號傳導、抑制血管生成、抑制細胞增殖、抑制癌症幹細胞增殖及/或消耗癌症幹細胞之量的抗-RSPO抗體。在一個實施例中，「個體」為人類。在一些實施例中，個體及/或癌症具有一或多種生物標記物。在一些實施例中，一或多種生物標記物包含RSPO易位。在一些實施例中，RSPO易位包含RSPO2及/或RSPO3易位。在一些實施例中，個體及/或癌症具有增加之一或多種生物標記物表現。在一些實施例中，一或多種生物標記物包含RSPO，例如RSPO2及/或RSPO3。 在一些實施例中，一或多種生物標記物包含幹細胞生物標記物。在一些實施例中，幹細胞生物標記物包含Myc、Axin2、LGR5、TERT、BIRC5及/或Ascl2。在一些實施例中，個體及/或癌症具有減少之一或多種分化生物標記物表現。在一些實施例中，分化生物標記物包含 CEACAM7、SLC26A3、CA1、SYTl5、CA4、TFF1及/或KRT20。在一些實施例中，用抗-RSPO抗體治療減少例如Myc、Axin2、LGR5、TERT、BIRC5及/或Ascl2之一或多種幹細胞生物標記物之表現。在一些實施例中，用抗-RSPO抗體治療增加例如CEACAM7、SLC26A3、CA1、SYTl5、CA4、TFF1及/或KRT20之一或多種分化生物標記物之表現。在一些實施例中，癌症為腎上腺癌、膀胱癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌(例如NSCLC)、淋巴癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、皮膚癌(例如黑色素瘤)、胃癌、甲狀腺癌及/或子宮癌。在一些實施例中，癌症為肺癌(例如NSCLC)、卵巢癌、乳癌、肝癌或多發性骨髓瘤。在一些實施例中，癌症為結腸直腸癌。
在另一態樣中，本發明提供包含本文所提供之任何抗-RSPO抗體之醫藥調配物，其例如用於任何上述治療方法中。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文所提供之任何抗-RSPO抗體及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文所提供之任何抗-RSPO抗體及至少一種例如如下所述之額外治療劑。在一些實施例中，RSPO為RSPO2。在一些實施例中，RSPO為RSPO3。在一些實施例中，RSPO為RSPO2及RSPO3。在一些實施例中，個體及/或癌症具有增加之一或多種生物標記物表現。在一些實施例中，一或多種生物標記物包含RSPO，例如RSPO2及/或RSPO3。在一些實施例中，一或多種生物標記物包含幹細胞生物標記物。在一些實施例中，幹細胞生物標記物包含Myc、Axin2、LGR5、TERT、BIRC5及/或Ascl2。在一些實施例中，個體及/或癌症具有減少之一或多種分化生物標記物表現。在一些實施例中，分化生物標記物包含CEACAM7、SLC26A3、CA1、SYTl5、CA4、TFF1及/或KRT20。在一些實施例中，用抗-RSPO抗體治療減少例如Myc、Axin2、LGR5、TERT、BIRC5及/或 Ascl2之一或多種幹細胞生物標記物之表現。在一些實施例中，用抗-RSPO抗體治療增加例如CEACAM7、SLC26A3、CA1、SYTl5、CA4、TFF1及/或KRT20之一或多種分化生物標記物之表現。在一些實施例中，癌症為腎上腺癌、膀胱癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、頭頸癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌(例如NSCLC)、淋巴癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、皮膚癌(例如黑色素瘤)、胃癌、甲狀腺癌及/或子宮癌。在一些實施例中，癌症為肺癌(例如NSCLC)、卵巢癌、乳癌、肝癌或多發性骨髓瘤。在一些實施例中，癌症為結腸直腸癌。
本發明之抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言，本發明之抗體可與至少一種額外治療劑共同投與。在某些實施例中，額外治療劑為細胞毒性劑、化學治療劑、細胞生長抑制劑、抗激素劑及/或EGFR抑制劑。
上述此類組合療法涵蓋組合投藥(其中兩種或兩種以上治療劑包括在同一或分開之調配物中)及分開投藥，在此情況下，本發明抗體之投與可在投與額外治療劑之前、同時及/或之後進行。在一個實施例中，抗-RSPO抗體之投與及額外治療劑之投與彼此相隔約一個月；或相隔約一週、兩週或三週；或相隔約一天、兩天、三天、四天、五天或六天進行。本發明之抗體亦可與放射療法組合使用。
本發明之抗體(及任何額外治療劑)可藉由任何適合方式投與，該等方式包括非經腸、肺內及鼻內投藥，且必要時對於局部治療，包括病灶內投藥。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。可藉由任何適當途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)給藥，在某種程度上視投藥之短期還是長期性而定。本文涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或經各個時間點多次投藥、快速投藥(bolus administration)及脈衝式輸注。
以與良好醫療實踐一致之方式調配、給藥及投與本發明之抗體。在此背景下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑之傳遞位點、投藥方法、投藥時程及從業醫生已知之其他因素。抗體無需但視情況可與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量視存在於調配物中之抗體之量、病症或治療之類型及上文所論述之其他因素而定。此等藥劑通常以與本文中所述相同之劑量及投藥途徑使用，或以本文中所述劑量之約1%至99%使用，或以憑經驗/臨床上確定為適當的任意劑量及任何途徑使用。
為預防或治療疾病，本發明抗體之適當劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視待治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重程度及病程、投與抗體以供達成預防還是治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。抗體適於一次性或經一系列治療投與患者。無論例如藉由一或多次分開投藥，還是藉由連續輸注，視疾病類型及嚴重程度而定，抗體投與患者的初始候選劑量可為約1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)。一種典型日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或更高劑量之範圍內，此視上文所提及之因素而定。對於歷經數天或更長時間的重複投藥，治療視病狀而定通常可持續至疾病症狀之所要抑制發生為止。 抗體之一種示例性劑量在約0.05mg/kg至約10mg/kg之範圍內。因此，可將約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg之一或多個劑量(或其任何組合)投與患者。此類劑量可間歇地投與，例如隔週或隔三週(例如，以使得患者接受約二至約二十或例如約六劑抗體)。可投與最初較高負荷劑量，接著可投與一或多個較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程易於藉由習知技術及分析監控。
應瞭解，替代或除抗-RSPO抗體之外，可使用本發明之免疫結合 物進行上述任何調配物或治療方法。
H. 製品
