MX2009001021A

MX2009001021A - Agentes de union especificos dirigidos a pdgfr-alfa y sus usos.

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Publication number: MX2009001021A
Application number: MX2009001021A
Authority: MX
Inventors: Ian Foltz; Jaspal Singh Kang; Gadi Gazit-Bornstein; David Charles Blakey; Susan Ann Cartlidge; Naomi Laing; Xiadong Yang; Laura Taylor
Original assignee: Astrazeneca Ab
Priority date: 2006-08-03
Filing date: 2007-08-02
Publication date: 2009-02-05
Also published as: CL2007002225A1; CN103588881A; EP2420513A1; DK2049571T3; AU2007348940A1; IL222833A0; ES2402380T3; KR20090056969A; JP5437804B2; JP2010500872A; AU2007348940B2; TWI503329B; PL2049571T3; NZ596381A; EP2049571A2; NZ575245A; WO2008112003A2; ZA200900461B; SI2049571T1; IL196209A0

Abstract

Se describen agentes de unión objeto dirigidos al antígeno PDGFR-alfa y usos de tales agentes. Más específicamente la invención se refiere a anticuerpos monoclonales completamente humanos dirigidos al antígeno PDGFR-alfa y a usos de estos anticuerpos. Los aspectos de la invención también se refieren a hibridomas u otras líneas celulares que expresan tales anticuerpos. Los agentes de unión objeto y anticuerpos descritos son útiles como diagnóstico y para el tratamiento de enfermedades asociadas a la actividad y/o sobre-expresión de PDGFR-alfa.

Description

AGENTES DE UNION ESPECIFICOS DIRIGIDOS A PDGFR-ALFA Y SUS USOS Campo de la Invención La invención se refiere a agentes de unión específicos contra el PDGFR-alfa antígeno específico y usos de tales agentes. En algunas modalidades, la invención se refiere a anticuerpos monoclonales completamente humanos dirigidos a PDGFR-alfa y usos de estos anticuerpos. Los aspectos de la invención también se relacionan a hibridomas u otras líneas celulares que expresan tales agentes de unión específicos o anticuerpos. Los agentes de unión específicos y anticuerpos descritos son útiles como diagnósticos y para el tratamiento de enfermedades asociadas con la actividad y/o sobreexpresion dei PDGFR-alfa. Antecedentes de la Invención El factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF por sus siglas en inglés) es una proteína que regula el crecimiento y división celular. Hay cinco diferentes isoformas de PDGF (A, A, C, D, y un heterodímero AB) que existan como dimeros y activan la respuesta celular a través de dos diferentes receptores (PDGFR-alfa y PDGFR-beta). Específicamente, los dimeros de PDGF unen a dos receptores simultáneamente para inducir la dimerización, autofosforilación y señalización intracelular del receptor.

El receptor-alfa del factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGFR-alfa, también conocido como CD140a,) es una tirosina cinasa del receptor tipo III caracterizado por un dominio extracelular que tiene cinco dominios similares a IgG, un dominio transmembrana y un dominio intracelular catalítico. El PDGFR-alfa puede formar homodimeros o heterodímeros con el PDGFR-beta estructuralmente similar. El PDGF-AA activa solamente dímeros del receptor alfa-alfa, PDGF-AB y PDGF-CC activan dímeros del receptor alfa-alfa y/o alfa-beta y PDGF-BB activa todas las tres combinaciones de dímeros del receptor. El PDGFR-alfa se ha ligado al tumorigénesis y se ha implicado en un número de cánceres incluyendo mama, pulmón, ovárico, próstata, colon y cánceres endometriales, así como carcinoma hepatocelular, glioblastoma, melanoma, y tumor estromal gastrointestinal (GIST)). Varias compañías han desarrollado agentes terapéuticos que detectan el PDGFR-alfa. Gleevec© (Novartis®) y SUTENT/SU11248 (malato de sunitinib, Pfizer©) son fármacos de molécula pequeña que detectan PDGFR-alfa así como otras tirosina cinasas del receptor. Además, se han reportado anticuerpos monoclonales que detectan PDGFR-alfa. La publicación internacional número W01992/013867 describe que los anticuerpos monoclonales y/o policlonales de ratón o conejo pueden prepararse para constructos del receptor de PDGF. La publicación internacional número WO 1995/000659 se relaciona con un anticuerpo monoclonal, específico para PDGFR-alfa, caracterizado en que une PDGFR-alfa y no une PDGFR-beta. La solicitud describe dos anticuerpos; caracterizados como que tienen afinidad de unión máxima media de 50pM y 75pM como se midió por el ensayo inmunosorbente de enzima enlazado de fase sólida. La publicación internacional número WO2006/138729 describe un anticuerpo monoclonal completamente humano, llamado 3G3 (ImClone Systems, Inc.), que detecta PDGFR-alfa. Este anticuerpo tiene una afinidad detectada para PDGFR-alfa soluble de 40 pM como se midió en un ensayo de afinidad bivalente; en el cual PDGFR-alfa soluble se inmovilizó en un chip sensor y el anticuerpo se inyectó en varias concentraciones. Como se discutió en la presente, en un ensayo bivalente, los artefactos experimentales puede afectar la afinidad medida. Un anticuerpo con una afinidad mayor de 40 pM, puede ser deseable mientras tal anticuerpo puede producir una amplitud y/o duración mayor de inhibición del PDGFR-alfa cuando se administra a humanos en dosis estándar. Un anticuerpo con una afinidad mayor de 40pM puede administrarse en una dosis efectiva menor que un anticuerpo con una afinidad menor, o puede administrarse en intervalos de dosificación prolongados en comparación con un intervalo de dosificación estándar para un anticuerpo con una afinidad menor. Breve Descripción de la Invención Las modalidades de la invención se relacionan con agentes de unión específicos que unen específicamente a PDGFR-alfa e inhiben el crecimiento de células que expresan PDGFR-alfa. Los mecanismos por los cuales esto puede realizarse pueden incluir, y no se limitan a, bloqueo de la unión de ligando y/o señalización celular implicada en el crecimiento celular tumoral así como inhibición del componente fibroblasto estromal llevado a reducido la angiogénesis. Los agentes de unión específicos son útiles para reducir el crecimiento tumoral y angiogénesis. En una modalidad de la invención, el agente de unión específico es un anticuerpo completamente humano que une al PDGFR-alfa e inhiben la unión de los ligandos de PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, y/o PDGF-CC a PDGFR-alfa. Aún otra modalidad de la invención es un anticuerpo monoclonal completamente humano que une al PDGFR-alfa e inhiben la autofosforilación del receptor. Otra modalidad de la invención es un anticuerpo monoclonal completamente humano que une al PDGFR-alfa e inhiben la señalización celular corriente abajo implicada en el crecimiento celular. En algunas modalidades, el agente de unión específico une al PDGFR-alfa y sin reacción cruzada con el receptor PDGFR-beta, es decir, el agente es monoespecífico. En algunas modalidades, el agente de unión específico une al PDGFR-alfa y no cruza la reacción con otros miembros de familia tirosina cinasa del receptor de Clase III, tal como, por ejemplo, FLT3. c-kit, y/o CSF-IR.

Otra modalidad de la invención es un agente de unión específico que compite por la unión con cualquier de los agentes de unión específicos o anticuerpos descritos en la presente. En una modalidad, el agente de unión específico une PDGFR-alfa con un KD de menos de aproximadamente 500 picomolar. En otra modalidad, el agente de unión específico unido con un KD menor de aproximadamente 400, 300, 200 ó 100 pM. En una modalidad, el agente de unión específico une con un KD de menor de aproximadamente 75, 60, 50. 40, 30, 20, 10 o 5 pM Las medidas de la afinidad y/o de la avidez se pueden medir por FMAT, FACS, KinExA® y/o BIACORE©, como se describe en la presente. En otra modalidad, el agente de unión específico une PDGFR-alfa con un KD menor de aproximadamente 400, 300, 200, ó 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 10, ó 5 pM como se midió en un análisis de afinidad monovalente. La afinidad monovalente puede medirse en un ensayo de BIACORE© en el cual el receptor soluble se fluye sobre el anticuerpo inmovilizado. En comparación con un ensayo de afinidad bivalente, el KD como se reportó por un ensayo de afinidad monovalente es mucho menos probable sea afectado por artefactos experimentales y así puede reportar un KD mucho más cercano a la afinidad monovalente real del anticuerpo. En un ensayo de afinidad bivalente, la densidad del receptor inmovilizado influye la amplitud a la cual las moléculas del anticuerpo sencillas se ligan dos veces y/o el receptor inmovilizado religado cuando se fluyen encima. Como tal, en un ensayo de afinidad bivalente, la densidad del receptor puede afectar directamente al KD descrito. Así, un ensayo de afinidad monovalente proporciona una medida mucho más biológicamente relevante de afinidad. En otra modalidad, el agente de unión específico inhibe la transfosforilación inducida al ligando dentro del dímero del receptor con un Cl50 menor de aproximadamente 400, 300, 200, ó 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 10, ó 5 pM cuando se realiza cerca para saturar los niveles del ligando. En otra modalidad, el agente de unión específico inhibe la autofosforilación del receptor inducida al ligando con un Cl50 menor de aproximadamente 400, 300, 200, 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 10 ó 5 pM cuando se realiza cerca para saturar los niveles del ligando. En una modalidad de la invención, el agente de unión específico es un anticuerpo. En una modalidad de la invención, el agente de unión específico es un anticuerpo monoclonal. En una modalidad de la invención, el agente de unión específico es un anticuerpo monoclonal completamente humano. En otra modalidad de la invención, el agente de unión específico es un anticuerpo monoclonal completamente humano del isotipo IgGI, lgG2, lgG3 o lgG4. En otra modalidad de la invención, el agente de unión específico es un anticuerpo monoclonal completamente humano del isotipo lgG2. Este isotipo tiene reducida la potencial para provocar la función efectora en comparación con otros isotipos, que pueden llevar a la toxicidad reducida. Una modalidad adicional es un anticuerpo que une al PDGFR-alfa y comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que tiene uno, dos o tres de las secuencias de regiones que determinan la complementariedad mostrada en la Tabla 12 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que tiene una, dos o tres de las secuencias de CDR mostrada en la Tabla 13. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo que une el mismo epítope como cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente. En una modalidad, la cadena pesada del anticuerpo 2.175.3, 2.451.1, 2.449.1.3, 2.998.2 o 2.84.3 se empareja con una cadena ligera heteróloga. La promiscuidad de la cadena ligera está bien establecida en la técnica. Así, la cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos 2.175.3, 2.451.1, 2.449.1.3, 2.998.2 ó 2.84.3 u otros anticuerpos como se describe en la presente puede emparejarse con la cadena ligera de cualquieras de los anticuerpos 2.175.3, 2.451.1, 2.449.1.3, 2.998.2, 2.84.3 u otro anticuerpo como se describe en la presente. En una modalidad un sitio de unión al antígeno puede comprender una cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y una cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 de cualquiera de los anticuerpos 2.175.3, 2.451.1, 2.449.1.3, 2.998.2, 2.84.3 con cualquiera como veinte, dieciséis, diez, nueve o menos, por ejemplo uno, dos, tres, cuatro o cinco, adiciones, sustituciones, eliminaciones, y/o inserciones de aminoácidos dentro de los CDRs descritos. Tales modificaciones pueden potencialmente hacerse en cualquier residuo dentro de los CDRs. En otra modalidad el agente de unión específico o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende cualquier, dos, tres, cuatro, cinco o seises secuencias CDR1, CDR2 o CDR3 como se muestra en la Tabla 12 o en la Tabla 13. En otra modalidad el agente de unión específico o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 como se muestra en la Tabla 12. En otra modalidad el agente de unión específico o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 como se muestra en la Tabla 13. En otra modalidad el agente de unión específico o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 como se muestra en la Tabla 12 y una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 como se muestra en la Tabla 13. Se observa que los expertos ordinarios en la técnica pueden lograr fácilmente determinaciones de CDR. Ver por ejemplo, Kabat y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest. Quinta edición, Publicación NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. En otra modalidad el agente de unión específico o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende cualquier, dos, tres, cuatro, cinco o seises de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.175.3, 2.449.1.3 ó 2.998.2 como se muestra en la Tabla 12 o en la Tabla 13. En una modalidad el agente de unión específico o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 2.175.3, 2.449.1.3 o 2.998.2, como se muestra en la Tabla 12. En otra modalidad el agente de unión específico o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 2.175.3, 2.449.1.3 ó 2.998.2, como se muestra en la Tabla 13. En otra modalidad el agente de unión específico o anticuerpo puede comprender una secuencia que comprende una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 2.175.3, 2.449.1.3 ó 2.998.2 como se muestra en la Tabla 12, y una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 2.175.3, 2.449.1.3 ó 2.998.2 como se muestra en la Tabla 13. En otra modalidad el agente de unión específico o anticuerpo comprende una secuencia que comprende una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 2.175.3 como se muestra en la Tabla 12 y una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 2.175.3 como se muestra en la Tabla 13. En otra modalidad el agente de unión específico o anticuerpo comprende una secuencia que comprende una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 2.449.1.3 como se muestra en la Tabla 12 y una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 2.449.1.3 como se muestra en la Tabla 13. En otra modalidad el agente de unión específico o anticuerpo comprende una secuencia que comprende una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 2.998.2 como se muestra en la Tabla 12 y una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal completamente humano 2.998.2 como se muestra en la Tabla 13. Una modalidad adicional de la invención es un agente de unión específico que compite para unir al PDGFR-alfa con el agente de unión específico o anticuerpos de la invención. En otra modalidad de la invención hay un anticuerpo que compite para unir al PDGFR-alfa con el agente de unión específico o anticuerpos de la invención. En otra modalidad el agente de unión específico o anticuerpo compite para unir a PDGFR-alfa con los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.175.3, 2.449.1.3 ó 2.998.2. En una modalidad de la invención se proporciona un anticuerpo que compite con cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.175.3. 2.449.1.3 ó 2.998.2 para unir a PDGFR-alfa.

Una modalidad adicional de la invención es un agente de unión específico o anticuerpo que une al mismo epítope en PDGFR-alfa como el agente de unión específico o anticuerpos de la invención. En otra modalidad de la invención hay un anticuerpo que une al mismo epítope en PDGFR-alfa como el agente de unión específico o anticuerpos de la invención. En una modalidad de la invención se proporciona un agente de unión específico que une al mismo epítope en PDGFR-alfa como cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.175.3, 2.449.1.3 ó 2.998.2. En una modalidad de la invención se proporciona un anticuerpo que une a! mismo epítope en PDGFR-alfa como cualquiera de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.175.3, 2.449.1.3 o 2.998.2. Una modalidad adicional de la invención es un agente de unión específico o anticuerpo que comprende las secuencias contiguas de cadena pesada y ligera que comprenden las regiones de estructurales y/o regiones que determinan la complementariedad (CDR's), específicamente de FR1 a FR4 o CDR1 a CDR3 de cualquiera de los anticuerpos monoclonales como se muestra en la Tabla 12 o en la Tabla 13. Una modalidad proporciona un agente de unión específico, o porción de unión a antígeno del mismo, en donde el agente, o porción de unión, comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEC ID NO.:2. En una modalidad, el agente, o porción de unión de la misma, adicionalmente comprende un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de la SEC ID NO.:4. Otra modalidad es un agente de unión específico, o porción de unión a antígeno del mismo, en donde el agente, o porción de unión, comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEC ID NO.: 10. En una modalidad, el agente, o porción de unión del mismo, adicionalmente comprende un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de la SEC ID NO.: 12. Aún otra modalidad es un agente de unión específico, o porción de unión a antígeno del mismo, en donde el agente, o porción de unión, comprende un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEC ID NO.: 14. En una modalidad, el agente, o porción de unión del mismo, adicionalmente comprende un polipéptido la cadena ligera que tiene la secuencia de la SEC ID NO.: 16. En una modalidad, el agente de unión específico comprende uno o más de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.175.3, 2.449.1.3 ó 2.998.2. En una modalidad, el agente de unión específico de la invención comprende un polipéptido que comprende la secuencia de la SEC ID NO.: 2, en donde la secuencia comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos de la línea germinal y no-línea germinal indicados por cada fila en la Tabla 6. En una modalidad, el agente de unión específico de la invención comprende un polipéptido que comprende la secuencia de la SEC ID NO.: 10, en donde la secuencia comprende cualquiera de las combinaciones únicas de los residuos de la línea germinal y no-línea germinal indicados por cada fila en la Tabla 8. En una modalidad, el agente de unión específico de la invención comprende un polipéptido que comprende la secuencia de la SEC ID NO.: 14, en donde la secuencia comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos de línea germinal y no-línea germinal indicadas por cada fila en la Tabla 10. En una modalidad, el agente de unión específico de la invención comprende un polipéptido que comprende la secuencia de la SEC ID NO.: 4, en donde la secuencia comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos de línea germinal y no-línea germinal indicadas por cada fila en la Tabla 7. En una modalidad, el agente de unión específico de la invención comprende un polipéptido que comprende la secuencia de la SEC ID NO.: 12, en donde la secuencia comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos de línea germinal y no-línea germinal indicadas por cada fila en la Tabla 9. En una modalidad, el agente de unión específico de la invención comprende un polipéptido que comprende la secuencia de la SEC ID NO.: 16, en donde la secuencia comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos de línea germinal y no-línea germinal indicadas por cada fila en la Tabla 11. En una modalidad, el anticuerpo de la invención comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de la SEC ID NO.: 2, en donde la secuencia comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos de línea germinal y no-línea germinal indicadas por cada fila en la Tabla 6. En una modalidad, el anticuerpo de la invención comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de la SEC ID NO.: 10, en donde la secuencia comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos de línea germinal y no-línea germinal indicadas por cada fila en la Tabla 8. En una modalidad, el anticuerpo de la invención comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de la SEC ID NO.: 14, en donde la secuencia comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos de línea germinal y no-línea germinal indicadas por cada fila en la Tabla 10. En una modalidad, el anticuerpo de la invención comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEC ID NO.: 4, en donde la secuencia comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos de línea germinal y no-línea germinal indicadas por cada fila en la Tabla 7. En una modalidad, el anticuerpo de la invención comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEC ID NO.: 12, en donde la secuencia comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos de línea germinal y no-línea germinal indicadas por cada fila en la Tabla 9. En una modalidad, el anticuerpo de la invención comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEC ID NO.: 16, en donde la secuencia comprende cualquiera de las combinaciones únicas de residuos de línea germinal y no-línea germinal indicadas por cada fila en la Tabla 11. En una modalidad, el agente de unión específico o anticuerpo de la invención comprende una secuencia de cadena pesada de acuerdo con la SEC ID NO: 2, 6 ó 10, en donde el residuo en la posición 30 se selecciona de: S o R; el residuo en la posición 31 se selecciona de: S, N o D; el residuo en la posición 33 se selecciona de: G o Y; el residuo en la posición 35 se selecciona de: S, H o N; el residuo en la posición 50 se selecciona de: Y, V o F; el residuo en la posición 53 se selecciona de: Y, S o R; el residuo en la posición 54 se selecciona de: S o D; el residuo en la posición 57 se selecciona de: T, L, N o I; el residuo en la posición 58 se selecciona de: K o I; el residuo en la posición 61 se selecciona de: V o A; el residuo en la posición 99 se selecciona de: G, D o E o el residuo es eliminado; el residuo en la posición 100 se selecciona de: G o ei residuo es eliminado; el residuo en la posición 101 se selecciona de: S, H, P o R; el residuo en la posición 102 se selecciona de: Y o l; el residuo en la posición 103 se selecciona de: S, V o A; el residuo en la posición 104 se selecciona de: G o A; el residuo en la posición 105 se selecciona de: S o R; el residuo en la posición 106 se selecciona de: P o G; el residuo en la posición 107 se selecciona de: F o M; y el residuo en la posición 109 se selecciona de: Y o V. Este grupo de secuencias de cadena pesada se nombra "Grupo A". En una modalidad, el agente de unión específico o anticuerpo de la invención comprende una secuencia de cadena pesada de acuerdo con la SEC ID NO: 14 ó 18, en donde el residuo en la posición 27 se selecciona de: G o D; el residuo en la posición 28 se selecciona de: S o F; el residuo en la posición 32 se selecciona de: S o F; el residuo en la posición 33 se selecciona de: S, N, T o I; el residuo en la posición 52 se selecciona de: S o T; el residuo en la posición 56 se selecciona de: S o T; el residuo en la posición 58 se selecciona de: S o T; el residuo en la posición 63 se selecciona de: S o P; el residuo en la posición 100 se selecciona de: H o el residuo es eliminado; el residuo en la posición 101 se selecciona de: H o el residuo es eliminado; y el residuo en la posición 103 se selecciona de: V o el residuo es eliminado. Este grupo de secuencias de cadena pesada se nombra "Grupo B". En una modalidad, el agente de unión específico o anticuerpo de la invención comprende una secuencia de cadena ligera de acuerdo con la SEC ID NO: 4, 8 ó 12, en donde residuo en la posición 25 se selecciona de: A o P; residuo en la posición 27 se selecciona de: Q, R o H; residuo en la posición 28 se selecciona de: G, V, S, I, D o R; residuo en la posición 29 se selecciona de: I o F; residuo en la posición 30 se selecciona de: S, N, A, R o ?; residuo en la posición 31 se selecciona de: S, H, K, T o R; residuo en la posición 32 se selecciona de: S, T, Y, D, N o F; residuo en la posición 33 se selecciona de: L o I; residuo en la posición 50 se selecciona de: A, G, L, Y, S o V; residuo en la posición 51 se selecciona de: A, G o S; residuo en la posición 53 se selecciona de: T, Q, N, H, R o S; residuo en la posición 54 se selecciona de: L, R o S; residuo en la posición 55 se selecciona de: Q, P, F, A o V; el residuo en la posición 56 se selecciona de: S, N, T o G; el residuo en la posición 91 se selecciona de: S o T; el residuo en la posición 92 se selecciona de: Y o F; el residuo en la posición 94 se selecciona de: N, T, S o el residuo es eliminado; el residuo en la posición 95 se selecciona de: F, W, P, I, A, L o el residuo es eliminado; el residuo en la posición 96 se selecciona de: P o el residuo es eliminado; y el residuo en la posición 97 se selecciona de: W.L, R, I o el residuo es eliminado. Este grupo de secuencias de cadena ligera se nombra "Grupo C". En una modalidad, el agente de unión específico o anticuerpo de la invención comprende una secuencia de cadena ligera de acuerdo con la SEC ID NO: 16 ó 20, en donde el residuo en la posición 28 se selecciona de: S, I, G, D, R o V; el residuo en la posición 29 se selecciona de: F, I o V; el residuo en la posición 30 se selecciona de: S, A, T, G, R o N; el residuo en la posición 31 se selecciona de: S, R, K, N o T; el residuo en la posición 32 se selecciona de: Y, F.W, N, D o el residuo en la posición 33 se selecciona de: L o I; el residuo en la posición 34 se selecciona de: N, A o H: el residuo en la posición 50 se selecciona de: A, Y, G.L o V el residuo en la posición 51 se selecciona de: A, G o S; el residuo en la posición 52 se selecciona de: A, Y, G.L o V el residuo en la posición 54 se selecciona de: L, R o S; el residuo en la posición 55 se selecciona de: Q, F.V, A o P; el residuo en la posición 56 se selecciona de: S.N.T o G: el residuo en la posición 92 se selecciona de: S o T; y el residuo en la posición 93 se selecciona de: S, N o I. Este grupo de secuencias de la cadena ligera se nombra "grupo D". En una modalidad el agente de unión específico o anticuerpo de la invención comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada del grupo A y cualquiera de las secuencias de cadena ligera del grupo C o grupo D. En una modalidad el agente de unión específico o anticuerpo de la invención comprende cualquiera de las secuencias de cadena pesada del grupo B y cualquiera de las secuencias de cadena ligera del grupo C o grupo D. En una modalidad, el agente de unión específico comprende un anticuerpo que comprende variantes o derivado de CDRs descrito en la presente o las secuencias de cadena ligera o pesada descritas en la presente o anticuerpos monoclonales descritos en la presente. Los variantes incluyen anticuerpos que comprenden secuencias de cadena ligera o pesada que tienen por lo menos identidad de secuencia de aminoácido de aproximadamente 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o de aproximadamente 99% con cualquiera de los CDR1, CDR2 o CDR3s como se muestran en la Tabla 12 o Tabla 13, o con secuencias de cadena ligera o pesada descritas en la presente, o con los anticuerpos monoclonales descritos en la presente. En una modalidad las variantes comprenden cambios en las secuencias de CDR o las secuencias de cadena ligera o pesada descritas en la presente que ocurren naturalmente o son introducidas por ingeniería in vitro de secuencias nativas usando técnicas de ADN recombinante o técnicas de mutagénesis. Las variantes que ocurren naturalmente incluyen las que se generan in vivo en las secuencias del nucleótido de línea germinal correspondientes durante la generación de un anticuerpo a un antígeno extranjero. En una modalidad el derivado puede ser un heteroanticuerpo, que es un anticuerpo en el cual dos o más anticuerpos se unen juntos. Los derivados incluyen anticuerpos que se han modificado químicamente. Los ejemplos incluyen la unión covalente de uno o más polímeros, tal como polímeros solubles en agua, N-ligados, o carbohidratos O-ligados, azúcares, fosfatos, y/u otras tales moléculas. Los derivados son modificados de una forma que es diferente de la que ocurre naturalmente o anticuerpo de inicio, en el tipo o localización de las moléculas unidas. Los derivados adicionalmente incluyen la eliminación de uno o más grupos químicos que se presentan naturalmente en el anticuerpo. Otras modalidades de la invención incluyen anticuerpos monoclonales humanos que unen PDGFR-alfa y comprenden un polipéptido de cadena pesada derivado de una secuencia de línea germinal VH3-11. Otras modalidades de la invención incluyen anticuerpos monoclonales humanos que une PDGFR-alfa y comprenden un polipéptido de cadena pesada derivado de una secuencia de línea germinal VH4-39. Otras modalidades de la invención incluyen anticuerpos monoclonales humanos que une PDGFR-alfa y comprenden un polipéptido de cadena pesada derivado de una secuencia de línea del germinal D1-26, D6-6 o D7-27. Algunas modalidades de la invención incluyen anticuerpos monoclonales humanos que une PDGFR-alfa y comprenden una cadena ligera de VK. Aún otras modalidades de la invención incluyen un anticuerpo monoclonal que comprende una cadena ligera VK emparejada con una cadena pesada codificada por, o derivada de, un gen de cadena pesada VH3-11 o VH4-39. En algunas modalidades, el polipéptido de cadena ligera VK es codificado por, o derivado de, un gen de cadena ligera JK1. En otras modalidades, el polipéptido de cadena ligera VK es codificado por, o derivado de, un gene de cadena ligera JK5. Otras modalidades de la invención incluyen anticuerpos monoclonales humanos que une PDGFR-alfa y comprenden un polipéptido de cadena pesada derivado de una secuencia de línea germinal VH3-11 , y un polipéptido de cadena ligera VK derivado de un gen de cadena ligera 012. Las modalidades adicionales de la invención incluyen anticuerpos monoclonales humanos que une PDGFR-alfa y comprenden un polipéptido de cadena pesada derivado de una secuencia de línea germinal VH3-11 , y un polipéptido de cadena ligera VK derivado de la cadena ligera de la secuencia de línea germinal 012 en donde el segundo aminoácido en CDR1 de la cadena ligera codifica la prolina. Esta combinación de gen de cadena pesada VH3-11 usada en combinación con el gen de cadena ligera 012 usado junto con la prolina codificada para la segunda posición del aminoácido de CDR1 de la cadena ligera se ejemplifica en anticuerpos derivados a partir de dos anticuerpos de linajes independientes con diferentes secuencias de cadena pesada y cadena ligera CDR3, particularmente 2.449.1.3 y 2.175.3 (ver Tablas 12 y 13). Los anticuerpos monoclonales 2.175.3 y 2.449.1.3 son ambos anticuerpos de afinidad alta para PDGFRa, y bloquean las respuestas celulares accionadas por PDGF con alta potencia in vitro. Aunque estos dos anticuerpos comparten el uso de VH (VH3-11) y VK (012), divergen en el uso de D, JH and Jk. Así, se derivan de diferentes linajes de célula B. Ellos, sin embargo, comparten patrones de secuencia inusuales en Vk. El residuo 25 es una prolina en ambos anticuerpos, mutados de la alanina de línea germinal. La prolina no es utilizada por cualquiera de los genes de línea germinal de Vk, y ocurre en esta localización en solamente 0.2% de secuencias humanas en la base de datos de Kabat. La prolina en la posición 25 insertará un enlace del péptido rígido y un ángulo agudo en la columna del péptido, y por lo tanto producirá características estructurales únicas dentro de esta región de Vk de la cadena ligera de ambos anticuerpos. Similarmente, una arginina mutante es utilizada por 2.175.3 y 2.449.1.3 en la posición 27e (numeración de Kabat) de CDR1 de Vk. La arginina no se utiliza en esta localización canónica en ninguno de los genes de línea germinal de Vk, y ocurre en solamente 0.4% de las secuencias humanas en la base de datos de Kabat. En una modalidad de la invención se proporciona un anticuerpo monoclonal humano que une PDGFR-alfa y comprende una prolina en el residuo 25. En una modalidad de la invención se proporciona un anticuerpo monoclonal humano que une PDGFR-alfa y comprende una arginina en la posición 27e de CDR1. En otras modalidades, la invención proporciona composiciones, incluyendo un agente de unión específico de la invención o fragmento de unión del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable. En otras modalidades, la invención proporciona composiciones, incluyendo un anticuerpo de la invención o fragmento de unión del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable. Aún otras modalidades de la invención incluyen métodos para efectivamente tratar un animal que sufre de una enfermedad neoplástica, incluyendo la selección de un animal en necesidad del tratamiento para una enfermedad neoplástica, y la administración al animal de una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión específico que une específicamente al PDGFR-alfa. En ciertas modalidades, el animal es humano. En ciertas modalidades, el agente de unión específico es un anticuerpo monoclonal completamente humano. En ciertas modalidades, el agente de unión específico es un anticuerpo de la invención y puede seleccionarse del grupo que consisten de 2.175.3, 2.449.1.3, o 2.998.2. Enfermedades neoplásticas medicable, incluyendo, por ejemplo, cánceres que incluyen, melanoma, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, glioma, carcinoma hepatocelular (hígado), tumor tiroideo, cáncer gástrico (estomacal), cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer endometrial, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer pancreático, carcinoma esofágico, cánceres de cabeza y cuello, mesotelioma, sarcomas, biliar (colangiocarcinoma), adenocarcinoma de intestino delgado, malignidades pediátricas, carcinoma epidermoide, y tumor estromal gastrointestinal (GIST).

