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TWI504748B - 於異源性生物體中使用多不飽和脂肪酸（ｐｕｆａ）聚酮合成酶系統來製造多不飽和脂肪酸之技術（一） - Google Patents

於異源性生物體中使用多不飽和脂肪酸（ｐｕｆａ）聚酮合成酶系統來製造多不飽和脂肪酸之技術（一） Download PDF

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TWI504748B
TWI504748B TW096108936A TW96108936A TWI504748B TW I504748 B TWI504748 B TW I504748B TW 096108936 A TW096108936 A TW 096108936A TW 96108936 A TW96108936 A TW 96108936A TW I504748 B TWI504748 B TW I504748B
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organism
seq
plant
microorganism
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James G Metz
Jerry M Kuner
James Casey Lippmeier
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Dsm Ip Assets Bv
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Publication date
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Description

於異源性生物體中使用多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮合成酶系統來製造多不飽和脂肪酸之技術(一) 相關申請案之交互參照
本申請案係依據35 U.S.C.§ 119(e)申明美國專利暫時申請案序號60/784,616，於2006年3月21日提申，以及美國專利暫時申請案序號60/783,205，於2006年3月15日提申，之優先權。美國專利暫時申請序號60/784,616，以及美國專利暫時申請案序60/783,205，於2006年3月15日提申，在此併入本案以作為參考資料。
發明領域
本發明一般係相關於使用附屬蛋白與其標的物，以增進聚不飽和脂肪酸(PUFAs)，尤其是長鏈PUFAs(LCPUFAs)於宿主中之製造，該宿主經PKS－類似系統進行基因修飾，以製造此類PUFAs(即PUFA PKS系統或PUFA合成酶)。本發明亦相關於經基因修飾之生物體，以表現此類附屬蛋白或此類標的之修飾，並相關於製造與使用此類生物體之方法。
 發明背景
聚不飽和脂肪酸(PUFA)被認為可使用於營養應用、醫藥應用、工業應用，以及其他目的。然而，目前得自天然來源與化學合成來源之PUFAs並無法滿足工業需求。衍生自油類種子作物之蔬菜油相對較便宜，且不會有與魚油相關之污染組織。然而，在工業發展植物油中發現之PUFAs一般限制於次亞麻油酸(18個碳，具有2個雙鍵，在delta 9與12位置－18：2 delta 9,12)，以及次亞麻油酸(18：3 delta 9,12,15)。數種單獨之去飽和酶與鏈延長酶酵素係自次亞麻油與次亞麻油酸合成脂肪酸，以製造更多飽和與更長鏈PUFAs所必需。因此，以基因工程表現PUFAs，如EPA與二十二碳六烯酸(DHA)之植物宿主細胞，為表現數種合成所需之酵素所需要。此外，為了製造出可用量之此類PUFAs，需要額外之基因工程。因此，另一製造PUFAs系統，其為聚酮合成酶－類似系統，之發現，便提供了植物或其他生物體(如微生物體)基因工程之替代，其使用“典型”或“標準”脂肪酸合成路徑之去飽和酶與鏈延長酶。
目前已有許多研究相關於在油類種子作物中製造PUFA，藉由修飾內生性製造之脂肪酸。這些具有各種脂肪酸鏈延長酶與去飽和酶獨立基因之基因修飾之植物，可生產出含有明顯量之PUFA如EPA，並含有明顯量之混合較短鏈與較不飽和PUFA之葉子或種子(Qi et al.,Nature Biotech.22：739(2004)；PCT公開案號WO 04/071467；Abbadi et al.,Plant Cell 16：1(2004))；Napier and Sayanova,Proceedings of the Nutrition Society(2005),64：387－393；Robert et al.,Functional Plant Biology(2005)32：473－479；或U.S.專利申請案公開號2004/0172682。
因此，目前此技術上仍需要可有效率且有效地自油類種子植物中製造大量富含希望之PUFA之脂質(如，三醯基甘油(TAG)與磷脂質(PL))。
聚酮合成酶(PKS)系統一般為此領域已知，為相關於脂肪酸合成酶(FAS)系統之酵素複合物，但通常經高度修飾，以製造特化之產物，僅顯示脂肪酸之些許相似性。然而，目前已知，聚酮合成酶系統存在於海洋細菌與某些微藻類(microalgae)，其可自乙醯基－CoA與丙二醯基－CoA合成聚不飽和脂肪酸(PUFAs)。這些系統在此稱之為PUFA PKS系統、用於製造PUFA之PKS－類似系統，或PUFA合成酶系統。
沙雷菌(Shewanella)與另一海洋細菌，海洋弧菌(Vibrio marinus)中，用於PUFA合成之PUFA PKS路徑，係詳細描述於美國專利號6,140,486。在真核生物破囊壺菌(thraustochytrid)，裂殖壺菌(Schizochytrium)中用於PUFA合成之PUFA PKS路徑，係詳細描述於美國專利號6,566,583。在真核生物中，如破囊壺菌目成員，用於PUFA合成之PUFAPKS路徑，包括關於裂殖壺菌(Schizochytrium)中PUFA PKS系統之額外描述，以及破囊壺菌(thraustochytrium)中PUFA PKS系統之辨識，係詳細描述於美國專利申請案公開號20020194641，公開於2002年12月19日，以及PCT公開案號WO 2006/135866，公開於2006年12月21日。美國專利申請公開案號，20040235127公開於2004年11月25日，係揭示破囊壺菌(thraustochytrium)中PUFA PKS系統之詳細架構，尤其是二十碳五烯酸(C20：5,ω－3)(EPA)之製造，以及其他使用此系統之PUFA。美國專利申請公開案號20050100995，公開於2005年5月12日，係揭示沙雷菌(Shewanella olleyana)與沙雷菌(Shewanella japonica)中之PUFA PKS系統之架構與功能描述，以及此類系統之用途。這些申請案亦揭示生物體之基因修飾，包括微生物體與植物，具有包含PUFA PKS路徑之基因，以及以此類生物體製造PUFA。此外，PCT專利公開案號WO 05/097982，係描述巫肯尼亞菌(Ulkenia)中之PUFA PKS系統，以及美國專利申請公開案號20050014231，係描述金黃色破囊壺菌(thraustochytrium aureum)中之PUFA PKS基因與其產生之蛋白質。上述申請案之每一者皆在此併入本案以作為參考資料。
因此，該PUFA合成酶家族酵素之基本區塊(domain)結構與序列特性，已經描述，顯示出PUFA合成酶可重新合成各種PUFA(如，二十碳五烯酸(EPA；C20：5n－3)、二十二碳六烯酸(DHA；22：6n－3)，以及二十二碳五烯酸(DPAn－6；C22：5n－6)。已瞭解PUFA產物會堆積於宿主生物體磷脂質(PL)中，以及，在某些情況下，天然脂質中(如，三醯基甘油(TAG))。然而，就本發明人背景知識所瞭解，目前尚未定義出這些標的物之酵素中，PUFA轉移之確切機制。
由於瞭解生物體中這些標的終點之PUFA轉移之確切機制，可幫助經基因修飾以製造PUFA之生物體中，PUFA之製造效率增加及/或改良，因此目前此領域需要有關此種機制之資訊。因此，目前此領域需要一種製造PUFA之改良方法，包括於經基因修飾以產生此類PUFA於植物與微生物體中，若瞭解此機制則更具優勢。
 發明概要
本發明之一實施例係相關於一種經分離之核酸分子，包含一編碼醯基－CoA合成酶(ACoAS)，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA，之核酸序列，其中該核酸序列編碼一醯基－CoA合成酶(ACoAS)，其至少60%相等於ACoAS，具有一胺基酸序列選自於由：SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97，以及SEQ ID NO：99組成之族群。在另一觀點中，該核酸序列係編碼一醯基－CoA合成酶(ACoAS)，具有胺基酸序列選自於由：SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ I DNO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97，以及SEQ ID NO：99組成之族群。在一觀點中，該核酸序列係編碼一胺基酸序列，選自於由：SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85，以及SEQ ID NO：97組成之族群。在一觀點中，該核酸序列係選自於由：SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96，以及SEQ ID NO：98組成之族群。
本發明之另一觀點係相關於一種經分離之核酸分子，包含編碼一蛋白質之核酸序列，該蛋白質利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)，其中該蛋白質包含一胺基酸，其至少60%相等於一胺基酸序列，選自於由：SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：110，以及SEQ ID NO：113組成之族群。在一觀點中，該核酸係編碼一蛋白質，包含一胺基酸序列，選自於由：SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：110，以及SEQ ID NO：113組成之族群。在一觀點中，該核酸係編碼一蛋白質，包含一胺基酸序列，選自於由：SEQ ID NO：102與SEQ ID NO：104組成之族群。在一觀點中，該核酸序列係選自於由SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111，以及SEQ ID NO：112組成之族群。
本發明之另一觀點係相關於一種經分離之之蛋白質，係由上述核酸分子所編碼。
本發明之另一實施例係相關於一種一種重組核酸分子，包含上述核酸分子，操作性地與一表現控制序列聯結。
本發明之另一實施例係相關於一種重組宿主細胞，包含上述之重組核酸分子。在一觀點中，該宿主細胞為一生物體。在另一觀點中，該宿主細胞為一植物細胞。
本發明之另一實施例係相關於一種經基因修飾之生物體，其中該生物體已經基因修飾，以表現上述之經分離之核酸分子或其組合物。在一觀點中，該生物體係表現一PUFA合成酶，以及一磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)。在一觀點中，該生物體已經基因修飾，以表現該合成酶與PPTase。在一觀點中，該生物體係包含一額外之基因修飾，以剔除或使該生物體表現之脂肪酸合成酶(FAS)失去活性。在一觀點中，該生物體係包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量。
另一實施例係相關於一種經基因修飾之生物體，其中該生物體係表現一PUFA合成酶，其製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，以及一磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)，且其中該生物體含有一基因修飾，以表現一或多個異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)，或一同源性該合成酶，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA。在一觀點中，該生物體係經一核酸分子轉型，其包含一核酸序列，係編碼一醯基－CoA合成酶(ACoAS)，或其同源物，來自會內生性製造PUFA合成酶之生物體。在一觀點中，該生物體係經由一核酸分子轉型，該核酸包含一編碼來自隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)之醯基－CoA合成酶(ACoAS)，或其同源物之核酸序列，其中該ACoAS或其同源物係催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA。在一觀點中，該生物體係經由一核酸分子轉型，該核酸包含一編碼來自破囊壺菌目微生物體之醯基－CoA合成酶(ACoAS)，或其同源物之核酸序列，其中該ACoAS或其同源物係催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA。在一觀點中，該生物體係經由一核酸分子轉型，該核酸包含一編碼來自裂殖壺菌(Schizochytrium)之醯基－CoA合成酶(ACoAS)，或其同源物之核酸序列，其中該ACoAS或其同源物係催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA。在一觀點中，該生物體係包含一額外之基因修飾，以剔除或使該生物體表現之脂肪酸合成酶(FAS)失去活性。在一觀點中，該生物體係包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量。在一觀點中，該生物體包含一額外之基因修飾，以自可內生性製造PUFA之生物體中表現一或多種異源性蛋白質，其中該蛋白質利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)。
另一實施例係相關於一種經基因修飾之生物體，其中該生物體係表現一PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，以及一磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)，其中該生物體包含一基因修飾，以剔除或使該生物體表現之脂肪酸合成酶(FAS)失去活性。在一觀點中，該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量。
另一實施例係相關於一種經基因修飾之生物體，其中該生物體係表現一PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，以及一磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)，以及其中該生物體含有一基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量。在一觀點中，該生物體包含一額外之基因修飾，以剔除或使該生物體表現之脂肪酸合成酶(FAS)失去活性。
又一實施例係相關於一種經基因修飾之生物體，其中該生物體係表現一PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，以及一磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)，其中該生物體包含一基因修飾，以自可內生性製造PUFAs之生物體中表現一或多種異源性蛋白質，其中該蛋白質利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)。在一觀點中，該蛋白質為DAGAT或LPAAT。在一觀點中，該生物體係以一核酸分子轉型，該核酸分子包含一核酸序列，編碼來自破囊壺菌(thraustochytrid)或網黏菌(labyrinthulid)微生物體之醯基－CoA合成酶(ACoAS)，或其同源物，其利用PUFA－CoA為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)。在一觀點中，該生物體係經由一核酸分子轉型，該核酸分子包含一核酸序列，編碼得自隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)之醯基－CoA合成酶(ACoAS)，或其同源物，其利用PUFA－CoA為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)。在一觀點中，該生物體包含一額外之修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)，或其同源物，可催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA。在一觀點中，該生物體包含一額外之基因修飾，以剔除或使該生物體表現之脂肪酸合成酶(FAS)失去活性。在一觀點中，該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量。
在一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾；且其中該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群。
在另一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，以及其中編碼PUFA合成酶或PPTase之至少一核酸分子，係操作性地與編碼色素體－標的序列，由SEQ ID NO：81代表之核酸序列聯結。
在另一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，且其中該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群，且其中該生物體含有一額外之基因修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA。
在又一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾；其中至少一編碼PUFA合成酶或PPTase之核酸分子，係操作性地與編碼色素體－標的序列，由SEQ ID NO：81代表之核酸序列聯結；或其中該生物體含有一額外之基因修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA。
在一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾；其中該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以自會內生性製造PUFA合成酶之生物體中表現一或多種異源性蛋白質；以及其中該蛋白質會利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)。
在又一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾；其中該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以自會內生性製造PUFA合成酶之生物體中表現一或多種異源性蛋白質；其中該蛋白質會利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)；以及其中該生物體含有一額外之基因修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA。
在另一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾；其中編碼PUFA合成酶或PPTase之至少一核酸分子，係操作性地與編碼色素體－標的序列，由SEQ ID NO：81代表之核酸序列聯結；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以自會內生性製造PUFA合成酶之生物體中表現一或多種異源性蛋白質；以及其中該蛋白質會利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)。
在另一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾；其中至少一編碼PUFA合成酶或PPTase之核酸分子，係操作性地與編碼色素體－標的序列，由SEQ ID NO：81代表之核酸序列聯結；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以自會內生性製造PUFA合成酶之生物體中表現一或多種異源性蛋白質，其中該蛋白質會利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)；以及其中該生物體含有一額外之基因修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA。
在另一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾；其中該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群；以及其中該生物體含有一額外之基因修飾，以剔除或使內生性脂肪酸合成酶(FAS)失去活性，或使與該植物表現之FAS結合之蛋白質失去活性。
在一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾；其中該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以剔除或使內生性脂肪酸合成酶(FAS)失去活性，或使與該植物表現之FAS之結合蛋白質失去活性；以及其中該生物體含有一額外之基因修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA。
在一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾；其中該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以剔除或使內生性脂肪酸合成酶(FAS)失去活性，或使與該植物表現之FAS結合之蛋白質失去活性；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以自會內生性製造PUFA合成酶之生物體中表現一或多種異源性蛋白質；且其中該蛋白質會利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)。
在一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾；其中該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以剔除或使內生性脂肪酸合成酶(FAS)失去活性，或使與該植物表現之FAS結合之蛋白質失去活性；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以自會內生性製造PUFA合成酶之生物體中表現一或多種異源性蛋白質；以及其中該蛋白質會利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)。在另一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾；其中至少一編碼PUFA合成酶或PPTase之核酸分子，係操作性地與編碼色素體－標的序列，由SEQ ID NO：81代表之核酸序列聯結；以及其中該生物體含有一額外之基因修飾，以剔除或使內生性脂肪酸合成酶(FAS)或與該植物表現之FAS結合之蛋白質失去活性。
在另一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾；其中至少一編碼PUFA合成酶或PPTase之核酸分子，係操作性地與編碼色素體－標的序列，由SEQ ID NO：81代表之核酸序列聯結；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以剔除或使內生性脂肪酸合成酶(FAS)或與該植物表現之FAS結合之蛋白質失去活性；以及其中該生物體含有一額外之基因修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA。
在另一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾；其中至少一編碼PUFA合成酶或PPTase之核酸分子，係操作性地與編碼色素體－標的序列，由SEQ ID NO：81代表之核酸序列聯結；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以剔除或使內生性脂肪酸合成酶(FAS)或與該植物表現之FAS結合之蛋白質失去活性；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以自會內生性製造PUFA合成酶之生物體中表現一或多種異源性蛋白質；其中該蛋白質會利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)。
在另一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾；其中至少一編碼PUFA合成酶或PPTase之核酸分子，係操作性地與編碼色素體－標的序列，由SEQ ID NO：81代表之核酸序列聯結；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以剔除或使內生性脂肪酸合成酶(FAS)或與該植物表現之FAS結合之蛋白質失去活性；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA；以及其中該生物體含有一額外之基因修飾，以自會內生性製造PUFA合成酶之生物體中表現一或多種異源性蛋白質；以及其中該蛋白質會利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)。
在一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，以及其中該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群，其中該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量。
在一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，以及其中該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群，其中該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量；以及其中該生物體含有一額外之基因修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA。
在一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，以及其中該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群，其中該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以自會內生性製造PUFA合成酶之生物體中表現一或多種異源性蛋白質；以及其中該蛋白質會利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)。
在一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，以及其中該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群，其中該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量；以及其中該生物體含有一額外之基因修飾，以剔除或使內生性脂肪酸合成酶(FAS)或與該植物表現之FAS結合之蛋白質失去活性。
在一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，以及其中該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群，其中該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以自會內生性製造PUFA合成酶之生物體中表現一或多種異源性蛋白質；以及其中該蛋白質會利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)。在一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，以及其中該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群，其中該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA；以及其中該生物體含有一額外之基因修飾，以剔除或使內生性脂肪酸合成酶(FAS)或與該植物表現之FAS結合之蛋白質失去活性。在一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，以及其中該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群，其中該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以剔除或使內生性脂肪酸合成酶(FAS)或與該植物表現之FAS結合之蛋白質失去活性；以及其中該蛋白質會利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)；以及其中該生物體含有一額外之基因修飾，以剔除或使內生性脂肪酸合成酶(FAS)或與該植物表現之FAS結合之蛋白質失去活性。在一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，以及其中該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群，其中該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以自會內生性製造PUFA合成酶之生物體中表現一或多種異源性蛋白質；其中該蛋白質會利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)；以及其中該生物體含有一額外之基因修飾，以剔除或使內生性脂肪酸合成酶(FAS)或與該植物表現之FAS結合之蛋白質失去活性。在另一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，以及其中至少一編碼PUFA合成酶或PPTase之核酸分子，係操作性地與編碼色素體－標的序列，由SEQ ID NO：81代表之核酸序列聯結，其中該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量。
在另一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，以及其中至少一編碼PUFA合成酶或PPTase之核酸分子，係操作性地與編碼色素體－標的序列，由SEQ ID NO：81代表之核酸序列聯結，其中該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量；以及其中該生物體含有一額外之基因修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA。
在另一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，以及其中至少一編碼PUFA合成酶或PPTase之核酸分子，係操作性地與編碼色素體－標的序列，由SEQ ID NO：81代表之核酸序列聯結，其中該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以自會內生性製造PUFA合成酶之生物體中表現一或多種異源性蛋白質；以及其中該蛋白質會利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)。
在另一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，以及其中至少一編碼PUFA合成酶或PPTase之核酸分子，係操作性地與編碼色素體－標的序列，由SEQ ID NO：81代表之核酸序列聯結，其中該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量；以及其中該生物體含有一額外之基因修飾，以剔除或使內生性脂肪酸合成酶(FAS)或與該植物表現之FAS結合之蛋白質失去活性。
在另一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，以及其中至少一編碼PUFA合成酶或PPTase之核酸分子，係操作性地與編碼色素體－標的序列，由SEQ ID NO：81代表之核酸序列聯結，其中該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以自會內生性製造PUFA合成酶之生物體中表現一或多種異源性蛋白質；以及其中該蛋白質會利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)。在另一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，以及其中至少一編碼PUFA合成酶或PPTase之核酸分子，係操作性地與編碼色素體－標的序列，由SEQ ID NO：81代表之核酸序列聯結，其中該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA；以及其中該生物體含有一額外之基因修飾，以剔除或使內生性脂肪酸合成酶(FAS)或與該植物表現之FAS結合之蛋白質失去活性。在另一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，以及其中至少一編碼PUFA合成酶或PPTase之核酸分子，係操作性地與編碼色素體－標的序列，由SEQ ID NO：81代表之核酸序列聯結，其中該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以自會內生性製造PUFA合成酶之生物體中表現一或多種異源性蛋白質；以及其中該蛋白質會利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)；以及其中該生物體含有一額外之基因修飾，以剔除或使內生性脂肪酸合成酶(FAS)或與該植物表現之FAS結合之蛋白質失去活性。在另一實施例中，本發明係提供一種經基因修飾之生物體，包括一微生物、植物、植物之一部分，或植物細胞，其中該生物體經PUFA合成酶，其可製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，與磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)基因修飾，以及其中至少一編碼PUFA合成酶或PPTase之核酸分子，係操作性地與編碼色素體－標的序列，由SEQ ID NO：81代表之核酸序列聯結，其中該生物體包含一額外之基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在生物體中之含量；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA；其中該生物體含有一額外之基因修飾，以自會內生性製造PUFA合成酶之生物體中表現一或多種異源性蛋白質；以及其中該蛋白質會利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)；以及其中該生物體含有一額外之基因修飾，以剔除或使內生性脂肪酸合成酶(FAS)或與該植物表現之FAS結合之蛋白質失去活性。在某些實施例中，該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群。
在其他實施例中，該生物體會產生較多量之該至少一PUFA，與缺乏該KASII或KASIII抑制之情況相較。
該基因修飾可包含將生物體以RNAi建構物轉型，該RNAi建構物可抑制KASII之表現或活性，或可抑制KASIII之表現或活性。該RNAi建構物可包含一核酸序列，由SEQ ID NO：122或SEQ ID NO：124代表。
在其他實施例中，該基因修飾包含以反義股(antisense)核酸分子使該生物體轉型，該反義股核酸分子可抑制KASII之表現或活性，或可抑制KASIII之表現或活性。該反義股核酸分子可包含一核酸序列，由SEQ ID NO：123或SEQ ID NO：125代表。
在某些實施例中，該生物體包含一額外之基因修飾，以表現一或多種異源性醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物，其會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA，該生物體可經由一核酸分子轉型，該核酸包含一編碼得自隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)之醯基－CoA合成酶(ACoAS)，或其同源物之核酸序列，其中該ACoAS或其同源物係催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA。在其他實施例中，該生物體可經由一核酸分子轉型，該核酸包含一編碼得自裂殖壺菌(Schizochytriu m)之醯基－CoA合成酶(ACoAS)或其同源物之核酸序列，該合成酶至少60%等同於得自裂殖壺菌(Schizochytrium)之ACoAS之胺基酸序列，其中該ACoAS或其同源物係催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA。在其他實施例中，該生物體係經一核酸分子轉型，該核酸分子包含一編碼醯基－CoA合成酶(ACoAS)之核酸序列，該合成酶至少60%等同於具有胺基酸序列選自於由SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97與SEQ ID NO：99組成族群之ACoAS。在其他實施例中，該生物體係經一核酸分子轉型，該核酸分子包含一編碼醯基－CoA合成酶(ACoAS)之核酸序列，該合成酶至少60%等同於具有胺基酸序列選自於由SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97與SEQ ID NO：99組成族群之ACoAS；且更佳為，編碼醯基－CoA合成酶(ACoAS)，具有胺基酸序列選自於由：SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85與SEQ ID NO：97組成族群之核酸分子。在其他實施例中，該生物體係經一核酸分子轉型，該核酸分子包含一編碼醯基－CoA合成酶(ACoAS)之核酸序列，該合成酶具有胺基酸序列如SEQ ID NO：83或SEQ ID NO：85，以及該核酸分子包含一編碼醯基－CoA合成酶(ACoAS)之核酸序列，該合成酶具有胺基酸序列如SEQ ID NO：97。在其他實施例中，該生物體係經一核酸分子轉型，該核酸分子包含一核酸序列選自於由：SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96，與SEQ ID NO：98組成之族群。
在某些實施例中，其中該生物體包含一額外之基因修飾，以自會內生性製造PUFA合成酶之生物體中表現一或多種異源性蛋白質；以及其中該蛋白質會利用PUFA－CoA作為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)，該生物體會內生性地表現PUFA合成酶。在其他實施例中，該蛋白質為DAGAT或LPAAT。在其他實施例中，該生物體係以一核酸分子轉型，該核酸分子包含一核酸序列，編碼一得自破囊壺菌(thraustochytrid)或網黏菌(labyrinthulid)之蛋白質，其利用PUFA－CoA為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)。在其他實施例中，該生物體係以一核酸分子轉型，該核酸分子包含一核酸序列，編碼一得自裂殖壺菌(Schizochytrium)之蛋白質，其利用PUFA－CoA為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)。在某些實施例中，該核酸分子係編碼一蛋白質，包含一胺基酸序列，其至少60%等同於選自於由：SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：110與SEQ ID NO：113組成族群之胺基酸序列。在其他實施例中，該生物體係以一核酸分子轉型，該核酸分子包含一核酸序列，係編碼一蛋白質，其包含胺基酸序列選自於由：SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：110與SEQ ID NO：113；且較佳為一核酸分子，包含一核酸序列，係編碼一蛋白質，其包含胺基酸序列選自於由SEQ ID NO：102與SEQ ID NO：104組成之族群。在其他實施例中，生物體係以一核酸分子轉型，該核酸分子包含一核酸序列，係編碼一蛋白質，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：102，以及一核酸序列，係編碼一蛋白質，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：104。在其他實施例中，生物體係以一核酸分子轉型，該核酸分子包含一核酸序列，係編碼一蛋白質，其包含胺基酸序列選自於由SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111與SEQ ID NO：112組成之族群。其中該生物體係經由一核酸分子轉型，該核酸分子包含一核酸序列，係編碼得自隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)之醯基－CoA合成酶(ACoAS)，或其同源物，之核酸序列，其利用PUFA－CoA為受質，形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)。在某些實施例中，該生物體係經一核酸分子轉型，該核酸分子包含一核酸序列，其至少90%等同於選自於由：SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120與SEQ ID NO：121組成族群之一核酸序列。
在前述實施例之某些實施例中，該PUFA合成酶包含至少一功能性區塊，得自破囊壺菌(thraustochytrid)或網黏菌(labyrinthulid)之PUFA合成酶。在某些實施例中，該PUFA合成酶包含至少一功能性區塊，得自破囊壺菌(thraustochytrid)微生物體之PUFA合成酶。在其他實施例中，該PUFA合成酶包含至少一功能性區塊，得自選自於由裂殖壺菌(Schizochytrium)、破囊壺菌(thraustochytrium)、巫肯尼亞菌(Ulkenia)，以及網黏菌(Labyrinthula)組成族群之一微生物體之PUFA合成酶。在其他實施例中，該PUFA合成酶包含至少一功能性區塊，得自選自於由美國菌種中心(ATCC)No.20888之裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)、ATCC No.20892之破囊壺菌(thraustochytrium)23B，及該微生物之任一突變株組成族群之一者之PUFA合成酶。在某些實施例中，該PUFA合成酶包含至少一功能性區塊，得自海洋細菌之PUFA合成酶。在其他實施例中，該PUFA合成酶包含至少一功能性區塊，得自選自於由沙雷菌(Shewanella)、嗜壓菌(Moritella)，以及發光菌(Photobacterium)組成族群之一者之PUFA合成酶。
在其他實施例中，該該PUFA合成酶係由一或多種蛋白質組成，包含：至少一烯酯－ACP還原酶(ER)區塊；至少四醯基載體蛋白質(ACP)區塊；至少二β－酮基醯基－ACP合成酶(KS)區塊；至少一醯基轉移酶(AT)區塊；至少一β－酮基醯基－ACP還原酶(KR)區塊；至少二FabA－類似β－羥基醯基－ACP脫氫酶(DH)區塊；以及至少一鏈長度因子(CLF)區塊；至少一丙二醯－CoA：ACP醯基轉移酶(MAT)區塊。在其他實施例中，該該PUFA合成酶係由一或多種蛋白質組成，包含：二個烯酯－ACP還原酶(ER)區塊；八或九個醯基載體蛋白質(ACP)區塊；二β－酮基醯基－ACP合成酶(KS)區塊；一醯基轉移酶(AT)區塊；一酮基還原酶(KR)區塊；二FabA－類似β－羥基醯基－ACP脫氫酶(DH)區塊；一鏈長度因子(CLF)區塊；以及一丙二醯－CoA：ACP醯基轉移酶(MAT)區塊。
