TWI503329B - 針對血小板衍生生長因子受體-α（ＰＤＧＦＲ-α）之致標性結合劑及其用途 - Google Patents

Description

針對血小板衍生生長因子受體- α (PDGFR- α )之致標性結合劑及其用途 發明領域

本發明根據35 U.S.C.g 119請求2006年8月2日提申之美國臨時申請案序號第60/835,647號之優先權，該案之整體係併於此作為參考。

本發明係關於對抗該目標抗原PDGFR－α 之致標性結合劑及此劑之用途。在某些實施態樣中，本發明係完全相關於對於PDGFR－α 之人類單株抗體及這些抗體的用途。本發明之其它層面亦關於表現此類致標性結合劑或抗體之融合瘤或其它細胞株。該所述之及抗體係可用於檢測劑及用於治療和PDGFR－α 之活性及/或過度表現相關聯之疾病。

發明背景

血小板衍生生長因子(PDGF)係一控制細胞生長及分裂的蛋白質。PDGF有5種不同的異構物(A、B、C、D以及一AB異二聚物(heterodimer))，其存在為二聚物且經由二不同之受體(PDGF－α 及PDGF－β )而活化細胞反應。特定地，PDGF二聚物同時連結至二種受體以引發受體二聚合化、自磷酸化及細胞內之訊息傳導。

血小板衍生生長因子受體－α (PDGFR－α ，也被知道為CD140a)係一第3型受體酪胺酸激酶，其特徵係在於具有5個似IgG結構區之一細胞外結構區域，一穿膜結構區域以及一催化性細胞內結構區域。PDGFR－α 可和PDGFR－β 結構相似性地形成同二聚物或異二聚物。PDGF－AA只活化α －α 受體二聚物，PDGF－AB及PDGF－CC活化α －α 及/或α －β 受體二聚物，而PDGF－BB則活化所有三種之受體二聚物組合。

PDGFR－α 已被聯結至腫瘤生成且已被應用至數種癌症，例如：乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、結腸癌及子宮內膜癌，以及肝細胞癌、神經膠母細胞瘤、黑色素瘤及胃腸道基質瘤(GIST)。

數家公司已發展出致標於PDGFR－α 之治療劑。Gleevec(Novartis)及SUTENT/SU11248(sunitinib malate,Pfizer)係致標於PDGFR－α 以及其它受體酪胺酸激酶之小分子藥物。此外，已報導出致標於PDGFR－α 之單株抗體。國際專利第WO1992/013867號公開案敘述出可製備出針對PDGF受體構造之小鼠或兔子單株抗體及/或多株抗體。國際專利第WO1995/000659號公開案係有關於特別針對PDGFR－α 之單株抗體，其特徵在於其結合至PDGFR且不結合至PDGFR－β 。該案揭露二種抗體，特徵在於以固態酵素連結免疫吸附測定法量測時，其具有50pM及75pM之半最大結合親合力。國際專利第WO2006/138729號公開案揭露一完全人類單株抗體，命名為3G3(ImClone Systems,Inc.)，其致標於PDGFR－α 。此抗體在二價親合力測定法中量測為對於可溶性PDGFR－α 具有40pM的親合力；其中可溶性PDGFR－α 係固定在一感測器晶片上且以各種濃度注入抗體。如其中所論者，在二價測定法中，實驗性矯作會影響所量測的親合力。

一具有親合力高於40pM的抗體可能是所欲的，因為如此的抗體在以標準劑量投藥到人體時可產生一較大程度及/或較持久的PDGFR－α 的抑制。一具有親合力高於40pM的抗體可比一具有較低親合力之抗體以較低之有效劑量投藥，或是相較於一具有較低親合力之抗體的標準給藥區間，可以一較長之給藥區間來投藥。

發明概要

本發明之實施態樣係關於特定結合至PDGFR－α 且抑制表現有PDGFR－α 之細胞生長的致標性結合劑。可達成此功效之機制包含，但不限定於，阻礙配體結合及/或抑制在腫瘤細胞中所涉及之細胞訊息傳導以及抑制基質纖維母細胞組份導致降低血管生成。該致標性結合劑係可用於降低腫瘤生長及血管生成。

在本發明之一實施態樣中，該致標性結合劑係為結合至PDGFR－α 且抑制PDGF－AA、PDGF－AB、PDGF－BB及/或PDGF－CC配體結合至PDGFR－α 之完全人類抗體。然而，本發明之另一實施態樣係為結合至PDGFR－α 且抑制受體自體磷酸化之完全人類單株抗體。本發明之另一實施態樣係為結合至PDGFR－α 且抑制細胞生長中所涉及之下游細胞訊息傳導之完全人類單株抗體。

在一些實施態樣中，該致標性結合劑結合至PDGFR－α 且不會和PDGFR－β 受體交叉反應，也就的，該劑係單一特異性的。在一些實施態樣中，該致標性結合劑結合至PDGFR－α 且不會和其它第3型(Class III)受體酪胺酸激酶家族成員交叉反應，舉例如：FLT3、c－kit及/或CSF－1R。

本發明之另一實施態樣係一競爭和於此所敘述之致標性結合劑或抗體相結合之致標性結合劑。

在一實施態樣中，該致標性結合劑以一少於500pM之KD結合至PDGFR－α 。在另一實施態樣中，該致標性結合劑以一少於約400、300、200或100pM之KD結合。在一實施態樣中，該致標性結合劑以一少於75、60、50、40、30、20、10或5pM之KD結合。親合力及/或親和性量測可藉由於此所敘述之FMAT、FACS、KinExA及/或BIACORE而測量。

在另一實施態樣中，該致標性結合劑在一單價親合力測定法中以一少於約400、300、200或100、75、60、50、40、30、20、10或5pM之KD結合PDGFR－α 。單價親合力測定可在一BIACORE測定法中量測，其中可溶性受體係流動於經固定的抗體之上。相較於二價親合力測定法，由一單價親合力測定法所報知的KD係較少可能被實驗性矯作所影響且因此可報知更接近於該抗體之真實單價親合力的KD值。在二價親合力測定法中，經固定化之受體的密度影響了該單一抗體分子流動過時其二次結合至及/或再結合至該經固定化之受體的程度。如此一來，在二價親合力測定法中，該受體的密度可直接影響所報知的KD值。因此，一單價親合力測定法提供了更具生物性意義的親合力量測。

在另一實施態樣中，當以接近於飽和配體位準而執行時，該致標性結合劑以一少於400、300、200或100、75、60、50、40、30、20、10或5 pM之IC50抑制了在該受體二聚物中配體所誘導之轉磷酸化作用。

在另一實施態樣中，當以接近於飽和配體位準而執行時，該致標性結合劑以一少於400、300、200、100、75、60、50、40、30、20、10或5 pM之IC50抑制了配體所誘導之受體自體磷酸化作用。

在本發明之一實施態樣中，該致標性結合劑係一抗體。在本發明之一實施態樣中，該致標性結合劑係一單株抗體。在本發明之一實施態樣中，該致標性結合劑係一完全人類單株抗體。在本發明之另一實施態樣中，該致標性結合劑係一為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同類型之完全人類單株抗體。在本發明之另一實施態樣中，該致標性結合劑係一為IgG2類型之完全人類單株抗體。該類型相較於其它類型對於誘發效應物作用具有降低之可能性，此可能導致降低之毒性。

另一實施態樣是一結合至PDGFR－α 且包含一具有一、二或三個在第12表中所示之互補決定區域(complementarity determining regions；CDR)序列的重鏈胺基酸序列以及一具有一、二或三個在第13表中所示之CDR序列的輕鏈胺基酸序列。在特定實施態樣中，該抗體係一完全人類單株抗體。在某些實施態樣中，本發明提供一結合至和此處所述之任何抗體相同之抗原決定部位(epitope)之抗體。

在一實施態樣中，該2.175.3抗體、2.451.1抗體、2.449.1.3抗體、2.998.2抗體或2.84.3抗體之重鏈係和一異源之輕鏈配在一起。在此技術領域中輕鏈雜交是已良好確立的技術。因此，2.175.3抗體、2.451.1抗體、2.449.1.3抗體、2.998.2抗體或2.84.3抗體之任一者或此處所述之另一抗體的重鏈可和2.175.3抗體、2.451.1抗體、2.449.1.3抗體、2.998.2抗體、2.84.3抗體之任一者或此處所述之其它抗體的輕鏈配在一起。

在一實施態樣中，一抗原結合位置可包含2.175.3抗體、2.451.1抗體、2.449.1.3抗體、2.998.2抗體或2.84.3抗體之任一者的一重鏈CDR1、CDR2及CDR3及一輕鏈CDR1、CDR2及CDR3，以及具有如20、16、10、9或更少，例如：1、2、3、4或5，的胺基酸添加、取代、刪除及/或嵌入於該等所揭露之CDRs。如此之改質可能發生在該等CDRs之內的任何殘基。

在另外的實施態樣中，該致標性結合劑或抗體可包含一含有如第12表或第13表中所示之CDR1、CDR2或CDR3序列中的任一、二、三、四、五或六者的序列。在另一實施態樣中，該致標性結合劑或抗體可包含一含有如第12表所示之CDR1、CDR2或CDR3序列的序列。在另一實施態樣中，該致標性結合劑或抗體可包含一含有如第13表所示之CDR1、CDR2或CDR3序列的序列。在另一實施態樣中，該致標性結合劑或抗體可包含一含有如第12表所示之CDR1、CDR2或CDR3序列及如第13表所示之CDR1、CDR2或CDR3序列的序列。了解的是，那些習於此藝者可容易地完成CDR的決定。例如：Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH Publication 91－3242，Bethesda MD(1991)，vols.1－3。

在另外的實施態樣中，該致標性結合劑或抗體可包含一含有如第12表或第13表中所示之完全人類單株抗體2.175.3、2.449.1.3或2.998.2之任一者之CDR1、CDR2或CDR3序列中的任一、二、三、四、五或六者的序列。在一實施態樣中，該致標性結合劑或抗體可包含一含有如第12表所示之完全人類單株抗體2.175.3、2.449.1.3或2.998.2之CDR1、CDR2或CDR3序列的序列。在另一實施態樣中，該致標性結合劑或抗體可包含一含有如第13表所示之完全人類單株抗體2.175.3、2.449.1.3或2.998.2之CDR1、CDR2或CDR3序列的序列。在另一實施態樣中，該致標性結合劑或抗體可包含一含有如第12表所示之完全人類單株抗體2.175.3、2.449.1.3或2.998.2之CDR1、CDR2或CDR3序列及如第13表所示之完全人類單株抗體2.175.3、2.449.1.3或2.998.2之CDR1、CDR2或CDR3序列的序列。

在另一實施態樣中，該致標性結合劑或抗體可包含一含有如第12表所示之完全人類單株抗體2.175.3之CDR1、CDR2或CDR3序列及如第13表所示之完全人類單株抗體2.175.3之CDR1、CDR2或CDR3序列的序列。在另一實施態樣中，該致標性結合劑或抗體可包含一含有如第12表所示之完全人類單株抗體2.449.1.3之CDR1、CDR2或CDR3序列及如第13表所示之完全人類單株抗體2.449.1.3之CDR1、CDR2或CDR3序列的序列。在另一實施態樣中，該致標性結合劑或抗體可包含一含有如第12表所示之完全人類單株抗體2.998.2之CDR1、CDR2或CDR3序列及如第13表所示之完全人類單株抗體2.998.2之CDR1、CDR2或CDR3序列的序列。

本發明之另一實施態樣係一和本發明之致標性結合劑或抗體競爭和PDGFR－α 結合之致標性結合劑。在本發明之另一實施態樣中，係有一和本發明之致標性結合劑或抗體競爭和PDGFR－α 結合之抗體。在另一實施態樣中，該致標性結合劑或抗體係和完全人類單株抗體2.175.3、2.449.1.3或2.998.2之任一者競爭和PDGFR－α 的結合。在本發明之一實施態樣中，提供一和完全人類單株抗體2.175.3、2.449.1.3或2.998.2之任一者競爭和PDGFR－α 結合的抗體。

本發明之另外的實施態樣係一和本發明之致標性結合劑或抗體結合至PDGFR－α 上相同之抗原決定部位的致標性結合劑或抗體。在本發明之另一實施態樣中，係一和本發明之致標性結合劑或抗體結合至PDGFR－α 上相同之抗原決定部位的抗體。在本發明之一實施態樣中，係提供一和完全人類單株抗體2.175.3、2.449.1.3或2.998.2之任一者結合至PDGFR－α 上相同之抗原決定部位的致標性結合劑。在本發明之一實施態樣中，係提供一和完全人類單株抗體2.175.3、2.449.1.3或2.998.2之任一者結合至PDGFR－α 上相同之抗原決定部位的抗體。

本發明之另外的實施態樣係一包含橫跨該結構區域及/或互補決定區域(CDR’s)，特別是自如第12表或第13表所示之單株抗體之任一者的FR1至FR4或是CDR1至CDR3，之連續性重鏈及輕鏈序列的致標性結合劑或抗體。

一實施態樣提供一致標性結合劑或是其抗原結合部份，其中該劑或結合部份包含一具有SEQ ID NO.：2序列之重鏈多胜肽。在一實施態樣中，該劑或其結合部份更包含一具有SEQ ID NO.：4序列之輕鏈多胜肽。另一實施態樣係一致標性結合劑或是其抗原結合部份，其中該劑或結合部份係包含一具有SEQ ID NO.：10序列之重鏈多胜肽。在一實施態樣中，該劑或其結合部份更包含一具有SEQ ID NO.：12序列之輕鏈多胜肽。又一實施態樣係一致標性結合劑或是其抗原結合部份，其中該劑或結合部份係包含一具有SEQ ID NO.：14序列之重鏈多胜肽。在一實施態樣中，該劑或其結合部份更包含一具有SEQ ID NO.：16序列之輕鏈多胜肽。

在一實施態樣中，該致標性結合劑包含一或多個完全人類單株抗體2.175.3、2.449.1.3或2.998.2。

在一實施態樣中，本發明之致標性結合劑包含一含有之SEQ ID NO.：2序列之多胜肽，其中該序列包含在第6表之各列中所指出之種系及非種系殘基的特定組合中的任一者。在一實施態樣中，本發明之致標性結合劑包含一含有序列SEQ ID NO.：10之多胜肽，其中該序列包含在第8表之各列中所指出之種系及非種系殘基的特定組合中的任一者。在一實施態樣中，本發明之致標性結合劑包含一含有序列SEQ ID NO.：14之多胜肽，其中該序列包含在第10表之各列中所指出之種系及非種系殘基的特定組合中的任一者。在一實施態樣中，本發明之致標性結合劑包含一含有序列SEQ ID NO.：4之多胜肽，其中該序列包含在第7表之各列中所指出之種系及非種系殘基的特定組合中的任一者。在一實施態樣中，本發明之致標性結合劑包含一含有序列SEQ ID NO.：12之多胜肽，其中該序列包含在第9表之各列中所指出之種系及非種系殘基的特定組合中的任一者。在一實施態樣中，本發明之致標性結合劑包含一含有序列SEQ ID NO.：16之多胜肽，其中該序列包含在第11表之各列中所指出之種系及非種系殘基的特定組合中的任一者。

在一實施態樣中，本發明之抗體包含一含有序列SEQ ID NO.：2之重鏈多胜肽，其中該序列包含在第6表之各列中所指出之種系及非種系殘基的特定組合中的任一者。在一實施態樣中，本發明之抗體包含一含有序列SEQ ID NO.：10之重鏈多胜肽，其中該序列包含在第8表之各列中所指出之種系及非種系殘基的特定組合中的任一者。在一實施態樣中，本發明之抗體包含一含有序列SEQ ID NO.：14之重鏈多胜肽，其中該序列包含在第10表之各列中所指出之種系及非種系殘基的特定組合中的任一者。在一實施態樣中，本發明之抗體包含一含有序列SEQ ID NO.：4之輕鏈多胜肽，其中該序列包含在第7表之各列中所指出之種系及非種系殘基的特定組合中的任一者。在一實施態樣中，本發明之抗體包含一含有序列SEQ ID NO.：12之輕鏈多胜肽，其中該序列包含在第9表之各列中所指出之種系及非種系殘基的特定組合中的任一者。在一實施態樣中，本發明之抗體包含一含有序列SEQ ID NO.：16之輕鏈多胜肽，其中該序列包含在第11表之各列中所指出之種系及非種系殘基的特定組合中的任一者。

在一實施態樣中，本發明之致標性結合劑或抗體包含一依據SEQ ID NO：2、6或10的重鏈序列，其中：在位置30之殘基係擇自於：S或R；在位置31之殘基係擇自於：S,N或D；在位置33之殘基係擇自於：G或Y；在位置35之殘基係擇自於：S,H或N；在位置50之殘基係擇自於：Y,V或F；在位置53之殘基係擇自於：Y,S或R；在位置54之殘基係擇自於：S或D；在位置57之殘基係擇自於：T,L,N或I；在位置58之殘基係擇自於：K或I；在位置61之殘基係擇自於：V或A；在位置99之殘基係擇自於：G,D或E或是該殘基係經刪除的；在位置100之殘基係擇自於：G或是該殘基係經刪除的；在位置101之殘基係擇自於：S,H,P或R；在位置102之殘基係擇自於：Y或I；在位置103之殘基係擇自於：S,V或A；在位置104之殘基係擇自於：G或A；在位置105之殘基係擇自於：S或R；在位置106之殘基係擇自於：P或G；在位置107之殘基係擇自於：F或M；以及在位置109之殘基係擇自於：Y或V。

此重鏈序列之群組係命名為「群組A」。

在一實施態樣中，本發明之致標性結合劑或抗體包含一依據SEQ ID NO：14或18的重鏈序列，其中在位置27之殘基係擇自於：G或D；在位置28之殘基係擇自於：S或F；在位置32之殘基係擇自於：S或F；在位置33之殘基係擇自於：S,N,T或I；在位置52之殘基係擇自於：S或T；在位置56之殘基係擇自於：S或T；在位置58之殘基係擇自於：S或T；在位置63之殘基係擇自於：S或P；在位置100之殘基係擇自於：H或是該殘基係經刪除的；在位置101之殘基係擇自於：H或是該殘基係經刪除的；以及在位置103之殘基係擇自於：V或是該殘基係經刪除的。

此重鏈序列之群組係命名為「群組B」。

在一實施態樣中，本發明之致標性結合劑或抗體包含一依據SEQ ID NO：4、8或12的輕鏈序列，其中在位置25之殘基係擇自於：A或P；在位置27之殘基係擇自於：Q,R或H；在位置28之殘基係擇自於：G,V,S,I,D或R；在位置29之殘基係擇自於：I或F；在位置30之殘基係擇自於：S,N,A,R或T；在位置31之殘基係擇自於：S,H,K,T或R；在位置32之殘基係擇自於：S,T,Y,D,N或F；在位置33之殘基係擇自於：L或I；在位置50之殘基係擇自於：A,G,L,Y,S或V；在位置51之殘基係擇自於：A,G或S；在位置53之殘基係擇自於：T,Q,N,H,R或S；在位置54之殘基係擇自於：L,R或S；在位置55之殘基係擇自於：Q,P,F,A或V；在位置56之殘基係擇自於：S,N,T或G；在位置91之殘基係擇自於：S或T；在位置92之殘基係擇自於：Y或F；在位置94之殘基係擇自於：N,T,S或是該殘基係經刪除的；在位置95之殘基係擇自於：F,W,P,I,A,L或是該殘基係經刪除的；在位置96之殘基係擇自於：P或是該殘基係經刪除的；以及在位置97之殘基係擇自於：W,L,R,I或是該殘基係經刪除的。

此輕鏈序列之群組係命名為「群組C」。

在一實施態樣中，本發明之致標性結合劑或抗體包含一依據SEQ ID NO：16或20的輕鏈序列，其中在位置28之殘基係擇自於：S,I,G,D,R或V；在位置29之殘基係擇自於：F,I或V；在位置30之殘基係擇自於：S,A,T,G,R或N；在位置31之殘基係擇自於：S,R,K,N或T；在位置32之殘基係擇自於：Y,F,W,N,D或S；在位置33之殘基係擇自於：L或I；在位置34之殘基係擇自於：N,A或H；在位置50之殘基係擇自於：A,Y,G,L或V；在位置51之殘基係擇自於：A,G或S；在位置52之殘基係擇自於：A,Y,G,L或V；在位置54之殘基係擇自於：L,R或S；在位置55之殘基係擇自於：Q,F,V,A或P；在位置56之殘基係擇自於：S,N,T或G；在位置92之殘基係擇自於：S或T；以及在位置93之殘基係擇自於：S,N或I。