En una modalidad, la presente invención es adecuada para uso en antagonizar PDGFR-alfa, en pacientes con un tumor el cual es dependiente solo, o en parte, en un PDGFR-alfa. Las modalidades adicionales de la invención incluyen métodos para inhibir el crecimiento de células tumorales en un animal. Estos métodos incluyen seleccionar un animal en necesidad del tratamiento para el crecimiento de células tumorales, y la administración al animal de una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión específico, en donde el agente específicamente una a PDGFR-alfa. En otra modalidad, el método incluye seleccionar un animal en necesidad del tratamiento para el crecimiento de células tumorales, y la administración al animal de una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal completamente humano, en donde el anticuerpo une específicamente a PDGFR-alfa. Modalidades adicionales de la invención incluyen el uso de un agente de unión específico en la preparación del medicamento para el tratamiento de enfermedades que involucran la expresión de PDGFR-alfa en un animal, en donde el agente específicamente une al PDGFR-alfa. En otra modalidad, la invención incluye el uso de un anticuerpo en la preparación del medicamento para el tratamiento de enfermedades que involucran la expresión de PDGFR-alfa en un animal, en donde el anticuerpo monoclonal específicamente une al PDGFR-alfa. En otras modalidades, los agentes de unión específicos o anticuerpos descritos en la presente pueden utilizarse para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades neoplásticas en un animal, en donde el anticuerpo específicamente une al PDGFR-alfa. Las modalidades de la invención descritas en la presente se relacionan con anticuerpos monoclonales que unen PDGFR-alfa y afectan la función de PDGFR-alfa. Otras modalidades se relacionan con anticuerpos de anti-PDGFR-alfa completamente humanos y preparaciones del anticuerpo de anti-PDGFR-alfa con propiedades deseables de una perspectiva terapéutica, incluyendo alta afinidad de unión para PDGFR-alfa, alta selectividad para la inhibición de la señalización de PDGFR-alfa, baja toxicidad, la capacidad de bloquear los ligandos de PDGF-AA de unir a PDGFR-alfa, la capacidad de bloquear los ligandos de PDGF-AB de unir al PDGFR-alfa, la capacidad de bloquear ligandos de PDGF-BB de unir al PDGFR-alfa, la capacidad de bloquear los ligandos de PDGF-CC de unir al PDGFR-alfa, y/o la capacidad de inhibir el crecimiento de células tumorales in vitro e in vivo. Algunas modalidades se relacionan con anticuerpos de anti-PDGFR-alfa completamente humanos que no cruzan sustancialmente reaccionan con PDGFR-beta. Aún otras modalidades se relacionan con anticuerpos anti-PDGFR-alfa completamente humanos y preparaciones del anticuerpo anti-PDGFR-alfa que no dan lugar a una respuesta del anticuerpo anti-quimérico humano (HACA por sus siglas en inglés) significativo, de tal modo permitiendo la administración repetida.

En una modalidad, la invención incluye anticuerpos que une a PDGFR-alfa con afinidades muy altas (Kd). Por ejemplo un anticuerpo humano, conejo, ratón, quimérico o humanizado que es capaz de unir PDGFR-alfa con un Kd menor de, pero sin limitarse a, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 ó 10-11M, o cualquier intervalo o valor de los mismos. Las medidas de afinidad y/o avidez pueden medirse por KinExA® y/o BIACORE®, como se describe en la presente. Por consiguiente, una modalidad descrita en la presente incluye anticuerpos aislados, o fragmentos de estos anticuerpos, que une a PDGFR-alfa. Como se conoce en la técnica, los anticuerpos pueden ventajosamente ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales, oligoclonales, monoclonales, quiméricos, humanizados, y/o completamente humanos. Las modalidades de la invención descritas en la presente también proporcionan células para producir estos anticuerpos. Se apreciará que las modalidades de la invención no están limitadas a ninguna forma particular de un anticuerpo o método de generación o producción. Por ejemplo, el anticuerpo anti-PDGFR-alfa puede ser un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, que tiene una región Fe humana intacta) o un fragmento de unión de anticuerpo (por ejemplo, un Fab, Fab' o F(ab")2, FV o dAb). Además, el anticuerpo puede elaborarse de un hibridoma que secreta el anticuerpo, o de una célula recombinantemente diseñadas que se ha transformado o transfectado con un gen o genes que codifican el anticuerpo. Además, los anticuerpos pueden ser anticuerpos de un solo dominio tal como camélido o dominios VH o VL simples humanos que une a PDGFR-alfa, tal como un fragmento dAb. Otras modalidades de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican cualquiera de los agentes de unión específicos o anticuerpos descritos en la presente, los vectores que tienen moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos de anti-PDGFR-alfa o una célula hospedadora transformada con cualquiera de tales moléculas de ácido nucleico. Además, una modalidad de la invención es un método para producir un anticuerpo anti-PDGFR-alfa cultivando células hospedadoras bajo condiciones en donde una molécula de ácido nucleico se expresa para producir el anticuerpo seguido por la recuperación del anticuerpo. Una modalidad adicional en la presente incluye un método para producir anticuerpos de afinidad alta a PDGFR-alfa inmunizando un mamífero con células que expresan el PDGFR-alfa humano, membranas celulares aisladas que contienen PDGFR-alfa humano, PDGFR-alfa humano purificado, o un fragmento del mismo, y/o uno o más secuencias o fragmentos ortólogos del mismo. Otras modalidades se basan sobre la generación e identificación de los anticuerpos aislados que une específicamente al PDGFR-alfa. El PDGFR-alfa se expresa en un número de tipos de tumor. Los anticuerpos que neutralizan PDGFR-alfa pueden prevenir el PDGFR-alfa inducido por el crecimiento tumoral y otros efectos deseados. Otra modalidad de la invención incluye un método para diagnosticar enfermedades o condiciones en las cuales un anticuerpo preparado como describe en la presente se utiliza para detectar el nivel de PDGFR-alfa en un paciente o muestra de paciente. En modalidades adicionales, los métodos para la identificación de factores de riesgo, diagnosis de enfermedad, y representación de la enfermedad se presenta, los cuales involucra la identificación de la expresión y/o sobreexpresion de PDGFR-alfa usando anticuerpos de anti-PDGFR-alfa. En algunas modalidades, los métodos comprenden la administración a un paciente de un conjugado del anticuerpo completamente humano que une selectivamente a una proteína de PDGFR-alfa en una célula. El conjugado del anticuerpo comprende un anticuerpo que une selectivamente al PDGFR-alfa y un marcador. Los métodos adicionalmente comprenden observar la presencia del marcador en el paciente. Una cantidad relativamente alta del marcado indicará un riesgo relativamente de alto de la enfermedad y una cantidad relativamente baja del marcado indicará un riesgo relativamente bajo de la enfermedad. En una modalidad, el marcado es una proteína fluorescente verde. La invención además proporciona métodos para probar el nivel de PDGFR-alfa en una muestra de paciente, que comprende poner en contacto un anticuerpo anti-PDGFR-alfa con una muestra biológica de un paciente, y detectar el nivel de unión entre el anticuerpo y PDGFR-alfa en la muestra. En modalidades más específicas, la muestra biológica es sangre o suero. Otra modalidad de la invención incluye un método para diagnosticar una condición asociada con la expresión de PDGFR-alfa en una célula que se pone en contacto con el suero o una célula con un anticuerpo de anti-PDGFR-alfa, y después de lo mismo detectando la presencia de PDGFR-alfa. En otra modalidad, la invención incluye un kit de ensayo para detectar PDGFR-alfa en tejidos mamíferos, células, o fluidos corporales para clasificar enfermedades que involucran células que expresan PDGFR-alfa. El kit incluye un anticuerpo que une al PDGFR-alfa y un medio para indicar la reacción del anticuerpo con PDGFR-alfa, si está presente. Preferiblemente el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En una modalidad, el anticuerpo que une PDGFR-alfa está marcado. En otra modalidad el anticuerpo es un anticuerpo primario no marcado y el kit adicionalmente incluye un medio para detectar el anticuerpo primario. En una modalidad, el medio incluye un segundo anticuerpo marcado que es una anti-inmunoglobulina. Preferiblemente el anticuerpo se marcado con un marcador seleccionado del grupo que consiste de un fluorocromo, una enzima, un radionúclido y un material radioopaco. Aún otra modalidad incluye métodos para tratar enfermedades o condiciones asociadas con la expresión de PDGFR-alfa en un paciente, administrando al paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-PDGFR-alfa. El anticuerpo anti-PDGFR-alfa puede administrarse solo, o puede administrarse en combinación con anticuerpos adicionales o fármaco quimioterapéutico o radioterapia. Por ejemplo, una mezcla monoclonal, oligoclonal o policlonal de anticuerpos PDGFR-alfa que inhiban el crecimiento del tumor puede administrarse en combinación con un fármaco mostrado para inhibir la proliferación de célula tumoral directamente. El método puede realizarse ¡n vivo y el paciente es preferiblemente un paciente humano. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PDGFR-alfa pueden modificarse para mejorar su capacidad de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC por sus siglas en inglés). En otras modalidades, los anticuerpos anti-PDGFR-alfa pueden modificarse para mejorar su capacidad de activar células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC por sus siglas en inglés). En aún otras modalidades, los anticuerpos anti-PDGFR-alfa pueden modificarse para mejorar su capacidad de activar células efectoras y participar en la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) y para mejorar su capacidad de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). En otra modalidad, la invención proporciona un artículo de fabricación que incluye un envase. El envase incluye una composición que contiene un anticuerpo anti-PDGFR-alfa, y un inserto empaquetado o marcado que indica que la composición puede utilizarse para tratar enfermedades caracterizadas por la expresión o sobreexpresión de PDGFR-alfa. En otras modalidades, la invención proporciona un kit para tratar enfermedades que involucran la expresión de PDGFR-alfa, que comprende anticuerpos monoclonales anti-PDGFR-alfa e instrucciones para administrar los anticuerpos monoclonales a un sujeto en necesidad del tratamiento. En otro aspecto, se proporciona un método para selectivamente eliminar una célula cancerosa en un paciente. El método comprende administrar un conjugado del anticuerpo completamente humano a un paciente. El conjugado del anticuerpo completamente humano comprende un anticuerpo que pueda unir al dominio extracelular del PDGFR-alfa y un agente. El agente es una toxina, radioisótopo, u otra sustancia que elimina una célula cancerosa. El conjugado del anticuerpo por lo tanto selectivamente elimina la célula cancerosa. El agente puede ser saporina. En un aspecto, se proporciona un anticuerpo completamente humano conjugado que une a PDGFR-alfa. Unido al anticuerpo está un agente, y la unión del anticuerpo a una célula resulta de un suministro del agente a la célula. En una modalidad, el anticuerpo completamente humano conjugado anterior une a un dominio extracelular de PDGFR-alfa. En otra modalidad, el anticuerpo y toxina conjugada son internalizados por una célula que exprese PDGFR-alfa. En otra modalidad, el agente es un agente citotóxico. En otra modalidad, el agente es, por ejemplo saporina, o auristatina, exotoxina de pseudomonas, gelonina, ricina, caliceamicina o inmunoconjugados basados en maitansina, y similares. En aún otra modalidad, el agente es un radioisótopo.

En algunas modalidades de la invención, los patrones de glicosilación de los anticuerpos proporcionados en la presente se modifican para mejorar la función de efector ADCC y CDC. Ver Shields RL y colaboradores, (2002) JBC. 277:26733; Shinkawa T y colaboradores, (2003) JBC. 278:3466 and Okazaki A y colaboradores, (2004) J. Mol. Biol . , 336: 1239. Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es una gráfica que muestra las respuestas de dosis para 5 anticuerpos monoclonales seleccionados para el % de inhibición de la proliferación inducida por PDGF-AA de células de tumor MG-63 contra el anticuerpo en ng/ml. La estimulación celular se condujo usando 100 ng/ml (3.45 nM) de PDGF-AA. Las Figuras 2a-2b muestran los resultados de la evaluación antitumor ¡n vivo de 2.175.3 y 2.449.1.3 en el modelo de xenoinjerto del carcinoma de pulmón de célula no pequeña Calu-6. La figura 2a muestra el tamaño de tumor promedio (mm3) contra el tiempo (días) y la Figura 2b muestra el peso corporal promedio (g) contra tiempo (días). Los puntos cuadrados representan un grupo de tratamiento de vehículo; los puntos circulares representan un grupo de tratamiento de 2.175.3 10 mg/kg; los puntos triangulares representan el grupo de tratamiento 2.449.1.3 10 mg/kg. La Figura 3 muestra los resultados de la evaluación in vivo de los anticuerpos en el modelo de xenoinjerto del glioma U118 en ratones SCID. El tamaño de tumor (mm3) contra tiempo (días) del tratamiento con anticuerpos se representa gráficamente. Los puntos cuadrados muestran un grupo de tratamiento de vehículo; los puntos circulares muestran un grupo de tratamiento de 2.175.3 10 mg/kg: los puntos triangulares muestran un grupo de tratamiento de 2.449.1.3 10 mg/kg. Descripción Detallada de la Modalidad Preferida Las modalidades de la invención descritas en la presente se relacionan con agentes de unión específicos que une a PDGFR-alfa. En algunas modalidades, los agentes de unión específicos son los anticuerpos que une a PDGFR-alfa e inhiben el crecimiento de células tumorales. Otras modalidades de la invención incluyen anticuerpos anti-PDGFR-alfa completamente humanos, y preparaciones de anticuerpo que son terapéuticamente útiles. Tales preparaciones del anticuerpo de anti-PDGFR-alfa preferiblemente tienen propiedades terapéuticas deseables, incluyendo afinidad de unión fuerte para PDGFR-alfa, selectividad alta para la inhibición de la señalización de PDGFR-alfa, toxicidad baja, la capacidad de bloquear ligandos de PDGF-AA para unir al PDGFR-alfa, la capacidad de bloquear ligandos de PDGF-AB de la unión a heterodímeros de PDGFR-alfa o PDGFR-alfa/beta, la capacidad de bloquear ligandos de PDGF-BB de la unión a heterodímeros de PDGFR-alfa o PDGFR-alfa/beta, la capacidad de bloquear ligandos de PDGF-CC de la unión a heterodímeros de PDGFR-alfa o PDGFR-alfa/beta, y/o la capacidad de inhibir crecimiento de células tumorales in vitro e in vivo. Algunas modalidades se relacionan con anticuerpos anti-PDGFR-alfa completamente humanos que no tienen reacción cruzada con PDGFR-beta. Las modalidades de la invención también incluyen agentes de unión específicos que son fragmentos de unión aislados de anticuerpos de anti-PDGFR-alfa. Preferiblemente, los fragmentos de unión se derivan de anticuerpos de anti-PDGFR-alfa completamente humanos. Los fragmentos ejemplares incluyen Fv, Fab" dAb u otros fragmentos del anticuerpo bien conocidos, como se describe más detalladamente a continuación. Las modalidades de la invención también incluyen células que expresan anticuerpos completamente humanos contra PDGFR-alfa. Los ejemplos de células incluyen hibridomas, o células recombinantemente creadas, tal como células ováricas de hámster chino (CHO por sus siglas en inglés) que producen anticuerpos contra PDGFR-alfa. Además, las modalidades de la invención incluyen métodos para usar estos anticuerpos para tratar enfermedades. Los anticuerpos de anti-PDGFR-alfa son útiles para inhibir el crecimiento tumoral. El mecanismo de la acción puede incluirse, pero no está limitado a, bloquear la señalización de la célula de unión y/o inhibición involucrada en el crecimiento celular. Las enfermedades que son tratables a través de este mecanismo incluyen, pero no se limitan a, enfermedades neoplásticas, tal como, cánceres incluyendo, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, cáncer de próstata, cáncer de colon, glioblastoma, melanoma y tumor estromal gastrointestinal (GIST).

Otras modalidades de la invención incluyen ensayo de diagnóstico para específicamente determinar la presencia y/o cantidad de PDGFR-alfa en una muestra de paciente o biológica. El kit de ensayo puede incluir anticuerpos de anti-PDGFR-alfa junto con los marcados necesarios para detectar tales anticuerpos. Estos ensayo de diagnóstico son útiles para clasificar enfermedades relacionadas a PDGFR-alfa incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades neoplásticas, tal como cánceres incluyendo, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, cáncer de próstata, cáncer de colon, glioblastoma, melanoma y tumor estromal gastrointestinal (GIST). Otra modalidad es un anticuerpo que comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de la SEC ID NO.:2. En una modalidad, el anticuerpo adicionalmente comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEC ID NO.:4. Otra modalidad incluye un anticuerpo que comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de la SEC ID NO.: 10. En una modalidad, el anticuerpo adicionalmente comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEC ID NO.: 12. Aún otra modalidad es un anticuerpo que comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende la secuencia de la SEC ID NO.: 14. En una modalidad, el anticuerpo adicionalmente comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende la secuencia de la SEC ID NO.: 16.

Aún otra modalidad es un hibridoma que produce la cadena ligera y/o cadena pesada del anticuerpo como se describe anteriormente. El hibridoma puede producir una cadena ligera y/o cadena pesada de un anticuerpo monoclonal completamente humano. En una modalidad, el hibridoma produce la cadena ligera y/o cadena pesada del anticuerpo monoclonal completamente humano 2.175.3, 2.449.1.3, y 2.998.2. Alternativamente el hibridoma puede producir un anticuerpo que une al mismo epítope o epítopes como el anticuerpo monoclonal completamente humano 2.175.3, 2.449.1.3, y 2.998.2. Alternativamente el hibridoma puede producir un anticuerpo que compita para unir al PDGFR-alfa con el anticuerpo monoclonal completamente humano 2.175.3, 2.449.1.3, y 2.998.2. Aún otra modalidad es una molécula del ácido nucleico que codifica la cadena ligera o cadena pesada del anticuerpo como se describe anteriormente. En esta modalidad, la molécula del ácido nucleico puede codificar la cadena ligera o cadena pesada de un anticuerpo monoclonal completamente humano. En una modalidad, la molécula del ácido nucleico codifica la cadena ligera o cadena pesada de uno de los anticuerpos monoclonales completamente humanos 2.175.3, 2.449.1.3 ó 2.998.2. Una modalidad adicional es un vector que comprende una molécula o moléculas del ácido nucleico como se describe antes, en donde el vector codifica una cadena ligera y/o cadena pesada de un anticuerpo como se define anteriormente.

