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TWI548418B - Anti-NR10 / IL-31RA antibody and its use - Google Patents

Anti-NR10 / IL-31RA antibody and its use Download PDF

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TWI548418B
TWI548418B TW097147385A TW97147385A TWI548418B TW I548418 B TWI548418 B TW I548418B TW 097147385 A TW097147385 A TW 097147385A TW 97147385 A TW97147385 A TW 97147385A TW I548418 B TWI548418 B TW I548418B
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TW
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antibody
amino acid
seq
acid sequence
variable region
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TW097147385A
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TW200932266A (en
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倉持太一
糟谷惠子
大山創平
角田浩行
井川智之
橘達彥
白岩宙丈
江崎圭子
Original Assignee
中外製藥股份有限公司
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Publication date
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Publication of TW200932266A publication Critical patent/TW200932266A/zh
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Description

抗NR10/IL-31RA抗體及其應用
本發明係關於抗NR10抗體，及包含抗NR10抗體之醫藥組成物。
相關於各種細胞之增殖分化，或相關於對於活化已分化成熟之細胞功能之液性因子，已知存在多數細胞介素(cytokine)。於活體，接受到細胞介素刺激之細胞產生其他細胞介素，並且由多數細胞介素形成網路。活體之恆定性，藉由此網路彼此調節，而保持在微妙的平衡。許多免疫發炎性疾病，據認為係由於此等細胞介素‧網路之破綻而生，利用單株抗體之抗細胞介素療法受到重視。例如，抗TNF抗體或抗IL-6受體抗體，於臨床顯示高效果。但是另一方面，實際病態中，會有代償路徑作用，僅將IL-4等一種細胞介素阻斷並無法得到治療效果，失敗例也多。
本案發明人等，成功地離析出與IL-6之訊息傳遞受體gp130相同性高的新穎細胞介素受體NR10(專利文獻1)。NR10，與抑瘤素(oncostatin)M受體(OSMR)形成異二聚體，並作為IL-31受體之功能(非專利文獻1)。關於IL-31，有人報告IL-31過度表現之基因轉殖小鼠會自然產生搔癢性皮膚炎(專利文獻2)。
結合於NR10且抑制IL-31與NR10結合之抗體被認為對於發炎性疾病之治療有效，但是為了將抗NR10抗體於臨床使用，必需要免疫原性低之抗體。又，為了發揮高治療效果，希望有對於NR10之結合活性或中和活性高之抗體。
又，本發明之先前技術文獻如以下所示。
【專利文獻1】WO00/75314
【專利文獻2】WO03/060090
【非專利文獻1】IL-31 is associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis.,J Allergy Clin Immunol. 2006 Feb;117(2):418-25.
鑑於上述背景，本發明之課題在於提供：抗NR10抗體，及包含抗NR10抗體之醫藥組成物。
本案發明人等為了解決上述課題努力研究。本案發明人等，成功地取得對於NR10具有效中和活性之抗NR10抗體。再者，本案發明人等成功地將維持著抗體活性之抗體予以人類化。再者，本案發明人等成功地製作藥物動態提升、對於抗原之結合活性增強、安定性提升，及/或免疫原性風險減低之抗體。該抗體作為發炎性疾病治療劑有用。
本發明係關於抗NR10抗體，及包含抗NR10抗體之醫藥組成物，更具體而言，包含以下[1]～[15]之發明。
[1]　一種抗體，辨識NR10之結構域(domain)1。
[2]　如[1]之抗體，其具中和活性。
[3]　如[1]或[2]之抗體，為人類化抗體。
[4]　如以下(1)～(8)中任一項記載之抗NR10抗體；
(1)　一種具有重鏈可變區之抗體，該重鏈可變區包含：具序列識別號：1之胺基酸序列的CDR1，具有序列識別號：2之胺基酸序列的CDR2，具序列識別號：3之胺基酸序列的CDR3。
(2)　一種抗體，具序列識別號：4之重鏈可變區。
(3)　一種具有輕鏈可變區之抗體，該輕鏈可變區包含：具序列識別號：5之胺基酸序列的CDR1，具序列識別號：6之胺基酸序列的CDR2，具序列識別號：7之胺基酸序列的CDR3。
(4)　一種抗體，具序列識別號：8之輕鏈可變區。
(5)　一種抗體，具(1)之重鏈可變區及(3)之輕鏈可變區。
(6)　一種抗體，具(2)之重鏈可變區及(4)之輕鏈可變區。
(7)　一種與(1)～(6)中任一項之抗體具同等活性之抗體，其中(1)～(6)中任一項之抗體中1或多數胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入。
(8)　一種抗體，結合於與(1)～(7)中任一項之抗體所結合之抗原決定位相同之抗原決定位。
[5]　一種以下(1)～(8)中任一項之抗NR10抗體；
(1)　一種具有重鏈可變區之抗體，該重鏈可變區包含:具序列識別號：9之胺基酸序列的CDR1，具序列識別號：10之胺基酸序列的CDR2，具序列識別號：11之胺基酸序列的CDR3。
(2)　一種抗體，包含序列識別號：12之重鏈可變區。
(3)　一種具有輕鏈可變區之抗體，該輕鏈可變區包含：具序列識別號：13之胺基酸序列的CDR1，具序列識別號：14之胺基酸序列的CDR2，具序列識別號：15之胺基酸序列的CDR3。
(4)　一種抗體，包含序列識別號：16之輕鏈可變區。
(5)　一種抗體，包含(1)之重鏈可變區及(3)之輕鏈可變區。
(6)　一種抗體，包含(2)之重鏈可變區及(4)之輕鏈可變區。
(7)　一種與(1)～(6)中任一項之抗體具同等活性之抗體，其中(1)～(6)中任一項之抗體中1或多數胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入。
(8)　一種抗體，結合於與(1)～(7)中任一項之抗體所結合之抗原決定位相同之抗原決定位。
[6]　如以下(1)～(8)中任一項之抗NR10抗體；
(1)　一種具有重鏈可變區之抗體，該重鏈可變區包含：具有序列識別號：17之胺基酸序列的CDR1，具有序列識別號：18之胺基酸序列的CDR2，具有序列識別號：19之胺基酸序列的CDR3。
(2)　一種抗體，包含序列識別號：20之重鏈可變區。
(3)　一種具有輕鏈可變區之抗體，該輕鏈可變區包含：具序列識別號：21之胺基酸序列的CDR1，具序列識別號：22之胺基酸序列的CDR2，具序列識別號：23之胺基酸序列的CDR3。
(4)　一種抗體，包含序列識別號：24之輕鏈可變區。
(5)　一種抗體，包含(1)之重鏈可變區及(3)之輕鏈可變區。
(6)　一種抗體，包含(2)之重鏈可變區及(4)之輕鏈可變區。
(7)　一種與(1)～(6)中任一項之抗體具同等活性之抗體，其中(1)～(6)中任一項之抗體中1或多數胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入。
(8)　一種抗體，結合於與(1)～(7)中任一項之抗體所結合之抗原決定位相同之抗原決定位。
[7]　如以下(1)～(8)中任一項之抗NR10抗體；
(1)　一種具有重鏈可變區之抗體，該重鏈可變區包含：CDR1，具有序列識別號：25之胺基酸序列；CDR2，具有序列識別號：26之胺基酸序列；CDR3，具有序列識別號：27之胺基酸序列。
(2)　一種抗體，包含序列識別號：28之重鏈可變區。
(3)　一種具有輕鏈可變區之抗體，該輕鏈可變區包含：具序列識別號：29之胺基酸序列的CDR1，具序列識別號：30之胺基酸序列的CDR2，具序列識別號：31之胺基酸序列的CDR3。
(4)　一種抗體，包含序列識別號：32之輕鏈可變區。
(5)　一種抗體，包含(1)之重鏈可變區及(3)之輕鏈可變區。
(6)　一種抗體，包含(2)之重鏈可變區及(4)之輕鏈可變區。
(7)　一種與(1)～(6)中任一項之抗體具同等活性之抗體，其中在(1)～(6)中任一項之抗體中，1或多數胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入。
(8)　一種抗體，結合於與(1)～(7)中任一項之抗體所結合之抗原決定位相同之抗原決定位。
[8]　以下(1)～(20)中任一項之抗體可變區，或抗體；
(1)　一種重鏈可變區(H17)，包含序列識別號：196之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：11之CDR3。
(2)　一種重鏈可變區(H19)，包含序列識別號：176之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：11之CDR3。
(3)　一種重鏈可變區(H28、H42)，包含序列識別號：196之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：184之CDR3。
(4)　一種重鏈可變區(H30、H44)，包含序列識別號：9之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：184之CDR3。
(5)　一種重鏈可變區(H34、H46)，包含序列識別號：176之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：184之CDR3。
(6)　一種重鏈可變區(H57、H78)，包含序.列識別號：9之CDR1、序列識別號：198之CDR2、序列識別號：184之CDR3。
(7)　一種重鏈可變區(H71、H92)，包含序列識別號：176之CDR1、序列識別號：198之CDR2、序列識別號：184之CDR3。
(8)　一種重鏈可變區(H97、H98)，包含序列識別號：9之CDR1、序列識別號：199之CDR2、序列識別號：184之CDR3。
(9)　一種輕鏈可變區(L11)，包含序列識別號：200之CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3。
(10)　一種輕鏈可變區(L12)，包含序列識別號：201之CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3。
(11)　一種輕鏈可變區(L17)，包含序列識別號：202之CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3。
(12)　一種輕鏈可變區(L50)，包含序列識別號：203之CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3。
(13)　一種抗體，包含(3)之重鏈可變區及(11)之輕鏈可變區。
(14)　一種抗體，包含(4)之重鏈可變區及(11)之輕鏈可變區。
(15)　一種抗體，包含(5)之重鏈可變區及(11)之輕鏈可變區。
(16)　一種抗體，包含(6)之重鏈可變區及(11)之輕鏈可變區。
(17)　一種抗體，包含(7)之重鏈可變區及(11)之輕鏈可變區。
(18)　一種抗體，包含(8)之重鏈可變區及(12)之輕鏈可變區。
(19)　一種與(13)～(18)中任一項之抗體具同等活性之抗體，其中在(13)～(18)中任一項之抗體中，1或多數胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入。
(20)　一種抗體，結合於與(13)～(18)中任一項之抗體所結合之抗原決定位相同之抗原決定位。
[9]　以下(1)～(32)中任一項之抗體可變區或抗體；
(1)　一種重鏈可變區(H17)，具序列識別號：204之胺基酸序列。
(2)　一種重鏈可變區(H19)，具序列識別號：205之胺基酸序列。
(3)　一種重鏈可變區(H28)，具序列識別號：206之胺基酸序列。
(4)　一種重鏈可變區(H30)，具序列識別號：207之胺基酸序列。
(5)　一種重鏈可變區(H34)，具序列識別號：208之胺基酸序列。
(6)　一種重鏈可變區(H42)，具序列識別號：209之胺基酸序列。
(7)　一種重鏈可變區(H44)，具序列識別號：210之胺基酸序列。
(8)　一種重鏈可變區(H46)，具序列識別號：211之胺基酸序列。
(9)　一種重鏈可變區(H57)，具序列識別號：212之胺基酸序列。
(10)　一種重鏈可變區(H71)，具序列識別號：213之胺基酸序列。
(11)　一種重鏈可變區(H78)，具序列識別號：214之胺基酸序列。
(12)　一種重鏈可變區(H92)，具序列識別號：215之胺基酸序列。
(13)　一種重鏈可變區(H97)，具序列識別號：216之胺基酸序列。
(14)　一種重鏈可變區(H98)，具序列識別號：217之胺基酸序列。
(15)　一種輕鏈可變區(L11)，具序列識別號：218之胺基酸序列。
(16)　一種輕鏈可變區(L12)，具序列識別號：219之胺基酸序列。
(17)　一種輕鏈可變區(L17)，具序列識別號：220之胺基酸序列。
(18)　一種輕鏈可變區(L50)，具序列識別號：221之胺基酸序列。
(19)　一種抗體(H28L17)，包含(3)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(20)　一種抗體(H30L17)，包含(4)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(21)　一種抗體(H34L17)，包含(5)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(22)　一種抗體(H42L17)，包含(6)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(23)　一種抗體(H44L17)，包含(7)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(24)　一種抗體(H46L17)，包含(8)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(25)　一種抗體(H57L17)，包含(9)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(26)　一種抗體(H71L17)，包含(10)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(27)　一種抗體(H78L17)，包含(11)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(28)　一種抗體(H92L17)，包含(12)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(29)　一種抗體(H97L50)，包含(13)之重鏈可變區及(18)之輕鏈可變區。
(30)　一種抗體(H98L50)，包含(14)之重鏈可變區及(18)之輕鏈可變區。
(31)　一種與(19)～(30)中任一項之抗體具同等活性之抗體，其中在(19)～(30)中任一項之抗體中，1或多數胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入。
(32)　一種抗體，結合於與(19)～(30)中任一項之抗體所結合之抗原決定位相同之抗原決定位。
[10]　如[4]至[9]中任一項之抗NR10抗體，為人類化抗體。
[11]　以下(1)～(32)中任一項之抗體重鏈、抗體輕鏈、或抗體：
(1)　一種重鏈(H17)，具序列識別號：222之胺基酸序列。
(2)　一種重鏈(H19)，具序列識別號：223之胺基酸序列。
(3)　一種重鏈(H28)，具序列識別號：224之胺基酸序列。
(4)　一種重鏈(H30)，具序列識別號：225之胺基酸序列。
(5)　一種重鏈(H34)，具序列識別號：226之胺基酸序列。
(6)　一種重鏈(H42)，具序列識別號：227之胺基酸序列。
(7)　一種重鏈(H44)，具序列識別號：228之胺基酸序列。
(8)　一種重鏈(H46)，具序列識別號：229之胺基酸序列。
(9)　一種重鏈(H57)，具序列識別號：230之胺基酸序列。
(10)　一種重鏈(H71)，具序列識別號：231之胺基酸序列。
(11)　一種重鏈(H78)，具序列識別號：232之胺基酸序列。
(12)　一種重鏈(H92)，具序列識別號：233之胺基酸序列。
(13)　一種重鏈(H97)，具序列識別號：234之胺基酸序列。
(14)　一種重鏈(H98)，具序列識別號：235之胺基酸序列。
(15)　一種輕鏈(L11)，具序列識別號：236之胺基酸序列。
(16)　一種輕鏈(L12)，具序列識別號：237之胺基酸序列。
(17)　一種輕鏈(L17)，具序列識別號：238之胺基酸序列。
(18)　一種輕鏈(L50)，具序列識別號：239之胺基酸序列。
(19)　一種抗體(H28L17)，包含(3)之重鏈與(17)之輕鏈。
(20)　一種抗體(H30L17)，包含(4)之重鏈與(17)之輕鏈。
(21)　一種抗體(H34L17)，包含(5)之重鏈與(17)之輕鏈。
(22)　一種抗體(H42L17)，包含(6)之重鏈與(17)之輕鏈。
(23)　一種抗體(H44L17)，包含(7)之重鏈與(17)之輕鏈。
(24)　一種抗體(H46L17)，包含(8)之重鏈與(17)之輕鏈。
(25)　一種抗體(H57L17)，包含(9)之重鏈與(17)之輕鏈。
(26)　一種抗體(H71L17)，包含(10)之重鏈與(17)之輕鏈。
(27)　一種抗體(H78L17)，包含(11)之重鏈與(17)之輕鏈。
(28)　一種抗體(H92L17)，包含(12)之重鏈與(17)之輕鏈。
(29)　一種抗體(H97L50)，包含(13)之重鏈與(18)之輕鏈。
(30)　一種抗體(H98L50)，包含(14)之重鏈與(18)之輕鏈。
(31)　一種與(19)～(30)中任一項之抗體具同等活性之抗體，其中在(19)～(30)中任一項之抗體中，1或多數胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入。
(32)　一種抗體，結合於與(19)～(30)中任一項之抗體所結合之抗原決定位相同之抗原決定位。
[12]　一種醫藥組成物，包含[1]～[11]中任一項之抗體。
[13]　如[12]之醫藥組成物，為發炎性疾病治療劑。
[14]　一種發炎性疾病之治療或預防方法，包含投予[1]～[11]中任一項之抗體之步驟。
[15]　一種[1]～[11]中任一項之抗體之用途，用於發炎性疾病治療劑製造。
NR10
NR10，係與抑瘤素(oncostatin)M受體(OSMR)形成異二聚體，並作為IL-31受體功能之蛋白質。已知亦有glm-r(J Biol Chem 277,16831-6,2002)、GPL(J Biol Chem 278,49850-9,2003)、IL31RA(Nat Immunol 5,752-60,2004)等名稱，本發明之NR10，包含以此種名稱稱呼的蛋白質。
本發明之NR10(也稱為IL31RA、GPL或glm-r)之來源不特別限定，包含人類、小鼠、猴、其他哺乳動物來源的NR10，但較佳為人類、小鼠或猴來源的NR10、尤佳為人類來源的NR10。
人類來源的NR10，已知多數的切割變異體(splicing variant)(WO00/075314)。上述切割變異體之中，NR10.1由662個胺基酸所構成，特徵為具細胞膜貫通區域。又，NR10.2，為由252個胺基酸序列所構成之不具膜貫通區域之類可溶性受體蛋白質。另一方面，作用為細胞膜貫通型受體蛋白質之NR10切割變異.體，已知NR10.3及IL31RAv3。本發明中，人類NR10，只要與抑瘤素(oncostatin)M受體(OSMR)形成異二聚體，且作為IL-31受體功能即不特別限制，但較佳的NR10，例如：NR10.3(也稱為ILRAv4(Nat Immunol 5,752-60,2004))及IL31RAv3。NR10.3(IL31RAv4)，由662個胺基酸所構成(WO00/075314，Nat Immunol 5,752-60,2004)，IL31RAv3由732個胺基酸所構成(GenBank ACCESSION No:NM_139017)。IL31RAv4之胺基酸序列如序列識別號：79所示，IL31RAv3之胺基酸序列如序列識別號：80所示。另一方面，小鼠來源的NR10，例如，由序列識別號：81之胺基酸序列所構成之蛋白質。又，長尾獼猴(Macaca fascicularis)來源的NR10，例如序列識別號：66之胺基酸序列所構成之蛋白質。
抗體(序列)
本發明之抗NR10抗體之較佳態樣，例如下述(A)～(D)中(1)～(8)中任一項之抗NR10抗體。
(A)NS18
(1)一種具有重鏈可變區之抗體，該重鏈可變區包含：具序列識別號：1(HCDR1)之胺基酸序列的CDR1，具序列識別號：2(HCDR2)之胺基酸序列的CDR2，具序列識別號：3(HCDR3)之胺基酸序列的CDR3。
(2)一種抗體，具序列識別號：4(VH)之重鏈可變區。
(3)一種具有輕鏈可變區之抗體，該輕鏈可變區包含：具序列識別號：5(LCDR1)之胺基酸序列的CDR1，具序列識別號：6(LCDR2)之胺基酸序列的CDR2，具序列識別號：7(LCDR3)之胺基酸序列的CDR3。
(4)一種抗體，具序列識別號：8(VL)之輕鏈可變區。
(5)一種抗體，具(1)之重鏈可變區及(3)之輕鏈可變區。
(6)一種抗體，具(2)之重鏈可變區及(4)之輕鏈可變區。
(7)一種與(1)～(6)中任一項之抗體具同等活性之抗體，其中在(1)～(6)中任一項之抗體中，1或多數胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入。
(8)一種抗體，結合於與(1)～(7)中任一項之抗體所結合之抗原決定位相同之抗原決定位。
(B)NS22
(1)　一種具有重鏈可變區之抗體，該重鏈可變區包含：具序列識別號：9(HCDR1)之胺基酸序列的CDR1，具序列識別號：10(HCDR2)之胺基酸序列的CDR2，具序列識別號：11(HCDR3)之胺基酸序列的CDR3。
(2)　一種抗體，具序列識別號：12(VH)之重鏈可變區。
(3)　一種具有輕鏈可變區之抗體，該輕鏈可變區包含：具序列識別號：13(LCDR1)之胺基酸序列的CDR1，具序列識別號：14(LCDR2)之胺基酸序列的CDR2，具序列識別號：15(LCDR3)之胺基酸序列的CDR3。
(4)一種抗體，具序列識別號：16(VL)之輕鏈可變區。
(5)一種抗體，具(1)之重鏈可變區及(3)之輕鏈可變區。
(6)一種抗體，具(2)之重鏈可變區及(4)之輕鏈可變區。
(7)一種與(1)～(6)中任一項之抗體具同等活性之抗體，其中在(1)～(6)中任一項之抗體中，1或多數胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入。
(8)一種抗體，結合於與(1)～(7)中任一項之抗體所結合之抗原決定位相同之抗原決定位。
上述1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入之具體例雖不特限定，但例如可為以下改變。
