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TWI574697B - 人類ｃｇｒｐ受體結合蛋白 - Google Patents

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TWI574697B
TWI574697B TW098144377A TW98144377A TWI574697B TW I574697 B TWI574697 B TW I574697B TW 098144377 A TW098144377 A TW 098144377A TW 98144377 A TW98144377 A TW 98144377A TW I574697 B TWI574697 B TW I574697B
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大衛Ｗ 布蘭考
柯林Ｖ 蓋格二世
胡小芬
伽德維克Ｔ 金恩
盧瀗鍹
石立成
徐岑
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Description

人類CGRP受體結合蛋白
本申請案含有序列表，其已經由EFS網呈遞且以全文引用的方式併入本文中。2009年12月14日建立之該ASCII複本係命名為A1472PCT.txt且大小為312,447個位元組。
肽之抑鈣素超家族包括至少五種已知成員：抑鈣素、澱粉素、腎上腺髓素，及兩種與抑鈣素基因相關之肽(「CGRP」)CGRP1(亦稱為ctCGRP或CGRP)及CGRP2(亦稱為βCGRP)。CGRP為表現於中樞神經系統與末梢神經系統中之37個胺基酸激脈神經肽，且已顯示為末梢中之強血管舒張劑，其中含CGRP之神經元與血管緊密相關。CGRP介導之血管擴張亦與神經性發炎相關，作為一連串事件的一部分，引起血漿外滲及微血管系統中之血管擴張且存在於偏頭痛中。澱粉素在CNS中亦具有特異性結合位點且被視為可調節胃排空且在碳水化合物代謝中起作用。腎上腺髓素為強血管舒張劑。腎上腺髓素在星形細胞上具有特異性受體且其信使RNA在罹患局部缺血之CNS組織中受到上調。(Zimmermann等人，Identification of adrenomedullin receptors in cultured rat astrocytes and in neuroblastoma glioma hybrid cells(NG108-15),Brain Res.,724:238-245(1996)；Wang等人，Discovery of adrenomedullin in rat ischemic cortex and evidence for its role in exacerbating focal brain ischemic damage,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,92:11480-11484(1995))。
抑鈣素涉及控制骨代謝且亦在中樞神經系統(CNS)中具有活性。CGRP之生物活性包括調節神經肌肉接合點、免疫系統內之抗原呈遞、血管緊張性及感官神經傳輸。(Poyner,D. R.,Calcitonin gene-related peptide: multiple actions,multiple receptors,Pharmacol. Ther.,56:23-51(1992)；Muff等人，Calcitonin,calcitonin gene related peptide,adrenomedullin and amylin: homologous peptides,separate receptors and overlapping biological actions,Eur. J. Endocrinol.,133: 17-20(1995))。亦已在許多哺乳動物物種中鑑別出三種抑鈣素受體刺激肽(CRSP)；CRSP可在CGRP家族中形成新穎亞家族。(Katafuchi,T及Minamino,N,Structure and biological properties of three calcitonin receptor-stimulating peptides,novel members of the calcitonin gene-related peptide family,Peptides,25(11): 2039-2045(2004))。
抑鈣素超家族肽經由七個跨膜域G蛋白偶合受體(GPCR)起作用。抑鈣素受體(「CT」、「CTR」或「CT受體」)及CGRP受體為第II型(「B家族」)GPCR，該家族包括可識別調節肽(諸如胰泌素、升糖素及激脈腸多肽(VIP))之其他GPCR。表徵最充分之人類抑鈣素受體之剪接變異體視第一細胞內環中16個胺基酸之存在(先前稱為CTRII+或CTR1，現稱為CT(b))或不存在(主要剪接變異體，先前稱為CTRII-或CTR2，現稱為CT(a))而異。(Gorn等人，Expression of two human skeletal calcitonin receptor isoforms cloned from a giant cell tumor of bone: the first intracellular domain modulates ligand binding and signal transduction,J. Clin. Invest.,95:2680-2691(1995)；Hay等人，Amylin receptors: molecular composition and pharmacology,Biochem. Soc. Trans.,32:865-867(2004);Poyner等人，2002)。已在多項活體內及活體外生物檢定中依據差異性拮抗劑親和力及促效劑效能提出存在至少兩種CGRP受體亞型。(Dennis等人，CGRP8-37,A calcitonin gene-related peptide antagonist revealing calcitonin gene-related peptide receptor heterogeneity in brain and periphery,J. Pharmacol. Exp. Ther.,254:123-128(1990)；Dennis等人，Structure-activity profile of calcitonin gene-related peptide in peripheral and brain tissues. Evidence for multiplicity,J. Pharmacol. Exp. Ther.,251:718-725(1989)；Dumont等人，A potent and selective CGRP2 agonist,[Cys(Et)2,7]hCGRP: comparison in prototypical CGRP1 and CGRP2 in vitro assays,Can. J. Physiol. Pharmacol.,75:671-676(1997))。
發現CGRP1受體亞型對拮抗劑片段CGRP(8-37)敏感。(Chiba等人，Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist human CGRP-(8-37),Am. J. Physiol.,256:E331-E335(1989)；Dennis等人，(1990)；Mimeault等人，Comparative affinities and antagonistic potencies of various human calcitonin gene-related peptide fragments on calcitonin gene-related peptide receptors in brain and periphery,J. Pharmacol. Exp. Ther.,258:1084-1090(1991))。相比之下，CGRP2受體對線性人類CGRP(hCGRP)類似物敏感，其中位置2及7之半胱胺酸殘基係經衍生化(例如經乙醯胺基甲基衍生化[Cys(ACM)2,7]或經乙基醯胺衍生化[Cys(Et)2,7])，但CGRP2受體對片段CGRP(8-37)不敏感。(Dennis等人，(1989);Dennis等人，(1990);Dumont等人，(1997))。
抑鈣素受體及類抑鈣素受體(「CL」、「CLR」或「CRLR」)之配位體特異性視稱為受體活性修飾蛋白(RAMP)之輔助蛋白家族成員之共表現而定。RAMP家族包括三種多肽(RAMP1、RAMP2及RAMP3)，其充當決定受體對抑鈣素家族成員之配位體特異性的受體調節劑。RAMP為第I型跨膜蛋白，其與細胞質短C端(一個跨膜域)及細胞外大N端(負責特異性)共有約30%胺基酸序列一致性及所預測之共同拓撲結構(topology)。(McLatchie等人，(1998)RAMPs regulate the transport and ligand specificity of the calcitonin-receptor-like receptor,Nature,393:333-339；Fraser等人，(1999) The amino terminus of receptor activity modifying proteins is a critical determinant of glycosylation state and ligand binding of calcitonin receptor-like receptor,Molecular Pharmacology,55:1054-1059)。
1998年，CGRP1受體鑑別為由新穎單一跨膜域輔助蛋白、受體活性修飾蛋白1(RAMP1)及CRLR構成之雜二聚體。(McLatchie等人，見上)。交聯實驗表明，CGRP受體係由CRLR與RAMP1按一比一化學計量比排列所組成(Hilairet等人，JBC 276,42182-42190(2001))，使用若干方法(諸如BRET及BiFC)之最新研究揭示，功能性CGRP受體複合物可由CRLR之不對稱高寡聚物及RAMP1之單體構成(Heroux等人，JBC 282,31610-31620(2007))。
純化CRLR N端域已顯示可特異性結合125I-CGRP(Chauhan等人，Biochemistry 44,782(2005))，證實CRLR與CGRP配位體之間存在重要且直接之相互作用。詳言之，咸信CRLR之Leu 24及Leu 34構成CGRP之C端Phe37之繫泊位點(Banerjee等人，BMC Pharmacol. 6,9(2006))。此外，Koller等人(FEBS Lett. 531,464-468(2002))證明CRLR之N端18個胺基酸殘基促成與CGRP或腎上腺髓素之選擇性相互作用，且Ittner等人(Biochemistry 44,5749-5754(2005))提出CRLR之N端胺基酸殘基23-60介導與RAMP1之結合。
對RAMP1之結構-功能分析已鑑別，與「螺旋3」相關(Simms等人，Biophys. J. 91,662-669(2006))且在與CRLR相互作用中潛在重要的殘基91-103及與CGRP配位體潛在相互作用的殘基Trp74及Phe92與其結合CGRP受體複合物有關。使用人類/大鼠RAMP1嵌合體之配位體結合研究表明，CGRP R之某些小分子抑制劑(例如BIBN4096BS)的結合位點位於包括RAMP1之胺基酸66-102的區域內(Mallee等人，JBC 277,14294-14298(2002))。
儘管跨膜域幾乎80%一致，但CRLR與CTR具有55%總體胺基酸序列一致性。(McLatchie等人，(1998)；Poyner等人，International union of pharmacology. XXXII. The mammalian calcitonin gene-related peptides,adrenomedullin,amylin and calcitonin receptors,Pharmacol. Rev.,54:233-246(2002))。
CRLR已顯示可形成CGRP之高親和力受體(當與RAMP1結合時)或優先結合腎上腺髓素(當與RAMP2或RAMP3結合時)。(McLatchie等人，(1998)；Sexton等人，Receptor activity modifying proteins,Cellular Signaling,13:73-83(2001)；Conner等人，Interaction of calcitonin-gene-related peptide with its receptors,Biochemical Society Transactions 30(第4部分): 451-454(2002))。CRLR之糖基化狀態係與其藥理學相關。RAMP 1、2及3向質膜傳輸CRLR的效率類似，然而RAMP1以末端糖基化、成熟醣蛋白及CGRP受體之形式呈遞CRLR，而RAMP 2及3以未成熟、核心糖基化腎上腺髓素受體之形式(「AM」或「AMR」或「AM受體」呈遞CRLR(Fraser等人，(1999))。儘管RAMP 2與3共有僅30%胺基酸序列一致性，但藉由放射性配位體結合(125I腎上腺髓素作為放射性配位體)、功能性檢定(cAMP量測)或生化分析(SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳)對HEK293T細胞中CRLR/RAMP2及CRLR/RAMP3受體之表徵揭示其不可區分。(Fraser等人，1999)。然而，在藥理學中已觀測到CRLR隨RAMP 2表現與隨RAMP 3表現的差異。CGRP與CGRP8-37，以及腎上腺髓素及來源於腎上腺髓素之肽AM 22-52對於RAMP 3雜二聚體皆具活性，表明此複合物可充當CGRP與AM受體。(Howitt等人，British Journal of Pharmacology,140:477-486(2003)；Muff等人，Hypertens. Res.,26:S3-S8(2003))。人類CRLR隨大鼠RAMP1共表現(且反之亦然)表明，RAMP1物種決定CRLR/RAMP1複合物相對於若干所測試小分子CGRP受體拮抗劑之藥理學特徵。(Mallee等人，Receptor Activity-Modifying Protein 1 determines the species selectivity of non-peptide CGRP receptor antagonists,J. Biol. Chem.,277(16):14294-14298(2002))。可結合任何內源性配位體的CRLR未知，除非與RAMP結合；目前認為僅GPCR以此方式運作。(Conner等人，A key role for transmembrane prolines in calcitonin receptor-like agonist binding and signaling: implications for family B G-protein-coupled receptors,Molec. Pharmacol.,67(1):20-31(2005))。
亦已證明抑鈣素受體(CT)與RAMP(其稱為澱粉素受體(「AMY」、「AMY R」或「AMY受體」))可形成雜二聚複合物。一般而言，CT/RAMP1受體(稱作「AMY1」或「AMY1」)對鮭魚抑鈣素、澱粉素及CGRP具有高親和力且對哺乳動物抑鈣素具有較低親和力。對於CT/RAMP2受體(「AMY2」或「AMY2」)及CT/RAMP3受體(「AMY3」或「AMY3」)，主要觀測到相似模式，儘管對CGRP之親和力較低且在生理學相關配位體濃度下可能不顯著。準確受體表型係視細胞類型及CTR剪接變異體(CT(a)或CT(b))而定，尤其對於RAMP2產生之澱粉素受體。舉例而言，類蝕骨細胞之純群體據報導表現RAMP2、CTR及CRLR，而非RAMP1或RAMP3。(Hay等人，(2004)；Christopoulos等人，Multiple amylin receptors arise from receptor activity-modifying protein interaction with the calcitonin receptor gene product,Molecular Pharmacology,56:235-242(1999)；Muff等人，An amylin receptor is revealed following co-transfection of a calcitonin receptor with receptor activity modifying proteins-1 or-3,Endocrinology,140:2924-2927(1999)；Sexton等人，(2001)；Leuthauser等人，Receptor-activity-modifying protein 1 forms heterodimers with two G-protein-coupled receptors to define ligand recognition,Biochem. J.,351:347-351(2000)；Tilakaratne等人，Amylin receptor phenotypes derived from human calcitonin receptor/RAMP co-expression exhibit pharmacological differences dependent on receptor isoform and host cell environment,J. Pharmacol. Exp. Ther.,294:61-72(2000)；Nakamura等人，Osteoclast-like cells express receptor activity modifying protein 2: application of laser capture microdissection,J. Molec. Endocrinol.,34:257-261(2005))。
下表1總結上述受體組份的關係。
已提出CGRP拮抗劑之治療用途。Noda等人描述CGRP或CGRP衍生物用於抑制血小板聚集及用於治療或預防動脈硬化症或血栓症之用途。(EP 0385712 B1)。Liu等人揭示調節CTR活性之治療劑，其包括與媒劑結合之肽，諸如抑鈣素及人類αCGRP。(WO 01/83526 A2；US 2002/0090646 A1)。Smith等人揭示激脈CGRP肽拮抗劑及其在抑制CGRP與CGRP受體結合之方法中的用途；顯示此等CGRP肽拮抗劑可抑制CGRP與冠狀動脈膜結合及鬆弛經辣椒鹼處理之豬冠狀動脈。(美國專利第6,268,474 B1號；及美國專利第6,756,205 B2號)。Rist等人揭示具有CGRP受體拮抗劑活性之肽類似物及其用作治療及預防多種病症之藥物的用途。(DE 19732944 A1)。
CGRP為強血管舒張物，已涉及許多血管舒縮症狀，諸如所有形式之血管性頭痛，包括偏頭痛(有或無先兆)及叢集性頭痛之病理。Durham,N. Engl. J. Med. 350:1073-1075,2004。偏頭痛病理生理學涉及三叉神經節之活化，CGRP位於三叉神經節中，且CGRP含量在偏頭痛發作期間顯著提高。此又促進顱血管擴張及神經性發炎及敏感化。(Doods,H.,Curr. Opin. Investig. Drugs,2:1261-1268(2001))。此外，在偏頭痛性頭痛期間，患者外頸靜脈中之血清CGRP含量升高。Goadsby等人，Ann. Neurol. 28:183-7,1990。在無先兆之偏頭痛患者中，靜脈內投與人類ci-CGRP誘發頭痛及偏頭痛，支持CGRP在偏頭痛中有病原作用的觀點(Lassen等人，Cephalalgia 22:54-61,2002)。
偏頭痛為複雜、常見之神經學病狀，其特徵在於頭痛之嚴重、間歇性發作及相關特徵，其可包括噁心、嘔吐、對光、聲音或移動之敏感性。在一些患者中，頭痛之前或同時有先兆。在某些患者中，頭痛可能嚴重且亦可能為單側頭痛。偏頭痛發作破壞日常生活。在美國及西歐，偏頭痛患者之總體盛行率為一般群體之11%(6%男性；15-18%女性)。此外，個體中發作之中位頻率為1.5次/月。儘管有多種療法可供緩解或減輕症狀，但對於每月偏頭痛發作大於3-4次之患者推薦預防療法。Goadsby等人，New Engl. J. Med. 346(4): 257-275,2002。一些偏頭痛患者已以妥泰(topiramate)治療，妥泰為阻斷電壓依賴性鈉通道及某些麩胺酸鹽受體(AMPA-海人草酸)、增強GABA-A受體活性及阻斷碳酸酐酶之抗驚厥藥。較近期血清素5HT-I B/ID及/或5HT-1a受體促效劑，諸如英明格(suma-triptan)，在一些患者之成功已引導研究者提出該病症之血清素激導性(serotonergic)病原學。遺憾的是，儘管一些患者對此治療反應良好，但其他患者對其作用具有相當抗性。
CGRP可能涉及偏頭痛已為用於開發及測試許多抑制CGRP釋放(例如英明格)、拮抗CGRP受體(例如二肽衍生物BIBN4096BS(Boehringer Ingelheim)；CGRP(8-37))或與一或多種受體相關蛋白質(諸如RAMP1)相互作用之化合物的基礎。Brain,S.等人，Trends in Pharmaco-logical Sciences 23:51-53,2002。α-2腎上腺素受體亞型及腺苷Al受體亦控制(抑制)CGRP釋放及三叉神經活化(Goadsby等人，Brain 125:1392-401,2002)。另一方面，用專門抑制神經性發炎之化合物(例如速激肽NKI受體拮抗劑)或三叉神經活化之化合物(例如5HT10受體促效劑)治療作為偏頭痛之急性治療似乎相當無效，導致一些有關抑制CGRP釋放是否為有效抗偏頭痛治療基礎的問題。Arulmani等人，Eur. J. Pharmacol. 500:315-330,2004。
儘管尚末充分瞭解偏頭痛之準確病理生理學，但已提出CGRP拮抗劑及CGRP靶向適體用於治療偏頭痛及其他病症之治療用途。(例如Olesen等人，Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine,New Engl. J. Med.,350:1104-1110(2004)；Perspective: CGRP-receptor antagonists--a fresh approach to migraine,New Engl. J. Med.,350:1075(2004)；Vater等人，Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX,Nuc. Acids Res.,31(21 e130):1-7(2003)；WO 96/03993)。此外，強小分子CGRP拮抗劑已在最近III期臨床試驗中顯示可減輕中度至嚴重偏頭痛發作，包括偏頭痛及偏頭痛相關症狀(Connor等人，Efficacy and Safety of telcagepant(MK-0974),a Novel Oral CGRP Receptor Antagonist,for Acute Migraine Attacks. Poster,European Headache and Migraine Trust International Congress,London,England,2008年9月)。
CGRP亦可涉及除偏頭痛外之慢性疼痛症候群。在齧齒動物中，鞘內傳遞之CGRP誘發嚴重疼痛，且CGRP含量在許多疼痛模型中提高。另外，CGRP拮抗劑部分阻斷齧齒動物之急性胰臟炎之傷痛刺激(Wick等人，(2006) Surgery，第139卷，第2期，第197-201頁)。總之，此等觀測結果意味選擇性強CGRP受體拮抗劑可為治療慢性疼痛(包括偏頭痛)之有效治療劑。
本文描述可結合CGRP R(尤其靈長類CGRP R，例如人類CGRP R)之分離抗體、其抗原結合片段及其他分離抗原結合蛋白。此等分離抗原結合蛋白可選擇性抑制靈長類CGRP R(與靈長類AM1、AM2、CT或澱粉素受體相比)且可結合CGRP R之CRLR與RAMP1組份。發現CGRP R結合蛋白可抑制、干擾或調節至少一種與CGRP R有關之生物反應，且因此適用於改善CGRP R相關疾病或病症之影響。因此，某些抗原結合蛋白結合CGRP R可具有一或多種以下活性：抑制、干擾或調節CGRP R、抑制血管擴張、減少神經性發炎，及緩解、改善、治療、預防或減輕慢性疼痛或偏頭痛之症狀。
在一個例示性態樣中，分離之抗原結合蛋白選擇性抑制人類CGRP受體(與人類AM1、AM2或澱粉素受體相比)。在一些實施例中，分離之抗原結合蛋白以50或50以上、75或75以上、100或100以上、150或150以上、200或200以上、250或250以上、300或300以上、400或400以上、500或500以上、750或750以上，或1,000或1,000以上之選擇比選擇性抑制人類CGRP受體。選擇性抑制之程度可使用任何適合方法(例如使用如本文實例中所述之cAMP檢定)來測定。在一些實施例中，分離之抗原結合蛋白特異性結合人類CRLR與人類RAMP1，且並不特異性結合人類AM1、人類AM2或人類澱粉素受體(例如AMY1或AMY2)。舉例而言，分離之抗原結合蛋白可以KD 1 μM、100 nM、10 nM或5 nM特異性結合人類CGRP R。在一些實施例中，如使用FACS結合檢定所測定且例如使用Rathanaswami等人，Biochemical and Biophysical Research Communications 334(2005) 1004-1013中所述之方法所分析，分離之抗原結合蛋白係以KD 100 nM、10 nM或5 nM特異性結合人類CGRP R。在一些實施例中，分離之抗原結合蛋白在CGRP結合競爭檢定中具有100 nM、10 nM、1 nM、0.5 nM或0.1 nM之Ki。在一些實施例中，分離之抗原結合蛋白在放射性標記125I-CGRP結合競爭檢定(例如本文中實例5中所述之檢定)中對來自表現人類CGRP R之細胞的膜具有100 nM、50 nM、20 nM、10 nM、1 nM、0.5 nM或0.1 nM之Ki。
在另一例示性態樣中，分離之抗原結合蛋白與參考抗體競爭結合人類CGRP R，例如CGRP R之細胞外部分，參考抗體包含含有選自由SEQ ID NO: 158-170組成之群之序列的重鏈可變區及含有選自由SEQ ID NO: 137-170組成之群之序列的輕鏈可變區。在一些實施例中，使用結合檢定(例如使用Biacore分析法，例如本文實例7中所述者)評估結合競爭。在一些實施例中，分離之抗原結合蛋白與參考抗體競爭結合人類CGRP R，該參考抗體包含(i)含有選自由SEQ ID NO: 161、163、164、166及168組成之群之序列的重鏈可變區；及(ii)含有選自由SEQ ID NO: 140、143、146、148及150組成之群之序列的輕鏈可變區。在某些實施例中，參考抗體包含(i)由選自由SEQ ID NO: 32、34、35、37及39組成之群的序列定義之重鏈；及(ii)由選自由SEQ ID NO: 15、18、21、23及25組成之群的序列定義之輕鏈。在更特定實施例中，參考抗體包含由以下序列對之一所定義之重鏈及輕鏈：(i) SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 15；(ii) SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 18；(iii) SEQ ID NO: 35及SEQ ID NO: 21；(iv) SEQ ID NO: 37及SEQ ID NO: 23；及(V) SEQ ID NO: 39及SEQ ID NO: 25。在一個此實施例中，參考抗體包含含有SEQ ID NO: 32之重鏈及含有SEQ ID NO: 15之輕鏈。在另一個此實施例中，參考抗體包含含有SEQ ID NO: 34之重鏈及含有SEQ ID NO: 18之輕鏈。在另一個此實施例中，參考抗體包含含有SEQ ID NO: 35之重鏈及含有SEQ ID NO: 21之輕鏈。在另一個此實施例中，參考抗體包含含有SEQ ID NO: 37之重鏈及含有SEQ ID NO: 23之輕鏈。在另一個此實施例中，參考抗體包含含有SEQ ID NO: 39之重鏈及含有SEQ ID NO: 25之輕鏈。
在某些實施例中，競爭結合人類CGRP R的分離抗原結合蛋白亦以例如100或100以上、250或250以上、500或500以上、750或750以上、1,000或1,000以上、2,500或2,500以上、5,000或5,000以上，或10,000或10,000以上之選擇比選擇性抑制人類CGRP受體，且此選擇性可例如使用如本文實例中所述之cAMP檢定來測定。在相關實施例中，競爭結合人類CGRP R的分離抗原結合蛋白係以例如KD 1 μM、I00 nM、10 nM或5 nM特異性結合人類CGRP R，如使用FACS結合檢定所測定及例如使用Rathanaswami等人，Biochemical and Biophysical Research Communications 334(2005)1004-1013中所述之方法所分析。在相關實施例中，競爭結合人類CGRP R的分離抗原結合蛋白在CGRP結合競爭檢定中，例如在放射性標記125I-CGRP結合競爭檢定(例如本文實例5中所述之檢定)中對來自表現人類CGRP R之細胞的膜具有100nM、10nM、1nM、0.5nM或0,1nM之Ki。
在任一上述實施例中，競爭結合人類CGRP R的分離抗原結合蛋白可為例如單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類(例如完全人類)抗體、人類化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗原結合片段。此外，競爭結合人類CGRP R之分離抗原結合蛋白的抗體片段可為Fab片段及Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體或單鏈抗體分子；且可為例如人類單株抗體，例如IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型抗體。在某些實施例中，競爭結合人類CGRP R的分離抗原結合蛋白可為中和性抗原結合蛋白。
在某些例示性態樣中，所述之分離抗原結合蛋白(例如分離之抗體或其片段)包含(A)一或多個選自由以下組成之群的重鏈互補決定區(CDRH)：(i)具有SEQ ID NO: 134之CDRH1；(ii)具有SEQ ID NO: 135之CDRH2；(iii)具有SEQ ID NO: 136之CDRH3；及視情況選用之(iv)含有一或多個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之(i)、(ii)及(iii)的CDRH，該等胺基酸取代、缺失或插入總數不多於四個胺基酸；(B)一或多個選自由以下組成之群的輕鏈互補決定區(CDRL)：(i)選自由SEQ ID NO: 107、111及118組成之群的CDRL1；(ii)選自由SEQ ID NO: 108、112及119組成之群的CDRL2；(iii)選自由SEQ ID NO: 109、113及120組成之群的CDRL3；及視情況選用之(iv)含有一或多個(例如一、二、三、四個或四個以上)胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之(i)、(ii)及(iii)的CDRL，該等胺基酸取代、缺失或插入總數不多於四個胺基酸)；或(C)(A)之一或多個重鏈CDRH及(B)之一或多個輕鏈CDRL。
在一些實施例中，CDRH進一步選自由以下組成之群：(i)具有SEQ ID NO: 131之CDRH1；(ii)具有SEQ ID NO: 132之CDRH2；(iii)具有SEQ ID NO: 133之CDRH3；及視情況選用之(iv)含有一或多個(例如一、二、三、四個或四個以上)胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之(i)、(ii)及(iii)的CDRH，該等胺基酸取代、缺失或插入總數不多於三個胺基酸。在相關實施例中，CDRH進一步選自由以下組成之群：(i)選自由SEQ ID NO: 76、88、100、121、125及128組成之群的CDRH1；(ii)選自由SEQ ID NO: 89、101、122、124、126及129組成之群的CDRH2；(iii)選自由SEQ ID NO: 78、90、102、123、127及130組成之群的CDRH3；及視情況選用之(iv)含有一或多個(例如一、二、三、四個或四個以上)胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之(i)、(ii)及(iii)的CDRH，該等胺基酸取代、缺失或插入總數不多於兩個胺基酸。在其他相關實施例中，CDRH進一步選自由以下組成之群：(i)選自由SEQ ID NO: 73、76、79、82、85、88、92、97及100組成之群的CDRH1；(ii)選自由SEQ ID NO: 74、77、80、83、86、89、91、93、95、98、101及129組成之群的CDRH2；(iii)選自由SEQ ID NO: 75、78、81、84、87、90、96、99、102及123組成之群的CDRH3；及視情況選用之(iv)含有一或多個(例如一、二、三、四個或四個以上)胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之(i)、(ii)及(iii)的CDRH，該等胺基酸取代、缺失或插入總數不多於兩個胺基酸。
在一些實施例中，CDRL進一步選自由以下組成之群：(i)選自由SEQ ID NO: 107、111及115組成之群的CDRL1；(ii)選自由SEQ ID NO: 108、112及116組成之群的CDRL2；(iii)選自由SEQ ID NO: 109、113及117組成之群的CDRL3；及視情況選用之(iv)含有一或多個(例如一、二、三、四個或四個以上)胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之(i)、(ii)及(iii)的CDRL。在一些實施例中，每個CDRL之胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入總數不多於三個胺基酸。在一些實施例中，每個CDRL之胺基酸取代、缺失或插入總數不多於兩個胺基酸。在相關實施例中，CDRL進一步選自由以下組成之群:(i)選自由SEQ ID NO: 42、45、51、57、62、69、103及110組成之群的CDRL1；(ii)選自由SEQ ID NO: 43、52、55、58、63、70、104、108及114組成之群的CDRL2；(iii)選自由SEQ ID NO: 44、47、53、56、59、64、105及106組成之群的CDRL3；及視情況選用之(iv)含有一或多個(例如一、二、三、四個或四個以上)胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之(i)、(ii)及(iii)的CDRL，該等胺基酸取代、缺失或插入總數不多於兩個胺基酸。在其他實施例中，CDRL進一步選自由以下組成之群:(i)選自由SEQ ID NO:42、45、48、51、54、57、62、65、66及69組成之群的CDRL1；(ii)選自由SEQ ID NO: 43、46、49、52、55、58、61、63、67及70組成之群的CDRL2；(iii)選自由SEQ ID NO: 44、47、50、53、56、59、64、68、71及72組成之群的CDRL3；及視情況選用之(iv)含有一或多個(例如一、二、三、四個或四個以上)胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之(i)、(ii)及(iii)的CDRL。在一實施例中，每個CDR之胺基酸取代、缺失或插入總數不多於兩個胺基酸。在另一實施例中，胺基酸取代為保守性取代。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含任一上述(A)之至少一或兩個CDRH及任一上述(B)之至少一或兩個CDRL。在又一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(i)任一上述(A)之至少三個CDRH，其中三個CDRH包括CDRH1、CDRH2及CDRH3，及(ii)任一上述(B)之至少三個CDRL，其中三個CDRL包括CDRL1、CDRL2及CDRL3。在其他實施例中，上述分離抗原結合蛋白包含含有至少一個CDRH之第一胺基酸序列及含有至少一個CDRL之第二胺基酸序列。在一實施例中，第一胺基酸序列與第二胺基酸序列彼此共價鍵結。
在另一態樣中，分離之抗原結合蛋白包括CDRH1、CDRH2及CDRH3。在一實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 73，CDRH2包含SEQ ID NO: 74且CDRH3包含SEQ ID NO: 75。在另一實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 76，CDRH2包含SEQ ID NO: 77且CDRH3包含SEQ ID NO: 78。在另一實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 79，CDRH2包含SEQ ID NO: 80且CDRH3包含SEQ ID NO: 81。在另一實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 82，CDRH2包含SEQ ID NO: 83且CDRH3包含SEQ ID NO: 84。在另一實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 85，CDRH2包含SEQ ID NO: 86且CDRH3包含SEQ ID NO: 87。在另一實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 88，CDRH2包含SEQ ID NO: 89且CDRH3包含SEQ ID NO: 90。在另一實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 76，CDRH2包含SEQ ID NO: 91且CDRH3包含SEQ ID NO: 78。在另一實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 92，CDRH2包含SEQ ID NO: 93且CDRH3包含SEQ ID NO: 94。在另一實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 76，CDRH2包含SEQ ID NO: 95且CDRH3包含SEQ ID NO: 78。在另一實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 73，CDRH2包含SEQ ID NO: 74且CDRH3包含SEQ ID NO: 96。在另一實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 97，CDRH2包含SEQ ID NO: 98且CDRH3包含SEQ ID NO: 99。在另一實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 100，CDRH2包含SEQ ID NO: 101且CDRH3包含SEQ ID NO: 102。
在另一態樣中，分離之抗原結合蛋白包括CDRL1序列、CDRL2序列及CDRL3序列。在一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 42，CDRL2包含SEQ ID NO: 43且CDRL3包含SEQ ID NO: 44。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 45，CDRL2包含SEQ ID NO: 46且CDRL3包含SEQ ID NO: 47。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 48，CDRL2包含SEQ ID NO: 49且CDRL3包含SEQ ID NO: 50。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 51，CDRL2包含SEQ ID NO: 52且CDRL3包含SEQ ID NO: 53。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 54，CDRL2包含SEQ ID NO: 55且CDRL3包含SEQ ID NO: 56。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 57，CDRL2包含SEQ ID NO: 58且CDRL3包含SEQ ID NO: 59。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 60，CDRL2包含SEQ ID NO: 55且CDRL3包含SEQ ID NO: 56。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 45，CDRL2包含SEQ ID NO: 61且CDRL3包含SEQ ID NO: 47。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 62，CDRL2包含SEQ ID NO: 63且CDRL3包含SEQ ID NO: 64。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 65，CDRL2包含SEQ ID NO: 55且CDRL3包含SEQ ID NO: 56。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 66，CDRL2包含SEQ ID NO: 67且CDRL3包含SEQ ID NO: 68。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 69，CDRL2包含SEQ ID NO: 70且CDRL3包含SEQ ID NO: 71。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 69，CDRL2包含SEQ ID NO: 70且CDRL3包含SEQ ID NO: 72。