此輕鏈序列之群組係命名為「群組D」。

在一實施態樣中，本發明之致標性結合劑或抗體包含群組A重鏈序列之任一者以及群組C或群組D輕鏈序列之任一者。

在一實施態樣中，本發明之致標性結合劑或抗體包含群組B重鏈序列之任一者以及群組C或群組D輕鏈序列之任一者。

本發明之其它實施態樣包括結合至PDGFR－α且包含一衍生自VH3－11種系序列之重鏈多胜肽的人類單株抗體。本發明之其它實施態樣包括結合至PDGFR－α且包含一衍生自VH4－39種系序列之重鏈多胜肽的人類單株抗體。本發明之其它實施態樣包括結合至PDGFR－α且包含一衍生自D1－26,D6－6 or D7－27種系序列之重鏈多胜肽的人類單株抗體。本發明之某些實施態樣包括結合至PDGFR－α且包含一V輕鏈的人類單株抗體。本發明仍有之其它實施態樣包括一包含和由VH3－11或VH4－39重鏈基因所譯碼或是所衍生出之重鏈相配對之V輕鏈的單株抗體。S在某些實施態樣中，該V輕鏈多胜肽係由JK1輕鏈基因所譯碼或是所衍生。在其它實施態樣中，該V輕鏈多胜肽係由JK5輕鏈基因所譯碼或是所衍生。

本發明之其它實施態樣包括結合至PDGFR－α且包含一衍生自VH3－11種系序列之重鏈多胜肽以及一衍生自O12輕鏈基因之Vk輕鏈多胜肽的人類單株抗體。本發明另外之實施態樣包括結合至PDGFR－α且包含一衍生自VH3－11種系序列之重鏈多胜肽以及一衍生自O12種系序列輕鏈之Vk輕鏈多胜肽的人類單株抗體，其中該輕鏈之CDR1中的第二胺基酸譯碼出脯胺酸。VH3－11重鏈基因使用與伴隨有脯胺酸經譯碼為輕鏈之CDR1之第2胺基酸位置的O12輕鏈基因使用的組合係以衍生自來自具有互異之CDR3重鏈及輕鏈序列之獨立族系之二抗體(也就是2.449.1.3及2.175.3(參考第12表及第13表))的抗體為例示。

單株抗體2.175.3及2.449.1.3皆係對於PDGFR－α具高親合力之抗體，且在試管中具有阻斷PDGF所驅動之細胞反應的高效力。雖然這二個抗體共同使用VH(VH3－11)及Vk(O12)使用，其係在D、JH及Jk使用上相異。因此，其係來自於不同之B－細胞族系。然而，其確實在Vk共同具有獨特的序列形式。在二抗體中殘基25皆是脯胺酸，由族系之丙氨酸突變而來。脯胺酸並未在任何Vk族系基因中被使用，且係只在Kabat資料庫中0.2%之人類序列的此位置出現。在位置25之脯胺酸將在該胜肽骨架中嵌入一不易彎曲的胜肽鍵以及一急轉的角度，且因而在該二抗體之輕鏈的Vk區域內產生獨特的結構特性。同樣地，一突變之精胺酸係被2.175.3及2.449.1.3使用於Vk之CDR1的位置27e(Kabat編號)。精胺酸並不被使用於任何Vk族系基因之此標準位置上，且係只在Kabat資料庫中0.4%之人類序列中出現。在本發明之一實施態樣中，提供一結合至PDGFR－α且在殘基25包含一脯胺酸之人類單株抗體。在本發明之一實施態樣中，提供一結合至PDGFR－α且在CDR1之位置27e包含一精胺酸之人類單株抗體。

在本發明之其它實施態樣中，提供一包含一本發明之致標性結合劑或其結合片段以及一藥學上可接受之載劑的組成物。在本發明之其它實施態樣中，提供一包含一本發明之抗體或其結合片段以及一藥學上可接受之載劑的組成物。

本發明還有之其它實施態樣包括有效地治療一遭受細胞增生性疾病之動物的方法，包括選定一需要治療細胞增生性疾病之動物，且投與一治療有效量之特定結合至PDGFR－α之致標性結合劑至該動物。在某些實施態樣中，該動物為人類。在某些實施態樣中，該致標性結合劑係一完全人類單株抗體。在某些實施態樣中，該致標性結合劑係本發明之抗體且係擇自於由2.175.3、2.449.1.3或2.998.2所組成之群組。

能治療的細胞增生性疾病舉例如包括癌症，例如：黑色素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膠質瘤、肝癌、甲狀腺腫瘤、胃癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、神經膠元母細胞瘤、子宮內膜癌、腎臟癌、結腸癌、胰臟癌、食道癌、頭頸部腫瘤、惡性間皮瘤、肉瘤、膽管癌、小腸腺癌、兒童惡性腫瘤、扁平細胞瘤以及胃腸道基質瘤(GIST)。

本發明之一實施態樣係適用於和PDGFR－α相拮抗，在一具有和PDGFR－α單獨相關或部份相關之腫瘤的病人中。本發明額外的實施態樣包括在動物中抑制腫瘤生長的方法。這些方法包括選定一需要治療腫瘤細胞生長之動物，且投與一治療有效劑量之致標性結合劑至該動物，其中該劑係特定結合至PDGFR－α。在另外的實施態樣中，該方法包括選定一需要治療腫瘤細胞生長之動物，且投與一治療有效劑量之完全人類單株抗體至該動物，其中該抗體係特定結合至PDGFR－α。

本發明之另外的實施態樣包括一致標性結合劑在製備一用於治療涉及在一動物中PDGFR－α表現之疾病之藥物的用途，其中該劑係特定結合至PDGFR－α。在另外的實施態樣中，本發明包括一抗體在製備一用於治療涉及在一動物中PDGFR－α表現之疾病之藥物的用途，其中該單株抗體係特定結合至PDGFR－α。

在其它實施態樣中，其中所述之該致標性結合劑或抗體可被使用於製備一用於治療在一動物中細胞增生性疾病之藥物，其中該抗體係特定結合至PDGFR－α。

此處所述之本發明的實施態樣係關於結合至PDGFR－α且影響PDGFR－α功能之抗體。其它實施態樣係關於完全人類抗PDGFR－α抗體以及由治療之層面來看具有所欲性質之抗PDGFR－α抗體製備物，包括對於PDGFR－α之高結合親合力、對於PDGFR－α訊息傳導之高選擇性的抑制作用、低毒性、阻斷PDGF－AA配體結合至PDGFR－α的能力、阻斷PDGF－AB配體結合至PDGFR－α的能力、阻斷PDGF－BB配體結合至PDGFR－α的能力、阻斷PDGF－CC配體結合至PDGFR－α的能力及/或在試管內及在活體內抑制腫瘤細胞生長的能力。有些實施態樣係關於不會實質上和PDGFR－β交叉反應的完全人類抗PDGFR－α抗體。其它仍有之實施態樣係關於不會產生顯著人類抗嵌合化抗體(Human Anti－Chimeric Antibody；HACA)反應之完全人類抗PDGFR－α抗體及抗PDGFR－α抗體製備物，藉此可用於重複地投藥。

在一實施態樣中，本發明包括具有非常高之結合至PDGFR－α之親合力(Kd)的抗體。例如，一人類、兔子、小鼠、嵌合化或人源化抗體係可以一少於10－5、10－6、10－7、10－8、10－9、10－10或10－11M之Kd(但不受限於以上數值)或是其中之任何範圍或數值結合至PDGFR－α。親合力及/或親合性量測可以KinExA及/或BIACORE來測量，如其中所述。

因此，其中所述之一實施態樣包括經分離之抗體或是這些抗體的片段，其結合至PDGFR－α。如該技術領域中所知者，該抗體可有利地為，例如：多株的、寡株的、單株的、嵌合的、人源化的及/或完全人類抗體。其中所述之本發明之實施態樣也提供用以產生這些抗體之細胞。

被了解的是本發明之實施態樣並不限定於一抗體之任何特定的形式或是產生或是製造的方法。例如：該抗PDGFR－α抗體可為全長的抗體(亦即是，具有一完整的人類Fc區域)或是一抗體結合片段(亦即是，一Fab、Fab’或F(ab’)2、FV或dAb)。此外，該抗體可由一分泌該抗體之融合瘤製備，或是由一已經過轉形或轉染有可譯碼該抗體之一基因或多基因的基因重組建構的細胞所製備。此外，該抗體可為單一功能區抗體，如：結合至PDGFR－α之單區(camelid)或人類單一VH或VL功能區，如一dAb片段。

本發明之其它實施態樣包括譯碼出其中所述之任何致標性結合劑或抗體之經分離的核酸分子或是具有譯碼出抗PDGFR－α抗體之經分離的核酸分子的載體或是經轉形有任何此類核酸分子的宿主細胞。此外，本發明之一實施態樣係藉由在一核酸分子表現以產生該抗體且接著藉由取回該抗體之情形下培養宿主細胞而製造一抗PDGFR－α抗體之方法。

其中另一實施態樣包括藉由以表現人類PDGFR－α之細胞、含有人類PDGFR－α之經分離的細胞膜、經純化之人類PDGFR－α或是其等之片段及/或一或多個其直系同源(orthologous)序列或片段來免疫一哺乳類動物而製造對於PDGFR－α具高親合力之抗體的方法。

其它實施態樣係基於特定結合至PDGFR－α之經分離的抗體的產生及鑑定。PDGFR－α係表現在數種腫瘤型式上。中和PDGFR－α之抗體可預防PDGFR－α所引發之腫瘤生長及其它所欲之效果。

本發明之另一實施態樣包括一診斷疾病或病狀的方法，其中，一如其中所述般而製備的抗體係利用於偵測在一病患或一病患檢體中之PDGFR－α位準。在另一實施態樣中，用於鑑定風險因子、診斷疾病以及疾病之階段的方法係存在的，其涉及使用抗－PDGFR－α抗體來鑑定PDGFR－α的表現及/或過量表現。在某些實施態樣中，該方法包含投予一選擇性結合至一細胞上之PDGFR－α蛋白質之完全人類抗體綴合物至一病患。該抗體綴合物包含一選擇性結合至PDGFR－α之抗體及一標記。該方法進一步包含觀察該標記在病患中之存在。一相對高量的標記將表示一相對高之疾病風險以及一相對低量的標記將表示一相對低之疾病風險。在一實施態樣中，該標記係綠螢光蛋白。

本發明進一步提供用於測定在一病患樣品中PDGFR－α位準之方法，該方法包含使一抗PDGFR－α抗體和一由病患而來之生物樣品相接觸，且偵測在該樣品中該抗體及PDGFR－α之間結合的位準。在更特定之實施態樣中，該生物樣品係血液或血清。

本發明之另一實施態樣包括用於診斷和PDGFR－α在一細胞中之表現相關之病症的方法，該方法藉由使一血清或細胞和一抗PDGFR－α抗體相接觸，而之後偵測PDGFR－α的存在。

在另一實施態樣中，本發明包括一用於偵測在哺乳類組織、細胞或體液中之PDGFR－α以篩選涉及表現PDGFR－α之細胞之疾病的測定套組。該套組包括一結合至PDGFR－α之抗體以及一用於指示該抗體和PDGFR－α反應之物件，如果有該反應的話。較佳的是該抗體為單株抗體。在一實施態樣中，該結合至PDGFR－α之抗體係經標記的。在另一實施態樣中，該抗體係一未經標記的第一抗體而該套組更包括用於偵測該第一抗體之物件。在一實施態樣中，該物件包括一經標記之第二抗體，該第二抗體為一抗免疫球蛋白。較佳地，該抗體係經一選自於以下群組之標記所標識：螢光物、酵素、放射性核種及輻射線不能穿透的物質(radiopaque material)。

還有另外的實施態樣包括用於治療在一病患中和PDGFR－α表現相關之疾病或病況的方法，該方法藉由投予一有效量之抗PDGFR－α抗體至該病患。該抗PDGFR－α抗體可被單獨投藥，或是可和其它的抗體或是化療藥物或是放射性治療合併投予。例如：抑制腫瘤生長之PDGFR－α抗體之一單株、寡株或多株混合物可和一顯示出可直接抑制腫瘤細胞增殖之藥物合併投藥。該方法可在活體內執行且該病患較佳係人類病患。

在某些實施態樣中，該抗PDGFR－α抗體可被改質以增強其固定補體及參與補體依賴性細胞毒殺作用(complement－dependent cytotoxicity,CDC)之能力。在實施態樣中，該抗PDGFR－α抗體可經改質以增強其活化效應細胞及參與抗體依賴性細胞毒殺作用(antibody－dependent cytotoxicity,ADCC)之能力。在其它仍有之實施態樣中，該抗PDGFR－α抗體可經改質以增強其活化效應細胞及參與抗體依賴性細胞毒殺作用且增強其固定補體及參與補體依賴性細胞毒殺作用之能力。

在另外之實施態樣中，本發明提供一包括一容器之製造商品。該容器包括一含有抗PDGFR－α抗體之組成物及一仿單或標識指明該組成物係用於治療特徵為PDGFR－α表現或過度表現的疾病。

在其它實施態樣中，本發明提供一用於治療涉及PDGFR－α表現之疾病的套組，該套組包括抗PDGFR－α單株抗體及將該單株抗體投予一需要此治療之病患的指示。

在其它方面，係提供一選擇性殺死在一病人之癌細胞的方法。該方法包含投予一完全人類抗體綴合物至一病人。該完全人類抗體綴合物包含一可結合至PDGFR－α之胞外功能區域之抗體及一藥劑。該藥劑係一毒素、一放射性同位素或另一可殺死癌細胞的物質。該抗體綴合物藉此可選擇性地殺死癌細胞。該藥劑可為皂草毒素蛋白(saporin)。

在一方面，係提供一結合至PDGFR－α之經綴合的完全人類抗體。附接至該抗體之係一藥劑，且該抗體結合至一細胞導致該藥劑傳送至該細胞。在一實施態樣中，上述經綴合之完全人類抗體結合至一PDGFR－α之胞外功能區域。在另一實施態樣中，該抗體及該經綴合之毒素係被一表現PDGFR－α之細胞胞內化。在另一實施態樣中，該藥劑係一細胞毒殺性藥劑。在另一實施態樣中，該藥劑係，例如，皂草毒素蛋白或奧瑞司他汀(auristatin)、假單孢菌屬外毒素、吉柔寧(gelonin)、蓖麻毒素(ricin)、卡利甲米辛(calicheamicin)或是以美登素為基礎(maytansine－based)之免疫綴合物等等。在其它另外的實施態樣中，該藥劑係放射性同位素。

在本發明之某些實施態樣中，其中所提供之抗體醣化形態係經改質以增加ADCC及CDC效應者功能。參考Shields RL等人(2002)JBC.277：26733；Shinkawa T等人,(2003)JBC.278：3466以及Okazaki A等人,(2004)J.Mol.Biol.,336：1239的論文。

圖式簡單說明

第1圖係一顯示5種經選定之單株抗體之劑量反應的圖表，其係就抑制PDGF－AA－所引發之MG－63腫瘤細胞增生%對於抗體濃度ng/ml而言。使用100 ng/ml(3.45nM)的PDGF－AA進行細胞刺激。

第2a－2b圖顯示2.175.3及2.449.1.3在Calu－6非小細胞肺異種移植模式之活體內抗腫瘤評估。第2a圖顯示平均腫瘤大小(mm³ )對時間(天數)，而第2b圖顯示平均體重(g)對時間(天數)。該方形點表示該載劑治療組；該圓形點表示該2.175.3 10 mg/kg治療組；該三角形點表示該2.449.1.3 10mg/kg治療組。

第3圖顯示該等抗體在SCID小鼠之U118神經膠質瘤異種移植模式之活體內評估的結果。圖表中係以抗體治療之腫瘤大小(mm³ )對時間(天數)。該方形點表示該載劑治療組；該圓形點表示該2.175.3 10 mg/kg治療組；該三角形點表示該2.449.1.3 10mg/kg治療組。

較佳實施例之詳細說明

於此所述之本發明的實施態樣係關於結合至PDGFR－α且抑制腫瘤細胞生長的致標性結合劑。在某些實施態樣中，該致標性結合劑係結合至PDGFR－α且抑制腫瘤細胞生長的抗體。本發明之其它實施態樣包括在治療上可用之完全人類抗PDGFR－α抗體及抗體製備物。此類抗PDGFR－α抗體製備物較佳係具有所欲之治療性質，包括對於PDGFR－α之強結合親和力，對於抑制PDGFR－α訊息傳導之高選擇性，低毒性，阻止PDGF－AA配體結合至PDGFR－α之能力，阻止PDGF－AB配體結合至PDGFR－α或是PDGFR－α/β異二聚物之能力，阻止PDGF－BB配體結合至PDGFR－α或是PDGFR－α/β異二聚物之能力，阻止PDGF－CC配體結合至PDGFR－α或是PDGFR－α/β異二聚物之能力，及/或在試管內及在活體內抑制腫瘤細胞生長的能力。某些實施態樣係關於不會和PDGFR－β交互反應的完全人類抗PDGFR－α抗體。

本發明之實施態樣也包括是抗PDGFR－α抗體之經分離的結合片段的致標性結合劑。較佳地，該結合片段係衍生自完全人類抗PDGFR－α抗體。典型的片段包括Fv,Fab’dAb或其它已知之抗體片段，如以下所詳述者。本發明之實施態樣也包括表現對抗PDGFR－α之完全人類抗體的細胞。細胞之例子包括融合瘤或是基因重組所製造出來之細胞，例如：產生對抗PDGFR－α抗體之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。

此外，本發明之實施態樣包括使用這些抗體治療疾病之方法。抗PDGFR－α抗體係可用於抑制腫瘤生長。該作用之機包括，但並不侷限於，阻斷配體結合及/或抑制關於細胞生長之細胞訊息傳導。可藉由此機制治療之疾病包括，但並不侷限於，腫瘤疾病，例如：癌症，包括肺癌、卵巢癌、前列腺癌、結腸癌、神經膠質瘤、黑色素瘤及胃腸道基質瘤(GIST)。

本發明之其它實施態樣包括用明確地決定在一病患或生物性樣品中PDGFR－α的存在及/或其量之診斷試驗。該試驗套組可包括伴有用於偵測此類抗體之必須的標識的抗PDGFR－α抗體。這些診斷試驗係可使用於篩選和PDGFR－α相關之疾病，包括，但並不侷限於，腫瘤疾病，例如：癌症，包括乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、結腸癌、神經膠質瘤、黑色素瘤及胃腸道基質瘤(GIST)。

另一實施態樣係一包含一含有SEQ ID NO.：2序列之重鏈多胜肽之抗體。在一實施態樣中，該抗體更包含一含有SEQ ID NO.：4序列之輕鏈多胜肽。另一實施態樣包括一含有SEQ ID NO.：10序列之重鏈多胜肽之抗體。在一實施態樣中，該抗體更包含一含有SEQ ID NO.：12序列之輕鏈多胜肽。仍有之另一實施態樣係一包含一含有SEQ ID NO.：14序列之重鏈多胜肽之抗體。在一實施態樣中，該抗體更包含一含有SEQ ID NO.：16序列之輕鏈多胜肽。

還有之另一實施態樣係一產生如上所述之抗體的輕鏈及/或重鏈的融合瘤。該融合瘤可產生一完全人類單株抗體之一輕鏈及/或一重鏈。在一實施態樣中，該融合瘤產生完全人類單株抗體2.175.3、2.449.1.3及2.998.2之輕鏈及/或重鏈。可擇地，該融合瘤可產生如同完全人類單株抗體2.175.3、2.449.1.3及2.998.2結合至相同之抗原決定部位或多種抗原決定部位的抗體。可擇地，該融合瘤可產生和完全人類單株抗體2.175.3、2.449.1.3及2.998.2競爭結合至PDGFR－α之抗體。

仍有之另一實施態樣係一譯碼如上所述之抗體的輕鏈或重鏈的核酸分子。在此實施態樣中，該核酸分子可譯碼一完全人類單株抗體的輕鏈或重鏈。在一實施態樣中，該核酸分子譯碼2.175.3、2.449.1.3或2.998.2完全人類單株抗體之一者的輕鏈或重鏈。

一額外的實施態樣係一包含核酸分子或如上所述之分子的載體，其中該載體譯碼出如上所界定之抗體的輕鏈及/或重鏈。

本發明之一實施態樣包括一包含有如上所述之載體的宿主細胞。可擇地，該宿主細胞可包含多.於一種之載體。

此外，本發明之一實施態樣係一藉由在一核酸分子表現而產生該抗體之情形下培養該宿主細胞且接續回收該抗體而產生一抗體之方法。

在本發明之一實施態樣中，其包括一藉由以至少一譯碼出如上所述之致標性結合劑的核酸分子轉染至少一宿主細胞，在該宿主細胞中表現該核酸分子且分離出該致標性結合劑而製造一致標性結合劑的方法。本發明之另一實施態樣中係一藉由以至少一譯碼出如上所述之抗體的核酸分子轉染至少一宿主細胞，在該宿主細胞中表現該核酸分子且分離出該抗體而製造一抗體的方法。

本發明之另一方面係一藉由投予如上所述之致標性結合劑而抑制表現有PDGFR－α之細胞生長的方法。該方法可包括選定一需要治療和PDGFR－α表現相關之疾病的動物，且投予一治療有效量之特定結合至PDGFR－α之致標性結合劑至該動物。