Una modalidad de la invención incluye una célula hospedadora que comprende un vector como se describe anteriormente. Alternativamente la célula hospedadora puede comprender más de un vector. Además, una modalidad de la invención es un método para producir un anticuerpo cultivando células hospedadoras bajo condiciones en donde una molécula del ácido nucleico se expresa para producir el anticuerpo, seguido por la recuperación del anticuerpo. En una modalidad la invención incluye un método para hacer un agente de unión específico transfectando por lo menos una célula hospedadora con por lo menos una molécula del ácido nucleico que codifica el agente de unión específico como se describe anteriormente, expresando la molécula del ácido nucleico en la célula hospedadora y aislando el agente de unión específico. Otra modalidad de la invención es un método para hacer un anticuerpo transfectando por lo menos una célula hospedadora con por lo menos una molécula del ácido nucleico que codifica el anticuerpo como se describe anteriormente, expresando la molécula del ácido nucleico en la célula hospedadora y aislando el anticuerpo. Otro aspecto de la invención es un método para inhibir el crecimiento de células que expresa PDGFR-alfa administrando un agente de unión específico como se describe anteriormente. El método puede incluir la selección de un animal en necesidad del tratamiento para la enfermedad relacionada con la expresión de PDGFR-alfa, y la administración al animal de una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión específico que une específicamente al PDGFR-alfa. Aún otro aspecto es un método para tratar una enfermedad neoplástica en un mamífero administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de unión específico que une específicamente a PDGFR-alfa. El método puede incluir la selección de un animal en necesidad el tratamiento para una enfermedad neoplástica, y la administración al animal de una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión específico que une específicamente a PDGFR-alfa. El agente puede administrarse solo, o puede administrarse en combinación con un segundo agente anti-neoplástico seleccionado de un anticuerpo, un fármaco quimioterapéutico, o fármaco radiactivo. Otro aspecto es un método para tratar el cáncer en un mamífero administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de unión específico que une específicamente PDGFR-alfa. El método puede incluir la selección de un animal en necesidad el tratamiento para el cáncer, y la administración al animal de una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de unión específico que une específicamente a PDGFR-alfa. El agente puede administrarse solo, o puede administrarse en combinación con un segundo agente anti-neoplástico seleccionado de un anticuerpo, un fármaco quimioterapéutico, o un fármaco radiactivo. De acuerdo a otro aspecto de la invención un agente de unión específico puede utilizarse para que específicamente una PDGFR-alfa para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neoplástica. Una modalidad de la invención es particularmente adecuada para uso en la inhibición del crecimiento tumoral en pacientes con un tumor que es dependiente solo, o en parte, en la expresión de PDGFR-alfa. Otra modalidad de la invención incluye un kit de ensayo para detectar PDGFR-alfa en tejidos mamíferos, células, o fluidos corporales para clasificar enfermedades neoplásticas y/o fibróticas y/o del sistema inmune. El kit incluye un agente de unión específico que une al PDGFR-alfa y un medio para indicar la reacción del agente de unión específico con PDGFR-alfa, si está presente. El agente de unión específico puede ser un anticuerpo monoclonal. En una modalidad, el anticuerpo que une a PDGFR-alfa está marcado. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo primario no marcado y el kit adicionalmente incluye un medio para detectar el anticuerpo primario. En una modalidad, el medio incluye un segundo anticuerpo marcado que es una anti-inmunoglobulina. Preferiblemente el anticuerpo es marcado con un marcador seleccionado del grupo que consiste de un fluorocromo, enzima, radionúclido y un material radio-opaco. Las modalidades adicionales, características, y similares con respecto a anticuerpos de anti-PDGFR-alfa se proporcionan en detalle adicionalmente a continuación. Definiciones A menos que se defina de otra manera, los términos científicos y técnicos usados en la presente tienen los significados que se entienden comúnmente por los expertos ordinarios en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por el contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y términos plurales incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y las técnicas de, un cultivo celular y tejido, biología molecular, y proteína y química oligo- o polinucleótido e hibridación descritos en la presente son bien conocido y comúnmente usados en la técnica. Las técnicas estándar se utilizan para el ADN recombinante, síntesis de oligonucleótido, y cultivo y transformación de tejido (por ejemplo electroporación , lipofección) . Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan de acuerdo a las eespecíf icoaciones del fabricante o como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. Las técnicas y procedimientos precedentes se realizan generalmente de acuerdo a métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten a través de la presente eespecíficoación . Ver por ejemplo, Sambrook y colaboradores Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)), que se incorpora en la presente por referencia. Las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, la química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente se conocen bien y se usan general en la técnica. Las técnicas estándar se utilizan para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, y liberación, y tratamiento de pacientes. Como se utiliza de acuerdo con la presente descripción, los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, serán entendidos para tener los siguientes significados. Un compuesto se refiere a cualquier compuesto de peso molecular pequeño con un peso molecular menor de aproximadamente 2000 Daltons. El término "PDGFR-alfa" se refiere al receptor-alfa de tirosina cinasa del factor de crecimiento derivado de plaqueta codificado por el gen de PDGFR-alfa. El PDGFR-alfa también se conoce como CD140a y PDGFR-a. El término "neutralización" cuando referir a un agente de unión específico tal como un anticuerpo relacionado con la capacidad del agente de eliminar, o significativamente reducir, la actividad de un antígeno específico. Por consiguiente, un anticuerpo de anli-PDGFR-alfa de "neutralización" de la invención es capaz de eliminar o significativamente reducir la actividad de PDGFR-alfa. Un anticuerpo de PDGFR-alfa de neutralización puede, por ejemplo, actuar bloqueando la unión del ligando a su PDGFR-alfa del receptor. El término "polinucleótido aislado" como se utiliza en la presente significará un polinucleótido que se ha aislado de su ambiente natural. Tales polinucleótidos pueden ser genómicos, ADNc, o sintéticos. Los polinucleótidos aislados preferiblemente no se asocian con todos o una porción de los polinucleótidos que se asocian en naturaleza. Los polinucleótidos aislados pueden operablemente ligarse a otro polinucleótido que no está ligado en naturaleza. Además, los polinucleótidos aislados preferiblemente no ocurren en la naturaleza como parte de una secuencia larga. El término "proteína aislada" referido en la presente significa una proteína que se ha aislado de su ambiente que ocurre naturalmente. Tales proteínas pueden derivarse del ADN genómicos, ADNc, ADN recombinante, ARN recombinante, o de origen sintético o cierta combinación de las mismas, que en virtud de su origen, o fuente de derivación, "proteína aislada" (1) no se asocia con proteínas encontradas en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo libre de proteínas murinas, (3) es expresada por una célula de una diferente especie, o (4) no ocurre en la naturaleza. El término "polipéptido" se utiliza en la presente como un término genérico para referirse a la proteína nativa, fragmentos, o análogos de una secuencia del polipéptido. Por lo tanto, la proteína nativa, fragmentos, y análogos son especie del género del polipéptido. Los polipéptidos preferidos de acuerdo con la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humanas y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera humanas kappa, así como moléculas del anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tal como kappa o moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera lambda, y viceversa, así como fragmentos y análogos de las mismas. Los polipéptidos preferidos de acuerdo con la invención pueden también comprender solamente las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada o fragmentos humanos de los mismos. El término "que ocurre naturalmente" como se utiliza en la presente como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio o de otra manera no ocurre naturalmente. El término "operablemente ligado" como se utiliza en la presente se refiere a posiciones de los componentes así descritos que están en una relación permitiendo que funcionen en su manera prevista. Por ejemplo, una secuencia de control "operablemente ligada" a una secuencia de codificación está conectada de una manera tal que la expresión de la secuencia de codificación se realiza bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. El término "secuencia de control" como se utiliza en la presente se refiere a secuencias del polínucleótido que son necesarias para efectuar o afectar a la expresión y proceso de las secuencias de codificación con las cuales están conectadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador; en procariotas, como secuencias de control incluyen generalmente el promotor, sitio de unión ribosomal, y secuencia de terminación de transcripción; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control pueden incluir promotores, mejoradores, intrones, secuencias de terminación de transcripción, secuencias de señal de poliadenilación, y regiones sin traducir 5' y '3. El término "secuencias de control" se desea para incluir, al mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y puede también incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias madre de fusión. El término "polinucleótido" como se refiere en la presente significa una forma polimérica de nucleótidos de por lo menos 10 bases en longitud, los ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada del tipo de nucleótido, o heterodúplexes de ARN-ADN. El término incluye formas con hebras solas y dobles de ADN. El término "oligonucleótido" referido en la presente incluye nucleótidos que ocurren naturalmente, y modificados ligados juntos por ligados que ocurren naturalmente, y que no ocurren naturalmente. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótido que comprende generalmente una longitud de 200 bases o menos. Preferiblemente, los oligonucleótidos son 10 a 60 bases en longitud y más preferiblemente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 a 40 bases en longitud. Los oligonucleótidos son generalmente de hebra sencilla, por ejemplo para prueba; aunque los oligonucleótidos pueden ser de hebra doble, por ejemplo para uso en la construcción de un mutante de gen. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos sentido o antisentido. El término "nucleótidos que ocurren naturalmente" referido en la presente incluye desoxiribonucleotidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" referido en la presente incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces de oligonucleótido" referido en la presente incluye enlaces de oligonucleótidos tal como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforan iladato , fosforoamidato, y similares. Ver por ejemplo, LaPlanche y colaboradores Nucí. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec y colaboradores J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein y colaboradores Nucí. Acids Res. 16:3209 (1988): Zon y colaboradores Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon y colaboradores Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein. Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec y colaboradores, Patente Estadounidense No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), la descripción de los cuales se incorpora por este medio por referencia. Un oligonucleótido puede incluir una etiquetar para detección, si se desea. El término "selectivamente hibridizado" referido en la presente significado para unir significativa y específicamente. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos del mismo selectivamente hibridiza a los filamentos del ácido nucleico bajo condiciones de hibridación y lavado que minimizan cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Las condiciones de severidad altas pueden utilizarse para alcanzar condiciones de hibridación selectivas como se conoce en la técnica y discutidas en la presente. Generalmente, la homología de la secuencia del ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos, o fragmentos del anticuerpo y una secuencia del ácido nucleico de interés serán de por lo menos 80%, y más normalmente con homologías preferiblemente incrementadas de por lo menos 85%, 90%, 95%, 99% y 100%.

El término "región de CDR" o "CDR" se desea para indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina como se define por Kabat y colaboradores 1991 (Kabat, E.A. y colaboradores (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edición. US Department of Health and Human Services, Public Service, N1H, Washington), y últimas ediciones. Un anticuerpo normalmente contiene 3 CDRs de cadena pesada y 3 CDRs de cadena ligera. El término CDR o CDRs es utilizado en la presente para indicar, de acuerdo al caso, una de estas regiones o varias, o aún el integral, de estas regiones que contienen la mayoría de los residuos del aminoácido responsables para la unión por afinidad del anticuerpo para el antígeno o epítope que se reconoce. El tercer CDR de la cadena pesada (HCDR3) tiene una variabilidad de tamaño mayor (mayor diversidad esencialmente debido a los mecanismos de arreglo de los genes que dan lugar). Puede ser tan corta como 2 aminoácidos aunque el tamaño prolongado conocido es 26. La longitud de CDR puede también variar de acuerdo a la longitud que puede acomodarse por el marco subyacente particular. Funcionalmente, el HCDR3 desempeña un papel en parte en la determinación de la eespecíficoidad del anticuerpo (Segal y colaboradores, PNAS, 71:4298-4302, 1974, Amit y colaboradores, Science, 233:747-753, 1986, Chothia y colaboradores, J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987, Chothia y colaboradores, Nature, 342:877-883. 1989, Catón y colaboradores, J. Immunol., 144: 1965-1968, 1990, Sharon y colaboradores. PNAS, 87:4814-4817, 1990. Sharon y colaboradores, J. Immunol., 144:4863-4869, 1990. Kabat y colaboradores. J. Immunol., 147: 1709-1719, 1991). El término un "conjunto de CDRs" referido en la presente comprende CDR1, CDR2 y CDR3. Así, un conjunto de HCDRs se refiere a HCDR1. HCDR2 y HCDR3, y un conjunto de LCDRs se refiere a LCDR1, LCDR2 y LCDR3. A menos que se indique de otra manera, "conjunto de CDRs" incluye HCDRs y LCDRs. Dos secuencias de aminoácidos son "homologas" si hay una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, 85% de la homología significa que 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para emparejarse al máximo. Los Gaps (en cualquiera de las dos secuencias se emparejan) se permiten maximizar en emparejado; las longitudes de gap de 5 o menos son preferidas con 2 o menos son más preferidas. Alternativa y preferiblemente, dos secuencias de proteína (o secuencias del polipéptido derivadas de ellas de por lo menor aproximadamente 30 aminoácidos en longitud) son homologas, pues este término se utiliza en la presente, si tienen un puntaje de alineación de más de 5 (en unidades de desviación estándar) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una pena de gap de 6 o mayor. Ver Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-1 10 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) and Supplement 2 to this volume, pp. 1-10. Las dos secuencias o partes del mismo son preferiblemente homologas si sus aminoácidos son mayores o iguales a 50% idénticas cuando opcionalmente se alinean usando el programa ALIGN. Debe apreciarse que pueden diferenciarse las regiones de homología dentro de dos secuencias ortólogas. Por ejemplo, los sitios funcionales ortólogos de ratón y humano pueden tener un grado mayor de homología que las regiones no funcionales. El término "corresponde a" se utiliza en la presente para significar que una secuencia de polinucleótido es homologa (es decir, es idéntica, no relacionada estrictamente evolucionaría) a toda o una porción de una secuencia del polinucleótido de referencia, o que una secuencia del polipéptido es idéntica a una secuencia del polipéptido de referencia. En contradistinción, el término "complementario a" se utiliza en la presente para significar que la secuencia complementaria es homologa a toda o una porción de una secuencia del polinucleótido de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótido "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA". El término "secuencia de identidad" o "identidad" se refiere a una secuencia que significa que dos polinucleótido o secuencias de aminoácidos son idénticas (es decir sobre una base de nucleótido-por-nucleótido o residuo-por-residuo) sobre la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" es calculado comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales la base del ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U, o I) o el residuo del aminoácido ocurre en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de ventana), y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de la identidad de secuencia. Los términos "identidad sustancial" como se utiliza en la presente significan una característica de una secuencia del polinucleótido o aminoácido, en donde el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene por lo menos 85 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente por lo menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 99 por ciento de identidad de secuencia, como se comparó con una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de por lo menos 18 posiciones del nucleótido (6 aminoácidos), frecuentemente sobre una ventana de por lo menos 24-48 posiciones del nucleótido (8-16aminoácido) , en donde el porcentaje de identidad de secuencia es calculado comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir las eliminaciones o adiciones que suman el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor. Como se utiliza en la presente, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Ver Immunology - A Synthesis (2a Edición, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que es incorporada en la presente por referencia. Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos artificiales tal como a-, a-aminoácidos disustituídos, N-alquil-aminoácidos, ácido láctico, y otros aminoácidos poco convencionales pueden también ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos poco convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?,?,?-trimetillisina, e-?-acetillisina, O-fosfoserina , N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-?-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación del polipéptido usada en la presente, la dirección izquierda es la dirección amino terminal y la dirección derecha es la dirección carboxi-terminal, de acuerdo con uso y convención estándar. Similarmente, a menos que se especifique lo contrario, el extremo izquierdo de las secuencias del polinucleótido de hebra sencilla es el extremo 5'; la dirección izquierda de las secuencias del polinucleótido de hebra doublé se refiere como la dirección 5'.

La dirección de adición 5' a 3' de transcriptos de ARN naciente se refiere como la dirección de transcripción; las regiones de secuencia en la hebra de ADN tiene la misma secuencia como el ARN y que son el extremo 5' al 5' del transcripto de ARN se refieren como las "secuencias corriente arriba"; las regiones de la secuencia en la hebra de ADN tiene la misma secuencia como el ARN y que son el extremo 3' al 3' del transcripto de ARN se refieren como las "secuencias corriente abajo". Como se aplica a los polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias del péptido, cuando se alinean óptimamente, por ejemplo por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de gap de defecto, dividen por lo menos 80 por ciento la identidad de secuencia, preferiblemente por lo menos 90 por ciento de identidad de la secuencia, más preferiblemente por lo menos 95 por ciento de identidad de la secuencia, y más preferiblemente por lo menos 99 por ciento de identidad de la secuencia. Preferiblemente, las posiciones del residuo que no son idénticas difieren por las sustituciones del aminoácido conservadoras. Las sustituciones del aminoácido conservadoras se refieren a la alternancia de los residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales de hidroxilo alifática es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina, y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen sulfuro es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutámico-aspártico, y asparagina-glutamina. Como se discutió en la presente, las variaciones menores en las secuencias de aminoácido de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se contemplan como que se comprenden por la presente invención, proporcionando que las variaciones en la secuencia de aminoácido mantienen por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, 90%, 95%, y más preferiblemente 99% de identidad de secuencia a los anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina descritos en la presente. En particular, se contemplan los reemplazos del aminoácido conservador. Los reemplazos conservadores son los que toman lugar dentro de una familia de aminoácidos que se han relacionado las cadenas laterales. Los aminoácidos genéticamente codificados se dividen generalmente en familias: (1) acídico = aspartato, glutamato; (2) básico = lisina, arginina, histidina: (3) no-polar=alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polar no cargado = glicina, asparragina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Las familias más preferidas son: serina y treonina son una familia alifática-hidroxi; asparragina y glutamina son una familia que contiene amida: alanina, valina, leucina e isoleucina son una familia alifática; y fenilalanina, triptófano y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, es razonable contar con que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tenga un efecto mayor en la función de unión o propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no involucra un aminoácido dentro de un sitio de estructural. Si un cambio del aminoácido da lugar a un péptido funcional puede determinarse fácilmente probando la actividad específica del derivado del polipéptido. Los ensayos se describen detalladamente en la presente. Los fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina pueden prepararse fácilmente por los expertos ordinarios en la técnica. El amino- y carboxi-treminal o fragmentos o análogos preferidos ocurren cerca de los dominios limitantes o funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse por la comparación de los datos de la secuencia del nucleótido y/o aminoácido a las bases de datos de la secuencia pública o propietaria. Preferiblemente, los métodos de comparación automatizados se utilizan para identificar motivos de la secuencia o dominios de conformación de proteína previstos que ocurren en otras proteínas de la estructura y/o función conocida. Los métodos para identificar las secuencias de proteína que se doblan en una estructura tridimensional conocida se conocen. Bowie y colaboradores Science 253:164 (1991). Así, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la técnica pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden utilizarse para definir los dominios estructurales y funcionales de acuerdo con los anticuerpos descritos en la presente. Las sustituciones del aminoácido preferidas son las que: (1) reducen susceptibilidad a proteólisis, (2) reducen susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia con excepción de la secuencia del péptido que ocurre naturalmente. Por ejemplo, las sustituciones del aminoácido sencillas o múltiples (sustituciones del aminoácido conservadoras preferibles) pueden hacerse en la secuencia que ocurre naturalmente (preferiblemente en la porción del polipéptido fuera de los dominios que forman los contactos intermoleculares. Una sustitución del aminoácido conservadora no debe sustancialmente cambiar las características estructurales de la secuencia madre (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe tender a romper una hélice que ocurra en la secuencia madre, o interrumpir otros tipos de estructura secundaria que caracterice la secuencia madre). Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias del polipéptido reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Crcighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); y Thornton y colaboradores, Nature 354:105 (1991), que cada una se incorpora en la presente por referencia. Las variantes de los dominios VH y VL y CDRs de la presente invención, incluyendo aquellas para las cuales las secuencias de aminoácido se indican en la presente, y las cuales pueden utilizarse en los agentes y anticuerpos específicos para PDGFR-alfa pueden obtenerse por medio de métodos de alteración de secuencia o mutación y clasificarse para el marcado del antígeno con características deseadas. Los ejemplos de características deseadas incluyen pero no se limitan a: afinidad de unión incrementada para antígeno con relación a anticuerpos conocidos que son específico para el antígeno; neutralización incrementada de una actividad de antígeno con relación a anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno si se conoce la actividad; capacidad competitiva especificada con un anticuerpo o ligando conocido al antígeno en una proporción molar especifica; capacidad al complejo del ligando-receptor del ¡nmunoprecipitado; capacidad de unir a un epítope especificado; epítope lineal, por ejemplo secuencia del péptido identificada usando la exploración de unión a péptido, por ejemplo usando péptidos clasificados en la adaptación lineal y/o restricción; epítope de adaptación, formado por residuos no continuos; capacidad de modular una nueva actividad biológica de PDGFR-alfa, o molécula corriente abajo; capacidad de unir y/o neutralizar y/o para cualquier otra propiedad deseada. Las técnicas requeridas para hacer sustituciones dentro de secuencias de aminoácidos de CDRs, dominios VH o VL del anticuerpo y sitios de unión al antígeno están disponibles en la técnica. Las variantes de moléculas del anticuerpo detectadas en la presente pueden producirse y utilizarse en la presente invención. Seguido de la conducción de la química computacional en la aplicación de técnicas de análisis de datos multivariantes a las relaciones de estructura/propiedad-actividad (Wold, y colaboradores ultivariate data analysis in chemistry. Chemometrics -Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984) las relaciones de actividad-propiedad cuantitativas de anticuerpos puede derivarse usando técnicas matemáticas bien conocidas, tal como regresión estadística, reconocimiento de patrón y clasificación (Norman y colaboradores, Applied Regression Analysis. Wiley-lnterscience; 3a Edición (abril de 1998): Kandel, Abraham & Backer, Eric. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (11 mayo de 1995); Krzanowski, Wojtek. Principies of Multivariate Analysis: A Users Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press; (diciembre de 2000); Witten. lan H. & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (11 de octubre de 1999); Denison David G. T. (Editor). Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrián F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (juio de 2002); Ghose, Arup K. & Viswanadhan, Vellarkad N. Combinatorial Library Design and Evaluation Principies, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery). Las propiedades de los anticuerpos pueden derivarse de modelos empíricos y teóricos (por ejemplo, ensayo de residuos de contacto probables o propiedad fisicoquímica calculada) de la secuencia del anticuerpo, estructuras funcionales y tridimensionales y estas propiedades pueden considerarse solas y en combinación. Un sitio de unión al antígeno del anticuerpo compuesto por un dominio VH y un dominio VL es formado normalmente por seis bucles de polipéptido: tres del dominio variable de cadena ligera (VL) y tres del dominio variable de cadena pesada (VH). El análisis de anticuerpos de la estructura atómica conocida ha aclarado las relaciones entre la secuencia y estructura tridimensional del anticuerpo que combinan los sitios. Estas relaciones involucran que, a excepción de la tercera región (bucle) en los dominios VH, los bucles del sitio de unión tienen un pequeño número de conformaciones de cadena principal: estructuras canónicas. La estructura canónica formada en un bucle particular se ha mostrado para determinarse por su tamaño y presencia de ciertos residuos en los sitios clave en el bucle y en regiones estructurales. Este estudio de relación de secuencia-estructura puede utilizarse para la predicción estos residuos en un anticuerpo de la secuencia conocida, pero de una estructura tridimensional desconocida, que son importantes en mantener la estructura tridimensional de sus bucles de CDR y por lo tanto mantienen la especificidad de unión. Estas predicciones pueden apoyarse por la comparación de las predicciones a la salida de experimentos de optimización dirigida. En un proceso estructural, un modelo puede crearse de la molécula del anticuerpo usando cualquier paquete disponible libremente o comercial, tal como WAM. Un paquete de software de visualización y análisis de proteína, tal como Insight II (Accelrys. Inc.) o Deep View puede entonces utilizarse para evaluar sustituciones posibles en cada posición en el CDR. Esta información puede entonces utilizarse para hacer sustituciones probablemente para tener un efecto mínimo o beneficioso en actividad o para conferir otras propiedades deseables. El término "fragmento de polipéptido" como se utiliza en la presente se refiere a un polipéptido que tiene una eliminación de amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero donde la secuencia del aminoácido restante es idéntica a la posición correspondiente en la secuencia que ocurre naturalmente deducida, por ejemplo, de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos normalmente son de por lo menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de largo, preferiblemente de por lo menos 14 aminoácidos de largo, más preferiblemente de por lo menos 20 aminoácidos de largo, normalmente de por lo menos 50 aminoácidos de largo, y aún más preferiblemente de por lo menos 70 aminoácidos de largo. El término "análogo" como se utiliza en la presente se refiere a polipéptidos que se comprenden de un segmento de por lo menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial a una porción de una secuencia de aminoácido deducida y que tiene por lo menos una de las siguientes propiedades: (1) unión específico a un PDGFR-alfa, bajo condiciones de unión adecuadas, (2) capacidad de inhibir la unión de PDGF-AA, (3) capacidad de inhibir la unión de PDGF-AB, (4) capacidad de inhibir la unión de PDGF-BB, y/o (5) capacidad de inhibir la unión de PDGF-CC. Normalmente, los análogos del polipéptido comprenden una sustitución del aminoácido conservadora (o adición o eliminación) con respecto a la secuencia que ocurre naturalmente. Los análogos normalmente son por lo menos 20 aminoácidos de largo, preferiblemente por lo menos 50 aminoácidos de largo o mayores, y pueden a menudo ser más largos como un polipéptido que ocurre naturalmente de longitud completa. Los análogos del péptido se utilizan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no-péptido con propiedades análogas a las del péptido modelo. Estos tipos de compuesto de no-péptido son llamado "miméticos del péptido" o "peptidomiméticis". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p. 392 (1985); y Evans y colaboradores J. Med. Chem. 30: 1229 (1987), que se incorporan en la presente por referencia. Tales compuestos se desarrollan a menudo con la ayuda del modelado molecular automatizado. Los miméticos del péptido que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles puede utilizarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido de paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica), tal como el anticuerpo humano, pero tiene uno o más enlaces del péptido sustituidos opcionalmente por un enlace seleccionado del grupo que consiste de: --CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH = CH--(cis y trans), --COCH2--, --CH(OH)CH2--, y --CH2SO--, por métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) puede utilizarse para generar péptidos más estables. Además, los péptidos con restricción que comprenden una secuencia de consenso o una variación de secuencia de consenso sustancialmente idéntica pueden generarse por métodos conocidos en la técnica (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), incorporado en la presente por referencia); por ejemplo, agregando residuos de cisteína internos capaces de formar puentes de disulfuro intramoleculares que ciclizan el péptido. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos que se comprenden de por lo menos un dominio de unión que es formado del plegamiento de cadenas de polipéptido que tienen espacios de unión tridimensionales con formas superficiales internas y distribuciones de carga complementarias a las características de un determinante antigénico de un antígeno. Un anticuerpo tiene normalmente una forma tetramérica, que comprende dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, cada par que tiene una cadena "ligera" y una "pesada". Las regiones variables de cada par de la cadena ligera/pesada forman un sitio de unión del anticuerpo. Como se utiliza en la presente, un "agente de unión específico" es un agente, por ejemplo un anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, que une a un sitio específico. En una modalidad, el agente de unión específico es específico para solamente un sitio específico. En otras modalidades, el agente de unión específico es específico para más de un sitio específico.