在另一態樣中，分離之抗原結合蛋白包括CDRL1序列、CDRL2序列、CDRL3序列、CDRH1序列、CDRH2序列及CDRH3序列。在一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 42，CDRL2包含SEQ ID NO: 43，CDRL3包含SEQ ID NO: 44，CDRH1包含SEQ ID NO: 73，CDRH2包含SEQ ID NO: 74且CDRH3包含SEQ ID NO: 75。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 45，CDRL2包含SEQ ID NO: 46，CDRL3包含SEQ ID NO:47，CDRH1包含SEQ ID NO:76，CDRH2包含SEQ ID NO:77且CDRH3包含SEQ ID NO:78。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO:48，CDRL2包含SEQ ID NO:49，CDRL3包含SEQ ID NO:50，CDRH1包含SEQ ID NO:79，CDRH2包含SEQ ID NO:80且CDRH3包含SEQ ID NO:81。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO:51，CDRL2包含SEQ ID NO:52，CDRL3包含SEQ ID NO:53，CDRH1包含SEQ ID NO:82，CDRH2包含SEQ ID NO:83且CDRH3包含SEQ ID NO:84。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO:54，CDRL2包含SEQ ID NO:55，CDRL3包含SEQ ID NO:56，CDRH1包含SEQ ID NO:85，CDRH2包含SEQ ID NO:86且CDRH3包含SEQ ID NO:87。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO:57，CDRL2包含SEQ ID NO:58，CDRL3包含SEQ ID NO:59，CDRH1包含SEQ ID NO:88，CDRH2包含SEQ ID NO:89且CDRH3包含SEQ ID NO:90。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO:60，CDRL2包含SEQ ID NO:55，CDRL3包含SEQ ID NO:56，CDRH1包含SEQ ID NO:85，CDRH2包含SEQ ID NO:86且CDRH3包含SEQ ID NO:87。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO:45，CDRL2包含SEQ ID NO:61，CDRL3包含SEQ ID NO:47，CDRH1包含SEQ ID NO:76，CDRH2包含SEQ ID NO:91且CDRH3包含SEQ ID NO:78。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO:62，CDRL2包含SEQ ID NO:63，CDRL3包含SEQ ID NO:64，CDRH1包含SEQ ID NO: 92，CDRH2包含SEQ ID NO: 93且CDRH3包含SEQ ID NO: 94。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO:45，CDRL2包含SEQ ID NO: 61，CDRL3包含SEQ IDNO: 47，CDRH1包含SEQ ID NO: 76，CDRH2包含SEQ ID NO: 95且CDRH3包含SEQID NO: 78。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 65，CDRL2包含SEQ ID NO: 55，CDRL3包含SEQ ID NO: 56，CDRH1包含SEQ ID NO: 85，CDRH2包含SEQ ID NO: 86且CDRH3包含SEQ ID NO: 87。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 42，CDRL2包含SEQ ID NO: 43，CDRL3包含SEQ ID NO: 44，CDRH1包含SEQ ID NO: 73，CDRH2包含SEQ ID NO:7 4且CDRH3包含SEQ ID NO: 96。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 66，CDRL2包含SEQ ID NO: 67，CDRL3包含SEQ ID NO: 68，CDRH1包含SEQ ID NO: 97，CDRH2包含SEQ ID NO: 98且CDRH3包含SEQ ID NO: 99。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 69，CDRL2包含SEQ ID NO: 70，CDRL3包含SEQ ID NO: 71，CDRH1包含SEQ ID NO: 100，CDRH2包含SEQ ID NO: 101且CDRH3包含SEQ ID NO: 102。在另一實施例中，CDRL1包含SEQ ID NO: 69，CDRL2包含SEQ ID NO: 70，CDRL3包含SEQ ID NO: 72，CDRH1包含SEQ ID NO: 100，CDRH2包含SEQ ID NO: 101且CDRH3包含SEQ ID NO: 102。
在任一上述以序列定義之實施例中，分離之抗原結合蛋白可為例如單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類(例如完全人類)抗體、人類化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗原結合片段。此外，分離之抗原結合蛋白的抗體片段可為Fab片段及Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體或單鏈抗體分子。舉例而言，分離之抗原結合蛋白可為人類單株抗體且可為例如IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型抗體。此外，分離之抗原結合蛋白可為中和性抗原結合蛋白。
在任一上述以序列定義之實施例中，分離之抗原結合蛋白可特異性結合人類CRLR與人類RAMP1，而不特異性結合AM1、AM2或人類澱粉素受體(例如AMY1)，例如，分離之抗原結合蛋白可以例如KD 1 μM、100 nM、10 nM或5 nM特異性結合人類CGRP R，如使用FACS結合檢定所測定及例如使用Rathanaswami等人，Biochemical and Biophysical Research Communications 334(2005) 1004-1013中所述之方法所分析。在任一上述以序列定義之實施例中，相對於人類AM1、AM2或AMY1受體，分離之抗原結合蛋白可以例如100或100以上、250或250以上、500或500以上、750或750以上、1,000或1,000以上、2,500或2,500以上、5,000或5,000以上，或10,000或10,000以上之選擇比選擇性抑制人類CGRP R，其中選擇性抑制之程度可使用任何適合方法(例如使用如本文實例中所述之cAMP檢定)來測定。在任一上述以序列定義之實施例中，分離之抗原結合蛋白可在CGRP結合競爭檢定中，例如在放射性標記125I-CGRP結合競爭檢定(例如本文實例5中所述之檢定)中對來自表現人類CGRP R之細胞的膜具有100 nM、10 nM、1 nM、0.5 nM或0.1 nM之Ki。
另一組實施例包括分離之抗原結合蛋白，其包括具有下述共同序列且視情況結合人類CGRP R之CDR之一或組合。共同序列來源於親緣譜系CDR序列。在一態樣中，可將來自各種群之CDR混合且與任何結合人類CGRP R之特定之分離之抗原結合蛋白匹配。在另一態樣中，抗原結合蛋白包含來源於抗體純系之相同親緣譜系群的重鏈及輕鏈CDR。例示性CDR共同序列係如下：
K1共同序列
CDR1 RASQGIRX1DLG(SEQ ID NO: 103)，其中X1係選自由N及K組成之群。
CDR2 X1 ASSLQS(SEQ ID NO: 104)，其中X1係選自由A及G組成之群。
CDR3 LQYNX1X2PWT(SEQ ID NO: 105)，其中X1係選自由I及S組成之群，且X2係選自由Y及F組成之群。
K4共同序列
CDR3 QQYGNSLX1R(SEQ ID NO: 106)，其中X1係選自由S及C組成之群。
K 1,4共同序列
CDR1 RASQX1X2X3X4GX5LX6(SEQ ID NO: 107)，其中X1係選自由S及G組成之群，X2係選自由V及I組成之群，X3係選自由S及R組成之群，X4係選自由S、N及K組成之群，X5係選自由Y及D組成之群，且X6係選自由T及G組成之群。
CDR2 X1ASSX2X3X4(SEQ ID NO: 108)，其中X1係選自由G及A組成之群，X2係選自由R及L組成之群，X3係選自由A及Q組成之群，且X4係選自由T及S組成之群。
CDR3 X1QYX2X3X4X5X6X7(SEQ ID NO: 109)，其中X1係選自由Q及L組成之群，X2係選自由G及N組成之群，X3係選自由N及T組成之群，X4係選自由S、Y及F組成之群，X5係選自由L及P組成之群，X6係選自由C、W及S組成之群，且X7係選自由R及T組成之群。
K3共同序列
CDR1 KSSQSLLHSX1GX2X3YLY(SEQ ID NO: 110)，其中X1係選自由D及A組成之群，X2係選自由R及K組成之群，且X3係選自由N及T組成之群。
K2,3共同序列
CDR1 X1SSQSLLHSX2GX3X4YLX5(SEQ ID NO: 111)，其中X1係選自由R及K組成之群，X2係選自由F、D及A組成之群，X3係選自由Y、R及K組成之群，X4係選自由N及T組成之群，且X5係選自由D及Y組成之群。
CDR2 X1X2SNRX3S(SEQ ID NO: 112)，其中X1係選自由L及E組成之群，X2係選自由G及V組成之群，且X3係選自由A及F組成之群。
CDR3 MQX1X2X3X4PX5T(SEQ ID NO: 113)，其中X1係選自由A及S組成之群，X2係選自由L及F組成之群，X3係選自由Q及P組成之群，X4係選自由T及L組成之群，且X5係選自由F及L組成之群。
Lm3共同序列
CDR2 RX1NQRPS(SEQ ID NO: 114)，其中X1係選自由N及S組成之群。
Lm1,2,3共同序列
CDR1 SGSSSNIGX1NX2VX3(SEQ ID NO: 115)，其中X1係選自由N及S組成之群，X2係選自由Y及T組成之群，且X3係選自由S、N及Y組成之群。
CDR2 X1X2NX3RPS(SEQ ID NO: 116)，其中X1係選自由D、T及R組成之群，X2係選自由N及S組成之群，且X3係選自由K及Q組成之群。
CDR3X1X2X3DX4X5LX6X7VV(SEQ ID NO: 117)，其中X1係選自由G及A組成之群，X2係選自由T及A組成之群，X3係選自由W及R組成之群，X4係選自由S及D組成之群，X5係選自由R及S組成之群，X6係選自由S及N組成之群，且X7係選自由A及G組成之群。
LmAll共同序列
CDR1 X1GX2X3SX4X5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO: 118)，其中X1係選自由S及Q組成之群，X2存在或不存在，且若存在則為S，X3係選自由S及D組成之群，X4存在或不存在，且若存在則為N，X5係選自由I及L組成之群，X6係選自由G及R組成之群，X7係選自由N及S組成之群，X8係選自由N及F組成之群，X9係選自由Y及T組成之群，X10係選自由V及A組成之群，且X11係選自由S、N及Y組成之群。
CDR2 X1X2NX3RPS(SEQ ID NO: 119)，其中X1係選自由D、G、T及R組成之群，X2係選自由N、K及S組成之群，且X3係選自由K、N及Q組成之群。
CDR3 X1X2X3DX4X5X6X7X8X9V(SEQ ID NO: 120)，其中X1係選自由G、N及A組成之群，X2係選自由T、S及A組成之群，X3係選自由W及R組成之群，X4係選自由S及D組成之群，X5係選自由R及S組成之群，X6係選自由L及V組成之群，X7係選自由S、Y及N組成之群，X8係選自由A、H及G組成之群，且X9係選自由V及L組成之群。
HC1共同序列
CDR1 X1YYMX2(SEQ ID NO: 121)，其中X1係選自由G及D組成之群，X2係選自由H及Y組成之群。
CDR2 WIX1PNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO: 122)，其中X1係選自由N及S組成之群。
CDR3 X1X2X3SX4X5X6X7X8GX9X10X11X12YYX13GMDV(SEQ ID NO: 123)，其中X1係選自由D及G組成之群，X2係選自由Q及G組成之群，X3係選自由M及Y組成之群，X4係選自由I及G組成之群，X5係選自由I及Y組成之群，X6係選自由M及A組成之群，X7存在或不存在，且若存在則為L，X8存在或不存在，且若存在則為R，X9係選自由V及L組成之群，X10係選自由F及Y組成之群，X11係選自由P及S組成之群，X12係選自由P及H組成之群，且X13存在或不存在，且若存在則為Y。
HC2共同序列
CDR2 RIKSX1TDGGTTDYX2APVKG(SEQ ID NO: 124)，其中X1係選自由K及T組成之群，且X2係選自由T及A組成之群。
HC3共同序列
CDR1 X1YX2MX3(SEQ ID NO: 125)，其中X1係選自由T及S組成之群，X2係選自由S及A組成之群，且X3係選自由N及S組成之群。
CDR2 X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG(SEQ ID NO: 126)，其中X1係選自由S及A組成之群，X2係選自由S及G組成之群，X3係選自由S及G組成之群，X4係選自由S及G組成之群，X5係選自由Y及R組成之群，且X6係選自由R及T組成之群。
CDR3 X1X2X3X4X5X6X7PYSX8X9WYDYYYGMDV(SEQ ID NO: 127)，其中X1係選自由E及D組成之群，X2係選自由G及Q組成之群，X3係選自由V及R組成之群，X4係選自由S及E組成之群，X5係選自由G及V組成之群，X6係選自由S及G組成之群，X7存在或不存在，且若存在則為S，X8係選自由I及S組成之群，且X9係選自由S及G組成之群。
HC4共同序列
CDR1 SX1GMH(SEQ ID NO: 128)，其中X1係選自由F及Y組成之群。
CDR2 VISX1DGSX2KYX3X4DSVKG(SEQ ID NO: 129)，其中X1係選自由F及Y組成之群，X2係選自由I及H組成之群，X3係選自由S及Y組成之群，且X4係選自由V及A組成之群。
CDR3 X1RX2X3X4X5X6SX7X8YYX9X10X11YYGX12X13V(SEQ ID NO: 130)，其中X1係選自由D及E組成之群，X2係選自由L及K組成之群，X3係選自由N及R組成之群，X4係選自由Y及V組成之群，X5係選自由Y及T組成之群，X6係選自由D及M組成之群，X7係選自由S及T組成之群，X8係選自由G及L組成之群，X9係選自由H及Y組成之群，X10存在或不存在，且若存在則為Y，X11係選自由K及F組成之群，X12係選自由M及L組成之群，且X13係選自由A及D組成之群。
HCA共同序列
CDR1 X1X2X3MX4(SEQ ID NO: 131)，其中X1係選自由N及S組成之群，X2係選自由A、Y及F組成之群，X3係選自由W、A及G組成之群，且X4係選自由S及H組成之群。
CDR2 X1IX2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14VKG(SEQ ID NO: 132)，其中X1係選自由R、A及V組成之群，X2係選自由K、S及W組成之群，X3係選自由S、G、F及Y組成之群，X4存在或不存在，且若存在則係選自由K及T組成之群，X5存在或不存在，且若存在則為T，X6係選自由D及S組成之群，X7係選自由G及S組成之群，X8係選自由T、R、I、N及H組成之群，X9係選自由T及K組成之群，X10係選自由D及Y組成之群，X11係選自由Y及S組成之群，X12係選自由T、A及V組成之群，X13係選自由A及D組成之群，且X14係選自由P及S組成之群。
CDR3 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17GX18X19V(SEQ ID NO: 133)，其中X1係選自由D、A及E組成之群，X2係選自由R、Q及G組成之群，X3係選自由T、R、L、G及K組成之群，X4係選自由G、E、N、I及R組成之群G，X5係選自由Y、V及A組成之群，X6係選自由S，G、Y、A及T組成之群，X7係選自由I、P，D、A及M組成之群，X8存在或不存在，且若存在則係選自由S及Y組成之群，X9存在或不存在，且若存在則係選自由W、S及T組成之群，X10係選自由S、G及L組成之群，X11係選自由S、G、L及Y組成之群，X12存在或不存在，且若存在則係選自由W及Y組成之群，X13係選自由Y及H組成之群，X14存在或不存在，且若存在則係選自由Y及D組成之群，X15係選自由Y、K及F組成之群，X16存在或不存在，且若存在則為Y，X17存在或不存在，且若存在則為Y，X18係選自由M及L組成之群，且X19係選自由D及A組成之群。
HCB共同序列
CDR1 X1X2X3X4X5(SEQ ID NO: 134)，其中X1係選自由N、G、D、S及A組成之群，X2係選自由A、F及Y組成之群，X3係選自由W、Y、A及G組成之群，X4係選自由M及L組成之群，且X5係選自由S及H組成之群。
CDR2 X1IX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17G(SEQ ID NO: 135)，其中X1係選自由R、W、A、V、S及F組成之群，X2係選自由K、N、S、W及R組成之群，X3係選自由S、P、G、F及Y組成之群，X4存在或不存在，且若存在則係選自由K、T及R組成之群，X5存在或不存在，且若存在則係選自由T及A組成之群，X6係選自由D、N、H、S及Y組成之群，X7係選自由G及S組成之群，X8係選自由G及S組成之群，X9係選自由T、G、R、I、N、H及Y組成之群，X10係選自由T、K、R及P組成之群，X11係選自由D、N、Y及E組成之群，X12係選自由Y及S組成之群，X13係選自由T、A及V組成之群，X14係選自由A、Q及D組成之群，X15係選自由P、K及S組成之群，X16係選自由V及F組成之群，且X17係選自由K及Q組成之群。
CDR3 X1X2X3X4X5SX6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16GX17X18V(SEQ ID NO: 136)，其中X1係選自由D、G、A及E組成之群，X2係選自由R、G及Q組成之群，X3係選自由T、M、Y、R、L、G及K組成之群，X4係選自由G、S、E、N、I及R組成之群，X5係選自由Y、I、G、V及A組成之群，X6係選自由S、I、Y、G、A及T組成之群，X7係選自由I、M、A、P及D組成之群，X8存在或不存在，且若存在則係選自由S、L及Y組成之群，X9存在或不存在，且若存在則係選自由W、R、S及T組成之群，X10係選自由S、G及L組成之群，X11係選自由S、V、L、G及Y組成之群，X12存在或不存在，且若存在則係選自由F、Y及W組成之群，X13係選自由Y、P、S及H組成之群，X14存在或不存在，且若存在則係選自由Y、P、D及H組成之群，X15係選自由Y、K及F組成之群，X16存在或不存在，且若存在則為Y，X17存在或不存在，且若存在則為Y，且X18係選自由M及L組成之群。
在任一上述以共同序列定義之實施例中，分離之抗原結合蛋白可為例如AVIMER多肽、單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類(例如完全人類)抗體、人類化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗原結合片段。此外，分離之抗原結合蛋白的抗體片段可為Fab片段及Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體或單鏈抗體分子。舉例而言，分離之抗原結合蛋白可為人類單株抗體且可為例如IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型抗體。此外，分離之抗原結合蛋白可為中和性抗原結合蛋白。
在任一上述以共同序列定義之實施例中，分離之抗原結合蛋白可特異性結合人類CRLR與人類RAMP1，而不特異性結合AM1、AM2或人類澱粉素受體(例如AMY1)，例如，分離之抗原結合蛋白可以例如KD 1 μM、100 nM、10 nM或5 nM特異性結合人類CGRPR，如使用FACS結合檢定所測定及例如使用Rathanaswami等人，Biochemical and Biophysical Research Communications 334(2005)1004-1013中所述之方法所分析。在任一上述以共同序列定義之實施例中，相對於人類AM1、AM2或AMY1受體，分離之抗原結合蛋白可以例如100或100以上、250或250以上、500或500以上、750或750以上、1,000或1,000以上、2,500或2,500以上、5,000或5,000以上，或10,000或10,000以上之選擇比選擇性抑制人類CGRP R，其中選擇性抑制之程度可使用任何適合方法(例如使用如本文實例中所述之cAMP檢定)來測定。在任一上述以共同序列定義之實施例中，分離之抗原結合蛋白可在CGRP結合競爭檢定中，例如在放射性標記125I-CGRP結合競爭檢定(例如本文實例5中所述之檢定)中對來自表現人類CGRP R之細胞的膜具有100 nM、10 nM、1 nM、0.5 nM或0.1 nM之Ki。
所述之分離抗原結合蛋白中有些包含與選自由SEQ ID NO: 158-170組成之群的胺基酸序列具有至少80%、85%及90%或95%序列一致性之重鏈可變區(VH)序列。所述之分離抗原結合蛋白中有些包含與選自由SEQ ID NO: 137-153組成之群的胺基酸序列具有至少80%、85%及90%或95%序列一致性之輕鏈可變區(VL)序列。所述之分離抗原結合蛋白中有些包含與選自由SEQ ID NO: 158-170組成之群的胺基酸序列具有至少80%、85%及90%或95%序列一致性之VH序列，及與選自由SEQ ID NO: 137-153組成之群的胺基酸序列具有至少80%、85%及90%或95%序列一致性之VL。在一些實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區所含之序列(i)選自由SEQ ID NO: 158-170組成之群或(ii)如(i)所定義且含有一或多個(例如五、十、十五或二十個)胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入；(B)VL，該VL所含之序列(iii)選自由SEQ ID NO: 137-153組成之群，或(iv)如(iii)所定義且含有一或多個(例如五、十、十五或二十個)胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入；或(C)(A)之VH及(B)之VL。在一些實施例中，分離之抗原結合蛋白包含含有選自由SEQ ID NO: 158-170組成之群的序列之重鏈可變區(VH)及含有選自由SEQ ID NO: 137-153組成之群的序列之VL。
在一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 158、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VH，該VH含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 159、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VH，該VH含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 160、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VH，該VH包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 161、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VH，該VH含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 162、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VH，該VH含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 163、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VH，該VH含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 164、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VH，該VH含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 165、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VH，該VH含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 166、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VH，該VH含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 167、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VH，該VH含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO: 168、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VH，該VH含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO: 169、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VH，該VH含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO: 170、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在一個實施例中，分離之抗原結合蛋白包含輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i)SEQ ID NO: 137、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義含有多至十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，經分離之抗原結合蛋白包含VL，該VL含有選自由以下組成之群的胺基酸序列:(i)SEQ ID NO: 138、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義含有多至十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VL，該VL含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 139、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義含有多至十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VL，該VL含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 140、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義含有多至十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VL，該VL含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 141、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義含有多至十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VL，該VL含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 142、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義含有多至十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VL，該VL含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 143、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義含有多至十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VL，該VL含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 144、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義含有多至十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VL，該VL含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 145、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VL，該VL含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 146、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VL，該VL含有選自由以下組成之群的胺基酸序列:(i) SEQ ID NO: 147、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VL，該VL含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 148、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VL，該VL含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 149、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VL，該VL含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 150、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VL，該VL含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 151、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VL，該VL含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 152、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含VL，該VL含有選自由以下組成之群的胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 153、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在任一上述以VL及VH序列定義之實施例中，分離之抗原結合蛋白可為例如單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類(例如完全人類)抗體、人類化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗原結合片段。此外，分離之抗原結合蛋白的抗體片段可為Fab片段及Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體或單鏈抗體分子。舉例而言，分離之抗原結合蛋白可為人類單株抗體且可為例如IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型抗體。此外，分離之抗原結合蛋白可為中和性抗原結合蛋白。
在任一上述以VL及VH序列定義之實施例中，分離之抗原結合蛋白可特異性結合人類CRLR與人類RAMP1，而不特異性結合AM1、AM2或人類澱粉素受體(例如AMY1)，例如，分離之抗原結合蛋白可以例如KD 1 μM、100 nM、10 nM或5 nM特異性結合人類CGRP R，如使用FACS結合檢定所測定及例如使用Rathanaswami等人，Biochemical and Biophysical Research Communications 334(2005) 1004-1013中所述之方法所分析。在任一上述以VL及VH序列定義之實施例中，相對於人類AM1、AM2或AMY1受體，分離之抗原結合蛋白可以例如100或100以上、250或250以上、500或500以上、750或750以上、1,000或1,000以上、2,500或2,500以上、5,000或5,000以上，或10,000或10,000以上之選擇比選擇性抑制人類CGRP R，其中選擇性抑制之程度可使用任何適合方法(例如使用如本文實例中所述之cAMP檢定)來測定。在任一上述以VL及VH序列定義之實施例中，分離之抗原結合蛋白可在CGRP結合競爭檢定中，例如在放射性標記125I-CGRP結合競爭檢定(例如本文實例5中所述之檢定)中對來自表現人類CGRP R之細胞的膜具有100 nM、10 nM、1 nM、0.5 nM或0.1 nM之Ki。
在一態樣中，分離之抗原結合蛋白包含與選自由SEQ ID NO: 29-41組成之群的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性之重鏈序列。所述之分離抗原結合蛋白中有些包含與選自由SEQ ID NO: 12-28組成之群的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性之輕鏈序列。一些分離之抗原結合蛋白包含與選自由SEQ ID NO: 29-41組成之群的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性之重鏈序列，及與選自由SEQ ID NO: 12-28組成之群的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性之輕鏈序列。在一些實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)重鏈，該重鏈包含的序列(i)選自由SEQ ID NO: 29-41組成之群，或(ii)如(i)所定義且含有一或多個(例如五、十、十五或二十個)胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入；(B)輕鏈，該輕鏈包含的序列(iii)選自由SEQ ID NO: 12-28組成之群，或(iv)如(iii)定義且含有一或多個(例如五、十、十五或二十個)胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入；或(C)(A)之重鏈及(B)之輕鏈。在一些實施例中，分離之抗原結合蛋白包含含有選自由SEQ ID NO: 29-41組成之群的序列之重鏈及含有選自由SEQ ID NO: 12-28組成之群的序列之輕鏈。
在一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈：(i) SEQ ID NO: 29、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈:(i) SEQ ID NO: 12、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈:(i) SEQ ID NO: 30、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈:(i) SEQ ID NO: 13、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈:(i) SEQ ID NO: 31、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈:(i) SEQ ID NO: 14、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈：(i) SEQ ID NO: 32、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈：(i) SEQ ID NO: 15、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈：(i) SEQ ID NO: 33、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈：(i) SEQ ID NO: 16、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈：(i) SEQ ID NO: 29、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈：(i) SEQ ID NO: 17、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈：(i) SEQ ID NO: 34、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈：(i) SEQ ID NO: 18、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈：(i) SEQ ID NO: 33、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈：(i) SEQ ID NO: 19、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈：(i) SEQ ID NO: 29、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈：(i) SEQ ID NO: 20、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈：(i) SEQ ID NO: 35、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈：(i) SEQ ID NO: 21、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈：(i) SEQ ID NO: 36、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈：(i) SEQ ID NO: 22、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈：(i) SEQ ID NO: 37、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈：(i) SEQ ID NO: 23、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈：(i) SEQ ID NO: 38、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈：(i) SEQ ID NO: 23、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈：(i) SEQ ID NO: 33、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈：(i) SEQ ID NO: 24、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈：(i) SEQ ID NO: 39、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈：(i) SEQ ID NO: 25、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈：(i) SEQ ID NO: 40、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈：(i) SEQ ID NO: 26、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈：(i) SEQ ID NO: 41、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈：(i) SEQ ID NO: 27、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白包含(A)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈：(i) SEQ ID NO: 41、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列；及(B)含有選自由以下組成之群的胺基酸序列之輕鏈：(i) SEQ ID NO: 28、(ii)與(i)所定義之序列至少90%或95%一致之序列，及(iii)如(i)所定義且含有至多十個胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之序列。
在任一上述以輕鏈及重鏈序列定義之實施例中，分離之抗原結合蛋白可包含指定重鏈及/或輕鏈序列，但具有不同信號肽或無信號肽。在任一上述以輕鏈及重鏈序列定義之實施例中，分離之抗原結合蛋白可為例如單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類(例如完全人類)抗體、人類化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗原結合片段。此外，分離之抗原結合蛋白的抗體片段可為Fab片段及Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體或單鏈抗體分子。舉例而言，分離之抗原結合蛋白可為人類單株抗體且可為例如IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型抗體。此外，分離之抗原結合蛋白可為中和性抗原結合蛋白。
在任一上述以輕鏈及重鏈序列定義之實施例中，分離之抗原結合蛋白可特異性結合人類CRLR與人類RAMP1，而不特異性結合AM1、AM2或人類澱粉素受體(例如AMY1)，例如，分離之抗原結合蛋白可以例如KD 1 μM、100 nM、10 nM或5 nM特異性結合人類CGRP R，如使用FACS結合檢定所測定及例如使用Rathanaswami等人，Biochemicaland Biophysical Research Communications 334(2005) 1004-1013中所述之方法所分析。在任一上述以輕鏈及重鏈序列定義之實施例中，相對於人類AM1、AM2或AMY1受體，分離之抗原結合蛋白可以例如100或100以上、250或250以上、500或500以上、750或750以上、1,000或1,000以上、2,500或2,500以上、5,000或5,000以上，或10,000或10,000以上之選擇比選擇性抑制人類CGRP R，其中選擇性抑制之程度可使用任何適合方法(例如使用如本文實例中所述之cAMP檢定)來測定。在任一上述以輕鏈及重鏈序列定義之實施例中，分離之抗原結合蛋白可在CGRP結合競爭檢定中，例如在放射性標記125I-CGRP結合競爭檢定(例如本文實例5中所述之檢定)中對來自表現人類CGRP R之細胞的膜具有100 nM、10 nM、1 nM、0.5 nM或0.1 nM之Ki。
在另一態樣中，亦提供編碼任一種如上文所概述之CGRP R抗原結合蛋白的分離之核酸聚核苷酸。在一實施例中，分離之聚核苷酸包含選自由SEQ ID NO: 175、176、178、179、180、181、182、183、186、187、188、189、191、192、193、194、195、196、197、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209及210組成之群的序列。在另一實施例中，分離之聚核苷酸包含選自由SEQ ID NO: 224-258組成之群的序列。在另一實施例中，分離之聚核苷酸包含能夠在嚴格雜交條件下與選自由SEQ ID NO: 224-258組成之群的序列雜交之序列。在另一實施例中，分離之聚核苷酸包含與選自由SEQ ID NO: 224-258組成之群的序列約80%、85%、90%或95%或95%以上一致之序列。分離之核酸分子有時候可操作地連接至控制序列。在相關實施例中，分離之聚核苷酸係併入表現載體中。
亦包括經表現載體轉型之細胞株，該等表現載體包含如上所述之分離之聚核苷酸。在相關態樣中，亦提供表現載體及經該等表現載體轉型或轉染之宿主細胞，該等表現載體包含上述分離之核酸分子，該等核酸分子編碼上述CGRP R抗原結合蛋白。
在另一態樣中，亦提供一種製備抗原結合蛋白之方法，其包括自分泌抗原結合蛋白之宿主細胞製備抗原結合蛋白之步驟。在一些實施例中，使用包含可溶性CGRP受體之免疫原產生抗原結合蛋白。在一些實施例中，藉由共表現及純化人類CRLR之N端細胞外域(ECD)與人類RAMP1之ECD(例如包含SEQ ID NO: 6之人類CRLR的ECD及包含SEQ ID NO: 8之RAMP1的ECD)獲得此可溶性CGRP受體，例如本文實例1及2中所述。
在又一態樣中，提供一種醫藥組合物，其包含至少一種如上文所概述之抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之賦形劑。在一實施例中，醫藥組合物可包含選自由放射性同位素、放射性核種、毒素或治療劑及化學治療劑組成之群的其他活性劑。
在一態樣中，分離之抗原結合蛋白當向患者投與時有效抑制血管擴張且/或減少神經性發炎。在一實施例中，分離之抗原結合蛋白有效降低頭痛(例如偏頭痛)頻率及/或嚴重度。舉例而言，抗原結合蛋白可用作偏頭痛之急性治療，及/或用作預防性處理以預防或降低伴隨偏頭痛發作之症狀(尤其疼痛症狀)之頻率及/或嚴重度。
