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TW202142239A - 包含環狀多核糖核苷酸之組合物之遞送 - Google Patents

包含環狀多核糖核苷酸之組合物之遞送 Download PDF

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TW202142239A
TW202142239A TW110103507A TW110103507A TW202142239A TW 202142239 A TW202142239 A TW 202142239A TW 110103507 A TW110103507 A TW 110103507A TW 110103507 A TW110103507 A TW 110103507A TW 202142239 A TW202142239 A TW 202142239A
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cyclic
polyribonucleotide
polyribonucleotides
sequence
rna
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TW110103507A
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亞法克 卡維吉恩
尼可拉斯 麥卡尼 普拉吉斯
亞歷姍卓 蘇菲 德波爾
艾瑞卡 嘉貝麗 韋恩斯坦
羅傑斯 凱薩琳 希弗安提斯
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美商旗艦先鋒創新有限責任公司
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Abstract

本發明大體上係關於環狀多核糖核苷酸及其組合物之遞送。

Description

包含環狀多核糖核苷酸之組合物之遞送
某些環狀多核糖核苷酸普遍存在於人類組織及細胞中，包括健康個體之組織及細胞。
本發明大體上係關於用於遞送包含環狀多核糖核苷酸之組合物的系統及方法，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合位點。在一些實施例中，該系統為非經腸核酸遞送系統。在一些實施例中，非經腸核酸遞送系統包含非經腸可接受之稀釋劑且不含任何載劑。在一些實施例中，非經腸核酸遞送系統包含載劑。在一些實施例中，該方法包含藉由非經腸投與遞送包含環狀多核糖核苷酸之組合物。非經腸投與可為靜脈內、肌肉內、經眼或局部投與。在一些實施例中，該組合物包含環狀多核糖核苷酸及非經腸可接受之稀釋劑。在一些實施例中，該組合物包含環狀多核糖核苷酸、非經腸可接受之稀釋劑，且不含任何載劑。在一些實施例中，該組合物包含環狀多核糖核苷酸、非經腸可接受之稀釋劑及載劑。在一些實施例中，結合位點包含結合目標之序列。環狀多核糖核苷酸可為轉譯非勝任型。
在第一態樣中，本發明之特徵在於一種非經腸核酸遞送系統，其包含環狀多核糖核苷酸及非經腸可接受之稀釋劑，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。
在一些實施例中，遞送系統不含任何載劑。在一些實施例中，遞送系統包含載劑。
在第二態樣中，本發明之特徵在於環狀多核糖核苷酸在製造用於非經腸遞送至個體之組合物中的用途，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸之量有效地引起個體之生物反應。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸之量有效地對個體之細胞或組織產生生物效應。
在第三態樣中，本發明之特徵在於環狀多核糖核苷酸在製造用於遞送至個體之細胞或組織之非經腸組合物中的用途，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。
在一些實施例中，組合物經調配用於靜脈內、肌肉內、經眼或局部投與。在一些實施例中，組合物為進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組合物。在一些實施例中，組合物包含載劑。在一些實施例中，組合物包含非經腸可接受之稀釋劑且不含任何載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸與目標形成複合物，且環狀多核糖核苷酸或目標在遞送後至少5天為可偵測的。
在一些實施例中，目標係選自由以下組成之群：核酸分子、小分子、蛋白質、碳水化合物及脂質。在一些實施例中，目標係選自由以下組成之群：核酸分子、小分子、蛋白質、碳水化合物及脂質。
在一些實施例中，小分子為分子量不超過900道爾頓之有機化合物，且調節細胞過程。在一些實施例中，小分子為藥物。在一些實施例中，小分子為螢光團。在一些實施例中，小分子為代謝物。
在一些實施例中，目標為基因調控蛋白。在一些實施例中，基因調控蛋白為轉錄因子。在一些實施例中，核酸分子為DNA分子或RNA分子。在一些實施例中，複合物調節基因表現。在一些實施例中，複合物調節DNA分子之定向轉錄、DNA分子之表觀遺傳重塑或DNA分子之降解。在一些實施例中，複合物調節目標之降解、目標之易位或目標信號轉導。在一些實施例中，基因表現與疾病或病況之發病機制相關。
在一些實施例中，複合物之環狀多核糖核苷酸或複合物之目標在遞送後至少7、8、9或10天為可偵測的。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸在遞送後存在至少五天。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸在遞送後存在至少6、7、8、9或10天。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸為未經修飾之環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸具有準雙股二級結構。在一些實施例中，序列為具有結合目標之二級結構的適體序列。在一些實施例中，適體序列進一步具有結合目標之三級結構。
在一些實施例中，細胞為真核細胞。在一些實施例中，真核細胞為動物細胞。在一些實施例中，真核細胞為寵物細胞。在一些實施例中，真核細胞為哺乳動物細胞。在一些實施例中，真核細胞為人類細胞。在一些實施例中，真核細胞為家畜細胞。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸缺乏多A序列、缺乏複製元件、缺乏自由3'端或缺乏RNA聚合酶識別模體或其任何組合。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸進一步包含表現序列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含終止元件或IRES，或其組合。 定義
本發明將關於特定實施例且參照某些圖式來描述，但本發明不限於此。除非另外指明，否則如下文所闡述之術語一般應按其常識來理解。
如本文所用，術語「circRNA」或「環狀多核糖核苷酸」或「環狀RNA」可互換使用，且意謂具有無自由端(亦即無自由3'及/或5'端)之結構的多核糖核苷酸分子，例如經由共價鍵或非共價鍵形成環狀或無端結構之多核糖核苷酸分子。
如本文所用，術語「隱源子」為環狀多核糖核苷酸之核酸序列，其有助於減少、逃避及/或避免被免疫細胞偵測及/或減少針對環狀多核糖核苷酸之免疫反應的誘導。
如本文所用，術語「表現序列」為編碼產物(例如肽或多肽)之核酸序列或調控核酸。編碼肽或多肽之例示性表現序列可包含複數個核苷酸三聯體，其中之每一者可編碼一個胺基酸且稱為「密碼子」。
如本文所用，術語「經修飾之核糖核苷酸」意謂對未經修飾之天然核糖核苷酸，諸如天然未經修飾之核苷酸腺苷(A)、尿苷(U)、鳥嘌呤(G)、胞苷(C)之化學組成具有一或多個化學修飾的任何核糖核苷酸類似物或衍生物。在一些實施例中，經修飾之核糖核苷酸的化學修飾為對核糖核苷酸之任一或多個官能基，諸如糖、核鹼基或核苷間鍵(例如連接磷酸酯/磷酸二酯鍵/磷酸二酯主鏈)的修飾。
如本文所用，片語「準螺旋結構」為環狀多核糖核苷酸之高階結構，其中環狀多核糖核苷酸之至少一部分摺疊成螺旋結構。
如本文所用，片語「準雙股二級結構」為環狀多核糖核苷酸之高階結構，其中環狀多核糖核苷酸之至少一部分形成內部雙股。
如本文所用，術語「調控序列」為修飾表現產物之核酸序列。
如本文所用，術語「重複核苷酸序列」為在一段DNA內或在整個基因體中的重複核酸序列。在一些實施例中，重複核苷酸序列包括多CA或多TG (UG)序列。在一些實施例中，重複核苷酸序列包括Alu家族內含子中之重複序列。
如本文所用，術語「複製元件」是可用於複製或啟動環狀多核糖核苷酸轉錄之序列及/或模體。
如本文所用，術語「選擇性轉譯序列」為選擇性地啟動或活化環狀多核糖核苷酸中之表現序列之轉譯的核酸序列。
如本文所用，術語「選擇性降解序列」意謂啟動環狀多核糖核苷酸中之表現序列之轉譯的核酸序列。
如本文所用，術語「交錯元件」為在轉譯期間誘導核糖體暫停之部分，諸如核苷酸序列。在一些實施例中，交錯元件為具有強α-螺旋傾向之胺基酸的非保守序列，其後為共同序列-D(V/I)ExNPG P，其中x為任何胺基酸。在一些實施例中，交錯元件可包括化學部分(諸如丙三醇)、非核酸連接部分、化學修飾、經修飾之核酸或其任何組合。
如本文所用，術語「實質上抗性」係指與參考物相比具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%抗性。
如本文所用，術語「複合物」意謂對彼此具有親和力之至少兩個部分(例如化學或生物化學)之間的締合。舉例而言，至少兩個部分為目標(例如蛋白質)及環狀RNA分子。
「多肽」及「蛋白質」可互換使用，且意謂藉由共價鍵(例如醯胺鍵)接合之兩個或更多個胺基酸的聚合物。如本文所述之多肽可包括全長蛋白質(例如經完全加工之蛋白質)以及較短胺基酸序列(例如天然存在之蛋白質的片段或合成多肽片段)。多肽可包括天然存在之胺基酸(例如，自然界中合成之肽中常見的二十種胺基酸之一，且憑一個字母縮寫A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y及V得知)及非天然存在之胺基酸(例如，不為自然界中合成之肽中常見的二十種胺基酸之一的胺基酸，包括合成胺基酸、胺基酸類似物及胺基酸模擬物)。
如本文所用，術語「結合位點」係指環狀多核糖核苷酸中與另一實體(例如化合物、蛋白質、核酸等)相互作用的區域。結合位點可包含適體序列。
如本文所用，術語「結合部分」係指可藉由結合位點結合之目標的區域，例如核酸(例如RNA、DNA、RNA-DNA雜交體)、化合物、小分子(例如藥物)、適體、多肽、蛋白質、脂質、碳水化合物、抗體、病毒、病毒顆粒、膜、多組分複合物、細胞器細胞、其他細胞部分、其任何片段及其任何組合之區、域、片段、抗原決定基或部分。
如本文所用，術語「適體序列」為與目標分子特異性結合之非天然存在或合成的寡核苷酸。適體通常為20至500個核苷酸。適體通常經由二級結構而非序列同源性與其目標結合。
如本文所用，術語「小分子」為分子量不超過900道爾頓之有機化合物。小分子能夠調節細胞過程或為螢光團。
如本文所用，術語「接合部分」為包含用於接合方法之官能基的經修飾之核苷酸。
如本文所用，術語「線性對應物」為具有與環狀多核糖核苷酸相同或相似之核苷酸序列(例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%或其間任何百分比的序列相似性)且具有兩個自由端(亦即，環化多核糖核苷酸之未環化型式(及其片段))的多核糖核苷酸分子(及其片段)。在一些實施例中，線性對應物(例如環化前型式)為具有與環狀多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列(例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%或其間任何百分比的序列相似性)及相同或相似的核酸修飾且具有兩個自由端(亦即，環化多核糖核苷酸之未環化型式(及其片段))的多核糖核苷酸分子(及其片段)。在一些實施例中，線性對應物為具有與環狀多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列(例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%或其間任何百分比的序列相似性)及不同或無核酸修飾且具有兩個自由端(亦即，環化多核糖核苷酸之未環化型式(及其片段))的多核糖核苷酸分子(及其片段)。在一些實施例中，作為線性對應物之多核糖核苷酸分子之片段為線性對應物多核糖核苷酸分子中比線性對應物多核糖核苷酸分子短的任何部分。在一些實施例中，線性對應物進一步包含5'帽。在一些實施例中，線性對應物進一步包含多腺苷尾。在一些實施例中，線性對應物進一步包含3' UTR。在一些實施例中，線性對應物進一步包含5' UTR。
如本文所用，術語「載劑」為藉由環狀多核糖核苷酸之共價修飾、經由部分或完全囊封劑或其組合促進組合物(例如環狀多核糖核苷酸)運輸或遞送至細胞中的化合物、組合物、試劑或分子。載劑之非限制性實例包括碳水化合物載劑(例如經酸酐修飾之植物糖原或糖原型材料)、奈米粒子(例如囊封或共價連接結合至環狀多核糖核苷酸之奈米粒子)、脂質體、融質體(fusosome)、離體分化之網狀紅血球、胞外體、蛋白質載劑(例如共價連接至環狀多核糖核苷酸之蛋白質)或陽離子型載劑(例如陽離子型脂質聚合物或轉染試劑)。
如本文所用，術語「裸遞送」意謂不借助於載劑且不對有助於遞送至細胞之部分進行共價修飾而遞送至細胞的調配物。裸遞送調配物不含任何轉染試劑、陽離子型載劑、碳水化合物載劑、奈米粒子載劑或蛋白質載劑。舉例而言，環狀多核糖核苷酸之裸遞送調配物為包含無共價修飾之環狀多核糖核苷酸且不含載劑的調配物。