序列識別號：9之重鏈CDR1中，第3位之Ile取代為其他之胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Val。
序列識別號：9之重鏈CDR1中，第4位之Met取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Ile。
序列識別號：9之重鏈CDR1中，第4位之Met取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Leu。
序列識別號：9之重鏈CDR1中，第3位之Ile取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Ala。
序列識別號：10之重鏈CDR2中，第1位之Leu取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Glu。
序列識別號：10之重鏈CDR2中，第3位之Asn取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Asp。
序列識別號：10之重鏈CDR2中，第13位之Gln取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Asp。
序列識別號：10之重鏈CDR2中，第14位之Lys取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Gln。
序列識別號：10之重鏈CDR2中，第16位之Lys取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Gln。
序列識別號：10之重鏈CDR2中，第17位之Gly取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Asp。
序列識別號：10之重鏈CDR2中，第16位之Lys及第17位之Gly取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如，第16位之Lys取代為Gln、第17位之Gly取代為Asp。
序列識別號：10之重鏈CDR2中，第14位之Lys、第16位之Lys及第17位之Gly取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如，第14位之Lys取代為Gln、第16位之Lys取代為Gln、第17位之Gly取代為Asp。
序列識別號：10之重鏈CDR2中，第13位之Gln、第14位之Lys、第16位之Lys及第17位之Gly取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如，第13位之Gln取代為Asp、第14位之Lys取代為Gln、第16位之Lys取代為Gln、第17位之Gly取代為Asp。
序列識別號：10之重鏈CDR2中，第10位之Ser取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Asp。
序列識別號：10之重鏈CDR2中，第13位之Gln取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Pro。
序列識別號：11之重鏈CDR3中，第3位之Tyr取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Leu。
序列識別號：11之重鏈CDR3中，第10位之Met取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Leu。
序列識別號：11之重鏈CDR3中，第11位之Asp取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Glu。
序列識別號：11之重鏈CDR3中，第12位之Tyr取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Thr或Ser。
序列識別號：11之重鏈CDR3中，第10位之Met、第11位之Asp及第12位之Tyr取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例，例如：第10位之Met取代為Leu、第11位之Asp取代為Glu、及第12位之Tyr取代為Thr。
序列識別號：11之重鏈CDR3中，第11位之Asp及第12位之Tyr取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例，例如第11位之Asp取代為Glu、及第12位之Tyr取代為Thr。
序列識別號：11之重鏈CDR3中，第3位之Tyr、第11位之Asp及第12位之Tyr取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例，例如第3位之Tyr取代為Leu、第11位之Asp取代為Glu、及第12位之Tyr取代為Thr或Ser。
序列識別號：13之輕鏈CDR1中，第1位之Arg取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Gln。
序列識別號：13之輕鏈CDR1中，第5位之Asn取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Asp。
序列識別號：13之輕鏈CDR1中，第1位之Arg及第5位之Asn取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如，第1位之Arg取代為Gln、第5位之Asn取代為Asp。
序列識別號：13之輕鏈CDR1中，第8位之Ser取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Arg。
序列識別號：13之輕鏈CDR1中，第10位之Leu取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Val。
序列識別號：13之輕鏈CDR1中，第8位之Ser及第10位之Leu取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如，第8位之Ser取代為Arg、第10位之Leu取代為Val。
序列識別號：13之輕鏈CDR1中，第2位之Thr取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Ala或Ser。
序列識別號：14之輕鏈CDR2中，第1位之Asn取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Asp。
序列識別號：14之輕鏈CDR2中，第3位之Lys取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Gln。
序列識別號：14之輕鏈CDR2中，第5位之Leu取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Glu。
序列識別號：14之輕鏈CDR2中，第7位之Lys取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Gln或Asp。
序列識別號：14之輕鏈CDR2中，第3位之Lys、第5位之Leu及第7位之Lys取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例，例如第3位之Lys取代為Gln、第5位之Leu取代為Glu、第7位之Lys取代為Gln。
序列識別號：15之輕鏈CDR3中，第5位之Glu取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Asp。
序列識別號：15之輕鏈CDR3中，第6位之Ser取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Asp。
序列識別號：15之輕鏈CDR3中，第9位之Thr取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸雖不特別限定，但較佳例例如Phe。
上述取代可單獨進行，亦可組合多數取代。又，可將上述取代與上述以外之取代組合。藉此等取代，能提升抗體之藥物動態(血漿中滯留性)、增強對於抗原結合活性、提升安定性，及/或減低免疫原性風險。
本發明中，上述取代組合後之可變區具體例，例如：具序列識別號：167記載之胺基酸序列之重鏈可變區或具序列識別號：168記載之胺基酸序列之輕鏈可變區。再者，上述取代組合後之抗體例，例抗體包含：具序列識別號：167記載之胺基酸序列之重鏈可變區及具序列識別號：168記載之胺基酸序列之輕鏈可變區。
又，上述取代組合後之重鏈可變區或輕鏈可變區具體例，例：以下可變區。
(a)一種重鏈可變區(H17)，包含序列識別號：196之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：11之CDR3。
(b)一種重鏈可變區(H19)，包含序列識別號：176之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：11之CDR3。
(c)一種重鏈可變區(H28、H42)，包含序列識別號：196之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：184之CDR3。
(d)一種重鏈可變區(H30、H44)，包含序列識別號：9之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：184之CDR3。
(e)一種重鏈可變區(H34、H46)，包含序列識別號：176之CDR1、序列識別號：197之CDR2、序列識別號：184之CDR3。
(f)一種重鏈可變區(H57、H78)，包含序列識別號：9之CDR1、序列識別號：198之CDR2、序列識別號：184之CDR3。
(g)一種重鏈可變區(H71、H92)，包含序列識別號：176之CDR1、序列識別號：198之CDR2、序列識別號：184之CDR3。
(h)一種重鏈可變區(H97、H98)，包含序列識別號：9之CDR1、序列識別號：199之CDR2、序列識別號：184之CDR3。
(i)一種輕鏈可變區(L11)，包含序列識別號：200之CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3。
(j)一種輕鏈可變區(L12)，包含序列識別號：201之CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3。
(k)一種輕鏈可變區(L17)，包含序列識別號：202之CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3。
(1)一種輕鏈可變區(L50)，包含序列識別號：203之CDR1、序列識別號：170之CDR2、序列識別號：193之CDR3。
再者，上述取代組合後之抗體具體例，例以下抗體。
(i)一種抗體，包含(c)之重鏈可變區及(k)之輕鏈可變區。
(ii)一種抗體，包含(d)之重鏈可變區及(k)之輕鏈可變區。
(iii)一種抗體，包含(e)之重鏈可變區及(k)之輕鏈可變區。
(iv)一種抗體，包含(f)之重鏈可變區及(k)之輕鏈可變區。
(v)一種抗體，包含(g)之重鏈可變區及(k)之輕鏈可變區。
(vi)一種抗體，包含(h)之重鏈可變區及(1)之輕鏈可變區。
(C)NS23
(1)一種具有重鏈可變區之抗體，該重鏈可變區包含：CDR1，具序列識別號：17(HCDR1)之胺基酸序列；CDR2，具序列識別號：18(HCDR2)之胺基酸序列；CDR3，具序列識別號：19(HCDR3)之胺基酸序列。
(2)一種抗體，具序列識別號：20(VH)之重鏈可變區。
(3)一種具有輕鏈可變區之抗體，該輕鏈可變區包含：CDR1，具序列識別號：21(LCDR1)之胺基酸序列；CDR2，具序列識別號：22(LCDR2)之胺基酸序列；CDR3，具序列識別號：23(LCDR3)之胺基酸序列。
(4)一種抗體，具序列識別號：24(VL)之輕鏈可變區。
(5)一種抗體，具(1)之重鏈可變區及(3)之輕鏈可變區。
(6)一種抗體，具(2)之重鏈可變區及(4)之輕鏈可變區。
(7)一種與(1)～(6)中任一項之抗體具同等活性之抗體，其中在(1)～(6)中任一項之抗體中，1或多數胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入。
(8)一種抗體，結合於與(1)～(7)中任一項之抗體所結合之抗原決定位相同之抗原決定位。
(D)NS33
(1)一種具有重鏈可變區之抗體，該重鏈可變區包含：CDR1，具序列識別號：25(HCDR1)之胺基酸序列；CDR2，具序列識別號：26(HCDR2)之胺基酸序列；CDR3，具序列識別號：27(HCDR3)之胺基酸序列。
(2)一種抗體，具有序列識別號：28(VH)之重鏈可變區。
(3)一種具有輕鏈可變區之抗體，該輕鏈可變區包含：CDR1，具序列識別號：29(LCDR1)之胺基酸序列；CDR2，具序列識別號：30(LCDR2)之胺基酸序列；CDR3，具序列識別號：31(LCDR3)之胺基酸序列。
(4)一種抗體，具序列識別號：32(VL)之輕鏈可變區。
(5)一種抗體，具(1)之重鏈可變區及(3)之輕鏈可變區。
(6)一種抗體，具(2)之重鏈可變區及(4)之輕鏈可變區。
(7)一種與(1)～(6)中任一項之抗體具同等活性之抗體，其中在(1)～(6)中任一項之抗體中，1或多數胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入。
(8)一種抗體，結合於與(1)～(7)中任一項之抗體所結合之抗原決定位相同之抗原決定位。
上述(1)或(3)之抗體中可使用任意框架區域(FR)，但使用人類來源的FR較佳。又，上述(1)～(8)之抗體中，固定區可使用任意固定區，但使用人類來源的固定區較佳。本發明之抗體使用之FR或固定區之胺基酸序列，可使用成為來源之原本FR或固定區之胺基酸序列，可也將1或多數之胺基酸予以取代、缺失、加成及/或插入等使成不同的胺基酸序列後使用。
上述NS18之重鏈之胺基酸序列如序列識別號：34所示，編碼為該胺基酸序列之鹼基序列如序列識別號：33所示。又，輕鏈之胺基酸序列如序列識別號：36所示，編碼為該胺基酸序列之鹼基序列如序列識別號：35所示。
NS22之重鏈之胺基酸序列如序列識別號：38所示，編碼為該胺基酸序列之鹼基序列如序列識別號：37所示。又，輕鏈之胺基酸序列如序列識別號：40所示，編碼為該胺基酸序列之鹼基序列如序列識別號：39所示。
NS23之重鏈之胺基酸序列如序列識別號：42所示，編碼為該胺基酸序列之鹼基序列如序列識別號：41所示。又，輕鏈之胺基酸序列如序列識別號：44所示，編碼為該胺基酸序列之鹼基序列如序列識別號：43所示。
NS33之重鏈之胺基酸序列如序列識別號：46所示，編碼為該胺基酸序列之鹼基序列如序列識別號：45所示。又，輕鏈之胺基酸序列如序列識別號：48所示，編碼為該胺基酸序列之鹼基序列如序列識別號：47所示。
本發明中，「與(1)～(6)中任一項之抗體為同等活性」，意指對於NR10(例如人類NR10)之結合活性及/或中和活性同等。本發明中，「同等」，不一定為同程度活性，可為活性增強，又，只要具活性，可為活性減少。活性減少之抗體，例如相較於原本抗體，具30%以上之活性，較佳為具50%以上之活性，更佳為具80%以上之活性的抗體。
上述(1)～(6)中任一項之抗體，只要對於NR10具結合活性及/或中和活性，可將可變區(CDR序列及/或FR序列)之胺基酸序列的1或多數之胺基酸進行取代、缺失、加成及/或插入。就為了製備胺基酸序列中，1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入且對於NR10具結合活性及/或中和活性之抗體之胺基酸序列，可使用該技術領域中具通常知識者熟知的方法，已知對於蛋白質導入變異之方法。例如，該技術領域中具通常知識者，可使用點專一性突變誘發法(Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y,and Nakagawa,M.(1995)An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152,271-275、Zoller,MJ,and Smith,M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100,468-500、Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW,Kramer,B,Pflugfelder,M,and Fritz,HJ(1984)The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12,9441-9456、Rramer W,and Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154,350-367、Kunkel,TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82,488-492)等，藉由在對於NR10具結合活性及/或中和活性之抗體之胺基酸序列導入適當變異，而製備與對於NR10具結合活性及/或中和活性之抗體在功能上為同等之變異體。如此，於可變區中有1或多數之胺基酸變異，且對於NR10具結合活性及/或中和活性之抗體，也包含於本發明之抗體。
改變胺基酸殘基時，希望變異成保存胺基酸側鏈性質之其他胺基酸。例如胺基酸側鏈之性質，例：疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具脂肪族側鏈之胺基酸(G、A、V、L、I、P)、具含羥基側鏈之胺基酸(S、T、Y)、具含硫原子側鏈之胺基酸(C、M)、具含羧酸及醯胺側鏈之胺基酸(D、N、E、Q)、具含鹼側鏈之胺基酸(R、K、H)、及具含芳香族側鏈之胺基酸(H、F、Y、W)(括弧內均以胺基酸之單字母標記表示)。此等各群組內之胺基酸之取代稱為保守性取代。具有相對於某胺基酸序列，1或多數個之胺基酸殘基缺失、加成及/或取代為其他胺基酸而經修飾之胺基酸序列的多胜胺，已知能維持其生物學活性(Mark,D. F. et al.,PrOC. Natl. ACad. SCi. USA(1984)81:5662-6；Zoller,M. J. and Smith,M.,NUcleic Acids Res.(1982)10:6487-500；Wang,A. et al.,Science(1984)224:1431-3；Dalbadie-MCFar land,G. et al.,PrOC. Natl. Acad. Sci. USA(1982)79:6409-13)。此種變異體，與本發明之可變區(例如CDR序列、FR序列、可變區全體)之胺基酸序列具有至少70%、更佳為至少75%、更佳為至少80%、又更佳為至少85%、再更佳為至少90%，且最佳為至少95%記載之胺基酸序列之同一性。本說明書中，序列同一性，定義為：以使序列同一性成為最大之方式視需要將序列整列化，並導入適宜間隔(gap)後，與原本重鏈可變區或輕鏈可變區記載之胺基酸序列之殘基為相同殘基之比例。胺基酸序列之同一性，可用後述方法決定。
又，可變區(CDR序列及/或FR序列)之胺基酸序列中，1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入且對於NR10具結合活性及/或中和活性之可變區之胺基酸序列，可從使編碼為該可變區記載之胺基酸序列之鹼基序列所構成之核酸在嚴苛(strignet)條件下雜交之核酸得到。為了將對於編碼為可變區記載之胺基酸序列之鹼基序列所構成之核酸於嚴苛條件下雜交之核酸離析，嚴苛雜交條件例如：6M尿素、0.4% SDS、0.5 x SSC、37℃之條件或與此同等之嚴苛度之雜交條件。嚴苛度更高之條件，例如6M尿素、0.4% SDS、0.1x SSC之條件，若使用42℃，能期待離析相同性更高之核酸。離析後之核酸序列之決定，可利用後述公知方法進行。離析之核酸之相同性，於鹼基序列全體，具至少50%以上，較佳為70%以上，更佳為90%以上(例如95%、96%、97%、98%、99%以上)之序列同一性。
除了利用上述雜交技術之方法，可利用依據編碼為可變區記載之胺基酸序列之鹼基序列資訊合成之引子的基因放大法，例如利用聚合酶連鎖反應(PCR)法，將與編碼為可變區記載之胺基酸序列之鹼基序列所構成之核酸在嚴苛條件下雜交之核酸予以離析。
鹼基序列及胺基酸序列之同一性，可利用Rarlin及Altschul之演算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:5873-7)決定。依據此演算法，開發了稱為BLASTN或BLASTX之程式(Altschul et al.,J.Mol.Biol.(1990)215:403-10)。依據BLAST，以BLASTN解析鹼基序列時，參數為例如score=100、wordlength=12。又，依據BLAST以BLASTX解析胺基酸序列時，參數例如score=50、wordlength=3。使用BLAST及Gapped BLAST程式時，使用各程式的預設參數。該等解析方法之具體方法，參照公知(NCBI(National Center for Biotechnology Information)之BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)網站；http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
又，本發明提供與(1)～(7)中任一項之抗體所結合之抗原決定位為相同抗原決定位結合之抗體。
某抗體是否與其他抗體辨識相同抗原決定位，可由兩者對於抗原決定位之競爭來確認。抗體間之競爭，可利用競爭結合分析評價，其方法有例如：ELISA、螢光能量轉移測定法(FRET)或螢光微量測定技術(FMAT(註冊商標))等。結合於抗原之該抗體之量，與對於相同抗原決定位之結合競爭的候選競爭抗體(待測抗體)之結合能力間接相關。亦即，相對於相同抗原決定位之待測抗體量或親和性愈大，則該抗體對於抗原之結合量降低，待測抗體對於抗原之結合量增加。具體而言，將經適當標記之該抗體與待評價之抗體同時對於抗原添加，並利用標記檢測結合中的該抗體。結合於抗原之該抗體量，能利用預先標記該抗體而能輕易測定。此標記不特別限制，可視方法選擇標記方法。標記方法，具體而言，例如：螢光標記、放射標記、酵素標記等。
例如，將經螢光標記之該抗體，與非標記之該抗體或待測抗體同時對於經使NR10表現之動物細胞添加，並利用螢光微量測定技術檢測經標記之該抗體。
此處所指「辨識相同抗原決定位之抗體」，係定義為相對於經標記之該抗體，非經標記之該抗體之結合造成結合量50%降低之濃度(IC50 )，待測抗體能在非標記該抗體之IC50 之通常100倍、較佳為80倍，又更佳為50倍，較佳為30倍，更佳為10倍高之濃度，使標記該抗體之結合量降低至少50%。
與上述(1)～(7)中任一項之抗體所結合之抗原決定位結合之抗體，尤在具高中和活性之觀點為有用。
上述(1)～(8)中任一項之抗體不特別限定，以人類化抗體較佳。
再者，本發明提供編碼為上述(A)～(D)中(1)～(8)中任一項之抗NR10抗體之基因。本發明之基因可為任意，例如DNA、RNA皆可。
抗體(人類化)
本發明中，抗體之較佳態樣之一，例如與NR10結合之人類化抗體。人類化抗體可使用該技術領域中具通常知識者既知之方法製造。
抗體之可變區，通常在4個框架(FR)嵌入3個互補性決定區域(COmp1ementarity determining regiOn；CDR)構成。CDR實質上係決定抗體之結合專一性之區域。CDR之胺基酸序列，富含多樣性。另一方面，構成FR之胺基酸序列，即使在具相異結合專一性之抗體之間，常會顯示高相同性。因此，一般而言，可利用CDR移植，將某抗體之結合專一性移植到其他抗體。
人類化抗體，也稱為再構成(reshaped)人類抗體，係將人類以外之哺乳動物例如小鼠抗體之CDR移植到人類抗體之互補性決定區域者，其一般基因重組方法亦已知(參照歐洲專利申請公開號碼EP 125023號公報、WO 96/02576號公報)。