仍有之另一方面係一藉由投予一治療有效量之特定結合至PDGFR－α之致標性結合劑以治療一哺乳類動物之腫瘤疾病的方法。該方法可包括選定一需要治療腫瘤疾病的動物，且投予一治療有效量之特定結合至PDGFR－α之致標性結合劑至該動物。該藥劑可被單獨投藥，或是可和一第二抗腫瘤藥劑合併投藥，該第二抗腫瘤藥劑係選自一抗體、一化療藥物或是一放射性藥物。

另一方面係一藉由投予一治療有效量之特定結合至PDGFR－α之致標性結合劑以治療一哺乳類動物之癌症的方法。該方法可包括選定一需要治療癌症的動物，且投予一治療有效量之特定結合至PDGFR－α之致標性結合劑至該動物。該藥劑可被單獨投藥，或是可和一第二抗腫瘤藥劑合併投藥，該第二抗腫瘤藥劑係選自一抗體、一化療藥物或是一放射性藥物。

依據本發明之另一方面，一特定結合至PDGFR－α之致標性結合劑可被使用於製造一用於治療腫瘤疾病的藥物。

本發明之一實施態樣係特定適合於用在抑制一病患之單獨，或是部份，依賴於PDGFR－α表現的腫瘤生長。

本發明之另一實施態樣包括一用於偵測在哺乳類動物之組織、細胞或體液中之PDGFR－α以篩選腫瘤及/或纖維性病變及/或免疫系統疾病的測試套組。該套組包括一結合至PDGFR－α之致標性結合劑及一用於顯示該致標性結合劑和PDGFR－α反應的物件，若有該反應的話。該致標性結合劑可為一單株抗體。在一實施態樣中，該結合PDGFR－α的抗體係經標記的。在另一實施態樣中，該抗體係未經標記的該抗體係一未經標記的第一抗體而該套組更包括用於偵測該第一抗體之物件。在一實施態樣中，該物件包括一經標記之第二抗體，該第二抗體為一抗免疫球蛋白。較佳地，該抗體係經一選自於以下群組之標記所標識：螢光物、酵素、放射性核種及輻射線不能穿透的物質(radiopaque material)。

關於抗PDGFR－α抗體之進一步的實施態樣、特徵等係於以下詳細地敘述。

定義

除非有另外的定義，此處所使用的科學性及技術性的用語係具有此領域中具有通常知識者所能並遍了解的意義。此外，除非內文中另外的需求，單數的用語係包括複數且複數的用語應包括單數。一般來說，和此處所述之細胞、組織培養，分子生物以及蛋白質及寡－或聚核苷酸化學及雜交相關聯之命名及技術係此技術領域中所習知且普遍的。

標準技術係使用重組DNA、寡核苷酸合成以及組織培養和轉形(例如：電穿透作用，脂質轉染法)之中。酵素反應及純化技術係依據製造商的說明書或是如同該領域中一般所熟練的或是此中所述者而執行。前述之技巧及步驟一般係依據該領域中所熟知的以及在本發明說明書中所引用或是所討論之各種一般或是更特定之文獻中所述之習知方法而執行。參考文獻如Sambrook等人的Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第三版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))，其係併入此作為參考。此中所述和分析化學、合成有機化學以及藥物及製藥化學相關所應用的命名以及實驗室步驟及技術係該領域中所熟知者且是普遍使用的。標準技術係使用於化學合成、化學分析、製藥調配、配方及傳送以及治療病患。

如同依據本揭露內容所採用者，下列之用語，除非另有指示，應被解讀為具有以下之意思：一化合物係意指任何具有小於約2000道耳吞(Daltons)之分子量的小分子量化合物。

該「PDGFR－α」一詞係意指由PDGFR－α基因所譯碼出之血小板衍生生長因子酪胺酸激酶受體－α。PDGFR－α亦已知為CD140a及PDGFR－α。

該「中和」一詞在意指一例如一抗體之致標性結合劑係關於該藥劑消除或明顯減少一標的抗原之活性的能力。因此，本發明之中和性抗PDGFR－α抗體係可消除或明顯減少PDGFR－α之活性。舉例來說，一中和性PDGFR－α抗體可藉由阻斷配體結合至其受體PDGFR－α而作用。

如此處所使用之該「經分離之聚核苷酸」一詞係意指一已由其自然存在之環境中被分離出來的聚核苷酸。此聚核苷酸可為染色體、cDNA或是合成的。經分離的聚核苷酸較佳係和其本質上相關聯的所有或部份聚核苷酸沒有關聯的。該經分離的聚核苷酸可能操作性地連接於另一本質上不相連接之聚核苷酸。此外，經分離的聚核苷酸較佳係本質上不會以一部份之較大序列存在。

該「經分離的蛋白質」一詞在此係意指一已由其自然存在之環境中被分離出來的蛋白質。此類之蛋白質可衍生自染色體DNA，cDNA，經基因重組之DNA，經基因重組之RNA或是合成之來源或是其等藉由其來源或是衍生源之某些組合，該「經分離的蛋白質」(1)係並不和自然中所發現之蛋白質相連接；(2)係不具有由相同來源而來之蛋白質，例如，不具有鼠類蛋白質；(3)係由一來自不同種之細胞所表現；或是(4)在自然中不存在的。

該「多胜肽」一詞在此處係使用為一通稱用語以意指天然的蛋白質、片段、或一多胜肽序列的類似物。因此，天然的蛋白質、片段或類似物係多胜肽屬的種類。依據本發明之較佳的多胜肽包含人類的重鏈免疫球蛋白分子以及人類輕鏈免疫球蛋白分子，以及一藉由包含該重鏈免疫球蛋白分子和一如或是λ輕鏈免疫球蛋白分子之該輕鏈免疫球蛋白分子之組合所形成的抗體分子，反之亦然，以及其片段或是類似物。依據本發明之較佳的多胜肽也可能僅包含人類重鏈免疫球蛋白分子或其片段。

此處所使用之該「自然存在」一詞在應用至一物體時係意指該物體可在自然中被發現的事實。例如，存在於一有機體(包括病毒)中之一多胜肽或是一聚核苷酸序列，其可由一自然之來源中被分離出來且其係並未經過實驗室中之人員有目的地或是其它自然發生地改質。

此處所使用之「可操作性地連接」一詞係意指如此所述之構件的位置係處於允許其等以其所欲之方式而運作的關係。例如，一控制序列「可操作性地連接」至一譯碼序列係指以在適合於該控制序列之情形下可達成該譯碼序列表現的方式連接。

此處所使用之「控制序列」一詞係意指造成或影響其所連接至之譯碼序列表現或進行之聚核苷酸序列。此類控制序列之本質係依據其宿主有機體而有所不同；在原核細胞中，此類控制序列一般係包括啟動子(promoter)、核糖體結合部位(ribosomal binding site)以及轉錄終止序列(transcription termination sequence)；在真核細胞中，此類控制序列一般係包括啟動子、增強子、內子、轉錄終止序列、聚腺苷酸化訊號序列(polyadenylation signal sequences)以及5’及3’非轉譯區域(untranslated regions)。該「控制序列」一詞係意於包括，至少，所有其存在係為表現或進行所必須的物件，且亦可包括其存在係為有助益的額外的物件，例如：領導序列及融合fusion partner sequences.

此處所意指之該「聚核苷酸」一詞係意謂一具有一至少10個鹼基長度之核苷酸的聚合形式，不論是核糖核酸或是去氧核糖核酸或是任一類型核苷酸之經改質的形式，或是RNA－DNA之雜交雙股。該用詞包括單股及雙股形式的DNA。

此處所意指之該「寡核苷酸」一詞係包括藉由自然存在及非自然存在之鏈結而連接在一起之自然存在的及經改質的核苷酸。寡核苷酸係一般包含有200或更少鹼基長度之聚核苷酸的子集合。較佳地，寡核苷酸係10－60鹼基長度且更佳地係12、13、14、15、16、17、18、19或20－40鹼基長度。寡核苷酸通常係單股的，例如：用於探針；雖然寡核苷酸可能係雙股的，例如：用於建構一基因突變體。寡核苷酸可為正義或反義寡核苷酸。

此處所意指之「自然存在之核苷酸」一詞係包括去氧核糖核酸及核糖核酸。此處所意指之「經改質之核苷酸」一詞係包括具有經改質或是經取代之糖基團等等之核苷酸。此處所意指之「寡核苷酸鍵結」一詞係包括如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、磷醯胺酸酯等的寡核苷酸鏈結。參考如LaPlanche et al.Nucl.Acids Res.14：9081(1986)；Stec et al.J.Am.Chem.Soc.106：6077(1984)；Stein et al.Nucl.Acids Res.16：3209(1988)；Zon et al.Anti－Cancer Drug Design 6：539(1991)；Zon et al.Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach,pp.87－108(F.Eckstein,Ed.,Oxford University Press,Oxford England(1991))；Stec等人的美國第5,151,510號專利；Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90：543(1990)，該等之揭露係併入於此作為參考。一寡核苷酸在所欲之情形下可包括一用於偵測之標記。

此處所意指之「選擇性雜交」係意指可偵測地及特定地結合。聚核苷酸、寡核苷酸及其片段在雜交及降低可察覺到之和非特定核酸之可偵測結合的清洗條件下選擇性地雜交至核酸股。如該領域所習知或是其中所討論的，可利用高嚴苛條件以達到選擇性雜交狀態。一般而言，在聚核苷酸、寡核苷酸或是抗體片段和一有興趣之核酸序列之間該核酸序列的相似性將至少係80%，而更代表性地較佳地增加相似性為至少85%,90%,95%,99%,及100%。

該「CDR區域」或是「CDR」一詞係意於指明免疫球蛋白之重鏈及輕鏈上高度變化的區域，如Kabat等人1991(Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版。US Department of Health and Human Services,Public Service,NIH,Washington)以及其之後的再版所界定者。一抗體典型地含有3個重鏈CDRs及3個輕鏈CDRs。該用語CDR或是CDRs在此處係用於指明，依據該實例，這些區域之一或是這些區域之數者，甚至是全部，含有大多數胺基酸殘基負責於以抗體之親和力結合於抗原或是其所辨識之抗原決定部位。

該重鏈之第三CDR(HCDR3)具有較大之尺寸變化(較多之變異性本質上係來自於產生其之基因的排列機制)。其可能短如2個胺基酸，雖然已知最長的尺寸為26。CDR長度也可能依據可被獨特之基本架構所容納之長度而改變。功能上而論，HCDR3在決定該抗體之特異性方面扮演了部份的角色(Segal et al.,PNAS,71：4298－4302,1974,Amit et al.,Science,233：747－753,1986,Chothia et al.,J.Mol.Biol.,196：901－917,1987,Chothia et al.,Nature,342：877－883,1989,Caton et al.,J.Immunol.,144：1965－1968,1990,Sharon et al.,PNAS,87：4814－4817,1990,Sharon et al.,J.Immunol.,144：4863－4869,1990,Kabat et al.,J.Immunol.,147：1709－1719,1991)。

此處所指之「CDRs組」一詞包含CDR1、CDR2及CDR3。因此，一組HCDRs係意指HCDR1、HCDR2及HCDR3，且一組LCDRs係意指LCDR1、LCDR2及LCDR3。除非另有陳述，一「CDRs組」包括HCDRs及LCDRs。

二胺基酸序列係「相似的(homologous)」，若其序列之間存有部份或是完全地相同性。例如，85%的相似表示當該二序列係調整為最高度比對時有85%的胺基酸係相同的。缺口(在該二經比對之序列之中的其一)在最高度比對時係允許的；缺口長度在5或更少係較佳的，在2或更少係更佳的。可擇地或是較佳地，二蛋白質序列(或是衍生自其之具至少30個胺基酸長度的多胜肽序列)係相似的，當該詞在此處使用時，若使用具有突變資料矩陣及一缺口扣分為6或更多之ALIGN程式時其具有一多於5之比對積分(以標準偏差單位)。參考Dayhoff,M.O.,在Atlas of Protein Sequence and Structure,pp.101－110(第5冊,National Biomedical Research Foundation(1972))及此冊之補充刊物2,pp.1－10。該二序列或其部份更佳係相似的，若其胺基酸有50%或更高的相同度，在其係使用ALIGN程式作最佳比對時。該被了解的是，在二直系同源序列中可有具相似性之不同區域。例如，在鼠類或人類直系同源之功能部位比非功能部位可具有較高程度的相似性。

此處所用之「相當於」一詞係意指一聚核苷酸序列係完全或部份相似於(亦即是，相同於，並非完全係演化相關的)一參考聚核苷酸，或是一多胜肽序列係相同一參考多胜肽序列。

相對地，此處所用之「互補於」一詞係意指該互補序列係完全或部份相似於一參考聚核苷酸序列。用以說明的是，該核苷酸序列「TATAC」係相當於一參考序列「TATAC」且係互補於一參考序列「GTATA」。

關於一序列之「序列相同性」或「相同性」一詞係係代表二聚核苷酸或胺基酸序列在一比較視窗之上係相同的(也就是，在一核苷酸對核苷酸或殘基對殘基的基礎上)。「序列相同性之比例」一詞係藉由在一比較視窗之上比較二經最佳比對之序列而計算，判斷在二序列中發生相同核酸鹼基(例如：A,T,C,G,U,或I)或是胺基酸殘基的位置數目以產生相配的位置數目，將相配的位置數目除以在一比較視窗中之總數目(也就是，該視窗尺寸大小)，且將該結果乘以100而產生序列相同性之比例。此處所用之「實質上相同」一詞係表示一聚核苷酸或胺基酸序列之特徵，其中該聚核苷酸或胺基酸包含一至少85%序列相同性之序列，較佳係至少90至95%序列相同性，更佳係至少99%之序列相同性，當在一至少有18個核苷酸(6個胺基酸)位置的比較視窗之上相較於一參考序列時，常常是在一至少有24－48個核苷酸(8－16個胺基酸)位置的比較視窗之上，其中序列相同性之比例係藉由在比較視窗之上將參考序列和該包括總共為參考序列之20%或更少之刪除及附加的序列相比較。該參考序列可為一較大序列的次群組。

如此處所使用的，該等20個慣用之胺基酸及其縮寫係跟隨慣用的用法。參考免疫學－一綜合體(Immunology－A Synthesis)(第2版,E.S.Golub及D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其係併入此以作為參考文獻。該等20個慣用胺基酸之立體異構物(例如，D－型胺基酸)、非天然的胺基酸，如：α－,α－雙重取代胺基酸、N－烷基胺基酸、乳酸及其它非慣用之胺基酸也係適用於本發明之多胜肽的成份。非慣用之胺基酸的範例包括：4－羥基脯胺酸、γ－羧基麩胺酸、ε－N,N,N－三甲基離胺酸、ε－N－乙醯基離胺酸、O－磷絲胺酸、N－乙醯基絲胺酸、N－甲醯基甲硫胺酸、3－甲基組織胺酸、5－羥基離胺酸、σ－N－甲基精胺酸以及其它相似之胺基酸及亞胺酸(例如：4－羥基脯胺酸)。在此處所使用之多胜肽標示法中，該左手方向係該胺基端方向且該右手方向係該羧基端方向，依據標準用法及慣用的原則。

相同地，除非特別有指明，否則單股聚核苷酸序列之左手端係該5’－端；雙股聚核苷酸序列之左手方向係意指該5’－方向。由5’至3’的方向添加新生RNA轉錄體係意指為轉錄方向；DNA股上具有相同於RNA且係為RNA轉錄體之5’至5’端之序列區域稱為「上游序列」，DNA股上具有相同於RNA且係為RNA轉錄體之3’至3’端之序列區域稱為「下游序列」。

當適用於多胜肽，該「實質相同性」一詞係意指二胜肽序列，在最佳化對齊時，例如係藉由使用缺陷缺口比重之GAP或BESTFIT程式，共有至少80%的序列相同性，較佳係至少90%序列相同性，更佳係至少95%序列相同性，且最佳係至少99%序列相同性。較佳地，不相同的殘基位置係由保留性胺基酸取代而不同。保留性胺基酸取代係意指具有相似側鏈之殘基的可交換性。例如，一群具有脂肪族側鏈之胺基酸係甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；一群具有脂肪族－氫氧根側鏈之胺基酸係絲胺酸及酥胺酸；一群具有含胺基側鏈之胺基酸係醯胺天門冬胺酸鹽及麩醯胺酸；一群具有芳香族側鏈之胺基酸係苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；一群具有鹼基側鏈之胺基酸係離胺酸、精胺酸及組織胺酸；以及一群具有含硫側鏈之胺基酸係半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳之保留性胺基酸取代群組係：纈胺酸－白胺酸－異白胺酸，苯丙胺酸－酪胺酸，離胺酸－精胺酸，丙胺酸－纈胺酸，麩胺酸－天門冬胺酸以及天門冬醯胺酸鹽－麩醯胺酸。

如此處所討論的，在抗體或免疫球蛋白分子的胺基酸序列中些微的變化係被預期為包含在本發明之中，設若該胺基酸序列的變化對於此處所述之抗體或免疫球蛋白分子係維持至少75%，更佳係至少80%、90%或95%，且最佳係99%的序列相同性。特定地，保留性胺基酸置換係可預期的。保留性置換係那些發生在具有相關側鏈之胺基酸家族之中。基因上經譯碼的胺基酸一般係分為數個家族：(1)酸性的＝天門冬胺酸、麩胺酸；(2)鹼性的＝離胺酸、精胺酸、組織胺酸；(3)非極性的＝丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；以及(4)非帶電極性＝甘胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸。更佳之家族係：絲胺酸及酥胺酸係一脂肪族－氫氧基家族；天門冬醯胺酸及麩醯胺酸係含胺基之家族；丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸係一脂肪族家族；且苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸係一芳族家族。舉例來說，可合理地預期以異白胺酸或纈胺酸獨立置換掉白胺酸；以麩胺酸獨立置換掉天門冬胺酸；以絲胺酸獨立置換掉酥胺酸的或是以一結構上相關的胺基對一胺基酸進行相似置換將不會對獲得的分子造成結合功能或性質上的影響，特別是該置換不涉及在骨架位置內的胺基酸時。可藉由檢測該多胜肽衍生物的特異活性而輕易地測定一胺基酸改變是否產生一功能性肽。在此處將詳述其檢測方法。本領域之習於此技術者可輕易地製備該抗體或免疫球蛋白分子的片斷或類似物。片斷或類似物的較佳胺基－和羧基－端出現於靠近功能功能區的邊界。藉由將核苷酸及/或胺基酸序列資料與公共或專屬序列資料庫比較可鑑定出其構造和功能功能區。較佳地，電腦化比較法係被用於鑑定出現在其他具已知構造及/或功能之蛋白質的序列基序(motif)或經預測之蛋白質的構形功能區。已知用於鑑定被折疊成一已知之3D立體結構之蛋白質序列的方法。Bowie等人，(1991)Science 253：164的文章。因此，前述的說明實例教示的是熟習本技術者依據此處所揭露之抗體可辨識出可被用於界定構造和功能功能區的序列基序和構造構形。

較佳的胺基酸取代為那些：(1)降低對蛋白質水解的敏感性；(2)降低對氧化作用的敏感性；(3)改變形成蛋白複合物的結合親和力；(4)改變結合親和力；以及(5)賦予或修改此類類似物的其他物理化學或功能性質。類似物可包括(除了自然存在之胜肽序列之外)之一序列的各種突變體(muteins)。例如，可在一自然存在序列內(較佳為在形成分子間接觸之多胜肽功能區外的部分)進行單一或多重胺基酸取代(較佳為保留性胺基酸取代)。一保留性胺基酸取代必需在實質上不改變其親代序列的結構特徵(例如，一置換胺基酸必需不傾向於打斷出現於親代序列的螺旋結構，或分裂作為親代序列特徵之次級構造的其他類型)。技術可辨識多胜肽次級和三級結構的實例係描述於Proteins,Structures and Molecular Principles一書(Creighton,Ed.,W.H.Freeman and Company，紐約(1984))；Introduction to Protein Structure一書(C.Branden and J.Tooze,eds.,Garland Publishing，紐約，紐約州(1991))；以及Thornton等人，Nature 354：105(1991)，將其各併入於此以供參考。

可藉由序列變化或突變以及篩選具所欲特性之抗原致標的方法獲得本發明之VH和VL功能區以及CDRs的變體，其包括那些具有於此處提出之胺基酸序列以及其可被運用於針對PDGFR－α之致標性藥劑和抗體者。所欲之特性的實例包括，但並不侷限於：相對已知具抗原特異性之抗體增加對抗原的結合親和力；相對已知具抗原特異性之抗體若已知其活性時增加其對抗原活性的中和作用；在一特定莫耳比例下與對抗該抗原之一已知抗體或配體相比具有特異性的競爭能力；使配體－受體複合物進行免疫沈澱的能力；結合至一特異性抗原決定部位的能力；線性的抗原決定部位，例如：利用胜肽掃描所鑑定之胜肽序列，例如：利用在線性及/或受約束之構形下經篩檢之胜肽；藉由非連續殘基所形成之構形性抗原決定部位；調節PDGFR－α或下游分子之新生物活性的能力；結合及/或中和及/或任何其它所欲特性之能力。