在本發明之另一態樣中，提供一種含有可用於治療、預防及/或診斷上文所述病症之物質的製品。該製品包含容器及在該容器上或該容器隨附之標籤或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納單獨組合物或與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體。標記或藥品說明書指示該組合物用於治療所選病狀。此外，該製品可包含(a)內含組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體；及(b)內含組合物之第二容器，其中該組合物包含另一種細胞毒性劑或治療劑。本發明之實施例中的製品可另外包含藥品說明書，該藥品說明書指示組合物可用於治療特定病狀。或者或另外，該製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液(諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林葛爾氏溶液(Ringer's solution)及葡萄糖溶液)。其可進一步包括就商業及使用者角度而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
應瞭解代替或除抗-RSPO抗體之外，任一上述製品可包括本發明之免疫結合物。
III. 實例
以下為本發明之方法及組合物之實例。應瞭解，考慮到上文提供之一般說明，可實踐各種其他實施例。
方法
選殖及純化 ：FLAG標記之RNF43藉由抗FLAG親和層析法 (Genentech)、接著尺寸排阻層析法(Superdex 75,GE Healthcare)來純化。FLAG標記之R-反應素(hRSPO2、hRSPO2 L186、cynoRSPO2、hRSPO3及cynoRSPO3FLAG)藉由抗-FLAG親和層析法、接著陽離子交換層析法(Mono S,GE Healthcare)來純化。人類IgG1 Fc標記之LGR細胞外結構域藉由親和層析法(MabSelect SuRe,GE Healthcare)、接著尺寸排阻層析法(Superdex 200,GE Healthcare)來純化。
WNT報導體分析 ：在96孔盤中，每孔4,500個293T細胞塗鋪在90μL補充有2.5%胎牛血清之DMEM中。在培養16-20小時後，在10μL使用Fugene 6(Promega,Madison,WI)之轉染混合物中用0.04μg Topbrite 25及0.02μg SV40海腎DNA將細胞共轉染。又培養16-20小時之後，在37℃下細胞用25μL 5X溶液刺激6小時。對於上清液篩選，將細胞用補充有50ng/ml rmWNT3a(R&D Systems,Minneapolis,MN)及250pM rhRSPO2或rhRSPO3(R&D Systems,Minneapolis,MN)之融合瘤上清液刺激。對於使用選殖抗體之分析，添加補充有10%胎牛血清、50ng/ml rmWNT3a、250pM或5X計算EC50 rRSPO(如所指示)及遞增濃度之抗體。對於測試條件培養基之分析，藉由使用Fugene 6，根據製造商之說明書(Promega,Madison,WI)將293T用指示基因轉染來製備培養基。轉染3天後收集條件培養基，補充50ng/ml rmWNT3a+/-抗-RSPO抗體且添加至報導細胞。刺激6小時後，使用Promega Dual-Glo系統(Promega,Madison,WI)偵測螢光素酶活性。數據分析為螢火蟲/海腎(RLU WNT報導體)之比率或在不存在抗體下之校正值(有抗體之RLU/無抗體之RLU)。藉由用遞增濃度之抗體刺激具有EC50 rRSPO之細胞來量測IC50。使用GraphPad Prism，將Log變換數據用四參數劑量反應等式擬合。
表現RSPO之細胞小球之產生 ：pGCIG為基於HIV之自我不活化豆狀病毒載體，其係藉由用含有CMVie啟動子、多選殖位點(MCS)、 內部核糖體入口位點(IRES)及增強綠色螢光蛋白(eGFP)之片段替換pGIPZ(Open Biosystems)之ZeoR-CMVie-tGFP-IRES-PuroR-shRNA-WRE內含物來產生。人類R-反應素1-4開放閱讀框架(ORF)在C端藉由PCR用HA抗原決定基(YPYDVPDYA)標記，且插入pGCIG之MCS中。 HEK-293細胞於含10%熱不活化FBS之DMEM高葡萄糖中15×106個細胞/盤塗鋪在15cm培養皿上24小時，接著轉染。藉由使用6μg pGCIG-hRSPO、12μg封裝載體△8.9(Zufferey等人，1997)、3μg包膜載體pVSV-G(Clontech)及轉染試劑Genejuice(Novagen)進行共轉染，來製備慢病毒上清液。在轉染12小時之後替換培養基，且24小時後收集病毒上清液，經由0.45μm PES過濾器(Nalgene)過濾且儲存在4℃下，直至進一步加工。HEK-293細胞於含10%熱不活化FBS之DMEM高葡萄糖中1×106個細胞/盤塗鋪在10cm培養皿上。使細胞黏附12小時，此後用10ml病毒上清液替換培養基。病毒上清液保持在細胞上60小時，此後收穫細胞且藉由FACS分析螢光蛋白表現。閘設定成每個病毒構築體分選出2×105個低、中等及高eGFP表現細胞。細胞株擴展且使用HIV-1 p24抗原ELISA 2.0套組(ZeptoMetrix Corporation)測試複製勝任型病毒(RCV)之產生的缺乏情況。人類R-反應素之表現及分泌藉由濃縮細胞培養物上清液及具有eGFP表現水準之相關孔的抗-HA西方墨點法來確定。
IHC反應性篩選 ：福馬林固定之石蠟包埋的細胞小球以4μm切片。載玻片用基於檸檬酸鹽之pH 6.0緩衝液(Dako目錄號S1699,Carpinteria,CA)在99℃下預處理20分鐘。在10%血清阻斷之後，以1：250使用抗-RSPO血清且操作融合瘤上清液。1：250下之免疫前血清或10μg/ml總濃度之原生小鼠IgG1、2a及2b用作陰性對照。生物素標記之驢抗小鼠二級抗體(Jackson Immuno目錄號715-065-151,West Grove,PA)以5μg/ml使用。VECTASTAIN Elite ABC套組 (Standard*)(Vector Labs目錄號PK-6100)用於偵測且用Pierce Metal Enhanced DAB(Thermo目錄號34065,Rockford,IL)目測信號。
抗原決定基分組 ：抗-RSPO抗體之抗原決定基分組使用Octet RED384儀器(ForteBio)進行。重組RSPO(R&D Systems,Minneapolis,MN)經生物素標記且在10μg/ml下捕捉至抗生蛋白鏈菌素生物感測器上，歷時120秒。藉由添加10μg/ml實現第一抗體結合至飽和，歷時600秒。相同生物感測器浸漬至5μg/ml競爭抗體中且量測結合300秒。在飽和量之第一抗體存在下第二抗體無法結合指示兩種抗體處於相同抗原決定基組中。
親和性量測 ：藉由表面電漿子共振(SPR)使用BIAcoreTM-2000儀器量測抗-RSPO抗體之結合親和力。CM5生物感測器晶片用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)試劑根據供應商(GE Healthcare Biosciences,Piscataway,NJ)之說明書活化。RSPO抗原固定至生物感測器晶片上以實現約250反應單元(RU)，接著用1M乙醇胺阻斷。
對於動力學量測，在25℃下以30μl/min之流動速率，注射抗-RSPO Fab於HBS-P緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005%界面活性劑P20)中之兩倍連續稀釋液。締合速率(kon)與解離速率(koff)使用簡單一比一朗繆爾結合模型(BIAcore Evaluation Software 3.2版)計算。以k off/ k on之比率來計算平衡解離常數(KD)。