在其他實施例中，PUFA合成酶為一細菌性PUFA合成酶，其於溫度至少約25℃製造PUFAs，且其中該PUFA合成酶係由一或多種蛋白質組成，包含：至少一烯酯ACP－還原酶(ER)區塊；至少六醯基載體(ACP)區塊；至少二β－酮基醯基－ACP合成酶(KS)區塊；至少一醯基轉移酶(AT)區塊；至少一酮基還原酶(KR)區塊；至少二FabA－類似β－羥基醯基－ACP脫氫酶(DH)區塊；至少一鏈長度因子(CLF)區塊；至少一丙二醯基－CoA：ACP醯基轉移酶(MAT)區塊；以及至少一4’－磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)區塊。
在某些實施例中，該PUFA合成酶包含一或更多個序列，選自於由：SEQ ID NOs：1－32任一者，以及SEQ ID NOs：35－80任一者組成之族群。
在某些實施例中，一或多種編碼PUFA合成酶之核酸序列，係經最佳化，以增進PUFA合成酶在植物或植物細胞中之表現。在其他實施例中，PUFA合成酶與該PPTase之表現係以植物或植物細胞中之色素體為標的。
在某些實施例中，該經基因修飾生物體為一植物，且該植物為一油類種子植物。在其他實施例中，該植物為雙子葉(dicotyledonous)植物。在其他實施例中，該植物係選自於由：油菜(canola)、大豆、油菜(rapeseed)、亞麻子(linseed)、玉米、紅花(safflower)、葵花與煙草(tobacco)組成之族群。
在其他實施例中，該經基因修飾之生物體係製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，選自於由：EPA(C20：5,n－3)、DHA(C22：6,n－3)、DPA(C22：5,n－6或n－3)、ARA(C20：4,n－6)、GLA(C18：3,n－6)，及/或SDA(C18：4,n－3))組成之族群。在某些實施例中，該經基因修飾之生物體係製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，選自於由：DHA、EPA與DPAn－6組成之族群。在其他實施例中，該經基因修飾之生物體係產生DHA與DPAn－6。在其他實施例中，該經基因修飾之生物體係產生ARA。
在某些實施例中，該經基因修飾之生物體包含至少0.5%重之該至少一PUFA。在其他實施例中，該PUFA合成酶產生之總脂肪酸，除了該至少一PUFA之外，尚包含小於約10%重之由該生物體所製造之總脂肪酸。在其他實施例中，該PUFA合成酶製造之總脂肪酸，除了該至少一PUFA之外，尚包含小於約5%重之由該生物體所製造之總脂肪酸。
在其他實施例中，該植物、植物部分或植物細胞之總脂肪酸分佈，包含至少約0.5%重之至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，具有至少20個碳與4或更多個碳－碳雙鍵，且其中該植物、植物部分或植物細胞之總脂肪酸分佈包含小於5%之下列總PUFAs：γ－次亞麻油酸(GLA；18：3,n－6)、具有18個碳與4個碳－碳雙鍵之PUFA、具有20個碳與3個碳－碳雙鍵之PUFA，以及具有22個碳與2或3個碳－碳雙鍵之PUFA。
在其他實施例中，該植物、植物部分或植物細胞之總脂肪酸分佈，包含至少0.5%重之至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，具有至少20個碳與4或更多個碳－碳雙鍵，且其中該植物、植物部分或植物細胞之總脂肪酸分佈包含小於1%之下列總PUFA：γ－次亞麻油酸(GLA；18：3,n－6)、具有18個碳與4個碳－碳雙鍵之PUFA、具有20個碳與3個碳－碳雙鍵之PUFA，以及具有22個碳與2或3個碳－碳雙鍵之PUFA。
在其他實施例中，該植物、植物部分或植物細胞之總脂肪酸分佈，包含至少0.5%重之至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，具有至少20個碳與4或更多個碳－碳雙鍵，且其中該植物、植物部分或植物細胞之總脂肪酸分佈包含小於2%之γ－次亞麻油酸(GLA；18：3,n－6)，以及二高－γ－次亞麻油酸(DGLA或HGLA；20：3,n－6)。
在其他實施例中，該植物、植物部分或植物細胞之總脂肪酸分佈，包含小於1%之γ－次亞麻油酸(GLA；18：3,n－6)，以及二高－γ－次亞麻油酸(DGLA或HGLA；20：3,n－6)。
在其他實施例中，該經基因修飾之生物體之總脂肪酸分佈，包含至少約0.5%重之至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，具有至少20個碳與4或更多個碳－碳雙鍵，且其中該植物、植物部分或植物細胞之總脂肪酸分佈包含小於1%之γ－次亞麻油酸(GLA；18：3,n－6)。
在其他實施例中，該經基因修飾之生物體之總脂肪酸分佈，包含至少約0.5%重之γ－次亞麻油酸(GLA；18：3,n－6)。
本發明亦提供一種油類，得自本發明之任一經基因修飾生物體。在一實施例中，本發明係提供一種油類，包含可偵測量之DHA(二十二烷六烯酸(C22：6,n－3))，以及DPA(二十二烷五烯酸(C22：5,n－6)，其中該DPAn－6與DHA之比例為1：1或大於1：1，其中該植物油係得自本發明任一經基因修飾之生物體。
其中該經基因修飾之生物體為一植物，本發明提供得自該植物之種子。
本發明亦提供一種食物產品，包含本發明任一油類或子。
本發明亦提供一種醫療用產品，其包含本發明之油類。
本發明亦提供一種製造包含至少一PUFA之油類之方法，包含自本發明之種子中回收一油類。
本發明亦提供一種製造包含至少一PUFA之油類之方法，包含自本發明經基因修飾之生物體回收一油類。
本發明亦提供一種製造至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)之方法，包含生長本發明之經基因修飾植物或微生物體。
本發明更提供一種提供包含至少一PUFA之補充或醫療用產品至一個體之方法，包含提供該個體本發明之經基因修飾之生物體或其一部份、本發明之種子、本發明之油類、本發明之食物產品，或本發明之醫療用產品。
本發明亦提供一種製造前述經基因修飾生物體之方法，包含將一生物體以一或多個編碼PUFA合成酶與該PPTase之核酸分子轉型，其中該生物體含有一基因修飾，以抑制一蛋白質之表現，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群。
本發明亦提供一種製造前述經基因修飾之生物體之方法，包含將一生物體以一或多個編碼PUFA合成酶與該PPTase之核酸分子轉型，並更進一步基因修飾該生物體，以抑制一蛋白質之表現或活性，該蛋白質選自於由KASII與KASIII組成之族群。
本發明亦提供一種將生物體轉型以表現PUFA之方法，包含以編碼PUFA合成酶之核酸分子、磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)之核酸分子，以及此述任一醯基－CoA合成酶或醯基轉移酶之核酸分子，使一生物體轉型。在一觀點中，該生物體含有一基因修飾，以剔除或使該生物體表現之脂肪酸合成酶(FAS)失去活性。在一觀點中，該生物體含有一基因修飾，以降低丙二醯CoA與PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在該生物體中之含量。該生物體可包括一植物或一微生物體，舉例而言。
圖式簡單說明
第1圖為螢光影像分析之數位影像，用於分析裂殖壺菌(Schizochytrium)Ac66株與衍生自該殖株之PUFA－S KO與FAS KO突變株之不含細胞均質物之體外活性試驗。
第2圖為螢光影像分析之數位影像，用於分析以正相TLC分離之裂殖壺菌(Schizochytrium)FAS－KO株之外活性試驗。反應於指示時間下進行。
第3圖為螢光影像分析之數位影像，用於分析以正相TLC分離之裂殖壺菌(Schizochytrium)FAS－KO株之外活性試驗。係使用標準試驗成分，但變化NADH、NADPH與乙醯基－CoA成分(欄1－NADH/NADPH/乙醯基－CoA，欄2－NADPH/乙醯基－CoA，欄3－NADH/乙醯基－CoA，欄4－NADH/NADPH，欄5－無)。
第4圖為螢光影像分析之數位影像，用於分析以正相TLC分離之裂殖壺菌(Schizochytrium)FAS－KO株之外活性試驗。反應係進行10分鐘，之後加入ATP與Mg＋2。反應於底部標示時間終止(“＝秒，‘＝分鐘)。
第5圖為螢光影像分析之數位影像，用於分析以正相TLC分離之裂殖壺菌(Schizochytrium)FAS－KO株之體外活性試驗。反應係進行10分鐘，之後加入ATP與Mg＋2(除了樣本1之外)，繼續靜置20分鐘(欄3－2 uL DMSO，欄4－4 uL DMSO，欄5－25 uM Triascin C，欄6－100 uM Triascin C，欄7－200 uM Triascin C)。
第6A圖為FAME分析之數位影像，用於分析表現有裂殖壺菌(Schizochytrium)OrfA、OrfB＊ 、OrfC與Het I之大腸桿菌。標的PUFA在均質物、高速沈澱物分液(P2)、上清液(S1)與高速上清液(S2)中。
第6B圖為第6A圖所使用之大腸桿菌之樣本分析結果，除了脂質產物僅以HIP(而非轉換為FAMES)萃取之外，在以TLC分離之前。
第7圖控制組酵母菌與表現有裂殖壺菌(Schizochytrium)OrfA、OrfB＊ 、OrfC與Het I之酵母菌之FAME分佈圖。
第8圖為第1圖酵母菌之FAME分佈圖，延伸說明標的PUFA之製造。
第9圖為FAS活性之抑制對於DHA分佈之影響(為總FAME之百分比)，在表現有裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶(sOrfA,sOrfB,OrfC)與Het I，單獨或與醯基CoA合成酶表現組合之酵母菌中。
第10圖為FAS活性之抑制對於DHA與DPAn6分佈之影響(為總FAME之百分比)，在表現有裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶(sOrfA,sOrfB,OrfC)與Het I，單獨或與醯基CoA合成酶表現組合之酵母菌中。
第11圖為FAME分佈，顯示抑制FAS活性(藉由淺藍菌素)、裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶(sOrfA,sOrfB,OrfC)與Het I之表現，以及醯基CoA合成酶之表現，對於酵母菌中DHA與DPAn6產生之共同影響。
第12圖顯示剔除DAGAT基因之裂殖壺菌(Schizochytrium)之脂質分佈。
第13圖為野生型阿拉伯芥(Arabidopsis)與品系263(色素體標的)，在種子發育過程中表現有裂殖壺菌(Schizochytrium)Orfs A,B＊ ,C與Het I，之FAME分佈。
第14圖來自品系1087－7(色素體標的)之阿拉伯芥種子，在種子發育過程中表現有裂殖壺菌(Schizochytrium)Orfs A,B＊ ,C與Het I，之FAME分佈。
第15圖為品系1366匯集之阿拉伯芥種子，在種子發育過程中表現有裂殖壺菌(Schizochytrium)Orfs A,B＊ ,C與Het I，標的為色素體，並結合FAS抑制(KAS II RNAi)與ACS－1，之FAME分佈。
 較佳實施例之詳細說明
本發明一般相關於提供一種蛋白質或標的(於此一般稱之為“附屬蛋白”或“附屬標的”)，以及編碼此蛋白質之核酸分子，以增進聚不飽和脂肪酸(PUFAs)，以及，尤其是，長鏈PUFAs(LCPUFAs)之製造，於已經基因修飾以製造此類PUFA之宿主生物體中。本發明亦相關於一種生物體，其已經基因修飾表現此類蛋白質，以及製造並使用此類蛋白質與生物體之方法。本發明亦相關於製造PUFA(包括經基因修飾以製造PUFA)生物體之其他基因修飾，其可包括生物體中特定基因或標的之剔除或失活。尤其是，本發明係相關於表現PUFA PKS系統(不論是內生性或基因操作)之生物體之基因修飾，以增進或強化生物體中PUFA之製造，及/或堆積。例如，本發明亦相關於人為降低調節酵素，以與受質競爭，並人為提高酵素活性，如藉由突變或將酵素傳送至色素體胞器與細胞質中。
依據本發明，經基因修飾以表現PUFA PKS系統(亦已知為PUFA合成酶系統)之生物體，其中該生物體並非自然地(內生性，非基因修飾)表現此系統，或至少特別是PUFA PKS系統或其部分，其中該生物體係經基因修飾，於此可稱之為“異源性”宿主生物體，該生物體具有PUFA PKS系統或另一非該生物體內生性製造蛋白質之修飾。本發明之基因修飾亦可用於增進已內生性製造PUFA PKS系統之宿主生物體中PUFA之製造，其中該生物體並未經不同PUFA PKS系統或其一部份修飾。
更特別的是，本發明人發現並於此首度揭示裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶之脂肪酸產物(主要為DHA與DPAn－6)，會以自由脂肪酸(FFA)形式自酵素中釋放出，釋放機制一般相信為所有破囊壺菌(thraustochytrid)PUFA PKS(PUFA合成酶)酵素系統之特徵，且為所有真核生物PUFA PKS系統之特徵，包括網黏菌(labyrinthulid)系統。此外，本發明人指出，使用裂殖壺菌(Schizochytrium)作為模式，DHA與DPA FFAs之後會酯化為CoA(CoA)，藉由內生性醯基－CoA合成酶(ACoAS或ACS)或合成酶之作用。這些脂肪酸之活化形式(醯基－CoA)之後可作為PL與TAG形成酵素之受質。
裂殖壺菌(Schizochytrium)之內生性酵素，可非常有效轉換其PUFA合成酶之FFA產物為醯基－CoA，之後使用於PL與TAG合成。此證據為高含量之DHA與DPA堆積於裂殖壺菌(Schizochytrium)之油類與PL分液中。然而，不受理論束縛，本發明人相信異源性宿主中之ACoAS酵素轉換為可轉型之PUFA合成酶系統，不會如同PUFA合成酶供應生物體之AcoAS般有效率。此外，會在新宿主生物體中形成PL與TAG之內生性醯基－轉移酶，並不會有效地利用PUFA－CoA作為受質，尤其是與PUFA合成酶衍生之生物體比較。本發明人亦假設，某些生物體之醯基轉移酶一般為較佳之酵素，用於堆積PUFA於宿主生物體之油類與油類分液中，尤其是某些PUFA，與其他生物體之類似酵素相較(如，來自某一生物體之醯基轉移酶可轉換更多之DHA－CoA單元為TAG，與不同生物體之醯基轉移酶相較)。因此，本發明人係於此揭示，生物體，如裂殖壺菌(Schizochytrium)，但不限制於裂殖壺菌(Schizochytrium)，(如a破囊壺菌(thraustochytrid)或另一生物體，尤其是另一真核生物體)，其會產生PUFA，經由PUFA合成酶酵素(PUFA PKS系統)，或經由另一醯基鏈生合成系統，其會堆積高含量之PUFA於其PL與TAG中，將提供作為編碼這些酵素之基因之良好來源。
本發明人發現以FFA形式自PUFA合成酶釋放PUFA產物，代表在轉移該系統至異源性宿主方面之挑戰與機會，並提供實質上控制並增進異源性宿主生物體中PUFA之製造效率之機會。
於此解釋，長鏈PUFAs(LCPUFAs)通常不會以FFA形式作為“標準”或“典型”PUFA生合成路徑之一部分(定義如下)。事實上，生物體中將PUFA作為FFA，通常僅發生於當其為外生性供應時。例如，大腸桿菌，像大部分細菌一樣，不會合成PUFA。由這些生物體製造16與18個碳之飽和或單－未飽和脂肪酸，係於醯基載體蛋白(ACPs)上合成，經由第II型FAS系統。醯基－ACP作為PL形成酵素之受質。大腸桿菌能利用各種FFA作為外生性碳來源。這些FFA會轉換為醯基－CoA，在其進入PL或降解循環時。FadD基因係編碼大腸桿菌中唯一已知之ACoAS酵素，該基因之突變會導致生長之不穩定，在FFA作為唯一之碳來源時。
真核生物體一般會製造飽和脂肪酸(16與18個碳)，使用第I型脂肪酸合成酶(FAS)(或第II型FAS，在較高等植物中)。FAS系統之產物可以FFA(如動物FAS)，或以醯基－CoA(如黴菌FAS)形式釋放。在植物中，第II型FAS係位於色素體中。在這些情況下，16或18個碳之脂肪酸係經由第II型FAS製造，且通常形成單鍵，當脂肪酸連結至ACP上時。該醯基－ACP可作為形成色素體PL之受質。就這些最終由色素體輸出之脂肪酸而言(用於細胞質PL或TAG合成)，醯基－ACP硫酯酶會水解硫酯鍵，以釋放FFA。該FFA之後自色素體輸出，藉由細胞質ACoAS轉換為醯基－CoA。這些醯基－CoA可作為PL與TAG合成酵素之受質。
真核生物體中長鏈PUFAs(LCPUFAs)之“標準”或“典型”合成路徑，涉及中鏈長度之飽和或單－未飽和脂肪酸(如上述FAS系統之產物)之修飾。這些修飾係由碳鏈延長步驟與去飽和步驟組成。碳鏈延長反應之受質為脂肪基醯基－CoA(該脂肪酸鏈待延長)與丙二醯基－CoA(在每一次延長反應中加入二個碳之來源)。碳鏈延長酶反應之產物為脂肪基醯基－CoA，其在直鏈上具有二額外之碳。自由脂肪酸(FFAs)一般不會在此反應循環中發生。該去飽和酶會產生順式雙鍵於預存之脂肪酸鏈上，藉由在氧依賴型反應中減去2個氫而得。該去飽和酶之受質為醯基－CoA(在某些動物中)，或是脂肪酸，其可與甘油骨架酯化為PL(如磷酯醯膽鹼)。同樣地，FFAs並不會在此反應機制中產生。因此，在“標準”或“典型”LCPUFA合成路徑中，FFA出現的唯一機會為在脂肪酸自某些FAS系統釋放時。如上所述，一般為16或18個碳之脂肪酸，且通常不是飽和，就是單－未飽和脂肪酸，並非較長鏈之PUFA，如EPA或DHA。此長鏈PUFA製造流程之一結果為，路徑中之中間產物通常會堆積，這通常代表該系統產生之大部分新的脂肪酸。
因此，依據本發明，稱之為PUFA製造之“標準”或“典型”路徑，係指該脂肪酸合成路徑，其中中鏈長度之飽和脂肪酸(如上述脂肪酸合成酶(FAS)系統之產物)，係經由碳鏈延長反應與去飽和反應修飾。碳鏈延長反應之受質為脂肪基醯基－CoA(該脂肪酸鏈待延長)與丙二醯基－CoA(在每一次延長反應中加入二個碳之來源)。碳鏈延長酶反應之產物為脂肪基醯基－CoA，其在直鏈上具有二額外之碳。該去飽和酶會產生順式雙鍵於預存之脂肪酸鏈上，藉由在氧依賴型反應中減去2個氫而得。此路徑與涉及此路徑之基因為文獻上已知(請參照如先前技術一節)。
使用PUFA PKS(PUFA合成酶)之長鏈PUFAs合成路徑(如下所述)，非常不同於上述之“標準”路徑。該PUFA合成酶會利用丙二醯基－CoA作為碳來源，並製造最終之PUFA，而不會釋放明顯量之中間產物。可在合成過程中加入適當之順式雙鍵，使用不需要氧之機制。NADPH係在合成循環中使用作為還原劑。至少在破囊壺菌(thraustochytrid)PUFA PKS系統中，酵素係以FFA形式釋放PUFA，如同本發明人首度揭示者。此釋放機制為酵素本身之一部分。因此，以FFA形式自PUFA酵素系統釋放LCPUFA，為裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA PKS系統之獨特特徵，且似乎可為所有真核PUFA合成酶系統之特徵，如破囊壺菌(thraustochytrid)s。
因此，本發明人係假設，當表現PUFA PKS系統(PUFA合成酶系統)於異源性宿主(如不會內生性製造特定PUFA PKS系統之宿主生物體)中時，在希望之部分或脂質分液中，PUFA之製造與堆積最佳化需考慮之一因素為，宿主內生性醯基－CoA合成酶(ACoAS)辨識引入系統之FFA產物，作為相對應醯基－CoA轉換之受質之能力。如上所述，由於大部分異源性宿主生物體中引入之PUFA PKS系統，僅會在其外生性提供時，以PUFA作為FFA，該宿主生物體並不具有最佳附屬蛋白，可取而代之控制FFA，其可存在一抑制因子於最佳PUFA製造與堆積中，在希望之脂質分液，或宿主生物體之部分中。例如，已知有數家族之蛋白質具有ACoAS活性，且這些酵素之FFA受質傾向性皆具特異性。因此，存在於某些有潛力之宿主中之ACoAS，並不會轉移長鏈PUFA FFA至醯基－CoA，尤其是於一般不會有FFA形式之PUFA之宿主中。此外，宿主生物體可能不會有形成PL與TAG，並可利用PUFA－CoA作為受質之最佳醯基轉移酶。最後，甚至在內生性製造PUFA PKS系統之宿主生物體中，本發明人亦相信可經由基因修飾該生物體，使用上述討論之修飾方法，增進該生物體中油類與油類分液之PUFA堆積。
上述本發明人之發現與路徑，提供了數個原則或策略，於異源性(或原始)生物體中製造PUFAs，藉由表現PUFA合成酶：1.基因最佳化 需要最佳化基因序列以匹配(match)異源性宿主中之序列，以使蛋白質表現。此以下列範例說明，其中編碼來自裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA PKS系統之蛋白質之基因，係經細菌宿主及酵母菌中密碼子使用率最佳化。最適用於細菌中之基因，亦發現可用於植物中裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA PKS之表現。這些最佳化基因之細節係如下所述。
2.PPTase之表現 本發明人測定大腸桿菌、酵母菌與植物中存在之內生性PPTases，無法活化PUFA合成酶ACP區塊。本發明人已於先前定義出適當之替代PPTase，來自Nostoc之Het I(描述於美國專利申請案公開號20020194641)，其可使用於其內生性PPTases不會活化PUFA合成酶ACP區塊之宿主中。其他適用之PPTases亦經描述，且可立即獲得。使用PPTases於各種異源性宿主細胞係如下描述與示範。
3.FAS受質流通量/抑制之修飾 PUFA合成酶利用丙二醯基－CoA作為碳鏈延長反應中碳之來源。丙二醯基－CoA亦被FAS、細胞質脂肪酸延長反應，與其他酵素(如查爾酮(chalcone)合成酶)使用。該PUFA合成酶會與其他丙二醯基－CoA酵素系統競爭。此代表經由PUFA合成酶增進流通量之一方法，會增強其穩定性，以與丙二醯基－CoA匯集物競爭。有許多可能方法可達到與此受質競爭之能力。這些包括，但不侷限於，1)競爭路徑之抑制，包括FAS路徑上任一元素之抑制，如降低涉及這些路徑之酵素或次單元之表現量(如藉由使用反義股RNA、RNAi、共抑制或突變)，2)於異源性宿主中表現PUFA合成酶，其中競爭路徑已降低或阻斷(如在卡諾拉油菜籽(Canola)中，其細胞質中延長脂肪酸之能力已被阻斷)，及/或3)藉由增加丙二醯基－CoA匯集物(如藉由表現乙醯基－CoA羧酸酶)。此策略範例係於下個範例中更詳細描述與說明。
4.醯基－CoA合成酶之表現 裂殖壺菌(Schizochytrium)中存在之酵素，可有效地轉換PUFA合成酶之自由脂肪酸產物為醯基－CoA。存在於異源性宿主中之酵素，並不會在這些反應中以類似之效率進行，由於這些自由脂肪酸一般不會在這些生物體中產生。例如，醯基－CoA合成酶酵素，其可有效轉換各種PUFA合成酶之自由脂肪酸產物(如DHA、DPA n－6、EPA或其他產物)為醯基－CoA，於這些異源性宿主中之表現，會導致這些產物堆積能力增加。在此方面，裂殖壺菌(Schizochytrium)，或其他可經由PUFA合成酶路徑製造PUFA之生物體，可提供作為編碼這些酵素之基因之良好來源(請見下列描述與範例)。
5.醯基轉移酶與相關酵素之表現 存在於裂殖壺菌(Schizochytrium)中之酵素，可有效地利用醯基－CoA形式之PUFA合成酶產物，以合成PL與TAG分子。存在於異源性宿主中之酵素並不會在這些反應中以類似效率進行，由於這些自由脂肪酸一般不會在這些生物體中產生。例如，PL或TAG合成酵素，其可有效整合各種PUFA合成酶之醯基CoA產物(如DHA、DPA n－6、EPA或其他產物)，為PL或TAG分子，於這些異源性宿主中之表現，會導致這些產物堆積能力之增加。在此方面，裂殖壺菌(Schizochytrium)，或其他可經由PUFA合成酶路徑製造PUFA之生物體，可提供作為編碼這些酵素之基因之良好來源(請見下列描述與範例)。
6.胞器－特異性之表現 可利用其他方法增加異源性宿主中PUFA之堆積量或改變其分佈。作為一範例，可於宿主不同部分中表現PUFA合成酶系統，因而取得個別之丙二醯基－CoA匯集物者，可產生堆積增加(如於植物細胞之色素體與細胞質中)。此策略亦以下列範例示範。
因此，本發明係提供一種異源性宿主生物體中PUFA製造及/或堆積抑制之解決方案，亦提供一種獨特之機會，可控制並增強任一生物體中PUFA之製造，該生物體係使用PUFA PKS系統(不論是基因修飾或內生性)製造PUFA。特別的是，本發明係提供多種標的，為蛋白質形式，以及編碼此種蛋白質之核酸分子，該蛋白質可於經基因修飾以表現PUFA PKS系統以及其他基因修飾之生物體中表現，以及於此所述之策略，以強化或增加生物體中PUFA之製造及/或堆積，尤其是在生物體中希望之部分或脂質分液中。此類標的於此一般可稱之為PUFA PKS系統之“附屬”標的。如此所述，該標的可為核酸分子，及/或其編碼之蛋白質，於此所述之宿主生物體中表現或過度表現，以及剔除或失活之標的，或甚至為標的胞器(如目標為植物之色素體)。換句話說，一標的可為加至PUFA PKS系統之元素，或製造PUFA之酵素系統之修飾，尤其是，其中該標的係經定義，可用於增加或增進宿主生物體中脂肪酸之製造及/或堆積。
PUFA PKS系統(PUFA合成酶)
因此，本發明係相關於一種附屬蛋白與其他標的，用於與PUFA PKS系統相連結。使用於此，PUFA PKS系統(其亦可稱之為PUFA合成酶系統或PUFA合成酶)一般具有下列特徵：(1)可製造PUFA，尤其是長鏈PUFA，為該系統之天然產物；以及(2)包含數種多功能性蛋白質，組合為複合體，可同時 產生脂肪酸鏈迭代與非迭代過程，包括反式－順式異構物化與烯酯還原反應，於選定之循環中。此外，PUFA合成酶酵素中存在之ACP區塊需要藉由連結一輔酶(4－磷酸泛醯巰基)而活化。此輔酶之連結係以磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)達成。若宿主生物體中之內生性PPTase無法活化該PUFA合成酶ACP區塊，則它必須提供一PPTase，其可執行該功能。本發明人已辨識出Nostoc sp.之Het I酵素可作為一示範性且適當之PPTase，用以活化該PUFA合成酶ACP區塊。PUFA PKS系統或PUFA合成酶，係通稱所有的基因及其編碼之產物，其以複合體方式發揮功能，在生物體中製造PUFA。因此，該PUFA PKS系統特別指一PKS系統，其自然產物為PUFA。
更特別的是，於此稱之為PUFA PKS系統者，會製造聚不飽和脂肪酸(PUFAs)，尤其是長鏈PUFAs(LCPUFAs)為產物。例如，內生性(自然地)含有PUFA PKS系統之生物體會使用此系統製造PUFA。依據本發明，PUFA為具有至少16個碳鏈長度之脂肪酸，更佳為至少18個碳，較佳為至少20個碳，尤佳為22或更多個碳，具有至少3或更多個雙鍵，較佳為4個或更多，更佳為5個或更多，尤佳為6個或更多雙鍵，其中所有雙鍵皆位於順式結構中。於此稱為長鏈聚不飽和脂肪酸(LCPUFAs)者，特別指具有18個或更多個碳原子之鏈長度之脂肪酸，較佳為20與更多個碳鏈長度，含有3或更多個雙鍵。omega－6系列之LCPUFA包括：γ－次亞麻油酸(C18：3)、二高－γ－次亞麻油酸(C20：3n－6)、花生四烯酸(C20：4n－6)、adrenic acid(亦稱之為二十二碳四烯酸或DTA)(C22：4n－6)，以及二十二碳五烯酸(C22：5n－6)。omega－3系列之LCPUFA：α－次亞麻油酸(C18：3)、二十碳三烯酸(C20：3n－3)、二十碳四烯酸(C20：4n－3)、二十碳五烯酸(C20：5n－3)、二十二碳五烯酸(C22：5n－3)，以及二十二碳六烯酸(C22：6n－3)。該LCPUFAs亦包括具有大於22個碳與4或更多個雙鍵之脂肪酸，包括，但不侷限於，C28：8(n－3)。
本發明之PUFA PKS系統亦包含數個多功能之蛋白質(且可包括單一功能蛋白質，尤其是來自海洋細菌之PUFA PKS系統)，其可組合為一複合體，可同時 引導脂肪酸鏈迭代與非迭代過程，包括反式－順式異構物化與烯酯還原反應，於選定之循環中。這些蛋白質於此亦稱之為核心T PUFA PKS酵素複合體，或核心PUFA PKS系統。這些蛋白質內含之區塊與模體之一般功能皆為技術上已知，且已詳細描述各種來自海洋細菌與真核生物體之PUFA PKS系統(請見，如美國專利案號6,140,486；美國專利案號6,566,583；Metz et al.,Science 293：290－293(2001)；美國專利申請公開案號20020194641；美國專利申請公開案號20040235127；美國專利申請公開案號20050100995，以及PCT公開案號WO 2006/135866)。該區塊可為單一蛋白質(即，該區塊與蛋白質為同義)，或在一單一蛋白質上有二或更多(多重)區塊，如上所述。
來自海洋細菌與破囊壺菌(thraustochytrium)成員之各種PUFA PKS系統區塊架構，以及包含此PUFA PKS系統之基因與蛋白質之結構與功能特性，已詳細描述(請見如美國專利號6,140,486；美國專利號6,566,583；Metz et al.,Science 293：290－293(2001)；美國專利申請公開案號20020194641；美國專利申請公開案號20040235127；美國專利申請公開案號20050100995，以及PCT公開號WO 2006/135866)。
可使用於本發明之PUFA PKS系統與其蛋白質或區塊，包括細菌性與非細菌性PUFA PKS系統。非細菌性PUFA PKS系統為來自或衍生自非細菌之生物體，如真核生物或古生菌，之PUFA PKS系統。真核生物與原核生物之分別為細胞分化之程度，真核生物較原核生物更進一步分化。一般而言，原核生物不具有核膜，在細胞分裂時無有絲分裂現象，僅具有一個染色體，在細胞質中含有70S核醣體，不具有粒線體、內質網、葉綠體、溶小體或高基氏體，且可具有鞭毛，若存在的話，則具含有單一纖絲。相反地，真核生物則具有核膜，在細胞分裂時有有絲分裂現象，有許多染色體，在細胞質中含有80S核醣體，具有粒線體、內質網、葉綠體(海藻中)、溶小體或高基氏體，可具有鞭毛，若存在的話，則具含有許多纖絲。一般而言，細菌為原核生物，而海藻、黴菌、單細胞生物、原生動物與較高等植物為真核生物。依據本發明，可產生經基因修飾之植物，其具有非細菌性PUFA PKS功能性區塊、細菌性PUFA PKS功能性區塊，以及來自其他PKS系統(第I型迭代式或模塊式、第II型或第III型)之PKS功能性區塊或蛋白質，或FAS系統。
較佳為，本發明之PUFA PKS系統包含至少下列具生物活性之區塊，其一般含有三或更多個蛋白質：(a)至少一烯酯－ACP還原酶(ER)區塊；(b)多重醯基載體蛋白質(ACP)區塊(如至少一至四，較佳至少五個ACP區塊，在某些實施例中，至多六、七、八、九、十，或大於十個ACP區塊)；(c)至少二β－酮基醯基－ACP合成酶(KS)區塊；(d)至少一醯基轉移酶(AT)區塊；(e)至少一β－酮基醯基－ACP還原酶(KR)區塊；(f)至少二FabA－類似－β－羥基醯基－ACP脫氫酶(DH)區塊；(g)至少一鏈長度因子(CLF)區塊；(h)至少一丙二醯基－CoA：ACP醯基轉移酶(MAT)區塊。在一實施例中，本發明之一PUFA PKS系統亦包含至少一含有脫氫酶(DH)保守活性位置之區域。
在一較佳實施例中，PUFA PKS系統包含至少下列具生物活性區塊：(a)至少一烯酯－ACP還原酶(ER)區塊；(b)至少五醯基載體蛋白質(ACP)區塊；(c)至少二β－酮基醯基－ACP合成酶(KS)區塊；(d)至少一醯基轉移酶(AT)區塊；(e)至少一β－酮基醯基－ACP還原酶(KR)區塊；(f)至少二FabA－類似β－羥基醯基－ACP脫氫酶(DH)區塊；(g)至少一鏈長度因子(CLF)區塊；以及(h)至少一丙二醯基－CoA：ACP醯基轉移酶(MAT)區塊。在一實施例中，本發明之PUFA PKS系統亦包含至少一區域或區塊含有一脫氫酶(DH)保守活性位置模體，其並非FabA－類似DH區塊之一部分。這些區塊每一者之結構與功能特性，皆詳細描述於美國專利申請案公開號20020194641；美國專利申請案公開號20040235127；美國專利申請案公開號20050100995；以及PCT公開號WO 2006/135866。
依據本發明，具有3－酮基醯基－ACP合成酶(KS)生物活性(功能)之區塊或蛋白質之特徵為該酵素會進行FAS(與PKS)碳鏈延長反應循環之起始步驟。術語“β－酮基醯基－ACP合成酶”可與“3－酮基醯基－ACP合成酶”、“β－酮基醯基－ACP合成酶”，以及“酮基－醯基ACP合成酶”，及其類似衍生詞互相交換使用。待延長之醯基係藉由硫酯鍵連結至酵素活性位置之一半胱胺酸殘基上。在多步驟反應中，醯基－酵素係與丙二醯基－ACP進行縮合反應，形成－酮基醯基－ACP、CO2 與自由酵素。KS在碳鏈延長循環中扮演重要角色，且在許多系統中顯示具有較大之受質特異性，與該反應循環中之其他酵素相較。例如，大腸桿菌具有三個獨特之KS酵素－每一者皆在該生物體中具有特定功能(Magnuson et al.,Microbiol.Rev.57,522(1993))。海洋細菌與破囊壺菌(thraustochytrid)中PUFA－PKS系統之二KS區塊，在PUFA生合成反應順序上扮演獨特的角色。作為某一類之酵素，KS已經完整鑑定。許多已辨識出之KS基因之序列為已知，該活性位置模體已辨識出，且其中數種已解出其結晶結構。蛋白質(或蛋白質區塊)可立即辨識出，屬於KS家族酵素，與已知之KS序列具有相似性。
依據本發明，具有丙二醯基－CoA：ACP醯基轉移酶(MAT)生物活性(功能)之區塊或蛋白質之特性為，其可自丙二醯基－CoA上轉移丙二醯基片段至ACP。術語“丙二醯基－CoA：ACP醯基轉移酶”可與“丙二醯基醯基轉移酶”，及類似衍生詞互相交換使用。除了該活性位置模體(GxSxG)之外，這些酵素在關鍵位置上具有一延長之R與Q胺基酸模體，使其被辨識為MAT酵素(如相對於下列之AT區塊)。在某些PKS系統(但非PUFA PKS區塊)中，MAT區塊並不傾向於載入甲基－或乙基－丙二酸酯於ACP基團上(自相對應之CoA酯)，因此引入分支至直線碳鏈上。MAT區塊之特徵為其與已知之MAT序列及其延伸之模體結構之相似度。
依據本發明，具有醯基載體蛋白質(ACP)生物活性(功能)之區塊或蛋白質特徵為其為小型多胜肽(一般而言，80至100個胺基酸)，其功能係作為成長脂肪基醯基鏈時之載體，該鏈成長經由硫酯鍵連結至共價性結合之蛋白質與輔酶。它們發生於不同之單元或較大蛋白質之區塊中。ACP係自未活化之不完全(apo)－形式轉換為功能性完全(holo)－形式，藉由轉移CoA上之磷酸泛醯巰基片段至ACP上之高度保守絲胺酸殘基。醯基基團係連結至ACP上，藉由於磷酸泛醯巰基片段之自由終端之硫酯鍵連結。ACP係以標記有放射活性之泛醯巰基，以及與已知ACP之序列相似性而辨識出。上述模體(LGIDS＊ )變化之存在亦為ACP之一特徵。
依據本發明，具有酮基還原酶活性，亦稱之為3－酮基醯基－ACP還原酶(KR)生物活性(功能)，之區塊或蛋白質特徵為，可催化3－酮基醯基形式之ACP之吡啶－核苷酸－依賴型還原。此為脂肪酸重新生合成延長循環之第一還原步驟，以及通常於聚酮生合成中進行之反應。術語“β－酮基醯基－ACP還原酶”可與術語“酮基還原酶”、“3－酮基醯基－ACP還原酶”、“酮基－醯基ACP還原酶”及該術語之類似衍生詞，互相交換使用。明顯之序列類似度係觀察自烯酯ACP還原酶家族(ER)；其他FAS還原酶(但非出現於PUFA PKS系統之ER家族)，以及短鏈酒精脫氫酶家族。上述之PUFA PKS區域之Pfam分析透露出其與短鏈酒精脫氫酶家族核心區域之相似性。相同區域之Blast分析則與已知之KR酵素核心區域匹配，並有一延伸區域與其他已鑑定之PUFA PKS系統區塊具有相似性。
依據本發明，該區塊或蛋白質係可作為一鏈長度因子(CLF)，依據下列邏輯。CLF原本描述之特徵為第II型(分離酵素)PKS系統，且假設在延長循環次數上扮演重要角色，因而在最終產物鏈長度上相當重要。CLF胺基酸序列顯示與KS區塊具相似性(被認為與KS蛋白質形成異體二合物)，但缺乏活性位置半胱胺酸。CLF在PKS系統中之角色是有爭議的。新的證據(C.Bisang et al.,Nature401 ,502(1999))顯示在PKS系統之啟動(priming)(提供待延長之醯基基團)上扮演重要角色。在此角色中，CLF區塊被認為是脫羧基丙二酸酯(為丙二醯基－ACP)，因此形成可轉移至KS活性位置之醋酸鹽基團。因此，此醋酸鹽可作為‘啟動(priming)’分子，其可進行起始延長(縮合)反應。第II型CLF之類似性已被辨識為某些模塊式PKS系統之‘載入’區塊。具有CLF序列特徵之區塊在所有最近辨識出之PUFA PKS系統皆發現到，且在每一情況下，皆發現為多區塊蛋白質之一部分。
“醯基轉移酶”或“AT”係指一般類型之酵素，其可進行數種獨特之醯基轉移反應。術語“醯基轉移酶”可與術語“醯基轉移酶”互相交換使用。PUFA PKS系統中辨識出之AT區塊與另一者，以及所有最近檢視出之其他PUFA PKS系統之區塊顯示良好之相似性，並與某些醯基轉移酶顯示較差之相似性，該轉移酶之功能已經辨識(如丙二醯基－CoA：ACP醯基轉移酶，MAT)。雖然與MAT相似性較差，AT區塊並不被為可作為MAT，由於其不具有此類酵素之延伸模體結構(請見上述有關MAT區塊之描述)。就本發明目的，PUFAPKS系統中AT區塊之可能功能包括，但不侷限於：脂肪基醯基基團自ORFA ACP區塊轉移至水上(即以自由脂肪酸形式進行脂肪基醯基之硫酯鍵－釋放)、將脂肪基醯基轉移至接受者如CoA上、將醯基在各ACP區塊間轉移，或將脂肪基醯基轉移至親脂性受器分子上(如至溶血磷酸上)。
依據本發明，此區塊具有烯酯還原酶(ER)生物活性。該ER酵素會還原脂肪基醯基－ACP上之反式雙鍵(由DH活性引入)，使這些碳鏈完全飽和。PUFA－PKS中之ER區塊，顯示與最近新發現之ER酵素家族具有相似性(Heath et al.,Nature406 ,145(2000))。Heath與Rock發現此新類型之ER酵素，藉由選殖肺炎雙球菌(Streptococcus pneumoniae)中有興趣之基因、純化由該基因表現之蛋白質，並顯示出其在體外試驗中具有ER活性。目前所有新發現之PUFA PKS系統皆含有至少一區塊，與裂殖壺菌(Schizochytrium)ER區塊具有非常高之相似性，其顯示與肺炎雙球菌ER蛋白質具相似性。
依據本發明，具有脫水酶或脫水酶(DH)蛋白質或區塊會催化一脫水反應。使用於此，具有DH活性一般係指具有FabA－類似β－羥基醯基－ACP脫水酶(DH)生物活性。FabA－類似β－羥基醯基－ACP脫水酶(DH)生物活性會自β－酮基醯基－ACP移除HOH，一開始會在碳鏈上製造出一反式雙鍵。術語“FabA－類似β－羥基醯基－ACP脫水酶”可與術語“FabA－類似β－羥基醯基－ACP脫水酶”、“β－羥基醯基－ACP脫水酶”、“脫水酶”及類似衍生術語交換使用。PUFA PKS系統之DH區塊顯示與具有FAS系統(而非其他PKS系統之DH區塊)之細菌DH酵素具有相似性。次族群之細菌DH中，該FabA－類似DH具有順式－反式異構酶活性(Heath et al.,J.Biol.Chem.,271,27795(1996))。與FabA－類似DH蛋白質之相似性，代表此述之一或所有DH區塊對應於PUFA PKS產物順式雙鍵之插入。
用於本發明之PUFA PKS蛋白質亦具有脫水酶之活性，並未鑑定為FabA－類似(如上述與FabA－類似活性相關之順式－反式活性)，於此一般稱之為非－FabA－類似DH活性，或非－FabA－類似β－羥基醯基－ACP脫水酶(DH)生物活性。更特別的是，保守活性位置模體(~13胺基酸長：L＊ xxHxxxGxxxxP；如SEQ ID NO：70胺基酸2504－2516所示；＊ 在該模體中，L可為I)係於PKS系統之脫水酶區塊中發現(Donadio S,Katz L.Gene.1992 Feb 1；111(1)：51－60)。此保守模體，亦稱之為脫水酶(DH)保守活性位置模體或DH模體，係發現於所有目前已知PUFA－PKS序列之類似區域中，但一般認為，其模體最近才被偵測到。此保守模體係位於PUFA－PKS序列中高度相似之尚未辨識區域中。假設經由PUFA－PKS之PUFA生合成需要非－FabA類似之脫水反應，而此模體則可用於該反應。
用於說明目的，數種PUFA PKS系統之架構係於下詳述。然而，應瞭解到本發明並非限制這些PUFA PKS系統之使用。
裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA PKS系統
在一實施例中，來自裂殖壺菌(Schizochytrium)之PUFA PKS系統包含至少下列生物活性區塊：(a)二烯酯－ACP還原酶(ER)區塊；(b)5至10個或更多之醯基載體蛋白質(ACP)區塊，且在一觀點中，9個ACP區塊；(c)二β－酮基醯基－ACP合成酶(KS)區塊；(d)一醯基轉移酶(AT)區塊；(e)一β－酮基醯基－ACP還原酶(KR)區塊；(f)二FabA－類似β－羥基醯基－ACP脫水酶(DH)區塊；(g)一碳鏈長度因子(CLF)區塊；以及(h)一丙二醯基－CoA：ACP醯基轉移酶(MAT)區塊。在一實施例中，本發明之裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA PKS系統亦包含至少一區域或區塊，含有一脫水酶(DH)保守活性位置模體，其並非FabA－類似DH區塊之一部分。這些區塊之結構與功能性特徵分別為技術上已知(請見如美國專利號6,566,583；Metz et al.,Science 293：290－293(2001)；美國專利申請案公開號20020194641；以及PCT公開號WO 2006/135866)。
先前已描述有三個開放閱讀框架(open reading frames)會形成裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA PKS系統。每一開放閱讀框架(open reading frame)之區塊架構如下。
裂殖壺菌(Schizochytrium)開放閱讀框架(open reading frame)A(OrfA) ：OrfA之完整核苷酸序列於此係描述為SEQ ID NO：1。OrfA為8730個核苷酸序列(不包括終止密碼子)，其編碼2910個胺基酸序列，於此為SEQ ID NO：2。在OrfA中有12個區塊：(a)一β－酮基醯基－ACP合成酶(KS)區塊；(b)一丙二醯基－CoA：ACP醯基轉移酶(MAT)區塊；(c)9個醯基載體蛋白質(ACP)區塊；以及(d)一個酮基還原酶(KR)區塊。編碼OrfA之基因體DNA複製株(質體)，來自裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.ATCC 20888與其子株ATCC 20888，命名為裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.N230D株，係分離出並定序。
於此所述之基因體複製株為JK1126，分離自裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.ATCC 20888，包含，就本發明人所知，SEQ ID NO：1位置1至8730之核苷酸序列，並編碼SEQ ID NO：2所對應之胺基酸序列。基因體複製株pJK1126(命名為pJK1126 OrfA基因體複製株，為大腸桿菌質體載體形式，含有裂殖壺菌(Schizochytrium)ATCC 20888之“OrfA”基因)，係寄存於美國菌種中心(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110－2209 USA，於2006年6月8日，ATCC取得號為PTA－7648。本發明包含pJK1126 OrfA基因體複製株之核苷酸序列，以及由此質體編碼之胺基酸序列。
於此描述之二基因體為pJK306 OrfA基因體複製株與pJK320 OrfA基因體複製株，分離自裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.N230D，共同包含(重疊複製株)，就本發明人所知，SEQ ID NO：1之核苷酸序列，以及其所編碼之SEQ ID NO：2胺基酸序列。基因體複製株pJK306(命名為pJK306 OrfA基因體複製株，為大腸桿菌質體形式，含有來自裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.N230D(與pJK320重疊2.2kB)OrfA基因之5'端部分)，係寄存於美國菌種中心(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110－2209 USA，於2006年6月8日，ATCC取得號為PTA－7641。本發明包含pJK306 OrfA基因體複製株之核苷酸序列，以及此質體編碼之胺基酸序列。基因體複製株pJK320(稱之為pJK320 OrfA基因體複製株，為大腸桿菌質體形式，含有來自裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.N230D(與pJK306重疊2.2kB)OrfA基因之3'端部分)，係寄存於美國菌種中心(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110－2209 USA，於2006年6月8日，ATCC取得號為No.PTA－7644。本發明包含pJK320 OrfA基因體複製株之核苷酸序列，以及此質體編碼之胺基酸序列。
OrfA之第一區塊為KS區塊，於此亦稱之為ORFA－KS，含有編碼此ORFA－KS區塊之序列之核苷酸序列為SEQ ID NO：7(SEQ ID NO：1之位置1－1500)。含有ORFA－KS區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：8(SEQ ID NO：2之位置1－500)。值得注意的是該ORFA－KS區塊含有一活性位置模體：DXAC＊ (＊ 醯基結合位置C215 )。同時，在裂殖壺菌(Schizochytrium)KS末端之一特徵模體，GFGG，出現於SEQ ID NO：2之此區塊中，因此亦存在於SEQ ID NO：8。
OrfA之第二區塊為MAT區塊，於此亦稱之為ORFA－MAT，含有編碼此ORFA－MAT區塊之序列之核苷酸序列為SEQ ID NO：9(SEQ ID NO：1之位置1723－3000)。含有ORFA－MAT區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：10(SEQ ID NO：2之位置575－1000)。該MAT區塊包含一天門冬胺酸於位置93，以及一組胺酸於位置94(分別對應於SEQ ID NO：2之位置667與668)。值得注意的是，ORFA－MAT區塊含有一活性位置模體：GHS＊ XG(＊ 醯基結合位置S706 )，於此為SEQ ID NO：11。
