JP2008278784A - １本鎖環状ｒｎａおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】生体への安全性、生体内安定性および徐放性の高い１本鎖環状ＲＮＡおよび該１本鎖環状ＲＮＡの収率の高い製造方法を提供すること。
【解決手段】センス鎖配列と、該センス鎖配列に相補的なアンチセンス鎖配列と、該センス鎖と該アンチセンス鎖の間に両鎖を結合する同じか又は異なる２つのループ配列とを含み、該センス鎖と該アンチセンス鎖が対合してステムを形成することを特徴とする、持続的又は徐放的ＲＮＡ干渉作用を有する１本鎖環状ＲＮＡ。
【選択図】図１

Description

本発明は、１本鎖環状ＲＮＡ、その製造方法および１本鎖環状ＲＮＡを用いた医薬組成物に関する。

これまでのＲＮＡ干渉法は、化学合成した２本鎖ＲＮＡを用いる方法とプラスミドベクターを用いる方法に大別される。後者のプラスミドベクターを用いたＲＮＡ干渉技術は、バイオテクノロジーとして汎用され、主に基礎生物学実験に用いられている。しかし、ＲＮＡ干渉技術を医薬品開発に応用する場合、プラスミドベクターを用いた方法は人体への安全性が問題となるため、前者の化学合成した２本鎖ＲＮＡを用いることが望ましいようである。

しかしながら、化学合成した２本鎖ＲＮＡは、生体内不安定性、すなわち、細胞内の酵素（ヌクレアーゼ）で分解されやすいという問題があった。そこで、細胞内での２本鎖ＲＮＡの安定性を高めるために非天然核酸を導入したＲＮＡ鎖が開発されたが、安定性は高くなるが、生物活性は下がってしまうことが問題となっていた。さらに、非天然核酸が与える毒性も未知であり、医薬品への応用は難しかった。

ＲＮＡ干渉法に用いる２本鎖ＲＮＡの形態は、平滑末端または突出末端を有する２本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ末端の一方がループ状になっているヘアピン構造を有するＲＮＡ（特許文献１）、約１９塩基対からなるステムと２個のループを有し、かつ化学修飾ポリヌクレオチドを有する環状ＲＮＡ（特許文献２）などがある。

また、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラのダンベル型核酸が開示されているが（特許文献３）、この核酸はＲＮＡ干渉に用いられるものではなく、細胞内でダンベル型核酸のＲＮＡ部分が酵素で切断されてアンチセンスＤＮＡ部分が細胞内のｍＲＮＡに結合して阻害するものである。特許文献３には、核酸がダンベル型構造を有することにより、細胞内での核酸分解酵素耐性が高く、リボヌクレアーゼＨが作用するまでは細胞内で安定に存在し、リボヌクレアーゼＨの作用により相補的ＲＮＡ部分が切除されて、はじめて、アンチセンスＤＮＡ部分を含む１本鎖オリゴヌクレオチドが細胞内に遊離されるので、投与量当たりのアンチセンス効果が高くなると考えられることが開示されている。

また、ダンベル型構造の環状核酸の合成方法については、例えば、線状にオリゴヌクレオチドを合成して、ステム部分とヘアピンループ部分を形成させ、目的とする環状ダンベル型オリゴヌクレオチドの１箇所（上記ヘアピンループ部分の反対側の末端）が結合されていないニックダンベル型オリゴヌクレオチドを得、その５’末端をリガーゼでライゲーションさせることにより、環状ダンベル型環状核酸を調製することが開示されている（特許文献３）。