競爭性結合ELISA ：為量測抗-RSPO抗體阻斷LGR4及LGR5 ECD與RSPO結合之活性，在4℃下將MaxiSorp 384孔微孔盤(Thermo Scientific Nunc,Roskilde,Denmark)用50mM碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)中25微升/孔0.5μg/ml hRSPO2或hRSPO3(Genentech)塗佈隔夜。盤用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(pH 7.4)中80微升/孔0.5%牛血清白蛋白、15ppm Proclin 300阻斷1小時。將含有0.1μg/ml LGR4-Fc或0.015μg/ml LGR5-Fc於分析緩衝液(含0.5% BSA、0.05%聚山梨醇酯20、15ppm Proclin 300之PBS)中的連續稀釋之抗-RSPO抗體(3倍連續稀釋，0.078-10ng/ml，加緩衝液空白)以25微升/孔添加至盤中。在培育2小時之後，使用過氧化酶標記之山羊F(ab')2抗人類Fc(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)偵測結合於盤之LGR4-Fc及LGR5-Fc。在培育1小時之後，將受質3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(Moss Inc.,Pasadena,Maryland)添加至盤中且藉由添加1M磷酸停止反應。在各步驟之間將盤用含有0.05% tween 20之PBS pH 7.4洗滌且在塗佈步驟之後的所有培育步驟均在定軌震盪器上在室溫下進行。在multiskan Ascent讀取器(Thermo Scientific,Hudson,NH)上在450nm下讀取吸光度。
類似地，使用0.5ng/ml生物素標記之RNF43-Flag(在RSPO2塗佈之盤上)或20ng/ml生物素標記之RNF43-Flag(在RSPO3塗佈之盤上)量測抗-RSPO抗體阻斷RNF43與RSPO結合之活性。結合之生物素標記之RNF43-Flag使用過氧化酶標記之抗生蛋白鏈菌素(GE Healthcare,Piscataway,NJ)，接著如上文所描述之受質來偵測。
抗-RSPO3抗體之人類化： 如下所述將單株抗體5D6人類化。殘基編號係根據Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。
在5D6人類化期間構築之變異體呈Fab形式來評估。將來自鼠類5D6之VL及VH結構域與人類VlκI(VLKI)及人類VH子群IV(VH4)共同序列比對。來自鼠類抗體之高變區經工程改造至VLKI及VHI接受者構架中。特定言之，自mu5D6 VL結構域，位置24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)移植至VLKI中，且自mu5D6 VH結構域，位置26-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)移植至VHI中。所有來自mu5D6之VL 及VH游標位置亦分別移植至VLK1及VH4中。此移植物稱作v1。
此部分中抗體之結合親和力藉由BIAcoreTM T200格式測定。簡言之，根據供應商之說明書，BIAcoreTM研究級CM5晶片用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)試劑活化。huRSPO3固定以實現各流動池中約50反應單元(RU)。未反應之偶合基團用1M乙醇胺阻斷。對於動力學量測，在25℃下，以30μl/min之流動速率，注射變異抗體於HBS-P緩衝液(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、0.005%界面活性劑P20)中之四倍連續稀釋液。締合速率(kon)與解離速率(koff)使用1：1朗繆爾結合模型(BIAcoreTM T200 Evaluation Software2.0版)計算。以koff/kon之比率來計算平衡解離常數(Kd)。
結晶學RSPO3(M33-E210)純化 ：將含有N端His-MBP標籤之RSPO3(M33-E210)與未標記之EndoH一起在生長在用基夫鹼(Kifunensine)處理之培養基中之SF9細胞中共表現。收穫細胞上清液且通過10mL鎳-NTA瓊脂糖管柱，該管柱已在洗滌緩衝液(25mM Tris-HCl pH 7.5、500mM NaCl、20mM咪唑、5%甘油)中預平衡。隨後管柱用10管柱體積之洗滌緩衝液洗滌。使用5管柱體積溶離緩衝液(25mM Tris-HCl pH 7.5、500mM NaCl、300mM咪唑、10%甘油)自管柱溶離蛋白質且濃縮至低於30mL。添加TEV蛋白酶且在4℃下樣品針對透析緩衝液(25mM Tris-HCl pH 7.5、500mM NaCl、10mM咪唑、10%甘油)透析隔夜。透析後，樣品通過5mL HisTrap管柱，該管柱已經洗滌緩衝液預平衡。隨後樣品濃縮至低於2mL且施加至Superdex 75 16/60管柱，該管柱已經凝膠過濾緩衝液(25mM Tris-HCl pH 7.5、300mM NaCl、5%甘油)預平衡。將含有RSPO3(M33-E210)之溶離份彙集且濃縮。等分試樣儲存在-80℃下。
結晶學Fab純化 ：Fab 5D6及26E11在大腸桿菌細胞中表現。將細 胞糊狀物再懸浮於溶解緩衝液(補充有25mM EDTA及1mM PMSF之PBS)中且藉由三次通過微流化床使細胞溶解。隨後溶解物在12,000rpm下旋轉一小時且清除之溶解物經由0.8μm過濾器過濾。將清除之溶解物直接施加至25mL蛋白質G管柱，該管柱經補充有25mM EDTA之PBS預平衡。管柱用10管柱體積之PBS洗滌且蛋白質用0.58%乙酸溶離。隨後溶離液負載至HiTrap SP HP管柱上，該管柱已經緩衝液A(20mM MES pH 5.5)預平衡。管柱用10管柱體積之緩衝液A洗滌且蛋白質經20管柱體積緩衝液A至緩衝液B之線性梯度(20mM MES pH 5.5、500mM NaCl)溶離。將含有Fab之溶離份彙集且濃縮至低於2mL且施加至Superdex 75 26/60管柱，該管柱已經凝膠過濾緩衝液預平衡。將含有Fab之溶離份彙集且濃縮。等分試樣儲存在-80℃下。
結晶學RSPO3/Fab複合物純化 ：為形成複合物，將1.25倍莫耳過量之RSPO3(M33-E210)添加至含有凝膠過濾緩衝液之800μL結合反應物中之150nmol任一Fab中。結合反應物在冰上培育一小時。隨後反應物在4℃下在13,000rpm下旋轉且負載至Superdex 75 16/60管柱上，該管柱已經凝膠過濾緩衝液預平衡。將含有複合物之溶離份彙集且濃縮至20mg/mL。等分試樣儲存在-80℃下。
結晶學 ：對於RSPO3(M33-E210)/Fab 5D6，使用Labcyte Echo液體處置器設置若干稀少基質晶體篩網，使用100nL沉滴。篩網儲存在18℃下。晶體在含有100mM MIB pH 9及25% PEG 1500作為母液之液滴中獲得。冷凍保護溶液藉由將1μL 70%甘油與1.8μL儲槽溶液混合來製得。收穫單一晶體且浸沒在冷凍保護溶液中10秒，且在液氮中快速冷凍。
對於RSPO3(M33-E210)/Fab 26E11，使用Labcyte Echo液體處置器設置若干稀少基質晶體篩網，使用100nL沉滴。篩網儲存在18℃下。晶體在含有200mM甲酸鈉及20%(w/v)PEG 3,350作為母液之液 滴中獲得。冷凍保護溶液藉由將1μL 70%乙二醇與1.8μL儲槽溶液混合來製得。收穫單一晶體且浸沒在冷凍保護溶液中10秒，且在液氮中快速冷凍。
兩種複合物在各種類似條件下結晶。幾乎所有晶體均在基於PEG之條件下增長，其中最常見為20-25% PEG 3,350。其他成功沈澱劑包括20% PEG 6,000、20-25% PEG 4,000及25% PEG 1,500。pH在3.5-9範圍內變化，其中見到大部分晶體係在7與8之間增長。在200mM濃度下各種鹽幫助晶體增長。