OrfA之區塊3－11為9個重複之ACP區塊，於此亦稱之為ORFA－ACP(該序列中之第一區塊為ORFA－ACP1、第二區塊為ORFA－ACP2、第三區塊為ORFA－ACP3等)。該第一ACP區塊，ORFA－ACP1，係位於SEQ ID NO：1(OrfA)之位置約3343至約3600之核苷酸序列內。含有編碼此ORFA－ACP1區塊之序列之核苷酸序列為SEQ ID NO：12(SEQ ID NO：1之位置3343－3600)。含有第一ACP區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：2之位置約1115至約位置1200。含有ORFA－ACP1區塊之胺基酸序列於此係為SEQ ID NO：13(SEQ ID NO：2位置1115－1200)。值得注意的是ORFA－ACP1區塊含有一活性位置模體：LGIDS＊ (＊ 泛醯巰基結合模體S1157 )，於此為SEQ ID NO：14。
所有9個ACP區塊之核苷酸與胺基酸序列皆為高度保守，因此，每一區塊之序列並非由個別序列辨識子(identifier)代表。然而，基於此述之資訊，熟習此技術領域者可立即決定含有其他8個ACP區塊任一個之序列。所有9個ACP共同橫越SEQ ID NO：1約位置3283至約位置6288之區域，其對應於SEQ ID NO：2之胺基酸位置約1095至約2096。含有所有9個區塊之完整ACP區域之核苷酸序列於此係以SEQ ID NO：16代表。由SEQ ID NO：16代表之區域包括各ACP區塊間之聯結片段。9個區塊間之重複間隔約為SEQ ID NO：16每330個核苷酸(鄰近活性位置絲胺酸之實際胺基酸數目為104至116個胺基酸)。9個ACP區塊之每一者皆含有一泛醯巰基結合模體LGIDS＊ (於此以SEQ ID NO：14代表)，其中S＊ 為泛醯巰基結合位置絲胺酸(S)。泛醯巰基結合位置絲胺酸(S)係位於接近每一ACP區塊序列中心處。在ACP區塊區域之每一末端與介於每一ACP區塊之間為一富含脯胺酸(P)與丙胺酸(A)之區域，其一般認為為一聯結區域。例如，介於ACP區塊1與2之間為序列：APAPVKAAAPAAPVASAPAPA，於此以SEQ ID NO：15代表。9個ACP區塊每一者之活性位置絲胺酸殘基位置(即，該泛醯巰基結合位置)，就SEQ ID NO：2胺基酸序列而言，如下：ACP1＝S1157 ；ACP2＝S1266 ；ACP3＝S1377 ；ACP4＝S1488 ；ACP5＝S1604 ；ACP6＝S1715 ；ACP7＝S1819 ；ACP8＝S1930 ；以及ACP9＝S2034 。ACP區塊之平均大小為約85胺基酸，除了聯結基之外，約110胺基酸包含於聯結基中，活性位置絲胺酸約在該區塊之中心，熟習此技術領域者可立即決定OrfA中9個ACP區塊之每一者。
OrfA之區塊12為一KR區塊，於此亦稱之為ORFA－KR，含有編碼此ORFA－KR區塊之序列之核苷酸序列為SEQ ID NO：17(SEQ ID NO：1之位置6598－8730)。含有ORFA－KR區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：18(SEQ ID NO：2位置2200－2910)。在KR區塊中為一核心區域，與短鏈醛類－脫氫酶具有相似性(KR為此家族之一成員)。此核心區域橫越SEQ ID NO：1之約位置7198至約位置7500，其對應於SEQ ID NO：2胺基酸位置2400－2500。
裂殖壺菌(Schizochytrium)開放閱讀框架(open reading frame)B(OrfB) ：OrfB之完整核苷酸序列於此係描述為SEQ ID NO：3。OrfB為6177個核苷酸序列(不包括終止密碼子)，其編碼2059個胺基酸序列，於此為SEQ ID NO：4。OrfB有4個區塊：(a)一酮基醯基－ACP合成酶(KS)區塊；(b)一鏈長度因子(CLF)區塊；(c)一醯基轉移酶(AT)區塊；以及(d)一烯酯ACP－還原酶(ER)區塊。
編碼來自裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.ATCC 20888與其子株ATCC 20888，命名為裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.，N230DOrfB株，之OrfB基因體DNA複製株(色素體)，係經分離與定序。
於此所述之基因體複製株為JK1129，分離自裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.ATCC 20888，包含，就本發明人所知，SEQ ID NO：3之核苷酸序列，並編碼SEQ ID NO：4所對應之胺基酸序列。基因體複製株pJK1129(稱之為pJK1129 OrfB基因體複製株，為大腸桿菌質體載體形式，含有裂殖壺菌(Schizochytrium)ATCC 20888之“OrfB”基因)，係寄存於美國菌種中心(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110－2209 USA，於2006年6月8日，ATCC取得號為PTA－7649。本發明包含pJK1126 OrfB基因體複製株之核苷酸序列，以及由此質體編碼之胺基酸序列。
於此描述之基因體複製株為pJK324 OrfB基因體複製株，分離自裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.N230D，包含就本發明人所知，SEQ ID NO：3之核苷酸序列，以及其所編碼之SEQ ID NO：4胺基酸序列。基因體複製株pJK324(命名為pJK324 OrfB基因體複製株，為大腸桿菌質體形式，含有來自裂殖壺菌(Schizochytrium)N230D OrfB基因)，係寄存於美國菌種中心(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110－2209 USA，於2006年6月8日，ATCC取得號為PTA－7643。本發明包含pJK324 OrfB基因體複製株之核苷酸序列，以及此質體編碼之胺基酸序列。
OrfB之第一區塊為KS區塊，於此亦稱之為ORFB－KS，含有編碼此ORFB－KS區塊之序列之核苷酸序列為SEQ ID NO：19(SEQ ID NO：3之位置1－1350)。含有ORFB－KS區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：20(SEQ ID NO：4之位置1－450)。此KS區塊包含一纈胺酸於SEQ ID NO：20位置371(亦在SEQ ID NO：20之位置371)。值得注意的是該ORFB－KS區塊含有一活性位置模體：DXAC＊ (＊ 醯基結合位置C196 )。同時，在裂殖壺菌(Schizochytrium)KS末端之一特徵模體，GFGG，出現於SEQ ID NO：4之此區塊中，因此亦存在於SEQ ID NO：20。
OrfB之第二區塊為CLF區塊，於此亦稱之為ORFB－CLF，含有編碼此ORFB－CLF區塊之序列之核苷酸序列為SEQ ID NO：21(SEQ ID NO：3之位置1378－2700)。含有ORFB－CLF區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：22(SEQ ID NO：4之位置460－900)。值得注意的是，ORFB－CLF區塊含有KS活性位置模體，不含醯基－結合半胱胺酸。
OrfB之第三區塊為AT區塊，於此亦稱之為ORFB－AT，含有編碼此ORFB－AT區塊之序列之核苷酸序列為SEQ ID NO：23(SEQ ID NO：3之位置2701－4200)。含有ORFB－AT區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：24(SEQ ID NO：4之位置901－1400)。值得注意的是，ORFB－AT區塊含有一活性位置模體：GxS＊ xG(＊ 醯基結合位置S1140 )，其特徵為醯基轉移酶(AT)蛋白質。
OrfB之第四區塊為ER區塊，於此亦稱之為ORFB－ER，含有編碼此ORFB－ER區塊之序列之核苷酸序列為SEQ ID NO：25(SEQ ID NO：3之位置4648－6177)。含有ORFB－ER區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：26(SEQ ID NO：4之位置1550－2059)。
裂殖壺菌(Schizochvtrium)開放閱讀框架(open reading frame)C(OrfC) ：OrfC之完整核苷酸序列於此係描述為SEQ ID NO：5。OrfC為4506個核苷酸序列(不包括終止密碼子)，其編碼1502個胺基酸序列，於此為SEQ ID NO：6。在OrfC中有3個區塊：(a)二FabA－類似－羥基醯基－ACP脫水酶(DH)區塊；以及(b)一烯酯ACP－還原酶(ER)區塊。
編碼來自裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.ATCC 20888與其子株ATCC 20888，命名為裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.，N230DOrfB株，之OrfC基因體DNA複製株(質體)，係經分離與定序。
於此所述之基因體複製株為pJK1131，分離自裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.ATCC 20888，包含，就本發明人所知，SEQ ID NO：5之核苷酸序列，並編碼SEQ ID NO：6所對應之胺基酸序列。基因體複製株pJK1131(稱之為pJK1131 OrfC基因體複製株，為大腸桿菌質體載體形式，含有裂殖壺菌(Schizochytrium)ATCC 20888之“OrfC”基因)，係寄存於美國菌種中心(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110－2209 USA，於2006年6月8日，ATCC取得號為PTA－7650。本發明包含pJK1131 OrfC基因體複製株之核苷酸序列，以及由此質體編碼之胺基酸序列。
於此描述之基因體複製株為pBR002 OrfC基因體複製株，分離自裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.N230D，包含就本發明人所知，SEQ ID NO：5之核苷酸序列，以及其所編碼之SEQ ID NO：6胺基酸序列。基因體複製株pBR002(命名為pBR002 OrfC基因體複製株，為大腸桿菌質體形式，含有來自裂殖壺菌(Schizochytrium)N230D OrfB基因)，係寄存於美國菌種中心(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110－2209 USA，於2006年6月8日，ATCC取得號為PTA－7642。本發明包含pBR002 OrfC基因體複製株之核苷酸序列，以及此質體編碼之胺基酸序列。
OrfC之第一區塊為DH區塊，於此亦稱之為ORFC－DH1。此為OrfC中二DH區塊之一。因此於此命名為DH1。含有編碼此ORFC－DH 1區塊之序列之核苷酸序列為SEQ ID NO：27(SEQ ID NO：5之位置1－1350)。含有ORFC－DH1區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：28(SEQ ID NO：6之位置1－450)。
OrfC之第二區塊為DH區塊，於此亦稱之為ORFC－DH2。此為OrfC中二DH區塊之一。因此於此命名為DH2。含有編碼此ORFC－DH 2區塊之序列之核苷酸序列為SEQ ID NO：29(SEQ ID NO：5之位置1351－2847)。含有ORFC－DH2區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：30(SEQ ID NO：6之位置451－949)。此DH區塊包含胺基酸H－G－I－A－N－P－T－F－V－H－A－P－G－K－I(SEQ ID NO：6之位置876－890)，於SEQ ID NO：30之位置426－440。
OrfC之第三區塊為ER區塊，於此亦稱之為ORFC－ER，含有編碼此ORFC－ER區塊之序列之核苷酸序列為SEQ ID NO：31(SEQ ID NO：5之位置2995－4506)。含有ORFC－ER區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：32(SEQ ID NO：6之位置999－1502)。
破囊壺菌(thraustochvtrium)之PUFA PKS系統
在一實施例中，破囊壺菌(thraustochytrium)PUFA PKS系統包含至少下列生物活性區塊：(a)二烯酯－ACP還原酶(ER)區塊；(b)5至10個或更多之醯基載體蛋白質(ACP)區塊，且在一觀點中，8個ACP區塊；(c)二β－酮基醯基－ACP合成酶(KS)區塊；(d)一醯基轉移酶(AT)區塊；(e)一β－酮基醯基－ACP還原酶(KR)區塊；(f)二FabA－類似β－羥基醯基－ACP脫水酶(DH)區塊；(g)一碳鏈長度因子(CLF)區塊；以及(h)一丙二醯基－CoA：ACP醯基轉移酶(MAT)區塊。在一實施例中，本發明之破囊壺菌(thraustochytrium)PUFA PKS系統亦包含至少一區域或區塊，含有一脫水酶(DH)保守活性位置模體，其並非FabA－類似DH區塊之一部分。這些區塊之結構與功能性特徵分別為技術上已知(請見，如美國專利申請案公開號2004035127，如上所述)。
先前已描述有三個開放閱讀框架(open reading frames)會形成核心破囊壺菌(thraustovhytrium)23B PUFA PKS系統。每一開放閱讀框架(open reading frame)之區塊架構如下。
破囊壺菌(thraustochytrium)23B開放閱讀框架(open reading frame)A(OrfA) ：Th.23B OrfA之完整核苷酸序列於此係描述為SEQ ID NO：38。Th.23B OrfA為8433個核苷酸序列(不包括終止密碼子)，其編碼2811個胺基酸序列，於此為SEQ ID NO：39。SEQ ID NO：38編碼下列Th.23B OrfA區塊：(a)一β－酮基醯基－ACP合成酶(KS)區塊；(b)一丙二醯基－CoA：ACP醯基轉移酶(MAT)區塊；(c)8個醯基載體蛋白質(ACP)區塊；以及(d)一β－酮基醯基－ACP還原酶(KR)區塊。
Th.23B OrfA之第一區塊為KS區塊，於此亦稱之為Th.23B OrfA－KS，包含於核苷酸序列SEQ ID NO：38之約位置1至約位置1500，於此以SEQ ID NO：40代表。含有Th.23B KS區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：39之一區域，橫越SEQ ID NO：39之約位置1至約位置500，於此以SEQ ID NO：41代表。SEQ ID NO：39之此區域與FabB(β－酮基醯基－ACP合成酶)，橫越SEQ ID NO：39之約位置1至約位置450(亦可為SEQ ID NO：41之約位置1至約位置450)，呈Pfam匹配。值得注意的是該Th.23B OrfA－KS區塊含有一活性位置模體：DXAC＊ (＊ 醯基結合位置C207 )。同時，在Th.23B KS區域末端之一特徵模體，GFGG，出現於SEQ ID NO：39之位置453－456(亦出現於SEQ ID NO：41之位置453－456)。
Th.23B OrfA之第二區塊為MAT區塊，於此亦稱之為Th.23B OrfA－MAT，包含於核苷酸序列SEQ ID NO：38之約位置1503至約位置3000，於此以SEQ ID NO：42代表。含有Th.23B MAT區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：39之一區域，橫越SEQ ID NO：39之約位置501至約位置1000，於此以SEQ ID NO：43代表。SEQ ID NO：39之此區域與FabD(丙二醯基－CoA：ACP醯基轉移酶)，橫越SEQ ID NO：39之約位置580至約位置900(亦可為SEQ ID NO：43之約位置80至約位置400)，呈Pfam匹配。值得注意的是該Th.23B OrfA－MAT區塊含有一活性位置模體：GHS＊ XG(＊ 醯基結合位置S697 )，以SEQ ID NO：39之位置695－699表示。
Th.23B OrfA之區塊3－10為8個重複之ACP區塊，於此亦稱之為Th.23 BOrfA－ACP(該序列中之第一區塊為OrfA－ACP1、第二區塊為OrfA－ACP2、第三區塊為OrfA－ACP3等)。第一Th.23 BACP區塊，Th.23 BOrfA－ACP1，係位於SEQ ID NO：38(OrfA)之位置約3205至約3555之核苷酸序列內，於此以SEQ ID NO：44代表。含有第一Th.23B ACP區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：39之一區域，橫跨SEQ ID NO：39之位置約1069至約位置1185，於此以SEQ ID NO：45表示。
Th.23 BOrfA之8個ACP區塊皆互相鄰近，且可以磷酸泛醯巰基結合位置模體，LGXDS＊ (以SEQ ID NO：46代表)位置之存在辨識出，其中該S＊ 為磷酸泛醯巰基聯結位置。該8個S＊ 位置之胺基酸位置，參照SEQ ID NO：39，分別為1128(ACP1)、1244(ACP2)、1360(ACP3)、1476(ACP4)、1592(ACP5)、1708(ACP6)、1824(ACP7)與1940(ACP8)。所有8個Th.23 BACP區塊之核苷酸與胺基酸序列皆為高度保守，因此，每一區塊之序列並非由個別序列辨識子(identifier)代表。然而，基於此述之資訊，熟習此技術領域者可立即決定SEQ ID NO：38與SEQ ID NO：39中含有其他8個ACP區塊任一個之序列。
所有8個ACP共同橫越SEQ ID NO：38約位置3205至約位置5994之區域，其對應於SEQ ID NO：39之胺基酸位置約1069至約1998。含有所有8個區塊之完整ACP區域之核苷酸序列於此係以SEQ ID NO：47代表。SEQ ID NO：47係編碼一胺基酸序列，於此以SEQ ID NO：48代表。SEQ ID NO：48包括各ACP區塊間之聯結片段。8個區塊間之重複間隔約為SEQ ID NO：48之每116個核苷酸，且每一區塊可視為由約活性位置模體中心之116個胺基酸組成(如上所述)。
Th.23B OrfA最後一個區塊為KR區塊，於此亦稱之為Th.23B OrfA－KR，其包含於核苷酸序列橫越SEQ ID NO：38之約位置6001至約位置8433，於此以SEQ ID NO：49代表。含有Th.23B KR區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：39之一區域，橫越SEQ ID NO：39約位置2001至約位置2811，於此係以SEQ ID NO：50代表。SEQ ID NO：39之此區域與FabG(β－酮基醯基－ACP還原酶)，橫越SEQ ID NO：39之位置2300至約2550(SEQ ID NO：5之位置300－550)，具有Pfam匹配。
破囊壺菌(thraustochytrium).23B開放閱讀框架(open reading frame)B(OrfB) ：Th.23B OrfB之完整核苷酸序列於此係描述為SEQ ID NO：51，其為一5805個核苷酸之序列(不包括終止密碼子)，其編碼1935個胺基酸序列，於此為SEQ ID NO：52。SEQ ID NO：51編碼下列Th.23B OrfB區塊：(a)一β－酮基醯基－ACP合成酶(KS)區塊；(b)一鏈長度因子(CLF)區塊；(c)一醯基轉移酶(AT)區塊；以及(d)一烯酯－ACP還原酶(ER)區塊。
Th.23B Orf B之第一區塊為KS區塊，於此亦稱之為Th.23B OrfB－KS，包含於核苷酸序列SEQ ID NO：51(Th.23B OrfB)之約位置1至約位置1500，於此以SEQ ID NO：53代表。含有Th.23B KS區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：52之一區域，橫越SEQ ID NO：52之約位置1至約位置500，於此以SEQ ID NO：54代表。SEQ ID NO：52之此區域與FabB(β－酮基醯基－ACP合成酶)，橫越約位置1至約450(SEQ ID NO：54之位置1－450)，具有Pfam匹配。值得注意的是該Th.23B OrfB－KS區塊含有一活性位置模體：DXAC＊ ，其中C＊ 為醯基結合位置，且C＊ 為於SEQ ID NO：52之位置201，以SEQ ID NO：39之位置695－699表示。同時，在KS區域末端之一特徵模體，GFGG，出現於SEQ ID NO：52之位置434－437。
Th.23B OrfB之第二區塊為CLF區塊，於此亦稱之為Th.23B OrfB－CLF，包含於核苷酸序列SEQ ID NO：51之約位置1501(OrfB)至約位置3000，於此以SEQ ID NO：55代表。含有CLF區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：52之一區域，橫越SEQ ID NO：52之約位置501至約位置1000，於此以SEQ ID NO：56代表。SEQ ID NO：52之此區域與FabB(β－酮基醯基－ACP合成酶)，橫越位置550至約位置910(SEQ ID NO：56之約位置50至約位置410)，呈Pfam匹配。雖然CLF與KS蛋白質具有相似性，但其缺乏活性位置半胱胺酸至KS蛋白質聯結之醯基上。
Th.23B OrfA之第三區塊為AT區塊，於此亦稱之為Th.23B OrfB－AT，包含於核苷酸序列SEQ ID NO：51(Th.23B OrfB)之約位置3001至約位置4500，於此以SEQ ID NO：58代表。含有Th.23B AT區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：52之一區域，橫越SEQ ID NO：52之約位置1001至約位置1500，於此以SEQ ID NO：58代表。SEQ ID NO：52之此區域與FabD(丙二醯基－CoA：ACP醯基轉移酶)，橫越約位置1100至約位置1375(亦可為SEQ ID NO：58之約位置100－375)，呈Pfam匹配。雖然PUFA合成酶之此AT區塊與MAT蛋白質具相似性，但其缺乏MAT之延伸模體(關鍵精胺酸與麩胺酸殘基)，且其被認為涉及丙二醯基－CoA之轉移。醯基轉移酶之GXS＊ XG模體係存在，其中S＊ 為醯基連結位置，且位於SEQ ID NO：52之位置1123。
Th.23B OrfA之第四區塊為ER區塊，於此亦稱之為Th.23B OrfB－ER，包含於核苷酸序列SEQ ID NO：51(OrfB)之約位置4501至約位置5805，於此以SEQ ID NO：59代表。含有Th.23B ER區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：52之一區域，橫越SEQ ID NO：52之約位置1501至約位置1935，於此以SEQ ID NO：60代表。SEQ ID NO：52之此區域與2－硝基丙烷二氧化酶相關之二氧化酶家族，橫越約位置1501至約位置1810(SEQ ID NO：60之位置1－310)，呈Pfam匹配。此作為ER之區塊可進一步預測，由於其與新發現之肺炎雙球菌(Streptococcus pneumoniae)ER酵素具有相似性。
破囊壺菌(thraustochytrium)23B開放閱讀框架(open reading frame)C(OrfC) ：Th.23B OrfC之完整核苷酸序列於此係描述為SEQ ID NO：61，其具有4410個核苷酸序列(不包括終止密碼子)，其編碼1470個胺基酸序列，於此係以SEQ ID NO：62代表。SEQ ID NO：61係編碼下列Th.23B OrfC區塊：(a)二FabA－類似β－羥基醯基－ACP脫水酶(DH)區塊，二者皆與FabA蛋白質(為一酵素，其會催化反式－2－十烯酯－ACP之合成，與此產物可逆異構化為順式－3－十烯酯－ACP)具有相似性；以及(b)一烯酯－ACP還原酶(ER)區塊，與裂殖壺菌(Schizochytrium)OrfB之ER區塊具高度相似性。
Th.23B OrfC之第一區塊為DH區塊，於此亦稱之為Th.23B OrfC－DH1，包含於核苷酸序列SEQ ID NO：61(OrfC)之約位置1至約位置1500，於此以SEQ ID NO：63代表。含有Th.23B DH1區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：62之一區域，橫越SEQ ID NO：62之約位置1至約位置500，於此以SEQ ID NO：64代表。SEQ ID NO：62之此區域與FabA，如上所述，橫越約位置275至約位置400(SEQ ID NO：64之約位置275－400)，呈Pfam匹配。
Th.23B OrfC之第二區塊亦為一DH區塊，於此亦稱之為Th.23B OrfC－DH2，包含於核苷酸序列SEQ ID NO：61(OrfC)之約位置1501至約位置3000，於此以SEQ ID NO：65代表。含有Th.23B DH2區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：62之一區域，橫越SEQ ID NO：62之約位置501至約位置1000，於此以SEQ ID NO：66代表。SEQ ID NO：62之此區域與FabA，如上所述，橫越約位置800至約位置925(SEQ ID NO：66之約位置300－425)，呈Pfam匹配。
Th.23B OrfC之第三區塊為ER區塊，於此亦稱之為Th.23B OrfC－ER，包含於核苷酸序列SEQ ID NO：61(OrfC)之約位置3001至約位置4410，於此以SEQ ID NO：67代表。含有Th.23B ER區塊之胺基酸序列為SEQ ID NO：62之一區域，橫越SEQ ID NO：62之約位置1001至約位置1470，於此以SEQ ID NO：68代表。SEQ ID NO：62之此區域與2－硝基丙烷二氧化酶相關之二氧化酶家族，如上所述，橫越約位置1025至約位置1320(SEQ ID NO：68之約位置25－320)，呈Pfam匹配。此作為ER之區塊可預測，由於其與新發現之肺炎雙球菌(Streptococcus pneumoniae)ER酵素具有相似性。
沙雷菌(Shewanella iaponica)PUFA PKS
有5個開放閱讀框架形成沙雷菌(Shewanella japonica)核心PUFA PKS系統與其PPTase，如先前所述。每一開放閱讀框架之區塊架構如下。
SEQ ID NO：69為沙雷菌(Shewanella japonica)黏粒(cosmid)3F3之核苷酸序列，並發現含有15個ORF。在此微生物體中與PUFA PKS系統相關之ORF特徵如下。
pfaA(SEQ ID NO：69之核苷酸10491－18854)係編碼PFASA(SEQ ID NO：70)，一種PUFA PKS蛋白質，具有下列區塊：β－酮基醯基－合成酶(KS)(SEQ ID NO：69核苷酸10575－12029、SEQ ID NO：70胺基酸29－513)；丙二醯基－CoA：ACP醯基轉移酶(MAT)(SEQ ID NO：69之核苷酸12366－13319、SEQ ID NO：70之胺基酸625－943)；6個重複醯基－載體蛋白質(ACP)區塊(SEQ ID NO：69之核苷酸14280－16157、SEQ ID NO：70之胺基酸1364－1889)；β－酮基醯基－ACP還原酶(KR)(SEQ ID NO：69之核苷酸17280－17684，SEQ ID NO：70之胺基酸2264－2398)；以及一PFAS A蛋白質區域，介於SEQ ID NO：70胺基酸2399與2787間，含有一脫水酶(DH)保守活性位置模體LxxHxxxGxxxxP(SEQ ID NO：70之胺基酸2504－2516)，於此稱之為DH－模體區域。
在PFAS A中，KS活性位置DXAC＊ 係位於SEQ ID NO：70之胺基酸226－229，其中C＊ 為醯基連結位置。MAT活性位置，GHS＊ XG，係位於SEQ ID NO：70胺基酸721－725，其中S＊ 為醯基結合位置。ACP活性位置LGXDS＊ 係位於下列位置：SEQ ID NO：70之胺基酸1296－1300、胺基酸1402－1406、胺基酸1513－1517、胺基酸1614－1618、胺基酸1728－1732與胺基酸1843－1847，其中S＊ 為磷泛醯巰基連結位置。介於SEQ ID NO：70胺基酸2399與2787之間，PFAS A亦包含脫水酶(DH)保守活性位置模體LxxHxxxGxxxxP(SEQ ID NO：70之胺基酸2504－2516)，請參照上述。
pfaB(SEQ ID NO：69之核苷酸18851－21130)係編碼PFAS B(SEQ ID NO：71)，一種PUFA PKS蛋白質，包含下列區塊：醯基轉移酶(AT)(SEQ ID NO：69之核苷酸19982－20902、SEQ ID NO：71之胺基酸378－684)。
在PFAS B中，活性位置GXS＊ XG模體係位於SEQ ID NO：71之胺基酸463－467，其中S＊ 為醯基連結位置。
pfaC(SEQ ID NO：69之核苷酸21127－27186)係編碼PFAS C(SEQ ID NO：72)，一種PUFA PKS蛋白質，包含下列區塊：KS(SEQ ID NO：69之核苷酸21139－22575、SEQ ID NO：72之胺基酸5－483)、鏈長度因子(CLF)(SEQ ID NO：69之核苷酸22591－23439、SEQ ID NO：72之胺基酸489－771)；以及二FabA 3－羥基醯基－ACP脫水酶，稱之為DH1(SEQ ID NO：69之核苷酸25408－25836、SEQ ID NO：72之胺基酸1428－1570)與DH2(SEQ ID NO：69之核苷酸26767－27183、SEQ ID NO：72之胺基酸1881－2019)。
在PFAS C中，KS活性位置DXAC＊ 係位於SEQ ID NO：72之胺基酸211－214，其中C＊ 為醯基結合位置。
pfaD(SEQ ID NO：69之核苷酸27197－28825)係編碼PFASD(SEQ ID NO：73)，PUFA PKS蛋白質包含下列區塊：一烯酯還原酶(ER)(SEQ ID NO：69之核苷酸27446－28687、SEQ ID NO：73之胺基酸84－497)。
pfaE(SEQ ID NO：69之核苷酸6150－7061反義股)係編碼PFAS E(SEQ ID NO：74)，一4’－磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)，具有已辨識之區塊(SEQ ID NO：69之核苷酸6504－6944、SEQ ID NO：74之胺基酸40－186)。
沙雷菌(Shewanella ollevana)PUFA PKS
有5個開放閱讀框架形成沙雷菌(Shewanella olleyana)核心PUFA PKS系統與其PPTase，如先前所述。每一開放閱讀框架之區塊架構如下。
SEQ ID NO：75為沙雷菌(Shewanella olleyana)黏粒(cosmid)9A10之核苷酸序列，並發現含有17個ORF。在此微生物體中與PUFA PKS系統相關之ORF特徵如下。
pfaA(SEQ ID NO：75之核苷酸17437－25743)係編碼PFAS A(SEQ ID NO：76)，一種PUFA PKS蛋白質，具有下列區塊：β－酮基醯基－合成酶(KS)(SEQ ID NO：75之核苷酸17521－18975、SEQ ID NO：76之胺基酸29－513)；丙二醯基－CoA：ACP醯基轉移酶(MAT)(SEQ ID NO：75之核苷酸19309－20265、SEQ ID NO：76之胺基酸625－943)；6個重複醯基－載體蛋白質(ACP)區塊(SEQ ID NO：75之核苷酸21259－23052、SEQ ID NO：76之胺基酸1275－1872)；β－酮基醯基－ACP還原酶(KR)(SEQ ID NO：75之核苷酸24154－24558、SEQ ID NO：76之胺基酸2240－2374)；以及PFAS A蛋白質之一區域，介於SEQ ID NO：76之胺基酸2241與2768之間，含有一脫水酶(DH)保守活性位置模體LxxHxxxGxxxxP(SEQ ID NO：76之胺基酸2480－2492)，於此稱之為DH－模體區域。
在PFAS A中，KS活性位置DXAC＊ 係位於SEQ ID NO：76之AA 226－229，其中C＊ 為醯基連結位置。MAT活性位置，GHS＊ XG，係位於SEQ ID NO：76胺基酸721－725，其中S＊ 為醯基結合位置。ACP活性位置LGXDS＊ 係位於下列位置：SEQ ID NO：76之胺基酸1307－1311、胺基酸1408－1412、胺基酸1509－1513、胺基酸1617－1621、胺基酸1721－1725，以及胺基酸1826－1830，其中S＊ 為磷酸泛醯巰基連結位置。介於SEQ ID NO：76之胺基酸2241與2768間，PFAS A亦包含脫水酶(DH)保守活性位置模體LxxHxxxGxxxxP(SEQ ID NO：76之胺基酸2480－2492)，請參照上述。
pfaB(SEQ ID NO：75之核苷酸25740－27971)係編碼PFAS B(SEQ ID NO：77)，一種PUFA PKS蛋白質，包含下列區塊：醯基轉移酶(AT)(SEQ ID NO：75之核苷酸26837－27848、SEQ ID NO：77之胺基酸366－703)。
在PFAS B中，活性位置GXS＊ XG模體係位於SEQ ID NO：77之胺基酸451－455，其中S＊ 為醯基連結位置。
pfaC(SEQ ID NO：75之核苷酸27968－34030)係編碼PFAS C(SEQ ID NO：78)，一種PUFA PKS蛋白質，包含下列區塊：KS(SEQ ID NO：75之核苷酸27995－29431、SEQ ID NO：78之胺基酸10－488)；鏈長度因子(CLF)(SEQ ID NO：75之核苷酸29471－30217、SEQ ID NO：78之胺基酸502－750)；以及二FabA 3－羥基醯基－ACP脫水酶，稱之為DH1(SEQ ID NO：75之核苷酸32258－32686、SEQ ID NO：78之胺基酸1431－1573)，以及DH2(SEQ ID NO：75之核苷酸33611－34027、SEQ ID NO：78之胺基酸1882－2020)。
在PFAS C中，KS活性位置DXAC＊ 係位於SEQ ID NO：78之胺基酸216－219，其中C＊ 為醯基連結位置。
pfaD(核苷酸34041－35669 of SEQ ID NO：75)係編碼PFAS D(SEQ ID NO：79)，一種PUFA PKS蛋白質，包含下列區塊：一烯酯還原酶(ER)(SEQ ID NO：75之核苷酸34290－35531、SEQ ID NO：79之胺基酸84－497)。
pfaE(SEQ ID NO：75之核苷酸13027－13899，反義股)係編碼PFAS E(SEQ ID NO：80)，一種4’－磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)，具有已辨識之區塊(SEQ ID NO：75之核苷酸13369－13815、SEQ ID NO：80之胺基酸29－177)。
其他PUFA PKS序列，包括最佳化之PUFA PKS序列
本發明包括各種最佳化序列，用以於異源性宿主中表現PUFA PKS系統，如下提供之範例。熟習此技術領域者可製造最佳化之序列，尤其是，使用異源性宿主較喜歡之密碼子或較佳之表現或功能。
sOrfA SEQ ID NO：35，稱之為sOrfA，代表編碼裂殖壺菌(Schizochytrium)OrfA之核酸序列(SEQ ID NO：1)，其經再合成，以使酵母菌中密碼子之使用最佳化。SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：35每一者皆編碼SEQ ID NO：2。
sOrfB SEQ ID NO：36，稱之為sOrfB，代表編碼裂殖壺菌(Schizochytrium)OrfB之核酸序列(SEQ ID NO：3)，其經再合成，以使酵母菌中密碼子之使用最佳化。SEQ ID NO：3與SEQ ID NO：36每一者皆編碼SEQ ID NO：4。
OrfB ＊ pJK780 SEQ ID NO：37，稱之為OrfB＊ ，代表編碼裂殖壺菌(Schizochytrium)OrfB之核酸序列(SEQ ID NO：3)，其經再合成SEQ ID NO：3之一部分，用於植物細胞中，且其係衍生自非常類似於初始發展時大腸桿菌中密碼子最佳化使用之序列。OrfB＊ 與SEQ ID NO：3相同，不同之處在於再合成BspHI(SEQ ID NO：3之核苷酸4415)至SacII片段(SEQ ID NO：3之獨特位置)上，且該SEQ ID NO：37與SEQ ID NO：3二者皆編碼SEQ ID NO：4。
用於增進PUFA之產生與堆積之附屬蛋白與額外之標的與策略
依據本發明，用以於異源性宿主中製造及/或堆積PUFA之PUFA PKS系統，或是於內生性宿主中增進PUFA之製造及/或堆積之PUFA PKS系統，該PUFA PKS系統較佳使用一或多種各式標的或策略，如同前述有關PUFA之製造(請見上述之6項準則與策略)。這些策略包括，在其他策略中，使用各種附屬蛋白，其於此係定義為一種蛋白質，其不被視為上述核心PUFA PKS系統之一部分(即，非PUFA合成酶酵素複合體本身之一部分)，但其可為，或為使用本發明核心PUFA合成酶酵素複合體製造PUFA，或至少有效製造PUFA所必須。這些策略亦包括各種基因修飾，以增進受質，丙二醯CoA，通過PUFA合成酶路徑之流通量，藉由增強其與丙二醯基－CoA匯集物競爭之能力。本發明這些實施例之變化係如下所述。
磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)
如上所述，在異源性宿主中製造PUFA之一般性準則與策略下，為了製造PUFA，PUFA PKS系統，必須以會自CoA轉移4’－磷酸泛醯巰基片段至醯基載體蛋白質(ACP)區塊之附屬蛋白工作。因此，PUFA PKS系統被視為包括至少一4’－磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)區塊，或此區塊被視為一PUFA PKS系統之附屬區塊或蛋白質。PPTases之結構與功能特徵已經詳細描述，例如，於美國專利申請案公開號20020194641；美國專利申請案公開號20040235127；以及美國專利申請案公開號20050100995。
依據本發明，具有4’－磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)生物活性(功能)之區塊或蛋白質之特徵為，該酵素會自CoA轉移4’－磷酸泛醯巰基片段至醯基載體蛋白質(ACP)上。此轉移至ACP無變化之絲胺酸殘基上之動作，會活化不完全－形式為完全形式。在聚酮與脂肪酸合成中，磷酸泛醯巰基會與成長中之醯基鏈形成硫酯。PPTases為一酵素家族，其已於脂肪酸合成、聚酮合成，以及非核醣體胜肽合成步驟中鑑定出。許多PPTases序列為已知，並已決定其結晶結構(如Reuter K,Mofid MR,Marahiel MA,Ficner R.“Crystal structure of the surfactin synthetase－activating enzyme sfp：a prototype of the 4'－phosphopantetheinyl transferase superfamily”EMBO J.1999 Dec 1；18(23)：6823－31)，以及對於活性相當重要之胺基酸殘基突變分析(Mofid MR,Finking R,Essen LO,Marahiel MA.“Structure－based mutational analysis of the 4'－phosphopantetheinyl transferases Sfp from Bacillus subtilis：carrier protein recognition and reaction mechanism”Biochemistry.2004 Apr 13；43(14)：4128－36)。這些PPTases中高度保守之胺基酸係包含於來自上述沙雷菌(Shewanella)株之pfaE ORF中。
一作為受質之異源性PPTase，其先前已知可辨識出此述之OrfA ACP區塊，為Nostoc sp.PCC 7120(先前稱之為Anabaena sp.PCC 7120)之Het I蛋白質。Het I係存在於Nostoc基因組中，可合成長鏈羥基－脂肪酸，其為該生物體異形細胞存在之醣脂層成分之一(Black and Wolk,1994,J.Bacteriol.176,2282－2292；Campbell et al.,1997,Arch.Microbiol.167,251－258)。Het I似乎可活化該基因組中存在之一蛋白質，Hgl E之ACP區塊。該二Hgl E之ACP區塊與裂殖壺菌(Schizochytrium)Orf A中發現之ACP區塊具有高度序列相似性。SEQ ID NO：34代表Nostoc Het I蛋白質之胺基酸序列，為功能性PPTase，其可使用此述之PUFA PKS系統，包括來自裂殖壺菌(Schizochytrium)與破囊壺菌(thraustochytrium)之PUFA PKS系統。SEQ ID NO：34係由SEQ ID NO：33所編碼。Het I之內生性起始密碼子尚未經確認(並無甲硫胺酸存在於假定之蛋白質上)。有數種可能之替代起始密碼子(如TTG與ATT)靠近開放閱讀框架之5’端。無甲硫胺酸密碼子(ATG)出現於該序列中。然而，Het I表現建構物之建構係使用PCR完成，係使用甲硫胺酸密碼子(ATG，作為NdeI限制酶辨識位置之一部分)取代最遠5'端可能之替代起使密碼子(TTG)，並於編碼序列3'端引入一XhoI位置，且該編碼之PPTase(SEQ ID NO：34)已知具有功能性。
另一作為受質之異源性PPTase，其先前已知可辨識此述之OrfA ACP區塊，為sfp，衍生自枯草桿菌(Bacillus subtilis)。Sfp已經鑑定並廣泛使用，由於其可辨識廣範圍受質之能力。基於已公開之序列資訊(Nakana,et al.,1992,Molecular and General Genetics 232：313－321)，用於sfp表現之載體，已藉由複製該編碼區域，與經定義之上游－與下游側接DNA序列，至pACYC－184複製載體上而製備。此建構物係編碼一功能性PPTase，其能力為可與裂殖壺菌(Schizochytrium)Orfs A、B＊ 與C，於大腸桿菌中共同表現，在適當條件下，產生DHA堆積於這些細胞中(請見美國專利申請案公開號20040235127)。
當使用基因修飾生物體(如微生物體或植物)表現本發明PUFA PKS系統時，某些宿主生物體可內生性製造附屬蛋白，該蛋白為PUFA PKS製造PUFA所必須(如PPTases)。然而，某些生物體可經核酸轉型，該核酸係編碼一或多個此述之附屬蛋白，可允許及/或增強該生物體製造PUFA，即使該生物體會內生性製造一同源性附屬蛋白(即，某些異源性附屬蛋白可更有效地或更有效率地協同轉型之PUFA合成酶蛋白質操作，與宿主細胞之內生性附屬蛋白相較)。本發明係提供一細菌、酵母菌與植物範例，其經本發明PUFA PKS系統基因性修飾，並包含一附屬PPTase。
因此，本發明之一實施例係相關於一種經基因修飾之宿主細胞或生物體(如微生物體或植物或其細胞)，其中該宿主細胞或生物體已經基因修飾，以表現此述之核心PUFA PKS系統，以及PPTase。適當之PPTases係如上所述，亦為技術上已知。該PPTase可表現於同一或不同之建構物上，為一或多個核酸分子編碼之核心PUFA PKS蛋白質或蛋白質。該二實施例皆如範例中所述(請見範例12與13)。在一觀點中，該PPTase為Nostoc HetI(於此以SEQ ID NOs：33與34代表)。
在本發明之一實施例中，PUFA之製造與堆積係藉由降低(抑制、降低調節、減少)宿主細胞或宿主生物體所表現之內生性PPTase之表現量或活性而達成(如防止與本實施例PUFA PKS酵素引入之PPTase競爭)。內生性PPTase活性之抑制可藉由任何適當之基因剔除或失活而達成，包括，但不侷限於，使用反義股RNA、RNAi、共抑制或引入突變)。
本發明包括外生性PPTases之表現(單獨或與內生性PPTases之抑制結合)，以及表現此述之PUFA合成酶，其可單獨使用，或與此述任一或多種策略結合(如以下之任一、二、三、四或五種：密碼子最佳化、胞器－標的、強化PUFA合成酶與丙二醯CoA之競爭(如藉由抑制FAS)、醯基CoA合成酶之表現，及/或一或多種醯基轉移酶或相關酵素之表現)，以增加PUFA於異源性宿主中之製造及/或堆積。
丙二醯CoA流通量之修飾/FAS之抑制
如上所述，PUFA PKS系統(PUFA合成酶)之受質，丙二醯基－CoA，亦被脂肪酸合成酶系統(FASs)、細胞質脂肪酸延長反應，以及其他酵素(如查爾酮(chalcone)合成酶)使用。因此，PUFA合成酶會與丙二醯基－CoA其他酵素系統競爭。因此，本發明之一實施例係相關於一種方法與基因修飾，以增加丙二醯CoA於PUFA合成酶路徑之流通量，藉由增強PUFA合成酶酵素與丙二醯基－CoA匯集物之競爭。於此假設之方法包括，但不侷限於，1)抑制競爭路徑，包括抑制FAS路徑上之任一成分，如藉由降低涉及這些路徑之酵素或次單元之表現量(如藉由使用反義股RNA、RNAi、共抑制或突變)，2)於異源性宿主中表現PUFA合成酶，其中競爭路徑經降低或阻斷(如於油菜(Canola)中，其中在細胞質中延長脂肪酸之能力已被阻斷)，及/或3)藉由增加丙二醯基－CoA匯集物(如藉由表現乙醯基－CoA羧酸酶)。