其他態樣進一步提供治療或預防患者之CGRP R相關病狀的方法，其包含向患者投與有效量之至少一種如上文概述之分離之抗原結合蛋白。在一實施例中，病狀為頭痛，例如偏頭痛或叢集性頭痛或另一類型之疼痛，例如慢性疼痛；在另一實施例中，其為糖尿病(第II型)；在另一實施例中，其為發炎，尤其神經性發炎；在另一實施例中，其為心血管病症；在另一實施例中，其為與內毒血症及敗血症相關之血液動力學紊亂；在另一實施例中，其為血管擴張。
在另一態樣中，亦提供一種在患者中抑制CGRP與人類CGRP R(例如CGRP R之細胞外部分)結合之方法，其包含投與有效量之至少一種如本文所提供及/或上文概述之抗原結合蛋白。
此等及其他態樣將在本文中更詳細地加以描述。所提供之各態樣可涵蓋本文所提供之各種實施例。因此應瞭解，所述各態樣可包括涉及一種要素或要素組合之各實施例，且明確考慮上述態樣及實施例之所有此等組合。本發明之其他特徵、目標及優勢在以下實施方式中顯而易見。
本文中所用之章節標題僅用於組織目的且不應被視為限制所述標的物。
除非本文中另有定義，否則配合本申請案使用之科學及技術術語應具有一般技術者通常所瞭解之含義。此外，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。
一般而言，配合本文所述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遣傳學及蛋白質及核酸化學及雜交術所使用之命名法及技術為此項技術中熟知且常用者。除非另有說明，否則本申請案之方法及技術一般根據此項技術中所熟知及如本說明書中通篇所引用及論述之各種一般性及更具體參考文獻中所述之習知方法來進行。參看例如Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001),Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)，及Harlow及Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，該等文獻以引用的方式併入本文中。如此項技術中通常所達成或如本文所述，根據製造商說明書來進行酶促反應及純化技術。配合本文所述之分析化學、合成有機化學及醫學及藥物化學所使用之術語及實驗程序及技術為此項技術中熟知及常用者。標準技術可用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞，及治療患者。
應瞭解本發明不限於本文所述之特定方法、方案及試劑等且因此可變化。本文中所用之命名法僅用於描述特定實施例之目的，且不意欲限制本發明之範疇，本發明之範疇係僅由申請專利範圍限定。
除在操作實例中或其他處另外指示外，本文中用於表示成份含量或反應條件的所有數字在所有情形下均應視為被術語「約」修飾。術語「約」當配合百分比使用時意謂±1%。
定義
術語「聚核苷酸」或「核酸」包括單股與雙股核苷酸聚合物。構成聚核苷酸之核苷酸可為核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或修飾形式之任一類型核苷酸。該等修飾包括鹼基修飾，諸如溴尿苷(bromouridine)及肌苷衍生物；核糖修飾，諸如2',3'-二脫氧核糖；及核苷酸間鍵修飾，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯及磷醯胺酸。
術語「寡核苷酸」意謂包含200個或200個以下核苷酸之聚核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸長度為10至60個鹼基。在其他實施例中，寡核苷酸長度為12、13、14、15、16、17、18、19或20至40個核苷酸。寡核苷酸可為單股或雙股寡核苷酸，例如用於建構突變基因之單股或雙股寡核苷酸。寡核苷酸可為有義或反義寡核苷酸。寡核苷酸可包括供偵測檢定用的標記，包括放射性標記、螢光標記、半抗原或抗原標記。寡核苷酸可用作例如PCR引子、選殖引子或雜交探針。
「分離之核酸分子」意謂基因組DNA或RNA、mRNA、cDNA，或合成來源之基因組DNA或RNA、mRNA、cDNA，或其一些組合，其不與其中分離之聚核苷酸可於自然界中存在之聚核苷酸之全部或一部分結合，或與在自然界中不與其連接的聚核苷酸連接。為達成本揭示案之目的，應瞭解「包含特定核苷酸序列之核酸分子」不涵蓋完整染色體。「包含」指定核酸序列的分離核酸分子除含指定序列外亦可包括多至十個或甚至多至二十個其他蛋白質或其部分之編碼序列，或可包括可操作連接之調控序列，其控制所述核酸序列之編碼區的表現，且/或可包括載體序列。
除非另有規定，否則本文中討論之任何單股聚核苷酸序列之左手端為5'端；雙股聚核苷酸序列之左手方向係稱作5'方向。初生RNA轉錄物之5'至3'添加方向係稱作轉錄方向；DNA股上與RNA轉錄物(RNA轉錄物之5'至5'端)具有相同序列的序列區域係稱作「上游序列」；DNA股上與RNA轉錄物(RNA轉錄物之3'至3'端)具有相同序列的序列區域係稱作「下游序列」。
術語「控制序列」係指聚核苷酸序列，其可影響與其所接合之編碼序列的表現及加工。此等控制序列之性質可視宿主生物體而定。在特定實施例中，原核生物之控制序列可包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列。舉例而言，真核生物之控制序列可包括啟動子，該等啟動子包含轉錄因子、轉錄強化子序列及轉錄終止序列之一個或多個識別位點。「控制序列」可包括前導序列及/或融合搭配物序列。
術語「載體」意謂用以將蛋白質編碼資訊轉移至宿主細胞中之任何分子或實體(例如核酸、質體、噬菌體或病毒)。
術語「表現載體」或「表現構築體」係指適於宿主細胞轉型且含有核酸序列之載體，該等核酸序列可導引及/或控制(配合宿主細胞)一或多個其可操作地連接之異源編碼區之表現。表現構築體可包括(但不限於)影響或控制轉錄、轉譯且當存在內含子時影響其可操作地連接之編碼區之RNA剪接的序列。
如本文中所用，「可操作地連接」意謂術語所應用之組份係呈允許其在適合條件下實現其內在功能之關係。舉例而言，載體中「可操作地連接」至蛋白質編碼序列之控制序列係以在與控制序列之轉錄活性相容的條件下達成蛋白質編碼序列之表現的方式與其接合。
術語「宿主細胞」意謂已經或能夠經核酸序列轉型且藉此表現相關基因之細胞。該術語包括母細胞之後代(無論後代在形態方面或在遺傳構成方面是否與原始母細胞一致，只要相關基因存在)。
術語「轉導」意謂通常藉由噬菌體使基因自一個細菌轉移至另一者中。「轉導」亦指藉由複製缺陷反轉錄病毒獲得及轉移真核細胞序列。
術語「轉染」意謂細胞吸收外來或外源DNA，且當外源DNA已引入細胞膜內時，該細胞已「轉染」。許多轉染技術在此項技術中已熟知且揭示於本文中。參看例如Graham等人，1973,Virology 52:456;Sambrook等人，2001,Molecular Cloning: A Laboratory Manual，見上；Davis等人，1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier;Chu等人，1981,Gene 13:197。此等技術可用以將一或多個外源DNA部分引入適合宿主細胞中。
術語「轉型」係指細胞遺傳特徵之改變，且當細胞已被修飾而含有新DNA或RNA時，該細胞已轉型。舉例而言，當細胞經由轉染、轉導或其他技術引入新遺傳物質而自其天然狀態經遺傳修飾時，該細胞係經轉型。轉染或轉導之後，轉型DNA可藉由實體整合於細胞之染色體內而與細胞DNA重組，或可作為游離型元件短暫保持而不複製，或可以質體形式獨立複製。當轉型DNA隨細胞分裂而複製時，該細胞視為已「穩定轉型」。
術語「多肽」或「蛋白質」在本文中可互換使用且係指胺基酸殘基之聚合物。該等術語亦適用於一或多個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸的類似物或擬似物之胺基酸聚合物，且適用於天然存在之胺基酸聚合物。該等術語亦可涵蓋經修飾(例如添加碳水化合物殘基以形成醣蛋白，或磷酸化)之胺基酸聚合物。多肽及蛋白質可由天然存在及非重組之細胞產生；或其由經遺傳工程改造或重組之細胞產生，且包含具有原生蛋白質之胺基酸序列的分子，或具有原生序列之一或多個胺基酸缺失、添加及/或取代之分子。術語「多肽」及「蛋白質」尤其涵蓋抗原結合蛋白，例如CGRP R抗原結合蛋白、CGRP R結合蛋白、抗體，或具有抗原結合蛋白之一或多個胺基酸缺失、添加及/或取代之序列。術語「多肽片段」係指與全長蛋白質相比具有胺基端缺失、羧基端缺失及/或內部缺失之多肽。與全長蛋白質相比，此等片段亦可含有經修飾之胺基酸。在某些實施例中，片段長為約5至500個胺基酸。舉例而言，片段長可為至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450個胺基酸。適用多肽片段包括抗體之免疫功能性片段，包括結合域。在CGRP R結合抗體之情況下，適用片段包括(但不限於)CDR區、重鏈或輕鏈之可變域、抗體鏈之一部分或僅其可變域(包括兩個CDR)及其類似物。「CGRP受體」或「CGRP R」應理解為包含RAMP1及CRLR。
術語「分離之蛋白質」(例如分離之抗原結合蛋白)、「分離之多肽」或「分離之抗體」意謂本發明之蛋白質、多肽或抗體(1)不含至少一些在正常情況下存在之其他蛋白質，(2)實質上不含相同來源(例如相同物種)之其他蛋白質，(3)可由不同物種之細胞表現，(4)已與在自然界中和其結合之聚核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質之至少約50%分離，(5)與在自然界中和其不結合之多肽可操作地結合(藉由共價或非共價相互作用)，或(6)不存在於自然界中。「分離之蛋白質」、「分離之多肽」或「分離之抗體」通常構成指定樣本之至少約5%、至少約10%、至少約25%或至少約50%。基因組DNA、cDNA、mRNA或其他RNA、合成來源之基因組DNA、cDNA、mRNA或其他RNA，或其任何組合可編碼此分離之蛋白質。分離之蛋白質多肽或抗體較佳實質上不含其自然環境中存在之干擾其治療、診斷、預防、研究或其他用途的其他蛋白質或其他多肽或其他污染物。
多肽(例如抗原結合蛋白或抗體)之「變異體」包含如此胺基酸序列：其中相對於另一多肽序列，該胺基酸序列中已插入、缺失及/或取代一或多個胺基酸殘基。變異體包括融合蛋白。
多肽之「衍生物」為已以不同於插入、缺失或取代變異體之一些方式(例如經由與另一化學部分結合)經化學修飾之多肽(例如抗原結合蛋白或抗體)。
如本說明書中針對生物物質(諸如多肽、核酸、宿主細胞及其類似物)所使用，術語「天然存在」係指存在於自然界之物質。
如本文中所用，「抗原結合蛋白」意謂特異性結合指定標靶抗原(諸如CGRP R，尤其靈長類動物(例如人類)CGRP R)之蛋白質。CGRP R抗原結合蛋白特異性結合人類CGRP受體。
當解離常數(KD)10-6 M時，可稱抗原結合蛋白「特異性結合」其標霸。當KD 1×10-8 M時，抗體以「高親和力」特異性結合標靶抗原。在一實施例中，抗體以KD 5×10-7結合CGRP R或人類CGRP R；在另一實施例中，抗體以KD 1×10-7結合；在另一實施例中，抗體以KD 5×10-8結合；在另一實施例中，抗體以KD 1×10-8結合；在另一實施例中，抗體以KD 5×10-9結合；在另一實施例中，抗體以KD 1×10-9結合；在另一實施例中，抗體將KD 5×10-10結合；在另一實施例中，抗體以KD 1×10-10結合。
當抗體、其抗原結合片段或抗原結合蛋白在特異性受體之抑制檢定中之IC50值為在另一種「參考」受體之抑制檢定中之IC50值的至多1/50時，該抗體、其抗原結合片段或抗原結合蛋白相對於其他受體「選擇性抑制」特異性受體。「選擇比」為參考受體之IC50值除以特異性受體之IC50值。若抗體、其抗原結合片段或抗原結合蛋白在cAMP檢定(例如本文實例4中所述之cAMP抑制檢定)中之IC50值為該抗體、其抗原結合片段或抗原結合蛋白在人類AM1、AM2或澱粉素受體(例如AMY1)之抑制檢定中之IC50值的至多1/50，則該抗體、其抗原結合片段或抗原結合蛋白選擇性抑制人類CGRP受體。作為非限制性實例，若特異性抗CGRP R抗體在hCGRP R之cAMP檢定中之IC50值例如在0.1 nM與20 nM之間，且該抗體在hAM1、hAM2或人類AMY1受體之cAMP檢定中之IC50值為1000 nM或1000 nM以上，則該抗體選擇性抑制hCGRP受體。亦應瞭解，選擇性抑制特異性受體之抗原結合蛋白相對於該受體為中和性抗原結合蛋白。
「抗原結合區」意謂特異性結合指定抗原之蛋白質或蛋白質之一部分。舉例而言，含有可與抗原相互作用且賦予抗原結合蛋白針對抗原之特異性及親和力的胺基酸殘基之抗原結合蛋白之該部分稱作「抗原結合區」。抗原結合區通常包括一或多個「互補結合區」(「CDR」)。某些抗原結合區亦包括一或多個「框架」區。「CDR」為促成抗原結合特異性及親和力之胺基酸序列。「框架」區可有助於保持CDR之適當構形以促進在抗原結合區與抗原之間結合。
在某些態樣中，提供可結合CGRP R蛋白或人類CGRP R之重組抗原結合蛋白。在本上下文中，「重組蛋白」為使用重組技術(亦即經由如本文所述之重組核酸之表現)製得的蛋白質。製造重組蛋白之方法及技術在此項技術中已熟知。
術語「抗體」係指任何同型之完整免疫球蛋白或其抗原結合片段，其可與完整抗體競爭特異性結合標靶抗原，且包括例如嵌合、人類化、完全人類及雙特異性抗體。「抗體」因此為一種抗原結合蛋白。完整抗體一般包含至少兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈，但有時候可包含更少鏈，諸如天然存在於駱駝中、僅包含重鏈之抗體。抗體可僅來源於單一來源，或可為「嵌合」抗體，亦即，抗體之不同部分可來源於兩種不同抗體(如下文進一步描述)。抗原結合蛋白、抗體或結合片段可於融合瘤中藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學裂解完整抗體所產生。除非另有說明，否則除包含兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈之抗體外，術語「抗體」亦包括其衍生物、變異體、片段及突變體，其實例描述於下文中。
術語「輕鏈」包括具有足夠可變區序列以賦予結合特異性之全長輕鏈及其片段。全長輕鏈包括可變區結構域VL及恆定區結構域CL。輕鏈之可變區結構域位於多肽之胺基端。輕鏈包括κ鏈及λ鏈。
術語「重鏈」包括具有足夠可變區序列以賦予結合特異性之全長重鏈及其片段。全長重鏈包括可變區結構域VH及三個恆定區結構域CH1、CH2及CH3。VH域位於多肽之胺基端，且CH域位於羧基端，其中CH3最接近多肽之羧基端。重鏈可為任何同型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亞型)、IgA(包括IgA1及IgA2亞型)、IgM及IgE。
術語「信號序列」、「前導序列」或「信號肽」係指可導引蛋白質轉運之短(3-60個胺基酸長)肽鏈。信號肽亦可稱作靶向信號、信號序列、轉運肽或定位信號。一些信號肽係在蛋白質轉運之後藉由信號肽酶自蛋白質裂解，使得生物學活性形式之蛋白質(例如本文所述之抗原結合蛋白)為裂解之較短形式。因此，應瞭解，諸如「包含重鏈...之抗體」、「包含輕鏈...之抗體」等術語當抗體之特徵為其中重鏈及/或輕鏈具有經鑑別之特定序列時，可包括具有經鑑別之特定序列之抗體、具有經鑑別之特定序列但信號序列已經不同信號序列置換之抗體，以及具有經鑑別之序列但無任何信號序列之抗體。
如本文中所用，術語抗體或免疫球蛋白鏈(重鏈或輕鏈)之「抗原結合片段」(或簡稱「片段」)包含缺乏至少一些存在於全長鏈中之胺基酸但能夠特異性結合抗原的抗體之一部分(不論該部分以何方式獲得或合成)。此等片段之生物學活性在於其可特異性結合標靶抗原且可與其他抗原結合蛋白(包括完整抗體)競爭特異性結合指定抗原決定基。在一態樣中，此片段保留至少一個存在於全長輕鏈或重鏈中之CDR，且在一些實施例中包含單一重鏈及/或輕鏈或其一部分。此等生物學活性片段可藉由重組DNA技術產生，或可藉由酶促或化學裂解抗原結合蛋白(包括完整抗體)來產生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、域抗體及單鏈抗體，且可來源於任何哺乳動物來源，包括(但不限於)人類、小鼠、大鼠、駱駝或兔。另外應瞭解，本文所揭示之抗原結合蛋白之功能性部分(例如一或多個CDR)可與第二蛋白質或與小分子共價結合以產生針對體內特定標靶之治療劑，從而具有雙功能治療特性，或具有延長之血清半衰期。
「Fab片段」包含一條輕鏈，及一條重鏈之CH1及可變區。Fab分子之重鏈不能與另一重鏈分子形成雙硫鍵。
「Fc」區含有兩個包含抗體之CH1及CH2域的重鏈片段。兩個重鏈片段係藉由兩個或兩個以上雙硫鍵且藉由CH3域之疏水性相互作用結合在一起。
「Fab'片段」含有一條輕鏈，及一條含有VH域及CH1域的重鏈之一部分，以及CH1與CH2域之間的區域，使得可在兩個Fab'片段之兩條重鏈之間形成鏈間雙硫鍵以形成F(ab')2分子。
「F(ab')2片段」含有兩條輕鏈及兩條重鏈，此兩條重鏈含有CH1與CH2域之間恆定區的一部分，以使得兩條重鏈之間可形成鏈間雙硫鍵。F(ab')2片段因此由兩個Fab'片段構成，此兩個Fab'片段藉由兩條重鏈之間的雙硫鍵結合在一起。
「Fv區」包含來自重鏈與輕鏈之可變區，但缺乏恆定區。
「單鏈抗體」為Fv分子，其中重鏈可變區與輕鏈可變區已藉由柔性連接子相連而形成單一多肽鏈，從而形成抗原結合區。單鏈抗體詳述於國際專利申請公開案第WO 88/01649號及美國專利第4,946,778號及第5,260,203號，該等案之揭示內容係以引用的方式併入本文中。
「域抗體」為僅含有重鏈之可變區或輕鏈之可變區的免疫功能性免疫球蛋白片段。有時候兩個或兩個以上VH區可經由肽連接子共價接合而產生二價域抗體。二價域抗體之兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
「二價抗原結合蛋白」或「二價抗體」包含兩個抗原結合位點。有時候兩個結合位點具有相同抗原特異性。二價抗原結合蛋白及二價抗體可呈雙特異性(參看下文)。
「多特異性抗原結合蛋白」或「多特異性抗體」可靶向一種以上抗原或抗原決定基。
「雙特異性」、「雙重特異性」或「雙功能」抗原結合蛋白或抗體分別為具有兩個不同抗原結合位點之雜交抗原結合蛋白或抗體。雙特異性抗原結合蛋白及抗體為一種多特異性抗原結合蛋白或多特異性抗體，且可藉由多種方法(包括(但不限於)融合瘤融合或Fab'片段連接)產生。參看例如Songsivilai及Lachmann,1990,Clin. Exp. Immunol. 79:315-321；Kostelny等人，1992,J. Immunol. 148:1547-1553。雙特異性抗原結合蛋白或抗體之兩個結合位點可結合兩個可存在於相同或不同蛋白質標靶上之不同抗原決定基。
術語「中和性抗原結合蛋白」或「中和性抗體」分別指可結合配位體、防止配位體與其結合搭配物結合且中斷生物反應(否則配位體與其結合搭配物結合會引起生物反應)的抗原結合蛋白或抗體。在評估抗原結合蛋白(例如抗體或其免疫功能性抗原結合片段)之結合及特異性中，當過量抗體使結合搭配物與配位體之結合量減少至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或99%以上(如在活體外競爭結合檢定中所量測)時，抗體或片段將實質上抑制配位體與其結合搭配物結合。在CGRP R結合蛋白之情況下，此中和性分子將減弱CGRP R與CGRP結合之能力。
術語「競爭」當在可結合標靶抗原上相同區域之抗原結合蛋白的情形下使用時意謂抗原結合蛋白之間的競爭可藉由一種檢定來測定，在該檢定中，測試下之抗原結合蛋白(例如抗體或其免疫功能性抗原結合片段)防止或抑制參考抗原結合蛋白(例如配位體或參考抗體)與共同抗原(例如CGRP R或其抗原結合片段)特異性結合。可使用許多競爭結合檢定中之任一者，例如：固相直接或間接放射免疫檢定(RIA)、固相直接或間接酶免疫檢定(EIA)、夾層競爭檢定(參看例如Stahli等人，1983,Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參看例如Kirkland等人，1986,J. Immunol. 137:3614-3619)、固相直接標記檢定、固相直接標記夾層檢定(參看例如Harlow及Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125標記之固相直接標記RIA(參看例如Morel等人，1988,Molec. Immunol. 25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參看例如Cheung等人，1990,Virology 176:546-552)；及直接標記RIA(Moldenhauer等人，1990,Scand. J. Immunol. 32:77-82)。此檢定可包括使用與固體表面或細胞結合之純化抗原，該固體表面或該等細胞含有未標記之測試抗原結合蛋白及標記之參考抗原結合蛋白之此等任一者。競爭性抑制可藉由測定在測試抗原結合蛋白存在下與固體表面或細胞結合之標記的量來量測。藉由競爭檢定鑑別之抗原結合蛋白(競爭性抗原結合蛋白)包括與參考抗原結合蛋白結合相同抗原決定基之抗原結合蛋白，及因出現位阻效應而與參考抗原結合蛋白所結合之抗原決定基足夠近之相鄰抗原決定基結合的抗原結合蛋白。通常，當競爭性抗原結合蛋白過量存在時，其將參考抗原結合蛋白與共同抗原之特異性結合抑制至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。有時候可將結合抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或97%以上。競爭性抑制亦可如下量測：將參考抗原結合蛋白固著於基板(例如「感應晶片」)、經由與參考抗體結合而將抗原捕捉於基板上，及檢定不同抗原結合蛋白(競爭性抗原結合蛋白)是否可另外與抗原結合。後一競爭結合檢定之實例係採用Biacore分析法，且描述於本文實例7中。
術語「抗原」或「免疫原」係指一種分子或分子之一部分，其能夠被選擇性結合劑(諸如抗原結合蛋白，包括例如抗體或其免疫功能性抗原結合片段)結合，且另外能夠用於動物中以產生能夠與該抗原結合之抗體。抗原可具有一或多個能夠與不同抗原結合蛋白(例如抗體)相互作用之抗原決定基。
術語「抗原決定基」為被抗原結合蛋白(例如抗體)結合之分子的一部分。該術語包括任何能夠與抗原結合蛋白(諸如抗體)或與T細胞受體特異性結合之決定子。抗原決定基可為相連或非相連的(例如(i)在單鏈多肽中，胺基酸殘基在多肽序列中彼此不相連，但在分子被抗原結合蛋白結合之情形下相連，或(ii)在包含兩種或兩種以上個別組份(例如RAMP1及CRLR)之多聚體受體(例如CGRPR)中，存在於兩種或兩種以上個別組份上之胺基酸殘基不相連，但在多聚體受體被抗原結合蛋白結合之情形下相連)。在某些實施例中，抗原決定基可為模擬物，亦即其包含類似於用以產生抗原結合蛋白之抗原決定基的三維結構，然而不包含或僅包含一些用以產生抗原結合蛋白之該抗原決定基中所存在之胺基酸殘基。抗原決定基通常存在於蛋白質上，但有時候可存在於其他類型之分子(諸如核酸)上。抗原決定基決定子可包括根據表面化學活性分類之分子，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。一般而言，對特定標靶抗原具有特異性之抗體將優先識別蛋白質及/或巨分子之複雜混合物中之標靶抗原上的抗原決定基。
術語「一致性」係指兩種或兩種以上多肽分子或兩種或兩種以上核酸分子之序列之間的關係，如藉由比對及比較序列所測定。「一致性百分比」意謂在所比較分子之胺基酸或核苷酸之間一致殘基之百分比且基於所比較之最小分子之大小來計算。對於此等計算，必須藉由特定數學模型或電腦程式(亦即「演算法」)來尋定比對中之間隙(若有)。可用以計算所比對核酸或多肽之一致性的方法包括以下文獻中所述者：Computational Molecular Biology,(Lesk,A. M.編)，1988,New York: Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D. W.編)，1993,New York: Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，(Griffin,A. M.及Griffin,H. G.編)，1994,New Jersey: Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology,New York: Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M. and Devereux,J.編)，1991,New York: M. Stockton Press；及Carillo等人，1988,SIAM J. Applied Math. 48:1073。
計算一致性百分比時，以得到序列之間最大匹配之方式比對所比較之序列。用以測定一致性百分比之電腦程式為GCG程式套件，其包括GAP(Devereux等人，1984,Nucl. Acid Res. 12:387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)。電腦演算法GAP係用以比對兩種多肽或聚核苷酸以便測定序列一致性百分比。序列經比對可達成其各別胺基酸或核苷酸之最佳匹配(「匹配範圍(matched span)」，如依據演算法所測定)。間隙空缺罰分(gap opening penalty)(其依平均對角線(average diagonal)之3倍計算，其中「平均對角線」為所用比較矩陣之對角線平均值；「對角線」為特定比較矩陣賦予各完全胺基酸匹配之分數或數字)及間隙延伸罰分(gap extension penalty)(其通常為間隙空缺罰分之1/10)，且聯合演算法使用諸如PAM 250或BLOSUM 62之比較矩陣。在某些實施例中，演算法亦使用標準比較矩陣(參看Dayhoff等人，1978,Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352(關於PAM 250比較矩陣)；Henikoff等人，1992,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919(關於BLOSUM 62比較矩陣))。
使用GAP程式測定多肽或核苷酸序列之一致性百分比的推薦參數係如下：演算法：Needleman等人，1970,J. Mol. Biol. 48:443-453；比較矩陣：BLOSUM 62，獲自Henikoff等人，1992，見上；間隙罰分：12(但末端間隙無罰分)；間隙長度罰分：4；相似性之臨限值：0。
比對兩種胺基酸序列之某些比對方案僅可產生兩種序列之短區域的匹配，且此小比對區域可具有極高序列一致性，儘管此兩種全長序列之間不存在顯著關係。因此，所選比對方法(GAP程式)可視需要加以調整以產生範圍為標靶多肽之至少50個相連胺基酸的比對。
如本文中所用，「實質上純」意謂所述分子物質為主要存在物質，亦即以莫耳濃度比計，其豐度比同一混合物中之任何其他個別物質更大。在某些實施例中，實質上純分子為其中目標物質佔所存在之全部巨分子物質的至少50%(以莫耳濃度計)之組合物。在其他實施例中，實質上純組合物將佔組合物中所存在之全部巨分子物質的至少80%、85%、90%、95%或99%。在其他實施例中，將目標物質純化至基本均質，其中藉由習知偵測方法偵測不到組合物中之污染物質，且因此組合物係由單一可偵測巨分子物質組成。
術語「治療」係指治療或改善損傷、病變或病狀之任何成功指標，包括任何客觀或主觀參數，諸如減輕；緩解；減弱症狀或使患者更能耐受損傷、病變或病狀；減緩退化或衰退之速率；減輕退化終點時之虛弱；改善患者之身體或心理健康。治療或改善症狀可基於客觀或主觀參數；包括身體檢查、神經精神病學檢查及/或精神病學評估之結果。舉例而言，本文中所述之某些方法係以預防方式或以急性治療形式成功地治療偏頭痛，從而降低偏頭痛頻率、降低偏頭痛嚴重度及/或改善與偏頭痛相關之症狀。
「有效量」一般為足以降低症狀嚴重度及/或頻率、消除症狀及/或潛在病因、預防症狀及/或其潛在病因發生及/或改善或再介導(remediate)由偏頭痛引起或與偏頭痛相關之損傷的量。在一些實施例中，有效量為治療有效量或預防有效量。「治療有效量」為足以治癒疾病病況(例如偏頭痛)或症狀、尤其與該疾病病況相關之病況或症狀之量，或以其他方式(以無論任何方式)預防、阻滯、延緩或逆轉疾病病況或與該疾病相關之任何其他不良症狀之進展之量。「預防有效量」為投與個體時將具有預定預防作用(例如預防或延遲偏頭痛發作(或復發)，或降低偏頭痛或偏頭痛症狀之發作(或復發)之可能性)的醫藥組合物之量。完全治療或預防作用未必經投與一次劑量而出現，且可僅在投與一系列劑量之後出現。因此，治療或預防有效量可分一或多次投與來投與。
「胺基酸」包括其在此項技術中之一般含義。二十種天然存在之胺基酸及其縮寫沿用習知用法。參看Immunology-A Synthesis，第2版，(E. S. Golub及D. R. Green編)，Sinauer Associates: Sunderland,Mass.(1991)，該文獻以引用的方式併入本文中以用於任何目的。二十種習知胺基酸、非天然胺基酸(諸如α-,α-雙取代胺基酸、N-烷基胺基酸)及其他非習知胺基酸之立體異構體(例如D-胺基酸)亦可為多肽之適合組份且包括於片語「胺基酸」中。非習知胺基酸之實例包括：4-羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸，及其他類似胺基酸及亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文所用之多肽符號中，根據標準用法及慣例，左手方向為胺基端方向且右手方向為羧基端方向。
總體概 述
本文提供結合CGRP R蛋白(包括人類CGRP R(hCGRP R)蛋白)之抗原結合蛋白。所提供之抗原結合蛋白為一或多個互補決定區(CDR)如本文所述於其中嵌入及/或接合之多肽。在一些抗原結合蛋白中，CDR嵌入「框架」區中，其使CDR定向，以便達成CDR之適當抗原結合特性。一般而言，所提供之抗原結合蛋白可干擾、阻礙、減小或調節CGRP與CGRP R之間的相互作用。
本文所述之某些抗原結合蛋白為抗體或來源於抗體。在某些實施例中，抗原結合蛋白之多肽結構係基於抗體，包括(但不限於)單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、域抗體、合成抗體(在本文中有時稱作「抗體模擬物」)、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、抗體融合物(在本文中有時稱作「抗體結合物」)，及其片段。下文進一步描述各種結構。
本文提供之抗原結合蛋白已顯示可結合CGRP R，尤其人類CGRP R。如下文實例中進一步描述，某些抗原結合蛋白經測試且發現：其結合的抗原決定基可不同於針對CGRP R之一種或其他組份之多種其他抗體所結合的抗原決定基。所提供之抗原結合蛋白與CGRP競爭且藉此防止CGRP與其受體結合。因此，本文提供之抗原結合蛋白能夠抑制CGRP R活性。詳言之，結合此等抗原決定基之抗原結合蛋白可具有一或多種以下活性：抑制，尤其誘導CGRP R信號轉導路徑、抑制血管擴張、促使血管收縮、減少發炎(例如神經性發炎)，及CGRP結合CGRP R所誘導之其他生理效應。
本文所揭示之抗原結合蛋白具有多種效用。一些抗原結合蛋白例如適用於CGRP R(尤其hCGRP R或其配位體)之特異性結合檢定、親和力純化，及可鑑別CGRP R活性之其他拮抗劑的篩檢檢定中。一些抗原結合蛋白適用於抑制CGRP與CGRP R結合。
如本文中所解釋，抗原結合蛋白可用於多種治療應用中。舉例而言，某些CGRP R抗原結合蛋白適用於治療患者之與CGRP R介導信號傳導相關之病狀，諸如降低、緩解或治療偏頭痛頻率及/或嚴重度，降低、緩解或治療叢集性頭痛，降低、緩解或治療慢性疼痛，緩解或治療糖尿病(第II型)，降低、緩解或治療心血管病症，及降低、緩解或治療與內毒血症及敗血症相關之血液動力學紊亂。抗原結合蛋白之其他用途包括例如診斷CGRP R相關疾病或病狀，及測定CGRP R存在或不存在之篩檢檢定。本文所述之一些抗原結合蛋白適用於治療與CGRP R活性相關之結果、症狀及/或病變。此等者包括(但不限於)各種類型之偏頭痛。
CGRP受 體
本文所揭示之抗原結合蛋白可結合CGRP R，尤其人類CGRP R。CGRP R為包括CRLR與RAMP1之多聚體。人類CRLR之核苷酸序列在本文中以SEQ ID NO: 1提供。人類CRLR之胺基酸序列在本文中以SEQ ID NO: 2提供。人類RAMP1之核苷酸序列在本文中以SEQ ID NO: 3提供。人類RAMP1之胺基酸序列在本文中以SEQ ID NO: 4提供。本文所述之抗原結合蛋白結合CGRP R之細胞外部分，包括CRLR及RAMP1之細胞外部分。人類CRLR之例示性細胞外域(「ECD」)係由如SEQ ID NO: 5所示之核苷酸序列編碼，且具有如SEQ ID NO: 6所示之胺基酸序列。此序列包括信號肽；例示性成熟(無信號肽)CRLR ECD具有如SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列。人類RAMP1之例示性ECD係由如SEQ ID NO: 7所示之核苷酸序列編碼，且具有如SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列。此序列包括信號肽；例示性成熟(無信號肽)RAMP1 ECD具有如SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列。如下所述，CGRP R蛋白質亦可包括片段。如本文中所用，該等術語可互換使用且意謂受體，尤其意謂可特異性結合CGRP之人類受體，除非另有說明。
術語CGRP R亦包括CGRP R胺基酸序列之轉譯後修飾，例如可能之N-連接糖基化位點。因此，抗原結合蛋白可結合在一或多個位置糖基化之蛋白質或自在一或多個位置糖基化之蛋白質產生。
CGRP受體結合蛋白
提供多種適用於調節CGRP R活性之選擇性結合劑。此等藥劑包括例如含有抗原結合域之抗原結合蛋白(例如具有抗原結合區之單鏈抗體、域抗體、免疫黏附物及多肽)且特異性結合CGRP R，尤其人類CGRP R。一些藥劑例如適用於抑制CGRP與CGRP R結合，且因此可用以抑制、干擾或調節一或多種與CGRP R信號傳導相關之活性。
一般而言，所提供之抗原結合蛋白通常包含一或多個(例如1、2、3、4、5或6個)如本文所述之CDR。有時候抗原結合蛋白包含(a)多肽結構及(b)一或多個插入及/或接合於多肽結構中之CDR。多肽結構可採取多種不同形式。舉例而言，其可為或包含天然存在之抗體或其片段或變異體的框架，或在本質上可完全為合成的。下文進一步描述各種多肽結構之實例。
在某些實施例中，抗原結合蛋白之多肽結構為抗體或來源於抗體，包括(但不限於)單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、域抗體、合成抗體(在本文中有時稱作「抗體模擬物」)、嵌合抗體、人類化抗體、抗體融合物(有時稱作「抗體結合物」)，及分別各自之一部分或片段。有時候抗原結合蛋白為抗體之免疫片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2或scFv)。在本文中進一步描述及定義各種結構。
如本文所提供之某些抗原結合蛋白可特異性結合人類CGRP R。在一特定實施例中，抗原結合蛋白可特異性結合人類CGRP R蛋白，該人類CGRP R蛋白包含具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之人類CRLR及具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之人類RAMP1。
在抗原結合蛋白用於治療應用之實施例中，抗原結合蛋白可抑制、干擾或調節CGRP R之一或多種生物活性。在此情況下，當過量抗體將與CGRP結合之人類CGRP R之量(或反之亦然)減少至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或99%以上(例如藉由在活體外競爭結合檢定中量測結合)時，抗原結合蛋白特異性結合人類CGRP R且/或實質上抑制人類CGRP R與CGRP結合。
天然存在之抗體結構
所提供之抗原結合蛋白中有些具有與天然存在之抗體通常相關的結構。此等抗體之結構單元通常包含一或多個各自由兩個相同多肽鏈對組成之四聚體，儘管一些哺乳動物物種亦產生僅具有單一重鏈之抗體。在典型抗體中，各對包括一條全長「輕」鏈(在某些實施例中，約25 kDa)及一條全長「重」鏈(在某些實施例中，約50-70 kDa)。各個別免疫球蛋白鏈由若干「免疫球蛋白域」構成，各「免疫球蛋白域」由約90至110個胺基酸組成且表現特徵摺疊模式。此等域為組成抗體多肽之基本單位。各鏈之胺基端部分通常包括負責抗原識別之可變域。羧基端部分在進化上比鏈之另一端更保守且稱作「恆定區」或「C區」。人類輕鏈一般分類為K及λ輕鏈，且此等鏈各自含有一個可變域及一個恆定域。重鏈通常分類為μ、Δ、γ、α或ε鏈，且據此將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有若干亞型，包括(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM亞型包括IgM及IgM2。IgA亞型包括IgA1及IgA2。在人類中，IgA及IgD同型含有四條重鏈及四條輕鏈；IgG及IgE同型含有兩條重鏈及兩條輕鏈；且IgM同型含有5條重鏈及5條輕鏈。重鏈C區通常包含一或多個可負責效應功能之域。重鏈恆定區結構域之數目視同型而定。舉例而言，IgG重鏈各自含有三個C區結構域，稱為CH1、CH2及CH3。所提供之抗體可具有任一此等同型及亞型。在某些實施例中，CGRP R抗體為IgG1、IgG2或IgG4亞型。
在全長輕鏈及重鏈中，可變區及恆定區係藉由約十二個或十二個以上胺基酸之「J」區接合，其中重鏈亦包括約十個或十個以上胺基酸之「D」區。參看例如Fundamental Immunology，第2版，第7章(Paul,W.編) 1989,New York: Raven Press(以全文引用的方式併入本文中以用於所有目的)。各輕鏈/重鏈對之可變區通常形成抗原結合位點。
例示性CGRP R單株抗體之IgG2重鏈恆定域的一個實例具有以下胺基酸序列：ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(該序列之最後326個殘基係如SEQ. ID NO: 29所示)。
例示性CGRP R單株抗體之κ輕鏈恆定域的一個實例具有以下胺基酸序列：RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(該序列之最後107個殘基係如SEQ ID NO: 14所示)。
免疫球蛋白鏈之可變區一般展現相同總體結構，包含經由三個高變區(更通常稱為「互補決定區」或CDR)接合之相對保守性框架區(FR)。來自上述各重鏈/輕鏈對之兩條鏈的CDR通常藉由框架區對齊以形成可特異性結合標靶蛋白質(例如CGRP R)上之特定抗原決定基的結構。天然存在之輕鏈與重鏈可變區自N端至C端通常均符合此等元件之以下順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。已設計編號系統以便對佔據此等各域中之位置之胺基酸指定編號。此編號系統係定義於Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(1987及1991,NIH,Bethesda,MD)，或Chothia及Lesk,1987,J. Mol. Biol. 196:901-917；Chothia等人，1989,Nature 342:878-883。
本文所提供之各種重鏈及輕鏈可變區描繪於表3中。此等各可變區可與上述重鏈及輕鏈恆定區連接以分別形成完整抗體重鏈及輕鏈。此外，如此產生之各重鏈及輕鏈序列可經組合以形成完整抗體結構。應瞭解本文所提供之重鏈及輕鏈可變區亦可連接至具有與上列例示性序列不同之序列的其他恆定域。
所提供之抗體的一些全長輕鏈及重鏈之特定實例及其相應胺基酸序列概括於圖2A及2B中。表2A展示例示性輕鏈序列，且表2B展示例示性重鏈序列。
除32H7及32H7 CS外，表2A中各輕鏈序列之前22個胺基酸為信號序列。在32H7及32H7CS之情況下，信號序列為20個胺基酸。類似地，表2B中各重鏈序列之前22個胺基酸為信號序列。信號肽可更換為具有不同序列之信號肽，例如在某些宿主細胞中表現更佳之信號肽。因此應瞭解本發明亦包括具有如圖2A及2B中指定之輕鏈及/或重鏈序列但具有不同信號序列之抗體。
又，表2B中所列之各例示性重鏈(H1、H2、H3等)可與表2A中所示之任一例示性輕鏈組合以形成抗體。此等組合之實例包括H1經由L17與任一L1組合；H2經由L17與任一L1組合；H3經由L17與任一L1組合等。有時候抗體包括表2A及2B中所列之至少一條重鏈及一條輕鏈。有時候抗體包含表2A及2B中所列之兩條不同重鏈及兩條不同輕鏈。在其他情況下，抗體含有兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈。舉例而言，抗體或免疫功能片段可包括兩條H1重鏈及兩條L1輕鏈，或兩條H2重鏈及兩條L2輕鏈，或兩條H3重鏈及兩條L3輕鏈，及如表2A及2B中所列之輕鏈對及重鏈對之其他類似組合。
所提供之其他抗原結合蛋白為由表2A及2B中所示之重鏈與輕鏈之組合所形成之抗體的變異體，且包含的輕鏈及/或重鏈各自與此等鏈之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%一致性。有時候此等抗體包括至少一條重鏈及一條輕鏈，而在其他情況下，變異體形式含有兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈。
抗體之可變域
亦提供抗原結合蛋白，其含有選自由VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12及VH13組成之群的抗體重鏈可變區，及/或選自由VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16及VL17組成之群的抗體輕鏈可變區(如下表3中所示)；及此等輕鏈及重鏈可變區之免疫功能片段、衍生物、突變蛋白(mutein)及變異體。
圖1A及1B中分別提供各種重鏈及輕鏈可變區之序列比對。
此類型之抗原結合蛋白一般可由式「VHx/VLy」表示，其中「x」對應於重鏈可變區之編號且「y」對應於輕鏈可變區之編號。
表3中所列之各重鏈可變區可與表3中所示之任一輕鏈可變區組合以形成抗原結合蛋白。此等組合之實例包括VH1與任一VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16或VL17組合；VH2與任一VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16或VL17組合；VH3與任一VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16或VL17組合等。
有時候抗原結合蛋白包括表3中所列之至少一個重鏈可變區及/或一個輕鏈可變區。有時候抗原結合蛋白包括表3中所列之至少兩個不同重鏈可變區及/或輕鏈可變區。此抗原結合蛋白之實例包含(a)一個VH1，及(b)VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12或VH13之一。另一實例包含(a)一個VH2，及(b)VH1、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12或VH13之一。又一實例包含(a)一個VH3，及(b)VH1、VH2、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12或VH13之一等。此抗原結合蛋白之又一實例包含(a)一個VL1，及(b)VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16或VL17、VL18、VL19、VL20或VL21之一。此抗原結合蛋白之又一實例包含(a)一個VL2，及(b)VL1、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16、VL17、VL18、VL19、VL20或VL21之一。此抗原結合蛋白之又一實例包含(a)一個VL3，及(b)VL1、VL2、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16、VL17、VL18、VL19、VL20或VL21之一等。
如熟習此項技術者顯而易知，重鏈可變區之不同組合可與輕鏈可變區之任一不同組合組合。
在其他情況下，抗原結合蛋白含有兩個相同輕鏈可變區及/或兩個相同重鏈可變區。舉例而言，抗原結合蛋白可為抗體或免疫功能片段，其包括的兩個輕鏈可變區及兩個重鏈可變區為表3中所列之輕鏈可變區對與重鏈可變區對之組合。