晶體結構確定及精修： 在同步加速器下收集兩種RSPO3/Fab複合物之繞射數據。使用XDS及SCALA，將數據索引化、整合且按比例調整。RSPO3/5D6及RSPO3/26E11之晶體結構藉由使用Fab結構作為搜索模型進行分子置換來解決。初始分子置換溶液之各相藉由使用PHENIX進行溶劑扁平化及密度改質來改良。使用迭代數輪之精修及重建構建RSPO3結構。RSPO3/5D6及RSPO/26E11之結晶學統計數據如下。
最高解析度殼層之統計數據示於圓括號中。
活體內功效實驗 ：RSPO3融合陽性患者來源腫瘤在Balbc/裸鼠中皮下生長。一旦腫瘤達到約200mm3之尺寸，則小鼠經30mg/kg對照抗體或抗-RSPO3抗體(5D6)處理，一週兩次，持續3-4週。對於抗-RSPO3抗體(5D6)與伊立替康組合使用之實驗，在第0天或在第0天及第3天，抗-RSPO3抗體如上文所描述給藥，且伊立替康以100mg/kg給藥。
對於連續移植研究，植入RSPO3融合陽性患者來源腫瘤之小鼠用對照抗體或抗-RSPO3抗體如上文所描述處理。一旦生長曲線開始分開，則移除腫瘤片段且移植至原生Balbc/裸鼠中。移植腫瘤片段之小鼠隨後用對照或抗-RSPO3抗體如上文所描述處理。
結果 阻斷功能及IHC反應性抗-RSPO抗體之產生
為產生抗-RSPO抗體，小鼠及倉鼠經重組人類RSPO2及/或人類RSPO3免疫接種且產生融合瘤細胞株。首先針對結合於hRSPO1、hRSPO2、hRSPO3及hRSPO4，藉由ELISA篩選來自此等細胞之上清液。隨後對展示hRSPO2及/或hRSPO3結合之上清液測試阻斷WNT報導體活性之hRSPO2及hRSPO3刺激的能力。隨後候選物選殖、表現且純化。如圖1中所示，經純化純系之子集有力地抑制rhRSPO2刺激之WNT報導體活性(圖1A)及/或rhRSPO3刺激之WNT報導體活性(圖1B)。
此外，篩選上清液以鑑別可用作IHC試劑之抗-RSPO抗體。自穩定表現高、中等或低水準hRSPO2或hRSPO3之293細胞製備福馬林固定之石蠟包埋之細胞小球。此外，自293細胞及穩定表現hRSPO1或 hRSPO4之293細胞製備細胞小球。對融合瘤上清液及抗體純系測試在製備之細胞小球上的IHC反應性。如圖2中所示，藉由IHC反應性，抗體49G5識別高、中等及低水準hRSPO2表現(D-F)，而不識別hRSPO3(A-C)、hRSPO1(G)、hRSPO4(H)或非-hRSPO1-4(I)。所有測試抗體之結果概述展示在以下表4中。抗體4H1、4D4、5C2、5D6、5E11、21C2特異性識別hRSPO3。抗體1A1、36D2、49G5特異性識別hRSPO2。抗體6E9及26E11識別hRSPO2及hRSPO3。
-、+、++、+++指示相對強度，-為不顯著染色，且+++為最高水準染色；百分比指示細胞染色之相對百分比
抗-RSPO抗體之抗原決定基分組
為進一步表徵抗-RSPO抗體，抗體分入之獨特抗原決定基組之數目使用OCTET RED分析確定。首先抗體進行親和性分級。針對hRSPO2或hRSPO3結合之生物感測器，具有最高親和性之抗體結合至飽和。隨後評估第二抗體之結合。測試之抗-RSPO2抗體分成藉由與1A1或11F11競爭之能力界定的兩個獨特抗原決定基組。第一獨特抗原決定基組包括1A1、49G5及36D2，而第二獨特抗原決定基組包括11F11。測試之抗-RSPO3抗體分成藉由與26E11、4H1或21C2競爭之能力界定的三個獨特抗原決定基組。第一獨特抗原決定基組包括26E11、5D6、5E11及6E9，第二獨特抗原決定基組包括4H1，且第三獨特抗原決定基組包括5C2及21C2。
抗-RSPO抗體之結合特異性及親和力
為進一步表徵抗-RSPO抗體，針對小鼠RSPO2(R&D Systems)及獼猴RSPO2(Genentech)測試其功能阻斷活性。抗體純系之子集可阻斷WNT報導細胞之hRSPO2、cynoRSPO2及mRSPO2刺激(圖3A-C)。在人類群體中鑑別RSPO2中位置186之多形現象。為評估抗-RSPO抗體對此多形現象之功能阻斷活性及在此患者群體中之潛在有效性，首先純化hRSPO2 L186P蛋白質，接著用於刺激WNT報導細胞。抗-RSPO抗體之子集可阻斷功能hRSPO2 L186P(圖3D)。
此外，測試抗-RSPO抗體阻斷小鼠RSPO3(R&D Systems)及獼猴RSPO3(Genentech)之功能的能力。抗體之子集可抑制hRSPO3、cynoRSPO3、mRSPO3之WNT報導細胞刺激(圖4A-C)。另外測試抗-RSPO抗體抑制近來在結腸直腸腫瘤中鑑別之RSPO3融合基因(Seshagiri等人，Nature 488：660-664(2012))之能力。條件培養基藉由轉染編碼所鑑別之兩種PTPRK-RSPO3融合基因(SEQ ID NO：176及178)之構築體來製備。含有RSPO3或RSPO3融合基因之條件培養基可 刺激WNT報導體活性。抗-RSPO3抗體可抑制報導細胞之RSPO3融合基因刺激(圖4D)。此結果指示抗-RSPO3抗體可抑制RPSO易位介導之wnt信號傳導。
表面電漿子共振用於證實對人類、小鼠及獼猴RSPO之結合特異性及親和力。來自抗體純系之Fab片段消化、純化，接著使用BIAcoreTM-2000儀器分析與重組蛋白質之結合。抗體分成三組：對RSPO2具特異性之抗體、對RSPO3具特異性之抗體及具有一定程度交叉反應性之抗體(圖5)。結合親和力在低於奈莫耳至低奈莫耳範圍(0.073-80nM範圍)。
抗-RSPO抗體之結合特徵
先前已展示，RSPO蛋白質可結合於兩種不同類別之跨膜蛋白質：E3-接合酶(RNF43及ZNRF3)及LGR(LGR4及LGR5)(Hao等人，Nature 485(7397)：195-200(2012))。為測試抗-RSPO抗體是否可抑制與此兩種類別蛋白質之結合，發展一種競爭性結合ELISA分析。當測試抑制LGR4或LGR5與hRSPO2及hRSPO3結合之能力時抗-RSPO抗體分成三個類別：可抑制之抗體、不抑制之抗體及促進LGR4與LGR5之相互作用的抗體(圖6A-B且數據未圖示)。同樣，抗-RSPO抗體組之子集抑制RNF43與hRSPO2或hRSPO3之結合(圖7A-B)。抗-RSPO結果之概述展示在下文中(表5)。
抗-RSPO抗體之人類化
人類化5D6v1(稱為hu5D6v1)抗體之結合親和力與嵌合5D6相比。將hu5D6v1之鼠類游標位置轉變回人類殘基以評估鼠類游標位置對與hRSPO3結合之貢獻。四種額外輕鏈(L1：v1+Y36(稱為v2.1)、v1+L46(稱為v2.2)、v1+T69(稱為v2.3)、v1+F71(稱為v2.4))及四種額外重鏈(v1+V71(稱為v2.8)、v1+R94(稱為v2.10)、v1+W47+I48+F78(稱為v3.2)、v1+W47+I48+v67+F78(稱為v3.3))。基於上述變異抗體 之結合親和力評估(數據未圖示)，輕鏈上之F36及T46為關鍵小鼠游標殘基，且重鏈上之V71及R94確定為關鍵小鼠游標殘基。嵌合5D6以3.3E-11M之KD結合，而v1+T69(LC)+W47+I48+V67+F78(HC)(稱為hu5D6v4.1)、v1+T69(LC)+W47+I48+F78(HC)(稱為hu5D6v4.3)分別以6.3E-11M及7.0E-11MKD之KD結合。
如上文所描述，測試hu5D6v4.1及嵌合5D6結合獼猴及小鼠RSPO3之能力，不同之處在於結合分析中獼猴或鼠類RSPO3替換huRSPO3。人類化抗體之結合特性展示在下文表5中。
在熱應力(40℃，pH 5.5，2週)及2,2'-偶氮二(2-甲脒基丙烷)鹽酸鹽(AAPH)分析下測試人類化抗體hu5D6v4.1。隨後樣品經受熱壓力以模擬在產物存放期內之穩定性。樣品經緩衝液更換成20mM組胺酸乙酸酯、240mM蔗糖pH 5.5且稀釋至1mg/mL之濃度。一毫升樣品在40℃下經受壓力2週，且第二個樣品儲存在-70℃下作為對照。隨後兩個樣品使用胰蛋白酶消化以產生肽，可使用液相層析法(LC)-質譜分析(MS)分析進行分析。對於樣品中之各肽，在MS中，自LC以及高解析度精確質量及肽離子碎片資訊(胺基酸序列資訊)獲得滯留時間。在+-10ppm之窗口下，自資料集，針對所關注之肽(天然及經修飾之肽離子)採集提取離子層析圖(XIC)且整合峰以確定面積。針對各樣品，藉由將(經修飾之肽之面積)除以(經修飾之肽之面積加原生肽之面積)乘以100來計算修飾之相對百分比。