特表２００３−５０２０１２号公報 特開２００６−２７１３８７号公報 特開平１１−１３７２６０号公報

本発明は、１本鎖環状ＲＮＡおよびその製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、相補鎖を形成しない塩基配列を両端に有するセンス鎖とアンチセンス鎖を別々に合成して、両端の塩基にリガーゼを同時に作用させることにより、意外にも、従来の方法に比べて高収率で１本鎖環状ＲＮＡを得られることを見出し、かつ、得られた１本鎖環状ＲＮＡがＲＮＡ干渉作用を持続的、徐放的に発揮することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）センス鎖配列と、該センス鎖配列に相補的なアンチセンス鎖配列と、該センス鎖と該アンチセンス鎖の間に両鎖を結合する同じか又は異なる２つのループ配列とを含み、該センス鎖と該アンチセンス鎖が対合してステムを形成することを特徴とする、持続的又は徐放的ＲＮＡ干渉作用を有する１本鎖環状ＲＮＡ。
（２）対照細胞における標的ＲＮＡの発現を１とした場合に、細胞に導入後２４時間の標的ＲＮＡの発現が０．４以下を示す、（１）に記載の１本鎖環状ＲＮＡ。
（３）ヒト血清中で８時間経過したときに７０％以上が保持されている、（１）または（２）に記載の１本鎖環状ＲＮＡ。
（４）相補鎖を形成しない塩基配列を５’末端および３’末端に有する、センス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ合成し、センス鎖が有する相補鎖を形成しない塩基配列の５’末端の塩基とアンチセンス鎖が有する相補鎖を形成しない塩基配列の３’末端の塩基、およびセンス鎖が有する相補鎖を形成しない塩基配列の３’末端の塩基とアンチセンス鎖が有する相補鎖を形成しない塩基配列の５’末端の塩基を、リガーゼで同時に連結することを含み、
その際、センス鎖が５’末端に有する相補鎖を形成しない塩基配列とアンチセンス鎖が３’末端に有する相補鎖を形成しない塩基配列が互いに結合してループを形成し、センス鎖が３’末端に有する相補鎖を形成しない塩基配列とアンチセンス鎖が５’末端に有する相補鎖を形成しない塩基配列が互いに結合してループを形成し、ならびにセンス鎖とアンチセンス鎖が対合してステムを形成する、（１）〜（３）のいずれかに記載の１本鎖環状ＲＮＡの製造方法。
（５）センス鎖が有する相補鎖を形成しない塩基配列とアンチセンス鎖が有する相補鎖を形成しない塩基配列の５’末端をリン酸化することを更に含む、（４）に記載の製造方法。
（６）前記ループの配列が互いに同じかまたは異なる、（４）または（５）に記載の製造方法。
（７）前記ループの長さが２〜２０塩基である、（４）〜（６）のいずれかに記載の製造方法。
（８）前記ステムの長さが１９〜３１塩基である、（４）〜（７）のいずれかに記載の製造方法。
（９）（１）〜（３）のいずれかに記載の１本鎖環状ＲＮＡをヒト由来の細胞に導入し、標的ＲＮＡを不能にしてタンパク質への翻訳を持続的に阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現をｉｎ ｖｉｔｒｏで抑制する方法。
（１０）（１）〜（３）のいずれかに記載の１本鎖環状ＲＮＡを非ヒト動物、植物又はそれの細胞に導入し、標的ＲＮＡを不能にしてタンパク質への翻訳を持続的に阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する方法。
（１１）（１）〜（３）のいずれかに記載の１本鎖環状ＲＮＡを有効成分として含む、医薬組成物。

本明細書において、１本鎖環状ＲＮＡは、ダンベル型ＲＮＡともいう。ダンベル型ＲＮＡとは、センス鎖とアンチセンス鎖が相補的に対合してステムを形成し、ステムの両側に相補鎖を形成しない塩基配列によりループが形成され、１本鎖環状ＲＮＡの全体の形状としてダンベル状になっているものをいう。

本発明により、安定性、持続性および徐放性に優れたダンベル型合成ＲＮＡを効率よく作製することができる。

特に、ＲＮＡ干渉法に用いるダンベル型ＲＮＡは、２本のＲＮＡ鎖を環化することにより作製され、両端がループ状に閉じているために、ＲＮＡ末端がなくなり、細胞内において、ダイサーなどの特異的酵素以外は、分解酵素エキソヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）などの基質となりにくいので、酵素により分解されにくく、細胞内での安定性が飛躍的に増す。そのため、安定性を高めるために非天然型核酸を用いる必要がない。

また、ダンベル型ＲＮＡは、細胞内で生体内酵素ダイサーなどに特異的に認識されて、両側のループ部が切断されて天然型ＲＮＡ２本鎖になるため（図１）、２本鎖ＲＮＡと同等の活性を持ち得、また、従来の２本鎖ＲＮＡによるＲＮＡ干渉作用よりも持続的、徐放的な効果がある。

更に、本発明のダンベル型ＲＮＡは、従来の２本鎖ＲＮＡよりもヒト血清中で安定である。

本発明の１本鎖環状ＲＮＡは、標的ＲＮＡの塩基配列又はその一部に相同なセンス鎖配列および該センス鎖配列に相補的でかつ対合可能なアンチセンス鎖配列と、それらの鎖の間に相補鎖を形成しないループ配列を含む。

センス鎖とアンチセンス鎖は、対合してステムを形成する。ステムの長さは特に限定されず、標的ＲＮＡの種類や構造などに応じて長さを決定すればよいが、例えば１９〜３１塩基対、好ましくは２１〜２５塩基対、より好ましくは２２〜２４塩基対、さらに好ましくは２３塩基対からなる。

相補鎖を形成しない塩基配列は、センス鎖とアンチセンス鎖のそれぞれ５’末端と３’末端にあって、センス鎖の相補鎖を形成しない塩基配列の５’末端の塩基とアンチセンス鎖の相補鎖を形成しない塩基配列の３’末端の塩基とが連結してループを形成し、センス鎖の相補鎖を形成しない塩基配列の３’末端の塩基とアンチセンス鎖の相補鎖を形成しない塩基配列の５’末端の塩基とが連結してループを形成している。ループの長さは、好ましくは２〜２０塩基、より好ましくは６〜１２塩基からなる。従って、全体の１本鎖環状ＲＮＡは、好ましくは４２〜１０２塩基で形成される。

センス鎖の５’末端の相補鎖を形成しない塩基配列をＡ、アンチセンス鎖の３’末端の相補鎖を形成しない塩基配列をＢ、センス鎖の３’末端の相補鎖を形成しない塩基配列をＣ、アンチセンス鎖の５’末端の相補鎖を形成しない塩基配列をＤとすると、例えばループの長さが２０塩基の場合、Ａは１〜１９塩基、Ｂは１９〜１塩基、Ｃは１９〜１塩基、Ｄは１〜１９塩基の長さを有し、Ａの５’末端の塩基とＢの３’末端の塩基が連結して２０塩基のループを形成し、Ｃの３’末端の塩基とＤの５’末端の塩基が連結して２０塩基のループを形成する。

相補鎖を形成しない配列は、ＡとＢ間、ＣとＤ間で、例えば１塩基、２塩基または３塩基の長さの違いがあるか、または同じ長さであることが好ましい。従って、例えば、ループの長さが８塩基の場合、Ａは３〜５塩基、Ｂは５〜３塩基、Ｃは５〜３塩基、Ｄは３〜５塩基の長さであることが好ましい。ループの長さが９塩基の場合、Ａは３〜６塩基、Ｂは６〜３塩基、Ｃは６〜３塩基、Ｄは３〜６塩基であることが好ましい。ループの長さが１０塩基の場合、Ａは４〜６塩基、Ｂは６〜４塩基、Ｃは６〜４塩基、Ｄは４〜６塩基であることが好ましい。

なお、ＡとＢで形成されるループとＣとＤで形成されるループの塩基配列は、同じでも異なっていてもよい。

本発明の１本鎖環状ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉法に用いることができる。
ＲＮＡ干渉とは、ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）ともいい、標的ＲＮＡと相補的な配列を持つ小ＲＮＡ分子が標的ＲＮＡに結合し、それを分解するか又は翻訳を抑制する現象である。

ダンベル型ＲＮＡのセンス鎖は、標的となるＲＮＡ（例えばｍＲＮＡまたはその前駆体ＲＮＡ）に相補的な配列を有する。また、相補鎖を形成しない塩基配列は、特に限定されないが、例えばＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、またはＵＧＵＧＣＵＧＵＣ（Ｍ．Ｍｉｙａｇｉｓｈｉら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ２００３，１３：１−７）などが挙げられる。

更に、ダンベル型ＲＮＡのループは化学修飾されていてもよく、例えば分子量約２０００〜５０００のポリエチレングリコールで修飾すると、生体内でのダンベル型ＲＮＡの安定性を向上することができる。細胞内でダイサーなどの酵素によりダンベル型ＲＮＡのループが切断され除去されるので、ステムがｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡとしてＲＮＡ干渉作用を発揮する際、ポリエチレングリコールが影響を与えることはほとんどないと考えられる。

本発明のダンベル型ＲＮＡは、対照細胞（ダンベル型ＲＮＡが導入されていない）における標的ＲＮＡの発現を１とした場合に、該ダンベル型ＲＮＡを導入した細胞における細胞導入後２４時間での標的ＲＮＡの発現が０．４以下を示すことが好ましい。

標的ＲＮＡの発現は、例えばレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニターゼ、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）など）を細胞に形質転換し、レポーター遺伝子のｍＲＮＡを標的ＲＮＡとして、該標的ＲＮＡの発現がダンベル型ＲＮＡによってどのくらい阻害されているかを、レポーター遺伝子由来のタンパク質の発色、蛍光を測定することにより確認することができる。

更に、本発明のダンベル型ＲＮＡは、ヒト血清中で８時間経過したときに７０％以上が分解されずに保持されるという特徴を有する。例えばヒト血清中でダンベル型ＲＮＡをインキュベーションし、経時的に分解されるかどうかを電気泳動などで分子量を測定することにより確認することができる。

本発明のダンベル型１本鎖環状ＲＮＡの製造方法は、相補鎖を形成しない塩基配列を５’末端および３’末端に有する、センス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ合成し、センス鎖が有する相補鎖を形成しない塩基配列の５’末端の塩基とアンチセンス鎖が有する相補鎖を形成しない塩基配列の３’末端の塩基、およびセンス鎖が有する相補鎖を形成しない塩基配列の３’末端の塩基とアンチセンス鎖が有する相補鎖を形成しない塩基配列の５’末端の塩基を、リガーゼで同時に連結することを含む。

センス鎖およびアンチセンス鎖は、標的となる遺伝子を抑制できるように、標的遺伝子の塩基配列から設計する。設計は、複数のセンス鎖およびアンチセンス鎖を作製してそれぞれ抑制効率を確認してもよいが、例えばｓｉＲＮＡ設計用アルゴリズムなどによる設計を利用してもよい（参照文献：Ｊ．Ａ．Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９） １８３：２８１−３０６；Ｄ．Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９） ２８８：９１１−９４０）。設計時には、標的遺伝子と類似した配列を持つ、標的遺伝子以外の遺伝子の発現を抑制すること（Ｏｆｆ ｔａｒｇｅｔ効果）がないことが望ましい。センス鎖およびアンチセンス鎖は、特に限定されないが、例えば１９〜３１塩基、好ましくは２１〜２５塩基、より好ましくは２２〜２４塩基、さらに好ましくは２３塩基の長さで設計する。

標的遺伝子は特に限定されないが、例えば、白血病のａｂｌ/ｂｃｒ遺伝子、加齢性黄斑変性症のＶＥＧＦ遺伝子、肝炎のＨＣＶ遺伝子が挙げられる。

後にループを形成する配列、例えば上記配列ＵＵＣＡＡＧＡＧＡを任意の箇所で２つに分けて相補鎖を形成しない塩基配列とし（該配列は９塩基であり、２つに分けたときに、上述のように長さの違いが１〜３塩基の範囲にあることが好ましい）、一方をアンチセンス鎖の３’末端、もう一方をセンス鎖の５’末端に連結した配列を設計し、同様にして一方をセンス鎖の３’末端、もう一方をアンチセンス鎖の５’末端に連結した配列を設計する。設計したこれら２つの配列の１本鎖核酸を、それぞれ別に合成する。その際、化学的リン酸化試薬を用いて５’末端のリン酸化を行うことが好ましい。なお、ループを形成したときの長さが、例えば２〜２０塩基、好ましくは６〜１２塩基になるように設計することが好ましい。

核酸合成方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ合成方法、プラスミド、ウイルスベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法など種々の方法があり、特に限定されないが、純度の高さ、大量合成可能、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用安全性の高さ、化学修飾可能などの点から、化学合成方法が好ましい。化学合成方法は、Ｈ−ホスホネート法、ホスホロアミダイト法などがあり、特に限定されず、市販の自動核酸合成機を使用することができる。

センス鎖およびアンチセンス鎖の両端にある相補鎖を形成しない塩基配列の末端をリガーゼ（例えばＴ４ ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなど）で連結して、２つのループを同時に形成する。反応条件は、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＢＳＡなどを含む緩衝液中で低温下２０時間インキュベーションすればよい。合成したダンベル型１本鎖環状ＲＮＡは、常法で回収・精製（例えば高速液体クロマトグラフィー、ＰＡＧＥ法など）することができる。

更に、１本鎖環状ＲＮＡをポリエチレングリコール(ＰＥＧ)などで化学修飾してもよく、化学修飾はループ部分に行うことが好ましい。結合のために、ＰＥＧの両末端を改変して、たとえばホルミル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基などの、塩基のアミノ基と反応性の官能基を導入する。

以下、上記方法で製造したダンベル型ＲＮＡを用いた、ＲＮＡ干渉法について説明する。
本発明によれば、本発明の１本鎖環状ＲＮＡを細胞に導入し、標的ＲＮＡを不能にしてタンパク質への翻訳を持続的に阻害することができ、前記細胞は、ヒト細胞または非ヒト細胞を用いることができる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡ干渉法を行う場合、ダンベル型ＲＮＡを、例えばエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法などで細胞に導入する。

ｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡ干渉法を行う場合、まずダンベル型ＲＮＡを含む試料を透析、ｐＨ調節などを行って、生体に適合するように調製する。動物又は植物への導入方法は特に限定されず、例えば局所投与、静脈内投与、遺伝子銃を用いる方法などが挙げられ、ヒトに適用する場合、安全性の点から微生物等を用いない方法が好ましい。

細胞内に導入されたダンベル型ＲＮＡは、細胞内ダイサーにより切断を受けＲＮＡ干渉作用のあるＲＮＡ２本鎖（ｓｉＲＮＡ）を細胞内で生じる（図１）。ｓｉＲＮＡの末端は、平滑末端または突出末端であり得る。ｓｉＲＮＡが１本鎖となり、ＲＮＡ−ヌクレアーゼ複合体（ＲＮＡ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ））を形成し、ｓｉＲＮＡと相補的な配列の標的ｍＲＮＡを認識して、ｍＲＮＡを分解し、標的遺伝子の発現が抑制される。

本発明の１本鎖環状ＲＮＡは、植物、動物（例えばヒト、ペット、家畜を含む哺乳動物など）、それらの細胞のいずれでも使用可能であり、特に医学、農学分野での広範な応用が期待される。例えば、植物又は動物レベルあるいは植物又は動物細胞レベルでの特定の遺伝子やタンパク質の機能の解明、例えばノックアウト法による機能の解明など、種々の目的のために本発明の１本鎖環状ＲＮＡを使用することができる。

また、本発明は、１本鎖環状ＲＮＡを有効成分として含む医薬組成物を含有する。
１本鎖環状ＲＮＡの医薬組成物への配合量は、組成物の種類や目的等によって調整することができ、組成物の全量に対して、例えば１重量％、３重量％、５重量％、１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、１００重量％であるが、これらに限定されない。

本発明の医薬組成物の剤形として、例えば液体製剤（溶液剤、懸濁剤、乳濁剤など）、固体製剤（用時調製の凍結乾燥剤など）、リポソーム（カチオン性リポソームが好ましい）封入製剤などが挙げられ、また投与経路として、非経口投与が好ましく、例えば患部に直接投与する局所投与、経肺投与、経鼻投与等の経粘膜投与、静脈内投与などが含まれる。

本発明の医薬組成物は、製剤化、剤形等に応じて、賦形剤（生理食塩水、滅菌水、リンゲル液など）、緩衝剤、等張化剤、安定化剤などを含めてもよい。

また、本発明の医薬組成物の投与量は、患者の性別、体重、年齢、重篤度、症状などに応じて変更し得る。

本発明の医薬組成物の適用は、特に限定されないが、例えば、癌などの疾患の治療、例えば癌細胞で特異的に発現する遺伝子やタンパク質の機能の抑制などが挙げられる。

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。

ダンベル型ＲＮＡの作製
ダンベル型ＲＮＡの原料となる５’リン酸化ＲＮＡは、全てホスホロアミダイト法に基づきＤＮＡ合成機（ＧｅｎｅＷｏｒｌｄ Ｈ８−ＳＥ）により合成した。ＲＮＡアミダイトはＴＢＤＭＳ保護体（Ｐｒｏｌｉｇｏ）、５’リン酸化はＣｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。脱保護は定法に従い、ＰＡＧＥ精製した。合成したＲＮＡ配列を、配列番号１（センス鎖２８ｍｅｒ）、配列番号２（アンチセンス鎖２８ｍｅｒ）、配列番号３（５６ｍｅｒ）および図２に示す。なお、図２のＲＮＡ配列のうち、下線の配列がダンベル型ＲＮＡのループ部を形成する配列である。

次に、酵素反応を、２μＭ ＲＮＡ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ、２．０ｕｎｉｔｓ／μｌ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、０．００６％ＢＳＡ、２５％ＰＥＧ６０００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰの組成で、反応スケール２５μｌで行った。

具体的には、まず、５’リン酸化ＲＮＡ２本鎖が４μＭとなるよう、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＡＴＰ緩衝液中（２ｘ緩衝液）１２．５μｌに溶解し、６５℃で５分間加熱後、室温まで徐冷した。その後、ＢＳＡ水溶液、ＰＥＧ６０００水溶液、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（タカラバイオ）を上記の組成と反応スケールになるように加え、１１℃で２０時間インキュベートした。エタノール沈殿により、回収したＲＮＡをＰＡＧＥにて解析した。