所提供之抗原結合蛋白中有些包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含的胺基酸序列僅1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基不同於選自VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12及VH13之重鏈可變域之序列，其中此序列差異各自獨立地為一個胺基酸之缺失、插入或取代，其中此等缺失、插入及/或取代引起的胺基酸改變(相對於前述可變域序列)不多於15個。一些抗原結合蛋白中之重鏈可變區包含胺基酸序列與VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12及VH13之重鏈可變區的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%序列一致性。
某些抗原結合蛋白包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含的胺基酸序列僅1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基不同於選自VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16或VL17之輕鏈可變域之序列，其中此序列差異各自獨立地為一個胺基酸之缺失、插入或取代，其中此等缺失、插入及/或取代引起的胺基酸改變(相對於前述可變域序列)不多於15個。一些抗原結合蛋白中之輕鏈可變區包含胺基酸序列與VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16或VL17之輕鏈可變區的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%序列一致性。
在其他情況下，抗原結合蛋白包含如下配對之輕鏈與重鏈可變域：VL1與VH1、VL2與VH2、VL3與VH3、VL4與VH4、VL5與VH5、VL6與VH1、VL7與VH6、VL8與VH5、VL9與VH1、VL10與VH7、VL11與VH8、VL12與VH9、VL12與VH10、VL13與VH5、VL14與VH11、VL15與VH12、VL16與VH13，及VL17與VH13。有時候，如上配對之抗原結合蛋白可包含胺基酸序列與指定可變域具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%序列一致性。
其他抗原結合蛋白(例如抗體或免疫功能片段)包括剛剛所述之變異體重鏈及變異體輕鏈之變異體形式。
CDR
本文所揭示之抗原結合蛋白為一或多個CDR已移植、插入及/或接合於其中之多肽。抗原結合蛋白可具有1、2、3、4、5或6個CDR。抗原結合蛋白因此可具有例如一條重鏈CDR1(「CDRH1」)，及/或一條重鏈CDR2(「CDRH2」)，及/或一條重鏈CDR3(「CDRH3」)，及/或一條輕鏈CDR1(「CDRL1」)，及/或一條輕鏈CDR2(「CDRL2」)，及/或一條輕鏈CDR3(「CDRL3」)。一些抗原結合蛋白包括CDRH3與CDRL3。特定重鏈及輕鏈CDR分別標識於表4A及4B中。
指定抗體之互補決定區(CDR)及框架區(FR)可使用以下文獻所述之系統加以鑑別：Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國健康與人類服務部(US Dept. of Health and Human Services),PHS,NIH,NIH公告第91-3242號，1991。本文所揭示之某些抗體包含一或多個胺基酸序列與表4A(CDRH)及表4B(CDRL)中所示之一或多個CDR之胺基酸序列一致或具有實質上序列一致性。
天然存在之抗體內之CDR的結構及特性已描述於上文中。簡言之，在傳統抗體中，CDR係嵌入重鏈及輕鏈可變區中之框架內，從而構成負責抗原結合及識別之區域。可變區在框架區(命名為框架區1-4：FR1、FR2、FR3及FR4，依據Kabat等人，1991，見上；亦參看Chothia及Lesk,1987，見上)內包含至少三條重鏈或輕鏈CDR，參看上文(Kabat等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，公共健康服務中心(Public Health Service) N.I.H.,Bethesda,MD；亦參看Chothia及Lesk,1987,J. Mol. Biol. 196:901-917；Chothia等人，1989,Nature 342: 877-883)。然而，本文提供之CDR不僅可用以定義傳統抗體結構之抗原結合域，而且可嵌入如本文所述之多種其他多肽結構中。
在一態樣中，所提供之CDR為(a)選自由以下組成之群的CDRH：(i)選自由SEQ ID NO: 73、76、79、82、85、88、92、97及100組成之群的CDRH1；(ii)選自由SEQ ID NO: 74、77、80、83、86、89、91、93、95、98、101及129組成之群的CDRH2；(iii)選自由SEQ ID NO: 75、78、81、84、87、90、96、99、102及123組成之群的CDRH3；及(iv)含有一或多個(例如一、二、三、四個或四個以上)胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之(i)、(ii)及(iii)之CDRH，該等胺基酸取代、缺失或插入不多於五、四、三、二或一個胺基酸；(B)選自由以下組成之群的CDRL：(i)選自由SEQ ID NO: 42、45、48、51、54、57、62、65、66及69組成之群的CDRL1；(ii)選自由SEQ ID NO: 43、46、49、52、55、58、61、63、67及70組成之群的CDRL2；(iii)選自由SEQ ID NO: 44、47、50、53、56、59、64、68、71及72組成之群的CDRL3；及(iv)含有一或多個(例如一、二、三、四個或四個以上)胺基酸取代(例如保守性胺基酸取代)、缺失或插入之(i)、(ii)及(iii)之CDRL，該等胺基酸取代、缺失或插入不多於五、四、三、二或一個胺基酸。
在另一態樣中，抗原結合蛋白包括表4A及4B中所列之CDR的1、2、3、4、5或6個變異體形式，其各自與表4A及4B中所列之CDR序列具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性。一些抗原結合蛋白包括表4A及4B中所列之1、2、3、4、5或6個CDR，其各自與此等表中所列之CDR相差不多於1、2、3、4或5個胺基酸。
在又一態樣中，本文所揭示之CDR包括來源於相關單株抗體群之共同序列。如本文所述，「共同序列」係指具有許多序列所共有之保守胺基酸及在指定胺基酸序列內變化之可變胺基酸的胺基酸序列。所提供之CDR共同序列包括對應於各CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3之CDR。
在又一態樣中，抗原結合蛋白包括以下之結合：CDRL1、CDRL2及CDRL3：SEQ ID NO: 42、43及44；SEQ ID NO: 45、46及47；SEQ ID NO: 48、49及50；SEQ ID NO: 51、52及53；SEQ ID NO: 54、55及56；SEQ ID NO: 57、58及59；SEQ ID NO: 60、55及56；SEQ ID NO: 45、61及47；SEQ ID NO: 62、63及64；SEQ ID NO: 65、55及56；SEQ ID NO: 66、67及68；SEQ ID NO: 69、70及71；及SEQ ID NO: 69、70及72。
在另一態樣中，抗原結合蛋白包括以下之結合：CDRH1、CDRH2及CDRH3：SEQ ID NO: 73、74及75；SEQ ID NO: 76、77及78；SEQ ID NO: 79、80及81；SEQ ID NO: 82、83及84；SEQ ID NO: 85、86及87；SEQ ID NO: 88、89及90；SEQ ID NO: 76、91及78；SEQ ID NO: 92、93及94；SEQ ID NO: 76、95及78；SEQ ID NO: 73、74及96；SEQ ID NO: 97、98及99；及SEQ ID NO: 100、101及102。
在另一態樣中，抗原結合蛋白包括以下之結合：CDRL1、CDRL2及CDRL3與CDRH1、CDRH2及CDRH3：SEQ ID NO: 42、43及44與SEQ ID NO: 73、74及75；SEQ ID NO: 45、46及47與SEQ ID NO: 76、77及78；SEQ ID NO: 48、49及50與SEQ ID NO: 79、80及81；SEQ ID NO: 51、52及53與SEQ ID NO: 82、83及84；SEQ ID NO: 54、55及56與SEQ ID NO: 85、86及87；SEQ ID NO: 57、58及59與SEQ ID NO: 88、89及90；SEQ ID NO: 60、55及56與SEQ ID NO: 85、86及87；SEQ ID NO: 45、61及47與SEQ ID NO: 76、91及78；SEQ ID NO: 62、63及64與SEQ ID NO: 92、93及94；SEQ ID NO: 45、61及47與SEQ ID NO: 76、95及78；SEQ ID NO: 65、55及56與SEQ ID NO: 85、86及87；SEQ ID NO: 42、43及44與SEQ ID NO: 73、74及96；SEQ ID NO: 66、67及68與SEQ ID NO: 97、98及99；SEQ ID NO: 69、70及71與SEQ ID NO: 100、101及102；及SEQ ID NO: 69、70及72與SEQ ID NO: 100、101及102。
對與抗CGRP R抗體之VH及VL對應的CDR使用標準譜系分析來測定共同序列。藉由保持相同序列內對應於VH或VL之CDR相連來測定共同序列。
如圖3A、3B、4、5A、5B、5C、5D及5E中所說明，對本文所提供之多種抗原結合蛋白進行譜系分析可產生相關序列群，命名為輕鏈CDR群K1、K2、K3及K4(圖3A及3B)、輕鏈CDR群L1、L2、L3及L4(圖4)，及重鏈CDR群HC1(圖5A)、HC2(圖5B)、HC3(圖5C)、HC4(圖5C)、HC5(圖5D)及HC6(圖5E)。如圖3A、3B、4及5F中所說明，上述序列群中有些係用以產生其他共同序列，以得到輕鏈CDR群K1,4(圖3A)、K2,3(圖3B)、L1,2,3(圖4)及LA11(圖4)，及重鏈CDR群HCA及HCB(圖5F)。
下文提供各種CDR區群之共同序列：
K1共同序列
CDR1 RASQGIRX1DLG(SEQ ID NO: 103)，其中X1係選自由N及K組成之群。
CDR2 X1ASSLQS(SEQ ID NO: 104)，其中X1係選自由A及G組成之群。
CDR3 LQYNX1X2PWT(SEQ ID NO: 105)，其中X1係選自由I及S組成之群，且X2係選自由Y及F組成之群。
K4共同序列
CDR3 QQYGNSLX1R(SEQ ID NO: 106)，其中X1係選自由S及C組成之群。
K1,4共同序列
CDR1 RASQX1X2X3X4GX5LX6(SEQ ID NO: 107)，其中X1係選自由S及G組成之群，X2係選自由V及I組成之群，X3係選自由S及R組成之群，X4係選自由S、N及K組成之群，X5係選自由Y及D組成之群，且X6係選自由T及G組成之群。
CDR2 X1ASSX2X3X4(SEQ ID NO: 108)，其中X1係選自由G及A組成之群，X2係選自由R及L組成之群，X3係選自由A及Q組成之群，且X4係選自由T及S組成之群。
CDR3 X1QYX2X3X4X5X6X7(SEQ ID NO: 109)，其中X1係選自由Q及L組成之群，X2係選自由G及N組成之群，X3係選自由N及T組成之群，X4係選自由S、Y及F組成之群，X5係選自由L及P組成之群，X6係選自由C、W及S組成之群，且X7係選自由R及T組成之群。
K3共同序列
CDR1 KSSQSLLHSX1GX2X3YLY(SEQ ID NO: 110)，其中X1係選自由D及A組成之群，X2係選自由R及K組成之群，且X3係選自由N及T組成之群。
K2,3共同序列
CDR1 X1SSQSLLHSX2GX3X4YLX5(SEQ ID NO: 111)，其中X1係選自由R及K組成之群，X2係選自由F、D及A組成之群，X3係選自由Y、R及K組成之群，X4係選自由N及T組成之群，且X5係選自由D及Y組成之群。
CDR2 X1X2SNRX3S(SEQ ID NO: 112)，其中X1係選自由L及E組成之群，X2係選自由G及V組成之群，且X3係選自由A及F組成之群。
CDR3 MQX1X2X3X4PX5T(SEQ ID NO: 113)，其中X1係選自由A及S組成之群，X2係選自由L及F組成之群，X3係選自由Q及P組成之群，X4係選自由T及L組成之群，且X5係選自由F及L組成之群。
Lm3共同序列
CDR2 RX1NQRPS(SEQ ID NO: 114)，其中X1係選自由N及S組成之群。
Lm1,2,3共同序列
CDR1 SGSSSNIGX1NX2VX3(SEQ ID NO: 115)，其中X1係選自由N及S組成之群，X2係選自由Y及T組成之群，且X3係選自由S、N及Y組成之群。
CDR2 X1X2NX3RPS(SEQ ID NO: 116)，其中X1係選自由D、T及R組成之群，X2係選自由N及S組成之群，且X3係選自由K及Q組成之群。
CDR3 X1X2X3DX4X5LX6X7VV(SEQ ID NO: 117)，其中X1係選自由G及A組成之群，X2係選自由T及A組成之群，X3係選自由W及R組成之群，X4係選自由S及D組成之群，X5係選自由R及S組成之群，X6係選自由S及N組成之群，且X7係選自由A及G組成之群。
LAll共同序列
CDR1 X1GX2X3SX4X5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO: 118)，其中X1係選自由S及Q組成之群，X2存在或不存在，且若存在則為S，X3係選自由S及D組成之群，X4存在或不存在，且若存在則為N，X5係選自由I及L組成之群，X6係選自由G及R組成之群，X7係選自由N及S組成之群，X8係選自由N及F組成之群，X9係選自由Y及T組成之群，X10係選自由V及A組成之群，且X11係選自由S、N及Y組成之群。
CDR2 X1X2NX3RPS(SEQ ID NO: 119)，其中X1係選自由D、G、T及R組成之群，X2係選自由N、K及S組成之群，且X3係選自由K、N及Q組成之群。
CDR3 X1X2X3DX4X5X6X7X8X9V(SEQ ID NO: 120)，其中X1係選自由G、N及A組成之群，X2係選自由T、S及A組成之群，X3係選自由W及R組成之群，X4係選自由S及D組成之群，X5係選自由R及S組成之群，X6係選自由L及V組成之群，X7係選自由S、Y及N組成之群，X8係選自由A、H及G組成之群，且X9係選自由V及L組成之群。
HC1共同序列
CDR1 X1YYMX2(SEQ ID NO: 121)，其中X1係選自由G及D組成之群，X2係選自由H及Y組成之群。
CDR2 WIX1PNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO: 122)，其中X1係選自由N及S組成之群。
CDR3 X1X2X3SX4X5X6X7X8GX9X10X11X12YYX13GMDV(SEQ ID NO: 123)，其中X1係選自由D及G組成之群，X2係選自由Q及G組成之群，X3係選自由M及Y組成之群，X4係選自由I及G組成之群，X5係選自由I及Y組成之群，X6係選自由M及A組成之群，X7存在或不存在，且若存在則為L，X8存在或不存在，且若存在則為R，X9係選自由V及L組成之群，X10係選自由F及Y組成之群，X11係選自由P及S組成之群，X12係選自由P及H組成之群，且X13存在或不存在，且若存在則為Y。
HC2共同序列
CDR2 RIKSX1TDGGTTDYX2APVKG(SEQ ID NO: 124)，其中X1係選自由K及T組成之群，且X2係選自由T及A組成之群。
HC3共同序列
CDR1 X1YX2MX3(SEQ ID NO: 125)，其中X1係選自由T及S組成之群，X2係選自由S及A組成之群，且X3係選自由N及S組成之群。
CDR2 X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG(SEQ ID NO: 126)，其中X1係選自由S及A組成之群，X2係選自由S及G組成之群，X3係選自由S及G組成之群，X4係選自由S及G組成之群，X5係選自由Y及R組成之群，且X6係選自由R及T組成之群。
CDR3 X1X2X3X4X5X6X7PYSX8X9WYDYYYGMDV(SEQ ID NO: 127)，其中X1係選自由E及D組成之群，X2係選自由G及Q組成之群，X3係選自由V及R組成之群，X4係選自由S及E組成之群，X5係選自由G及V組成之群，X6係選自由S及G組成之群，X7存在或不存在，且若存在則為S，X8係選自由I及S組成之群，且X9係選自由S及G組成之群。
HC4共同序列
CDR1 SX1GMH(SEQ ID NO: 128)，其中X1係選自由F及Y組成之群。
CDR2 VISX1DGSX2KYX3X4DSVKG(SEQ ID NO: 129)，其中X1係選自由F及Y組成之群，X2係選自由I及H組成之群，X3係選自由S及Y組成之群，且X4係選自由V及A組成之群。
CDR3 X1RX2X3X4X5X6SX7X8YYX9X10X11YYGX12X13V(SEQ ID NO: 130)，其中X1係選自由D及E組成之群，X2係選自由L及K組成之群，X3係選自由N及R組成之群，X4係選自由Y及V組成之群，X5係選自由Y及T組成之群，X6係選自由D及M組成之群，X7係選自由S及T組成之群，X8係選自由G及L組成之群，X9係選自由H及Y組成之群，X10存在或不存在，且若存在則為Y，X11係選自由K及F組成之群，X12係選自由M及L組成之群，且X13係選自由A及D組成之群。
HCA共同序列
CDR1 X1X2X3MX4(SEQ ID NO: 131)，其中X1係選自由N及S組成之群，X2係選自由A、Y及F組成之群，X3係選自由W、A及G組成之群，且X4係選自由S及H組成之群。
CDR2 X1IX2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14VKG(SEQ ID NO: 132)，其中X1係選自由R、A及V組成之群，X2係選自由K、S及W組成之群，X3係選自由S、G、F及Y組成之群，X4存在或不存在，且若存在則係選自由K及T組成之群，X5存在或不存在，且若存在則為T，X6係選自由D及S組成之群，X7係選自由G及S組成之群，X8係選自由T、R、I、N及H組成之群，X9係選自由T及K組成之群，X10係選自由D及Y組成之群，X11係選自由Y及S組成之群，X12係選自由T、A及V組成之群，X13係選自由A及D組成之群，且X14係選自由P及S組成之群。
CDR3 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17GX18X19V(SEQ ID NO: 133)，其中X1係選自由D、A及E組成之群，X2係選自由R、Q及G組成之群，X3係選自由T、R、L、G及K組成之群，X4係選自由G、E、N、I及R組成之群，X5係選自由Y、V及A組成之群，X6係選自由S、G、Y、A及T組成之群，X7係選自由I、P、D、A及M組成之群，X8存在或不存在，且若存在則係選自由S及Y組成之群，X9存在或不存在，且若存在則係選自由W、S及T組成之群，X10係選自由S、G及L組成之群，X11係選自由S、G、L及Y組成之群，X12存在或不存在，且若存在則係選自由W及Y組成之群，X13係選自由Y及H組成之群，X14存在或不存在，且若存在則係選自由Y及D組成之群，X15係選自由Y、K及F組成之群，X16存在或不存在，且若存在則為Y，X17存在或不存在，且若存在則為Y，X18係選自由M及L組成之群，且X19係選自由D及A組成之群。
HCB共同序列
CDR1 X1X2X3X4X5(SEQ ID NO: 134)，其中X1係選自由N、G、D、S及A組成之群，X2係選自由A、F及Y組成之群，X3係選自由W、Y、A及G組成之群，X4係選自由M及L組成之群，且X5係選自由S及H組成之群。
CDR2 X1IX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17G(SEQ ID NO: 135)，其中X1係選自由R、W、A、V、S及F組成之群，X2係選自由K、N、S、W及R組成之群，X3係選自由S、P、G、F及Y組成之群，X4存在或不存在，且若存在則係選自由K、T及R組成之群，X5存在或不存在，且若存在則係選自由T及A組成之群，X6係選自由D、N、H、S及Y組成之群，X7係選自由G及S組成之群，X8係選自由G及S組成之群，X9係選自由T、G、R、I、N、H及Y組成之群，X10係選自由T、K、R及P組成之群，X11係選自由D、N、Y及E組成之群，X12係選自由Y及S組成之群，X13係選自由T、A及V組成之群，X14係選自由A、Q及D組成之群，X15係選自由P、K及S組成之群，X16係選自由V及F組成之群，且X17係選自由K及Q組成之群。
CDR3 X1X2X3X4X5SX6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16GX17X18V(SEQ ID NO: 136)，其中X1係選自由D、G、A及E組成之群，X2係選自由R、G及Q組成之群，X3係選自由T、M、Y、R、L、G及K組成之群，X4係選自由G、S、E、N、I及R組成之群，X5係選自由Y、I、G、V及A組成之群，X6係選自由S、I、Y、G、A及T組成之群，X7係選自由I、M、A、P及D組成之群，X8存在或不存在，且若存在則係選自由S、L及Y組成之群，X9存在或不存在，且若存在則係選自由W、R、S及T組成之群，X10係選自由S、G及L組成之群，X11係選自由S、V、L、G及Y組成之群，X12存在或不存在，且若存在則係選自由F、Y及W組成之群，X13係選自由Y、P、S及H組成之群，X14存在或不存在，且若存在則係選自由Y、P、D及H組成之群，X15係選自由Y、K及F組成之群，X16存在或不存在，且若存在則為Y，X17存在或不存在，且若存在則為Y，且X18係選自由M及L組成之群。
在一些情況下，抗原結合蛋白包含至少一條具有上述共同序列之一的重鏈CDR1、CDR2或CDR3。在一些情況下，抗原結合蛋白包含至少一條具有上述共同序列之一的輕鏈CDR1、CDR2或CDR3。在其他情況下，抗原結合蛋白包含至少兩條符合上述共同序列之重鏈CDR，及/或至少兩條符合上述共同序列之輕鏈CDR。在其他情況下，抗原結合蛋白包含至少三條符合上述共同序列之重鏈CDR，及/或至少三條符合上述共同序列之輕鏈CDR。
例示性抗原結合蛋白
根據一態樣，提供一種結合CGRP R之分離抗原結合蛋白，該分離之抗原結合蛋白包含(A)一或多個選自由以下組成之群的重鏈互補決定區(CDRH)：(i)選自由SEQ ID NO: 73、76、79、82、85、88、92、97及100組成之群的CDRH1；(ii)選自由SEQ ID NO: 74、77、80、83、86、89、91、93、95、98、101及129組成之群的CDRH2；(iii)選自由SEQ ID NO: 75、78、81、84、87、90、96、99、102及123組成之群的CDRH3；及(iv)含有一或多個(例如一、二、三、四個或四個以上)胺基酸取代、缺失或插入之(i)、(ii)及(iii)之CDRH，該等胺基酸取代、缺失或插入不多於五、四、三、四、二或一個胺基酸；(B)一或多個選自由以下組成之群的輕鏈互補決定區(CDRL)：(i)選自由SEQ ID NO: 42、45、48、51、54、57、62、65、66及69組成之群的CDRL1；(ii)選自由SEQ ID NO: 43、46、49、52、55、58、61、63、67及70組成之群的CDRL2；(iii)選自由SEQ ID NO: 44、47、50、53、56、59、64、68、71及72組成之群的CDRL3；及(iv)含有一或多個(例如一、二、三、四個或四個以上)胺基酸取代、缺失或插入之(i)、(ii)及(iii)之CDRL，該等胺基酸取代、缺失或插入不多於五、四、三、四、二或一個胺基酸；或(C)(A)之一或多個重鏈CDRH及(B)之一或多個輕鏈CDRL。
在又一實施例中，分離之抗原結合蛋白可包含(A)選自由以下組成之群的CDRH：(i)選自由SEQ ID NO: 73、76、79、82、85、88、92、97及100組成之群的CDRH1；(ii)選自由SEQ ID NO: 74、77、80、83、86、89、91、93、95、98、101及129組成之群的CDRH2；及(iii)選自由SEQ ID NO: 75、78、81、84、87、90、96、99、102及123組成之群的CDRH3；(B)選自由以下組成之群的CDRL：(i)選自由SEQ ID NO: 42、45、48、51、54、57、62、65、66及69組成之群的CDRL1；(ii)選自由SEQ ID NO: 43、46、49、52、55、58、61、63、67及70組成之群的CDRL2；及(iii)選自由SEQ ID NO: 44、47、50、53、56、59、64、68、71及72組成之群的CDRL3；或(C)(A)之一或多個重鏈CDRH及(B)之一或多個輕鏈CDRL。在一實施例中，分離之抗原結合蛋白可包括(A) SEQ ID NO: 73、76、79、82、85、88、92、97及100之CDRH1，SEQ ID NO: 74、77、80、83、86、89、91、93、95、98、101及129之CDRH2，及SEQ ID NO: 75、78、81、84、87、90、96、99、102及123之CDRH3，及(B) SEQ ID NO: 42、45、48、51、54、57、62、65、66及69之CDRL1，SEQ ID NO: 43、46、49、52、55、58、61、63、67及70之CDRL2，及SEQ ID NO: 44、47、50、53、56、59、64、68、71及72之CDRL3。
在另一實施例中，重鏈可變區(VH)與選自由SEQ ID NO: 158-170組成之群的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%序列一致性，且/或VL與選自由SEQ ID NO: 137-153組成之群的胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%序列一致性。在另一實施例中，VH係選自由SEQ ID NO: 158-170組成之群，且/或VL係選自由SEQ ID NO: 137-153組成之群。
在另一態樣中，亦提供一種特異性結合抗原決定基(由CGRP R之CRLR與RAMP1組份之胺基酸殘基形成)之分離抗原結合蛋白。
在又一實施例中，上述分離抗原結合蛋白包含含有至少一個如本文所揭示之CDRH共同序列的第一胺基酸序列，及含有至少一個如本文所揭示之CDRL共同序列的第二胺基酸序列。在一態樣中，第一胺基酸序列包含至少兩個CDRH共同序列，且/或第二胺基酸序列包含至少兩個CDRL共同序列。
在某些實施例中，第一胺基酸序列與第二胺基酸序列彼此共價結合。
在另一實施例中，分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包括SEQ ID NO: 75、78、81、84、87、90、96、99、102及123之CDRH3，SEQ ID NO: 74、77、80、83、86、89、91、93、95、98、101及129之CDRH2，及SEQ ID NO: 73、76、79、82、85、88、92、97及100之CDRH1，且/或分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含SEQ ID NO: 44、47、50、53、56、59、64、68、71及72之CDRL3，SEQ ID NO: 43、46、49、52、55、58、61、63、67及70之CDRL2，及SEQ ID NO: 42、45、48、51、54、57、62、65、66及69之CDRL1。
在另一實施例中，抗原結合蛋白包含重鏈序列H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12或H13之至少兩個CDRH序列，如表5A中所示。在又一實施例中，抗原結合蛋白包含輕鏈序列L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16或L17之至少兩個CDRL序列，如表5B中所示。在又一實施例中，抗原結合蛋白包含重鏈序列H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12或H13之至少兩個CDRH序列(如表5A中所示)，及輕鏈序列L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16或L17之至少兩個CDRL(如表5B中所示)。
在又一實施例中，抗原結合蛋白包含重鏈序列H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12或H13之CDRH1、CDRH2及CDRH3序列，如表5A中所示。在又一實施例中，抗原結合蛋白包含輕鏈序列L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16或L17之CDRL1、CDRL2及CDRL3序列，如表5B中所示。
在又一實施例中，抗原結合蛋白包含L1及H1，或L2及H2，或L3及H3，或L4及H4，或L5及H5，或L6及H1，或L7及H6，或L8及H5，或L9及H1，或L10及H7，或L11及H8，或L12及H9，或L12及H10，或L13及H5，或L14及H11，或L15及H12，或L16及H13，或L17及H13之所有六個CDR，如表5A及5B中所示。
在一態樣中，本文所提供之分離抗原結合蛋白可為單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗體抗原結合片段。
在另一實施例中，本文所提供之分離抗原結合蛋白的抗體片段可為Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體或單鏈抗體分子。
在另一實施例中，本文所提供之分離抗原結合蛋白為人類抗體且可為IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。
在另一實施例中，抗原結合蛋白僅由如表5A-5B中所述之輕鏈或重鏈多肽組成。在一些實施例中，抗原結合蛋白僅由諸如表5A-5B中所列之輕鏈可變域或重鏈可變域組成。此等抗原結合蛋白可在一或多個PEG分子存在下聚乙二醇化。
在又一態樣中，本文所提供之分離抗原結合蛋白可與標記基團偶合且可與本文所提供之分離抗原結合蛋白之一之抗原結合蛋白競爭結合人類CGRP R之細胞外部分。在一實施例中，本文所提供之分離抗原結合蛋白投與患者時可降低單核細胞趨化性、抑制單核細胞遷移至腫瘤中或抑制腫瘤中腫瘤相關巨噬細胞之積累及功能。
如熟習此項技術者所瞭解，對於具有一個以上來自所描繪序列之CDR的任何抗原結合蛋白，獨立選自所描繪序列之CDR的任何組合均適用。因此，可產生具有一、二、三、四、五或六個獨立選擇之CDR的抗原結合蛋白。然而，如熟習此項技術者所瞭解，特定實施例一般利用非重複CDR之組合，例如抗原結合蛋白一般不具有兩個CDRH2區等。
所提供之抗原結合蛋白中有些更詳細地論述於下文中。
抗原結合蛋白及結合抗原決定基及結合域
當稱抗原結合蛋白可結合抗原決定基(諸如CGRP R之一或兩種組份，或CGRP R之細胞外域)時，意謂抗原結合蛋白特異性結合CGRP R之特定部分，其可位於CRLR、RAMP1上，或位於CRLR與RAMP1之全長部分(span portion)上。在抗原結合蛋白僅結合CRLR(而不結合RAMP1)之情況下，預計抗原結合蛋白不會選擇性結合CGRP R，因為CRLR尤其與AM1及AM1受體相似。類似地，在抗原結合蛋白僅結合RAMP1(而不結合CRLR)之情況下，預期抗原結合蛋白不會選擇性結合CGRP R，因為RAMP1尤其與AMY1受體相似。在抗原結合蛋白與CRLR及RAMP1均相互作用之情況下，預期抗原結合蛋白會結合CRLR與RAMP1中之殘基或殘基序列或區域。前述實施例皆未預期抗原結合蛋白接觸CRLR或RAMP1內之每個殘基。類似地，並非CRLR、RAMP1或其細胞外域內之每個胺基酸取代或缺失均預期會顯著影響結合親和力。
詳述於例如實例10中之方法可用以評估多聚體受體(諸如CGRP R)中涉及結合所選抗原結合蛋白的區域。
競爭性抗原結合蛋白
在另一態樣中，所提供之抗原結合蛋白與結合上述抗原決定基之例示性或「參考」抗體或功能片段之一競爭特異性結合CGRP R。此等抗原結合蛋白亦可與本文所例示之抗原結合蛋白之一結合相同抗原決定基，或重疊抗原決定基。預計與所例示或參考抗原結合蛋白競爭或結合相同抗原決定基的抗原結合蛋白及片段可展示類似功能特性。所例示之抗原結合蛋白及片段包括表2A、2B、3、4A、4B、5A及5B中所包括之具有重鏈及輕鏈、可變區結構域VL1-VL17及VH1-VH13及CDR的彼等者。因此，作為特定實例，所提供之抗原結合蛋白包括可與具有以下之抗體競爭之彼等者：(a)針對表5A及5B中所列之抗體所列的所有6個CDR；(b)選自VL1-VL17及VH1-VH13且針對表5A及5B中所列之抗體所列的VH及VL；或(c)如針對表5A及5B中所列之抗體指定之兩條輕鏈及兩條重鏈。適合參考抗體的其他實例包括其中重鏈可變區具有對應於鑑別為SEQ ID NO: 158-170之任一序列之序列及其中輕鏈可變區具有對應於鑑別為SEQ ID NO: 137-153之任一序列之序列的抗體。
可例如使用結合檢定，諸如下文實例7中所述之Biacore檢定來評估結合競爭。在該實例中，針對六種「參考」抗體(五種中和性抗體(11D11、3B6、4H6、12G8及9F5)及一種非中和性抗體(34E3))中之每一者測試本文所述之19種抗體。表13中所示之檢定結果表明，所有經測試之中和性抗體(1E11、1H7、2E7、3B6、3C8、4E4、4H6、5F5、9D4、9F5、10E4、11D11、11H9、12E8、12G8、13H2及32H7)均結合CGRP R之實質上相同區域，該區域不同於所測試之非中和性抗體(32H8、33B5、33E4及34E3)所結合的CGRP R之區域。基於此等資料，任一中和性抗體在競爭檢定中均可成為例示性參考抗原結合蛋白，尤其在實例7所述之檢定中固著的任一中和性抗體：11D11、3B6、4H6、12G8及9F5。
單株抗體
所提供之抗原結合蛋白包括可結合CGRP R之單株抗體。可使用此項技術中已知之任何技術(例如使自完成免疫時程後之轉殖基因動物所收集之脾臟細胞永生化)產生單株抗體。脾臟細胞可使用此項技術中已知之任何技術(例如使其與骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤)永生化。用於產生融合瘤之融合程序中之骨髓瘤細胞較佳不產生抗體，具有高融合效率，且缺乏酶，致使其不能生長於某些僅支持所需融合細胞(融合瘤)生長之選擇性培養基中。用於小鼠融合之適合細胞株的實例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7及S194/5XXO Bul；用於大鼠融合之細胞株的實例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F及4B210。適用於細胞融合之其他細胞株為U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2及UC729-6。製備單株抗體之例示性方法描述於下文實例2中。
有時候融合瘤細胞株可如下製備：以CGRP R免疫原使動物(例如具有人類免疫球蛋白序列之轉殖基因動物)免疫；自免疫之動物收集脾臟細胞；使所收集之脾臟細胞與骨髓瘤細胞株融合，藉此產生融合瘤細胞；自融合瘤細胞建立融合瘤細胞株，且鑑別可產生結合CGRP R之抗體的融合瘤細胞株(例如下文實例1-3中所述)。此等融合瘤細胞株及其所產生之抗CGRP R單株抗體為本申請案之態樣。
可使用此項技術中已知之任何技術純化融合瘤細胞株所分泌之單株抗體。可例如使用cAMP檢定(例如下文所述)進一步篩檢融合瘤或mAb以鑑別具有特定特性之mAb，諸如結合表現CGRP之細胞的能力、阻斷或干擾CGRP配位體或CGRP8-37肽結合之能力，或在功能上阻斷受體之能力。
嵌合及人類化抗體
亦提供基於前述序列之嵌合及人類化抗體。適用作治療劑之單株抗體可在使用前以多種方式修飾。一個實例為嵌合抗體，其為由不同抗體之蛋白質區段組成的抗體，該等蛋白質區段共價接合以產生功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈或其免疫功能性部分。一般而言，該重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或亞類之抗體中之相應序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或亞類之抗體中之相應序列一致或同源。關於與嵌合抗體有關之方法，參看例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，1985,Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 81:6851-6855，該等文獻係以引用的方式併入本文中。CDR移植描述於例如美國專利第6,180,370號、第5,693,762號、第5,693,761號、第5,585,089號及第5,530,101號中。
製造嵌合抗體之目標通常在於產生使來自預定患者物種之胺基酸數目最大化的嵌合體。一個實例為「CDR移植」抗體，其中該抗體包含一或多個來自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類之互補決定區(CDR)，而抗體鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或亞類的抗體中之相應序列一致或同源。為用於人類，通常將來自齧齒動物抗體之可變區或所選CDR移植於人類抗體中，從而置換人類抗體之天然存在之可變區或CDR。
一種適用類型之嵌合抗體為「人類化」抗體。人類化抗體通常自最初在非人類動物中產生之單株抗體產生。此單株抗體中之某些胺基酸殘基(通常來自抗體之非抗原識別部分)係經修飾以與相應同型之人類抗體中相應殘基同源。人類化可使用各種方法進行，例如用齧齒動物可變區之至少一部分取代人類抗體之相應區域(參看例如美國專利第5,585,089號及第5,693,762號；Jones等人，1986,Nature 321:522-525；Riechmann等人，1988,Nature 332:323-27；Verhoeyen等人，1988,Science 239:1534-1536)。
在一態樣中，將本文所提供之抗體的輕鏈及重鏈可變區之CDR(參看表4)移植至來自相同或不同譜系物種之抗體的框架區(FR)。舉例而言，可將重鏈及輕鏈可變區VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12及VH13，及/或VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16及VL17之CDR移植至共同序列人類FR。為產生共同序列人類FR，可比對若干人類重鏈或輕鏈胺基酸序列之FR以鑑別共同胺基酸序列。在其他實施例中，本文所揭示之重鏈或輕鏈之FR係經來自不同重鏈或輕鏈之FR置換。在一態樣中，抗CGRP R抗體之重鏈及輕鏈的FR中之稀有胺基酸不置換，而置換其餘FR胺基酸。「稀有胺基酸」為一種特定胺基酸，在此特定胺基酸所處之FR中之位置通常不存在此特定胺基酸。或者，所移植之來自一條重鏈或輕鏈之可變區可與不同於如本文揭示之特定重鏈或輕鏈之恆定區的恆定區一起使用。在其他實施例中，所移植之可變區為單鏈Fv抗體之一部分。
在某些實施例中，來自除人類外之物種的恆定區可與人類可變區一起使用以產生雜交抗體。
完全人類抗體
亦提供完全人類抗體。可使用產生對指定抗原具有特異性之完全人類抗體(「完全人類抗體」)而不使人類暴露於抗原的方法。為產生完全人類抗體所提供之一種特定方式為小鼠體液免疫系統之「人類化」。將人類免疫球蛋白(Ig)基因座引入內源性Ig基因已去活化之小鼠中為一種在小鼠(可以任何所需抗原免疫之動物)中產生完全人類單株抗體(mAb)之方式。使用完全人類抗體可使免疫原性反應及過敏反應最小化，免疫原性反應及過敏反應有時可因向人類投與作為治療劑之小鼠mAb或來源於小鼠之mAb引起。
完全人類抗體可藉由使轉殖基因動物(通常為小鼠)免疫來產生，該等轉殖基因動物能夠在不產生內源性免疫球蛋白之情況下產生人類抗體譜。用於此目的之抗原通常具有六個或六個以上相連胺基酸，且視情況與載劑結合，諸如半抗原。參看例如Jakobovits等人，1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555；Jakobovits等人，1993,Nature 362:255-258；及Bruggermann等人，1993,Year in Immuno1. 7:33。在此方法之一個實例中，轉殖基因動物係如下產生：使其中編碼小鼠免疫球蛋白重鏈及輕鏈之內源性小鼠免疫球蛋白基因座失能，且插入含有編碼人類蛋白質重鏈及輕鏈之基因座的人類基因組DNA之小鼠基因組大片段中。接著雜交育種經部分修飾之動物(其具有人類免疫球蛋白基因座之不完整互補序列)以獲得具有所有所需免疫系統修飾之動物。當投與免疫原時，此等轉殖基因動物產生對免疫原具有免疫特異性、但具有人類而非鼠類胺基酸序列(包括可變區)之抗體。關於此等方法之其他細節，參看例如WO96/33735及WO94/02602。關於產生人類抗體之轉殖基因小鼠之其他方法描述於美國專利第No. 5,545,807號；第6,713,610號；第6,673,986號；第6,162,963號；第5,545,807號；第6,300,129號；第6,255,458號；第5,877,397號；第5,874,299號及第5,545,806號；PCT公開案WO 91/10741、WO 90/04036及EP 546073B1及EP 546073A1中。
本文中稱作「HuMab」小鼠之上述轉殖基因小鼠含有編碼未重排人類免疫球蛋白重鏈([μ]及[γ])及[κ]輕鏈序列之人類免疫球蛋白基因小基因座，以及使內源性[μ]及[κ]鏈基因座去活化之靶向突變(Lonberg等人，1994,Nature 368:856-859)。因此，小鼠顯示小鼠IgM或[κ]之低表現及對免疫之反應，且所引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因經歷類別轉換及體細胞突變以產生高親和力人類IgG[κ]單株抗體(Lonberg等人，見上；Lonberg及Huszar,1995,Intern. Rev. Immunol . 13:65-93；Harding及Lonberg,1995,Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546)。HuMab小鼠之製備詳述於Taylor等人，1992,Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen等人，1993,International Immunology 5:647-656；Tuaillon等人，1994,J. Immunol. 152:2912-2920；Lonberg等人，1994,Nature 368:856-859；Lonberg,1994,Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101；Taylor等人，1994,International Immunology 6:579-591；Lonberg及Huszar,1995,Intern. Rev. Immunol. 13:65-93；Harding及Lonberg,1995,Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546；Fishwild等人，1996,Nature Biotechnology 14:845-851中；前述參考文獻係以全文引用的方式併入本文中以用於所有目的。參看其他美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,789,650號；第5,877,397號；第5,661,016號；第5,814,318號；第5,874,299號；及第5,770,429號；以及美國專利第5,545,807號；國際公開案第WO 93/1227號；及第WO 92/22646號；及第WO 92/03918號，該等所有專利之揭示內容係以全文引用的方式併入本文中以用於所有目的。為在此等轉殖基因小鼠中產生人類抗體所用之技術亦揭示於WO 98/24893，及Mendez等人，1997,Nature Genetics 15:146-156中，該等文獻係以引用的方式併入本文中。舉例而言，HCo7及HCo12轉殖基因小鼠品系可用以產生抗CGRP R抗體。關於使用轉殖基因小鼠產生人類抗體之其他細節提供於下文實例中。
使用融合瘤技術，可自轉殖基因小鼠(諸如上文所述彼等小鼠)產生並選擇具有所需特異性之抗原特異性人類mAb。可使用適合載體及宿主細胞選殖並表現此等抗體，或可自所培養之融合瘤細胞收集抗體。