具體而言，當例如CDR為小鼠抗體來源時，將設計為使得小鼠抗體之CDR與人類抗體之框架區域(framework region；FR)連結之DNA序列，使用以製作成在CDR及FR兩方之末端區域具重疊部分之數個寡核苷酸為引子，以PCR法合成(參照WO98/13388號公報之方法)。將得到之DNA與編碼為人類抗體固定區之DNA連結，接著插入表現載體，將其導入寄主並使生產可得(參照歐洲專利申請公開號碼EP 239400、國際特許出願公開號碼WO 96/02576)。
與CDR連結之人類抗體之框架區域，選擇互補性決定區域形成良好之抗原結合部位者。視需要，可將抗體之可變區中之框架區域之胺基酸進行取代、缺失、加成及/或插入等，使得再構成人類抗體之互補性決定區域形成適當抗原結合部位。例如，應用將小鼠CDR移植到人類FR之PCR法，可在FR導入胺基酸序列變異。異體而言，可在黏合於FR之引子導入部分鹼基序列之變異。利用此種引子合成之FR，導入有鹼基序列之變異。經胺基酸之變異型抗體對於抗原之結合活性，藉由以上述方法測定並評價，可選擇具所望性質之變異FR序列(Sato,R. etal.,CancerRes.(1993)53,851-856)。
人類化抗體之C區域使用人類抗體者，例如H鏈可使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、cα2、Cε，L鏈可使用Cκ、Cλ。Cκ之胺基酸序列如序列識別號：58所示，編碼為該胺基酸序列之鹼基序列如序列識別號：57所示。Cγ1之胺基酸序列如序列識別號：60所示，編碼為該胺基酸序列之鹼基序列如序列識別號：59所示。Cγ2之胺基酸序列如序列識別號：62所示，編碼為該胺基酸序列之鹼基序列如序列識別號：61所示。Cγ4之胺基酸序列如序列識別號：64所示，編碼為該胺基酸序列之鹼基序列如序列識別號：63所示。又，為了改善抗體或其產生安定性，可將人類抗體C區域修飾。經修飾人類抗體C區域之例，例如後述C區域。人類化時使用之人類抗體，可為IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等任意同種異構型(isotype)之人類抗體，但本發明使用IgG較佳。IgG可使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。
又，製作人類化抗體後，可將可變區(例如、CDR、FR)或固定區中之胺基酸以其他胺基酸取代、缺失、加成及/或插入等，本發明之人類化抗體，尚包含經此種胺基酸取代等之人類化抗體。
人類化抗體中，CDR之來源不特別限定，可為任何動物來源。例如，可使用小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、駱駝抗體等序列，較佳為小鼠抗體之CDR序列。
抗體之人類化中，通常欲維持著成為來源之抗體之結合活性或中和活性進行人類化有困難，本發明中成功地取得與成為來源之小鼠抗體具同等結合活性及/或中和活性之人類化抗體。人類化抗體，由於在人類體內之免疫原性降低，因此在治療目的等對於人類投予時有用。
本發明中，人類化抗NR10抗體之較佳例，例如以下(a)～(e)中任一項之抗體。
(a)一種包含重鏈可變區之人類化抗體，該重鏈可變區具序列識別號：50(H0-VH)之胺基酸序列。
(b)一種包含重鏈可變區之人類化抗體，該重鏈可變區具序列識別號：112(H1-VH)之胺基酸序列。
(c)一種包含輕鏈可變區之人類化抗體，該輕鏈可變區具序列識別號：52(L0-VL)之胺基酸序列。
(d)一種包含輕鏈可變區之人類化抗體，該輕鏈可變區具有：具序列識別號：50(H0-VH)記載之胺基酸序列之重鏈可變區及具序列識別號：52(L0-VL)之胺基酸序列。
(e)一種包含輕鏈可變區之人類抗體，該輕鏈可變區具有：具序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區及具序列識別號：52記載之胺基酸序列之輕鏈可變區。
又，具序列識別號：50(H0-VH)記載之胺基酸序列之重鏈可變區、具序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區及具序列識別號：52(L0-VL)記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，可有1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入。胺基酸之取代、缺失、加成及/或插入可在CDR或FR進行，又可於CDR與FR兩方進行。
因此，本發明中，人類化抗NR10抗體之較佳態樣，例如以下(f)～(j)中任一項之抗體。
(f)一種包含重鏈可變區之抗體，該重鏈可變區具有序列識別號：50(H0-VH)之胺基酸序列中，1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入之胺基酸序列。
(g)一種包含重鏈可變區之抗體，該重鏈可變區具有序列識別號：112(H1-VH)之胺基酸序列中，1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入之胺基酸序列。
(h)一種包含輕鏈可變區之抗體，該輕鏈可變區具有序列識別號：52(L0-VL)之胺基酸序列中，1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入之胺基酸序列。
(i)一種抗體，包含：重鏈可變區，具序列識別號：50(H0-VH)之胺基酸序列中，1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入之胺基酸序列；及輕鏈可變區，具序列識別號：52(L0-VL)之胺基酸序列中，1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入之胺基酸序列。
(j)一種抗體，包含：重鏈可變區，具序列識別號：112(H1-VH)之胺基酸序列中，1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入之胺基酸序列；及輕鏈可變區，具序列識別號：52(LO-VL)之胺基酸序列中，1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入之胺基酸序列。
雖不特別限定，但(f)～(j)中任一項之抗體，以具與(a)～(e)中任一項之抗體同樣活性較佳。
胺基酸之取代、缺失、加成及/或插入，不特別限定，具體例，例如可進行上述胺基酸取代。
更具體而言，例如以下之胺基酸取代。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR1(序列識別號：9)之3位之Ile取代為Val(序列識別號：173)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：9記載之胺基酸序列之CDR1取代為具序列識別號：173記載之胺基酸序列之CDR1。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR1(序列識別號：9)之4位之Met取代為Ile(序列識別號：174)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：9記載之胺基酸序列之CDR1取代為具序列識別號：174記載之胺基酸序列之CDRI。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR1(序列識別號：9)之4位之Met取代為Leu(序列識別號：175)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：9記載之胺基酸序列之CDR1取代為具序列識別號：175記載之胺基酸序列之CDR1。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR1(序列識別號：9)之3位之Ile取代為Ala(序列識別號：176)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：9記載之胺基酸序列之CDR1取代為具序列識別號：176記載之胺基酸序列之CDR1。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)之1位之Leu取代為Glu(序列識別號：113)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：10記載之胺基酸序列之CDR2取代為具序列識別號：113記載之胺基酸序列之CDR2。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)之3位之Asn取代為Asp(序列識別號：114)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：10記載之胺基酸序列之CDR2取代為序列識別號：114記載之胺基酸序列之CDR2。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)之13位之Gln取代為Asp(序列識別號：115)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：10記載之胺基酸序列之CDR2取代為具序列識別號：115記載之胺基酸序列之CDR2。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)之14位之Lys取代為Gln(序列識別號：116)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：10記載之胺基酸序列之CDR2取代為具序列識別號：116記載之胺基酸序列之CDR2。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)之16位之Lys取代為Gln(序列識別號：117)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：10記載之胺基酸序列之CDR2取代為具序列識別號：117記載之胺基酸序列之CDR2。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)之17位之Gly取代為Asp(序列識別號：118)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：10記載之胺基酸序列之CDR2取代為具序列識別號：118記載之胺基酸序列之CDR2。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)之16位之Lys取代為Gln及17位之Gly取代為Asp(序列識別號：119)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：10記載之胺基酸序列之CDR2取代為具序列識別號：119記載之胺基酸序列之CDR2。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)之14位之Lys取代為Gln、16位之Lys取代為Gln及17位之Gly取代為Asp(序列識別號：167)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：10記載之胺基酸序列之CDR2取代為具序列識別號：171記載之胺基酸序列之CDR2。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)之13位之Gln取代為Asp、14位之Lys取代為Gln、16位之Lys取代為G1n及17位之Gly取代為Asp(序列識別號：172)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：10記載之胺基酸序列之CDR2取代為具序列識別號：172記載之胺基酸序列之CDR2。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)之10位之Ser取代為Asp(序列識別號：177)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：10記載之胺基酸序列之CDR2取代為具序列識別號：177記載之胺基酸序列之CDR2。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR2(序列識別號：10)之13位之Gln取代為Pro(序列識別號：178)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：10記載之胺基酸序列之CDR2取代為具序列識別號：178記載之胺基酸序列之CDR2。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)之3位之Tyr取代為Leu(序列識別號：179)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：11記載之胺基酸序列之CDR3取代為具序列識別號：179記載之胺基酸序列之CDR3。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)之10位之Met取代為Leu(序列識別號：180)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：11記載之胺基酸序列之CDR3取代為具序列識別號：180記載之胺基酸序列之CDR3。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)之11位之Asp取代為Glu(序列識別號：181)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：11記載之胺基酸序列之CDR3取代為具序列識別號：181記載之胺基酸序列之CDR3。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)之12位之Tyr取代為Thr(序列識別號：182)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：11記載之胺基酸序列之CDR3取代為具序列識別號：182記載之胺基酸序列之CDR3。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)之12位之Tyr取代為Ser(序列識別號：183)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：11記載之胺基酸序列之CDR3取代為具序列識別號：183記載之胺基酸序列之CDR3。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)之10位之Met取代為Leu、11位之Asp取代為Glu及12位之Tyr取代為Thr(序列識別號：184)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：11記載之胺基酸序列之CDR3取代為具序列識別號：184記載之胺基酸序列之CDR3。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)之11位之Asp取代為Glu及12位之Tyr取代為Thr(序列識別號：185)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：11記載之胺基酸序列之CDR3取代為具序列識別號：185記載之胺基酸序列之CDR3。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)之3位之Tyr取代為Leu、11位之Asp取代為Glu及12位之Tyr取代為Thr(序列識別號：186)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：11記載之胺基酸序列之CDR3取代為具序列識別號：186記載之胺基酸序列之CDR3。
序列識別號：50或序列識別號：112之重鏈可變區中，CDR3(序列識別號：11)之3位之Tyr取代為Leu、11位之Asp取代為Glu 及 12位之Tyr取代為Ser(序列識別號：187)。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：11記載之胺基酸序列之CDR3取代為具序列識別號：187記載之胺基酸序列之CDR3。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR1(序列識別號：13)之1位之Arg取代為Gln(序列識別號：121)。因此，本發明提供一種輕鏈可變區，將具序列識別號：52記載之胺基酸序列之輕鏈可變區中，具序列識別號：13記載之胺基酸序列之CDR1取代為具序列識別號：121記載之胺基酸序列之CDR1。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR1(序列識別號：13)之5位之Asn取代為Asp(序列識別號：122)。因此，本發明提供一種輕鏈可變區，將具序列識別號：52之胺基酸序0之輕鏈可變區中，具序列識別號：13記載之胺基酸序列之CDR1取代為具序列識別號：122記載之胺基酸序列之CDR1。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR1(序列識別號：13)之8位之Ser取代為Arg(序列識別號：188)。因此，本發明提供一種輕鏈可變區，將具序列識別號：52記載之胺基酸序列之輕鏈可變區中，具序列識別號：13記載之胺基酸序列之CDR1取代為具序列識別號：188記載之胺基酸序列之CDR1。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR1(序列識別號：13)之10位之Leu取代為Val(序列識別號：189)。因此，本發明提供一種輕鏈可變區，將具序列識別號：52記載之胺基酸序列之輕鏈可變區中，具序列識別號：13記載之胺基酸序列之CDR1取代為具序列識別號：189記載之胺基酸序列之CDR1。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR1(序列識別號：13)之8位之Ser取代為Arg及10位之Leu取代為Val(序列識別號：190)。因此，本發明提供一種輕鏈可變區，將具序列識別號：52記載之胺基酸序列之輕鏈可變區中，具序列識別號：13記載之胺基酸序列之CDR1取代為具序列識別號：190記載之胺基酸序列之CDR1。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR1(序列識別號：13)之2位之Thr取代為Ala(序列識別號：191)。因此，本發明提供一種輕鏈可變區，將具序列識別號：52記載之胺基酸序列之輕鏈可變區中，具序列識別號：13記載之胺基酸序列之CDR1取代為具序列識別號：191記載之胺基酸序列之CDR1。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR1(序列識別號：13)之2位之Thr取代為Ser(序列識別號：192)。因此，本發明提供一種輕鏈可變區，將具序列識別號：52記載之胺基酸序列之輕鏈可變區中，具序列識別號：13記載之胺基酸序列之CDR1取代為具序列識別號：192記載之胺基酸序列之CDR1。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR2(序列識別號：14)之1位之Asn取代為Asp(序列識別號：123)。因此，本發明提供一種輕鏈可變區，將具序列識別號：52記載之胺基酸序列之輕鏈可變區中，具序列識別號：14記載之胺基酸序列之CDR2取代為具序列識別號：123記載之胺基酸序列之CDR2。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR2(序列識別號：14)之3位之Lys取代為Gln(序列識別號：124)。因此，本發明提供一種輕鏈可變區，將具序列識別號：52記載之胺基酸序列之輕鏈可變區中，具序列識別號：14記載之胺基酸序列之CDR2取代為具序列識別號：124記載之胺基酸序列之CDR2。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR2(序列識別號：14)之5位之Leu取代為Glu(序列識別號：125)。因此，本發明提供一種輕鏈可變區，將具序列識別號：52記載之胺基酸序列之輕鏈可變區中，具序列識別號：14記載之胺基酸序列之CDR2取代為具序列識別號：125記載之胺基酸序列之CDR2。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR2(序列識別號：14)之7位之Lys取代為Gln(序列識別號：126)。因此，本發明提供一種輕鏈可變區，將具序列識別號：52記載之胺基酸序列之輕鏈可變區中，具序列識別號：14記載之胺基酸序列之CDR2取代為具序列識別號：126記載之胺基酸序列之CDR2。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR2(序列識別號：14)之7位之Lys取代為Asp(序列識別號：127)。因此，本發明提供一種輕鏈可變區，將具序列識別號：52記載之胺基酸序列之輕鏈可變區中，具序列識別號：14記載之胺基酸序列之CDR2取代為具序列識別號：127記載之胺基酸序列之CDR2。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR1(序列識別號：13)之1位之Arg取代為Gln及5位之Asn取代為Asp(序列識別號：169)。因此，本發明提供一種輕鏈可變區，將具序列識別號：52記載之胺基酸序列之輕鏈可變區中，具序列識別號：13記載之胺基酸序列之CDR1取代為具序列識別號：169記載之胺基酸序列之CDR1。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR2(序列識別號：14)之3位之Lys取代為Gln、5位之Leu取代為Glu及7位之Lys取代為Gln(序列識別號：170)。因此，本發明提供一種輕鏈可變區，將具序列識別號：52之輕鏈可變區中，具序列識別號：14記載之胺基酸序列之CDR2取代為具序列識別號：170記載之胺基酸序列之CDR2。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR3(序列識別號：15)之5位之Glu取代為Asp(序列識別號：193)。因此,本發明提供一種輕鏈可變區，將具序列識別號：52之輕鏈可變區中，具序列識別號：15記載之胺基酸序列之CDR3取代為具序列識別號：193記載之胺基酸序列之CDR3。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR3(序列識別號：15)之6位之Ser取代為Asp(序列識別號：194)。因此，本發明提供一種輕鏈可變區，將具序列識別號：52之輕鏈可變區中，具序列識別號：15記載之胺基酸序列之CDR3取代為具序列識別號：194記載之胺基酸序列之CDR3。
序列識別號：52之輕鏈可變區中，CDR3(序列識別號：15)之9位之Thr取代為Phe(序列識別號：195)。因此，本發明提供一種輕鏈可變區，將具序列識別號：52之輕鏈可變區中，具序列識別號：15記載之胺基酸序列之CDR3取代為具序列識別號：195記載之胺基酸序列之CDR3。
再者，上述胺基酸取代以外之取代，例如：具序列識別號：97記載之胺基酸序列之重鏈FR2中，3位之Arg取代為其他胺基酸。取代後之胺基酸不特別限定，較佳例例如Gln。再者，將序列識別號：97之3位之Arg取代為Gln時，可將5位之Ala取代為Ser，使FR2成為人類序列。序列識別號：97之胺基酸序列中，3位之Arg取代為Gln，5位之Ala取代為Ser後之胺基酸序列如序列識別號：120所示。因此，本發明提供一種重鏈可變區，將具序列識別號：50或序列識別號：112記載之胺基酸序列之重鏈可變區中，具序列識別號：97記載之胺基酸序列之FR2取代為具序列識別號：120記載之胺基酸序列之FR2。