更特別的是，在一觀點中，本發明亦包括宿主生物體之基因修飾，其可製造PUFA，尤其是表現異源性PUFA PKS系統之宿主生物體，以剔除或失活該基因，或降低由這些基因編碼之酵素之活性，其可競爭或干擾PUFA PKS系統製造及/或堆積PUFA。例如，本發明人發現，藉由降低FAS於宿主生物體中之活性，該宿主已經PUFA PKS系統轉型，會增進PUFA之製造與堆積，與維持正常FAS活性之宿主生物體相較(請見如裂殖壺菌(Schizochytrium)之範例實驗，以及範例中描述酵母菌與植物實驗之詳細描述)。
在一實施例中，係顯示各種可抑制脂肪酸經FAS路徑製造之酵素。在本發明之此實施例中，許多酵素可為適當之標的，係示範二特別適用之標的，並詳述如下。本發明人已展現於裂殖壺菌(Schizochytrium)中剔除FAS酵素之能力(請見範例)，且此策略可應用於異源性宿主中。在另一實施例中，本發明人展示可藉由生化方法，於酵母菌中抑制FAS系統之能力，導致PUFA製造之增進，於表現有PUFA合成酶與PPTase之酵母菌中，與缺乏FAS系統生化標的相較。某些其他宿主亦可使用類似策略。
最後，在植物中，本發明人進行對於FAS路徑之抑制，藉由抑制KasII或KasIII，使用反義股或RNAi技術，增進PUFA之製造，於表現有PUFA合成酶與PPTase之異源性宿主中。而本發明並不侷限於這些標的，本發明之一觀點為以這些酵素之一或二者為抑制標的，並與此述之PUFA合成酶與PPTase結合，單獨或與此述之其他策略結合(如密碼子最佳化、胞器－標的、醯基CoA合成酶之表現，及/或一或多種醯基轉移酶或相關酵素之表現)，以增加PUFA於異源性宿主中之製造及/或堆積。
在脂肪類種子中，主要為三醯基甘油(TAGs)形式，係衍生自複雜酵素路徑之同化物中。一般而言，還原碳係經由韌皮部，自植物之其他部分傳送至種子。在植物種子中，TAG之生合成係於細胞內進行，於不同胞器內(Ohrolgge and Browse,1995,Plant Cell 7：957－970)。在色素體中，短鏈碳前驅物係轉換為長鏈脂肪酸，藉由第II型可溶性脂肪酸合成酶(FAS)複合體(Slabas and Fawcett,1992,Plant Molecular Biology 19：169－191)，其重複地加入C2－單元至脂肪基醯基鏈上，並準備下一延長循環之碳鏈。8或9個循環之C2－單元縮合反應，會產生C16與C18脂肪酸，其特徵為膜脂質。初始之FAS活性係以細胞核編碼、色素體標的之酵素丙二醯基－CoA：ACP醯基轉移酶(MCAT)進行，其會自丙二醯基－CoA上轉移丙二醯基至醯基載體蛋白質上(ACP)(Yasuno et al.,2004,Journal of Biological Chemistry 292：8242－8251)。此形成受質，丙二醯基－ACP，其提供C2－單元於後續之延長反應中。合成之下一步驟係經由細胞核編碼、色素體標的之β－酮基醯基－醯基載體蛋白質合成酶III(KAS III)之催化活性而完成，其中丙二醯基－CoA縮合至提供者，丙二醯基－ACP，之反應，產生丁醯基(C4)－ACP。ACP－活化醯基鏈之所有後續延長反應，係以細胞核編碼、色素體標的之3－酮基醯基－醯基載體蛋白質合成酶I(KAS I)，與β－酮基醯基－醯基載體蛋白質合成酶II(KAS II)同功酶進行。KAS I會催化縮合反應，轉換C4－ACP為C16－ACP，藉由使用丁醯基(C4)－至十四醯(C14)－ACP，作為受質，KAS II係進行最終步驟，以產生十八醯(C18)－ACP，藉由使用十六醯(C16)－ACP(Carlsson et al.,2002,Plant Journal 29：761－770)。因此，藉由抑制或降低KasIII或KasII之表現，便可達到於種子發育期間抑制脂肪酸之生合成。
在一實施例中，本發明包括將異源性宿主生物體，或具有包含KasII或KasIII標的RNAi之核酸分子於宿主細胞中之細胞轉型。在一實施例中，該宿主細胞為一植物細胞。
在一實施例中，本發明係包括將異源性宿主生物體，或具有包含SEQ ID NO：122之核酸序列，其為具有CHSA內含子之KasII RNAi之核酸分子，描述於範例13，於宿主細胞中之細胞轉型。在一實施例中，本發明係包括將異源性宿主生物體，或具有包含SEQ ID NO：124之核酸序列，其為具有CHSA內含子之KasIII RNAi之核酸分子，描述於範例13，於宿主細胞中之細胞轉型。在一實施例中，本發明係包括將異源性宿主生物體，或具有包含SEQ ID NO：123之核酸序列，其為KAS II反義股核酸序列，描述於範例13，於宿主細胞中之細胞轉型。在一實施例中，本發明係包括將異源性宿主生物體，或具有包含SEQ ID NO：125之核酸序列，其為具有KAS III反義股核酸序列，描述於範例13，於宿主細胞中之細胞轉型。
強化PUFA合成酶能力，以與丙二醯基－CoA匯集物競爭之其他方法包括，於異源性宿主中表現PUFA合成酶，其中該競爭路徑已經降低或阻斷(如於油菜(Canola)中，其中在細胞質中延長脂肪酸之能力已被阻斷)。其他適當之異源性宿主可經選擇(天然產生之生物體及/或經選擇、隨機突變與篩選，及/或定點突變)，藉由技術如tilling、育種、標記輔助篩選等，以降低或阻斷競爭路徑，如FAS路徑及類似路徑。
其他酵素之表現，如乙醯基－CoA羧酸酶，亦可增加所有酵素系統可獲得之丙二醯CoA匯集物，因而增進通過PUFA PKS系統之流通量。
本發明包括增進PUFA PKS系統能力之實施例準則，其表現外生性PPTases(單獨或與內生性PPTases抑制結合)，以及表現此述之PUFA合成酶，其可單獨使用，或與此述任一或多種策略結合(如以下之任一、二、三或四種：密碼子最佳化、胞器－標的、醯基CoA合成酶之表現，及/或一或多種醯基轉移酶或相關酵素之表現)，以增加PUFA於異源性宿主中之製造及/或堆積。
醯基－CoA合成酶
本發明之另一實施例係提供一種醯基－CoA合成酶(ACoAS)蛋白質，其可催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA。
本發明人已發現PUFA PKS系統之PUFA內生性製造者，裂殖壺菌(Schizochytrium)，具有一或多種ACoAS，其可轉換PUFA PKS系統之FFA產物為醯基－CoA。此為在此生物體中這些分液高含量PUFA堆積之證據。因此，裂殖壺菌(Schizochytrium)，以及其他內生性包含PUFA PKS系統(如其他破囊壺菌(thraustochytrid)s)之生物體，或其他製造PUFA之真核生物(如海洋矽藻(Thalassiosira pseudonana)或隱甲藻(Crypthecodinium cohnii))，為良好之基因編碼酵素來源，其可用於允許或增加異源性宿主中PUFA PKS系統表現產物之堆積。
本發明人已於裂殖壺菌(Schizochytrium)中辨識出9個核酸序列，其編碼之蛋白質與已知或假設之具醯基－CoA合成酶(ACoAS)活性之蛋白質具有相似性。本發明人認為這些序列之一或多者，係與編碼ACoAS之基因相關，其可轉換裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶FFA產物為醯基－CoA，並展現使用數種這些序列以增加宿主生物體中PUFA之製造及/或堆積之能力。因此，它們便具有絕佳之利用性，可用以增加異源性宿主中PUFA之堆積，其中係表現該裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶或另一PUFA合成酶。不受任合理論束縛，本發明人認為其發現之ACoAS可用於增加表現PUFA合成酶之宿主中，PUFA之堆積，其產物分佈類似於裂殖壺菌(Schizochytrium)中發現者，以及表現有PUFA合成酶之宿主，其產物分佈不同於裂殖壺菌(Schizochytrium)之PUFA合成酶。事實上，於此所示之範例有數種來自裂殖壺菌(Schizochytrium)之ACoAS，會增加PUFAs於酵母菌株中堆積，該酵母菌經裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA PKS系統修飾，在植物中亦經類似之基因修飾。此外，裂殖壺菌(Schizochytrium)ACoAS預期可有效辨識其他生物體之PUFA合成酶製造之EPA，若EPA以FFA方式呈現。此外，本發明係揭示編碼其他生物體ACoAS之基因，其已經辨識出並可用於異源性宿主生物體中表現這些PUFA合成酶。這些ACoAS蛋白質之每一者，以及編碼該蛋白質之核酸，以及其同源物與生物活性片段，係包含於本發明中。這些蛋白質與核酸分子將於下面描述與範例中詳細討論。
本發明之一實施例係相關於一種經經分離之之醯基－CoA合成酶(ACoAS)，其其可催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA。在本發明之觀點中，該經分離之ACoAS係衍生自內生性表現有PUFA PKS系統(PUFA合成酶)之生物體中。此生物體包括，但不侷限於，破囊壺菌(thraustochytrid)。在一觀點中，該經分離之ACoAS係衍生自裂殖壺菌(Schizochytrium)、破囊壺菌(thraustochytrium)，或巫肯尼亞菌(Ulkenia)。在另一觀點中，該經分離之ACoAS係衍生自裂殖壺菌(Schizochytrium)ATCC 20888或裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.株N230D，其為衍生自裂殖壺菌(Schizochytrium)ATCC 20888之菌株，藉由突變與篩選以增加油類生產。在另一觀點中，任一與PUFA PKS系統結合，以製造及/或堆積宿主細胞或生物體之PUFA之ACoAS，皆可使用於本發明。本發明並未受到於此所述之特定範例所限制。
在另一觀點中，該經分離之ACoAS係由核苷酸序列，選自於SEQ ID NO：82、84、86、88、90、92、94、96或98任一者所編碼。在另一觀點中，該經分離之ACoAS係經由一退化演繹(degenerate)之核酸序列所編碼，該核酸序列係編碼一蛋白質，其由選自於SEQ ID NOs：82、84、86、88、90、92、94、96或98任一核苷酸序列所編碼。在另一觀點中，該經分離之ACoAS係包含一胺基酸序列，選自於SEQ ID NOs：83、85、87、89、91、93、95、97或99任一者，或此胺基酸序列任一者之同源物(如下描述)，包括此序列任一生物活性片段或區塊。在一較佳實施例中，該經分離之ACoAS係包含一胺基酸序列，於此以SEQ ID NO：83、85、87、89、91、93、95、97或99，或此胺基酸序列之同源物代表。在一更佳實施例中，該經分離之ACoAS係包含一胺基酸序列，於此係以SEQ ID NO：83、85、87、91或97，或此序列之同源物代表，特佳為SEQ ID NO：83、85或97。任一或更多之醯基－CoA合成酶組合亦包含於本發明中。
本發明包括一或多種醯基－CoA合成酶，如此所述與示範，以及PUFA合成酶，如此所述與示範，以及外生性PPTase(單獨或與內生性PPTases之抑制結合)之表現，其可單獨使用或與任一或多種此述之策略結合(如下列任一、二、三或四者：密碼子最佳化、胞器－標的、強化PUFA合成酶與丙二醯CoA之競爭(如藉由抑制FAS)，及/或一或多種醯基轉移酶或相關酵素之表現)，以增加PUFA於異源性宿主中之製造及/或堆積。
醯基轉移酶
相關於另一上述之於異源性宿主中增加PUFA之製造及/或堆積之策略，本發明之另一實施例係提供一種額外之醯基轉移酶蛋白質，其可利用PUFA－CoA作為受質，形成PL或TAG(如3－甘油－磷酸鹽醯基轉移酶(GPAT)、溶血磷脂酸醯基轉移酶(LPAAT)與二醯基甘油醯基轉移酶(DAGAT))或其他醯基轉移酶，其可導致PL或TAG形式之PUFA之增加(如磷脂質：二醯基甘油醯基轉移酶(PDAT))。本發明包括此經分離之蛋白質與其同源物、編碼此蛋白質之核酸分子、表現此蛋白質之經基因修飾生物體，以及使用此蛋白質之各種方法，特別用以增強生物體中PUFA之製造與堆積。
此外，本發明亦揭示可利用PUFA－CoA作為受質形成PL或TAG之酵素，因此為一額外之附屬蛋白，其用於表現有PUFA合成酶之異源性宿主生物體中，以強化PUFA合成酶製造之PUFA堆積。候選酵素包括，但不侷限於，3－甘油－磷酸鹽醯基轉移酶(GPAT)、溶血磷脂酸醯基轉移酶(LPAAT)與二醯基甘油醯基轉移酶(DAGAT)。這些醯基－CoA－利用蛋白質之每一者，與編碼該蛋白質之核酸，皆包含於本發明中。例如，裂殖壺菌(Schizochytrium)核酸序列已經辨識出，並認為其編碼一具有DAGAT活性之酵素(請見如ScDAGAT)。此外，隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)序列已辨識出編碼具有LPAAT或DAGAT活性之酵素之序列，亦如下所述。這些蛋白質、其具生物活性之同源物、核酸分子，以及其他醯基轉移酶蛋白質，其同源物與核酸分子，皆包含於本發明中，且特定範例將於下描述。
本發明之另一實施例係相關於一種經分離之蛋白質，其利用PUFA－CoA作為受質，形成PL或TAG(如3－甘油－磷酸鹽醯基轉移酶(GPAT)、溶血磷脂酸醯基轉移酶(LPAAT)與二醯基甘油醯基轉移酶(DAGAT))。較佳之蛋白質包括醯基轉移酶，選自於GPAT、LPAAT與DAGAT任一者。在一觀點中，該經分離之蛋白質係衍生自一生物體，其會內生性地表現PUFA PKS系統(PKS合成酶)，或至少製造PUFA之一生合成路徑。此生物體包括，但不侷限於，破囊壺菌(thraustochytrid)或隱甲藻(Crypthecodinium cohni)。在一觀點中，該經分離之醯基轉移酶係衍生自裂殖壺菌(Schizochytrium)、破囊壺菌(thraustochytrium)或巫肯尼亞菌(Ulkenia)。在另一觀點中，該經分離之醯基轉移酶係衍生自裂殖壺菌(Schizochytrium)ATCC 20888或裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)株N230D。在另一觀點中，該醯基轉移酶係衍生自隱甲藻(Crypthecodinium cohni)。在另一觀點中，任一醯基轉移酶，其功能係與任一PUFA PKS系統結合，以增加宿主細胞或生物體中PUFA之製造及/或堆積，皆可使用於本發明。本發明並非侷限於此述之特定範例。
在另一方面，經分離之醯基轉移酶係以一核苷酸序列編碼，該序列選自於SEQ ID NOs：100、102、103、105、106、108、109、111、112或114－121之任一者。在另一觀點中，該經分離之醯基轉移酶係經由一退化演繹(degenerate)之核酸序列所編碼，該核酸序列係編碼一蛋白質，其由選自於SEQ ID NOs：100、102、103、105、106、108、109、111、112或114－121任一核苷酸序列所編碼。在另一觀點中，該經經分離之之醯基轉移酶包含一胺基酸序列，選自於SEQ ID NOs：101、104、107、110或113任一者，或此胺基酸序列任一者之同源物(如下描述)，包括此序列任一生物活性片段或區塊。在一較佳實施例中，該經分離之之醯基轉移酶包含一胺基酸序列，於此以SEQ ID NO：101、104、107、110或113，或此胺基酸序列之同源物代表。在一較佳實施例中，該經分離之醯基轉移酶包含一胺基酸序列，於此以SEQ ID NO：101或104，或此序列之同源物代表，特佳為SEQ ID NO：101。此述醯基轉移酶之組合亦包含於本發明之用途中。
在另一觀點中，該經分離之之醯基轉移酶係包含一胺基酸序列，選自於SEQ ID NOs：之任一者，或此胺基酸序列之同源物(如下描述)，包括此序列之任一生物活性片段或區塊。
本發明包括表現一或多種醯基－CoA合成酶，如此所述，以及PUFA合成酶，如此所述與示範，以及外生性PPTase(單獨或與內生性PPTases之抑制結合)之表現，其可單獨使用或與任一或多種此述之策略結合(如下列任一、二、三或四者：密碼子最佳化、胞器－標的、強化PUFA合成酶與丙二醯CoA之競爭(如藉由抑制FAS)，及/或醯基CoA合成酶之表現)，以增加PUFA於異源性宿主中之製造及/或堆積。
胞器－特異性表現
相關於上述之另一策略，本發明之一實施例係相關於標的PUFA合成酶酵素、PPTase及/或任一或多種附屬蛋白之表現，及/或標的宿主一或多種胞器中之基因修飾。例如，在一實施例中，PUFA合成酶系統與PPTase之表現係以植物之色素體為標的。在另一實施例中，PUFA合成酶系統與PPTase之表現係以細胞質為標的。另一實施例中，PUFA合成酶系統與PPTase之表現係以植物細胞之色素體與細胞質二者為標的。在這些實施例之任一者中，其他目標可導向於色素體或細胞質。在一觀點中，醯基－CoA合成酶之表現係以細胞質為標的，在另一實施例中，此表現係以色素體為標的。在一實施例中，一醯基－CoA合成酶係以細胞質為標的，而另一醯基－CoA合成酶則以色素體為標的。較佳為，醯基－CoA合成酶係表現於細胞質中，以轉換DHA及/或DPA自由脂肪酸為醯基－CoA，其之後可被醯基轉移酶利用。醯基轉移酶一般可共轉譯，標的為內質網。FAS系統之抑制，如藉由基因修飾以抑制一或多個宿主酵素，可導入相同胞器中，其中該PUFA合成酶係被表現。
一示範性色素體標的序列係衍生自甘藍型油菜(Brassica napus)之醯基－ACP硫酯酶，該經編碼之標的胜肽之胺基酸序列於此係由SEQ ID NO：81代表。多種其他色素體標的序列為技術上已知，且可用於實施例中，其中該異源性宿主為植物或植物細胞，且其中標的為色素體者較佳。
本發明包括使用胞器標的(如標的為色素體或植物中之葉綠體)，並表現PUFA合成酶，如此所述與示範，以及外生性PPTase(單獨或與內生性PPTases之抑制結合)之表現，其可單獨使用或與任一或多種此述之策略結合(如下列任一、二、三或四者：密碼子最佳化、強化PUFA合成酶與丙二醯CoA之競爭(如藉由抑制FAS)、一或多種醯基－CoA合成酶之表現，及/或一或多種醯基轉移酶或相關酵素之表現)，以增加PUFA於異源性宿主中之製造及/或堆積。
色素體或葉綠體之基因產物標的係由訊號序列控制，其發現於各種蛋白質之胺基端，且可在輸入時被切割，而產生成熟蛋白質(如就葉綠體標的而言，請見如Comai et al.,J.Biol.Chem.263：15104－15109(1988))。這些訊號序列可融合至異源性基因產物上，以影響異源性產物輸入葉綠體中(van den Broeck et al.Nature 313：358－363(1985))。編碼適當訊號序列之DNA可分離自編碼RUBISCO蛋白質、CAB蛋白質、EPSP合成酶酵素、GS2蛋白質，以及許多其他蛋白質之cDNA，其已知可定位至葉綠體。
在本發明之各實施例中，較佳係相關於本發明之蛋白質定位至細胞內部分，例如，至色素體或葉綠體。蛋白質可引導至葉綠體，藉由包含一葉綠體轉移胜肽(CTP)於其胺基端。類似地，蛋白質可引導至色素體，藉由包含一色素體轉移胜肽或訊號胜肽於其胺基端。
天然發生之葉綠體標的蛋白質，係以較大之前驅蛋白質形式合成，其含有一胺基端葉綠體標的胜肽而引導該前驅物至葉綠體輸入機器，為技術上已知。葉綠體標的胜肽一般係以葉綠體胞器內之特異性內蛋白酶切割，因而自前驅物釋放該標的之成熟，較佳具活性之酵素，至葉綠體melieu。編碼該胜肽之序列，該胜肽適用於引導基因標的或基因產物至植物細胞之葉綠體或色素體中，包括牽牛花EPSPS CTP、阿拉伯芥(Arabidopsis)EPSPS CTP2與內含子，以及其他技術上已知者。此標的序列係用以提供所希望之表現蛋白質，轉移至可發揮最有效功能之細胞結構中，或轉移該表現之蛋白質至細胞某一區域，該處會集中所希望之現象功能之細胞加工。特定之葉綠體標的胜肽範例為技術上已知，包括阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)核酮醣雙磷酸鹽羧酸酶小次單元ats1A轉移胜肽、阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS轉移胜肽，以及玉米(Zea maize)核酮醣雙磷酸鹽羧酸酶小次單元轉移胜肽。
一最佳化之轉移胜肽為較佳，例如，Van den Broeck et al.所述“Targeting of a foreign protein to chloroplasts by fusion to the transit peptide from the small subunit of ribulose 1,5－biphosphate carboxylase”,Nature,313：358－363(1985)。原核與真核訊號序列係揭示於，如Michaelis et al.(1982)Ann.Rev.Microbiol.36,425。可使用於本發明之額外轉移胜肽包括葉綠體轉移胜肽，如描述於Von Heijne et al.,Plant Mol.Biol.Rep.9：104－126(1991)；Mazur et al.,Plant Physiol.85：1110(1987)；Vorst et al.,Gene 65：59(1988)者。Chen & Jagendorf(J.Biol.Chem.268：2363－2367(1993))已描述使用葉綠體轉移胜肽，以輸入異源性轉殖基因。此胜肽為來自菸草(Nicotiana plumbaginifolia)之rbcS基因之轉移胜肽(Poulsen et al.Mol.Gen.Genet.205：193－200(1986))。此述功能為定位異源性蛋白質至葉綠體中之一CTP，係衍生自甘藍型油菜(Brassica napus)醯基－ACP硫酯酶。
另一定位基因至葉綠體或色素體之方法包括葉綠體或色素體轉型。重組植物可經製造，其中僅葉綠體DNA經改變或加入此植物中出現之分子。作用於葉綠體之驅動子為技術上已知(Hanley－Bowden et al.,Trends in Biochemical Sciences 12：67－70,1987)。獲得含有已插入異源性DNA之葉綠體之細胞之方法與組成物，已描述於如Daniell et al.(美國專利號5,693,507；1997)，及Maliga et al.(美國專利號5,451,513；1995)。
策略之組合
依據本發明，於異源性宿主中製造與堆積一或多種標的PUFA，此述增進該宿主製造及/或堆積PUFA之任一或更多之(任一組合)策略皆可使用。事實上，該策略之各種組合可加成或同步，並提供增進之PUFA製造及/或堆積，與無一或多種此策略時相較。事實上，該範例係提供多種示範性策略，包括多種策略組合，以於宿主生物體(異源性宿主與天然表現PUFA PKS系統之生物體二者皆可)中製造PUFA。
適當用於製造本發明PUFA之經基因修飾宿主細胞或生物體具有下列基本特性。該宿主細胞或生物體係表現PUFA PKS系統，其包含此述之核心PUFA PKS酵素與PPTase，其可有效製造PUFA，當與核心PUFA PKS酵素一同使用時。該PUFA PKS系統及/或PPTase可由宿主細胞或生物體內生性地製造，或於宿主中表現為異源性蛋白質(如藉由重組技術)。編碼核心PUFA PKS酵素及/或PPTase之核酸分子，可經密碼子使用最佳化，或於宿主細胞或生物體較佳表現。該宿主細胞或生物體可額外地經修飾，以表現一、二、三或更多醯基－CoA合成酶，包括於此所述之任一者或技術上已知之其他者。該宿主細胞或生物體可額外地經修飾，以表現一、二、三或更多醯基轉移酶，包括於此所述之任一者或技術上已知之其他者。該宿主細胞或生物體可額外地經基因修飾(或經選擇或製造)，以強化PUFA PKS系統與受質，丙二醯CoA，競爭之能力。在一觀點中，此可藉由篩選生物體而達成，此特徵為天然，或一天然、經篩選或直接之突變，或藉由育種或其他技術而達成。在另一觀點中，此可藉由選擇性抑制與PUFA PKS競爭丙二醯CoA之路徑，如FAS系統，之一或多種酵素而達成。在任一實施例中，該PUFA PKS或附屬蛋白或修飾物之標的可為胞器特異性，如至植物之色素體。
某些用於與核心PUFA PKS系統與PPTase之較佳組合包括，但不侷限於：(1)表現一、二或更多醯基－CoA合成酶；(2)FAS抑制(如藉由抑制KASII或KASIII)；(3)一、二或更多醯基－CoA合成酶與FAS抑制(如藉由抑制KASII或KASIII)之結合；(4)表現一、二或更多醯基轉移酶；(5)表現一、二或更多醯基－CoA合成酶；抑制FAS(如藉由抑制KASII或KASIII)；以及表現一、二或更多醯基轉移酶之結合。
某些植物中修飾之示範性組合(請見範例13)包括表現PUFA PKS(如來自裂殖壺菌(Schizochytrium))與異源性PPTase(如來自Nostoc之HetI)，以及：(a)表現醯基－CoA合成酶(範例為ACS－1與ACS－2)；(b)抑制FAS(範例為抑制KASII RNAi、KAS II反義股、KASIII RNAi與KASIII反義股)；(c)表現醯基－CoA合成酶與抑制FAS之結合(範例為表現ACS－1並抑制FAS，使用KASII RNAi、KAS II反義股、KASIII RNAi與KASIII反義股)；(d)表現醯基轉移酶(範例為LPAAT－1)；(e)表現醯基轉移酶、表現醯基－CoA合成酶，以及抑制FAS之結合(範例為表現DAGAT－1與表現ACS－1，每一者皆與抑制FAS結合，藉由KASII RNAi或KASIII反義股)；(f)表現醯基轉移酶、表現二醯基－CoA合成酶，以及抑制FAS之結合(範例為表現DAGAT－1，表現ACS－1，與表現ACS－8，每一者皆與抑制FAS組合，藉由KASII RNAi或KASIII反義股)；(g)表現二醯基轉移酶、表現醯基－CoA合成酶，與抑制FAS之結合(範例為表現DAGAT－1與LPAAT－1，與表現ACS－1，每一者皆與FAS抑制結合，藉由KASII RNAi或KASIII反義股)；以及(h)表現二醯基轉移酶、二表現醯基－CoA合成酶，與抑制FAS之結合(範例為表現DAGAT－1與LPAAT－1，與表現ACS－1與ACS－8，每一者皆與FAS抑制結合，藉由KASII RNAi或KASIII反義股)。
任一使用這些修飾組合、其他修飾，或此述修飾組合之植物與植物細胞，係包含於本發明中。此外，任一使用此述任何修飾或修飾組合之宿主細胞或生物體，以及衍生自此細胞或生物體之產物，包括含有標的物PUFA之油類，亦包含於本發明中。本發明之所有實施例皆可用於此述經基因修飾之生物體，與製造及使用此生物體之方法之討論中。
經基因修飾之細胞、生物體與製造並使用其之方法為了製造明顯高產率之一或多種希望之聚不飽和脂肪酸或其他生物活性分子，一生物體，較佳為一微生物體或一植物，可經基因修飾，以改變其PUFA PKS系統之活性，尤其是，最終產物，於該微生物體或植物中，或引入PUFA PKS系統至該微生物體或植物中。本發明係相關於一種增進或強化此類基因修飾之方法，尤其是，相關於增進或強化PUFA PKS系統最終產物，較佳為PUFA，之製造及/或堆積。
因此，本發明之一實施例係相關於一種經基因修飾之生物體，其中該生物體係表現一PUFA PKS系統，其中該生物體已經基因修飾，以表現此述之一附屬蛋白，以增進PUFA之製造及/或堆積(或其他PUFA PKS系統之生物活性產物)於該宿主中，及/或其中該生物體已經任何方法基因修
飾，包括天然篩選與突變，以強化PUFA PKS與宿主中之受質競爭之能力(如藉由抑制FAS路徑與此述其他競爭路徑)。若PUFA PKS系統對於宿主而言為異源性，則該生物體較佳經基因修飾，以表現PPTase為PUFA PKS附屬蛋白，其如上所述。在一實施例中，該生物體經基因修飾，以表現此述之ACoAS，較佳為ACoAS，其係衍生自相同屬、種或特定生物體，PUFA PKS系統衍生之生物體，可催化轉換PUFA PKS系統製造之長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)為醯基－CoA。在另一實施例中，該生物體已經基因修飾，以表現蛋白質，其可利用PUFA－CoA作為受質形成PL或TAG。在另一實施例中，該生物體已經基因修飾，以表現上述ACoAS與利用PUFA－CoA作為受質形成PL或TAG之蛋白質。在一實施例中，若PUFA PKS系統對宿主而言為內生性，該生物體可經基因修飾以表現異源性附屬蛋白，如上所述，其可增進或強化PUFA之製造及/或堆積(或PUFA PKS系統之另一生物活性產物)於宿主生物體中，及/或該生物體可經基因修飾，以增加、最佳化或強化該生物體內生性製造之此一附屬蛋白之表現及/或生物活性(如增進內生性ACoAS之表現或活性，其可以內生性PUFA PKS系統操作於宿主中)。在一實施例中，該生物體係以任何方式經基因修飾，包括天然篩選與突變、定點突變或隨機突變與篩檢等，以強化PUFA PKS與該宿主中受質之競爭能力(藉由抑制FAS路徑與此述其他競爭路徑)。在一實施例中，該生物體中之FAS路徑係經抑制。在一實施例中，該生物體中之KASII及/或KASIII係經抑制。本發明之這些實施例係如上詳細描述。較佳之經基因修飾生物體包括經基因修飾微生物體與經基因修飾之植物。
該生物體可內生性地表現PUFA PKS系統，雖然本發明特別適用於強化生物體PUFA之製造及/或堆積，該生物體係經基因修飾，以表現PUFA PKS系統(異源性宿主)。由該生物體表現之PUFA PKS系統可包括任一PUFA PKS系統，例如，PUFA PKS系統，其完全衍生自一特定之生物體(如裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA PKS系統)，以及PUFA PKS系統，其可由“與匹配”之核酸序列製造，該核酸係編碼來自不同PUFA PKS系統之蛋白質及/或區塊(如藉由混合裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA PKS蛋白質及/或區塊，以及來自如破囊壺菌(thraustochytrium)、巫肯尼亞菌(Ulkenia)、沙雷菌(Shewanella)、嗜壓菌(Moritella)，及/或發光菌(Photobacterium)之PUFA PKS蛋白質及/或區塊等)，及/或來自不同之非－PUFA PKS系統(如第I型模塊式、第I型迭代式、第II型或第III型PKS系統)，其中該來自不同生物體之蛋白質及/或區塊係結合，以形成一完全、功能性PUFA PKS系統。PUFA PKS系統，包括結合來自不同生物體之PUFA PKS基因或蛋白質，係詳細描述於美國專利號6,140,486；美國專利號6,566,583；Metz et al.,Science 293：290－293(2001)；美國專利申請案公開號20020194641；美國專利申請案公開號20040235127；美國專利申請案公開號20050100995；以及PCT公開號WO 2006/135866；如上所述)。PUFA PKS基因與蛋白質亦揭示於：PCT專利公開號WO 05/097982；以及美國專利申請案公開號20050014231。上述每一份文件，以及此述之基因與蛋白質，皆在此併入本案以作為參考資料。
因此，本發明包含基因修飾該生物體之方法：藉由基因修飾該生物體之至少一核酸序列，其編碼PUFA PKS系統之至少一功能性區塊或蛋白質(或生物活性片段或其同源物)，包括，但不侷限於，任一PUFA PKS系統，特別是於此所述者，及/或藉由表現至少一重組核酸分子，其包含一編碼此區塊或蛋白質之核酸序列。此外，該方法包括基因修飾該生物體，藉由基因修飾至少一核酸序列於該生物體中，其編碼一ACoAS及/或一利用PUFA－CoA作為受質形成PL或TAG之蛋白質，及/或藉由表現至少一重組核酸分子，其包含編碼此蛋白質之核酸序列。該方法可更包括基因修飾該生物體，以抑制與PUFA PKS作為受質競爭之路徑，如FAS系統，包括，但不侷限於，抑制生物體中之KASII或KASIII。在一實施例中，任一外生性引入之核酸序列可經密碼子使用最佳化，或增進於宿主中之表現在一實施例中，任一引入之核酸序列可標的生物體中一或多種胞器。此序列、基因修飾一生物體之方法、特定修飾與其組合之各種實施例，已於上詳細描述，並包含於此。一般而言，該方法係用於製造特定之經基因修飾生物體，其可製造具特定生物活性之分子或分子群。較佳為，該經基因修飾生物體為經基因修飾之微生物體或經基因修飾之植物。
較佳為，本發明之一經基因修飾生物體係製造一或多種聚不飽和脂肪酸，包括，但不侷限於，EPA(C20：5,n－3)、DHA(C22：6,n－3)、DPA(C22：5,n－6或n－3)、ARA(C20：4,n－6)、GLA(C18：3,n－6)、ALA(C18：3,n－3)，及/或SDA(C18：4,n－3))，更佳為，一或多種更長鏈之PUFA，包括，但不侷限於，EPA(C20：5,n－3)、DHA(C22：6,n－3)、DPA(C22：5,n－6或n－3)或DTA(C22：4,n－6)。在一較佳實施例中，本發明經基因修飾之植物係製造一或多種聚不飽和脂肪酸，包括，但不侷限於，EPA(C20：5,n－3)、DHA(C22：6,n－3)，及/或DPA(C22：5,n－6或n－3)。
依據本發明，經基因修飾之生物體包括一生物體，其藉由使用重組技術或典型突變與篩選技術而修飾。如此所述，會導致基因表現或基因產物(即，該基因編碼之蛋白質)功能降低之基因修飾，可稱之為失活(完全或部分)、剔除、干擾、阻斷或降低調節一基因。例如，一基因之基因修飾，其會導致此基因編碼之蛋白質功能降低，可為該基因完全剔除之結果(即，該基因不存在，因而該蛋白質不存在)、該基因之突變，其會導致蛋白質不完全或無轉譯(如該蛋白質不表現)，或基因突變，其會降低或抵銷蛋白質之天然功能(如一蛋白質係表現，但酵素活性或作用係降低或無活性)。會導致基因表現或功能增加之基因修飾，係稱之為倍增、過度製造、活化、強化、加成，或加強調節該基因。
本發明生物體之基因修飾較佳係影響該生物體表現之PUFA PKS系統，不論該PUFA PKS系統是內生性與經基因修飾、內生性並引入重組核酸分子至該生物體中(可修飾內生性系統或不修飾)，或是完全由重組技術提供。為了改變PUFA PKS系統或表現此系統之生物體中PUFA之製造分佈，此系統包括會導致任何可偵測或可測量之一或多種PUFA(或其他由此PUFA PKS系統製造之生物活性分子)製造量改變者，於該宿主生物體中，與無此基因修飾者相較(即，與未經修飾、野生型生物體，或生物體至少於PUFA合成方面未經修飾－即，該生物體可能具有其他與PUFA無關之修飾，相較)。為了影響PUFA PKS系統之活性，該系統包括任何會導致該生物體PUFA PKS系統產生可偵測或可測量之改變或修飾之基因修飾，係與無基因修飾者相較。PUFA PKS系統之可偵測改變或修飾可包括，但不侷限於：經修飾PUFA PKS系統之一或多個區塊之表現，及/或生物活性之改變或修飾(引入、增加或降低)，與無此基因修飾之內生性PUFA PKS系統相較：將PUFA PKS系統活性引入至一生物體中(即，該生物體不包含PKS系統或基因修飾前之PUFA PKS系統)，使得該生物體具有可測量/可偵測之PUFA PKS系統活性。
值得注意的是，增加PUFA PKS系統中功能性區塊或蛋白質之活性，包括PUFA PKS系統之一附屬蛋白，係稱之為含有該區塊或蛋白質之生物體(或該區塊或蛋白質待引入處)之基因修飾，其導致該區塊或蛋白質或系統功能性之增加，並可包括該區塊或蛋白質或系統之更高活性(如特異活性或體內酵素活性)、降低該區塊或蛋白質或系統之抑制或分解，並過度表現該區塊或蛋白質或系統。例如，可增加基因複製數、藉由使用可提供較原始驅動子高表現量之驅動子增加表現量，或可藉由基因工程或典型突變改變之基因，以增加該基因編碼之區塊或蛋白質之活性。
類似地，PUFA PKS系統中功能性區塊或蛋白質活性之降低，包括PUFA PKS系統之附屬蛋白，係指含有此區塊或蛋白質之生物體之基因修飾(或該區塊或蛋白質待引入處)，其會導致區塊或蛋白質功能性降低，並包括區塊或蛋白質活性之降低、增加該區塊或蛋白質之抑制或降解，並降低或消除該區塊或蛋白質之表現。例如，本發明區塊或蛋白質之作用可藉由阻斷或降低該區塊或蛋白質之製造而降低，“剔除”該基因或其編碼區塊或蛋白質之部分，降低該區塊或蛋白質之活性，或抑制該區塊或蛋白質之活性。阻斷或降低該區塊或蛋白質之製造，可包括將編碼該區塊或蛋白質基因置於驅動子之控制下，其需要在培養基中有誘發化合物存在。藉由建立將誘發劑自培養基中耗盡之條件，編碼該區塊或蛋白質之基因之表現(因此，蛋白質合成)可被關閉。本發明人展現在破囊壺菌(thraustochytrid)微生物體中剔除(knock out)標的基因之能力，請見範例一節。阻斷或降低區塊或蛋白質之活性亦可包括使用刪除技術法，類似於美國專利號4,743,546中所述，在此併入本案以作為參考資料。為了使用此方法，編碼有興趣蛋白質之基因係選殖至特定基因序列之間，其可允許該基因自基因體中特異性、經控制地刪除。該刪除可藉由，如，改變培養溫度而促進，如美國專利號4,743,546中所述，或藉由某些其他物理性或營養性訊號。
經基因修飾之微生物體
如此所述，經基因修飾之微生物體可包括一經基因修飾之細菌、單細胞生物、微藻類、真菌或其他微生物。此經基因修飾之微生物體具有一基因體，其修飾(即，突變或改變)自其正常形式(即，野生型或天然發生)，使得所希望之結果可達成(即，增加或修飾PUFA PKS活性，及/或使用PUFA PKS系統希望產物之製造與堆積)。微生物體之基因修飾可使用典型菌株發育及/或分子基因技術達成。此類技術為技術上已知，且一般揭示用於微生物體，例如，於Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labs Press。參考文獻Sambrook et al.,ibid.，係在此併入本案以作為參考資料。經基因修飾之微生物體可包括一微生物體，其中核酸分子已經插入、刪除或修飾(即，突變；如藉由核苷酸插入、刪除、取代，及/或倒位)，以此方式使得此類修飾可對於該微生物體提供所希望之影響。
適用於基因修飾之宿主微生物體範例包括，但不侷限於，酵母菌，包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、啤酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis)，或其他酵母菌，如假絲酵母(Candida)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces)或其他真菌，例如，絲狀真菌，如麴菌(Aspergillus)、胞菌(Neurospora)、青黴菌(Penicillium)等。細菌細胞亦可使用作為宿主。這些包括，但不侷限於，大腸桿菌，其可用於發酵製程中。此外，僅作為範例，宿主如乳酸菌(Lactobacillus)或桿菌(Bacillus)，皆可使用作為宿主。
其他可用於本發明之宿主包括微生物體，來自各屬包括，但不侷限於，破囊壺菌(thraustochytrium)、加彭歐凱崔恩菌(Japonochytrium)、不遊走壺菌(Aplanochytrium)、艾利納菌(Elina)與裂殖壺菌(Schizochytrium)，落於破囊壺菌科中，以及網黏菌(Labyrinthula)、拉比琳休洛依迪斯菌(Labyrinthuloides)，與迷黏菌(Labyrinthomyxa)，落於網黏菌科中。在這些屬中之較佳物種包括，但不侷限於，下列描述之任一物種。特佳之破囊壺菌目株包括，但不侷限於：裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.(S31)(ATCC 20888)；裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.(S8)(ATCC 20889)；裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.(LC－RM)(ATCC 18915)；裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.(SR21)；裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.N230D、聚裂殖壺菌(Schizochytrium aggregatum)(Goldstein et Belsky)(ATCC 28209)；裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)(Honda et Yokochi)(IFO 32693)；破囊壺菌(thraustochytrium sp.)(23B)(ATCC 20891)；紋狀破囊壺菌(thraustochytrium striatum)(Schneider)(ATCC 24473)；破囊壺菌(thraustochytrium aureum)(Goldstein)(ATCC 34304)；紅破囊壺菌(thraustochytrium roseum)(Goldstein)(ATCC 28210)；以及加彭歐凱崔恩菌(Japonochytrium sp.)(L1)(ATCC 28207)。
依據本發明，術語“破囊壺菌(thraustochytrid)”係指破囊壺菌目目之任一成員，包括破囊壺菌科家族，術語“網黏菌(labyrinthulid)”係指網黏菌目之任一成員，其包括網黏菌科家族。網黏菌科家族成員一度被認為是破囊壺菌目成員，但最近有關生物體的分類學研究指出，該家族被認為是網黏菌目之一員，且網黏菌目與破囊壺菌目二者皆被認為是網黏菌門(Labyrinthulomycota)之一員。此發展導致破囊壺菌(thraustochytrid)與網黏菌(labyrinthulid)時常在分類學上修正。然而，分類學者現在一般將這群組分類為微生物體，具有海藻或海藻－類似單細胞生物，在原生藻菌(Stramenopile)品系中。目前對於破囊壺菌(thraustochytrid)與網黏菌(labyrinthulid)之分類摘要如下：界：原生藻菌(Chromista)門：網黏菌門綱：網黏菌綱目：網黏菌目科：網黏菌科屬：破囊壺菌屬種：破囊壺菌科
然而，由在分類學上仍不明確，用於本發明目的較佳可視為破囊壺菌(thraustochytrid)之菌株包括下列生物體：目：破囊壺菌目；科：破囊壺菌科；屬：破囊壺菌(thraustochytrium)(種：sp.,阿魯迪曼達雷(arudimentale)、阿伍雷恩(aureum)、班思寇拉(benthicola)、格洛巴森(globosum)、肯內伊(kinnei)、摩提夫(motivum)、馬堤盧蒂曼達雷(multirudimentale)、巴凱得門(pachydermum)、普洛利芬盧(proliferum)、紅破囊壺菌(roseum)、紋狀破囊壺菌(striatum))、巫肯尼亞菌(Ulkenia)(種：sp.、阿墨巴戴亞(amoeboidea)、開古蓮西斯(kerguelensis)、迷努它(minuta)、普羅弗達(profunda)、拉迪亞它(radiata)、沙伊廉斯(sailens)、沙勒乃利阿納(sarkariana)、賽索凱特羅皮思(schizochytrops)、維蘇爾傑西斯(visurgensis)、約肯西斯(yorkensis))、裂殖壺菌(Schizochytrium)(種：sp.、聚裂殖壺菌(aggregatum)、利納賽恩(limnaceum)、曼格洛維伊(mangrovei)、迷努頓(minutum)、歐克多斯波倫(octosporum))、加彭歐凱崔恩菌(Japonochytrium)(種：sp.,馬利奴恩(marinum))、不遊走壺菌(Aplanochytrium)(種：sp.、哈利歐堤蒂斯(haliotidis)、開古蓮西斯(kerguelensis)、普羅弗達(profunda)、史多其諾伊(stocchinoi))、歐索爾尼亞菌(Althornia)(種：sp.、可勞齊(crouchii))，或艾利納菌(Elina)(種：sp.、馬利撒爾巴(marisalba)、辛諾李菲卡(sinorifica))。值得注意的是，巫肯尼亞菌(Ulkenia)屬之原始描述，並未發表於同儕評核(peer－reviewed)之期刊上，所以在此屬以及其下之種之確認上仍有些問題存在。就本發明目的而言，巫肯尼亞菌(Ulkenia)下之種被視為是破囊壺菌屬之一員。
本發明描述之菌株為網黏菌(labyrinthulid)，包括下列生物體：目：網黏菌目，科：網黏菌科，屬：網黏菌屬(種：sp.,阿勒傑利恩西斯(algeriensis)、可安諾賽斯提斯(coenocystis)、恰特圖尼(chattonii)、麥可洛塞斯提斯(macrocystis)、麥可洛塞斯提斯阿特蘭提卡(macrocystis atlantica)、麥可洛塞斯提斯麥可洛塞斯提斯(macrocystis macrocystis)、馬利納(marina)、迷努它(minuta)、羅斯可芬西斯(roscoffensis)、芳考羅伊蒂斯(valkauloides)(種：sp.、哈利歐堤蒂斯(haliotidis)、約肯西斯(yorkensis))、利比琳索米克斯諾維(Labyrinthomyxnovii)、維特里納(vitellina)、維特里納帕西菲卡(vitellina pacifica)、維特里納維特里納(vitellina vitellina)、索琵菲(zopfii))，利比琳沙(Labyrintha)(種：sp.,馬利納(marina))、雙孔蟲(種：sp.,阿爾切利(archeri))、派爾侯蘇勒斯菌(Pyrrhosorus)(種：sp.,馬利努思(marinus))、蘇洛迪普洛菲力斯菌(Sorodiplophrys)(種：sp.,史特爾寇來亞(stercorea))或克廉米多米克沙菌(Chlamydomyxa)(種：sp.,拉比琳休洛依迪斯(labyrinthuloides)、蒙大拿(montana))(雖然並無與派爾侯蘇勒斯菌(Pyrrhosorus)、蘇洛迪普洛菲力斯菌(Sorodiplophrys)或克廉米多米克沙菌(Chlamydomyxa)確切一致之分類)。
在本發明之一實施例中，該微生物體之內生性PUFA PKS系統，及/或內生性PUFA PKS附屬蛋白(如ACoAS)係經基因修飾，藉由如典型突變與篩選技術，及/或分子基因技術，包括基因工程技術。基因工程技術包括，例如，使用標的重組載體以剔除內生性基因部分，或置換內生性基因為一異源性序列。可引入宿主基因體中之異源性序列範例，包括編碼來自另一PKS系統之至少一功能性PUFA PKS區塊或蛋白質，或甚至完整PUFA PKS系統之序列(如所有與PUFA PKS系統相關之基因)。異源性序列亦可包括一序列，其編碼一PUFA PKS系統天然區塊之經修飾功能性區塊(同源物)。其他可引入該宿主基因體之異源性序列包括編碼一蛋白質之核酸分子，該蛋白質會影響內生性PUFA PKS系統之活性，如於此所述之附屬蛋白。例如，可引入宿主基因體之一核酸分子係編碼ACoAS，尤其是，會強化宿主中PUFA之製造及/或堆積之ACoAS，與PUFA PKS系統共同操作之內生性ACoAS相較。