術語「稀釋劑」意謂包含非活性溶劑之媒劑，本文所述之組合物(例如包含環狀多核糖核苷酸之組合物)可在其中稀釋或溶解。稀釋劑可為RNA增溶劑、緩衝劑、等張劑或其混合物。稀釋劑可為液體稀釋劑或固體稀釋劑。液體稀釋劑之非限制性實例包括水或其他溶劑、增溶劑及乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及脫水山梨糖醇之脂肪酸酯及1,3-丁二醇。固體稀釋劑之非限制性實例包括碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸二鈣、硫酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸鈉乳糖、蔗糖、纖維素、微晶纖維素、高嶺土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化鈉、乾澱粉、玉米澱粉或糖粉。
如本文所用，術語「非經腸可接受之稀釋劑」為用於非經腸投與組合物(例如包含環狀多核糖核苷酸之組合物)之稀釋劑。以引用的方式併入
本說明書中提及之所有出版物、專利及專利申請案以引用的方式併入本文中，其引用的程度如同每個單獨的出版物、專利或專利申請案經特定及單獨地指示以引用的方式併入一般。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2020年1月29日申請之美國臨時申請案第62/967,548號及2020年12月16日申請之美國臨時申請案第63/126,472號之優先權及權益，該等臨時申請案中之每一者的全部內容以引用之方式併入本文中。
本發明大體上係關於環狀多核糖核苷酸之組合物之遞送。
如本文所揭示之本發明包括一種非經腸遞送系統，其包含環狀多核糖核苷酸及非經腸可接受之稀釋劑，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合位點，例如結合目標之序列。非經腸遞送系統可為不含任何載劑之遞送系統。非經腸遞送系統可進一步包含載劑。
如本文所揭示之本發明包括一種非經腸遞送系統，其包含環狀多核糖核苷酸及非經腸可接受之稀釋劑，其中該環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸且包含結合目標之序列。非經腸遞送系統可為不含任何載劑之遞送系統。非經腸遞送系統可進一步包含載劑。
如本文所揭示之本發明包括一種活體內遞送環狀多核糖核苷酸之方法，其包含向個體非經腸投與該環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。在一些實施例中，將環狀多核糖核苷酸活體內遞送至個體之細胞或組織的方法包含向該細胞或組織非經腸投與該環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。環狀多核糖核苷酸可在組合物中。組合物可包含載劑。在一些實施例中，組合物包含非經腸可接受之稀釋劑且不含任何載劑。非經腸投與可包含肌肉內投與、靜脈內投與、經眼投與或局部投與。
如本文所揭示之本發明包括一種活體內遞送環狀多核糖核苷酸之方法，其包含向個體非經腸投與該環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸且包含結合目標之序列。在一些實施例中，將環狀多核糖核苷酸活體內遞送至個體之細胞或組織的方法包含向該細胞或組織非經腸投與該環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸且包含結合目標之序列。環狀多核糖核苷酸可在組合物中。組合物可包含載劑。在一些實施例中，組合物包含非經腸可接受之稀釋劑且不含任何載劑。非經腸投與可包含肌肉內投與、靜脈內投與、經眼投與或局部投與。
在如本文所述之遞送方法中投與之環狀多核糖核苷酸可與目標結合。環狀多核糖核苷酸可包含與目標結合(例如雜交)之序列。環狀多核糖核苷酸可包含具有與目標結合之二級結構的適體。在一些實施例中，所投與之環狀多核糖核苷酸為經完全修飾之環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，所投與之環狀多核糖核苷酸為經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸。在其他實施例中，所投與之環狀多核糖核苷酸為未經修飾之環狀多核糖核苷酸。在向個體之細胞或組織或向個體投與之後，本文所述之環狀多核糖核苷酸可調節細胞功能或細胞過程，例如細胞、組織或個體之基因表現。環狀多核糖核苷酸可缺乏多A序列、缺乏複製元件、缺乏自由3'端或缺乏RNA聚合酶識別模體或其任何組合。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸進一步包含表現序列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含終止元件或IRES，或其組合。
在一些實施例中，結合細胞中之目標的方法包含提供包含適體序列之環狀多核糖核苷酸，其中該適體序列具有結合目標之二級結構；及將該環狀多核糖核苷酸遞送至細胞，其中該環狀多核糖核苷酸與在遞送後至少5天可偵測之目標形成複合物。在一些實施例中，結合細胞中之目標的方法包含提供包含適體序列之轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸，其中該適體序列具有結合目標之二級結構；及將該轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸遞送至細胞，其中該轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸與在遞送後至少5天可偵測之目標形成複合物。
在一些實施例中，組合物包括包含適體序列之環狀多核糖核苷酸，其中該適體序列具有結合目標之二級結構。在一些態樣中，組合物包括包含適體序列之轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸，其中該適體序列具有結合目標之二級結構。
在一些態樣中，醫藥組合物包括包含適體序列之轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸，其中該適體序列具有結合目標之二級結構；及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
在一些實施例中，細胞包含如本文所述之環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，細胞包含如本文所述之轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸。
在一些實施例中，醫藥組合物包含環狀多核糖核苷酸，其包含結合目標，例如RNA、DNA、蛋白質、細胞膜等的結合位點；及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑；其中該目標及該環狀多核糖核苷酸形成複合物，且其中該目標不為微RNA。在一些態樣中，醫藥組合物包含環狀多核糖核苷酸，其包含：結合第一目標之第一結合位點及結合第二目標之第二結合位點；及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑；其中該第一結合位點不同於該第二結合位點，且其中該第一目標及該第二目標均為微RNA。
在一些實施例中，醫藥組合物包含環狀多核糖核苷酸，其包含結合目標之結合位點；及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑；且其中該目標不為微RNA。在一些態樣中，醫藥組合物包含環狀多核糖核酸，其包含結合目標之結合位點，其中該目標包含核糖核酸(RNA)結合模體；及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑；且其中該目標為微RNA。在一些實施例中，醫藥組合物包含環狀多核糖核苷酸，其包含結合目標之結合位點；及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑；其中該環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型或轉譯缺陷型，且其中該目標不為微RNA。在一些態樣中，醫藥組合物包含環狀多核糖核酸，其包含結合目標之結合位點，其中該目標包含核糖核酸(RNA)結合模體；及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑；其中該環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型或轉譯缺陷型，且其中該目標為微RNA。在一些實施例中，結合位點包含具有結合目標之二級結構的適體序列。 非經腸遞送系統
非經腸遞送系統可用於活體內遞送本文所述之環狀多核糖核苷酸(circRNA)。在一些實施例中，非經腸遞送系統包含環狀多核糖核苷酸及非經腸可接受之稀釋劑。
CircRNA為經由共價或非共價鍵形成連續結構之多核糖核苷酸。circRNA可為如本文所述之任何環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，circRNA包含結合目標之序列。在一些實施例中，circRNA為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸，且包含結合目標之序列。結合目標之序列可為具有結合目標之二級結構的適體序列。結合目標之序列可與目標雜交。由於環狀結構，與相應的線性RNA相比，circRNA可具有改良的穩定性、增加的半衰期、降低的免疫原性及/或改良的功能性(例如，本文所述之功能)。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後至少5天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後至少6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天或16天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後5天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後6天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後7天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後8天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後9天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後10天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA可偵測11天，在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後12天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後13天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後14天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後15天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後16天為可偵測的。circRNA可在組合物中。在一些實施例中，組合物為進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組合物。
稀釋劑(例如非經腸可接受之稀釋劑)為包含非活性溶劑之媒劑，其中可稀釋或溶解本文所述之組合物(例如包含環狀多核糖核苷酸之組合物)。稀釋劑可為RNA增溶劑、緩衝劑、等張劑或其混合物。稀釋劑可為液體稀釋劑或固體稀釋劑。液體稀釋劑之非限制性實例包括水或其他溶劑、增溶劑及乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及脫水山梨糖醇之脂肪酸酯及1,3-丁二醇。固體稀釋劑之非限制性實例包括碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸二鈣、硫酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸鈉乳糖、蔗糖、纖維素、微晶纖維素、高嶺土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化鈉、乾澱粉、玉米澱粉或糖粉。
在一些實施例中，非經腸遞送系統進一步包含載劑。載劑為藉由環狀多核糖核苷酸之共價修飾、經由部分或完全囊封劑或其組合促進如本文所述之環狀多核糖核苷酸運輸或遞送至細胞中的化合物、組合物、試劑或分子。載劑之非限制性實例包括碳水化合物載劑(例如經酸酐修飾之植物糖原或糖原型材料)、奈米粒子(例如囊封或共價連接結合至環狀多核糖核苷酸之奈米粒子)、脂質體、融質體、離體分化之網狀紅血球、胞外體、蛋白質載劑(例如共價連接至環狀多核糖核苷酸之蛋白質)或陽離子型載劑(例如陽離子型脂質聚合物或轉染試劑)。 醫藥組合物
本發明包括非經腸遞送系統之如本文所揭示之環狀多核糖核苷酸與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑組合作為醫藥組合物。醫藥學上可接受之賦形劑可為非載劑賦形劑。非載劑賦形劑充當組合物(諸如本文所述之環狀多核糖核苷酸)之媒劑或介質。非載劑賦形劑之非限制性實例包括溶劑、水性溶劑、非水性溶劑、分散介質、稀釋劑、分散體、懸浮助劑、表面活性劑、等張劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、玻尿酸酶、分散劑、成粒劑、崩解劑、黏合劑、緩衝劑(例如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS))、潤滑劑、油及其混合物。非載劑賦形劑可為經美國食品藥物管理局(FDA)批准且列於非活性成分資料庫中之不表現出細胞穿透作用之非活性成分中之任一者。醫藥學上可接受之賦形劑可視情況包含一或多種活性物質，例如治療及/或預防活性物質。本發明之醫藥組合物可為無菌及/或無熱原質的。調配及/或製造醫藥劑之一般考慮因素可見於例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy第21版, Lippincott Williams & Wilkins, 2005，其以引用的方式併入本文中。