En una modalidad, el agente de unión específico puede ser un anticuerpo monoclonal y el sitio específico puede ser un epítope. Como descrito más abajo, un agente de unión específico puede comprender por lo menos un dominio de unión al antígeno (por ejemplo un CDR) de un anticuerpo, en donde el dominio está fusionado o contenido dentro de un andamio de proteína heterólogo, por ejemplo un andamio de proteína no-anticuerpo. Los "fragmentos de unión" de un anticuerpo son producidos por técnicas de ADN recombinantes, o por la división enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab", F(ab')2, Fv, dAb y anticuerpos de cadena sencilla. Un anticuerpo con excepción de un anticuerpo "bisepecífico" o "bifuncional" se entiende por tener cada uno de sus sitios de unión idénticos. Un anticuerpo sustancialmente inhibe la adhesión de un receptor a un contador-receptor cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de enlace del receptor al contador-receptor por al menos aproximadamente 20%, 40%, 60% u 80%, y más generalmente mayor de aproximadamente 85% (como se midió en un ensayo de unión competitivo in vitro). Un anticuerpo puede ser oligoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo CDR-injertado, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo catalítico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo antiidiotípico y anticuerpos que se pueden marcarse en forma soluble o unida así como fragmentos, variantes o derivados del mismo, solos o en combinación con otras secuencias de aminoácido proporcionadas por técnicas conocidas. Un anticuerpo puede ser de cualquier especie. El término anticuerpo también incluye fragmentos de unión de los anticuerpos de la invención; los fragmentos ejemplares incluyen Fv, Fab, Fab , anticuerpo filamentoso sencillo (svFC), región variable dimérica (Diacuerpo) y región variable estabilizada de disulfuro (dsFv). Se ha mostrado que los fragmentos de un anticuerpo entero pueden realizar la función de antígenos de unión. Los ejemplos de fragmentos de unión son (Ward, E. S. y colaboradores, (1989) Nature 341, 544-546) el fragmento Fab consiste de los dominios VL, VH, CL y CHI; (McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554) el fragmento Fd consiste de los dominios VH y CHI; (Holt y colaboradores (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490) el fragmento Fv consiste de los dominios VL y VH de un solo anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. y colaboradores, Nature 341, 544-546 (1989), McCafferty y colaboradores (1990) Nature, 348, 552-554, Holt y colaboradores (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490], que consiste de un dominio VH o e VL; (v) regiones de CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados (vii) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL son ligados por un enlazador de péptido que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión al antígeno (Bird y colaboradores, (1988) Science, 242, 423-426, Huston y colaboradores, (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883); (viii) dímeros Fv de cadena sencilla biespecíficos (PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por la fusión del gen (W094/13804; Holliger, P. (1993) y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 6444-6448,). Fv, scFv o moléculas diacuerpo pueden estabilizarse por la incorporación de puentes de disulfuro que unen los dominios VH y VL (Reiler, Y. y colaboradores, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). Minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 puede también hacerse (Hu, S. y colaboradores, (1996) Cáncer Res., 56, 3055-3061). Otros ejemplos de fragmentos de unión son Fab', que difieren de fragmentos Fabs por la adición de algunos residuos en el término carboxilo del dominio CHI de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo, y Fab'-SH, que es un fragmento Fab' en el cual los residuos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. El término "epítope" incluye cualquier determinante de proteína capaz de la unión específica a una inmunoglobulina o receptor de célula T. Los determinantes epitópicos normalmente consisten de agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tal como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y pueden, pero no siempre, tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específica. Un anticuerpo se dice para unir específicamente un antígeno cuando el constante de disociación es el <1 µ?, preferiblemente = 100 nM y más preferiblemente < 10 nM. El término "agente" se utiliza en la presente para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto hecho de materiales biológicos. "Activo" o "actividad" en vista de un polipéptido de PDGFR-alfa se refiere a una porción de un polipéptido de PDGFR-alfa que tiene una actividad biológica o inmunológica de un polipéptido de PDGFR-alfa nativo. "Biológico" cuando se utiliza en la presente se refiere a una función biológica que resulta de la actividad del polipéptido de PDGFR-alfa nativo. Una actividad biológica de PDGFR-alfa preferida incluye, por ejemplo, autofosforílación. "Mamífero" cuando se utiliza en la presente se refiere a cualquier animal que se considere un mamífero. Preferiblemente, el mamífero es humano. La digestión de anticuerpos con la enzima, papaína, da lugar a dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, conocidos también como fragmentos "Fabs", y un fragmento "Fe", que no tienen ninguna actividad de unión al antígeno pero tienen la capacidad de cristalizar. La digestión de los anticuerpos con la enzima, pepsina, da lugar a un fragmento F(ab')2 en el cual los dos brazos de la molécula del anticuerpo permanecen ligados y comprende sitios de unión de dos-antígeno. El fragmento F(ab')2 tiene la capacidad de reticular el antígeno. "Fv" cuando se utiliza en la presente se refiere al fragmento mínimo de un anticuerpo que conserva los sitios reconocimiento de antígeno y unión al antígeno. "Fab" cuando se utiliza en la presente se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende el dominio constante de la cadena ligera y el dominio de CHI de la cadena pesada. Un "dAb" es un solo anticuerpo de dominio y comprende el dominio variable de una cadena pesada de anticuerpo (dominio VH) o el dominio variable de una cadena ligera de anticuerpo (dominio VL). Cada dAb contiene tres de los seises CDRs que ocurren naturalmente (Ward y colaboradores, Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nature 341, 544-546 (1989); Holt, y colaboradores, Domain antibodies: protein for therapy. Trends Biotechnol. 21, 484-49 (2003)). Con pesos moleculares que van de 11 a 15 kDa, son cuatro veces más pequeñas que un antígeno del fragmento que unen (Fab)2 y mitad del tamaño de una molécula Fv de cadena sencilla (scFv). El término "mAb" se refiere al anticuerpo monoclonal. "Liposoma" cuando está utilizado en la presente se refiere a una pequeña vesícula que puede utilizase para la liberación de fármacos que pueden incluir el polipéptido de PDGFR-alfa de la invención o anticuerpos tal como un polipéptido de PDGFR-alfa a un mamífero. "Marcado" o "marcado" como se utiliza en la presente se refiere a la adición de un radical detectable a un polipéptido, por ejemplo, a un radiomarcado, marcado fluorescente, marcado enzimático, marcado quimioluminescente o un grupo biotinilado. Los radioisótopos o radionúclidos pueden incluir 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111 n , 1251, 1311, marcados fluorescentes pueden incluir rodamina, fósforos de lantánido o FITC y marcados enzimáticos pueden incluir peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina. Las marcados adicionales incluyen, por medio de ilustración y sin limitación: enzimas, tal como deshidrogenase de glucosa-e-fosfato ("G6PDH"), alfa-D-galactosidasa, oxidasa de glucosa, amilasa de glucosa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa, lisozima, deshidrogenase de malato y peroxidasa; tintes; marcados fluorescentes adicionales o los fluorescedores incluyen, tal como fluoresceína y sus derivados, fluorocromo, GFP (GFP para "Proteína Fluorescente Verde"), dansilo, umbeliferona, ficoeritrina , ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeh ido, y fluorescamina; fluorofores tal como criptatos de lantánido y quelatos por ejemplo (Perkin Elmer y Cis Biointernational); marcados quimioluminiscentes o quimioluminecedores, tal como isoluminol, luminol y los dioxetanos; sintetizadores; coenzimas; sustratos enzimáticos; partículas, tal como partículas de látex o carbono; sol de metal; cristalito; liposomas; células, etc., que pueden marcarse adicionalmente con in tinte, catalizador u otro grupo significativo; moléculas tal como biotina, digoxigenina o 5-bromodeoxiuridina; radicales de toxina, tal como por ejemplo un radical de toxina seleccionado de un grupo de exotoxina de pseudomonas (PE o un fragmento o mutante citotoxico del mismo), toxina de Difteria o un fragmento o mutante citotoxico del mismo, una toxina botulina A, B, C, D, E o F, ricina o un fragmento citotoxico del mismo por ejemplo ricina A, abrina o un fragmento citotoxico del mismo, saporina o un fragmento citotoxico de la misma, toxina antivirus de pokeweed o un fragmento citotoxico de la misma y briodina 1 o un fragmento citotoxico de la misma. El término "agente o fármaco farmacéutico" como se utiliza en la presente se refiere a un compuesto o composición química capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando es administrado correctamente a un paciente. Otros términos de la química en la presente se utilizan de acuerdo al uso convencional en la técnica, como se ejemplificó por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker. S., Ed., McGraw-Hill. San Francisco (1985)), (incorporado en la presente por referencia). Como se utiliza en la presente, "sustancialmente puro" significa una especie objeto que es la presente especie predominante (es decir, sobre una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y preferiblemente una fracción sustancialmente purificada es una composición en donde la especie objeto comprenden por lo menos aproximadamente 50 por ciento (sobre una base molar) de todos las presentes especies macromoleculares. Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80 por ciento de todas las presentes especies macromoleculares en la composición, preferiblemente más de aproximadamente 85%, 90%, 95%, y 99%. Más preferiblemente, la especie objeto se purifica a homogeneidad esencial (la especie contaminante no puede detectarse en la composición por métodos de detección convencionales) en donde la composición consiste esencialmente de una sola especie macromolecular. "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Ig Fe (FcRs) (por ejemplo células Destructoras Naturales (NK por sus siglas en inglés), monocitos, neutrófilos, y macrófagos) reconocer el anticuerpo enlazado en una célula objetivo y posteriormente causan la lisis de la célula objetivo. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan FcvRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRIl y FcvRIII. La expresión FcRs en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para determinar la actividad de ADCC de una molécula de interés, un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la Patente Estadounidense No. 5,500,362, ó 5,821,337 puede realizarse. Las células efectoras útiles para tal ensayo incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC por sus siglas en inglés) y células Destructoras Naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede determinarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes y colaboradores PNAS (USA) 95:652-656 (1988). "Citotoxicidad dependiente complemento" y "CDC" se refieren al mecanismo por el cual los anticuerpos realizan su función destructora de célula. Es iniciada por la unión de Clq, un componente del primer componente de complemento, al dominio Fe de Igs. IgG o IgM, que están en el complejo con el antígeno (Hughs-Jones, N. C, and B. Gardner. 1979. Mol. Immunol. 16:697). Clq es una glicoproteina del complejo grande, estructural de -410 kDa presente en suero humano en una concentración de 70 g/ml (Cooper, N. R. 1985. Adv. Immunol. 37:151). Junto con dos proteasas de serina, Clr y Cls, Clq forman el Cl complejo, el primer componente del complemento. Por lo menos dos de las cabezas globulares N-terminal de Clq deben unirse al Fe de Igs para la activación de Cl, por lo tanto para la iniciación de la cascada del complemento (Cooper, N.R. 1985. Adv. Immunol. 37: 151). "Ensayo de sangre entera" utiliza sangre no fraccionada como una fuente de efectores naturales. La sangre contiene el complemento en el plasma, junto con efectores celulares que expresan FcR, tal como células polimorfonucleares (PMNs por sus siglas en inglés) y células mononucleares (MIMCs por sus siglas en inglés). Así, los ensayo de sangre entera permiten la evaluación simultánea de la sinergia de los mecanismos efector de ADCC y CDC in vitro. El término "paciente" incluye sujetos humanos y veterinarios. El término "y/o" como se utiliza en la presente debe tomarse como la descripción específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo "A y/o B" debe tomarse como la descripción especifica de cada uno (i) A, (¡i) B y (iii) A y B, justo como si cada uno se indica individualmente en la presente. Estructura del Anticuerpo La unidad estructural del anticuerpo básico se conoce por comprender un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes son unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada también incluyendo una región "D" de aproximadamente 10 más aminoácidos. Ver generalmente, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N. Y. (1989)) (incorporado por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo. Así, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecífico, los dos sitios de unión son los mismos. Las cadenas todas exhiben la misma estructura general de las regiones estructurales relativamente conservadas (FR), unidas por tres regiones hieprvariables, también llamadas regiones que determinan la complementariedad o CDRs. Los CDRs de las dos cadenas de cada par son alineados por las regiones estructurales, permitiendo la unión a un epítope específico. Del N-terminal al C-terminal, las cadenas ligeras y pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Choihia y colaboradores Nature 342:878-883 (1989). Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos diferentes pares de cadena pesada/ligera y dos diferentes sitios de unión. Los anticuerpos de biespecífico pueden producirse por una variedad de métodos incluyendo fusión de hibridomas o enlace de fragmentos de Fab'. Ver, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny y colaboradores J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992). Los anticuerpos de biespecífico no existen bajo la forma de fragmentos que tienen un solo sitio de unión (por ejemplo, Fab, Fab' y Fv). Normalmente, un dominio VH se empareja con un dominio VL para proporcionar un sitio de unión al antígeno del anticuerpo, aunque un dominio VH o VL solamente puede utilizarse para unir el antígeno. El dominio VH (ver Tabla 12) puede emparejarse con el dominio VL (ver Tabla 13), para formar un sitio de unión al antígeno del anticuerpo que comprende los dominios VH y VL. Anticuerpos Humanos y Humanización de Anticuerpos Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes de murino o rata. La presencia de tales proteínas derivadas de murino o rata puede llevar a la separación rápida de los anticuerpos o puede llevar a la generación de una inmunorespuesta contra el anticuerpo de un paciente. Para evitar la utilización de anticuerpos derivados de murino o rata, los anticuerpos completamente humanos puede generarse a través de la introducción del loci de anticuerpo humano funcional en el roedor, otro mamífero o animal de modo que el roedor, otro mamífero o animal produzca los anticuerpos completamente humanos. Un método para generar anticuerpos completamente humanos es a través del uso de cepas de XenoMousc® de ratón que se han diseñado para contener solamente menos de 1000 fragmentos configurados de línea germinal de tamaño kb del locus de cadena pesada humano y locus de cadena ligera kappa. Ver Méndez y colaboradores, Nature Genetics 15: 146-156 (1997) and Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). Las cepas de XenoMouse© están disponibles de Amgen, Inc. (Fremont, California, U.S. A). Tales ratones, después, son capaces de producir moléculas y anticuerpos de inmunoglobulina humanos y son deficientes en la producción de moléculas y anticuerpos de inmunoglobulina murina. Las tecnologías utilizadas para alcanzar las mismas se describen en la Solicitud de Patente Estadounidense No. 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996 y Solicitud de Patente Estadounidense No. WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998 y WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000, la descripción de las cuales se incorpora por este medio por referencia. Ver también Méndez y colaboradores Nature Genetics 15: 146-156 (1997), la descripción de la cual se incorpora por este medio por referencia. La producción de las cepas de XenoMouse© de ratón se discute y define adicionalmente en la Solicitud de Patente Estadounidense No. 07/466.008, presentada el 12 de enero de 1990, 07/610,515, presentada el 8 de noviembre de 1990, 07/919,297, presentada el 24 de julio de 1992, 07/922,649, presentada el 30 de julio de 1992, 08/031,801, presentada el 15 de marzo de 1993, 08/112,848, presentada el 27 de agosto de 1993, 08/234,145, presentadas el 28 de abril de 1994, 08/376,279, presentada el 20 de enero de 1995, 08/430,938, presentada el 27 de abril de 1995, 08/464,584, presentada el 5 de junio de 1995, 08/464,582, presentada el 5 de junio de 1995, 08/463,191, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462,837, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,853, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,857, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,859, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462,513, presentada el 5 de junio de 1995, 08/724,752, presentada el 2 de octubre de 1996, 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996, Publicación Estadounidense 2003/0093820, presentada el 30 de noviembre de 2001 y Patentes Estadounidenses Nos. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181 y 5,939,598 y Patentes Japonesas Nos. 3068 180 B2, 3068 506 B2 y 3 068 507 B2. Ver también Patente Europea No., EP 0 463 151 B1, 12 concesión publicada el 12 de junio de 1996, Solicitud de Patente Internacional No., WO 94/02602, publicada el 3 de febrero de 1994, Solicitud de Patente Internacional No., WO 96/34096, publicada el 31 de octubre de 1996, WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998, WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000. Las descripciones de cada una de las patentes, solicitudes, y referencias anteriormente citadas se incorporan por este medio por referencia en su totalidad. En un proceso alternativo, otros, que incluyen GenPharm International, Inc., han utilizado un proceso de "minilocus". En el proceso de minilocus, un locus de Ig exógeno es mimetizado a través de la inclusión de piezas (genes individuales) del locus de Ig. Así, uno o más genes de VH, uno o más genes de ADO, uno o más genes de JH, una región constante de mu, y una segunda región constante (preferiblemente una región constante gamma) se forman generalmente en un constructo para la inserción en un animal. Este proceso se describe en la Patente Estadounidense No. 5,545.807 para Surani y colaboradores y Patentes Estadounidenses Nos. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299, y 6,255,458 cada una para Lonberg y Kay, Patente Estadounidense No. 5,591,669 and 6,023.010 para Krimpenfort and Berns, Patentes Estadounidenses Nos. 5.612,205, 5,721,367, y 5,789,215 para Berns y colaboradores, y Patente Estadounidense No. 5,643,763 para Choi y Dunn, y GenPharm, Solicitudes de Patentes Estadounidenses Internationales Nos. de Serie 07/574,748, presentada el 29 de agosto de 1990, 07/575,962, presentada el 31 de agosto de 1990, 07/810,279, presentada el 17 de diciembre de 1991, 07/853,408, presentada el 18 de marzo de 1992, 07/904,068, presentada el 23 de junio de 1992, 07/990,860, presentada el 16 de diciembre de 1992, 08/053,131, presentada el 26 de abril de 1993, 08/096,762, presentada el 22 de julio de 1993, 08/155,301, presentada el 18 de noviembre de 1993, 08/161,739, presentada el 3 de diciembre de 1993, 08/165.699, presentada el 10 de diciembre de 1993, 08/209.741, presentada el 9 de marzo de 1994, la descripción de las cuales se incorpora por este medio por referencia. Ver también Patente Europea No. 0 546 073 B1, Solicitudes de Patentes Internacionales Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647. WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585. WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884 y Patente Estadounidense No. 5,981,175, la descripción de las cuales se incorpora por este medio por referencia en su totalidad. Ver además Taylor y colaboradores, 1992, Chen y colaboradores, 1993, Tuaillon y colaboradores, 1993, Choi y colaboradores, 1993, Lonberg y colaboradores, (1994), Taylor y colaboradores, (1994), and Tuaillon y colaboradores, (1995), Fishwild y colaboradores, (1996), la descripción de las cuales se incorpora por este medio por referencia en su totalidad.

Kirin también ha demostrado la generación de anticuerpos humanos de ratones en los cuales, a través de la fusión de microcélulas, piezas grandes de cromosomas, o cromosomas enteros, se han introducido. Ver Solicitud de Patente Europea No. 773 288 y 843 961, la descripción de las cuales se incorpora por este medio por referencia. Además, el KMTM-ratón , el cual es el resultado de la reproducción cruzada de ratones Te de Kirin con ratones minilocus de Medarex (Humab). Estos ratones poseen el transcromosoma IgH humano de ratón de Kirin y el transgen de cadena de kappa de los ratones de Genpharm (Ishida y colaboradores, Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102). Los anticuerpos humanos pueden también derivarse por métodos in vitro. Los ejemplos adecuados incluyen pero no se limitan a exhibición de fago (CAT, Morfosys, Dyax, Biosite/Medarex. Xoma, Symphogen, Alexion (Proliferon de formerilo), Affimed) exhibición de ribosoma (CAT), exhibición de levadura, y similares. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención compiten con los anticuerpos descritos. La competencia entre los anticuerpos puede probarse fácilmente in vitro, por ejemplo usando ELISA y/o marcando una molécula reportero específica para un miembro de unión que pueda detectarse en presencia de uno o más de los otros anticuerpos no marcados, para permitir la identificación de los anticuerpos que unen el mismo epítope o un epítope traslapado. Tales métodos se conocen fácilmente por uno experto en la técnica, y se describen más detalladamente en la presente. Así, un aspecto adicional de la presente invención proporciona un sitio de unión al antígeno que comprende un sitio de unión al antígeno del anticuerpo humano que compite con una molécula del anticuerpo, por ejemplo especialmente una molécula del anticuerpo que comprende un dominio VH y/o VL, el CDR por ejemplo HCDR3 o conjunto de CDRs del anticuerpo madre o cualquiera de los anticuerpos descrito en la presente que se unen a PDGFR-alfa. En una modalidad, un anticuerpo de la invención compite con 2.175.3, 2.449.1.3 y/o 2.998.2. Preparación de Anticuerpos En general, los anticuerpos producidos por los hibridomas fusionados fueron las cadenas pesadas lgG2 o lgG4 humanas con las cadenas ligeras kappa o lambda completamente humanas. Los anticuerpos también pueden ser de otros isotipos humanos, incluyendo cadenas pesadas I g G 1. Los anticuerpos poseyeron altas afinidades, normalmente poseyeron un Kd de aproximadamente 10-6 con aproximadamente 10-12 M o menor, cuando se midieron contra células en técnicas de medición de afinidad basadas en FACS. La afinidad también puede medirse por técnicas de fase sólida y fase de solución. En una modalidad, los anticuerpos descritos en la presente unen a CD PDGFR-alfa 20 con un Kd menor de aproximadamente 500, 400, 300, 200 o 100 picomolar 8pM) e inhiben el crecimiento tumoral. En algunas modalidades, los anticuerpos unen PDGFR-alfa con un Kd menor de aproximadamente 75, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 10 ó 5 pM. Como se apreciará, los anticuerpos de anti-PDGFR-alfa pueden expresarse en líneas celulares con excepción de líneas celulares del hibridoma. Las secuencias que codifican los anticuerpos particulares pueden utilizarse para transformar una célula hospedadora mamífera adecuada. La transformación puede ser por cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedadora, incluyendo, por ejemplo empaquetando el polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y transduciendo una célula hospedadora con el virus (o vector) o por procedimientos de transfeccion conocidos en la técnica, como se ejemplificó por las Patentes Estadounidenses Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 y 4,959,455 (cuyas patentes se incorporan por este medio en la presente por referencia). El procedimiento de transformación usado depende del huésped a transformarse. Los métodos para introducir los polinucleótidos heterólogos en las células mamíferas son bien conocido en la técnica e incluyen transfeccion mediada por dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfeccion mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación , encapsulación de los polinucleótidos en liposomas, e microinyección directa del ADN en nucleico. Las líneas celulares mamíferas disponibles como huéspedes para la expresión se conocen bien en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC), incluyendo pero sin limitarse a células ováricas de hámster chino (CHO), células HeLa, células del riñon de hámster bebé (BHK), células del riñon de mono (COS), células del carcinoma hepatocelular humanas (por ejemplo, Hep G2), células de riñon epiteliales humanas 293, y un número de otras líneas celulares. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan a través determinar qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión y producen anticuerpos con propiedades de unión de PDGFR-alfa constitutivas. Los anticuerpos de Anti-PDGFR-alfa son útiles en la detección de PDGFR-alfa en muestras de pacientes y por consiguiente son útiles como diagnósticos para estados de enfermedad como se describe en la presente. Además, basado en su capacidad de inhibir el crecimiento tumoral, los anticuerpos de anti-PDGFR-alfa tienen efectos terapéuticos en tratar síntomas y condiciones que resultan de la expresión de PDGFR-alfa. En modalidades específicas, los anticuerpos y métodos en la presente se relacionan con el tratamiento de síntomas que resultan del crecimiento tumoral inducido por PDGFR-alfa. Otras modalidades involucran el uso de anticuerpos y métodos descritos en la presente para tratar enfermedades neoplásticas, tal como cánceres incluyendo, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, cáncer de próstata, cáncer de colon, glioblastoma, melanoma y tumor estromal gastrointestinal (GIST).

Secuencias del Anticuerpo Las modalidades de la invención incluyen anticuerpos de anti-PDGFR-alfa específicos listados más adelante en la Tabla 1. Esta tabla describe el número de identificación de cada anticuerpo anti-PDGFR-alfa, junto con el número de SEC ID de regiones variables de los genes de cadena pesada y cadena ligera correspondientes. A cada anticuerpo se ha dado un número de identificación que incluye dos o tres números separados por uno o dos puntos decimales. En algunos casos, solamente dos números de identificación separados por un punto decimal son mencionados. Sin embargo, en algunos casos, varios clones de un anticuerpo se prepararon. Aunque los clones tienen las secuencias idénticas del ácido nucleico y aminoácido como la secuencia madre, pueden también listarse por separado, con el número de clon indicado por el número a la derecha de un segundo punto decimal. Así, por ejemplo, las secuencias del ácido nucleico y aminoácido del anticuerpo 2.84 son idénticos a las secuencias del anticuerpo 2.84.1, 2.84.2, y 2.84.3.

TA B LA 1 mAb Id No. Secuencia SEC ID NO: 2.175.3 Secuencia del nucleótido que codifica la región 1 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 2 variable de la cadena pesada Secuencia del nucleótido que codifica la región 3 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 4 variable de la cadena ligera 2.451 .1.1 Secuencia del nucleótido que codifica la región 5 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 6 variable de la cadena pesada Secuencia del nucleótido que codifica la región 7 variable de la cadena ligera 012/JK5 Secuencia de aminoácido que codifica la región 8 variable de la cadena ligera 012/JK5 Secuencia del nucleótido que codifica la región 21 variable de la cadena ligera A20/JK5 Secuencia de aminoácido que codifica la región 22 variable de la cadena ligera A20/JK5 2.449.1.3 Secuencia de nucleótido que codifica la región 9 variable de la cadena pesada mAb Id No. Secuencia SEC ID NO: Secuencia de aminoácido que codifica la región 10 variable de la cadena pesada Secuencia de nucleotido que codifica la región 1 1 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 12 variable de la cadena ligera 2.998.2 Secuencia de nucleotido que codifica la región 13 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 14 variable de la cadena pesada Secuencia de nucleotido que codifica la región 15 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 16 variable de la cadena ligera 2.84.3 Secuencia de nucleotido que codifica la región 17 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 18 variable de la cadena pesada Secuencia de nucleotido que codifica la región 19 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 20 variable de la cadena ligera mAb Id No. Secuencia SEC ID NO: 2.1576.1.2 Secuencia de nucleótido que codifica la región 23 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 24 variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótido que codifica la región 25 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 26 variable de la cadena ligera 3.625.1 Secuencia de nucleótido que codifica la región 27 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 28 variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótido que codifica la región 29 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 30 variable de la cadena ligera 2.414.2 Secuencia de nucleótido que codifica la región 31 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 32 variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótido que codifica la región 33 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 34 variable de la cadena ligera mAb Id No. Secuencia SEC ID NO: 2.542.2 Secuencia de nucleótido que codifica la región 35 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 36 variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótido que codifica la región 37 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 38 variable de la cadena ligera 2.737.1.4 Secuencia de nucleótido que codifica la región 39 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 40 variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótido que codifica la región 41 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 42 variable de la cadena ligera 2.1623.1.2 Secuencia de nucleótido que codifica la región 43 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 44 variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótido que codifica la región 45 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 46 variable de la cadena ligera mAb Id No. Secuencia SEC ID NO: 2.1853.3 Secuencia de nucleótido que codifica la región 47 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 48 variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótido que codifica la región 49 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 50 variable de la cadena ligera 2.1954.2 Secuencia de nucleótido que codifica la región 51 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 52 variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótido que codifica la región 53 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 54 variable de la cadena ligera 3.23.2 Secuencia de nucleótido que codifica la región 55 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 56 variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótido que codifica la región 57 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 58 variable de la cadena ligera mAb Id No. Secuencia SEC ID NO: 3.87.1.1 Secuencia de nucleótido que codifica la región 59 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 60 variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótido que codifica la región 61 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 62 variable de la cadena ligera 3.341.1 Secuencia de nucleótido que codifica la región 63 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 64 variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótido que codifica la región 65 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 66 variable de la cadena ligera 3.472.1.1 Secuencia de nucleótido que codifica la región 67 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 68 variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótido que codifica la región 69 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 70 variable de la cadena ligera mAb Id No. Secuencia SEC ID NO: Secuencia de nucleótido que codifica la región 71 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 72 variable de la cadena pesada 3.805.1.3 Secuencia de nucleótido que codifica la región 73 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 74 variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótido que codifica la región 75 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 76 variable de la cadena pesada 3.818.4 Secuencia de nucleótido que codifica la región 77 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 78 variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótido que codifica la región 79 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 80 4.16.2 variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótido que codifica la región 81 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 82 variable de la cadena ligera mAb Id No. Secuencia SEC ID NO: Secuencia de nucleótido que codifica la región 83 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 84 variable de la cadena pesada 5.1.1.1 Secuencia de nucleótido que codifica la región 85 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 86 variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótido que codifica la región 87 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 88 variable de la cadena pesada 5.9.3 Secuencia de nucleótido que codifica la región 89 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 90 variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótido que codifica la región 91 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 92 variable de la cadena pesada 2.796 2 Secuencia de nucleótido que codifica la región 93 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 94 variable de la cadena ligera mAb Id No. Secuencia SEC ID NO: Secuencia de nucleótido que codifica la región 95 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 96 variable de la cadena pesada 3 772 2 Secuencia de nucleótido que codifica la región 97 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 98 variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótido que codifica la región 99 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 100 variable de la cadena pesada 5.16.1 Secuencia de nucleótido que codifica la región 101 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 102 variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótido que codifica la región 103 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 104 variable de la cadena pesada 2.2002.3 Secuencia de nucleótido que codifica la región 105 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 106 variable de la cadena ligera mAb Id No. Secuencia SEC ID NO: Secuencia del nucleótido que codifica la región 107 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 108 variable de la cadena pesada .2071 .1 . 3 Secuencia del nucleótido que codifica la región 109 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 110 variable de la cadena ligera Secuencia del nucleótido que codifica la región 111 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 112 variable de la cadena pesada 3.23.3 Secuencia del nucleótido que codifica la región 113 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 114 variable de la cadena ligera Secuencia del nucleótido que codifica la región 115 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 116 variable de la cadena pesada 3.457.3.1 Secuencia del nucleótido que codifica la región 117 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 118 variable de la cadena ligera mAb Id No. Secuencia SEC ID NO: Secuencia del nucleótido que codifica la región 119 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 120 variable de la cadena pesada 2.84.1 Secuencia del nucleótido que codifica la región 121 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 122 variable de la cadena ligera Secuencia del nucleótido que codifica la región 123 variable de la cadena pesada Secuencia de aminoácido que codifica la región 124 variable de la cadena pesada 2.351.3 Secuencia del nucleótido que codifica la región 125 variable de la cadena ligera Secuencia de aminoácido que codifica la región 126 variable de la cadena ligera Los anticuerpos, como se describe en la presente en los Ejemplos, se prepararon con la utilización de la tecnología de XenoMouse® , como se describe más adelante. Tal ratones, después, son capaces de producir moléculas y anticuerpos de inmunoglobulina humanos y son deficientes en la producción de moléculas y anticuerpos de inmunoglobulina murinos. Las tecnologías utilizadas para lograr los mismos se describen en las patentes, solicitudes, y referencias descritas en la sección antecedente en la presente. En particular, sin embargo, una modalidad preferida de la producción transgénica de ratones y anticuerpos de la misma se describe en la Solicitud de Patente Estadounidense No. de Serie 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996 y Solicitud de Patente Internacional No. WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998 y WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000, la descripción de las cuales se incorporó por este medio por referencia. Ver también Méndez y colaboradores Nature Genetics 15:146-156 (1997), la descripción de la cual se incorporó por este medio por referencia.

