TWI469981B

TWI469981B - 用於治療退化性及發炎疾病之新穎化合物

Info

Publication number: TWI469981B
Application number: TW99120587A
Authority: TW
Inventors: Christel Jeanne Marie Menet; Javier Blanc
Original assignee: Galapagos Nv
Priority date: 2009-06-26
Filing date: 2010-06-23
Publication date: 2015-01-21
Also published as: PL2792677T3; MA33447B1; PT2445912E; AU2010264635B2; HK1202537A1; ES2634325T3; CR20110673A; DOP2011000378A; JP5486084B2; US9505754B2; ZA201109502B; BRPI1014759A2; EP2792677A1; JP2012530767A; KR20120059487A; DK2792677T3; CY1119711T1; AU2010264635A1; UY32741A; IL216618A0

Description

用於治療退化性及發炎疾病之新穎化合物

本發明係關於一種作為JAK抑制劑之化合物，該JAK為參與發炎病狀、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥、涉及軟骨轉換不良之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6分泌過多有關之疾病的酪胺酸激酶家族。本發明亦提供製備此化合物之方法；包含此化合物之醫藥組合物；及藉由投與本發明化合物來預防及/或治療發炎病狀、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥、涉及軟骨轉換不良之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6分泌過多有關之疾病的方法。

傑納斯激酶(Janus kinases，JAK)為自膜受體轉導細胞激素信號至STAT轉錄因子之細胞質酪胺酸激酶。已描述了四種JAK家族成員，亦即JAK1、JAK2、JAK3及TYK2。細胞激素結合於其受體後，JAK家族成員發生自體磷酸化及/或彼此轉磷酸化，繼而使STAT磷酸化，該等STAT隨後遷移至細胞核以調節轉錄。JAK-STAT細胞內信號轉導用於干擾素、大多數介白素以及多種細胞激素及內分泌因子，諸如EPO、TPO、GH、OSM、LIF、CNTF、GM-CSF及PRL(Vainchenker W.等人，(2008))。

遺傳模型與小分子JAK抑制劑研究之組合揭示數種JAK之治療潛力。小鼠及人類遺傳學證實JAK3為免疫抑制目標(O'Shea J.等人，(2004))。JAK3抑制劑成功用於臨床研發，最初用於器官移植排斥，但隨後亦用於其他免疫發炎適應症，諸如類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬及克羅恩氏症(Crohn's disease)(http://clinicaltrials.gov/)。

TYK2由人類遺傳學及小鼠基因剔除研究證實為免疫發炎疾病之潛在目標(Levy D.及Loomis C.(2007))。

JAK1為免疫發炎疾病領域之新穎目標。JAK1與其他JAK雜二聚以轉導細胞激素驅動之促炎性信號傳導。因此，抑制JAK1及/或其他JAK預期會對諸多發炎病狀以及由JAK介導之信號轉導促成的其他疾病具有治療效益。

軟骨退化為多種疾病之標誌，其中類風濕性關節炎及骨關節炎最突出。類風濕性關節炎(RA)為慢性關節退化性疾病，其特徵為關節結構之發炎及破壞。若未對該疾病進行抑制，則其將因喪失關節功能性而導致實質性致殘及疼痛，且甚至導致過早死亡。因此，RA療法之目標不僅為延緩疾病，而且亦實現好轉以停止關節破壞。除疾病後果嚴重以外，RA之高流行率(全世界約0.8%之成人受影響)意謂著高社會經濟影響。(關於對RA之回顧，請參看Smolen及Steiner(2003)；Lee及Weinblatt(2001)；Choy及Panayi(2001)；O'Dell(2004)及Firestein(2003))。

骨關節炎(亦稱作OA，或磨損及撕裂關節炎)為關節炎之最常見形式，且特徵為關節軟骨損耗，通常結合有骨肥大及疼痛。關於對骨關節炎之廣泛回顧，請參看Wieland等人，(2005)。

骨關節炎難以治療。目前尚不能治癒，且治療集中於緩解疼痛及防止受影響之關節變形。常見治療包括使用非類固醇消炎藥(NSAID)。儘管已建議膳食補充劑(諸如軟骨素及硫酸葡糖胺)作為治療骨關節炎安全且有效之選擇，但近期臨床試驗揭示兩種治療均不能減少與骨關節炎有關之疼痛。(Clegg等人，2006)。總之，未獲得改善疾病之骨關節炎藥物。

刺激合成代謝過程、阻斷分解代謝過程，或此兩者之組合可使軟骨穩定，且或許甚至使損傷復原，且因此預防疾病進一步發展。各種觸發劑可刺激軟骨細胞之合成代謝刺激。胰島素樣生長因子I(IGF-I)為滑液中之主要合成代謝生長因子，且刺激蛋白聚糖與膠原蛋白之合成。亦已展示骨形態發生蛋白(BMP)家族之成員(尤其BMP2、BMP4、BMP6及BMP7)及人類轉化生長因子β(TGF-β)家族之成員可誘導軟骨細胞合成代謝刺激(Chubinskaya及Kuettner,2003)。近年來已鑑別出一種誘導軟骨細胞之合成代謝刺激之化合物(US 6,500,854；EP 1 391 211)。然而，大多數此等化合物展示嚴重副作用，且因此，非常需要刺激軟骨細胞分化而無此等副作用之化合物。

Vandeghinste等人(WO 2005/124342)發現JAK1為一種目標，對其進行抑制可能對數種疾病(包括OA)具有治療相關性。JAK1屬於細胞質酪胺酸激酶之傑納斯激酶(JAK)家族，參與細胞激素受體介導之細胞內信號轉導。JAK家族由4個成員組成：JAK1、JAK2、JAK3及TYK2。JAK在結合細胞激素之後被招募至細胞激素受體，繼而該等細胞激素受體與共享受體次單元(共有之γ-c鏈，gp130)發生雜二聚。隨後JAK藉由自體磷酸化及/或藉由另一JAK轉磷酸化而活化，使受體被磷酸化，且募集信號轉導因子及轉錄活化因子(STAT)之成員且使該等成員磷酸化。磷酸化之STAT二聚且移位至細胞核，在細胞核中，其結合於細胞激素反應性基因之增強子區。剔除小鼠之JAK1基因表明JAK1在發育期間起必需及非冗餘作用：JAK1-/-小鼠在出生之後24小時內死亡，且淋巴細胞發育嚴重受損。此外，JAK1-/-細胞對使用以下受體的細胞激素不具反應性或具有較低反應性：II類細胞激素受體、使用γ-c次單元進行信號傳導之細胞激素受體及使用gp130次單元進行信號傳導之細胞激素受體家族(Rodig等人，1998)。

軟骨細胞生物學中有不同群組涉及JAK-STAT信號傳導。Li等人，(2001)展示制瘤素M(oncostatin M)藉由活化JAK/STAT及MAPK信號傳導路徑而誘導原代軟骨細胞中之MMP及TIMP3基因表現。Osaki等人，(2003)展示干擾素-γ介導之對軟骨細胞中膠原蛋白II之抑制涉及JAK-STAT信號傳導。IL1-β藉由減少基質組分之表現及藉由誘導膠原蛋白酶及誘導型氧化氮合成酶(NOS2)(其介導氧化氮(NO)產生)之表現而誘導軟骨分解代謝。Otero等人，(2005)展示瘦素(leptin)及IL1-β協同誘導軟骨細胞中之NO產生或NOS2 mRNA表現，且NO產生或NOS2 mRNA表現被JAK抑制劑阻斷。Legendre等人，(2003)展示IL6/IL6受體誘導牛關節軟骨細胞中之軟骨特異性基質基因膠原蛋白II、聚集蛋白聚糖核心及連接蛋白之下調，且此下調由JAK/STAT信號傳導介導。因此，此等觀察結果表明JAK激酶活性在軟骨內穩定中之作用及JAK激酶抑制劑之治療可能性。

JAK家族成員與其他病狀有關，包括脊髓增生病症(O'Sullivan等人，2007,Mol Immunol. 44(10):2497-506)，在該等病症中已鑑別到JAK2突變。此表明JAK(尤其JAK2)之抑制劑亦可適用於治療脊髓增生病症。另外，JAK家族(尤其JAK1、JAK2及JAK3)與癌症有關，尤其白血病，例如急性骨髓性白血病(O'Sullivan等人，2007,Mol Immunol. 44(10):2497-506；Xiang等人，2008,「Identification of somaticJAK1 mutations in patients with acute myeloid leukemia」,Blood第一版論文，2007年12月26日線上預發表；DOI 10.1182/blood-2007-05-090308)及急性淋巴母細胞性白血病(Mullighan等人，2009)，或實體腫瘤，例如子宮平滑肌肉瘤(Constantinescu等人，2007,Trends in Biochemical Sciences 33(3): 122-131)、前列腺癌(Tam等人，2007,British Journal of Cancer,97,378-383)。此等結果表明JAK(尤其JAK1及/或JAK2)之抑制劑亦可用於治療癌症(白血病及實體腫瘤，例如子宮平滑肌肉瘤、前列腺癌)。

另外，卡斯特門氏症(Castleman's disease)、多發性骨髓瘤、腎小球膜增生性腎小球腎炎、牛皮癬及卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)可能由細胞激素IL-6分泌過多導致，細胞激素IL-6之生物作用由細胞內JAK-STAT信號傳導介導(Tetsuji Naka,Norihiro Nishimoto及Tadamitsu Kishimoto,Arthritis Res 2002,4(增刊3):S233-S242)。此結果表明JAK抑制劑亦可用於治療該等疾病。

已確定JAK3及Tyk2與自體免疫疾病有關。JAK3以及上游信號傳導組分γ-c受體鏈及IL7受體之突變總計造成約70%之人類嚴重複合免疫不全症病例('OShea等人，2004)。注意到JAK1與JAK3協同自γ-c受體鏈轉導信號。全身性紅斑狼瘡(SLE)中可見Tyk2多形現象(O'Sullivan等人，2007,Mol Immunol. 44(10):2497-506)。因此，靶向JAK家族可提供免疫發炎領域中之治療可能性。

當前療法不能令人滿意，且因此仍需要鑑別可用於治療發炎病狀、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥、涉及軟骨轉換不良之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6分泌過多有關之疾病的其他化合物。因此，本發明提供一種化合物、其製備方法及包含本發明化合物以及適合醫藥載劑之醫藥組合物。特定言之，該化合物對JAK1展現優於對除385激酶及非激酶目標以外同樣亦對其他JAK家族成員的高效能及選擇性。另外，資料表明該化合物具有良好安全界限。因此可得出結論，本發明提供一種用於治療JAK1介導之疾病(尤其發炎疾病，諸如SLE(全身性紅斑狼瘡)及RA)的新穎可能性。

本發明亦提供本發明化合物用於製備用以治療該等疾病及病狀之藥物中的用途。

本發明係基於如下發現：JAK(尤其JAK1)之抑制劑適用於治療發炎病狀、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥、涉及軟骨轉換不良之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6分泌過多有關之疾病。本發明亦提供製備此等化合物之方法；包含此等化合物之醫藥組合物；及藉由投與本發明化合物來治療發炎病狀、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥、涉及軟骨轉換不良之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6分泌過多有關之疾病的方法。

因此，在本發明之第一態樣中，揭示一種具有式(I)之本發明化合物：

本發明化合物為JAK之新穎抑制劑，其展現對JAK1優於對其他JAK家族成員及385激酶及非激酶目標的高效能及選擇性，且展示良好安全界限。使用具有該特徵之化合物因降低脫靶作用之發生而可能有利於治療發炎疾病，尤其SLE及RA。

在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含本發明化合物及醫藥載劑、賦形劑或稀釋劑。此外，適用於本文所揭示之醫藥組合物及治療方法的本發明化合物在製備及使用時為醫藥學上可接受的。在本發明之此態樣中，醫藥組合物可另外包含適合與本發明化合物組合使用之其他活性成分。

在本發明之另一態樣中，本發明提供一種治療易患或罹患本文所列病狀中之病狀、且尤其諸如可能與異常JAK活性有關之病狀(例如發炎病狀、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥、涉及軟骨轉換不良之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6分泌過多有關之疾病)的哺乳動物的方法，該方法包含投與治療有效量之如本文所述之本發明化合物或一或多種醫藥組合物。在一特定態樣中，本發明提供一種治療易患或罹患可能與異常JAK1活性有關之病狀(尤其發炎病狀、增生性疾病及涉及軟骨轉換不良之疾病)的哺乳動物的方法。

在另一態樣中，本發明提供適用於治療或預防選自本文所列病狀之病狀、尤其諸如可能與異常JAK活性有關之病狀(諸如發炎病狀、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥、涉及軟骨轉換不良之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6分泌過多有關之疾病)的本發明化合物。在一特定態樣中，本發明提供適用於治療或預防與異常JAK1活性有關之病狀(尤其發炎病狀、增生性疾病及涉及軟骨轉換不良之疾病)的本發明化合物。

在治療態樣之另一方法中，本發明提供一種治療易患或罹患如本文所述之病因與異常JAK活性有關之病狀的哺乳動物的方法，該方法包含投與治療病狀或預防病狀有效量之本文所述之一或多種本發明之醫藥組合物或化合物。在一特定實施例中，異常JAK活性為異常JAK1活性。

在另一態樣中，本發明提供適用於治療或預防病因與異常JAK活性有關之病狀的本發明化合物。在一特定實施例中，異常JAK活性為異常JAK1活性。

在其他態樣中，本發明提供合成本發明化合物之方法，其中代表性合成方案及路徑揭示於下文中。

因此，本發明之一主要目標在於提供一種化合物，其可調節JAK之活性且因此預防或治療病因可能與JAK活性有關之任何病狀。特定言之，病因可能與JAK1之活性有關之任何病狀。

本發明之另一目標在於提供一種化合物，其可治療或緩和病因可能與JAK(尤其JAK1及JAK2)之活性有關之病狀或疾病或其症狀，諸如發炎病狀、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥、涉及軟骨轉換不良之疾病、先天性軟骨畸形及與IL6分泌過多有關之疾病。特定言之，病因可能與JAK1之活性有關之疾病或病狀。

本發明之另一目標在於提供一種可用於治療或預防多種疾病病況之醫藥組合物，該等疾病病況包括與JAK活性有關之疾病，諸如發炎病狀、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥、涉及軟骨轉換不良之疾病、先天性軟骨畸形及與IL6分泌過多有關之疾病。特定言之，病狀與JAK1活性有關。

其他目標及優勢對於熟習此項技術者將可藉由考慮後續[實施方式]而變得顯而易見。

定義

以下術語意欲具有下文提供之含義且適用於理解本發明之描述及預定範疇。

除非另外指定，否則當描述本發明(其可包括化合物、含有該等化合物之醫藥組合物及使用該等化合物及組合物之方法)時，以下術語存在時具有以下含義。亦應瞭解，當在本文中描述時，下文定義之任何部分可經多種取代基取代，且各別定義意欲包括下述範疇內之該等經取代部分。除非另外說明，否則術語「經取代」如下文所述定義。應進一步瞭解，當在本文中使用時，術語「基團」及「基」可視為可互換使用。

冠詞「一」在本文中可用以指一個(種)或一個(種)以上(亦即至少一個(種))的該冠詞語法上的賓語。舉例而言，「一類似物」意謂一種類似物或一種以上類似物。

『醫藥學上可接受』意謂由聯邦政府或州政府之管理機構或非美國國家之相應機構批准或可批准者，或列於美國藥典(U.S. Pharmacopoeia)或其他一般公認之藥典中適用於動物且更特定言之人類者。