如藉由熱應力測試確定，hu5D6v4.1在CDR-H3中具有W100b，其易於氧化(色胺酸氧化增加11.5%，自對照中24.1%增加至AAPH應力之 後35.6%)。構築F100b(稱為hu5D6v5.1)及W100bH(稱為hu5D6v5.2)變異體以減少潛在氧化。
藉由結晶學定位抗原決定基
為進一步表徵抗-RSPO抗體，如上文所描述製備RSPO3/Fab複合物(5D6及26E11)之晶體且確定晶體結構。參見圖8。表6含有5D6及RSPO3(F鏈)之重鏈(HC)與輕鏈(LC)之間的觸點清單。表6之截止值為4埃。表7含有26E11及RSPO3(F鏈)之重鏈(HC)與輕鏈(LC)之間的觸點清單。表7之截止值為4埃。5D6與26E11之大多數觸點具有RSPO3之弗林1結構域。
活體內功效
在結腸直腸癌PTPRK-RSPO融合患者來源腫瘤模型中測試抗-RSPO3抗體之功效。在PTPRK-RSPO融合患者來源腫瘤模型及/或NSCLC組織中，與用抗-RSPO3抗體處理之前的表現水準相比，抗-RSPO3抗體(5D6)顯著減少以下腸幹細胞標記物之標記物的基因表現：Myc、Axin2、LGR5、TERT、BIRC5及/或Ascl2，而分化標記物之基因表現增加，例如CEACAM7、SLC26A3、CA1、SYTl5、CA4、TFF1及KRT20(數據未圖示)。雖然不希望受任何特定理論束縛，但此等結果表明如藉由基因表現標記物所確定，抗-RSPO3抗體(5D6)能夠促進自幹細胞樣標記物型態轉變至分化標記物型態。
亦在結腸直腸癌PTPRK-RSPO融合患者來源腫瘤模型中，在用抗-RSPO3抗體(5D6)處理後，測試隨時間推移對腫瘤體積之影響(例如腫瘤生長抑制)，展示在圖11A-D中。用抗-RSPO3抗體(5D6)處理模型展示腫瘤生長顯著減少或腫瘤生長停滯。在模型中，消退及/或停滯並 非在用抗-RSPO3抗體(5D6)處理後立即開始；在處理開始之後消退或停滯之開始存在延遲。此外，當用抗豚草抗體或抗-RSPO3抗體(5D6)處理之結腸直腸癌患者來源模型腫瘤用H&E染色劑及愛爾斯藍染色劑染色時，如圖12A-D中所示，病理組織學存在顯著差異。在抗-RSPO3(5D6)處理之腫瘤中，腫瘤細胞數目顯著減少。大部分剩餘細胞之組織學符合分化、成熟的未增殖杯狀細胞。此外，如藉由愛爾斯藍染色指示，與抗豚草抗體對照相比，黏液顯著增加。因此，量測之腫瘤體積可實際上已由黏液佔據顯著部分，且未由腫瘤細胞佔據，且因此，實際上已低估對腫瘤生長抑制之影響。雖然不希望受任何特定理論束縛，此等功效數據符合RSPO3融合陽性腫瘤之分層組織：癌症幹細胞之增殖視RSPO蛋白質而定，且在用抗-RSPO3抗體(5D6)處理後癌症幹細胞死亡或分化成短暫擴增(TA)細胞。在確保其補充之幹細胞來源缺乏下，在其終末分化之後，後者進行有限數目之細胞分裂，導致其耗盡。因此，TA細胞群體之動力學及整體尺寸可決定腫瘤生長抑制之開始。
再次，雖然不希望受任何特定理論束縛，但基於所描述之RSPO3融合陽性腫瘤的分層組織理論，與化學治療劑之組合治療應藉由殺死TA細胞群體而減少消退及/或停滯之開始延遲，且與在PTPRK-RSPO融合患者來源腫瘤模型中用單獨化學治療劑處理相比，功效增加。根據此理論及如圖11D及13A中所示，抗-RSPO3抗體(5D6)與伊立替康組合顯著減少消退及/或停滯開始之延遲，且與在CRCD及CRCC結腸直腸癌PTPRK-RSPO融合患者來源腫瘤模型中單獨伊立替康處理相比，腫瘤生長減少。藉由投與抗-RSPO3抗體與化學療法組合，靶向癌症幹細胞與TA細胞以使腫瘤生長較早消退或停滯。
此外，雖然不希望受任何特定理論束縛，但基於上述RSPO3融合陽性腫瘤之分層組織理論以及如藉由腫瘤移植分析所量測，幹細胞隔 室負責腫瘤起始之想法，用抗-RSPO3抗體處理之移植PTPRK-RSPO融合患者來源腫瘤模型應具有減少之癌症幹細胞群體，其應減少連續PTPRK-RSPO融合患者來源腫瘤之建立及腫瘤生長。再次，根據此理論及如圖13B-C所示，在連續移植實驗中，用抗-RSPO3抗體(5D6)處理使得在連續移植後自經抗-RSPO3處理之片段建立及生長較少腫瘤。
雖然已出於清楚理解之目的藉助於說明及實例略為詳細地描述本發明，但不應將該等描述及實例解釋為限制本發明之範疇。本文中引用之所有專利及科學文獻之揭示內容係以全文引用的方式明確併入本文中。
SEQ ID NO：1>sp|Q6UXX9|RSPO2_人類R-反應素-2 OS=智人GN=RSPO2
SEQ ID NO：2>sp|Q9BXY4|RSPO3_人類R-反應素-3 OS=智人GN=RSPO3
SEQ ID NO：3>sp|Q2MKA7|RSPO1_人類R-反應素-1 OS=智人GN=RSPO1
SEQ ID NO：4>sp|Q2I0M5|RSPO4_人類R-反應素-4 OS=智人GN=RSPO4
EIF3E(e1)-RSPO2(e2)易位融合聚核苷酸(SEQ ID NO：173)
EIF3E(e1)-RSPO2(e2)易位融合多肽序列(SEQ ID NO：174)
PTPRK(e1)-RSPO3(e2)易位融合聚核苷酸序列(SEQ ID NO：175)
PTPRK(e1)-RSPO3(e2)易位融合多肽序列(SEQ ID NO：176)
PTPRK(e7)-RSPO3(e2)易位融合聚核苷酸序列(SEQ ID NO：177)
PTPRK(e7)-RSPO3(e2)易位融合多肽序列(SEO ID NO：178)
<110> 美商建南德克公司等人
<120> 抗-RSPO抗體及使用方法
<130> P5719R1-WO
<140> 62/056,324
<141> 2014-09-26
<150> 61/893,141
<151> 2013-10-18
<160> 216
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 243
<212> PRT
<213> 智人
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<210> 2
<211> 272
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<212> PRT
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<221> source
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<212> PRT
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<221> source
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<212> PRT
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<211> 7
<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<220>
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<221> misc_feature
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
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<400> 80
<210> 81
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成肽"
<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> misc_feature
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<400> 81