A través del uso de tal tecnología, los anticuerpos monoclonales completamente humanos a una variedad de antígenos se han producido. Esencialmente. Las líneas de XenoMouse® de ratones se inmunizan con un antígeno de interés (por ejemplo PDGFR-alfa), células linfáticas (tal como células B) se recuperan de los ratones hiper-inmunizados, y los linfocitos recuperados se fusionan con una línea celular tipo mieloide para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales. Estas líneas celulares del hibridoma se clasifican y seleccionan para identificar las líneas celulares del hibridoma que produjeron los anticuerpos específicos al antígeno de interés. Los proporcionados en la presente son métodos para la producción de líneas celulares del hibridoma múltiples que producen anticuerpos específicos al PDGFR-alfa. Además, las proporcionadas en la presente son caracterizaciones de los anticuerpos producidos por tales líneas celulares, incluyendo ensayo de secuencia del nucleótido y aminoácido de las cadenas pesadas y ligeras de tales anticuerpos. Alternativamente, en vez de fusionarse a células de mieloma para generar hibridomas, las células B pueden ensayarse directamente. Por ejemplo, las células B CD19+ pueden aislarse de ratones de XenoMouse® hiperinmunes y permitir proíiferar y diferenciarse en las células de plasma de la secreción de anticuerpos. Los anticuerpos de los sobrenadantes de célula después se analizan por ELISA para reactividad contra el inmunógeno de PDGFR-alfa. Los sobrenadantes pueden también clasificarse para inmunoreactividad contra fragmentos de PDGFR-alfa para trazar adicionalmente los diferentes anticuerpos para unir a los dominios de interés funcional en PDGFR-alfa. Los anticuerpos pueden también clasificarse de otros receptores humanos relacionados y contra rata, ratón, y primate no humano, tal como mono Cinomolgo, ortólogos de PDGFR-alfa, el último para determinar la reactividad cruzada de la especie. Las células de B de pozos que contienen anticuerpos de interés pueden inmortalizarse por varios métodos incluyendo fusión para hacer hibridomas de pozos individuales o agrupados, o por infección con EBV o transfección por genes inmortalizantes conocidos y después se colocaron en placas en medio adecuado. Alternativamente, células de plasma sencillas que secretan anticuerpos con especificidades deseadas después se aislan usando un ensayo de placa hemolítico de PDGFR-alfa-específico (ver por ejemplo Babcook y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)). Las células marcadas para lisis son preferiblemente células de glóbulos rojos de ovejas (SRBCs por sus siglas en inglés) cubiertas con el antígeno de PDGFR-alfa. En presencia de un cultivo de célula B que contiene células de plasma que secretan la inmunoglobulina de interés y complemento, la formación de una placa indica la lisis mediada por PDGFR-alfa específica de las células de glóbulos rojos de ovejas que rodean la célula de plasma de interés. La célula de plasma de antígeno-específica sencilla en el centro de la placa puede aislarse y la información genética que codifica la especificidad del anticuerpo se aisla de la célula de plasma sencilla. Usando la transcripción inversa seguido por PCR (RT-PCR), el ADN que codifica las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo puede clonarse. Tal ADN clonado puede entonces insertarse adicionalmente en un vector de expresión adecuado, preferiblemente un cásete de vector tal como un ADNpc, preferiblemente tal vector de ADNpc que contiene los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina. El vector generado puede entonces transfectarse en células hospedadoras, por ejemplo, células HEK293, células CHO, y cultivar en medio nutriente convencional modificado como se apropiado para inducir la transcripción, seleccionando los transformantes, o amplificando los genes que codifican las secuencias deseadas. Los anticuerpos de anti-PDGFR-alfa pueden tener efectos terapéuticos en tratar síntomas y condiciones relacionadas con la expresión de PDGFR-alfa. Por ejemplo, los anticuerpos pueden inhibir el crecimiento de las células que expresan PDGFR-alfa, de tal modo inhibiendo el crecimiento tumoral, o los anticuerpos pueden asociarse con un agente y liberar una toxina mortal a una célula marcada. Los anticuerpos anti-PDGFR-alfa pueden tener efectos terapéuticos en tratar enfermedades fibróticas, tal como fibrosis cardiaca, pulmonar, hígado, riñon o piel. Los anticuerpos de Anti-PDGFR-alfa pueden también tener efectos terapéuticos en el tratamiento de vasculopatía del aloinjerto o restenosis. Además, los anticuerpos de anti-PDGFR-alfa son útiles como diagnósticos para los estados de enfermedad, enfermedades fibróticas y del sistema inmune especialmente neoplásticas. Si se desea, el isotipo de un anticuerpo de anti-PDGFR-alfa puede cambiarse, por ejemplo para tomar ventaja de una propiedad biológica de un isotipo diferente. Por ejemplo, en algunas circunstancias puede ser deseable en conexión con la generación de anticuerpos como anticuerpos terapéuticos contra PDGFR-alfa donde los anticuerpos son capaces del complemento de fijación y participan en citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). Existe un número de isotipos de los anticuerpos que son capaces de los mismos, incluyendo, sin limitación, los siguientes: IgM murina, lgG2a murina, lgG2b murina, lgG3 murina, IgM humano, IgA humano, IgGI humano, e lgG3 humano. En otras modalidades puede ser deseable en conexión con la generación de anticuerpos como anticuerpos terapéuticos contra PDGFR-alfa cuyos anticuerpos son capaces de unir los receptores de Fe en células efectora y que participan en la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC). Existe un número de isotipos de anticuerpos que son capaces de lo mismo, sin limitar, los siguientes: lgG2a murina, lgG2b murina, lgG3 murina, IgGI humano, e lgG3 humano. Se apreciará que los anticuerpos que se generan no necesitan inicialmente poseer tal isotipo sino, más bien, el anticuerpo como se generó puede poseer cualquier isotipo y el anticuerpo puede ser el isotipo cambiado después de lo mismo usando técnicas convencionales que son bien conocidas en la técnica. Tales técnicas incluyen el uso de técnicas recombinantes directas (ver por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,816,397), técnicas de fusión célula-célula (ver por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 5,916,771 y 6,207,418), entre otras. A modo de ejemplo, los anticuerpos de anti-PDGFR-alfa discutidos en la presente son anticuerpos completamente humanos. Si un anticuerpo poseído deseado unido al PDGFR-alfa, puede ser fácilmente el isotipo cambiado para generar un isotipo IgM humano, IgGI humano, o lgG3 humano, mientras que todavía posea la misma región variable (que define la especificidad del anticuerpo y algo de su afinidad). Tal molécula podrá entonces ser capaz de fijar el complemento y participar en la CDC y/o ser capaz de unir a los receptores de Fe en las células efectora y participar en la ADCC. En la técnica de fusión de célula-célula, se prepara el mieloma, célula CHO u otra línea celular que posee una cadena pesada con cualquier isotipo deseado y otro mieloma. Se prepara la célula CHO u otra línea celular que posee la cadena ligera. Tales células pueden, por consiguiente, fusionarse y una línea celular que expresa un anticuerpo intacto puede aislarse. Por consiguiente, como se generan los candidatos del anticuerpo que cumplen con las atributos "estructurales" deseadas como se discutió antes, pueden generalmente proporcionarse con por lo menos ciertos atributos "funcionales" deseados a través del intercambio del isotipo. Administración y Formulaciones terapéuticas Las modalidades de la invención incluyen formulaciones farmacéuticas estériles de anticuerpos de anti-PDGFR-alfa que son útiles como tratamientos para enfermedades. Tales formulaciones inhibirían el crecimiento celular, de tal modo tratando efectivamente condiciones patológicas donde, por ejemplo, expresión de PDGFR-alfa es anormalmente elevada o estados de enfermedad medias por células que expresa PDGFR-alfa. Los anticuerpos de anti-PDGFR-alfa preferiblemente poseen afinidad adecuada para específicamente unir PDGFR-alfa, y preferiblemente tienen una duración adecuada de acción teniendo dosificación infrecuente en humanos. Una duración prolongada de la acción permitirá horarios de dosificación menos frecuentes y más adecuadas para las rutas parenterales alternas tal como inyección subcutánea o intramuscular. Pueden crearse formulaciones estériles, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la liofilización y reconstitución del anticuerpo. El anticuerpo ordinariamente se almacenará en forma liofilizada o en solución. Las composiciones de anticuerpo terapéuticas se colocan generalmente en un envase que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o frasco de solución intravenoso que tiene un adaptador que permite la recuperación de la formulación, tal como un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. La ruta de la administración del anticuerpo es de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión por intravenosa, intraperitoneal, intracerebral , intramuscular, intraocular, intrarterial, intratecal, rutas de inhalación o intralesionales, o por sistemas de liberación continua como se observa más adelante. El anticuerpo es preferiblemente administrado continuamente por infusión o inyección de bolo. Una cantidad efectiva de anticuerpo a utilizarse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración, y la condición del paciente. Por consiguiente, es preferido que la cantidad de sustancia terapéutica de la dosificación y modificación de la ruta de administración como se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Normalmente, el clínico administrará el anticuerpo hasta que se llegue a una dosificación que alcance el efecto deseado. El progreso de esta terapia es monitoreado fácilmente por ensayos convencionales o por ensayos descritos en la presente. Los anticuerpos, como se describe en la presente, pueden prepararse en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición terapéutica puede administrarse intravenosamente o a través de la nariz o pulmón, preferiblemente como un líquido o aerosol en polvo (liofilízado) . La composición también puede administrarse parenteral o subcutáneamente como se desee. Cuando se administra sistémicamente, la composición terapéutica debe ser estéril, libre de pirógeno y en una solución parenteralmente aceptable que tiene un interés adecuado para el pH, isotonicidad, y estabilidad. Estas condiciones se conocen por los expertos en la técnica. Brevemente, las formulaciones de dosificación de los compuestos descritos en la presente se preparan para el almacenamiento o administración mezclando el compuesto que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes, o estabilizadores fisiológicamente aceptables. Tales materiales son no tóxicos a los recipientes en las dosificaciones y concentraciones utilizadas, e incluyen amortiguadores tal como HCI de TRIS, fosfato, citrato, acetato y otras sales de ácido orgánico; antioxidantes tal como ácido ascórbico; péptidos de peso molecular bajo (menos de aproximadamente diez residuos) tal como poliarginina, proteínas, tal como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidinona; aminoácidos tal como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, o arginina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; alcoholes de azúcar tal como manitol o sorbitol; contraiones tal como tensioactivos de sodio y/o no iónicos tal como TWEEN, PLURONICS o pol ieti leng I ico I . Las composiciones estériles para inyección pueden formularse de acuerdo a la práctica farmacéutica convencional como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20a ed, Lippincott Williams & Wilkens Publishers (2003)). Por ejemplo, la disolución o suspensión del compuesto activo en un vehículo tal como agua o aceite vegetal que ocurre naturalmente tiene aceite de sésamo, cacahuete, o semilla de algodón o un vehículo graso sintético como oleato de etilo o similares pueden desearse. Los amortiguador, conservadores, antioxidantes y similares pueden incorporarse de acuerdo a la práctica farmacéutica aceptada. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el polipéptido, cuyas matrices están en la forma de artículos configurados, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación continua incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) como se describe por Langer y colaboradores, J. Biomed Mater. Res., (1981) 15: 167-277 y Langer, Chem. Tech., (1982) 12:98-105, o poli(vinilalcohol)), polilactidas (Patente Estadounidense No. 3,773,919, EP 58,481), copolímeros del ácido L-glutámico y etil-L-glutamato de gamma (Sidman y colaboradores, Biopolimers, (1983) 22:547-556), acetato de etilen-vi n ilo no-degradable (Langer y otros, supra), copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico degradables tal como el LUPRON Depot™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988). Mientras los polímeros tal como acetato de etilen-vin ilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por períodos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante mucho tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como un resultado de la exposición a la humedad a 37°C, dando por resultado una pérdida de actividad biológica y cambios posibles en inmunogenicidad. Las estrategias racionales pueden idearse para la estabilización de proteína dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre para ser la formación de enlace S-S intermolecular a través del intercambio de disulfuro, la estabilización puede realizarse modificando residuos de sulhidrilo, liofilizando soluciones ácidas, controlando el contenido de agua, usando aditivos apropiados, y desarrollando las composiciones de matriz del polímero específicas. Las composiciones de liberación sostenida también incluyen preparaciones de cristales del anticuerpo suspendido en formulaciones adecuadas capaces de mantener cristales en suspensión. Estas preparaciones cuando se inyectan subcutánea o intraperitonealmente pueden producir un efecto de liberación continua. Otras composiciones también incluyen anticuerpos liposomalmente encerrados. Los liposomas que contienen tales anticuerpos se preparan por métodos conocidos per se: Patente Estadounidense No. DE 3,218,121; Epstein y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046: EP 143,949: 142,641; Solicitud de Patente Japonesa 83-118008. Patentes Estadounidenses Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y documento EP 102,324. La dosificación de la formulación del anticuerpo para un paciente dado se determinará por el médico de asistencia que toma en consideración varios factores conocidos para modificar la acción de fármacos incluyendo severidad y tipo de enfermedad, peso corporal, sexo, dieta, tiempo y ruta de administración, otras medicaciones y otros factores clínicos relevantes. Las dosificaciones terapéuticamente efectivas pueden determinarse por métodos in vitro o in vivo. Una cantidad efectiva de los anticuerpos, descrita en la presente, para utilizarse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración, y la condición del paciente. Por consiguiente, es preferida para la concentración de la dosificación y modifica la ruta de administración como se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación diaria normal puede ir de aproximadamente 0.001 mg/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Normalmente, el médico administrará el anticuerpo terapéutico hasta que se alcance una dosificación que alcance el efecto deseado. El progreso de esta terapia es monitoreado fácilmente por ensayos convencionales o como se describe en la presente. Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas de acuerdo con las composiciones y métodos en la presente se administrará con portadores, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en formulaciones para proporcionar transferencia, liberación, tolerancia mejorada y similares. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, lípido (catiónico o aniónico) que contienen vesículas (tal como LipofectinTM), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones aceite-en-agua y agua-en-aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de varios pesos moleculares), geles semisólidos, y las mezclas semisólidas que contienen carbowax. Cualquiera de Las mezclas anteriores pueden ser apropiadas en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, a condición de que el ingrediente activo en la formulación no sea inactivo por la formulación y la formulación es fisiológicamente compatible y tolerable con la ruta de administración. Ver también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1 -2): 1 -60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci 89(8):967-78 (2000), Powell y colaboradores "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) y las citas en la presente para información adicional relacionada a formulaciones, excipientes y portadores se conocen bien por los químicos farmacéuticos. Diseño y Generación de Otros Terapéuticos De acuerdo con la presente invención y basado en la actividad de los anticuerpos que se producen y caracterizan en la presente con respecto a PDGFR-alfa, el diseño de otras modalidades terapéuticas se facilita y describe a un experto en la técnica. Tales modalidades incluyen, sin limitación, terapéutica de anticuerpo avanzada, tal como anticuerpos biespecíficos, inmunotoxinas, terapéutica con radiomarcados, y dominios del anticuerpo V sencillo, agente de unión similar a anticuerpo basado en otros andamios de región V, generación de terapéutica con péptidos, terapias de gen, particularmente intracuerpos, terapéutica con antisentido, y moléculas pequeñas. Un sitio de unión al antígeno puede proporcionarse por medio del arreglo de CDRs en andamios de proteína de no-anticuerpo, tal como fibronectina o citocromo B etc. (Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide y colaboradores (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151; Nygren y colaboradores (1997) Current Opinión in Structural Biology. 7:463-469) o por residuos de aminoácido de asignación aleatoria o transformantes de un bucle dentro de un andamio de proteína para conferir la especificidad de unión para un objetivo deseado. Los andamios para sitios de unión nuevos de ingeniería en proteínas se han repasados detalladamente por Nygren y colaboradores (Nygren y colaboradores (1997) Current Opinión in Structural Biology, 7: 463-469). Los andamios de proteína para imitadores de anticuerpo se describen en el documento WO/0034784, que en la presente se incorpora por referencia en su totalidad, en donde los inventores describen proteínas (imitadoras del anticuerpo) que incluyen un dominio tipo III de fibronectina que tiene por lo menos un bucle asignado aleatoriamente. Un andamio adecuado en el cual se injerta uno o más CDRs, por ejemplo un conjunto de HCDRs, puede proporcionarse por cualquier miembro de dominio de la superfamilia del gen de inmunoglobulina. El andamio puede ser una proteína humana o no humana. Una ventaja de un andamio de proteína de no-anticuerpo es que puede proporcionar un sitio de unión al antígeno en una molécula de andamio que es pequeña y/o fácil de fabricar de por lo menos algunas moléculas de anticuerpo. El tamaño pequeño de un miembro de unión puede conferir propiedades fisiológicas útiles, tal como una habilidad de introducir células, penetrar profundamente en tejidos o alcanzar objetivos dentro de otras estructuras, o para unir dentro de las cavidades de proteína del antígeno objetivo. El uso de sitios de unión del antígeno en andamios de proteína del no-anticuerpo se revisa en Wess, 2004 (Wess, L. In: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004). Normalmente son proteínas que tienen una estructura estable y uno o más bucles variables, en los cuales la secuencia de aminoácido del bucle o bucles está específicamente o aleatoriamente mutada para crear un sitio de unión al antígeno que une al antígeno objetivo. Tales proteínas incluyen dominios de unión a IgG de la proteína A a S, áurea, transferina, albúmina, tetranectina, fibronectina (por ejemplo 10vo dominio de fibronectina tipo III), lipocalinas así como gamma-cristalina y otros andamios de Affilin™ (Scil Proteins). Los ejemplos de otros procesos incluyen "M icrocuerpos" sintético basados en ciclótidos - proteínas pequeñas que tienen enlaces de disulfuro intramoleculares, M icroproteínas (Versabodies1M, Amunix) y proteínas de repetición de ancrina (DARPins, Molecular Partners). Además de las secuencias del anticuerpo y/o un sitio de unión al antígeno, un agente de unión específico de acuerdo la presente invención puede comprender otros aminoácidos, por ejemplo formando un péptido o polipéptido, tal como un dominio doblado, o impartir a la molécula otra característica funcional además de la habilidad de unir el antígeno. El agente de unión específico s de la invención puede llevar un marcado detectable, o puede conjugarse a una toxina o un radical o enzima marcado (por ejemplo vía un enlace o enlazador de peptidilo). Por ejemplo, un agente de unión específico puede comprender un sitio catalítico (por ejemplo en un dominio de enzima) así como un sitio de unión de antígeno, en donde el sitio de unión al antígeno une al antígeno y así marca el sitio catalítico al antígeno. El sitio catalítico puede inhibir la función biológica del antígeno, por ejemplo por división. En conexión a la generación de terapéuticos de anticuerpo avanzado, donde la fijación de complemento es un atributo deseable, puede ser posible eludir la dependencia en complemento para la destrucción celular a través del uso de bíespecíficos, inmunotoxinas, o radiomarcados, por ejemplo. Por ejemplo, los anticuerpos biespecífico que pueden generarse que comprenden (i) dos anticuerpos, uno con una especificidad al PDGFR-alfa y otro a una segunda molécula, que se conjugan juntos, (ii) un solo anticuerpo que tiene una cadena específica a PDGFR-alfa y una segunda cadena específica a una segunda molécula, o (iii) un solo anticuerpo de cadena que tiene especificidad al PDGFR-alfa y a la otra molécula. Tales anticuerpos biespecífico pueden generarse usando técnicas que son bien conocidas; por ejemplo, en conexión con (i) y (ii) ver por ejemplo, el 4:72 de los métodos de Fanger y colaboradores Immunol Methods 4:72-81 (1994) y Wright and Harris, supra, y en conexión con (iii) ven por ejemplo, Traunecker y colaboradores Int. J. Cáncer (Suppl.) 7:51-52 (1992). En cada caso, la segunda especificidad puede hacerse de acuerdo como se desee. Por ejemplo, la segunda especificidad puede hacerse para los receptores de activación de cadena pesada, incluyendo, sin limitación, CD16 o CD64 (ver por ejemplo, Deo y colaboradores 18: 127 (1997)) o CD89 (ver por ejemplo, Valerius y colaboradores Blood 90:4485-4492 (1997)). Los anticuerpos pueden también modificarse para actuar como inmunotoxinas que utilizan técnicas que son bien conocidas en la técnica. Ver por ejemplo, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Ver también Patente Estadounidense No. 5,194,594. En conexión con la preparación de anticuerpos radiomarcados, tales anticuerpos modificados también pueden prepararse fácilmente utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Ver por ejemplo, Junghans y colaboradores in Cáncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2a Edición, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Ver también Patentes Estadounidenses Nos. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471 y 5,697,902. Cada una de las inmunotoxinas y moléculas radiomarcadas pueden ser probablemente para elimina células que expresan el dominio de oligomerización de la subunidad de enzima multimérica deseado. En algunas modalidades, una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del anticuerpo en asociación con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable se proporciona. En algunas modalidades, un anticuerpo de anti-PDG FR-alfa se liga a un agente (por ejemplo, radioisótopo, composición farmacéutica, o una toxina). Preferiblemente, tales anticuerpos pueden utilizarse para el tratamiento de enfermedades, tales enfermedades pueden relacionase a células que expresan PDGFR-alfa o células que sobreexpresan PDGFR-alfa. Por ejemplo, se contempla que el fármaco posee la propiedad farmacéutica seleccionada del grupo de agentes antimitóticos, alquilantes, antimetabolitos, antiangiogénicos, apoptóticos, alcaloides, COX-2, y antibióticos y combinaciones de los mismos El fármaco pueden seleccionarse del grupo de mostazas de nitrógeno, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas, triacenos, análogos de ácido fólico, antraciclinas, taxanos, inhibidores de COX-2, análogos de pirimidina, análogos de purina, antimetabolitos, antibióticos, enzimas, epipodofilotoxinas, complejos de coordinación de platino, alcaloides de vinca, ureas sustituidas, derivados de metilhidracina, supresores adrenocorticales, antagonistas, endostatina, taxoles, camptotecinas, oxaliplatina , doxorubicinas y sus análogos, y una combinación de los mismos. Los ejemplos de toxinas adicionalmente incluyen gelonina, exotoxina de pseudomonas (PE), PE40, PE38, toxina de difteria, ricina, ricina, abrina, toxina alfa, saporina, ribonucleasa (ARNasa), DNase 1, enterotoxina-A estafilococia , proteína antiviral de pokeweed, gelonina. La endotoxina de pseudomonas, así como derivados, combinaciones y modificaciones de la misma.