図２のＰＡＧＥの各レーンのサンプルは以下の通りである。
レーン１：２８塩基のセンス鎖および２８塩基のアンチセンス鎖の混合物（マーカー）
レーン２：５７塩基のＲＮＡ（マーカー）
レーン３：２８塩基のセンス鎖と２８塩基のアンチセンス鎖から形成したダンベル型ＲＮＡ
レーン４：５６塩基（１本鎖）から形成したダンベル型ＲＮＡ
レーン５：ＲＮＡリガーゼで処理した２８塩基のセンス鎖（参考）
レーン６：ＲＮＡリガーゼで処理した２８塩基のアンチセンス鎖（参考）

レーン４のダンベル型ＲＮＡは、配列番号３の５６塩基の１本鎖を合成してステム部分およびヘアピンループ部分を形成し、最初の塩基と最後の塩基をＴ４リガーゼで結合して作製した。

レーン３の丸で囲んだバンドが、本発明の方法で作製したダンベル型ＲＮＡであり、その収率は約８０％であった。レーン４のダンベル型ＲＮＡの収率は約５％以下であった。

ダンベル型ＲＮＡのステムの長さの検討
上記ＤＮＡ合成機で、配列番号４〜１３に示すＲＮＡを合成した。配列番号４および５は１８塩基対を形成する２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−１）、配列番号６および７はステムの長さ１９塩基のダンベル型ＲＮＡ（Ｄｂ−１９）、配列番号８および９はステムの長さ２３塩基のダンベル型ＲＮＡ(Ｄｂ-２３)、配列番号１０及び１１はステムの長さ２７塩基のダンベル型ＲＮＡ(Ｄｂ-２７)、配列番号１２および１３はステムの長さ３１塩基のダンベル型ＲＮＡ(Ｄｂ-３１)を形成する（図３）。

酵素反応を、２μＭ ＲＮＡ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ、１．０ｕｎｉｔｓ／μｌ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、０．００６％ＢＳＡ、２５％ＰＥＧ６０００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰの組成で、反応スケール１．５〜２．５ｍｌで行った。

具体的には、５’リン酸化ＲＮＡ２本鎖が４μＭとなるよう、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＡＴＰ緩衝液中（２ｘ緩衝液、最終的な反応液量の半分量）に溶解し、６５℃で５分間加熱後、室温まで徐冷した。その後、ＢＳＡ水溶液、ＰＥＧ６０００水溶液、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（タカラバイオ）を加え、１１℃で２０時間インキュベートした。

反応液からアルコール沈殿によりＲＮＡを回収し、ＰＡＧＥを用いて環化体を単離した。ＵＶ ｓｈａｄｏｗｉｎｇ法で目的物を含むバンドを可視化して切り出し、細かく粉砕した後、溶出バッファー（０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））４ｍｌで３回抽出した。Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジを用いて脱塩（５０％アセトニトリル水６ｍｌで溶出）し、遠心エバポレーターを用いて濃縮し、さらに酢酸アンモニウム存在下アルコール沈殿した。ＵＶスペクトルを測定し得られた目的物を定量した。

上記各ダンベル型ＲＮＡ２μｇに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２緩衝液中ＣｏｌｄＳｈｏｃｋ−ＤＩＣＥＲ（タカラバイオ）２ｕｎｉｔｓを加え（反応液量２０μｌ）、３７℃でインキュベートした。１、６、１８時間後に反応液３μｌをサンプリングし、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液２μｌと混合し、酵素反応を停止した。これを未変性ＰＡＧＥ（１０％ＰＡＧＥ、１ｘ ＴＢＥ）で解析した（１ｘＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩで染色後、ＢｉｏＲａｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＦＸで画像化・定量を行った）。

図４に各ダンベル型ＲＮＡのＰＡＧＥを示す。コントロールとして、ダンベル化反応前の２本鎖ＲＮＡを基質とする切断反応も同様に検討した。その結果、Ｄｂ−１９の切断反応は、１時間後に約５％進行し、２０塩基長の２本鎖ＲＮＡの生成が確認された。Ｄｂ−１９の２０塩基前後の切断断片は、６、１８時間後とほぼ同程度の濃度を維持した。一方、コントロールの１９塩基直鎖(Ｌｉｎｅｒ)は、１時間後にほぼ１００％切断され２０塩基長のＲＮＡ２本鎖が観察された。その後、時間とともにその生成物のＲＮＡ２本鎖は、分解され消失した。Ｄｂ−２３では、１時間後に約８％切断され２０塩基長の２本鎖が生成した。ステムの長さが長くなるに従い、Ｄｂ−２７、Ｄｂ−３１と１時間後の切断速度が１０％、２０％と速くなることが確認された。１８時間後、Ｄｂ−１９では原料が約７５％残っているのに対して、Ｄｂ−３１では原料が完全に消失した。このことから、ステムの長さが短い方が酵素に対して安定であることが明らかとなった。