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(11)
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<400> 82
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成肽"
<400> 83
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成肽"
<400> 84
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成肽"
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /置換="His"
<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
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<400> 85
<210> 86
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成肽"
<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
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<210> 87
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成肽"
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(15)
<223> /置換="Ile"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> /注意="關於註解中之彼等殘基，序列中給出之變異殘基對變異位置無偏好"
<400> 87
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成肽"
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> /置換="Val"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> /注意="關於註解中之彼等殘基，序列中給出之變異殘基對變異位置無偏好"
<400> 88
<210> 89
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成多肽"
<400> 89
<210> 90
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成多肽"
<400> 90
<210> 91
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成多肽"
<400> 91
<210> 92
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成多肽"
<400> 92
<210> 93
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成多肽"
<400> 93
<210> 94
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成多肽"
<400> 94
<210> 95
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成多肽"
<400> 95
<210> 96
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成多肽"
<400> 96
<210> 97
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成多肽"
<400> 97
<210> 98
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成多肽"
<400> 98
<210> 99
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 99
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
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<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成多肽"
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成多肽"
<400> 102
<210> 103
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成多肽"
<400> 103
<210> 104
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意="人工序列之描述：合成多肽"
<400> 104
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<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
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Claims (17)

  1. 一種結合於R-反應素2(RSPO2)之分離抗體，其中該抗體包含(a)輕鏈可變域(VL)，其包含(i)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的高變區-L1(HVR-L1)、(ii)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的HVR-L2及(iii)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的HVR-L3，及(b)重鏈可變域(VH)，其包含(i)包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的HVR-H2及(iii)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的HVR-H3。
  2. 如請求項1之分離抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO：105之VL序列及SEQ ID NO：106之VH序列。
  3. 如請求項1之分離抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：105之序列具有至少95%一致性之VL序列及與SEQ ID NO：106之序列具有至少95%一致性之VH序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之分離抗體，其中該抗體抑制RSPO2介導之wnt信號傳導。
  5. 如請求項1至3中任一項之分離抗體，其中該抗體抑制RSPO2與跨膜E3泛素酶之相互作用。
  6. 如請求項1至3中任一項之分離抗體，其中該抗體為人類化抗體或嵌合抗體。
  7. 如請求項1至3中任一項之分離抗體，其中該抗體為全長人類IgG1或IgG2a抗體。
  8. 如請求項1至3中任一項之分離抗體，其中該抗體為包含Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段之抗體片段。
  9. 如請求項1至3中任一項之分離抗體，其中該抗體為雙特異性或多特異性抗體。