Los ejemplos de radioisótopos incluyen emisores gamma, emisores de positrón, y emisores de rayos x que pueden utilizarse para la localización y/o terapia, y emisores beta y emisor alfa que pueden utilizarse para terapia. Los radioisótopos descritos previamente como útiles para diagnósticos, pronósticos y etapas también son útiles para la terapéutica. Los ejemplos no limitantes de agentes anticáncer o anti-leucemia incluyen antraciclinas tal como doxorubicina (adriamicina), daunorubicina (daunomicina), idarubicina, detorubicina , carminomicina, epirubicina, esorubicina, y morfolino y derivados sustituidos, combinaciones y modificaciones de los mismos. Los agentes farmacéuticos ejemplares incluyen cis-platino, taxol, caliceamicina, vincristina, citarabina (Ara-c), ciclofosfamida, prednisona, daunorubicina, idarubicina, fludarabina, clorambucil, ¡nterferón alfa, hidroxiurea, temozolomida, talidomida, y bleomicina, y derivados, combinaciones y modificaciones de los mismos. Preferiblemente, el anticáncer o anti-leucemia es doxorubicina, morfolinodoxorubicina, o morfolinodaunorubicina. Los anticuerpos de la invención también comprenden anticuerpos que tienen vidas medias (por ejemplo, vida media del suero) en un mamífero, preferiblemente un humano, mayor que el de un anticuerpo sin modificar. En una modalidad, la vida media del anticuerpo es mayor de aproximadamente 15 días, mayor de aproximadamente 20 días, mayor de aproximadamente 25 días, mayor de aproximadamente 30 días, mayor de aproximadamente 35 días, mayor de aproximadamente 40 días, mayor de aproximadamente 45 días, mayor de aproximadamente 2 meses, mayor de aproximadamente 3 meses, mayor de aproximadamente 4 meses, o mayor de aproximadamente 5 meses. Las vidas medias incrementadas de los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos en un mamífero, preferiblemente un humano, dan lugar a un título de suero mayor de los anticuerpos o fragmentos del anticuerpo en el mamífero, y así, reducen la frecuencia de la administración de los anticuerpos o fragmentos del anticuerpo y/o reducen la concentración de los anticuerpos o fragmentos del anticuerpo a administrarse. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos incrementan las vidas medias in vivo pueden generarse por técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de los mismos con vidas medias in vivo incrementadas pueden generarse modificando (por ejemplo, sustituyendo, eliminando o agregando) los residuos del aminoácido identificados como se involucró en la interacción entre el dominio Fe y el receptor FcRn (ver, por ejemplo, Publicaciones Internacionales Nos. WO 97/34631 y WO 02/060919, que se incorporan en la presente por referencia en su totalidad). Los anticuerpos o fragmentos de los mismos con incrementos en las vidas medias in vivo pueden generarse uniendo a los anticuerpos o moléculas del polímero de fragmentos de anticuerpo tal como polietilenglicol de peso molecular elevado (PEG). El PEG puede unirse al anticuerpo o fragmento del anticuerpo con o sin un enlazador multifuncional con la conjugado de sitio-específico del PEG al N o C-terminal de los anticuerpos o fragmentos del anticuerpo o vía grupos épsilon-amino presente en residuos de lisina. La derivación lineal o ramificada del polímero que da lugar a pérdida mínima dé actividad biológica se utilizará. El grado de conjugación será monitoreado de cerca por SDS-PAGE y espectrometría de masa para asegurar el conjugado apropiado de las moléculas de PEG a los anticuerpos. El PEG sin reaccionar puede separarse de conjugados de anticuerpo-PEG cerca de, por ejemplo, exclusión de tamaño o cromatografía de intercambio iónico. Como se apreciará por un experto en la técnica, en las modalidades anteriores, aunque los valores de afinidad pueden ser importantes, otros factores pueden ser igual o más importantes, dependiendo de la función particular del anticuerpo. Por ejemplo, para una inmunotoxina (toxina asociada con un anticuerpo), el acto de unión del anticuerpo al objetivo puede ser útil; sin embargo, en algunas modalidades, es la internalización de la toxina en la célula que es el resultado final deseado. Tal como, anticuerpos con un alto porcentaje de internalización pueden ser deseables en estas situaciones. Así, en una modalidad, los anticuerpos con una eficacia alta en la internalización se contemplan. Una eficacia alta de internalización puede medirse como un por ciento de anticuerpo internado, y puede ser de un valor bajo de 100%. Por ejemplo, en modalidades diferentes, 0.1-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-99 y 99-100% pueden ser una eficacia alta. Como se apreciará por un experto en la técnica, la eficacia deseable puede ser diferente en diferentes modalidades, dependiendo de, por ejemplo, el agente asociado, la cantidad de anticuerpo que puede administrarse en un área, los efectos secundarios del complejo del agente anticuerpo, al tipo (por ejemplo, tipo de cáncer) y severidad del problema a tratarse.

En otras modalidades, los anticuerpos descritos en la presente proporcionan un kit de ensayo para la detección de la expresión de PDGFR-alfa en tejidos o células mamíferas para clasificar una enfermedad o trastorno asociado con cambios en la expresión de PDGFR-alfa. El kit comprende un anticuerpo que une PDGFR-alfa y el medio para indicar la reacción del anticuerpo con el antígeno, si está presente. En algunas modalidades, un artículo para fabricación se proporciona, que comprende un envase, que comprende una composición que contiene un anticuerpo de anti-PDGFR-alfa, y un injerto o marcado empaquetado que indica que la composición puede utilizarse para tratar la enfermedad mediada por la expresión de PDGFR-alfa. Preferiblemente un mamífero y, más preferiblemente, un humano, recibe el anticuerpo de anti-PDGFR-alfa. Combinaciones El tratamiento antineoplástico definido en la presente puede aplicarse como una sola terapia o puede involucrar, además de los compuestos de la invención, cirugía convencional, trasplantes de célula madre de médula y periférica o radioterapia o quimioterapia. Tal quimioterapia puede incluir una o más de las siguientes categorías de agentes antitumor: (i) otros fármacos antiproliferativos/antineoplásticos y combinaciones de los mismos, como se utiliza en oncología médica, tal como agentes alquilantes (por ejemplo cis-platina, oxaliplatina, carboplatina, ciclofosfamida, mostaza de nitrógeno, melfalan, clorambucil, busulfan, temozolamida y nitrosoureas); antimetabolitos (por ejemplo gemcitabina y antifolates tal como fluoropirimidinas como 5-fluorouracil y tegafur, raltitrexed, metotrexato, arabinosido de citosina, e hidroxiurea); antibióticos antitumores (por ejemplo antraciclinas como adriamicina, bleomicina, doxorubicina , daunomicina, epirubicina, idarubicina, mitomicina-C , dactinomicina y mitramicina); agentes antimitóticos (por ejemplo alcaloides de vinca como vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina y taxoides como inhibidores de taxol y taxótero y polocinasa); e inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo epipodofilotoxinas como etoposida y teniposida, amsacrina, topotecan y camptotecina); (ii) agentes citoestáticos tal como antioestrógenos (por ejemplo tamoxifen, fulvestrant, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno e yodoxífeno), antiandrógenos (por ejemplo bicalutamida, flutamida, nilutamida y acetato de ciproterono) , antagonistas de LHRH o agonistas de LHRH (por ejemplo goserelina, leuprorelina y buserelina), progestogenos (por ejemplo acetato de megestrol), inhibidores de aromatasa (por ejemplo como anastrozol, letrozol, vorazol y exemestano) e inhibidores de 5a-reductasa tal como finasterida; (iii) agentes anti-invasión (por ejemplo inhibidores de la familia cinasa c-Src como 4-(6-cloro-2,3-metilendioxianilino)-7-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]-5-tetrahidropiran-4-iloxiquinazolina (AZD0530: Solicitud de Patente Internacional WO 01/94341) y N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-{6-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1 - il]-2-metilpirimidin-4-ilamino}tiazol-5-carboxamida (dasatinib. BMS-354825; J. Med. Chem., 2004, 47, 6658-6661), e inhibidores de metaloproteinasa como marimastat, inhibidores de función del receptor activador de plasminógeno de urocinasa o, inhibidores de catepsinas, inhibidores de serina proteasas por ejemplo matriptasa, hepsina, urocinasa, inhibidores de heparanasa); (iv) agentes citotóxicos tal como fludarabina, 2-clorodesoxiadenosina , clorambucilo o doxorubicina y combinación de los mismos tal como fludarabina, 2-clorodesoxiadenosina, clorambucilo o doxorubicina y combinación de los mismos tal como fludarabina + ciclofosfamida, CVP: ciclofosfamida + vincristina + prednisona, ACVBP: doxorubicina + ciclofosfamida + vindesina + bleomicina + prednisona, CHOP: ciclofosfamida + doxorubicina + vincristina + prednisona, CNOP: ciclofosfamida + mitoxantrona + vincristina + prednisona, m-BACOD: metotrexato + bleomicina + doxorubicina + ciclofosfamida + vincristina + dexametasona + leucovorina, MACOP-B: metotrexato + doxorubicina + ciclofosfamida + vincristina + dosis fija de prednisona + bleomicina + leucovorina, o ProMACE CytaBOM: prednisona + doxorubicina + ciclofosfamida + etoposida + citarabina + bleomicina + vincristina + metotrexato + leucovorina. (v) inhibidores de la función del factor de crecimiento, por ejemplo tales inhibidores incluyen anticuerpos y anticuerpos del receptor de factor de crecimiento (por ejemplo trastuzumab del anticuerpo anti-erbB2 [Herceptin™], panitumumab del anticuerpo anti-EGFR, cetuximab del anticuerpo anti-erbB1 [Erbitux, C225] y cualquier factor de crecimiento o anticuerpos del factor de crecimiento descritos por Stern y colaboradores Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol. 54, pp 11-29); tales inhibidores también incluyen inhibidores de tirosina cinasa, por ejemplo inhibidores de la familia del factor de crecimiento epidérmica (por ejemplo inhibidores la familia de tirosina cinasa de EGFR tal como /V-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metoxi-6-(3-morfolinpropoxi)quinazolin-4-amina (gefitinib, ZD1839), /-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)quinazolin-4-amina (erlotinib, OSI-774) y 6-acrilamido-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-(3-morfolinopropoxi)-quinazolin-4-amina (Cl 1033), inhibidores de tirosina cinasa erbB2 tal como lapatinib, inhibidores de la familia del factor de crecimiento de hepatocito, inhibidores de la familia del factor de crecimiento derivada de plaqueta tal como imatinib, inhibidores de la serina/treonina cinasa (por ejemplo inhibidores de señalización Ras/Raf tal como inhibidores de farnesil transferasa, por ejemplo sorafenib (BAY 43-9006)), inhibidores de señalización celular a través de cinasas MEK y/o AKT, inhibidores de la familia del factor de crecimiento de hepatocito, inhibidores de c-kit, inhibidores de cinasa de abl, inhibidores de cinasa del receptor IGF (factor de crecimiento similar a insulina), inhibidores de cinasa aurora (por ejemplo AZD1152, PH739358, VX-680, MLN8054, R763, MP235, MP529, VX-528 y AX39459), inhibidores de cinasa dependientes de ciclina tal como inhibidores CDK2 y/o CDK4, e inhibidores de proteínas de señalización de supervivencia tal como Bcl-2, Bcl-XL por ejemplo ABT-737; (vi) agentes antiangiogénicos tal como los que inhiben los efectos del factor de crecimiento endotelial vascular, [por ejemplo el bevacizumab del anticuerpo del factor de crecimiento celular endotelial anti-vascular (Avastin™) e inhibidores de tirosina cinasa del receptor de VEGF tal como 4-(4-bromo-2-fluoroanilino)-6-metoxi-7-(1-metilpiperidin-4-ilmetoxi)quinazolina (ZD6474; Ejemplo 2 dentro del documento WO 01/32651), 4-(4-fluoro-2-metilindol-5-iloxi)-6-metoxi-7-(3-pirrolidin-1-ilpropoxi)quinazolina (AZD2171; Ejemplo 240 dentro del documento WO 00/47212), vatalanib (PTK787: WO 98/35985) y SU11248 (sunitinib; WO 01/60814), compuestos tal como los descrito en las Solicitudes de Patente Internacionales W097/22596, WO 97/30035, WO 97/32856, WO 98/13354, WO00/47212 y WO01/32651 y compuestos que trabajan por otros mecanismos (por ejemplo linomida, inhibidores de la función de integrina a?ß3 y angiostatina)] o factor 1 estimulante de colonia (CSF1) o receptor CSF1.; (vii) agentes perjudiciales vasculares tal como Combretastatina A4 y compuestos descritos en las Solicitudes de Patentes Internacionales WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 y WO 02/08213; (viii) terapias antisentido, por ejemplo las que se dirigen al listado objetivo anterior, tal como G-3139 (Genasense), un antisentido anti bcl2; (ix) proceso de terapia de gen, incluyendo por ejemplo procesos para sustituir genes anormales tal como procesos p53 anormal o BRCA1 o procesos de BRCA2, GDEPT anormales (terapia de profármaco de enzima dirigida a gen) tal como los que utilizan citosina desaminasa, timidina cinasa o una enzima de nitroreductasa bacteriana y procesos para incrementar la tolerancia paciente a quimioterapia o radioterapia tal como terapia de gen de resistencia a multifármacos; y (x) procesos de inmunoterapia, incluyendo por ejemplo tratamiento con Alemtuzumab (campath-1 H™), un anticuerpo monoclonal dirigido a CD52, o tratamiento con anticuerpos dirigidos a CD22, procesos ex vivo e in vivo para incrementar la inmunogenicidad de células tumorales de pacientes, transfección con citocinas tal como interleucina 2, interleucina 4 o factor estimulador de colonia de macrofago o granulocito, procesos para disminuir la energía de la célula T tal como tratamiento con anticuerpos monoclonales que inhiben la función de CTLA-4, procesos que usan células inmunes transfectadas tal como células dendríticas transfectadas con citocina, procesos que utilizan líneas celulares tumorales transfectadas con citocina y procesos que usan anticuerpos anti-idiotípicos. (xi) inhibidores de degradación de proteína tal como inhibidor de proteasoma tal como Velcade (bortezomid) . (xii) procesos terapéuticos bioterapéuticos por ejemplo los que utilizan péptidos o proteínas (tal como anticuerpos o construcciones de dominio del receptor externo soluble) que secuestran ligandos del receptor, ligando bloque que unen al receptor o señalización del receptor disminuida (por ejemplo debido a la degradación del receptor mejorada o niveles de expresión disminuida). Tal tratamiento conjunto puede alcanzarse por medio de la dosificación simultánea, secuencial o separada de los componentes individuales del tratamiento. Tales productos de combinación utilizan los compuestos de esta invención, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, dentro del intervalo de dosificación descrito antes y el otro agente farmacéuticamente activo dentro de su intervalo de dosificación aprobado. En una modalidad de la invención los tratamientos antineoplásticos de la invención combinados con agentes que inhiben los efectos del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), (por ejemplo bevacizumab del anticuerpo del factor de crecimiento celular endotelial anti-vascular (Avastin©), anticuerpos del receptor del factor de crecimiento endoteliales anti-vasculares como anticuerpos anti-KDR y anticuerpos a nti-f It 1 , compuestos tal como los descritos en las Solicitudes de Patentes Internacionales WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/3285, WO 98/13354, WO00/47212 y WO01/32651) y compuestos que trabajan por otros mecanismos (por ejemplo linomida, inhibidores de función de integrina avb3 y angiostatina); En otra modalidad de la invención los tratamientos anti-angiogénicos de la invención son agentes combinados que inhiben la actividad de la tirosina cinasa del receptor de factor de crecimiento endotelial vascular del, KDR (por ejemplo AZD2171 o AZD6474). Los detalles adicionales en AZD2171 pueden encontrarse en Wedge y colaboradores (2005) Cáncer Research. 65(10):4389-400. Los detalles adicionales en AZD6474 pueden encontrarse en Ryan & Wedge (2005) British Journal of Cáncer. 92 Suppl LS6-13. Ambas publicaciones en la presente se incorporan por referencia en su totalidad. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos completamente humanos 1.1.2, 1.5.3, 2.1.2 se combinan solos o en combinación con Avastin™, AZD2171 o AZD6474. Tal tratamiento conjunto puede alcanzarse por medio de dosificación simultánea, secuencial o separada de los componentes individuales de tratamiento. Tales productos de combinación utilizan los compuestos de esta invención, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, dentro del intervalo de dosificación descrito antes y del otro agente farmacéuticamente activo dentro de su intervalo de dosificación aprobado. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos, que incluyen los experimentos conducidos y resultados alcanzados se proporcionan para propósitos ilustrativos solamente y no deben interpretarse como limitantes sobre las enseñanzas en la presente. EJEMPLO 1 INMUNIZACION Y TITULACION Inmunóqeno El dominio extracelular de PDGFR-alfa soluble recombinante se obtuvo de R&D Systems (Minneapolis, MN. Catalog #: 322-PR/CF) y se utilizó como el inmunógeno. Además, el PDGFR-alfa humano recombinante expresado en células de BHK (riñon de hámster bebé) se utilizó como un antígeno para inmunización. Las células de BFIK se obtuvieron de la American Type Tissue Collection, catálogo No. CCL-10. Inmunización Los anticuerpos monoclonales contra PDGFR-alfa se desarrollaron por ratones XcnoMouse® secuencialmente inmunizados (cepas de XenoMouse: XMG2 (kappa lgG2) y XM3C-1 (lgG4 kappa) Amgen, Inc. Fremont, CA) con el dominio extracelular de PDGFR-alfa (R&D Systems, catálogo #: 322-PR/CF). Los animales XenoMouse se inmunizaron vía la ruta de almohadilla plantar para todas las inyecciones por medios convencionales. El volumen total de cada inyección fue 50 µ? por ratón que contenía 10 microgramos de dominio extracelular de PDGFR-alfa, 25 µ? por almohadilla plantar. Los adyuvantes Titermax GoldTM incluidos (sigma, cat. T2684), adyuvante del gel de fosfato de aluminio, Biosector de HCI (cat. 1452-250) y adyuvante de ratón de ImmbucleEasy (qCpG, Qiagen cat. No. 303105). La primera inyección se administró con Titermax GoldTM (día 0). Los refuerzos se administraron como 5 ul de adyuvante del gel de fosfato de aluminio (5 ul) y qCpG (15 ul) junto con 10 ug de dominio extracelular de PDGFRalfa los días 3, 6, 10, 13, 20, 24, 27, 31 y 34.

EJEMPLO 2 RECUPERACION DE LINFOCITOS, AISLAMIENTOS DE CELULAS B, FUSIONES Y GENERACION DE HIBRIDOMAS Los ratones inmunizados SE sacrificaron mediante dislocación cervical y los nodulos linfáticos vaciados se cosecharon y reunieron de cada cohorte. Las células linfoides se disociaron moliendo en DMEM para liberar las células de los tejidos, y las células se suspendieron en DMEM. Las células se contaron, y 0.9 mi de DMEM por 100 millones de linfocitos se agregaron a la pelotilla celular para suspender de nuevo las células suavemente pero completamente. Usando 100 µ? de gránulos magnéticos de CD90+ por 100 millones de células, las células se marcaron incubando las células con los gránulos magnéticos a 4°C durante 15 minutos. La suspensión de célula magnéticamente-marcada que contiene hasta 108 células positivas (o hasta 2x109 de células totales) se cargó sobre una columna de LS+ y la columna se lavó con DMEM. El efluente total se recolectó como la fracción de CD90-negativa (más de estas células se esperaba que fueran células B). Una fusión se realizó mezclando células B enriquecidas lavadas de las anteriores y células P3X63Ag8.653 de mieloma no secretadas adquiridas de ATCC (cat. No. CRL 1580) (Kearney y colaboradores, J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550) en una proporción 1:1. La mezcla celular se granuló suavemente mediante centrifugación a 800 x g. Después del retiro completo del sobrenadante, las células se trataron con 2-4 mi de solución de Pronase (CalBiocem. cat. # 53702; 0.5 mg/ml en PBS) por no más de 2 minutos. Después se agregaron 3-5 mi de FBS para detener la actividad enzimática y la suspensión se ajustó a 40 mi de volumen total usando la solución de fusión de célula electro, ECFS (0.3 M de sucrosa, Sigma, Cat. # S7903, 0.1 mM de acetatos de magnesio, Sigma, Cat. # M2545, 0.1 mM de acetato de calcio, Sigma, Ca. t# C4705). El sobrenadante se eliminó después de la centrifugación y las células se suspendieron de nuevo en 40 mi de ECFS. Esta etapa de lavado se repitió y las células de nuevo se suspendieron nuevamente en ECFS a una concentración de 2x106 células/ml. La fusión de electro-célula se realizó usando un generador de fusión, modelo ECM2001. Genetronic, Inc., San Diego, CA. El tamaño de cámara de fusión usado fue 2.0 mi, usando los siguientes ajustes del instrumento: Condición de alineación: voltaje: 50 V, tiempo: 50 segundos: ruptura de membrana a: voltaje: 3000 V, tiempo: 30 µ/segundos; tiempo que se mantuvo la post-fusión: 3 segundos. Después de la ECF, las suspensiones celulares se eliminaros cuidadosamente de la cámara de fusión bajo condiciones estériles y se transfirieron en un tubo estéril que contienen el mismo volumen de Hybridoma Culture Médium (DMEM (JRH Biosciences), 15% de FBS (Hyclone), complementado con L-glutamina, pen/strep, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (todo de Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim). Las células se incubaron por 15-30 minutos a 37°C, y después se centrifugaron a 400 x g (1000 rpm) durante cinco minutos. Las células se resuspendieron suavemente en un pequeño volumen de Hybridoma Selection Médium (Hybridoma Culture Médium complementado con 0.5x HA (Sigma, cat. # A9666)), y el volumen se ajustó apropiadamente con más Hybridoma Selection Médium, basado en una colocación en placa final 5x106 de células B total por placa de 96 pozos y 200 µ? por pozo. Las células se mezclaron suavemente y pipetearon en placas de 96 pozos y se dejó crecer. El día 7 ó 10, un medio del medio se eliminó, y las células se re-alimentaron con Hybridoma Selection Médium. Investigación de ELISA Para el ensayo de ELISA, el PDGFR-alfa humano recombinante (R&D systems. Cat. #322-PR/CF), en una concentración de 4 ug/ml, se utilizó como un reactivo de captura. Las placas de ELISA se cubrieron con PDGFR-alfa humano recombinante en un volumen de 50 µ?/???? en amortiguador de revestimiento de antígeno (0.1 M de amortiguador de carbonato, pH 9.6 de NaHC03 (MW 84) 8.4 g/l) e incubó durante la noche a 4°C. El siguiente día, la placa de ELISA se lavó 3 veces con amortiguador de lavado (0.05% Tween 20 en 1x PBS) y posteriormente se bloqueó con 200 µ?/???? de amortiguador de bloqueo (1% de BSA, 0.01% de Tween 20, 0.1% de Thimerosal en 1x PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Sobre la terminación de la etapa de bloqueo, 50 µ?/???? de sobrenadante de hibridoma se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la incubación, la placa de ELISA se lavó 3 veces en amortiguador de lavado. Seguido de la etapa de lavado, 50 µ?/???? del anticuerpo de detección se agregaron a los pozos e incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa de ELISA se lavó posteriormente 3 veces con amortiguador de lavado y el sustrato de TMB se agregó (50 µ?/????). Seguido de la adición de la solución de detención (50 µ?/????), la placa de ELISA se leyó a 650 nm con un lector de placa de ELISA. Los sobrenadantes se estimaron positivos por ELISA donde se evaluaron posteriormente por FMAT y FACS. EJEMPLO 3 SELECCION DE ANTICUERPOS CANDIDATO POR FMAT Y FACS Después de 14 días de cultivo, los sobrenadantes del hibridoma se protegieron para anticuerpos monoclonales de PDGFR-alfa-especificos por Fluorometric Microvolume Assay Technology (FMAT) mediante la protección contra la línea celular MG-63 de osteosarcoma humana o células HEK293 recombinantes que se transfectaron con PDGFR-alfa humano y se protegieron de manera contraria contra células HEK293 madre. Los sobrenadantes de cultivo de los pozos del crecimiento de células de hibridoma positivos basados en la clasificación primaria se eliminaron y las células del hibridoma de PDGFR-alfa positivas se suspendieron con medio de cultivo de hibridoma fresco y transfirieron a placas de 24 pozos. Después de dos días en cultivo, estos sobrenadantes estuvieron listos para una clasificación de confirmación secundaria. En la clasificación de confirmación secundaria, los positivos en la primera clasificación se clasificaron por FACS con dos conjuntos o tres conjuntos de anticuerpos de detección usados por separado: 1.25 ug/ml GAH-Gamma Cy5 (JIR#109-176-098) para detección de cadena gamma humana; 1.25 ug/ml GAH-Kappa PE (S . B J2063-09) para detección de cadena ligera kappa humana y 1.25 ug/ml GAH-lambda PE (S. B. #2073-09) para detección de cadena ligera lambda humana para confirmar que los anticuerpos anti-PDGFR-alfa fueran completamente humanos. EJEMPLO 4 ENSAYO DE FOSFORILACION DE TIROSINA DE PDGFR 791 líneas de anticuerpo se examinado usando un ensayo de fosforilación de tirosina de PDGFR (pTyr por sus siglas en inglés) para determinar si las líneas de anticuerpo inhibieron la fosforilación de PDGFR-alfa en células tumorales. Brevemente, las células MG-63 de osteosarcoma humanas se sembraron a 10.000 células por pozo en una placa de ensayo FMAT de 96 pozo en 100 µ? de Starvation Media (1% de FBS tratado con carbón/dextrano) e incubadas a 37°C por aproximadamente 20 horas. El Starvation Media se eliminó y 37.5 µ? del medio se agregó a todos los pozos que recibieron la muestra y se agregaron 12.5 µ? a los pozos que recibieron el control (ratón mAb anti-PDGF a (BD PharMingen catálogo # 556001) o ratón lgG2a (serotech, 2X concentración final)) e incubaron durante 30 minutos a 37°C. 50 µ? de PDGF-AA (R&D) en 1% de medio de ensayo a 2X de concentración final (50 ng/ml) se agregaron a todas las placas y el medio se agregó a la columna 12 de la placa control. Las placas se incubaron durante 10 minutos a 37°C. El medio se eliminó y se agregaron 100 µ? de formaldehído al 3.7% en PBS/3%BSA e incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron dos veces con PBS y 100 µ? de amortiguador de permeabilización (0.1% de Triton-X en 3%BSA/PBS) se agregaron a cada pozo, incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos, y desechado. Se agregaron 100 mi de 0.6% de peróxido de hidrógeno en PBS/3% BSA para hacer inactivo cualquier actividad de la peroxidasa endógena e incubando a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las placas se lavaron tres veces con PBS/0.1% de Tween-20 y bloquearon con 100 µ? de 10% de FBS en PBS/0.1% de Tween-20. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, el amortiguador de bloqueo se eliminó, y 50 µ? del anticuerpo de PDGFa anti-fosfo (sc-12910-R) (1 g/ml) se agregaron a cada pozo en 10% de FBS/PBS-T. Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente, después se lavaron tres veces con PBST, impregnaron durante 5 minutos entre cada lavado. Se agregaron 50 µ? de anticuerpo secundario Goat anti-Rabbit IgGFc-HRP diluido Blocking Buffer e incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron tres veces durante 5 minutos con PBST y se sometieron a punción en seco. Se agregaron 50 µ? del reactivo de ECL (LumiGLO Reserve, KPL catálogo # 54-71-01) y RLUs se leyeron inmediatamente. Las placas se lavaron dos veces con PBST y se sometieron a punción en seco. Las placas después se congelado a -80°C durante 30-60 minutos. Las placas se llevaron a temperatura ambiente y 100 µ? de CyQuant se agregaron a cada pozo. Las placas se leyeron a 485 nm de excitación y 530 nm de emisión en un lector de fluorescencia. 103 líneas se seleccionaron basadas en una neutralización mayor o igual a 90% en el ensayo de pTyr, es decir fosforilación de tirosina inhibida por líneas de anticuerpo seleccionadas del receptor PDGF-alfa mayor o igual al 90%. (Datos no mostrados.) EJEMPLO 5 ANALISIS DE AFINIDAD Y CONCENTRACION DE SOBRENADANTES DE HIBRIDOMA ANALISIS DE ANTIGENO ALTO (AH)/ANTIGENO LIMITADO (LA) 103 líneas de anticuerpo se examinado usando un análisis de antígeno alto(HA)/antígeno limitado (LA) como se describe más adelante. HA es una reacción dependiente de concentración del anticuerpo, y es así una medida de concentración del anticuerpo. LA es en gran parte una reacción dependiente de afinidad del anticuerpo y así, puede ser una medida de afinidad del anticuerpo. Ensayo de Cuantificación del Antigeno Alto Brevemente, las placas de ELISA se cubrieron con una cantidad mayor de antígeno PDGFR-alfa humano (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN Cat. No. 322-PR-050/CF) en comparación con el Limited Antigen Quantitation Assay descrito más adelante. Los sobrenadantes del hibridoma que contienen anticuerpos se titularon sobre un intervalo de dilución de 1:51 a 1:1656. Un control de un anticuerpo PDGFR-alfa-específico anti-humano de ratón conocido (FarMingen Catálogo No. 556001) se utilizó para definir el intervalo lineal del ensayo. Los datos dentro del intervalo lineal entonces se utilizaron para derivar la concentración relativa del anticuerpo PDGFR-específico en cada muestra titulada. Ensayo de Cuantificación del Antígeno Limitada Las placas de microtitulación se cubrieron con una cantidad menor de antígeno PDGFR-alfa humano en comparación con el High Antigen Quantitation Assay descrito antes. Cincuenta microlitros (50 µ?) de PDGFR-alfa humano a 64, 32, 16, 8, 4 y 2 ng/ml (que cubren un intervalo de 8.5 nM a 0.26 nM) en 1% de leche de descremada/1 X de PBS pH 7.4/0.5% de azida se agregaron a cada pozo. La placa se incubó durante 30 minutos. Las placas se lavaron cuatro veces con agua, y se agregaron 50 µ? del sobrenadante de hibridoma que contiene los anticuerpos de prueba diluidos a 1:25 en 1% de leche descremada/1 X de PBS pH 7.4/0.5% de azida a los pozos. Las placas se envolvieron firmemente con la envoltura plástica o película de parafina, e incubaron durante la noche con agitación a temperatura ambiente. En el día siguiente, todas las placas se lavaron cinco veces y 50 µ? de anticuerpo policlonal de IgG Fe HRP anti-Humano de cabra en una concentración de 0.5 ug/ml en 1% de leche, 1X PBS pH 7.4 se agregó a cada pozo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron por al menos cinco veces con agua de la llave. Cincuenta microlitros (50) µ? de TMB del sustrato HPR se agregados a cada pozo, y la placa se incubó durante 30 minutos. La reacción de HRP-TMB se detuvo agregando 50 µ? de ácido fosfórico 1 M a cada pozo. La densidad óptica (absorbencia) a 450 nm se midió para cada pozo de la placa. Treinta y cuatro (34) líneas de anticuerpo se seleccionaron basadas en la afinidad de unión relativa. La selección se basó en la titulación del antígeno a 16 ng/ml y 2 ng/ml. Los cortes seleccionados fueron LA mayor a 0.3 unidades OD y 3.3 µg/ml. Se descartaron las líneas que exhibieron reactividad débil en la concentración de antígeno de 2 ng/ml del antígeno. Nueve (9) líneas adicionales se agregaron para incrementar el grupo candidato en base a la inhibición de la fosforilación de PDGFR-alfa en células MG-63, tal que un total de 43 líneas de anticuerpos que exhibieron inhibición potente de la fosforilación de tirosina y afinidad relativa alta basada en ensayo de HA/LA se continuaron. Las nueve líneas adicionales mencionadas anteriormente exhibieron la inhibición completa de la fosforilación de PDGFR-alfa (es decir 100%). Ningunas de las líneas de reacción cruzada con PDGFR-beta u homólogos (FLT3, c-kit, CSF-IR).