ダンベル型ＲＮＡのＲＮＡ干渉効果
上記ダンベル型ＲＮＡ（Ｄｂ−１９、Ｄｂ−２３、Ｄｂ−２７、Ｄｂ−３１）のＲＮＡ干渉効果を蛍ルシフェラーゼレポーター遺伝子ｐＧＬ３の発現阻害実験により評価した。

ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（ＲＩＫＥＮ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫ）を１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）培地中で３７℃、５％ＣＯ_２下培養し、９６穴プレートに、１００μｌずつ、１．６ｘ１０^４細胞／ウェルとなるよう分注した。さらに３７℃、５％ＣＯ_２下で３９時間培養し、約７０％コンフルエントの状態で２種のプラスミドベクター（ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＲＬ−ＴＫ（内部標準用）、いずれもＰｒｏｍｅｇａ）と各種ＲＮＡをトランスフェクション試薬ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）を用い、トランスフェクション試薬添付のプロトコールに従い、コトランスフェクションした。トランスフェクション時の濃度条件は以下の通りである。

０．２μｇ ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ／０．０２μｇ ｐＲＬ−ＴＫ／２５ｎＭ ＲＮＡ（最終量１００μｌ）
ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ １μｌ
ＤＭＥＭ培地 ２５μｌ
ｓｉＲＮＡ希釈液 ２．５μｌ
ＤＭＥＭ培地 １５μｌ
ＲＮＡ（５ｐｍｏｌ／μｌ） ０．５μｌ
ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ（１μｇ／μｌ） ０．２μｌ
ｐＲＬ−ＴＫ（０．１μｇ／μｌ） ０．２μｌ
４４．４μｌ

トランスフェクション後、３７℃、５％ＣＯ_２下４時間インキュベートし、２０％血清入りＤＭＥＭ培地１００μｌをそれぞれのウェルに加えた。３７℃でさらに２０時間インキュベート後、Ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、添付のプロトコールに従い細胞を可溶化してルシフェラーゼ発現量を定量した（条件：試薬量３０μｌ、ｄｅｌａｙ ｔｉｍｅ２秒、ｒｅａｄ ｔｉｍｅ１０秒。機器Ｗａｌｌａｃ ＡＲＶＯ ＳＸ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ）。

比較として、バッファーのみ（コントロール）の条件も同様に評価した。蛍ルシフェラーゼの発光強度は、内部標準であるレニラルシフェラーゼの発光強度により補正した。その結果を図５に示す。２４時間後では、ダンベル型ＲＮＡのうち、Ｄｂ−２３の活性が最も高く、０．２４まで阻害効果を示した。この結果から、最適な二本鎖長を２３塩基とした。

ＲＮＡ干渉効果の持続性
Ｄｂ−２３とｓｉＲＮＡ−１のＲＮＡ干渉効果の持続性について比較した。
ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、１０％ウシ仔牛血清(ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏ／Ｇｉｂｃｏ)を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）で、５％ＣＯ_２加湿チャンバーで培養した。約７０％コンフルエントの状態のトランスフェクションの４０時間前に、細胞を９６穴プレートに、１００μｌずつ、１．６×１０^４細胞／ウェルになるように分注した。レポータープラスミドとＲＮＡのコトランスフェクションをＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＮＩＨ ３Ｔ３細胞の製造者による説明に従って行った。実施例３と比べてトランスフェクション試薬で１０倍に希釈した１６ｎｇ／ｍｌのｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ(Ｐｒｏｍｅｇａ)、１．６ｎｇ／ｍｌのｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および２５ｎＭのＲＮＡを、ウェルに１００μｌ適用した。４時間のインキュベーション後、２０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭを１００μｌ添加した。更に３日以上インキュベーションを行い、培地を随時交換した。ルシフェラーゼの発現を、Ｗａｌｌａｃ ＡＲＶＯ ＳＸ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に添付の指示書に従い、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、２４時間、７２時間、１２０時間後にモニターした（図６）。ＲＮＡの入っていないものをコントロールとした。

ルシフェラーゼの活性は、２４時間ではＤｂ−２３とｓｉＲＮＡ−１ともにほぼ同等の活性を示したが、１２０時間後では、Ｄｂ−２３がより高い遺伝子発現抑制作用を示した。このことから、ダンベル型ＲＮＡの徐放作用、長期活性効果が示された。