所需用於在CDRs之胺基酸序列中、抗體VH或VL功能區中及抗原結合位置中進行取代之技術在此技藝中係可利用的。此處所揭示的抗體分子變體係可於本發明中製造及利用。接續著運用多元數據分析技術於結構/性質－活性關係(Wold等人,Multivariate data analysis in chemistry.Chemometrics－Mathematics and Statistics in Chemistry(B.Ko walski編輯)，D.Reidel出版公司，荷蘭Dordrecht市，1984)之計量化學的引導下，可利用習知數學技術衍生出抗體的定量性活性－性質間的關係，該習知數學技術係如：統計迴歸、圖樣辨認和分類之技術(Norman等人,Applied Regression Analysis，Wiley－Interscience， 第三版(1998年4月)；Kandel,Abraham & Backer,Eric.，Computer－Assisted Reasoning in Cluster Analysis，Prentice Hall PTR,(1995年5月11日)；Krzanowski,Wojtek,Principles of Multivariate Analysis：A User’s Perspective(Oxford Statistical Science Series第22號(文件),Oxford University Press(2000年12月)；Witten,Ian H.& Frank,Eibe，Data Mining：Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations，Morgan Kaufmann(1999年10月11日)；Denison David G.T.(編輯),Christopher C.Holmes,Bani K.Mallick,Adrian F.M.Smith.Bayesian，Methods for Nonlinear Classification and Regression(Wiley Series in Probability and Statistics)，John Wiley & Sons(2002年7月)；Ghose,Arup K.& Viswanadhan,Vellarkad N.，Combinatorial Library Design and Evaluation Principles,Software,Tools,and Applications in Drug Discovery)。抗體的性質可衍生自抗體序列、功能性和3D立體結構的經驗性和理論性模式(例如，分析可能的接觸殘基或經計算出之物理化學性質)且這些性質可被視為單一的和組合性的。

由一VH功能區和一VL功能區所構成的抗體抗原結合位置典型係由六環多胜肽所組成：三個來自輕鏈可變功能區(VL)及三個來自重鏈可變功能區(VH)。已知原子構造的抗體分析可說明抗體結合位置之序列和3D立體結構間的關係。這些關係意味著除了VH功能區內的該第三區域(環)之外，結合部位環具有一為小數目的主鏈構形：標準結構。該形成於一特定環內的標準結構已被顯示為被決定於其大小及在二環內和在骨架區內之關鍵位置某些殘基的出現。

此序列－結構關係的研究可被用於預測在一已知序列但卻是未知3D立體結構之抗體內的那些在使其CDR環維持立體結構而因此維持其結合專一性上極為重要的殘基。可藉由將該等預測與得自於先導最佳化試驗的輸出資料相比較而支援這些預測。在一結構性策略中，利用任何可免費取得或市售的軟體如WAM即可創造該抗體分子的模型。然後可利用蛋白質具象化和分析軟體套件，例如Insight II(Accelrys公司)或Deep View，以評估在CDR內各位置可能的取代。然後可利用此資訊以製造對活性具最小影響或最佳效應或是授予其它所欲之特性的取代。

此處所使用之「多胜肽片斷」一詞係意指具有胺基端及/或羧基端刪除但其餘之胺基酸序列係與演譯自例如一全長cDNA序列之自然存在序列內之相對應位置上相同的一多胜肽。片斷係通常具有至少約5、6、8或10個胺基酸長度，較佳為至少約14個胺基酸長度，更佳為至少約20個胺基酸長度，其通常為至少約50個胺基酸長度，以及甚至更佳為具有至少約70個胺基酸長度。此處所使用之「類似物」一詞係意指包含至少約25個胺基酸之部份的多胜肽，其與一演譯胺基酸序列的一部分係實質上相同的以及具有至少一種下列的性質：(1)在適當的結合條件下，可特異性地結合至PDGFR－α；(2)抑止PDGF－AA結合的能力；(3)抑止PDGF－AB結合的能力；；(4)抑止PDGF－BB結合的能力；及/或(5)抑止PDGF－CC結合的能力。典型地，多胜肽類似物對於自然存在序列而言包含一保留性胺基酸取代(或添加或刪除)。類似物一般為至少20個胺基酸長度，較佳為至少50個胺基酸長度或更長，以及通常可長至如一自然存在之多胜肽的全長。

胜肽類似物通常在製藥工業中使用為具有類似於該等模板胜肽(template peptide)之性質的非胜肽藥物。這些類型的非胜肽化合物被稱為「擬胜肽(peptidemimetics)」或「肽模擬分子(peptidomimetics)」。Fauchere,J.Adv.Drug Res. 15：29(1986)；Veber和Freidinger,TINS第392頁(1985)；以及Evans等人,J.Med.Chem. 30：1229(1987)等將併入於此以供參考。此類化合物通常係藉助於電腦化分子模型而發展出來。構造上類似於治療用胜肽的擬肽可被用於產生一等效性治療或預防效應。通常，胜肽模擬分子在構造上類似於一範例多胜肽(亦即是，具有一生化性質或藥理活性的多胜肽)，例如人類抗體，但具有選擇性地被選自於下列鍵結所構成之群組之鍵結藉由習知技術中已知之方法所取代的一或多個肽鍵結：－CH₂ NH－、－CH₂ S－、－CH₂ －CH₂ －、－CH＝CH－(順和反式)、－COCH₂ －、－CH(OH)CH₂ －和－CH₂ SO－。以相同類型的D－型胺基酸(例如，D－離胺酸代替L－離胺酸)系統性地取代共有序列中的一或多個胺基酸可被用於產生更穩定的胜肽。此外，藉由技術上習知的方法可產生一包含有共有序列或實質上相同之共有序列變異的受約束胜肽(Rizo和Gierasch,Ann.Rev.Biochem. 61：387(1992),併入於此以供參考)；例如，藉由加入能形成分子內雙硫鍵(disulfide bridges)之內部半胱胺酸殘基以環化該多胜肽。

如此處所使用的，「抗體」一詞係意指包含有至少一由多胜肽鏈之折疊所組成之結合功能區之一多胜肽或是一群多胜肽，該結合功能區具有帶有與一抗原之抗原決定部位特性互補的內部表面形狀及電荷分佈的3D立體結合空間。一抗體一般具有四聚體之形式，其包含兩對相同之多胜肽鏈，各對具有一「輕」和一「重」鏈。各輕/重鏈對的可變區形成一抗體結合位置。

如此處所使用的，「致標性結合劑」係一結合至一標的位置的藥劑，例如：一抗體或其結合片斷。在一實施態樣中，該致標性結合劑僅對一標的位置具有專一性。在其他實施態樣中，該致標性結合劑係對多於一個以上的標的位置具有專一性。在一實施態樣中，該致標性結合劑可為一單株抗體及該標的位置可為一抗原決定部位。如下所述，一致標性結合劑可包含至少一抗體的抗原結合功能區(例如：CDR)，其中該功能區係被融合或包含於一異源蛋白質骨架內，例如：一非抗體之蛋白質骨架。

藉由重組DNA技術或藉由完整抗體的酵素或化學切割製造一抗體的「結合片斷」。結合片斷包括Fab、Fab’、F(ab’)₂ 、Fv、dAb和單鏈抗體。除了「雙特異性」或「雙功能性」抗體之外的一抗體係被了解為各具有其相同的結合位置。當一過量之抗體降低結合至反受體(counter receptor)之受體的數目至少約20%、40%、60%或80%及通常係大於約85%(由在一體外競爭性結合試驗中所測定者)時，一抗體係實質上抑制受體至反受體的黏附。

一抗體可為一寡株抗體、多株抗體、單株抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、催化性抗體、嵌合抗體、人類化抗體、完全人類抗體、抗－抗原特異性抗體(anti－idiotypic antibody)和於可溶或結合形式中之經標示的抗體以及其片斷、其變異株或衍生物，其可單獨或和其他藉由已知技術所提供之胺基酸序列結合。一抗體可源自任何的品種。該抗體一詞亦包括本發明抗體的結合片斷；舉例性的片斷包括Fv、Fab、Fab’、單股抗體(svFC)、二聚體化可變區(Diabody雙聯體)以及雙硫鍵穩定化可變區(dsFv)。

已顯示的是，一全抗體的片斷可執行結合抗原的功能。結合片斷的實例為(i)由VL、VH和CH1功能區所組成的Fab片斷(Ward,E.S.等人(1989)Nature ,341：544~546)；(ii)由VH和CH1功能區所組成的Fd片斷(McCafferty等人(1990)Nature ,348：552~554)；(iii)由單一抗體之VL和VH功能區所組成的Fv片斷(Holt等人(2003)Trends in Biotechnology 21：484~490)；(iv)由一VH或一VL功能區所組成的dAb片斷(Ward,E.S.等人,Nature,341：544~546(1989)；McCafferty等人(1990)Nature 348：552~554；Holt等人(2003)Trends in Biotechnology 21：484~490)；(v)經分離的CDR區域；(vi)F(ab’)₂ 片斷，包含兩個經鏈接的Fab片斷的雙價片斷；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中一VH功能區和一VL功能區係藉由一胜肽連接子相連接而容許該兩個功能區聯合而形成一抗原結合位置(Bird等人(1988)Science ,242：423~426；Huston等人(1988)PNAS USA 85：5879~5883)；(viii)雙特異性單鏈Fv二聚物(PCT/US92/09965)；以及(ix)由基因融合所構建的「雙聯體」、多價或多特異性片斷(WO94/13804；Holliger,P.(1993)等人,Proc.Natl.Acad.Sci. 美國90 6444~6448)。可藉由併入鏈接VH和VL功能區的雙硫鍵而穩定化Fv、scFv或雙聯體分子(Reiter,Y.等人,Nature Biotech. ,14：1239~1245(1996))。亦可製造微型抗體(minibodies)，其包含一結合至一CH3功能區的scFv(Hu,S.等人(1996)Cancer Res. 56：3055~3061)。結合片斷的其他實例為Fab’，其不同於Fab片斷之處在於在該重鏈CH1功能區的羧基端加入少數殘基，包括來自抗體絞鏈區的一或多個半胱胺酸；以及Fab’－SH，其為一在該恒定功能區的半胱胺酸殘基具有一游離硫醇基的Fab’片斷。

該「抗原決定部位(epitope)」一詞包括能特異性地結合至一免疫球蛋白或T－細胞受體的任何蛋白質決定簇(determinant)。抗原決定性簇通常由分子的化學活性表面簇所組成，例如：胺基酸或糖側鏈且可以但並非經常具有特異性3D立體構造特性以及特異性電荷特性。當一抗體的解離常數≦1μM時則視為可特異性地結合一抗原，較佳為≦100 nM以及最佳為≦10 nM。

此處所使用之「藥劑」一詞係指明一化學化合物、化學化合物的混合物、生物性巨分子，或是一從生物材料而製的萃取物。

有關PDGFR－α多胜肽之「活性的」或「活性」一詞係意指一部分的PDGFR－α多胜肽具有一原始PDGFR－α多胜肽的生物學或免疫活性。當此處使用時，「生物學上」一詞係意指導因於原始PDGFR－α多胜肽之活性的生物學功能。較佳的PDGFR－α之生物學活性包括，例如：自體磷酸化反應。

此處所使用之「哺乳動物」一詞係意指任何可被視為一哺乳類的動物。較佳的哺乳動物為人類。

以酵素、木瓜酵素消化抗體所產生之兩種相同的抗原結合片斷，亦稱為「Fab」片斷；以及一「Fc」片斷為不具有抗原結合活性但具有結晶的能力。以酵素、胃蛋白酶消化抗體可產生F(ab’)₂ 片斷，其中該抗體分子的雙臂維持相連接及包含兩個抗原結合位置。該F(ab’)₂ 片斷具有交聯抗原的能力。

此處所使用之「Fv」一詞係意指保留有抗原辨識和抗原結合位置之抗體的最小片斷。

此處所使用之「Fab」一詞係意指包含有輕鏈之恒定區及重鏈之CH1功能區的一抗體片斷。

一「dAb」係一單一功能區抗體且包含有一抗體重鏈之變化功能區(VH功能區)或是一抗體輕鏈之變化功能區(VL功能區)。各dAb包含6個自然存在之CDRs中的3個(Ward等人,Binding activities of a repertoire of single immdnoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli.Nature 341,544－546(1989)；Holt等人,domain antibodies：protein for therapy,Trends Biotechnol. 21,484－49(2003))。具有在11－15 kDa範圍內之分子量，其係4倍小於一抗原結合片段(Fab)₂ 且係一單一鏈Fv(scFv)分子的一半尺寸。

「mAb」一詞係意指單株抗體。

此處所使用之「微脂體」一詞係意指可被用於輸送藥物至哺乳動物的小囊胞，該藥物係包括本發明的PDGFR－α多胜肽或是針對此一PDGFR－α多胜肽的抗體。

此處所使用之「標記」或「經標示」一詞係意指將一可偵測部份添加至一多胜肽，例如：放射性標記、螢光標記、酵素性標記、化學發光標示或生物素標記。放射性同位素或放射性核素係包括³ H、¹⁴ C、¹⁵ N、³⁵ S、⁹⁰ Y、⁹⁹ Tc、¹¹¹ In、¹²⁵ I、¹³¹ I；螢光標記包括羅丹明(rhodamine)、鑭系磷光體或FITC；以及酵素性標記包括辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)、β－半乳糖苷酶、螢光素酶(luciferase)、鹼性磷酸酶。

供說明之用，但不侷限於，其他標記係包括：酵素，例如：葡萄糖－6－磷酸去氫酶(G6PDH)、α－D－半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖澱粉酶、碳酸酐酶、乙醯膽鹼酯酶、溶菌酶、蘋果酸酯脫氫酶和過氧化酶；染料；其他的螢光標記或螢光劑包括例如：螢光素(fluorescein)和其衍生物、螢光染料、GFP(GFP指「綠色螢光蛋白質」)、丹磺醯(dansyl)、傘形花內酯(umbelliferone)、藻紅蛋白(phycoerythrin)、藻藍素(phycocyanin)、別藻藍素(allophycocyanin)、鄰酞醛和螢胺(fluorescamine)；螢光體(fluorophores)，例如：鑭系穴合物和螯合物如銪(Europium)等(Perkin Elmer和Cis Biointernational)；化學發光標記或化學發光劑例如：異魯米諾(isoluminol)、魯米諾(luminol)和二氧烷酮(dioxetanes)；敏化劑；輔酶；酶作用物；顆粒，如乳膠或碳粒；金屬溶膠；微晶(crystallite)；微脂體；細胞等；其可進一步被染料、催化劑或其他可偵測基團所標示；分子，例如：生物素、毛地黃配體(digoxygenin)或5－溴化去氧尿－；毒素部份，舉例如一選自以下群組之毒素部份：假單胞菌外毒素(綠膿桿菌外毒素(PE)或細胞毒殺性片斷或其突變株)、白喉毒素或細胞毒殺性片斷或其突變株、肉毒桿菌毒素A、B、C、D、E或F、菎麻毒素(ricin)或其細胞毒殺性片斷，例如菎麻毒素A、相思豆毒素(abrin)或其細胞毒殺性片斷、皂草毒素(saporin)或其細胞毒殺性片斷、美洲商陸(pokeweed)抗病毒毒素或其細胞毒殺性片斷以及瀉根毒素1(bryodin 1)或其細胞毒殺性片斷。

此處所使用之「藥劑或藥物」一詞係意指當適當投藥至一病患時可誘發一所欲治療效應的一化學化合物或組成物。此處所使用的其他化學名詞係根據該技術領域中習知的用法，其說明於The McGraw－Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker,S.,Ed.,McGraw－Hill,San Francisco(1985))，將其併入於此以供參考。

如此處所使用的，「實質上為純的」一詞係表示標的物種係存在的主要物種(亦即是，在莫耳基礎上其係較組成物內任何其他個別物種更為多量的)，以及實質上經純化的部份較佳係為一組成物，其中該標的物種包含所存在之全部巨分子物種之至少約50%(在莫耳基礎上)。通常，一實質上為純的組成物將包含多於約80%之該組成物內存在的全部巨分子物種，更佳為多於約85%、90%和99%。最佳地，該標的物種為經純化至本質上同質的程度(藉由習知的偵測方法無法偵測出在該組成物內污染的物種)，其中該組成物本質上由單一巨分子物種所組成。

「抗體依賴性細胞媒介之細胞毒殺作用(antibody－dependent cell－mediated cytotoxicity)」及「ADCC」係意指一細胞媒介之反應，其中表現Ig Fc受體(FcRs)之非特異性細胞毒殺性細胞(例如：自然殺手細胞(NK cell)、單核細胞、噬中性白血球及巨噬細胞)辨識出結合在一標的細胞上之抗體且接著引起該標的細胞的溶胞作用。用於媒介ADCC之主要細胞，自然殺手細胞，只表現Fc讪RIII，而單核細胞則表現Fc讪RI、Fc讪RII及Fc讪RIII。在造血細胞上之FcRs表現係概述於Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457－92(1991)的第464頁第3表中。為評估一有興趣之分子的ADCC活性，可執行一活體外ADCC測試，舉例如美國第5,500,362或5,821,337號專利中所述的。用於此測試之可利用的效應物包括週邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手細胞(NK cell)。可擇地或是額外地，一有興趣之分子的ADCC活性可在活體內評估，例如：在一如Clynes等人PNAS (USA)95：652－656(1988)中所揭露之動物模式。

「補體依賴性細胞毒殺作用(complementary－dependent cytotoxicity)」及「CDC」係意指一藉由抗體執行其細胞毒殺功能之機制。其係由C1q結合至Igs、IgG或IgM Fc功能區而啟始，C1q係補體之第一成份的組成，該等Igs、IgG或IgM係和抗原形成複合體(Hughs－Jones,N.C.,及B.Gardner.1979.Mol.Immunol. 16：697)。C1q係一為~410 kDa之大型、結構上複合性醣蛋白以70 μg/ml之濃度存在於人類血清中(Cooper,N.R.1985.Adv.Immunol. 37：151)。C1q和二絲胺酸蛋白質水解酶，C1r及C1s，一起形成複合物C1，補體的第一成份。C1q之至少二N－端球狀前端必須結合至Igs的Fc以活化該C1，藉此啟始該補體串聯(Cooper,N.R.1985.Adv.Immunol. 37：151)。

「全血測試」係使用未分份之血液作為自然效應物之來源。血液中包含補體於血漿中，連同FcR－表現之細胞性效應物，例如：多形核細胞(PMNs)及單核球細胞(MNCs)。因此，全血測試允許在活體外同時評估ADCC及CDC效應物機制的協同反應。

「病患」一詞係包括人類和獸醫實體。

如此處所使用之「及/或」一詞係用於特定揭示二特定之特徵或組成中之各者具有或不具有另一者。例如：「A及/或B」係用作特定揭示為(i)A、(ii)B以及(iii)A及B，如同各者係在此處個別被提出一樣。

抗體之結構

基本的抗體結構單元係已知為包含一四聚體。各四聚體係包含二對相同之多胜肽鏈，各對具有一「輕鏈」(約25 kDa)以及一「重鏈」(約50－70 kDa)。各鏈之胺基端部份包括一約100至110或更多胺基酸之可變區，其主要係負責於抗原的辨識。各鏈之羧基端部份界定一恒定區，其主要係負責於效應物功能。人類輕鏈係分類為(kappa)輕鏈及λ(lambda)輕鏈。重鏈係分類為μ(mu)、σ(delta)、γ(gamma)、α(alpha)或是ε(epsilon)，且係分別界定該抗體的類型如：IgM、IgD、IgA及IgE。在輕及重鏈內，該可變區及恒定區係藉由一由約12個或更多胺基酸所構成之「J」區而連接，加上重鏈也包括一由約10個或更多胺基酸所構成之「D」區。一般係參考Fundamental Immunology 第七章(Paul,W.,編，第二版，Raven Press，N.Y.(1989))(整體併入以作為各種用途之參考)。各輕/重鏈對之可變區形成該抗體結合位置。

因此，一完整的抗體具有二結合位置。除了在雙功能或雙特異性抗體中，該二結合位置是相同的。該等鏈全部呈現由三個高度可變區(hyper variable regions)所結連之相對保留性骨架區域(FR)之相同的一般結構，也稱為互補決定區域或CDR。由各對之二鏈而來的CDRs係由該骨架區域而比對，使能結合至一特定之抗原決定部位。自N－端至C－端，輕鏈及重鏈兩者皆包含功能區FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。係依據Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,馬里蘭(1987及1991))或是Chothia & Lesk J.Mol.Biol. 196：901－917(1987)；Chothi等人，Nature 342：878－883(1989)之定義而分配胺基酸至各功能區。