完全人類抗體亦可來源於噬菌體呈現文庫(如以下文獻中所揭示：Hoogenboom等人，1991,J. Mol. Biol. 227: 381；及Marks等人，1991,J. Mol. Biol. 222:581)。噬菌體呈現技術係經由在絲狀噬菌體表面上呈現抗體譜及隨後依據噬菌體與所選抗原之結合來選擇噬菌體來模擬免疫選擇。一種此技術描述於PCT公開案第WO 99/10494號中(該案以引用的方式併入本文中)，該案描述使用此方法分離針對MPL受體及msk受體之高親和力及功能促效性抗體。
雙特異性或雙功能抗原結合蛋白
所提供之抗原結合蛋白亦包括雙特異性及雙功能抗體，該等抗體如上所述包括一或多個CDR或一或多個可變區。雙特異性或雙功能抗體有時候為具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人造雜交抗體。雙特異性抗體可由多種方法(包括(但不限於)融合瘤融合或Fab'片段連接)產生。參看例如Songsivilai及Lachmann,1990,Clin. Exp. Immunol. 79:315-321；Kostelny等人，1992,J. Immunol. 148:1547-1553。
各種其他形式
所提供之抗原結合蛋白中有些為如上文揭示之抗原結合蛋白之變異體形式(例如具有表2-5中所列之序列的彼等者)。舉例而言，一些抗原結合蛋白在表2-5中所列之一或多個重鏈或輕鏈、可變區或CDR中具有一或多個保守性胺基酸取代。
天然存在之胺基酸可基於共同側鏈特性分類：
1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
3)酸性：Asp、Glu；
4)鹼性：His、Lys、Arg；
5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；及
6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
保守性胺基酸取代可包括此等類別中之一成員與同類中之另一成員互換。保守性胺基酸取代可涵蓋非天然存在之胺基酸殘基，其通常藉由化學肽合成而非藉由在生物系統中合成來併入。此等者包括肽模擬物及其他逆向或反向形式之胺基酸部分。
非保守性取代可包括將上述類別中之一成員交換為另一類別之成員。此等經取代之殘基可引入與人類抗體同源的抗體區域中或該分子之非同源區域中。
產生此等變化時，根據某些實施例，可考慮胺基酸之親水指數(hydropathic index)。蛋白質之親水概況係如下計算：賦予各胺基酸一個數值(「親水指數」)且接著沿肽鏈反覆求此等值之平均值。各胺基酸係依據其疏水性及電荷特徵賦予親水指數。其為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸鹽(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天冬胺酸鹽(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。
親水概況對賦予蛋白質相互作用生物功能的重要性已瞭解於此項技術中(參看例如Kyte等人，1982,J. Mol. Biol. 157:105-131)。已知可用某些胺基酸取代具有類似親水指數或分數之其他胺基酸且仍保留類似生物活性。在依據親水指數產生變化時，在某些實施例中，包括取代親水指數在±2內之胺基酸。在一些態樣中，包括在±1內者，且在其他態樣中，包括在±0.5內者。
在此項技術中亦瞭解，可依據親水性進行類似胺基酸之取代，尤其在藉此所產生之生物功能蛋白或肽意欲用於免疫實施例的情況下，如在本發明情況下。在某些實施例中，蛋白質之最大局部平均親水性(如取決於其相鄰胺基酸之親水性)係與其免疫原性及抗原結合或免疫原性(亦即蛋白質之生物特性)有關。
已賦予此等胺基酸殘基以下親水性值：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0)；天冬胺酸鹽(+3.0±1)；麩胺酸鹽(+3.0±1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；麩醯胺酸(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5±1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)及色胺酸(-3.4)。在依據類似親水性值產生變化時，在某些實施例中，包括取代親水性值在±2內之胺基酸，在其他實施例中，包括取代親水性值在±1內之胺基酸，且在其他實施例中，包括取代親水性值在±0.5內之胺基酸。有時候亦可依據親水性、自一級胺基酸序列鑑別抗原決定基。此等區域亦稱作「抗原決定基核心區」。
表6中闡述例示性保守性胺基酸取代。
熟習此項技術者將能夠使用熟知技術測定如本文所述之多肽的適合變異體。熟習此項技術者可鑑別分子中適於變化的區域，而不因靶向咸信對活性不重要之區域而破壞活性。熟習此項技術者亦將能夠鑑別分子中在類似多肽當中具保守性的殘基及部分。在其他實施例中，甚至可對對生物活性或對結構重要之區域進行保守性胺基酸取代而不破壞生物活性或對多肽結構無不利影響。
另外，熟習此項技術者可回顧鑑別類似多肽中對活性或結構重要之殘基的結構功能研究。鑒於此比較，可預測蛋白質中之重要胺基酸殘基以及類似蛋白質中對活性或結構重要的對應胺基酸殘基。對於所預測之此等重要胺基酸殘基，熟習此項技術者可選擇化學上類似之胺基酸取代。
熟習此項技術者亦可分析類似多肽之3維結構及與類似多肽之3維結構相關的胺基酸序列。鑒於此資訊，熟習此項技術者可針對其三維結構預測抗體之胺基酸殘基比對。熟習此項技術者可選擇不使預測位於蛋白質表面上之胺基酸殘基產生根本變化，因為此等殘基可能涉及與其他分子之重要相互作用。此外，熟習此項技術者可產生在各所需胺基酸殘基處含有單一胺基酸取代之測試變異體。接著可使用檢定篩檢此等變異體之CGRP R中和活性，(參看下文實例)，從而產生關於哪個胺基酸可變化及哪個胺基酸不許變化之資訊。換言之，依據自此等常規實驗所收集之資訊，熟習此項技術者可容易地測定應避免進一步取代(單獨或與其他突變組合)之胺基酸位置。
許多科學出版物已致力於預測二級結構。參看Moult,1996,Curr. Op. in Biotech. 7:422-427；Chou等人，1974,Biochem. 13:222-245；Chou等人，1974,Biochemistry 113:211-222；Chou等人，1978,Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148；Chou等人，1979,Ann. Rev. Biochem. 47:251-276；及Chou等人，1979,Biophys. J. 26:367-384。此外，目前可利用電腦程式協助預測二級結構。一種預測二級結構之方法係依據同源建模法。舉例而言，序列一致性大於30%或相似性大於40%之兩種多肽或蛋白質可具有相似拓撲結構。蛋白質結構資料庫(PDB)之最新發展已提供增強之二級結構可預測性，包括多肽結構或蛋白質結構內之潛在摺疊數目。參看Holm等人，1999,Nucl. Acid. Res. 27:244-247。已有人提出(Brenner等人，1997,Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376)，指定多肽或蛋白質中存在有限數目之摺疊且一旦解出關鍵數目之結構，則結構預測將變得更大為精確。
預測二級結構之其他方法包括「穿線法(threading)」(Jones,1997,Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-387；Sippl等人，1996,Structure 4:15-19)、「概況分析法」(Bowie等人，1991,Science 253:164-170；Gribskov等人，1990,Meth. Enzym. 183:146-159；Gribskov等人，1987,Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358)，及「進化關聯法(evolutiOnary 1inkage)」(參看Holm,1999，見上；及Brenner,1997，見上)。
在一些實施例中，胺基酸經取代應：(1)降低蛋白易分解性，(2)降低易氧化性，(3)改變結合親和力以便形成蛋白質複合物，(4)改變配位體或抗原結合親和力，及/或(4)賦予或修飾此等多肽其他物理化學或功能特性。舉例而言，可在天然存在之序列中進行單個或多個胺基酸取代(在某些實施例中，為保守性胺基酸取代)。可在抗體中位於形成分子間接點之域外的該部分中進行取代。在此等實施例中，可使用實質上不改變親本序列之結構特徵的保守性胺基酸取代(例如一或多個置換胺基酸不破壞可表徵親本或原生抗原結合蛋白之二級結構)。此項技術認可之多肽二級及三級結構之實例描述於Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton編)，1984，W. H. New York: Freeman and Company；Introduction to Protein Structure(Branden及Tooze編)，1991，New York: Garland Publishing；及Thornton等人，1991,Nature 354:105，該等文獻各自以引用的方式併入本文中。
其他較佳抗體變異體包括半胱胺酸變異體，其中親本或原生胺基酸序列中之一或多個半胱胺酸殘基缺失或經另一胺基酸(例如絲胺酸)取代。半胱胺酸變異體為適用的，尤其當抗體必須再摺疊為生物學活性構形時。半胱胺酸變異體可具有少於原生抗體之半胱胺酸殘基，且通常為偶數以使不成對半胱胺酸所引起之相互作用最小化。
所揭示之重鏈及輕鏈、可變區結構域及CDR可用以製備含有可特異性結合CGRP R之抗原結合區的多肽。舉例而言，可將表4及表5中所列之一或多個CDR以共價或非共價方式併入分子(例如多肽)中以製備免疫黏附物。免疫黏附物可合併CDR作為較大多肽鏈之一部分，可使CDR與另一多肽鏈共價連接，或可以非共價方式合併CDR。CDR使免疫黏附物能夠與特定相關抗原(例如CGRP R或其抗原決定基)特異性結合。
亦提供基於本文所述之可變區結構域及CDR的模擬物(例如肽模擬物)。此等類似物可為肽、非肽，或肽與非肽區之組合。Fauchere,1986,Adv. Drug Res. 15:29；Veber及Freidinger,1985,TINS第392頁；及Evans等人，1987,J. Med. Chem. 30:1229，該等文獻以引用的方式併入本文中以用於任何目的。結構上類似於治療適用肽的肽模擬物可用以產生類似治療或預防作用。此等化合物通常藉助於電腦化分子建模法來開發。肽模擬物通常為結構上類似於呈現所需生物活性(在本文中諸如特異性結合CGRP R之能力)之抗體的蛋白質，但其中一或多個肽鍵已視情況藉由此項技術中熟知之方法置換為選自-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH-CH-(順式及反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-及-CH2SO-之鍵。以相同類型之D-胺基酸系統性取代共同序列之一或多個胺基酸(例如D-離胺酸置換L-離胺酸)可在某些實施例中用於產生較穩定之蛋白質。另外，可藉由此項技術中已知之方法(Rizo及Gierasch,1992,Ann. Rev. Biochem. 61:387，該文獻以引用的方式併入本文中)，例如藉由添加能夠形成使肽環化之分子內雙硫橋之內部半胱胺酸殘基來產生包含共同序列或實質上一致共同序列變異體之限制肽。
亦提供本文所述之抗原結合蛋白之衍生物。所衍生之抗原結合蛋白可包含賦予抗體或片段所需特性(諸如在特定用途中延長半衰期)之任何分子或物質。所衍生之抗原結合蛋白可包含例如可偵測(或標記)部分(例如放射性分子、比色分子、抗原分子或酶促分子)、可偵測珠粒(諸如磁性或電緻密(例如金)珠粒)，或與另一分子結合之分子(例如生物素或抗生蛋白鏈菌素(streptavidin))、治療或診斷部分(例如放射性部分、細胞毒性部分或醫藥學活性部分)，或提高抗原結合蛋白對於特定用途(例如投與個體，諸如人類個體，或其他活體內或活體外用途)之適用性的分子。可用以衍生抗原結合蛋白之分子的實例包括白蛋白(例如人類血清白蛋白)及聚乙二醇(PEG)。可使用此項技術中熟知之技術製備抗原結合蛋白之白蛋白連接衍生物及聚乙二醇化衍生物。某些抗原結合蛋白包括如本文所述之聚乙二醇化單鏈多肽。在一實施例中，抗原結合蛋白與運甲狀腺素蛋白(transthyretin，TTR)或TTR變異體)結合或以其他方式連接。TTR或TTR變異體可經例如選自由以下組成之群的化學物質來化學修飾：聚葡萄糖、聚(n-乙烯基吡咯啶酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚合物、聚氧乙烯化多元醇及聚乙烯醇。
其他衍生物包括CGRP R結合蛋白與其他蛋白質或多肽之共價或聚集性結合物，諸如藉由表現重組融合蛋白，該重組融合蛋白包含異源多肽與CGRP R結合蛋白之N端或C端之融合。舉例而言，結合肽可為異源信號(或前導)多肽，例如酵母α因子前導多肽；或肽，諸如抗原決定基標籤。含CGRP抗原結合蛋白之融合蛋白可包含為有助於純化或鑑別CGRP R結合蛋白所添加之肽(例如多His)。CGRP R結合蛋白亦可連接如Hopp等人，1988,Bio/Technology 6:1204；及美國專利第5,011,912號中所述之FLAG肽。FLAG肽具高度抗原性且提供特異性單株抗體(mAb)可逆性結合之抗原決定基，使得所表現之重組蛋白能夠快速檢定及易純化。適用於製備融合蛋白(其中FLAG肽與指定多肽融合)之試劑在市面上可購得(Sigma,St. Louis,MO)。
含有一或多種CGRP R結合蛋白之寡聚物可用作CGRP R拮抗劑。寡聚物可呈共價連接或非共價連接之二聚物、三聚物或較高寡聚物形式。使用時可考慮包含兩種或兩種以上CGRP R結合蛋白之寡聚物，一個實例為均二聚物。其他寡聚物包括雜二聚物、均三聚物、雜三聚物、均四聚物、雜四聚物，等。
一個實施例係關於寡聚物，其包含經由肽部分之間共價或非共價相互作用所接合之多個CGRP R結合多肽與CGRP R結合蛋白之融合。此等肽可為肽連接子(間隔子)，或具有促進寡聚化之特性的肽。如下文較詳細描述，白胺酸拉鏈及來源於抗體之某些多肽屬於可促進與其連接之CGRP R結合蛋白寡聚化之肽。
在特定實施例中，寡聚物包含二至四種CGRP R結合蛋白。寡聚物之CGRP R結合蛋白部分可呈任一上述形式，例如變異體或片段。寡聚物較佳包含具有CGRP R結合活性之CGRP R結合蛋白。
在一實施例中，使用來源於免疫球蛋白之多肽製備寡聚物。製備包含某些異源多肽與來源於抗體之多肽之各部分(包括Fc域)融合的融合蛋白已描述於Ashkenazi等人，1991,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535；Byrn等人，1990,Nature 344:677；及Hollenbaugh等人，1992「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins」,Current Protocols in Immunology，增刊4，第10.19.1-10.19.11頁。
一個實施例係關於包含兩個融合蛋白的二聚物，該二聚物係由CGRP R結合蛋白與抗體之Fc區融合所產生。二聚物可如下製備：例如將編碼融合蛋白之基因融合物插入適當表現載體中，在經重組表現載體轉型之宿主細胞中表現基因融合物，且允許所表現之融合蛋白組裝成大量類似抗體分子，隨後在Fc部分之間形成鏈間雙硫鍵以產生二聚物。
如本文中所用，術語「Fc多肽」包括來源於抗體之Fc區的多肽之原生及突變蛋白形式。亦包括含有促進二聚化之鉸鏈區的此等多肽之截斷形式。包含Fc部分之融合蛋白(及由此形成之寡聚物)提供容易在蛋白質A或蛋白質G管柱上進行親和力層析純化之優勢。
PCT申請案WO 93/10151及美國專利第5,426,048號及第5,262,522號中所述之一種適合Fc多肽為一種單鏈多肽，其自人類IgG1抗體之Fc區之N端鉸鏈區延伸至原生C端。另一適用之Fc多肽為美國專利第5,457,035號，及Baum等人，1994,EMBO J. 13:3992-4001中所述之Fc突變蛋白。此突變蛋白之胺基酸序列與WO 93/10151中所述的原生Fc序列之胺基酸序列一致，但胺基酸19已自Leu變為Ala，胺基酸20已自Leu變為Glu，且胺基酸22已自Gly變為Ala。突變蛋白對Fc受體顯示低親和力。
在其他實施例中，諸如本文所揭示之CGRP R結合蛋白之重鏈及/或輕鏈的可變部分可取代抗體重鏈及/或輕鏈之可變部分。
或者，寡聚物為包含多種CGRP R結合蛋白、有或無肽連接子(間隔肽)之融合蛋白。適合之肽連接子包括美國專利第4,751,180號及第4,935,233號所述者。
另一種製備寡聚CGRP R結合蛋白衍生物之方法包括使用白胺酸拉鏈。白胺酸拉鏈域為促進其所存在之蛋白質寡聚化的肽。白胺酸拉鏈最初在若干DNA結合蛋白中得到鑑別(Landschulz等人，1988,Science 240:1759)，且此後發現於多種不同蛋白質中。已知白胺酸拉鏈包括天然存在之肽及其二聚或三聚衍生物。適於產生可溶性寡聚蛋白質之白胺酸拉鏈域的實例描述於PCT申請案WO 94/10308中，且來源於肺界面活性劑蛋白質D(SPD)之白胺酸拉鏈描述於Hoppe等人，1994,FEBS Letters 344:191中，該等文獻以引用的方式併入本文中。使用經修飾之白胺酸拉鏈(容許與其融合之異源蛋白質穩定三聚化)描述於Fanslow等人，1994,Semin. Immunol. 6:267-278中。在一種方法中，包含CGRP R結合蛋白片段或衍生物與白胺酸拉鏈肽融合之重組融合蛋白係表現於適合宿主細胞中，且自培養物上清液中回收所形成之可溶性寡聚CGRP R結合蛋白片段或衍生物。
在某些實施例中，抗原結合蛋白具有之小於1 pM、10 pM、100 pM、1 nM、2 nM、5 nM、10 nM、25 nM或50 nM之KD(平衡結合親和力)。
另一態樣提供活體外或活體內(例如當投與人類個體時)半衰期為至少一天之抗原結合蛋白。在一實施例中，抗原結合蛋白具有至少三天之半衰期。在另一實施例中，抗體或其一部分具有四天或四天以上之半衰期。在另一實施例中，抗體或其一部分具有八天或八天以上之半衰期。在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分係經衍生或修飾，使得其較之未經衍生或未經修飾之抗體具有更長半衰期。在另一實施例中，抗原結合蛋白含有可延長血清半衰期之點突變，諸如2000年2月24日公開之WO 00/09560(以引用的方式併入本文中)中所述。
糖基化
抗原結合蛋白之糖基化模式可與原生物種中所存在之糖基化模式不同或由其改變而來。如此項技術中所知，糖基化模式可視蛋白質之序列(例如存在或不存在特定糖基化胺基酸殘基，下文討論)或產生蛋白質之宿主細胞或生物體而定。下文討論特定表現系統。
多肽之糖基化通常為N連接或O連接。N連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸)為碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈酶促連接之識別序列。因此，多肽中存在任一此等三肽序均可產生潛在糖基化位點。O連接糖基化係指使糖N-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖之一與羥胺基酸(最通常為絲胺酸或蘇胺酸)連接，但亦可使用5-羥脯胺酸或5-羥離胺酸。
將糖基化位點添加至抗原結合蛋白中宜藉由改變胺基酸序列使得其含有一或多個上述三肽序列來實現(對於N連接糖基化位點)。亦可藉由將一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添加至起始序列中或經此等殘基取代來產生該變化(對於O連接糖基化位點)。為簡易起見，抗原結合蛋白胺基酸序列可經由在DNA層面改變，尤其藉由使編碼標靶多肽之DNA在預選鹼基處突變(以便產生將轉譯為所需胺基酸之密碼子)來改變。
增加抗原結合蛋白上碳水化合物部分之數目的另一方式為使醣苷與蛋白質化學或酶促偶合。此等程序有利之處在於其不需要在宿主細胞中產生具有糖基化能力(針對N連接糖基化及O連接糖基化)之蛋白質。視所用偶合模式而定，糖可連接至(a)精胺酸及組胺酸、(b)游離羧基、(c)游離硫氫基(諸如半胱胺酸之游離硫氫基)、(d)游離羥基(諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥脯胺酸之游離羥基)、(e)芳族殘基(諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之芳族殘基)或(f)麩醯胺酸之醯胺基。此等方法描述於1987年9月11日公開之WO 87/05330中及Aplin及Wriston,1981,CRC Crit. Rev,Biochem.，第259-306頁中。
移除存在於起始抗原結合蛋白上之碳水化合物部分可以化學或酶促方式實現。化學脫除糖基化需要將蛋白質暴露於化合物三氟甲烷磺酸或等效化合物。此處理使得大多數或所有糖(除連接糖(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳胺糖)外)裂解，同時保留多肽完整性。Hakimuddin等人，1987,Arch. Biochem. Biophys. 259:52及Edge等人，1981,Anal. Biochem. 118:131描述化學脫除糖基化。如Thotakura等人，1987,Meth. Enzymol. 138:350所述，多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可藉由使用多種內切醣苷酶及外切醣苷酶來達成。如Duskin等人，1982,J. Biol. Chem. 257:3105所述，可藉由使用化合物衣黴素(tunicamycin)來防止潛在糖基化位點之糖基化。衣黴素阻斷蛋白質-N-醣苷鍵之形成。
因此，本發明態樣包括抗原結合蛋白之糖基化變異體，其中糖基化位點之數目及/或類型較之親本多肽之胺基酸序列已改變。在某些實施例中，抗體蛋白質變異體包含比原生抗體更大或更小數目之N連接糖基化位點。N連接糖基化位點特徵在於序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定為X之胺基酸殘基可為除脯胺酸外之任何胺基酸殘基。產生此序列之胺基酸殘基取代可為添加N連接碳水化合物鏈提供潛在新位點。或者，消除或改變此序列之取代將防止添加原生多肽中存在之N連接碳水化合物鏈。舉例而言，可藉由缺失Asn或藉由不同胺基酸取代Asn來減少糖基化。在其他實施例中，產生一或多個新N連接位點。抗體通常在Fc區具有N連接糖基化位點。
標記及效應基團
在一些實施例中，抗原結合包含一或多種標記。術語「標記基團」或「標記」意謂任何可偵測標記。適合之標記基團的實例包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核種(例如3H、14C、15N、35s、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光基團(例如FITC、羅丹明(rhodamine)、鑭系元素磷光體)、酶促基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基團，或由二級報導者(secondary reporter)識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)。在一些實施例中，使標記基團經由各種長度之間隔臂與抗原結合蛋白偶合以減小潛在位阻。標記蛋白質之各種方法在此項技術中已知且可適當地使用。
術語「效應基團」意謂充當細胞毒性劑之與抗原結合蛋白偶合之任何基團。適合效應基團的實例為放射性同位素或放射性核種(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)。其他適合基團包括毒素、治療基團或化學治療基團。適合基團的實例包括刺孢黴素(calicheamicin)、奧利斯坦汀(auristatins)、格爾德黴素(geldanamycin)及美登素(maytansine)。在一些實施例中，使效應基團經由各種長度之間隔臂與抗原結合蛋白偶合以減小潛在位阻。
一般而言，標記分為以下多個類別(視偵測其之檢定而定)：a)可為放射性或重同位素之同位素標記；b)磁性標記(例如磁性粒子)；c)氧化還原活性部分；d)光學染料；酶促基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；e)生物素標記之基團；及f)由二級報導者識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤等)。在一些實施例中，使標記基團經由各種長度之間隔臂與抗原結合蛋白偶合以減小潛在位阻。各種標記蛋白質之方法在此項技術中已知。
特異性標記包括光學染料，包括(但不限於)發色團、磷光體及螢光團，後者在許多情況下具有特異性。螢光團可為「小分子」螢光團或蛋白質螢光團。
「螢光標記」意謂可經由其固有螢光特性偵測之任何分子。適合之螢光標記包括(但不限於)螢光素、羅丹明、四甲基羅丹明、伊紅(eosin)、赤藻紅(erythrosin)、香豆素(coumarin)、甲基香豆素、芘、孔雀綠(Malacite green)、芪、螢光黃(Lucifer Yellow)、級聯藍J(Cascade BlueJ)、德克薩斯紅(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC紅640(LC Red 640)、Cy 5、Cy 5.5、(LC紅705)LC Red 705、俄勒岡綠(Oregon green)、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、級聯藍、級聯黃及R-藻紅素(R-phycoerythrin)(PE)(Molecular Probes,Eugene,OR)、FITC、羅丹明及德克薩斯紅(Pierce,Rockford,IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science,Pittsburgh,PA)。適合之光學染料(包括螢光團)描述於Richard P. Haugland之MOLECULAR PROBES HANDBOOR中，該文獻以引用的方式明確併入本文中。
適合之蛋白質螢光標記亦包括(但不限於)綠色螢光蛋白質，包括海腎(Renilla)、橘海筆(Ptilosarcus)或多管水母(Aequorea)物種之GFP(Chalfie等人，1994,Science 263:802-805)、EGFP(Clontech Labs.,Inc.,Genbank Accession Number U55762)、藍色螢光蛋白質(BFP,Quantum Biotechnologies,Inc.,Quebec,Canada;Stauber,1998,Biotechniques 24:462-471；Heim等人，1996,Curr. Biol. 6:178-182)、增強型黃色螢光蛋白質(EYFP,Clontech Labs.,Inc.)、螢光素酶(Ichiki等人，1993,J. Immunol. 150:5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人，1988,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607)及海腎(WO 92/15673、WO 95/07463、WO 98/14605、WO 98/26277、WO 99/49019，美國專利第5292658號、第5418155號、第5683888號、第5741668號、第5777079號、第5804387號、第5874304號、第5876995號、第5925558)。
編碼CGRP抗原結合蛋白之核酸序列
亦提供編碼本文所述之抗原結合蛋白或其一部分的核酸，包括編碼抗體或其片段、衍生物、突變蛋白或變異體的一或兩條鏈之核酸；編碼重鏈可變區或僅CDR之聚核苷酸；足以用作雜交探針、PCR引子或定序引子之聚核苷酸，以鑑別、分析、擴增編碼多肽之聚核苷酸或使編碼多肽之聚核苷酸突變；抑制聚核苷酸表現之反義核酸；及前述者之互補序列。核酸可為任何長度。其長度可為例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500或1,500個以上核苷酸，且/或可包含一或多種額外序列(例如調控序列)，且/或為較大核酸(例如載體)之一部分。核酸可為單股或雙股且可包含RNA及/或DNA核苷酸，及其人造變異體(例如肽核酸)。
表7展示編碼IgG2重鏈恆定區、κ輕鏈恆定區及λ hCL-1輕鏈恆定區之例示性核酸序列。本文所提供之任何可變區可與此等恆定區連接以形成全長重鏈及輕鏈序列。然而，應瞭解此等恆定區序列僅作為特定實例提供，熟習此項技術者可採用其他恆定區，包括IgG1重鏈恆定區、IgG3或IgG4重鏈恆定區、七個λ輕鏈恆定區(包括hCL-1、hCL-2、hCL-3及hCL-7)中之任一者；已針對改良之穩定性、表現、可製造性或其他所需特徵經修飾之恆定區，及其類似恆定區。在一些實施例中，可變區序列與此項技術中已知之其他恆定區序列接合。表8中提供編碼重鏈及輕鏈可變區之例示性核酸序列。
表8展示編碼重鏈及輕鏈可變區之例示性核酸序列，其中有不同CDRL1、CDRL2及CDRL3，或CDRH1、CDRH2及CDRH3序列嵌入。
表9展示編碼本文所揭示之例示性分離抗原結合蛋白(尤其hCGRP R結合蛋白)之全長重鏈及全長輕鏈以及重鏈可變區及輕鏈可變區之例示性核酸序列的SEQ ID NO。
編碼某些抗原結合蛋白或其一部分(例如全長抗體、重鏈或輕鏈、可變域或CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3)之核酸可自小鼠之B細胞中分離，該等小鼠已用CGRP R或其免疫原性組份免疫，例如用以下來免疫：全長CGRP R(包含CRLR與RAMP1)、CGRP R之細胞外域(包含CRLR及RAMP1之細胞外域)、表現CGRP R之全細胞、自表現CGRP R之細胞所製備的膜、融合蛋白(例如包含CRLR、RAMP1(或其細胞外域)與Fc融合之Fc融合物)，及此項技術中已知之其他方法，例如本文實例1-3中所述。可藉由諸如聚合酶鏈反應(PCR)之習知程序分離核酸。噬菌體呈現為已知技術之另一實例，藉此可製備抗體及其他抗原結合蛋白之衍生物。在一種方法中，作為相關抗原結合蛋白之組份的多肽係表現於任何適合之重組表現系統中，且允許所表現之多肽組裝以形成抗原結合蛋白分子。
表7-9中所提供之核酸僅具例示性。由於遺傳密碼子之簡幷性，因此表2-5中所列或本文中另外描繪之各多肽序列亦可由除所提供者外之大量其他核酸序列編碼。因此，一般技術者應瞭解本申請案針對編碼各抗原結合蛋白之各簡幷核苷酸序列提供的書面說明充分且可行。
一態樣進一步提供在特定雜交條件下與其他核酸(例如包含表7、表8、表9中所列之核苷酸序列及/或SEQ ID NO: 224-258之核酸)雜交之核酸。此項技術中已熟知核酸雜交之方法。參看例如Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley ＆ Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。如本文所定義，中度嚴格雜交條件係使用含有5×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、0.5% SDS、1.0 mM EDTA(pH 8.0)之預洗溶液，約50%甲醯胺、6×SSC之雜交緩衝液，及55℃之雜交溫度(或其他類似雜交溶液，諸如含有約50%甲醯胺之雜交溶液，42℃之雜交溫度)，及60℃、0.5×SSC、0.1% SDS之洗滌條件。嚴格雜交條件係在6×SSC中、在45℃下雜交，接著在68℃下、在0.1×SSC、0.2% SDS中洗滌一或多次。此外，熟習此項技術者可操縱雜交及/或洗滌條件以提高或降低雜交嚴格度，使得包含彼此至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致之核苷酸序列的核酸通常保持彼此雜交。
影響雜交條件選擇的基本參數及設計適合條件之規則描述於以下文獻中：例如Sambrook,Fritsch，及Maniatis(2001,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，見上；及Current Protocols in Molecular Biology,1995,Ausubel等人編，John Wiley ＆ Sons,Inc.，第2.10節及第6.3-6.4節)闡述，且可容易由一般技術者依據例如核酸之長度及/或鹼基組成來測定。
變化可藉由突變來引入核酸中，藉此使得其所編碼之多肽(例如抗體或抗體衍生物)之胺基酸序列產生變化。可使用此項技術中已知之任何技術來引入突變。在一實施例中，使用例如定點突變誘發方案來改變一或多個特定胺基酸殘基。在另一實施例中，使用例如隨機突變誘發方案來改變一或多個隨機選擇之殘基。無論以何方式產生變化，均可針對所需特性表現並篩檢突變體多肽。
可將突變引入核酸中而不顯著改變其所編碼之多肽的生物活性。舉例而言，進行核苷酸取代時可在非必需胺基酸殘基處發生胺基酸取代。或者，可將一或多個突變引入核酸中，從而選擇性改變其所編碼之多肽的生物活性。舉例而言，突變可定量或定性地改變生物活性。定量改變之實例包括提高、降低或消除活性。定性改變之實例包括改變抗體之抗原特異性。在一實施例中，可使用此項技術中已充分建立之分子生物學技術使編碼本文所述之任何抗原結合蛋白的核酸突變以改變胺基酸序列。
另一態樣提供適用作偵測核酸序列之引子或雜交探針的核酸分子。核酸分子可僅包含編碼全長多肽之核酸序列之一部分，例如可用作探針或引子的片段或編碼多肽之活性部分(例如CGRP R結合部分)的片段。
基於核酸序列之探針可用以偵測核酸或類似核酸，例如編碼多肽之轉錄物。探針可包含標記基團，例如放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔助因子。此等探針可用以鑑別表現多肽之細胞。
另一態樣提供載體，其包含編碼多肽或其一部分(例如含有一或多個CDR或一或多個可變區結構域之片段)之核酸。載體之實例包括(但不限於)質體、病毒載體、非游離型哺乳動物載體及表現載體，例如重組表現載體。重組表現載體可以適於在宿主細胞中表現核酸之形式包含核酸。重組表現載體包括一或多個基於欲用於表現之宿主細胞所選擇之調控序列，其可操作地連接至欲表現之核酸序列。調控序列包括導引核苷酸序列在許多類型宿主細胞中構成性表現之調控序列(例如SV40早期基因強化子、勞斯(Rous)肉瘤病毒啟動子及巨細胞病毒啟動子)、導引核苷酸序列僅在某些宿主細胞中表現之調控序列(例如組織特異性調控序列，參看Voss等人，1986,Trends Biochem. Sci. 11:287,Maniatis等人，1987,Science 236:1237，該等文獻係以全文引用的方式併入本文中)，及導引核苷酸序列之可誘導性表現作為對特定處理或條件之反應的調控序列(例如哺乳動物細胞中之金屬硫蛋白(metallothionin)啟動子，及原核與真核系統中之四環素反應性啟動子及/或鏈黴素(streptomycin)反應性啟動子(參看上文)。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計可視諸如待轉型之宿主細胞之選擇、所需蛋白質之表現量等因素而定。可將表現載體引入宿主細胞中以藉此產生由如本文所述之核酸編碼之蛋白質或肽，包括融合蛋白或肽。
另一態樣提供已引入重組表現載體之宿主細胞。宿主細胞可為任何原核細胞(例如大腸桿菌)或真核細胞(例如酵母、昆蟲，或哺乳動物細胞(例如CHO細胞))。可經由習知轉型或轉染技術將載體DNA引入原核或真核細胞中。穩定轉染哺乳動物細胞時，視所用表現載體及轉染技術而定，已知僅一小部分細胞可將外源DNA整合至其基因組中。為鑑別及選擇此等整合物(integrant)，通常將編碼可選標記(例如對抗生素具有抗性)之基因連同相關基因一起引入宿主細胞中。較佳可選標記包括賦予抗藥性之標記，諸如G418、潮黴素(hygromycin)及甲胺喋呤(methotrexate)。經所引入之核酸穩定轉染之細胞可藉由藥物選擇(例如已合併可選標記基因之細胞將存活，而其他細胞死亡)以及其他方法來鑑別。
製備抗原結合蛋白
所提供之非人類抗體可例如來源於產生抗體之任何動物，諸如小鼠、大鼠、兔、山羊、驢或非人類靈長類動物(諸如猴(例如獼猴或恆河猴)或猿(例如黑猩猩))。非人類抗體可用於例如活體外細胞培養及基於細胞培養之應用中，或對抗體之免疫反應不發生或可忽略、可預防、不受關注或合乎需要之任何其他應用中。在某些實施例中，可藉由使用此項技術中已知之方法使動物免疫來產生抗體，如上文中及/或下文實例1-3中所述。該等實例描述使用三種不同免疫原製劑來產生抗CGRP R抗體，該等製劑為(i)表現CGRP R之兩種主要組份(RAMP1及CRLR)之全長型式的全細胞；(ii)來自此等細胞之膜提取物；及(iii)藉由共表現及純化CRLR及RAMP1之N端細胞外域所得之可溶性CGRP R。抗體可為多株、單株抗體，或可在宿主細胞中藉由表現重組DNA來合成。完全人類抗體可如上所述藉由使含有人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物免疫或藉由選擇表現人類抗體譜之噬菌體呈現文庫來製備。
單株抗體(mAb)可藉由多種技術製得，包括習知單株抗體方法，例如Kohler及Milstein,1975,Nature 256:495之標準體細胞雜交技術。或者，可採用產生單株抗體之其他技術，例如B淋巴細胞之病毒或致癌轉型。一種適用於製備融合瘤之動物系統為鼠類系統，其為已充分建立之程序。免疫方案及分離用於融合之經免疫脾細胞的技術在此項技術中已為人所知且在下文實例中描述說明性方法。對於此等程序，通常使來自免疫小鼠之B細胞與適合之永生化融合搭配物(諸如鼠類骨髓瘤細胞株)融合。此外，必要時，可使大鼠或其他哺乳動物免疫以代替小鼠，且可使來自此等動物之B細胞與鼠類骨髓瘤細胞株融合以形成融合瘤。或者，可使用來自除小鼠外之來源的骨髓瘤細胞株。產生融合瘤之融合程序亦熟知。
所提供之單鏈抗體可藉由使重鏈與輕鏈可變域(Fv區)片段經由胺基酸橋(短肽連接子)連接、產生單一多肽鏈來形成。此等單鏈Fv(scFv)可藉由編碼兩個可變域多肽(VL及VH)之DNA之間經編碼肽連接子之DNA融合來製備。視在兩個可變域之間肉性連接子之長度而定，所得多肽可自身折回以形成抗原結合單體，或其可形成多聚物(例如二聚物、三聚物或四聚物)(Kortt等人，1997,Prot. Eng. 10:423；Kortt等人，2001,Biomol. Eng. 18:95-108)。藉由組合包含不同VL及VH之多肽，可形成結合不同抗原決定基之多聚scFv(Kriangkum等人，2001,Biomol. Eng. 18:31-40)。為產生單鏈抗體所開發之技術包括以下文獻中所述之技術：美國專利第4,946,778號；Bird,Science 242: 423；Huston等人，1988,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5879；Ward等人，Nature 334:544,de Graaf等人，2002,Methods Mol Biol . 178：379-387。來源於本文所提供之抗體的單鏈抗體包括(但不限於)包含以下之scFv：表3中所描繪之重鏈與輕鏈可變區之可變域組合，或包括表4A及4B中所描繪之CDR的輕鏈與重鏈可變域之組合。
本文所提供之屬於一個亞類的抗體可使用亞類轉換法轉變為不同亞類之抗體。因此，舉例而言，IgG抗體可來源於IgM抗體，且反之亦然。此等技術可製備新穎抗體，其不僅具有指定抗體(親本抗體)之抗原結合特性，而且展現與抗體同型或亞類相關之生物特性，此等生物特性不同於親本抗體之生物特性。可採用重組DNA技術。此等程序中可使用編碼特定抗體多肽之經選殖DNA，例如編碼所需同型之抗體之恆定域的DNA。參看例如Lantto等人，2002,Methods Mol. Biol . 178:303-316。
因此，所提供之抗體包括含有例如上述可變域組合、具有所需同型(例如IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE及IgD)之抗體，以及其Fab或F(ab')2片段。此外，若需要IgG4，則亦可能需要在鉸鏈區引入點突變(CPSCP→CPPCP)(如Bloom等人，1997,Protein Science 6:407中所述，該文獻以引用的方式併入本文中)以減緩形成重鏈內雙硫鍵之趨勢，重鏈內雙硫鍵會引起IgG4抗體之非均質。
此外，亦已知衍生具有不同特性(亦即針對其所結合之抗原的不同親和力)之抗體的技術。一種此技術(稱作鏈改組)包括在絲狀噬菌體表面上呈現免疫球蛋白可變域基因譜，通常稱作噬菌體呈現。如Marks等人，1992,BioTechnology 10 :779所述，鏈改組已用以製備針對半抗原2-苯基噁唑-5-酮之高親和力抗體。
可對表3中所述之重鏈及輕鏈可變區，或表4A及4B中所述之CDR進行保守性修飾(及對編碼核酸進行相應修飾)以產生具有某些所需功能性及生物化學特徵之CGRP R結合蛋白。達成此等修飾之方法已描述於上文中。
可以多種方式進一步修飾CGRP抗原結合蛋白。舉例而言，若其欲用於治療目的，則其可與聚乙二醇結合(聚乙二醇化)以延長血清半衰期或增強蛋白質傳遞。或者，本發明抗體或其片段之V區可與不同抗體分子之Fc區融合。用於此目的之Fc區可經修飾以使其不結合補體，從而當將融合蛋白用作治療劑時可降低誘導患者細胞溶解之可能性。另外，本發明抗體或其功能片段可與人類血清白蛋白結合以增強抗體或其抗原結合片段之血清半衰期。抗原結合蛋白或其片段之另一適用融合搭配物為運甲狀腺素蛋白(TTR)。TTR具有形成四聚物之能力，因此抗體-TTR融合蛋白可形成多價抗體，從而可提高其結合親和力。
或者，本文所述之抗原結合蛋白的功能特徵及/或生物化學特徵之實質性修飾可如下達成：在重鏈及輕鏈的胺基酸序列中產生具有以下顯著不同作用的取代：維持(a)取代區域內分子主鏈之結構，例如呈摺疊或螺旋構形，(b)分子在靶點處之電荷或疏水性，或(c)側鏈之蓬鬆性。「保守性胺基酸取代」可包括原生胺基酸殘基經對該位置之胺基酸殘基之極性或電荷具有極少或無影響的非原生殘基取代。參看前述表4。此外，如先前已針對丙胺酸掃描突變誘發所述，多肽中之任何原生殘基亦可經丙胺酸取代。
本發明抗體之胺基酸取代(不論保守性還是非保守性)可由熟習此項技術者藉由應用常規技術來實施。胺基酸取代可用以鑑別本文所提供之抗體的重要殘基，或提高或降低此等抗體對人類CGRP R之親和力或調節本文所述之其他抗原結合蛋白之結合親和力。
表現抗原結合蛋白之方法
本文亦提供呈質體、表現載體、轉錄或表現卡匣(包含至少一種如上所述之聚核苷酸)形式之表現系統及構築體，以及包含此等表現系統或構築體之宿主細胞。
本文所提供之抗原結合蛋白可藉由許多習知技術中任一者來製備。舉例而言，可藉由重組表現系統，使用此項技術中已知之任何技術製得CGRP R抗原結合蛋白。參看例如Monoclonal Antibodies,Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses,Kennet等人(編)，Plenum Press,New York(1980)；及Antibodies: A Laboratory Manual,Harlow及Lane(編)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)。
抗原結合蛋白可表現於融合瘤細胞株(例如抗體尤其可表現於融合瘤中)或除融合瘤外之細胞株中。編碼抗體之表現構築體可用以使哺乳動物、昆蟲或微生物宿主細胞轉型。可使用將聚核苷酸引入宿主細胞中之任何已知方法進行轉型，該已知方法包括例如將聚核苷酸封裝於病毒或噬菌體中且以構築體，藉由此項技術中已知之轉染程序(如美國專利第4,399,216號；第4,912,040號；第4,740,461號；第4,959,455號所例示)來轉導宿主細胞。所採用之最佳轉型程序將視所轉型之宿主細胞類型而定。將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法在此項技術中已熟知且包括(但不限於)聚葡萄糖介導轉染、磷酸鈣沈澱、凝聚胺(polybrene)介導轉染、原生質體融合、電穿孔、囊封聚核苷酸於脂質體中、混合核酸與帶正電之脂質，及將DNA直接微注射於核中。
重組表現構築體通常包含編碼多肽的核酸分子，該多肽包含一或多個以下者：一或多個如本文提供之CDR；輕鏈恆定區；輕鏈可變區；重鏈恆定區(例如CH1、CH2及/或CH3)；及/或CGRP R抗原結合蛋白之另一骨架部分。此等核酸序列係使用標準接合技術插入適當表現載體中。在一實施例中，使重鏈或輕鏈恆定區附接於抗CGRP R特異性重鏈或輕鏈可變區之C端且接合至表現載體中。通常選擇在所用特定宿主細胞中具功能性的載體(亦即載體與宿主細胞機構相容，允許發生基因擴增及/或表現)。在一些實施例中，所用載體係採用使用報導蛋白(二氫葉酸還原酶)之蛋白質片段互補檢定(參看例如美國專利第6,270,964號，該專利以引用的方式併入本文中)。適合表現載體可購自例如Invitrogen Life Technologies或BD Biosciences(前身為「Clontech」)。選殖及表現抗體及片段之其他適用載體包括Bianchi及McGrew,2003,Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84:439-44(該文獻以引用的方式併入本文中)中所述之載體。其他適合表現載體論述於例如Methods Enzymol.，第185卷(D. V. Goeddel編)，1990,New York: Academic Press中。
用於任一宿主細胞中之表現載體通常含有用於質體維持，及選殖及表現外源核苷酸序列之序列。此等序列(統稱「側接序列」)在某些實施例中通常包括一或多個以下核苷酸序列：啟動子、一或多個強化子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供體及受體剪接位點之完整內含子序列、編碼用於多肽分泌之前導序列的序列、核糖體結合位點、聚腺苷酸化序列、供插入編碼待表現多肽之核酸的多連接子區域，及可選標記元件。下文討論此等各序列。
載體視情況可含有「標籤」編碼序列，亦即位於CGRP R結合蛋白編碼序列之5'或3'端的寡核苷酸分子；寡核苷酸序列編碼多His(諸如6His)，或另一「標籤」，諸如、HA(血球凝集素流感病毒)或myc，針對其之抗體可在市面上購得。此標籤通常在多肽表現後與多肽融合，且可充當供親和力純化或偵測來自宿主細胞之CGRP R結合蛋白之方式。親和力純化可例如藉由管柱層析，使用針對標籤之抗體作為親和基質來實現。視情況可隨後藉由各種方式(諸如使用供裂解用的某些肽酶)自純化之CGRP R結合蛋白移除標籤。
側接序列可為同源(亦即來自與宿主細胞相同的物種及/或細胞株)、異源(亦即來自除宿主細胞物種或細胞株外之物種)、雜交(亦即來自一種以上來源之側接序列的組合)、合成或原生的。因此，側接序列之來源可為任何原核或真核生物體、任何脊椎動物或無脊椎動物生物體，或任何植物，限制條件為側接序列在宿主細胞機構中具功能性且可由宿主細胞機構活化。
適用於載體之側接序列可藉由此項技術中熟知之若干方法中任一者獲得。本文中適用之側接序列通常已預先藉由基因定位及/或藉由限制性核酸內切酶消化加以鑑別，且因此可使用適當限制性核酸內切酶自適當組織來源分離。側接序列之全長核苷酸序列有時候可能已知。在本文中，側接序列可使用本文所述之核酸合成或選殖方法合成。
無論側接序列之全部或僅一部分是否已知，其均可使用聚合酶鏈反應(PCR)及/或藉由適合探針(諸如來自相同或另一物種之寡核苷酸及/或側接序列片段)篩檢基因組文庫來獲得。當側接序列未知時，可自含有例如編碼序列或甚至另一個或多個基因之一大段DNA中分離含有側接序列之DNA片段。分離可如下實現：限制性核酸內切酶消化以產生適當DNA片段，接著使用瓊脂糖凝膠純化(管柱層析(Chatsworth,CA))加以分離，或藉由熟習此項技術者已知之其他方法實現分離。實現此目的之適合酶之選擇對於一般技術者顯而易知。
複製起點通常為可市購之彼等原核表現載體之一部分，且起點有助於宿主細胞中載體之擴增。若所選載體不含有複製起點，則可依據已知序列進行化學合成，且接合至載體中。舉例而言，來自質體pBR322(New England Biolabs,Beverly,MA)之複製起點適於大多數革蘭氏陰性(gram-negative)細菌，且各種病毒起點(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitus virus，VSV)，或諸如HPV或BPV之乳頭狀瘤病毒)適用於在哺乳動物細胞中選殖載體。一般而言，哺乳動物表現載體不需要複製組份起點(例如通常僅使用SV40起點，因為SV40起點亦含有病毒早期啟動子)。
轉錄終止序列通常位於多肽編碼區之末端的3'且用以終止轉錄。原核細胞中之轉錄終止序列通常為富G-C片段，接著為多T序列。儘管該序列容易自文庫選殖或甚至可作為載體之一部分市購，但其亦可使用核酸合成方法(諸如本文所述方法)容易地合成。
可選標記基因編碼對選擇性培養基中生長之宿主細胞的存活及成長必需之蛋白質。典型之選擇標記基因編碼的蛋白質：(a)賦予原核宿主細胞針對抗生素或其他毒素(例如安比西林(ampicillin)、四環素(tetracycline)或康黴素(kanamycin))之抗性；(b)補充細胞之營養缺陷；或(c)供應複合或合成培養基(defined media)不可得之關鍵營養素。特異性可選標記為抗康黴素基因、抗安比西林基因及抗四環素基因。抗新黴素基因亦宜用於在原核與真核宿主細胞中選擇。
其他可選基因可用以擴增將表現之基因。擴增為基因在繼代之重組細胞之染色體內連續複製的過程，該等基因係生長或細胞存活關鍵之蛋白質之產生所必需。哺乳動物細胞之適合可選標記之實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)及無啟動子胸苷激酶基因。將哺乳動物細胞轉型體置於選擇壓力下，其中僅轉型體因載體中存在可選基因而獨經調適以存活。藉由在連續提高選擇劑於培養基中之濃度的條件下培養所轉型之細胞來施加選擇壓力，藉此使得可選基因與編碼另一基因(諸如結合CGRP R之抗原結合蛋白)之DNA均擴增。從而自所擴增之DNA合成更多量之多肽(諸如抗原結合蛋白)。
核糖體結合位點通常為mRNA之轉譯起始所必需且特徵在於Shine-Dalgarno序列(原核細胞)或Kozak序列(真核細胞)。該元件通常位於啟動子之3'及待表現之多肽之編碼序列的5'。
在一些情況下，諸如當需要在真核宿主細胞表現系統中糖基化時，可操縱各種前序列或原序列以改良糖基化或產量。舉例而言，可改變特定信號肽之肽酶裂解位點，或添加亦可影響糖基化的原序列。最終蛋白質產物可在-1位置(相對於成熟蛋白質之第一胺基酸)具有一或多個可能尚未完全移除之易於表現之其他胺基酸。舉例而言，最終蛋白質產物可具有一或兩個存在於肽酶裂解位點之胺基酸殘基與胺基端連接。或者，若酶在成熟多肽內之此區域切割，則有些酶裂解位點之使用會產生略微截斷形式之所需多肽。
表現及選殖通常含有可由宿主生物體識別且可操作地連接至編碼CGRP R結合蛋白之分子的啟動子。啟動子為位於結構基因起始密碼子上游(亦即5')、控制結構基因轉錄的未轉錄序列(通常在約100 bp至1000 bp內)。啟動子習知歸為兩類之一：可誘導性啟動子及構成性啟動子。作為對培養條件之某些變化(諸如存在或不存在營養素或溫度變化)之反應，可誘導性啟動子啟動DNA在其控制下大量轉錄。另一方面，構成性啟動子均一地轉錄其可操作連接之基因，亦即極少或不控制基因表現。可由多種潛在宿主細胞識別之大量啟動子已熟知。適合啟動子如下可操作地連接至編碼構成CGRP R結合蛋白之重鏈或輕鏈的DNA：藉由限制酶消化自源DNA移除啟動子且將所需啟動子序列插入載體中。
適用於酵母宿主之啟動子在此項技術中亦已熟知。酵母強化子宜與酵母啟動子一起使用。適用於哺乳動物宿主細胞之啟動子已熟知且包括(但不限於)獲自病毒基因組的啟動子，該等病毒諸如多形瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猴病毒40(SV40))。其他適合哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如熱休克啟動子及肌動蛋白啟動子。
可能受關注之其他啟動子包括(但不限於)SV40早期啟動子(Benoist及Chambon,1981,Nature 290:304-310)；CMV promoter(Thornsen等人，1984,Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663)；勞斯肉瘤病毒之3'長末端重複中所含之啟動子(Yamamoto等人，1980，Cell 22:787-797)；疱疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人，1981,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445)；金屬硫蛋白基因之啟動子及調控序列(Prinster等人，1982,Nature 296:39-42)；及原核啟動子，諸如β-內醯胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等人，1978,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731)；或tac啟動子(DeBoer等人，1983,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25)。展現組織特異性且已用於轉殖基因動物中之以下動物轉錄控制區亦受關注：在胰腺泡細胞中具活性之第1型彈性蛋白酶基因控制區(Swift等人，1984,Cell 38:639-646；Ornitz等人，1986,Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409；MacDonald,1987,Hepatology 7:425-515)；在胰β-細胞中具活性之胰島素基因控制區(Hanahan,1985,Nature 315:115-122)；在淋巴樣細胞中具活性之免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等人，1984,Cell 38:647-658；Adames等人，1985,Nature 318:533-538；Alexander等人，1987,Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)；在睾丸、乳房、淋巴及肥大細胞中具活性之小鼠乳腺瘤病毒控制區(Leder等人，1986,Cell 45:485-495)；在肝中具活性之白蛋白基因控制區(Pinkert等人，1987,Genes and Devel. 1:268-276)；在肝中具活性之α-胎蛋白基因控制區(Krumlauf等人，1985,Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648；Hammer等人，1987,Science 253:53-58)；在肝中具活性之α1-抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等人，1987,Genes and Devel. 1:161-171)；在骨髓細胞中具活性之β-血球蛋白基因控制區(Mogram等人，1985,Nature 315:338-340；Kollias等人，1986,Cell 46:89-94)；在腦寡樹突神經膠質細胞中具活性之髓鞘鹼性蛋白基因控制區(Readhead等人，1987,Cell 48:703-712)；在骨骼肌中具活性之肌凝蛋白輕鏈-2基因控制區(Sani,1985,Nature 314:283-286)；及在下視丘中具活性之促性腺釋放激素基因控制區(Mason等人，1986,Science 234:1372-1378)。
可將強化子序列插入載體中以增強高等真核細胞對編碼構成人類CGRP R結合蛋白之輕鏈或重鏈之DNA的轉錄。強化子為DNA之順式作用元件，長度通常約10-300 bp，其作用於啟動子以增強轉錄。強化子之取向及位置相對獨立，已發現其位於轉錄單元之5'與3'。已知可自哺乳動物基因獲得多種強化子序列(例如血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)。然而通常使用來自病毒之強化子。此項技術中已知之SV40強化子、巨細胞病毒早期啟動子強化子、多瘤強化子及腺病毒強化子為活化真核啟動子之例示性增強元件。儘管強化子可位於載體中編碼序列之5'或3'，但其通常位於自啟動子之5'位點。編碼適當原生或異源信號序列(前導序列或信號肽)之序列可併入表現載體中以促進抗體之細胞外分泌。信號肽或前導序列之選擇視產生抗體之宿主細胞的類型而定，且異源信號序列可置換原生信號序列。在哺乳動物宿主細胞中具功能性之信號肽的實例包括以下：美國專利第4,965,195號中所述之介白素-7(IL-7)之信號序列；Cosman等人，1984,Nature 312:768中所述之介白素-2受體之信號序列；歐洲專利第0367 566號中所述之介白素-4受體信號肽；美國專利第4,968,607號中所述之第I型介白素-1受體信號肽；歐洲專利第0 460 846號中所述之第II型介白素-1受體信號肽。
所提供之表現載體可自諸如市售載體之起始載體建構。此等載體可能或可能不含有所需全部側接序列。當一或多個如本文所述之側接序列已不存在於載體中時，其可個別地獲得且接合至載體中。熟習此項技術者已熟知獲得各側接序列所用之方法。
在已建構載體且已將編碼輕鏈、重鏈或包含CGRP R抗原結合序列之輕鏈及重鏈的核酸分子插入載體之適當位點後，可將完成之載體插入適合宿主細胞中以便擴增及/或多肽表現。可藉由熟知方法實現抗原結合蛋白之表現載體於所選宿主細胞中之轉型，熟知方法包括轉染、感染、磷酸鈣共沈澱、電穿孔、微注射、脂質體轉染、DEAE-聚葡萄糖介導轉染或其他已知技術。所選方法將部分地隨待用宿主細胞之類型而變。此等方法及其他適合方法為熟習此項技術者所熟知，且闡述於例如Sambrook等人，2001，見上中。
宿主細胞當在適當條件下培養時合成抗原結合蛋白，其可隨後自培養基(若宿主細胞將其分泌至培養基中)或直接自產生其之宿主細胞(若其未分泌)收集。選擇適當宿主細胞將視各種因素而定，該等因素諸如所需表現量、活性所需或必需之多肽修飾(諸如糖基化或磷酸化)，及易摺疊為生物學活性分子。
可作為宿主用於表現的哺乳動物細胞株在此項技術中已熟知且包括(但不限於)可獲自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)之永生化細胞株，其包括(但不限於)中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞、海拉細胞(HeLa cell)、幼倉鼠腎臟(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)及許多其他細胞株。在某些實施例中，可經由測定哪些細胞株具有高表現量且構成性地產生具有CGRP R結合特性之抗原結合蛋白來選擇細胞株。在另一實施例中，可選擇B細胞系之細胞株，其不產生其自身抗體，但具有產生及分泌異源抗體之能力。
人類CGRP抗原結合蛋白用於診斷及治療目的之用途
抗原結合蛋白適用於偵測生物樣本中之CGRP R及鑑別產生CGRP R之細胞或組織。舉例而言，CGRP R抗原結合蛋白可用於診斷檢定(例如結合檢定)中以偵測及/或定量表現於組織或細胞中之CGRP R。可特異性結合CGRP R之抗原結合蛋白亦可用於治療有需要之患者的CGRP R相關疾病。另外，CGRP R抗原結合蛋白可用以抑制CGRP R與其配位體CGRP形成複合物，藉此調節細胞或組織中CGRP R之生物活性。可調節之活性之實例包括(但不限於)抑制血管擴張及/或減少神經性發炎。可結合CGRP R之抗原結合蛋白因此可調節及/或阻斷與其他結合化合物之相互作用且因此可治療性地用於改善CGRP R相關疾病。
適應症
與人類CGRP R相關之疾病或病狀包括患者發病至少部分地由CGRP R與其配位體CGRP相互作用所引起之任何疾病或病狀。CGRP R與CGRP之相互作用亦可提高或降低疾病或病狀之嚴重度。可用本文所述之抗原結合蛋白治療的疾病及病狀之實例包括頭痛，諸如叢集性頭痛、偏頭痛，包括偏頭痛性頭痛；慢性疼痛；第II型糖尿病；發炎，例如神經性發炎；心血管病症；及與內毒血症及敗血症相關之血液動力學紊亂。
詳言之，本文所述之抗原結合蛋白可作為偏頭痛已開始發作後開始之急性治療用以治療偏頭痛，及/或作為預防性投與治療(例如每日一次、每週一次、兩週一次、每月一次、兩月一次、一年兩次等)用以預防或降低與偏頭痛發作相關之症狀(例如疼痛症狀)之頻率及/或嚴重度。
診斷方法
本文所述之抗原結合蛋白可用於診斷目的以偵測、診斷或監測與CGRP R相關之疾病及/或病狀。亦提供使用熟習此項技術者已知之經典免疫組織法偵測樣本中CGRP R之存在的方法(例如Tijssen,1993,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays，第15卷(R.H. Burdon及P.H. van Knippenberg編，Elsevier, Amsterdam)；Zola, 1987,Monoclonal Antibodies： A Manual of Techniques，第147-158頁(CRC Press,Inc.)；Jalkanen等人，1985,J. Cell. Biol. 101:976-985；Jalkanen等人，1987,J. Cell Biol. 105:3087-3096)。可在活體內或活體外進行CGRP R偵測。
本文所提供之診斷應用包括使用抗原結合蛋白偵測CGRP R表現及配位體與CGRP R之結合。適用於偵測CGRP R存在之方法的實例包括免疫檢定(諸如酶聯免疫吸附檢定(ELISA))及放射免疫檢定(RIA)。
對於診斷應用，抗原結合蛋白通常將以可偵測標記基團標記。適合之標記基團包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核種(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光基團(例如FITC、羅丹明、鑭系元素磷光體)、酶促基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基，或由二級報導者識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)。在一些實施例中，使標記基團經由各種長度之間隔臂與抗原結合蛋白偶合以減小潛在位阻。標記蛋白質之各種方法在此項技術中已為人所知且可使用。
在另一態樣中，抗原結合蛋白可用以鑑別表現CGRP R之細胞。在一特定實施例中，抗原結合蛋白係以標記基團標記且偵測所標記之抗原結合蛋白與CGRP R之結合。在另一特定實施例中，活體內偵測抗原結合蛋白與CGRP R之結合。在另一特定實施例中，使用此項技術中已知之技術分離及量測CGRP R抗原結合蛋白。參看例如Harlow及Lane,1988,Antibodies: A Laboratory Manual,New York: Cold Spring Harbor(1991年版及週期性增刊)；John E. Coligan編，1993,Current Protocols In Immunology New York: John Wiley ＆ Sons。
另一態樣提供偵測與所提供之抗原結合蛋白競爭結合CGRP R的測試分子之存在。一種此檢定之實例包括在測試分子存在或不存在下偵測含有一定量CGRP R之溶液中之游離抗原結合蛋白之量。游離抗原結合蛋白(亦即不與CGRP R結合之抗原結合蛋白)之量提高將表明測試分子能夠與抗原結合蛋白競爭結合CGRP R。在一實施例中，以標記基團標記抗原結合蛋白。或者，標記測試分子且在抗原結合蛋白存在及不存在下監測游離測試分子之量。
治療方法：醫藥調配物、投藥途徑
亦提供使用抗原結合蛋白之方法。在一些方法中，向患者提供抗原結合蛋白。抗原結合蛋白抑制CGRP與人類CGRP R結合。
亦提供醫藥組合物，其包含治療有效量之一或多種抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。另外，包括藉由投與此醫藥組合物治療患者(例如偏頭痛)之方法。術語「患者」包括人類患者。
可接受之調配物質在所用劑量及濃度下對接受者無毒性。在特定實施例中，提供包含治療有效量之人類CGRP R抗原結合蛋白之醫藥組合物。
在某些實施例中，可接受之調配物質在所用劑量及濃度下較佳對接受者無毒性。在某些實施例中，醫藥組合物可含有供調節、維持或保持例如組合物之pH值、容積滲透濃度、黏度、透明度、顏色、等張性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸附性或通透性之調配物質。在此等實施例中，適合調配物質包括(但不限於)胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸)；抗微生物劑；抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝劑(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)；增積劑(諸如甘露糖醇或甘胺酸)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))；錯合劑(諸如咖啡鹼、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)；填充劑；單醣；二醣；及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑、調味劑及稀釋劑；乳化劑；親水聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮)；低分子量多肽；形成鹽之相對離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如氯化苯甲烴銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞(thimerosal)、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)；懸浮劑；界面活性劑或濕潤劑(諸如氧化異丙烯(pluronics)、PEG、脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(諸如聚山梨醇酯20)、聚山梨醇酯、特瑞通(triton)、緩血酸胺、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；穩定性增強劑(諸如蔗糖或山梨糖醇)；張力增強劑(諸如鹼金屬鹵化物，較佳為氯化鈉或氯化鉀、甘露糖醇、山梨糖醇)；傳遞媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或醫藥佐劑。參看REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，(A.R. Genrmo編)，1990,Mack Publishing Company。
在某些實施例中，最佳醫藥組合物將由熟習此項技術者視例如預定投與途徑、傳遞形式及所需劑量而決定。參看例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，見上。在某些實施例中，此等組合物可影響所揭示之抗原結合蛋白的物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。在某些實施例中，醫藥組合物中之主要媒劑或載體本質上可為水性或非水性。舉例而言，適合媒劑或載劑可為可能補充有供非經腸投與之組合物中常見之其他物質的注射用水、生理鹽水溶液或人造腦脊液。中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合之鹽水為其他例示性媒劑。在特定實施例中，醫藥組合物包含pH值約7.0-8.5之Tris緩衝液，或pH值約4.0-5.5之乙酸鹽緩衝液，且可進一步包括山梨糖醇或適合替代物。在某些實施例中，人類CGRP R抗原結合蛋白組合物可藉由將具有所需純度之所選組合物與可選調配劑(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，見上)混合製備為凍乾餅或水溶液之形式以便儲存。此外，在某些實施例中，人類CGRP R抗原結合蛋白可使用諸如蔗糖之適當賦形劑調配為凍乾產物(lyopbilizate)。
可選擇非經腸傳遞之醫藥組合物。或者，可選擇吸入或經由消化道(諸如經口)傳遞之組合物。製備此等醫藥學上可接受之組合物屬於此項技術之技能範圍內。
調配物組份較佳以投與部位可接受之濃度存在。在某些實施例中，緩衝液係用以使組合物維持在生理學pH值或略微較低pH值，通常在約5至約8之pH範圍內。
當考慮非經腸投與時，治療組合物可呈無熱原質、非經腸可接受之水溶液(包含所需人類CGRP R結合蛋白於醫藥學上可接受之媒劑中)形式提供。尤其適於非經腸注射之媒劑為無菌蒸餾水，其中人類CGRP R抗原結合蛋白係調配為經適當防腐之無菌等張溶液。在某些實施例中，製備可包括用諸如可注射微球體、生物易蝕性粒子、聚合化合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體之試劑調配所需分子，從而可提供產物的控制釋放或持續釋放，該產物可經由儲槽式注射傳遞。在某些實施例中，亦可使用玻尿酸，玻尿酸具有促進持久持續循環之作用。在某些實施例中，可植入藥物傳遞裝置可用以引入所需抗原結合蛋白。
某些醫藥組合物經調配可供吸入。在一些實施例中，人類CGRP R抗原結合蛋白係調配為乾燥可吸入散劑。在特定實施例中，人類CGRP R抗原結合蛋白吸入溶液亦可用推進劑調配以用於氣溶膠傳遞。在某些實施例中，溶液可霧化。因此經肺投與及調配方法進一步描述於國際專利申請案第PCT/US94/001875號中，該案係以引用的方式併入本文中且描述經化學修飾之蛋白質的經肺傳遞。一些調配物可經口投與。以此方式投與之人類CGRP R抗原結合蛋白可用或不用固體劑型(諸如錠劑及膠囊)混配中常用之載劑加以調配。在某些實施例中，膠囊可設計為在某個時點釋放調配物之活性部分於胃腸道內，此時生物可用性最大化且全身前降解最小化。可包括促進人類CGRP R抗原結合蛋白吸收的其他試劑。亦可採用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑及黏合劑。
一些醫藥組合物包含有效量之一或多種人類CGRP R抗原結合蛋白與適於製造錠劑之無毒性賦形劑混合。藉由溶解錠劑於無菌水或另一種適當媒劑中，可製備呈單位劑量形式之溶液。適合之賦形劑包括(但不限於)惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或黏合劑，諸如澱粉、明膠或阿拉伯膠(acacia)；或潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
熟習此項技術者顯而易知其他醫藥組合物，包括調配物，包括含有人類CGRP R抗原結合蛋白之持續傳遞或控制傳遞調配物。熟習此項技術者亦已知調配多種其他持續傳遞或控制傳遞方式(諸如脂質體載劑、生物易蝕性微粒或多孔珠粒及儲槽式注射劑)之技術。參看例如國際專利申請案第PCT/US93/00829號，其係以引用的方式併入本文中且描述供傳遞醫藥組合物之多孔聚合微粒之控制釋放。持續釋放製劑可包括呈成形物品(例如膜或微囊)形式之半滲透聚合物基質。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚乳酸交酯(如美國專利第3,773,919號及歐洲專利申請公開案第EP 058481號中所揭示，各案係以引用的方式併入本文中)、L-麩胺酸與γ-L-麩胺酸乙酯之共聚物(Sidman等人，1983,Biopolymers 2:547-556)、聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)(Langer等人，1981,J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277及Langer,1982,Chem. Tech. 12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，1981，見上)或聚-D(-)-3-羥丁酸(歐洲專利申請公開案第EP 133,988號)。持續釋放組合物亦可包括可藉由此項技術中已知之若干方法中之任一者所製備之脂質體。參看例如Eppstein等人，1985,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692；歐洲專利申請公開案第EP 036,676號；第EP 088,046號及第EP 143,949號，該等文獻以引用的方式併入本文中。
用於活體內投與之醫藥組合物通常呈無菌製劑形式提供。可經由無菌過濾膜過濾實現滅菌。凍乾組合物時，可在凍乾及復原之前或之後使用此方法進行滅菌。供非經腸投與之組合物可呈凍乾形式或溶液形式儲存。一般將非經腸組合物置於具有無菌接取孔之容器(例如具有皮下注射針可刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)中。
在某些實施例中，將表現如本文揭示之重組抗原結合蛋白的細胞囊封以便傳遞(參看Invest. Ophthalmol Vis Sci 43:3292-3298，2002及Proc. Natl. Acad. Sciences 103:3896-3901,2006)。
在某些調配物中，抗原結合蛋白具有至少10 mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml、40 mg/ml、50 mg/ml、60 mg/ml、70 mg/ml、80 mg/ml、90 mg/ml、100 mg/ml或150 mg/ml之濃度。一些調配物含有緩衝液、蔗糖及聚山梨醇酯。調配物之一實例為含有50-100 mg/ml抗原結合蛋白、5-20 mM乙酸鈉、5-10% w/v蔗糖及0.002-0.008% w/v聚山梨醇酯之調配物。某些調配物例如於9-11 mM乙酸鈉緩衝液、8-10% w/v蔗糖及0.005-0.006% w/v聚山梨醇酯中含有65-75 mg/ml抗原結合蛋白。某些此等調配物之pH值係在4.5-6之範圍內。其他調配物具有5.0-5.5之pH值(例如5.0、5.2或5.4之pH值)。
在已調配醫藥組合物後，可將其以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、晶體或經脫水或凍乾之粉末形式儲存於無菌小瓶中。此等調配物可以即用形式或在投與之前復原之形式(例如凍乾形式)儲存。亦提供產生單次劑量投與單元之套組。某些套組含有具有乾燥蛋白質之第一容器及具有水性調配物之第二容器。在某些實施例中，提供含有單室及多室預填充注射器(例如液體注射器及溶解型注射器(lyosyringe))之套組。欲使用之含人類CGRP R抗原結合蛋白之醫藥組合物的治療有效量將視例如治療情形及目標而定。熟習此項技術者應瞭解治療之適當劑量將部分地視所傳遞之分子、使用人類CGRP R抗原結合蛋白所針對之適應症、投與途徑及患者之尺寸(體重、體表或器官尺寸)及/或狀況(年齡及一般健康狀況)而改變。在某些實施例中，臨床醫師可滴定劑量且調整投與途徑以獲得最佳治療效果。
視上述因素而定，典型劑量範圍可為約1 μg/kg至約30 mg/kg或30 mg/kg以上。在特定實施例中，劑量範圍可為10 μg/kg至約30 mg/kg，視情況可為0.1 mg/kg至約30 mg/kg，或者0.3 mg/kg至約20 mg/kg。在一些應用中，劑量為0.5 mg/kg至20 mg/kg。有時候抗原結合蛋白係以0.3 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg或20 mg/kg給藥。一些治療方案中之劑量時程為0.3 mg/kg qW、0.5 mg/kg qW、1 mg/kg qW、3 mg/kg qW、10 mg/kg qW或20 mg/kg qW之劑量。
給藥頻率將視所用調配物中特定人類CGRP R抗原結合蛋白之藥物動力學參數而定。臨床醫師通常投與組合物直至達到實現所需作用之劑量為止。組合物因此可以單次劑量或隨時間以兩次或兩次以上劑量(其可能或可能不含有相同量之所需分子)投與，或以連續輸注方式經由植入裝置或導管投與。適當劑量可經由使用適當劑量-反應資料來確定。在某些實施例中，可長期向患者投與抗原結合蛋白。長期投與抗原結合蛋白可使與非完全人類抗原結合蛋白(例如非人類動物中針對人類抗原所產生之抗體，例如非人類物種中所產生之非完全人類抗體或非人類抗體)相關之不利免疫反應或過敏反應減到最小。
醫藥組合物之投與途徑係根據已知方法，例如經口、經由靜脈內、腹膜內、腦內(腦實質內(intra-parenchymal))、腦室內、肌肉內、眼內、動脈內、門靜脈內或病灶內途徑注射；藉由持續釋放系統或藉由植入裝置投與。在某些實施例中，組合物可藉由快速注射或藉由輸注連續地投與，或藉由植入裝置投與。
組合物亦可經由植入其上已吸收或囊封所需分子之膜、海綿或另一適當材料來局部投與。在某些實施例中，當使用植入裝置時，可將裝置植入任何適合之組織或器官中，且所需分子可經由擴散、定時釋放丸劑或連續投與來傳遞。
亦可能需要離體使用人類CGRP R抗原結合蛋白醫藥組合物。在此等情況下，使已自患者移除之細胞、組織或器官暴露於人類CGRP R抗原結合蛋白醫藥組合物，隨後將該等細胞、組織及/或器官植回患者。
詳言之，人類CGRP R抗原結合蛋白可藉由植入某些細胞來傳遞，該等細胞已使用諸如本文所述之方法加以遺傳工程改造以表現及分泌多肽。在某些實施例中，此等細胞可為動物或人類細胞，且可為自體性、異源或異種細胞。在某些實施例中，可使細胞永生化。在其他實施例中，為降低免疫反應之可能性，可囊封細胞以避免滲入周圍組織。在其他實施例中，囊封材料通常為生物相容性、半滲透聚合外殼或膜，其允許蛋白質產物釋放、但防止細胞被患者之免疫系統或來自周圍組織之其他損害因子破壞。
以下實例(包括所進行之實驗及達成之結果)僅為說明性目的而提供且不應視為限制隨附申請專利範圍之範疇。
實例1 產生CGRP受體作為抗原 A.　人類CRLR及RAMP1之分子選殖
將人類CRLR cDNA(GenBank寄存號U17473；SEQ ID NO: 1)及RAMP1 cDNA(GenBank寄存號AJ001014；SEQ ID NO: 3)分別選殖於哺乳動物細胞表現載體pcDNA3.1-Zeo及pcDNA3.1-Hyg(Invitrogen,Carlsbad,CA)中以便如下所述轉染HEK 293EBNA細胞(Invitrogen)。亦將hCRLR cDNA及hRAMP1 cDNA選殖於pDSRα24載體中(Kim,H. Y.等人，J. Inv. Derm. Symp. Proc.(2007)12: 48-49)以便轉染AM-1 CHO細胞(美國專利第6,210,924號)。
B.　穩定轉染之細胞株
1.　在293EBNA細胞中穩定表現人類CGRP R
以1.5×106個細胞/100 mm盤之密度接種HEK 293EBNA細胞(可獲自ATCC或Invitrogen)。24小時之後，依照Invitrogen所提供之說明書，使用FuGene6(Invitrogen,Carlsbad,CA)、以huRAMP1/pcDNA3.1-Hyg及huCRLR/pcDNA3.1-Zeo之6 μg線性化DNA共轉染該等細胞。兩天之後，使細胞受到胰蛋白酶作用且繼代培養於含有400 μg/ml潮黴素+250 μg/ml勻黴素(zeocin)之生長培養基中。兩週之後，使所得抗藥性群落受到胰蛋白酶作用且合併於池內。對該等池進行四輪FACS，從而分選出標記Alexa 647之CGRP8-37類似物(下述)。每輪收集之表現細胞最高為5%。
2.　在AM-1 CHO細胞中穩定表現人類CGRP R
以1.5×106個細胞/100 mm盤接種AM-1 CHO細胞(Urlaub及Chasin,Proc. Natl. Acad. Sci. 77,4216(1980)中所述之CHO DHFR不足細胞株之經無血清生長培養基調適之變異株)。24小時之後，依照Invitrogen所提供之說明書，使用FuGene6(Invitrogen,Carlsbad,CA)、以pDSRα24/huRAMP1及pDSRα24/huCRLR每一者之4 μg線性化DNA共轉染該等細胞。轉染之後2天，使經轉染之細胞受到胰蛋白酶作用且接種於含有10%經透析FBS且無次黃嘌呤/胸苷補充之CHO DHFR選擇性生長培養基中。2週之後，將所得經轉染之群落受到胰蛋白酶作用且合併。對該等池進行FACS分選分析。
3.　在HEK 293EBNA細胞中穩定表現人類腎上腺髓素(AM1)
將293EBNA細胞於DMEM(高葡萄糖)+5% FBS+1% MEM非必需胺基酸+1%丙酮酸鈉中以1.5×106個細胞/盤接種於100 mm盤中。次日使用FuGENE 6轉染試劑(Roche)、以pcDNA3.1/勻黴素/huCRLR外加pcDNA3.1/潮黴素/huRAMP2共轉染該等細胞。DNA構築體均以FspI線性化。48小時之後，將細胞於含有200 μg/ml勻黴素之生長培養基中以3種細胞密度(8×105、3.2×105及8×104個細胞/盤)繼代培養於100 mm盤中。每週更換培養基兩次。一週之後，向培養盤中饋入含有200 μg/ml潮黴素+200 μg/ml勻黴素之培養基。兩週之後，以多輪選殖分離96個群落。剩餘群落收集於單池培養物中。檢定純系及池對受體促效劑或毛喉素(forskolin)刺激之反應。多個純系展示良好反應，且選擇一者用於後續實驗。
4.　在HEK 293EBNA細胞中穩定表現犬CGRP R
將293EBNA細胞於DMEM(高葡萄糖)+5% FBS+1% MEM非必需胺基酸+1%丙酮酸鈉中以1.5×106個細胞/盤接種於100 mm盤中。次日使用FuGENE 6、以pcDNA3.1/勻黴素/犬CRLR外加pcDNA3.1/潮黴素/cynoRAMP1共轉染該等細胞。構築體均以FspI線性化。48小時之後，將細胞繼代培養於含有200 μg/ml勻黴素+400 μg/ml潮黴素、稀釋度為1:20、1:40、1:100及1:200之生長培養基中。每週更換培養基兩次。兩週之後，使用多輪選殖分離96個經轉染之群落。檢定純系對CGRP配位體刺激之反應。多個純系展示類似高程度反應且選擇一者用於後續實驗。
C.　分離高度表現CGRP受體之細胞
合成具有下文序列之CGRP8-37肽類似物(Midwest Bio-Tech Inc. Fishers,IN)：
Ac-WVTHRLAGLLSRSGGVVRCNFVPTDVGPFAF-NH2(SEQ ID NO: 9)
依照製造商說明書(Molecular Probes,Inc. Cat A 2006)以Alexa 647-NHS標記該肽。標記Alexa 647之CGRP8-37展示經CGRP受體轉染之細胞被特異性染色而未經轉染之親本細胞未被特異性染色，且用作FACS試劑。
使用具有標記Alexa 647之CGRP8-37肽之池重複分選經huCGRP受體轉染之293EBNA及AM-1 CHO細胞池(如上述所產生)四次。每次分選時收集高表現細胞，擴增且在最終分選後於小瓶中冷凍。使用AM-1 CHO/huCGRP R細胞如下所述進行免疫，且在免疫之後使用293EBNA/huCGRP R細胞滴定小鼠血清及用於融合瘤上清液之結合篩檢中。
D.產生可溶性CGRP受體
如下所述藉由含有相應cDNA(SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7)之載體短暫共轉染293 6E細胞(Durocher等人，Nucleic Acids Res. 30:E9(2002))來產生含有人類CRLR(SEQ ID NO: 6)及人類RAMP1(SEQ ID NO: 8)之N端細胞外域(ECD)之可溶性CGRP受體多肽。採用常用標籤(多His、Flag、HA及/或Fc)以有助於分泌及/或後續純化。
使用適當引子、藉由PCR選殖於短暫表現載體pTT5中(Durocher等人，見上)來製備與Fc融合之可溶性雜二聚CGRP R ECD。CRLR N端ECD-Fc係由CRLR(SEQ ID NO: 6)的N端細胞外域與人類IgG1 Fc融合所組成。RAMP1 ECD-Fc含有RAMP1(SEQ ID NO: 8)之細胞外域與人類IgG1 Fc融合。在兩種情況下，連接子均由五個位於ECD域與Fc之間的連續甘胺酸組成。
如下藉由共轉染兩種構築體來表現可溶性雜二聚CGRP受體。在FreeStyle 293培養基(Invitrogen)中，使用3 ml PEI/mg DNA、以0.5 mg/L DNA(hCRLR N端ECD-Fc/pTT5及huRAMP1 ECD-Fc/pTT5)轉染震盪瓶中1×106個細胞/毫升之293-6E細胞。使細胞懸浮生長於補充有0.1%氧化異丙烯F68(Pluronic F68)及50 μg/ml遺傳黴素(Geneticin)之FreeStyle 293表現培養基中歷時7天且收集以純化。
隨添加50 mM Tris、400 mM檸檬酸鈉緩衝CM且調節pH值至8.5來自改良性培養基(「CM」)進行純化。接著使經緩衝之CM通過經50 mM Tris、400 mM檸檬酸鈉平衡之蛋白質A親和管柱且將pH調節至pH 8.5。以PBS洗滌蛋白質A管柱且以0.1 N HOAc溶離Fc融合蛋白。使用對CRLR或RAMP1具有特異性之個別抗體、經西方墨點法(western blot)測試，溶離峰含有CRLR與RAMP1組份。進一步LC-MS及N端定序證實CRLR:RAMP1雜二聚體與CRLR:CRLR均二聚體均存在，其比率約(2:3)。此「可溶性CGRP受體」在FMAT分析中展示可與CGRP受體表現重組細胞競爭結合標記Alexa647之CGRP8-37，但其不結合CGRP配位體，如使用Biacore測試所測定。該物質可用作如實例中所述之免疫原，儘管其存在非均質性且不結合CGRP配位體。
E.自重組CGRP受體表現細胞產生膜提取物
使用Boss,R.等人(Journal of Biomolecular Screening,3(4): 285-292(1998))所述之方法，自CGRP受體表現細胞製備膜提取物。簡言之，在4℃下，於50ml PBS中、在3,000 rpm下離心10分鐘來獲得約5公克細胞團，且再懸浮於30 ml冷溶解緩衝液(25 mM HEPES，pH 7.4，3 mM MgCl2外加一種Roche蛋白酶抑制劑混合物錠劑/50mL)中。以Glas-Col(鐵氟龍(Teflon)-玻璃均質機)在5,000 rpm下以約20次衝擊使溶胞物均質化且在JA21轉子中在20,000 rpm下在4℃下旋轉15分鐘。再次重複此過程且將最後離心塊再懸浮於約1-5 ml「最後離心塊」緩衝液(25 mM HEPES，pH 7.4，3 mM MgCl2，10%(w/v)蔗糖外加一種Roche蛋白酶抑制劑混合物錠劑/50 mL)中。藉由通過16 G及25 G針2-3次來剪切膜提取物。以微定量板BCA蛋白質檢定(Microplate BCA Protein Assay)(Pierce)來測定總膜蛋白質濃度。
實例2 產生針對CGRP受體之抗體 A.　免疫
使用如實例1中所述製備之以下形式的CGRP受體抗原進行免疫：
(i)在細胞表面表現全長人類CRLR及RAMP1之AM-1 CHO轉染物，其藉由以人類全長CRLR cDNA(SEQ ID NO: 1)(編碼具有序列SEQ ID NO: 2之多肽)與RAMP1 cDNA(SEQ ID NO: 3)(編碼具有序列SEQ ID NO: 4之多肽)共轉染CHO細胞來獲得；
(ii)來自上文(i)中所述之細胞的膜提取物；及
(iii)可溶性CGRP受體，其如實例1中所述藉由共表現及純化CRLR(SEQ ID NO: 6)之N端ECD及RAMP1(SEQ ID NO: 8)之細胞外域(ECD)獲得。
用純化之可溶性CGRP受體蛋白及自穩定表現CGRP R之AM-1 CHO細胞所製備之經純化之CGRP R膜(分別使用10微克/小鼠及150微克/小鼠之劑量)、以相同方式使XENOMOUSE動物免疫。使用上述方法製備CGRP膜。
隨後投與10微克/小鼠之可溶性CGRP R或75 μg純化之CGRP R膜的劑量加強。亦以CGRP受體表現細胞(使用3.4×106個CGRP R轉染細胞/小鼠之劑量)使XENOMOUSE動物免疫且隨後使用1.7×106個CGRP R轉染細胞/小鼠之劑量進行加強。所用注射部位為皮下尾根部(base-of-tail)與腹膜內之組合。根據2002年2月19日申請之美國專利第7,064,244號中揭示之方法進行免疫，該案之揭示內容係以引用的方式併入本文中。根據製造商說明書製備佐劑TiterMax Gold(Sigma；目錄號T2684)、Alum(E.M. Sergent Pulp and Chemical Co.,Clifton,NJ,目錄號1452-250)，且以1:1比率將佐劑乳液與抗原溶液混合。
首次注射之後4-6週收集血清且藉由重組CGRP受體表現293EBNA細胞之FACs染色來測定特異性效價。
以細胞/膜使小鼠免疫，從而表現全長CGRP R細胞或可溶性CGRP R細胞外域，其中在約一個月至三個半月期間進行11-17次多次免疫。鑑別具有最高血清效價之小鼠且製備用於產生融合瘤。在多個(通常十個)小鼠之組中進行免疫。通常彙集各組之膕及腹股溝淋巴結及脾臟組織以便產生融合物。
B.製備單株抗 體
鑑別顯示適合效價之動物，且自引流淋巴結(draining lymph node)獲得淋巴細胞，且必要時彙集各組之淋巴細胞。在適合之培養基(例如經杜貝可氏改良之伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM；可獲自Invitrogen,Carlsbad,CA)中自淋巴組織解離淋巴細胞以使細胞脫離組織且懸浮於DMEM中。使用適合方法選擇及/或擴增B細胞，且使其與適合之融合搭配物(例如非分泌性骨髓瘤P3X63Ag8.653細胞)(美國菌種保存中心CRL 1580；Kearney等人，J. Immunol. 123,1979,1548-1550)融合。
使淋巴細胞與融合搭配物細胞以1:4之比率混合。藉由在400×g下離心4分鐘使細胞混合物輕緩成塊，傾析上清液，且藉由使用1 ml吸移管輕緩混合細胞混合物。以PEG/DMSO(聚乙二醇/二甲亞碸；獲自Sigma-Aldrich,St. Louis MO；每百萬個淋巴細胞用1 ml)誘導融合。在輕緩攪拌下歷經一分鐘緩慢添加PEG/DMSO，接著混合一分鐘。接著在輕緩攪拌下歷經2分鐘添加IDMEM(無麩醯胺酸之DMEM；每百萬個B細胞用2 ml)，接著歷經3分鐘再添加IDMEM(每百萬個B細胞用8 ml)。
使融合細胞輕緩成塊(400×g 6分鐘)且再懸浮於每百萬個B細胞20 ml選擇培養基(例如含有偶氮絲胺酸及次黃嘌呤[HA]及必要時其他補充物質之DMEM)中。在37℃下培育細胞20-30分鐘且接著再懸浮於200 ml選擇培養基中且在T175燒瓶中培養三至四天後接種於96孔盤中。
使用標準技術將細胞分布於96孔培養盤中以使所得群落之選殖率最大化。培養若干天之後，收集融合瘤上清液且如下文實例中詳述進行篩檢檢定，包括驗證與人類CGRP受體結合、依據配位體結合競爭檢定鑑別阻斷抗體，及評估與其他與CGRP受體有關之受體(例如人類腎上腺髓素受體)的交叉反應性。進一步選擇陽性細胞且對其執行標準選殖及次選殖技術。活體外擴增純系株，且獲得所分泌之人類抗體以便分析。
C.所選單株抗體之序列分析
使用標準RT-PCR法將所選次選殖單株抗體定序。表2A展示本文所揭示之例示性抗體的輕鏈之胺基酸序列。表2B展示本文所揭示之例示性抗體的重鏈之胺基酸序列。
將對應於所定序抗體之CDR區的胺基酸序列比對且利用比對、依據相似性將純系分類。
圖3A及圖3B中展示來自具有K輕鏈之純系的輕鏈CDR及某些相應共同序列之序列比對。
圖4中展示來自具有λ輕鏈之純系的輕鏈CDR及某些相應共同序列之序列比對。
圖5A、5B、5C、5D及5E中展示本文所揭示之例示性抗體的重鏈CDR及某些相應共同序列之序列比對。
圖5F中展示本文所揭示之例示性重鏈CDR的某些共同序列。
實例3 鑑別CGRP受體特異性抗體 A.藉由FMAT選擇CGRP受體特異性結合抗體
培養14天之後，藉由螢光微量檢定技術(Fluorometric Microvolume Assay Technology，FMAT)(Applied Biosystems,Foster City,CA)、針對CGRP R特異性單株抗體篩檢融合瘤上清液。針對以人類CGRP R轉染之AM-1 CHO huCGRP R細胞或重組HEK 293細胞篩檢上清液，且針對親本HEK 293細胞(如實例1中所述製備)進行反向篩檢。
簡言之，將Freestyle培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中之細胞以約4000個細胞/孔之密度(對於穩定轉染物)及以約16,000個細胞/孔之密度(對於親本細胞)接種於每孔50微升體積之384孔FMAT培養盤中，且在37℃下培育細胞隔夜。接著添加10微升/孔上清液且在4℃下培育盤約一小時，之後以2.8 μg/ml濃度(400 ng/ml最終濃度)每孔添加10微升抗人類IgG-Cy5二次抗體(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)。接著在4℃下培育盤一小時，且使用FMAT大共焦掃描儀(macroconfocal scanner)(Applied Biosystems,Foster City,CA)讀取螢光。
反向篩檢時，類似地接種親本AM-1 CHO細胞或HEK 293細胞且針對此等細胞藉由FMAT並行篩檢上清液以區分及排除結合細胞蛋白、而非結合CGRP受體的融合瘤。
B.　藉由配位體結合競爭檢定、經由FMAT鑑別阻斷抗體
開發一種配位體結合競爭法以鑑別(融合瘤上清液中)結合CGRP受體且阻斷CGRP配位體結合之抗體。製備每孔中具有5,000個AM-1 huCGRP R池2細胞及20,000個未轉染CHO-S細胞的384孔培養盤(Corning Costar，目錄號3712)。將20 μl之抗CGRP R融合瘤上清液添加至各孔中且在室溫下培育盤1小時。接著將2.8 μg/ml Alexa647-CGRP8-37肽添加至各孔中且在室溫下再培育培養盤3小時。在FMAT 8200細胞偵測系統(Applied Biosystems)上檢定與細胞結合之Alexa647-CGRP8-37之量。輸出資料為信號強度之數顯FL1值(較高FL1值表明較高信號強度)以及細胞影像。
實驗包括陰性對照物融合瘤上清液。將此等陰性對照實驗中所觀測到之平均FL1值用作檢定之最大可能信號。將實驗上清液與此最大信號相比且計算各孔之抑制百分比(抑制%=(1-(抗CGRP R融合瘤上清液之FL1/最大FL1信號)))。
圖6中展示資料概述。在此實驗中，使用受體配位體檢定測試1092個抗CGRP R上清液。使用平均抑制百分比將資料排序。九十個上清液具有>25%平均抑制，其中31者>50%且7者>70%平均抑制。
下表10中展示簡化資料集。1-5號樣本說明抑制Alexa647-CGRP8-37肽與CGRP受體結合之抗CGRP R融合瘤上清液之實例，且536-540號樣本說明不抑制Alexa647-CGRP8-37肽與CGRP受體結合之抗CGRP R融合瘤上清液的實例。
依據結合競爭檢定，選擇約30個上清液用於進一步表徵。
實例4 CGRP受體特異性阻斷單株抗體在cAMP功能性檢定中之活性 A. CGRP受體抗體活性
在活體外CGRP受體介導cAMP檢定中篩檢所選CGRP受體抗體以測定固有效能。活體外cAMP檢定採用獲自ATCC(ATCC編號HTB-10；「HTB-10細胞」)、來源於人類神經母細胞瘤之細胞株(SK-N-MC；Spengler等人，(1973)In Vitro 8: 410)。HTB-10細胞表現CRLR及RAMP1，從而形成CGRP受體(L. M. McLatchie等人，1998)。如實例1中所述產生表現重組獼猴CGRP R之293EBNA細胞株，且自ATCC獲得表現大鼠CGRP受體之大鼠L6細胞株(CRL-1458)。
篩檢中使用LANCE cAMP檢定套組(PerkinElmer,Boston,MA)。在60 μL總體積之白色96孔培養盤中進行檢定。簡言之，在檢定之日，在37℃下解凍冷凍之HTB-10細胞，以檢定緩衝液洗滌細胞一次，且將12 μL含有10000個細胞與標記Alexa之抗cAMP抗體混合的細胞懸浮液添加至96孔半區域白色培養盤中。添加12 μL CGRP受體抗體之後，在室溫下培育混合物30分鐘。接著添加12 μL CGRP受體促效劑人類α-CGRP(1 nM最終濃度)且在室溫下進一步培育15分鐘。在人類α-CGRP刺激之後，添加24 μL偵測混合物且在室溫下培育60分鐘，且在EnVision儀器(PerkinElmer,Boston,MA)上、在Em665 nM下讀取培養盤。藉由Prizm(GraphPad Software Inc.)或ActivityBase(IDBS)處理及分析資料。
圖7A展示如上所述使用三種抗體3C8、13H2及1E11之hCGRP受體表現細胞株HTB-10獲得之例示性資料。依相對於對照之百分比(「POC」)與抗體(3C8、13H2或1E11)濃度的關係將資料作圖，且與標準非線性回歸曲線擬合以產生圖底部所示之IC50值。
B.　對相關受體缺乏活性之抗體
使用表現相關受體AM1(表現hCRLR+hRAMP2之HEK 293細胞；D. R. Poyner等人，Pharmacological review,54:233-246,2002)、AM2(表現hCRLR+hRAMP3之CHO細胞；D. R. Poyner等人，Pharmacological review,54:233-246,2002)或人類澱粉素AMY1受體(MCF-7細胞hCTR+hRAMP1；Wen-Ji Chen等人，Molecular pharmacology,52: 1164-1175,1997)之細胞測定所測試抗體之選擇性。如上文實例1中所述產生AM1表現HEK 293細胞株。AM2表現CHO細胞株係購自EuroScreen(現為PerkinElmer,Inc.)；且人類澱粉素AMY1受體表現MCF-7細胞株(Zimmermann等人，Journal of Endocrinology,423-431,1997)係獲自ATCC(HTB-22)。如上所述繪製之例示性結果展示於圖7B(hAM1-HEK細胞)、7C(hAM2-CHO細胞)及7D(hAMY-MCF-7細胞)中。注意所測試抗體在所測試範圍內皆無針對hAM1、hAM2或hAMY1受體之顯著抑制活性。
使用表現獼猴CGRP受體之重組HEK細胞及表現大鼠CGRP受體之大鼠L6細胞(ATCC)進行類似實驗。來自此等研究之資料，以及如本實例之A部分中所述獲得之其他IC50資料展示於下表11之「cAMP」欄中。注意針對人類及犬CGRP受體之IC50值係在奈莫耳濃度範圍內，而針對大鼠CGRP受體，及人類AM1、AM2及AMY1受體，以及表現抑鈣素之MCF7細胞(資料未圖示)的活性皆大於1微莫耳濃度。人類CGRP受體與人類AM1、AM2、澱粉素與抑鈣素受體之間的IC50差異說明此等抗體對CGRP受體的選擇性高於部分地由相同受體組份所形成之相關受體。使用人類及獼猴CGRP受體所得之IC50類似，而所測試抗體似乎不與大鼠CGRP受體交叉反應。
實例5 測定受體阻斷抗體之Ki的放射性配位體CGRP結合檢定
在各種濃度之測試抗體存在下使用標記125I之CGRP(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)及HTB-10細胞之細胞膜(PerkinElmer Inc.,Waltham,Massachusetts)進行放射性配位體結合實驗以測定相應Ki值。在室溫下、在96孔培養盤中建立CGRP結合檢定，該等96孔培養盤：110μ1結合緩衝液(20 mM Tris-HCl，pH 7.5，5.0 mM MgSO4、0.2% BSA(Sigma)、1錠CompleteTM錠劑/50 ml緩衝液(蛋白酶抑制劑))；20 μl測試化合物(10×)；20 μl 125I-hαCGRP(Amersham Biosciences；10×)；及50 μl人類神經母細胞瘤細胞(HTB-10)膜懸浮液(每孔10 μg，PerkinElmer)。在室溫下、在60 rpm下、在震盪下培育盤2小時，且接著經由0.5%聚乙二亞胺(PEI)處理(至少一小時)之GF/C 96孔濾盤過濾各孔之內含物。以50 mM冰冷Tris(pH 7.5)洗滌GF/C濾盤六次且在烘箱中、在55℃下乾燥1小時。接著密封GF/C濾盤之底部。將40 μl MicroscintTM 20添加至各孔中，以TopSealTM-A(壓上黏著型密封膜)密封GF/C濾盤之頂部，且以TopCount NXT(Packard)對GF/C濾盤計數。使用Prizm(GraphPad Software Inc.)分析資料。
圖8中展示使用抗體3C8、12H2及1E11獲得之例示性資料及Ki值。
上表11中最右側欄列出放射性標記125I-CGRP競爭結合檢定中指定mAb對HTB-10細胞膜之Ki值。資料說明CGRP受體抗體具有針對CGRP結合之高度競爭性(所有亞奈莫耳濃度範圍)。
實例6 測定CGRP受體阻斷抗體之K D 的FACS結合檢定
使用FACS方法測定抗CGRP R mAb對表現於細胞上之CGRP受體的親和力。簡言之，將如上所述製備之AM-1 CHO huCGRP R表現細胞於含有10%FBS、NEAA、PS、L Glut、NaPyr及0.05%疊氮化鈉之DMEM培養基中以每孔16,000或160,000個細胞之密度接種於96孔培養盤中。在50nM至1 pM之相同培養基中滴定CGRP受體抗體且與細胞一起培育。在4℃下以120 μl之總體積在盤式震盪器(plate shaker)上培育隔夜之後，以PBS+2% FBS洗滌細胞2次，每次離心且棄置上清液。接著添加100微升/孔含有7AAD(5微升/孔)之G抗Hu Fc Cy5(5 μg/mL；Jackson ImmunoResearchLaboratories Inc.,West Grove,PA,USA)且在4℃下培育40分鐘。以PBS+2%FBS洗滌細胞2次，每次離心且棄置上清液。接著添加100 μl PBS+2% FBS緩衝液且藉由FACS分析以測定結合幾何平均值。使用KinExA軟體藉由求取各種抗體濃度下之負幾何平均值來計算Kd作為游離抗體之存在量，Rathanaswami等人，Biochemical and Biophysical Research Communications 334(2005) 1004-1013。如Rathanaswami等人，Biochemical and Biophysical Research Communications 334(2005)1004-1013中所述，藉由n曲線分析法來分析在兩種不同細胞濃度下所獲得之資料以測定Kd及95%信賴區間。
圖10中展示抗體12G8.2之具有相應曲線擬合之例示性資料。表12中展示根據本揭示案所產生之八種阻斷抗體的資料。在兩個不同日分析抗體之一(3B6)。對於16K細胞實驗獲得0.9之比率表明，抗原濃度可依0.9倍Kd預測且藉由此實驗獲得之曲線因此為Kd控制曲線。可瞭解以此方式獲得之Kd值係在所有測試抗體之低個位數奈莫耳濃度範圍內。
實例7 藉由BICORE結合競爭，CGRP受體阻斷抗體之結合(依據BICORE結合競爭)
如下進行Biacore分析(Karlsson,R.等人，Methods;A Companion to Methods in Enzymology,6: 99-110(1994))。根據製造商說明書，使用10 mM HEPES、0.15 M NaCl、3.4 mM EDTA、0.005% P-20(pH 7.4)(HBS-EP緩衝液)之連續流將抗CGRP受體抗體固著於CM5感應晶片表面。藉由注射60 μL含有0.2 M N-乙基-N'(二甲胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)及0.05 M N-羥基丁二醯亞胺(NHS)之混合物活化感應晶片表面上之羧基。藉由注射180 μl於10 mM乙酸鹽(pH 4.0)中稀釋之抗CGRP受體抗體(濃度為30 μg/mL)來獲得特異性表面。藉由注射60 μL 1 M乙醇胺使表面上之過量反應性基團失活。個別抗體之最終固著含量係如下：
抗體　共振單位(RU)
11D11　約5,900
3B6　約7,200
4H6　約8,000
12G8　約7,800
9F5　約6,600
34E3　約3,700
亦在感應晶片上製備空白模擬偶合參考表面。濃度為100 nM之可溶性huCGRP受體捕捉於具有上文提及之六種固著抗體(11D11、3B6、4H6、12G8、9F5或34E3)之一的感應晶片上。接著將20種抗CGRP R測試抗體中之每一者注射於被捕捉之huCGRP受體上。若所注射之抗體識別不同抗原決定基(相對於固著之抗體所識別之抗原決定基)，則會觀測到第二結合事件。若抗體識別相同或極相似抗原決定基，則僅會觀測到huCGRP受體之結合。
圖9A中展示使用塗有固著抗體3B6之感應晶片獲得的例示性資料。四條跡線為在所注射溶液中使用抗體1E11、4E4、2E7及12G8所獲得之資料。實驗期間之事件係以字母表示，「A」對應於注射huCGRP R-Fc，「B」對應於huCGRP R-Fc注射結束，「C」對應於注射第二mAb，且「D」對應於第二mAb注射結束及緩衝液洗滌開始。注意若固著抗體表面上無任何所注射抗體之任何結合信號的指示，則表明四種所注射抗體似乎與所固著抗體識別相同或極相似抗原決定基。對於在五種固著中和性抗體表面之每一者上所洗滌之所有測試阻斷抗體均觀測到實質相同之結果，表明所有測試之抗huCGRP受體阻斷抗體均識別相同或極相似且大量重疊之抗原決定基。
相比之下，如圖9B、9C及9D中部分所示，四種所測試之非阻斷性CGRP受體特異性抗體32H8、33B5、33E4及34E3未能與11D11(資料未圖示)、3B6(圖9B)、12G8(圖9C)及9F5(資料未圖示)競爭，儘管34E3能夠與4H6(圖9D)競爭且與32H7(資料未圖示)微弱競爭。32H8未能與3B6、4H6、12G8、9F5或非阻斷性抗體34E3競爭，但33B5及33E4可與非阻斷性抗體34E3競爭。所有阻斷及非阻斷性抗體之資料均概括於下表13中。「NB」表示不結合；「+」表示顯著結合；且「弱」表示弱結合。
如可自資料所瞭解，所有測試之阻斷或中和性抗體可與五種固著之阻斷抗體結合相同區域；亦即所有測試之中和性抗體均結合CGRP R分子之相同區域。另一方面，非阻斷性抗體一般不與固著之阻斷抗體競爭，表明非阻斷性抗體主要結合CGRP R之不同區域。
實例8 在西方墨點法中CGRP受體抗體與可溶性CGRP受體之結合
使用西方墨點法測試三種代表性CGRP受體阻斷抗體與可溶性CGRP受體-muFc融合蛋白之結合。
在13.3%濃度之β-巰基乙醇(βME)存在(還原)或不存在(非還原)下，將100 ng純化之CGRP R-muFc(如上針對CGRP R-huFc所述來產生及純化，例外為使用小鼠Fc且將RAMP1或CRLR ECD與muFc之間的連接子變為「GGGGGVDGGGGGV」(SEQ ID NO: 213))於具有PAGE樣本緩衝液之PBS中稀釋。接著煮沸含有βME之樣本4分鐘。將還原及未還原之樣本裝載於不同的4-20% Tris-甘胺酸凝膠(Invitrogen)上(具有CGRP R-Fc蛋白與分子量標記(Invitrogen)之交替泳道)。凝膠於0.2 μm硝化纖維素濾膜(Invitrogen)上進行電泳吸墨(electroblotted)。以Tris緩衝鹽水+1% Tween 20(TBST)洗滌墨點且接著以TBST+5%乳粉阻斷30分鐘。沿分子量標記泳道將墨點切成條。將一條各具有還原及未還原之CGRP R-muFc之條帶與純化之huCGRP R抗體4E4、9F5或3B6(於TBST+5%牛乳中1:500稀釋)、山羊抗huRAMP1 N-20(1:500；Santa Cruz Biotechnology,Inc)、兔抗小鼠IgG-Fc-HRP(1:10,000)(Pierce)或山羊抗人類IgG-Fc-HRP(1:10,000)(Pierce)一起培育。墨點與抗體一起培育一小時，接著以TBST+1%牛乳洗滌3×10分鐘。經huCGRP R抗體處理之墨點接著與山羊抗小鼠IgG-Fc-HRP(於TBST+1%牛乳中1:10,000)一起培育，且經抗huRAMP1(N-20抗RAMP1山羊多株抗體，Santa Cruz Biotech,CA)處理之墨點與兔抗山羊IgG-Fc-HRP(1:10,000)一起培育20分鐘。以TBST洗滌墨點3×15分鐘。以Pierce Supersignal west Pico偵測試劑處理huCGRP R及抗huRAMP1抗體墨點，且以Pierce標準偵測試劑處理(1分鐘)抗小鼠及抗人類IgG-Fc-HRP墨點。接著以Kodak Biomax MS X射線膠片使墨點曝光。
所有三種CGRP受體抗體4E4、9F5及3B6在非還原條件下均能夠(但在還原條件下未能)偵測可溶性CGRP R-muFc(含有RAMP1-ECD及CRLR ECD)，表明此等CGRP R抗體之結合抗原決定基具有構形且對二硫鍵(RAMP1-ECD中有3對，且CRLR N-ter ECD中有3對)敏感。相比之下，商業抗RAMP1抗體N-20(Santa Cruz Biotech)在還原與非還原條件下均結合RAMP1，表明N-20抗體之結合位點主要為線性且對二硫鍵不敏感。
實例9 CGRP受體阻斷抗體與嵌合受體之結合
使用由原生RAMP1與嵌合CRLR，或原生CRLR與嵌合RAMP1形成之CGRP受體鑑別涉及抗體結合之CGRP受體序列。因為所有測試之人類CGRP受體阻斷抗體均未展示對大鼠CGRP受體之功能活性，所以嵌合組份在人類序列背景下含有大鼠序列之區域。產生以下嵌合體以便藉由FACS進行結合分析：
1號RAMP1嵌合體(Q28至A34)；SEQ ID NO: 217
人類RAMP1之胺基酸殘基Q28至A34係經大鼠RAMP1之相應序列置換。此段包括人類與大鼠RAMP1之間不同的五個胺基酸殘基。
2號RAMP1嵌合體(Q43至E53)；SEQ ID NO: 218
人類RAMP1之胺基酸殘基Q43至E53係經大鼠RAMP1之相應序列置換。此段包括人類與大鼠RAMP1之間不同的六個胺基酸殘基。
3號RAMP1嵌合體(R67至E78)；SEQ ID NO: 219
人類RAMP1之胺基酸殘基R67至E78係經來自大鼠RAMP1之相應序列置換。此段包括人類與大鼠RAMP1之間不同的七個胺基酸殘基。
1號CRLR嵌合體(L24至Q33)；SEQ ID NO: 223
人類CRLR之胺基酸殘基L24至Q33係經大鼠CRLR之相應序列置換。此段包括人類與大鼠CRLR之間不同的八個胺基酸殘基。
圖11展示獼猴(SEQ ID NO: 215)、人類(SEQ ID NO: 4)、大鼠(SEQ ID NO:214)及恆河猴(SEQ ID NO: 216)之RAMP1胺基酸序列以及1號RAMP1嵌合體(SEQ ID NO: 217)、2號嵌合體(SEQ ID NO: 218)及3號嵌合體(SEQ ID NO: 219)之序列的比對。圖12A及12B展示人類(SEQ ID NO: 2)、獼猴(SEQ ID NO: 221)、恆河猴(SEQ ID NO: 222)、大鼠(SEQ ID NO: 220)之CRLR胺基酸序列以及1號CRLR嵌合體之胺基酸序列(SEQ ID NO: 223)的比對。
以CGRP R嵌合體DNA構築體(CRLR wt+RAMP1 Q28-A34；CRLR wt+RAMP1 Q43-E53；CRLR wt+RAMP1 R67-E78；CRLR L24-Q33+RAMP wt；CRLR wt+RAMP1 wt；pTT5載體對照物)短暫性轉染293-6E細胞。72小時之後收集細胞，以PBS+0.5% BSA洗滌，且計數。以每100 μl PBS/BSA 5×105個細胞之稀釋度再懸浮經轉染之各細胞株。將細胞懸浮液以每孔100 μl等分於96孔圓底培養盤(Falcon)中。在1200 rpm下使細胞離心5分鐘。移除上清液且用100 μl含有0.5 μg純化huCGRP R抗體1H7、2E7、3B6、9F5、4H6、12G8、3C8、10E4、11D11、32H8或33B5之懸浮液置換。以抗DNP huIgG2(0.5 μg)、Alexa647-CGRP肽(0.5 μg)或單獨之PBS/BSA處理對照孔。細胞於冰上培育1小時且接著以PBS/BSA洗滌兩次。將細胞再懸浮於100微升/孔含有抗hug-Fc-FITC(0.5 μg)(Alexa647-CGRP處理之細胞除外)之PBS/BSA中。細胞在黑暗中在冰上培育1小時，且接著以PBS/BSA洗滌兩次。將細胞再懸浮於200 μl PBS/BSA中且使用FACS Calibur來分析。
測試十種代表性阻斷抗體(3B6、9F5、4H6、12G8、3C8、10E4、32H7、4E4、11D11及1H7)及兩種非阻斷性抗體(32H8及33B5)。圖13A、13B及13C中展示代表性資料(9F5抗體)。圖13A展示與野生型CGRP受體結合；圖13B展示與含有CRLR L24-Q33嵌合體之CGRP受體結合，且圖13C展示與含有RAMP1 Q28-A34嵌合體之CGRP受體結合。FACS分析展示所有12種抗體如所預期均結合野生型人類CGRP受體對照物。所有12種抗體均展示與三種RAMP1嵌合體RAMP1(Q28-A34)、(Q43-E53)及(R67-E78)中任一者之結合均顯著降低。此可由以下引起：(1)嵌合體受體之表現量低得多，(2)RAMP1嵌合體損害人類CRLR之摺疊且改變受體複合物之構形，及/或(3)RAMP1上之此等三個所選區域直接涉及此等抗體與CGRP受體結合。
當開啟FACS追蹤以僅包括極小「表現」細胞群時，非阻斷抗體33B5及32H8與阻斷抗體相比似乎不能一致良好地結合RAMP1 Q43-E53嵌合體(較低幾何平均值)，表明結合RAMP1 Q43-E53區對於非阻斷性抗體可能更重要。另一方面，33B5及32H8比阻斷抗體更能一致良好地結合RAMP1 R67-E78嵌合體，表明RAMP1 R67-E78序列對於阻斷抗體可能更重要。
所有測試之CGRP受體抗體均與CRLR嵌合體(L24-Q33)適度良好地結合，表明此位點對於阻斷抗體之結合並非必需。
總而言之，資料展示RAMP1上之三個不連續區域(Q28-A34)、(Q43-E53)及(R67-E78)可能涉及CGRP受體抗體結合，其中(R67-E78)對於阻斷抗體更重要。如藉由此方法所分析，CRLR之N端序列(L24-Q33)似乎並不決定性地涉及CGRP受體抗體之結合。此方法不排除人類與大鼠CGRP受體之間具有一致或相似序列、並非此分析之標靶之其他結合位點。
實例10 藉由蛋白酶保護檢定鑑別抗CGRP R中和性抗體之人類CGRP R抗原決定基
成熟形式之CRLR-Fc融合分子(信號肽已移除；本文以SEQ ID NO: 10揭示)中之CRLR部分含有116個胺基酸(位於甘胺酸連接子之前)且具有三個因形成三個雙硫鍵而產生之大環結構。CRLR中之三個雙硫鍵為序列位置26之Cys1(此段落中所列之所有CRLR序列位置均相對於如SEQ ID NO: 10所示之成熟序列)與序列位置52之Cys3之連接(稱作CRLR C1-C3)、序列位置43之Cys2與序列位置83之Cys5(稱作CRLR C2-C5)、序列位置66之Cys4與序列位置105之Cys6之連接(稱作CRLR C4-C6)。成熟形式之RAMP1-Fc融合分子中之RAMP1部分含有91個位於甘胺酸連接子之前的胺基酸(SEQ ID NO: 11)，其亦形成三個分子內雙硫鍵。RAMP1中之三個雙硫鍵為序列位置1之Cys1(此段落中所列之所有RAMP1序列位置均相對於如SEQ ID NO: 11所示之成熟序列)與序列位置56之Cys5之連接(稱作RAMP1 C1-C5)、序列位置14之Cys2與序列位置46之Cys4之連接(稱作RAMP1 C2-C4)、序列位置31之Cys3與序列位置78之Cys6之連接(稱作RAMP1 C3-C6)。
抗CGRP中和性單株抗體所結合之人類CGRP受體蛋白之區域係藉由特異性蛋白酶將h CGRP R分割為肽且測定所得h CGRP R肽(亦即CRLR及RAMP1部分之含二硫鍵與不含二硫鍵之肽片段)之序列來鑑別。接著進行蛋白酶保護檢定以測定hCGRP R在結合單株抗體存在下之蛋白水解性消化。此檢定之一般原理為mAb與CGRP R結合可保護某些特異性蛋白酶裂解位點且此資訊可用以測定mAb所結合之CGRP R之區域或部分。
簡言之，對肽消化物進行HPLC肽繪圖(HPLC peptide mapping)；收集個別峰，且藉由線上電噴霧電離LC-MS(ESI-LC-MS)分析及/或藉由N端定序來鑑別該等肽並繪圖。此等研究之所有HPLC分析均使用窄孔逆相C18管柱(2.1 mm內徑×15 cm長度；Zorbax 300SB,5 μm,Agilent Technologies)(對於離線分析)及使用毛細管逆相C18管柱(0.5 mm內徑×25 cm Vydac C18 MS,5 μm;The Separation Group)(對於LC-MS)來進行。以0.05%三氟乙酸(移動相A)至含有90%乙腈之0.05%三氟乙酸的線性梯度進行HPLC肽繪圖。對於離線或線上LC-MS分析之窄孔HPLC，在0.25 ml/min之流動速率下沖洗管柱90分鐘，且對於線上LC-MS分析之毛細管HPLC，在0.018 ml/min之流動速率下沖洗管柱90分鐘。
成熟形式之人類CGRP R係使用AspN(其在胺基端之天冬胺酸及一些麩胺酸殘基之後裂解)藉由在37℃下將0.1 M磷酸鈉(pH 6.5)中之約100 μg CGRP R(1.0 mg/ml)與2 μg AspN一起培育20小時來消化。
AspN消化物之HPLC層析產生如圖14中所示之肽概況(各樣本注射30 μg)(單獨CGRP R(濃度1 mg/ml)的層析圖標記為A)，而用類似量之CGRP R中和性抗體純系12G8之對照消化展示抗體實質上對AspN內蛋白酶(endoproteinase)具有抗性(層析圖標記為B；CGRP R：抗體重量比分別100:2；100:7；100:20)。藉由線上LC-MS/MS且藉由Edman定序對自HPLC回收之肽峰進行序列分析。對肽消化物進行線上ESI LC-MS分析以測定藉由HPLC所分離之肽的準確質譜及序列。從而測定AspN消化所得之肽峰中所存在之若干肽的身分(如圖14中編號之峰所示)。下表14展示此等肽序列在hCGRP R之相應組份(CRLR或RAMP1)中之位置。位於編號或X後之大寫字母C表示鑑別為CRLR肽之肽；位於編號或X之大寫字母R為RAMP1肽且「Fc」表示自CRLR-Fc及RAMP1-Fc融合分子中所釋放之未消化大Fc片段。
圖15展示用單獨CGRP R的AspN消化實驗(各樣本注射30 μg)(層析圖標記為A)與在中和性抗體12G8存在下所進行之實驗(層析圖標記為B)的比較。CGRP R：抗體之重量比為1:1。層析圖B中之多個峰(C5、C6及C7)展示峰高降低(相對於層析圖A)，而層析圖B中之兩個其他峰(C-X及R-X)展示峰高增加(相對於層析圖A)。若消化樣本中存在類似量之不同中和性抗CGRP R抗體(10E4、3B6、3C8或4E4)(如標記為C之層析圖中所見)，則亦觀測到類似肽圖案。C6與C7均為二硫鍵鍵連肽，其覆蓋CRLR分子之大部分，而C5為存在於分子之N端的CRLR不含二硫鍵肽且位於C7二硫鍵肽之倒數第二位置。峰C-X含有三個CRLR雙硫鍵與多個序列，表明至少二至三個肽係藉由雙硫鍵連接在一起。在CGRP中和性抗體存在下CGRP R消化物之峰C-X之峰高增加表明，該抗體已保護CGRP R防止在多個與Glu25及Asp55有關之裂解位點被AspN消化。因為肽C2及C4之峰強度根本未降低，所以抗體似乎對Asp33及Asp72不具有顯著保護作用。因此，抗體似乎結合CRLR中包括CRLR C1-C3及CRLR C4-C6二硫鍵區域的區域，以及Cys53與Cys66之間的環區域。
對hCGRP R之AspN繪圖亦可鑑別RAMP1二硫鍵肽(R2)及RAMP1非二硫鍵肽(R1)(參看表14及圖14)。在任一上述中和性抗體(12G8、10E4、4E4、3B6或3C8)存在下，所回收之肽R-X的峰強度顯著高於自消化無抗體樣本所得之峰強度。質譜及序列分析展示R-x含有對應於Cys1與Arg86之間RAMP1序列的單鏈多肽。此等實驗表明CGRP R中和性抗體可保護RAMP1之重要區域防止AspN蛋白水解性消化。
為評估對CGRP R AspN蛋白分解之防禦作用對CGRP R中和性(阻斷性)抗體是否具有特異性(與抗CGRP R非中和性抗體相比)，在不中和CGRP R活性之無關對照單株抗體存在下進行CGRP R之AspN消化。結果展示於圖15之層析圖D中。非中和性抗體對CGRP R AspN蛋白分解並不展示任何顯著阻斷作用；實際上，肽圖概況(層析圖D)在有關方面與消化單獨CGRP R所得的概況(層析圖A)幾乎不可區分。
蛋白分解防禦作用視添加至消化樣本中之濃度而定。如圖16中所見，以樣本中固定量之CGRP R(100 μg)及可變量之抗CGRP R中和性抗體4E4(CGRP R：抗體重量(微克)比率分別為100:2；100:7；100:20)進行Aspen蛋白分解。可觀測防禦概況且該防禦具有抗體濃度依賴性。
總而言之，此等資料說明本文所揭示之阻斷或中和抗CGRP R抗體可阻斷CGRP R(CRLR與RAMP1組份)以防AspN蛋白分解，表明當此等抗體與CGRP受體結合時，該等阻斷抗體與CRLR與RAMP1均結合。此外，防禦作用具有抗體濃度依賴性。此等結果亦表明CGRP R中和性抗體結合人類CGRP R上接近AspN裂解位點之共同區域。
實例11 cAMP功能性檢定中之市售抗RAMP1及抗CRLR抗體
在CGRP受體介導cAMP檢定中，使用如上文實例4中所述之HTB-10細胞篩檢針對人類CGRP受體之一個或另一個組份(RAMP1或CRLR)之市售抗體以測定抗體是否具有生物活性。資料描述於下表15中。在本文所揭示之例示性抗體具有強生物活性之濃度範圍內，抗體具有不可偵測(「ND」)、極弱(「VW」)或弱(「W」)生物活性。
實例12 表現不同受體組份之細胞的免疫組織化學染色
每個考拉塞(colla plug)(Integra LifeSciences Co.,Plainsboro,NJ)注射2×106-4×106個細胞。將考拉塞包埋於OCT培養基(Sakura Finetek Inc.,Torrance,CA)中，在-20℃下冷凍且使用冷凍切片機(cryostat)切為20 μm切片。在室溫(RT)下以4%三聚甲醛固定切片1小時且隨後在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中洗滌。以3% H2O2/PBS阻斷內源性過氧化酶15分鐘，且在阻斷溶液(具有3%正常山羊血清(Vector Labs,Burlingame,CA)及0.3%特瑞通X-100之PBS)中培育切片1小時。隨後，切片在4℃下與人類抗CGRP受體一次抗體(32H7，0.03-0.1 μg/ml)中培育隔夜，在PBS中洗滌且在室溫下、在1%正常山羊血清/PBS溶液中與二次抗體(生物素標記之山羊抗人類IgG Fc片段，1:800，Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)培育1小時。使用Vector Elite套組，根據製造商說明書(Vector Labs,Burlingame,CA)擴增免疫反應性，且使用3,3'-二胺基聯苯胺-鎳作為色原體(Sigma-Aldrich,St. Louis,MO)來顯色。以二甲苯清潔切片且以Permount(Fisher Chemicals,Fair Lawn,NJ)滑動蓋片。使用Nikon E-800顯微鏡及相關軟體(Nikon,Melville,NY)分析免疫反應性。
使用如上所述之抗體32H7獲自表現不同受體組份之細胞(如下文鑑別)的資料揭示表現重組人類CGRP受體之CHO細胞(CRLR+RAMP1；「CHO/CGRPR細胞」)顯著染色，且內源式表現CGRP受體之SK-N-MC細胞較弱地染色(因低得多之受體密度所致)。對以下細胞未觀測到染色：親本CHO細胞株、表現無關重組蛋白(TRPM8)之CHO細胞、相應32H7抗原預吸附後之CHO/CGRPR細胞、表現重組人類腎上腺髓素受體2(CRLR+RAMP3)之CHO細胞、內源式表現澱粉素受體之MCF-7細胞、表現重組人類腎上腺髓素受體1(CRLR+RAMP2)之HEK細胞或親本HEK細胞。此等實驗之資料概括於下表16中。
所有經鑑別之專利及其他公開案均以引用的方式明確地併入本文中以達成描述及揭示例如此等公開案中所述之可聯合本文所揭示之標的物使用之方法的目的。在本申請案申請日之前，此等公開案僅為其揭示目的而提供。就此而言決不應解釋為承認本發明者因先前發明或任何其他原因而無權先於該揭示案。所有關於此等文件日期之聲明或內容之陳述均基於本申請者可獲得之資訊且不等同於任何關於此等文件日期或內容之修正的承認。
圖1展示人類、獼猴及大鼠之RAMP-1序列的比對。
圖2展示人類、獼猴及大鼠之CRLR序列的比對。
圖3A及3B展示具有κ輕鏈之指定抗CGRP受體抗體純系之輕鏈CDR及某些相應共同序列的基於譜系學之序列比對。
圖4展示具有κ輕鏈之指定抗CGRP受體抗體純系之輕鏈CDR及某些相應共同序列的基於譜系學之序列比對。
圖5A、5B、5C、5D及5E展示指定抗CGRP受體抗體純系之重鏈CDR及某些相應共同序列的基於譜系學之序列比對。
圖5F展示本文所揭示之例示性抗CGRP受體抗體重鏈CDR之共同序列。
圖6為兩個實驗之資料圖，其展示藉由1092個抗CGRP R融合瘤上清液(菱形)及68個陰性對照物上清液(方塊)對經標記之配位體結合CGRP R的抑制百分比。
圖7A-D展示三種指定抗CGRP R mAb對表現hCGRP受體(圖7A)、hAM1(圖7B)、hAM2(圖7C)及人類澱粉素受體(圖7D)之細胞的例示性cAMP檢定IC50資料。
圖8展示125I-CGRP結合資料之實例，其諸如可用以測定mAb對人類CGRP受體之Ki。
圖9A-D展示本文所揭示之所選抗體的Biacore競爭資料。
圖10展示mAb 12G8之FACS Kd測定。
圖11展示獼猴、人類、人類嵌合體、大鼠及恆河猴RAMP1序列之比對。
圖12A-B展示人類、獼猴、恆河猴、大鼠、人類嵌合體及CRLR共同序列之比對。
圖13A-13C展示不同嵌合CGRP受體與抗CGRP R抗體結合之代表性FACS資料。
圖14展示來源於單獨CGRP R之AspN消化(層析圖A)及來源於含有CGRP R單株抗體12G8之對照樣本之消化(層析圖B)的肽圖。
圖15展示在不同濃度之CGRP R中和性抗體存在下CGRP R之AspN消化。
圖16展示在不同濃度之CGRP R中和性抗體4E4存在下CGRP R之AspN消化。
圖17展示在抗體32H7存在下表現各種受體組份之細胞的免疫組織化學染色強度。
(無元件符號說明)

Claims (26)

  1. 一種分離之抗體或其抗原結合片段，其包含(i)重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1、CDRH2及CDRH3之互補決定區，及(ii)輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1、CDRL2及CDRL3之互補決定區，其中CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：42、43及44之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：73、74及75之序列；且其中與人類AM1、AM2或澱粉素受體相比，該分離之抗體或其抗原結合片段可選擇性抑制人類CGRP受體。
  2. 如請求項1之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該分離之抗體或其抗原結合片段以100或100以上之選擇比選擇性抑制人類CGRP受體。
  3. 如請求項1之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該分離之抗體或其抗原結合片段以KD 100nM特異性結合人類CGRP受體。
  4. 如請求項1之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該分離之抗體或其抗原結合片段在CGRP結合競爭檢定中具有小於10nM之Ki。
  5. 如請求項1之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區(VH)包含與SEQ ID NO：158的胺基酸序列具有至少90%序列一致性之序列。
  6. 如請求項1之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區(VL)包含與SEQ ID NO：137、142或145的胺基 酸序列具有至少90%序列一致性之序列。
  7. 如請求項1之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區(VH)包含SEQ ID NO：158之序列，且該輕鏈可變區(VL)包含SEQ ID NO：142之序列。
  8. 如請求項1之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區(VH)包含SEQ ID NO：158之序列，且該輕鏈可變區(VL)包含SEQ ID NO：137之序列。
  9. 如請求項1之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區(VH)包含SEQ ID NO：158之序列，且該輕鏈可變區(VL)包含SEQ IDNO：145之序列。
  10. 一種分離之抗體，其包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：29扣除任何信號序列之序列，且該輕鏈包含選自SEQ ID NO：12、17或20扣除任何信號序列之序列。
  11. 如請求項10之分離之抗體，其中該重鏈包含SEQ ID NO：29扣除任何信號序列之序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO：17扣除任何信號序列之序列。
  12. 如請求項1至11中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該分離之抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：單株抗體、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體(diabody)及單鏈抗體。
  13. 如請求項12之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該分離之抗體為選自由完全人類抗體、人類化抗體及嵌合抗體組成之群的單株抗體。
  14. 如請求項13之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該單 株抗體為IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型抗體。
  15. 如請求項14之分離之抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體為IgG1或IgG2抗體。
  16. 一種分離之聚核苷酸，其編碼如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  17. 如請求項16之分離之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含選自SEQ ID NO：186、187、188及207之序列。
  18. 如請求項16之分離之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含選自SEQ ID NO：224、229、232、242、247及250之序列。
  19. 一種表現載體，其包含如請求項16至18中任一項之分離之聚核苷酸。
  20. 一種經如請求項19之表現載體轉型的細胞株。
  21. 一種產生如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合片段的方法，其包含培養如請求項20之細胞株，及收集所產生的抗體或其抗原結合片段。
  22. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之賦形劑。
  23. 一種如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合片段之用途，其係用於製備治療患者之CGRP受體相關病狀的醫藥品。
  24. 如請求項23之用途，其中該病狀為頭痛。
  25. 如請求項23之用途，其中該病狀為偏頭痛。
  26. 如請求項23至25中任一項之用途，其中該治療包含預防性治療。
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Families Citing this family (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS20080200A (sr) 2005-11-14 2009-07-15 Rinat Neuroscience Corp., Antagonistička antitela usmerena protiv kalcitonina, peptida povezanog sa genom, i postupak njihovog korišćenja
EP2220118A2 (en) * 2007-11-21 2010-08-25 Amgen Inc. Wise binding antibodies and epitopes
US8293239B2 (en) 2008-03-04 2012-10-23 Pfizer Limited Methods of treating chronic pain
JO3382B1 (ar) * 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
CA2771186C (en) 2009-08-28 2018-01-02 Rinat Neuroscience Corporation Methods for treating visceral pain by administering antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide
NZ732970A (en) 2011-05-20 2022-08-26 H Lundbeck As Use of anti-cgrp antibodies and antibody fragments to prevent or inhibit photophobia or light aversion in subjects in need thereof, especially migraine sufferers
RS58621B1 (sr) 2011-05-20 2019-05-31 Alderbio Holdings Llc Anti-cgrp kompozicije i njihova upotreba
JP6189832B2 (ja) 2011-05-20 2017-08-30 アルダーバイオ・ホールディングズ・エルエルシー 慢性および急性の下痢を治療または予防するための抗ｃｇｒｐ若しくは抗ｃｇｒｐ−ｒの抗体または抗体断片の使用
EP2970483A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 Amgen Inc. Methods and compositions relating to anti-ccr7 antigen binding proteins
EA032830B1 (ru) * 2013-03-15 2019-07-31 Эмджен Инк. Антитела к pac1 человека и их применение для лечения головной боли