TABLA 2 SUMARIO DE 43 LINEAS DE ANTICUERPO SELECCIONADAS BASADAS EN HABILIDAD PARA POTENCIALMENTE INHIBIR LA FOSFORILACION DE PDGFR-ALFA EN CELULAS MG-63 Promedio de Inhibición de Línea de Anticuerpo pTyr 3.197 >100% 3.476 >100% 2.1623 >100% 3.87 >100% 3.404 >100% 3.72 >100% 2.1795 >100% 2.1853 >100% 2.1954 >100% 7.7007 >100% 2.2071 >100% Promedio de Inhibición de Línea de Anticuerpo pTyr 3.156 >100% 3.341 >100% 3.456 >100% 3.818 >100% 2.1696 >100% 2.451 >100% 3.457 >100% 2.175 99% 2.259 99% 2.998 99% 2.449 99% 2.414 98% 2.84 98% 3.268 98% 2.351 97% 2.850 95% 3.472 95% 2.886 94% 2.415 94% 3.23 94% 2.10 93% 2.737 93% Promedio de Inhibición de Línea de Anticuerpo pTyr 2.796 93% 2.565 92% 2.12 92% 2.624 92% 2.862 92% 3.805 92% 2.542 91% 3.289 91% 3.772 91% 2.889 90% EJEMPLO 6 CLASIFICACION IN VITRO Y ANALISIS DE DATOS DE ANTICUERPOS MONOCLONAL CLONADOS Treinta (30) líneas de anticuerpo se clonaron y examinaron adicionalmente como sigue. Ensayo de pTyr La PDGFR Tyrosine Fosfory lation (ensayo de pTyr) se realizó usando células MG-63 como se describe anteriormente en el Ejemplo 4. Los resultados se muestra en la Tabla 3. Ensayo de Proliferación La inhibición del crecimiento de células MG-63 por los anticuerpos monoclonales purificados contra PDGF -alfa se evaluó usando un PDGF-AA Proliferation Assay Screen. Brevemente, las células MG-63 se sembraron en 5,000 células por pozo en 100 µ? de medio de crecimiento completo en los pozos internos de placas de fondo claro de color negro e incubadas a 37°C, 5% de C02 durante 3-4 horas. Las células se lavaron con PBS 1X con medio y sustituidas con medio de cultivo de supresión de crecimiento (MEM, 1% de NEAA, 0.1% de NaBicarb, 1% de L en exceso) e supresión durante la noche. El medio se eliminó de las placas y se agregaron 50 µ? de 2X mAb o medio a los pozos apropiados. 50 µ? de titulación de PDGF-AA, 200 ng/ml de PDGF-AA o medio solo se agregaron y las placas se incubaron durante 3 días. Las placas se leyeron con Alamar Blue a 530 de excitación y 580 nm de emisión (100 µ? por pozo/100 µ?).

Los datos para los 15 anticuerpos monoclonales superiores, es decir exhibiendo los valores de Cl50 menores, para una estimulación celular usando 100 ng/ml (3.45 nM) PDGF-AA se sumario más adelante en la Tabla 3. Los anticuerpos monoclonales seleccionados para el ensayo adicional se muestran en negrilla. Las curvas de respuesta de dosis para 5 de los anticuerpos seleccionados se muestran en la Tabla 1. La preparación de 2.451.1.1 puede contener dos diferentes anticuerpos, con la misma cadena pesada pero diferentes cadenas ligeras, puesto que había dos diferentes secuencias de la cadena ligera detectadas durante la secuencia del ADN para este anticuerpo monoclonal TABLA 3 ENSAYO DE PROLIFERACIÓN: CLULAS MG-63 Determinación de Afinidad de FACS Kd La afinidad de los anticuerpos monoclonales purificados (mAbs 2.175.3, 2.449.1.3, 2.451.1.1, 2.998.2, 2.84.3) contra PDGFR-alfa se determinados por análisis de FACS. Brevemente, las células MG-63 que expresaron PDGFR-alfa se resuspendieron en amortiguador de FACS (2% de FBS, 0.05% de NaN3) en una concentración de aproximadamente 3 a 5 millones de células/ml. Las células se mantuvieron en hielo. Los anticuerpos purificados y CD140a control se diluyeron serialmente en 1xPBS filtrado (2x) a través de 11 pozos de placas en 96 pozos. El doceavo pozo en cada fila contuvo amortiguador solamente. Se agregaron 1x PBS y células a cada pozo de mAb tal que el volumen final fue 30 µ?/???? y cada pozo contuvo aproximadamente 100.000 células. Los intervalos de concentración molecular finales para mAbs son como sigue: mAb Concentración 2.451.1. 1 = 19.1 - 0.019 nM 2.175.3 = 10.8 - 0.021 nM 2.449.1. 3 = 10.7 - 0.021 nM 2.449.1. 3 = 9.2 - 0.009 nM 2.84.3 = 4.4 - 0.009 nM 2.449.1. 3 = 9.2 - 0.009 nM 2.998.2 = 4.6 - 0.009 nM CD140a = 20.2 - 0.020 nM Las placas se colocaron en un agitador de placa durante 5 horas a 4°C, después se giraron y lavaron 3x con PBS. Se agregaron 200 µ? de 100 ó 131 nM de anticuerpo policlonal a-humano de cabra Cy5 (Jackson Laboratories, #109-175-008) a cada pozo, y se agregaron 200 µ? de 100 nM de anticuerpo policlonal a-ratón de cabra Cy5 a las células complejadas con anticuerpo CD140a. Las placas después se colocaron en un agitador durante 40 minutos a 4°C, después se giraron y lavaron 3x con PBS. La Geometric Mean Fluorescence (GMF) de 15,000 a 20,000 "eventos" celulares para cada concentración de mAb de determinó usando un instrumento FACSCalibur. Para cada mAb, los datos de GMF se normalizaron para ambas titulaciones replicadas con relación a un punto de concentración de mAb idéntico en cada titulación. Los puntos de titulación normalizados correspondientes se promediaron para dar un punto de GMF normalizado para cada concentración de mAb. Solamente un conjunto de datos de titulación para mAb 2.351.3 fue de calidad aceptable para el análisis. Un diagrama no lineal de GMF en función de la concentración de mAb molecular se ajustó usando un software Scientist que utiliza la la ecuación: (KD + + ¦) - j((KD + M- + ])f - 4M 2 En la ecuación anterior, F = fluorescencia del medio geométrico, LT = concentración de mAb molecular total, P' = constante de proporcionalidad que relaciona unidades de fluorescencia arbitrarias para enlazar mAb, y KD = constante de disociación de equilibrio. Para cada mAb una estimación para KD se obtuvo como P' y KD se permitió flotar libremente en el análisis no lineal. La Tabla 4 a continuación listas los KDs resultantes para cada mAb junto con el 95% de intervalo de confianza del ajuste. MAbs se lista en orden de afinidad decreciente. TABLA 4 Reactividad cruzada de ratón Para ajustar los estudios de xenoinjerto animales, la reactividad cruzada de ratón se determinó usando el análisis de FACS realizado con células N1H3T3, una línea de fibroblasto murina que expresa PDGFRa endógeno. Las células N1H3T3 se incubaron en 0.5 x 106 células/ml con 10 ug/ml de anticuerpos de prueba en hielo durante 1 h, se enjuagaron y después resuspendieron en PBS con 5 ug/ml de anticuerpos IgG cabra- anti-humano marcados con Cy5. Las células se enjuagaron y analizaron por FACS para la presencia de Cy5. Solamente 3 de los anticuerpos monoclonales probados exhibieron reactividad cruzada de ratón. Los resultados se sumario en la Tabla 5. Porcentaje de Internalización El porcentaje del anticuerpo se internalizó en células que se determinaron usando un protocolo de internalización estándar. Los resultados de internalización en por ciento a 10 pg/ml se sumario en la Tabla 5. Resultados Los resultados de un análisis de clasificación ¡n vitro y datos de los 30 anticuerpos monoclonales clonados se sumario en la Tabla 5. mAbs se lista en orden de valores de Cl50 incrementados. mAbs en cursiva se seleccionaron como los diez mAbs y anticuerpos superiores, en negrilla se seleccionaron como los tres candidatos dirigidos. "( )" significa la clasificación en la Tabla 5. Como puede verse en la Tabla 5, mAb 2.175.3 exhibió inhibición excepcional de la proliferación de PDGF-AA de células MG-63 así como inhibición excepcional de fosforilación de PDGFR-alfa en células MG-63. MAbs 2.449.1.3 y 2.998.2 también fosforilación inhibida de PDGFR-alfa en células MG-63 y proliferación de PDGF-AA inhibida de células MG-63. Además, mAbs 2.449.1.3 y 2.998.2 también tienen uha afinidad de unión alta para PDGFR-alfa.

TABLA 5 SUMARIO DEL ANTICUERPO MONOCLONAL DE PDGFR-ALFA Anticuerpo Ensayo Ensayo de Ensayo de % Reactivida Afinidad: pTyr: Proliferación: Proliferación: Internalización d Cruzada KD %de CI50 ng/ml CI50 ng/ml @ 10 ug/ml de Ratón Inhibición (1-6-06) (1-23-06) @ 2Mg/ml 2.175.3 100 67.3(1) 56.1 (1) 19% Si 328pM (0.45nM) (0.37nM) 2.449.1.3 99 178.6 (2) 236.6 (2) 20% 52pM (1.2nM) (1.57nM) 2.451.1.1 100 399.0 (6) 283.1 (3) 21% 389pM (2.67nM) (1.9nM) 2.998.2 99 307.6 (4) 315.5(4) 25% 57p (2.05n ) (2.1 n ) 2.84.3 98 192.3 (3) 480.9 (8) 26% 227pM (1.3nM) (3.2nM) 2.414.2 99 657.7 (9) 349.1 (5) 28% (4.4nM) (2.3nM) 5.16.1 99 385.5 (5) 422.7 (6) 31% (2.57??) (2.81nM) 3.341.2 100 403.6 (7) 471.0(7) 22% - (2.7nM) (3.1nM) .2071.1.3 99 1,276.4 (10) 492.0 (9) 21% (8.5nM) (3.3nM) 2.737.1.4 99 550.8 (8) 558.5(10) 22% (3.7nM) (3.73nM) 2.796.2 99 497.7 756.8 19% - Anticuerpo Ensayo Ensayo de Ensayo de % Reactivida Afinidad: pTyr: Proliferación: Proliferación: Internalización d Cruzada KD % de CI50 ng/ml CI50 ng/ml @ 10 ug/ml de Ratón Inhibición (1-6-06) (1-23-06) @ 2Mg/ml 7.542.2 99 1037.5 651.6 26% - 2.351.3 97 1 ,078.9 648.6 21 % - 2.16232 97 755.1 981 .7 46% Si 2.1853.3 98 1 ,122.0 2679.2 30% Si 3.818.4 92 4,602.6 - 3.457.3.1 85 - - 3.23.3 84 61.9 - 5.1.1.1 77 > 10 ug/ml - 4.16.2 74 > 10 ug/ml - 3.87.1.1 69 6,237.3 - .1576.1.2 65 > 10 ug/ml - 3.472.1.1 61 - - 3.805.1.3 58 1 ,016.2 - 3.7722 56 167.9 - 5.9.3 31 2.2 - 3.23.2 26 150.3 - 2.1954.2 -3 - - 3.625.1.7 -3 3819.44 - 2.2002.3 -9 - EJEMPLO 7 ANALISIS ESTRUCTURAL DE ANTICUERPOS DE ANTI-PDGFR- ALFA Los dominios variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos se secuenciaron para determinar sus secuencias de ADN. La información de la secuencia completa para los anticuerpos de anti-PDGFR-alfa se proporciona en el listado de secuencias con las secuencias de nucleótido y aminoácido para cada combinación de cadena gamma y kappa. Las secuencias pesadas variables se analizaron para determinar la familia de VH, la secuencia de región D y la secuencia de región J. Las secuencias después se tradujeron para determinar la secuencia de aminoácido primaria y compararse con la línea germinal VH, las secuencias de región D y J para determinar las hipermutaciones somáticas. "-" indica identidad con la secuencia de línea germinal. "'#" indica un aminoácido adicional en las secuencias de anticuerpo que no se encuentre en el línea germinal. La Tabla 12 es una tabla que compara las regiones de cadena pesada del anticuerpo a su región de cadena pesada de línea germinal cognada. La Tabla 13 es una tabla que compara las regiones de cadena ligera kappa del anticuerpo a su región de la cadena ligera de línea germinal cognada. Las regiones variables (V) de cadenas de inmunoglobulina son codificadas por los segmentos de ADN múltiples de línea germinal, que se unen en regiones variables funcionales (VHDJH o VKJK) durante la ontogenia de la célula B. Debe también apreciarse que donde un anticuerpo particular difiere de su secuencia de línea germinal respectiva en el nivel de aminoácido, la secuencia de anticuerpo puede mutarse de nuevo a la secuencia de línea germinal. Tales mutaciones correctivas pueden ocurrir en una, dos, tres o más posiciones, o una combinación de cualquiera de las posiciones mutadas, usando técnicas biológicas moleculares estándar. Por medio del ejemplo no limitante. La Tabla 12 muestra que la secuencia de cadena pesada de mAb 2.175.3 (SEC ID NO.: 2) difiere de la secuencia de línea germinal correspondiente entre inter alia a través de una mutación de Q a H (mutación 1) en la región FR1, una mutación de S a H (mutación 2) en la región CDR1, y una mutación de S a R (mutación 3) en la región CDR2. Así, la secuencia de aminoácido o nucleótido que codifica la cadena pesada de mAb 2.175.3 puede modificar para cambiar la mutación 1 para proporcionar la secuencia de línea germinal en el sitio de mutación 1. Además, la secuencia de aminoácido o nucleótido que codifica la cadena pesada de mAb 2.175.3 puede modificarse para cambiar la mutación 2 o mutación 3 para proporcionar la secuencia de línea germinal en el sitio de mutación 2 o mutación 3. De hecho la secuencia de aminoácido o nucleótido que codifica la cadena pesada de mAb 2.175.3 puede comprender cualquier combinación de las dos o más mutaciones para proporcionar la secuencia de línea germinal en los sitios particulares. Las Tablas 6-11 a continuación ilustran la posición de tales variaciones de línea germinal para mAb 2.175.3, 2.449.1.3 y 2.998.2. Cada fila representa una combinación única de residuos de línea germinal y no-línea germinal en las posiciones indicadas. En caso de discrepancia entre el listado de secuencias y las Tablas 6-11, la información proporcionada en la tabla toma precedencia. Tabla 6. Mutaciones Ejemplares de Cadena Pesada de mAb 2.175.3 (SEC ID NO: 2) a Línea Germinal en el Número de Residuo Indicado. 3 35 53 57 61 80 99 100 101 106 Q S s T A Y ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO Q S s T A Y ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO P Q s s T A Y ELIMINADO ELIMINADO P ELIMINADO Q s s T A Y ELIMINADO ELIMINADO P P Q s s T A Y ELIMINADO G ELIMINADO ELIMINADO Q s s T A Y ELIMINADO G ELIMINADO P Q s s T A Y ELIMINADO G P ELIMINADO Q s s T A Y ELIMINADO G P P Q s s T A Y G ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO Q s s T A Y G ELIMINADO ELIMINADO P Q s s T A Y G ELIMINADO P ELIMINADO Q s s T A Y G ELIMINADO P P Q s s T A Y G G ELIMINADO ELIMINADO Q s s T A Y G G ELIMINADO P Q s s T A Y G G P ELIMINADO 3 35 53 57 61 80 99 100 101 106 Q S s T A Y G G P P Q S s T A N ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO Q s s T A N ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO P Q s s T A N ELIMINADO ELIMINADO P ELIMINADO Q s s T A N ELIMINADO ELIMINADO P P Q s s T A N ELIMINADO G ELIMINADO ELIMINADO Q s s T A N 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ELIMINADO H H s L V Y G G P P H H s L V N ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO H H s L V N ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO P H H s L V N ELIMINADO ELIMINADO P ELIMINADO H H s L V N ELIMINADO ELIMINADO P P H H s L V N ELIMINADO G ELIMINADO ELIMINADO 3 35 53 57 61 80 99 100 101 106 H H S L V N ELIMINADO G ELIMINADO P H H S L V N ELIMINADO G P ELIMINADO H H s L V N ELIMINADO G P P H H s L V N G ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO H H s L V N G ELIMINADO ELIMINADO P H H s L V N G ELIMINADO P ELIMINADO H H s L V N G ELIMINADO P P H H s L V N G G ELIMINADO ELIMINADO H H s L V N G G ELIMINADO P H H s L V N G G P ELIMINADO H H s L V N G G P P H H R T A Y ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO H H R T A Y ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO P H H R T A Y ELIMINADO ELIMINADO P ELIMINADO H H R T A Y ELIMINADO ELIMINADO P P H H R T A Y ELIMINADO G ELIMINADO ELIMINADO H H R T A Y ELIMINADO G ELIMINADO P H H R T A Y ELIMINADO G P ELIMINADO H H R T A Y ELIMINADO G P P H H R T A Y G ELIMINADO ELIMINADO 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ELIMINADO H H R T V N G G P P H H R L A Y ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO H H R L A Y ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO P H H R L A Y ELIMINADO ELIMINADO P ELIMINADO H H R L A Y ELIMINADO ELIMINADO P P H H R L A Y ELIMINADO G ELIMINADO ELIMINADO H H R L A Y ELIMINADO G ELIMINADO P H H R L A Y ELIMINADO G P ELIMINADO H H R L A Y ELIMINADO G P P H H R L A Y G ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO 3 35 53 57 61 80 99 100 101 106 H H R L A Y G ELIMINADO ELIMINADO P H H R L A Y G ELIMINADO P ELIMINADO H H R L A Y G ELIMINADO P P H H R L A Y G G ELIMINADO ELIMINADO H H R L A Y G G ELIMINADO P H H R L A Y G G P ELIMINADO H H R L A Y G G P P H H R L A N ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO H H R L A N ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO P H H R L A N ELIMINADO ELIMINADO P ELIMINADO H H R L A N ELIMINADO ELIMINADO P P H H R L A N ELIMINADO G ELIMINADO ELIMINADO H H R L A N ELIMINADO G ELIMINADO P H H R L A N ELIMINADO G P ELIMINADO H H R L A N ELIMINADO G P P H H R L A N G ELIMINADO ELIMINADO 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ELIMINADO P P H H R L V N ELIMINADO G ELIMINADO ELIMINADO H H R L V N ELIMINADO G ELIMINADO P H H R L V N ELIMINADO G P ELIMINADO H H R L V N ELIMINADO G P P H H R L V N G ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO H H R L V N G ELIMINADO ELIMINADO P H H R L V N G ELIMINADO P ELIMINADO H H R L V N G ELIMINADO P P H H R L V N G G ELIMINADO ELIMINADO H H R L V N G G ELIMINADO P H H R L V N G G P ELIMINADO H H R L V N G G P P Ta b la 7. M utacio nes Ejem pla res de la Cade n a Lig e ra de mAb 2.175.3 (SEC ID NO: 4) para una Línea Germinal en el Número de Residuo Indicado. 25 28 31 46 55 77 A S S L Q S A S s L Q T A s s L P s A s s L P T A s s F Q s A s s F Q T A s s F P s A s s F P T A s R L Q s A s R L Q T A s R L P s A s R L P T A s R F Q s A s R F Q T A s R F P s A s R F P T A R S L Q s A R S L Q T A R S L P s A R S L P T A R S F Q s 25 28 31 46 55 77 A R S F Q S A R s F P T A R s F P s 5 A R R L Q T A R R L Q s A R R L P T A R R L P s A R R F Q T A R R F Q s A R R F P T A R R F P s P S S L Q T P S S L Q s 15 P S S L P T P S S L P s P S S F Q T P S S F Q s 20 P S S F P T P S S F P s P S R L Q T P S R L Q s P S R L P T 25 25 28 31 46 55 77 P s R L P S P s R F Q T P s R F Q s P s R F P T P s R F P s P R S L Q T P R S L Q s P R S L P T P R S L P s P R S F Q T P R S F Q s P R S F P T P R S F P s P R R L Q T P R R L Q s P R R L P T P R R L P s P R R F Q T P R R F Q s P R R F P T P R R F P s Tabla 8. utaciones Ejemplares de la Cadena Pesada de mAb 2.449.1.3 (SEC ID NO: 10) para una Línea Germinal Número de Residuo Indicado. 35 57 99 100 101 S T ELIMINADO ELIMINADO s S T ELIMINADO ELIMINADO R s T ELIMINADO Cl S s T ELIMINADO G R s T E ELIMINADO S s T E ELIMINADO R s T E G S s T E G R s ELIMINADO ELIMINADO S 1 s ELIMINADO ELIMINADO R 1 s ELIMINADO G S 1 s ELIMINADO G R 1 s E ELIMINADO S 1 s E ELIMINADO R 1 s E G S 1 s E G R 1 N T ELIMINADO ELIMINADO S N T ELIMINADO ELIMINADO R N T ELIMINADO G S N T ELIMINADO G R N 1 E ELIMINADO 35 57 99 100 101 N T E ELIMINADO N T E G s N T E G R N ELIMINADO ELIMINADO S 1 N ELIMINADO ELIMINADO R 1 N ELIMINADO G S 1 N ELIMINADO G R 1 N E ELIMINADO S 1 N E ELIMINADO 1 N E G 1 N E G R 1 Tabla 9. Mutaciones Ejemplares de la Cadena Ligera de mAb 2.449.1.3 (SEC ID NO: 12) para una Línea Germinal en el Número de Residuo Indicado. 20 25 29 31 33 49 55 56 91 94 95 96 107 T A I s L Y Q S s ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO I T A I s L Y Q S s ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO M T A I s L Y Q s s ELIMINADO ELIMINADO P I 0 25 29 31 33 49 55 56 91 94 95 96 107 T A S L Y Q S s ELIMINADO ELIMINADO P M t A s L Y Q S s ELIMINADO P ELIMINADO I t A s L Y Q s s ELIMINADO P ELIMINADO M t A s L Y Q s s ELIMINADO P P I t A s L Y Q s s ELIMINADO P P M t A s L Y Q s s N ELIMINADO ELIMINADO I t A s L Y Q s s N ELIMINADO ELIMINADO M t A s L Y Q s s N ELIMINADO P I t A s L Y Q s s N ELIMINADO P M t A s L Y Q s s N P ELIMINADO I t A s L Y Q s s N P ELIMINADO M t A s L Y Q s s N P P I t A s L Y Q s s N P P M t A s L Y Q s T ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO I t A s L Y Q s T ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO M t A s L Y Q s T ELIMINADO ELIMINADO P I t A s L Y Q s T ELIMINADO ELIMINADO P M t A s L Y Q s T ELIMINADO P 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A s L H Q S s N ELIMINADO P 1 1 t A s L H Q S s N ELIMINADO P M t A s L H Q S s N P ELIMINADO 1 t A s L H Q S s N P ELIMINADO M t A s L H Q S s N P P 1 t A s L H Q S s N P P M t A s L H Q S T ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO 1 t A s L H Q S T ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO M t A s L H Q S T ELIMINADO ELIMINADO P 1 t A s L H Q s T ELIMINADO ELIMINADO P M t A s L H Q s T ELIMINADO P ELIMINADO 1 t A s L H Q s T ELIMINADO P ELIMINADO M t A s L H Q s T ELIMINADO P P 1 t A s L H Q s T ELIMINADO P P M t A s L H Q s T N ELIMINADO ELIMINADO 1 t A s L H Q s T N ELIMINADO ELIMINADO M 20 25 29 31 33 49 55 56 91 94 95 96 107 T A S L H Q S T N P P I t A s L H Q S T N P P M t A s L H Q G s ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO I t A s L H Q G s ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO M t A s L H Q G s ELIMINADO ELIMINADO P I t A s L H Q G s ELIMINADO ELIMINADO P M t A s L H Q G s ELIMINADO P ELIMINADO I t A s L H Q G s ELIMINADO P ELIMINADO M t A s L H Q G s ELIMINADO P P I t A s L H Q G s ELIMINADO P P M t A s L H Q G s 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Mutaciones Ejemplares de la Cadena Pesada de mAb .998.2 (SEC ID NO: 14) para una Línea Germinal en el Número de Residuo Indicado. 7 32 33 52 85 100 101 103 112 G S s s R ELIMINADO Q H V G S s s R ELIMINADO L H H G s s s R ELIMINADO H H Q G s s s R V L H H G s s s R V H H Q G s s T S ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO L G s s T S ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO Q G s s T S ELIMINADO ELIMINADO L V G s s T S ELIMINADO ELIMINADO Q V G s s T S ELIMINADO ELIMINADO L H G s s T S ELIMINADO ELIMINADO Q H G s s T S ELIMINADO L H V G s s T S ELIMINADO Q H V G s s T S ELIMINADO ELIMINADO L H G s s T S ELIMINADO ELIMINADO Q H G s s T S ELIMINADO L H V G s s T S ELIMINADO H V Q G s s T S ELIMINADO L H H G s s T S ELIMINADO H H Q G s s T S V L H H G s s T S V Q H H G s s T R ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO L G s s T R ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO Q 7 32 33 52 85 100 101 103 112 G S s T R ELIMINADO ELIMINADO L V G S s T R ELIMINADO ELIMINADO V Q G s s T R ELIMINADO ELIMINADO L H G s s T R ELIMINADO ELIMINADO 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ELIMINADO L H V D F s s ELIMINADO H V Q D F s s ELIMINADO L H H D F s s ELIMINADO Q H H D F s s V L H H D F s s V H H Q D F s R ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO L D F s R ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO Q D F s R ELIMINADO ELIMINADO L V D F s R ELIMINADO ELIMINADO V Q D F s R ELIMINADO ELIMINADO L H D F s R ELIMINADO ELIMINADO Q H D F s R ELIMINADO L H V D F s R ELIMINADO Q H V D F s R ELIMINADO ELIMINADO L H D F s R ELIMINADO ELIMINADO H Q D F s R ELIMINADO L H V D F s R ELIMINADO H V Q D F s R ELIMINADO L H H D F s R ELIMINADO Q H H D F s R V L H H D F s R V H H Q 7 32 33 52 85 100 101 103 112 D F T s ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO L D F T s ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO Q D F T s ELIMINADO ELIMINADO L V D F T s ELIMINADO ELIMINADO V Q D F T s ELIMINADO ELIMINADO L H D F T s ELIMINADO ELIMINADO H Q D F T s ELIMINADO L H V D F T s ELIMINADO H V Q D F T s ELIMINADO ELIMINADO L H D F T s ELIMINADO ELIMINADO H Q D F T s ELIMINADO L H V D F T s ELIMINADO H V Q D F T s ELIMINADO L H H D F T s ELIMINADO H H Q D F T s V L H H D F T s V H H Q D F T R ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO L D F T R ELIMINADO ELIMINADO ELIMINADO Q D F T R ELIMINADO ELIMINADO L V D F T R ELIMINADO ELIMINADO V Q D F T R ELIMINADO ELIMINADO L H D F T R ELIMINADO ELIMINADO H Q D F T R ELIMINADO L H V 27 32 33 52 85 100 101 103 112 D F T R ELIMINADO H V Q D F T R ELIMINADO ELIMINADO L H D F T R ELIMINADO ELIMINADO H Q D F T R ELIMINADO H V L D F T R ELIMINADO 1 H V Q D F T R ELIMINADO H L H D F T R ELIMINADO H H Q D F T R V H L H D F T R V H H Q Tabla 11. Mutaciones Ejemplares de la Cadena Ligera mAb 2.998.2 (SEC ID NO: 16)para la Línea Germinal en el Número de Residuo Indicado. 1 7 28 80 92 93 106 E S s A S s I E S s A S s V E s s A s I I E s s A s I V E s s A T s I E s s A T s V E s s A T I I E s s A T I V 1 7 28 80 92 93 106 E S s V S s I E S s V S s V E s s V s I I 5 E s s V s I V E s s V T s I E s s V T s V E s s V T I I E s s V T I V E s V A s s I E s V A s s V E s V A s I I E s V A s I V E s V A T s I E s V A T s V E s V A T I I E s V A T I V E s V V s s I E s V V s s V E s V V s I I E s V V s I V E s V V T s I E s V V T s V E s V V T I I E s V V T I V E F s A s s I 1 7 28 80 92 93 106 E F S A S s V E F S A S I I E F s A s I V 5 E F s A T s I E F s A T s V E F s A T I I E F s A T I V E F s V s s I 10 E F s V s s V E F s V s I I E F s V s I V E F s V T s I E F s V T s V 15 E F s V T I I E F s V T I V E F V A s s I E F V A s s V E F V A s I I E F V A s I V 20 E F V A T s I E F V A T s V E F V A T I I E F V A T I V E F V V s s I 25 1 7 28 80 92 93 106 E F V V S s V E F V V S I I E F V V s I V 5 E F V V T s E F V V T s V E F V V T I I E F V V T I V D S s A s s I 10 D S s A s s V D s s A s I I D s s A s I V D s s A T s I D s s A T s V 15 D s s A T I D s s A T I V D s s V s s I D s s V s s V D s s V s I I 20 D s s V s 1 V D s s V T s I D s s V T s V D s s V T I I D s s V T I V 25 D s V A s s I 1 7 28 80 92 93 106 D S V A S s I D S V A S s V D s V A s I I 5 D s V A s I V D s V A T s I D s V A T s V D s V A T I I D s V A T I V D s V V s s I D s V V s s V D s V V s I I D s V V s I V D s V V T s I D s V V T s V 15 D s V V T I I D s V V T I V D F s A s s I D F s A s s V D F s A s I I D F s A s I V D F s A T s I D F s A T s V D F s A T I I D F s A T I V 25 1 7 28 80 92 93 106 D F S V S s I D F S V S s V D F s V s I I 5 D F s V s I V D F s V T s I D F s V T s V D F s V T I I D F s V T I V D F V A s s I D F V A s s V D F V A s I I D F V A s I V D F V A T s I D F V A T s V D F V A T I I D F V A T I V D F V V s s I D F V V s s V D F V V s I I D F V V s I V D F V V T s D F V V T s V D F V V T I I 25 D F V V T I V o TABLA 12 SECUENCIAS DE CADENA PESADA DEL ANTICUERPO ANTI-PDGFR-ALFA CDR2 FR3 CDR3 FR SEQ ID NO.