經基因修飾之植物
本發明之另一實施例係相關於一種經基因修飾之植物，其中該植物經基因修飾，以重組性地表現一PUFA PKS系統，包括一PPTase，如此所述，且其中該植物進一步經基因修飾，以表現一如此所述之附屬蛋白，以增進宿主中PUFA之製造及/或堆積(或PUFA PKS系統之其他生物活性)，及/或抑制與PUFA PKS系統競爭之路徑(如抑制FAS系統)。較佳為，此附屬蛋白為ACoAS及/或一利用PUFA－CoA作為受質形成PL或TAG之蛋白質(如GPAT、LFAAT或DAGAT)。
使用於此，一經基因修飾之植物可包括任何經基因修飾之植物，包括較高植物，尤其是消耗性植物，或可用於製造本發明所希望生物活性分子(如PUFA)之植物。“植物部分”，使用於此，包括植物之任一部分，包括，但不侷限於，種子(包括成熟與未成熟種子)、花粉、胚胎、花、果實、幼芽、葉子、根、樹幹、外植片體等。經基因修飾之植物具有一基因體，其修飾(即，突變或改變)自其正常形式(即，野生型或天然發生)，使得所希望之結果可達成(即，增加或修飾PUFA PKS活性，及/或使用PUFA PKS系統希望產物之製造與堆積)。植物之基因修飾可使用典型菌株發育，及/或分子基因技術達成。製造轉殖植物之方法，其中一重組核酸分子係編碼一希望之胺基酸序列，係加入植物之基因體中，為技術上已知。特佳之植物係依據本發明經基因修飾，較佳為適用於動物，包括人類消耗之植物。
本發明經基因修飾之較佳植物(即，植物宿主細胞)包括，但不侷限於任一較高植物，包括雙子葉與單子葉植物，尤其是消耗性植物(consumable plant)，包括作物，尤其是使用其油類之植物。此植物可包括，如：油菜(canola)、大豆、油菜(rapeseed)、亞麻子(linseed)、玉米、紅花(safflower)、葵花與煙草(tobacco)包括。其他較佳之植物為已知可製造用於醫藥試劑、香味劑、營養劑、功能性食品成分或化妝品活性成分之化合物者，或該植物經基因工程改造以製造這些化合物/試劑者。
如上所討論，本發明之PUFA PKS合成酶並不會利用FAS系統之脂肪酸產物。相反地，其會自FAS與鏈延長酶使用之小分子前驅物(丙二醯基－CoA)，製造最終PUFA產物(主要PUFA產物)。因此，並不會釋放出明顯量之合成循環之中間物，且該PUFA產物(於此亦稱之為主要PUFA產物)可有效轉移至脂質之磷脂質(PL)與三醯基甘油(TAG)部分中，事實上，PUFA PKS系統可製造二標的或主要PUFA產物(如來自裂殖壺菌(Schizochytrium)之PUFA PKS系統會製造DHA與DPA n－6為主要產物)，但DPA並非該路徑可製造DHA之中間產物。此外，每一者皆為相同PUFA PKS系統之單獨產物。因此，PUFA PKS基因為於異源性宿主如植物中，製造含有PUFA，尤其是長鏈PUFA(LCPUFAs)之油類之絕佳工具，其中該油類為中間產物之實質上自由形式(定義如下)，且該產物係由“標準”PUFA路徑(定義如下)製造。
因此，本發明之一目標為經由此述植物之基因操作，製造一聚不飽和脂肪酸，具有所希望之鏈長度與雙鍵數目，以及，延伸來說，包含這些PUFA之油類種子與此植物獲得之油類(即，由此植物之油類種子獲得)。可由本發明製造之PUFA範例包括，但不侷限於，DHA(二十二碳六烯酸(C22：6,n－3))、ARA(二十碳四烯酸或花生四烯酸(C20：4,n－6))、DPA(二十二碳五烯酸(C22：5,n－6或n－3))與EPA(二十碳五烯酸(C20：5,n－3))。本發明可允許製造商業上可購得之脂質，其富含一或多種希望之(標的或主要)PUFA，藉由本發明人發展之經基因修飾植物，透過使用會產生PUFA之聚酮合成酶－類似系統。
依據本發明，“主要PUFA”、“標的PUFA”，、“預期之PUFA”或“希望之PUFA”係指特定之PUFA或PUFA，其為製造PUFA之酵素路徑之預期或標的產物。例如，當使用鏈延長酶與去飽和酶修飾FAS系統之產物時，吾人可選擇鏈延長酶與去飽和酶之特定組合，當一同使用時，將產生一標的或希望之PUFA(如DHA或EPA)。如上所討論，此由標準路徑製造之標的或希望之PUFA，實際上可能並非“主要”PUFA，就PUFA佔該系統所製造之總脂肪酸百分比而言，由於中間產物與副產物之形成，其可實際上代表該系統製造之大部分產物。然而，吾人可使用術語“主要PUFA”，即使在指由系統中使用鏈延長酶或去飽和酶製造標的或預期PUFA產物時。
當使用PUFA PKS系統為本發明之較佳例時，所提供衍生自特定生物體之PUFA PKS系統，將製造特定之PUFA，使得經由篩選來自特定生物體PUFA PKS系統，便可導致特定標的或主要PUFA之製造。例如，使用來自裂殖壺菌(Schizochytrium)之PUFA PKS系統會導致DHA與DPAn－6之製造，為標的或主要PUFA。另一方面，使用來自各種沙雷菌(Shewanella)物種之PUFA PKS系統會導致EPA之製造，為標的或主要PUFA。值得注意的是，主要或標的PUFA之比例會依據特定PUFA PKS系統之篩選，以及該系統如何反應表現時之特定條件而不同。例如，使用來自破囊壺菌(thraustochytrium)23B(ATCC No.20892)之PUFA PKS系統，會導致DHA與DPAn－6之製造，為標的或主要PUFA；然而，在破囊壺菌(thraustochytrium)23B之情況下，DHA比DPAn－6之比例為約10：1(且可變化為約8：1至約40：1)，其中在裂殖壺菌(Schizochytrium)中，該比例一般為約2.5：1。因此，使用破囊壺菌(thraustochytrium)之PUFA PKS系統或蛋白質或區塊，可改變該生物體製造之PUFA之比例，與裂殖壺菌(Schizochytrium)相較，即使其標的PUFA相同。此外，吾人可修飾一PUFA PKS系統，藉由混合來自不同PUFA PKS系統或PUFA PKS與PKS系統之蛋白質與區塊，或吾人可修飾PUFA PKS系統之區塊或蛋白質，以改變標的PUFA產物及/或比例。
依據本發明，製造PUFA之酵素系統之“中間產物”或“副產物”係指任一產物，尤其是脂肪酸產物，其係由該酵素系統製造，為該系統製造標的或主要PUFA之結果，但並非主要或標的PUFA。在一實施例中，中間物與副產物可包括非標的脂肪酸，其自然地由野生型植物，或用於接受預定基因修飾之母株植物製造，但現在被分類為中間物或副產物，由於其被製造為較高含量，為基因修飾之結果，與野生型植物，或用於接受預定基因修飾之母株植物製造者相較。中間物或副產物在PUFA合成之標準路徑中特別明顯，且在PUFA PKS路徑上實質不明顯，如上所討論。值得注意的是，一酵素系統之主要或標的PUFA可為不同酵素系統之中間物，其中該主要或標的產物為不同之PUFA，此現象相當正確，對於製造PUFA之標準路徑之產物而言，由於PUFA PKS系統會實質上防止中間產物之製造。例如，當使用標準路徑製造EPA時，脂肪酸如GLA、DGLA與SDA係以中間產物形式製造，具明顯大量(如美國專利申請案公開號2004/0172682說明了此點)。同樣地，美國專利申請案公開號2004/0172682亦說明，當使用標準路徑製造DHA，除了上述之脂肪酸，ETA與EPA(注意上述第一範例之PUFA)係以明顯量製造，事實上，為總脂肪酸中相當明顯大量，與其本身之標的PUFA相較。後者觀點亦顯示於美國專利申請案公開號2004/0172682，其中一植物係經基因工程製造DHA，以標準路徑製造更多之EPA，其在總脂肪酸中之百分比較DHA高出許多。
為了製造明顯高產量之一或多種所希望之聚不飽和脂肪酸，植物可經基因修飾，以引入PUFA PKS系統於該植物中。植物已知並無內生性包含一PUFA PKS系統，因此，本發明之PUFA PKS系統係代表一機會，可產生具有獨特脂肪酸製造能力之植物。本發明之一尤佳實施例為，經基因工程改造之植物，以於相同植物中製造一或多種PUFA，包括EPA、DHA、DPA(n3或n6)、ARA、GLA、SDA與其他。本發明係提供一種能力，可創造數種“設計者油類”，具有各種比例與形式。此外，所揭示來自特定海洋生物體之PUFA PKS基因，於此所述，係提供一種機會，可立即延伸PUFA製造之範圍，並成功製造PUFA，在大部分作物成長之範圍內。
因此，本發明之一實施例係相關於一種經基因修飾之植物或植物之一部分(如其中該植物已經基因修飾，以表現PUFA PKS系統，如此所述)，其包括核心PUFA PKS酵素複合體與PPTase，如此所述，其中該植物經更進一步基因修飾，以表現一附屬蛋白，如此所述，以增進宿主中PUFA(PUFA PKS系統之其他生物活性產物)之製造及/或堆積，及/或其中該植物經基因修飾，以抑制與PUFA PKS系統競爭之路徑(如抑制FAS系統)，如此所述。較佳為，此附屬蛋白為一ACoAS及/或一蛋白質，其利用PUFA－CoA作為受質，以形成PL或TAG(如GPAT、LFAAT或DAGAT)，使得該植物製造PUFA。
較佳為，此額外之基因修飾可為任一修飾(天然發生、經篩選或合成)，其可增加通過PUFA合成酶路徑之流通量，藉由降低與丙二醯基－CoA匯集物之競爭。有許多可能之方法達成增強與此受質競爭之能力。這些方法包括，但不侷限於，1)競爭路徑之抑制，包括抑制FAS路徑上之任一元素，如藉由降低涉及這些路徑之酵素或次單元之表現(如藉由使用反義股RNA、RNAi、共抑制或突變)，2)在異源性宿主中PUFA合成酶之表現，其中競爭路徑已被降低或阻斷(如在油菜(Canola)中，其中在細胞質中延長脂肪酸之能力已被阻斷)，及/或3)增加丙二醯基－CoA之匯集物(如藉由表現乙醯基－CoA羧基酶)。在一實施例中，KASII及/或KASIII係於該植物中抑制(如藉由RNAi或反義股)。
如上所述，該使用於本發明之經基因修飾植物，已經基因修飾表現PUFA PKS系統。該PUFA PKS系統可包括任一PUFA PKS系統，如任一PUFA PKS系統，描述於如美國專利號6,566,583；美國專利申請案公開號20020194641；美國專利申請案公開號20040235127；美國專利申請案公開號20050100995；與PCT公開號WO 2006/135866。該PUFA PKS系統可選自，但不侷限於，任一特定之PUFA PKS系統，已於這些專利或專利公開案中辨識出並鑑定，如來自裂殖壺菌(Schizochytrium)sp.，美國菌種中心(ATCC)No.20888之PUFA PKS系統，及其衍生之突變株(如菌株N230D)；破囊壺菌(thraustochytrium)23B ATCC No.20892，及其衍生之突變株；沙雷菌(Shewanella olleyana)南極微生物體澳洲菌種中心(ACAM)菌株編號644，及其衍生之突變株；或沙雷菌(Shewanella japonica)ATCC菌株編號BAA－316，及其衍生之突變株。
在一實施例中，該PUFA PKS系統係包含一區塊，選自於上述任一PUFA PKS系統，其中該區塊係合併(混合與匹配)形成一完整之PUFA PKS系統，符合上述之最低需求。該植物可更進一步經另一PKS系統之至少一區塊或生物活性片段修飾，該系統包括，但不限制於，第I型PKS系統(迭代式或模塊式)、第II型PKS系統，及/或第III型PKS系統，其可取代PUFA PKS系統之一區塊。最後，PUFA PKS系統之任一區塊可修飾自其天然結構，以修飾或強化PUFA PKS系統之該區塊之功能(如修飾PUFA種類或其於該系統之製造比例)。混合此區塊以製造嵌合性PUFA PKS蛋白質，係描述於上述專利與專利公開案中。
較佳為，具有上述定義特徵之植物為經基因修飾以表現PUFA PKS系統(PUFA合成酶)之植物，如此詳細描述(即PUFA PKS系統為製造植物中標的PUFA之酵素系統)。在一實施例中，該植物經基因修飾，以表現一PUFA PKS系統，其包含PUFA PKS蛋白質/區塊，來自破囊壺菌(thraustochytrid)，包括，但不侷限於，裂殖壺菌(Schizochytrium)、破囊壺菌(thraustochytrium)、巫肯尼亞菌(Ulkenia)、加彭歐凱崔恩菌(Japonochytrium)、不遊走壺菌(Aplanochytrium)、歐索爾尼亞菌(Althornia)或艾利納菌(Elina)。在一實施例中，該植物經基因修飾以表現一PUFAPKS系統，其包含來自網黏菌(labrynthulid)之PUFA PKS蛋白質/區塊。在另一實施例中，該植物經基因修飾以表現PUFA PKS系統，其包含來自海洋細菌之PUFA PKS蛋白質/區塊，包括，但不侷限於，沙雷菌(Shewanella japonica)或沙雷菌(Shewanella olleyana)。在一實施例中，該植物經基因修飾以表現一PUFA PKS系統，其包含裂殖壺菌(Schizochytrium)OrfsA、B與C(包括其同源物或合成物)，及PPTase(如HetI)，如上所述(如SEQ ID NOs：1－32與SEQ ID NO：33，及有關上述裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA PKS系統之討論)。在另一實施例中，該植物經基因修飾以表現一PUFA PKS系統，其包含破囊壺菌(thraustochytrium)OrfsA、B與C(包括其同源物或合成物)，與PPTase(如HetI)，如上所述(如SEQ ID NOs：38－68與SEQ ID NO：33，以及上述有關破囊壺菌(thraustochytrium)PUFA PKS系統之討論；亦請見美國專利申請案公開號20050014231)。在另一實施例中，該植物經基因修飾以表現一PUFA PKS系統，其包含其他破囊壺菌(thraustochytrid)OrfsA、B與C(包括其同源物或合成物)，與PPTase(如HetI)(如PCT專利公開號WO 05/097982)。在另一實施例中，該植物經基因修飾以表現一PUFA PKS系統，其包含PUFA PKS Orfs，來自海洋細菌如沙雷菌(Shewanella)(包括其同源物或合成物)，與PPTase(如內生性沙雷菌(Shewanella)PPTase)，如上所述，(如SEQ ID NOs：1－6，有關沙雷菌(Shewanella japonica)，SEQ ID NOs：7－12，有關沙雷菌(Shewanella olleyana))。在另一實施例中，該植物經基因修飾以表現來自此PUFA PKS系統之區塊與蛋白質之任一組合(如嵌合PUFA PKS系統)。
最後，如上所述，該植物之基因修飾可包括引入一或多種附屬蛋白，其可與核心PUFA PKS酵素複合體共同作用，以允許、加速或強化該植物製造PUFA，及/或可強化丙二醯CoA受質通過PUFA PKS系統之流通量之基因修飾，如藉由抑制此述之FAS系統，或使用其他策略以達到此述之相同結果。該植物之基因修飾亦可包括該基因之宿主密碼子使用最佳化，以及引導PUFA合成酶酵素至特定胞器(如色素體)。
較佳為，該植物為一油類種子植物，其中該油類種子，及/或油類種子中之油類，係包含PUFA PKS系統製造之PUFA。此油類包含一可偵測量之至少一標的或主要PUFA，其為PUFA PKS系統之產物。此外，此油類實質上不含中間產物或副產物，其並非標的或主要PUFA產物，且其並非天然地由野生型植物之內生性FAS系統製造(即野生型植物製造某些較短或中間長度之PUFA，如18個碳之PUFA，經由FAS系統，但為該植物中製造之新穎或額外之脂肪酸，為經PUFA PKS系統基因修飾之結果)。換句話說，與野生型(非經基因修飾)植物或預定接受經基因修飾之母植物之總脂肪酸分佈相較，該植物製造之總脂肪酸分佈之大部分其他脂肪酸(新穎之脂肪酸或由於基因修飾增加之脂肪酸)，已經PUFA PKS系統基因修飾，包含標的或預期之PUFA PKS系統之PUFA產物(即該植物製造之總脂肪酸分佈之大部分其他或新穎之脂肪酸為標的PUFA)。
此外，合成PUFA之系統“實質上不含”中間產物或副產物於實際量中，係指任一中間產物或副產物脂肪酸(非標的PUFA)，其由經基因修飾之植物(及/或植物之部分及/或種子油類分液)製造，為該製造PUFAS之酵素系統引入或存在之結果(即非由野生型植物或用於基因修飾之母株植物製造)，其量小於植物總脂肪酸之約10%重，較佳小於約9%,，更佳小於約8%，尤佳小於約7%，特佳小於約6%,，更佳小於約5%，更佳小於約4%，更佳小於約3%，更佳小於約2%，更佳小於約1%重之植物製造之總脂肪酸，更佳小於約0.5%重之植物製造之總脂肪酸。
在一較佳實施例中，合成PUFA之系統“實質上不含”中間產物或副產物，或不具有中間產物或副產物於實際量中，係指任一中間產物或副產物脂肪酸，其由經基因修飾植物(及/或植物之部分及/或種子油類分液)製造，為該製造PUFAS之酵素系統引入或存在之結果(即非由野生型植物或用於接受基因修飾之母株植物製造)，其量小於植物製造之總脂肪酸之約10%重(額外脂肪酸係定義為並非由野生型植物，或用於製造標的PUFA之基因修飾之母株植物天然製造之脂肪酸含量)，較佳為小於約9%，更佳小於約8%，尤佳小於約7%，特佳小於約6%，更佳小於約5%，更佳小於約4%，更佳小於約3%，更佳小於約2%，更佳小於約1%種之該植物製造之總脂肪酸。因此，相對於經基因修飾、經由標準路徑製造PUFA之植物之脂肪酸分佈，由PUFA PKS系統基因修飾產生之主要脂肪酸產物將為標的或預期之脂肪酸產物。
當PUFA PKS系統之標的產物為長鏈PUFA，如DHA、DPA(n－6或n－3)或EPA時，並未在經PUFA PKS基因修飾植物之總脂質中佔有實質量之中間產物與副產物為，但不侷限於：γ－次亞麻油酸(GLA；18：3,n－6)；十八碳四烯酸(STA或SDA；18：4,n－3)；二高－γ－次亞麻油酸(DGLA或HGLA；20：3,n－6)、花生四烯酸(ARA,C20：4,n－6)；二十碳三烯酸(ETA；20：3,n－9)，以及各種其他中間產物或副產物，如20：0；20：1(△5)；20：1(△11)；20：2(△8,11)；20：2(△11,14)；20：3(△5,11,14)；20：3(△11,14,17)；蜂蜜酸(20：3；△5,8,11)；或20：4(△5,1,14,17)。此外，當標的產物特別為PUFA，如DHA時，並未在經基因修飾植物之總脂質中佔有實質量之中間產物與副產物，亦包括其他PUFA，其為不同PUFA PKS系統之天然產物，如EPA，在此範例中。值得注意的是，本發明之PUFA PKS系統亦可使用於，若希望的話，製造標的PUFA，其可包括GLA、SDA或DGLA。
使用此述PUFA PKS系統之基因基礎與區塊結構知識，本發明設計並製造出編碼此PUFA PKS系統之建構物，並已成功地製造出基因轉殖植物，表現PUFA PKS系統。該基因轉殖植物製造含有PUFA之油類，且該油類實質上不含中間產物，其於標準PUFA路徑中堆積。本發明人亦呈現了使用該建構物製造PUFA於另一真核生物，酵母菌中，此為概念驗證實驗，在製造基因轉殖植物之前。該範例呈現了具有PUFA PKS系統之酵母菌與植物，其會製造DHA與DPAn－6為標的PUFA，係製造這些PUFA之二者為主要額外脂肪酸，於該植物與酵母菌之總脂肪酸中(即，減去野生型植物製造之脂肪酸)，此外，任一其他為出現於野生型植物或植物母株脂肪酸中之其他脂肪酸，實際上未偵測到。經基因修飾之植物與其油類部分之特定特徵，係如下所述。
依據本發明，經基因修飾脂質物包括一植物，其使用重組技術修飾，可與典型突變與篩選技術合併。如此所述，會導致基因表現降低、基因功能降低或基因產物之功能降低之基因修飾(即，由該基因編碼之蛋白質)可稱之為一基因之失活(完全或部分)、剔除、干擾阻斷或降低調節。例如，一基因之基因修飾，其會導致由此基因編碼之蛋白質功能之降低，可為該基因完全剔除之結果(即，該基因不存在，因此該蛋白質不存在)，基因突變，其會導致蛋白質之不完全或無轉譯(如該蛋白質未表現)，或基因突變，其降低或抵銷蛋白質之天然功能(如一蛋白質之表現係降低或無酵素活性或作用)。基因修飾，其導致基因表現或功能之增加，可稱之為一基因之倍增、過度表現、活化、強化、加成或加強調節。
本發明植物之基因修飾可導致該植物製造一或多種PUFA。該植物製造之PUFA分佈與PUFA比例，並不需要與該PUFA PKS系統衍生之生物體所製造之PUFA分佈與PUFA比例相同。
就經基因修飾植物之製造而言，基因工程改造植物之方法為技術上已知。例如，數種植物轉型之方法已發展出，包括生物性與物理性轉型流程。請見，如Miki et al.,“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.and Thompson,J.E.Eds.(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993)pp.67－88。此外，植物細胞或植物之組織轉型與再生用之載體與體外培養方法，皆可獲得。請見，如，Gruber et al.,“Vectors for Plant Transformation”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.and Thompson,J.E.Eds.(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993)pp.89－119。
最廣泛用於引入一表現載體至植物中之方法，係基於農桿菌(Agrobacterium)之天然轉型系統。請見，如，Horsch et al.,Science 227：1229(1985)。根瘤農桿菌(A.tumefaciens)與髮根農桿菌(A.rhizogenes)為植物病理土壤細菌，其可使植物細胞基因轉型。根瘤農桿菌(A.tumefaciens)與髮根農桿菌(A.rhizogenes)之Ti與Ri質體，係分別攜帶對應之使植物基因轉型之基因。請見，如，Kado,C.I.,Crit.Rev.Plant.Sci.10：1(1991)。關於農桿菌載體系統與農桿菌媒介之基因轉移方法之描述，係提供於數種文獻中，包括Gruber et al.,supra,Miki et al.,如上所述,Moloney et al.,Plant Cell Reports 8：238(1989)，與美國專利號4,940,838與5,464,763。
另一植物轉型之一般應用方法為微噴射(microprojectile)－媒介轉型，其中DNA係攜帶於微噴射之表面。表現之載體係引入植物組織中，使用基因槍(biolistic)裝置，其可加速微噴射粒子至足以穿透植物細胞壁與細胞膜之速度。Sanford et al.,Part.Sci.Technol.5：27(1987),Sanford,J.C.,Trends Biotech.6：299(1988),Sanford,J.C.,Physiol.Plant 79：206(1990),Klein et al.,Biotechnology 10：268(1992)。
另一物理性傳送DNA至植物中之方法為將標的細胞超音波震盪。Zhang et al.,Bio/Technology 9：996(1991)。此外，微脂體或球狀體(spheroplast)融合已用於引入表現載體至植物中。Deshayes et al.,EMBO J.,4：2731(1985),Christou et al.,Proc Natl.Acad.Sci.USA 84：3962(1987)。DNA直接攝入於原生質體(protoplast)中，使用CaCl2 沈澱、聚乙二醇或聚－L－烏胺酸(ornithine)，已經報導。Hain et al.,Mol.Gen.Genet.199：161(1985)與Draper et al.,Plant Cell Physiol.23：451(1982)。原生質體與全細胞與組織之電破法已經描述。Donn et al.,In Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC,A2－38,p.53(1990)；D'Halluin et al.,Plant Cell 4：1495－1505(1992)與Spencer et al.,Plant Mol.Biol.24：51－61(1994)。
因此，本發明係包含基因修飾植物細胞之方法，藉由使用來自海洋細菌、任一破囊壺菌(thraustochytrid)或其他真核PUFA PKS系統之基因，更可利用基因混合，以延伸及/或改變PUFA產物之範圍，包括EPA、DHA、DPA(n－3或n－6)、ARA、GLA、SDA與其他。獲得這些經改變PUFA製造分佈之方法，包括混合來自不同生物體之基因至破囊壺菌(thraustochytrid)PUFA PKS基因上，以及基因修飾該內生性破囊壺菌(thraustochytrid)PUFA PKS基因之方法，如此所述。有關破囊壺菌(thraustochytrid)PUFA PKS系統與海洋細菌PUFA PKS系統之基因基礎與區塊結構之知識，係提供設計新穎之經基因修飾生物體之基礎，其可製造各種PUFA分佈。新穎之PUFA PKS建構物係製備於微生物體中，如破囊壺菌(thraustochytrid)或大腸桿菌，可經分離之出並使用於使植物轉型，以輸入類似之PUFA製造特性至該植物中。包含於本發明中有關PUFA PKS系統特定修飾之詳細討論請參照，如美國專利申請案公開號20020194641；美國專利申請案公開號20040235127；與美國專利申請案公開號20050100995)。
經基因修飾之植物較佳係培養於發酵培養基中，或成長於適當之基質如土壤中。一適當或有效之發酵培養基已如上述詳細討論。適用於較高等植物之成長培養基，包括，但不侷限於，土壤、沙子、任一其他可支撐根部生長之特定介質(如蛭石(vermiculite)、珍珠岩(perlite)等)或水栽培養，以及適當之光線、水與營養補充物，使較高等植物之生長最佳化。本發明經基因修飾之植物係經基因改造，以製造PUFA，經由PUFA PKS系統之活性。該PUFA可經由純化過程回收，可自植物中萃取該化合物。在一較佳實施例中，該PUFA係經該植物中收穫而回收。在一特佳實施例中，PUFA係由該植物之油類中收穫而回收(如自油類種子)。該植物亦可以其自然狀態消耗或更進一步處理為可消耗產品。
較佳為，本發明之經基因修飾植物係製造一或多種聚不飽和脂肪酸，包括，但不侷限於，EPA(C20：5、n－3)、DHA(C22：6、n－3)、DPA(C22：5、n－6或n－3)、ARA(C20：4、n－6)、GLA(C18：3、n－6)、ALA(C18：3,n－3)，及/或SDA(C18：4,n－3))，較佳為，一或多種長鏈脂肪酸(LCPUFAs)，包括，但不侷限於，EPA(C20：5,n－3)、DHA(C22：6,n－3)、DPA(C22：5,n－6或n－3)或DTA(C22：4,n－6)。在一特佳實施例中，本發明經基因修飾之植物係製造一或多種聚不飽和脂肪酸，包括，但不侷限於，EPA(C20：5,n－3)、DHA(C22：6,n－3)，及/或DPA(C22：5,n－6或n－3)。
因此，本發明之一實施例係相關於一種植物，較佳為一油類種子植物，其中該植物係製造(如於其成熟種子中，若為一油類種子植物，或於油類種子植物之種子之油類)至少一PUFA(標的PUFA)，且其中該植物或可堆積PUFA之植物部分之總脂肪酸分佈(如於其成熟種子中，若為一油類種子植物，或於油類種子植物之種子之油類)，包含一可偵測量之此PUFA或PUFA。較佳為，該標的PUFA為至少20個碳之PUFA，並包含至少3個雙鍵，更佳至少4個雙鍵，尤佳為，至少5個雙鍵。此外，該標的PUFA較佳為一PUFA，其非天然地由該植物製造(即，缺乏該基因修飾之野生型植物，或作為基因修飾接受者之植物母株)。較佳為，該植物或可堆積PUFA之植物部分之總脂肪酸分佈(包括該植物之種子油類)係包含至少約0.1%之標的PUFA，佔總脂肪酸之重量，較佳至少約0.2%，更佳至少約0.3%，尤佳至少約0.4%，更佳至少約0.5%，更佳至少約1%，更佳至少約1.5%，更佳至少約2%，更佳至少約2.5%，更佳至少約3%，更佳至少約3.5%，更佳至少約4%，更佳至少約4.5%，更佳至少約5%，更佳至少約5.5%，更佳至少約10%，更佳至少約15%，更佳至少約20%，更佳至少約25%，更佳至少約30%，更佳至少約35%，更佳至少約40%，更佳至少約45%，更佳至少約50%，更佳至少約55%，更佳至少約60%，更佳至少約65%，更佳至少約70%，更佳至少約75%，更佳至少約75%之至少一聚不飽和脂肪酸(標的PUFA或PUFA)，佔該植物製造之總脂肪酸重量，或自0.1%至75%之任一百分比，或大於75%(至多100%或約100%)，以0.1%增加量，之標的PUFA。如此一般所述，製造之PUFA百分比係以該生物體(植物)製造之總脂肪酸之重量為基準，除非另有指出(如在某些情況下，百分之重係相對於由該酵素複合體，如PUFA PKS系統，製造之總脂肪酸)。在一實施例中，由該植物製造之總脂肪酸係以重量百分比表示，係以氣相層析法分析脂肪酸甲酯(FAME)製備物，雖然總脂肪酸之決定並不受限於此方法。
如上所述，由上述植物(及/或植物部分或種子油類分液)製造之總脂肪酸之其他特徵為，這些由該植物製造之總脂肪酸包含小於(或不含任何大於)約10%重之任一脂肪酸，標的PUFA除外，其係由製造標的PUFA之酵素複合體製造。較佳為，由製造標的PUFA之酵素複合體製造之脂肪酸(如為該植物經製造標的PUFA之酵素或酵素複合體基因修飾之結果)，標的PUFA除外，存在量係小於約9%，更佳小於約8%，尤佳小於約7%，特佳小於約6%，更佳小於約5%，更佳小於約4%，更佳小於約3%，更佳小於約2%，更佳小於約1%重之該植物製造之總脂肪酸。
在另一實施例中，該製造標的PUFA之酵素複合體製造之任一脂肪酸，標的PUFA除外，之存在量係小於(或不大於)約10%重之該酵素複合體製造之總脂肪酸，該複合體可於植物中製造標的PUFA(即，此測量係限制於由製造標的PUFA之酵素複合體製造之總脂肪酸)，更佳小於約9%，尤佳小於約8%，特佳小於約7%，更佳小於約6%，更佳小於約5%，更佳小於約4%，更佳小於約3%，更佳小於約2%，更佳小於約1%重之總脂肪酸，且，更佳小於約0.5%重之總脂肪酸，其由製造標的PUFA之酵素複合體製造。
在本發明此實施例之另一觀點中，該由該植物製造之總脂肪酸(及/或植物部分或種子油類分液)係含有小於(或不大於)10%重PUFA，其具有18或更多個碳，佔該植物製造之總脂肪酸重量，標的PUFA或野生型(非經基因修飾)植物，或預定之基因修飾接受者之植物母株存在之PUFA除外。在另一觀點中，由該植物(及/或植物部分或種子油類分液)製造之總脂肪酸，含有小於約9% PUFA，其具有18或更多個碳，或小於8% PUFA，其具有18或更多個碳，或小於7% PUFA，其具有18或更多個碳，或小於6% PUFA，其具有18或更多個碳，或小於5% PUFA，其具有18或更多個碳，或小於4% PUFA，其具有18或更多個碳，或小於3% PUFA，其具有18或更多個碳，或小於2% PUFA，其具有18或更多個碳，或小於1% PUFA，其具有18或更多個碳，重之總脂肪酸，由該植物製造，標的PUFA或野生型(非經基因修飾)植物，或預定之基因修飾接受者之植物母株存在之PUFA除外。
在本發明此實施例之另一觀點中，由該植物(及/或植物部分或種子油類分液)製造之總脂肪酸含有小於(或不大於)10% PUFA，其具有20或更多個碳，重之總脂肪酸，由該植物製造，標的PUFA或野生型(非經基因修飾)植物，或預定之基因修飾接受者之植物母株存在之PUFA除外。在另一觀點中，由該植物(及/或植物部分或種子油類分液)製造之總脂肪酸含有小於(或不大於)9% PUFA，其具有20或更多個碳，或小於8% PUFA，其具有20或更多個碳，或小於7% PUFA，其具有20或更多個碳，或小於6% PUFA，其具有20或更多個碳，或小於5% PUFA，其具有20或更多個碳，或小於4% PUFA，其具有20或更多個碳，或小於3% PUFA，其具有20或更多個碳，或小於2% PUFA，其具有20或更多個碳，或小於1% PUFA，其具有20或更多個碳，重之總脂肪酸，由該植物製造，標的PUFA或野生型(非經基因修飾)植物，或預定之基因修飾接受者之植物母株存在之PUFA除外。
在一實施例中，由該植物(及/或植物部分或種子油類分液)製造之總脂肪酸含有小於(或不大於)10%重之由該植物製造之總脂肪酸，更佳小於約9%，更佳小於約8%，更佳小於約7%，更佳小於約6%，更佳小於約5%，更佳小於約4%，更佳小於約3%，更佳小於約2%，更佳小於約1%之脂肪酸，選自於下列任一或更多者：γ－次亞麻油酸(GLA；18：3,n－6)；十八碳四烯酸(stearidonic acid)(STA或SDA；18：4,n－3)；二高－γ－次亞麻油酸(DGLA或HGLA；20：3,n－6)、花生四烯酸(ARA,C20：4,n－6)：二十碳三烯酸(ETA；20：3,n－9)與各種其他脂肪酸，如20：0；20：1(△5)；20：1(△11)；20：2(△8,11)；20：2(△11,14)；20：3(△5,11,14)；20：3(△11,14,17)；蜂蜜酸(20：3；△5,8,11)；或20：4(△5,1,14,17)。
在另一實施例中，於該植物中製造長鏈PUFA之酵素系統製造之脂肪酸，含有小於約10%重之脂肪酸，選自：γ－次亞麻油酸(GLA；18：3,n－6)；十八碳四烯酸(STA或SDA；18：4,n－3)；二高－γ－次亞麻油酸(DGLA或HGLA；20：3,n－6)、花生四烯酸(ARA,C20：4,n－6)；二十碳三烯酸(ETA；20：3,n－9)與各種其他脂肪酸，如20：0；20：1(△5)；20：1(△11)；20：2(△8,11)；20：2(△11,14)；20：3(△5,11,14)；20：3(△11,14,17)；蜂蜜酸(20：3；△5,8,11)；或20：4(△5,1,14,17)，佔該植物製造之總脂肪酸百分比較佳小於約9%，更佳小於約8%，尤佳小於約7%，特佳小於約6%，更佳小於約5%，更佳小於約4%，，更佳小於約3%，更佳小於約2%，更佳小於約1%之脂肪酸，選自於：γ－次亞麻油酸(GLA；18：3,n－6)；十八碳四烯酸(STA或SDA；18：4,n－3)；二高－γ－次亞麻油酸(DGLA或HGLA；20：3,n－6)、花生四烯酸(ARA,C20：4,n－6)；二十碳三烯酸(ETA；20：3,n－9)與各種其他脂肪酸，如20：0；20：1(△5)；20：1(△11)；20：2(△8,11)；20：2(△11,14)；20：3(△5,11,14)；20：3(△11,14,17)；蜂蜜酸(20：3；△5,8,11)；或20：4(△5,1,14,17)。
在另一實施例中，於該植物中製造長鏈PUFA之酵素系統製造之脂肪酸，含有小於約10%重之脂肪酸之下列所有PUFA，選自：γ－次亞麻油酸(GLA；18：3,n－6)，具有18個碳與4個碳－碳雙鍵之PUFA，具有20個碳與3個碳－碳雙鍵之PUFA，以及具有22個碳與2或3個碳－碳雙鍵之PUFA，佔該植物製造之總脂肪酸百分比，較佳小於約9%，更佳小於約8%，尤佳小於約7%，特佳小於約6%，更佳小於約5%，更佳小於約4%，更佳小於約3%，更佳小於約2%，更佳小於約1%之下列所有PUFA：γ－次亞麻油酸(GLA；18：3,n－6)，具有18個碳與4個碳－碳雙鍵之PUFA，具有20個碳與3個碳－碳雙鍵之PUFA，具有22個碳與2或3個碳－碳雙鍵之PUFA。
在另一實施例中，於該植物中製造長鏈PUFA之酵素系統製造之脂肪酸，含有小於約10%重之脂肪酸之下列所有PUFA，選自：γ－次亞麻油酸(GLA；18：3,n－6)，具有18個碳與4個碳－碳雙鍵之PUFA，具有20個碳與3個碳－碳雙鍵之PUFA，具有22個碳與2或3個碳－碳雙鍵之PUFA，佔該植物製造之總脂肪酸百分比，較佳小於約9%，更佳約小於8%，尤佳約小於7%，特佳約小於6%，更佳約小於5%，更佳約小於4%，更佳約小於3%，更佳約小於2%，更佳約小於1%之下列PUFA之每一者：γ－次亞麻油酸(GLA；18：3,n－6)，具有18個碳與4個碳－碳雙鍵之PUFA，具有20個碳與3個碳－碳雙鍵之PUFA，具有22個碳與2或3個碳－碳雙鍵之PUFA。
於該植物中製造長鏈PUFA之酵素系統製造之脂肪酸，含有小於約10%重之脂肪酸之下列任一PUFA，選自：γ－次亞麻油酸(GLA；18：3,n－6)，具有18個碳與4個碳－碳雙鍵之PUFA，具有20個碳與3個碳－碳雙鍵之PUFA，具有22個碳與2或3個碳－碳雙鍵之PUFA，佔該植物製造之總脂肪酸百分比，較佳小於約9%，更佳約小於8%，尤佳約小於7%，特佳約小於6%，更佳約小於5%，更佳約小於4%，更佳約小於3%，更佳約小於2%，更佳約小於1%之下列PUFA之一或多者：γ－次亞麻油酸(GLA；18：3,n－6)，具有18個碳與4個碳－碳雙鍵之PUFA，具有20個碳與3個碳－碳雙鍵之PUFA，具有22個碳與2或3個碳－碳雙鍵之PUFA。
在本發明實施例之一觀點中，該植物製造至少二標的PUFA，且該植物或堆積PUFA之植物部分(包括油類種子之油)之總脂肪酸，包含可偵測量之這些PUFA。在此實施例中，該PUFA較佳每一者至少為20個碳之PUFA，並包含至少3個雙鍵，更佳至少4個雙鍵，尤佳至少5個雙鍵。此PUFA較佳係選自DHA、DPAn－6與EPA。在一觀點中，該植物係製造DHA與DPAn－6，DHA比DPAn－6之比例為約1：10至約10：1，包括之間之任一比例。在一實施例中，DHA比DPA之比例為約1：1至約3：1，在另一實施例中約2.5：1。在一實施例中，該植物係製造DHA與EPA。
在本發明此實施例之另一觀點中，該植物製造之總脂肪酸分佈，係由第13圖或第14圖表示。
本發明更包括任一由此述植物製造之種子，以及該由植物或此述種子製造之油類。本發明亦包括使用此植物、種子或此述油類製造之任一產物。
本發明經基因修飾之生物體之使用
本發明之一實施例為一製造所希望之生物活性分子之方法(亦稱之為產物或化合物)，藉由成長或培養本發明之經基因修飾生物體(如一微生物體或一植物)(如上所述)。較佳為，該生物活性分子為PUFA，較佳為LCPUFA。較佳為，該經基因修飾生物體為一經基因修飾微生物體或一經基因修飾植物。此方法包括，例如，分別於發酵培養基中培養或於適當環境下，如土壤，成長該微生物體或植物之步驟，該生物體具有前述之基因修飾，如本發明所述。用於基因修飾之較佳宿主細胞與生物體，其相關於本發明之PUFA PKS系統，係如上所述。
本發明之一實施例為一種藉由培養本發明經基因修飾微生物體而製造希望之PUFA之方法(如上所述)。此方法包括在發酵培養基與可有效於該微生物體中，其具有上述並與本發明一致之基因修飾，製造PUFA條件下培養之步驟。一適當或有效之培養基係指任一培養基，其中本發明之一經基因修飾之微生物體，當培養時，可製造所希望之PUFA產物。此培養基一般為一水溶液培養基，包含可吸收之碳、氮與磷來源。此培養基亦可包括適當之鹽類、礦物質、金屬與其他營養物。本發明之任一微生物體可培養於一般發酵用生物反應器中。該微生物體可培養於任一發酵流程中，其包括，但不侷限於，批次、進料批次、細胞再循環與連續式發酵。本發明較佳之破囊壺菌(thraustochytrid)微生物體生長條件為技術上已知，並詳細描述於如美國專利號5,130,242、美國專利號5,340,742與美國專利號5,698,244，在此併入本案以作為參考資料。
由該經基因修飾微生物體製造之所希望之PUFA，及/或其他生物活性分子，可回收自發酵培養基，使用一般分離與純化技術。例如，該發酵培養基可經過濾或離心，以移除微生物體、細胞殘骸與其他特殊物質，且該產物可以一般方法移除自不含細胞之上清液，如，離子交換法、層析法、萃取、溶劑萃取、相分離、膜分離、電透析、逆向滲透、蒸餾、化學衍生法與結晶法。此外，製造PUFA之微生物體或其萃取物與各分液，可直接使用，而不需移除該產物之微生物體成分。
較佳為，PUFA之製造量係大於約5%微生物體乾燥重量，且在一觀點中，其量係大於約6%，在另一觀點中，其量大於約7%，在另一觀點中，其量大於約8%，在另一觀點中，其量大於約9%，在另一觀點中，其量大於約10%，以此類推，佔整體百分比至多大於90%微生物體乾燥重量(如15%、20%、30%、40%、50%，及介於其間之任一百分比)。
較佳為，有興趣之生物活性化合物係由該經基因修飾之微生物體製造，其量大於約0.05%，較佳大於約0.1%，更佳大於約0.25%，尤佳大於約0.5%，特佳大於約0.75%，更佳大於約1%，更佳大於約2.5%，更佳大於約5%，更佳大於約10%，更佳大於約15%，尤佳大於約20%之微生物體乾燥重量。就脂質化合物而言，較佳為，此化合物之製造量係大於約5%之微生物體乾燥重量。就其他生物活性化合物而言，如抗生素或以較小量合成之化合物，這些殖株具有此化類合物，其佔微生物體乾燥重量之百分比，係經辨識出，預測含有上述種類之新穎PKS系統。在某些實施例中，特定之生物活性分子(化合物)係由該微生物體分泌，而非堆積。因此，此生物活性分子一般係回收自培養基中，且其製造之分子濃度將取決於該微生物體與培養之規模。
在本發明之一製造所希望生物活性化合物之方法中，經基因修飾之植物係培養於發酵培養基，或於適當環境下，如土壤中成長。一適當或有效之發酵培養基係如上述。用於高等植物之適當成長培養基包括，但不侷限於，土壤、沙質、任一其他可支撐根部生長之培養基(如蛭石(vermiculite)、珍珠岩(perlite)等)或水栽培養，以及適當之光線、水與營養補充物，其可使較高等植物生長最佳化。本發明經基因修飾之植物係經改造，以製造大量之希望產物，經由PUFA PKS系統之活性，與本發明其他異源性蛋白質(PUFA PKS系統之附屬蛋白)。該化合物可經由純化過程回收，其可自該植物萃取出化合物。在一較佳實施例中，該化合物係以收穫該植物而回收。在此實施例中，該植物可於其自然狀態下被消耗，或更進一步處理成可消耗產物。
本發明更包括任一此述生物體或其部分(如微生物體與其製劑或分液，或植物、植物部分(如油類種子)，或其製劑或分液)，以及由此述生物體製造之任一油類。本發明亦包括任一產物，使用該生物體、其部分或此述之油類製造。
本發明之一實施例係相關於一種修飾含有至少一脂肪酸之產物之方法，包含加入一生物體、其部分，或由本發明與此述之經基因修飾生物體(如一植物或微生物體，其經PUFA PKS系統基因修飾，使用此述製造及/或堆積PUFA之增進策略，並具有此述之脂肪酸分佈)製造之油類至該產物中。由此方法製造之產物，或一般包含此述任一生物體、其部分或得自該生物體之油類，亦包含於本發明中。
較佳為，該產物係選自於由食物、飲食補充品、醫藥配方、人源化動物乳與嬰兒配方乳組成之族群。適當之醫藥配方包括，但不侷限於，抗發炎配方、化療試劑、活性賦形劑、骨質疏鬆藥物、抗憂鬱劑、抗痙攣劑、抗幽門桿菌藥物、治療神經退化疾病藥物、治療退化性肝病之藥物、抗生素、與膽固醇降低配方。在一實施例中，該產物係用於治療一病症，選自於由：慢性發炎、急性發炎、腸胃疾病、癌症、惡病質、心臟再狹窄、神經退化疾病、退化性肝病、血脂病、骨質疏鬆症、骨關節炎、自體免疫疾病、子癇前症、早產、老年黃斑病變、肺部疾病，以及過氧化體病變組成之族群。
適當之食物產品包括，但不侷限於，焙烤製品、麵包、早餐麥片、加工或未加工乳酪、調味料(蕃茄醬、美乃茲等)、乳製品(牛乳、優格)、布丁與果凍甜點、碳酸飲料、茶、粉末飲品混合物、加工魚製品、水果基底飲料、口香糖、硬糕餅、冷凍乳製品、加工肉類、堅果與堅果基底抹醬、麵團、加工家禽類產品、肉汁與醬汁、洋芋片或其他薄片或油炸洋芋片、巧克力與其他糖果、湯類與湯類混合物、大豆基底產品(豆乳、飲料、奶油、增白劑)、蔬菜油基底抹醬，與蔬菜油基底飲料。
一般定義與準則
依據本發明，分離出之蛋白質為一蛋白質或其片段(包括多胜肽或胜肽)，其移自天然環境(即經由人為操作)，並可包含經純化之蛋白質、部分純化之蛋白質、重組製造之蛋白質，與合成製造之蛋白質，舉例而言。因此，“分離”並非延伸為該蛋白質經純化。較佳為，本發明之一分離出之蛋白質係重組製造。分離出之胜肽可合成製造(如化學性，如藉由胜肽合成)或重組性。
使用於此，術語“脂質”包括磷脂質；自由脂肪酸；脂肪酸之酯類；三醯基甘油；二醯基甘油酯；單醯基甘油酯；溶血磷脂質；皂類；磷脂；蠟(醇類與脂肪酸之酯類)；固醇與固醇酯；類胡蘿蔔素；葉黃素(如含氧類胡蘿蔔素)；碳水化合物；與其他技術上已知之脂質。術語“聚不飽和脂肪酸”與“PUFA”不僅包括自由脂肪酸形式，亦包括其他形式，如TAG形式與PL形式。
特定生物體之特定蛋白質或衍生自特定生物體之蛋白質，如“裂殖壺菌(Schizochytrium)ACoAS”或“衍生自裂殖壺菌(Schizochytrium)之ACoAS”，舉例而言，係指一來自裂殖壺菌(Schizochytrium)之ACoAS(包括天然發生之ACoAS之同源物)，或由來自裂殖壺菌(Schizochytrium)天然發生之ACoAS已知結構資訊(如序列)產生之ACoAS。換句話說，裂殖壺菌(Schizochytrium)ACoAS包括任一ACoAS，其具有裂殖壺菌(Schizochytrium)天然發生之ACoAS之結構與功能，或具有類似於裂殖壺菌(Schizochytrium)ACoAS類似之結構與功能，使得ACoAS為生物活性(即，具有生物活性)裂殖壺菌(Schizochytrium)天然發生之ACoAS同源物。如此，裂殖壺菌(Schizochytrium)ACoAS可包括經純化、部分純化、重組、突變/修飾與合成之蛋白質。
依據本發明，術語“修飾”與“突變”可互相交換使用，尤其是此述之蛋白質或胜肽之一級胺基酸序列(或核酸序列)之修飾/突變。術語“修飾”亦可用於描述蛋白質或胜肽之轉譯後修飾，包括，但不侷限於，甲基化、法呢烷基化(farnesylation)、羧基甲基化、香葉醇香葉醇化(geranyl geranylation)、醣化、磷酸化、乙醯基化、十四醯基化、異戊二烯化、十六醯基化，及/或醯胺基化。修飾亦可包括，如，錯合一蛋白質或胜肽與另一化合物。此種修飾可視為一種突變，如，若修飾不同於天然、野生型蛋白質或胜肽之轉譯後修飾。
使用於此，術語“同源物”係指一蛋白質或胜肽，其不同於天然發生之蛋白質或胜肽(即，“原型”或“野生型”蛋白質)，經一或多種次要修飾，或天然發生之蛋白質或胜肽產生突變，但其維持天然發生形式之總體基礎蛋白質與側鏈結構(即，該同源物可辨識出與野生型蛋白質相關)。此改變包括，但不侷限於：一或某些(如1%或更少)胺基酸側鏈之改變；一或某些(如1%或更少)胺基酸之改變，包括剔除(如該蛋白質或胜肽之截斷形式)、插入及/或取代；一或某些(如1%或更少)原子之空間結構改變；及/或次要衍生，包括，但不侷限於：甲基化、法呢烷基化(farnesylation)、羧基甲基化、香葉醇香葉醇化(geranyl geranylation)、醣化、磷酸化、乙醯基化、十四醯基化、異戊二烯化、十六醯基化，及/或醯胺基化。同源物可具有與天然發生蛋白質或胜肽增強、減少或實質上類似之性質。較佳之蛋白質同源物係如下所述。值得注意的是，同源物可包括合成製造之同源物、蛋白質或其區塊之天然發生等位變異物，或來自一生物體之類似序列，該生物體並非來自參考序列衍生之生物體。
保守性取代一般包括下列族群之取代：甘胺酸與丙胺酸；纈胺酸、異亮胺酸與亮胺酸；天門冬胺酸、麩胺酸、精胺酸，與麩胺酸鹽；絲胺酸與蘇胺酸、離胺酸與精胺酸；苯丙胺酸與酪胺酸。取代亦可產生於保守疏水性或親水性基礎上(Kyte and Doolittle,J.Mol.Biol.157：105(1982))，或假設類似多胜肽二級結構之基礎上(Chou and Fasman,Adv.Enzymol.47：45(1978))。
同源物可為天然等位變異物或天然突變之結果。編碼一蛋白質之核酸之天然發生等位變異物為一基因，其發生於基因體之實質上相同位點(或位點群)，該基因係編碼此蛋白質，但由於，如突變或重組導致之天然變異，而具有類似但不完全相等之序列。等位變異物一般係編碼具有類似活性之蛋白質，與待比較之基因編碼之蛋白質相較。等位變異物之一群可編碼相同之蛋白質，但具有不同之核酸序列，係由於基因密碼子退化演繹而得。等位變異物亦可包含在該基因5'或3'端未轉譯區域改變(如調節控制區域)。等位變異物為技術上已知。
同源物可使用一般已知製造蛋白質之技術製造，包括，但不侷限於，分離、天然發生之蛋白質、直接蛋白質合成，或修飾編碼該蛋白質之核酸序列，例如，典型或重組DNA技術，以完成隨機或標的突變。
蛋白質同源物之修飾與突變，與野生型蛋白質相較，可增加、降低或非實質上改變該同源物之基礎生物活性，與天然發生(野生型)蛋白質相較。一般而言，一蛋白質之生物活性或生物作用係指該蛋白質具有或表現之任一功能，為該蛋白質之天然發生形式，於體內測量或觀察(即該蛋白質之天然生理環境)，或體外(即在實驗室條件下)。PUFA PKS系統之生物活性與各蛋白質/區塊，其組成PUFA PKS系統，已於本文別處與參考專利與申請案中詳細描述。ACoAS之生物活性包括結合至受質，本發明較佳為，PUFA之自由脂肪酸(FFA)，並催化FFA轉換為醯基－CoA PUFA。
蛋白質之修飾，如同源物，可產生具有類似活性之蛋白質，與天然發生之蛋白質相較，或具有降低或增加生物活性之蛋白質，與天然發生之蛋白質相較。導致蛋白質表現降低或蛋白質活性降低之修飾，可稱之為一蛋白質之失活(完全或部分)、降低調節，或降低作用(或活性)。類似地，導致蛋白質表現增加或蛋白質活性增加之修飾，可稱之為一蛋白質之倍增、過度製造、活化、強化、加強調節或增加作用(或活性)。值得注意的是，一般稱之為具野生型蛋白質生物活性之同源物，並非具有與野生型蛋白質相等生物活性之同源物，尤其是在生物活性方面。此外，同源物可展現與野生型蛋白質相同之生物活性，但降低或增加活性量，與野生型蛋白質相較。蛋白質之功能性區塊為一區塊(即一區塊可為蛋白質之一部分)，其可展現生物活性(即，具有生物活性)。
偵測蛋白質或測量蛋白質活性之方法包括，但不侷限於，測量蛋白質之轉錄、測量蛋白質之轉譯、測量蛋白質之轉譯後修飾、測量蛋白質之酵素活性，及/或測量由該蛋白質活性產生之產物製造(如PUFA之製造)。值得注意的是，本發明分離出之蛋白質(包括同源物)並非必須具有野生型蛋白質之生物活性。例如，一蛋白質可為截斷、突變或失活之蛋白質，舉例而言。此蛋白質可用於篩選試驗，舉例而言，或用於其他目的，如抗體製造。在一較佳實施例中，本發明分離出之蛋白質具有一生物活性，類似於野生型蛋白質(雖然並非等價，如上所述)。
測量蛋白質表現量之方法一般包括，但不侷限於：西方墨漬法、免疫浸漬法、酵素－連結免疫吸附試驗(ELISA)、放射免疫試驗(RIA)、免疫沈澱、表面等離子共振、化學放光、螢光極化、磷光、免疫組織分析、基質輔助雷射脫附/離子化飛行時間(MALDI－TOF)質譜法、微細胞儀、微陣列、顯微鏡、螢光活化細胞分類儀(FACS)，以及流式細胞儀，以及以蛋白質性質為基礎之試，包括，但不侷限於，酵素活性或與其他結合蛋白質之作用。結合試驗亦為技術上已知。例如，BIAcore機器可用於決定二蛋白質間之錯合常數。錯合物之解離常數可以監測反射率隨著時間之改變，當緩衝液通過該晶片而決定(O'Shannessy et al.Anal.Biochem.212：457(1993)；Schuster et al.,Nature 365：343(1993))。其他適用於測量一蛋白質與另一者之結合之試驗包括，如，免疫試驗，如酵素連結免疫吸附試驗(ELISA)與放射免疫試驗(RIA)；或以監測蛋白質之光譜或光學性質改變而決定結合，經由螢光、UV吸收、圓二偏極光，或核磁共振(NMR)。
在本發明之一觀點中，本發明包含之一蛋白質，包括此述特定蛋白質之同源物，係包含一胺基酸序列，其包括參考蛋白質之胺基酸序列之至少約100個連續胺基酸，其中同源物之胺基酸序列具有此述蛋白質之生物活性。在另一觀點中，該蛋白質之胺基酸序列包含至少200個連續胺基酸，更佳為至少300個連續胺基酸，尤佳至少400個連續胺基酸，並可包括參考蛋白質胺基酸序列之500個連續胺基酸，至多為蛋白質全長，包括以整數方式增加(如200、201、202、203等)。
依據本發明，術語“接續”或“連續”，就此述核酸或胺基酸序列而言，係指相連未間斷之序列。例如，就包含第二序列30個接續(或連續)胺基酸之第一序列而言，係指該第一序列包括一未間段之30胺基酸殘基之序列，其與第二序列之30個未間斷胺基酸序列100%相等。類似地，就與第二序列具有“100%相等度”之第一序列而言，係指該第一序列完全匹配該第二序列，在核苷酸或胺基酸間不會有空格。
一般而言，參考蛋白質之同源物，如如此述之ACoAS蛋白質，具有一胺基酸序列，其至少約50%相等，較佳至少約55%相等，更佳至少約60%相等，更佳至少約65%相等，更佳至少約70%相等，更佳至少約75%相等，更佳至少約80%相等，更佳至少約85%相等，更佳至少約90%相等，更佳至少約95%相等，更佳至少約96%相等，更佳至少約97%相等，更佳至少約98%相等，更佳至少約99%相等(或任一介於60%至99%之間之百分比，以一個百分比方式增加)於參考蛋白質(如ACoAS蛋白質)之胺基酸序列。該同源物較佳具有其衍生或相關之蛋白質或區塊之生物活性(即，該蛋白質或區塊具有參考胺基酸序列)。就ACoAS同源物而言，該同源物較佳具有ACoAS酵素活性，更佳為，催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基－CoA之能力。就此述之其他附屬蛋白而言，此蛋白質可具有生物活性，如，利用PUFA－CoA作為受質形成PL或TAG。
使用於此，除非另有指出，百分比(%)相似度係指類似性之評估，其使用：(1)a BLAST 2.0 Basic BLAST類似性搜尋，使用blastp於胺基酸搜尋、blastn於核酸搜尋，以及blastX於核酸搜尋，並以6種所有開放閱讀框架搜尋轉譯之胺基酸，所有皆使用標準預設參數，其中該要求序列係經預設低複雜度區域過濾(dsscribed in Altschul,S.F.,Madden,T.L.,Schffer,A.A.,Zhang,J.,Zhang,Z.,Miller,W.& Lipman,D.J.(1997)“Gapped BLAST and PSI－BLAST：a new generation of protein database search programs.”Nuclear Acids Res.25：3389，在此併入本案以作為參考資料)；(2)a BLAST 2比對(使用下述參數)；(3)及/或PSI－BLAST，具有標準預設參數(Position－Specific Iterated BLAST)。值得注意的是由於BLAST 2.0 Basic BLAST與BLAST 2間標準參數之不同，二特定序列可辨識為具有明顯相似度，使用BLAST 2程式，而BLAST 2.0 Basic BLAST上進行之搜尋，使用一序列作為要求序列，可能無法辨識上方匹配之第二序列。此外，PSI－BLAST係提供一種自動化、容易使用之“分佈”搜尋版本，其具有尋找序列同源物之高感度。該程式首先呈現一有裂口(gapped)之BLAST資料庫搜尋。PSI－BLAST程式係使用來自任一明顯比對之資訊，轉為建構一位置－特異性積分矩陣，其取代下一回合資料搜尋之要求序列。因此，可瞭解到該百分比相似度可使用任一這些程式決定。
二特定序列可互相比對，使用BLAST 2序列，如同描述於Tatusova and Madden,“Blast 2 sequences－a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”,FEMS Microbiol Lett.174：247(1999)，在此併入本案以作為參考資料。BLAST 2序列比對係以blastp或blastn進行，使用BLAST 2.0演算法，進行二序列間之Gapped BLAST搜尋(BLAST 2.0)，允許在所得比對中引入缺口(刪除與插入)。就此述目的而言，BLAST 2序列比對係使用如下標準預設參數進行。
就blastn而言，使用0 BLOSUM62矩陣：匹配報酬＝1錯位罰分＝－2開放缺口(5)與延伸缺口(2)罰分gap x_dropoff(50)expect (10)word size(11)filter(on)
就blastp而言，使用0 BLOSUM62矩陣：開放缺口(11)與延伸缺口(1)罰分gap x_dropoff(50)expect (10)word size(3)filter(on)。
在本發明之一實施例中，本發明分離出之蛋白質或區塊包含下列胺基酸序列、實質上由下列胺基酸序列組成，或由下列胺基酸序列組成，該序列描述於美國專利6,566,583；Metz et al.,Science 293：290－293(2001)；美國專利申請案公開號20020194641；美國專利申請案公開號20040235127；美國專利申請案公開號20050100995；以及美國暫時申請案號60/689,167，於2005年6月10日提申，或其任一生物活性片段或區塊。這些蛋白質為PUFA PKS系統之蛋白質，並可用於與此述之任一附屬蛋白連結。
在本發明之另一實施例中，具有此述蛋白質(如ACoAS蛋白質)生物活性之胺基酸序列，包括一胺基酸序列，其足以類似於天然發生之蛋白質或多胜肽，其於此特別描述，編碼該胺基酸序列之核酸序列可於中度、高度或非常高嚴苛條件下(描述如下)，雜合至(即與)一核酸分子，其編碼天然發生之蛋白質或多胜肽(即，雜合至編碼天然發生之蛋白質或多胜肽之核酸互補股)。較佳為，具有此述蛋白質生物活性之胺基酸序列，係由一核酸序列編碼，其可於中度、高度或非常高嚴苛條件下，雜合至此述之任一核酸分子。演繹一互補序列之方法為技術上已知。應注意的是，由於胺基酸定序與核酸定序技術並非完全無錯誤，該序列示於此，最佳為，代表本發明包含之蛋白質之原始序列。
使用於此，雜合條件係指標準雜合條件，其中核酸分子係用於辨識類似之核酸分子。此標準條件係揭示於，如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labs Press(1989)。Sambrook et al.,ibid.，在此併入本案以作為參考資料(請見第9.31－9.62頁)。此外，計算適當雜合與清洗條件以達到雜合，其允許各種核苷酸錯位，之公式係揭示於，如Meinkoth et al.,Anal.Biochem.138,267(1984)；Meinkoth et al.,ibid.，在此併入本案以作為參考資料。
更特別的是，中度嚴苛雜合與清洗條件，如此所述，係指一條件，其允許分離出與用於雜合反應用探針之核酸分子至少約70%核酸序列等同度之分子(即，該條件允許約30%或更少之核苷酸錯位)。高度嚴苛雜合與清洗條件，如此所述，係指一條件，其允許分離出與用於雜合反應用探針之核酸分子至少約80%核酸序列等同度之分子(即，該條件允許約20%或更少之核苷酸錯位)。非常高度嚴苛雜合與清洗條件，如此所述，係指一條件，其允許分離出與用於雜合反應用探針之核酸分子至少約90%核酸序列等同度之分子(即，該條件允許約10%或更少之核苷酸錯位)。如上所述，此技術領域者可使用Meinkoth et al.,ibid.之公式計算適當之雜合與清洗條件，以達到這些特定之核苷酸錯位量。此條件將依據進行之雜合種類為DNA：RNA或DNA：DNA而不同。DNA：DNA雜合物之熔融溫度計算值為10℃，小於DNA：RNA雜合物所使用者。在特定實施例中，用於DNA：DNA雜合物之嚴苛雜合條件包括於6X SSC之離子強度(0.9 M Na＋ )，溫度介於約20℃至約35℃之間(較低嚴苛度)，更佳為，介於約28℃至約40℃之間(較嚴苛)，尤佳為，介於約35℃至約45℃(更嚴苛)，下雜合，配合適當清洗條件。在特定實施例中，用於DNA：RNA雜合物之嚴苛雜合條件包括於6X SSC之離子強度(0.9 M Na＋ )，溫度介於約30℃至約45℃之間，更佳為，介於約38℃至約50℃之間，尤佳為，介於45℃至約55℃之間，配合類似之嚴苛清洗條件。這些值係以大於約100個核苷酸之分子之熔融溫度為基礎計算，0%甲醯胺與G＋C含量約40%。此外，Tm 可依據經驗計算，如Sambrook et al.，如上所述，第9.31至9.62頁。一般而言，清洗條件應盡量嚴苛，且應適用於選擇雜合條件。例如，雜合條件可包括鹽類之組合，與溫度條件約低於特定雜合物Tm 20－25℃，清洗條件一般包括鹽類之組合，與溫度條件約低於特定雜合物Tm 12－20℃。適用於DNA：DNA雜合物之雜合條件範例之一包括2－24小時雜合於6X SSC(50%甲醯胺)，於約42℃，之後之清洗步驟包括一或多次清洗，於室溫下，於約2X SSC中，之後為額外之清洗，於較高溫度與較低離子強度下(如至少一次清洗於約37℃，約0.1X－0.5X SSC中，之後至少一次清洗於約68℃，約0.1X－0.5X SSC)。
本發明亦包括一融合蛋白質，其包括本發明任一蛋白質或任一同源物或其片段，連結於一或多種融合片段上。適用於本發明之融合片段包括，但不侷限於可：增強一蛋白質之穩定度；提供其他希望之生物活性；及/或幫助蛋白質純化(如使用親和性管柱)。適當之融合片段可為任一大小之區塊，其具有適當之功能(如提供增進之穩定性、溶解度、生物活性；及/或簡化蛋白質之純化)。融合片段可接合蛋白質之胺基及/或羧基端，並可切割以直接獲得所希望之蛋白質。融合蛋白質較佳係由培養經融合核酸分子轉型之重組細胞而製造，該核酸分子係編碼一蛋白質，其包含一融合片段，可接合上述本發明蛋白質之羧基及/或胺基端。
在本發明之一實施例中，任一此述之胺基酸序列，以及此序列之同源物，可製造為至少一，至多約20個額外之異源性胺基酸，側接於所提供胺基酸序列之C－及/或N－端。所得之蛋白質或多胜肽可稱之為“實質上由”一特定胺基酸序列組成。依據本發明，該異源性胺基酸為一胺基酸序列，其並非自然發現(即，並非於自然界，體內發現)側接於特定胺基酸序列，或不由側接於編碼基因中特定胺基酸序列天然發生之核酸序列之核苷酸編碼，若此天然發生序列中使用該生物體之標準密碼子轉譯，衍生出該特定之胺基酸序列。類似地，術語“實質上由...組成”，當用於核酸序列時，係指一核酸序列，編碼一特定胺基酸序列，其可側接至少1至多60個額外異源性核苷酸於編碼該胺基酸序列之核酸序列之5'及/或3'端。異源性核苷酸並非自然發現(即，並非於自然界，體內發現)側接於特定胺基酸序列，其發生於天然基因中。
本發明蛋白質或區塊，及/或其片段同源物之最小尺寸，在一觀點中，該尺寸係足以具有要求之生物活性，或足以作為產生抗體之抗原，或做為體外試驗之一標的。在一實施例中，本發明之一蛋白質為至少約8個胺基酸長度(如適用於抗體之表位，或作為試驗中可偵測之胜肽)，或至少約25個胺基酸長度，或至少約50個胺基酸長度，或至少約100個胺基酸長度，或至少約150個胺基酸長度，或至少約200個胺基酸長度，或至少約250個胺基酸長度，或至少約300個胺基酸長度，或至少約350個胺基酸長度，或至少約400個胺基酸長度，或至少約450個胺基酸長度，或至少約500個胺基酸長度，以此類推，介於8個胺基酸至最多本發明蛋白質或區塊全長，或更長，以整數增加(如8、9、10、...25、26、...500、501,...)。對於蛋白質最大尺寸並無限制，在實際限制之外，該蛋白質可包括蛋白質之一部分、區塊或其生物活性或可使用片段，或一全長蛋白質或區塊，加上額外之序列(如一融合蛋白質序列)，若希望的話。
本發明之另一實施例係相關於一種分離之核酸分子，包含、實質上由或由一核酸序列組成，該序列係編碼任一此述之蛋白質，包括一同源物或任一此蛋白質之片段，以及完全互補之核酸序列。依據本發明，該分離出之核酸分子為一核酸分子，其移自其天然背景(即，經由人為操作)，其天然背景為基因體或染色體，其中該核酸分子係於自然界發現。因此，“分離”並非延伸為該蛋白質經純化，但代表該分子並不包含完整之基因體或完整之染色體，其中該核酸分子係於自然界中發現。分離出之核酸分子可包括一基因。一包括一基因之經分離核酸分子，並非包含此基因之基因體之一片段，但包括與該基因相關之編碼區域以及調控區域，但無其他基因自然發現於相同染色體上，除了編碼此述PUFA PKS系統之其他蛋白質之其他基因，當核酸分子編碼一核心PUFA PKS蛋白質時。一分離出之核酸分子亦可包括一特定核酸序列，側接(即於該序列之5'及/或3'端)一額外核酸，其在自然界中並非正常側接該特定核酸序列(即異源性序列)。分離出之核酸分子可包括DNA、RNA(如mRNA)，或DNA或RNA之衍生物(如cDNA)。雖然片語“核酸分子”主要係指一物理性核酸分子，片語“核酸序列”主要係指該核酸分子上之一核苷酸序列，該二片語可交換使用，尤其是核酸分子，或核酸序列，可編碼一蛋白質或蛋白質之一區塊。
較佳為，本發明之一經分離之核酸分子係使用重組DNA技術製造(如聚合酶連鎖反應(PCR)倍增、選殖)或化學合成。分離之核酸分子包括天然核酸分子與其同源物，包括，但不侷限於，天然等位變異物與經修飾核酸分子，其中核苷酸經插入、剔除、取代，及/或倒位，使得此修飾可提供希望之作用(如維持、增進或降低蛋白質之活性)。蛋白質同源物(如由核酸同源物編碼之蛋白質)已於上述討論。
核酸分子同源物可使用數種技術上已知之方法製造(請見，如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labs Press(1989))。例如，核酸分子可使用各種技術修飾，包括，但不侷限於，典型突變技術重組DNA技術，如定點突變、化學處理核酸分子以誘發突變、核酸片段之限制酶切割、核酸片段之黏合反應、PCR倍增，及/或核酸序列選定區域之突變、寡核苷酸混合物之合成，與混合物族群之接合，以“建構”核酸分子混合物及其組合物。核酸分子同源物可選自經修飾核酸之混合物，藉由篩選蛋白質功能，該蛋白質係由核酸編碼，及/或與野生型基因雜合。
本發明核酸分子之最小尺寸為足以形成探針或寡核苷酸引子之尺寸，其可形成穩定之雜合物(如在中度、高度或非常高度嚴苛條件下)，具有與本發明核酸分子互補之序列，或該尺寸足以編碼一胺基酸序列，具有本發明蛋白質之生物活性。如此，編碼此蛋白質之核酸分子大小，係依據核酸組成物，以及核酸分子與互補序列間類似度或等同度百分比，並取決於本身之雜合條件(如溫度、鹽類濃度與甲醯胺濃度)。使用作為寡核苷酸引子或探針之核酸分子最小尺寸，一般為至少約12至約15個核苷酸長度，若核酸分子為富含GC，以及至少約15至約18個鹼基長度，若其富含AT。除了實際限制外，對於本發明核酸分子之最大尺寸並無限制，其中該核酸分子可包括一序列，其足以編碼一蛋白質之生物活性片段，或蛋白質全長。
本發明之另一實施例包括一重組核酸分子，其包含一重組載體與一核酸序列，其編碼此述之蛋白質或具有該蛋白質生物活性之胜肽。此核酸序列係如上詳述。依據本發明，重組之載體為經工程改造(即人工製造)之核酸分子，其用於作為操作核酸序列之工具，經選擇並用以引入此核酸序列至宿主細胞中。因此，重組之載體適用於選殖、定序，及/或操作所選用之核酸序列，如藉由表現，及/或傳遞所選之核酸序列至宿主細胞中，以形成重組細胞。此載體一般包含異源性核酸序列，其為一核酸序列，並非天然發現於鄰近待複製或傳遞之核酸序列，雖然該載體亦可包含一調控核酸序列(如驅動子、未轉譯區域)，其可天然發現鄰近於本發明之核酸分子，或其可用於表現本發明之核酸分子(於下詳細討論)。該載體可為RNA或DNA，不論是原核或真核，一般為一質體。該載體可以染色體外元素方式維持(如一質體)，或其可整合至重組生物體之染色體中(如一微生物或植物)。完整之載體可維持於宿主細胞中，或在某些條件下，該質體DNA可經剔除，留下本發明之核酸分子。整合之核酸分子可置於染色體驅動子之控制下，在原始或質體驅動子控制下，或在數個驅動子控制之組合下。核酸分子之單一或多重複製版本可整合至染色體中。本發明之重組載體可包含至少一可篩選之標記。
在一實施例中，使用於本發明重組核酸分子之重組載體為一表現載體。使用於此，片語“表現載體”係指一載體，其適用於製造一經編碼之產物(如有興趣之蛋白質)。在此實施例中，編碼待製造之產物之核酸序列(如PUFA PKS區塊或蛋白質)係插入重組載體中，以製造重組核酸分子。編碼待製造蛋白質之核酸序列係插入該載體中，操作性地連結該核酸序列與載體上之調控序列，其可允許重組宿主細胞中該核酸序列之轉錄與轉譯。
在另一實施例中，使用於本發明重組核酸分子之重組載體為一標的載體。使用於此，術語“標的載體”係指一載體，其可用於傳送特定核酸分子至重組宿主細胞中，其中該核酸分子係用於刪除、失活或取代宿主細胞或微生物體之內生性基因，或基因之一部分(即，用於標的基因之破壞或剔除(knock－out)技術)。此載體為技術上已知之“剔除(knock－out)”載體。在本實施例之一觀點中，載體之一部分，更典型的，插入載體之核酸分子(即插入子)，具有一核酸序列，其類似於宿主細胞中標的基因之核酸序列(即該基因標的為剔除或失活)。該載體插入子之核酸序列係設計與標的基因結合，使得該標的基因與插入子可進行類似重組，其中該內生性標的基因係經剔除、失活、降低(即，藉由至少一部份之內生性標的基因，其經突變或剔除)，或取代。使用此類型之重組載體取代內生性裂殖壺菌(Schizochytrium)基因，例如，使用前述本發明人所述之重組基因，以及一般用於破囊壺菌(thraustochytrid)s基因轉型之技術，描述於美國專利申請系列案號10/124,807，為美國專利申請案公開號20030166207，公開於2003年9月4日。用於植物之基因轉型技術為技術上已知。
一般而言，重組核酸分子包括本發明至少一核酸分子，操作性地連結至一或多個表現控制序列。使用於此，術語“重組分子”或“重組核酸分子”主要係指一核酸分子或核酸序列，操作性地聯結至一表現控制序列，但可與術語“核酸分子”交換使用，當此核酸分子為一重組分子，如此所述。依據本發明，術語“操作性聯結”係指聯結一核酸分子至一表現控制序列(如一轉錄控制序列及/或轉譯控制序列)，使該分子可於經轉染(即轉型、轉導(transfected)、接合(conjugated)或引入(conduced))之宿主細胞中表現。轉錄控制序列為一序列，其控制轉錄之起使、延長或終止。特別重要之轉錄控制序列為控制轉錄起始者，如驅動子、增強子、操作子與抑制子序列。適當之轉錄控制序列包括任一轉錄控制序列，其可作用於引入重組核酸分子之宿主細胞或生物體中。
本發明之重組核酸分子亦可包含一額外之調控序列，如轉譯調控序列，複製源與其他可與該重組細胞相容之調控序列。在一實施例中，本發明之一重組分子，包括整合至宿主細胞染色體者，亦包含分泌訊號(即訊號片段核酸序列)，以使表現之蛋白質自製造蛋白質之細胞中分泌出。適當之訊號片段包括一訊號片段，其天然地與待表現之蛋白質結合，或任一異源性訊號片段，可引導本發明蛋白質之分泌。在另一實施例中，本發明之重組分子包含一引導序列，以使表現之蛋白質傳送至並插入至宿主細胞之細胞膜上。適當之引導序列包括一天然地與蛋白質結合之引導序列，或任一異源性引導序列，可引導本發明蛋白質傳送至並插入至宿主細胞之細胞膜上。
本發明之一或更多個重組分子可用於製造本發明之一經編碼之產物(如一ACoAS)。在一實施例中，經編碼之產物係由表現此述之核酸分子而製造，在可有效製造該蛋白質之條件下。一較佳製造經編碼蛋白質之方法，係以一或多種重組分子轉染一宿主細胞，以形成一重組細胞。待轉染之適當宿主細胞包括，但不侷限於，任一細菌、真菌(如酵母菌)、昆蟲、植物或動物細胞，其可經轉染。在本發明之一實施例中，較佳之宿主細胞為一植物宿主細胞。宿主細胞可為未經轉染之細胞，或已經至少一其他重組核酸分子轉染之細胞。
依據本發明，術語“轉染”係指任一方法，其使用一外源性核酸分子(即，一重組核酸分子)，可插入細胞中。術語“轉型”可與術語“轉染”交互使用，當此術語用於引入核酸分子至微生物體細胞中，如藻類、細菌與酵母菌，或植物細胞中。在微生物與植物系統中，術語“轉型”係用於描述於一遺傳性改變，由於該微生物體或植物取得該外生性核酸，並與術語“轉染”為同義詞。然而，在動物細胞中，轉型需要第二意義，其指細胞培養時生長特性之改變，舉例而言，變得更具癌性。因此，為避免混淆，術語“轉染”較佳係用於指稱引入一外生性核酸至動物細胞中，且術語“轉染”一般包含動物細胞之轉染，與微生物細胞或植物細胞之轉型，延伸該術語之意義為引入外生性核酸至一細胞中。因此，轉染技術包括，但不侷限於，轉型、顆粒轟炸、擴散、主動運輸、水浴超音波震盪、電破法、微注射法、脂質體轉染法、吸附、感染與原生質體融合法。
此技術領域者應瞭解到，使用重組DNA技術可增進轉染核酸分子表現之控制，藉由操作，如宿主細胞中核酸分子之複製版本數目、核酸分子轉錄之效率、所得轉錄物之轉譯效率，以及轉譯後修飾之效率。此外，該驅動子序列可經基因改造，以增進表現量，與原始驅動子相較。可用於控制核酸分子表現之重組技術包括，但不侷限於，整合核酸分子至一或多個宿主細胞染色體中、加入載體穩定序列至質體中、取代或修飾轉錄控制訊號(如驅動子、操作子、增強子)、取代或修飾轉譯控制訊號(如核醣體結合位置、Shine－Dalgarno序列)、修飾核酸分子以對應宿主細胞所使用之密碼子，以及刪去使轉錄物不穩定之序列。
許多用於製造生物活性分子之基因修飾，為本發明包含任一相關於此述之PUFA PKS系統及/或附屬蛋白之基因修飾，其會產生所希望之生物活性分子之製造。
生物活性分子，依據本發明，包括任一分子(化合物、產物等)，其具有生物活性，可由PUFA PKS系統製造。此生物活性分子可包括，但不侷限於：聚不飽和脂肪酸(PUFA)、抗發炎配方、化療試劑、活性賦形劑、骨質疏鬆藥物、抗憂鬱劑、抗痙攣劑、抗幽門桿菌藥物、治療神經退化疾病藥物、治療退化性肝病之藥物、抗生素、與膽固醇降低配方。本發明之PUFA PKS系統之一優勢為此系統引入碳－碳雙鍵至順式構形上之能力，且該分子每隔三個碳便包含一雙鍵。此能力可用於製造各種化合物。
每一文獻、專利或專利申請案皆在此併入本案以作為參考資料。
下列範例係以說明目的提供，並非用於限制本發明範疇。
範例
範例之一般引言。
PUFA合成酶之編碼基因已於鼠科、細菌與破囊壺菌等物種中發現。其中有數種基因可表達於E.coli，當提供適量PPTase時，這些酵素的特定PUFA產物可於細胞中累積。然而，就本發明人所知，目前有關這類酵素之PUFAs釋放並未有詳盡描述。釋放機制與PUFA合成酶系統於異源宿主生物體內之表達有關。同時亦提供一努力方向，即經由該系統調節碳的流動及最終PUFAs於異源或原始宿主生物體內之累積量。本發明揭示了裂殖壺菌PUFA合成酶(並且，不受理論束縛，幾乎為所有真核PUFA合成酶系統，包括所有破囊壺菌PUFA PKS系統)之產物為游離脂肪酸，且游離脂肪酸可由酵素複合物中完整釋出。此外，在裂殖壺菌中，PUFA FFA於形成磷脂質(PL)與三酸甘油酯(TAG)之前會先酯化成CoA。以下範例之數據提出異源宿主生物體之表達及原始宿主生物體中PUFA累積量之調節策略。
範例1
本範例係描述一裂殖壺菌FAS基因剔除殖株以進行生物化學研究。
裂殖壺菌含有一編碼FAS酵素之基因，以產生短鏈飽和脂肪酸(揭示於美國專利申請案公開號20050191679 A1)。裂殖壺菌FAS基因剔除(FAS－KO)構築體之建立係利用美國專利號7,001,772所揭示之方法。將一含有FAS Orf(由推測之ATG起使密碼下游約728 bp處至停止密碼下游約680 bp處)之~10.0 kB EcoRV基因體DNA片段選殖至Stratagene bluescript載體(pBSK)多重選殖區內之EcoRV位置。將選殖之裂殖壺菌DNA內~3.5 kB BglII片段移去並置換~1.1 kB BamHI片段，係選自pTubZeo11－2並含有抗Zeocin基因盒(請見美國專利號7,001,772，如上所述)。質體(pJK878)藉由粒子轟擊法(particle bombardment)導入細胞壁缺失殖株裂殖壺菌(以Ac66表示)中。轉形物初步以含Zeocin與棕櫚酸之固體培養基篩選。在二次篩選時，未補充棕櫚酸者無法在培養盤上生長，可用於確認可能的雙重交互效應，因為FAS基因體之一部分已被抗Zeocin基因盒取代。利用PCR與南方墨點法(Southern blot)分析並確認具備預期基因構造之轉形物(標示為FAS－KO)。本殖株係生長於添加500 uM棕櫚酸之培養基。另使用一類似方法，亦即將一抗Zeocin基因盒插入編碼裂殖壺菌PUFA合成酶次單元之基因中，使裂殖壺菌Ac66殖株之酵素失活。在此情況中，培養基係添加500 uM DHA。這些殖株的整體細胞與細胞萃取液部分隨後進行生化研究(請見以下範例)。
範例2
以下範例係描述裂殖壺菌Ac66，及裂殖壺菌Ac66之PUFA合成酶KO與FAS－KO殖株之細胞萃取液製備方法。
以下範例係裂殖壺菌細胞壁缺失殖株之細胞均質液(CFH)製備方法。細胞生長於A50－3培養基並隨後以M2B培養基稀釋。KO殖株生長時所使用之培養基係添加適量之脂肪酸。細胞於M2B培養基內生長至OD600 nm>~2.5且<~5。細胞於50 mL培養基中離心收集(桌上型離心~1200 rpm x 4分鐘)。移去上清液後將細胞再懸浮於5 mL緩衝液A(100 mM磷酸鹽pH 7.2、10%(w/v)甘油、1 mM EDTA與2 mM DTT)並以前述方法離心。移去上清液後將細胞再懸浮於冰冷之5 mL緩衝液A。懸液置於試管內，並於冰上超音波震盪1.5分鐘(Ultrasonic Processor Model GE130連接微探針，Pulser為2秒，~1 Watt電源設定)。樣品以顯微鏡確認所有細胞均破裂。CFH以200 uL體積分裝於0.5 mL PCR管內，加蓋後以液態氮冰凍。樣品保存於－74℃中備用。
範例3
本範例係描述活體外FAS與PUFA合成酶活性分析之一般條件。
FAS與PUFA合成酶活體外活性分析之範例如下。在一最終體積100 uL之反應中，將酵素與緩衝液A混合(兩者之總體積90 uL)，再加入下列成分(10 uL)使其產生以下各最終濃度：丙二醯基－CoA(50 uM－混合未標定與丙二醯基－2－14 C－CoA，最終標定濃度為0.65 μCi/mL)、NADH(1 mM)、NADPH(1 mM)及乙醯－CoA(10 uM)。這些成分及其他成分均可依實驗需求進行調整。反應於室溫水浴之玻璃管內進行(~21℃)。反應時間依實驗需求而定。反應之終止可依需要採用以下兩種方法。若進行脂肪酸轉換為脂肪酸甲基酯類(FAMEs)則使用酸性終止法，係加入FAME試劑終止反應(請見如下)。若進行脂肪萃取而非衍生化反應，則加入125 uL異丙醇：醋酸(4：1 v/v)終止反應(請見如下)。
酸性FAME終止法：反應之終止係加入溶於甲醇與50 uL甲苯之2.0 mL 4% HCl，玻璃管以鐵氟龍加蓋後於100℃下加熱1 hr。冷卻至室溫後，加入1.0 mL己烷與0.5 mL水，混合後使其分離。若有需要，取一部分進行液態閃爍計數(LSC)。將~600 uL之有機層移至一新試管內，並以氮氣吹除溶劑部分。將殘留物溶於50 uL己烷並點於矽膠60A TLC薄片上(以己烷：二乙基醚：醋酸－70：30：2進行反應)或經10% AgNO3 /90%乙腈浸泡之矽膠G薄片上(使用前，先於100℃下活化30 min)(以己烷：二乙基醚：醋酸－70：20：2進行反應)。待薄片風乾後，以螢光影像技術(phosphorimaging technology)偵測輻射反應區域。
HIP終止法－未衍生化脂肪之萃取：如前面所述，反應之終止係加入125 uL異丙醇：醋酸(4：1 v/v)，隨後加入2 mL己烷：異丙醇(3：2,v/v)，經混合後加入1 mL6.7%(w/v)硫酸鈉並再次混合。使各相分層。若有需要，取部分有機層(上層)進行LSC後將其餘部分移至(~1.0 mL)一新試管內。以氮氣吹除溶劑並將殘留物溶於50 uL己烷。將樣品點於矽膠60 A TLC薄片上並以己烷：二乙基醚：醋酸(70：30：2)進行反應。待薄片風乾後，以螢光影像技術偵測輻射反應區域。
範例4
以下範例係描述FAS與PUFA合成酶活體外活性分析之結果。
準備裂殖壺菌Ac66及裂殖壺菌Ac66衍生之PUFA合成酶KO與FAS－KO殖株之CFHs，並進行FAS與PUFA合成酶之活性分析，係使用上述之酸性FAME與銀染TLC法。第1圖顯示其分析結果。TLC薄片上經標定帶域之影像代表FAMEs具備之放射線活性(其可由標準品之共同遷移及HPLC分離法進行再確認)。第1與第2行顯示由原始Ac66萃取液產生之結果。FAS(14：0與16：0 FAMEs)與PUFA合成酶(DHA與DPA n－6)之產物可見於其他行。PUFA合成酶失活後之結果如第3與第4行所示。在此情況下，DHA與DPA n－6 FAMEs不存在。FAS失活後之結果如第5與第6行所示。在此情況下，脂肪酸衍生自FAS，亦即，14：0與16：0及脂肪酸衍生物消失。數據顯示，在FAS－KO殖株中，FAS活性明顯或完全消失。利用FAS－KO殖株進一步確認裂殖壺菌PUFA之合成及累積途徑。
範例5
以下範例係描述裂殖壺菌內合成PUFA之其他確認結果，並顯示裂殖壺菌PUFA合成酶之初始產物為游離脂肪酸(FFA)。
利用酸性法將活體外反應產物轉變為FAMEs有利於決定丙二醯基－CoA結合脂肪酸片段之輻射活性，但在衍生作用前無法顯示這些脂肪酸的分子形式。第2圖顯示FAS－KO殖株之活體外時間進程分析結果，其中脂質係利用前述HIP方法萃取(亦即，無需將脂醯基片段轉為甲酯基)並隨後以正相TLC分離。薄片上TAG與游離脂肪酸(FFA)標準品之移動位置顯示於左方。在此TLC系統中，不同鏈長與不飽和程度之FFA無法有效分離。然而，由於所使用之殖株具有很小或無FAS活性，故此區域FFAs很可能衍生自PUFA合成酶系統。其他支持證據顯示於第3圖。其中，活體外分析時FFA帶域輻射標定之表現取決於NADPH的加入。相較之下，NADH無法完成此反應。如此精確地以NADPH為還原劑的情況亦為沙雷菌(沙雷菌)SCRC2738 PUFA合成酶之特性(第2C圖，Metz等人，Science 293：290－293(2001))。在第2與第3圖中，發現經輻射標定帶域之移動明顯稍快於FFA帶域(標示為‘未知’)。由於帶域之表現與還原劑的加入無關，(NADH或NADPH－請見第5行，第3圖)，因此可能與PUFA合成酶活性無關。此外，此帶域可於PUFA合成酶失活殖株之類似分析中偵測出(數據未顯示)。第2與第3圖之數據顯示，裂殖壺菌PUFA合成酶之初步產物為FFA。FAS系統釋出之產物為FFA(例如哺乳動物FAS)，這些FFA隨即於變成PL或TAG之前酯化為CoA。FFA之活化由醯基－輔酶A合成酶進行，此反應需要ATP與Mg＋2 。在TAG部分之活體外反應中，某些輻射活性表現的時間進程變慢符合裂殖壺菌之反應途徑(由於樣品中殘留ATP)。此現象將進一步檢測(請見如下)。
範例6
以下範例證實醯基－輔酶A合成酶參與裂殖壺菌PUFA累積途徑之反應。
外加ATP(2.5 mM)與Mg＋2 (10 mM)對於裂殖壺菌FAS－KO樣本活體外分析產物之影響顯示於第4圖。樣本於標準反應混合物中反應10分鐘後加入ATP與Mg＋2 。反應於外加ATP與Mg＋2 後收取多個時間點(亦即，0＝未加入、10與30 sec，及1、3、10與30 min)。在時間進程期間，可發現FFA帶域之輻射標定減少且TAG帶域之輻射標定增加。‘未知’帶域之輻射標定不受外加ATP之影響。這些數據符合ATP需求反應參與由經標定FFA移至TAG片段之情況。
Triacsin C目前被視為醯基－輔酶A合成酶之特定抑制劑，其可活化長鏈PUFAs(Knoll等人，1995)。進行Triacsin C對於FAS－KO樣本活體外分析期間產物表現之檢測。樣本於標準配方中反應10分鐘，其中包含各種濃度的Triacsin C(0、25、100或200 uM)，隨後加入ATP與Mg＋2 。反應繼續進行20分鐘後終止，萃取脂質並利用HIP法之TLC分離。結果顯示於第5圖。加入高濃度Triacsin C可阻止FFA帶域輻射標定之喪失。此結果符合醯基－輔酶A合成酶參與之情況。
範例7
以下範例係描述表達裂殖壺菌Orf A、OrfBss(OrfB＊ )、OrfC與Nostoc Het I之E.coli萃取物活體外分析。
上述範例之數據顯示，裂殖壺菌PUFAs在形成TAG與PL之前可先轉變為游離脂肪酸。數據顯示，PUFA以游離脂肪酸形式釋出之方式為PUFA合成酶之不可或缺部分。裂殖壺菌原始Orf A(核酸序列顯示於SEQ ID NO：1)、OrfBss(亦以OrfB＊ 表示；核酸序列顯示於SEQ ID NO：37)與原始OrfC(核酸序列顯示於SEQ ID NO：5)係以人工操縱子形式選殖於pET載體並表達於E.coli，如美國申請案公開號20050100995，如上所述，所揭示。Het I選殖至pACYC載體並表達於相同細胞中。細胞生長至O.D.值~1後加入IPTG(最終濃度1 mM)以誘發產生T7聚合酶。誘發約4小時後，收取細胞，並以緩衝液A清洗，再利用French細胞壓力破碎機進行兩次破菌。取均質液進行離心(5k x g x 5 min)產生上清液1(S1)。隨後，再以100,000 x g離心1小時產生高速沈澱物(P2)與高速上清液(S2)部分。沈澱物部分再懸浮於緩衝液A至原離心體積。所有部分均以前述之一般方法分析，包括使用酸性FAME/銀相TLC檢測法或HIP脂質萃取法結合正相TLC分離法。第6圖顯示這些分析之結果。
酸性FAME分析(第6A圖)顯示活體外分析的主要產物為DHA與DPA n－6。均質液部分具有最高活性，而S1與P2部分活性較低。S2部分的活性很小。有趣的是，CFH與S1部分可偵測到小量的FAS系統產物(如第6A圖中16：0箭頭所指)。這可能是因為利用T7系統可產生高度表現量的PUFA合成酶。相較之下，以含編碼沙雷菌EPA合成酶黏粒之E.coli萃取物(CFH與S1)進行之類似分析中，顯示TLC薄片上的多數輻射活性與FAS產物有關(Metz等人，Science 293：290－293(2001)，第2B圖)。同時，E.coli內部FAS系統包含數個可溶性蛋白，且高速離心後上清液部分仍具有FAS活性(Metz等人，Science 293：290－293(2001)，第2B圖)。相較之下，第6A圖中PUFA合成酶活性部分於高速離心後位於沈澱物位置。
第6B圖之數據係與第6A圖相同之E.coli殖株樣本之分析結果，除了脂質產物在TLC分離前必須以HIP法萃取(而非FAMES)。利用兩部分進行，即CFH(圖左)與P2(圖右)。調整分析時萃取物之用量，所以兩者會有大約等量的脂質產生輻射活性。同時進行不同還原劑成分(NADH與/或NADPH)之影響：第1行－單獨NADPH、第2行－單獨NDPH、第3行－NADH與NADPH及第4行－水，而非每一種成分都加入。第6B圖數據顯示TLC薄片上大部分輻射標定可與游離脂肪酸標準品一起移動。同時，分析時主要(FFA)帶域的表現取決於NADPH的加入。這些部分之NADPH需求及缺乏明顯FAS活性之情況(尤其是P2部分)顯示FFA為PUFA合成酶產物。由於只有三種裂殖壺菌(編碼Orfs A、B與C)基因表達於本E.coli(結合Het I)殖株，數據顯示合成酶之PUFA釋放係此酵素之固有特性，而非其他硫酯酶所致。
上述範例中的許多重要數據顯示裂殖壺菌之PUFA合成與累積具有以下特點。DPAn－6與DHA之PUFA合成酶編碼基因為Orfs A、B與C，其如美國專利號6,566,583、Metz等人，Science 293：290－293(2001)、美國專利申請案公開號20020194641與PCT公開號WO 2006/135866所揭示。次單元內之ACP區塊可受內生性PPTase活化。合成反應係利用丙二醯基－CoA為碳的來源(醯基－CoA可能或可能不需要)並以NADPH為還原劑。PUFA產物以FFAs形式由酵素釋出，且該釋出反應係酵素之固有特性。FFAs可酯化為CoA，其為ATP依賴反應並可受一或更多內生性醯基－輔酶A合成酶催化。PUFA－CoAs隨後可作為PL與TAG合成酶之受質。
範例8
以下範例係顯示麵包酵母之裂殖壺菌PUFA合成酶(sOrf A、sOrfB與原始OrfC，請見如下)與Het I之編碼基因表現。
裂殖壺菌PUFA合成酶基因與Het I於酵母菌內表達所需之材料係購自Invitrogen。以酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)之INVscl殖株配合以下轉形載體：pYESLeu(sOrfA，SEQ ID NO：35，編碼SEQ ID NO：2)、pYES3/CT (sOrfB，SEQ ID NO：36，編碼SEQ ID NO：4)、pYES2/CT(OrfC，SEQ ID NO：5，編碼SEQ ID NO：6)與pYESHis(HetI，SEQ ID NO：33，編碼SEQ ID NO：34)。修改某些載體以因應特殊選殖需求。使用適當的篩選培養基，係取決於特定實驗。在各實驗中，將基因選殖至GAL1啟動子之後，且誘發作用係以經洗滌細胞再懸浮於含有乳糖之培養基中，其方法如Invitrogen所提供。細胞生長於30℃並於移至誘發培養基後之指定時間點收取(利用離心方式)。細胞沈澱物經冷凍乾燥，且FAMEs以酸性甲醇製備並萃取至己烷中，再以GC分析。
先前實驗指出，原始形式OrfA(SEQ ID NO：1)與小量修飾之原始形式OrfB(OrfB＊ ，SEQ ID NO：37)於酵母菌內之表達不會產生預期分子大小之蛋白質(亦未發現其正確之mRNAs)。相較之下，預期分子大小之蛋白質可見於原始形式OrfC(SEQ ID NO：5)表達之細胞中。OrfsA與B之編碼基因經過再合成，因此其密碼子使用情形(codon usage)較優於其他酵母菌耐受株(再合成反應由Blue Heron,Inc.進行)。這些經合成基因為sOrfA(SEQ ID NO：35)與sOrfB(SEQ ID NO：36)。酵母菌中這些基因之表現會分別使預期大小之Orf A與B蛋白開始累積。
第7圖係比較表達裂殖壺菌PUFA合成酶系統(sOrfA、sOrfB、OrfC與Het I)之酵母菌細胞與控制組細胞(缺乏sOrfA基因)之脂肪酸表現。細胞於誘發~20 hrs後收集。可以發現，表達完整PUFA合成酶系統之殖株出現兩個新的FAME尖峰。此二尖峰經確認為DPA n－6與DHA，係以其沖提時間比對標準品並隨即以MS分析。如發明人所預期之裂殖壺菌PUFA合成酶特徵，亦即，除了DHA與DPA n－6以外，並未發現新的尖峰。
第8圖係顯示第7圖之GC圖譜區域，其包含PUFA FAMEs。控制組細胞與PUFA合成酶表達細胞兩者均含有一尖峰，且沖提位置接近DHA FAME。經確認為C26：0 FAME且(依據文獻參考資料)已知衍生自鞘脂類(sphingolipids)。雖然沖提位置接近DHA尖峰，但解析程度夠，故不會干擾DHA的定量。DPAn－6尖峰可有效地由其他內生性酵母菌脂質中分離出來並以FAME形式表現。在此特定範例中，裂殖壺菌PUFA合成酶系統表達細胞可累積2.4% DHA與2.0% DPAn－6(以總FAMEs百分比表示)。DHA與DPA n－6於細胞中所測得脂肪酸之總和為4.4%。細胞內DHA與DPA n－6之比為~1.2：1。
上述結果顯示，酵母菌裂殖壺菌PUFA合成酶之表達，可用於確認先前申請案中所提出之假設，並可預測酵母菌與植物中脂肪酸表現改變後之狀況。
範例9
以下範例係描述以共同表達特定醯基－輔酶A合成酶的方式，增加表達裂殖壺菌PUFA合成酶之酵母菌PUFAs累積情況。
發明人指出，在裂殖壺菌，其PUFA合成酶之FFA產物可受內生性醯基－輔酶A合成酶(ACoASs)之作用而有效轉變為醯基－輔酶A(請見上述範例)。藉由比對EST數據庫後，發明人發現9個AcoASs可能參與PUFAs轉變為醯基－輔酶A之過程。
簡單來說，本發明人比對裂殖壺菌EST數據庫，其中含有由不同cDNA基因庫挑出的~20,000個別質體序列，且這些ESTs具備蛋白類似性及已知(或預期)之AcoAS活性。發明人使用VectorNTI程式，Contig Express，組合這些基因疊連群(contigs)(當出現二或更多重疊序列時)並依據各序列訊息進行編排。結果摘要如下。有八個不同疊連群與單一片段(於數據庫內無重疊序列)被確認出可能與AcoAS酵素有關，並能有效地將PUFA合成酶產物轉變為醯基－輔酶A。利用EST之數據，可獲得每一可能片段之完整編碼區序列，並可使用多種標準方法進行檢驗(例如，基因體DNA與基因體DNA衍生之PCR產物定序分析)。
裂殖壺菌醯基－輔酶A合成酶(ACS）之編碼序列與演繹性轉譯作用： 1.長度＝2004個核苷酸(不包括終止密碼)(SEQ ID NO：82)。預期可編碼668個胺基酸(SEQ ID NO：83)，分子量73.5 kDa的蛋白。蛋白質序列與已知ACSs具有良好的類似性。最好的Blast比對結果為Thalassiosira pseudonanna ACS (TplacA，編號：AAW58006)，已知其具有高DHA活性(Tonon等人，Plant Physiol.2005 May；138(1)：402－8)。SEQ ID NO：83之碳端三個胺基酸為：SKL－係一將標的蛋白帶往過氧化體(peroxisome)之相關區域。此碳端區域亦出現於上述Thalassiosira pseudonanna ACS中。
2.ScACS－2(亦標示為ScACoAS－2或ACS－2) ：長度＝2340個核苷酸(不包括終止密碼)(SEQ ID NO：84)。預期可編碼780個胺基酸(SEQ ID NO：85)，分子量84.7 kDa的蛋白。大部分經推測之蛋白與已知之ACSs，包括人類之示範性Lipidosin與口香糖(Bubble Gum)形式，具有良好的類似性。
3.ScACS－3(亦標示為ScACoAS－3或ACS－3) ：長度＝2526個核苷酸(不包括終止密碼)(SEQ ID NO：86)。預期可編碼842個胺基酸(SEQ ID NO：87)，分子量90.6 kDa的蛋白。大部分經推測之蛋白(特別是中心部位~700個胺基酸)與口香糖(Bubble Gum)形式之ACS蛋白具有良好的類似性。
4.ScACS－4(亦標示為ScACoAS－4或ACS－4) ：長度＝2037個核苷酸(不包括終止密碼)(SEQ ID NO：88)。預期可編碼679個胺基酸(SEQ ID NO：89)，分子量74.7 kDa的蛋白。大部分經推測之蛋白與已知ACSs蛋白，包括人類與其他哺乳類之範例，具有良好的類似性。
5.ScACS－5(亦標示為ScACoAS－5或ACS－5) ：長度＝1734個核苷酸(不包括終止密碼)(SEQ ID NO：90)。預期可編碼578個胺基酸(SEQ ID NO：91)，分子量63.1 kDa的蛋白。大部分經推測之蛋白與已知ACS蛋白具有良好的類似性。最好的Blast比對結果為細菌ACSs。SEQ ID NO：91之碳端三個胺基酸為：SKL－係一將標的蛋白帶往過氧化體之相關區域。
6.ScACS－6(亦標示為ScACoAS－6或ACS－6) ：長度＝1806個核苷酸(不包括終止密碼)(SEQ ID NO：92)。預期可編碼602個胺基酸(SEQ ID NO：93)，分子量66.0 kDa的蛋白。大部分經推測之蛋白與已知ACS蛋白具有良好的類似性。最好的Blast比對結果為細菌ACSs。SEQ ID NO：93之碳端三個胺基酸為：係一將標的蛋白帶往過氧化體之相關區域。
7.ScACS－7(亦標示為ScACoAS－7或ACS－7) ：長度＝1920個核苷酸(不包括終止密碼)(SEQ ID NO：94)。預期可編碼640個胺基酸蛋白(SEQ ID NO：95)，分子量70.4 kDa的蛋白。大部分經推測之蛋白與已知ACS蛋白具有良好的類似性。最好的Blast比對結果為細菌ACSs。
8.ScACS－8(亦標示為ScACoAS－8或ACS－8) ：長度＝1893個核苷酸(不包括終止密碼)(SEQ ID NO：96)。預期可編碼631個胺基酸(SEQ ID NO：97)，分子量70.7 kDa的蛋白。最好的Blast比對結果為脂肪酸運輸蛋白家族成員，可能具備AcoAS活性。
9.ScACS－9(亦標示為ScACoAS－9或ACS－9) ：長度＝2950個核苷酸(不包括終止密碼)(SEQ ID NO：98)。預期可編碼766個胺基酸(SEQ ID NO：99)，分子量84.1 kDa的蛋白。大部分經推測之蛋白與已知ACS蛋白具有良好的類似性。最好的Blast比對結果為動物ACSs。
發明人認為，異源宿主所表現之PUFA合成酶可能無法有效處理新生成的(針對該生物體)PUFA游離脂肪酸(FFAs)，而共同表現適當的ACoAS(s)可能會增加該宿主PUFAs的累積。上述裂殖壺菌ACoASs中，其中有兩種可個別表達於(ScACS－1，SEQ ID NO：82/83與ScACS－2，SEQ ID NO：84/85)酵母菌，並含有裂殖壺菌PUFA合成酶系統之編碼基因(例如，sOrfA、sOrfB與nOrfC，及Het I)。
更特別的是，上述範例之酵母菌表達系統係經修正，其中使用4載體並導入第五種ACoAS基因(亦即，酵母菌亦含有裂殖壺菌PUFA合成酶系統OrfsA、B與C與PPTase(Het I源自Nostoc))。可選殖兩基因之酵母菌表達載體(pESC載體)係購自Stratagene。這些載體均類似，並與上述pYES載體相容。將兩基因，原始OrfC(nOrfC，SEQ ID NO：5)與HetI(SEQ ID NO：33)，選殖至pESC載體，而sOrfA(SEQ ID NO：35，sOrfB(SEQ ID NO：36)與第五種基因(ScACS－1(SEQ ID NO：82)或ScACS－2(SEQ ID NO：84))則選殖至pYES載體。將四載體導入酵母菌中，而基因之誘發作用如前述將細胞再懸浮於含乳糖培養基中。細胞生長於30℃並於誘發後18小時收取。這些細胞的FAME分析摘錄於表1。控制組細胞含有所有4種載體，但缺少Orf A編碼基因。共同表達任何一種ScACOASs可增加DHA與DPA n－6之累積量(約為控制組細胞之兩倍)。因此可以確定，異源宿主PUFA合成酶產物之累積因酵素之共同表達而增加，因其能更有效利用這些產物。
在隨後實驗中，ScACS－3、ScACS－5、ScACS－6與ScACS－8亦利用酵母菌進行檢測，其中含有裂殖壺菌PUFA合成酶系統編碼基因(例如，sOrfA、sOrfB與nOrfC，及HetI)，並使用前述類似之方法。相較於不加入醯基－輔酶A合成酶基因之結果，ScACS－3、ScACS－5或ScACS－8之個別表達均造成酵母菌DHA產量的增加(數據未顯示)。
如前面所述，ScACS－8具有脂肪酸運輸蛋白家族成員類似性，可能也具備ACS活性。已知這些蛋白可結合至細胞膜，以協助游離脂肪酸進入細胞並將其轉變為醯基－輔酶A衍生物。在植物細胞色素體(plastids)內，此家族酵素於PUFA合成酶系統表達時可能具有特定用途，其中產物以游離脂肪酸形式釋出。色素體的外膜被認為源自細胞膜，故細胞膜標的蛋白(例如ScACS－8)亦可能作為色素體之外膜標的蛋白。如此一來，這些脂肪酸運輸蛋白(例如ScAC－8)可協助色素體內PUFA合成酶游離脂肪酸產物之釋放，並可將其轉變為醯基－輔酶A衍生物。一表達裂殖壺菌PUFA PKS系統之植物醯基－輔酶A合成酶實驗敘述如下。
範例10
以下範例顯示，表達裂殖壺菌PUFA合成酶之酵母菌PUFA表現量之增加情形，以及在無或有ScACoAS－1且生長時加入淺藍菌素(cerulenin)以抑制FAS途徑。
PUFA合成酶與FAS均以丙二醯基－CoA為碳的來源以合成其脂肪酸產物。此外，兩系統所合成之脂肪酸醯基－輔酶A形式，可作為合成PL與TAG之酵素受質。如前面所討論，當PUFA合成酶與FAS存在於一生物體時，FAS系統之向下調節或抑制作用預期會增加PUFAs的累積。淺藍菌素為一常見之脂肪酸合成縮合反應抑制劑。先前研究指出，相較於FAS系統，PUFA合成酶對於淺藍菌素之抑制作用敏感性較低。
本發明人檢測淺藍菌素對於範例8所述酵母菌殖株脂肪酸表現之影響，並以此作為FAS活性降低之模式。範例9所述之酵母菌亦含有醯基CoA－合成酶，亦於本系統中檢測，以確定兩種方式之效果是否為加成地或協同地增加PUFA產量。
初步實驗顯示，最大效用(亦即，PUFAs之增加以總脂肪酸表現百分比表示)出現於淺藍菌素濃度4 uM時。在移至乳糖誘發培養基後4小時加入淺藍菌素。細胞於移至誘發培養基後19 hr收取，冷凍乾燥，並製備FAMES以進行GC分析。
經檢測之酵母菌殖株為：．殖株5.5含有PUFA合成酶基因(sOrfA、sOrfB、OrfC與Het I)，如前述範例8所示；以及．殖株5.6含有殖株5.5之PUFA合成酶基因，再加上ScACoAS－1(SEQ ID NO：82)，如前述範例9所示。
參照表2，“0 Cer”意指不加入淺藍菌素，且“4 uM Cer”意指移至誘發培養基4小時後加入4 uM淺藍菌素。每一殖株均評估其於存在與不存在淺藍菌素時脂肪酸之產生，以確認FAS途徑之抑制對於PUFA產生之影響。表2顯示以GC分析時之主要脂肪酸表現情形(亦請見第11圖)。其結果以總脂肪酸百分比表示。DHA與DPAn－6為裂殖壺菌PUFAPKS系統之產物，並為僅有之PUFAs。DHA外加DPAn－6之總和列於表2。第9與第10圖係酵母菌DHA(第9圖)或DHA外加DPAn－6(第10圖；白色柱狀圖為DHA；黑色柱狀圖為DHA＋DPAn－6)之產量，並以總FAME百分比表示。
不含PUFA合成酶基因之酵母菌細胞未發現任何PUFAs。在本實驗中，表達PUFA合成酶系統之酵母菌會累積1.2% DHA。含有ScACoA－1基因(SEQ ID NO：82)之DHA產量可增加4.1%。含PUFA合成酶系統之細胞於4 uM淺藍菌素(抑制FAS系統)存在時之DHA產量增加3.7%。以表達PUFA合成酶與ScACoAS－1基因之細胞生長於含4 uM淺藍菌素(亦即，結合醯基－輔酶A合成酶表達系統與抑制FAS系統)之培養基時，DHA產量增加至總脂肪酸的8.2%。在所有樣本中，DPAn－6累積量相對增加。樣本中DHA外加DPA n－6之總和亦列於表2，其中最大量者(為總脂肪酸14.5%)為生長於4 uM淺藍菌素之殖株5.6。可以發現的是，ACoA合成酶基因之表達與淺藍菌素之生長條件為附加效應。這些數據顯示，本發明可增加異源宿主之PUFAs累積。
範例11
以下範例係描述可增加異源宿主PUFA產量與/或累積量之其他組裝蛋白或標的物之確認。
裂殖壺菌內之酵素可有效利用PUFA合成酶產物醯基－輔酶A以合成磷脂質(PL)與三酸甘油酯(TAG)分子。然而，異源宿主內之酵素無法進行這些反應以產生類似功效，因為這些PUFA－COAs無法為該生物體所使用。舉例而言，PL或TAG合成酵素之表達可增加產物累積能力，這是因為其可於異源宿主內，有效地將各種PUFA合成酶(例如，DHA－CoA、DPA n－6－CoA、EPA－CoA或其他)之醯基－輔酶A產物轉變為PL或TAG分子。如此一來，裂殖壺菌或其他可經由PUFA合成酶途徑產生PUFAs之生物體，可作為編碼這類酵素基因之良好來源。因此，本發明人提出可使用數種醯基轉移酶蛋白，其以PUFA－CoA為受質產生PL或TAG(例如，3－甘油－磷酸醯基轉移酶(GPAT)、溶血磷酸酯醯基轉移酶(LPAAT)與甘油二酯醯基轉移酶(DAGAT))，或其他醯基轉移酶，其可增加PUFAs中的PL或TAG(例如，磷脂質：甘油二酯醯基轉移酶(PDAT))。多種此類醯基轉移酶之確認如下。其中少部分已於酵母菌與植物中進行檢測。
DAGAT酵素 本發明人進行裂殖壺菌EST數據庫中之相關ESTs比對，其具備類似已知(或推測)DAGAT活性之蛋白。發明人確認三種可能的DAGAT酵素並用於結合PUFA PKS系統，其中一種描述如下並顯示可參與裂殖壺菌游離脂肪酸以TAG分子累積之過程：裂殖壺菌DAGAT(亦指DAGAT－1或ScDAGAT－1) －密碼區長度＝1518個核苷酸(不包括終止密碼)(SEQ ID NO：100)。預期可編碼506個胺基酸(SEQ ID NO：101)，分子量為57.4 kDa之蛋白。其與已知DAGAT Type 2B酵素蛋白內部三分之二具有良好的類似性(始於~胺基酸170並延伸至碳端)。前面三分之一蛋白序列(胺基酸1至170)的Blast比對分析並未明顯與任何蛋白有類似性且未發現任何Pfam配對。
利用上述範例1之裂殖壺菌FAS基因剔除技術，發明人可剔除裂殖壺菌殖株之DAGAT基因(包含有SEQ ID NO：100)，並標示為B73－8。如第13圖所示，裂殖壺菌中DAGAT基因失活可明顯抑制脂肪酸TAG之累積。特別的是，DAGAT的失活，可減少大約80% mg FAME/gm生物量及減少大約90% TAG。因此，發明人認為此DAGAT為主要參與裂殖壺菌TAG合成之酵素。
因此，預期此核酸分子於本發明PUFA PKS系統表達宿主(例如，酵母菌、植物)內之表現，為增加游離脂肪酸以PL或TAG之形式累積。於轉基因植物內表達此基因之代表性實驗描述如下。
LPAAT酵素 本發明人亦進行裂殖壺菌EST數據庫中之相關ESTs比對，其具備類似已知(或推測)LPAAT活性之蛋白。發明人將其收集成疊連群(即形成二或更多重疊序列)，並依據前述各序列訊息進行編排。結果摘錄如下。有三個不同疊連群與單一片段(於數據庫內無重疊序列)被確認出與LPAAT酵素有關。可以理解的是，這些序列所編碼之酵素可能具備類似，但不同於，所推測之LPAAT活性。在所有四種情況之中，有一推測之Orf(包括起始與終止密碼)被確認。可以理解的是，隨著更多數據的取得，會發現原本精確的序列，包括內在之起始密碼，可能有所改變。
分析EST數據庫以確認可能的裂殖壺菌LPAAT ：1.ScLPAAT－1疊連群 ：長度＝1478個核苷酸(SEQ ID NO：102)。其中包括Orf全長927 nt(包括終止密碼，ScLPAAT－1 CDS，SEQ ID NO：103)。利用CDS(SEQ ID NO：104)轉譯與Blast搜尋，顯示其中大部分之蛋白編碼部位與已知及推測之醯基轉移酶蛋白具有良好之類似性。最佳配對之蛋白來自Arabidopsis。Pfam分析顯示有一大塊中央保留區域與PlsC(1－醯基－sn－甘油－3－磷酸醯基轉移酶，亦即，LPAAT)家族有關。
2.ScLPAAT－2疊連群 ：長度＝2112個核苷酸(SEQ ID NO：105)。其中包括Orf全長1140 nt(包括終止密碼，ScLPAAT－2 CDS，SEQ ID NO：106)。利用CDS(SEQ ID NO：107)轉譯與Blast搜尋，顯示其中大部分之蛋白編碼部位與已知及推測之醯基轉移酶蛋白具有良好之類似性。最佳配對之蛋白來自阿拉伯芥(Arabidopsis)。Pfam分析顯示有一大塊中央保留區域與PlsC(1－醯基－sn－甘油－3－磷酸醯基轉移酶，亦即，LPAAT)家族有關。
3.ScLPAAT－3疊連群 ：長度＝1862個核苷酸(SEQ ID NO：108)。其中包括Orf全長1323 nt(包括終止密碼，ScLPAAT－3 CDS，SEQ ID NO：109)。利用CDS(SEQ ID NO：110)轉譯與Blast搜尋，顯示其中大部分之蛋白編碼部位與已知及推測之醯基轉移酶蛋白具有良好之類似性。最佳配對之蛋白來自哺乳類動物。Pfam分析顯示有一大塊中央保留區域與PlsC(1－醯基－sn－甘油－3－磷酸醯基轉移酶，亦即，LPAAT)家族有關。
4.ScLPAAT－4單體 ：長度＝794個核苷酸(SEQ ID NO：111)。其中包括Orf全長756 nt(包括終止密碼，ScLPAAT－4 CDS，SEQ ID NO：112)。利用CDS(SEQ ID NO：113)轉譯與Blast搜尋，顯示其中大部分之蛋白編碼部位與已知及推測之醯基轉移酶蛋白具有良好之類似性。最佳配對之蛋白來自鳥類與哺乳類動物。Pfam分析顯示有一大塊中央保留區域與PlsC(1－醯基－sn－甘油－3－磷酸醯基轉移酶，亦即，LPAAT)家族有關。
ScLPAAT－1經選殖及表達於酵母菌與植物。
其他DAGAT或LPAAT酵素 發明人亦比對隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)EST數據庫，係針對已知或推測具備DAGAT或LPAAT活性之類似蛋白之ESTs。結果摘錄如下。
A)分析EST數據庫以確認可能的隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)DAGAT ：1.CA5 PTA.838.C ：長度＝817個核苷酸(SEQ ID NO：114)。本序列最後274個核苷酸與PCT專利公開號WO 2004/087902所揭示之隱甲藻醯基轉移酶序列有好的類似性。
2.CA5 PTA.131.C1 ：長度＝850個核苷酸(SEQ ID NO：115)。
3.CA12 cot10 003a h10 ：長度＝663個核苷酸(SEQ ID NO：116)。
4.CA12 cot10 001a h02 ：長度＝807個核苷酸(SEQ ID NO：117)。
5.CA12 cot10 005b g12 ：長度＝765個核苷酸(SEQ ID NO：118)。
6.CA12 cot50 005c d07 ：長度＝782個核苷酸(SEQ ID NO：119)。
B)分析EST數據庫以確認可能的隱甲藻(Crvpthecodinium cohnii)LPAAT ：1.CA12 cot10 003a e11 ：長度＝793個核苷酸(SEQ ID NO：120)。
2.CA12 PTA.739.C1 ：長度＝744個核苷酸(SEQ ID NO：121)。
本範例中所述之任何一或更多之核酸分子可轉形於任何宿主細胞，包括產生任何經基因修飾生物體(例如，植物或微生物)，以進一步增加生物體內PUFA之累積，特別的是，表達PUFA PKS系統之生物體。若宿主生物體利用傳統或標準脂肪酸合成酶途徑產生PUFAs，則這些酵素的表達亦具有用途。這些構築體可單獨於PUFA PKS系統進行或結合其他方法，以增加本發明宿主生物PUFA之產量與累積量(例如，結合醯基－輔酶A合成酶表達殖株或結合FAS途徑抑制殖株)。PCT專利公開號WO 2004/087902所揭示之其他醯基轉移酶序列，於本發明中亦考量其可能用途，在此列為參考資料。
範例12
以下範例係描述於阿拉伯芥中表現編碼裂殖壺菌PUFA合成酶(OrfA、OrfB＊ 與OrfC)以及Het I之基因，以及製造PUFA、DHA與DPAn－6，在實質上無任一可偵測之中間產物或副產物存在下。
裂殖壺菌OrfA(核苷酸序列由SEQ ID NO：1代表)、OrfB＊ (核苷酸序列由SEQ ID NO：37代表)，與OrfC(核苷酸序列由SEQ ID NO：5代表)，及Het I(核苷酸序列由SEQ ID NO：33代表)係選殖(分別或以各種組合，包括所有4基因於一超級構築體上)，至適當之雙價載體上，以引入該基因至植物上。此構築體與載體之範例描述如下(三個表現構築體)，及範例13(一“超級構築體”4127)。
5720之構築 ：Orf B＊ (色素體表現)Orf B＊ (編碼SEQ ID NO：4)係限制選殖於表現基因匣上，在flax linin啟動子/終結子控制下(美國專利號6,777,591)。linin啟動子控制轉殖基因之特定－短暫與組織特異性表現，在種子發育期間。裂殖壺菌Orf B＊ 之直接上游與框內區域為色素體標的序列，衍生自甘藍型油菜(Brassica napus)醯基－ACP硫酯酶(PT－訊號胜肽)，將Orf B＊ 傳送至色素體。該植物雙價表達載體亦包含一現存之大腸桿菌磷酸甘露糖異構酶基因(Miles and Guest,1984,Gene 32：41－48)，由得自荷蘭芹(Petroselinum crispum)之泛素(ubiquitin)啟動子/終結子驅動(Kawalleck等人，1993,Plant Mol.Bio.,21：673－684)，介於左與右邊界序列間，用於陽性篩選(Haldrup等人，1998,Plant Mol.Biol.37：287－296)。
4107之構築 ：HetI與Orf C(色素體表現)裂殖壺菌Orf C(核苷酸序列，由SEQ ID NO：5代表)以及HetI(核苷酸序列由SEQ ID NO：33代表)係選殖至表現基因盒上，在flax linin啟動子/終結子控制下(美國專利號6,777,591)。linin啟動子控制轉殖基因之特定－短暫與組織特異性表現，在種子發育期間。裂殖壺菌Orf C與HetI之直接上游與框內區域為色素體標的序列，衍生自甘藍型油菜(Brassica napus)醯基－ACP硫酯酶(PT－訊號胜肽)，將PUFA合成酶與PPTase傳送至色素體。二表現基因盒之後組合成一植物雙價表達載體，含有一pat基因，提供宿主植物膦基丁胺酸(phosphinothricine)抵抗性(Wohlleben等人，1988,Gene 70：25－37)由得自荷蘭芹(Petroselinum crispum)之泛素(ubiquitin)啟動子/終結子驅動(Kawalleck等人，1993,Plant Mol.Bio.,21：673－684)，介於左與右邊界序列間。
4757之構築 ：Orf A(色素體表現)裂殖壺菌Orf A(核苷酸序列，由SEQ ID NO：1代表)係選殖至表現基因盒上，在flax linin啟動子/終結子控制下(美國專利號6,777,591)。linin啟動子控制轉殖基因之特定－短暫與組織特異性表現，在種子發育期間。裂殖壺菌Orf A為色素體標的序列，衍生自甘藍型油菜(Brassica napus)醯基－ACP硫酯酶(PT－訊號胜肽)，將PUFA合成酶與PPTase傳送至色素體。表現基因匣係包含於植物雙價表達載體中，其含有一nptII基因，提供宿主植物卡那黴素抵抗性，由MAS啟動子/終結子驅動，介於左與右邊界序列間。
在一範例中，轉殖基因係選殖至三單獨之表現基因盒上：一構築體命名為5720(含有OrfB＊ ，係編碼SEQ ID NO：4)、一構築體命名為4107(含有OrfC，係編碼SEQ ID NO：6，與HetI，係編碼SEQ ID NO：34)，以及一構築體命名為4757(包含OrfA，包含SEQ ID NO：2)，如上所述。在每一構築體中，基因係選殖。為了引導蛋白質至色素體中，額外之5’序列係編碼一色素體標的序列，衍生自荷蘭芹(Petroselinum crispum)之醯基－ACP硫酯酶，係直接位於Orfs A、B＊ 、C與HetI之上游。經編碼標的胜肽之胺基酸序列為：MLKLSCNVTNHLHTFSFFSDSSLFIPVNRRTLAVS(SEQ ID NO：81)。編碼此胜肽之核苷酸序列係置於讀框內，起使密碼子為甲硫胺酸，在每一PUFA合成酶Orf中，Het I之起使密碼子為人造(ATG)。在其他構築體中，其中PUFA合成酶之位置係以植物細胞之細胞質為標的，無額外之蛋白質編碼序列係附於Orfs之5’端。
標準方法係用於引入該基因於阿拉伯芥中(浸蘸(floral dipping)至含有適當載體之阿拉伯芥殖株懸浮液中，如Clough等人，1998,Plant J.16：735－743所述)。該方法之細節係描述於下面範例13。由這些植物獲得之種子係種植於選擇性培養基上，並使其發芽。某些成長中植物係生長至成熟，並分析種子之PUFA含量。基於PUFA含量，這些種子之一部分係進行至下一代。由這些植物獲得之匯集種子係分析其脂肪酸含量。這些基因轉殖植物中之標的PUFA為二十二碳六烯酸(DHA)與二十二碳五烯酸(DPAn－6)，其為由裂殖壺菌PUFA PKS系統製造之主要PUFA所衍生，其中該基因係用於轉型該植物。
一示範性基因轉殖植物株之脂肪酸分析範例係示於第13圖。第13圖上圖顯示野生型阿拉伯芥種子典型之脂肪酸分佈，以匯集種子樣本製備之FAME代表，其經由GC分離與FID偵測。主要脂肪酸為：16：0、18：0、16：1、18：1、20：1、20：2與22：1。無DHA或DPA n－6出現於野生型種子樣本中。
第13圖之下圖顯示一示範性基因轉殖阿拉伯芥株(品系263)之脂肪酸分佈，其表現裂殖壺菌PUFA合成酶基因與HetI基因，自三個分離之表現基因盒(5720、4107與4757)引入，所有皆以色素體為標的，如上所述。參照品系263之脂肪酸分佈，可立即觀察到二FAME尖峰係出現於轉殖植物種子之分佈中，而非出現於野生型種子之分佈中。此二尖峰之沖提態樣確實反應於真正之DHA與DPAn－6沖提情況(使用製備自裂殖壺菌油類之FAME作為標準物，以及商業上可購自NuCheck Prep之DHA標準物)。在此特定範例中，該DHA尖峰代表0.8%之總計算FAME，而DPA n－6尖峰代表1.7%。新PUFA之總和為2.5%總FAME。
其他基因轉殖植物品系之實驗產生類似之結果。舉例而言，另一轉殖基因品系，命名為269，其以與263品系相同之構築體與類似之方法轉型，製造約0.75%總計算FAME之DHA，以及1.41%總計算FAME之DPAn－6(資料未顯示)。
此外，多個使用上述相同核酸分子之其他轉殖基因阿拉伯芥，亦製造標的PUFA，不論其使用PUFA PKS基因與HetI PPTase分離構築之構築體、合併之構築體，或單一超級構築體(資料顯示於範例13)。
此外，將PUFA PKS基因傳送至細胞質之基因轉殖植物，皆表現出標的PUFA(資料未顯示)。舉例而言，表現裂殖壺菌PUFA PKS與HetI於細胞質中之植物品系，係引入至三個分離之表現基因盒，如上所述(無色素體標的序列)，係製造約0.45% DHA與約0.8% DPA，佔總FAME之比例。在另一範例中，表現裂殖壺菌PUFA PKS與HetI於細胞質中植物，係引入至一超級構築體上(類似於下列範例13所述)，製造約0.2－0.3% DHA與約0.5% DPA，佔總FAME之比例。
DHA與DPAn－6在種子脂肪酸分佈中之出現係示於第13圖(並於其他轉殖殖株中觀察到，某些如上所述)，顯示有引入裂殖壺菌PUFA合成酶系統功能，當表現於植物細胞中時，且該蛋白質可以色素體為標的。此外，本發明人確認該蛋白質可以細胞質為標的，或以色素體與細胞質二者為標的，製造PUFA。如同其他宿主中之生化與異源性表現數據(例如，於大腸桿菌與酵母菌中)，在轉殖植物種子分佈中僅偵測到之新脂肪酸為DHA或DPA n－6(亦即，該脂肪酸分佈實質上不含污染之中間產物或副產物，得自PUFA產生酵素系統)，更進一步說明在植物製造PUFA方面，PUFA PKS系統較標準路徑酵素佳。
範例13(a)－13(i)
以下範例係描述使用此述各種策略(包括策略之結合)，以增加植物中PUFA之製造及/或累積。
特別是，以下範例描述在阿拉伯芥種子中表現編碼裂殖壺菌PUFA合成酶(nOrfA、Orf B＊ 與nOrfC)之基因，以及Het I，單獨或與其他附屬蛋白質結合，與/或基因修飾策略，以增強PUFA之製造與累積。特別地，該裂殖壺菌PUFA合成酶與Het I係單獨表現於植物中，或與：(1)編碼醯基－CoA合成酶(ACS)之基因，或(2)用於抑制內生性FAS活性之基因元素結合。此外，亦展示合併使用裂殖壺菌PUFA合成酶與Het I，以及表現ACS基因，與用於抑制內生性FAS活性之基因元素，之範例。最後，醯基轉移酶，包括DAGAT與/或LPAAT，之表現範例，單獨或與一或多種醯基－CoA合成酶，以及用於抑制內生性FAS活性之基因元素合併，係描述如下。此述指出之策略係說明了執行先前植物範例中所描述概念之能力。
範例13(a)－(i)之材料與方法
(1) 構築體 構築體4127之構築 ：PT－訊號胜肽：nORFA、PT－訊號胜肽：nORFB＊ 、PT－訊號胜肽：HetI、PT－訊號胜肽：nORFC(裂殖壺菌PUFA合成酶，具有HetI之色素體標的表現)裂殖壺菌原始OrfA(nOrfA，由SEQ ID NO：1代表，係編碼SEQ ID NO：2)、合成(再合成)OrfB＊ (OrfB＊ ，由SEQ ID NO：37代表，係編碼SEQ ID NO：4)，及原始OrfC(nOrfC，由SEQ ID NO：5代表，並編碼SEQ ID NO：6)，以及來自Nostoc之HetI(由SEQ ID NO：33代表並編碼SEQ ID NO：34)，係選殖於表現基因盒上，在flax linin啟動子/終結子控制下(請見美國專利號No.6,777,591，啟動子/終結子方面)。linin啟動子控制轉殖基因之特定－短暫與組織特異性表現，在種子發育期間。裂殖壺菌Orfs A、B＊ 、C與HetI之直接上游與框內區域為色素體標的序列，衍生自甘藍型油菜(Brassica napus)醯基－ACP硫酯酶(於此係指一PT－訊號胜肽，其胺基酸序列係由SEQ ID NO：81代表)，描述於範例12，PUFA合成酶與PPTase標的為色素體。所有四種表現基因盒係組合至一植物雙價表達載體上，其含有pat基因，提供宿主植物膦基丁胺酸抵抗性(Wohlleben等人，1988,Gene 70：25－37)，由得自荷蘭芹(Petroselinum crispum)之泛素啟動子/終結子驅動(Kawalleck等人，1993,Plant Mol.Bio.,21：673－684)，介於左與右邊界序列間。
5723之構築 ：ACS－1(細胞質表現)為了表現醯基－CoA合成酶，係構築單獨之植物雙價表達載體，以表現裂殖壺菌ACS－1之核酸序列(SEQ ID NO：82，係編碼SEQ ID NO：83)。ACS－1，5’與3’端經改造具有適當之限制酶位置，係係經選殖與定序。ACS－1之後經限制選殖至表現基因匣(expression cassette)中，在flax linin啟動子/終結子(美國專利號6,777,591)控制下，至植物雙價表達載體中，其含有大腸桿菌之磷酸甘露糖異構酶基因(Miles and Guest,1984,Gene 32：＋41－48)，由得自荷蘭芹(Petroselinum crispum)之泛素啟動子/終結子驅動(Kawalleck等人，1993,Plant Mol.Bio.,21：673－684)，介於左與右邊界序列之間，用於陽性篩選(Haldrup等人，1998,Plant Mol.Biol.37：287－296)。
類似之構築體亦製造，以表現醯基－CoA合成酶，於此分別稱之為ACS－2(SEQ ID NO：84/85)與ACS－8(SEQ ID NO：96/97)，5724與5730。在一觀點中，該醯基－CoA合成酶序列結合編碼DAGAT(SEQ ID NO：100/101)與/或LPAAT(SEQ ID NO：102/103/104)之核酸，如下所述。
5727之構築 ：KAS II RNAi，具有CHSA內含子(具有內含子之KAS II RNAi之細胞質表現)就FAS抑制而言，個別植物雙價表達載體係構築以降低KAS II之表現。在此情況下，由At1g74960位點編碼之細胞核編碼KAS II轉錄子之499 bp區域(Carlsson等人，2002,Plant J.29：761－770)，係以RNA干擾(RNAi)為標的，其具有干擾內含子，衍生自矮牽牛花(petunia chalcone)合成酶A(CHSA)基因(McGinnis等人，2005,Methods in Enzymology 392：1－24；Koes等人，1989,Gene 81：245－257)。具有CHSA內含子之KAS II RNAi(由SEQ ID NO：122代表)係選殖至植物雙價表達載體上，介於linin啟動子/終結子間(美國專利號6,777,591)，於含有大腸桿菌磷酸甘露糖異構酶基因之植物雙價表達載體中(Miles and Guest,1984,Gene 32：41－48)，由得自荷蘭芹(Petroselinum crispum)之泛素啟動子/終結子驅動(Kawalleck等人，1993,Plant Mol.Bio.,21：673－684)，介於左與右邊界序列間，用於陽性篩選(Haldrup等人，1998,Plant Mol.Biol.37：287－296)。
5729之構築 ：KAS III反義股RNA(KAS III反義股RNA之細胞內表現)就FAS抑制而言，個別植物雙價表達載體係構築以降低KAS III之表現。在此情況下，衍生自由At1g62640位點編碼之細胞核編碼反義股KAS III序列轉錄子之1210 bp(Yamada等人，2002,GenBank Accession AY091275)係為標的。KAS III反義股序列(於此係由SEQ ID NO：125代表)係選殖於植物雙價表達載體上，介於linin啟動子/終結子間(美國專利號6,777,591)，於含有大腸桿菌磷酸甘露糖異構酶基因之植物雙價表達載體中(Miles and Guest,1984,Gene 32：41－48)，其由得自荷蘭芹(Petroselinum crispum)之泛素啟動子/終結子驅動(Kawalleck等人，1993,Plant Mol.Bio.,21：673－684)，介於左與右邊界序列間，用於陽性篩選(Haldrup等人，1998,Plant Mol.Biol.37：287－296)。
5731之構築 ：ACS－1與具有內含子之KAS II RNAi(細胞質表現)就表現醯基－CoA合成酶，合併FAS抑制而言，個別之植物雙價表達載體係構築以降低KAS II之表現，並表現裂殖壺菌ACS－1之核酸序列(SEQ ID NO：82，係編碼SEQ ID NO：83)。就此構築體而言，ACS－1與具有內含子之KAS II RNAi之雙重表現基因匣係表現，在flax linin啟動子/終結子(美國專利號6,777,591)控制下，其選殖至含有大腸桿菌磷酸甘露糖異構酶基因之植物雙價表達載體上(Miles and Guest,1984,Gene 32：41－48)，由得自荷蘭芹(Petroselinum crispum)之泛素啟動子/終結子驅動(Kawalleck等人，1993,Plant Mol.Bio.,21：673－684)，介於左與右邊界序列間，用於陽性篩選(Haldrup等人，1998,P1ant Mol.Biol.37：287－296)。
5732之構築 ：ACS－1與反義股KAS II(細胞質表現)就表現醯基－CoA合成酶，合併FAS抑制而言，個別植物雙價表達載體係構築以降低KAS II之表現，並表現裂殖壺菌ACS－1之核酸序列(SEQ ID NO：82,編碼SEQ ID NO：83)。就此構築體而言，ACS－1與具有內含子之KAS II RNAi之雙重表現基因匣係表現(KASII反義股序列係由SEQ ID NO：123代表)，在flax linin啟動子/終結子(美國專利號6,777,591)控制下，其選殖至含有大腸桿菌磷酸甘露糖異構酶基因之植物雙價表達載體上(Miles and Guest,1984,Gene 32：41－48)，由得自荷蘭芹(Petroselinum crispum)之泛素啟動子/終結子驅動(Kawalleck等人，1993,Plant Mol.Bio.,21：673－684)，介於左與右邊界序列間，用於陽性篩選(Haldrup等人，1998,Plant Mol.Bio1.37：287－296)。
5733之構築 ：ACS－1與KAS III RNAi(細胞質表現)就表現醯基－CoA合成酶，合併FAS抑制而言，個別植物雙價表達載體係構築以降低KAS III之表現，並表現裂殖壺菌ACS－1之核酸序列(SEQ ID NO：82,編碼SEQ ID NO：83)。就此構築體而言，ACS－1與具有內含子之KAS III RNAi之雙重表現基因匣係表現，(KASIII RNAi序列係由SEQ ID NO：124代表)，在flax linin啟動子/終結子(美國專利號6,777,591)控制下，其選殖至含有大腸桿菌磷酸甘露糖異構酶基因之植物雙價表達載體上(Miles and Guest,1984,Gene 32：41－48)，由得自荷蘭芹(Petroselinum crispum)之泛素啟動子/終結子驅動(Kawalleck等人，1993,Plant Mol.Bio.,21：673－684)，介於左與右邊界序列間，用於陽性篩選(Haldrup等人，1998,Plant Mol.Biol.37：287－296)。
5734之構築 ：ACS－1與KAS III反義股RNA(細胞質表現)就表現醯基－CoA合成酶，合併FAS抑制而言，個別植物雙價表達載體係構築以降低KAS III之表現，並表現裂殖壺菌ACS－1之核酸序列(SEQ ID NO：82，編碼SEQ ID NO：83)。就此構築體而言，ACS－1與具有內含子之KAS III RNAi之雙重表現基因匣係表現，在flax linin啟動子/終結子(美國專利號6,777,591)控制下，其選殖至含有大腸桿菌磷酸甘露糖異構酶基因之植物雙價表達載體上(Miles and Guest,1984,Gene 32：41－48)，由得自荷蘭芹(Petroselinum crispum)之泛素啟動子/終結子驅動(Kawalleck等人，1993,Plant Mol.Bio.,21：673－684)，介於左與右邊界序列間，用於陽性篩選(Haldrup等人，1998,Plant Mol.Biol.37：287－296)。
4793之構築 ：DAGAT就DAGAT之表現而言，個別之植物雙價表達載體係構築，以表現裂殖壺菌DAGAT－1(SEQ ID NO：100，係編碼SEQ ID NO：101)。裂殖壺菌DAGAT(核酸序列係由SEQ ID NO：100代表)係選殖於表現基因盒上，在flax linin啟動子/終結子(美國專利號6,777,591)控制下。linin啟動子控制轉殖基因之特定－短暫與組織特異性表現，在種子發育期間。表現基因匣係包含於植物雙價表達載體內，其含有nptII基因，可提供宿主植物卡那黴素抵抗性，由MAS啟動子/終結子驅動，介於左與右邊界序列間。
4794之構築： DAGAT與ACS－8就DAGAT與醯基－CoA合成酶之表現而言，個別之植物雙價表達載體係構築以表現：(1)裂殖壺菌DAGAT之核酸序列(SEQ ID NO：100，係編碼SEQ ID NO：101)，以及(2)裂殖壺菌ACS－8之核酸序列(SEQ ID NO：96，係編碼SEQ ID NO：97)。就此構築體而言，ACS－8與DAGAT之雙重表現基因匣係表現，在flax linin啟動子/終結子(美國專利號6,777,591)控制下，其選殖至含有nptII基因之植物雙價表達載體上，其提供宿主植物卡那黴素抵抗性，由MAS啟動子/終結子驅動，介於左與右邊界序列間。
4795之構築 ：LPAAT與DAGAT就LPAAT與DAGAT之表現而言，個別之植物雙價表達載體係構築以表現：(1)裂殖壺菌LPAAT之核酸序列(SEQ ID NO：103,編碼SEQ ID NO：104，以及(2)裂殖壺菌DAGAT－1之核酸序列(SEQ ID NO：100，係編碼SEQ ID NO：101)。就此構築體而言，LPAAT與DAGAT之雙重表現基因匣係表現，在flax linin啟動子/終結子(美國專利號6,777,591)控制下，其選殖至含有nptII基因之植物雙價表達載體上，其提供宿主植物卡那黴素抵抗性，由MAS啟動子/終結子驅動，介於左與右邊界序列間。
4796之構築 ：ACS－8、LPAAT與DAGAT就醯基－CoA合成酶、LPAAT與DAGAT之表現而言，個別之植物雙價表達載體係構築以表現：(1)裂殖壺菌LPAAT之核酸序列(SEQ ID NO：103，係編碼SEQ ID NO：8104)，(2)裂殖壺菌DAGAT－1之核酸序列(SEQ ID NO：100，係編碼SEQ ID NO：101)，以及(3)裂殖壺菌ACS－8之核酸序列(SEQ ID NO：96，係編碼SEQ ID NO：97)。就此構築體而言，ACS－8、LPAAT與DAGAT之三重表現基因匣係表現，在flax linin啟動子/終結子(美國專利號6,777,591)控制下，其選殖至含有nptII基因之植物雙價表達載體上，其提供宿主植物卡那黴素抵抗性，由MAS啟動子/終結子驅動，介於左與右邊界序列間。
(2)阿拉伯芥之轉型 所有植物雙價載體之整體性，係以診斷性限制切割與序列分析而確定。分離出之質體係用以使農桿菌株EH101勝任株轉型(Hood et al.,1986,J.Bacteriol.144：732－743)，使用電破法(25 μF,2.5 kV,200 Ω)。重組農桿菌係置於AB－壯觀黴素(spectinomycin)/卡那黴素(kanamycin)(20x AB鹽類、2 M葡萄糖、0.25 mg/ml FeSo4 . 7H2 O、1 M MgSo4 、1 M CaCl2 )，單一殖株用於接種5 ml之AB－壯觀黴素(spectinomycin)/卡那黴素(kanamycin)溶液。這些培養物係成長於28℃至隔日。含有4127質體之重組農桿菌係用於使野生型C24阿拉伯芥植物轉型，利用花序浸漬法(flower dipping)(Clough et al.,1998,Plant J.16：735－743)。由這些植物獲得之種子係置於選擇性基質上，在膦基丁胺酸存在下，並允許發芽。經陽性辨識出之幼苗係轉移至土壤中至成熟，在種子經PUFA含量分析之後。
就含有其他質體之重組農桿菌而言(5723,5724,5730,5727,5729,5731,5732,5733,5734,4793,4794,4795,及/或4796)，基因轉殖4127－品系150阿拉伯芥係使用花序浸漬法再轉型(Clough et al.,1998,Plant J.16：735－743)。由這些植物獲得之種子係置於選擇性培養基上，在膦基丁胺酸與甘露醣存在下，進行雙重篩選，或膦基丁胺酸、甘露醣與卡那黴素存在下，進行適當處之三重篩選，並允許其發芽。陽性辨識出之幼苗係轉移至土壤中至成熟，之後種子經PUFA含量分析。
範例13a
此範例係描述於轉殖阿拉伯芥種子中，其表現超級構築體(4127)上之裂殖壺菌PUFA合成酶(OrfA、OrfB＊ 與OrfC)與Het I，製造DHA與DPAn－6。
得自表現裂殖壺菌PUFA合成酶(OrfA、OrfB＊ 與OrfC)與Het I(構築體4127)之阿拉伯芥之匯集種子中，進行GC－FAME分析，顯示產生明顯量之標的PUFA、DHAn－3與DPAn－6，於其脂肪酸內容物中。如表3 所示，某一株(4127－品系150)特別具有0.6% DHAn－3與0.7% DPAn－6，就合併之1.3%裂殖壺菌型PUFA內容物而言。如預期的，得自野生型背景(C24)之控制組種子並不含可偵測量之DHAn－3或DPAn－6。4127－品系150後續之表現分析係以SDS－PAGE與西方墨漬法分析，顯示該重組種子表現有OrfA、OrfB＊ 、OrfC與Het I，正確的傳送至色素體(資料未顯示)。此外，表型相當穩定，由T2代分析至T4代，可作為一陽性控制組，決定DHA與裂殖壺菌PUFA之量，在使用此述各種策略(包括策略之結合)評估該植物中PUFA之製造及/或堆積是否有增加時。
範例13b
本範例係描述於於轉殖阿拉伯芥種子中，其表現裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶(OrfA、OrfB＊ 與OrfC)與Het I(4127)，結合裂殖壺菌(Schizochytrium)ScACS－1基因(5723)或ScACS－2基因(5724)，DHAn－3與DPAn－6之製造。
衍生自4127－品系150之植物(請見範例13a)係用於引入ScACS－1構築體(5723)或ScACS－2構築體(5724)，使用農桿菌－媒介之轉型，如上所述。在膦基丁胺酸與甘露醣存在下篩選重組植物後，種子係經收穫並分析脂肪酸分佈，使用匯集種子製備之FAMES進行GC分析與FID偵測。
舉例而言，特別表現裂殖壺菌(Schizochytrium)PKS與HetI，結合ACS－1(4127/5723－品系514)之特定品系，具有1.5% DHA與0.9% DPAn－6，在總脂肪酸分佈之合併2.4%裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA含量中(表4 )。此代表DHAn－3含量2.5倍增加，與4127－品系150陽性控制組相較。類似之結果在表現有裂殖壺菌(Schizochytrium)PKS與HetI，結合ACS－2(4127/5724－品系552)之特定品系中觀察到，其在DHAn－3含量上具有1.8倍增加，與陽性控制組相較。此外，DHA比DPA之比例由4127－品系150之T2代之約0.85：1.0，或T4代之約1.0：1.0，變動為ACS－1之1.7：1.0，與ACS－2品系之1.2：1.0。在所有分析之轉殖種子中，在分佈中僅偵測到之新脂肪酸為DHA n－3或DPA n－6。
範例13c
本範例係描述於於轉殖阿拉伯芥種子中，其表現裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶(OrfA、OrfB＊ 與OrfC)與Het I，合併FAS抑制，經由降低KAS II，使用RNA干擾(RNAi)而達成，DHA與DPAn－6之製造。
衍生自4127－品系150之植物係用於引入具有內含子之KAS II RNAi(構築體5727)，使用農桿菌－媒介之轉型，如上所述。在膦基丁胺酸與甘露醣存在下篩選重組植物後，種子係經收穫並分析脂肪酸分佈，使用匯集種子製備之FAMES進行GC分析與FID偵測。
舉例而言，一特定品系(4127/5727－品系1097)具有1.3% DHA n－3與1.2% DPA n－6，在總脂肪酸分佈之合併2.5%裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA含量中(表5 )。此代表DHA含量大於2.1倍之增加，與4127－品系150陽性控制組相較。之後，得自4127/5727－品系1097之單一種子係個別地進行總計算值FAME分析，使用GC分離與FID偵測。
分析之後，觀察到此族群中之種子具有至多2.0% DHAn－3與1.6% DPAn－6，在總脂肪酸分佈之合併3.6%裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA含量中(表5 )。此代表DHA含量3.3倍之增加，在裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA含量方面，與4127－品系150陽性控制組相較。此外，係觀察到DHA比DPA之比例由4127－品系150 T2代之0.85：1.0或T4代之1.0：1.0，變動為FAS抑制品系之1.25：1.0或更多。單一種子之平均值係與匯集樣本一致，在%DHA n－3、%DPA n－6與總%(DHA＋DPA)方面，此族群中不同處係由於共轉型種子中4127與5727位點之分離所造成。在所有分析之轉殖種子中，在分佈中僅偵測到之新脂肪酸為DHA n－3或DPA n－6。
範例13d
本範例係描述於於轉殖阿拉伯芥種子中，其表現裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶(OrfA、OrfB＊ 與OrfC)與Het I(4127)，結合FAS抑制，經由使用反義股RNA而降低KAS III。
衍生自4127－品系150之植物係用於引入KAS III反義股構築體(5129)，使用農桿菌－媒介之轉型，如上所述。在膦基丁胺酸與甘露醣存在下篩選重組植物後，種子係經收穫並分析脂肪酸分佈，使用匯集種子製備之FAMES進行GC分析與FID偵測。
舉例而言，一特定品系(4127/5729－品系1087)具有1.7% DHA n－3與1.2% DPA n－6，在總脂肪酸分佈之合併2.9%裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA含量中(表6 )。此代表DHA含量大於2.8倍之增加，與4127－品系150陽性控制組相較。
之後，得自4127/5729－品系1087之單一種子係個別地進行總計算值FAME分析，使用GC分離與FID偵測。分析之後，觀察到此族群中之種子具有至多2.4% DHAn－3與1.8% DPA n－6，在總脂肪酸分佈之合併4.2%裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA含量中(表6 )。此代表DHA含量3.2倍之增加，以及裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA含量4倍之增加，與4127－品系150陽性控制組相較。此外，係觀察到DHA比DPA之比例由4127－品系150 T2代之0.85：1.0或T4代之1.0：1.0，變動為FAS抑制品系之1.33：1.0或更多。單一種子之平均值係與匯集樣本一致，在%DHA n－3、%DPA n－6與總%(DHA＋DPA)方面，此族群中不同處係由於共轉型種子中4127與5729位點之分離所造成。在所有分析之轉殖種子中，在分佈中僅偵測到之新脂肪酸為DHA n－3或DPA n－6，如同先前大腸桿菌與酵母菌中觀察到的生化與異源性表現數據。由分析種子樣本1087－7獲得之GC－FAME層析圖，係列於第14圖。
範例13e
本範例係描述於於轉殖阿拉伯芥種子中，其表現裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶(OrfA、OrfB＊ 與OrfC)與Het I，合併ScACS－1基因之表現與FAS抑制，經由使用反義股RNA降低KAS III而達成，DHA與DPAn－6之製造。
衍生自4127－品系150之植物，係用於引入ScACS－1與KAS II RNAi，使用構築體5731，農桿菌－媒介之轉型，如上所述。在膦基丁胺酸與甘露醣存在下篩選重組植物後，種子係經收穫並分析脂肪酸分佈，使用匯集種子製備之FAMES進行GC分析與FID偵測。