  10. 如請求項1至3中任一項之分離抗體，其中該抗體增強RSPO2與含有富含白胺酸重複序列之G蛋白質偶合受體4(LGR4)及含有富含白胺酸重複序列之G蛋白質偶合受體5(LGR5)中之一或兩者的相互作用。
  11. 一種免疫結合物，其包含如請求項1至10中任一項之抗體及細胞毒性劑。
  12. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至10中任一項之抗體或如請求項11之免疫結合物及醫藥上可接受之載劑。
  13. 如請求項12之醫藥調配物，其進一步包含額外治療劑。
  14. 一種分離核酸，其編碼如請求項1至10中任一項之抗體。
  15. 一種宿主細胞，其包含如請求項14之核酸。
  16. 一種產生如請求項1至10中任一項之抗體之方法，其包含培養如請求項15之宿主細胞，使得抗體產生。
  17. 如請求項16之方法，進一步包含自宿主細胞回收抗體。
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2173379E (pt) 2007-07-02 2015-11-24 Oncomed Pharm Inc Composições e métodos para o tratamento e diagnóstico de cancro
CA2841745A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Rspo binding agents and uses thereof
US9181333B2 (en) 2012-07-13 2015-11-10 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. RSPO3 binding agents and uses thereof
CN106687137A (zh) 2014-09-16 2017-05-17 昂考梅德药品有限公司 纤维化疾病的治疗
JP2018522062A (ja) * 2015-05-26 2018-08-09 キュアジェニックス コーポレーション 腫瘍バイオマーカー及びその使用
WO2017095918A2 (en) * 2015-12-01 2017-06-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer using rspo3 antagonists
EP3865511A1 (en) 2016-04-14 2021-08-18 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-rspo3 antibodies and methods of use
KR102762570B1 (ko) * 2017-12-07 2025-02-06 내셔날 헬스 리서치 인스티튜트 항-rspo3 항체
EP3886905A4 (en) * 2018-12-27 2022-08-24 H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Inc. BISPECIFIC ANTIBODY FOR MEMBRANE CLEARANCE OF TARGET RECEPTORS
US12509512B2 (en) * 2019-06-27 2025-12-30 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Semaphorin 3A antibodies and uses thereof
CN115335123A (zh) * 2020-02-17 2022-11-11 得克萨斯大学体系董事会 人4-1bb激动剂抗体及其使用方法
WO2023081818A1 (en) * 2021-11-05 2023-05-11 American Diagnostics & Therapy, Llc (Adxrx) Monoclonal antibodies against carcinoembryonic antigens, and their uses

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013012747A1 (en) * 2011-07-15 2013-01-24 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Rspo binding agents and uses thereof

Family Cites Families (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
WO1991003489A1 (en) 1989-09-08 1991-03-21 The Johns Hopkins University Structural alterations of the egf receptor gene in human gliomas
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
AU661533B2 (en) 1992-01-20 1995-07-27 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives
ATE503496T1 (de) 1992-02-06 2011-04-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches bindeprotein für tumormarker
ATE139900T1 (de) 1992-11-13 1996-07-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
GB9314893D0 (en) 1993-07-19 1993-09-01 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
PT659439E (pt) 1993-12-24 2002-04-29 Merck Patent Gmbh Imunoconjugados
US5654307A (en) 1994-01-25 1997-08-05 Warner-Lambert Company Bicyclic compounds capable of inhibiting tyrosine kinases of the epidermal growth factor receptor family
IL112249A (en) 1994-01-25 2001-11-25 Warner Lambert Co Pharmaceutical compositions containing di and tricyclic pyrimidine derivatives for inhibiting tyrosine kinases of the epidermal growth factor receptor family and some new such compounds
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
GB9508538D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
JPH11507535A (ja) 1995-06-07 1999-07-06 イムクローン システムズ インコーポレイテッド 腫瘍の成長を抑制する抗体および抗体フラグメント類
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
TR199800012T1 (xx) 1995-07-06 1998-04-21 Novartis Ag Piroloprimidinler ve preparasyon i�in tatbikler.
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US5760041A (en) 1996-02-05 1998-06-02 American Cyanamid Company 4-aminoquinazoline EGFR Inhibitors
GB9603095D0 (en) 1996-02-14 1996-04-10 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
DE69710712T3 (de) 1996-04-12 2010-12-23 Warner-Lambert Co. Llc Umkehrbare inhibitoren von tyrosin kinasen
EP0912559B1 (en) 1996-07-13 2002-11-06 Glaxo Group Limited Fused heterocyclic compounds as protein tyrosine kinase inhibitors
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
US6002008A (en) 1997-04-03 1999-12-14 American Cyanamid Company Substituted 3-cyano quinolines
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
AU7165698A (en) 1997-05-06 1998-11-27 American Cyanamid Company Use of quinazoline compounds for the treatment of polycystic kidney disease
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
TW436485B (en) 1997-08-01 2001-05-28 American Cyanamid Co Substituted quinazoline derivatives
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
HUP0004286A3 (en) 1997-11-06 2002-01-28 American Cyanamid Co Madison Use of quinazoline derivatives for producing pharmaceutical compositions for treating colonic polyps
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
JP3687900B2 (ja) 1998-11-19 2005-08-24 ワーナー−ランバート・カンパニー、リミテッド、ライアビリティ、カンパニー チロシンキナーゼの不可逆的阻害剤であるｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミド
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1141024B1 (en) 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
ES2601882T5 (es) 1999-04-09 2021-06-07 Kyowa Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
KR100797667B1 (ko) 1999-10-04 2008-01-23 메디카고 인코포레이티드 외래 유전자의 전사를 조절하는 방법
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
AU784983B2 (en) 1999-12-15 2006-08-17 Genentech Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
DK1242438T3 (da) 1999-12-29 2007-02-12 Immunogen Inc Cytotoksiske midler omfattende modificerede doxorubiciner og daunorubiciner og deres terapeutiske anvendelse
DK2857516T3 (en) 2000-04-11 2017-08-07 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses thereof
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2020-07-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antitest-kompozíciót termelő sejt
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
EP1916303B1 (en) 2000-11-30 2013-02-27 Medarex, Inc. Nucleic acids encoding rearranged human immunoglobulin sequences from transgenic transchromosomal mice
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXICITY
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
WO2003084569A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Drug containing antibody composition
CA2481656A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells in which activity of the protein involved in transportation of gdp-fucose is reduced or lost
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
US20050031613A1 (en) 2002-04-09 2005-02-10 Kazuyasu Nakamura Therapeutic agent for patients having human FcgammaRIIIa
CN102911987B (zh) 2002-04-09 2015-09-30 协和发酵麒麟株式会社 基因组被修饰的细胞
WO2003085119A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcϜ RECEPTOR IIIa
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
DK2289936T3 (en) 2002-12-16 2017-07-31 Genentech Inc IMMUNGLOBULIN VARIATIONS AND APPLICATIONS THEREOF
EP1585767A2 (en) 2003-01-16 2005-10-19 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
WO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 融合蛋白質組成物
WO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. α1,6-フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するRNAを用いた抗体組成物の製造法
ES2437337T3 (es) 2003-10-10 2014-01-10 Deutsches Krebsforschungszentrum Composiciones para diagnosis y terapia de enfermedades asociadas con la expresión aberrante de futrinas (R-Espondinas)
DK2380910T3 (en) 2003-11-05 2015-10-19 Roche Glycart Ag Antigen binding molecules with increased Fc receptor binding affinity and effector function
PT2489364E (pt) 2003-11-06 2015-04-16 Seattle Genetics Inc Compostos de monometilvalina conjugados com anticorpos
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
PL1737891T3 (pl) 2004-04-13 2013-08-30 Hoffmann La Roche Przeciwciała przeciw selektynie p
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
NZ553500A (en) 2004-09-23 2009-11-27 Genentech Inc Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates withCysteine engineered antibodies and conjugates with a free cysteine amino acid in the heavy chain a free cysteine amino acid in the heavy chain
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
AR060871A1 (es) 2006-05-09 2008-07-16 Genentech Inc Union de polipeptidos con supercontigos optimizados
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
CA2664828A1 (en) * 2006-10-20 2008-04-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts Rspondins as modulators of angiogenesis and vasculogenesis
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
WO2011076932A1 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Deutsches Krebsforschungszentrum Receptors of rspo2 and rspo3
WO2013036867A2 (en) 2011-09-08 2013-03-14 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for cancer and cancer stem cell detection and elimination
EP3653222A1 (en) 2011-10-14 2020-05-20 Novartis AG Antibodies and methods for wnt pathway-related diseases
WO2013090787A1 (en) * 2011-12-14 2013-06-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Stimulation of ovarian follicle development and oocyte maturation
RU2014133069A (ru) 2012-02-11 2016-04-10 Дженентек, Инк. Транслокации r-спондина и способы с их использованием
US9181333B2 (en) * 2012-07-13 2015-11-10 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. RSPO3 binding agents and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013012747A1 (en) * 2011-07-15 2013-01-24 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Rspo binding agents and uses thereof

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