一雙特異性或雙功能抗體係一具有二不同重/輕鏈對以及二不同結合位置之人造合成抗體。雙特異性抗體可藉由各種不同之方法製造，包括：融合瘤的融合或是連結Fab’片段。參考如Songsivilai & LachmannClin.Exp.Immunol. 79：315－321(1990),Kostelny等人J.Immunol. 148：1547－1553(1992)。雙特異性抗體不以具有一單一結合位置之片段的形式(例如：Fab、Fab’及Fv)。

典型地，一VH功能區係和一VL功能區配對以提供一抗原結合位置予一抗體，雖然一VH或VL功能區單獨也可使用於結合抗原。該VH功能區(參考第12表)可和該VL功能區(參考第13表)配對，俾使一抗體之抗原結合位置形成為具有VH及VL功能區兩者。

人類抗體及抗體的人類化

人類抗體可避免某些與具有小鼠或大鼠可變及/或恒定區之抗體有關的一些問題。此類小鼠或大鼠衍生蛋白質的存在可導致該抗體迅速被清除或可導致病患產生對抗該抗體的免疫反應。為了避免使用小鼠或大鼠衍生抗體，可藉由引入功能性人類抗體基因座至一嚙齒動物、其他哺乳類或動物而使該嚙齒動物、其他哺乳類或動物產生完全人類抗體。

一種產生完全人類抗體的方法係經由利用XenoMouse品系小鼠，該小鼠已經工程處理為含有高至但小於1000kb大小之人類重鏈基因座和輕鏈基因座的胚源經配置片斷。請參考Mendez等人,Nature Genetics ,15：146~156(1997)及Green和Jakobovits,J.Exp.Med. 188：483~495(1998)。該XenoMouse品系可自Amgen公司(加州Fremont市)購得。

XenoMouse品系小白鼠的製造係進一步在以下文獻中討論和說明：於1990年1月12日提出的美國專利申請序號07/466,008、1990年11月8日提出的07/610,515、1992年7月24日提出的07/919,297、1992年7月30日提出的07/922,649、1993年3月15日提出的08/031,801、1993年8月27日提出的08/112,848、1994年4月28日提出的08/234,145、1995年1月20日提出的08/376,279、1995年4月27日提出的08/430,938、1995年6月5日提出的08/464,584、1995年6月5日提出的08/464,582、1995年6月5日提出的08/463,191、1995年6月5日提出的08/462,837、1995年6月5日提出的08/486,853、1995年6月5日提出的08/486,857、1995年6月5日提出的08/486,859、1995年6月5日提出的08/462,513、1996年10月2日提出的08/724,752、1996年12月3日提出的08/759,620、2001年11月30日申請的美國專利公開案2003/0093820和美國專利第6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598號以及日本專利第3 068 180 B2、3 068 506 B2和3 068 507 B2號。亦請參考公告於1996年6月12日的歐洲專利案EP 0 463 151 B1、公告於1994年2月3日的國際專利申請案WO 94/02602、公告於1996年10月31日的國際專利申請案WO 96/34096、公告於1998年6月11日的WO 98/24893、公告於2000年12月21日的WO 00/76310。上述所引證的各專利、申請案和參考資料之揭露內容係併入於此以供參照。

在一可替換的方法中，包括GenPharm國際公司，其它人已運用一「微小基因座」之技術。在微小基因座技術中，透過包合來自該Ig基因座的片段(個別基因)而模擬一外源性Ig基因座。因此，一或多個V_H 基因、一或多個D_H 基因、一或多個J_H 基因、一mu恒定區，以及通常一第二恒定區(較佳為一γ恒定區)係形成為一用於插入動物內的構體。此方法係述於屬於Surani等人的美國專利案5,545,807，以及分別屬於Lonberg和Kay的美國專利案5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299以及6,255,458、屬於Krimpenfort和Berns的美國專利案5,591,669和6,023,010、屬於Berns等人的美國專利案5,612,205、5,721,367和5,789,215，以及屬於Choi和Dunn的美國專利案5,643,763，以及GenPharm於1990年8月29日提出的國際美國專利申請序號07/574,748、1990年8月31日提出的07/575,962、1991年12月17日提出的07/810,279、1992年3月18日提出的07/853,408、1992年6月23日提出的07/904,068、1992年12月16日提出的07/990,860、1993年4月26日提出的08/053,131、1993年7月22日提出的08/096,762、1993年11月18日提出的08/155,301、1993年12月3日提出的08/161,739、1993年12月10日提出的08/165,699、1994年3月9日提出的08/209,741，將其等之揭露內容併入於此以供參照。亦請參考歐洲專利案0 546 073 B1、國際專利申請案WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852，及WO 98/24884和美國專利案5,981,175，將其等之揭露內容完整併入於此以供參照。進一步請參考Taylor等人,1992、Chen等人,1993、Tuaillon等人,1993、Choi等人,1993、Lonberg等人,1994、Taylor等人,1994和Tuaillon等人,1995、Fishwild等人,1996，將其等之揭露內容完整併入於此以供參照。

Kirin亦已證明可從小鼠產生人類抗體，其中係經由微細胞融合法將大片段染色體或全部染色體引入小鼠。請參考歐洲專利申請案第773 288和843 961號，將其揭露內容併入於此以供參照。此外，已製造出KMTM－小鼠，其為Kirin’s Tc小鼠與Medarex’s微小基因座(Humab)小鼠雜交育種的結果。這些小鼠具有Kirin小鼠的人類IgH轉殖染色體以及Genpharm小鼠的kappa鏈轉殖基因(Ishida等人,Cloning Stem Cells ,(2002)4：91~102)。

亦可藉由活體外的方法衍生出人類抗體。適當的實例包括但不侷限於噬菌體陳現技術(CAT、Morphosys、Dyax、Biosite/Medarex、Xoma、Symphogen、Alexion(先前稱為Proliferon)、Affimed)；核糖體陳現技術(CAT)；酵母菌陳現技術等。

在另一實施態樣中，本發明之抗體與所揭露之抗體相競爭。抗體之間的競爭可簡單地於活體外測定，例如：使用ELISA及/或藉由將一特異性之回報分子標識至一可在一或多個其它未標識之抗體存在下被偵測之結合部份，以可鑑識出結合相同抗原決定部位或或是一部份重疊之抗原決定部位的抗體。此方法係此技術領域中具有通常知識者所熟知的，且在此處將更詳細地描述。因此，本發明之另外的方面係提供一包含有一與抗體分子競爭之人類抗體抗原結合位置的抗原結合位置，例如：特別是一包含有一VH及/或VL功能區、如HCDR3或親代抗體之CDRs組之CDR或是此處所揭露之任何結合至PDGFR－α之抗體的抗體分子。在一實施態樣中，本發明之抗體和2.175.3、2.449.1.3及/或2.998.2競爭。

抗體的製備

通常，藉由融合融合瘤所製造的抗體為具有完全人類或λ輕鏈的人類IgG2或IgG4重鏈。抗體亦可為其他的人類種型，包括IgG1重鏈。該等抗體具有高度親和力，當在FACS－為基礎之親和力量測技術中對抗細胞測定時一般係具有從約10^－6 至約10^－12 M或更低的Kd。該親和力亦可藉由固相和液相技術測定。在一實施態樣中，此處所述之抗體以少於約500、400、300、200或100 pM的Kd結合至CD PDGFR－α 20且抑制腫瘤生長。在某些實施態樣中，該等抗體以少於約75、60、50、40、30、25、20、10或5 pM的Kd結合至PDGFR－α。

將如所瞭解到的，抗PDGFR－α抗體可被表現於除了融合瘤細胞株之外的細胞株。編碼特定抗體的序列可被用於轉形一適合之哺乳類宿主細胞。轉形作用可藉由任何習知將聚核苷酸導入一宿主細胞的方法，包括例如將該聚核苷酸包裹於一病毒內(或是一病毒載體內)及以該病毒(或載體)轉導一宿主細胞或是藉由此技術領域中已知的轉染方法，其舉例說明於美國專利案號4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455(將這些專利併入於此以供參照)。所使用的轉形方法視該被轉形的宿主而定。將異源性聚核苷酸導入哺乳動物細胞的方法已為此技術領域中所習知的且包括葡聚醣媒介之轉染法、磷酸鈣沈澱法、聚凝胺媒介之轉染法、原生質體融合技術、電穿孔法、將聚核苷酸包裹於脂質體內之方法，以及將DNA直接微注射入細胞核內。

可用於表現作為宿主的哺乳類細胞株已為此技術領域中所習知的且包括許多可得自美國標準菌種中心(ATCC)的永生化細胞株，其包括但不侷限於：中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、人類上皮腎293細胞，以及其他許多的細胞株。經由測定那一細胞株為具有高表現位準且產生具有固有PDGFR－α結合性質之抗體而選擇特定偏好的細胞株。

抗PDGFR－α抗體可被用於偵測病患樣本內的PDGFR－α，且因此可被用於診斷如此處所述的疾病狀態。此外，基於其可抑制腫瘤生長的能力，抗PDGFR－α抗體具有治療導因於PDGFR－α表現之症狀和病症的治療效應。在特定的實施態樣中，此處所述的抗體和方法係關於治療導因於PDGFR－α所誘發之腫瘤生長。進一步之實施態樣涉及利用此處所述之抗體和方法於治療腫瘤疾病，例如：癌症，包括肺癌、卵巢癌、前列腺癌、結腸癌、神經膠質瘤、黑色素瘤及胃腸道基質瘤(GIST)。

抗體序列

本發明的具體實施例包括列於以下第1表之專一性抗PDGFR－α抗體。此表記錄各抗PDGFR－α抗體的辨識編號以及相對應之重鏈和輕鏈基因之可變區的序列辨識編號(SEQ ID NO)。

各抗體已被給予一個包括以一或二個小數點所分隔開之二或三個數目的辨識編號。在某些實例中，只列出被一個小數點所隔開的二個辨識編號。然而，在某些實例中，係製備出一個抗體的數個株落(clone)。雖然這些株落具有和親本序列一致的核酸及胺基酸序列，他們也可分別地被列出，藉由在第二個小數點右方之數字來指明的株落編號來辨識。因此，例如，抗體2.84的核酸及胺基酸序列係相同於抗體2.84.1、2.84.2及2.84.3的該等序列。

如此處範例中所述者，透過利用下述之XenoMouse技術來製造所述的抗體。然後此類小鼠能夠產生人類免疫球蛋白分子和抗體且係無法產生鼠類免疫球蛋白分子和抗體。為了達成此目的所使用的技術係揭露於此處發明背景段落中所述的專利、申請案和參考文獻中。然而，更明確地說，製造轉殖基因小鼠及由其產生抗體的較佳具體實施例係揭示於1996年12月3日提出的美國專利申請序號08/759,620和公告於1998年6月11日的國際專利申請案WO 98/24893以及公告於2000年12月21日的WO 00/76310，其揭露內容係併入於此以供參照。亦請參考Mendez等人,Nature Genetics,15：146~156(1997)之文獻，將其揭露內容併入於此以供參照。

經由利用此類的技術，可製造出對抗各種抗原的完全人類單株抗體。基本上，XenoMouse株小鼠係以一有興趣之抗原(例如，PDGFR－α)進行免疫，自該高度免疫之小鼠回收淋巴細胞(例如B－細胞)，以及將該回收的淋巴細胞與骨髓樣細胞株相融合以製造永生化融合瘤細胞株。這些融合瘤細胞株係經篩檢和經選取以鑑定出可產生對標的抗原具專一性之抗體的融合瘤細胞株。此處所提供的係用於產生可製造出具PDGFR－α專一性之抗體的多重融合瘤細胞株的方法。再者，此處所提供的是由該等細胞株所產生之抗體的特性描述，其包括此類抗體之重鏈和輕鏈的核苷酸及胺基酸序列分析。

可擇地，除了融合至骨髓瘤細胞以產生融合瘤，B細胞可以直接地被檢測。例如，可從高度免疫XenoMouse小鼠分離出CD19＋B細胞且使其增生和分化成抗體分泌漿細胞。接著藉由ELISA篩檢來自細胞上清液之抗體對抗該PDGFR－α免疫原的活性。亦可利用該上清液篩檢對抗PDGFR－α片斷的免疫反應性以進一步堪測出用以結合至PDGFR－α上的功能標的功能區之不同的抗體。該等抗體亦可篩檢其他相關人類受體及對抗大鼠、小鼠和非人類靈長類如Cynomolgus猴、直系同源之PDGFR－α，最後決定品種的的交叉反應性。來自含標的抗體之孔的B細胞可藉由各種方法被永生化，包括從個別或是從經混合之孔經融合以製造融合瘤，或是藉由以EBV感染，或是藉由以已知之永生化基因的轉染，然後植入適當的培養基內。可擇地，利用PDGFR－α－特異性溶血斑試驗可接著分離出具有所欲專一性的分泌抗體之單一漿細胞(請參考例如Babcook等人,Proc.Natl.Acad.Sci.美國 93：7843~48(1996))。用於溶血標的之細胞較佳為包覆有PDGFR－α抗原的羊紅血球細胞(SRBCs)。

在含有分泌目標免疫球蛋白和補體之漿細胞的B－細胞培養的存在下，所形成溶血斑表示在目標漿細胞周圍之羊紅血球細胞的特異性PDGFR－α－媒介性溶血。在該溶血斑中央的單一抗原特異性漿細胞可被分離出來且編碼出該抗體之特異性的遺傳訊息可由該單一漿細胞分離出來。利用反轉錄作用及之後的PCR(RT－PCR)，可選殖出編碼該抗體之重鏈和輕鏈可變區的DNA。此類經選殖之DNA可接續被進一步插入一適當的表現載體，較佳為一載體匣(vector cassette)，例如：pcDNA，更佳為此pcDNA載體含有免疫球蛋白重鏈和輕鏈之恒定區。然後可將該產生的載體轉染入宿主細胞，例如HEK293細胞、CHO細胞，然後培養於經修飾為適當於誘發轉錄作用、選擇轉形株或擴增編碼該所欲序列之基因的習知營養培養基內。

抗PDGFR－α抗體可具有治療和PDGFR－α表現相關之疾病或病況的效用。例如：該抗體可抑制表現PDGFR－α之細胞的生長，藉此抑制腫瘤生長；或是該抗體可一藥劑相連且遞送一致死之毒素至一標的細胞。抗PDGFR－α抗體可具有治療纖維性病變的治療效應，例如：心臟性、肺、肝、腎或皮膚纖維性病變。抗PDGFR－α抗體也可具有治療同種異體移植血管病變或是再狹化的治療效應。此外，抗PDGFR－α抗體係可用於疾病狀態的檢測，特別是腫瘤、纖維化及免疫系統疾病。

若所欲的話，一抗－PDGFR－α抗體的類型間可轉變，例如，可利用不同類型之生物特性。例如，在某些情形下，關於生成抗體作為對抗PDGFR－α之治療用抗體，想要的是該抗體可固定補體且參與補體依賴性細胞毒殺作用(complement－dependent cytotoxicity,CDC)。有數種抗體類型係可如此的，包括但不侷限於以下所列：鼠類IgM,鼠類IgG2a,鼠類IgG2b,鼠類IgG3,人類IgM,人類IgA,人類IgG1及人類IgG3。在其它實施態樣中，關於生成抗體作為對抗PDGFR－α之治療用抗體，想要的是該抗體可結合效應細胞上的Fc受體且參與抗體依賴性細胞毒殺作用(antibody－dependent cytotoxicity,ADCC)。有數種抗體類型係可如此的，包括但不侷限於以下所列：鼠類IgG2a,鼠類IgG2b,鼠類IgG3,人類IgG1,以及人類IgG3。了解到的是，生成的抗體並不需要一開始就具有如此的類型，但是，更確切地說，之後該生成的抗體可具有任何類型且該抗體可作類型轉變使用此技術領域中已知的習知技術。此類技術包括使用直接基因重組技術(參考例如美國第4,816,397號專利)、細胞－細胞融合技術(參考例如美國第5,916,771及6,207,418號專利)及其它。

經由該等範例，此處所討論的抗－PDGFR－α抗體係完全人類抗體。若一抗體具有所欲結合至PDGFR－α，其可容易地類型轉變為產生一人類IgM,人類IgG1或人類IgG3類型，然而仍然具有相同之可變區(其為界定該抗體之特異性及某些其親和力)。此類分子接著可固定補體及參與CDC及/或可結合在效應細胞上之Fc受體及參與ADCC。

在細胞－細胞融合技術中，一骨髓瘤、CHO細胞或其它細胞株係經製備以致其具有一帶有任何所欲類型之重鏈，以及另一骨髓瘤、CHO細胞或其它細胞株係經製備以致其具有該輕鏈。之後，此細胞可經融合且可分離出一表現完整抗體的細胞株。

因此，當接受遴選之抗體係製備為符合以上所討論之所欲「結構」屬性，通常其可類型轉變而被供有至少特定之所欲「功能」屬性。

治療性給藥及調配物

本發明之實施態樣包括可用於治療疾病之抗PDGFR－α抗體的滅菌醫藥調配物。此類調配物可抑制細胞生長，藉此可有效治療例如PDGFR－α表現異常上升的病理狀態或是PDGFR－α表現細胞所媒介的疾病狀態。抗PDGFR－α抗體較佳為具有專一性結合至PDGFR－α的適當親和力，以及較佳為在人類中具有適當的作用期間而不需進行經常性的給藥。較長的作用期間將可減少給藥頻率以及可藉由改變成腸道外途逕如皮下或肌肉注射途徑而可更方便於給藥。

冷凍乾燥及抗體重構之前或之後可藉由例如通過滅菌濾膜的過濾而製造滅菌調配物。該抗體一般以冷凍乾燥或溶液的形式被儲存。治療性抗體組成物通常被置於具有滅菌存取口的一容器內，例如：一具有可供取得該調配物之銜接頭(如可被皮下注射針頭刺穿之塞子)的靜脈注射溶液袋或玻璃瓶。

抗體的投與途徑係根據已知的方法，例如藉由靜脈內、腹腔內、腦池內、肌肉內、眼內、動脈內、椎鞘內注射或輸入，吸入或病灶內的途徑、或是藉由下述的緩釋系統。該抗體較佳為藉由輸入或藉由點滴注射持續性地給藥。

治療上所應用之抗體的有效量係視例如治療目標、給藥途徑和病人的狀況而定。因此，較佳的是，治療學家滴定該劑量且調整其給藥途徑為得到最佳治療效果之所需。通常，臨床醫生將投與抗體直至達到所欲效應的劑量為止。藉由習知之檢測法或此處所述的檢測法可輕易地監控此治療的進展。

如此處所述者，可製備與醫藥上可接受之載體混合的抗體。此治療組成物可經由靜脈或鼻內或肺被投與，其較佳為一液體或粉末噴霧劑(冷凍乾燥)。該組成物需要時亦可經由腸道外或皮下給藥。當用於全身性給藥時，該治療組成物必需為無菌的、無發熱原的及置於具有適當pH、等張和穩定性的腸道外可接受溶液內。這些條件為習於此藝者所已知的。簡言之，藉由混合具有所欲純度的化合物和生理上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑而製備此處所述用於儲存或給藥的化合物劑量調配物。此類材料在使用劑量和濃度之下對接受者不具有毒性，以及包括緩衝液如TRIS鹽酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽及其他有機酸鹽類；抗氧化劑如抗壞血酸；低分子量(低於約10個殘基)胜肽如聚精胺酸；蛋白質如血清白蛋白、凝膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸如甘胺酸、麩胺酸、天門冬胺酸或精胺酸；單糖、雙糖和其他碳水化合物包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；反離子如鈉及/或非離子性界面活性劑如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇。

可根據習知的藥學實務調配用於注射的無菌組成物，如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(第20版,Lippincott Williams & Wikens出版社(2003))所述。例如，將活性化合物溶解或懸浮於一載劑內，例如水或天然植物油如芝麻油、花生油或棉籽油，或是一合成脂肪載劑如油酸乙酯或其他類似物。根據可接受的藥學實務可併入緩衝劑、防腐劑、抗氧化劑等。

緩釋製劑的適當實例包括含該多胜肽之固態疏水性聚合物的半透性基質，該基質係為經塑形之物件、薄膜或微膠囊之形式。緩釋基質的實例包括聚酯；水凝膠(例如，聚(2－羥乙基丙烯酸甲酯)，如於Langer等人,J.Biomed Mater.Res. (1981)15：167~277和Langer,Chem.Tech. (1982)12：98~105中所述，或聚(乙烯醇))；聚丙交酯(美國專利案3,773,919、EP 58,481)；L－麩胺酸和γ－L－麩胺酸乙酯的共聚物(Sidman等人,Biopolymers ,(1983)22：547~556)；不可崩解性之乙烯－醋酸乙烯(Langer等人,如上述)；可崩解性乳酸－乙醇酸共聚物，例如：LUPRON Depot^TM (由乳酸－乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)所組成的可注射性微球粒)，以及聚－D－(－)－3－羥基丁酸(EP 133,988)。