舉例而言，一特定品系(4127/5731－品系1366)具有1.9%DHA與1.9%DPA n－6，在總脂肪酸分佈之合併3.8%裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA含量中(表7 )。此代表3.2倍之增加，與4127－品系150陽性控制組相較、1.3倍之增加，與4127/5723－品系514之單一ACS－1策略相較、1.5倍之增加，與4127/5727－品系之1097單一KAS II RNAi降低策略相較，當分別與範例13b與13c(表4與5)匯集種子族群之DHA含量相較時。
吾人會預期在此族群之單一種子中觀察到較高含量之DHA，對應於在匯集種子中4127與5731位點之分離。在所有分析之轉殖種子中，在分佈中僅偵測到之新脂肪酸為DHA n－3或DPA n－6，如同先前大腸桿菌與酵母菌中觀察到的生化與異源性表現數據。由分析匯集種子樣本4127/5731－品系1366獲得之GC－FAME層析圖，係列於第15圖。
範例13f
本範例係描述於於轉殖阿拉伯芥種子中，其表現裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶(OrfA、OrfB*與OrfC)與Het I，合併LPAAT之表現，DHA與DPAn－6之製造。
衍生自4127－品系150之植物係用於引入LPAAT構築體(5725)，使用農桿菌－媒介之轉型，如上所述。在膦基丁胺酸與甘露醣存在下篩選重組植物後，種子係經收穫並分析脂肪酸分佈，使用匯集種子製備之FAMES進行GC分析與FID偵測。
預期得自這些植物之種子將製造標的PUFA(DHA與DPAn－6)。亦預期DHA與/或DPAn－6製造量將增加，與未加入LPAAT構築體之PUFA PKS－表現植物相較。
範例13g
本範例係描述於於轉殖阿拉伯芥種子中，其表現裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶(OrfA、OrfB＊ 與OrfC)與Het I，合併裂殖壺菌(Schizochytrium)DAGAT與ACS－1表現，與FAS抑制，經由降低KAS II，使用RNAi而達成，或經由降低KAS III，使用反義股而達成。
衍生自5731之植物(合併ACS－1之表現與FAS之抑制，使用KASII RNAi)，係用於引入DAGAT構築體(4793)，使用農桿菌－媒介之轉型，如上所述。類似之植物亦製造於5734背景上(合併表現ACS－1與抑制FAS，使用KASIII反義股)。在膦基丁胺酸與甘露醣存在下篩選重組植物後，種子係經收穫並分析脂肪酸分佈，使用匯集種子製備之FAMES進行GC分析與FID偵測。
預期得自這些植物之種子將製造標的PUFA(DHA與DPAn－6)。亦預期DHA與/或DPAn－6製造量將增加，與未加入DAGAT構築體與FAS抑制之PUFA PKS－表現植物相較。
範例13h
本範例係描述於於轉殖阿拉伯芥種子中，其表現裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶(OrfA、OrfB＊ 與OrfC)與Het I，合併裂殖壺菌(Schizochytrium)DAGAT與ACS－8表現，更合併裂殖壺菌(Schizochytrium)ACS－1表現與FAS抑制，經由使用RNAi降低KAS II而達成，或經由使用反義股降低KAS III而達成。
衍生自5731之植物(合併ACS－1之表現與FAS之抑制，使用KASII RNAi)，係用於引入DAGAT/ACS－8構築體(4794)，使用農桿菌－媒介之轉型，如上所述。類似之植物亦製造於5734背景上(合併表現ACS－1與抑制FAS，使用KASIII反義股)。在膦基丁胺酸與甘露醣存在下篩選重組植物後，種子係經收穫並分析脂肪酸分佈，使用匯集種子製備之FAMES，進行GC分析與FID偵測。
預期得自這些植物之種子將製造標的PUFA(DHA與DPAn－6)。亦預期DHA與/或DPAn－6製造量將增加，與未加入DAGAT/ACS－8構築體、ACS－1構築體，與FAS抑制之PUFA PKS－表現植物相較。
範例13i
本範例係描述於於轉殖阿拉伯芥種子中，其表現裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶(OrfA、OrfB＊ 與OrfC)與Het I，合併裂殖壺菌(Schizochytrium)LPAAT與裂殖壺菌(Schizochytrium)DAGAT表現，更合併裂殖壺菌(Schizochytrium)ACS－1表現與FAS抑制，經由使用RNAi降低KAS II而達成，或經由使用反義股降低KAS III而達成。
衍生自5731之植物(合併ACS－1之表現與FAS之抑制，使用KASII RNAi)，係用於引入DAGAT/LPAAT構築體(4795)，使用農桿菌－媒介之轉型，如上所述。類似之植物亦製造於5734背景上(合併表現ACS－1與抑制FAS，使用KASIII反義股)。在膦基丁胺酸與甘露醣存在下篩選重組植物後，種子係經收穫並分析脂肪酸分佈，使用匯集種子製備之FAMES進行GC分析與FID偵測。
預期得自這些植物之種子將製造標的PUFA(DHA與DPAn－6)。亦預期DHA與/或DPAn－6製造量將增加，與未加入DAGAT/LPAAT構築體、ACS－1構築體與FAS抑制之PUFA PKS－表現植物相較。
範例13j
本範例係描述於於轉殖阿拉伯芥種子中，其表現裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶(OrfA、OrfB＊ 與OrfC)與Het I，合併裂殖壺菌(Schizochytrium)LPAAT、裂殖壺菌(Schizochytrium)DAGAT與裂殖壺菌(Schizochytrium)ACS－8，更合併裂殖壺菌(Schizochytrium)ACS－1之表現與FAS抑制，經由使用RNAi降低KAS II而達成，或經由使用反義股降低KAS III而達成。
衍生自5731之植物(合併ACS－1之表現與FAS之抑制，使用KASII RNAi)，係用於引入DAGAT/LPAAT/ACS－8構築體(4796)，使用農桿菌－媒介之轉型，如上所述。類似之植物亦製造於5734背景上(合併表現ACS－1與抑制FAS，使用KASIII反義股)。在膦基丁胺酸與甘露醣存在下篩選重組植物後，種子係經收穫並分析脂肪酸分佈，使用匯集種子製備之FAMES進行GC分析與FID偵測。
預期得自這些植物之種子將製造標的PUFA(DHA與DPAn－6)。亦預期DHA與/或DPAn－6製造量將增加，與未加入DAGAT/LPAAT/ACS－8構築體、ACS－1構築體與FAS抑制之PUFA PKS－表現植物相較。
本發明之各種實施例已經詳細描述，顯而易見地，這些實施例之修飾與變化可由熟習此技術領域者進行。然而，應瞭解到此種修飾與變化皆落於本發明範疇中。
第1圖為螢光影像分析之數位影像，用於分析裂殖壺菌(Schizochytrium)Ac66株與衍生自該殖株之PUFA－S KO與FAS KO突變株之不含細胞均質物之體外活性試驗。
第2圖為螢光影像分析之數位影像，用於分析以正相TLC分離之裂殖壺菌(Schizochytrium)FAS－KO株之外活性試驗。反應於指示時間下進行。
第3圖為螢光影像分析之數位影像，用於分析以正相TLC分離之裂殖壺菌(Schizochytrium)FAS－KO株之外活性試驗。係使用標準試驗成分，但變化NADH、NADPH與乙醯基－CoA成分(欄1－NADH/NADPH/乙醯基－CoA，欄2－NADPH/乙醯基－CoA，欄3－NADH/乙醯基－CoA，欄4－NADH/NADPH，欄5－無)。
第4圖為螢光影像分析之數位影像，用於分析以正相TLC分離之裂殖壺菌(Schizochytrium)FAS－KO株之外活性試驗。反應係進行10分鐘，之後加入ATP與Mg＋2。反應於底部標示時間終止(“＝秒，‘＝分鐘)。
第5圖為螢光影像分析之數位影像，用於分析以正相TLC分離之裂殖壺菌(Schizochytrium)FAS－KO株之體外活性試驗。反應係進行10分鐘，之後加入ATP與Mg＋2(除了樣本1之外)，繼續靜置20分鐘(欄3－2 uL DMSO，欄4－4 uL DMSO，欄5－25 uM Triascin C，欄6－100 uM Triascin C，欄7－200 uM Triascin C)。
第6A圖為FAME分析之數位影像，用於分析表現有裂殖壺菌(Schizochytrium)OrfA、OrfB＊ 、OrfC與Het I之大腸桿菌。標的PUFA在均質物、高速沈澱物分液(P2)、上清液(S1)與高速上清液(S2)中。
第6B圖為第6A圖所使用之大腸桿菌之樣本分析結果，除了脂質產物僅以HIP(而非轉換為FAMES)萃取之外，在以TLC分離之前。
第7圖控制組酵母菌與表現有裂殖壺菌(Schizochytrium)OrfA、OrfB＊ 、OrfC與Het I之酵母菌之FAME分佈圖。
第8圖為第1圖酵母菌之FAME分佈圖，延伸說明標的PUFA之製造。
第9圖為FAS活性之抑制對於DHA分佈之影響(為總FAME之百分比)，在表現有裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶(sOrfA,sOrfB,OrfC)與Het I，單獨或與醯基CoA合成酶表現組合之酵母菌中。
第10圖為FAS活性之抑制對於DHA與DPAn6分佈之影響(為總FAME之百分比)，在表現有裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶(sOrfA,sOrfB,OrfC)與Het I，單獨或與醯基CoA合成酶表現組合之酵母菌中。
第11圖為FAME分佈，顯示抑制FAS活性(藉由淺藍菌素)、裂殖壺菌(Schizochytrium)PUFA合成酶(sOrfA,sOrfB,OrfC)與HetI之表現，以及醯基CoA合成酶之表現，對於酵母菌中DHA與DPAn6產生之共同影響。
第12圖顯示剔除DAGAT基因之裂殖壺菌(Schizochytrium)之脂質分佈。
第13圖為野生型阿拉伯芥(Arabidopsis)與品系263(色素體標的)，在種子發育過程中表現有裂殖壺菌(Schizochytrium)Orfs A,B＊ ,C與Het I，之FAME分佈。
第14圖來自品系1087－7(色素體標的)之阿拉伯芥種子，在種子發育過程中表現有裂殖壺菌(Schizochytrium)Orfs A,B＊ ,C與Het I，之FAME分佈。
第15圖為品系1366匯集之阿拉伯芥種子，在種子發育過程中表現有裂殖壺菌(Schizochytrium)Orfs A,B＊ ,C與Het I，標的為色素體，並結合FAS抑制(KAS II RNAi)與ACS－1，之FAME分佈。
<110> Martek Biosciences Corporation Metz, James G Kuner, Jerry M Lippmeier, Jerry Casey
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<160> 125
<170> PatentIn version 3.4
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<211> 6180
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<220>
<221> misc_feature
<222> (248)..(248)
<223> 位於248之’Xaa’代表Asp,Gly,Ala,或Val.
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<212> DNA
<213> 破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)
<220>
<221> CDS
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<223> n=a c t or g
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<212> PRT
<213> 破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)
<220>
<221> misc_feature
<222> (248)..(248)
<223> The’Xaa’at location 248 stands for Asp,Gly,Ala,or Val.
<400> 54
<210> 55
<211> 1500
<212> DNA
<213> 破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)
<220>
<221> CDS
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<212> PRT
<213> 破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)
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<212> DNA
<213> 破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)
<220>
<221> CDS
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<212> DNA
<213> 破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1305)
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<210> 60
<211> 435
<212> PRT
<213> 破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)
<400> 60
<210> 61
<211> 4410
<212> DNA
<213> 破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(4410)
<400> 61
<210> 62
<211> 1470
<212> PRT
<213> 破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)
<400> 62
<210> 63
<211> 1500
<212> DNA
<213> 破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1500)
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<210> 64
<211> 500
<212> PRT
<213> 破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)
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<213> 破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)
<220>
<221> CDS
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<211> 500
<212> PRT
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<211> 1410
<212> DNA
<213> 破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1410)
<400> 67
<210> 68
<211> 470
<212> PRT
<213> 破囊壺菌(Thraustochytrium sp.)
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<213> 沙雷菌(Sh.japonica)
<400> 69
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<212> PRT
<213> 沙雷菌(Sh.japonica)
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<210> 71
<211> 759
<212> PRT
<213> 沙雷菌(Sh.japonica)
<400> 71
<210> 72
<211> 2019
<212> PRT
<213> 沙雷菌(Sh.japonica)
<400> 72
<210> 73
<211> 542
<212> PRT
<213> 沙雷菌(Sh.japonica)
<400> 73
<210> 74
<211> 303
<212> PRT
<213> 沙雷菌(Sh.japonica)
<400> 74
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<211> 38794
<212> DNA
<213> 沙雷菌(Sh.olleyana)
<400> 75
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<211> 2768
<212> PRT
<213> 沙雷菌(Sh.olleyana)
<400> 76
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<211> 743
<212> PRT
<213> 沙雷菌(Sh.olleyana)
<400> 77
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<211> 2020
<212> PRT
<213> 沙雷菌(Sh.olleyana)
<400> 78
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<212> PRT
<213> 沙雷菌(Sh.olleyama)
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<212> PRT
<213> 沙雷菌(Sh.olleyana)
<400> 80
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<211> 35
<212> PRT
<213> 甘藍型油菜(Brassica napus)
<400> 81
<210> 82
<211> 2004
<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 82
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<212> PRT
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
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<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 84
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<211> 780
<212> PRT
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 85
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<211> 2529
<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 86
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<211> 842
<212> PRT
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 87
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<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
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<212> PRT
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
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<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
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<210> 91
<211> 578
<212> PRT
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
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<210> 92
<211> 1809
<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 92
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<211> 602
<212> PRT
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 93
<210> 94
<211> 1923
<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 94
<210> 95
<211> 640
<212> PRT
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 95
<210> 96
<211> 1893
<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
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<212> PRT
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
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<211> 2950
<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
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<210> 99
<211> 766
<212> PRT
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 99
<210> 100
<211> 5341
<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 100
<210> 101
<211> 506
<212> PRT
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 101
<210> 102
<211> 1478
<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 102
<210> 103
<211> 927
<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 103
<210> 104
<211> 308
<212> PRT
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 104
<210> 105
<211> 2111
<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 105
<210> 106
<211> 1140
<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 106
<210> 107
<211> 379
<212> PRT
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 107
<210> 108
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<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
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<210> 109
<211> 1323
<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 109
<210> 110
<211> 440
<212> PRT
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 110
<210> 111
<211> 794
<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 111
<210> 112
<211> 756
<212> DNA
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 112
<210> 113
<211> 251
<212> PRT
<213> 裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)
<400> 113
<210> 114
<211> 817
<212> DNA
<213> 隱甲藻(Crypthecodinjum cohnii)
<400> 114
<210> 115
<211> 850
<212> DNA
<213> 隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)
<400> 115
<210> 116
<211> 663
<212> DNA
<213> 隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)
<400> 116
<210> 117
<211> 807
<212> DNA
<213> 隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)
<400> 117
<210> 118
<211> 765
<212> DNA
<213> 隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)
<400> 118
<210> 119
<211> 782
<212> DNA
<213> 隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)
<400> 119
<210> 120
<211> 793
<212> DNA
<213> 隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)
<400> 120
<210> 121
<211> 744
<212> DNA
<213> 隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)
<400> 121
<210> 122
<211> 2361
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 合成
<400> 122
<210> 123
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 合成
<400> 123
<210> 124
<211> 1052
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 合成
<400> 124
<210> 125
<211> 1208
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 合成
<400> 125

Claims (51)

  1. 一種經分離之核酸分子，包含一編碼醯基-CoA合成酶(acyl-CoA synthetase,ACoAS)之核酸序列，該醯基-CoA合成酶會催化長鏈PUFA自由脂肪酸(FFA)轉換為醯基-CoA，其中該核酸序列編碼一醯基-CoA合成酶(ACoAS)，該醯基-CoA合成酶至少95%相等於一具有一選自於由SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、以及SEQ ID NO：99組成之組群的胺基酸序列之ACoAS。
  2. 如申請專利範圍第1項之經分離之核酸分子，其中該核酸序列係編碼一醯基-CoA合成酶(ACoAS)，該醯基-CoA合成酶具有一選自於由SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、以及SEQ ID NO：99組成之組群的胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1項之經分離之核酸分子，其中該核酸序列係編碼一選自於由SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、以及SEQ ID NO：97組成之組群的胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第1項之經分離之核酸分子，其中該核酸序列係選自於由SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、以及SEQ ID NO：98組成之組群。
  5. 一種經分離之蛋白質，其係由如申請專利範圍第1-4項中任一項之核酸分子所編碼。
  6. 一種重組核酸分子，其包含如申請專利範圍第1-4項中任一項之核酸分子，操作性地與一表現控制序列聯結。
  7. 一種重組宿主細胞，其包含如申請專利範圍第6項之重組核酸分子。
  8. 如申請專利範圍第7項之重組宿主細胞，其中該宿主細胞為一微生物體。
  9. 如申請專利範圍第7項之重組宿主細胞，其中該宿主細胞為一植物細胞。
  10. 一種經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該微生物體、植物細胞或動物細胞已經基因修飾以表現如申請專利範圍第1-4項中任一項之至少一經分離之核酸分子。
  11. 一種經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該微生物體、植物細胞或動物細胞已經基因修飾以表現如申請專利範圍第1-4項中任一項之至少一經分離之核酸分子以及包含編碼一利用PUFA-CoA作為受質以形成磷脂質(PL)或三醯基甘油(TAG)之蛋白質的核酸序列之至少一經分離之核酸分子，其中該蛋白質包含一胺基酸序列，該胺基酸序列至少95%相等於一選自於由SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：110、以及SEQ ID NO：113所組成之組群的胺基酸序列。
  12. 一種經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該微生物體、植物細胞或動物細胞已經基因修飾以表現如申請專利範圍第3項之至少一經分離之核酸分子以及包含編碼一包含選自於由SEQ ID NO：102與SEQ ID NO：104所組成之組群的一胺基酸序列之蛋白質的一核酸序列的至少一經分離之核酸分子。
  13. 如申請專利範圍第10項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該微生物體、植物細胞或動物細胞係表現一PUFA合成酶(PUFA synthase)以及一磷酸泛醯巰基轉移酶(phosphopantetheinyl transferase,PPTase)。
  14. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該微生物體、植物細胞或動物細胞已經基因修飾以表現該PUFA合成酶與PPTase。
  15. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該PUFA合成酶包含至少一來自破囊壺菌(Thraustochytrid )或網黏菌(Labyrinthulid )之PUFA合成酶的功能性區塊(domain)。
  16. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該PUFA合成酶包含至少一來自破囊壺菌目(Thraustochytriales ) 微生物體之PUFA合成酶的功能性區塊。
  17. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該PUFA合成酶包含至少一功能性區塊，該功能性區塊係來自選自於由裂殖壺菌(Schizochytrium )、破囊壺菌(Thraustochytrium )、巫肯尼亞菌(Ulkenia )、以及網黏菌(Labyrinthula )所組成之組群之一生物體之PUFA合成酶。
  18. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該PUFA合成酶包含至少一來自裂殖壺菌(Schizochytrium )之PUFA合成酶的功能性區塊。
  19. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該PUFA合成酶包含至少一功能性區塊，該功能性區塊係來自選自於由美國菌種中心(ATCC)No.20888之裂殖壺菌(Schizochytrium sp. )、ATCC No.20892之破囊壺菌(Thraustochytrium )23B、及該等微生物之任一者的突變株所組成之組群的一生物體之PUFA合成酶。
  20. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該PUFA合成酶包含至少一來自海洋細菌之PUFA合成酶的功能性區塊。
  21. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該 生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該PUFA合成酶包含至少一功能性區塊，該功能性區塊係來自選自於由沙雷菌(Shewanella )、嗜壓菌(Moritella )以及發光菌(Photobacterium )所組成之組群之一生物體之PUFA合成酶。
  22. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該PUFA合成酶係由一或多種蛋白質組成，包含：a)至少一個烯酯-ACP還原酶(enoyl-ACP reductase,ER)區塊；b)至少四個醯基載體蛋白質(ACP)區塊；c)至少二個β-酮基醯基-ACP合成酶[β-ketoacyl-ACP synthase(KS)]區塊；d)至少一個醯基轉移酶(AT)區塊；e)至少一個β-酮基醯基-ACP還原酶(KR)區塊；f)至少二個FabA-類似之β-羥基醯基-ACP脫氫酶[FabA-like β-hydroxyacyl-ACP dehydrase(DH)]區塊；以及g)至少一個鏈長度因子(CLF)區塊；h)至少一個丙二醯-CoA：ACP醯基轉移酶(MAT)區塊。
  23. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該PUFA合成酶係由一或多種蛋白質組成，包含： a)二個烯酯ACP-還原酶(ER)區塊；b)八或九個醯基載體蛋白質(ACP)區塊；c)二個β-酮基醯基-ACP合成酶(KS)區塊；d)一個醯基轉移酶(AT)區塊；e)一個酮基還原酶(KR)區塊；f)二個FabA-類似之β-羥基醯基-ACP脫氫酶(DH)區塊；g)一個鏈長度因子(CLF)區塊；以及h)一個丙二醯-輔酶：ACP醯基轉移酶(MAT)區塊。
  24. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該PUFA合成酶係一可於溫度至少約25℃下製造PUFA的細菌PUFA合成酶，且其中該PUFA合成酶係由一或多種蛋白質組成，包含：a)至少一個烯酯ACP-還原酶(ER)區塊；b)至少六個醯基載體蛋白質(ACP)區塊；c)至少二個β-酮基醯基-ACP合成酶(KS)區塊；d)至少一個醯基轉移酶(AT)區塊；e)至少一個酮基還原酶(KR)區塊；f)至少二個FabA-類似之β-羥基醯基-ACP脫氫酶(DH)區塊；g)至少一個鏈長度因子(CLF)區塊；h)至少一個丙二醯-CoA：ACP醯基轉移酶(MAT)區塊；以及 i)至少一個4’-磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)區塊。
  25. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該PUFA合成酶包含一或多個序列或係由一或多個序列編碼，該等序列係選自於由SEQ ID NOs：1-32中任一者、以及SEQ ID NOs：35-80中任一者所組成之組群。
  26. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且一或多個編碼PUFA合成酶之核酸序列已經最佳化以增進該微生物體、植物細胞或動物細胞中PUFA合成酶之表現。
  27. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該微生物體、植物細胞或動物細胞係製造聚不飽和脂肪酸(PUFA)，該聚不飽和脂肪酸係選自於由EPA(C20：5,n-3)、DHA(C22：6,n-3)、DPA(C22：5,n-6或n-3)、ARA(C20：4,n-6)、GLA(C18：3,n-6)、SDA(C18：4,n-3)、及其等之組合所組成之組群。
  28. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該微生物體、植物細胞或動物細胞係製造聚不飽和脂肪酸(PUFA)，該聚不飽和脂肪酸係選自於由DHA、EPA、DPAn-6、及其等之組合所組成之組群。
  29. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該微生物 體、植物細胞或動物細胞係製造DHA與DPAn-6。
  30. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該微生物體、植物細胞或動物細胞係製造ARA。
  31. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞，且該微生物體、植物細胞或動物細胞中之總脂肪酸分佈(profile)包含以重量計至少0.5%之由該PUFA合成酶製造的PUFA。
  32. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體，且該微生物體內生性地表現一PUFA PKS系統。
  33. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體，且該微生物體係選自於由破囊壺菌目(Thraustochytriales )微生物體與海洋細菌所組成之組群。
  34. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體，且該微生物體係已經基因修飾以表現PUFA PKS系統。
  35. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為微生物體，且該微生物體為一酵母菌或一細菌。
  36. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為植物細胞，且該PUFA合成酶與PPTase之表現係以該植物細胞之色素體(plastid)為標的。
  37. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為植物細胞，且該植物細胞為來自一油類種子植物。
  38. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為植物細胞，且該植物細胞為來自雙子葉(dicotyledonous)植物。
  39. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為植物細胞，且該植物細胞係來自選自於由油菜(canola)、大豆、油菜籽(rapeseed)、亞麻子(linseed)、玉米、紅花(safflower)、葵花與煙草(tobacco)所組成之組群的一植物。
  40. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為植物細胞，且該PUFA合成酶製造之非為該PUFA的總脂肪酸係構成以重量計少於約10%之由該植物細胞所製造之總脂肪酸。
  41. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為植物細胞，且該PUFA合成酶製造之非為該PUFA的總脂肪酸係構成以重量計少於約5%之由該植物細胞所製造之總脂肪酸。
  42. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為植物細胞，且該植物細胞之總脂肪酸分佈(profile)包含以重量計至少約0.5%之至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，該聚不飽和脂肪酸具有至少20個碳與4或更多個碳-碳雙鍵，且其中該植物細胞中之總脂肪酸分 佈包含總共少於5%之所有下列PUFAs：γ-次亞麻油酸(GLA；18：3,n-6)、具有18個碳與4個碳-碳雙鍵之PUFA、具有20個碳與3個碳-碳雙鍵之PUFA、以及具有22個碳與2或3個碳-碳雙鍵之PUFA。
  43. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為植物細胞，且該植物細胞之總脂肪酸分佈(profile)包含以重量計至少約0.5%之至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，該聚不飽和脂肪酸具有至少20個碳與4或更多個碳-碳雙鍵，且其中該植物細胞之總脂肪酸分佈(profile)包含少於1%之各個下列PUFAs：γ-次亞麻油酸(GLA；18：3,n-6)、具有18個碳與4個碳-碳雙鍵之PUFA、具有20個碳與3個碳-碳雙鍵之PUFA、以及具有22個碳與2或3個碳-碳雙鍵之PUFA。
  44. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為植物細胞，且該植物細胞之總脂肪酸分佈包含以重量計至少約0.5%之至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，該聚不飽和脂肪酸具有至少20個碳與4或更多個碳-碳雙鍵，且其中該植物細胞之總脂肪酸分佈包含少於2%之γ-次亞麻油酸(GLA；18：3,n-6)、以及二高-γ-次亞麻油酸(DGLA或HGLA；20：3,n-6)。
  45. 如申請專利範圍第44項之經基因修飾之生物體，其中該植物細胞之總脂肪酸分佈包含以重量計少於1%之γ-次亞麻油酸(GLA；18：3,n-6)、以及二高-γ-次亞麻油酸(DGLA或HGLA；20：3,n-6)。
  46. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為植物細胞，且該植物細胞之總脂肪酸分佈包含以重量計至少約0.5%之至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)，該聚不飽和脂肪酸具有至少20個碳與4或更多個碳-碳雙鍵，且其中該植物細胞中之總脂肪酸分佈包含少於1%之γ-次亞麻油酸(GLA；18：3,n-6)。
  47. 如申請專利範圍第13項之經基因修飾之生物體，其中該生物體為植物細胞，且該植物細胞之總脂肪酸分佈包含以重量計少於0.5%之γ-次亞麻油酸(GLA；18：3,n-6)。
  48. 一種製造包含至少一聚不飽和脂肪酸(PUFA)之油類之方法，包含培養如申請專利範圍第13項之生物體，其中該生物體為微生物體、植物細胞或動物細胞。
  49. 一種將微生物體、植物細胞或動物細胞轉型以表現PUFAs之方法，包含以編碼一PUFA合成酶之核酸分子、編碼磷酸泛醯巰基轉移酶(PPTase)之核酸分子，以及至少一如申請專利範圍第1-4項中任一項之核酸分子使一微生物體、植物細胞或動物細胞轉型。
  50. 如申請專利範圍第49項之方法，其中該微生物體、植物細胞或動物細胞含有一基因修飾以剔除該微生物體、植物細胞或動物細胞表現之脂肪酸合成酶(FAS)或使該微生物體、植物細胞或動物細胞表現之脂肪酸合成酶(FAS)失去活性。
  51. 如申請專利範圍第49項之方法，其中該微生物體、植物細胞或動物細胞含有一基因修飾以降低丙二醯CoA與 該PUFA合成酶之競爭，或增加丙二醯CoA在該微生物體、植物細胞或動物細胞中之含量。
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