本文所述之醫藥組合物可用於治療學及獸醫學中。在一些實施例中，本文提供之醫藥組合物(例如，包含如本文所述之環狀多核糖核苷酸)適合於向個體投與，其中該個體為非人類動物，例如適合於獸醫學用途。對適合於向人類投與之醫藥組合物進行修飾以使該等組合物適合於向各種動物投與為很好理解的，且一般熟練的獸醫藥理學家可僅藉由普通實驗(若存在)設計及/或進行此類修飾。考慮投與醫藥組合物之個體包括但不限於任何動物，諸如人類及/或其他靈長類動物；哺乳動物，包括商業上相關的哺乳動物，例如寵物及家畜動物，諸如牛、豬、馬、綿羊、山羊、貓、犬、小鼠及/或大鼠；及/或禽類，包括商業上相關的禽類，諸如鸚鵡、家禽、雞、鴨、鵝、母雞或公雞及/或火雞；動物園動物，例如貓科動物；非哺乳動物，例如爬行動物、魚、兩棲動物等。
本文所述之醫藥組合物的調配物可藉由藥理學技術中已知或此後開發之任何方法來製備。一般而言，此類製備方法包括使活性成分與賦形劑及/或一或多種其他附屬成分結合，且隨後必要時及/或需要時將產物分割、成型及/或封裝之步驟。
本文所述之醫藥組合物可呈適合於單次投與精確劑量之單位劑型。在單位劑型中，將調配物分成含有適量一或多種化合物的單位劑量。單位劑量可呈含有離散量調配物之封裝形式。非限制性實例為封裝的可注射劑、小瓶或安瓿。水性懸浮液組合物可封裝於不可再封閉之單劑量容器中。可使用可再封閉的多劑量容器，例如與防腐劑組合或不與防腐劑組合。注射用調配物可以單位劑型呈現，例如以安瓿或具有防腐劑之多劑量容器呈現。 活體內遞送方法
本發明包括活體內遞送環狀多核糖核苷酸及其組合物之方法。在一些實施例中，活體內遞送環狀多核糖核苷酸之方法包含向個體非經腸投與該環狀多核糖核苷酸或其組合物，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。在一些實施例中，活體內遞送環狀多核糖核苷酸之方法包含向個體非經腸投與該環狀多核糖核苷酸或其組合物，其中該環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸且包含結合目標之序列。在實施例中，環狀多核糖核苷酸之量有效引起個體之生物反應。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸之量有效地在個體中具有生物反應。
在一些實施例中，如本文所述之活體內遞送方法為將環狀多核糖核苷酸或其組合物活體內遞送至個體之細胞或組織的方法，其包含向該細胞或組織非經腸投與該環狀多核糖核苷酸或其組合物，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。在一些實施例中，如本文所述之活體內遞送方法為將環狀多核糖核苷酸或其組合物活體內遞送至個體之細胞或組織的方法，其包含向該細胞或組織非經腸投與該環狀多核糖核苷酸或其組合物，其中該環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸且包含結合目標之序列。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之投與使用本文所述之任何遞送方法進行。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係經由靜脈內注射向個體投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與包括但不限於產前投與、新生兒投與、產後投與、經口、藉由注射(例如靜脈內、動脈內、腹膜內、皮內、皮下及肌肉內)、藉由經眼投與及藉由鼻內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為產前投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為新生兒投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為產後投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係經口。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由注射。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由靜脈內注射。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由動脈內注射。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由腹膜內注射。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由皮內注射。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由皮下注射。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由肌肉內注射。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由經眼投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為鼻內投與。在一些實施例中，組合物係非經腸投與且包含載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為產前投與且包含載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為新生兒投與且包含載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為產後投與且包含載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係經口且包含載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由注射且包含載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由靜脈內注射且包含載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由動脈內注射且包含載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由腹膜內注射且包含載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由皮內注射且包含載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由皮下注射且包含載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由肌肉內注射且包含載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由經眼投與且包含載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為鼻內投與且包含載劑。在一些實施例中，組合物係非經腸投與且包含稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為產前投與且包含稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為新生兒投與且包含稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為產後投與且包含稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係經口且包含稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由注射且包含稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由靜脈內注射且包含稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由動脈內注射且包含稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由腹膜內注射且包含稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由皮內注射且包含稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由皮下注射且包含稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由肌肉內注射且包含稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由經眼投與且包含稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為鼻內投與且包含稀釋劑。在一些實施例中，組合物係非經腸投與且包含非經腸可接受之稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為產前投與且包含非經腸可接受之稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為新生兒投與且包含非經腸可接受之稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為產後投與且包含非經腸可接受之稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係經口且包含非經腸可接受之稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由注射且包含非經腸可接受之稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由靜脈內注射且包含非經腸可接受之稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由動脈內注射且包含非經腸可接受之稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由腹膜內注射且包含非經腸可接受之稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由皮內注射且包含非經腸可接受之稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由皮下注射且包含非經腸可接受之稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由肌肉內注射且包含非經腸可接受之稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由經眼投與且包含非經腸可接受之稀釋劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為鼻內投與且包含非經腸可接受之稀釋劑。在一些實施例中，組合物係非經腸投與且缺乏載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為產前投與且缺乏載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為新生兒投與且缺乏載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為產後投與且缺乏載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係經口且缺乏載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由注射且缺乏載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由靜脈內注射且缺乏載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由動脈內注射且缺乏載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由腹膜內注射且缺乏載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由皮內注射且缺乏載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由皮下注射且缺乏載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由肌肉內注射且缺乏載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與係藉由經眼投與且缺乏載劑。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸或其組合物之非經腸投與為鼻內投與且缺乏載劑。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸在製造非經腸組合物中之用途為用於遞送至個體之細胞或組織，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。在一些實施例中，非經腸組合物經調配用於靜脈內、肌肉內、經眼或局部投與。在一些實施例中，非經腸組合物為進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組合物。在一些實施例中，非經腸組合物包含載劑。在一些實施例中，非經腸組合物包含非經腸可接受之稀釋劑且不含任何載劑。在一些實施例中，非經腸組合物之環狀多核糖核苷酸與目標形成複合物，且環狀多核糖核苷酸或目標在遞送後至少5天為可偵測的。在一些實施例中，複合物之環狀多核糖核苷酸或複合物之目標在遞送後至少7、8、9或10天為可偵測的。在一些實施例中，非經腸組合物之環狀多核糖核苷酸在遞送後存在至少五天。在一些實施例中，非經腸組合物之環狀多核糖核苷酸在遞送後存在至少6、7、8、9或10天。在一些實施例中，非經腸組合物之環狀多核糖核苷酸為未經修飾之環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，非經腸組合物之環狀多核糖核苷酸具有準雙股二級結構。在一些實施例中，序列為具有結合目標之二級結構的適體序列。在一些實施例中，適體序列進一步具有結合目標之三級結構。在一些實施例中，非經腸組合物之環狀多核糖核苷酸缺乏多A序列、缺乏複製元件、缺乏自由3'端或缺乏RNA聚合酶識別模體或其任何組合。在一些實施例中，非經腸組合物之環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸進一步包含表現序列。在一些實施例中，非經腸組合物之環狀多核糖核苷酸包含終止元件或IRES，或其組合。