『醫藥學上可接受之鹽』係指本發明化合物之醫藥學上可接受且具有母體化合物之所需藥理學活性的鹽。特定言之，該等鹽無毒性，且可為無機或有機酸加成鹽及鹼加成鹽。具體而言，該等鹽包括：(1)酸加成鹽，與無機酸(諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其類似酸)形成；或與有機酸(諸如乙酸、丙酸、己酸、環戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、丁二酸、蘋果酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲醯基)苯甲酸、肉桂酸、杏仁酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羥基乙烷磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、4-甲基雙環[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸、葡糖庚酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、第三丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、麩胺酸、羥基萘甲酸、水楊酸、硬脂酸、黏康酸及其類似酸)形成；或(2)當母體化合物中存在之酸性質子經金屬離子(例如鹼金屬離子、鹼土金屬離子或鋁離子)置換；或與有機鹼(諸如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基還原葡糖胺及其類似鹼)配位時形成之鹽。鹽另外包括(僅舉例而言)鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、銨鹽、四烷基銨鹽及其類似鹽；及當化合物含有鹼性官能基時，無毒有機或無機酸之鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、順丁烯二酸鹽、草酸鹽及其類似鹽。術語『醫藥學上可接受之陽離子』係指酸性官能基之可接受之陽離子性相對離子。該等陽離子例如為鈉、鉀、鈣、鎂、銨、四烷基銨陽離子及其類似陽離子。

『醫藥學上可接受之媒劑』係指與本發明化合物一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或載劑。

『前藥』係指如下化合物(包括本發明化合物之衍生物)，其具有可裂解基團且藉由溶劑分解或在生理條件下變成在活體內具有醫藥活性之本發明化合物。該等實例包括(但不限於)膽鹼酯衍生物及其類似物，N-烷基嗎啉酯及其類似物。

『溶劑合物』係指化合物與溶劑通常藉由溶劑分解反應締合之形式。此物理締合包括氫鍵結。習知溶劑包括水、乙醇、乙酸及其類似物。本發明化合物可製備成例如結晶形式，且可經溶劑化或水合。適合溶劑合物包括醫藥學上可接受之溶劑合物(諸如水合物)，且另外包括化學計量之溶劑合物及非化學計量之溶劑合物。在某些情況下，例如當一或多個溶劑分子併入結晶固體之晶格中時，溶劑合物將能夠分離。『溶劑合物』涵蓋溶液相與可分離之溶劑合物。代表性溶劑合物包括水合物、乙醇化物及甲醇化物。

『個體』包括人類。術語『人類』、『患者』及『個體』在本文中可互換使用。

「治療有效量」意謂化合物當投與個體以治療疾病時足以實現對該疾病之該治療的量。「治療有效量」可視化合物、疾病及其嚴重性及欲治療個體之年齡、體重等而變化。

『預防』係指使獲得或產生疾病或病症之風險降低(亦即在疾病發作之前使可能暴露於病原體或易患疾病之個體中疾病之至少一種臨床症狀不產生)。

術語『防治』係指『預防』，且指目的為預防而非治療或治癒疾病之措施或程序。防治措施之非限制性實例可包括投與疫苗；向由於例如不活動而具有血栓症風險之住院患者投與低分子量肝素；及在到訪瘧疾為地方病或感染瘧疾之風險較高之地理區之前投與抗瘧劑(諸如氯奎(chloroquine))。

在一實施例中，『治療』任何疾病或病症係指改善疾病或病症(亦即抑制疾病或降低其至少一個臨床症狀之顯現、程度或嚴重性)。在另一實施例中，『治療』係指改善至少一個身體參數，該身體參數可能不可由個體辨別。在另一實施例中，『治療』係指在身體上(例如穩定可辨別之症狀)、生理學上(例如穩定身體參數)或兩方面調節疾病或病症。在另一實施例中，「治療」係指減緩疾病之發展。

如本文所用之術語『發炎病狀』係指如下病狀群，包括：類風濕性關節炎、骨關節炎、青少年特發性關節炎、牛皮癬、過敏性氣管病(例如哮喘、鼻炎)、發炎性腸病(例如克羅恩氏症、結腸炎)、內毒素促成之疾病病況(例如繞通手術後的併發症或造成例如慢性心臟衰竭之慢性內毒素病況)及涉及軟骨(諸如關節之軟骨)之有關疾病。該術語尤其指類風濕性關節炎、骨關節炎、過敏性氣管病(例如哮喘)及發炎性腸病。

如本文所用之術語『自體免疫疾病』係指如下疾病群，包括：阻塞性氣管病，包括諸如COPD之病狀；哮喘(例如內因性哮喘、外因性哮喘、塵埃性哮喘、嬰兒哮喘)，尤其慢性或頑固性哮喘(例如遲發性哮喘及氣管過度反應)；支氣管炎，包括支氣管哮喘；全身性紅斑狼瘡(SLE)；多發性硬化症；第I型糖尿病及與其有關之併發症；異位性濕疹(異位性皮膚炎)、接觸性皮膚炎及其他濕疹性皮膚炎；發炎性腸病(例如克羅恩氏症及潰瘍性結腸炎)；動脈粥樣硬化；及肌萎縮性側索硬化症。該術語尤其指COPD、哮喘、全身性紅斑狼瘡、第I型糖尿病及發炎性腸病。

如本文所用之術語『增生性疾病』係指如下病狀，諸如：癌症(例如子宮平滑肌肉瘤或前列腺癌)、脊髓增生病症(例如真性紅血球增多症、原發性血小板增多症及骨髓纖維化)、白血病(例如急性骨髓性白血病及急性淋巴母細胞性白血病)、多發性骨髓瘤、牛皮癬、再狹窄、硬化性皮炎或纖維化。特定言之，該術語係指癌症、白血病、多發性骨髓瘤及牛皮癬。

如本文中所使用之術語『癌症』係指皮膚或身體器官(例如(但不限於)乳房、前列腺、肺、腎臟、胰臟、胃或腸)中之細胞的惡性或良性生長。癌症趨向於浸潤至相鄰組織中且擴散(轉移)至遠端器官，例如骨、肝臟、肺或腦。如本文所用之術語癌症包括轉移性腫瘤細胞類型，諸如(但不限於)黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及肥大細胞瘤；及組織癌瘤類型，諸如(但不限於)結腸直腸癌、前列腺癌、小細胞肺癌及非小細胞肺癌、乳癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、胃癌、膠質母細胞瘤、原發性肝癌、卵巢癌、前列腺癌及子宮平滑肌肉瘤。

如本文所用之術語『白血病』係指血液及血液形成器官之贅生性疾病。該等疾病可造成骨髓及免疫系統功能障礙，使宿主極易感染及出血。特定言之，術語白血病係指急性骨髓性白血病(AML)及急性淋巴母細胞性白血病(ALL)。

如本文所用之術語『移植排斥』係指例如胰島、幹細胞、骨髓、皮膚、肌肉、角膜組織、神經元組織、心臟、肺、心肺組合、腎臟、肝臟、腸、胰臟、氣管或食道之細胞、組織或實體器官同種異體移植物或異種移植物的急性或慢性排斥，或移植物抗宿主疾病。

如本文所用之術語『涉及軟骨轉換不良之疾病』包括如下病狀，諸如：骨關節炎、牛皮癬性關節炎、青少年類風濕性關節炎、痛風性關節炎、敗血性或感染性關節炎、反應性關節炎、反射性交感神經失養症、痛性營養不良、蒂策症候群(Tietze syndrome)或肋軟骨炎、肌肉纖維疼痛、骨軟骨炎、神經性或神經病性關節炎、關節病、關節炎之地方性形式(如地方性變形性骨關節炎(osteoarthritis deformans endemica)、莫色尼病(Mseleni disease)及汗德古多病(Handigodu disease))；由肌肉纖維疼痛、全身性紅斑狼瘡、硬皮病及僵直性脊椎炎所致之退化症。

如本文所用之術語『先天性軟骨畸形』包括如下病狀：諸如遺傳性軟骨溶解、軟骨發育不良及假軟骨發育不良，尤其但(但不限於)小耳症、無耳症、幹骺端軟骨發育不良及相關病症。

如本文所用之術語『與IL6分泌過多有關之疾病』包括如下病狀，諸如卡斯特門氏症、多發性骨髓瘤、牛皮癬、卡波西氏肉瘤及/或腎小球膜增生性腎小球腎炎。

如本文所用之術語「JAK」係指傑納斯激酶(JAK)家族，其為自膜受體轉導細胞激素信號至STAT轉錄因子的細胞質酪胺酸激酶。已描述了四種JAK家族成員，JAK1、JAK2、JAK3及TYK2，且術語JAK可根據情形所指示總體指所有JAK家族成員，或指一或多種JAK家族成員。

『本發明化合物』及等效表述意欲涵蓋上述式之化合物，若上下文允許，則該表述包括醫藥學上可接受之鹽及溶劑合物(例如水合物)及醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物。類似地，若上下文允許，則提及中間物(無論是否主張其自身)意欲涵蓋其鹽及溶劑合物。

當本文提及範圍時，例如(但不限於)C₁ -C₈ 烷基，引述一個範圍應視為代表該範圍之各成員。

本發明化合物之酸及酸衍生形式之其他衍生物均具有活性，但酸敏感形式之衍生物通常提供在哺乳動物生物體中溶解、組織相容或釋放延緩之優勢(參見Bundgard,H.,Design of Prodrugs，第7-9頁，第21-24頁，Elsevier,Amsterdam 1985)。前藥包括習此項技術之專業人員熟知之酸衍生物，諸如藉由使母體酸與適合醇反應製備之酯，或藉由使母體酸化合物與經取代或未經取代之胺反應製備之醯胺，或酸酐或混合酸酐。衍生自本發明化合物上側接之酸性基團的簡單脂族酯或芳族酯、醯胺及酸酐為特別適用之前藥。在一些情況下，宜製備雙酯型前藥，諸如(醯氧基)烷基酯或((烷氧基羰基)氧基)烷基酯。特定言之，該等前藥為本發明化合物之C₁ 至C₈ 烷基、C₂ -C₈ 烯基、芳基、C₇ -C₁₂ 經取代芳基及C₇ -C₁₂ 芳基烷基酯。

如本文所用之術語『同位素變體』係指如下化合物，其在一或多個構成該化合物之原子處含有非天然比例之同位素。舉例而言，化合物之『同位素變體』可含有一或多個非放射性同位素，諸如氘(² H或D)、碳-13(¹³ C)、氮-15(¹⁵ N)或其類似同位素。應瞭解，在進行該同位素取代之化合物中，以下原子(若存在)可變化以使例如任何氫可為² H/D，任何碳可為¹³ C，或任何氮可為¹⁵ N，且在此項技術之技能範疇內可確定該等原子之存在及定位。同樣，在例如所得化合物可用於藥物及/或基質組織分佈研究的情況下，本發明亦可包括製備具有放射性同位素之同位素變體。放射性同位素氚(亦即³ H)及碳-14(亦即¹⁴ C)鑒於其易於併入及偵測方法簡便而尤其適用於此目的。此外，可製備經正電子發射同位素(諸如¹¹ C、¹⁸ F、¹⁵ O及¹³ N)取代且適用於正電子發射斷層攝影法(Positron Emission Topography，PET)研究以檢查基質受體佔有率的化合物。

預期本文所提供之化合物的具有放射性或不具有放射性的所有同位素變體均涵蓋於本發明之範疇內。

彼此不為鏡像之立體異構體稱作『非對映異構體』，且彼此為不可重疊鏡像之立體異構體稱作『對映異構體』。當化合物具有不對稱中心時，例如其鍵結至4個不同基團，則可能形成對映異構體對。對映異構體可由其不對稱中心之絕對構型表徵，且由Cahn及Prelog之R定序法則及S定序法則描述，或由分子使偏振光之平面旋轉之方式描述且表示為右旋或左旋(亦即分別表示為(+)-或(-)-異構體)。對掌性化合物可以個別對映異構體或其混合物形式存在。含有等比例之對映異構體的混合物稱作『外消旋混合物』。

『互變異構體』係指如下化合物，其為特定化合物結構之可互換形式，且氫原子及電子之位移改變。因此，兩種結構可經由π電子及原子(通常H)之移動而平衡。舉例而言，烯醇及酮為互變異構體，因為其藉由用酸或鹼處理而快速相互轉化。互變異構現象之另一實例為苯基硝基甲烷之酸型及硝基型，其同樣藉由用酸或鹼處理而形成。

互變異構形式可能與獲得相關化合物之最佳化學反應性及生物活性有關。

本發明化合物可具有一或多個不對稱中心；因此該等化合物可製備成個別(R)-或(S)-立體異構體或其混合物。

除非另外指明，否則在本說明書及申請專利範圍中特定化合物之描述或命名意欲包括個別對映異構體與其混合物(外消旋混合物或其他混合物)。測定立體化學及分離立體異構體之方法為此項技術中所熟知。

化合物

本發明係基於以下發現：JAK抑制劑適用於治療發炎病狀、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥、涉及軟骨轉換不良之疾病、先天性軟骨畸形及與IL6分泌過多有關之疾病。本發明亦提供製備該化合物之方法；包含該化合物之醫藥組合物；及藉由投與本發明化合物來治療涉及軟骨退化、骨及/或關節退化及/或發炎之疾病的方法。本發明化合物為JAK家族成員之抑制劑；具體而言，其抑制JAK1、JAK2、JAK3及TYK2之活性。特定言之，其抑制JAK1之活性。

因此，在本發明之第一態樣中，揭示一種具有式I之本發明化合物：

本發明化合物為環丙烷甲酸{5-[4-(3,3-二甲基-氮雜環丁烷-1-羰基)-苯基]-[1,2,4]三唑幷[1,5-a]吡啶-2-基}-醯胺。

在一實施例中，本發明化合物不為同位素變體。

在一態樣中，本發明化合物以游離鹼形式存在。

在一態樣中，本發明化合物為醫藥學上可接受之鹽。

在一態樣中，本發明化合物為化合物之溶劑合物。

在一態樣中，本發明化合物為化合物之醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物。

在某些態樣中，本發明提供上式化合物之前藥及衍生物。前藥為本發明化合物之衍生物，其具有代謝可裂解基團且藉由溶劑分解或在生理條件下變成在活體內具有醫藥活性之本發明化合物。該等實例包括(但不限於)膽鹼酯衍生物及其類似物，N-烷基嗎啉酯及其類似物。

本發明化合物之酸及酸衍生形式之其他衍生物均具有活性，但酸敏感形式之衍生物通常提供在哺乳動物生物體中溶解、組織相容或釋放延緩之優勢(參見Bundgard,H.,Design of Prodrugs，第7-9頁，第21-24頁，Elsevier,Amsterdam 1985)。前藥包括習此項技術之專業人員熟知之酸衍生物，諸如藉由使母體酸與適合醇反應製備之酯，或藉由使母體酸化合物與經取代或未經取代之胺反應製備之醯胺，或酸酐或混合酸酐。衍生自本發明化合物上側接之酸性基團的簡單脂族酯或芳族酯、醯胺及酸酐為較佳前藥。在一些情況下，宜製備雙酯型前藥，諸如(醯氧基)烷基酯或((烷氧基羰基)氧基)烷基酯。特別適用之前藥為本發明化合物之C₁ 至C₈ 烷基、C₂ -C₈ 烯基、芳基、C₇ -C₁₂ 經取代芳基及C₇ -C₁₂ 芳基烷基酯。

醫藥組合物

本發明化合物當用作藥物時通常以醫藥組合物之形式投與。該等組合物可以醫藥技術中熟知之方式製備且包含至少一種活性化合物。一般而言，投與醫藥有效量之本發明化合物。實際投與之化合物之量通常由醫師按照如下相關情況確定，包括：欲處理之病狀；所選投藥途徑；實際投與之化合物；個別患者之年齡、體重及反應；患者症狀之嚴重性；及其類似因素。

本發明之醫藥組合物可藉由如下多種途徑投與，包括：經口、經直腸、經皮、皮下、關節內、靜脈內、肌肉內及鼻內。視預定傳遞途徑而定，本發明化合物較佳調配成可注射或口服組合物，或調配成油膏、洗劑或貼片(均用於經皮投與)。

用於經口投與之組合物可採用散裝液體溶液或懸浮液或散裝散劑之形式。然而，組合物更通常以單位劑型提供以有助於精確給藥。術語「單位劑型」係指適用作用於人類個體及其他哺乳動物之單一劑量的實體不連續單元，各單元含有經計算以產生所需治療作用的預定量的活性物質以及適合醫藥賦形劑、媒劑或載劑。典型單位劑型包括液體組合物之預填充、預量測安瓿或注射器，或在固體組合物情況下包括丸劑、錠劑、膠囊或其類似物。在該等組合物中，本發明化合物通常為次要組分(約0.1重量%至約50重量%，或較佳約1重量%至約40重量%)，其餘部分為有助於形成所需給藥形式之各種媒劑或載劑及加工助劑。

適用於經口投與之液體形式可包括適合水性或非水性媒劑以及緩衝劑、懸浮劑及分散劑、著色劑、調味劑及其類似物。固體形式可包括例如以下成分或具有類似性質之化合物中之任一者：黏合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸、澱粉羥基乙酸鈉(Primogel)或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂；滑動劑，諸如膠態二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或橙味調味劑。

可注射組合物通常基於可注射無菌生理食鹽水或磷酸鹽緩衝生理食鹽水或此項技術中已知之其他可注射載劑。如前所述，該等組合物中之活性化合物通常為次要組分，通常為約0.05重量%至10重量%，其餘部分為可注射載劑及其類似物。

經皮組合物通常調配成局部軟膏或乳膏，其含有一般約0.01重量%至約20重量%、較佳約0.1重量%至約20重量%、較佳約0.1重量%至約10重量%且更佳約0.5重量%至約15重量%範圍內之量的活性成分。當調配成軟膏時，活性成分通常與石蠟或水混溶性軟膏基劑組合。或者，活性成分可用例如水包油乳膏基劑調配成乳膏。該等經皮調配物為此項技術所熟知，且一般包括其他成分以增強活性成分或調配物之皮膚滲透穩定性。所有該等已知經皮調配物及成分均包括於本發明之範疇內。

本發明化合物亦可藉由經皮裝置投與。因此，經皮投藥可使用儲庫型或多孔膜型或固體基質變化形式之貼片完成。

上述可經口投與之組分、可注射或局部投與組合物僅為代表性的。其他材料以及處理技術及其類似方面闡述於Remington's Pharmaceutical Sciences，第17版，1985,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania之第8章中，該文獻係以引用的方式併入本文中。

本發明化合物亦可以持續釋放形式投與或自持續釋放藥物傳遞系統投與。代表性持續釋放材料之描述可見於Remington's Pharmaceutical Sciences中。

以下調配物實例說明可根據本發明製備之代表性醫藥組合物。然而本發明並不限於以下醫藥組合物。

調配物1-錠劑

可以約1:2重量比將本發明化合物與無水明膠黏合劑混合成乾粉。可添加少量硬脂酸鎂作為潤滑劑。可在製錠機中使混合物成型為240-270 mg錠劑(每個錠劑中含80-90 mg活性醯胺化合物)。

調配物2-膠囊

可以約1:1重量比將本發明化合物與澱粉稀釋劑混合成乾粉。可將混合物填充至250 mg膠囊中(每個膠囊中含125 mg活性醯胺化合物)。

調配物3-液體

可使本發明化合物(125 mg)與蔗糖(1.75 g)及三仙膠(xanthan gum)(4 mg)混合，且可摻合所得混合物，通過第10號篩目之美國篩(No. 10 mesh U.S. sieve)，且隨後與預先製備之微晶纖維素及羧甲基纖維素鈉(11:89，50 mg)於水中之溶液混合。用水稀釋苯甲酸鈉(10 mg)、調味劑及著色劑且在攪拌下添加。可隨後在攪拌下添加足量水。隨後添加足量水以產生5 mL之總體積。

調配物4-錠劑

可以約1:2重量比將本發明化合物與無水明膠黏合劑混合成乾粉。可添加少量硬脂酸鎂作為潤滑劑。在製錠機中使混合物成型為450-900 mg錠劑(150-300 mg活性醯胺化合物)。

調配物5-注射液

可將本發明化合物溶解或懸浮於經緩衝無菌生理食鹽水可注射水性介質中，至約5 mg/mL之濃度。

調配物6-局部

可使硬酯醇(250 g)及白石蠟脂(250 g)在約75℃下熔融，且隨後可添加本發明化合物(50 g)、對羥基苯甲酸甲酯(0.25 g)、對羥基苯甲酸丙酯(0.15 g)、月桂基硫酸鈉(10 g)及丙二醇(120 g)溶解於水(約370 g)中之混合物，且可攪拌所得混合物直至其凝結。

治療方法

本發明化合物可用作治療哺乳動物之病因與JAK之異常活性有關或可歸因於JAK之異常活性的病狀的治療劑。特定言之，病狀與JAK1之異常活性有關。因此，本發明之化合物及醫藥組合物適用作預防及/或治療哺乳動物(包括人類)之發炎病狀、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥、涉及軟骨轉換不良之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6分泌過多有關之疾病的治療劑。

在治療態樣之另一方法中，本發明提供治療易患或罹患發炎病狀之哺乳動物的方法。該等方法包含投與治療病狀或預防病狀有效量之本文所述之一或多種本發明之醫藥組合物或化合物。在一特定實施例中，發炎病狀係選自類風濕性關節炎、骨關節炎、過敏性氣管病(例如哮喘)及發炎性腸病。

在另一態樣中，本發明提供適用於治療、預防或防治發炎病狀之本發明化合物。在一特定實施例中，發炎病狀係選自類風濕性關節炎、骨關節炎、過敏性氣管病(例如哮喘)及發炎性腸病。

在治療態樣之另一方法中，本發明提供治療易患或罹患自體免疫疾病之哺乳動物的方法。該等方法包含投與治療病狀或預防病狀有效量之本文所述之一或多種本發明之醫藥組合物或化合物。在一特定實施例中，自體免疫疾病係選自COPD、哮喘、全身性紅斑狼瘡、第I型糖尿病及發炎性腸病。

在另一態樣中，本發明提供適用於治療、預防或防治自體免疫疾病之本發明化合物。在一特定實施例中，自體免疫疾病係選自COPD、哮喘、全身性紅斑狼瘡、第I型糖尿病及發炎性腸病。

在治療態樣之另一方法中，本發明提供治療易患或罹患增生性疾病、尤其癌症(例如實體腫瘤，諸如子宮平滑肌肉瘤或前列腺癌)、白血病(例如AML或ALL)、多發性骨髓瘤及/或牛皮癬之哺乳動物的方法。該等方法包含投與治療病狀或預防病狀有效量之本文所述之一或多種本發明之醫藥組合物或化合物。

在另一態樣中，本發明提供適用於治療、預防或防治增生性疾病、尤其癌症(例如實體腫瘤，諸如子宮平滑肌肉瘤或前列腺癌)、白血病(例如AML或ALL)、多發性骨髓瘤及/或牛皮癬的本發明化合物。

在治療態樣之另一方法中，本發明提供治療易患或罹患移植排斥之哺乳動物的方法。該等方法包含投與治療病狀或預防病狀有效量之本文所述之一或多種本發明之醫藥組合物或化合物。在一特定實施例中，本發明提供治療器官移植排斥之方法。

在另一態樣中，本發明提供適用於治療、預防或防治移植排斥之本發明化合物。在一特定實施例中，本發明提供治療器官移植排斥之方法。

在治療態樣之一方法中，本發明提供治療、預防或防治易患或罹患涉及軟骨轉換不良之疾病的哺乳動物的方法。該等方法包含投與治療病狀或預防病狀有效量之本文所述之一或多種本發明之醫藥組合物或化合物。

在另一態樣中，本發明提供適用於治療、預防或防治涉及軟骨轉換不良之疾病的本發明化合物。

本發明亦提供一種治療先天性軟骨畸形的方法。該等方法包含投與治療病狀或預防病狀有效量之本文所述之一或多種本發明之醫藥組合物或化合物。

在另一態樣中，本發明提供適用於治療、預防或防治先天性軟骨畸形的本發明化合物。

在治療態樣之另一方法中，本發明提供治療易患或罹患與IL6分泌過多有關之疾病、尤其卡斯特門氏症或腎小球膜增生性腎小球腎炎的哺乳動物的方法。該等方法包含投與治療病狀或預防病狀有效量之本文所述之一或多種本發明之醫藥組合物或化合物。

在另一態樣中，本發明提供適用於治療、預防或防治與IL6分泌過多有關之疾病、尤其卡斯特門氏症或腎小球膜增生性腎小球腎炎的本發明化合物。

本發明之另一態樣提供適用作尤其用於治療或預防上述病狀及疾病之藥物的本發明化合物。本文亦提供該化合物之用途，其係用於製備治療或預防上述病狀及疾病之一的藥物。

本發明方法之一特定方案包含向罹患發炎病狀之個體投與有效量之本發明化合物持續足以降低個體之發炎程度，且較佳終止造成該發炎之過程的一段時間。該方法之一特殊實施例包含向罹患類風濕性關節炎或易產生類風濕性關節炎之個體患者投與有效量之本發明化合物持續足以分別減少或預防該患者關節中的發炎，且較佳終止造成該發炎之過程的一段時間。

本發明方法之另一特定方案包含向罹患涉及軟骨轉換不良之疾病(例如骨關節炎)的個體投與有效量之本發明化合物持續足以減少且較佳終止造成該退化之自保持過程的一段時間。該方法之一特定實施例包含向罹患骨關節炎或易產生骨關節炎之個體患者投與有效量之本發明化合物持續足以分別減少或預防該患者關節中的軟骨退化，且較佳終止造成該退化之自保持過程的一段時間。在一特定實施例中，該化合物可展現軟骨合成代謝及/或抗分解代謝特性。

注射劑量濃度之範圍為約0.1 mg/kg/h至至少10 mg/kg/h，該等劑量均維持約1小時至約120小時，且尤其24小時至96小時。亦可投與約0.1 mg/kg至約10 mg/kg或10 mg/kg以上之預加載快速注射以達成足夠穩態之含量。對於40至80 kg之人類患者，最大總劑量預期不超過每日約2 g。

為預防及/或治療長期病狀(諸如退化性病狀)，治療方案通常長達多個月或多年，故經口給藥因患者便利性及耐受性而較佳。對於經口給藥，每日一至五次且尤其二至四次且通常三次經口給藥為代表性方案。使用此等給藥模式，每次給藥提供約0.01 mg/kg至約20 mg/kg本發明化合物，其中特定給藥各提供約0.1 mg/kg至約10 mg/kg、且尤其約1 mg/kg至約5 mg/kg本發明化合物。

經皮給藥一般選用於提供與使用注射給藥獲得之血液含量相比類似或較低的血液含量。

當用於預防發炎病狀之發作時，通常在醫師建議及監督下，向具有產生該病狀之風險的患者投與上述劑量濃度之本發明化合物。具有產生特定病狀之風險的患者一般包括具有該病狀之家族史的患者或已藉由遺傳測試或篩選鑑別特別易產生該病狀的患者。

本發明化合物可作為單一活性劑投與，或其可與其他治療劑組合投與，該等其他治療劑包括顯示相同或類似治療活性且對於該組合投藥確定為安全且有效的其他化合物。在一特定實施例中，共投與兩種(或兩種以上)藥劑使得可顯著降低欲使用各者之劑量，從而減少可見之副作用。

在一實施例中，本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防發炎病狀；特定藥劑包括(但不限於)免疫調節劑(例如硫唑嘌呤(azathioprine))、皮質類固醇(例如潑尼松龍(prednisolone)或地塞米松(dexamethasone))、環磷醯胺(cyclophosphamide)、環孢素A(cyclosporin A)、他克莫司(tacrolimus)、黴酚酸嗎啉乙酯(Mycophenolate Mofetil)、莫羅單抗-CD3(muromonab-CD3，OKT3，例如)、ATG、阿司匹林(aspirin)、乙醯胺苯酚(acetaminophen)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)及吡羅昔康(piroxicam)。

在一實施例中，本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防關節炎(例如類風濕性關節炎)；特定藥劑包括(但不限於)止痛劑、非類固醇消炎藥(NSAIDS)、類固醇、合成DMARDS(例如(但不限於)甲胺喋呤(methotrexate)、來氟米特(leflunomide)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、金諾芬(auranofin)、金硫丁二鈉(sodium aurothiomalate)、青黴胺(penicillamine)、氯奎、羥氯奎(hydroxychloroquine)、硫唑嘌呤及環孢素)及生物DMARDS(例如(但不限於)英利昔單抗(Infliximab)、依那西普(Etanercept)、阿達木單抗(Adalimumab)、利妥昔單抗(Rituximab)及阿巴西普(Abatacept))。

在一實施例中，本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防增生性病症；特定藥劑包括(但不限於)甲胺喋呤、亞葉酸(leukovorin)、阿德力黴素(adriamycin)、潑尼松(prenisone)、博來黴素(bleomycin)、環磷醯胺、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)、小紅莓(doxorubicin)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、阿那曲唑(anastrozole)、戈舍瑞林(goserelin)、抗HER2單株抗體(例如Herceptin^TM )、卡培他濱(capecitabine)、雷洛昔芬鹽酸鹽(raloxifene hydrochloride)、EGFR抑制劑(例如、Tarceva^TM 、Erbitux^TM )、VEGF抑制劑(例如Avastin^TM )、蛋白酶體抑制劑(例如Velcade^TM )、及hsp90抑制劑(例如17-AAG)。另外，本發明化合物可與其他療法組合投與，該等其他療法包括(但不限於)放射療法或手術。在一特定實施例中，增生性病症係選自癌症、骨髓增生性疾病或白血病。

在一實施例中，本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防自體免疫疾病；特定藥劑包括(但不限於)：糖皮質激素、細胞生長抑制劑(例如嘌呤類似物)、烷化劑(例如氮芥(環磷醯胺)、亞硝基脲、鉑化合物及其他烷化劑)、抗代謝物(例如甲胺喋呤、硫唑嘌呤及巰基嘌呤)、細胞毒性抗生素(例如放線菌素(dactinomycin)、蒽環黴素(anthracycline)、絲裂黴素C(mitomycin C)、博來黴素及光神黴素(mithramycin))、抗體(例如抗CD20、抗CD25或抗CD3(OTK3)單株抗體、及)、環孢素、他克莫司、雷帕黴素(rapamycin)(西羅莫司(sirolimus))、干擾素(例如IFN-β)、TNF結合蛋白(例如英利昔單抗(Remicade^TM )、依那西普(Enbrel^TM )或阿達木單抗(Humira^TM ))、黴酚酸酯(mycophenolate)、芬戈莫德(Fingolimod)及多球殼菌素(Myriocin)。

在一實施例中，本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防移植排斥，特定藥劑包括(但不限於)：鈣調神經磷酸酶(calcineurin)抑制劑(例如環孢素或他克莫司(FK506))、mTOR抑制劑(例如西羅莫司、依維莫司(everolimus))、抗增生劑(例如硫唑嘌呤、黴酚酸(mycophenolic acid))、皮質類固醇(例如潑尼松龍、氫皮質酮(hydrocortisone))、抗體(例如單株抗IL-2Rα受體抗體、巴利昔單抗(basiliximab)、達利珠單抗(daclizumab))、多株抗T細胞抗體(例如抗胸腺細胞球蛋白(ATG)、抗淋巴細胞球蛋白(ALG))。

在一實施例中，本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防哮喘及/或鼻炎及/或COPD，特定藥劑包括(但不限於)：β₂ -腎上腺素受體促效劑(例如沙丁胺醇(salbutamol)、左旋沙丁胺醇(levalbuterol)、特布他林(terbutaline)及比托特羅(bitolterol))、腎上腺素(吸入或錠劑)、抗膽鹼劑(例如溴化異丙托銨(ipratropium bromide))、糖皮質激素(口服或吸入)、長效β₂ -促效劑(例如沙美特羅(salmeterol)、福莫特羅(formoterol)、班布特羅(bambuterol)及持續釋放型口服舒喘寧(albuterol))、吸入類固醇與長效支氣管擴張劑之組合(例如氟替卡松(fluticasone)/沙美特羅、布地奈德(budesonide)/福莫特羅)、白三烯拮抗劑及合成抑制劑(例如孟魯司特(montelukast)、紮魯司特(zafirlukast)及齊留通(zileuton))、介體釋放抑制劑(例如敏鼻速樂(cromoglycate)及酮替酚(ketotifen))、IgE反應之生物調節劑(例如奧瑪利珠單抗(omalizumab))、抗組織胺(例如賽特那伶(ceterizine)、辛那伶(cinnarizine)、非索非那定(fexofenadine))及血管收縮劑(例如羥甲唑啉(oxymethazoline)、賽洛唑啉(xylomethazoline)、萘甲唑啉(nafazoline)及曲馬唑啉(tramazoline))。

另外，本發明化合物可與哮喘及/或COPD之急診療法組合投與，該等療法包括投與氧氣或氦氧混合劑、霧化之沙丁胺醇或特布他林(視情況與抗膽鹼劑(例如異丙托銨(ipratropium))組合)、全身性類固醇(口服或靜脈內，例如潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)、地塞米松或氫皮質酮)、靜脈內沙丁胺醇、非特異性β-促效劑(注射或吸入，例如腎上腺素、異他林(isoetharine)、異丙基腎上腺素(isoproterenol)、間羥異丙腎上腺素(metaproterenol))、抗膽鹼劑(靜脈內或霧化，例如格隆溴銨(glycopyrrolate)、阿托品(atropine)、異丙托銨)、甲基黃嘌呤(茶鹼(theophylline)、胺茶鹼(aminophylline)、下胺茶鹼(bamiphylline))、具有支氣管擴張作用之吸入麻醉劑(例如異氟醚(isoflurane)、鹵神(halothane)、安氟醚(enflurane))、氯胺酮(ketamine)及靜脈內硫酸鎂。

在一實施例中，本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防腸激躁疾病(IBD)，特定藥劑包括(但不限於)：糖皮質激素(例如潑尼松、布地奈德)、改善疾病之合成免疫調節劑(例如甲胺喋呤、來氟米特、柳氮磺吡啶、美沙拉嗪(mesalazine)、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤及環孢素)及改善疾病之生物免疫調節劑(英利昔單抗、阿達木單抗、利妥昔單抗及阿巴西普)。

在一實施例中，本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防全身性紅斑狼瘡，特定藥劑包括(但不限於)：改善疾病之抗風濕藥(DMARD)(諸如抗瘧劑(例如氯奎寧(plaquenil)、羥氯奎))、免疫抑制劑(例如甲胺喋呤及硫唑嘌呤)、環磷醯胺及黴酚酸；免疫抑制藥物及止痛劑，諸如非類固醇消炎藥、鴉片劑(例如右丙氧芬(dextropropoxyphene)及可待因-撲熱息痛(co-codamol))、類鴉片(例如氫可酮(hydrocodone)、羥考酮(oxycodone)、美施康定(MS Contin)或美沙酮(methadone))及芬太尼多瑞吉經皮貼片(fentanyl duragesic transdermal patch)。

在一實施例中，本發明化合物與另一治療劑共投與以治療及/或預防牛皮癬，特定藥劑包括(但不限於)：局部治療，諸如浴溶液；濕化劑；含有煤焦油之藥用乳膏及軟膏；地蒽酚(dithranol)(蒽三酚(anthralin))；皮質類固醇，如去羥米松(desoximetasone)(Topicort^TM )、氟輕鬆(fluocinonide)；維生素D₃ 類似物(例如卡泊三醇(calcipotriol))；阿甘油(Argan oil)及類視黃素(依曲替酯(etretinate)、阿曲汀(acitretin)、他紮羅汀(tazarotene))；全身性治療，諸如甲胺喋呤、環孢素、類視黃素、硫鳥嘌呤(tioguanine)、羥基脲、柳氮磺吡啶、黴酚酸嗎啉乙酯、硫唑嘌呤、他克莫司、反丁烯二酸酯；或生物製劑，諸如Amevive^TM 、Enbrel^TM 、Humira^TM 、Remicade^TM 、Raptiva^TM 及優特克單抗(ustekinumab)(IL-12及IL-23阻斷劑)。另外，本發明化合物可與其他療法組合投與，該等其他療法包括(但不限於)光電治療術或光化學療法(例如補骨脂素(psoralen)及紫外線A光電治療術(PUVA))。

如對於熟習此項技術者顯而易見，共投與包括向患者傳遞兩種或兩種以上治療劑作為同一治療方案之一部分的任何方法。雖然兩種或兩種以上藥劑可在單一調配物中同時投與，但此並非必需。該等藥劑可在不同調配物中及在不同時間投與。

通用合成程序

總則

本發明化合物可自易獲得之起始物質使用以下通用方法及程序製備。除非另外說明，否則應瞭解，若提供典型或較佳處理條件(亦即反應溫度、時間、反應物之莫耳比、溶劑、壓力等)，則亦可使用其他處理條件。最佳反應條件可隨所用特定反應物或溶劑而變化，但該等條件可由熟習此項技術者藉由常規最佳化程序確定。

另外，如對於熟習此項技術者顯而易見，可能必需習知保護基以防止某些官能基進行不合需要之反應。特定官能基之適合保護基的選擇以及保護及脫除保護基之適合條件為此項技術中所熟知。舉例而言，多個保護基及其引入及移除描述於T. W. Greene及P. G. M. Wuts,Protecting Groups in Organic Synthesis ，第2版，Wiley,New York,1991及其中引用之參考文獻中。

關於上文所列之代表性雙環雜芳基化合物的製備詳細提供以下方法。本發明化合物可由熟習有機合成之技術者自已知或市售起始物質及試劑製備。

除非另外說明，否則所有試劑均為商品級且不經進一步純化即可原樣使用。市售無水溶劑用於在惰性氛圍下進行反應。除非另外指明，否則在所有其他實例中均使用試劑級溶劑。在矽膠60(35-70 μm)上進行管柱層析。使用預塗佈之矽膠F-254板(厚度0.25 mm)進行薄層層析。在Bruker DPX 400 NMR光譜儀(400 MHz)上記錄¹ H NMR譜。¹ H NMR譜之化學位移(δ)用相對於作為內部參考之四甲基矽烷(δ 0.00)或適當殘餘溶劑峰值(亦即CHCl₃ (δ 7.27))之百萬分率(ppm)報導。多重性以如下形式給出：單峰(s)、雙重峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)、多重峰(m)及寬峰(br)。偶合常數(J)以Hz給出。在Micromass platform LC/MS光譜儀上獲得電噴霧MS譜。用於所有LCMS分析之管柱：Waters Acquity UPLC BEH C18 1.7 μm，2.1 mm ID×50 mm L(部件號186002350)。製備型HPLC：Waters XBridge Prep C18 5 μm ODB 19 mm ID×100 mm L(部件號186002978)。所有該等方法均使用MeCN/H₂ O梯度。H₂ O含有0.1% TFA或0.1% NH₃ 。

以下為實驗部分中所用之縮寫的清單：

合成製備本發明化合物

本發明化合物可根據以下流程製備。

通用合成方法

其中Ar表示苯基-L1-雜環烷基，其中L1為-CO-，且雜環烷基視情況經取代。

通用方法

1.1.1　1-(6-溴-吡啶-2-基)-3-乙氧羰基-硫脲 (2)

向冷卻至5℃之2-胺基-6-溴吡啶(1) (253.8 g，1.467 mol)於DCM(2.5 L)中之溶液中經15分鐘逐滴添加異硫氰酸乙氧羰酯(173.0 mL，1.467 mol)。隨後使反應混合物升溫至室溫(20℃)且攪拌16小時。在真空中蒸發得到固體，其可藉由過濾收集，用汽油(3×600 mL)充分洗滌且風乾，得到(2) 。硫脲可不經任何純化而原樣用於下一步驟。¹ H(400 MHz,CDCl₃ )δ12.03(1H,br s,NH),8.81(1H,d,J 7.8 Hz,H-3),8.15(1H,br s,NH),7.60(1H,t,J 8.0 Hz,H-4),7.32(1H,dd,J 7.7及0.6 Hz,H-5),4.31(2H,q,J 7.1 Hz,CH₂ ),1.35(3H,t,J 7.1 Hz,CH₃ )。

1.1.2　5-溴-[1,2,4]三唑幷[1,5-a]吡啶-2-基胺 (3)

向羥胺鹽酸鹽(101.8 g，1.465 mol)於EtOH/MeOH(1:1，900 mL)中之懸浮液中添加N,N -二異丙基乙胺(145.3 mL，0.879 mol)，且在室溫(20℃)下攪拌混合物1小時。隨後添加1-(6-溴-吡啶-2-基)-3-乙氧羰基-硫脲(2) (89.0 g，0.293 mol)，且緩慢加熱混合物至回流(請注意：需要漂白洗滌器以淬滅所析出之H₂ S)。在回流下3小時後，使混合物冷卻且過濾，收集所沈澱之固體。藉由在真空中蒸發濾液、添加H₂ O(250 mL)且過濾再收集產物。依次用H₂ O(250 mL)、EtOH/MeOH(1:1，250 mL)及Et₂ O(250 mL)洗滌經合併之固體，隨後在真空中乾燥，得到呈固體狀之三唑幷吡啶衍生物(3) 。該化合物可不經任何純化而原樣用於下一步驟。¹ H(400 MHz,DMSO-d ₆ )δ7.43-7.34(2H,m,2×芳族H),7.24(1H,dd,J 6.8及1.8 Hz,芳族H),6.30(2H,br,NH₂ )；m/z 213/215(1:1,M+H⁺ ,100%)。

1.1.3　環丙烷甲酸(5-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-醯胺 (4) ：

在5℃下向2-胺基-三唑幷吡啶(3) (7.10 g，33.3 mmol)於無水CH₃ CN(150 mL)中之溶液中依續添加Et₃ N(11.6 mL，83.3 mmol)、環丙烷羰基氯(83.3 mmol)。隨後使反應混合物升溫至環境溫度，且攪拌直至所有起始物質(3) 均被消耗。需要時，再添加Et₃ N(4.64 mL，33.3 mmol)及環丙烷羰基氯(33.3 mmol)以確保完全反應。在真空中蒸發溶劑後，用7 N甲醇氨溶液(50 mL)處理所得殘餘物，且在環境溫度下攪拌(1-16小時)以水解任何雙醯基化產物。藉由在真空中移除揮發物繼而用Et₂ O(50 mL)濕磨進行產物分離。藉由過濾收集固體，用H₂ O(2×50 mL)、丙酮(50 mL)及Et₂ O(50 mL)洗滌，隨後在真空中乾燥，得到所需溴中間物(4) 。

製備本發明化合物之合成程序

化合物1

步驟1：鈴木偶合(Suzuki coupling)

將4-羧基苯基酸(3.5 g，0.021 mol)添加至環丙烷甲酸(5-溴-[1,2,4]三唑幷[1,5-a]吡啶-2-基)-醯胺(中間物4，5 g，0.018 mol)於1,4-二噁烷/水(5:1)中之溶液中。向該溶液中添加K₂ CO₃ (5.0 g，0.036 mol)及PdCl₂ dppf(5%)。隨後在90℃下，於油浴中加熱所得混合物16小時。添加1 M HCl溶液，且於酸性溶液中形成沈澱物。過濾沈澱物，在真空下乾燥，得到標題化合物，其不經進一步純化即用於下一步驟中。

步驟2：環丙烷甲酸{5-[4-(3,3-二甲基-氮雜環丁烷-1-羰基)-苯基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基}-醯胺(化合物1)。

在室溫下將EDCI(3.59 g，0.019 mol)、HOBt(2.53 g，0.019 mol)及DIPEA(4.48 mL)添加至4-[2-(環丙烷羰基-胺基)-[1,2,4]三唑幷[1,5-a]吡啶-5-基]-苯甲酸(4 g，0.012 mol)於DCM(150 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌所得混合物10分鐘。向該溶液中添加二甲基氮雜環丁烷鹽酸鹽(1.64 g，0.013 mol)，且攪拌反應物16小時。向反應混合物中添加水。分離有機層且用2 N NaOH溶液、2 N HCl溶液及水洗滌。有機相經MgSO₄ 乾燥，過濾且在真空下蒸發。藉由急驟層析(溶離劑：1:1石油/EtOAc至純EtOAc)純化，得到環丙烷甲酸{5-[4-(3,3-二甲基-氮雜環丁烷-1-羰基)-苯基]-[1,2,4]三唑幷[1,5-a]吡啶-2-基}-醯胺。

已或可根據本文所述之合成方法製備的本發明化合物列於下表I中。表II中提供本發明化合物之NMR譜資料。

生物實例

實例1：活體外檢定

實例1.1　JAK1抑制檢定

重組人類JAK1(催化域，胺基酸866-1154；目錄號PV4774)係購自Invitrogen。在含有測試化合物或媒劑(DMSO，最終濃度為1%)的4 μL存在或不存在下，將1 ng JAK1與20 nM Ulight-JAK1(tyr1023)肽(Perkin Elmer，目錄號TRF0121)在激酶反應緩衝液(25 mM MOPS pH 6.8、0.016% Brij-35、8.33 mM MgCl₂ 、3.33 mM DTT、7 μM ATP)中於白色384 Luminotrac 200板(Greiner，目錄號781075)中一起培育，總體積為20 μL。在室溫下60分鐘之後，藉由每孔添加20 μL偵測混合物(1×偵測緩衝液(Perkin Elmer，目錄號CR97-100C)、0.5 nM銪-抗磷酸酪胺酸(PT66)(Perkin Elmer，目錄號AD0068)、10 mM EDTA)停止反應。使用Envision(Perkin Elmer)進行讀取，其中在320 nm下激發且量測615 nm下之發射。藉由自媒劑存在下得到之相對螢光單位(RFU)減去陽性對照抑制劑(10 μM星形孢菌素(staurosporine))存在下得到之RFU計算激酶活性。測試化合物抑制此活性之能力如下測定：抑制百分比=1-((測試化合物存在下測定的樣品RFU-陽性對照抑制劑存在下測定之樣品RFU)/(媒劑存在下測定之RFU-陽性對照抑制劑存在下測定之樣品RFU))*100。

製備化合物之劑量稀釋系列，使得能夠在JAK1檢定中測試劑量反應作用及計算該化合物之IC₅₀ 。通常測試20 μM濃度，繼而1/5連續稀釋所得之8個點(20 μM-4 μM-800 nM-160 nM-32 nM-6.4 nM-1.28 nM-0.26 nM)濃度的各化合物，DMSO最終濃度為1%。當化合物系列之效能增加時，製備更高稀釋度稀釋液及/或降低最高濃度(例如5 μM、1 μM)。資料表示為檢定之平均IC₅₀ ±平均值之標準誤差。

實例1.2　JAK1 Ki測定檢定

為測定Ki，將不同量之抑制劑與酶混合，且隨ATP濃度變化跟蹤酶促反應。藉助於繪製Km相對於濃度之雙倒數圖(萊恩威佛-伯克圖(Lineweaver-Burk plot))測定Ki。使用最終濃度為500 ng/ml之JAK1(Invitrogen，PV4774)。受質為Poly(Glu,Tyr)鈉鹽(4:1)，MW 20 000-50 000(Sigma，P0275)。在不同濃度之ATP及化合物存在下，在25 mM Hepes(pH 7.5)；0.01%吐溫20、10 mM MgCl₂ 中進行反應，且藉由添加150 mM磷酸停止反應。藉由將樣品裝載於過濾板上(使用收集器，Perkin Elmer)且隨後洗滌進行併入受質polyGT中之磷酸酯的量測。向過濾板(Perkin Elmer)添加閃爍液之後，在Topcount閃爍計數器中量測polyGT中併入之³³ P。

當在此檢定中測試化合物1時，測得之Ki值為6.9 nM。

或者，為測定Ki，將不同量之抑制劑與酶混合，且隨ATP濃度變化跟蹤酶促反應。藉助於繪製Km相對於化合物濃度之雙倒數圖(萊恩威佛-伯克圖)測定Ki。該檢定中使用1 ng JAK1(Invitrogen，PV4774)。受質為50 nM Ulight-JAK-1(Tyr1023)肽(Perkin Elmer，TRF0121)。反應在不同濃度之ATP及化合物存在下，在25 mM MOPS(pH 6.8)、2 mM DTT、5 mM MgCl₂ 、0.01% Brij-35中進行。使用經Eu標記之抗磷酸酪胺酸抗體PT66(Perkin Elmer，AD0068)量測磷酸化受質。在envision(Perkin Elmer)上進行讀取，其中在320 nm下激發且在615 nm及665 nm下跟蹤發射。

當在此檢定中測試化合物1時，測得之Ki值為5.6 nM。

實例1.3　JAK2抑制檢定

重組人類JAK2(催化域，胺基酸866-1154；目錄號PV4210)係購自Invitrogen。在含有測試化合物或媒劑(DMSO，最終濃度為1%)的4 μL存在或不存在下，將0.0125 mU JAK2與25 nM Ulight-JAK1(tyr1023)肽(Perkin Elmer，目錄號TRF0121)在激酶反應緩衝液(41.66 mM HEPES(pH 7.0)、0.016%曲通X-100(Triton X-100)、12.5 mM MgCl₂ 、3.33 mM DTT、7.5 μM ATP)中於白色384 Luminotrac 200板(Greiner，目錄號781075)中一起培育，總體積為20 μL。在室溫下60分鐘之後，藉由每孔添加20 μL偵測混合物(1×偵測緩衝液(Perkin Elmer，目錄號CR97-100C)、0.5 nM銪-抗磷酸酪胺酸(PT66)(Perkin Elmer，目錄號AD0068)、10 mM EDTA)停止反應。使用Envision(Perkin Elmer)進行讀取，其中在320 nm下激發且量測615 nm下之發射。藉由自媒劑存在下得到之相對螢光單位(RFU)減去陽性對照抑制劑(10 μM星形孢菌素)存在下得到之RFU計算激酶活性。測試化合物抑制此活性之能力如下測定：

抑制百分比=1-((測試化合物存在下測定之樣品RFU-陽性對照抑制劑存在下測定之樣品RFU)/(媒劑存在下測定之RFU-陽性對照抑制劑存在下測定之樣品RFU))*100。

製備化合物之劑量稀釋系列，使得能夠在JAK2檢定中測試劑量反應作用及計算化合物之IC₅₀ 。通常測試20 μM濃度，繼而1/5連續稀釋所得之8個點(20 μM-4 μM-800 nM-160 nM-32 nM-6.4 nM-1.28 nM-0.26 nM)濃度的各化合物，DMSO最終濃度為1%。當化合物系列之效能增加時，製備更高稀釋度稀釋液及/或降低最高濃度(例如5 μM、1 μM)。資料表示為檢定之平均IC₅₀ ±平均值之標準誤差。

實例1.4　JAK2 Ki測定檢定

為測定Ki，將不同量之抑制劑與酶混合，且隨ATP濃度變化跟蹤酶促反應。藉助於繪製Km相對於化合物濃度之雙倒數圖(萊恩威佛-伯克圖)測定Ki。該檢定中使用0.025 mU JAK2(Invitrogen，PV4210)。受質為Poly(Glu,Tyr)鈉鹽(4:1)，MW 20 000-50 000(Sigma，P0275)。在不同濃度之ATP及化合物存在下，在10 mM MOPS(pH 7.5)、0.5 mM EDTA、0.01% Brij-35、1 mM DTT、15 mM MgAc中進行反應，且藉由添加150 mM磷酸停止反應。藉由將樣品裝載於過濾板上(使用收集器，Perkin Elmer)且隨後洗滌進行併入受質polyGT中之磷酸酯的量測。向過濾板(Perkin Elmer)添加閃爍液之後，在Topcount閃爍計數器中量測polyGT中併入之³³ P。

當在此檢定中測試化合物1時，測得之Ki值為126 nM。

或者，為測定Ki，將不同量之抑制劑與酶混合，且隨ATP濃度變化跟蹤酶促反應。藉助於繪製Km相對於化合物濃度之雙倒數圖(萊恩威佛-伯克圖)測定Ki。該檢定中使用0.0125 mU JAK2(Invitrogen，PV4210)。受質為50 nM Ulight-JAK-1(Tyr1023)肽(Perkin Elmer，TRF0121)。在不同濃度之ATP及化合物存在下，在25 mM HEPES(pH 7.0)、0.01%曲通X-100、2 mM DTT、7.5 mM MgCl₂ 中進行反應。使用經Eu標記之抗磷酸酪胺酸抗體PT66(Perkin Elmer，AD0068)量測磷酸化受質。在envision(Perkin Elmer)上進行讀取，其中在320 nm下激發且在615 nm及665 nm下跟蹤發射。

當在此檢定中測試化合物1時，測得之Ki值為35 nM。

實例1.5　JAK3抑制檢定

重組人類JAK3催化域(胺基酸781-1124；目錄號PV3855)係購自Invitrogen。在含有測試化合物或媒劑(DMSO，最終濃度為1%)的5 μL存在或不存在下，將0.025 mU JAK3與2.5 μg polyGT受質(Sigma目錄號P0275)在激酶反應緩衝液(25 mM Tris(pH 7.5)、0.5 mM EGTA、0.5 mM Na₃ VO₄ 、5 mM b-甘油磷酸酯、0.01%曲通X-100、1 μM非放射性ATP、0.25 μCi³³ P-γ-ATP(GE Healthcare，目錄號AH9968)，最終濃度)中於聚丙烯96孔板(Greiner，V形底)中一起培育，總體積為25 μL。在30℃下105分鐘之後，藉由每孔添加25 μL 150 mM磷酸停止反應。使用細胞收集器(Perkin Elmer)將所有結束反應之激酶反應物轉移至經預洗滌(75 mM磷酸)之96孔過濾板(Perkin Elmer目錄號6005177)中。用每孔300 μL 75 mM磷酸溶液洗滌板6次，且密封板之底部。每孔添加40 μL Microscint-20，密封板之上部且使用Topcount(Perkin Elmer)進行讀取。藉由自媒劑存在下得到之每分鐘計數(cpm)減去陽性對照抑制劑(10 μM星形孢菌素)存在下得到之cpm計算激酶活性。測試化合物抑制此活性之能力如下測定：

抑制百分比=1-((測試化合物存在下測定之樣品cpm-陽性對照抑制劑存在下測定之樣品cpm)/(媒劑存在下測定之cpm-陽性對照抑制劑存在下測定之樣品cpm))*100%。

製備化合物之劑量稀釋系列，使得能夠在JAK3檢定中測試劑量反應作用及計算化合物之IC₅₀ 。通常測試20 μM濃度，繼而1/3連續稀釋所得之8個點(20 μM-6.67 μM-2.22 μM-740 nM-247 nM-82 nM-27 nM-9 nM)濃度的各化合物，DMSO最終濃度為1%。當化合物系列之效能增加時，製備更高稀釋度稀釋液及/或降低最高濃度(例如5 μM、1 μM)。資料表示為檢定之平均IC₅₀ ±平均值之標準誤差。

實例1.6　JAK3 Ki測定檢定

為測定Ki，將不同量之抑制劑與酶混合，且隨ATP濃度變化跟蹤酶促反應。藉助於繪製Km相對於化合物濃度之雙倒數圖(萊恩威佛-伯克圖)測定Ki。使用最終濃度為10 ng/ml之JAK3(Carna Biosciences，09CBS-0625B)。受質為Poly(Glu,Tyr)鈉鹽(4:1)，MW 20 000-50 000(Sigma，P0275)。在不同濃度之ATP及化合物存在下，在25 mM Tris(pH 7.5)、0.01%曲通X-100、0.5 mM EGTA、2.5 mM DTT、0.5 mM Na₃ VO₄ 、5 mM b-甘油磷酸酯、10 mM MgCl₂ 中進行反應，且藉由添加150 mM磷酸停止反應。藉由將樣品裝載於過濾板上(使用收集器，Perkin Elmer)且隨後洗滌進行併入受質polyGT中之磷酸酯的量測。向過濾板(Perkin Elmer)添加閃爍液之後，在Topcount閃爍計數器中量測polyGT中併入之³³ P。

當在此檢定中測試化合物1時，測得之Ki值為188 nM。

實例1.7　TYK2抑制檢定

重組人類TYK2催化域(胺基酸871-1187；目錄號08-147)係購自Carna biosciences。在含有測試化合物或媒劑(DMSO，最終濃度為1%)的5 μL存在或不存在下，將5 ng TYK2與12.5 μg polyGT受質(Sigma目錄號P0275)在激酶反應緩衝液(25 mM Hepes(pH 7.5)、100 mM NaCl、0.2 mM Na₃ VO₄ 、0.1% NP-40、0.1 μM非放射性ATP、0.125 μCi³³ P-γ-ATP(GE Healthcare，目錄號AH9968)，最終濃度)中於聚丙烯96孔板(Greiner，V形底)中一起培育，總體積為25 μL。在30℃下90分鐘之後，藉由每孔添加25 μL 150 mM磷酸停止反應。使用細胞收集器(Perkin Elmer)將所有結束反應之激酶反應物轉移至經預洗滌(75 mM磷酸)之96孔過濾板(Perkin Elmer目錄號6005177)中。用每孔300 μL 75 mM磷酸溶液洗滌板6次，且密封板之底部。每孔添加40 μL Microscint-20，密封板之上部且使用Topcount(Perkin Elmer)進行讀取。藉由自媒劑存在下得到之每分鐘計數(cpm)減去陽性對照抑制劑(10 μM星形孢菌素)存在下得到之cpm計算激酶活性。測試化合物抑制此活性之能力如下測定：

製備化合物之劑量稀釋系列，使得能夠在TYK2檢定中測試劑量反應作用及計算各化合物之IC₅₀ 。通常測試20 μM濃度，繼而1/3連續稀釋所得之8個點(20 μM-6.67 μM-2.22 μM-740 nM-247 nM-82 nM-27 nM-9 nM)濃度的化合物，DMSO最終濃度為1%。當化合物系列之效能增加時，製備更高稀釋度稀釋液及/或降低最高濃度(例如5 μM、1 μM)。

實例2.細胞檢定：

實例2.1　JAK-STAT信號傳導檢定：

將海拉細胞(HeLa cell)維持在含有10%熱滅活之胎牛血清、100 U/mL青黴素(penicillin)及100 μg/mL鏈黴素(streptomycin)的杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)中。使用70%匯合度之海拉細胞進行轉染。在96孔板格式中，每孔用40 ng pSTAT1(2)-螢光素酶報導基因(Panomics)、8 ng作為內部對照報導基因之LacZ報導基因及52 ng pBSK，使用0.32 μL Jet-PEI(Polyplus)作為轉染劑短暫轉染87 μL細胞培養基中之20,000個細胞。在37℃、10% CO₂ 下隔夜培育之後，移除轉染培養基。添加75 μL DMEM+1.5%熱滅活胎牛血清。添加15 μL 6.7×濃度之化合物歷時60分鐘，且隨後添加10 μL 33 ng/mL最終濃度的人類OSM(Peprotech)。

雙重複測試以20 μM起始，繼而1/3連續稀釋所得之總共8個劑量(20 μM-6.6 μM-2.2 μM-740 nM-250 nM-82 nM-27 nM-9 nM)的所有化合物，DMSO最終濃度為0.2%。

在37℃、10% CO₂ 下隔夜培育之後，於每孔100 μL溶解緩衝液(PBS、0.9 mM CaCl₂ 、0.5 mM MgCl₂ 、5%海藻糖、0.025% Tergitol NP9、0.15% BSA)中溶解細胞。

藉由添加180 μL β-Gal溶液(30 μl ONPG(4 mg/mL)+150μL β-半乳糖苷酶緩衝液(0.06 M Na₂ HPO₄ 、0.04 M NaH₂ PO₄ 、1 mM MgCl₂ ))，使用40 μL細胞溶解物讀取β-半乳糖苷酶活性歷時20分鐘。藉由添加50 μL Na₂ CO₃ (1 M)停止反應。在405 nm下讀取吸光度。

如製造商(Perkin Elmer)所述，使用40 μL細胞溶解物加上40 μL在Envision(Perkin Elmer)上量測螢光素酶活性。

使用10 μM泛JAK抑制劑作為陽性對照組(100%抑制)。使用0.5% DMSO作為陰性對照組(0%抑制)。使用陽性及陰性對照組計算z'及『抑制百分比』(PIN)值。

抑制百分比=1-((媒劑存在下測定之螢光-測試化合物存在下測定之樣品螢光)/(媒劑存在下測定之螢光-未經觸發測定之樣品螢光))*100%。

繪製劑量反應中測試之化合物的PIN值，且推導出EC₅₀ 值。

實例2.2　OSM/IL-1β信號傳導檢定

OSM及IL-1β顯示協同上調人類軟骨肉瘤細胞株SW1353中之MMP13含量。將細胞以每孔15,000個細胞接種於96孔板中120 μL體積之含有10%(v/v)FBS及1%青黴素/鏈黴素(InVitrogen)的DMEM(Invitrogen)中，在37℃、5% CO₂ 下培育。將細胞與15 μL化合物一起於含2% DMSO之M199培養基中預培育1小時，隨後用15 μL OSM及IL-1β觸發以達到25 ng/mL OSM及1 ng/mL IL-1β，且在觸發之後48小時在條件培養基中量測MMP13含量。使用抗體捕捉活性檢定量測MMP13活性。為此目的，在4℃下用35 μL 1.5 μg/mL抗人類MMP13抗體(R&D Systems，MAB511)溶液塗佈384孔板(NUNC，460518，MaxiSorb，黑色)歷時24小時。用PBS+0.05%吐溫(Tween)洗滌各孔2次之後，在4℃下用100 μL含5%脫脂乳粉(Santa Cruz，sc-2325，Blotto)之PBS阻斷剩餘結合位點歷時24小時。隨後，用PBS+0.05%吐溫洗滌孔兩次，且添加35 μL含MMP13之培養物上清液於100倍稀釋阻斷緩衝液中的1/10稀釋液，且在室溫下培育4小時。隨後用PBS+0.05%吐溫洗滌孔兩次，繼而藉由添加35 μL 1.5 mM乙酸4-胺基苯基汞(APMA)(Sigma，A9563)溶液活化MMP13，且在37℃下培育1小時。再用PBS+0.05%吐溫洗滌孔，且添加35 μL MMP13受質(Biomol，P-126，OmniMMP螢光受質)。在37℃下培育24小時之後，在Perkin Elmer Wallac EnVision 2102多標記讀取器中量測已轉化受質之螢光(激發波長：320 nm，發射波長：405 nm)。

抑制百分比=1-((媒劑存在下測定之螢光-測試化合物存在下測定之樣品螢光)/(媒劑存在下測定之螢光-未經觸發測定之樣品螢光))*100%。資料表示為檢定之平均EC₅₀ ±平均值之標準誤差。

實例2.3　PBL增殖檢定

用IL-2刺激人類周邊血淋巴細胞(PBL)，且使用BrdU併入檢定量測增殖。首先用PHA刺激PBL 72小時以誘導IL-2受體，禁食24小時以使細胞增殖停止，繼而用IL-2再刺激72小時(包括24小時之BrdU標記)。將細胞與測試化合物一起預培育1小時，隨後添加IL-2。在含有10%(v/v)FBS之RPMI 1640中培養細胞。

實例2.4　全血檢定(WBA)

2.4.1　IFNα刺激方案

為預測測試化合物在活體內對JAK1特異性信號傳導路徑之抑制強於對JAK2特異性信號傳導路徑之抑制的選擇性，使用人類全血產生生理學相關活體外模型。在WBA檢定中，用化合物離體處理自提供知情同意書之人類自願者抽取之血液(1小時)，且隨後用干擾素α(IFNα，JAK1依賴性路徑)刺激30分鐘或用顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF，JAK2依賴性路徑)刺激2小時。

2.4.1.1　磷酸化STAT1檢定

對於IFNα刺激，使用pSTAT1 ELISA檢定量測白血球萃取物中因IFNα所致之信號轉導因子及轉錄活化因子1(pSTAT1)磷酸化的增加。干擾素α(IFNα)觸發後的信號轉導因子及轉錄活化因子1(STAT1)之磷酸化為JAK1介導之事件。開發用於量測細胞萃取物中磷酸化STAT1含量的磷酸化STAT1檢定以評估化合物抑制JAK1特異性信號傳導路徑的能力。

用化合物離體處理自提供知情同意書之人類自願者抽取之人類全血(1小時)且隨後用IFNα刺激30分鐘。使用磷酸化STAT1 ELISA量測白血球萃取物中因IFNα所致之STAT1磷酸化增加。

ACK溶解緩衝液由0.15 M NH₄ Cl、10 mM KHCO₃ 、0.1 mM EDTA組成。緩衝液之pH值為7.2-7.4。

用水10倍稀釋10×細胞溶解緩衝液濃縮物(來自Cell Signaling之PathScan磷酸化STAT1(Tyr701)夾心ELISA套組之一部分)。在使用之前將蛋白酶抑制劑添加至緩衝液中。

將20 μg IFNα溶解於40 μL H₂ O中以得到500 μg/mL儲備溶液。在-20℃下儲存儲備溶液。

在DMSO中製備化合物之3倍稀釋系列(最高濃度：10 mM)。隨後，進一步在培養基中稀釋化合物(稀釋倍數取決於所需最終化合物濃度)。

2.4.1.1.1　與化合物一起培育血液及用IFNα刺激

人類血液收集於肝素化管中。將血液分成392 μL之等份試樣。之後，將4 μL化合物稀釋液添加至各等份試樣中且在37℃下培育血液樣品1小時。用RPMI培養基以1000倍稀釋IFNα儲備溶液，得到500 ng/mL工作溶液。將4 μL 500 ng/mL工作溶液添加至血液樣品中(IFNα之最終濃度：5 ng/ml)。在37℃下培育樣品30分鐘。

2.4.1.1.2　製備細胞萃取物

在刺激階段結束時，將7.6 mL ACK緩衝液添加至血液樣品中以溶解紅血球。藉由倒置管五次混合樣品，且於冰上培育反應物5分鐘。在此培育期間RBC之溶解應顯而易見。藉由在4℃下以300 g離心7分鐘使細胞集結，且移除上清液。將10 mL 1×PBS添加至各管中且再懸浮細胞集結塊。再在4℃下以300 g離心樣品7分鐘。移除上清液且將集結塊再懸浮於500 μL 1×PBS中。隨後，將細胞懸浮液轉移至潔淨的1.5 mL微量離心管中。藉由在4℃下以700 g離心5分鐘使細胞集結。移除上清液且將集結塊溶解於150 μL細胞溶解緩衝液中。於冰上培育樣品15分鐘。之後，將樣品儲存在-80℃下直至進一步處理。

2.4.1.1.3　藉由ELISA量測STAT1磷酸化

使用來自Cell Signaling之Pathscan磷酸化STAT1(Tyr701)夾心ELISA套組(目錄號#7234)測定磷酸化STAT1含量。

將細胞萃取物於冰上解凍。在4℃下以16,000 g離心各管5分鐘，且收集清澈溶解物。同時，將套組之微孔條平衡至室溫，且藉由用H₂ O稀釋20×洗滌緩衝液來製備洗滌緩衝液。用樣品稀釋劑2倍稀釋樣品，且將100 μL添加至微孔條中。將該等條在4℃下培育隔夜。

次日，用洗滌緩衝液洗滌各孔3次。將100 μL偵測抗體添加至各孔中。在37℃下培育該等條1小時。隨後，再用洗滌緩衝液洗滌各孔3次。將100 μL連接有HRP之二級抗體添加至各孔中，且在37℃下培育樣品。30分鐘之後，再洗滌各孔3次且將100 μL TMB受質添加至所有孔中。當樣品變成藍色時，添加100 μL停止溶液以停止反應。在450 nm下量測吸光度。

2.4.1.2　IL-8 ELISA

對於GM-CSF刺激，使用IL-8 ELISA檢定量測血漿中介白素-8(1L-8)含量之增加。顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)誘導之介白素8(IL-8)表現為JAK2介導之事件。開發可用於量測血漿樣品中IL-8含量的IL-8 ELISA以評估化合物抑制JAK2特異性信號傳導路徑的能力。

用化合物離體處理自提供知情同意書之人類自願者抽取之人類全血(1小時)且隨後用GM-CSF刺激2小時。使用IL-8 ELISA檢定量測血漿中之IL-8含量增加。

將10 μg GM-CSF溶解於100 μL H₂ O中以得到100 μg/mL儲備溶液。在-20℃下儲存儲備溶液。

在DMSO中製備測試化合物之3倍稀釋系列(最高濃度：10 mM)。隨後，進一步在培養基中稀釋化合物(稀釋倍數取決於所需最終化合物濃度)。

2.4.1.2.1　與化合物一起培育血液及用GM-CSF刺激

人類血液收集於肝素化管中。將血液分成245 μL之等份試樣。之後，將2.5 μL測試化合物稀釋液添加至各等份試樣中且在37℃下培育血液樣品1小時。用RPMI培養基以100倍稀釋GM-CSF儲備溶液，得到1 μg/mL工作溶液。將2.5 μL 1 μg/mL工作溶液添加至血液樣品中(GM-CSF之最終濃度：10 ng/mL)。在37℃下培育樣品2小時。

2.4.1.2.2　製備血漿樣品

在4℃下以1,000 g離心樣品15分鐘。收集100 μL血漿且儲存在-80℃下直至進一步使用。

2.4.1.2.3　藉由ELISA量測IL-8含量

使用來自R＆D Systems之人類IL-8化學發光免疫檢定套組(目錄號Q8000B)測定IL-8含量。

藉由用H₂ O稀釋10×洗滌緩衝液來製備洗滌緩衝液。在使用之前15分鐘至4小時藉由將1份Glo試劑1添加至2份Glo試劑B中來製備工作glo試劑。

將100 μL檢定稀釋劑RD1-86添加至各孔中。之後，添加50 μL樣品(血漿)。在室溫下以500 rpm培育ELISA板2小時。用洗滌緩衝液洗滌所有孔4次，且將200 μL IL-8結合物添加至各孔中。在室溫下培育3小時之後，用洗滌緩衝液洗滌各孔4次，且將100 μL工作glo試劑添加至各孔中。在室溫下培育ELISA板5分鐘(避光)。量測發光(讀取時間為每孔0.5秒)。

2.4.1.3　結果

化合物1抑制INFα誘導之pSTAT1含量增加的pIC₅₀ 為6.32±0.07(SEM)，而抑制GM-CSF誘導之IL-8增加的pIC₅₀ 為4.87±0.13(SEM)(使用6位獻血者得到之結果)。此表明化合物1對JAK1路徑之選擇性為對JAK2路徑之28倍高。因此，在細胞環境中，顯然化合物1對JAK1展現強於對JAK2之選擇性。相較於已知結構相關化合物或其他已知JAK抑制劑，化合物1似乎對JAK1展現高於對JAK2之選擇性。

2.4.1.4　資料整理處理及結果

為進一步改進結果，將細胞萃取物中對IFNα誘導磷酸化STAT1之抑制或血漿中對GM-CSF誘導IL-8之抑制相對於化合物濃度繪圖，且使用Graphpad軟體推導出IC₅₀ 值。若R² 大於0.8且希爾斜率(hill slope)小於3，則保留資料，且僅保留兩個檢定均得到有效資料之供體。

舉例而言，當進行此額外資料分析方案時，所測得之化合物1抑制INFα誘導之pSTAT1含量增加的pIC₅₀ 為6.21±0.09(SEM)，而抑制GM-CSF誘導之IL-8增加的pIC₅₀ 為4.97±0.14(SEM)(使用6位獻血者得到之結果)。此證實化合物1對JAK1路徑之選擇性為對JAK2路徑之17.6倍高。因此，在細胞環境中，顯然化合物1對JAK1展現強於對JAK2之選擇性。相較於已知結構相關化合物或其他已知JAK抑制劑，化合物1似乎對JAK1展現高於對JAK2之選擇性。

2.4.2　IL-6刺激方案

亦離體使用人類全血進行流動式細胞測量分析以確定化合物對JAK1強於對JAK2之選擇性。因此，自提供知情同意書之人類自願者獲取血液。隨後在37℃下在輕柔震盪下平衡血液30分鐘，且接著在Eppendorf管中等分。添加不同濃度之化合物，且在37℃下在輕柔震盪下培育30分鐘，且隨後在37℃下在輕柔震盪下用介白素6(IL-6)(對於JAK1依賴性路徑刺激)或GM-CSF(對於JAK2依賴性路徑刺激)刺激20分鐘。隨後使用FACS分析評估磷酸化STAT1及磷酸化STAT5。

2.4.2.1　磷酸化STAT1檢定

對於白血球中IL-6刺激之信號轉導因子及轉錄活化因子1(pSTAT1)磷酸化增加，用化合物離體處理自提供知情同意書之人類自願者抽取之人類全血30分鐘且隨後用IL-6刺激20分鐘。使用抗磷酸化STAT1抗體藉由FACS量測淋巴細胞中因IL-6所致之STAT1磷酸化增加。

用蒸餾水5倍稀釋5×溶解/固定緩衝液(BD PhosFlow，目錄號558049)，且在37℃下預加熱。丟棄剩餘經稀釋溶解/固定緩衝液。

將10 μg rhIL-6(R&D Systems，目錄號206-IL)溶解於1 ml含0.1% BSA之PBS中以得到10 μg/ml儲備溶液。將儲備溶液等份儲存在-80℃下。

在DMSO中製備化合物之3倍稀釋系列(10 mM儲備溶液)。對照處理樣品接受DMSO而非化合物。所有樣品均在1%最終濃度之DMSO存在下培育。

2.4.2.1.1　與化合物一起培育血液及用IL-6剌激

人類血液收集於肝素化管中。將血液分成148.5 μl之等份試樣。隨後，將1.5 μl化合物稀釋液添加至各等份試樣中，且在37℃下在輕柔震盪下培育血液樣品30分鐘。將IL-6儲備溶液(1.5 μl)添加至血液樣品中(最終濃度為10 ng/ml)，且在37℃下在輕柔震盪下培育樣品20分鐘。

2.4.2.1.2　白血球製備及CD4標記

在刺激階段結束時，將3 ml 1×預加熱溶解/固定緩衝液立即添加至血液樣品中，簡單渦旋且在37℃下於水浴中培育15分鐘以溶解紅血球且固定白血球，隨後在-80℃下冷凍直至進一步使用。

對於以下步驟，在37℃下將管解凍約20分鐘，且在4℃下以400 g離心5分鐘。用3 ml冷1×PBS洗滌細胞集結塊，且離心之後將細胞集結塊再懸浮於100 μl含3% BSA之PBS中。添加結合FITC之抗CD4抗體或對照結合FITC之同型抗體，且在室溫下於黑暗中培育20分鐘。

2.4.2.1.3　細胞滲透及用抗磷酸化STAT1抗體標記

用1×PBS洗滌細胞之後，將細胞集結塊再懸浮於100 μl冰冷1×PBS中，且添加900 μl冰冷100%甲醇。隨後在4℃下培育細胞30分鐘以進行滲透。

隨後用1×含3% BSA之PBS洗滌經滲透細胞，且最後再懸浮於80 μl 1×含3%BSA之PBX中。

添加20 μL PE小鼠抗STAT1(pY701)或PE小鼠IgG2aκ同型對照抗體(BD Biosciences，目錄號分別為612564及559319)且混合，隨後在4℃下於黑暗中培育30分鐘。

隨後用1×PBS洗滌細胞一次，且在FACSCanto II流式細胞儀(BD Biosciences)上分析。

2.4.2.1.4　在FACSCanto II上進行螢光分析

計數總共50,000個事件，且在對CD4+細胞設門之後量測淋巴細胞門中之磷酸化STAT1陽性細胞。使用FACSDiva軟體分析資料，且相應地基於CD4+細胞上磷酸化STAT1之陽性細胞百分比來計算IL-6刺激的抑制百分比。

2.4.2.2　磷酸化STAT5檢定

對於白血球中GM-CSF刺激之信號轉導因子及轉錄活化因子5(pSTAT5)磷酸化增加，用化合物離體處理自提供知情同意書之人類自願者抽取之人類全血30分鐘且隨後用GM-CSF刺激20分鐘。使用抗磷酸化STAT5抗體藉由FACS量測單核細胞中因GM-CSF所致之STAT5磷酸化增加。

用蒸餾水以5倍稀釋5×溶解/固定緩衝液(BD PhosFlow，目錄號558049)，且在37℃下預加熱。丟棄剩餘經稀釋溶解/固定緩衝液。

將10 μg rhGM-CSF(AbCys S.A.，目錄號P300-03)溶解於100 μl含0.1% BSA之PBS中以得到100 μg/ml儲備溶液。將儲備溶液等份儲存於-80℃下。

在DMSO中製備化合物之3倍稀釋系列(10 mM儲備溶液)。對照處理樣品接受DMSO而無任何測試化合物。所有樣品均在1%最終濃度之DMSO存在下培育。

2.4.2.2.1　與化合物一起培育血液及用GM-CSF刺激

人類血液收集於肝素化管中。將血液分成148.5 μl之等份試樣。之後，將1.5 μl化合物稀釋液添加至各等份試樣中，且在37℃下在輕柔震盪下培育血液樣品30分鐘。將GM-CSF儲備溶液(1.5 μl)添加至血液樣品中(最終濃度為20 pg/ml)，且在37℃下在輕柔震盪下培育樣品20分鐘。

2.4.2.2.2　白血球製備及CD14標記

對於以下步驟，在37℃下將管解凍約20分鐘，且在4℃下以400 g離心5分鐘。用3 ml冷1×PBS洗滌細胞集結塊，且離心之後將細胞集結塊再懸浮於100 μl含3% BSA之PBS中。添加FITC小鼠抗CD14抗體(BD Biosciences，目錄號345784)或對照FITC小鼠IgG2bκ同型抗體(BD Biosciences，目錄號555057)，且在室溫下於黑暗中培育20分鐘。

2.4.2.2.3　細胞滲透及用抗磷酸化STAT5抗體標記

隨後用1×含3% BSA之PBS洗滌經滲透細胞，且最後再懸浮於80 μl 1×含3% BSA之PBX中。

添加20 μL PE小鼠抗STAT5(pY694)或PE小鼠IgG1κ同型對照抗體(BD Biosciences，目錄號分別為612567及554680)，且混合，隨後在4℃下於黑暗中培育30分鐘。

2.4.2.2.4　在FACSCanto II上進行螢光分析

計數總共50,000個事件，且在對CD14+細胞設門之後量測磷酸化STAT5陽性細胞。使用FACSDiva軟體分析資料，且相應地基於CD14+細胞上磷酸化STAT5之陽性細胞百分比來計算GM-CSF刺激之抑制百分比。

2.4.2.3　結果

當進行此方案時，對於本發明化合物測定由3位健康自願者之平均值得到的抑制百分比(PIN)。舉例而言，測試化合物1，且在對STAT1磷酸化之抑制中獲得之pIC₅₀ =6.61，且在對STAT5磷酸化之抑制中獲得之pIC₅₀ =5.37。

當比較化合物1對STAT1(JAK1依賴性路徑)及STAT5(JAK2依賴性路徑)之作用時，測得對JAK1之選擇性為對JAK2之17.6倍。

實例3. 活體內模型

實例3.1　CIA模型

3.1.1　材料

傅氏完全佐劑(Completed Freund's adjuvant，CFA)及傅氏不完全佐劑(incomplete Freund's adjuvant，IFA)係購自Difco。II型牛膠原蛋白(CII)、脂多醣(LPS)及恩博(Enbrel)分別獲自Chondrex(Isle d'Abeau,France)；Sigma(P4252，L'Isle d'Abeau,France)、Whyett(25 mg可注射注射器，France)、Acros Organics(Palo Alto,CA)。所用之所有其他試劑均為試劑級且所有溶劑均為分析級。

3.1.2　動物

黑色刺豚鼠(Agouti rat)(雄性，7-8週齡)係獲自Harlan實驗室(Maison-Alfort,France)。DBA/1J小鼠(雄性，7週齡)係獲自Centre d'Elevage et de Reproduction JANVIER(CERJ)(Laval，France)。大鼠及小鼠在12小時明/暗循環(0700-1900)下飼養。溫度維持在22℃，且隨意提供食物及水。

3.1.3　膠原蛋白誘發之關節炎(CIA)

在實驗前一日，用0.05 M乙酸製備CII溶液(2 mg/mL)且儲存在4℃下。臨免疫之前，藉由均質機將等體積之佐劑(IFA)及CII混合於冰水浴中之預冷卻玻璃瓶中。若未形成乳液，則可能需要額外的佐劑及延長之均質化。

小鼠：在第1日，在各小鼠之尾根部皮內注射0.1 mL乳液，在第21日進行第二次輔助劑皮內注射(1 mg/mL CII溶液，於0.1 mL CFA/生理食鹽水中)。此免疫方法修改自已公開方法(David D Brand Kary A Latham,及Edward F Rosloniec. Collagen-induced arthritis. Nature Methods 2(5): 1269-1275,2007)。

大鼠：在第1日，在各大鼠之尾根部皮內注射0.2 mL乳液，在第9日進行第二次輔助劑皮內注射(2 mg/mL CII溶液，於0.1 mL CFA/生理食鹽水中)。此免疫方法修改自已公開方法(Sims NA等人，(2004) Targeting osteoclasts with zoledronic acid prevents bone destruction in collagen-induced arthritis,Arthritis Rheum. 502338-2346；Jou等人，2005)。

3.1.4　研究設計

在大鼠或小鼠CIA模型中對測試化合物之治療作用進行測試。將動物隨機分成等組且各組含有10隻動物。在第1日對所有大鼠進行免疫，且在第9日進行加強免疫。在第1日對所有小鼠進行免疫，且在第21日進行加強免疫。治療性給藥自第16日持續至第30日。用媒劑(MC 0.5%)處理陰性對照組，且用恩博(10 mg/kg，每週3次，皮下)處理陽性對照組。通常測試3個劑量(例如3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg，經口)之相關化合物。

3.1.5　關節炎之臨床評估

根據Khachigian 2006、Lin等人，2007及Nishida等人，2004之方法對關節炎評分。用如下關節炎分值對4個爪各自之腫脹進行分級：0分-無症狀；1分-輕度，但一種類型關節(諸如踝或腕)明顯發紅且腫脹，或明顯發紅且腫脹侷限於個別指，與受影響指之數目無關；2分-兩種或兩種以上關節中度發紅且腫脹；3分-全部爪(包括指)重度發紅且腫脹；4分-肢體最大限度地發炎，涉及多個關節(每隻動物之最大累積臨床關節炎分值為16分)(Nishida等人，2004)。

為允許進行多個研究之綜合分析，將臨床分值如下校正：

臨床分值之AUC(AUC分值)： 對於各個別大鼠計算第1日至第14日之曲線下面積(AUC)。將各動物之AUC除以獲得該動物之資料的研究中對於媒劑得到之平均AUC，且乘以100(亦即AUC表示為每個研究之平均媒劑AUC之百分比)。

臨床分值自第1日至第14日增加(終點分值)： 將各動物之臨床分值差值除以獲得該動物之資料的研究中對於媒劑得到之平均臨床分值差值，且乘以100(亦即差值表示為每個研究之平均臨床分值差值之百分比)。

3.1.6　關節炎發作之後的體重變化(%)

臨床上，體重減輕與關節炎有關(Shelton等人，2005；Argiles等人，1998；Rall,2004；Walsmith等人，2004)。因此，關節炎發作之後的體重變化可用作評估大鼠模型中之治療作用的非特異性終點。關節炎發作之後的體重變化(%)如下計算：

3.1.7　拉森氏分值(Larsen' score)

由至少2位科學家推導出死亡後所有大鼠兩個後爪的拉森氏分值。計算該等分值之平均值以使每隻大鼠得到一個拉森氏分值。為允許進行拉森氏分值之研究間比較，將各大鼠之拉森氏分值除以在大鼠所屬之研究中對於媒劑得到之平均拉森氏分值且乘以100(亦即將拉森氏分值表示為每個研究之平均媒劑拉森氏分值之百分比)。計算且比較不同處理組之平均拉森氏分值。

3.1.8　放射學

拍攝各個別動物之後爪之X射線相片。分配各相片隨機盲式識別號(random blind identity number)，且由兩個獨立評分員用如下放射性拉森氏評分系統(Larsen's score system)對骨侵蝕之嚴重性進行分級：0-正常，具有完整的骨輪廓及正常關節間隙；1-略微異常，其中任一或兩個外部蹠骨展示輕微骨侵蝕；2-明顯初期異常，其中任何三至五個外部蹠骨展示骨侵蝕；3-中等破壞性異常，其中所有外部蹠骨以及任一或兩個內部蹠骨展示明顯骨侵蝕；4-重度破壞性異常，其中所有蹠骨展示明顯骨侵蝕，且至少一個內部蹠骨關節完全侵蝕，部分保留一些骨關節輪廓；5-毀傷性異常，無骨輪廓。此評分系統為自Salvemini等人，2001；Bush等人，2002；Sims等人，2004；Jou等人，2005之修改而來。

3.1.9　組織學

放射性分析之後，將小鼠後爪固定於10%經磷酸鹽緩衝之福馬林(formalin)(pH 7.4)中，用快速骨去鈣劑去鈣以供精細組織學(Laboratories eurobio)之用，且包埋於石蠟中。為確保廣泛評估關節炎關節，切割至少4個連續切片(厚度為5 μm)，且各切片系列之間為100 μm。用蘇木精及伊紅(H＆E)對切片進行染色。以雙盲方式進行滑液發炎及骨及軟骨損傷之組織學檢查。在各爪中，使用四分量表評估4個參數。該等參數為細胞浸潤、關節翳嚴重性、軟骨侵蝕及骨侵蝕。如下進行評分：1分-正常，2分-輕度，3分-中度，4分-明顯。將此4個分值一起求和，且表示為另一分值，亦即『RA總分』。為允許進行組織學讀數之研究間比較，將各大鼠之總組織學分值除以在大鼠所屬之研究中對於媒劑得到之平均總組織學分值且乘以100(亦即將總組織學分值表示為每個研究之平均媒劑總組織學分值之百分比)。計算且比較不同處理組之平均總組織學分值。

3.1.10　踵骨(跟骨)之微電腦斷層攝影法(μCT)分析

RA中觀察到之骨退化尤其發生於皮層骨處，且可藉由μCT分析揭示(Sims NA等人，2004;Oste L等人，ECTC Montreal 2007)。對踵骨進行掃描及3D體積重建(3D volume reconstruction)之後，以每個載片(以電腦輔助方式(in silico)垂直於骨縱向軸分離)中所存在的離散物體之數目的形式量測骨退化。骨退化愈多，則量測到的離散物體愈多。分析1000個沿踵骨均勻分佈(間隔約10.8 μm)之切片。

3.1.11　結果

在小鼠CIA研究中測試30 mg/kg之化合物1，且在大鼠CIA研究中測試30、10、3及1 mg/kg之化合物1。在大鼠CIA研究中進行之所有讀取中，化合物1均有效，其中一些讀數具有統計顯著性，特定言之，可見以下明顯改良：臨床分值之AUC(由10 mg/kg)、終點臨床分值(由1 mg/kg)、拉森氏分值(由30 mg/kg)及爪腫脹(由1 mg/kg)。

實例3.2　敗血性休克模型

注射脂多醣(LPS)誘導可溶性腫瘤壞死因子(TNF-α)快速釋放於外周中。使用此模型分析活體內TNF釋放之預期阻斷劑。

以預定劑量經口處理每組6隻BALB/cJ雌性小鼠(20 g)一次。30分鐘以後，腹膜內注射LPS(15 μg/kg：大腸桿菌血清型0111:B4)。九十分鐘以後，對小鼠實施安樂死且收集血液。使用市售ELISA套組測定循環TNFα含量。使用地塞米松(5 μg/kg)作為參考消炎化合物。以一或多次劑量(例如3 mg/kg及/或10 mg/kg及/或30 mg/kg，經口)測試所選化合物。

經口30 mg/kg之化合物1展現統計上顯著之TNF釋放減少(>50%)。

實例3.3　MAB模型

MAB模型允許快速評估治療劑對類RA發炎反應的調節(Kachigian LM. Nature Protocols(2006) 2512-2516: Collagen antibody-induced arthritis)。用針對膠原蛋白II之mAb的混合液靜脈內注射DBA/J小鼠。一日以後，開始化合物處理(媒劑：10%(v/v) HPβCD)。三日後，小鼠接受腹膜內LPS注射(每隻小鼠50 μg)，引起快速發炎發作。持續化合物處理直至mAb注射之後10日。藉由量測爪腫脹及記錄各爪之臨床分值指示發炎。提供四肢之累積臨床關節炎分值來展示發炎之嚴重性。使用0-4分之量表(其中4分為最嚴重發炎)將評分系統施用於各肢體。

0分　無症狀

1分　輕度，但一種類型關節(諸如踝或腕)明顯發紅且腫脹，或明顯發紅且腫脹侷限於個別指，與受影響指之數目無關

2分　兩種或兩種以上類型關節中度發紅且腫脹

3分　全部爪(包括指)嚴重發紅且腫脹

4分　肢體最大限度地發炎，涉及多個關節

實例3.4　腫瘤模型

Wernig等人，Cancer Cell 13,311,2008及Geron等人，Cancer Cell 13,321,2008描述驗證小分子對JAK2促成之骨髓增生性疾病之功效的活體內模型。

實例3.5　小鼠IBD模型

Wirtz等人，2007描述驗證小分子對IBD之功效的活體外及活體內模型。

實例3.6　小鼠哮喘模型

Nials等人，2008；Ip等人，2006；Pernis等人，2002；Kudlacz等人，2008描述驗證小分子對哮喘之功效的活體外及活體內模型。

實例4：毒性、DMPK及安全性模型

實例4.1　熱力學溶解度

在室溫下於玻璃小瓶中製備測試化合物於0.2 M磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)或0.1 M檸檬酸鹽緩衝液(pH 3.0)中之1 mg/mL溶液。

在室溫下，使樣品在旋轉器驅動之STR 4(Stuart Scientific,Bibby)中以3.0之速度旋轉24小時。

24小時之後，將800 μL樣品轉移至eppendorf管中，且以14000 rpm離心5分鐘。隨後將200 μL樣品上清液轉移至MultiscreenR溶解性板(Millipore，MSSLBPC50)中，且藉助於真空歧管過濾(10-12" Hg)上清液至潔淨Greiner聚丙烯V形底96孔板(目錄號651201)中。將5 μL濾液稀釋至95 μL(F20)用於於含有標準曲線之板(Greiner，目錄號651201)中培育之相同緩衝液中。

用在DMSO中以兩倍稀釋之10 mM DMSO儲備溶液起始(5000 μM)，且隨後進一步在DMSO中稀釋至19.5 μM而用DMSO新鮮製備化合物之標準曲線。隨後將來自5000 μM之3 μL稀釋系列轉移至97 μL乙腈-緩衝液混合物(50/50)中。最終濃度範圍為2.5 μM至150 μM。

用密封墊(MA96RD-04S，www.kinesis.co.uk)密封板，且在室溫下在最佳化條件下使用Quanoptimize於LCMS(ZQ 1525，Waters)上量測樣品，以測定分子之適當質量。

於LCMS上使用1 mL/min之流速分析樣品。溶劑A為15 mM氨且溶劑B為乙腈。樣品在正離子噴霧下於XBridge C18 3.5 μM(2.1×30 mm)管柱(Waters)上操作。溶劑梯度之總操作時間為2分鐘且範圍為5% B至95% B。

藉助於Masslynx軟體套件分析峰面積，且將樣品之峰面積相對於標準曲線繪圖，以得到化合物之溶解度。

溶解度值以μM或μg/mL報導。

實例4.2　水溶解度

以於DMSO中之10 mM儲備液起始，在DMSO中製備化合物之連續稀釋液。將稀釋系列轉移至96 NUNC Maxisorb F形底板中(目錄號442404)，且在室溫下添加0.2 M磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)或0.1 M檸檬酸鹽緩衝液(pH 3.0)。

在5個等稀釋度步驟中最終濃度範圍為200 μM至2.5 μM。最終DMSO濃度不超過2%。將200 μM芘添加至各96孔板之角點中，且充當校準顯微鏡之Z軸的參考點。

將檢定板密封，且在230 rpm震盪下在37℃下培育1小時。隨後在白光顯微鏡下掃描各板，得到每個濃度所得沈澱物之個別圖片。分析沈澱物，且轉化為繪製於曲線圖上之編號。化合物呈現完全溶解之第一濃度為報導濃度，然而真實濃度處於此濃度與一更高稀釋度步驟之濃度之間。

溶解度值以μg/mL報導。

實例4.3　血漿蛋白結合(平衡透析)

在DMSO中以5倍稀釋化合物於DMSO中之10 mM儲備溶液。用新鮮解凍之人類、大鼠、小鼠或犬血漿(BioReclamation INC)進一步稀釋此溶液，其中最終濃度為10 μM，且最終DMSO濃度為0.5%(5.5 μl，於1094.5 μl血漿中，於PP-Masterblock 96孔(Greiner，目錄：780285)中)。

製備具有插入件(insert)之Pierce Red Device板(ThermoScientific，目錄號89809)，在緩衝液腔室中填充750 μL PBS且在血漿腔室中添加500 μL血漿。在230 rpm震盪下在37℃下培育板4小時。培育之後，將兩個腔室中120 μL轉移至96孔圓底PP深孔板(Nunc，目錄號278743)中之360 μL乙腈中，且用鋁箔蓋密封。將樣品混合且置於冰上30分鐘。隨後在4℃下以1200 rcf離心此板30分鐘，且將上清液轉移至96孔v形底PP板(Greiner，651201)中以供於LCMS上分析。

用www.kinesis.co.uk之密封墊(MA96RD-04S)密封板，且在室溫下在最佳化條件下使用Quanoptimize於LCMS(ZQ 1525，Waters)上量測樣品，以測定分子之適當質量。

緩衝液腔室及血漿腔室中化合物之峰面積視為100%化合物。由此等結果推導出結合於血漿之百分比且以結合於血漿之百分比的形式報導給LIMS。

藉由顯微鏡檢查最終測試濃度之化合物於PBS中的溶解度以指示是否觀察到沈澱。

實例4.4　QT延長之傾向

在hERG膜片鉗檢定中評估QT延長之可能性。

4.4.1　習知全細胞膜片鉗

使用由Pulse v8.77軟體(HEKA)控制之EPC10放大器進行全細胞膜片鉗記錄。串聯電阻通常小於10 MΩ，且補償超過60%，記錄不減去漏電。電極由GC150TF吸管玻璃(Harvard)製成。

外部電解液含有：135 mM NaCl、5 mM KCl、1.8 mM CaCl₂ 、5 mM葡萄糖、10 mM HEPES，pH 7.4。

內部膜片吸管溶液含有：100 mM葡糖酸鉀、20 mM KCl、1 mM CaCl₂ 、1 mM MgCl₂ 、5 mM Na₂ ATP、2 mM麩胱甘肽、11 mM EGTA、10 mM HEPES，pH 7.2。

使用Biologic MEV-9/EVH-9快速灌注系統灌注藥物。

所有記錄均在穩定表現hERG通道之HEK293細胞上進行。將細胞培養於使用2個鉑桿(Goodfellow)錨定於記錄腔室中之12 mm圓形蓋玻片(German glass，Bellco)上。使用達+40 mV之活化脈衝1000毫秒，繼而達-50 mV之尾電流脈衝2000毫秒誘導hERG電流，保持電位為-80 mV。每20秒施加脈衝，且所有實驗均在室溫下進行。

4.4.2　資料分析

計算各測試化合物之IC₅₀ 及IC₂₀ 值。計算如由獲自大鼠CIA模型之結果所測定在相關治療劑量下獲得之測試化合物之IC₂₀ 與未結合C_max 濃度之間的倍數差。

對於濃度反應曲線，在達-50 mV之電壓步驟期間量測峰尾電流幅度。使用如下方程進行濃度反應資料之曲線擬合：

y=a+[(b-a)/(1+10^((logc-x)d)]

其中a為最小反應，b為最大反應且d為希爾斜率，此方程可用於計算IC₅₀ (其中y=50且c為IC₅₀ 值)與IC₂₀ (其中y=20且c為IC₂₀ 值)。使用(Software Inc.)軟體進行所有曲線擬合。100倍或100倍以上之差值表明QT延長之可能性低。

實例4.5　微粒體穩定性

用182 mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)於96深孔板(Greiner，目錄號780285)中以1000倍稀釋化合物於DMSO中之10 mM儲備溶液，且在37℃下預培育。

將40 μL去離子水添加至聚丙烯Matrix 2D條碼標記之儲存管(barcode labelled storage tube，Thermo Scientific)之孔中且在37℃下預培育。

於182 mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)中製備葡萄糖-6-磷酸去氫酶(G6PDH)之工作儲備溶液，且在使用之前置於冰上。於去離子水中製備含有MgCl₂ 、葡萄糖-6-磷酸及NADP+之輔因子，且在使用之前置於冰上。

製備含有有關物種(人類、小鼠、大鼠、犬)之肝微粒體(Xenotech)、前述G6PDH及輔因子之最終工作溶液，且在室溫下培育此混合物不超過20分鐘。

將30 μL預熱化合物稀釋液添加至Matrix管中之40 μL預熱水中，且添加30 μL微粒體混合物。最終反應物濃度為3 μM化合物，1 mg微粒體，0.4 U/mL GDPDH，3.3 mM MgCl₂ ，3.3 mM葡萄糖-6-磷酸及1.3 mM NADP+。

為量測時間零時化合物之剩餘百分比，將MeOH或ACN(1:1)添加至孔中，接著添加微粒體混合物。用Matrix Sepra sealsTM(Matrix，目錄號4464)密封板，且震盪數秒確保所有組分完全混合。

在37℃下以300 rpm培育未停止反應之樣品，且培育1小時之後，用MeOH或ACN(1:1)停止反應。

停止反應之後，混合樣品且置於冰上30分鐘以使蛋白質沈澱。隨後在4℃下以1200 rcf離心各板30分鐘，且將上清液轉移至96孔v形底PP板(Greiner，651201)中以供於LCMS上分析。

用www.kinesis.co.uk之密封墊(MA96RD-04S)密封此等板，且在室溫下在最佳化條件下使用Quanoptimize於LCMS(ZQ 1525，Waters)上量測樣品，以測定母體分子之適當質量。

於LCMS上使用1 mL/min之流速分析樣品。溶劑A為15 mM氨，且溶劑B視所用停止溶液而定為甲醇或乙腈。樣品在正離子噴霧下於XBridge C18 3.5 μM(2.1×30 mm)管柱(Waters)上操作。溶劑梯度之總操作時間為2分鐘且範圍為5% B至95% B。

時間0時母體化合物之峰面積視為100%剩餘。培育1小時之後的剩餘百分比自時間0計算，且以剩餘百分比之形式計算。藉由顯微鏡檢查最終測試濃度之化合物於緩衝液中之溶解度，且報導結果。

關於微粒體穩定性之資料表示為60分鐘後剩餘化合物佔總量的百分比。

實例4.6　Caco2滲透性

如下所述進行雙向Caco-2檢定。Caco-2細胞係獲自歐洲細胞培養物保藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC，目錄號86010202)，且在於24孔Transwell板(Fisher TKT-545-020B)中進行細胞培養21日之後使用。

將每孔2×10⁵ 個細胞接種於由DMEM+GlutaMAXI+1% NEAA+10% FBS(FetalClone II)+1% Pen/Strep組成之塗鋪培養基中。每2-3日更換培養基。

於含有25 mM HEPES(pH 7.4)之亨克氏平衡鹽溶液(Hanks' Balanced Salt Solution)中製備測試及參考化合物(普萘洛爾(propranolol)及若丹明123(rhodamine 123)或長春鹼，均購自Sigma)，且以10 μM之濃度添加至Transwell板總成之頂端(125 μL)或底端(600 μL)腔室中，其中最終DMSO濃度為0.25%。

將50 μM螢光黃(Lucifer Yellow，Sigma)添加至所有孔中之供體緩衝液中以藉由監測螢光黃滲透來評估細胞層完整性。因為螢光黃(LY)不能自由滲透親脂性障壁，故高度LY輸送表明細胞層之完整性不良。

在迴轉式震盪器中以150 rpm震盪下，在37℃下培育1小時之後，自頂端(A)腔室及底端(B)腔室取出70 μL等份試樣，且添加至96孔板中含有分析內標(0.5 μM卡馬西平(carbamazepine))之100 μL 50:50乙腈：水溶液中。

在含有來自底端及頂端之150 μL液體的潔淨96孔板中，用Spectramax Gemini XS(Ex 426 nm且Em 538 nm)量測螢光黃。

藉由高效液體層析/質譜(LC-MS/MS)量測樣品中化合物之濃度。

由以下關係計算表觀滲透率(P_app )值：

P_app =[化合物]_受體最終 ×V_受體 /([化合物]_供體初始 ×V_供體 )/T_inc ×V_供體 /表面積×60×10^-6 cm/s

V=腔室體積

T_inc =培育時間

表面積=0.33 cm² 。

使用比率P_app B>A/P_app A>B計算流出率(自頂端細胞表面主動流出之指標)。

使用以下檢定接受準則：

普萘洛爾：P_app (A>B)值20(×10^-6 cm/s)

若丹明123或長春鹼：P_app (A>B)值<5(×10^-6 cm/s)，其中流出率5。

螢光黃滲透性：100 nm/s

實例4.7　藥物動力學研究

4.7.1　齧齒動物中之藥物動力學研究

在PEG200/生理食鹽水或PEG400/DMSO/生理食鹽水混合物中調配化合物以用於靜脈內途徑，且在0.5%甲基纖維素或10%-30%羥丙基-β-環糊精(pH 3或pH 7.4)中調配以用於經口途徑。以單一食道管飼法經口給與5-10 mg/kg的測試化合物，且以快速注射形式經由臀靜脈靜脈內給與1 mg/kg的測試化合物。各組由3隻大鼠組成。在以下時間點經由頸靜脈使用插有套管之大鼠或用肝素鋰作為抗血凝劑自後眼眶竇收集血液樣品：0.05至8小時(靜脈內途徑)，及0.25至6小時或24小時(經口途徑)。以5000 rpm離心全血樣品10分鐘，且將所得血漿樣品儲存在-20℃下以待分析。

4.7.2　犬中之藥物動力學研究

在PEG200/生理食鹽水混合物中調配化合物以用於靜脈內途徑且在用檸檬酸酸化至pH 2-3之0.5%甲基纖維素或PEG400/羥丙基-β-環糊精混合物中調配以用於經口途徑。經由管飼法經口給與5-30 mg/kg之測試化合物，且以快速注射形式或經由頭靜脈10分鐘輸注靜脈內給與1 mg/kg測試化合物。各組由3隻雄性或雌性米格魯犬(Beagle dog)組成。經由頸靜脈用肝素鋰作為抗血凝劑在給藥後0.083小時至24小時之間的時間點收集血液樣品。以5000 rpm離心全血樣品10分鐘，且將所得血漿樣品儲存在-20℃下以待分析。

4.7.3　血漿中化合物含量的定量

藉由LC-MS/MS法測定各測試化合物之血漿濃度，其中質譜儀以正電噴霧模式操作。

4.7.4　測定藥物動力學參數

使用(，United States)計算藥物動力學參數。

實例4.8　7日大鼠毒性研究

藉由管飼法，以100毫克/公斤/日、300毫克/公斤/日及500毫克/公斤/日之每日劑量，5毫升/公斤/日之恆定劑量體積，用測試化合物在斯普拉格-多利雄性大鼠中進行7日口服毒性研究以評估其潛在毒性及毒物動力學。

於含30%(v/v)HPβCD之純水中調配測試化合物。各組包括5隻主要雄性大鼠以及3隻衛星動物以供進行毒物動力學研究。以相同頻率、劑量體積且藉由相同投藥途徑向第四組僅提供含30%(v/v)HPβCD之水，且充當媒劑對照組。

該研究之目標在於確定不產生可鑑別不良事件的最低劑量(無可觀察到之不良作用之量-NOAEL)。

實例4.9　肝細胞穩定性

McGinnity等人，Drug Metabolism and Disposition2008 ,32,11 ,1247描述評估肝細胞中之代謝清除的模型。

熟習此項技術者應瞭解，以上說明本質上為例示性及說明性的，且如所示意欲說明本發明及其較佳實施例。技術人員應能經由常規實驗認識到，在不背離本發明之精神的情況下可進行的明顯修改及變化。因此，預期本發明不受以上說明限定，而受以下申請專利範圍及其等效物限定。

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本說明書中引用之所有公開案(包括(但不限於)專利及專利申請案)以引入的方式併入本文中，如同各個別公開案經特別且個別指示如充分闡述以引用的方式併入本文中一般。

熟習此項技術者可由以上說明進行本發明之組合物及方法的各種修改及改變。屬於隨附申請專利範圍之範疇內的所有該等修改預期均包括於本文中。

應瞭解，諸如各種化合物之不同細胞滲透能力的因素可造成活體外生物化學及細胞檢定中化合物活性之間的差異。

本申請案中所提供及闡述之本發明化合物的至少一些化學名稱可藉由使用市售化學命名軟體程序自動產生，且尚未獨立驗證。執行該功能之代表性程式包括Open Eye Software,Inc.出售之Lexichem命名工具及MDL,Inc.出售之Autonom軟體工具。在所示化學名稱與所述結構不同的情況下，以所述結構為準。

本文所示之化學結構係使用或/DRAW製得。本文結構中之碳、氧或氮原子上出現的任何開放價數表示存在氫原子。若結構中存在對掌性中心，但未展示該對掌性中心之特定立體化學，則該結構涵蓋與對掌性結構有關之兩種對映異構體。

Claims

一種式I化合物，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該化合物係呈游離鹼形式。
一種醫藥組合物，其包含醫藥學上可接受之載劑及醫藥學上有效量的如請求項1或2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項3之醫藥組合物，其係用於經口投與。
如請求項3之醫藥組合物，其係用於注射投與。
如請求項3之醫藥組合物，其係用於局部投與。
如請求項3至6中任一項之醫藥組合物，其包含另一治療劑，其中該另一治療劑係用於治療發炎病狀、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥、涉及軟骨轉換不良之疾病、先天性軟骨畸形、卡斯特門氏症(Castleman's disease)、多發性骨髓瘤、牛皮癬、卡波西氏肉瘤或腎小球膜增生性腎小球腎炎之藥劑。
如請求項1或2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用作藥物。
如請求項1或2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療發炎病狀、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥、涉及軟骨轉換不良之疾病、先天性軟骨畸形、卡斯特門氏症(Castleman's disease)、多發性骨髓瘤、牛皮癬、卡波西氏肉瘤或腎小球膜增生性腎小球腎炎。
一種如請求項1或2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製備用以治療發炎病狀、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥、涉及軟骨轉換不良之疾病、先天性軟骨畸形、卡斯特門氏症(Castleman's disease)、多發性骨髓瘤、牛皮癬、卡波西氏肉瘤或腎小球膜增生性腎小球腎炎的藥物。
如請求項9之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療發炎病狀。
如請求項11之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該發炎病狀為類風濕性關節炎。
如請求項9之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該發炎病狀為全身性紅斑狼瘡。
如請求項9之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療牛皮癬。
如請求項8之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該如請求項1或2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽係與另一治療劑組合使用，其中該另一治療劑係用於治療發炎病狀、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥、涉及軟骨轉換不良之疾病、先天性軟骨畸形、卡斯特門氏症(Castleman's disease)、多發性骨髓瘤、牛皮癬、卡波西氏肉瘤或腎小球膜增生性腎小球腎炎之藥劑。
如請求項15之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該化合物或其醫藥學上可接受之鹽係用於與治療全身性紅斑狼瘡之另一治療劑共投與。
如請求項15之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該化合物或其醫藥學上可接受之鹽係用於與治療牛皮癬之另一治療劑共投與。
如請求項15之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該化合物或其醫藥學上可接受之鹽係用於與治療類風濕性關節炎之另一治療劑共投與。