YI SSSGSTI YYADSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR ###YSGS#FDY WGQGTLVTVSS 127 R L V N GGP P 2 YI SSSGSTIYYADSVKG RFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA YYCAR # # S IAARGMDV GQGTTVTVSS 128 6 10 S IYYSGSTYY PSLKS RVTI SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR ##W#FDY WGQGTLVTVSS 129 T T s y HH-VFDY 18 T HH-VFDY Q 14 TABLA 13 SECUENCIAS DE CADENA LIGERA DEL ANTICUERPO ANTI-PDGFR-ALFA CDR2 FR3 CDR 3 FR4 SEO ID NO. AASSLOS GVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYC QOSYS PP T FGQGTKVEIK 130 AASTLQS G V P S R F S G S G S G T D F T T I S S L 0 P E D V A T Y Y C OKYNSAPi! ) í! #IT FGQGT LEIK 131 22 YASQS S GVPSRFSGSGSGTDFTLTIMSLEAEDAATYYC HQSSSLP T FGQGTKVEIK 132 _- — L TN 20 I 16 .AA.SSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYC QQSYSSíífíIT FGQGTRLEIK 133 u NPP — 12 --T--NPP-- 8 Ejemplo 8 Determinación de afinidad por análisis Bl ACORE Los experimentos Biacore fueron realizados usando un instrumento de Biacore T100 a 22°C. Se utilizó el acoplamiento estándar de aldehido de la superficie del biosensor con anticuerpo. Específicamente, 50 µg de cada mAb se hicieron reaccionar con ~1 mM Nal04 durante 25 minutos en hielo en 0.1 M NaOAc, pH 5.5, y entonces la reacción de oxidación fue detenida por desalación de la muestra en una columna columna Sephadex G-25 Nucleic Acid Purification-5 (NAP-5, GE Biociences) con 10 mM NaOAC, pH 4.0. Los mAbs entonces se hicieron fluir sobre una superficie del biosensor CM5 que se había hecho reaccionar con EDC/NHS, carbohidrazida, y etanolamina. Después de que la capacidad superficial deseada se hubiera alcanzado, los enlaces de hidrazona entre mAb y la superficie fueron reducidos mediante el flujo de 0.1 M NaBFBCN en 0.1 M NaOAc, pH 4.0 a través de los mAbs inmovilizados durante 20 minutos. Los Mabs 2.998.2 (SEC ID NO.: 14 y 16), 2.175.3 (SEC ID NO.: 2 y 4), 2.175.3 variante A (SEC ID NO.: 2 con 3Q, 80Y (SEC ID NO.: 134); SEC ID NO. : 4 con 46L, 77S (SEC ID NO.: 135)), 2.449.1 (SEC ID NO.: 10 y), y 2.449.1 variante 12 A (SEC ID NO.: 10; SEC ID NO.: 12 con 49Y, 1071 (SEC ID NO.: 136)), fueron inmovilizados en un chip biosensor CM5. SPDGFR-alfa humano recombinante (catalogo R&D# 322-PR/CF; lote# QY056081) fue inyectado durante 90 segundos a un intervalo de concentración de 51.6-0.806 nM (dilución serial 2 x) seguido por una disociación de 3 minutos. Puesto que la fase de disociación fue obviamente demasiado lenta para todas las interacciones estudiadas, las seis inyecciones adicionales, tres a 25.8 nM y tres inyecciones de amortiguador vacío, fueron realizadas con una inyección de 90 segundos con una fase de disociación de 14,400 segundos (4 horas) después de que las 30 inyecciones iniciales hubieran sido terminadas. Las muestras fueron preparadas en solución salina amortiguada con Hepes, 0.005% polisorbato 20, pH 7.4 (HBS-P) con 100 g/ml de BSA agregado. Todas las muestras fueron inyectadas de manera aleatoria por triplicado durante las diez inyecciones de amortiguador entremezcladas para una referencia doble. Todos los datos del sensograma fueron procesados con el Scrubber 2.0 y se ajustaron globalmente a un modelo de interacción de 1:1 que incluye un término para el transporte de masa usando CLAMP. Las constantes de unión resultantes se enumeran en la siguiente tabla. Los MAbs se enumera en un orden de la afinidad más alta a la más baja. Tabla 14. Afinidad de anticuerpos seleccionados Muestra ka (M"'s"') kd (s-') D (pM) 2.175.3 Variante A 3.55 X ÍO5 2.53 X 10"'' 7.1 2.449.1 Variante A 4.40 X 10' 3.80 X IO-6 8.6 2.175.3 5.16X 105 2.59 X 10-S 50 2.449.1 4.40 X lO5 6.16X 10° 140 2.998.2 2.98 X ÍO5 4.89 X 10'5 164 Los resultados en la tabla 14 mostraron que las variantes de la línea germinal de 2.175.3 y 2.449.1 muestran una afinidad creciente para PDGFRa soluble según lo determinado por el análisis Biacore en comparación con los anticuerpos sin línea germinal respectivos. Ambos anticuerpos de línea germinal muestran las constantes de disociación reducida en comparación a sus contrapartes normales que contribuyen al aumento observado de la afinidad. Cuatro de los anticuerpos con la afinidad más alta de la tabla 14 fueron probados en un ELISA de unión de PDGFRa soluble según lo descrito en el ejemplo 2 y un análisis de fosforilación MG-63 según lo descrito en el ejemplo 4. Los valores CI50 resultantes se enumeran en la tabla 15. Tabla 15. Actividad de anticuerpos seleccionados en ELISA de unión de sPDGFRa y en análisis de fosforilación de receptor Ejemplo 9 Evaluación de eficacia antitumoral en modelos de xenoinjerto tumoral humano La eficacia antitumoral de dos de los anticuerpos anteriores fue evaluada en un modelo de xenoinjerto de carcinoma pulmonar de célula no pequeña, Calu-6. Los ratones anfitriones fueron derivados a partir de un apareamiento entre los ratones Black6/129 que tienen el gen PDGFRa de murino remplazado por PDGFRa humano mediante la recombinación homologa, y los ratones SCID. Los ratones resultantes expresaron el receptor PDGFRa humano y no el receptor de murino. Estos ratones transgénicos de 19 semanas de edad (10/grupo) fueron inyectados con células Calu-6 2 x 106 en 0.1 mi de Matrigel en el flanco derecho. Cuando los tumores alcanzaron el promedio de tamaño de 170 mm3, los anticuerpos en un vehículo de solución salina amortiguada con fosfato o en un vehículo de solución salina vacía fueron administrados de manera intraperitoneal a 10 mg de anticuerpo por kilogramo dos veces por semana durante el trascurso del estudio. La figura 2a muestra el tamaño de tumor promedio por grupo de tratamiento en un periodo de tiempo, mientras que la figura 2b muestra el peso corporal promedio durante un periodo de tiempo. El tratamiento con ambos anticuerpos redujo el índice de crecimiento tumoral significativamente; el tratamiento con 2.175.3 produjo un crecimiento reducido del 55% (p=0.06) mientras que el tratamiento con 2.449.1.3 produjo un índice de crecimiento reducido del 73 (p< 0.001). No hubo una diferencia significativa entre los grupos con respecto al cambio de peso corporal durante el estudio (figura 2b). La eficacia antitumoral de 2.449.1.3 y 2.449.1.3 variante A fue evaluada adicionalmente en el modelo de xenoinjerto de glioma de U 118. Los ratones SCID de 19 semanas de edad (10/grupo) fueron inyectados con células 2 x 106 en 0.1 mi de Matrigel en el flanco derecho de los animales. Cuando los tumores alcanzaron un promedio de tamaño de 280 mm3, los anticuerpos fueron administrados según lo descrito anteriormente para el modelo Calu-6. Los resultados se muestran en la figura 3. El anticuerpo 2.449.1.3 redujo el crecimiento de los tumores U 118 al 94% (p < 0.000001). La variante A de 2.449.1.3 redujo el crecimiento al 101%. Por lo tanto 2.449.1.3 y 2.449.1.3 variante A son altamente activos en la reducción del crecimiento de este xenoinjerto de glioma, y las mutaciones de la variante A no redujeron la actividad in vivo en este modelo.

Incorporación por referencia Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo las Patentes, Solicitudes de Patente, documentos, libros de texto, y similares, y las referencias citadas en los mismos, hasta el punto en el que no lo estén ya, se incorporan por este medio en la presente mediante la referencia en su totalidad. Equivalentes La especificación escrita anterior se considera suficiente para permitir al experto en la técnica practicar la invención. La descripción y ejemplos anteriores detallan algunas modalidades preferidas de la invención y describen el mejor modo contemplado por los inventores. Será apreciado, sin embargo, que sin importar de que manera se detalle lo anterior, pueda aparecer en el texto, la invención se puede ser practicar de muchas maneras y la invención se debe interpretar de acuerdo con las reivindicaciones anexas y a cualquier equivalente de las mismas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un agente de unión objeto aislado que se une específicamente a PDGFR-alfa e inhibe el crecimiento de las células que PDGFR-alfa expresa, en donde el agente de unión objeto se une a PDGFR-alfa con un KD de menos de aproximadamente 40 pM.

2. El agente de unión objeto de la reivindicación 1, en donde el agente de unión objeto inhibe la unión de los ligandos de PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, y/o PDGF-CC a PDGFR-alfa.

3. El agente de unión objeto de la reivindicación 1, en donde el agente de unión objeto se une a PDGFR-alfa e inhibe la autofosforílación del receptor.

4. El agente de unión objeto de la reivindicación 1, en donde el agente de unión objeto se une a PDGFR-alfa e inhibe la señalización cadena arriba de la célula implicada en el crecimiento celular.

5. El agente de unión objeto de la reivindicación 1, en donde el agente de unión objeto se une a PDGFR-alfa y no reacciona de manera cruzada con el receptor PDGFR-beta.

6. El agente de unión objeto de la reivindicación 1, en donde el agente de unión objeto se une a PDGFR-alfa y no reacciona de manera cruzada con otros miembros de familia de tirosina cinasa receptora clase III.

7. El agente de unión objeto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente de unión objeto inhibe el crecimiento y metástasis tumoral en un mamífero.

8. El agente de unión objeto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente de unión objeto es un anticuerpo monoclonal.

9. Un agente de unión objeto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente de unión objeto es cualquiera de los anticuerpos monoclonales según lo mostrado en la tabla 1.

10. El agente de unión objeto de la reivindicación 9, en donde el agente de unión objeto es el anticuerpo monoclonal 2.175.3.

11. El agente de unión objeto de la reivindicación 9, en donde el agente de unión objeto es el del anticuerpo monoclonal 2.175.3 variante A.

12. El agente de unión objeto de la reivindicación 9, en donde el agente de unión objeto es el anticuerpo monoclonal 2.449.1.3.

13. El agente de unión objeto de la reivindicación 9, en donde el agente de unión objeto es el anticuerpo monoclonal 2.449.1.3 variante A.

14. El agente de unión objeto de la reivindicación 9, en donde el agente de unión objeto es el anticuerpo monoclonal 2.998.2.

15. Un agente de unión objeto en donde el agente de unión objeto es una variante o derivado del anticuerpo monoclonal de las reivindicaciones 9-14.

16. Un agente de unión objeto en donde el agente de unión objeto tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácido con el anticuerpo monoclonal de las reivindicaciones 9-14.

17. El agente de unión objeto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente de unión objeto es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

18. El agente de unión objeto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente de unión objeto es un fragmento de unión de un anticuerpo monoclonal completamente humano.

19. El agente de unión objeto de la reivindicación 18, en donde el fragmento de unión se selecciona del grupo que consiste de Fab, Fab', F(ab')2, Fv y dAb.

20. El agente de unión objeto de la reivindicación 1, en donde el agente de unión objeto comprende un polipéptido que comprende la secuencia de SEC ID NO.: 2.

21. El agente de unión objeto de la reivindicación 1, en donde el agente de unión objeto comprende un polipéptido que comprende la secuencia de SEC ID NO.: 10.

22. El agente de unión objeto de la reivindicación 1, en donde el agente de unión objeto comprende un polipéptido que comprende la secuencia de SEC ID NO.: 14.

23. El agente de unión objeto de la reivindicación 1, en donde el agente de unión objeto comprende un polipéptido que comprende la secuencia de SEC ID NO.: 4.

24. El agente de unión objeto de la reivindicación 1, en donde el agente de unión objeto comprende un polipéptido que comprende la secuencia de SEC ID NO.: 12.

25. El agente de unión objeto de la reivindicación 1, en donde el agente de unión objeto comprende un polipéptido que comprende la secuencia de SEC ID NO.: 16.

26. Un agente de unión objeto que compite por la unión a PDGFR-alfa con los agentes de unión objeto de las reivindicaciones 1-25.

27. Un agente de unión objeto que se une al mismo epítope en PDGFR-alfa de acuerdo a cualquiera de los agentes de unión objeto de las reivindicaciones 1-26.

28. Un agente de unión objeto que comprende una secuencia de aminoácido que comprende una secuencia CDR3 según lo mostrado en la tabla 12 ó 13; una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 según lo mostrado en la tabla 12; una Secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 según lo mostrado en la tabla 13; o una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 según lo mostrado en la tabla 12 y una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 según lo mostrado en la tabla 13.

29. Un agente de unión objeto de acuerdo a las reivindicaciones 20 a 28, en donde el agente de unión objeto es un anticuerpo.

30. Un agente de unión objeto de acuerdo a la reivindicación 29, en donde el agente de unión objeto es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

31. Un agente de unión objeto de acuerdo a la reivindicación 30, en donde el agente de unión objeto es un fragmento de unión de un anticuerpo monoclonal completamente humano.

32. Una molécula de ácido nucléico que codifica el agente de unión objeto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

33. Un vector que comprende la molécula de ácido nucléico de la reivindicación 32.

34. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 33.

35. Un método para tratar una enfermedad neoplástica en un mamífero, que comprende: la selección de un animal en necesidad del tratamiento de una enfermedad neoplástica; y la administración al animal de una dosis terapéuticamente efectiva del agente de unión objeto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

36. El método de la reivindicación 35, en donde el mamífero es un humano.

37. El método de la reivindicación 36, en donde el agente de unión objeto se selecciona de los agentes de unión objeto de las reivindicaciones 10-14.

38. El método de las reivindicaciones 35-37, en donde la enfermedad neoplástica se selecciona del grupo que consiste de: melanoma, cáncer pulmonar de célula pequeña, cáncer pulmonar de célula no pequeña, glioma, carcinoma hepatocelular (hígado), tumor de tiroides, cáncer gástrico (estómago), cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer de vejiga, cáncer pulmonar, glioblastoma, cáncer endometrial, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer pancreático, carcinoma de esófago, cánceres de cabeza y cuello, mesiotelioma , sarcomas, adenocarcinoma biliar (colangiocarcinoma) y del intestino delgado, padecimientos pediátricos, carcinoma epidérmico y tumor del estrómico gastrointestinal (GIST).

39. Un método para tratar una enfermedad no-neoplástíca, que comprende: la selección de un animal en necesidad del tratamiento de una enfermedad no-neoplástica; y la administración al animal de una dosis terapéuticamente efectiva del agente de unión objeto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

40. El método de la reivindicación 39, en donde el animal es un humano.

41. El método de la reivindicación 40, en donde el agente de unión objeto es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

42. El método de la reivindicación 41, en donde el agente de unión objeto se selecciona de los agentes de unión objeto de las reivindicaciones 10-14.

43. El método de la reivindicación 39-42, en donde la enfermedad no neoplástica se selecciona de las enfermedades fibróticas o del sistema inmunológico.

44. Un conjugado que comprende el agente de unión objeto de cualquiera de las reivindicaciones 1-31, o un fragmento de unión del mismos, y un agente terapéutico.

45. El conjugado de la reivindicación 44, en donde el agente terapéutico es una toxina.

46. El conjugado de la reivindicación 45, en donde el agente terapéutico es un radioisótopo.

47. El conjugado de la reivindicación 46, en donde el agente terapéutico es una composición farmacéutica.

48. Uso del agente de unión objeto de cualesquiera de las reivindicaciones 1-31 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neoplástica.

49. Uso del agente de unión objeto de cualquiera de las reivindicaciones 1-31 en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

50. Uso del agente de unión objeto de cualquiera de las reivindicaciones 1-31 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad no neoplástica. El agente de unión objeto de cualquiera de las reivindicaciones 1-31 en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable.