TWI468515B

TWI468515B - 單股環狀ｒｎａ及其製造方法

Info

Publication number: TWI468515B
Application number: TW97117329A
Authority: TW
Inventors: Hiroshi Abe; Yoshihiro Ito; Naoko Abe; Hidekazu Toyobuku
Original assignee: Riken; Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 2007-05-09
Filing date: 2008-05-09
Publication date: 2015-01-11
Also published as: BRPI0811440A2; KR20100024407A; US20180073020A1; US20100137407A1; HK1135140A1; EP2143792A1; EP2143792A4; EP2143792B1; CN101679962A; PT2143792E; WO2008140126A1; NZ581251A; CY1115283T1; RU2009145502A; DK2143792T3; IL201975A; SI2143792T1; RU2523596C2; CA2685994A1; AU2008250075A1

Description

單股環狀RNA及其製造方法

本發明係關於一種單股環狀RNA，其製造方法以及使用單股環狀RNA之醫藥組合物。

目前為止之RNA干擾法，大致可劃分為使用化學合成之雙股RNA之方法、以及使用質體載體之方法。後者之使用質體載體之RNA干擾技術，通常作為生物技術而使用，主要用於基礎生物學實驗。然而，將RNA干擾技術應用於醫藥品開發時，使用質體載體之方法對人體的安全性造成問題，因此較理想的是前者之使用化學合成之雙股RNA的方法。

然而，化學合成之雙股RNA存在如下問題：在生物體內不穩定，即，由於細胞內之酶(核酸酶)作用而易於分解。因此，為了提高細胞內的雙股RNA之穩定性，而開發出導入有非天然核酸之RNA股，從而穩定性得到提高，但出現生物活性下降之問題。進而，非天然核酸所產生之毒性亦未知，因此難以應用於醫藥品。

RNA干擾法中所使用之雙股RNA之形態有如下：具有平滑末端或突出末端之雙股RNA，具有雙股RNA末端的一端成環狀之髮夾結構之RNA(專利文獻1)，具有約19個鹼基對與2個環，且具有任意化學修飾聚核苷酸之環狀核酸(專利文獻2)等。但，該環狀核酸，於RNA干擾效應方面未經試驗。

又，揭示有RNA-DNA嵌合體之啞鈴型核酸(專利文獻3)，該核酸並非用於RNA干擾，而是於細胞內啞鈴型核酸之RNA部分藉由酶而被切割，從而阻礙反義DNA部分結合於細胞內之mRNA上。專利文獻3中揭示：由於核酸具有啞鈴型結構，故對細胞內的核酸分解酶之耐性高，並於核糖核酸酶H發揮作用之前穩定地存在於細胞內，藉由核糖核酸酶H之作用而切除互補RNA部分，首次，含有反義DNA部分之單股寡核苷酸游離於細胞內，因此一般認為單位投予量之反義效果會提高。

又，關於啞鈴型結構之環狀核酸之合成方法，例如揭示如下：將寡核苷酸合成為線狀，形成莖部分與髮夾環部分，而獲得目標環狀啞鈴型寡核苷酸之1個部位(上述髮夾環部分之相對側的末端)未被結合之鏈裂的啞鈴型寡核苷酸，其5'末端藉由連接酶而接合，藉此而製備環狀啞鈴型環狀核酸(專利文獻3)。

專利文獻1 日本專利特表2003-502012號公報

專利文獻2 日本專利特開2006-271387號公報

專利文獻3 日本專利特開平11-137260號公報

本發明之目的在於提供一種單股環狀RNA以及其製造方法。

本發明者等人發現，藉由分別合成於兩端具有不形成互補股之鹼基序列之有義股與反義股，使連接酶同時作用於兩端之鹼基，而可意外獲得高產率之單股環狀RNA；並且發現，所獲得之單股環狀RNA持續地、緩釋地發揮RNA干擾作用；從而完成本發明。

即，本發明包含以下之發明。

(1)一種具有持續性或緩釋性RNA干擾作用之單股環狀RNA，其特徵在於：含有有義股序列、與該有義股序列互補之反義股序列、於該有義股與該反義股之間結合二者之相同或不同的2個環序列，且該有義股與該反義股配對而形成莖。

(2)如(1)中所揭示之單股環狀RNA，其中將對照細胞中之標靶RNA之表現設為1時，導入至真核細胞24小時後之標靶RNA之表現顯示為0.4以下。

(3)如(1)或(2)中所揭示之單股環狀RNA，其係於人類血清中經過8小時之時、保持70%以上。

(4)一種如(1)~(3)中任一項所揭示之單股環狀RNA之製造方法，其包括：分別合成在5'末端以及3'末端具有不形成互補股之鹼基序列之有義股以及反義股，有義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之5'末端的鹼基、與反義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之3'末端的鹼基，以及有義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之3'末端的鹼基、與反義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之5'末端的鹼基，藉由連接酶同時連接，此時，有義股於5'末端所具有的不形成互補股之鹼基序列、與反義股於3'末端所具有的不形成互補股之鹼基序列相互結合而形成環，有義股於3'末端所具有的不形成互補股之鹼基序列、與反義股於5'末端所具有的不形成互補股之鹼基序列相互結合而形成環，以及有義股與反義股配對而形成莖。

(5)如(4)中所揭示之製造方法，其中進而包括：將有義股所具有的不形成互補股之鹼基序列、以及反義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之5'末端進行磷酸化。

(6)如(4)或(5)中所揭示之製造方法，其中上述環之序列相互相同或不同。

(7)如(4)至(6)中任一項所揭示之製造方法，其中上述環之長度為2~20個鹼基。

(8)如(4)至(7)中任一項所揭示之製造方法，其中上述莖之長度為19~31個鹼基。

(9)一種於體外抑制編碼該蛋白質之基因的表現之方法，其包括：將如(1)~(3)中任一項所揭示之單股環狀RNA導入至來自於人類之細胞後，使標靶RNA失去功能而持續地阻礙其轉譯為蛋白質。

(10)一種抑制編碼該蛋白質之基因的表現之方法，其包括：將如(1)~(3)中任一項所揭示之單股環狀RNA導入至非人類動物、植物或該等之細胞後，使標靶RNA失去功能而持續地阻礙其轉譯為蛋白質。

(11)一種醫藥組合物，其含有如(1)~(3)中任一項所揭示之單股環狀RNA作為有效成分。

本說明書中，單股環狀RNA亦稱為啞鈴型RNA。所謂啞鈴型RNA，係指有義股與反義股互補配對而形成莖，於莖之兩側由不形成互補股之鹼基序列形成環，單股環狀RNA之整體形狀成為啞鈴狀。

本說明書包含作為本申請案之優先權基礎的日本國專利申請案2007-125045號之說明書及/或圖式上所記載之內容。

本發明之單股環狀RNA包含：與標靶RNA之鹼基序列或者其一部分同源之有義股序列、以及與該有義股序列互補且可配對之反義股序列，及於有義股與反義股之間不形成互補股之環序列。

有義股與反義股配對而形成莖。莖之長度並無特別限定，根據標靶RNA之種類或結構決定長度即可，例如含有19~31個鹼基對，較好的是21~25個鹼基對，更好的是22~24個鹼基對，特別好的是23個鹼基對。

不形成互補股之鹼基序列，位於有義股與反義股各自之5'末端與3'末端上，有義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之5'末端的鹼基、與反義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之3'末端的鹼基連結而形成環，有義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之3'末端的鹼基、與反義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之5'末端的鹼基連結而形成環。環之長度較好的是含有2~20個鹼基，更好的是含有6~12個鹼基。因此，整個單股環狀RNA較好的是由42~102個鹼基形成。

若將有義股之5'末端之不形成互補股之鹼基序列設為 A，將反義股之3'末端之不形成互補股之鹼基序列設為B，將有義股之3'末端之不形成互補股之鹼基序列設為C，將反義股之5'末端之不形成互補股之鹼基序列設為D，則例如環之長度為20個鹼基時，A具有1~19個鹼基之長度，B具有19~1個鹼基之長度，C具有19~1個鹼基之長度，D具有1~19個鹼基之長度，A之5'末端之鹼基與B之3'末端之鹼基連結而形成20個鹼基之環，C之3'末端之鹼基與D之5'末端之鹼基連結而形成20個鹼基之環。

較好的是，不形成互補股之序列於A與B之間、C與D之間，長度相差例如1個鹼基，2個鹼基或3個鹼基，或者長度相同。因此，例如環之長度為8個鹼基時，較好的是A之長度為3~5個鹼基，B之長度為5~3個鹼基，C之長度為5~3個鹼基，D之長度為3~5個鹼基。環之長度為9個鹼基時，較好的是A之長度為3~6個鹼基，B之長度為6~3個鹼基，C之長度為6~3個鹼基，D之長度為3~6個鹼基。環之長度為10個鹼基時，較好的是A之長度為4~6個鹼基，B之長度為6~4個鹼基，C之長度為6~4個鹼基，D之長度為4~6鹼基。

再者，由A、B所形成之環與由C、D所形成之環的鹼基序列既可相同，亦可不同。

本發明之單股環狀RNA可用於RNA干擾法。

所謂RNA干擾，亦稱為RNA interference(RNAi)，係具有與標靶RNA互補之序列的小RNA分子與標靶RNA結合，並將其分解或抑制轉譯的現象。

啞鈴型RNA之反義股，具有與成為標靶之RNA(例如 mRNA或其前驅物RNA)互補之序列。又，不形成互補股之鹼基序列並無特別限定，例如可列舉：UUCAAGAGA、或UGUGCUGUC(M.Miyagishi等人，Oligonucleotides 2003,13：1-7)等。

進而，啞鈴型RNA之環可進行化學修飾，例如若藉由分子量約為2000~5000之聚乙二醇修飾，則可提昇啞鈴型RNA於生物體內之穩定性。因於細胞內藉由Dicer酶等酶而切割並去除啞鈴型RNA之環，故莖作為siRNA或miRNA而發揮RNA干擾作用時，可認為聚乙二醇幾乎不產生影響。

至於本發明之啞鈴型RNA，較好的是將對照細胞(未導入啞鈴型RNA)中之標靶RNA之表現設為1時，導入有該啞鈴型RNA之細胞中的細胞導入24小時後之標靶RNA之表現顯示為0.4以下。本發明中，細胞為真核細胞，較好的是動物細胞以及植物細胞。

至於標靶RNA之表現，例如使報告基因(螢光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、綠色螢光蛋白(green fluorescence protein，GFP)等)於細胞內轉形，將報告基因之mRNA作為標靶RNA，而該標靶RNA之表現在多大程度上受到啞鈴型RNA的阻礙，可藉由測定來源於報告基因之蛋白質的發色及螢光來確認。

進而，本發明之啞鈴型RNA具有如下特徵：於人類血清中經過8小時之時70%以上未被分解而得以保持。例如可於人類血清中培養啞鈴型RNA，藉由電泳等測定分子量來確認其是否經時分解。

至於本發明之啞鈴型單股環狀RNA之製造方法，包括：分別合成於5'末端以及3'末端具有不形成互補股之鹼基序列的有義股以及反義股，有義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之5'末端的鹼基、與反義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之3'末端的鹼基，以及有義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之3'末端的鹼基、與反義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之5'末端的鹼基，藉由連接酶同時連結。

為了可抑制成為標靶之基因，而根據標靶基因之鹼基序列設計有義股以及反義股。至於設計，係可製作多個有義股以及反義股並分別確認抑制效率，例如可利用根據siRNA設計用演算法等之設計(參照文獻：J.A.Jaeger等人，Methods in Enzymology(1989)183：281-306；D.H.Mathews等人，J.Mot.Biol.(1999)288：911-940)。設計時，較理想的是不用抑制具有與標靶基因類似之序列的、標靶基因以外的基因之表現(脫靶(off target)效應)。有義股以及反義股並無特別限定，設計之長度例如為19~31個鹼基，較好的是21~25個鹼基，更好的是22~24個鹼基，特別好的是23個鹼基。

標靶基因並無特別限定，例如可列舉：白血病之abl/bcr基因，老年性黃斑部病變之VEGF基因，肝炎之HCV基因。

其後將形成環之序列，例如上述序列UUCAAGAGA於任意部位切割成2組，而獲得不形成互補股之鹼基序列(該序列為9個鹼基，切割成2組時，較好的是如上所述，長度相差1~3個鹼基之範圍)，並設計成將一組連結於反義股之3'末端，將另一組連結於有義股之5'末端的序列，以相同之方式，設計成將一組連結於有義股之3'末端，將另一組連結於反義股之5'末端的序列。分別分開合成所設計之該等2個序列之單股核酸。此時，較好的是使用化學性磷酸化試劑對5'末端進行磷酸化。再者，較好的是將形成環時之長度設計成例如2~20個鹼基，較好的是6~12個鹼基。

核酸合成方法有如下各種方法：體外轉錄合成方法，使用質體、病毒載體之方法，藉由PCR盒之方法等，並無特別限定，就純度之高低，能否大量合成，於體內之使用安全性之高低，能否化學修飾等方面而言，較好的是化學合成方法。化學合成方法有膦酸氫法，亞磷醯胺法等，並無特別限定，可使用市售之自動核酸合成機。

位於有義股以及反義股之兩端的不形成互補股之鹼基序列之末端，藉由連接酶(例如T4 RNA連接酶，T4 DNA連接酶等)連結，同時形成2個環。至於反應條件，例如於含有聚乙二醇(PEG)，牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)等之緩衝液中於低溫下培養20小時即可。所合成之啞鈴型單股環狀RNA，可用通常之方法進行回收．純化(例如高效液相層析法，PAGE法等)。

進而，可藉由聚乙二醇(PEG)等對單股環狀RNA進行化學修飾，較好的是對環部分進行化學修飾。為了結合，而改變PEG之兩末端，並導入例如甲醯基、N-羥基琥珀醯亞胺酯基等與鹼基之胺基具有反應性之官能基。

以下，就使用由上述方法製造的啞鈴型RNA之RNA干擾法進行說明。

根據本發明，可將本發明之單股環狀RNA導入至細胞，使標靶RNA失去功能而持續阻礙其轉譯為蛋白質，上述細胞可使用人類細胞或非人類細胞。

於體外進行RNA干擾法時，藉由例如電穿孔法，顯微注射法，脂轉染法，磷酸鈣法等將啞鈴型RNA導入至細胞。

於體內進行RNA干擾法時，首先對含有啞鈴型RNA之試料進行透析、調節pH值等，而調整成適合於生物體。將試料導入至動物或植物之方法並無特別限定，例如可列舉：局部投予，靜脈內投予，使用基因槍之方法等，應用於人類時，就安全性方面而言，較好的是不使用微生物等之方法。

導入至細胞內之啞鈴型RNA，於細胞內藉由Dicer酶而被切割並於細胞內產生具有RNA干擾作用之RNA雙股(siRNA)(圖1)。siRNA之末端可為平滑末端或突出末端。siRNA變成單股，形成RNA-核酸酶複合體(RNA誘導沉默複合體(RISC))，識別並分解與siRNA互補之序列的標靶mRNA，從而抑制標靶基因之表現。

本發明之單股環狀RNA，可用於植物、動物(包括例如人類、寵物、家畜之哺乳動物等)、該等之細胞之任一種，特別期待於醫學、農學領域中得到廣泛應用。為了弄清例如植物或動物水平、植物或動物細胞水平下之特定基因或蛋白質的功能，弄清例如藉由剔除法所得基因之功能等各種目的，可使用本發明之單股環狀RNA。

又，本發明包括醫藥組合物，該醫藥組合物含有單股環狀RNA作為有效成分。

單股環狀RNA於醫藥組合物之調配量，可根據組合物之種類或目的進行調整，相對於組合物之總量，例如為1重量%、3重量%、5重量%、10重量%、20重量%、30重量%、40重量%、50重量%、60重量%、70重量%、80重量%、90重量%、100重量%，但並不限定於該等。

作為本發明之醫藥組合物之劑形，例如可列舉：液體製劑(溶液劑、懸浮劑、乳濁劑等)、固體製劑(使用時製備之冷凍乾燥劑等)、脂質體(較好的是陽離子性脂質體)封裝製劑等，又，作為投予途徑，較好的是非經口投予，例如包括：直接投予至患部之局所投予、經肺投予、經鼻投予等經黏膜投予以及靜脈內投予等。

本發明之醫藥組合物根據製劑化，劑形等，可含有賦形劑(生理鹽水、滅菌水、林葛爾氏溶液等)、緩衝劑、等張劑、穩定劑等。

又，本發明之醫藥組合物之投予量可根據病人之性別、體重、年齡、嚴重程度、症狀等進行變更。

本發明之醫藥組合物之應用並無特別限定，例如可列舉：治療癌症等疾病，例如抑制癌細胞中異常表現之基因或蛋白質之功能等。

以下，藉由實施例更具體說明本發明，但該等實施例並不限定本發明。

實施例1 啞鈴型RNA之製作

成為啞鈴型RNA之原料的5'磷酸化RNA，係完全基於亞磷醯胺法，藉由DNA合成機(GeneWorld H8-SE)合成。RNA亞磷醯胺係使用TBDMS保護體(Proligo公司)，5'磷酸化係使用化學磷酸化試劑(Chemical Phosphorylation Reagent)(Glen Research公司)。脫保護係根據常法進行PAGE純化。將所合成之RNA序列、序列編號1(有義股28 mer)，序列編號2(反義股28 mer)、序列編號3(56 mer)示於圖2。再者，圖2之RNA序列中，有下劃線之序列係形成啞鈴型RNA之環部的序列。

繼而，以2μM之RNA雙股(RNA double strand)、2.0 units/μl之T4 RNA連接酶、0.006%之BSA、25%之PEG6000、50mM之Tris-HCl(pH 7.5)、10mM之MgCl₂ 、10mM之DTT、1mM之ATP的組成，於反應規模25μl中進行酶反應。

具體而言，首先，將5'磷酸化RNA雙股溶解於含有100mM之Tris-HCl(pH 7.5)、20mM之MgCl₂ 、20mM之DTT、2mM之ATP的緩衝液(2x緩衝液)12.5μl中，以使5'磷酸化RNA雙股達到4μM，於65℃下加熱5分鐘後，慢慢冷卻至室溫。其後，添加BSA水溶液、PEG6000水溶液、T4 RNA連接酶(TAKARA BIO公司)，以使達到上述組成與反應規模，於11℃下培養20小時。藉由乙醇沈澱，使用PAGE解析所回收之RNA。

圖2之PAGE之各區帶的樣品如下所示。

區帶1：28個鹼基之有義股以及28個鹼基之反義股的混合物(標記物)

區帶2：57個鹼基之RNA(標記物)

區帶3：由28個鹼基之有義股與28個鹼基之反義股所形成之啞鈴型RNA

區帶4：由56個鹼基(單股)所形成之啞鈴型RNA

區帶5：藉由RNA連接酶處理之28個鹼基之有義股(參考)

區帶6：藉由RNA連接酶處理之28個鹼基之反義股(參考)

至於區帶4之啞鈴型RNA，係藉由如下方式製作：合成序列編號3之56個鹼基之單股並形成莖部分以及髮夾環部分，藉由T4連接酶結合最前之鹼基與最後之鹼基。

區帶3之圓圈所圈起之帶係藉由本發明之方法製作而成之啞鈴型RNA，其產率約為80%。區帶4之啞鈴型RNA之產率約為5%以下。

實施例2 啞鈴型RNA之莖之長度的研究

藉由上述DNA合成機合成序列編號4~13所示之RNA。序列編號4與5形成含有18個鹼基對之雙股RNA(siRNA-1)，序列編號6與7形成莖之長度為19個鹼基之啞鈴型RNA(Db- 19)，序列編號8與9形成莖之長度為23個鹼基之啞鈴型RNA(Db-23)，序列編號10與11形成莖之長度為27個鹼基之啞鈴型RNA(Db-27)，序列編號12與13形成莖之長度為31個鹼基之啞鈴型RNA(Db-31)(圖3)。

以2μM之RNA雙股、1.0 units/μl之T4 RNA連接酶、0.006%之BSA、25%之PEG6000、50mM之Tris-HCl(pH 7.5)、10mM之MgCl₂ 、10mM之DTT、1mM之ATP之組成，於反應規模1.5~2.5ml下進行酶反應。

具體而言，將5'磷酸化RNA雙股溶解於含有100mM之Tris-HCl(pH 7.5)、20mM之MgCl₂ 、20mM之DTT、2mM之ATP的緩衝液(2x緩衝液，最終反應液量的一半)中，於65℃下加熱5分鐘後，慢慢冷卻至室溫，以使5'磷酸化RNA雙股達到4μM。其後，添加BSA水溶液、PEG6000水溶液、T4 RNA連接酶(TAKARA BIO公司)，以使達到上述組成與反應規模，於11℃下培養20個小時。

藉由乙醇沈澱自反應液中回收RNA，使用PAGE離析環化體。藉由UV shadowing法使含有目標物之帶可視化並切出，粉碎成細小狀態後，以溶析緩衝液(0.2M之NaCl、1mM之EDTA(pH 8.0))4ml萃取3次。使用Sep-Pak濾筒進行脫鹽(以50%乙腈水6ml進行溶析)，並使用離心蒸發器進行濃縮，進而於醋酸銨存在下進行乙醇沈澱。測定UV光譜，從而將所獲得之目標物定量。

於上述各啞鈴型RNA 2μg中添加含有20mM之Tris-HCl(pH 8.5)、150mM之NaCl、2.5mM之MgCl₂ 之緩衝液中的 ColdShock-DICER酶(TAKARA BIO公司)2 units(反應液量20μl)，並於37℃下進行培養。於1、6、18個小時後對反應液取樣3μl，與120mM之EDTA水溶液2μl混合，並停止酶反應。藉由未變性PAGE(10% PAGE、1x TBE)對其進行解析(藉由1x SYBR Green I染色後，用BioRad Molecular Imager FX進行圖像化．定量)。

圖4係表示各啞鈴型RNA之PAGE。作為對照，亦同樣研究以啞鈴化反應前之雙股RNA為基質的切割反應。其結果，Db-19之切割反應於1小時後進行了約5%，從而可確認生成20個鹼基長度的雙股RNA。Db-19之20個鹼基前後之切割片段於6、18個小時後維持幾乎同樣程度的濃度。另一方面，對照之19個鹼基之直股(Liner)，於1小時後幾乎100%被切割而觀察到20個鹼基長度之RNA雙股。其後，隨著時間推移該產物之RNA雙股分解並消失。Db-23於1小時後約8%被切割而生成20個鹼基長度之雙股。隨著莖之長度變長，可確認Db-27，Db-31於1小時後之切割速度分別增速10%，20%。18個小時後，Db-19之原料剩下約75%，相對於此，Db-31之原料完全消失。由此可明確莖之長度較短，則其對酶較穩定。

實施例3 啞鈴型RNA之RNA干擾效應

藉由螢火蟲螢光素酶報告基因pGL3之表現阻礙實驗，來評價上述啞鈴型RNA(Db-19、Db-23、Db-27、Db-31)之RNA干擾效應。

於含有10% FCS之DMEM(GIBCO公司)培養基中，於37℃、5% CO₂ 之條件下，培養NIH 3T3細胞(RIKEN CELL BANK)，於96孔培養盤中，每孔分注100μl，以使達到1.6×10⁴ 細胞/孔。進而於37℃、5% CO₂ 之條件下培養39小時，於約70%融合之狀態下，使用轉染試劑之GeneSilencer(Genlantis公司)，並根據轉染試劑所附之操作說明，對2種質體載體(pGL3-對照，pRL-TK(內部標準用)，皆為Promega公司生產)與各種RNA進行轉染。轉染時之濃度條件如下所示。

0.2μg之pGL3-對照/0.02μg之pRL-TK/25nM之RNA(最終量100μl)

轉染後，於37℃、5% CO₂ 之條件下培養4小時，將含有20%血清之DMEM培養基100μl添加至各個孔中。於37℃下進一步培養20小時後，使用雙螢光素酶報告檢測系統(Dual-luciferase Reporter Assay System)(Promega公司)，根據所附之操作說明使細胞可溶化，而定量螢光素酶表現量(條件：試劑量為30μl，延遲時間為2秒鐘，讀取時間為10秒鐘。機器為Wallac ARVO SX 1420 Multilabel Counter)，作為比較，於僅為緩衝液(對照)之條件下同樣地進行評價。至於螢火蟲螢光素酶之發光強度，係根據作為內部標準之海腎螢光素酶之發光強度進行校正。其結果示於圖5。24小時後，啞鈴型RNA中，Db-23之活性最高，阻礙效果顯示至0.24。根據該結果，將最合適之雙股長度設為23個鹼基。

實施例4 RNA干擾效應之持續性

就Db-23與siRNA-1之RNA干擾效應之持續性進行比較。

於含有10%小牛血清(FCS、Invitro/Gibco公司)之杜貝可氏改良伊格爾氏培養基(Dulbeco's modified Eagle's medium,DMEM,Gibco公司)中，於5% CO₂ 加濕室中培養NIH 3T3細胞。於約70%融合之狀態之轉染的40個小時前，於96孔培養盤中，每孔分注細胞100μl，以使達到1.6×10⁴ 細胞/孔。使用GeneSilencer(基因治療系統(Gene Therapy Systems))，並根據NIH 3T3細胞之製造者所作的說明對報告質體與RNA進行轉染。與實施例3相比，於孔中使用100μl之用轉染試劑稀釋10倍而得的16ng/ml之pGL3-對照(Promega公司)、1.6ng/ml之pRL-TK(Promega公司)以及25nM之RNA。培養4小時後，添加100μl之含有20% FCS之DMEM。進而培養3日以上，隨時交換培養基。使用雙螢光素酶報告檢測系統(Promega公司)，並根據Wallac ARVO SX 1420 Multilabel Counter(Perkin-Elmer公司)所附之說明書，分別於24個小時、72個小時、120個小時後監測螢光素酶之表現(圖6)。將不含有RNA者作為對照。

至於螢光素酶之活性，於24小時後Db-23與siRNA-1顯示出幾乎相同之活性，於120小時後，Db-23顯示出更高的基因表現抑制作用。由此顯示啞鈴型RNA之緩釋作用及長期活性效果。

實施例5 人類血清中之啞鈴型RNA之穩定性

就Db-23與siRNA於人類血清中之穩定性進行比較。

於退火緩衝液(100mM之醋酸鉀、30mM之HEPES-KOH(pH 7.4)、2mM之醋酸鎂)中，添加退火前之dsRNA(siRNA-1、20μM)或啞鈴型RNA(Db-23、20μM)，將所得之溶液4μl與32μl之PBS、以及正常人類血清(Chemicon International公司)4μl混合，並於37℃下培養。於0.5、1、1.5、3、8以及20個小時後採集等分試樣5μl，用15%之未變性PAGE，並以SYBR Green I染色，使用Molecular Imager FX(BioRad公司)進行分析。

其結果，siRNA於3小時後分解至50%，相對於此，Db-23依然存在80%以上，即便於8小時後亦存在70%以上。因此，可期待Db-23於生物體內具有高穩定性。

產業上之可利用性

根據本發明，可高效率地製作穩定性，持續性以及緩釋性優異之啞鈴型合成RNA。

特別是用於RNA干擾法之啞鈴型RNA，藉由環化雙股 RNA而製作，並且兩端閉合成環狀，因此RNA末端消失，於細胞內，除Dicer酶等特異性酶以外，難以成為分解酶外切核酸酶(RNase)等的基質，因此難以藉由酶分解，從而於細胞內之穩定性飛躍增長。因此，無須使用用以提高穩定性之非天然型核酸。

又，啞鈴型RNA於細胞內可被生物體內Dicer酶等特異性識別，並切割兩側之環部而成為天然型RNA雙股(圖1)，因此可保持與雙股RNA相同之活性，又，與由先前之雙股RNA而產生之RNA干擾作用相比，亦具有持續性，緩釋性之效果。

本發明之啞鈴型RNA與先前之雙股RNA相比，於人類血清中較穩定，且可用作可應用於生物體之核酸分子。

本說明書所引用之全部的出版物、專利以及專利申請案直接作為參考列入本說明書。

圖1係模式性表示本發明之啞鈴型RNA。

圖2係表示RNA之結構以及各種RNA之電泳圖。

圖3係表示siRNA以及啞鈴型RNA之結構。

圖4係表示藉由Dicer酶切割之啞鈴型RNA以及雙股RNA(Liner)之電泳圖。

圖5係表示轉染24小時後之各啞鈴型RNA之干擾效應。

圖6係表示啞鈴型RNA之持續性RNA干擾效應。

圖7係表示啞鈴型RNA於人類血清中之穩定性。

<110> 獨立行政法人理化學研究所日商大塚製藥股份有限公日商林化成股份有限公司

<120> 單股環狀RNA及其製造方法

<130> PH-3542PCT

<140> 097117329

<141> 2008-05-09

<150> 2007-125045

<151> 2007-05-09

<160> 13

<170> PatentIn第3.4版

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Claims

一種具有持續性或緩釋性RNA干擾作用之單股環狀RNA，其特徵在於：含有有義股序列、與該有義股序列互補之反義股序列、於該有義股與該反義股之間結合二者之相同或不同的2個環序列，且該有義股與該反義股配對而形成莖；其中上述環序列係相同或不同，且其長度為6~9個鹼基。
如請求項1之單股環狀RNA，其中將對照細胞中之標靶RNA之表現設為1時，導入至真核細胞24小時後之標靶RNA之表現顯示為0.4以下。
如請求項1之單股環狀RNA，其係於人類血清中經過8小時之時，濃度含量保持70%以上。
如請求項2之單股環狀RNA，其係於人類血清中經過8小時之時，濃度含量保持70%以上。
如請求項1至4中任一項之單股環狀RNA，其中上述莖之長度為19~31個鹼基。
一種如請求項1至5中任一項之單股環狀RNA之製造方法，其包括：分別合成在5'末端以及3'末端具有不形成互補股之鹼基序列的有義股以及反義股，有義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之5'末端的鹼基、與反義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之3'末端的鹼基，以及有義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之3'末端的鹼基、與反義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之5'末端的鹼基，藉由連接酶同時連接；此時，有義股於5'末端所具有的不形成互補股之鹼基序列、與反義股於3'末端所具有的不形成互補股之鹼基序列相互結合而形成環，有義股於3'末端所具有的不形成互補股之鹼基序列、與反義股於5'末端所具有的不形成互補股之鹼基序列相互結合而形成環，以及有義股與反義股配對而形成莖。
如請求項6之製造方法，其係進而包括：將有義股所具有的不形成互補股之鹼基序列、以及反義股所具有的不形成互補股之鹼基序列之5'末端進行磷酸化。
如請求項6之製造方法，其中上述環之序列相互相同或不同。
如請求項7之製造方法，其中上述環之序列相互相同或不同。
如請求項6至9中任一項之製造方法，其中上述環之長度為6~9個鹼基。
如請求項6至9中任一項之製造方法，其中上述莖之長度為19~31個鹼基。
一種於體外抑制編碼該蛋白質之基因的表現之方法，其包括：將如請求項1~5中任一項之單股環狀RNA導入至來自於人類之細胞後，使標靶RNA失去功能而持續地阻礙其轉譯為蛋白質。
一種於體外抑制編碼該蛋白質之基因的表現之方法，其包括：將如請求項1~5中任一項之單股環狀RNA導入至非人類動物、植物或該等之細胞後，使標靶RNA失去功能而持續地阻礙其轉譯為蛋白質。
一種醫藥組合物，其含有如請求項1至5中任一項之單股環狀RNA作為有效成分。