上述胺基酸取代可單獨使用，亦可與上述其他胺基酸取代組合。又，可與上述以外之胺基酸取代組合。
進行上述取代後之抗體之具體例，例如：含具序列識別號：167記載之胺基酸序列之重鏈可變區的抗體、含具序列識別號：168記載之胺基酸序列之輕鏈可變區之抗體、含具序列識別號：167記載之胺基酸序列之重鏈可變區及具序列識別號：168記載之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體等。
又，經上述取代後之重鏈可變區具體例，例如以下之重鏈可變區。
(1)一種重鏈可變區(H17)，具序列識別號：204記載之胺基酸序列。
(2)一種重鏈可變區(H19)，具序列識別號：205記載之胺基酸序列。
(3)一種重鏈可變區(H28)，具序列識別號：206記載之胺基酸序列。
(4)一種重鏈可變區(H30)，具序列識別號：207記載之胺基酸序列。
(5)一種重鏈可變區(H34)，具序列識別號：208記載之胺基酸序列。
(6)一種重鏈可變區(H42)，具序列識別號：209記載之胺基酸序列。
(7)一種重鏈可變區(H44)，具序列識別號：210記載之胺基酸序列。
(8)一種重鏈可變區(H46)，具序列識別號：211記載之胺基酸序列。
(9)一種重鏈可變區(H57)，具序列識別號：212記載之胺基酸序列。
(10)一種重鏈可變區(H71)，具序列識別號：213記載之胺基酸序列。
(11)一種重鏈可變區(H78)，具序列識別號：214記載之胺基酸序列。
(12)一種重鏈可變區(H92)，具序列識別號：215記載之胺基酸序列。
(13)一種重鏈可變區(H97)，具序列識別號：216記載之胺基酸序列。
(14)一種重鏈可變區(H98)，具序列識別號：217記載之胺基酸序列。
又，經上述取代後之輕鏈可變區具體例，例如以下之輕鏈可變區。
(15)一種輕鏈可變區(L11)，具序列識別號：218記載之胺基酸序列。
(16)一種輕鏈可變區(L12)，具序列識別號：219記載之胺基酸序列。
(17)一種輕鏈可變區(L17)，具序列識別號：220記載之胺基酸序列。
(18)一種輕鏈可變區(L50)，具序列識別號：221記載之胺基酸序列。
再者，含上述重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體之具體例，例如以下抗體。
(19)一種抗體(H28L17)，包含(3)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(20)一種抗體(H30L17)，包含(4)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(21)一種抗體(H34L17)，包含(5)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(22)一種抗體(H42L17)，包含(6)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(23)一種抗體(H44L17)，包含(7)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(24)一種抗體(H46L17)，包含(8)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(25)一種抗體(H57L17)，包含(9)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(26)一種抗體(H71L17)，包含(10)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(27)一種抗體(H78L17)，包含(11)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(28)一種抗體(H92L17)，包含(12)之重鏈可變區及(17)之輕鏈可變區。
(29)一種抗體(H97L50)，包含(13)之重鏈可變區及(18)之輕鏈可變區。
(30)一種抗體(H98L50)，包含(14)之重鏈可變區及(18)之輕鏈可變區。
本發明之人類化抗體使用之固定區，可為人類抗體來源的任意固定區。人類抗體來源的固定區之較佳例，例如：IgG1或IgG2來源的固定區。又，可使用人類抗體來源的固定區中，1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入者。
人類抗體來源的固定區中，1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入後之固定區不特別限定，例如以下固定區。
固定區(M58)，具序列識別號：128記載之胺基酸序列。
固定區(M14)，具序列識別號：129記載之胺基酸序列。
固定區(SRSC)，具序列識別號：62記載之胺基酸序列。
使用上述固定區之重鏈或抗體之具體例，例如以下之重鏈或抗體。
(1)一種重鏈，包含具序列識別號：167記載之胺基酸序列之可變區及具序列識別號：128記載之胺基酸序列之固定區。
(2)(1)之重鏈中，具序列識別號：171記載之胺基酸序列之CDR2取代為具序列識別號：172記載之胺基酸序列之CDR2。
(3)一種抗體，包含(1)之重鏈與具序列識別號：152記載之胺基酸序列之輕鏈。
(4)一種抗體，包含(2)之重鏈與具序列識別號：152記載之胺基酸序列之輕鏈。
本發明之人類化抗NR10抗體之更具體例，例如以下(k)～(o)中任一項之抗體。
(k)一種抗體，包含具序列識別號：54(HO-VH+固定區)記載之胺基酸序列之重鏈。
(1)一種抗體，包含具序列識別號：130(H1-VH＋固定區)記載之胺基酸序列之重鏈。
(m)一種抗體，包含具序列識別號：56(LO-VL+固定區)記載之胺基酸序列之輕鏈。
(n)一種抗體，包含具序列識別號：54(HO-VH+固定區)記載之胺基酸序列之重鏈，及具序列識別號：56(LO-VL+固定區)記載之胺基酸序列之輕鏈。
(o)一種抗體，包含具序列識別號：130(H1-VH+固定區)記載之胺基酸序列之重鏈，及具序列識別號：56(LO-VL+固定區)記載之胺基酸序列之輕鏈。
又，具序列識別號：54(HO-VH+固定區)記載之胺基酸序列之重鏈及具序列識別號：56(LO-VL+固定區)記載之胺基酸序列之輕鏈，亦可有1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入。胺基酸之取代、缺失、加成及/或插入，可在可變區或固定區中進行，亦可在可變區與固定區兩者均進行。
因此，本發明提供以下(p)～(t)中任一項之抗體。
(p)一種抗體，包含具將序列識別號：54(HO-VH+固定區)之胺基酸序列中，1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入記載之胺基酸序列之重鏈。
(q)一種抗體，包含具將序列識別號：130(H1-VH＋固定區)之胺基酸序列中，1或多數之胺基酸經取代、缺、失、加成及/或插入記載之胺基酸序列之重鏈。
(r)一種抗體，包含具將序列識別號：56(L0-VL+固定區)之胺基酸序列中，1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入記載之胺基酸序列之輕鏈。
(s)一種抗體，包含：重鏈，具將序列識別號：54(H0-VH+固定區)之胺基酸序列中，1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入之胺基酸序列；及輕鏈，具將序列識別號：56(L0-VL+固定區)之胺基酸序列中，1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入之胺基酸序列。
(t)一種抗體，包含：重鏈，具將序列識別號：130(H1-VH+固定區)之胺基酸序列中，1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入之胺基酸序列；及輕鏈，具將序列識別號：56(L0-VL+固定區)之胺基酸序列中，1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入之胺基酸序列。
雖不特別限定，但(p)～(t)任一之抗體，以與(k)～(o)任一抗體具同樣活性較佳。
胺基酸之取代、缺失、加成及/或插入不特別限定，具體例例如經上述胺基酸取代。
又，編碼為上述人類化重鏈可變區之胺基酸序列(序列識別號：50)之鹼基序列如序列識別號：49所示，編碼為人類化輕鏈可變區之胺基酸序列(序列識別號：52)之鹼基序列如序列識別號：51所示，編碼為人類化重鏈之胺基酸序列(序列識別號：54)之鹼基序列如序列識別號：53所示，編碼為人類化輕鏈之胺基酸序列(序列識別號：56)之鹼基序列如序列識別號：55所示。
再者，本發明提供辨識與上述(a)～(t)中任一項之抗體所辨識之抗原決定位為相同抗原決定位之抗體。對於相同抗原決定位之結合如已記載者。
再者，本發明提供以下(u)～(w)中任一項之抗體。
(u)一種抗體，包含具序列識別號：151記載之胺基酸序列之重鏈。
(v)一種抗體，包含具序列識別號：152記載之胺基酸序列之輕鏈。
(w)一種抗體，包含(u)之重鏈與(v)之輕鏈。
再者，本發明提供以下任一項之重鏈、輕鏈、或抗體。
(1)　一種重鏈(H17)，具序列識別號：222之胺基酸序列
(2)　一種重鏈(H19)，具序列識別號：223之胺基酸序列
(3)　一種重鏈(H28)，具序列識別號：224之胺基酸序列
(4)　一種重鏈(H30)，具序列識別號：225之胺基酸序列
(5)　一種重鏈(H34)，具序列識別號：226之胺基酸序列
(6)　一種重鏈(H42)，具序列識別號：227之胺基酸序列
(7)　一種重鏈(H44)，具序列識別號：228之胺基酸序列
(8)一種重鏈(H46)，具序列識別號：229之胺基酸序列
(9)一種重鏈(H57)，具序列識別號：230之胺基酸序列
(10)一種重鏈(H71)，具序列識別號：231之胺基酸序列
(11)一種重鏈(H78)，具序列識別號：232之胺基酸序列
(12)一種重鏈(H92)，具序列識別號：233之胺基酸序列
(13)一種重鏈(H97)，具序列識別號：234之胺基酸序列
(14)一種重鏈(H98)，具序列識別號：235之胺基酸序列
(15)一種輕鏈(L11)，具序列識別號：236之胺基酸序列
(16)一種輕鏈(L12)，具序列識別號：237之胺基酸序列
(17)一種輕鏈(L17)，具序列識別號：238之胺基酸序列
(18)一種輕鏈(L50)，具序列識別號：239之胺基酸序列
(19)一種抗體(H28L17)，包含(3)之重鏈及(17)之輕鏈
(20)　一種抗體(H30L17)，包含(4)之重鏈及(17)之輕鏈
(21)　一種抗體(H34L17)，包含(5)之重鏈及(17)之輕鏈
(22)　一種抗體(H42L17)，包含(6)之重鏈及(17)之輕鏈
(23)　一種抗體(H44L17)，包含(7)之重鏈及(17)之輕鏈
(24)　一種抗體(H46L17)，包含(8)之重鏈及(17)之輕鏈
(25)　一種抗體(H57L17)，包含(9)之重鏈及(17)之輕鏈
(26)　一種抗體(H71L17)，包含(10)之重鏈及(17)之輕鏈
(27)　一種抗體(H78L17)，包含(11)之重鏈及(17)之輕鏈
(28)　一種抗體(H92L17)，包含(12)之重鏈及(17)之輕鏈
(29)　一種抗體(H97L50)，包含(13)之重鏈及(18)之輕鏈
(30)　一種抗體(H98L50)，包含(14)之重鏈及(18)之輕鏈
(31)　一種重鏈，其中在(1)～(14)中任一項之重鏈，具1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入之胺基酸序列。
(32)一種輕鏈，其中，(15)～(18)中任一項之輕鏈中，具1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入之胺基酸序列
(33)一種抗體，其中，(19)～(30)中任一項之抗體中，具1或多數之胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入之胺基酸序列。
(34)一種抗體，辨識(19)～(33)中任一項之抗體所辨識之抗原決定位為相同之抗原決定位。
胺基酸之取代、缺失、加成及/或插入如上述。又，辨識與某抗體所辨識之抗原決定位為相同抗原決定位之抗體如上述。
再者，本發明提供編碼為本發明之可變區、本發明之重鏈、本發明之輕鏈或本發明之抗體之基因。
再者，本發明提供包含上述基因之載體。
再者，本發明提供利用上述載體轉形後之寄主細胞。
再者，本發明係關於製造本發明之可變區、本發明之重鏈、本發明之輕鏈或本發明之抗體之方法，包含培養上述寄主細胞之步驟。
載體、寄主細胞、寄主細胞之培養如後述。
結構域辨識抗體
本發明中，抗NR10抗體之較佳態樣之一，例如辨識結構域1之抗體或辨識結構域2之抗體。本發明中，結構域1，係指序列識別號：76之人類NR10之胺基酸序列中，包含訊息胜肽之狀態下從號碼21位之胺基酸至120位之胺基酸為止之區域(LPAKP～LENIA)。又，本發明中，結構域2，係指序列識別號：76之人類NR10之胺基酸序列中，包含訊息胜肽之狀態下從號碼121位之胺基酸至227位之胺基酸為止之區域(KTEPP～EEEAP)。
如此種抗體不特別限定，通常為具中和活性之抗體，較佳為人類化抗體。
本發明中，較佳之抗體例，例如辨識結構域1之抗體。辨識結構域1之抗體具高中和活性，作為醫藥品尤其有用。
抗體(中和活性)
本發明尚提供具中和活性之抗NR10抗體。
本發明中，對於NR10之中和活性，係指抑制NR10與其配體IL-31間結合之活性，較佳為抑制NR10帶來之生理活性的活性。
具NR10中和活性之抗體之選別，例如可藉由當在IL-31依存性細胞株添加候選抗體時，觀察該IL-31依存性細胞株之增殖抑制效果之方法來進行。上述方法中，抑制IL-31依存性細胞株之增殖的抗體，判斷為對於NR10具中和活性之抗體。
抗體(一般)
本發明之抗體，其來源不限定，可為人類抗體、小鼠抗體、大鼠抗體等任意動物來源的抗體。又，可為嵌合(chimeric)抗體或人類化(humanized)抗體等重組抗體。如上述，本發明之較佳抗體，例如：人類化抗體。
嵌合抗體，係由人類以外之哺乳動物例如小鼠抗體之重鏈、輕鏈之可變區與人類抗體之重鏈、輕鏈之固定區所構成之抗體。嵌合抗體，可使用已知方法製造。例如,將抗體基因從融合瘤選殖，插入到適當載體，並導入寄主以進行(例如，參照Carl,A. K. Borrebaeck,James,W. Larrick,THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES,Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD,1990)。具體而言，從融合瘤之mRNA使用反轉錄酶合成抗體之可變區(V區域)之cDNA。若能得到編碼為目的抗體之V區域的DNA，則將其與編碼為所望人類抗體固定區(C區域)之DNA連結，並插入到表現載體。或，可將編碼為抗體之V區域之DNA，插入到包含人類抗體C區域之DNA的表現載體。插入到在表現控制區域例如，增強子(enhancer)、起動子控制之下能表現之表現載體。其次，以此表現載體將寄主細胞轉形，能使嵌合抗體表現。
又，人類抗體之取得方法亦為已知。例如，將人類淋巴球於體外(in vitro)以所望抗原或表現所望抗原之細胞感作，使感作淋巴球與人類骨髓瘤細胞例如U266融合,也可得到對於抗原具結合活性之所望人類抗體(參照日本特公平1-59878)。又，可將包含人類抗體基因全部曲目之基因轉殖動物以所望抗原免疫，藉此取得所望人類抗體(參照國際專利申請公開號碼WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。
再者，已知有利用人類抗體噬菌體庫，以淘篩法取得人類抗體之技術。例如，將人類抗體之可變區以單鏈抗體(scFv)的形式利用噬菌體呈現(phage display)法使在噬菌體表面表現，並選擇與抗原結合之噬菌體。若解析經選擇之噬菌體之基因，則能決定編碼為結合於抗原之人類抗體之可變區的DNA序列。若能明瞭結合於抗原之scFv之DNA序列，則能製作具該序列之適當表現載體，並取得人類抗體。此等方法為周知，可參考WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388等。
本發明之抗體中，只要具有對於NR10之結合活性及/或中和活性，則不僅包含以IgG為代表之二價抗體，亦可包含一價抗體或以IgM為代表之多價抗體，或能結合於相異之抗原之雙專一性(Bispecific)抗體。本發明之多價抗體，包含全部具相同抗原結合部位之多價抗體，或一部分或全部具相異抗原結合部位之多價抗體。本發明之抗體，不限於抗體之全長分子，只要能結合於NR10蛋白質，可為低分子化抗體或其修飾物。
又，本發明中，抗體也可為低分子化抗體。低分子化抗體，為包含全長抗體(whole antibody ，例如whole IgG等)之一部分缺損之抗體片段的抗體，只要對於NR10具結合活性及/或中和活性則不特別限定。本發明中，低分子化抗體，只要含全長抗體之一部分即不特別限定，但以含重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)較佳，尤佳為含VH及VL兩方之低分子化抗體。又，本發明之低分子化抗體之其他較佳例，例如:含抗體之CDR之低分子化抗體。低分子化抗體中包含之CDR，可含抗體之6個CDR全部，亦可含一部分CDR。
本發明中，低分子化抗體，較佳為較全長抗體之分子量為小，例如有時形成二聚體、三聚體、四聚體等多量體等，有時會成為較全長抗體分子量為大。
抗體片段之具體例，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等。又，低分子化抗體之具體例，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv(單鏈Fv)、Diabody、sc(Fv)2(單鏈(Fv)2)等。此等抗體之多聚體(例如二聚體、三聚體、四聚體、聚合物)，亦包含在本發明之低分子化抗體。
抗體片段，可藉由將例如抗體以酵素處理使產生抗體片段而得。產生抗體片段之酵素，例如木瓜酵素、胰蛋白酶、或胞漿素等為公知。或，可構建編碼為此等抗體片段之基因，並將其導入表現載體後，使適當寄主細胞表現(例如，參照Co,M.S. et al.,J. Immunol.(1994)152,2968-2976、Better,M. & Horwitz,A. H. Methods in Enzymology(1989)178,476-496、Plueckthun,A. & Skerra,A. Methods in Enzymo1ogy(1989)178,476-496、Lamoyi,E.,Methods in Enzymology(1989)121,652-663、Rousseaux,J. et al.,Methodsin Enzymology(1989)121,663-669、Bird,R. E. et al.,TIBTECH(1991)9,132-137)。
消化酵素，將抗體片段之特定位置切斷，得到如下特定構造之抗體片段。若對於如此以酵素法得到之抗體片段，利用基因工程的手法，可使抗體之任意部分缺失。
使用上述消化酵素時得到之抗體片段如下。
木瓜酵素消化：F(ab)2或Fab胰蛋白酶消化：F(ab’)2或Fab’胞漿素消化：Facb本發明中，低分子化抗體只要是對於NR10具結合活性及/或中和活性，則可含任意區域缺失後之抗體片段。
雙價抗體(Diabody)係指利用基因融合構建之二價(bivalent)之抗體片段(Holliger Petal.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)、EP404,097號、WO93/11161號等)。Diabody係由2條多胜肽鏈構成之二聚體。通常，構成二聚體之多胜肽鏈，各在同鏈中將VL及VH以連接子結合。Diabody中，連接子一般係VL與VH彼此無法結合程度之短。具體而言，構成連接子之胺基酸殘基，例如為5個殘基左右。因此，在同一多胜肽鏈上編碼之VL及VH，無法形成單鏈可變區片段，與其他單鏈可變區片段形成二量體。其結果，diabody具2個抗原結合部位。
scFv抗體，係將重鏈可變區([VH])及輕鏈可變區([VL])以連接子等結合成單鏈多胜肽的抗體(Huston,J. S. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1988)85,5879-5883、Plickthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol. 113,Resenburg及Moore編，Springer Verlag,New York,pp.269-315,(1994))。scFv中，H鏈V區域及L鏈V區域，可為本說明書記載之任一抗體來源。連結V區域之胜肽連接子，不特別限制。例如可將由約3至25個殘基所構成之任意單鏈胜肽作為連接子使用。具體而言，例如可使用後述胜肽連接子等。
兩鏈之V區域，可依照例如如上述PCR法連結。為了以PCR法將V區域連結，首先將以下DNA中，編碼為全部或所望部分胺基酸序列之DNA作為模板利用。
編碼為抗體之H鏈或H鏈V區域之DNA序列，及編碼為抗體之L鏈或L鏈V區域之DNA序列
使用具有與待放大之DNA兩端序列對應之序列的一對引子，以PCR法將編碼為H鏈與L鏈V區域之DNA分別放大。接著，準備編碼為胜肽連接子部分之DNA。亦可將編碼為胜肽連接子之DNA也利用PCR合成。此時在利用之引子之5’側，加成能與另外合成之各V區域之放大產物連結之鹼基序列。其次，將[H鏈V區域DNA]-[胜肽連接子DNA]-[L鏈V區域DNA]之各DNA，利用組合式PCR用引子進行PCR反應。
組合式PCR用之引子，係將黏合在[H鏈V區域DNA]之5’側的引子，與黏合在[L鏈V區域DNA]之3’側的引子組合所構成。亦即，組合式PCR用引子，係能夠將編碼為欲合成之scFv之全長序列的DNA予以放大的引子組。另一方面，[胜肽連接子DNA]加成有能與各V區域DNA連結之鹼基序列。其結果，該等DNA連結，並藉由組合式PCR用引子，最終產生scFv之全長作為放大產物。一旦製作編碼為scFv之DNA，則可利用常法得到含該等之表現載體，及經該表現載體轉形後之重組細胞。又，將結果得到之重組細胞培養並使編碼為該scFv之DNA表現，可取得該scFv。
結合之重鏈可變區與輕鏈可變區之順序不特別限定，可以任意順序排列，例如以下配置。
[VH]連接子[VL]
[VL]連接子[VH]
sc(Fv)2，係將2個VH及2個VL以連接子等結合成單鏈的低分子化抗體(Hudson et al,J Immunol. Methods 1999；231：177-189)。sc(Fv)2，可藉由將例如scFv以連接子連結製作。
又，以2個VH及2個VL利用單鏈多胜肽之N末端側為基點依照VH、VL、VH、VL([VH]連接子[VL]連接子[VH]連接子[VL])之順序排列為特徵之抗體較佳，但2個VH與2個VL之順序不特別限於上述配置，可以任何順序排列。例如以下配置。
[VL]連接子[VH]連接子[VH]連接子[VL]
[VH]連接子[VL]連接子[VL]連接子[VH]
[VH]連接子[VH]連接子[VL]連接子[VL]
[VL]連接子[VL]連接子[VH]連接子[VH]
[VL]連接子[VH]連接子[VL]連接子[VH]
低分子抗體中之重鏈可變區或輕鏈可變區之胺基酸序列，可經取代、缺失、加成及/或插入。再者，當使重鏈可變區與輕鏈可變區組裝時，只要具抗原結合活性，則可為使一部欠缺，也可加成其他多胜肽。又，可變區可經嵌合化或人類化。
本發明中，結合抗體之可變區的連接子，可使用能以基因工程導入任意胜肽連接子、或合成化合物連接子，例如Protein Engineering,9(3),299-305,1996揭示之連接子。
本發明中，較佳連接子為胜肽連接子。胜肽連接子之長度不特別限定，可視目的由該技術領域中具通常知識者適當選擇，通常為1～100個胺基酸，較佳為3～50個胺基酸，更佳為5～30個胺基酸，尤佳為12～18個胺基酸(例如15個胺基酸)。
胜肽連接子之胺基酸序列，例如以下序列。