雖然如乙烯－醋酸乙烯和乳酸－乙醇酸之聚合物可釋出分子的時間長達多於100天，某些水凝膠在較短時間期間釋出蛋白質。當經包覆之蛋白質於體內維持一長時間時，其可能因暴露於潮濕的37℃下而會變質或凝聚，而造成生物活性喪失及可能改變其免疫原性。可視其所涉及的作用機制而設計出用以穩定蛋白質的合理策略。例如，若發現該凝集機制係經由雙硫鍵互換的分子間S－S鍵形成時，可藉由修飾氫硫鍵殘基、自酸性溶液冷凍乾燥、控制濕度、利用適當的添加劑，以及形成特定之聚合物基質組成物而達到穩定化的目的。

緩釋組成物亦包括懸浮於能維持結晶懸浮液之適當調配物內之抗體結晶製劑。這些製劑在皮下或腹腔內注射後可產生緩釋的效果。其他組成物亦包括脂質體包覆之抗體。含有此類抗體的脂質體係藉由已知的方法製備：美國專利案DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美國 (1985)82：3688~3692；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美國 (1980)77：4030~4034；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；142,641；日本專利申請案83－118008；美國專利案4,485,045和4,544,545；以及EP 102,324。

用於一預設病人的抗體調配物的劑量將由參與照料的醫生考慮各種已知會改變該藥物作用之因素後而決定，包括疾病的嚴重度和類型、體重、性別、飲食、時間和給藥途徑、其他藥物及其他相關的臨床因素。治療有效劑量可藉由體外或體內的方法而決定。

此處所述治療上應用之抗體的有效量將視例如治療目標、給藥途徑和病人的狀況而定。因此，對於一治療學家較佳為滴定該劑量和視需要調整其給藥途徑以達到最佳的治療效果。依據以上所述的因素，一典型的每日劑量可在約0.001毫克/公斤至高達100毫克/公斤或以上的範圍。通常，臨床醫生將投與該治療性抗體直至達到所欲效果的劑量為止。藉由習知的檢測法或此處所述方法可輕易地監控此治療的進展。

應瞭解的是，根據此處之組成物和方法之治療實體的投與將和適當的載體、賦形劑及其他可併入調配物內以提供經改善之傳遞、輸送、耐受性等的物質一起投藥。這些調配物包括例如：粉末、藥膏、軟膏、凝膠、蠟、油、脂質、含脂質(陽離子或陰離子)的載劑(例如Lipofectin^TM )、DNA共軛物、無水吸附藥膏、水包油和油包水乳劑、乳化碳蠟(各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠，以及含碳蠟的半固體混合物。若該調配物內的活性成分不被該調配物失活且該調配物係生理上相容的和係可忍受該給藥途徑時，任何上述的混合物均適合用於根據本發明的治療及療法。亦請參考Baldrick P.「Pharmaceutical excipient development：the need for preclinical guidance.」，Regul.Toxicol.Pharmacol. 32(2)：210~8(2000)；Wang W.「Lyophilization and development of solid protein pharmaceutica1s.」，Int.J.Pharm. 203(1~2)：1~60(2000)；Charman WN,「Lipids,lipophilic drugs,and oral drug delivery－some emerging concepts.」，J.Pharm.Sci. 89(8)：967~78(2000)；Powell等人，「Compendium of excipients for parenteral formulations」,PDA J.Pharm.Sci.Technol. 52：238~311(1998)及其中所引述之關於藥物化學家已知之調配物、賦形劑和載體的引用資料。

其他治療劑的設計和產生

根據本發明及此處對於PDGFR－α所製造和定性的抗體活性，對於一習於此藝者而言，設計出其它治療劑形式是容易的且係顯而易見的。此類形式包括但不侷限於，進階抗體療法，例如：雙特異性抗體、免疫毒素和放射線標示治療劑，及單一抗體V功能區，基於除了V區域骨架之外的類抗體結合劑，胜肽產生療法，基因療法，細胞內抗體，反義核酸療法，及小分子。

藉由非抗體蛋白骨架上(如纖連蛋白或細胞色素B等)之CDRs的配置可產生一抗原結合位置(Haan & Maggos(2004)BioCentury ,12(5)：A1~A6；Koide等人,(1998)Journal of Molecular Biology ,284：1141~1151；Nygren等人(1997)Current Opinion in Structural Biology 7：463~469)或藉由在一蛋白骨架內一環的胺基酸殘基進行隨機化或突變而授予一對於所欲標的的結合專一性。蛋白質內用於製造新穎結合位置之骨架已詳述於Nygren等人(Nygren等人(1997)Current Opinion in Structural Biology 7：463~469)。用於擬抗體的蛋白質骨架係揭露於WO/0034784，其完整併入於此以供參照，發明者於其中描述包括具有至少一隨機化環體之第III型纖黏蛋白功能區的蛋白質(擬抗體)。可由免疫球蛋白基因超家族之任一功能區成員提供一用於將一或多個CDRs(如一組HCDRs)移植入之適合的骨架。該骨架可為人類或非人類蛋白。非抗體蛋白骨架的優點為其可提供一在一骨架分子內之較小的抗原結合位置，及/或其比至少一些抗體分子為較易製造的。結合元的小尺寸可賦予其有用的生理性質，例如：進入細胞的能力、深層穿透入組織或到達其他構造內的標的物，或是在標的抗原的蛋白穴內進行結合。使用於非抗體蛋白骨架之抗原結合位置已詳述於Wess,2004(Wess,L.，In：BioCentury,The Bernstein Report on BioBusines 12(42)：A1~A7,2004)。典型地是具有穩定主幹以及一或多個可變環的蛋白質，其中該環或該等環的胺基酸序列可經特異性地或隨機地突變以製造一可結合該標的抗原的抗原結合位置。此類蛋白質包括來自金黃色葡萄球菌之蛋白A的IgG－結合功能區、運鐵蛋白、白蛋白、胞漿素原結合蛋白(tetranectin)、纖黏蛋白(例如：第10纖黏蛋白第III型功能區)、脂籠蛋白(lipocalins)以及γ－結晶和其他Affilin^TM 骨架(Scil蛋白)。其他方法之實例包括合成以環狀多肽為基礎的微小體(microbodies)－具有分子內雙硫鍵的小型蛋白質、微蛋白(microproteins)(Versabodies^TM ,Amunix)以及錨蛋白重複序列蛋白(DARPins,Molecular Partners)。

除了抗體序列及/或一抗原結合位置之外，根據本發明的致標性結合劑可包含形成一胜肽或多胜肽的其他胺基酸，例如一折疊功能區或是賦予該分子除了抗原結合能力之外的另一功能特性。本發明的致標性結合劑可攜帶一可偵測標記，或是可被共軛至一毒素或一靶向基團或酵素(例如，經由一肽鏈或一鍵結物)。例如，一致標性結合劑可包含一催化性部位(例如，在一酵素功能區內)以及一抗原結合位置，其中該抗原結合位置係結合至抗原而因此將該催化性部位導向該抗原。該催化性部位可抑制該抗原的生物性功能，例如：藉由裂解。

關於進階抗體療法，補體結合為其所欲之屬性，其可經由使用雙特異性抗體、免疫毒素或放射線標示物而避免依賴補體殺死細胞。

舉例來說，雙特異性抗體可被產生為包含：(i)共軛在一起之兩抗體，其一具有對PDGFR－α的專一性而另一則具有對一第二分子之專一性；(ii)一單一抗體，其具有一鏈對PDGFR－α具有專一性及一第二鏈對一第二分子具有專一性；或(iii)一單鏈抗體，其對PDGFR－α及另一分子具有專一性。可利用習知的技術產生此類雙特異性抗體；例如：關於(i)和(ii)，請參考例如Fanger等人,Immunol.Methods ,4：72~81(1994)和Wright和Harris，如前述；以及關於(iii)，請參考例如Traunecker等人,Int.J.Cancer (補充文件)7：51~52(1992)。在各實例中，該第二專一性可依所欲地製造。例如：該第二專一性可被製成重鏈活化受體，包括但不侷限於：CD16或CD64(請參考例如Deo等人,Immunol.Today ,18：127(1997))或CD89(請參考例如Valeriu等人,Blood ,90：4485~4492(1997))。

亦可利用習知的技術將抗體修飾成作用為免疫毒素。請參考例如Vitetta,Immunol.Today ,14：252(1993)。亦請參考美國第5,194,594號專利。關於製備經放射線標示之抗體，利用該技術領域中習知的技術亦可輕易地製備此類經修飾的抗體。請參考例如Junghans等人,Cancer Chemotherapy and Biotherapy ,655~686(第二版，Chafner和Longo編輯，Lippincott Raven (1996))。亦請參考美國專利案4,681,581、4,735,210、5,101,827、5,102,990(RE35,500)、5,648,471和5,697,902。免疫毒素及經放射線標示之抗體之各者將可能殺死表現有所欲多聚體酵素次單元之寡聚化功能區的細胞。在某些實施態樣中，提供一包含有一有效量之抗體和醫藥上可接受之載體的藥學組成物。

在某些實施態樣中，一抗PDGFR－α抗體係鏈結至一藥劑(例如：放射性同位素、醫藥組成物或是一毒素)。較佳地，此類抗體可被使用於治療疾病，該等疾病可和表現PDGFR－α之細胞或是過度表現PDGFR－α之細胞相關。例如：預期的是該等藥物具有選自以下之醫藥特性：抗細胞分裂劑、烴化劑、抗代謝藥物、抗血管生成、細胞自戕劑、生物鹼、COX－2以及抗生素劑及其等之組合。該藥物可擇自以下群組：氮芥(nitrogen mustards)、次乙亞胺衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝酸基尿素(nitrosoureas)、三氮烯(triazenes)、葉酸類似物、蒽環黴素(anthracyclines)、紫杉醇、COX－2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤顯似物、抗代謝劑、抗生素、酵素、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxins)、鉑配位複合物、長春花生物鹼、經取代之尿素、甲基聯胺衍生物、腎上腺皮質抑制劑、拮抗劑、血管內皮抑素、太平洋紫杉醇、坎普特賽辛(camptothecins)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、多柔比辛(doxorubicins)及其類似物，以及其等之組合物。

毒素之實例進一步包括：吉柔凝(gelonin)、假單胞菌外毒素(PE)、PE40、PE38、白喉毒素、蓖麻毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素、α－毒素、皂草毒素、核糖核酸酶(RNase)、DNase I、葡萄球菌腸毒素－A、美洲商陸抗病毒蛋白、吉柔凝、假單胞菌內毒素以及其等之衍生物、組合物及修飾物。

放射性同位素之實例包括可使用於定位化及/或治療之γ－放射源、正電子放射源(positron－emitters)、以及x－射線放射源，而且可使用於治療之β－放射源及α－放射源。先前所述使用於診斷、預後及分階之放射性同位素也可使用於治療。抗癌劑及抗白血病劑之非限制性的實例包括：蒽環黴素，例如：多柔比辛(doxorubicin)(阿黴素，adriamycin)、道諾普比辛(daunorubicin)(道諾黴素，daunomycin)、艾達黴素(idarubicin)、地托比辛(detorubicin)、洋紅黴素(carminomycin)、表柔比星(epirubicin)、依索比辛(esorubicin)及嗎福啉(morpholino)以及其等之經取代的衍生物、組合物及修飾物。示範性的藥學藥劑包括順式鉑、太平洋紫杉醇、卡利甲米辛、長春新鹼(vincristine)、阿糖胞苷(cytarabine)(Ara－C)、環磷醯胺(塞克羅邁得 ；cyclophosphamide)、強體松(prednisone)、道諾普比辛、艾達黴素、氟達拉賓(fludarabine)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、干擾素－α、羥基脲、替莫唑胺(temozolomide)、沙利竇脈(thalidomide)以及博來霉素(bleomycin)，以及其等之衍生物、組合物及修飾物。較佳地，該抗癌劑及抗白血病劑係多柔比辛、嗎福啉多柔比辛或嗎福啉道諾普比辛。

本發明之抗體也包含在一哺乳類動物(較佳為人類)中比一未經修飾之抗體具有更長半生期(例如：血清半生期)之抗體。在一實施態樣中，該抗體半生期係多於約15天，多於約20天，多於約25天，多於約30天，多於約35天，多於約40天，多於約45天，多於約2個月，多於約3個月，多於約4個月，或多於約5個月。本發明之抗體或其片段在一哺乳類動物(較佳為一人類)中經增加之半生期在該哺乳類動物中產生該抗體或抗體片段較高之力價，且因此，降低該抗體或抗體片段投藥的頻率，及/或降低擬被投藥之該抗體或抗體片段投藥的濃度。可利用該技術領域中習知的技術製備具有經增加之活體內半生期的抗體或其片段。例如，可利用修飾(例如取代、刪除或增加)已被鑑定為涉及Fc功能區和FcRn受體間之相互作用的胺基酸殘基而製備具有經增加之活體內半生期的抗體或其片段(參考，如國際專利公開案WO 97/34631及WO 02/060919，其整體係併入於此作為參考)。可利用將聚合物分子(如高分子量之聚乙二醇(PEG))連接至該抗體或抗體片段而製備具有經增加之活體內半生期的抗體或其片段。PEG可使用或不使用多功能性鏈接物而連接至該抗體或抗體片段，不論是經由PEG對該抗體或抗體片段之N－或C－端的位置專一性共軛，或是經由出現在離胺酸殘基上的epsilon－胺基基團。造成最小生物活性損失的線性或分支性聚合物衍生化作用將被使用。共軛化之程度將藉由SDS－PAGE及質譜儀密切地監控以確定PEG分子適當地共軛至該抗體。未反應之PEG可藉由如尺寸排斥性或離子交換性色層分析法自抗體－PEG共軛體中分離出來。

如該技術領域中具有通常知識者所能了解的，在以上實施態樣中，雖然親和力數值是重要的，依據該抗體之特定功能，其它因素也一樣重要甚至更重要。例如，對於一免疫毒素(和抗體相連之毒素)，一抗體結合至標的之行為係有益的，然而，在某些實施態樣中，其所欲之最終結果是該毒素內化至該細胞內。如此一來，在此情形下，所欲的是具有高比例內化作用之抗體。因此，在一實施態樣中，預期的是具有高內化效能的抗體。一高內化效能可被量測為經內化之抗體的比例，且可為一低數至100%。例如，在不同的實施態樣中，0.1－5、5－10、10－20、20－30、30－40、40－45、45－50、50－60、60－70、70－80、80－90、90－99以及99－100%可為一高效能。如該技術領域中具有通常知識者所能了解的，在不同實施態樣中該所欲之效能可以是不同的，依賴例如該經相連的藥劑、可被投與至一區域之該抗體的數量、該抗體－藥劑複合物的副作用、擬被處理之問是題的類型(例如：癌症的類型)及嚴重程度。

在其它實施態樣中，此處所揭露之抗體提供一用於偵測在一哺乳類組織及細胞中PDGFR－α表現以篩選和PDGFR－α之表現量改變相關之疾病或病症的測試套組。該套組包含一結合PDGFR－α之抗體以及用於指明該抗體和該抗原反應的物件，若有反應的話。

在某些實施態樣中，一製造之物品係備置包含有一包含一含有一抗PDGFR－α抗體之組成物的容器，以及一指明該組成物可被使用於治療由PDGFR－α表現所媒介的疾病的仿單或是標籤。較佳係一哺乳類動物且更佳係一人類，接受該抗PDGFR－α抗體。

組合療法

此處所定義之抗腫瘤療法可被應用為單一治療法或除了本發明之化合物之外可涉及習知的外科手術，骨髓及週邊幹細胞移植或放射線療法或化學療法。此類化學療法可包括一或多種下列種類的抗腫瘤劑：(i)其他用於腫瘤醫學的抗增生/抗腫瘤藥物及其組合，例如：烷化劑(例如順式鉑、奧沙利鉑、卡鉑、環磷醯胺、氮芥、美法侖(melphalan)、氮芥苯丁酸、白消安(busulphan)、替莫唑胺(temozolamide)和亞硝基脲)；抗代謝劑(例如吉西他賓(gemcitabine)和抗葉酸鹽，如氟嘧啶類，如5－氟尿嘧啶和替加氟(tegafur)、雷替曲塞(raltitrexed)、甲胺蝶呤、阿糖胞嘧啶以及羥基脲)；抗腫瘤抗生素(例如，蒽環黴素類如阿黴素、博萊黴素、多柔比辛、道諾黴素、表柔比辛、艾達比辛、絲裂黴素C、放線黴素和光輝黴素)；抗有絲分裂劑(例如，長春花生物鹼如長春新鹼、長春花鹼、長春地辛(vindesine)和長春瑞賓(vinorelbine)以及紫杉醇類化合物如紫杉醇和多西紫杉醇和波羅激酶抑制劑(polokinase inhibitor))；以及拓樸異構酶抑制劑(例如表鬼臼毒素類如依託泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)、胺吖啶(amsacrine)、托普替康(topotecan)和喜樹鹼)；(ii)細胞抑制劑，例如：抗雌激素(例如，他莫昔芬(tamoxifen)、法洛德(fulvestrant)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)和碘醯昔芬(iodoxyfene))；抗雄激素(例如，比卡魯胺(bicalutamide)、氟卡胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和醋酸環丙孕酮(cyproterone acetate))；LHRH拮抗劑或LHRH促動劑(例如，戈舍瑞林(goserelin)、亮丙瑞林(leuprorelin)和布舍瑞林(buserelin))；黃體激素(例如，醋酸甲地孕酮(megestrol acetate))；芳香環轉化酶抑制劑(例如，阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、三唑化合物(vorazole)和依西美坦(exemestane))以及5α－還原酶，例如非那雄胺(finasteride)；(iii)抗侵入劑，(例如，c－Src激酶家族抑制劑，如4－(6－氯－2,3－亞甲基二氧苯胺基)－7－[2－(4－甲基哌玮－1－基)乙氧基]－5－四氫吡喃－4－基羥喹唑啉(AZD0530；國際專利申請案WO 01/94341)和N－(2－氯－6－甲基苯基)－2－{6－[4－(2－羥乙基)哌玮－1－基]－2－甲基嘧啶－4－基胺基}噻唑－5－甲醯胺(達沙替尼(dasatinib),BMS－354825；J.Med.Chem .,2004,47：6658~6661))，及金屬蛋白酶抑制劑，如：馬立馬司他(marimastat)；尿激酶型纖溶酶原激活因子受體功能抑制劑，組織蛋白酶抑制劑，絲胺酸蛋白水解酶(如：瑪崔普特司(matriptase)、海普辛(hepsin)及尿激酶)抑制劑，或乙醯肝素酶之抑制劑；(iv)細胞毒殺劑，例如：氟達拉賓、2－氯去氧腺核苷(2－chlorodeoxyadenosine)、氮芥苯丁酸或是多柔比辛，以及其等之組合物，如：氟達拉賓＋環磷醯胺；CVP：環磷醯胺＋長春新鹼＋強體松；ACVBP：多柔比辛＋環磷醯胺＋長春地辛＋博來霉素＋強體松；CHOP：環磷醯胺＋多柔比辛＋長春新鹼＋強體松；CNOP：環磷醯胺＋米托(mitoxantrone)＋長春新鹼＋強體松；m－BACOD：甲氨喋呤(methotrexate)＋博來霉素＋多柔比辛＋環磷醯胺＋長春新鹼＋地塞米松(dexamethasone)＋甲酰四氫葉酸(leucovorin)；MACOP－B：甲氨喋呤＋多柔比辛＋環磷醯胺＋長春新鹼＋固定劑量之強體松＋博來霉素＋甲酰四氫葉酸或ProMACE CytaBOM：強體松＋多柔比辛＋環磷醯胺＋依託泊苷＋阿糖胞苷＋博來霉素＋長春新鹼＋甲氨喋呤＋甲酰四氫葉酸。

(v)生長因子功能抑制劑：舉例如此類的抑制劑包括生長因子抗體和生長因子受體抗體(例如：抗－erbB2抗體妥珠單抗(trastuzumab)[Herceptin^TM ]、抗－EGFR抗體帕尼單抗(panitumumab)、抗－erbB1抗體西妥昔單抗(cetuximab)[Erbitux,C225]和任何生長因子或生長因子受體抗體，其揭示於Stern等人,Critical reviewsin oncology/haematology,2005,第54卷第11~29頁)；此類抑制劑亦包括酪胺酸激酶抑制劑，例如：上皮生長因子家族抑制劑(例如，EGFR家族酪胺酸激酶抑制劑，如N－(3－氯－4－氟苯基)－7－甲氧基－6－(3－嗎啉丙氧基)喹唑啉－4－胺(吉非替尼(gefitinib),ZD1839)、N－(3－乙炔基苯基)－6,7－雙(2－甲氧乙氧基)喹唑啉－4－胺(埃羅替尼(erlotinib),OSI－774)和6－丙烯醯胺基－N－(3－氯－4－氟苯基)－7－(3－嗎啉丙氧基)喹唑啉－4－胺(CI 1033))；erbB2酪胺酸激酶抑制劑，例如：拉帕替尼(lapatinib)；肝細胞生長因子家族抑制劑；血小板衍生生長因子家族抑制劑，例如伊馬替尼(imatinib)；絲胺酸/酥胺酸激酶抑制劑(例如，Ras/Raf訊息抑制劑，例如法尼基轉移酶抑製劑(farnesyl transferase inhibitors)，如索拉菲尼(sorafenib)(BAY 43－9006))；經由MEK及/或AKT激酶的細胞訊息抑制劑；肝細胞生長因子家族抑制劑；c－kit抑制劑；abl激酶抑制劑；IGF受體(類胰島素生長因子)激酶抑制劑；極光激酶抑制劑(例如，AZD1152、PH739358、VX－680、MLN8054、R763、MP235、MP529、VX－528和AX39459)以及週期素依賴激酶抑制劑，例如CDK2及/或CDK4抑制劑，以及如：Bcl－2、Bcl－XL之存活訊號蛋白(survival signaling proteins)之抑制劑，如ABT－737；(vi)抗血管生長劑，例如，可抑制血管內皮生長因子之效應者[例如：抗血管內皮細胞生長因子抗體貝伐單抗(Avastin^TM )]；以及VEGF受體酪胺酸激酶抑制劑，例如：4－(4－溴－2－氟苯胺)－6－甲氧基－7－(1－甲基哌啶－4－基甲氧基)喹唑啉(ZD6474；WO 01/32651內之實例2)、4－(4－氟－2－甲基吲哚－5－基氧基)－6－甲氧基－7－(3－吡咯烷－1－基丙氧基)喹唑啉(AZD 2171；WO 00/47212內之實例240)、維他拉尼(vatalanib)(PTK787；WO 98/35985)和SU11248(舒尼替尼(sunitinib)；WO 01/60814)、如揭示於國際專利申請案WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856、WO 98/13354、WO 00/47212及WO 01/32651中的化合物以及藉由其他機制而作用的化合物(例如：三羧胺基喹啉(linomide)、整合素αVβ3功能抑制劑和血管抑制素)或是群落刺激因子1 (CSF1)或CSF1受體；(vii)血管破壞劑，例如康布司他汀A4(combretastatin A4)和揭露於國際專利申請案WO 99/02166、WO 00/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/04434和WO 02/08213中的化合物；(viii)反義療法，例如：可被引導至上述所列標的者，如G－3139(Genasense)，一種抗－bcl2反義核酸；(ix)基因療法，包括例如取代如異常p53或異常BRCA1或BRCA2之異常基因的方法；基因導向酶前藥療法(GDEPT)例如利用胞嘧啶脫胺酶、胸腺嘧啶激酶或細菌性硝基還原酶之方法以及增加病人對化療或放射線治療耐受性的方法，例如多藥物抗性基因療法；以及(x)免疫療法，包括例如以Alemtuzumab(campath－1H^TM ，其為一種針對CD52的單株抗體)進行治療，或是以針對CD22之抗體治療；體外或體內增加病人對腫瘤細胞之免疫抗原性的方法；轉染細胞素，如：白介素2、白介素4或顆粒球巨嗜細胞群落刺激因子；降低T－細胞無變應性的方法，例如：以抑制CTLA－4功能之單株抗體治療；利用經轉染之免疫細胞的方法，如：經細胞素轉染之樹突細胞；使用經細胞素轉染之腫瘤細胞株的方法；以及利用抗特異性的抗體的方法；(xi)蛋白質分解抑制劑，如蛋白酶體抑制劑，如萬珂(bortezomid)。

(xii)生物治療性療法，例如：使用胜肽或蛋白質(例如：抗體或可溶性外部受體功能區建構物)的方法，其可能是隔絕受體配體、阻斷配體結合至受體或是降低受體的訊息傳導(例如：導因於增加的受體分解或是降低的表現位準)。

如此結合的治療可藉由同時的、接續的或分開的服用該治療的個別成份而達成。此類組合產物應用本發明之化合物或是其藥學上可接受之鹽類(在先前所述之劑量範圍之內)以及其它藥學上可接受之活性劑(在其經核准之劑量範圍內)。

在本發明之一實施態樣中，本發明之抗腫瘤治療係和抑制血管內皮生長因子(VEGF)之藥劑合併(例如：抗血管內皮細胞生長因子抗體貝伐單抗(Avastin^TM )，抗血管內皮生長因子受體抗體，如：抗－KDR抗體及抗－flt1抗體；如揭示於國際專利申請案WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856、WO 98/13354、WO 00/47212及WO 01/32651中的化合物；以及藉由其他機制而作用的化合物(例如：三羧胺基喹啉(linomide)、整合素αVβ3功能抑制劑和血管抑制素)。在本發明另外的實施態樣，本發明之抗血管生成治療係和抑制血管內皮生長因子受體之酪胺酸激酶(KDR)活性的藥劑(例如：AZD2171或AZD6474)合併。對於AZD2171之額外的細節可在Wedge等人(2005)Cancer Research. 65(10)：4389－400中發現。對於AZD6474之額外的細節可在Ryan和Wedge(2005)British Journal of Cancer. 92 Suppl 1：S6－13中發現。二篇出版物皆整體併入於此作為參考。在本發明另一實施態樣中，該完全人類抗體1.1.2、1.5.3、2.1.2係單獨合併或是和Avastin^TM 、AZD2171或AZD6474合併。

藉由同時、連續或分開進行個別的處理而可達到此類共同治療的目的。此類組合產品可使用在上述劑量範圍內的本發明化合物或其醫藥上可接受鹽類，以及在許可劑量範圍內的其他醫藥活性劑。

範例

下列實例(包括進行之試驗和得到之結果)僅供作為說明的目的而不得解讀為本發明被限制於該範圍內。

範例1 免疫及滴定

免疫原 重組之可溶性PDGFR－α細胞外功能區係由R&D系統取得(Minneapolis,MN.目錄號#：322－PR/CF)且使用為一免疫原。此外，表現在BHK細胞(幼倉鼠腎細胞)之重組人類PDGFR－α係使用為一用於免疫的抗原。該BHK細胞係由American Type Tissue Collection，目錄號CCL－10所取得。

免疫 對抗PDGFR－α之單株抗體係藉由以PDGFR－α之細胞外功能區抗續地免疫XenoMouse小鼠(XenoMouse品系：XMG2(IgG2)及XM3C－1(IgG4)Amgen公司，Fremont,CA)而發展(R&D系統，目錄號#：322－PR/CF)。XenoMouse動物係藉由習知之工具經由足肉墊作為所有注射途逕而免疫。每隻小鼠之各注射總體積係50 μl且含有10 μg PDGFR－α之細胞外功能區，各足肉墊25 μl。佐劑中包括Titermax GoldTM(Sigma,目錄號T2684)，磷酸鋁膠狀佐劑，HCL生物區段(目錄號1452－250)以及ImmuneEasy小鼠佐劑(qCpG,Qiagen目錄號303105)。第一次注射係和Titermax GoldTM投與(第0天)。加強免疫係以5 ul的磷酸鋁膠狀佐劑(5ul)及qCpG(15 ul)和10 ug之PDGFR－α細胞外功能區在第3、6、10、13、20、24、27、31及34天投與。

範例2 淋巴球的獲得、B細胞分離、融合及產生融合瘤

經免疫的小鼠係以斷頸椎法而犧牲且該汲出的淋巴結係由各個體採收且收集在一起。該等淋巴細胞係藉由在DMEM中碾磨以使該等細胞自組織中放出來而分離開，且該等細胞係懸浮在DMEM中。該等細胞係經計數，且以每100百萬個淋巴球添加0.9 ml DMEM之數量添加至該細胞沉澱以使該等細胞溫和地且完全地再懸浮。每100百萬個細胞係使用100 μl的CD90^＋ 磁性珠，該等細胞係藉由使該等細胞和該等磁性珠在4℃下共同培育15分鐘而完成標記。該等包含多至10⁸ 個陽性細胞(positive cells)(或多至2x10⁹ 個總細胞)經磁性標記之細胞懸浮液係裝載至一LS^＋ 管柱上且該管柱係以DMEM清洗。該總流出液係收集為CD90－陰性分液。(大部份這些細胞係期望為B細胞)。

藉由將以上所得經清洗增富之B細胞和非分泌性骨髓瘤P3X63Ag8.653細胞(購自ATCC(目錄號CRL 1580)(Kearney等人，J.Immunol. 123,1979,1548－1550)以1：1的比例混合而執行融合。該細胞混合物係以800 x g離心和緩地形成沉澱。在完全移除上清液之後，該等細胞係以2－4 Ml的Pronase溶液(CalBiochem,目錄號53702；0.5 mg/mL在PBS中)處理不超過2分鐘。接著，添加3－5 ml的FBS以中止該酵素活性且該懸浮液係以細胞電性融合溶液ECFS(0.3 M之Suc蔗糖，Sigma,目錄號S7903；0.1 mM乙酸鎂，Sigma,目錄號M2545；0.1 mM乙酸鈣,Sigma,目錄號C4705)調整至40 mL之總體積。在離心後移除該上清液且該等細胞係再懸浮在40 mL之ECFS中。重覆此清洗步驟且該等細胞係再懸浮於ECFS中至2x10⁶ cells/mL的濃度。

使用一融合產生器(模式ECM2001,Genetronic公司,聖帝牙哥,加州)執行電性細胞融合。所使用之融合腔大小為2.0 mL，使用下述儀器設定：校準狀態：電壓：50 V，時間：50秒；細胞膜破壞在電壓：3000 V，時間：30 μ秒；融合後保持狀態：3秒。

在ECF之後，該細胞上清液係在無菌狀態下小心地自該融合腔中移出且轉移至一含有相同體積之融合瘤培養液(DMEM(JRH Biosciences),15% FBS(Hyclone),補充有L－麩醯胺酸、青黴菌/鏈黴菌、OPI(草醯乙酸、丙酮酸鹽、牛胰島素)(皆購自Sigma)以及IL－6(Boehringer Mannheim))的無菌管中。該等細胞係培養在37℃下15－30分鐘，而接著以400 x g(1000 rpm)離心5分鐘。該等細胞係小心地再懸浮於小量之融合瘤篩選培養基(Hybridoma Selection Medium；即為補充有0.5x HA(Sigma,目錄號A9666)之融合瘤培養液)，且該體積係以更多之融合瘤篩選培養基適宜地調整，以下列最終塗佈條件為基準：96孔培養盤中每一孔中有5x10⁶ 個B細胞總量在200 μL體積中。小心地混合該等細胞且移液至96孔培養盤中且使其得以生長。在第7或10天，移除一半的培養基，而該等細胞係以融合瘤篩選培養基再投料。

ELISA篩選 用於ELISA分析，濃度為4ug/ml之重組人類PDGFR－α(R&D系統,目錄號322－PR/CF)係使用為一cap補捉劑。ELISA盤係以在抗原塗覆緩衝液中之50 μl/孔的重組人類PDGFR－α塗覆(0.1 M碳酸鹽緩衝液、pH 9.6 NaHCO3(分子量84)8.4 g/L)且培育在4℃下一整夜。隔天，該ELISA盤係以清洗緩衝液(0.05% Tween 20 in 1x PBS)清洗三次且接著以200 μl/孔之阻斷緩衝液(在1x PBS中之1% BSA,0.1% Tween 20,0.01%硫柳汞)在室溫下進行阻斷1小時。當完成該阻斷步驟時，50 μl/孔的融合瘤上清液係在室溫下培育2小時。在培育之後，該ELISA盤係以清洗緩衝液清洗三次。在該清洗步驟之後，50 μl/孔的偵測抗體係加入該等孔中且在室溫下培育1小時。該ELISA盤係接著以清洗緩衝液清洗三次且加入TMB受質(50 μl/孔)。接著加入終止溶液(50 μl/孔)，該ELISA盤係以一ELISA盤閱讀機在650nm下解讀。由ELISA認為是陽性的上清係接著以FMAT及FACS評估。

範例3 由FMAT及FACS選擇抗體候選者

在14天的培育之後，融合瘤上清液係以螢光微體積測試技術(FMAT)藉由對抗人類骨瘤MG－63細胞株或HEK293細胞之篩選而進行PDGFR－α專一性單株抗體的篩選，其中該等細胞係經轉染有人類PDGFR－α，且以對抗親代HEK293細胞作為對照篩選。

依據第一次篩選而來之陽性融合瘤細胞生長孔的培養上清液係經移除且該PDGFR－α正性融合瘤細胞係以新鮮的融合瘤培養基懸浮且係移至一24－孔盤中。在二天的培育之後，這些上清液係準備為一第二確認性篩選。在第二次確認性篩選中，在第一次篩選中為陽性的細胞係以二組或三組分開使用的偵測抗體藉由FACS進行篩選：1.25ug/ml GAH－γCy5(JIR#109－176－098)用於人類γ鏈的偵測；1.25ug/ml GAH－PE(S.B.#2063－09)用於人類輕鏈的偵測以及1.25ug/ml GAH－λPE(S.B.#2073－09)用於人類λ輕鏈的偵測，以確認該抗PDGFR－α抗體係完全人類抗體。

範例4 PDGFR酪胺酸磷酸化作用測試

使用PDGFR酪胺酸磷酸化作用(pTyr)測試以決定該等抗體株是否抑制腫瘤細胞中PDGFR－α的磷酸化作用而審視該791個抗體株。

簡言之，人類骨瘤MG－63細胞係以10,000細胞於100 μl的飢態培養基(Starvation Media)(1%碳黑/葡聚糖處理之FBS)量種在96孔FMAT測試盤之每孔中且培育在37℃下約20小時。飢態培養基係經移除且37.5 μl的培養基係添加至容納樣本之所有孔中且12.5 μl係添加至容納控制組之孔中(小鼠單株抗體，抗－PDGFR－α(BD PharMingen目錄號# 556001)或是小鼠IgG2a(serotech,2倍的最終濃度))且培育在37℃下30分鐘。50 μl的在1%測試培養基內2倍最終濃度的PDGF－AA(R&D)(50ng/ml)係加入所有的盤中且將培養基加至控制盤之第12欄。盤係培育在37℃下10分鐘。移除培養基且加入100 μl之在PBS/3%BSA中的3.7%甲醛且在室溫下培育20分鐘。以PBS清洗該等盤2次且加入100 μl的透化緩衝液(permeabilization buffer)(在3%BSA/PBS中之0.1% Triton－X)至各孔中，在室溫下培育10分鐘，且移除之。添加100 ml之在PBS/3% BSA中的0.6%過氧化氫以中止任何內生性過氧化酶活性且在室溫下培育20分鐘。以PBS/0.1% Tween－20清洗該等盤3次且以100 μl的在PBS/0.1% Tween－20中的10% FBS阻隔。該等盤係在室溫下培育1小時，移除阻隔(緩衝液，且50 μl之在10% FBS/PBS－T中的抗－磷酸化PDGF－α抗體(sc－12910－R)(1 μg/ml)係添加至各孔中。該等盤係在室溫下培育2小時，接著以PBST清洗3次，在每次清洗之間浸泡5分鐘。稀釋在阻隔緩衝液中之羊對抗兔之IgGFc－HRP二級抗體50 μl係添加且在室溫下培育1小時。以PBST清洗該等盤5分鐘3次且扣乾。添加50 μl之ECL試劑(LumiGLO Reserve,KPL目錄號# 54－71－01)且立即讀取RLUs。以PBST清洗該等盤2次且扣乾。該等盤係接著在－80℃冷凍30－60分鐘。將該等盤取出至室溫且添加100 μl之CyQuant至各孔。該等盤係在一螢光讀取機之485 nm激光且在530 nm發光下讀值。

依據在pTyr測試中大於或等於90%之中和率而篩選出103株，也就是，該等經選取之抗體株抑制PDGF－α受體酪胺酸磷酸化作用多於或等於90%。(資料未顯示)

範例5 融合瘤上清液之親和力及濃度分析 高抗原(HA)/限制性抗原(LA)分析

利用下述之高抗體(HA)/限制性抗原(LA)分析而審視這103個抗體株。高抗原(HA)係一抗體濃度依賴型反應且因此用於抗體濃度的測定。LA係大多是一抗體親和力依賴型反應且因此可為一抗體親和力之測定。

高抗原定量測試 簡言之，相較於下述之限定性抗原定量測試(Limited Antigen Quantitation Assay)，ELISA盤係塗覆有一大量的人類PDGFR－α抗原(R&D Systems公司，Minneapolis,MN目錄號322－PR－050/CF)。含有抗體之融合瘤上清液係在1：51至1：1656的稀釋範圍內滴定。使用已知小鼠抗人類PDGFR－α－特異性抗體(PharMingen目錄號556001)之控制組以界定該測試之線性範圍。接著使用在該線性範圍內之資料以衍生出PDGFR－α特異性抗體在各經滴定之樣品中的相對濃度。

限定性抗原定量測試 相較於上述之高抗原定量測試，該等微滴定盤係塗覆有一低量之之人類PDGFR－α抗原。在1%脫脂奶/1X PBS pH 7.4/0.5%疊氮化物中之為50 μL之為64、32、16、8、4及2 ng/ml之人類PDGFR－α(涵蓋8.5 nM至0.26 nM之範圍)係添加至各孔中。該盤係培育30分鐘。

以水清洗該等盤4次且加入以1：25稀釋於1%脫脂奶/1X PBS pH 7.4/0.5%疊氮化物中含有待測抗體之融合瘤上清液50μL。以塑膠帶或石蠟紙將該等盤緊密地包起來且在室溫下搖晃培育一整夜。

在隔天，所有的盤係清洗5次且添加在1%牛奶、1X PBS pH 7.4中濃度為0.5 ug/ml之羊抗人類IgG Fc HRP多株抗體50 μL至各孔中。該等盤係在室溫下培育1小時。

該等盤係以飲用水清洗至少5次。50 μL之HPR受質TMB係添加至各孔中，且該等盤係培育30分鐘。藉由添加50 μL之1M磷酸至各孔中而中止HRP－TMB反應。測量該盤中各孔在450 nm之光度(吸光值)。

依據相對結合親和力選出34抗體株。選擇係基於16 ng/ml及2 ng/ml之抗原濃度下的滴定。選定之切點係LA多於0.3 OD單位及3.3 μg/ml。在抗原濃度2 ng/ml下呈現低反應性之株係被刪除。

基於在MG－63細胞中抑制PDGFR－α磷酸化作用之結果，9株額外的抗體株係加入以增加候選者總數，因此，總共有43抗體株呈現有效地抑制酪胺酸磷酸化作用以及高相對親和力(基於進一步所執行的HA/LA分析)。該先前所描述之9株額外的抗體株表現完全抑制PDGFR－α磷酸化作用(也就是100%)。沒有一抗體株和PDGFR－β或類似物(FLT3,c－kit,CSF－1R)交叉反應。

範例6 經選殖之單株抗體之活體外篩選及分析資料

30株抗體株係經選殖且以下列方式審視。

pTyr測試 PDGFR酪胺酸磷酸化作用(pTyr測試)係使用MG－63細胞如同上述範例4而執行。結果係顯示於第3表中。

增殖測試 使PDGF－AA Proliferation Assay Screen而評估經純化之對抗PDGFR－α單株抗體對於MG－63細胞生長之抑制作用。

簡言之，MG－63細胞係以每孔5000個細胞的量種在黑色清晰底盤之具有100 μl完整生長培養基的內部孔中且在37℃,5% CO₂ 下培育3－4小時。以1X PBS清洗細胞且更換為生長飢態培養基(MEM,1% NEAA,0.1%碳酸氫鈉,1% L－麩醯胺酸)且飢餓一整夜。將培養基自盤中移除且將50 μl之2X mAb或培養基添加至適當的孔中。50 μl之PDGF－AA滴定，200 ng/ml PDGF－AA或培養基單獨係添加且該等盤係培育3天。以Alamar Blue在530激光及580 nm發光下讀取該等盤(100 μl各孔/100 μl)。

Data for the最優良之15株單株抗體之資料(亦即是，在以100 ng/ml(3.45 nM)PDGF－AA之細胞刺激中表現最低之IC50值)係總結於以下第3表中。選定以進一步分析之單株抗體係以粗體字表示。該等經選定之抗體中之5株的劑量反應曲線係表示在第1圖中。該2.451.1.1之製備物中可能包括二不同之抗體，其具有相同之重鏈但不同之輕鏈，因為在針對此單株抗體之DNA解序期間有偵測到二個不同之輕鏈序列。

FACS Kd親和力測定 經純化之單株抗體(mAbs 2.175.3,2.449.1.3,2.451.1.1,2.998.2.2.84.3)對抗PDGFR－α之親和力係以FACS分析測定。

簡言之，表現PDGFR－α之MG－63細胞係再懸浮於FACS緩衝液中(2% FBS,0.05% NaN3)為接近3至5百萬個細胞/mL的濃度。細胞係保持在冰塊上。經純化之抗體及CD140a控制組係在96孔盤中之11個孔進行系列稀釋於經過濾之1x PBS(2x)。每一列的第12個孔只含有緩衝液而已。1x PBS及細胞係加入各單株抗體孔中使得最終體積為30 μL/孔且各孔包含將近100,000個細胞。該等單株抗體的最終分子濃度範圍係如下列：

該等盤係放置在一平板震盪器上且於4℃下搖晃5小時，接著經旋轉且以PBS清洗3次。200 μL之100或131 Nm的Cy5羊抗人類多株抗體(Jackson Laboratories,#109－175－008)係加入各孔中，且200 μL之100 nM Cy5羊抗小鼠多株抗體係加入和CD140a抗體複合之細胞。該等盤係接著被放置在震盪器上且於4℃下搖晃40分鐘，接著經旋轉且以PBS清洗3次。

使用一FACSCalibur儀器測定各單株抗體濃度下15,000至20,000個細胞項目中之幾何平均螢光值(Geometric Mean Fluorescence，GMF)。對於各單株抗體，該GMF資料係對二重覆滴定值進行相對於各滴定中一相同單株抗體濃度點進行標準化。相對應之經標準化的滴定點係取平均值以給予各單株抗體濃度一經標準化之GMF點。對於單株抗體2.351.3，只有一滴定資料組為用可接受於分析之品質。為分子單株抗體濃度之一函數的GMF非線性圖面係符合使用以下方程式之科學軟體：

在上述方程式中，F＝幾何平均螢光值，LT＝總分子單株抗體濃度，P’＝關於經結合單株抗體之任意螢光單位的比例性常數，以及KD＝平衡解離常數。對於各單株抗體，對於KD之估計值係在P及KD被允許於在該非線性分析中自由地流動時而得到。以下第4表列出各單株抗體之KDs結果以及該事件的95%信賴區間。單株抗體係以親和力遞減的順序列出。

小鼠交叉反應 為了建立一動物異體移植研究，係使用NIH3T3細胞以測定小鼠交叉反應。經測試之單株抗體中只有3株呈現小鼠交叉反應。結果係總結在第5表中。

內化之比例 經內化至細胞內之抗體的比例係使用一標準內化實驗書而測定。在10 μg/ml濃度下之內化結果比例係總結於第5表中。

結果 活體外篩選之結果以及30株經選殖之單株抗體的資料結果係鏓結於第5表中。單株抗體係以IC50值遞增的順序列出。以斜體字列出之單株抗體係經選定為10大優良單株抗體，而以粗體字列出之單株抗體係經選定為3個領先的候選者。“()”表示在第5表中的等級。

如第5表中可見的，單株抗體2.175.3呈現優異的抑制MG－63細胞中PDGF－AA增殖，以及優異地抑制MG－63細胞中PDGFRα的磷酸化作用。單株抗體2.449.1.3及2.998.2也在MG－63細胞中抑制PDGFRα的磷酸化作用且抑制MG－63細胞的PDGF－AA增殖。此外，單株抗體2.449.1.3及2.998.2也具有對於PDGFR－α的高結合親和力。

範例7 抗－PDGFR－α抗體之結構分析

該等抗體之重鏈及輕鏈可變功能區係經序列分析以確定其DNA序列。該等抗PDGFR－α抗體之完整的序列資訊係提供在具有各γ及鏈組合之核苷酸及胺基酸序列的序列表中。該可變重鏈係經分析以確定該VH家族、該D－區域序列及該J－區域序列。該等序列係接著經轉譯以決定該一級胺基酸序列且和胚源VH、D及J－區域序列比對以評估體細胞超突變。「－」表示和胚源序列一致。「#」表示在該抗體序列中一額外的胺基酸(其不在胚源序列被發現)。

第12表係一比較該抗體重鏈區域和其同源之胚源重鏈區域。第13表係一比較該抗體輕鏈區域和其同源之胚源輕鏈區域。

免疫球蛋白鏈之可變(V)區係由多重胚源DNA節段譯碼而成，其係在B細胞發育過程中相連結為功能性可變區域(VHDJH或VKJK)。

該被了解的是，一特定抗體在胺基酸層次不同於其個別胚源序列之處，該抗體序列可被突變回去該胚源序列。如此之校正性突變可發生在一、二、三或更多的位置上，或是任何該等突變位置的組合，使用標準的分子生物技術。作為非限制性的範例，第12表顯示，該單株抗體2.175.3之重鏈序列(SEQ ID NO.：2)不同於該相對之胚源序列之處在於在FR1區域中之一Q至H的突變(突變1)，在CDR1區域中之一S至H的突變(突變2)，以及在CDR2區域中之一S至R的突變(突變3)。因此，單株抗體2.175.3之重鏈的胺基酸序列或是譯碼出單株抗體2.175.3之重鏈的核苷酸序列可經過修改以改變突變1以在突變1的位置產生胚源序列。此外，單株抗體2.175.3之重鏈的胺基酸序列或是譯碼出單株抗體2.175.3之重鏈的核苷酸序列可經過修改以改變突變2或突變3以在突變2或突變3的位置產生胚源序列。事實上該單株抗體2.175.3之重鏈的胺基酸序列或是譯碼出單株抗體2.175.3之重鏈的核苷酸序列可包含二或更多突變之組合以在那些特定之位置產生胚源序列。以下第6－11表說明單株抗體2.175.3、2.449.1.3及2.998.2中由其胚源而來之此類變化的位置。各列係代表在經指定之位置之胚源或非胚源殘基的一特定組合。在序列表和第6－11表之間不相符的情形下，以該等表格所提供之資訊為優先。

範例8

藉由BIACORE分析之親和力測定Biacore實驗(生物分子交互作用分析，biomolecular interaction analysis,BIACORE)係使用一Biacore T100儀器在22℃下執行。利用該生物感測器表面和該抗體之標準醛偶合。特定地，50 μg之各單株抗體係和~1 mM NaIO4在0.1 M之NaOAc(pH 5.5)中在冰上反應25分鐘且接著該氧化反應係藉由在一具有10 mM NaOAC,pH 4.0之Sephadex G－25核酸純化－5管柱中(NAP－5,GE biosciences)去鹽化而中止。該單株抗體係接著流過一已和EDC/NHS、碳醯肼及乙醇胺反應過之CM5生物感測器表面。在到達所欲之表面容量之後，在該單株抗體及該表面間之腙鍵係藉由使在0.1 M NaOAc、pH 4.0中之0.1 M NaBH3CN流過該經固定化之單株抗體達20分鐘而減低。

單株抗體2.998.2(SEQ ID Nos：14及16)、2.175.3(SEQ ID Nos：2及4)、2.175.3變化體A(具有3Q,80Y之SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：134)；具有46L,77S之SEQ ID NO：4(SEQ ID NO：135))、2.449.1(SEQ ID NO：10及12)，以及2.449.1變化體A(SEQ ID NO：10；具有49Y,107I之SEQ ID NO：12(SEQ ID NO：136))係固定於一CM5生物感測器晶片上。在濃度範圍51.6－0.806 nM(2倍系列稀釋)之重組人類sPDGFR－α(R&D目錄號# 322－PR/CF；批次號# QY056081)係注入90秒且接續3分鐘的解離。因該解離相對於所有研究的相互反應係明顯地為非常地慢，在啟始之30次注射完成之後，一組額外的6次注射(3次為25.8 nM而3次為空白緩衝液注射)係和一具有14,400秒(4小時)解離相之90秒注射一起執行。該等樣品係製備在添加有100 μg/ml之BSA之Hepes－緩衝鹽溶液、0.005%聚山梨酸酯20，pH 7.4(HBS－P)中。所有的樣品係隨機地三重覆注射且具有散置的超過10次的緩衝液注射用以雙重參考。所有感應譜資料係以Scrubber 2.0處理且使用CLAMP而總體地符合一包括用於質量運送之關係的1：1相互作用模式。該所得之結合常數係列於以下表格中。單株抗體係以最高親和力至最低親和力的順序列出。

第14表中之結果顯示，由Biacore分析所測得者，2.175.3 and 2.449.1的胚源變化體顯示出對可溶性PDGFR－α增加的親和力，相較於各別之非胚源抗體。相較於其正常的對應物，所有的胚源抗體顯示出降低的解離常數，其為導致所觀察到的親和力增加。第14表之該等抗體中具最高親和力之4株係在一如範例2所述之可溶性PDGFR－α結合ELISA以及範例4所述之MG－63磷酸化作用測驗中進行測試。所得之IC50值係列在第15表中。

範例9 在人類腫瘤異體移植模式中之抗腫瘤效用的評估

該上述抗體中之二者的抗腫瘤效用係在一非小細胞肺癌(Calu－6)之異體移植模式中評估。該宿主小鼠係衍生自Black6/129小鼠(具有藉由同源重組而將鼠類之PDGFR－α基因置換成人類PDGFR－α)及SCID小鼠間之雜交。該所產生之小鼠表現人類的PDGFR－α受體而非鼠類受體。這些插入/剔除小鼠19週大時(10/組)係在其右側腹注射入在0.1 ml之基質凝膠(matrigel)中之2*10⁶ Calu－6細胞。當該腫瘤達到平均170 mm³ 的大小時，在一磷酸鹽緩衝鹽溶液載劑中或空白鹽溶液載劑之抗體係以每公斤10 mg抗體的量在該研究期間進行每週2次的腹內投藥。第2a圖顯示每一治療組在每一時間的平均腫瘤大小，然而第2b圖顯示在每一時間的平均體重。以二抗體之治療明顯地減少腫瘤生長；以2.175.3治療產生55%之減少生長(p＝0.06)，然而以2.449.1.3治療則產生73%之減少生長率(p<0.001)。在研究期間，各組之間的體重改變並沒有明顯的差異(第2b圖)。

2.449.1.3及2.449.1.3變化體A之抗腫瘤功效係進一步在U118膠質瘤異體移植模式中評估。19週大的SCID小鼠(10/組)係在其右側腹注射入在0.1 ml之基質凝膠(matrigel)中之2*10⁶ 個細胞。當該腫瘤達到平均280 mm³ 的大小時，該抗體係如上述Calu－6模式般的投藥。結果係顯示在第3圖中。該抗體2.449.1.3減少U118腫瘤的生長達94%(p<0.000001)。2.449.1.3之變化體A減少生長達101%。因此，2.449.1.3及2.449.1.3變化體A對於減少此膠質瘤異體移植生長係皆呈高度活性的，且在此模式中，變化體A之突變並不減少活體內之活性。

併入作為參考

所有在此引用之參考文獻，包括專利、專利申請案、論文、教科書等等係整體併入於此作為參考。

等效物

上述所撰寫之說明書係被認為足以使一習於此藝者實施本發明。上述敘述及範例係詳述特定之本發明較佳實施態樣且敘述本發明所預期之最佳模式。然而，將被了解的是，無論前述在內文中呈現得多詳細，本發明可以許多方式實施且本發明應依據所附之申請專利範圍及任何其等同物來解讀。

第1圖係一顯示5種經選定之單株抗體之劑量反應的圖表，其係就抑制PDGF－AA－所引發之MG－63腫瘤細胞增生%對於抗體濃度ng/ml而言。使用100 ng/ml(3.45nM)的PDGF－AA進行細胞刺激。

第2a－2b圖顯示2.175.3及2.449.1.3在Calu－6非小細胞肺異種移植模式之活體內抗腫瘤評估。第2a圖顯示平均腫瘤大小(mm³ )對時間(天數)，而第2b圖顯示平均體重(g)對時間(天數)。該方形點表示該載劑治療組；該圓形點表示該2.175.3 10 mg/kg治療組；該三角形點表示該2.449.1.3 10mg/kg治療組。

第3圖顯示該等抗體在SCID小鼠之U118神經膠質瘤異種移植模式之活體內評估的結果。圖表中係以抗體治療之腫瘤大小(mm³ )對時間(天數)。該方形點表示該載劑治療組；該圓形點表示該2.175.3 10 mg/kg治療組；該三角形點表示該2.449.1.3 10mg/kg治療組。

<110> 亞斯特拉塞奈卡公司 梁 娜歐密 康 賈斯伯S. 佛特茲 艾恩 葛茲特－波史崔 葛迪 楊小丹 布拉基 大衛C. <120> 針對血小板衍生生長因子受體－α(PDGFR－α)之致標性結合劑及其用途<130> ASTR－013/Paris Convention <150> US 60/835,647 <151> 2006－08－03 <160> 136 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> 人類<400> 1<210> 2 <211> 120 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 2 <210> 3 <211> 324 <212> DNA <213> 人類<400> 3<210> 4 <211> 108 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 4 <210> 5 <211> 360 <212> DNA <213> 人類<400> 5<210> 6 <211> 120 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 6 <210> 7 <211> 336 <212> DNA <213> 人類<400> 7<210> 8 <211> 112 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 8 <210> 9 <211> 360 <212> DNA <213> 人類<400> 9<210> 10 <211> 120 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 10<210> 11 <211> 324 <212> DNA <213> 人類<400> 11<210> 12 <211> 108 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 12<210> 13 <211> 351 <212> DNA <213> 人類<400> 13<210> 14 <211> 117 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 14<210> 15 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 15 <210> 16 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 16<210> 17 <211> 351 <212> DNA <213> 人類<400> 17 <210> 18 <211> 117 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 18<210> 19 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 19<210> 20 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 20<210> 21 <211> 324 <212> DNA <213> 人類<400> 21<210> 22 <211> 108 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 22<210> 23 <211> 372 <212> DNA <213> 人類<400> 23<210> 24 <211> 124 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 24 <210> 25 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 25<210> 26 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 26 <210> 27 <211> 354 <212> DNA <213> 人類<400> 27<210> 28 <211> 118 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 28 <210> 29 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 29<210> 30 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 30 <210> 31 <211> 351 <212> DNA <213> 人類<400> 31<210> 32 <211> 117 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 32 <210> 33 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 33<210> 34 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 34<210> 35 <211> 351 <212> DNA <213> 人類<400> 35<210> 36 <211> 117 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 36<210> 37 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 37<210> 38 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 38<210> 39 <211> 360 <212> DNA <213> 人類<400> 39 <210> 40 <211> 120 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 40<210> 41 <211> 324 <212> DNA <213> 人類<400> 41 <210> 42 <211> 108 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 42<210> 43 <211> 360 <212> DNA <213> 人類<400> 43<210> 44 <211> 120 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 44<210> 45 <211> 324 <212> DNA <213> 人類<400> 45<210> 46 <211> 108 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 46<210> 47 <211> 360 <212> DNA <213> 人類<400> 47<210> 48 <211> 120 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 48 <210> 49 <211> 324 <212> DNA <213> 人類<400> 49<210> 50 <211> 108 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 50 <210> 51 <211> 363 <212> DNA <213> 人類<400> 51<210> 52 <211> 121 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 52 <210> 53 <211> 327 <212> DNA <213> 人類<400> 53<210> 54 <211> 109 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 54 <210> 55 <211> 351 <212> DNA <213> 人類<400> 55<210> 56 <211> 117 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 56 <210> 57 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 57<210> 58 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 58 <210> 59 <211> 354 <212> DNA <213> 人類<400> 59<210> 60 <211> 118 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 60 <210> 61 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 61<210> 62 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 62<210> 63 <211> 363 <212> DNA <213> 人類<400> 63<210> 64 <211> 121 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 64<210> 65 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 65<210> 66 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 66<210> 67 <211> 354 <212> DNA <213> 人類<400> 67 <210> 68 <211> 118 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 68<210> 69 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 69 <210> 70 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 70<210> 71 <211> 354 <212> DNA <213> 人類<400> 71<210> 72 <211> 118 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 72<210> 73 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 73<210> 74 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 74<210> 75 <211> 363 <212> DNA <213> 人類<400> 75<210> 76 <211> 121 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 76<210> 77 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 77<210> 78 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 78 <210> 79 <211> 366 <212> DNA <213> 人類<400> 79<210> 80 <211> 122 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 80 <210> 81 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 81<210> 82 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 82 <210> 83 <211> 357 <212> DNA <213> 人類<400> 83<210> 84 <211> 119 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 84 <210> 85 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 85<210> 86 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 86 <210> 87 <211> 372 <212> DNA <213> 人類<400> 87<210> 88 <211> 124 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 88 <210> 89 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 89<210> 90 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 90<210> 91 <211> 360 <212> DNA <213> 人類<400> 91<210> 92 <211> 120 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 92<210> 93 <211> 324 <212> DNA <213> 人類<400> 93<210> 94 <211> 108 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 94<210> 95 <211> 360 <212> DNA <213> 人類<400> 95 <210> 96 <211> 118 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 96<210> 97 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 97 <210> 98 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 98<210> 99 <211> 351 <212> DNA <213> 人類<400> 99<210> 100 <211> 117 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 100<210> 101 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 101<210> 102 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 102<210> 103 <211> 381 <212> DNA <213> 人類<400> 103<210> 104 <211> 127 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 104<210> 105 <211> 333 <212> DNA <213> 人類<400> 105<210> 106 <211> 111 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 106 <210> 107 <211> 360 <212> DNA <213> 人類<400> 107<210> 108 <211> 120 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 108 <210> 109 <211> 324 <212> DNA <213> 人類<400> 109<210> 110 <211> 108 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 110 <210> 111 <211> 360 <212> DNA <213> 人類<400> 111<210> 112 <211> 120 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 112 <210> 113 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 113<210> 114 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 114 <210> 115 <211> 354 <212> DNA <213> 人類<400> 115<210> 116 <211> 118 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 116 <210> 117 <211> 306 <212> DNA <213> 人類<400> 117<210> 118 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 118<210> 119 <211> 351 <212> DNA <213> 人類<400> 119<210> 120 <211> 117 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 120<210> 121 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<400> 121<210> 122 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 122<210> 123 <211> 384 <212> DNA <213> 人類<400> 123 <211> 124 <211> 128 <212> 蛋白質<213> 人類<411> 124<210> 125 <211> 321 <212> DNA <213> 人類<410> 125 <210> 126 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 126<210> 127 <211> 116 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 127 <210> 128 <211> 118 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 128<210> 129 <211> 114 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 129<210> 130 <211> 108 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 130 <210> 131 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 131<210> 132 <211> 107 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 132 <210> 133 <211> 105 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 133<210> 134 <211> 120 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 134<210> 135 <211> 108 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 135 <210> 136 <211> 108 <212> 蛋白質<213> 人類<400> 136

Claims (13)

1. 一種經分離之抗體或其結合片段，其專一性地結合至PDGFR-α且抑制表現PDGFR-α之細胞的生長，其中該抗體包含一包含SEQ ID NO.：10胺基酸序列之重鏈與一包含SEQ ID NO.：136胺基酸序列之輕鏈，其中該抗體或其結合片段包含：一重鏈互補決定區域(CDR)1，包含胺基酸序列GFTFSDYYMN；一重鏈CDR2，包含胺基酸序列YISSSGSIIYYADSVKG；一重鏈CDR3，包含胺基酸序列EGRIAARGMDV；一輕鏈CDR1，包含胺基酸序列RPSQSFSRYIN；一輕鏈CDR2，包含胺基酸序列AASSLVG；及一輕鏈CDR3，包含胺基酸序列QQTYSNPPIT；且其中該抗體或其結合片段以一少於約40pM之K_D 結合PDGFR-α。
2. 如申請專利範圍第1項之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段不會和PDGFR-β交叉反應。
3. 如申請專利範圍第1項之抗體或其結合片段，其中該抗體係一完全人類單株抗體或該結合片段係一完全人類單株抗體之一結合片段。
4. 如申請專利範圍第1項之抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段係Fab、Fab’、F(ab’)₂ 、Fv或dAb。
5. 一種編碼如申請專利範圍第1項之抗體或其結合片段之核酸分子。
6. 一種包含如申請專利範圍第5項之核酸分子的載體。
7. 一種包含如申請專利範圍第6項之載體的宿主細胞。
8. 一種包含有如申請專利範圍第1項之抗體或其片段以及一治療劑之綴合物。
9. 如申請專利範圍第8項之綴合物，其中該治療劑係一毒素。
10. 如申請專利範圍第8項之綴合物，其中該治療劑係一放射性同位素。
11. 一種包含有如申請專利範圍第1項之抗體或其結合片段以及一藥學上可接受之載劑的組成物。
12. 一種如申請專利範圍第1項之抗體或其結合片段用於製造一用於治療腫瘤疾病(neoplastic disease)之藥物的用途。
13. 如申請專利範圍第12項之抗體或其結合片段的用途，其中該腫瘤疾病係為下列之一者：黑色素瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膠質瘤、肝癌[hepatocellular(liver)carcinoma]、甲狀腺腫瘤、胃癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、神經膠元母細胞瘤(glioblastoma)、子宮內膜癌、腎臟癌、結腸癌、胰臟癌、食道癌、頭頸部腫瘤、惡性間皮瘤(mesothelioma)、肉瘤、膽管癌[biliary(cholangiocarcinoma)]、小腸腺癌、兒童惡性腫瘤、扁平細胞瘤(epidermoid carcinoma)以及胃腸道基質瘤(GIST)。