US20170114122A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Alderbio Holdings Llc Regulation of glucose metabolism using anti-cgrp antibodies
EP3722442B1 (en) 2013-08-05 2023-04-05 Twist Bioscience Corporation De novo synthesized gene libraries
CA3168888A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
AU2014340171B2 (en) 2013-10-24 2019-05-30 Amgen Inc. Injector and method of assembly
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
KR102274964B1 (ko) * 2014-03-21 2021-07-09 테바 파마슈티컬스 인터내셔널 게엠베하 칼시토닌 유전자-관련 펩티드에 대한 길항제 항체 및 그의 사용 방법
US10556945B2 (en) 2014-03-21 2020-02-11 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same
WO2015171777A1 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
KR102416904B1 (ko) 2014-06-03 2022-07-04 암겐 인코포레이티드 약물 전달 디바이스에 의해 수집된 데이터를 원격으로 프로세싱하기 위한 시스템들 및 방법들
CA2960756C (en) 2014-09-15 2023-08-01 Amgen Inc. Bi-specific anti-cgrp receptor/pac1 receptor antigen binding proteins and uses thereof
US10695506B2 (en) 2014-10-14 2020-06-30 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
US11357916B2 (en) 2014-12-19 2022-06-14 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
US10799630B2 (en) 2014-12-19 2020-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
CA2973964A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for ror1
US10669304B2 (en) 2015-02-04 2020-06-02 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
AU2016220141B2 (en) 2015-02-17 2018-07-12 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
ES2905870T3 (es) 2015-02-27 2022-04-12 Amgen Inc Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja
US9981239B2 (en) 2015-04-21 2018-05-29 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
JOP20200116A1 (ar) * 2015-04-24 2017-06-16 Amgen Inc طرق لعلاج أو الوقاية من الصداع النصفي
WO2016183479A1 (en) 2015-05-13 2016-11-17 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Variants of adrenomedullin and calcitonin gene-related peptide and methods of use
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
CA2998169A1 (en) 2015-09-18 2017-03-23 Twist Bioscience Corporation Oligonucleic acid variant libraries and synthesis thereof
US11512347B2 (en) 2015-09-22 2022-11-29 Twist Bioscience Corporation Flexible substrates for nucleic acid synthesis
ES2755717T3 (es) 2015-12-09 2020-04-23 Amgen Inc Autoinyector con tapa de señalización
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
AU2017213844A1 (en) 2016-02-02 2018-08-02 Fred Hutchinson Cancer Center Anti-ROR1 antibodies and uses thereof
WO2017160799A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
KR20190005873A (ko) 2016-04-15 2019-01-16 앨더 바이오파마슈티컬즈, 인코포레이티드 항-pacap 항체 및 그의 용도
US11541168B2 (en) 2016-04-29 2023-01-03 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
WO2017197222A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
EP3458988B1 (en) 2016-05-16 2023-10-18 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
EP3465124B1 (en) 2016-06-03 2026-02-11 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
US11285266B2 (en) 2016-07-01 2022-03-29 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
CN110248724B (zh) 2016-09-21 2022-11-18 特韦斯特生物科学公司 基于核酸的数据存储
US20180111984A1 (en) 2016-09-23 2018-04-26 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Treating cluster headache
FI3515937T3 (fi) 2016-09-23 2026-02-11 Teva Pharmaceuticals Int Gmbh Refraktaarisen migreenin hoito
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
US11993645B2 (en) 2017-01-11 2024-05-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions comprising R-Spondin (RSPO) surrogate molecules
US20190358411A1 (en) 2017-01-17 2019-11-28 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
WO2018140821A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Surrozen, Inc. Tissue-specific wnt signal enhancing molecules and uses thereof
JP7280189B2 (ja) 2017-02-17 2023-05-23 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達装置用の挿入機構
MX2019009625A (es) 2017-02-17 2019-10-09 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con trayectoria de flujo de fluido esteril y metodo relacionado de ensamblaje.
SG11201907713WA (en) 2017-02-22 2019-09-27 Twist Bioscience Corp Nucleic acid based data storage
AU2018226811A1 (en) 2017-03-02 2019-09-26 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Selecting headache patients responsive to antibodies directed against calcitonin gene related peptide
JP2020508803A (ja) 2017-03-06 2020-03-26 アムジエン・インコーポレーテツド 作動防止特徴部を備える薬物送達デバイス
IL268478B2 (en) 2017-03-07 2023-10-01 Amgen Inc Inserting a needle using super pressure
AU2018230486B2 (en) 2017-03-09 2023-05-11 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
KR20240042212A (ko) 2017-03-28 2024-04-01 암겐 인코포레이티드 플런저 로드 및 주사기 조립 시스템 및 방법
EP3634539A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
CN110709121B (zh) 2017-06-08 2022-06-24 安进公司 扭矩驱动式药物递送装置
MA49447A (fr) 2017-06-22 2020-04-29 Amgen Inc Réduction des impacts/chocs d'activation d'un dispositif
US11395880B2 (en) 2017-06-23 2022-07-26 Amgen Inc. Electronic drug delivery device
ES2972207T3 (es) 2017-07-14 2024-06-11 Amgen Inc Sistema de inserción-retracción de agujas con sistema de resorte de torsión doble
EP4292576A3 (en) 2017-07-21 2024-01-17 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
JP7242562B2 (ja) 2017-07-25 2023-03-20 アムジエン・インコーポレーテツド 容器アクセスシステムを有する薬物送達デバイス及び関連する組立方法
US11617837B2 (en) 2017-07-25 2023-04-04 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
MA49897A (fr) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc Injecteur sur-corps avec patch adhésif stérile
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
US11813426B2 (en) 2017-10-06 2023-11-14 Amgen Inc. Drug delivery device including seal member for needle of syringe
MA50348A (fr) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un ensemble d'entraînement et procédé d'assemblage associé
EP3697529B1 (en) 2017-10-20 2023-05-24 Twist Bioscience Corporation Heated nanowells for polynucleotide synthesis
US11305026B2 (en) 2017-11-03 2022-04-19 Amgen Inc. Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
ES2994389T3 (en) 2017-11-06 2025-01-23 Amgen Inc Drug delivery device with placement and flow sensing
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
CA3079665A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Amgen Inc. Plungers for drug delivery devices
CA3079540A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
AR114080A1 (es) 2018-01-12 2020-07-22 Amgen Inc Anticuerpos pac1 y sus usos
WO2019195185A1 (en) 2018-04-02 2019-10-10 Amgen Inc. Erenumab compositions and uses thereof
US20210163531A1 (en) 2018-04-12 2021-06-03 Amgen Inc. Methods for making stable protein compositions
IL278771B2 (en) 2018-05-18 2025-09-01 Twist Bioscience Corp Polynucleotides, reagents and methods for nucleic acid hybridization
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
US12466884B2 (en) 2018-07-09 2025-11-11 Surrozen Operating, Inc. Tissue-specific WNT signal enhancing molecules and uses
CN112469454B (zh) 2018-07-24 2024-01-26 安进公司 用于施用药物的输送装置
CN112351804A (zh) 2018-07-24 2021-02-09 安进公司 用于施用药物的输送装置
US12303677B2 (en) 2018-07-24 2025-05-20 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
US12109389B2 (en) 2018-07-31 2024-10-08 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
AU2019347710B2 (en) 2018-09-24 2025-05-08 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
AU2019350660B2 (en) 2018-09-28 2024-09-26 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
EP3860685A1 (en) 2018-10-02 2021-08-11 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
AR116607A1 (es) 2018-10-05 2021-05-26 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con indicador de dosis
MX2021004219A (es) 2018-10-15 2021-05-27 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con mecanismo de amortiguacion.
EP3866889A1 (en) 2018-10-15 2021-08-25 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
US12485219B2 (en) 2018-11-01 2025-12-02 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
MA54048A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament
US12357959B2 (en) 2018-12-26 2025-07-15 Twist Bioscience Corporation Highly accurate de novo polynucleotide synthesis
PH12021551478A1 (en) 2019-01-08 2022-05-02 H Lundbeck As Acute treatment and rapid treatment of headache using anti-cgrp antibodies
KR20210143766A (ko) * 2019-02-26 2021-11-29 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 Glp1 수용체에 대한 변이체 핵산 라이브러리
AU2020263289B2 (en) 2019-04-24 2025-05-22 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
WO2020239014A1 (zh) * 2019-05-30 2020-12-03 山东博安生物技术有限公司 抗cgrp抗体及其应用
AU2020304671A1 (en) 2019-06-28 2022-01-20 Amgen Inc. Anti-CGRP receptor/anti-PAC1 receptor bispecific antigen binding proteins
CA3148261A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
WO2021061842A1 (en) 2019-09-23 2021-04-01 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for single domain antibodies
EP4464827A3 (en) 2019-09-23 2025-02-26 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for crth2
AU2020202454A1 (en) 2020-04-06 2021-10-21 H. Lundbeck A/S Treatment of most bothersome symptom (MBS) associated with migraine using anti-CGRP antibodies
EP4243878A4 (en) 2020-11-16 2025-05-14 Surrozen Operating, Inc. Liver-specific WNT signal-enhancing molecules and their uses
MX2023010115A (es) 2021-03-02 2023-11-09 Cgrp Diagnostics Gmbh Tratamiento y/o reducción de la aparición de la migraña.
CN117320964A (zh) 2021-05-21 2023-12-29 美国安进公司 优化药物容器的灌装方案的方法
WO2023026205A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Cgrp Diagnostics Gmbh Preventative treatment of migraine
AU2023264616A1 (en) * 2022-05-05 2024-10-24 Amgen Inc. Heteromultimer binding dll3 and cd3
TW202432600A (zh) 2022-11-07 2024-08-16 美商安進公司 用於治療肥胖症之方法
WO2025226754A1 (en) 2024-04-23 2025-10-30 Amgen Inc. Method for predicting osmolality of protein solutions
CN118459595A (zh) * 2024-05-21 2024-08-09 杭州百懿生物药业有限公司 特异性结合cgrp受体的抗体分子及其用途
WO2026030152A1 (en) 2024-07-29 2026-02-05 Amgen Inc. System and method for assessing transferability of a fill recipe

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5866124A (en) * 1992-03-17 1999-02-02 Novartis Corporation Antiidiotypic antibodies for high molecular weight-melanoma associated antigen
US20060018909A1 (en) * 2001-10-11 2006-01-26 Oliner Jonathan D Angiopoietin-2 specific binding agents
WO2006068953A2 (en) * 2004-12-21 2006-06-29 Astrazeneca Ab Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
WO2007045927A2 (en) * 2005-10-18 2007-04-26 University Of Sheffield Therapeutic agent

Family Cites Families (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
DE3474511D1 (en) 1983-11-01 1988-11-17 Terumo Corp Pharmaceutical composition containing urokinase
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
AU597574B2 (en) 1986-03-07 1990-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
ATE87659T1 (de) 1986-09-02 1993-04-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5011912A (en) 1986-12-19 1991-04-30 Immunex Corporation Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system
US4965195A (en) 1987-10-26 1990-10-23 Immunex Corp. Interleukin-7
US4968607A (en) 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1990005183A1 (en) 1988-10-31 1990-05-17 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JPH02229119A (ja) 1989-02-28 1990-09-11 Toyo Jozo Co Ltd 動脈硬化予防および治療剤
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5292658A (en) 1989-12-29 1994-03-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center Cloning and expressions of Renilla luciferase
DK0463151T3 (da) 1990-01-12 1996-07-01 Cell Genesys Inc Frembringelse af xenogene antistoffer
US6713610B1 (en) 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
WO1991018982A1 (en) 1990-06-05 1991-12-12 Immunex Corporation Type ii interleukin-1 receptors
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69127627T2 (de) 1990-08-29 1998-02-19 Genpharm Int Produktion und Nützung nicht-menschliche transgentiere zur Produktion heterologe Antikörper
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2105984C (en) 1991-03-11 2002-11-26 Milton J. Cormier Cloning and expression of renilla luciferase
CA2111348A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 John S. Logan Production of human hemoglobin in transgenic pigs
CA2113113A1 (en) 1991-07-08 1993-01-21 Simon W. Kantor Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
US5262522A (en) 1991-11-22 1993-11-16 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M and leukemia inhibitory factor
EP0652950B1 (en) 1992-07-24 2007-12-19 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
ES2198414T3 (es) 1992-10-23 2004-02-01 Immunex Corporation Procedimientos para preparar proteinas oligomericas solubles.
US5766880A (en) 1992-10-27 1998-06-16 Queen's University At Kingston Isolated nucleic acid molecules encoding multidrug resistance proteins
US5457035A (en) 1993-07-23 1995-10-10 Immunex Corporation Cytokine which is a ligand for OX40
WO1995007463A1 (en) 1993-09-10 1995-03-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green fluorescent protein
WO1995021191A1 (en) 1994-02-04 1995-08-10 William Ward Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein
WO1996003993A2 (en) 1994-08-05 1996-02-15 The Rockefeller University Modulation of thymocyte and t cell functional activity
WO1996005221A1 (en) 1994-08-16 1996-02-22 Human Genome Sciences, Inc. Calcitonin receptor
US5777079A (en) 1994-11-10 1998-07-07 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
KR100654645B1 (ko) 1995-04-27 2007-04-04 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US5804387A (en) 1996-02-01 1998-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)
US5876995A (en) 1996-02-06 1999-03-02 Bryan; Bruce Bioluminescent novelty items
US5925558A (en) 1996-07-16 1999-07-20 The Regents Of The University Of California Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
WO1998003534A1 (en) 1996-07-23 1998-01-29 Smithkline Beecham Corporation Calcitonin gene-related peptide receptor component factor (houdc44)
US5976796A (en) 1996-10-04 1999-11-02 Loma Linda University Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes
US6255455B1 (en) * 1996-10-11 2001-07-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rh(D)-binding proteins and magnetically activated cell sorting method for production thereof
JP4215172B2 (ja) 1996-12-03 2009-01-28 アムジェン フレモント インク． 複数のＶ▲下Ｈ▼およびＶ▲下κ▼領域を含むヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック哺乳動物、ならびにそれから産生される抗体
WO1998026277A2 (en) 1996-12-12 1998-06-18 Prolume, Ltd. Apparatus and method for detecting and identifying infectious agents
CA2196496A1 (en) 1997-01-31 1998-07-31 Stephen William Watson Michnick Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions
DE19732944A1 (de) 1997-07-31 1999-02-04 Thomae Gmbh Dr K Peptidische CGRP-Antagonisten
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
AU765703B2 (en) 1998-03-27 2003-09-25 Bruce J. Bryan Luciferases, fluorescent proteins, nucleic acids encoding the luciferases and fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics, high throughput screening and novelty items
US6268474B1 (en) 1998-04-30 2001-07-31 Creighton University Peptide antagonists of CGRP-receptor superfamily and methods of use
US6210924B1 (en) 1998-08-11 2001-04-03 Amgen Inc. Overexpressing cyclin D 1 in a eukaryotic cell line
WO2000009560A2 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
AU1936201A (en) * 1999-12-02 2001-06-12 Myriad Genetics, Inc. Protein-protein interactions
US20020090646A1 (en) 2000-05-03 2002-07-11 Amgen Inc. Calcitonin-related molecules
FR2821080B1 (fr) 2001-02-20 2003-12-19 Sanofi Synthelabo Anticorps specifique de l'adrenomedulline humaine, composition pharmaceutique le contenant, ses applications therapeutiques
WO2002102973A2 (en) * 2001-06-20 2002-12-27 Prochon Biotech Ltd. Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
ATE453661T1 (de) 2001-09-27 2010-01-15 Merck & Co Inc Isolierte dna-moleküle, die für einen humanisierten calcitonin gene-related peptide receptor kodieren, damit verwandte, nichthumane transgene tiere und assayverfahren
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
ATE547430T1 (de) * 2002-01-18 2012-03-15 Zymogenetics Inc Multimere des cytokinrezeptors zcytor17
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040110170A1 (en) 2002-05-18 2004-06-10 The Regents Of The University Of California Cloning and characterization of calcitonin gene related peptide receptors
US20070071744A1 (en) * 2002-06-07 2007-03-29 Gotz Munch Agents which bind to epitopes of glycoprotein VI
DK1556020T3 (da) * 2002-08-12 2009-06-22 Birkir Sveinsson Anvendelse af CGRP-antagonistforbindelser til behandling af psoriasis
US20040176577A1 (en) * 2002-09-10 2004-09-09 Eva Rojer Immunoassays for specific determination of SCCA isoforms
WO2004097421A2 (en) 2003-04-29 2004-11-11 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with calcitonin receptor-like receptor (calcrl)
KR20120034237A (ko) 2004-02-11 2012-04-10 아밀린 파마슈티칼스, 인크. 선택가능한 특성을 갖는 하이브리드 폴리펩티드
US7423128B2 (en) * 2004-11-03 2008-09-09 Amgen Fremont Inc. Anti-properdin antibodies, and methods for making and using same
JP4993606B2 (ja) 2005-06-16 2012-08-08 隆行 新藤 Ｒａｍｐ２を標的とする血管構造の安定化剤及び血管新生剤
US8168592B2 (en) 2005-10-21 2012-05-01 Amgen Inc. CGRP peptide antagonists and conjugates
RS20080200A (sr) 2005-11-14 2009-07-15 Rinat Neuroscience Corp., Antagonistička antitela usmerena protiv kalcitonina, peptida povezanog sa genom, i postupak njihovog korišćenja
WO2007076336A1 (en) * 2005-12-22 2007-07-05 Eli Lilly And Company Treatment of migraine with anti-cgrp antibodies
TW200815474A (en) * 2006-08-03 2008-04-01 Astrazeneca Ab Antibodies alphaVbeta6 and uses thereof
GB0708002D0 (en) * 2007-04-25 2007-06-06 Univ Sheffield Antibodies
MX2010009724A (es) 2008-03-04 2010-09-28 Pfizer Ltd Procedimientos de tratamiento del dolor inflamatorio-.
FR2934597B1 (fr) 2008-07-31 2013-04-19 Univ Aix Marseille Ii Anticorps se liant aux recepteurs de l'adrenomedulline et leurs utilisations comme medicament.
JO3382B1 (ar) 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
CA2771186C (en) 2009-08-28 2018-01-02 Rinat Neuroscience Corporation Methods for treating visceral pain by administering antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide
US9401875B2 (en) 2012-06-01 2016-07-26 Nippon Telegraph And Telephone Corporation Packet transfer processing method and packet transfer processing device
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof
CA2960756C (en) 2014-09-15 2023-08-01 Amgen Inc. Bi-specific anti-cgrp receptor/pac1 receptor antigen binding proteins and uses thereof
JOP20200116A1 (ar) 2015-04-24 2017-06-16 Amgen Inc طرق لعلاج أو الوقاية من الصداع النصفي
US11385238B2 (en) * 2017-06-30 2022-07-12 Amgen Inc. Methods of protein clips recovery
WO2019195185A1 (en) * 2018-04-02 2019-10-10 Amgen Inc. Erenumab compositions and uses thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5866124A (en) * 1992-03-17 1999-02-02 Novartis Corporation Antiidiotypic antibodies for high molecular weight-melanoma associated antigen
US20060018909A1 (en) * 2001-10-11 2006-01-26 Oliner Jonathan D Angiopoietin-2 specific binding agents
WO2006068953A2 (en) * 2004-12-21 2006-06-29 Astrazeneca Ab Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
WO2007045927A2 (en) * 2005-10-18 2007-04-26 University Of Sheffield Therapeutic agent

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Christopher K. Taylor et al." Pharmacological characterization of novel alpha-calcitonin gene-related peptide (CGRP) receptor peptide antagonists that are selective for human CGRP receptors" JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS, Volume: 319, Pages: 749-757, 2006. *

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Publication number Publication date
ZA201105418B (en) 2012-02-29
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