SerGly‧SerGly‧Gly‧SerSer‧Gly‧GlyGly‧Gly‧Gly‧Ser(序列識別號：82)Ser‧Gly‧Gly‧Gly(序列識別號：83)Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列識別號：84)Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列識別號：85)Gly‧Gly‧Gly，Gly‧Gly‧Ser(序列識別號：86)Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列識別號：87)Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列識別號：88)Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列識別號：89)(Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列識別號：84))n(Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列識別號：85))n[n為1以上之整數]等。
胜肽連接子之胺基酸序列，可視目的由該技術領域中具通常知識者適當選擇。例如，決定上述胜肽連接子長度之n，通常1～5，較佳為1～3，更佳為1或2。
合成化學物連接子(化學交聯劑)為胜肽之交聯之中通常使用的交聯劑，例如N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)、雙(硫琥珀醯亞胺基辛二酸酯(BS3)、二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DSP)、二硫雙(硫琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇雙(硫琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(硫-EGS)、二琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(DST)、二硫琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(硫-DST))、雙[2-(琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(BSOCOES))、雙[2-(硫琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(硫-BSOCOES)等，該等交聯劑在市面上可購得。
當結合4個抗體可變區時，通常需3個連接子。多數連接子可相同，亦可使用相異之連接子。本發明之抗體，包含在本發明之抗體之胺基酸序列加成有1或多數個胺基酸殘基後之抗體。又，尚包含該等抗體與其他胜肽或蛋白質融合成的融合蛋白質。製作融合蛋白質之方法，可將編碼為本發明之抗體的聚核苷酸與編碼為其他胜肽或多胜肽之聚核苷酸連結成使得框架一致，並導入表現載體使寄主表現，可使用該技術領域中具通常知識者公知之手法。與本發明之抗體融合之其他胜肽或多胜肽，例如FLAG(Hopp,T. P. et al.,BioTechnology(1988)6,1204-1210)、6個His(組胺酸)殘基所構成之6×His、10×His、流感病毒凝集素(HA)、人類c-myc之片段、VSV-GP之片段、p18HIV之片段、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原之片段、1ck tag、α-tubulin之片段、B-tag、蛋白質C之片段等公知胜肽。又，與本發明之抗體融合之其他多胜肽，例如可使用GST(麩胱甘肽-S-轉移酶)、HA(流感病毒凝集素)、免疫球蛋白固定區、β-半乳糖苷酶、MBP(甘露糖結合蛋白質)等。使市售之編碼為該等胜肽或多胜肽之聚核苷酸與編碼為本發明之抗體之聚核苷酸融合，並使藉此製備之融合聚核苷酸表現，能製備融合多胜肽。
又，本發明之抗體，可製成結合有聚乙二醇(PEG)或透明質酸等高分子物質、放射性物質、螢光物質、發光物質、酵素、毒素等各種分子之偶聯(conjugate)抗體。此種偶聯抗體，可藉由對於得到的抗體施以化學性修飾得到。又，抗體之修飾方法在此領域中已經確立(例如US5057313、US5156840)。本發明中，「抗體」包含此種偶聯抗體。
再者，本發明使用之抗體可為雙重專一性抗體(bispecific antibody)。雙重專一性抗體，係指在同一抗體分子內具有辨識相異抗原決定位之可變區的抗體。本發明中，雙重專一性抗體可為辨識NR10分子上相異抗原決定位之雙重專一性抗體，亦可為其中之一抗原結合部位辨識NR10，另一抗原結合部位辨識其他物質之雙重專一性抗體。
用以製造雙重專一性抗體之方法為公知。例如，使辨識抗原之相異2種抗體結合，可製作雙重專一性抗體。使結合之抗體，可為各具H鏈及L鏈之1/2分子，亦可為僅由H鏈所構成之1/4分子。或，可使產生相異單株抗體之融合瘤融合，製作產生雙重專一性抗體之融合細胞。再者，可利用基因工程方法製作雙重專一性抗體。
本發明之抗體，可利用後述產生抗體之細胞或寄主或精製方法，使胺基酸序列、分子量、等電點或糖鏈有無或形態等相異。然而，得到之抗體，只要具有與本發明之抗體同等功能，即包含於本發明。例如，本發明之抗體於原核細胞例如大腸菌表現時，在原本抗體記載之胺基酸序列之N末端加成甲硫胺酸殘基。本發明之抗體尚包含此種抗體。
抗體之製造
本發明之抗體，可為多株抗體也可為單株抗體。對於NR10具有結合活性及/或中和活性之單株抗體，可藉由例如將人類或小鼠等哺乳動物來源的NR10或其胜肽片段作為免疫原，以公知方法製備抗NR10單株抗體後，從得到之抗NR10單株抗體之中選別具NR10結合活性及/或中和活性之抗體而得。亦即，使用表現所望抗原或所望抗原之細胞作為感作抗原，將其依照通常免疫方法進行免疫。得到之免疫細胞以通常細胞融合法與公知之母細胞融合，依照通常的篩選法，篩選單株抗體產生細胞(融合瘤)，可製作抗NR10單株抗體。受免疫之動物，例如小鼠、大鼠、兔、羊、猴、山羊、駱馬、牛、馬、豬等哺乳動物。抗原之製備，可使用公知NR10基因序列，以公知方法例如桿狀病毒之方法(WO98/46777等)等實行。
融合瘤之製作，例如可依照Milstein等人之方法(Kohler.G.and Milstein,C.,Methods Enzymol.(1981)73:3-46)等進行。抗原之免疫原性低時，可使與白蛋白等具免疫原性之巨大分子結合，進行免疫。
本發明之對於NR10具結合活性及/或中和活性之抗體之一態樣，例如:對於人類NR10具結合活性及/或中和活性之單株抗體。製作對於人類NR10具結合活性及/或中和活性之單株抗體用之免疫原，只要是能製作對於人類NR10具結合活性及/或中和活性之抗體即不特別限定。例如，已知人類NR10存在有多數變異體(variant.)，只要能製作對於人類NR10具結合活性及/或中和活性之抗體，可利用任一變異體作為免疫原。或可使用依照同樣條件，以NR10之胜肽片段或對於天然NR10序列施加人為變異者為免疫原。人類NR10.3，為製作本發明之對於NR10具結合活性及/或中和活性之抗體方面，較佳免疫原之一。
又，抗體之對於NR10之結合活性及/或中和活性之測定，例如可利用實施例記載觀察該IL-31依存性細胞株之增殖抑制效果的方法進行。
另一方面，單株抗體也可藉由DNA免疫(DNA Immunization)得到。DNA免疫，係將在免疫動物中編碼為抗原蛋白質之基因能表現之態樣所構建之載體DNA對於該免疫動物投予，且使免疫抗原於免疫動物活體內表現，藉此賦予免疫刺激之方法。相較於投予蛋白質抗原之一般免疫方法，DNA免疫能期待以下的優越性。
-能維持膜蛋白質構造並提供免疫刺激-無需精製免疫抗原但是，另一方面，DNA免疫中，難以與佐劑等免疫刺激機構組合。
為了以DNA免疫得到單株抗體，首先，將編碼為NR10之DNA對於免疫動物投予。編碼為NR10之DNA，可利用PCR等公知方法合成。將得到的DNA插入適當表現載體，對於免疫動物投予。表現載體可利用例如pcDNA3.1等市售表現載體。將載體對於活體投予之方法，亦可使用一般使用之方法。例如，可藉由將吸附於表現載體之金粒子以基因鎗(gene gun)打入細胞內以進行DNA免疫。DNA免疫後，利用NR10表現細胞進行追加免疫(boost)，為得到單株抗體之較佳方法。
依此方式將哺乳動物免疫，確認血清中所望抗體量上升後，從哺乳動物採取免疫細胞，進行細胞融合。較佳免疫細胞，尤其可使用脾臟細胞。
與上述免疫細胞融合之細胞，使用哺乳動物之骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞，以具備用於篩選之適當選擇記號較佳。選擇記號，係指能在特定培養條件下生存(或不能生存)之性狀。選擇記號，以次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶( hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) 缺損(以下省略為HGPRT缺損)、或胸腺嘧啶激酶缺損(以下省略為TK缺損)等為公知。具HGPRT或TK缺損之細胞，具有次黃嘌呤-胺基喋呤-胸腺嘧啶感受性(以下省略為HAT感受性)。HAT感受性之細胞在HAT選擇培養基中不能合成DNA會死滅，但是若與正常細胞融合則能利用正常細胞之廢物利用(salvage)路徑而能繼續DNA合成，因此即使在HAT選擇培養基中亦會增殖。
HGPRT缺損或TK缺損之細胞，各能以含6硫鳥嘌呤、8氮雜鳥嘌呤(以下省略為8AG)、或5’溴去氧尿嘧啶之培養基選擇。正常細胞由於會將此等嘧啶類似物導入到DNA中而死滅，但是欠缺此等之酵素的細胞，由於不會導入此等嘧啶類似物，因此能在選擇培養基中生存。此外，稱為G418耐性之選擇記號，以新黴素耐性基因而提供對於2-去氧Streptamine系抗生物質(健達黴素(gentamycin)類似體)的耐性。適於細胞融合的各種骨髓瘤細胞為公知。
基本上，依照公知方法例如Kohler與Milstein等人的方法(Kohler.G.and Milstein,C.、Methods Enzymol.(1981)73,3-46)等，進行免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合。
更具體而言，可例如於細胞融合促進劑存在下，於通常的營養培養液中實施細胞融合。融合促進劑例如可使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等。再者，為了提高融合效率，可依所望加入二甲基亞碸等輔助劑。
免疫細胞與骨髓瘤細胞之使用比例可任意設定。例如，相對於骨髓瘤細胞，可將免疫細胞定為1至10倍較佳。細胞融合使用之培養液，例如適於骨髓瘤細胞株增殖之RPMI1640培養液、MEM培養液，此外，可使用此種細胞培養使用之通常培養液。再者，可將胎牛血清(FCS)等血清補液添加在培養液中。
細胞融合，可將既定量免疫細胞與骨髓瘤細胞在培養液中充分混合，並藉由混合預先加溫至約37℃的PEG溶液，形成目的融合細胞(融合瘤)。細胞融合法中，可將例如約平均分子量1000至6000之PEG，以通常30至60%(w/v)之濃度添加。接著，將上述所舉適當培養液逐次添加，離心並除去上清之操作反複進行，將不利於融合瘤生長的細胞融合劑等除去。
以此方式得到之融合瘤，可藉由用於細胞融合之骨髓瘤具有之選擇記號對應的選擇培養液來選擇。例如具HGPRT或TK缺損之細胞，可在HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋 呤及胸腺嘧啶培養液)培養以選擇。亦即，將HAT感受性骨髓瘤細胞用於細胞融合時，可在HAT培養液中將成功與正常細胞細胞融合之細胞予以選擇性增殖。為了使目的融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死滅，繼續使用上述HAT培養液進行培養充足時間。具體而言，一般而言，藉由數日至數週的培養，能選擇目的融合瘤。接著，藉由實施通常之極限稀釋法，可實施產生目的抗體之融合瘤之篩選及單一選殖。或，可依照國際公開WO03/104453記載之方法製作辨識NR10之抗體。
目的抗體之篩選及單一選殖，理想地可依照公知之抗原抗體反應以篩選方法實施。例如，使抗原結合在聚苯乙烯等製成的珠子或市售96井的微量滴定平盤等擔體，使與融合瘤之培養上清反應。其次，將擔體清洗後，使與經酵素標記之二次抗體等反應。若培養上清中包含與感作抗原反應之目的抗體時，二次抗體會經由此抗體而與擔體結合。藉由檢測最終與擔體結合之二次抗體，能確認目的抗體是否存在於培養上清中。產生對於抗原具結合能力之所望抗體的融合瘤，能以極限稀釋法等予以選殖。此時，就抗原而言，包含免疫使用者，較佳為使用實質同質的NR10蛋白質。例如表現NR10之細胞株、NR10之細胞外結構域、或構成該區域之部分胺基酸序列所構成之寡胜肽，可利用為抗原。
又，將抗原對於人類以外動物進行免疫以得上述融合瘤之方法以外，亦可將人類淋巴球進行抗原感作而得目的抗體。具體而言，首先在體外，將人類淋巴球以NR10蛋白質感作。接著，將經免疫感作之淋巴球與適當的融合伙伴融合。融合伙伴，可利用為例如人類來源且具永久分裂能力之骨髓瘤細胞(參照日本特公平1-59878號公報)。此方法得到之抗體，為對於NR10蛋白質具結合活性之人類抗體。
編碼為上述方法等所取得之抗NR10抗體之鹼基序列、胺基酸序列，可利用該技術領域中具通常知識者所公知之方法得到。
依照得到之抗NR10抗體之序列，使用該技術領域中具通常知識者公知之基因重組技術，可製作抗NR10抗體。具體而言，依照辨識NR10之抗體之序列，構建編碼為抗體之聚核苷酸，將其導入到表現載體後，使適當寄主細胞表現即可(例如參照Co,M. S. et al.,J. Immunol.(1994)152,2968-2976;Better,M. and Horwitz,A. H.,Methods Enzymol.(1989)178,476-496;Pluckthun,A. and Skerra,A.,Methods Enzymol.(1989)178,497-515;Lamoyi,E.,Methods Enzymol.(1986)121,652-663;Rousseaux,J. et al.,Methods Enzymol.(1986)121,663-669;Bird,R,E. and Walker,B. W.,Trends Biotechnol.(1991)9,132-137)。
載體之例，例如：M13系載體、pUC系載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。又，以cDNA之次選殖、切出為目的時，上述載體之以外，例如pGEM-T、pDIRECT、pT7等。以生產本發明之抗體為目的使用載體時，尤以表現載體為有用。表現載體，例如以大腸菌之表現為目的時，當具有使載體於大腸菌放大之之上述特徵以外，寄主為JM109、DH5α、HB101、XL1-B1ue等大腸菌時，必需使用能在大腸菌以良好效率表現之起動子，例如1ac Z起動子(Ward等人,Nature(1989)341,544-546；FASEB J.(1992)6,2422-2427)、araB起動子(Better等人,Science(1988)240,1041-1043)、或T7起動子等。此種載體，除上述載體之外，例：pGEX-5X-1(Pharmacia製)、「QIAexpress system」(QIAGEN製)、pEGFP，或pET(此情形，寄主為表現T7RNA聚合酶之BL21較佳)等。
又，載體可含用於抗體分泌之訊息序列。抗體分泌用之訊息序列，當產生於大腸菌之細胞間質時，可使用pe1B訊息序列(Lei,S. P. et al J. Bacteriol.(1987)169,4379)。載體之導入寄主細胞，可利用例如氯化鈣法、電穿孔法進行。
大腸菌以外，例如就用於製造本發明抗體之載體而言，例如：哺乳動物來源的表現載體(例如pcDNA3(Invitrogen公司製)、pEF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990,18(17),p5322)、pEF、pCDM8)、昆蟲細胞來源的表現載體(例如「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(GibcoBRL製)、pBacPAK8)、植物來源的表現載體(例如pMH1、pMH2)、動物病毒來源的表現載體(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、反轉錄病毒來源的表現載體(例如pZIPneo)、酵母來源的表現載體(例如「Pichia Expression Kit」(Invitrogen製)、pNV11、SP-Q01)、枯草菌來源的表現載體(例如pPL608、pKTH50)。
於CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等動物細胞表現為目的時，必需帶有為了在細胞內表現所需要之起動子，例如SV40起動子(Mulligan等人，Nature(1979)277,108)、MMLV-LTR起動子、EF1α起動子(Mizushima等人，NuC1eiC ACids Res.(1990)18,5322)、CMV起動子等，更佳為具有用於選拔對於細胞轉形之基因(例如可利用藥劑(新黴素、G418等)判別之藥劑耐性基因)。具有此種特性之載體，例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。
再者，為了使基因安定表現且於細胞內之基因副本數放大時，例如：在核酸合成路徑缺損之CHO細胞中導入具有與其互補之DHFR基因的載體(例如pSV2-dhfr(「Molecular Cloning 2nd edition」Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989))等)，利用滅殺除癌(Methotrexate) (MTX)放大之方法，又，以基因暫時性表現為目的時，例如：使用在染色體上帶有表現SV40 T抗原之基因的COS細胞，以帶有SV40之複製起點的載體(pcD等)進行轉形之方法。複製開始點，又，可使用多瘤病毒病毒、腺病毒、牛乳突瘤病毒(BPV)等來源者。再者，為了以寄主細胞系將基因副本數放大，表現載體就選擇記號而言，可含胺基葡糖苷轉移酶(APH)基因、胸腺啶激酶(TK)基因、大腸菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酵素(dhfr)基因等。
藉此得到之本發明抗體，可從寄主細胞內或細胞外(培養基等)離析，並精製成實質純且均勻的抗體。抗體之分離、精製，可使用通常抗體精製使用之分離、精製方法，沒有任何限定。例如適當選擇、組合層析管柱、濾膜、極限過濾、鹽析、溶劑沈澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沈降、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳法、透析、再結晶等，則可將抗體分離、精製。
層析例如親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、逆相層析、吸附層析等(Strategies for 宜Protein Purification and CharaCterization: A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。此等層析，可使用液相層析例如HPLC、FPLC等液相層析進行。親和性層析使用之管柱，例如：蛋白質A管柱、蛋白質G管柱。使用例如蛋白質A之管柱，如Hyper D,POROS,Sepharose FF(GE Amersham Biosciences)等。本發明尚包含使用此等精製方法，經高度精製之抗體。
得到抗體對於NR10之結合活性之測定，可利用該技術領域中具通常知識者公知之方法進行。例如測定抗體之抗原結合活性之方法，可使用ELISA(酵素結合免疫吸附檢定法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)或螢光抗體法。例如使用酵素免疫測定法時，可在塗覆有抗原之平盤，加入含抗體之試樣，例如抗體產生細胞之培養上清或精製抗體。添加經鹼性磷解酶等酵素標記過的二次抗體，將平盤溫育並清洗後，加入對硝基苯基磷酸等酵素基質並測定吸光度，可評價抗原結合活性。
醫藥組成物
又，本發明提供含有上述抗體作為有效成分之醫藥組成物。再者，本發明提供以上述抗體為有效成分之發炎性疾病之治療劑。
本發明中，發炎性疾病，係指由於物理性、化學性、或生物學的作用物質所致損傷或異常刺激，而發生在罹患的血管及鄰接組織之細胞學的‧組織學反應相關之病理學上觀察現象的疾病(stedman 醫學大辭典第5版、medicalview 股份有限公司，2005年)。一般而言，發炎性疾病例如：皮膚炎(異位性皮膚炎、慢性皮膚炎等)、發炎性腸疾病(大腸炎等)、氣喘、關節炎(風濕性關節炎、變形性關節症等)、支氣管炎、Th-2型自體免疫疾病、全身性紅斑性狼瘡、重症肌無力症、慢性GVHD、庫隆病、變形性脊椎炎、腰痛、痛風、手術外傷後之發炎、腫脹緩解、神經痛、咽喉頭炎、膀胱炎、肝炎(非醇性脂肪性肝炎、醇性肝炎等)、B型肝炎、C型肝炎、動脈硬化、搔癢等。
成為本發明對象之發炎性疾病較佳例，例如：異位性皮膚炎、慢性皮膚炎、風濕病、變形性關節症、慢性氣喘、搔癢。
抗NR10抗體「就有效成分而含有」，意指含有抗NR10抗體作為活性成分至少其中之一，其含有率不限制。又，本發明之發炎性疾病之治療劑，可配合上述抗NR10抗體含有其他促進發炎性疾病治療之成分。
又，本發明之治療劑可用於預防目的。
本發明之抗NR10抗體，可依照常法製劑化(例如Remington’s Pharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton,U.S.A)。再者，可視需要一起包含醫藥上容許之擔體及/或添加物。例如界面活性劑(PEG、Tween等)、賦形劑、抗氧化劑(抗壞血酸等)、著色料、香味劑、保存劑、安定劑、緩衝劑(磷酸、檸檬酸、其他有機酸等)、螯合劑(EDTA等)、懸浮劑、等張化劑、結合劑、崩壤劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等。然而，本發明之發炎性疾病之預防或治療劑，不限於此等，可適當包含其他常用之擔體。具體而言，例如：輕質無水矽酸、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯基乙縮醛二乙基胺基乙酸酯、聚乙烯醇吡咯啶酮、明膠、中鏈脂肪酸三酸甘油酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、白糖、羧基甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽類等。又，可含其他低分子量之多胜肽、血清白蛋白、明膠及免疫球蛋白等蛋白質、及甘胺酸、麩醯胺、天冬醯胺酸、精胺酸及離胺酸等胺基酸。製成注射用水溶液時，將抗NR10抗體溶解在包含例如生理食鹽水、葡萄糖或其他輔助藥之等張液。輔助藥例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉，再者，可併用適當溶解輔助劑例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非離子性界面活性劑(聚山梨糖醇酐80、HCO-50)等。
又，視需要，可將抗NR10抗體封入微膠囊(羥基甲基纖維素、明膠、聚[甲基甲基丙烯酸]等微膠囊)，或製成膠體藥物傳遞系統(微脂體、白蛋白微球體、微乳劑、奈米粒子及奈米膠囊等)(參照Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition &, Oslo Ed.(1980)等)。再者，將藥劑製成緩釋性藥劑之方法亦為公知，可應用在抗體NR10抗體(Langer et al.,J. Biomed. Mater. Res.(1981)15:167-277；Langer,Chem. Tech.(1982)12:98-105；美國專利第3,773,919號；歐洲專利申請公開(EP)第58,481號；Sidman et a1.,Biopolymers(1983)22:547-56；EP第133,988號)。
本發明之醫藥組成物，可經口或非經口任一方式投予，較佳為非經口投予。具體而言，利用注射及經皮投予對於患者投予。注射劑型例，例如靜脈內注射、肌肉內注射或皮下注射等以對於全身或局部投予。亦可對於欲抑制發炎之部位或其周邊進行局部注入，尤其肌肉內注射。又，可視患者年齡、症状選擇適當投予方法。投予量，例如每1次體重每1kg的活性成分從0.0001mg～100mg之範圍選擇。或，例如對於人類患者時，可從每位患者活性成分在0.001～1000mg/kg‧body‧weight之範圍選擇，每1次投予量，例如包含本發明抗體約0.01～50mg/kg‧body‧weight之量較佳。然而，本發明之發炎性疾病預防或治療劑，不限於此等投予量。
又，本說明書中引用之所有先前技術文獻，納入本說明書作為參照。
【實施例】
以下將本發明以實施例具體說明，但本發明不限於此等實施例。
[實施例1]　融合瘤製作
1.1. DNA免疫用人類NR10質體、長尾獼猴NR10質體之製備
1.1.1. hNR10、CynNR10表現載體之製備
對於在小鼠β-肌動蛋白之起動子控制下表現蛋白質之載體pMacII(WO2005/054467)，導入人類NR10(鹼基序列序列識別號：75、胺基酸序列序列識別號：76)，製成hNR10表現載體。同樣地，從長尾獼猴NR10(鹼基序列序列識別號：65、胺基酸序列序列識別號：66)構建cynNR10表現載體。
1.1.2. DNA卡匣(DNA cartridge)之製作
為了將1.1.1製作之hNR10或cynNR10表現載體用於對小鼠進行DNA免疫，使用Herios Gene Gun用卡匣套組(BIO-RAD公司製)，製作關於各DNA能將每1次1μ gDNA免疫之DNA卡匣。
1.2.抗人類NR10抗體產生融合瘤之製作
1.2.1.使用人類NR10及長尾獼猴NR10免疫小鼠製作融合瘤
對於Balb/c小鼠(雌、免疫開始時6週齡、日本Charles River)10隻，將人類NR10或長尾獼猴NR10依以下方式免疫。初次免疫，將以hNR10表現載體製作之DNA卡匣使用Herios Gene Gun系統(BIO-RAD)進行免疫。第2次免疫係於1週後，將以cynNR10表現載體製作之DNA卡匣以Herios Gene Gun系統進行投予。第3次以後，以1週間隔將hNR10與cynNR10表現載體交替免疫。確認對於人類NR10之血清抗體價上升後，就最終免疫而言，將以PBS(-)稀釋之人類NR10蛋白質(細胞外區域)(參考例4)以10μg/隻進行靜脈內投予。最終免疫4日後，將小鼠脾臟細胞及小鼠骨髓瘤細胞P3X63Ag8U.1(稱為P3U1，ATCC CRL-1597)，依照使用PEG1500(Roche Diagnostics)之常法進行細胞融合。融合細胞，亦即融合瘤，於含10%FBS之RPMI1640培養基(以下稱為10%FBS/RPMI1640)培養。
1.2.2.融合瘤之選拔
融合次日，將(1)融合細胞懸浮於半流動培養基(StemCells)，進行融合瘤之選擇培養，並且實施融合瘤之群落化。
融合後第9日或第10日，挑取融合瘤之群落，在含有HAT選擇培養基(10% FBS/RPMI1640,2vol% HAT 50x concentrate(大日本製藥),5vol% BM-Condimed H1(Roche Diagnostics))之96井平盤，以1井1群落播種。3～4日培養後，將各井之培養上清回收，並測定培養上清中之小鼠IgG濃度。關於經確認小鼠IgG之培養上清，使用人類IL-31依存性細胞株(hNR10/hOSMR/BaF3細胞；參考例2)評價中和活性，得到具有高NR10中和活性之數個選殖體(圖3)。得到濃度依存性抑制人類IL-31刺激所致細胞增殖之選殖體，及濃度依存性抑制長尾獼猴IL-31刺激所致細胞(cynNR10/cynOSMR/BaF3細胞；參考例2)增殖之選殖體(圖4)。
[實施例2]嵌合抗體之製作
嵌合抗體表現載體之製作
從融合瘤細胞，使用RNeasy Mini Kits(QIAGEN)萃取總RNA，利用SMART RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences)合成cDNA。利用SMART RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences)中所附10X Universal Primer A Mix以及設定在抗體之各固定區之引子(H鏈：mIgG1-rnot、L鏈mIgK-rnot)，以PrimeSTAR HS DNA polymerase(TaKaRa)進行PCR，將抗體之可變區基因離析。經離析之各DNA片段之鹼基序列，使用BigDyeTerminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)，以DNA定序儀ABI PRISM 3730xL DNA Sequencer或ABI PRISM 3700 DNA Sequencer(Applied Biosystems)，依照添附說明書記載之方法決定。得到之NS18、NS22、NS23及NS33之小鼠抗體之胺基酸序列的H鏈可變區如圖1所示，L鏈可變區如圖2所示。
對於得到之H鏈、L鏈各片段，使用表1之組合之引子，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa)進行PCR，將得到之放大片段與固定區(各為人類γ1或γ2、人類κ)結合，插入到動物細胞表現載體。各DNA片段之鹼基序列，使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)，在DNA定序儀ABI PRISM 3730xL DNA Sequencer或ABI PRISM 3700 DNA Sequencer(Applied Biosystems)，依照添附說明書記載之方法決定。
嵌合抗體之製作
將人類胎兒腎癌細胞來源HEK293H株(Invitrogen)懸浮於含10%F胎牛血清(Invitrogen)之DMEM培養基(Invitrogen)，以6×105 個/mL之細胞密度各接種在接著細胞用培養皿(直徑10Cm,CORNING)之各培養皿10mL，於C02 培養箱(37℃、5% CO2 )內培養一日夜後，將培養基吸引除去，添加CHO-S-SFMII(Invitrogen)培養基6.9mL。在製備之質體DNA混合液(合計13.8μg)中加入CHO-S-SFMII培養基使成700μL，加入1μg/mL聚乙烯亞胺( Polyethylenimine) (Polysciences Inc.)20.7μL，混合並於室溫靜置10分鐘後對於各培養皿之細胞投予，於CO2 培養箱(37℃，5% CO2 )內溫育4～5小時。之後，添加CHO-S-SFMII(Invitrogen)培養基6.9mL，於CO2 培養箱內培養3～4日。將培養上清回收後，以離心分離(約2000g、5分鐘、室溫)將細胞除去，再通過0.22μm濾膜MILLEX(註冊商標)-GV(Millipore)。各樣本保存在4℃直到使用為止。從此上清使用蛋白質G Sepharose(Amersham BioscienCes)將抗體精製。經精製之抗體，使用Amicon Ultra 15(Millipore)濃縮，再使用PD-10脫鹽管柱(Amersham Biosciences)，將溶劑取代成含0.05%NaN3 之PBS(-)。 以ND-1000分光光度計(NanoDrop)測定於280nm之吸光度，依照Pace等人之方法(Protein Science(1995)4:2411-2423)計算濃度。
嵌合NS22之活性評價
使用與hIL-31用量依存性增殖之hNR10/hOSMR/BaF3細胞株，依以下所示評價hIL-31中和活性。
將hNR10/hOSMR/BaF3細胞於含10% FBS(MOREGATE)、1%盤尼西林-鏈黴素(Invitrogen)之RPMI1640培養基(GIBCO)中，製備成使為1.5 x 105 cells/mL。取其一部分添加使hIL-31(R&D Systems)成為4ng/mL(IL-31(+),終濃度;2ng/mL)。其餘的細胞懸浮液作為IL-31(-)。將經精製的NS22於培養基調整為2μg/mL，再製備稀釋公比3、合計8系列之稀釋液(終濃度；≦1μg/mL)。於96井平底平盤(CORNING)之各井中，分別接種細胞懸浮液與嵌合NS22(人類γ1,κ)稀釋溶液50μL，於37℃、5% CO2 培養箱培養2日。培養結束後，在各井中，添加將細胞計數套組-8(Dojindo)及PBS等量混合後之溶液20μL，測定吸光度(450nm/620nm)(TECAN,SUNRISE CLASSIC)。於37℃、5% CO2 培養箱使反應2小時後，再度測定吸光度。NS22之中和活性係使用2小時值減去0小時值後之值，以抑制率代表。其結果，NS22在hNR10/hOSMR/BaF3細胞株中，明顯以濃度依存地抑制IL-31刺激所致細胞増殖，證明對於人類IL-31訊息化具中和活性(圖5)。
使用顯示由於IL-31刺激誘導IL-6產生之DU145細胞株(人類前裂腺癌細胞株)，依以下所示，評價IL-31中和活性。
將DU145以含10% FBS(MOREGATE)、2mmol/L L-麩醯胺(Invitrogen)、1mmol/L丙酮酸鈉(SIGMA)之MEM培養基(Invitrogen)製備成2.5 x 105 cells/mL，在48井平盤(CORNING)之各井各分注200μL，於37℃、5%CO2 條件下培養一夜。將經精製之嵌合NS22(人類γ1,κ)以含10% FBS、2mmol/LL-麩醯胺、丙酮酸鈉之MEM培養基稀釋使成100μg/mL，並使用此溶液製備稀釋公比5、合計6系列之稀釋液，各與100ng/mL之人類介白素-31(R&D systems)以1：1混合，在各井各添加50μL。將於37℃、5% CO2條件下培養2日後之培養上清中，IL-6濃度以DuoSet ELISA Development kit(R&D systems)測定。NS22之中和活性以抑制率(%)之形式評價。亦即，以IL-31非存在下之IL-6濃度(A)作為最大抑制活性(100%抑制)、以IL-31添加下且NS22非添加下之IL-6濃度(B)作為無抑制活性(0%抑制)，以下式計算IL-31添加下且NS22添加下之IL-6濃度(C)。
抑制率(%)=(B-C)/(B-A) x 100
其結果，NS22明顯在DU145細胞株中，以濃度依存地抑制IL-31刺激所致IL-6產生，證明對於人類IL-31訊息化具中和活性(圖6)。
嵌合抗NR10抗體之IL-31競爭活性評價
對於人類IL-31(R&D Systems)，以FMAT Blue多功能反應性染料(Applied Biosystems)進行標記。對於在50mM磷酸鈉緩衝液(pH 8.0)中製備成0.5mg/mL之hIL-31100μL，添加溶解於DMSO(Junsei)之25nmoles FMAT Blue 5.25μL，進行強力渦流(vortex)混合後，於常溫靜置15分鐘。藉由添加1M Tris-HCl(pH 7.4)5μL及10% Tween20 1.1μL，停止對於hIL-31導入FMAT Blue之反應後，以Superdex 75(GE Healthcare,17-0771-01)為管柱，以凝膠過濾，利用0.1%Tween20/PBS展開液上，將FMAT Blue-labeled hIL-31及未反應之FMAT Blue分離。
使用hNR10表現CHO細胞，依以下所示，評價抗體之IL-31/NR10結合抑制活性。
將NS22及NA633(各自的固定區為γ1,κ)使用分析緩衝液(10mM HEPES,140mM NaCl,2.5mM CaCl2 ,3mM MgCl2 ,2% FBS,0.01% NaN3 )稀釋成適當濃度，再製作稀釋公比2、合計7系列之稀釋液，以40μL/井添加到平盤(96-Well FMAT Plates,Applied Biosystems)。接著，將FMAT Blue標記hIL-31以分析緩衝液稀釋400倍，以20μL/井添加。最後，以分析緩衝液將調整成2.5 x 105 /mL之細胞懸浮液以40μL/井添加(最終1 x 104 /well)。添加細胞2小時後，以8200 Cellular Detection System(Applied Biosystems)測定螢光(FL1)。其結果，NS22顯示用量依存地抑制hIL-31/hNR10之結合，證明其活性優於NA633(圖7)。
[實施例3]抗NR10抗體對於NR10之競爭
對於從融合瘤培養上清精製之NS22抗體，以FMATBlue(Applied Biosystems,4328853)進行標記。對於製備成1mg/ml-PBS之NS22 170μL，添加17μL 1M NaHCO3 溶液及溶解於DMSO之17nmoles FMAT Blue 3.4μL，進行強力渦流混合後，於常溫靜置30分鐘。藉由添加8μL 1M Tris-HCl(pH7.4)及1.9μL 1% Tween 20，停止FMAT Blue對於NS22之導入反應後，以Superdex 75(GE Healthcare,17-0771-01)作為管柱，使用凝膠過濾在0.01% Tween20/PBS展開液上將FMAT Blue標記NS22(FMAT Blue-NS22)及未反應之FMAT Blue分離。
使用8200 Cellular Detection System(Applied Biosystems,4342920)探討：對於得到之FMAT Blue-NS22與hNR10表現CH0細胞(參考例3)之結合，各種抗體所造成之抑制。相對於8.8×10-2 μg/mL FMAT Blue-NS22、7500cells/well，添加各種濃度之嵌合抗NR10抗體(固定區各為γ1,κ)，測定將於暗處、靜置4小時後之細胞所結合之FMAT Blue來源的螢光訊息。反應於含2.5mM CaCl2 、3mM MgCl2 、140mM NaCl、2% FBS、0.01% NaNO3 之10mM Hepes-KOH中進行。結果如圖8所示。隨著NS22與NS23抗體之濃度上升，代表FMAT Blue-NS22對於NR10表現細胞之結合的螢光值FL1減少。另一方面，伴隨NA633抗體(參考例6)之濃度上升，幾乎不認為FL1降低(圖8)。
[實施例4]　NS22抗體之人類化
各框架序列之選定
比較小鼠NS22抗體之可變區與人類之生殖系(germline)序列。其中，將人類化時使用之FR序列整理於表2。CDR、FR之決定，依照Kabat編號進行。人類化的可變區，H鏈以表2記載之FR1、FR2、FR3_1、FR4所構成之序列為H0-VH(序列識別號：50)、FR1、FR2、FR3_2、FR4所構成之序列為H1-VH(序列識別號：112)。又，L鏈以FR1、FR2、FR3、FR4所構成之序列為L0(序列識別號：52)。
人類化NS22 H0L0之可變區之製作
為了製作在人類化時使用之FR區域移植有NS22之CDR區域的人類化NS22之可變區，各將合成寡DNA設計為H鏈、L鏈。將各合成寡DNA混合，以組合式PCR製作編碼為人類化NS22之可變區的基因。組合式PCR使用KOD-Plus(TOYOBO)進行，依照以下條件，以PCR法實施。將附屬的PCR緩衝液、dNTPs、MgSO4 、KOD-Plus及10pmol之合成寡DNA所構成之反應混合物，於94℃加熱5分鐘後，實施2次由94℃ 2分鐘、55℃ 2分鐘、68℃ 2分鐘所構成之PCR反應週期後，加成在可變區之5’末端加成限制酶部位及Kozak序列後之引子，及在3’末端加成有限制酶部位之引子各10pmol，實施35次由94℃ 30秒、55℃ 30秒、68℃ 1分鐘所構成之PCR反應週期，得放大片段。將得到之放大片段選殖在TOPO TA Cloning載體(TOYOBO)，利用定序確認鹼基序列。將製作的可變區與固定區組合，製作H0-SKSC(序列識別號：54)、L0(序列識別號：56)，導入動物細胞中可表現插入基因之表現載體中。各DNA片段之鹼基序列，使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)，於DNA定序儀ABI PRISM 3730xL DNA Sequencer或ABI PRISM 3700 DNA Sequencer(Applied Biosystems)，依照附屬說明書記載之方法決定。
人 類化NS22 H1之可變區之製作
H1-SKSC(序列識別號：130)之製作，係藉由將存在於H0-SRSC(序列識別號：54)之FR3之kabat編號73位之麩醯胺(E)取代為離胺酸(K)以進行。變異體之製作，使用市售QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)進行，依照附屬說明書之方法製作變異體。
IgG化抗體之表現
抗體之表現使用以下方法進行。將人類胎兒腎癌細胞來源HEK293H株(Invitrogen)懸浮於含10%胎牛血清(Invitrogen)之DMEM培養基(Invitrogen)，以5～6×105 個/mL之細胞密度在黏著細胞用培養皿(直徑10cm,CORNING)之各培養皿各接種10mL，於CO2 培養箱(37℃、5%CO2 )內培養一日夜後，將培養基吸引除去，添加CHO-S-SFMII(Invitrogen)培養基6.9mL。將製備之質體DNA混合液(合計13.8μg)與1μg/mL聚乙烯亞胺(Polysciences Inc.)20.7μL及CHO-S-SFMII培養基690μL混合，於室溫靜置10分鐘後，對於各培養皿之細胞投入，於CO2 培養箱(37℃，5%CO2 )內溫育4～5小時。之後，添加CHO-S-SFMII(Invitrogen)培養基6.9mL，於CO2 培養箱內培養3日。將培養上清回收後，進行離心分離(約2000g、5分鐘、室溫)將細胞除去，再通過0.22μm濾膜MILLEX(R) -GV(Millipore)進行滅菌。各樣本保存在4℃直到使用為止。
IgG化抗體之精製
於得到之培養上清中，添加懸浮於TBS中之50μL rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，於4℃進行4小時以上倒轉混合。將此溶液移到0.22μm之濾杯Ultrafree(註冊商標)-MC(Millipore)，以TBS 500μL清洗3次後，在rProtein A SepharoseTM 樹脂懸浮100μL之50mM乙酸鈉水溶液、pH3.3，靜置3分鐘後，使抗體洗提。立即，加入6.7μL1.5M Tris-HCl、pH7.8使中和。洗提進行2次，得200μL之精製抗體。將含抗體之溶液2μL用在ND-1000 Spectrophotometer(NanoDrop公司)(Thermo ScientificNanoDropTN 1000 Spectrophotometer(ThermoScientific公司))，或50μL用在分光光度計DU-600(BECKMAN)，測定於280nm之吸光度，並利用Pace等人之方法(Protein Science(1995)4:2411-2423)計算抗體濃度。
使用FMAT測定IL-31競爭活性
使用hNR10表現CHO細胞，如以下所示，評價抗體之IL-31/NR10結合抑制活性。將NS22嵌合抗體及NS22_H0L0(H鏈H0-SKSC/序列識別號：54、L鏈L0/序列識別號：56)使用分析緩衝液(10mM HEPES、140mM NaCl、2.5mM CaCl2 、3mM MgCl2 、2% FBS、0.01% NaN3 、pH7.4)稀釋成適當濃度，再製備稀釋公比2、合計8系列之稀釋液，以40μL/井添加在平盤(96-Well FMAT Plates,Applied Biosystems)。接著，將FMAT Blue標記hIL-31以分析緩衝液稀釋400倍，以20μL/well添加。最後，將以分析緩衝液調整為2.5 x 105 /mL之細胞懸浮液以40μL/well添加(最終1 x 104 /well)。添加細胞2小時後，以8200 Cellular Detection System(Applied Biosystems)測定螢光(FL1)。
其結果，由於人類化NS22抗體、HOLO(H鏈H0-SKSC/序列識別號：54、L鏈L0/序列識別號：56)、H1L0(H鏈H1-SKSC/序列識別號：130、L鏈L0/序列識別號：56)如圖9所示與嵌合抗體顯示大致同等的競爭活性，因此可稱為H0L0,H1L0人類化抗IL-31受體抗體。又，用於H0L0,H1L0之FR，可認為均可在人類化時作為FR使用。
因此，可認為以下實施例所示對於CDR之變異處，也可導入H0,H1中任一。
(實施例5]人類化抗IL31受體抗體中，新穎固定區M14及M58所得異質性減低效果
如參考例7～9所示，藉由將人類化抗IL-6受體抗體huPM1抗體中，固定區從IgG2變換為M14或M58，確認能不使安定性降低，而使IgG2之鉸鏈區域來源的異質性減低。所以，探討人類化抗IL-31受體抗體中藉由將固定區從野生型IgG2變換為M14或M58是否能減低異質性。
H鏈，使用參考例8及9所製作之包含M14(序列識別號：129)、M58(序列識別號：128)，IgG1(序列識別號：60)、及IgG2(序列識別號：132)及實施例4所製作之人類化抗IL-31受體抗體之H鏈之可變區HO(HO-VH/序列識別號：50)組合成之HO-M14、HO-M58、HO-IgG1及HO-IgG2，L鏈使用實施例4製作之L0(L0/序列識別號：56)，製作H0L0-IgG1(H鏈H0-IgG1/序列識別號：133、L鏈L0/序列識別號：56)、H0L0-IgG2(H鏈H0-IgG2/序列識別號：134、L鏈L0/序列識別號：56)、H0L0-M14(H鏈H0-M14/序列識別號：135、L鏈L0/序列識別號：56)及H0L0-M58(H鏈H0-M58/序列識別號：136、L鏈L0/序列識別號：56)。各抗體之表現‧精製以實施例4記載之方法行之。
異質性之評價方法，利用陽離子交換層析進行評價。製作之抗體之異質性之評價，管柱使用ProPac WCX-10(Dionex)，移動相A使用20mM乙酸鈉,pH5.0，移動相B使用20mM乙酸鈉,1M NaCl,pH5.0，以適當流速及梯度實施。陽離子交換層析(IEC)所為評價之結果如圖10所示。
如圖10所示，抗IL-31受體抗體中亦為藉由將固定區從IgG1變換為IgG2，異質性增大，且藉由將固定區變換為M14或M58，確認在任一抗體中異質性均能減低。
[實施例6]抗IL-31受體抗體中，新穎固定區M58所得藥物動態改善效果
如參考例9所示發現，藉由將抗IL-6受體抗體huPM1抗體中，固定區從IgG1變換為M58，能提升對於人類FcRn之結合性，且人類FCRn基因轉殖小鼠中，藥物動態提升。所以，對於抗IL-31受體抗體，亦探討藉由將固定區變換為M58能否使藥物動態提升。
將實施例4及實施例5製作之H0L0-IgG1(H鏈H0-IgG1/序列識別號：133、L鏈L0/序列識別號：56)、H0L0-M58(H鏈H0-M58/序列識別號：136、L鏈 L0/序列識別號：56)以參考例9所示方法，評價對於人類FcRn之結合性。其結果如表3所示。
如表3所示，抗IL-31受體抗體H0L0中亦確認將固定區從IgG1變換為M58，與抗IL-6受體抗體hPM1同樣，對於人類FcRn之結合性提升。藉此，顯示藉由將固定區從IgG1變換為M58，抗IL-31受體中，亦可於人類之藥物動態提升。
[實施例7]使等電點降低之變異處之鑑別
變異體之製作
各變異體之製作依照實施例4之方法，或使用PCR之組合式PCR進行。使用組合式PCR之方法，係進行依據包含改變部位之順鏈及逆鏈之序列設計之寡DNA合成。將包含改變部位之順鏈之寡DNA與插入有進行改變之基因之載體所結合之逆鏈之寡DNA、包含改變部位之逆鏈之寡DNA與插入有進行改變之基因之載體所結合之順鏈之寡DNA各自組合，使用PrimeSTAR(TAKARA)進行PCR，製作5’末端側與3’末端側2個包含改變部位之片段。藉由將此2個片段以組合式PCR接合，而製作各變異體。將製作的變異體插入到動物細胞中，可表現插入基因之表現載體，將得到之表現載體之鹼基序列以該技術領域中具通常知識者公知之方法決定。抗體之製作及精製依照實施例4之方法進行。
變異處之鑑別
為了提升HOLO(H鏈HO-SKSC/序列識別號：54、L鏈LO/序列識別號：56)之藥物動態，探討能使可變區之等電點降低之改變處。篩選從立體構造模型推察之可變區變異處，結果發現能不使對於NR10之結合大幅降低而使可變區等電點降低之處，將此等整理於表4(Hp5-VH/序列識別號：137、Hp7-VH/序列識別號：138、Hp8-VH/序列識別號：139、Hp6-VH/序列識別號：140、Hp9-VH/序列識別號：141、Hp1-VH/序列識別號：142、Hp13-VH/序列識別號：143、Lp1-VL/序列識別號：144、Lp2-VL/序列識別號：145、Lp3-VL/序列識別號：146、Lp4-VL/序列識別號：147、Lp7-VL/序列識別號：148、Lp5-VL/序列識別號：149、Lp6-VL/序列識別號：150)。各改變體之製作、精製以實施例4記載之方法進行。
各改變體之hIL-31/hNR10結合抑制活性使用FMAT進行評價。方法依照實施例4之方法進行。如圖11所示，各改變體之競爭活性相較於HOLO之競爭活性，未顯示大幅降低。
上述表4中，※係為了製成人類序列，與等電點無關係但改變之處。
就將此等改變組合後等電點降低之人類化NS22抗體之例而言，例如Hp3Lp15(H鏈Hp3-SKSC/序列識別號：151、L 鏈 Lp15/序列識別號：152)。將Hp3Lp15對.於NR10之親和性、等電點、及小鼠中之血漿中滯留性，與HOLO比較。
親和性之測定
各抗體對於NR10之親和性依照參考例10之方法進行。
測定之親和性結果如表5所示。Hp3Lp15之親和性與H0L0之親和性大致同等。
等電點之測定
為了評價可變區之胺基酸改變所致全長抗體之等電點變化，對於各抗體之等電點以電泳實施分析。等電點電泳之方法依據以下實施。
使用Phastsystem Cassette(Amersham Biosciences公司製)，於以下膨潤液使凝膠Phast-Gel Dry IEF(Amersham Biosciences公司製)膨潤約30分鐘。
miliQ水1.5mL
IEF用Pharmalyte 5-8(Amersham Biosciences公司製)100μL
使用經膨潤之凝膠，利用PhastSystem(Amersham Biosciences公司製)以下列規畫進行電泳。樣本於步驟2添加到凝膠。pI記號，使用pI用校正套組(Amersham Biosciences公司製)。
步驟1:2000V　2.5mA　3.5W　15℃　75Vh
步驟2:200V　2.5mA　3.5W　15℃　15Vh
步驟3:2000V　2.5mA　3.5W　15℃　410Vh
將電泳後之凝膠以20% TCA固定後，使用Silver staining Kit,protein(Amersham Biosciences公司製)，依照套組附帶的實驗步驟進行銀染色。染色後，從pI記號之既知等電點，計算樣本(全長抗體)之等電點。
依照等電點電泳測定等電點之結果，H0L0之等電點約7.8、Hp3Lp15之等電點約5.5，因此，Hp3Lp15之等電點相較於H0L0之等電點，約降低2.3。又，將可變區VH/VL之理論等電點以GENETYX(GENETYX CORPORATION)計算，結果H0L0之可變區之理論等電點為7.76、Hp3Lp15之可變區之理論等電點為4.63，Hp3Lp15相較於H0L0，理論等電點降低3.13。
使用小鼠評價等電點降低之抗體之藥物動態
為了評價使等電點降低後改變抗體、Hp3Lp15於血漿中滯留性，比較H0L0與Hp3Lp15在正常小鼠之血漿中滯留性。將H0L0及Hp3Lp15對於小鼠(C57BL/6J、日本Charles River)以1mg/kg靜脈內單次投予，比較血漿中濃度變化。血漿中濃度測定依照ELISA法測定。將適當濃度之檢量線試樣及血漿測定試樣分注到經抗人類IgG(Fc-專一)抗體(Sigma公司製)固相化之免疫平盤(Nunc-Immuno Plate,MaxiSorp(Nalge nunc International公司製))，於室溫靜置1小時。使山羊抗人類IgG-ALP(Sigma公司製)於室溫反應1小時後，以BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System(Kirkegaard & Perry Laboratories公司製)作為基質進行發色反應，在微量平盤讀取儀測定650nm之吸光度。血漿中濃度從檢量線之吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices公司製)計算。
得到之血漿中濃度變化之資料使用藥物動態解析軟體WinNonlin(Pharsight公司製)計算藥物動態學參數(AUC、全身廓清(CL))，如表6所示。相對於HOLO，Hp3Lp15靜脈內投予後之AUC約14%，廓清降低約12%。如此，發現使HOLO之等電點降低之Hp3Lp15，其藥物動態提升。
[實施例8]組合可變區及固定區對於生物活性之影響
為了評價使用相異固定區對於生物活性之影響，製作以下改變體。
就H鏈而言，製作將固定區為參考例7及9製作之SKSC(序列識別號：62)、M58(序列識別號：128)可變區為實施例7製作之可變區Hp3(Hp3-VH/序列識別號：167)組合之Hp3-M58(序列識別號：240)、Hp3-SKSC(序列識別號：151)。將製作之H鏈與實施例7製作之L鏈Lp15(Lp15/序列識別號：152)組合，製作Hp3Lp15-SKSC(H鏈Hp3-SKSC/序列識別號：151、L鏈Lp15/序列識別號：152)及Hp3Lp15-M58(H鏈Hp3-M58/序列識別號：240、L鏈Lp15/序列識別號：152)。各抗體之表現，精製依照實施例4記載之方法進行。
對於上述製作之各抗體，及使用參考例7記載之固定區SKSC(序列識別號：62)之H0L0-SKSC(H鏈H0-SKSC/序列識別號：54、L鏈L0/序列識別號：56)、實施例5製作之H0L0-M58(H鏈H0-M58/序列識別號：136、L鏈L0/序列識別號：56)及H0L0-IgG2(H鏈H0-IgG2/序列識別號：134、L鏈L0/序列識別號：56)，將使用BaF/NR10之生物活性，依實施例2記載之方法進行，其結果整理於圖18。
如圖18所示，於固定區間未檢測到大的生物活性差異。由於即使將2個可變區H0、Hp3與各固定區組合亦不會影響生物活性，故可考量今後製作之可變區中，與任一固定區組合均不會使生物活性變化。
[實施例9]利用熱加速試驗鑑別抑制分解之變異處
使用於醫藥品之抗體，即使係由單一抗體產生細胞來源的選殖體得來的單株抗體，仍存在異質性。如此種抗體之異質性，已知會由於氧化、脫醯胺化等修飾而引起，且會由於在長期保存中或熱受壓、光受壓等受壓條件下暴露而增加(參考文獻：Heterogeneity of Monoclonal Antibodies:Journal of pharmaceutical sciences,vol. 97,No. 7,2426-2447)。然而，為了將抗體開發成醫藥品時，該蛋白質之物性，其中又以均一性及安定性極重要，希望減低目的物質/關連物質之異質性，儘可能成為單一物質。於是，為了評價在受壓條件下，抗體之異質性，並為了減低其異質性，進行以下實驗。
為了評價分解物，以下列方法製備HOLO(H鏈HO-SKSC/序列識別號：54、L鏈LO/序列識別號：56)之熱加速品。對於製備的熱加速品及未加速品(initial)，以如下方法利用陽離子交換層析進行分析。
‧熱加速品之製備方法
緩衝液：PBS抗體濃度：0.2-1.0mg/mL加速溫度：60℃加速期間：1日
‧陽離子交換層析之分析方法
管柱：ProPac WCX-10,4×250mm(Dionex)移動相：(A)25mmol/LMES/NaOH,pH6.1(B)25mmol/LMES/NaOH,250mmol/L
NaCl,pH 6.1
流速：0.5mL/min管柱溫度：40℃梯度：%B 0至0(0-5min)→0至30(5-80min)檢測：280nm
HOLO之熱加速前、後之樣本的層析結果如圖19所示。HOLO之熱加速後之樣本中，鹼性峰部有增加之傾向。
於是為了使該峰部減低，進行篩選，結果發現Ha355、Ha356、Ha360、Ha362，且製作將該等H鏈改變體與L0組合成之Ha355L0(H鏈Ha355-SKSC/序列識別號：242 L鏈L0/序列識別號：56)、Ha356L0(H鏈Ha356-SKSC/序列識別號：243 L鏈L0/序列識別號：56)、Ha360LO(H鏈Ha360-SKSC/序列識別號：244 L鏈L0/序列識別號：56)、Ha362L0(H鏈Ha362-SKSC/序列識別號：245 L鏈L0/序列識別號：56)。各改變體之序列整理於表7。
【表7】
發現之各抗體之表現‧精製，依實施例4記載之方法進行。將製作之各抗體與H0L0同樣地，製備熱加速品，以陽離子交換層析分析，其結果如圖19所示。
其結果，包含將H鏈101位之天冬醯胺酸取代為麩胺酸之改變的改變抗體，熱加速後增加之鹼性峰部產生相較於H0L0為少。此等改變抗體依照實施例2之方法進行使用BaF/NR10之生物活性實驗，其結果如圖20所示。如圖20所示，該等改變之生物活性較H0L0之生物活性，大致同等或更高。如以上，發現Ha355、Ha356、Ha360、Ha362之改變抑制由於熱加速產生之分解物，在提高抗體之安定性方面為有效的。
[實施例10]鑑別使親和性增加之變異處
為了使H0L0對於NR10之親和性提升，探討製作在CDR序列導入有變異之庫。篩選在CDR導入有變異之庫，結果發現對於NR10之親和性提升之變異，將此等整理於表8。將各H鏈改變體Ha101-SKSC(序列識別號：246)、Ha103-SKSC(序列識別號：247)、Ha111-SKSC(序列識別號：248)、Ha204-SKSC(序列識別號：249)、Ha219-SKSC(序列識別號：250)L0(L0/序列識別號：56)、各L鏈改變體La134(序列識別號：251)、La130(序列識別號：252)、La303(序列識別號：253)、La328(序列識別號：254)及H0(H0-SKSC/序列識別號：54)分別組合，製作各抗體。各改變體之製作、精製，依照實施例4記載之方法實施。
各改變體對於NR10之親和性使用Biacore評價，如表9所示。方法依照參考例10記載之方法進行。如表9所示，發現各改變體之KD值相較於H0L0(H鏈H0-SKSC/序列識別號：54、L鏈L0/序列識別號：56)提高。
【表8】
就使此等之親和性提升之變異與在實施例7製作之使等電點降低之變異組合之例而言，例如Ha401La402(H鏈Ha401-SKSC/序列識別號：255、L鏈La402/序列識別號：256)、或H17L11(H鏈H17-M58/序列識別號：222、L鏈L11/序列識別號：236)。各改變體之製作、精製，依照實施例4記載之方法進行。
Ha401La402(H鏈Ha401-SKSC/序列識別號：255、L鏈La402/序列識別號：256)對於NR10之親和性及使用BaF/NR10之生物活性，依照參考例10及實施例2記載之方法進行，與HOLO(H鏈HO-SKSC/序列識別號：54、L鏈LO/序列識別號：56)比較。測定之親和性結果如表10所示，使用BaF/NR10之生物活性如圖21所示。發現親和性、生物活性均為，較HOLO(H鏈HO-SKSC/序列識別號：54、L鏈LO/序列識別號：56)之親和性、生物活性提升。
又，H17L11(H鏈H17-M58/序列識別號：222、L鏈L11/序列識別號：236)對於NR10之親和性及使用BaF/NR10之生物活性，依照實施例7及實施例2記載之方法進行，與HOLO(H鏈HO-M58/序列識別號：136、L鏈LO/序列識別號：56)比較。測定之親和性之結果如表11所示，使用BaF/NR10之生物活性如圖22所示。發現親和性、生物活性均較H0L0(H鏈H0-M58/序列識別號：136、L鏈L0/序列識別號：56)之親和性、生物活性提升。
[實施例11]鑑別為了使免疫原性之風險降低之變異處
H鏈CDR1之免疫原性風險之減低
將存在於H0L0之可變區序列的T細胞抗原決定位使用TEPITOPE(Methods. 2004 Dec;34(4):468-75)進行解析。其結果預測到在H鏈CDR1存在許多結合於HLA之T細胞抗原決定位(存在免疫原性之風險高的序列)。所以，在TEPITOPE解析中，探討使H鏈CDR1之免疫原性風險減低之改變，發現藉由將kabat編號33位之異白胺酸(I)取代為丙胺酸(A)，為使免疫原性之風險大幅減少的改變(表12)。製作將此改變對於實施例10製作的H17施加而成的H19(H19-M58/序列識別號：223)。製作將所製作的H19與L12組合成的H19L12(H鏈H19-M58/序列識別號：223、L鏈L12/序列識別號：237)。各改變體之製作、精製，依照實施例4之方法進行。
對於NR10之親和性及使用BaF/NR10之生物活性，依照參考例10及實施例2記載之方法進行，並與HOLO(H鏈HO-M58/序列識別號：136、L鏈LO/序列識別號：56)比較。測定之親和性結果如表13所示，使用BaF/NR10之生物活性如圖23所示。親和性、生物活性均與HOLO之親和性、生物活性顯示大致同等活性。
L鏈CDR1之兔疫原性風險之減低
存在於L鏈之CDR1之kabat編號25位之蘇胺酸(T)在生殖細胞系列序列為丙胺酸(A)或絲胺酸(S)。所以，可推想到將25位之蘇胺酸(T)改變為丙胺酸(A)或絲胺酸(S)，免疫原性風險會降低(表14)。所以，製作對於L12施加上述改變之L17(序列識別號：238)。製作將所製作之L17與H0組合成的HOL17(H鏈HO-M58/序列識別號：136、L鏈L17/序列識別號：238)。改變體之製作、精製，依實施例4記載之方法進行。
各改變體對於NR10之親和性及使用BaF/NR10之生物活性，依照參考例10及實施例2記載之方法進行，與HOLO(H鏈H0-M58/序列識別號：136、L鏈L0/序列識別號：56)、及H0L12(H鏈H0-M58/序列識別號：136、L鏈L12/序列識別號：237)比較。L12由於包含親和性提升之序列，因此相較於H0L0，顯示約2倍高的親和性。測定的親和性結果如表15所示，使用BaF/NR10之生物活性如圖24所示。親和性、生物活性均較H0L12之親和性、生物活性顯示大致同等之親和性及生物活性。
[實施例12]完全人類化NS22抗體之製作
製作使上述實施例發現之使pI降低之改變、使親和性上升之改變、抑制H鏈分解之改變、降低免疫原性風險之改變，對於H0(H0-M58/序列識別號：136)、H1(H1-M58/序列識別號：257)、或L0(L0/序列識別號：56)組合多數而成之NS22改變體之可變區，並實施各種篩選，結果發現H28L17(H鏈H28-M58/序列識別號：224、L鏈L17/序列識別號：238)、H30L17(H鏈H30-M58/序列識別號：225、L鏈L17/序列識別號：238)、H34L17(H鏈H34-M58/序列識別號：226、L鏈L17/序列識別號：238)、H42L17(H鏈H42-M58/序列識別號：227、L鏈L17/序列識別號：238)、H44L17(H鏈H44-M58/序列識別號：228、L鏈L17/序列識別號：238)、H46L17(H鏈H46-M58/序列識別號：229、L鏈L17/序列識別號：238)、H57L17(H鏈H57-M58/序列識別號：230、L鏈L17/序列識別號：238)、H71L17(H鏈H71-M58/序列識別號：231、L鏈L17/序列識別號：238)、H78L17(H鏈H78-M58/序列識別號：232、L鏈L17/序列識別號：238)、H92L17(H鏈H92-M58/序列識別號：233、L鏈L17/序列識別號：238)、H97L50(H鏈H97-M58/序列識別號：234、L鏈L50/序列識別號：239)、H98L50(H鏈H98-M58/序列識別號：235、L鏈L50/序列識別號：239)。改變體之製作、精製依照實施例4記載之方法進行。
各改變體對於NR10之親和性及使用BaF/NR10之生物活性，依照參考例10及實施例2記載之方法進行，與H0L0(H鏈H0-M58/序列識別號：136、L鏈L0/序列識別號：56)比較。測定之親和性結果如表16所示，使用BaF/NR10之生物活性如圖25-1及圖25-2所示。任一抗體之親和性、生物活性，均較H0L0之親和性、生物活性呈現大致同等或更高。
【表16】
[實施例13]抗NR10中和抗體之結合結構域解析
(1)人類‧小鼠　野生型及嵌合抗原之製備
將編碼為人類與小鼠之野生型及嵌合NR10細胞外區域(hhh(序列識別號：258)、mmm(序列識別號：259)、hhm(序列識別號：260)、mmh(序列識別號：261)、hmm(序列識別號：262)、mhm(序列識別號：263)、mhh(序列識別號：264))之基因，在C末端附加His標籤及Myc標籤(HHHHHHEQKLISEEDL/序列識別號：287)，並插入到動物細胞表現載體，以FreeStyle 293 Expression System(invitrogenTM )使暫時表現。此等人類‧小鼠野生型及嵌合NR10-ECD之示意圖如圖26所示。
從培養上清精製人類‧小鼠野生型及嵌合抗原(hhh、mmm、hhm、mmh、hmm、mhm、mhh)，係以Ni-NTA Superflow管柱層析進行。亦即，將Ni-NTA Superflow(QIAGEN)1mL充填在Polyprepempty管柱(BioRad)，添加各30mL之培養上清，以150mM氯化鈉與20mM咪唑之D-PBS(Dulbecco’s phosphate-Buffered Salines)清洗後，以含150mM氯化鈉與250mM咪唑之D-PBS洗提。將洗提區分以區分分子量10K之Amicon-Ultra(Millipore)取代為D-PBS後進行濃縮。
(2)利用西方點墨法檢測結合抗原
將製備之人類‧小鼠野生型及嵌合抗原以相當於各0.5μg/lane，在4-20%聚丙烯醯胺凝膠(第一化學)3片進行電泳。在半乾型點墨(blotting)裝置電轉印到PVDF膜(Millipore)，以含5%脫脂奶的TBS阻斷。1片(人類化抗人類NR10抗體檢測系)於5μg/mLH44M58L17，1片(小鼠抗人類NR10抗體檢測系)於5μg/mL之ND41，1片(Myc標籤檢測系)，於以含5%脫脂奶之TBS稀釋成500倍之抗Myc抗體(SantaCruz、Cat. #sc-789)，於室溫反應1小時。
以含0.05% TweenTM 20之TBS清洗3分鐘3次後，使與二次抗體反應。人類化抗人類NR10抗體檢測系使用鹼性磷解酶標記山羊抗人類IgGγ(BIOSOURCE、Cat. #AHI0305)，小鼠抗人類NR10抗體檢測系使用鹼性磷解酶標記山羊抗小鼠IgG(SantaCruz、Cat. #sc-2008)，Myc標籤檢測系使用鹼性磷解酶標記山羊抗兔IgG(SantaCruz、Cat. #sc-2057)，於室溫使反應1小時。以包含0.05% TweenTN 20之TBS清洗3分鐘4次後，以BCIP/NBT Phosphatase substrate,1-Component System(KPL)使發色。在此使用之TBS(Tris-緩衝鹽液)，係將1包TBS(Tris-緩衝鹽液)粉末(TaKaRa)溶解於蒸餾水1L而製備。結果如圖27所示。
使用人類化抗體、小鼠抗體時，僅於係NR10之細胞外區域的hhh、hhm、hmm檢測到結合。
[參考例1]長尾獼猴NR10、OSMR、IL-31基因之離析
為了於前臨床階段進行安全性評價，考量與長尾獼猴之交叉性‧中和活性為重要，嘗試長尾獼猴NR10基因、OSMR基因之離析。從公開的普通獼猴(學名MaCaCa mulatta)基因體資訊等設計引子，並以PCR法從長尾獼猴胰臟CDNA成功地將NR10基因、OSMR基因放大。離析後之長尾獼猴NR10、OSMR、IL-31之基因序列，如序列識別號：65、69、67所示，又，長尾獼猴NR10、OSMR、IL-31之胺基酸序列如序列識別號：66、70、68所示。
[參考例2]NR10及OSMR表現Ba/F3細胞株之建立
將人類全長NR10 cDNA(序列識別號：75)嵌入表現載體pCOS1(Biochem Biophys Res Commun. 228,p838-45,1996)，製成pCosNR10.3。將抑瘤素(oncostatin)M受體cDNA(OSMR,GenBank accession No. NM003999)從人類胎盤庫以PCR法離析，並同樣地，構建表現載體pCos1-hOSMR。對於小鼠IL-3依存性pro-B細胞來源細胞株Ba/F3，將各載體10μg同時以電穿孔法導入(BioRad Gene Pulser,960μF,0.33kV)。導入後，將人類IL-31(R&D Systems)添加‧培養，得呈現IL-31依存性增殖之細胞株(hNR10/hOSMR/BaF3細胞)。又，將長尾獼猴IL-31基因(序列識別號：67)嵌入哺乳動物細胞用表現載體，導入到CHO細胞株DG44，以其培養上清之形式得到長尾獼猴IL-31。使用此培養上清，與hNR10/hOSMR/BaF3同樣地，將長尾獼猴全長NR10及長尾獼猴OSMR基因分別插入到表現載體pCOS1，使Ba/F3細胞表現，建立長尾獼猴IL-31依存性細胞株(cynNR10/CynOSMR/BaF3細胞)。
[參考例3]NR10表現CHO細胞株之建立
將細胞內區域缺失型人類NR10基因(序列識別號：73)及細胞內區域缺失型長尾獼猴NR10基因(序列識別號：71)分別插入到哺乳動物細胞用表現載體，並將此載體以限制酶切成直鏈狀後，以電穿孔法導入到CHO細胞株DG44(BioRad Gene Pulser,25μF,1.5kV)。以藥劑選拔，並使用抗人類NR10抗體，利用FCM解析選擇NR10表現細胞並建立之。又，依照細胞內區域缺失型人類NR10基因之鹼基序列(序列識別號：73)所編碼之胺基酸序列如序列識別號：74所示，依照細胞內區域缺失型長尾獼猴NR10基因之鹼基序列(序列識別號：71)所編碼之胺基酸序列如序列識別號：72所示。
[參考例4]NR10蛋白(細胞外區域)之製備
以人類NR10 cDNA為模板，利用PCR法僅將細胞外區域放大，並在C末端加成FLAG標籤序列，嵌入到哺乳動物細胞用表現載體。將成為直鏈狀之該載體10μg以電穿孔法導入中國倉鼠卵巢細胞株DG44(BioRad Gene PulserII,25μF,1.5kV)，得呈高表現之細胞株。從將此細胞株大量培養後的培養上清，以抗FLAG抗體管柱(SIGMA製)、凝膠濾過法精製，得可溶型NR10。可溶型NR10之鹼基序列如序列識別號：77所示，胺基酸序列如序列識別號：78所示。
[參考例5]抗人類NR10抗體之製作
將人類NR10蛋白(細胞外區域)[記載於參考例4]對於小鼠進行免疫，依照通常方法製作融合瘤。將此等融合瘤之培養上清，使用參考例2所示人類IL-31依存性細胞株(hNR10/hOSMR/BaF3細胞)，以中和活性進行評價，得具NR10中和活性之NA633。
又，使用插入有人類NR10全長基因(序列識別號：75)之哺乳動物用表現載體，使用He氣體射出基因鎗進行DNA免疫，依照通常方法製作融合瘤。將該等融合瘤之培養上清，以使用參考例2所示之人類IL-31依存性細胞株(hNR10/hOSMR/BaF3細胞)之中和活性進行評價，得具NR10中和活性之ND41。
[參考例6]人類‧嵌合抗體之製作
NA633之重鏈可變區之胺基酸序列如序列識別號：104所示，輕鏈可變區之胺基酸序列如序列識別號：108所示。又，NA633之重鏈可變區之CDR1之胺基酸序列如序列識別號：105所示，CDR2之胺基酸序列如序列識別號：106所示，CDR3之胺基酸序列如序列識別號：107所示，輕鏈可變區之CDR1之胺基酸序列如序列識別號：109所示，CDR2之胺基酸序列如序列識別號：110所示，CDR3之胺基酸序列如序列識別號：111所示。再者，依照常法，製作該等小鼠可變區與人類固定區(H鏈為γ1，L鏈為κ)之嵌合抗體。
[參考例7]製作使安定性不降低而野生型IgG2之異質性減低之huPM1-SKSC
NS22抗體由於為NR10中和抗體，考慮免疫原性或副作用時，認為對於Fcγ受體之結合會有不好的可能。為了減少對於Fcγ受體之結合，考慮使固定區之同種異構型不選擇IgG1，而選擇IgG2或IgG4之方法(Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48.)，從Fcγ受體I及血漿中滯留性之觀點，認為相較於IgG4，IgG2較佳(Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72)。另一方面，當開發抗體為醫藥品時，其蛋白質物性，其中又以均一性及安定性極重要，IgG2同種異構型，據報告在鉸鏈區域之雙硫鍵來源的異質性極多(J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16206-15.)。不易維持得該等來源的目的物質/關連物質之異質性之製造間差而大量製造成醫藥品，會相關於成本增加，儘可能希望為單一物質。因此，將IgG2同種異構型之抗體開發為醫藥品方面，希望使安定性不降低，使雙硫鍵來源的異質性減低。