在一些實施例中，細胞為真核細胞。在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞為人類細胞。在一些實施例中，細胞為動物細胞。在一些實施例中，細胞為免疫細胞。在一些實施例中，細胞為家畜細胞。在一些實施例中，組織為結締組織。在一些實施例中，組織為肌肉組織。在一些實施例中，組織為神經組織。在一些實施例中，組織為上皮組織。在一些實施例中，個體為哺乳動物。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，個體為寵物。在一些實施例中，個體為家畜動物。 遞送
如本文所述之非經腸遞送系統及遞送方法包含環狀多核糖核苷酸之組合物及非經腸投與之方法。非經腸遞送系統可包含環狀多核糖核苷酸及非經腸可接受之稀釋劑或賦形劑。在一些實施例中，遞送系統包含載劑。在一些實施例中，遞送系統不含任何載劑。在一些實施例中，組合物或醫藥組合物包含環狀多核糖核苷酸及非經腸可接受之稀釋劑。在一些實施例中，組合物或醫藥組合物進一步不含任何載劑。如本文所揭示之方法包括活體內遞送如本文所揭示之環狀多核糖核苷酸、如本文所揭示之組合物或如本文所揭示之醫藥組合物的方法，其包含向個體之細胞或組織或向個體非經腸投與該環狀多核糖核苷酸、組合物或醫藥組合物。
如本文所述之醫藥組合物可經調配以例如包括醫藥賦形劑或載劑。醫藥載劑可為膜、脂質雙層及/或聚合物載劑，例如脂質體或粒子，諸如奈米粒子，例如脂質奈米粒子，且藉由已知方法，諸如經由環狀多核糖核苷酸之部分或完全囊封遞送至有需要之個體(例如人類或非人類農業動物或家畜，例如牛、犬、貓、馬、家禽)。
此類方法包括但不限於轉染(例如脂質介導、陽離子聚合物、磷酸鈣、樹枝狀聚合物)；病毒遞送(例如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒、AAV)、融合基因、原生質體融合、胞外體介導之轉移、脂質奈米粒子介導之轉移及其任何組合。陽離子脂質介導之蛋白質遞送可在活體外及活體內實現基於蛋白質之有效基因體編輯。Nat Biotechnol. 2014年10月30日; 33(1):73-80。遞送方法亦描述於例如Gori等人, Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy. Human Gene Therapy. 2015年7月, 26(7): 443-451. doi:10.1089/hum.2015.074；及Zuris等人。
其他遞送方法包括電穿孔(例如使用流式電穿孔裝置)或其他膜破壞方法(例如核轉染)、顯微注射、微彈轟擊(「基因槍」)、直接音波負載、細胞擠壓、光轉染、刺穿感染、磁轉染及其任何組合。舉例而言，流式電穿孔裝置包含用於容納待電穿孔細胞，諸如本文所述之細胞(例如經分離細胞)之懸浮液的腔室，該腔室至少部分地由對立的可充電電極界定，其中該腔室之熱阻小於約110℃/瓦。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、組合物或醫藥組合物可以裸遞送調配物形式遞送。裸遞送調配物不借助於載劑且不進行共價修飾或部分或完整囊封環狀多核糖核苷酸的情況下將環狀多核糖核苷酸或蛋白質遞送至細胞。
裸遞送調配物為不含載劑之調配物，且其中環狀多核糖核苷酸沒有與有助於遞送至細胞之部分結合之共價修飾或沒有部分或完整囊封環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，沒有與有助於遞送至細胞之部分結合之共價修飾的環狀多核糖核苷酸未與有助於遞送至細胞之蛋白質、小分子、粒子、聚合物或生物聚合物共價結合。沒有與有助於遞送至細胞之部分結合之共價修飾的環狀多核糖核苷酸不含例如經修飾之磷酸酯基，諸如硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯、氫膦酸酯、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。
在一些實施例中，裸遞送調配物可不含以下任一者或全部：轉染試劑、陽離子型載劑、碳水化合物載劑、奈米粒子載劑或蛋白質載劑。舉例而言，裸遞送調配物可不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、經酸酐修飾之植物糖原β-糊精、脂染胺、聚乙烯亞胺、聚(三亞甲基亞胺)、聚(四亞甲基亞胺)、聚伸丙亞胺、胺基醣苷-聚胺、二去氧基-二胺基-b-環糊精、精胺、亞精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基胺基)乙酯、聚(離胺酸)、聚(組胺酸)、聚(精胺酸)、陽離子化明膠、樹枝狀聚合物、殼聚醣、l,2-二油醯基-3-三甲銨-丙烷(DOTAP)、氯化N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲銨(DOTMA)、氯化l-[2-(油醯基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥基乙基)咪唑啉鎓(DOTIM)、2,3-二油基氧基-N-[2(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-l-丙銨三氟乙酸鹽(DOSPA)、3B-[N-(N\N'-二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基]膽固醇鹽酸鹽(DC-膽固醇HC1)、二(十七烷基)醯胺基甘胺醯基亞精胺(DOGS)、溴化N,N-二硬脂基-N,N-二甲胺(DDAB)、溴化N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥基乙基銨(DMRIE)、氯化N,N-二油基-N,N-二甲胺(DODAC)、人類血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白。
裸遞送調配物可包含非載劑賦形劑。在一些實施例中，非載劑賦形劑可包含非活性成分。在一些實施例中，非載劑賦形劑可包含緩衝劑，例如PBS。在一些實施例中，非載劑賦形劑可為溶劑、非水性溶劑、稀釋劑(例如非經腸可接受之稀釋劑)、懸浮助劑、表面活性劑、等張劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、玻尿酸酶、分散劑、成粒劑、崩解劑、黏合劑、緩衝劑、潤滑劑或油。
在一些實施例中，裸遞送調配物可包含稀釋劑(例如非經腸可接受之稀釋劑)。稀釋劑可為液體稀釋劑或固體稀釋劑。在一些實施例中，稀釋劑可為RNA增溶劑、緩衝劑或等張劑。RNA增溶劑之實例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲醯胺及2-丙醇。緩衝劑之實例包括2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、Bis-Tris、2-[(2-胺基-2-側氧基乙基)-(羧甲基)胺基]乙酸(ADA)、N-(2-乙醯胺基)-2-胺基乙磺酸(ACES)、哌𠯤-N,N'-雙(2-乙磺酸) (PIPES)、2-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]乙磺酸(TES)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羥乙基)-1-哌𠯤乙磺酸(HEPES)、Tris、Tricine、Gly-Gly、Bicine或磷酸鹽。等張劑之實例包括甘油、甘露糖醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖或蔗糖。
本發明進一步關於包含如本文所述之環狀多核糖核苷酸、組合物或醫藥組合物的宿主或宿主細胞。在一些實施例中，脊椎動物、哺乳動物(例如人類)或其他生物體或細胞。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、組合物或醫藥組合物在宿主中為非免疫原性的。在一些實施例中，與由參考化合物(例如對應於所述環狀多核糖核苷酸之線性多核苷酸或缺乏隱源子之環狀多核糖核苷酸)引發之反應相比，環狀多核糖核苷酸、組合物或醫藥組合物之宿主免疫系統的反應降低或未能產生。一些免疫反應包括但不限於體液免疫反應(例如抗原特異性抗體之產生)及細胞介導之免疫反應(例如淋巴細胞增殖)。
在一些實施例中，宿主或宿主細胞與環狀多核糖核苷酸、組合物或醫藥組合物接觸(例如遞送至或投與至)。在一些實施例中，宿主為哺乳動物，諸如人類。宿主中環狀多核糖核苷酸、表現產物或兩者之量可在投與後之任何時間量測。在某些實施例中，確定宿主在培養物中生長之時程。若在環狀多核糖核苷酸或蛋白質、或表現產物或兩者之存在下，生長增加或減少，則確定環狀多核糖核苷酸或蛋白質、或表現產物或兩者對增加或減少宿主之生長有效。 遞送方法
將如本文所述之環狀多核糖核苷酸或如本文所述之其組合物遞送至細胞、組織或個體的方法包含向個體之細胞或組織或向個體非經腸投與如本文所述之環狀多核糖核苷酸或其組合物。
在一些實施例中，遞送方法為活體內方法。舉例而言，遞送如本文所述之環狀多核糖核苷酸的方法包含向有需要之個體非經腸投與如本文所述之環狀多核糖核苷酸、組合物或醫藥組合物。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸之量有效地對個體之細胞或組織產生生物效應。在一些實施例中，如本文所述之醫藥組合物包含載劑。在一些實施例中，如本文所述之醫藥組合物包含稀釋劑且不含任何載劑。在一些實施例中，非經腸投與為靜脈內、肌肉內、經眼或局部投與。在一些實施例中，非經腸投與為靜脈內投與。在一些實施例中，非經腸投與為肌肉內投與。在一些實施例中，非經腸投與為經眼投與。在一些實施例中，非經腸投與為局部投與。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係非經腸投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係經口投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係經鼻投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係藉由吸入投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係局部投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係經眼投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係經直腸投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係藉由注射投與。投與可為全身投與或局部投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係靜脈內、動脈內、腹膜內、皮內、顱內、鞘內、淋巴內、皮下或肌肉內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係經由眼內投與、耳蝸內(內耳)投與或氣管內投與來投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係靜脈內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係動脈內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係腹膜內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係皮內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係顱內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係鞘內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係淋巴內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係皮下投與。在一些實施例中，投與環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係肌肉內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係經由眼內投與來投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係經由耳蝸內(內耳)投與來投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係經由氣管內投與來投與。在一些實施例中，如本文所述之遞送方法中之任一者係用載劑進行。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係用載劑靜脈內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係用載劑動脈內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係用載劑腹膜內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係用載劑皮內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係用載劑顱內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係用載劑鞘內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係用載劑淋巴內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係用載劑皮下投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係用載劑投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係用載劑肌肉內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係用載劑經由眼內投與來投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係用載劑經由耳蝸內(內耳)投與來投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係用載劑經由氣管內投與來投與。在一些實施例中，如本文所述之任何遞送方法係在不借助於載劑之情況下在裸遞送調配物中進行。在一些實施例中，如本文所述之遞送方法中之任一者係在不借助於載劑之情況下在裸遞送調配物中進行。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係在不借助於載劑之情況下在裸遞送調配物中靜脈內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係在不借助於載劑之情況下在裸遞送調配物中動脈內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係在不借助於載劑之情況下在裸遞送調配物中腹膜內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係在不借助於載劑之情況下在裸遞送調配物中皮內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係在不借助於載劑之情況下在裸遞送調配物中顱內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係在不借助於載劑之情況下在裸遞送調配物中鞘內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係在不借助於載劑之情況下在裸遞送調配物中淋巴內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係在不借助於載劑之情況下在裸遞送調配物中皮下投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係在不借助於載劑之情況下在裸遞送調配物中投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係在不借助於載劑之情況下在裸遞送調配物中肌肉內投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係在不借助於載劑之情況下在裸遞送調配物中經由眼內投與來投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係在不借助於載劑之情況下在裸遞送調配物中經由耳蝸內(內耳)投與來投與。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係在不借助於載劑之情況下在裸遞送調配物中經由氣管內投與來投與。 基於細胞及囊泡之載劑
如本文所述之環狀多核糖核苷酸、組合物或醫藥組合物可在基於囊泡或其他膜之載劑中向細胞投與。
在實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物係在基於細胞、囊泡或其他膜之載劑中或經由該載劑投與。在一個實施例中，環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物可調配於脂質體或其他類似囊泡中。脂質體為由圍繞內部水性區室之單層或多層脂質雙層及相對不可滲透之外部親脂性磷脂雙層構成的球狀囊泡結構。脂質體可為陰離子、中性或陽離子的。脂質體具有生物相容性，無毒性，可遞送親水性及親脂性藥物分子，保護其負荷不被血漿酶降解，且將其負載轉運穿過生物膜及血腦屏障(BBB) (關於綜述，參見例如Spuch及Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章ID 469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679)。
囊泡可由數種不同類型的脂質製成；然而，磷脂最常用於生成脂質體作為藥物載劑。用於製備多層囊泡脂質之方法為此項技術中已知的(參見例如美國專利第6,693,086號，其關於多層囊泡脂質製備之教示內容以引用的方式併入本文中)。雖然當脂質膜與水溶液混合時，囊泡形成可為自發的，但其亦可藉由使用均質機、音波處理器或擠出設備以震盪形式施加力來加快(關於綜述，參見例如Spuch及Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 文章ID 469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679)。擠壓脂質可藉由擠壓穿過尺寸減小之過濾器來製備，如Templeton等人, Nature Biotech, 15:647-652, 1997中所述，其中與擠壓脂質製備有關之教示內容以引用之方式併入本文中。
脂質奈米粒子為載劑之另一個實例，其為如本文所述之環狀多核糖核苷酸分子或其醫藥組合物提供生物相容且可生物降解之遞送系統。奈米結構脂質載劑(NLC)為經修飾之固體脂質奈米粒子(SLN)，其保留SLN之特徵、提高藥物穩定性及裝載能力且防止藥物滲漏。聚合物奈米粒子(PNP)為藥物遞送之重要組成部分。此等奈米粒子可有效地將藥物遞送引導至特定目標，且改良藥物穩定性及受控藥物釋放。亦可採用脂質-聚合物奈米粒子(PLN)，其為組合脂質體及聚合物之一種新型載劑。此等奈米粒子具有PNP及脂質體之互補優點。PLN由核-殼結構構成；聚合物核提供穩定結構，且磷脂殼提供良好生物相容性。因此，兩種組分增加藥物囊封效率，便於表面修飾，且防止水溶性藥物滲漏。關於綜述，參見例如Li等人 2017, Nanomaterials 7, 122; doi:10.3390/nano7060122。
載劑之額外非限制性實例包括碳水化合物載劑(例如經酸酐修飾之植物糖原或糖原型材料)、蛋白質載劑(例如共價連接至環狀多核糖核苷酸之蛋白質)或陽離子型載劑(例如陽離子型脂質聚合物或轉染試劑)。碳水化合物載劑之非限制性實例包括植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精及經酸酐修飾之植物糖原β-糊精。陽離子型載劑之非限制性實例包括脂染胺、聚乙烯亞胺、聚(三亞甲基亞胺)、聚(四亞甲基亞胺)、聚伸丙亞胺、胺基醣苷-聚胺、二去氧基-二胺基-b-環糊精、精胺、亞精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基胺基)乙酯、聚(離胺酸)、聚(組胺酸)、聚(精胺酸)、陽離子化明膠、樹枝狀聚合物、殼聚醣、l,2-二油醯基-3-三甲銨-丙烷(DOTAP)、氯化N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲銨(DOTMA)、氯化l-[2-(油醯基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥基乙基)咪唑啉鎓(DOTIM)、2,3-二油基氧基-N-[2(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-l-丙銨三氟乙酸鹽(DOSPA)、3B-[N-(N\N'-二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基]膽固醇鹽酸鹽(DC-膽固醇HC1)、二(十七烷基)醯胺基甘胺醯基亞精胺(DOGS)、溴化N,N-二硬脂基-N,N-二甲胺(DDAB)、溴化N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥基乙基銨(DMRIE)及氯化N,N-二油基-N,N-二甲胺(DODAC)。蛋白質載劑之非限制性實例包括人類血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白。
胞外體亦可用作本文所述之環狀多核糖核苷酸分子或其醫藥組合物的藥物遞送媒劑。關於綜述，參見Ha等人2016年7月. Acta Pharmaceutica Sinica B. 第6卷, 第4期, 第287-296頁；https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。
離體分化之紅血球亦可用作本文所述之環狀多核糖核苷酸分子或其醫藥組合物的載劑。參見例如WO2015073587；WO2017123646；WO2017123644；WO2018102740；wO2016183482；WO2015153102；WO2018151829；WO2018009838；Shi等人2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136；美國專利9,644,180；Huang等人2017. Nature Communications 8: 423；Shi等人2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136。
融質體組合物，如WO2018208728中所述，亦可用作載劑以遞送本文所述之環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物。
病毒體及病毒樣粒子(VLP)亦可用作載劑以將本文所述之環狀多核糖核苷酸、其組合物或其醫藥組合物遞送至所靶向之細胞。
植物奈米囊泡及植物信使包裝(PMP)，如國際專利公開案第WO2011097480號、第WO2013070324號、第WO2017004526號或第WO2020041784號中所述，亦可用作載劑以遞送如本文所述之環狀RNA。
微泡亦可用作載劑以遞送本文所述之環狀多核糖核苷酸分子。微泡亦可用作載劑以遞送本文所述之線性多核糖核苷酸。參見例如US7115583；Beeri, R.等人, Circulation. 2002年10月1日;106(14):1756-1759；Bez, M.等人, Nat Protoc. 2019年4月; 14(4): 1015-1026；Hernot, S.等人, Adv Drug Deliv Rev. 2008年6月30日; 60(10): 1153-1166；Rychak, J.J.等人, Adv Drug Deliv Rev. 2014年6月; 72: 82-93。在一些實施例中，微泡為白蛋白塗佈之全氟碳微泡。
絲蛋白亦可用作載劑以遞送本文所述之環狀多核糖核苷酸分子。參見例如Boopathy, A.V.等人, PNAS. 116.33 (2019): 16473-1678；及He, H.等人, ACS Biomater. Sci. Eng. 4.5(2018): 1708-1715。 環狀多核糖核苷酸
本文所述之環狀多核糖核苷酸(circRNA)為經由共價或非共價鍵形成連續結構之多核糖核苷酸。
本文所述之本發明包括包含合成circRNA之組合物及其使用方法。由於環狀結構，與相應的線性RNA相比，circRNA可具有改良的穩定性、增加的半衰期、降低的免疫原性及/或改良的功能性(例如，本文所述之功能)。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後至少5天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後至少6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天或16天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後6天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後7天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後8天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後9天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後10天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後11天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後12天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後13天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後14天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後15天為可偵測的。在一些實施例中，環狀RNA在將環狀RNA遞送至細胞後16天為可偵測的。環狀RNA可使用此項技術中已知的任何技術來偵測。
在一些實施例中，circRNA結合一或多個目標。在一些實施例中，circRNA為環狀適體。在一個實施例中，circRNA包含一或多個結合位點，其與一或多個目標結合。在一個實施例中，circ RNA包含適體序列。在一個實施例中，circRNA結合DNA目標及蛋白質目標，且例如介導轉錄。在另一個實施例中，circRNA使蛋白質複合物聚集在一起，且例如介導轉譯後修飾或信號轉導。在另一個實施例中，circRNA結合兩個或更多個不同目標，諸如蛋白質，且例如將此等蛋白質穿梭至細胞質，或介導一或多個目標之降解。
在一些實施例中，circRNA結合DNA、RNA及蛋白質中之至少一者，從而調控細胞過程(例如，改變蛋白質表現、調節基因表現、調節細胞信號傳導等)。在一些實施例中，合成的circRNA包括用於與目標或至少一個所選DNA、RNA或蛋白質的部分(例如結合部分)相互作用的結合位點，從而與內源性對應物競爭結合。
在一些實施例中，環狀RNA形成調控細胞過程(例如，改變蛋白質表現、調節基因表現、調節細胞信號傳導等)之複合物。在一些實施例中，環狀RNA藉由與目標(例如轉錄因子)結合而使細胞對細胞毒性劑(例如化學治療劑)敏感，從而導致細胞生存力降低。舉例而言，使細胞對細胞毒性劑敏感導致在遞送細胞毒性劑及環狀RNA之後細胞生存力降低。在一些實施例中，降低的細胞生存力降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%或其中的任何百分比。
在一些實施例中，複合物在將環狀RNA遞送至細胞後至少5天為可偵測的。在一些實施例中，複合物在將環狀RNA遞送至細胞後至少6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天或16天為可偵測的。在一些實施例中，複合物在將環狀RNA遞送至細胞後6天為可偵測的。在一些實施例中，複合物在將環狀RNA遞送至細胞後7天為可偵測的。在一些實施例中，複合物在將環狀RNA遞送至細胞後8天為可偵測的。在一些實施例中，複合物在將環狀RNA遞送至細胞後9天為可偵測的。在一些實施例中，複合物在將環狀RNA遞送至細胞後10天為可偵測的。在一些實施例中，複合物在將環狀RNA遞送至細胞後11天為可偵測的。在一些實施例中，複合物在將環狀RNA遞送至細胞後12天為可偵測的。在一些實施例中，複合物在將環狀RNA遞送至細胞後13天為可偵測的。在一些實施例中，複合物在將環狀RNA遞送至細胞後14天為可偵測的。在一些實施例中，複合物在將環狀RNA遞送至細胞後15天為可偵測的。在一些實施例中，複合物在將環狀RNA遞送至細胞後16天為可偵測的。
在一個實施例中，合成的circRNA結合及/或螯合miRNA。在另一個實施例中，合成的circRNA結合及/或螯合蛋白質。在另一個實施例中，合成的circRNA結合及/或螯合mRNA。在另一個實施例中，合成的circRNA結合及/或螯合核糖體。在另一個實施例中，合成的circRNA結合及/或螯合circRNA。在另一個實施例中，合成的circRNA結合及/或螯合長非編碼RNA (lncRNA)或任何其他非編碼RNA，例如miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA、長非編碼RNA、shRNA。除結合及/或螯合位點以外，circRNA可包括降解元件，其將導致結合及/或螯合的RNA及/或蛋白質降解。
在一個實施例中，circRNA包含lncRNA或lncRNA之序列，例如，circRNA包含天然存在之非環狀lncRNA之序列或其片段。在一個實施例中，lncRNA或lncRNA之序列在具有或不具有間隔序列之情況下環化，以形成合成的circRNA。
在一個實施例中，circRNA具有核糖核酸酶活性。在一個實施例中，circRNA可用於充當核糖核酸酶且裂解病原性或內源性RNA、DNA、小分子或蛋白質。在一個實施例中，circRNA具有酶活性。在一個實施例中，合成的circRNA能夠特異性識別且裂解RNA (例如病毒RNA)。在另一個實施例中circRNA能夠特異性識別且裂解蛋白質。在另一個實施例中，circRNA能夠特異性識別且降解小分子。
在一個實施例中，circRNA為分解或自裂解或可裂解的circRNA。在一個實施例中，circRNA可用於遞送RNA，例如miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA、長非編碼RNA、shRNA。在一個實施例中，合成的circRNA由微RNA構成，該等微RNA由(1)可自裂解元件(例如錘頭、剪接元件)、(2)裂解募集位點(例如ADAR)、(3)可降解連接子(例如丙三醇)、(4)化學連接子及/或(5)間隔序列分隔開。在另一個實施例中，合成的circRNA由siRNA構成，該等siRNA由(1)可自裂解元件(例如錘頭、剪接元件)、(2)裂解募集位點(例如ADAR)、(3)可降解連接子(例如丙三醇)、(4)化學連接子及/或(5)間隔序列分隔開。
在一個實施例中，circRNA為轉錄/複製勝任型circRNA。此circRNA可編碼任何類型之RNA。在一個實施例中，合成的circRNA具有反義miRNA及轉錄元件。在一個實施例中，在轉錄後，由circRNA生成線性功能性miRNA。在一個實施例中，circRNA為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸。
在一個實施例中，circRNA具有以上屬性中之一或多者以及轉譯元件。
在一些實施例中，circRNA包含至少一個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，circRNA包含至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%經修飾之核苷酸。在一些實施例中，circRNA包含基本上全部(例如，大於80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%，或約100%)經修飾之核苷酸。在一些實施例中，circRNA包含經修飾之核苷酸及一部分未經修飾之連續核苷酸，其可稱為經雜交修飾之circRNA。一部分未經修飾之連續核苷酸可為經雜交修飾之circRNA中未經修飾之結合位點，其經組態以結合蛋白質、DNA、RNA或細胞目標。一部分未經修飾之連續核苷酸可為經雜交修飾之circRNA中未經修飾之IRES。在其他實施例中，circRNA缺乏經修飾之核苷酸，其可稱為未經修飾之circRNA。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸除包含結合位點(例如與目標結合之序列)以外，亦包含如本文所述之元件中之一或多者。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸缺乏多A尾。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸缺乏複製元件。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸缺乏IRES。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸缺乏帽。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸除結合位點以外，亦包含如WO2019/118919 (其以全文引用之方式併入本文中)中所揭示之任何特徵或特徵之任何組合。 目標
circRNA可包含目標，例如目標之結合部分的至少一個結合位點。circRNA可包含至少一個與目標結合之適體序列。在一些實施例中，circRNA包含一或多個目標之一或多個結合位點。目標包括但不限於核酸(例如RNA、DNA、RNA-DNA雜交體)、小分子(例如藥物、螢光團、代謝物)、適體、多肽、蛋白質、脂質、碳水化合物、抗體、病毒、病毒粒子、膜、多組分複合物、細胞器、細胞、其他細胞部分、其任何片段及其任何組合。(參見例如Fredriksson等人, (2002) Nat Biotech 20:473-77；Gullberg等人, (2004) PNAS, 101:8420-24)。舉例而言，目標為單股RNA、雙股RNA、單股DNA、雙股DNA、包含一或多個雙股區及一或多個單股區之DNA或RNA、RNA-DNA雜交體、小分子、適體、多肽、蛋白質、脂質、碳水化合物、抗體、抗體片段、抗體混合物、病毒粒子、膜、多組分複合物、細胞、細胞部分、其任何片段或其任何組合。
在一些實施例中，目標為多肽、蛋白質或其任何片段。舉例而言，目標可為經純化之多肽、經分離之多肽、融合標記之多肽、附接至或跨越細胞或病毒或病毒體之膜的多肽、細胞質蛋白、細胞內蛋白、細胞外蛋白、激酶、酪胺酸激酶、絲胺酸/蘇胺酸激酶、磷酸酶、芳香酶、磷酸二酯酶、環化酶、解螺旋酶、蛋白酶、氧化還原酶、還原酶、轉移酶、水解酶、解離酶、異構酶、醣苷酶、細胞外基質蛋白、連接酶、泛素連接酶、任何影響轉譯後修飾之連接酶、離子轉運體、通道、孔隙、凋亡蛋白、細胞黏附蛋白、致病蛋白、異常表現之蛋白、轉錄因子、轉錄調節因子、轉譯蛋白、表觀遺傳因子、表觀遺傳調節因子、染色質調節因子、伴隨蛋白、分泌蛋白、配體、激素、細胞介素、趨化因子、核蛋白、受體、跨膜受體、受體酪胺酸激酶、G蛋白偶合受體、生長因子受體、核受體、激素受體、信號轉導體、抗體、膜蛋白、整合膜蛋白、外周膜蛋白、細胞壁蛋白、球狀蛋白、纖維蛋白、糖蛋白、脂蛋白、染色體蛋白、原癌基因、致癌基因、抑瘤基因、其任何片段或其任何組合。在一些實施例中，目標為異源多肽。在一些實施例中，目標為使用分子技術，諸如轉染在細胞中過度表現之蛋白質。在一些實施例中，目標為重組多肽。舉例而言，目標係在由細菌(例如大腸桿菌)、酵母、動物(例如寵物)、哺乳動物(例如人類、家畜)或昆蟲細胞產生之樣品中(例如由生物體過度表現之蛋白質)。在一些實施例中，目標為具有突變、插入、缺失或多形現象之多肽。在一些實施例中，目標為由細胞(例如，健康細胞或與疾病或病況相關之細胞)天然表現之多肽。在一些實施例中，目標為抗原，諸如用於使生物體免疫或在生物體中產生免疫反應，諸如用於產生抗體之多肽。
在一些實施例中，目標為抗體。抗體可與另一分子之特定空間及極性組織特異性結合。抗體可為單株、多株或重組抗體，且可藉由此項技術中眾所周知的技術來製備，諸如宿主免疫且收集血清(多株)，或藉由製備連續雜交細胞株且收集分泌的蛋白質(單株)，或藉由選殖及表現至少編碼天然抗體之特異性結合所需的胺基酸序列之核苷酸序列或其突變誘發型式。天然存在之抗體可為包含藉由二硫鍵相互連接之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈之蛋白質。各重鏈可由重鏈可變區(VH )及重鏈恆定區構成。重鏈恆定區可包含三個域CH1 、CH2 及CH3 。各輕鏈可包含輕鏈可變區(VL )及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區可包含一個域CL 。VH 區及VL 區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其穿插有稱為構架區(FR)之更保守區。各VH 及VL 由自胺基端至羧基端按以下順序排列之三個CDR及四個FR組成：FR1 、CDR1 、FR2 、CDR2 、FR3 、CDR3 及FR4。抗體恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1 q)的結合。抗體可為任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如lgG1 、lgG2 、lgG3 、lgG4 、lgA1 及lgA2 )、其亞類或修飾型式。抗體可包括完整的免疫球蛋白或其片段。抗體片段可指保留與結合部分(諸如抗原)特異性結合能力之抗體的一或多個片段。另外，亦包括免疫球蛋白或其片段之聚集體、聚合物及接合物，只要維持對特定分子之結合親和力即可。抗體片段之實例包括Fab片段，由VL 、VH 、CL 及CH1 域組成之單價片段；F(ab)2 片段，包含由鉸鏈區之二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段；由VH 及CH1 域組成之Fd片段；由抗體單臂之VL 域及VH 域組成之Fv片段；單域抗體(dAb)片段(Ward等人, (1989) Nature 341 :544-46)，其由VH 域組成；及經分離之CDR及單鏈片段(scFv)，其中VL 區及VH 區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv)；參見例如Bird等人, (1988) Science 242:423-26；及Huston等人, (1988) PNAS 85:5879-83)。因此，抗體片段包括Fab、F(ab)2 、scFv、Fv、dAb及其類似物。雖然兩個域VL 及VH 係由獨立的基因編碼，但其可使用重組方法，藉由使其能夠製成單一蛋白質鏈之人工肽連接子接合。此類單鏈抗體包括一或多個抗原結合部分。抗體可為多價抗體，例如二價、三價、四價、五價、六價、七價或八價抗體。抗體可為多特異性抗體。舉例而言，可例如藉由以重組方式接合任何兩種或更多種抗原結合劑(例如Fab、F(ab)2 、scFv、Fv、IgG)之組合來產生雙特異性、三特異性、四特異性、五特異性、六特異性、七特異性或八特異性抗體。多特異性抗體可用於使兩個或更多個目標緊密接近，例如降解機構及待降解之目標受質，或泛素連接酶及待泛素化之受質。此等抗體片段可使用熟習此項技術者已知的習知技術獲得，且可以與完整抗體相同的方式對片段進行實用性篩選。抗體可為人類、人類化、嵌合、分離、犬、貓、驢、綿羊、任何植物、動物或哺乳動物的。
在一些實施例中，目標為核糖核苷酸及/或去氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)之聚合形式，諸如DNA或RNA (例如mRNA)。DNA包括線性DNA分子(例如限制性片段)、病毒、質體及染色體中發現之雙股DNA。在一些實施例中，多核苷酸目標為單股、雙股、小干擾RNA (siRNA)、信使RNA (mRNA)、轉移RNA (tRNA)、染色體、基因、非編碼基因體序列、基因體DNA (例如片段化基因體DNA)、經純化之多核苷酸、經分離之多核苷酸、雜交多核苷酸、轉錄因子結合位點、粒線體DNA、核糖體RNA、真核多核苷酸、原核多核苷酸、合成的多核苷酸、連接的多核苷酸、重組多核苷酸、含有核酸類似物之多核苷酸、甲基化多核苷酸、去甲基化多核苷酸、其任何片段或其任何組合。在一些實施例中，目標為重組多核苷酸。在一些實施例中，目標為異源多核苷酸。舉例而言，目標為由細菌(例如大腸桿菌)、酵母、哺乳動物或昆蟲細胞產生的多核苷酸(例如與生物體異源的多核苷酸)。在一些實施例中，目標為具有突變、插入、缺失或多形現象之多核苷酸。