ヒト血清中でのダンベル型ＲＮＡの安定性
Ｄｂ-２３とｓｉＲＮＡのヒト血清中での安定性を比較した。
アニーリングバッファー（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ酢酸マグネシウム）にアニーリング前のｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−１、２０μＭ）またはダンベル型ＲＮＡ（Ｄｂ−２３、２０μＭ）を加えたその４μｌと、ＰＢＳ３２μｌ、正常ヒト血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）４μｌを混合して３７℃でインキュベーションした。アリコート５μｌを０．５、１、１．５、３、８および２０時間後に採取し、１５％ｎａｔｉｖｅＰＡＧＥで、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉで染色、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒ ＦＸ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して分析した。

その結果、ｓｉＲＮＡは、３時間後に５０％まで分解されるのに対して、Ｄｂ−２３は依然として８０％以上存在し、８時間後でも７０％以上存在していた。従って、Ｄ−２３は、生体内での高い安定性が期待できた。

本発明は、生体に適用できる核酸分子として利用可能であり、収率よく該分子を製造できる。

本発明のダンベル型ＲＮＡを模式的に示す。 ＲＮＡの構造と各種ＲＮＡの電気泳動像を示す。 ｓｉＲＮＡとダンベル型ＲＮＡの構造を示す。 ダイサーで切断したダンベル型ＲＮＡの電気泳動像を示す。 トランスフェクションから２４時間後の各ダンベル型ＲＮＡの干渉効果を示す。 ダンベル型ＲＮＡの持続的なＲＮＡ干渉効果を示す。 ダンベル型ＲＮＡのヒト血清中の安定性を示す。

Claims (11)

1. センス鎖配列と、該センス鎖配列に相補的なアンチセンス鎖配列と、該センス鎖と該アンチセンス鎖の間に両鎖を結合する同じか又は異なる２つのループ配列とを含み、該センス鎖と該アンチセンス鎖が対合してステムを形成することを特徴とする、持続的又は徐放的ＲＮＡ干渉作用を有する１本鎖環状ＲＮＡ。
2. 対照細胞における標的ＲＮＡの発現を１とした場合に、細胞に導入後２４時間の標的ＲＮＡの発現が０．４以下を示す、請求項１に記載の１本鎖環状ＲＮＡ。
3. ヒト血清中で８時間経過したときに７０％以上が保持されている、請求項１または２に記載の１本鎖環状ＲＮＡ。
4. 相補鎖を形成しない塩基配列を５’末端および３’末端に有する、センス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ合成し、センス鎖が有する相補鎖を形成しない塩基配列の５’末端の塩基とアンチセンス鎖が有する相補鎖を形成しない塩基配列の３’末端の塩基、およびセンス鎖が有する相補鎖を形成しない塩基配列の３’末端の塩基とアンチセンス鎖が有する相補鎖を形成しない塩基配列の５’末端の塩基を、リガーゼで同時に連結することを含み、
   その際、センス鎖が５’末端に有する相補鎖を形成しない塩基配列とアンチセンス鎖が３’末端に有する相補鎖を形成しない塩基配列が互いに結合してループを形成し、センス鎖が３’末端に有する相補鎖を形成しない塩基配列とアンチセンス鎖が５’末端に有する相補鎖を形成しない塩基配列が互いに結合してループを形成し、ならびにセンス鎖とアンチセンス鎖が対合してステムを形成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の１本鎖環状ＲＮＡの製造方法。
5. センス鎖が有する相補鎖を形成しない塩基配列とアンチセンス鎖が有する相補鎖を形成しない塩基配列の５’末端をリン酸化することを更に含む、請求項４に記載の製造方法。
6. 前記ループの配列が互いに同じかまたは異なる、請求項４または５に記載の製造方法。
7. 前記ループの長さが２〜２０塩基である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
8. 前記ステムの長さが１９〜３１塩基である、請求項４〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
9. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の１本鎖環状ＲＮＡをヒト由来の細胞に導入し、標的ＲＮＡを不能にしてタンパク質への翻訳を持続的に阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現をｉｎ ｖｉｔｒｏで抑制する方法。
10. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の１本鎖環状ＲＮＡを非ヒト動物、植物又はそれらの細胞に導入し、標的ＲＮＡを不能にしてタンパク質への翻訳を持続的に阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する方法。
11. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の１本鎖環状ＲＮＡを有効成分として含む、医薬組成物。

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