為了減低野生型IgG2之異質性，將存在於IgG2之鉸鏈部分之半胱胺酸及CH1結構域之半胱胺酸進行改變。各種改變體之探討結果，野生型IgG2固定區序列中，藉由將存在於H鏈之CH1結構域的EU編號(Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No. 91-3242)131位之半胱胺酸與133位之精胺酸各改變為絲胺酸及離胺酸，將H鏈之上部鉸鏈存在之EU編號219位之半胱胺酸改變為絲胺酸而成之固定區SKSC(序列識別號：62)，認為能不使安定性降低，可使異質性減低。另一方面，就減低異質性之方法，考量僅將H鏈之上部鉸鏈存在之EU編號219位之半胱胺酸改變為絲胺酸之方法、及僅將220位之半胱胺酸改變為絲胺酸之方法。所以，製作將IgG2之EU編號219位之半胱胺酸改變為絲胺酸後之固定區SC(序列識別號：153)，及將IgG2之EU編號220位之半胱胺酸改變為絲胺酸後之固定區CS(序列識別號：154)。
就H鏈而言，使用將上述製作之各固定區與IgG1(序列識別號：60)、及IgG2(序列識別號：132)與人類化抗IL-6受體抗體之可變區(H鏈可變區huPM1-VH/序列識別號：155、L鏈可變區huPM1-VL/序列識別號：156)(CancerRes. 1993 Feb 15;53(4):851-6.)組合成之huPM1-SC(序列識別號：157)、huPM1-CS(序列識別號：158)、huPM1-IgG1(序列識別號：159)、huPM1-IgG2(序列識別號：160)及huPM1-SKSC(序列識別號：161)，且就L鏈而言，使用huPM1-L(序列識別號：162)，製作各抗體。各抗體之表現‧精製依照實施例4之方法進行。
進行各抗體之異質性之比較。就huPM1-IgG1、huPM1-IgG2、huPM1-SC、huPM1-CS、huPM1-SKSC之異質性之評價方法而言，以陽離子交換層析進行評價。管柱使用ProPaC WCX-10(Dionex)，移動相A使用20mM乙酸鈉,pH5.0，移動相B使用20mM乙酸鈉,1M NaCl,pH5.0，使用適當流量及梯度實施。以陽離子交換層析進行評價之結果如圖12所示。
其結果，如圖12所示，藉由將固定區從IgG1變換為IgG2，異質性增大，但是藉由將固定區變換為SKSC，異質性大幅減低。另一方面，固定區為SC時與固定區為SKSC時，同樣地異質性大幅減低，但是，固定區為CS時，未能充分改善異質性。
一般而言，為了將抗體開發成醫藥品，除了異質性小以外，希望為了製備安定製劑具有高安定性。所以，就安定性之評價方法而言，進行以差示掃描型熱量測定(DSC)之熱變性中間溫度(Tm值)之評價(VP-DSC、Microcal公司製)。熱變性中間溫度(Tm值)係安定性之指標，為了製作安定製劑作為醫藥品，希望熱變性中間溫度(Tm值)高(JPharm SCi.2008 Apr;97(4):1414-26.)。所以，將huPM1-IgG1、huPM1-IgG2、huPM1-SC、huPM1-CS、huPM1-SKSC對於20mM乙酸鈉,150mM NaCl,pH6.0之溶液進行透析(EasySEP,TOMY)，以約0.1mg/mL之蛋白質濃度，於40℃至100℃以1℃/min之升溫速度測定DSC。得到之DSC之變性曲線如圖13所示，Fab部分之Tm值如以下表17所示。
huPM1-IgG1及huPM1-IgG2之Tm值大致同等，約94℃(IgG2約低1℃)，相對於此，huPM1-SC及huPM1-CS之Tm值約86℃，相較於huPM1-IgG1及huPM1-IgG2，Tm值顯著降低。另一方面，huPM1-SKSC之Tm值約94℃，大致與huPM1-IgG1及huPM1-IgG2為同等。huPM1-SC及huPM1-CS的安定性相較於IgG2，顯著降低，因此，為了開發作為醫藥品，認為將CH1結構域之半胱胺酸也改變為絲胺酸之huPM1-SKSC較佳。huPM1-SC及huPM1-CS之Tm值相較於IgG2大幅降低之理由，可認為係huPM1-SC及huPM1-CS與IgG2之雙硫鍵樣式採取相異樣式。
又，比較DSC變性曲線時，huPM1-IgG1及huPM1-SKSC之Fab部分之變性峰部為銳利的，相對於此huPM1-SC及huPM1-CS相較於此，Fab部分之變性峰部為寬廣，認為huPM1-IgG2其Fab部分之變性峰部之低溫側，有肩峰部。DSC之變性峰部為單一成分時，通常顯示銳利的變性峰部，但是當Tm存在相異之多數成分(亦即異質性)時，可認為變性峰部變得寬廣。亦即，於huPM1-IgG2、huPM1-SC及huPM1-CS存在多數成分，且暗示huPM1-SC及huPM1-CS，天然型IgG2之異質性未能充分減低。由此，可認為天然型IgG2之異質性不僅是鉸鏈部分之半胱胺酸，且與CH1結構域存在之半胱胺酸兩者相關，為減低DSC上之異質性，不僅是需要將鉸鏈部分之半胱胺酸改變，也需要將CH1結構域之半胱胺酸進行改變。又，如上述，不僅是將鉸鏈部分之半胱胺酸改變，也藉由將CH1結構域之半胱胺酸改變，方能具有與天然型IgG2同等之安定性。
由以上，就經減低IgG2之鉸鏈區域來源的異質性後之固定區而言，僅將鉸鏈部分之半胱胺酸取代成絲胺酸之固定區SC與CS，在異質性及安定性之觀點認為是不夠的，發現藉由將CH1結構域存在之EU編號131位之半胱胺酸也取代為絲胺酸，方能維持著與IgG2同等之安定性，同時使異質性大幅減低。如此種固定區，例如SKSC。
[參考例8]Fcγ受體非結合之適化固定區M14之製作與評價
IgG2之固定區，在Fcγ受體結合部位當中，EU編號：233、234、235、236為非結合型，但是FCγ受體結合部位之中，EU編號：327、330、331位為與非結合型之IgG4相異之序列，因此，必需將EU編號：327、330、331位之胺基酸改變成1gG4之序列(Eur J Immuno1. 1999 Aug;29(8):2613-24中，G2Δa)。然而，IgG4之EU編號：339位之胺基酸為丙胺酸，相對於此，IgG2為蘇胺酸，因此，僅將EU編號：327、330、331位之胺基酸改變為IgG4之序列，會出現成為天然不存在之T-細胞抗原決定位胜肽的9個胺基酸之新胜肽序列，產生免疫原性風險。而發現到，藉由在上述改變之外，尚將IgG2之EU編號：339位之蘇胺酸改變為丙胺酸，能防止出現新的胜肽序列。除了此等變異以外，導入使IgG2在酸性條件下之安定性提升之IgG2之EU編號397位之甲硫胺酸變為纈胺酸之變異。再者，由於使參考例7製作之鉸鏈區域之雙硫鍵來源的異質性改善之SKSC(序列識別號：62)，會隨著131位與133位之變異導入，出現成為天然不存在之T-細胞抗原決定位胜肽之9個胺基酸之新胜肽序列，產生免疫原性風險，因此，導入使EU編號137位之麩胺酸變異為甘胺酸、138位之絲胺酸變異為甘胺酸，使131位至139位附近之胜肽序列與IgG1為同一。製作導入全部此等變異之固定區序列M14(序列識別號：129)。
H鏈使用huPM1-M14、L鏈使用huPM1-L(序列識別號：162)之huPM1-M14之表現‧精製，依照參考例7記載之方法進行。製作之huPM1-M14(序列識別號：163)及huPM1-IgG1、huPM1-IgG2之異質性評價，使用陽離子交換層析，依照參考例7記載之方法實施。
如圖14所示，於huPM1-M14中亦huPM1-SKSC同樣異質性減低。
[參考例9]製作使H鏈C末端側之異質性減低、藥物動態提升之huPM1-M58
製作huPM1-M58分子
huPM1為IgG1抗體。就IgG抗體之H鏈C末端序列之異質性而言，有人報告C末端胺基酸之離胺酸殘基缺損，及C末端之2胺基酸之甘胺酸、離胺酸兩方缺損所致C末端胺基之醯胺化(Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.)。huPM1中亦為，其主成分係鹼基序列上存在之C末端胺基酸之離胺酸經由轉譯後修飾缺損之序列，但離胺酸殘存之副成分及甘胺酸、離胺酸兩方缺損所致C末端胺基之醯胺化的副成分，亦存在成為異質性。維持目的物質/關連物質之異質性之製造間差且將大量製造成醫藥品不容易，且與成本增加相關，儘可能希望為單一物質，從將抗體開發為醫藥品方面，希望減低此等之異質性。因此，開發為醫藥品方現，希望H鏈C末端之異質性不存在。又，為了減少抗體之投予量，希望使抗體之血漿中半減期增長。
所以，為了製作使H鏈C末端側之異質性減低，較huPM1-IgG1使藥物動態更改善，且使野生型IgG2來源的異質性減低而不使安定性不降低之新穎固定區，導入以下改變。
具體而言，對於具高安定性且IgG2同種異構型之固定區，抗體的上述異質性減低的huPM1-SKSC，發現到：將EU編號137位之麩胺酸取代為甘胺酸，138位之絲胺酸取代為甘胺酸，268位之組胺酸取代為麩醯胺，355位之精胺酸取代為麩醯胺，419位之麩醯胺取代為麩胺酸，此外，發現為了減低H鏈C末端之異質性，使446位之甘胺酸及447位之離胺酸缺損之huPM1-M58(序列識別號：164)。H鏈使用huPM1-M58、L鏈使用huPM1-L(序列識別號：162)之huPM1-M58之表現.精製，依照實施例4記載之方法進行。
對於所製作之huPM1-M58及huPM1-IgG1、huPM1-IgG2之異質性評價，使用陽離子交換層析，安定性之評價使用DSC，各依照實施例5記載之方法實施。
DSC之結果如表18所示。又，如圖13及16所示，huPM1-M58中亦與huPM1-SKSC同樣，不損害安定性而使異質性減低了。
huPM1-M58之血漿中滯留性評價
IgG分子之血漿中滯留性長(緩慢的消失)，已知由於IgG分子之廢物利用受體之FCRn作用(Nat Rev ImmunOl.2007 Sep;7(9):715-25)。利用胞飲作用(pinocytosis) 進入到核內體(endosome )之IgG分子，在核內體內的酸性條件下(pH6.0附近)，與在核內體內表現的FcRn結合。未能與FcRn結合之IgG分子，進入到 溶小體(lysosome)，於溶小體分解，但是結合到FCRn之IgG分子往細胞表面移動，在血漿中之中性條件下(pH7.4附近)，藉由從FcRn解離而再度返回血漿。
IgG型之抗體，已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之同種異構型，但是此等於人類之血漿中半減期，據報告IgG1、IgG2約36日、IgG3約29日、IgG4為16日(Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72.)，據認為IgG1及IgG2之血漿中滯留性最長。一般而言，抗體醫藥之同種異構型為IgG1、IgG2、IgG4，但是使此等之IgG抗體之藥物動態進一步提升之方法，據告報有藉由使IgG之固定區序列改變，提升對於上述人類FcRn之結合性之方法(J Biol chem. 2007 Jan 19;282(3):1709-17、J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56)。
由於小鼠FcRn與人類FcRn間存在種差(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Dec 5;103(49):18709-14)，因此為了預測固定區之序列經改變後之IgG抗體在人類之血漿中滯留性，考量評價對於人類FcRn之結合，及人類FcRn基因轉殖小鼠中之血漿中滯留性(Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69)。
對人類FcRn之結合評價
FcRn為FcRn與β2-微球蛋白之複合體。依據公開的人類FcRn基因序列(J. Exp. Med. 180(6),2377-2381(1994))，製作寡DNA引子。以人類cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA,Clontech)為模板，使用製作的引子，以PCR法調整編碼為基因全長之DNA片段。以得到之DNA片段為模板，利用PCR法將編碼為包含訊息區域之細胞外區域(Metl-Leu290)的DNA片段放大，並插入到動物細胞表現載體(人類FcRn胺基酸序列/序列識別號：165)。同樣地，依據公開的人類β2-微球蛋白基因序列(Proc.Natl. ACad. SCi. U.S.A. 99(26),16899-16903(2002))，製作寡DNA引子。以人類cDNA(Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA,CLONTECH)為模板，使用製作的引子，以PCR法製作編碼為基因全長之DNA片段。以得到之DNA片段為模板，利用PCR法將包含訊息區域之編碼為β2-微球蛋白全長(Metl-Met119)之DNA片段放大，並插入到動物細胞表現載體(人類β2-微球蛋白胺基酸序列/序列識別號:166)。
可溶型人類FcRn之表現，將人類胎兒腎癌細胞來源HEK293H株(Invitrogen)使用10%胎牛血清(Invitrogen)，將製備的人類FcRn及人類β2-微球蛋白之質體以脂轉染法導入細胞。將得到之培養上清回收後，使用IgG Sepharose 6 Fast Flow(Amersham Biosciences)，依照(J Immunol. 2002 Nov 1;169(9):5171-80.)之方法精製。之後，利用HiTrap Q HP(GE Healthcare)進行精製。
對於人類FcRn之結合評價，使用Biacore 3000，從結合在固定化在感應晶片之蛋白質L或兔抗人類IgG Kappa鏈抗體之抗體，與作為分析物之人類FcRn交互作用時之人類FcRn結合量，計算親和性(KD)。具體而言，電泳緩衝液(ruhning buffer)使用含150mM Nacl之50mMNa-磷酸鹽緩衝液、pH6.0，利用胺偶合法將蛋白質L固定化在感應晶片CM5(BIACORE)。之後，將抗體以含0.02% Tween20之電泳緩衝液稀釋、注射並使抗體結合於晶片後，注射人類FcRn，評價抗體對人類FcRn之結合性。
親和性之計算使用軟體BIAevaluation。從得到之感應圖，求算人類FcRn注射即將結束前對於抗體之hFcRn結合量，將此等以穩態親和性法擬合，計算抗體對於人類FcRn之親和性。
使用人類FcRn預測評價huPM1-IgG1、huPM1-M58在人類之血漿中滯留性
huPM1-IgG1及huPM1-M58對於人類FcRn之結合性之評價，依照BIAcore進行。如表19所示，huPM1-M58之結合性較huPM1-IgG1優異約1.4倍程度。
【表19】
人類FcRn基因轉殖小鼠中，血漿中滯留性之評價
人類FcRn基因轉殖小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276+/+小鼠、Jackson Laboratories)中，藥物動態之評價依下列方式進行。將抗體對於小鼠以1mg/kg之投予量對靜脈內進行單次投予，並適時採血。將採取的血液立即於4℃，以15,000rpm離心分離15分鐘，得血漿。將分離之血漿保存於設定為-20℃以下之冷凍庫直到實施測定為止。血漿中濃度使用ELISA法測定。
使用人類FcRn轉殖預測評價huPM1-IgG1、huPM1-M58於人類血漿中滯留性
進行huPM1-IgG1及huPM1-M58於人類FcRn基因轉殖小鼠中之血漿中滯留性評價。其結果，如圖17所示，確認huPM1-M58相較於huPM1-IgG1，藥物動態改善。暗示對於人類FcRn之結合性與人類FcRn基因轉殖小鼠中之血漿中滯留性為相關。
[參考例10]使用Biacore測定抗原抗體反應之親和性
使用Biacore T100(GE Heal thcare Bioscience)，進行抗原抗體反應之速度論的解析。將rec-蛋白質A(ZYMED)(以下稱為蛋白質A)固定化在感應晶片上，使此固定化蛋白質A捕捉抗體，並使抗原與分析物反應，測定抗體與抗原之相互作用。抗原使用製備成各種濃度之rhNR10。從測定得到之感應圖，計算動力參數結合速度常數ka(1/Ms)，及解離速度常數kd (1/s)，依據其值計算KD (M)。各參數之計算使用Biacore T100 EvaluatiOn SoftWare version 1.1(GE Hea1thcare Bioscience)。
蛋白質A對於感應晶片之固定化
利用胺偶合法將蛋白質A固定化在感應晶片CM5(GEHealthcare Bioscience)之所有流體胞(flow Cell)上。電泳緩衝液使用HBS-EP+(10mM HEPES,0.15M NaC1,3mMEDTA,0.05%v/v界面活性劑P20)，以流速10μL/min進行實驗。將感應晶片上之羧基甲基葡聚糖之羧基以75mg/mL EDC(N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽)與11.5mg/mL NHS(N-羥基琥珀醯亞胺)之1:1混合液 100μL活化，並對其流通以1OmM乙酸緩衝液(pH4.5)製備為50μg/mL之蛋白質A並使反應。之後，使流通1M乙醇胺鹽酸鹽(pH8.5)100μL，使未反應之活性基不活化。最終，將約4000-5000RU固定化。實驗均在25℃進行。
被蛋白質A捕捉之抗體與rhNR10之抗原抗體反應之親和性測定
電泳緩衝液使用HBS-EP+。各抗體製備成0.25μg/mL，或使結合於蛋白質A約100RU。使用作為分析物之rhNR10為HBS-EP+，製備成0、38.5、77.0、154nM，或0、19.25、77.01nM。測定首先使蛋白質A捕捉到抗體溶液中，再於流速20μL/min，使分析物溶液反應3min，之後切換為HBS-EP+，測定5min解離相。解離相之測定結束後，以10mM甘胺酸-HCl(pH1.5)清洗，將感應晶片再生。從得到之感應圖，使用Biacore專用之資料解析軟體，使用Biacore T100 Evaluation Software Version 1.1進行速度論的解析。
 【產業利用性】
本案發明人所取得抗NR10抗體，對於NR10顯示有效的中和活性，例如作為發炎性疾病治療劑有用。
圖1顯示小鼠抗體NS18、NS22、NS23、NS33之重鏈可變區之胺基酸序列。
圖2顯示小鼠抗體NS18、NS22、NS23、NS33之輕鏈可變區之胺基酸序列。
圖3顯示融合瘤培養上清對於hNR10/hOSMR/BaF3細胞增殖之抑制。
圖4顯示融合瘤培養上清對於cynNR10/cynOSMR/BaF3細胞增殖之抑制。
圖5顯示嵌合NS22之活性評價(BaF)。
圖6顯示嵌合NS22之活性評價(DU-145)。
圖7顯示嵌合NS22之IL-31競爭活性評價。
圖8顯示抗NR10抗體之NR10結合競爭活性。
圖9顯示人類化NS22(H0L0)之IL-31競爭活性。
圖10顯示人類化抗NR10抗體H0L0之固定區對於異質性之影響以陽離子交換層析評價之圖。
圖11顯示使人類化抗NR10抗體對於NR10之結合不大幅降低，能使可變區之等電點降低之變異體之IL-31競爭活性評價。
圖12顯示抗IL-6受體抗體之固定區對於異質性之影響以陽離子交換層析評價之圖。
圖13顯示抗IL-6受體抗體之固定區對於變性峰部之影響以DSC評價之圖。
圖14顯示抗IL-6受體抗體中，新穎固定區M14對於異質性之影響以陽離子交換層析評價之圖。
圖15顯示抗IL-6受體抗體中，新穎固定區M58對於異質性之影響以陽離子交換層析評價之圖。
圖16顯示抗IL-6受體抗體中，新穎固定區M58對於變性峰部之影響以DSC評價之圖。
圖17顯示huPM1-IgG1及huPM1-M58在人類FcRn基因轉殖小鼠中，血漿中滯留性之評價結果。
圖18顯示對於各抗體，顯示使用BaF/NR10之生物活性。
圖19顯示得到之各改變抗體之熱加速品(虛線)及未加速品(實線)以陽離子交換層析分析，並比較於熱加速前後之分解物產生圖。箭頭代表認為有變化之鹼性成分峰部位置。
圖20顯示各改變體之活性評價(BaF)。
圖21顯示Ha401La402、H0L0之活性評價(BaF)。
圖22顯示H17L11、H0L0之活性評價(BaF)。
圖23顯示H19L12、H0L0之活性評價(BaF)。
圖24顯示對於H0L12及H0L17，使用BaF/NR10之生物活性。
圖25-1顯示各改變體之活性評價(BaF)。
圖25-2顯示接續於圖25-1之圖。
圖26顯示人類‧小鼠野生型及嵌合NR10-ECD之示意圖。
圖27顯示結合結構域使用西方點墨檢測之照片。A顯示以人類化抗人類NR10抗體檢測結果之照片，B顯示以小鼠抗人類NR10抗體檢測結果之照片，C顯示以抗Myc抗體檢測結果之照片。利用抗人類NR10抗體，僅hhh、hhm、hmm檢測到結合抗原，mmm、mmh、mhm無法確認結合。
圖28-1顯示H0(序列識別號：50)之各改變體之胺基酸序列。
圖28-2顯示接續於圖28-1之圖。
圖28-3顯示接續於圖28-2之圖。
圖29-1顯示L0(序列識別號：52)之各改變體之胺基酸序列。
圖29-2顯示接續於圖29-1之圖。

Claims (8)

  1. 一種抗NR10/IL-31RA抗體，為以下(1)~(3)中任一項：(1)含有具序列識別號：1記載之胺基酸序列的CDR1、具序列識別號：2記載之胺基酸序列的CDR2、具序列識別號：3記載之胺基酸序列的CDR3的重鏈可變區，以及具序列識別號：5記載之胺基酸序列的CDR1、具序列識別號：6記載之胺基酸序列的CDR2、具序列識別號：7記載之胺基酸序列的CDR3的輕鏈可變區的抗體；(2)具有序列識別號：4之重鏈可變區，以及序列識別號：8之輕鏈可變區的抗體；(3)與(1)或(2)之抗體所結合之抗原決定位為相同之抗原決定位結合的抗體。
  2. 一種抗NR10/IL-31RA抗體，為以下(1)~(3)中任一項：(1)含有具序列識別號：9記載之胺基酸序列的CDR1、具序列識別號：10記載之胺基酸序列的CDR2、具序列識別號：11記載之胺基酸序列的CDR3的重鏈可變區，以及具序列識別號：13記載之胺基酸序列的CDR1、具序列識別號：14記載之胺基酸序列的CDR2、具序列識別號：15記載之胺基酸序列的CDR3的輕鏈可變區的抗體；(2)具有序列識別號：12之重鏈可變區，以及序列識別號：16之輕鏈可變區的抗體；(3)一種與(1)或(2)之抗體所結合之抗原決定位為相同 之抗原決定位結合的抗體。
  3. 一種抗NR10/IL-31RA抗體，為以下(1)~(3)中任一項：(1)含有具序列識別號：17記載之胺基酸序列的CDR1、具序列識別號：18記載之胺基酸序列的CDR2、具序列識別號：19記載之胺基酸序列的CDR3的重鏈可變區，以及具序列識別號：21記載之胺基酸序列的CDR1、具序列識別號：22記載之胺基酸序列的CDR2、具序列識別號：23記載之胺基酸序列的CDR3的輕鏈可變區的抗體；(2)具有序列識別號：20之重鏈可變區，以及序列識別號：24之輕鏈可變區的抗體；(3)一種與(1)或(2)之抗體所結合之抗原決定位為相同之抗原決定位結合的抗體。
  4. 一種抗NR10/IL-31RA抗體，具以下(1)~(3)中任一項；(1)含有具序列識別號：25記載之胺基酸序列的CDR1、具序列識別號：26記載之胺基酸序列的CDR2、具序列識別號：27記載之胺基酸序列的CDR3的重鏈可變區，以及具序列識別號：29記載之胺基酸序列的CDR1、具序列識別號：30記載之胺基酸序列的CDR2、具序列識別號：31記載之胺基酸序列的CDR3的輕鏈可變區的抗體；(2)具有序列識別號：28之重鏈可變區，以及序列識別號：32之輕鏈可變區的抗體；(3)一種與(1)或(2)之抗體所結合之抗原決定位為相同 之抗原決定位結合的抗體。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之抗NR10/IL-31RA抗體，為人類化抗體。
  6. 一種醫藥組成物，包含申請專利範圍第1至5項中任一項之抗體。
  7. 如申請專利範圍第6項之醫藥組成物，其為一發炎性疾病治療劑。
  8. 一種申請專利範圍第1至5項中任一項所述之抗體在發炎性疾病治療劑之製造的用途。
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