在一些實施例中，目標為適體。適體為經分離之核酸分子，其以高特異性及親和力與結合部分或目標分子，諸如蛋白質結合。適體為保持一定構形之三維結構，其提供化學接觸以特異性結合其給定目標。雖然適體為基於核酸之分子，但適體與諸如基因及mRNA之其他核酸分子之間存在基本差異。在後者中，核酸結構經由其線性鹼基序列來編碼資訊，因此，此序列對於資訊儲存之功能至關重要。與此完全相反的是，基於對目標分子之特異性結合的適體功能不完全依賴於保守的線性鹼基序列(非編碼序列)，而是依賴於特定的二級/三級/四級結構。適體可能擁有之任何編碼潛能為偶然的，且不認為在適體與其同源目標之結合中起作用。適體有別於與某些蛋白質結合之天然存在之核酸序列。此等後面的序列為嵌入生物體基因體內之天然存在之序列，其與參與天然存在之核酸的轉錄、轉譯及運輸之專門的蛋白質亞群(例如核酸結合蛋白)結合。另一方面，適體為非天然存在之核酸分子。雖然可鑑別出與核酸結合蛋白結合之適體，但在大多數情況下，此類適體與自然界中由核酸結合蛋白識別之序列幾乎沒有或沒有序列一致性。更重要的是，適體可結合幾乎任何蛋白質(不僅僅為核酸結合蛋白)以及幾乎任何所關注之搭配物，包括小分子、碳水化合物、肽等。對於大部分搭配物，甚至蛋白質，其所結合之天然存在之核酸序列並不存在。對於確實具有此類序列之彼等搭配物，例如核酸結合蛋白，由於與緊密結合之適體相比在自然界中使用之結合親和力相對較低，此類序列將不同於適體。適體能夠與所選搭配物特異性結合，且調節搭配物之活性或結合相互作用，例如經由結合，適體可阻斷其搭配物發揮功能之能力。與搭配物特異性結合之功能特性為適體之固有特性。適體可為6-35 kDa。適體可為20至250個核苷酸。適體可以微莫耳至亞奈莫耳之親和力結合其搭配物，且可對密切相關之目標進行區分(例如，適體可選擇性結合來自同一基因家族之相關蛋白質)。在一些情況下，適體僅結合一個分子。在一些情況下，適體結合所關注分子之家族成員。在一些情況下，適體與多個不同分子結合。適體能夠使用常見的分子間相互作用，諸如氫鍵結、靜電互補、疏水性接觸及空間排阻與特定搭配物結合。適體具有許多用作治療及診斷之所需特徵，包括高特異性及親和力、低免疫原性、生物功效及優異的藥物動力學特性。適體可包含由共價連接之互補多核苷酸雜交形成的分子莖環結構(例如髮夾環結構)。莖包含雜交的多核苷酸，環為共價連接兩個互補多核苷酸之區域。適體可為包含適體序列之線性核糖核酸(例如線性適體)或包含適體序列之環狀多核糖核酸(例如環狀適體)。
在一些實施例中，目標為小分子。舉例而言，小分子可為巨環分子、抑制劑、藥物或化合物。在一些實施例中，小分子含有不超過五個氫鍵供體。在一些實施例中，小分子含有不超過十個氫鍵受體。在一些實施例中，小分子之分子量為500道爾頓或更小。在一些實施例中，小分子之分子量為約180至500道爾頓。在一些實施例中，小分子之辛醇-水分配係數lopP 不超過五。在一些實施例中，小分子之分配係數logP 為-0.4至5.6。在一些實施例中，小分子之莫耳折射率為40至130。在一些實施例中，小分子含有約20至約70個原子。在一些實施例中，小分子之極性表面積為140埃2 或更小。
在一些實施例中，目標為細胞。舉例而言，目標為完整細胞、用化合物(例如藥物)處理之細胞、固定細胞、溶解細胞或其任何組合。在一些實施例中，目標為單個細胞。在一些實施例中，目標為複數個細胞。
在一些實施例中，circRNA包含單個目標或複數個(例如兩個或更多個)目標之結合位點。在一個實施例中，單個circRNA包含單個目標之2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個不同的結合位點。在一個實施例中，單個circRNA包含單個目標之2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個相同的結合位點。在一個實施例中，單個circRNA包含一或多個不同目標之2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個不同的結合位點。在一個實施例中，兩個或更多個目標在樣品中，諸如目標之混合物或庫，且樣品包括包含兩個或更多個與兩個或更多個目標結合之結合位點的circRNA。
在一些實施例中，單個目標或複數個(例如兩個或更多個)目標具有複數個結合部分。在一個實施例中，單個目標可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個結合部分。在一個實施例中，兩個或更多個目標在樣品中，諸如目標之混合物或庫，且樣品包含兩個或更多個結合部分。在一些實施例中，單個目標或複數個目標包含複數個不同結合部分。舉例而言，複數個可包括至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、25,000或30,000個結合部分。
目標可包含複數個結合部分，其包含至少2個不同結合部分。舉例而言，結合部分可包含複數個結合部分，其包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000或25,000個不同結合部分。 結合位點及結合部分
在一些情況下，circRNA包含一個結合位點。結合位點可包含適體序列。在一些情況下，circRNA包含至少兩個結合位點。舉例而言，circRNA可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個結合位點。在一些實施例中，本文所述之circRNA為結合一或多個目標或一或多個目標之一或多個結合部分的分子骨架。各目標可為但不限於不同或相同的核酸(例如RNA、DNA、RNA-DNA雜交體)、小分子(例如藥物)、適體、多肽、蛋白質、脂質、碳水化合物、抗體、病毒、病毒粒子、膜、多組分複合物、細胞、細胞部分、其任何片段及其任何組合。在一些實施例中，一或多個結合位點與同一目標結合。在一些實施例中，一或多個結合位點與同一目標之一或多個結合部分結合。在一些實施例中，一或多個結合位點與一或多個不同目標結合。在一些實施例中，一或多個結合位點與不同目標之一或多個結合部分結合。在一些實施例中，circRNA充當結合一或多個目標之骨架。在一些實施例中，circRNA充當一或多個目標之一或多個結合部分的骨架。在一些實施例中，circRNA藉由與一或多個目標特異性結合來調節細胞過程。在一些實施例中，circRNA藉由與一或多個目標之一或多個結合部分特異性結合來調節細胞過程。在一些實施例中，circRNA藉由與一或多個目標特異性結合來調節細胞過程。在一些實施例中，本文所述之circRNA包括一或多個所關注之特定目標的結合位點。在一些實施例中，circRNA包括各所關注之目標的多個結合位點或結合位點之組合。在一些實施例中，circRNA包括各所關注之結合部分的多個結合位點或結合位點之組合。舉例而言，circRNA可包括多肽目標之一或多個結合位點。在一些實施例中，circRNA包括多核苷酸目標，諸如DNA或RNA、mRNA目標、rRNA目標、tRNA目標或基因體DNA目標之一或多個結合位點。
在一些情況下，circRNA包含單股DNA之結合位點。在一些情況下，circRNA包含雙股DNA之結合位點。在一些情況下，circRNA包含抗體之結合位點。在一些情況下，circRNA包含病毒粒子之結合位點。在一些情況下，circRNA包含小分子之結合位點。在一些情況下，circRNA包含在細胞內或細胞上結合之結合位點。在一些情況下，circRNA包含RNA-DNA雜交體之結合位點。在一些情況下，circRNA包含甲基化多核苷酸之結合位點。在一些情況下，circRNA包含未甲基化多核苷酸之結合位點。在一些情況下，circRNA包含適體之結合位點。在一些情況下，circRNA包含多肽之結合位點。在一些情況下，circRNA包含多肽、蛋白質、蛋白質片段、經標記之蛋白質、抗體、抗體片段、小分子、病毒粒子(例如包含跨膜蛋白之病毒粒子)或細胞的結合位點。在一些情況下，circRNA包含單股DNA上之結合部分的結合位點。在一些情況下，circRNA包含雙股DNA上之結合部分的結合位點。在一些情況下，circRNA包含抗體上之結合部分的結合位點。在一些情況下，circRNA包含病毒粒子上之結合部分的結合位點。在一些情況下，circRNA包含小分子上之結合部分的結合位點。在一些情況下，circRNA包含細胞內或細胞上之結合部分的結合位點。在一些情況下，circRNA包含RNA-DNA雜交體上之結合部分的結合位點。在一些情況下，circRNA包含甲基化多核苷酸上之結合部分的結合位點。在一些情況下，circRNA包含未甲基化多核苷酸上之結合部分的結合位點。在一些情況下，circRNA包含適體上之結合部分的結合位點。在一些情況下，circRNA包含多肽上之結合部分的結合位點。在一些情況下，circRNA包含多肽、蛋白質、蛋白質片段、經標記之蛋白質、抗體、抗體片段、小分子、病毒粒子(例如包含跨膜蛋白之病毒粒子)或細胞上之結合部分的結合位點。
在一些情況下，結合位點與目標之包含至少兩個醯胺鍵的一部分結合。在一些情況下，結合位點不與目標之包含磷酸二酯鍵的一部分結合。在一些情況下，目標之一部分不為DNA或RNA。在一些情況下，結合部分包含至少兩個醯胺鍵。在一些情況下，結合部分不包含磷酸二酯鍵。在一些情況下，結合部分不為DNA或RNA。
本文提供之circRNA可包括複合物上之結合部分的一或多個結合位點。本文提供之circRNA可包括目標之一或多個結合位點以形成複合物。舉例而言，本文提供之circRNA可充當骨架以在circRNA與目標之間形成複合物。在一些實施例中，circRNA與單個目標形成複合物。在一些實施例中，circRNA與兩個目標形成複合物。在一些實施例中，circRNA與三個目標形成複合物。在一些實施例中，circRNA與四個目標形成複合物。在一些實施例中，circRNA與五個或更多個目標形成複合物。在一些實施例中，circRNA與兩個或更多個目標之複合物形成複合物。在一些實施例中，circRNA與三個或更多個目標之複合物形成複合物。在一些實施例中，兩個或更多個circRNA與單個目標形成複合物。在一些實施例中，兩個或更多個circRNA與兩個或更多個目標形成複合物。在一些實施例中，第一circRNA與第一目標之第一結合部分及第二目標之第二不同結合部分形成複合物。在一些實施例中，第一circRNA與第一目標之第一結合部分形成複合物，且第二circRNA與第二目標之第二結合部分形成複合物。
在一些實施例中，circRNA可包括一或多個抗體-多肽複合物、多肽-多肽複合物、多肽-DNA複合物、多肽-RNA複合物、多肽-適體複合物、病毒粒子-抗體複合物、病毒粒子-多肽複合物、病毒粒子-DNA複合物、病毒粒子-RNA複合物、病毒粒子-適體複合物、細胞-抗體複合物、細胞-多肽複合物、細胞-DNA複合物、細胞-RNA複合物、細胞-適體複合物、小分子-多肽複合物、小分子-DNA複合物、小分子-適體複合物、小分子-細胞複合物、小分子-病毒粒子複合物及其組合之結合位點。
在一些實施例中，circRNA可包括一或多個抗體-多肽複合物、多肽-多肽複合物、多肽-DNA複合物、多肽-RNA複合物、多肽-適體複合物、病毒粒子-抗體複合物、病毒粒子-多肽複合物、病毒粒子-DNA複合物、病毒粒子-RNA複合物、病毒粒子-適體複合物、細胞-抗體複合物、細胞-多肽複合物、細胞-DNA複合物、細胞-RNA複合物、細胞-適體複合物、小分子-多肽複合物、小分子-DNA複合物、小分子-適體複合物、小分子-細胞複合物、小分子-病毒粒子複合物及其組合上之一或多個結合部分的結合位點。
在一些情況下，結合位點與多肽、蛋白質或其片段結合。在一些實施例中，結合位點與目標之多肽、蛋白質或其片段的域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。舉例而言，結合位點與經分離之多肽、細胞之多肽、經純化之多肽或重組多肽之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。舉例而言，結合位點與抗體或其片段之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。舉例而言，結合位點與轉錄因子之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。舉例而言，結合位點與受體之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。舉例而言，結合位點與跨膜受體之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點可與分離、純化及/或重組的多肽之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點可與分析物混合物(例如溶解物)之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。舉例而言，結合位點與來自複數個細胞或來自單個細胞之溶解物之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點可與目標之結合部分結合。在一些情況下，結合部分在多肽、蛋白質或其片段上。在一些實施例中，結合部分包含多肽、蛋白質或其片段之域、片段、抗原決定基、區或一部分。舉例而言，結合部分包含經分離之多肽、細胞之多肽、經純化之多肽或重組多肽之域、片段、抗原決定基、區或一部分。舉例而言，結合部分包含抗體或其片段之域、片段、抗原決定基、區或一部分。舉例而言，結合部分包含轉錄因子之域、片段、抗原決定基、區或一部分。舉例而言，結合部分包含受體之域、片段、抗原決定基、區或一部分。舉例而言，結合部分包含跨膜受體之域、片段、抗原決定基、區或一部分。結合部分可位於或包含分離、純化及/或重組的多肽之域、片段、抗原決定基、區或一部分。結合部分包括分析物混合物(例如溶解物)之域、片段、抗原決定基、區或一部分上之結合部分或分析物混合物(例如溶解物)之域、片段、抗原決定基、區或一部分。舉例而言，結合部分位於或包含來自複數個細胞或來自單個細胞之溶解物之域、片段、抗原決定基、區或一部分。
在一些情況下，結合位點與化合物(例如小分子)之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。舉例而言，結合位點與藥物之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。舉例而言，結合位點與化合物之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。舉例而言，結合部分與有機化合物之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。在一些情況下，結合位點與分子量為900道爾頓或更小之小分子之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。在一些情況下，結合位點與分子量為500道爾頓或更大之小分子之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點結合之小分子之部分可獲自例如天然存在或合成的分子庫，包括經由組合方式產生之化合物庫，亦即化合物多樣性組合庫。組合庫以及其生產及篩選方法為此項技術中已知的且描述於：US 5,741,713；5,734,018；5,731,423；5,721,099；5,708,153；5,698,673；5,688,997；5,688,696；5,684,711；5,641,862；5,639,603；5,593,853；5,574,656；5,571,698；5,565,324；5,549,974；5,545,568；5,541,061；5,525,735；5,463,564；5,440,016；5,438,119；5,223,409，其揭示內容以引用的方式併入本文中。結合位點可與小分子之結合部分結合。在一些情況下，結合部分位於或包含小分子之域、片段、抗原決定基、區或一部分。舉例而言，結合部分位於或包含藥物之域、片段、抗原決定基、區或一部分。舉例而言，結合部分位於或包含化合物之域、片段、抗原決定基、區或一部分。舉例而言，結合部分位於或包含有機化合物之域、片段、抗原決定基、區或一部分。在一些情況下，結合部分位於或包含分子量為900道爾頓或更小之小分子之域、片段、抗原決定基、區或一部分。在一些情況下，結合部分位於或包含分子量為500道爾頓或更大之小分子之域、片段、抗原決定基、區或一部分。結合部分可獲自例如天然存在或合成的分子庫，包括經由組合方式產生之化合物庫，亦即化合物多樣性組合庫。組合庫以及其生產及篩選方法為此項技術中已知的且描述於：US 5,741,713；5,734,018；5,731,423；5,721,099；5,708,153；5,698,673；5,688,997；5,688,696；5,684,711；5,641,862；5,639,603；5,593,853；5,574,656；5,571,698；5,565,324；5,549,974；5,545,568；5,541,061；5,525,735；5,463,564；5,440,016；5,438,119；5,223,409，其揭示內容以引用的方式併入本文中。
結合位點可與特異性結合對之成員(例如配體)之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點可與單價(單抗原決定基)或多價(多抗原決定基)之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點可與目標之抗原或半抗原部分結合。結合位點可與單個分子或具有至少一個共同抗原決定基或決定子位點之複數個分子之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點可與細胞(例如細菌細胞、植物細胞或動物細胞)之一部分之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點可與自然環境(例如組織)、培養的細胞、或微生物(例如細菌、真菌、原生動物或病毒)、或溶解的細胞中之目標結合。結合位點可與目標之一部分結合，該部分經修飾(例如化學修飾)以提供一或多個額外的結合位點，諸如但不限於染料(例如螢光染料)、多肽修飾部分(諸如磷酸酯基、碳水化合物基及其類似物)或多核苷酸修飾部分(諸如甲基)。結合位點可與特異性結合對之成員的結合部分結合。結合部分可位於或包含特異性結合對之成員(例如配體)之域、片段、抗原決定基、區或一部分。結合部分可位於或包含單價(單抗原決定基)或多價(多抗原決定基)之域、片段、抗原決定基、區或一部分。結合部分可為抗原性或半抗原性的。結合部分可位於或包含單個分子或具有至少一個共同抗原決定基或決定子位點之複數個分子之域、片段、抗原決定基、區或一部分。結合部分可位於或包含細胞(例如細菌細胞、植物細胞或動物細胞)之一部分之域、片段、抗原決定基、區或一部分。結合部分可在自然環境(例如組織)、培養的細胞、或微生物(例如細菌、真菌、原生動物或病毒)、或溶解的細胞中。結合部分可經修飾(例如化學修飾)以提供一或多個額外的結合位點，諸如但不限於染料(例如螢光染料)、多肽修飾部分(諸如磷酸酯基、碳水化合物基及其類似物)或多核苷酸修飾部分(諸如甲基)。
在一些情況下，結合位點與宿主樣品中發現之分子之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點可與宿主樣品中發現之分子之結合部分結合。在一些情況下，結合部分位於或包含宿主樣品中發現之分子之域、片段、抗原決定基、區或一部分。宿主樣品包括體液(例如尿液、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰液、腦脊髓液、淚液、黏液及其類似物)。樣品可直接檢測，或可經預處理以使結合部分更容易偵測。樣品包括一定數量的來自生物或先前生物的物質。樣品可為天然的、重組的、合成的或非天然存在的。結合位點可與細胞溶解物或細胞培養基、活體外轉譯之樣品或樣品(例如細胞溶解物)之免疫沈澱中由細胞天然或重組表現之以上任一者結合。結合部分可為細胞溶解物或細胞培養基、活體外轉譯之樣品或樣品(例如細胞溶解物)之免疫沈澱中由細胞天然或重組表現之以上任一者。
在一些情況下，結合位點與在無細胞系統中或活體外表現之目標結合。舉例而言，結合位點與細胞提取物中之目標結合。在一些情況下，結合位點與具有DNA模板及用於轉錄及轉譯之試劑的細胞提取物中之目標結合。結合位點可與在無細胞系統中或活體外表現之目標的結合部分結合。在一些情況下，目標之結合部分在無細胞系統中或活體外表現。舉例而言，目標之結合部分在細胞提取物中。在一些情況下，目標之結合部分在具有DNA模板及用於轉錄及轉譯之試劑的細胞提取物中。可使用之細胞提取物的例示性來源包括小麥胚芽、大腸桿菌、兔網狀紅血球、超嗜熱菌、雜交瘤、非洲爪蟾卵母細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞(例如人類細胞)。可用於表現目標多肽之例示性無細胞方法(例如在陣列上產生目標多肽)包括蛋白質原位陣列(PISA)、多重點樣技術(MIST)、自組裝mRNA轉譯、核酸可程式化蛋白質陣列(NAPPA)、奈米孔NAPPA、DNA陣列至蛋白質陣列(DAPA)、無膜DAPA、奈米孔複製及µIP-微凹版印刷及pMAC-蛋白質微陣列複製(參見Kilb等人,Eng. Life Sci . 2014, 14, 352-364)。
在一些情況下，結合位點與自DNA模板原位合成(例如在陣列之固體基板上)之目標結合。結合位點可與原位合成之目標的結合部分結合。在一些情況下，目標之結合部分係自DNA模板原位合成(例如在陣列之固體基板上)。在一些情況下，複數個結合部分係自複數個相應的DNA模板並行地或在單個反應中原位合成。原位目標多肽表現之例示性方法包括以下中所述之方法：Stevens,Structure 8(9): R177-R185 (2000)；Katzen等人,Trends Biotechnol. 23(3):150-6. (2005)；He等人,Curr. Opin. Biotechnol. 19(1):4-9. (2008)；Ramachandran等人,Science 305(5680):86-90. (2004)；He等人,Nucleic Acids Res. 29(15):E73-3 (2001)；Angenendt等人,Mol. Cell Proteomics 5(9): 1658-66 (2006)；Tao等人,Nat Biotechnol 24(10):1253-4 (2006)；Angenendt等人,Anal. Chem. 76(7):1844-9 (2004)；Kinpara等人,J. Biochem. 136(2):149-54 (2004)；Takulapalli等人,J. Proteome Res . 11(8):4382-91 (2012)；He等人,Nat. Methods 5(2):175-7 (2008)；Chatterjee及J. LaBaer,Curr Opin Biotech 17(4):334-336 (2006)；He及Wang,Biomol Eng 24(4):375-80 (2007)；以及He及Taussig,J. Immunol. Methods 274(1-2):265-70 (2003)。
在一些情況下，結合位點與包含至少6個核苷酸跨度，例如至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50或100個核苷酸之核酸目標結合。在一些情況下，結合位點與包含一段連續核苷酸之蛋白質目標結合。在一些情況下，結合位點與包含一段非連續核苷酸之蛋白質目標結合。在一些情況下，結合位點與包含突變或功能突變位點之核酸目標結合，該突變或功能突變位點包括核酸序列中核苷酸之缺失、添加、交換或截斷。結合位點可與核酸目標之結合部分結合。在一些情況下，核酸目標之結合部分包含至少6個核苷酸之跨度，例如至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50或100個核苷酸。在一些情況下，蛋白質目標之結合部分包含一段連續核苷酸。在一些情況下，蛋白質目標之結合部分包含一段非連續核苷酸。在一些情況下，核酸目標之結合部分包含突變或功能突變位點，其包括核酸序列中核苷酸之缺失、添加、交換或截斷。
在一些情況下，結合位點與包含至少6個胺基酸跨度，例如至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50或100個胺基酸之蛋白質目標結合。在一些情況下，結合位點與包含一段連續胺基酸之蛋白質目標結合。在一些情況下，結合位點與包含一段非連續胺基酸之蛋白質目標結合。在一些情況下，結合位點與包含突變或功能突變位點之蛋白質目標結合，該突變或功能突變位點包括多肽序列中胺基酸之缺失、添加、交換或截斷。結合位點可與蛋白質目標之結合部分結合。在一些情況下，蛋白質目標之結合部分包含至少6個胺基酸跨度，例如至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50或100個胺基酸。在一些情況下，蛋白質目標之結合部分包含一段連續胺基酸。在一些情況下，蛋白質目標之結合部分包含一段非連續胺基酸。在一些情況下，蛋白質目標之結合部分包含突變或功能突變位點，其包括多肽序列中胺基酸之缺失、添加、交換或截斷。
在一些實施例中，結合位點與膜結合蛋白之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點可與膜結合蛋白之結合部分結合。在一些實施例中，結合部分位於或包含膜結合蛋白之域、片段、抗原決定基、區或一部分。例示性膜結合蛋白質包括但不限於GPCR (例如腎上腺素激導性受體、血管收縮素受體、膽囊收縮素受體、蕈毒鹼乙醯膽鹼受體、神經調壓素受體、甘丙胺素受體、多巴胺受體、類鴉片受體、血清素受體、生長抑制素受體等)、離子通道(例如菸鹼乙醯膽鹼受體、鈉通道、鉀通道等)、非可興奮及可興奮通道、受體酪胺酸激酶、受體絲胺酸/蘇胺酸激酶、受體鳥苷酸環化酶、生長因子及激素受體(例如表皮生長因子(EGF)受體)等。結合位點可與膜結合蛋白之突變體或修飾變體之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點可與膜結合蛋白之突變體或修飾變體之結合部分結合。結合部分亦可位於或包含膜結合蛋白之突變體或修飾變體之域、片段、抗原決定基、區或一部分。舉例而言，GPCR之一些單點或多點突變保留功能且參與疾病(參見例如Stadel等人, (1997)Trends in Pharmacological Review 18:430-37)。
結合位點與例如泛素連接酶之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點與例如泛素銜接子、蛋白酶體銜接子或蛋白酶體蛋白之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點與例如參與胞吞作用、吞噬作用、溶酶體途徑、自噬途徑、大自噬、小自噬、伴隨蛋白介導之自噬、多囊泡體途徑或其組合之蛋白質之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。在一些情況下，結合位點與結合部分結合。結合部分可包含例如泛素連接酶之域、片段、抗原決定基、區或一部分。結合部分可包含例如泛素銜接子、蛋白酶體銜接子或蛋白酶體蛋白之域、片段、抗原決定基、區或一部分。結合部分可包含例如參與胞吞作用、吞噬作用、溶酶體途徑、自噬途徑、大自噬、小自噬、伴隨蛋白介導之自噬、多囊泡體途徑或其組合之蛋白質之域、片段、抗原決定基、區或一部分。
結合位點與例如與疾病或病況相關之蛋白質之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點與例如原癌基因之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點與例如致癌基因之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點與例如抑瘤基因之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點與例如炎性基因(例如細胞介素)之域、片段、抗原決定基、區或一部分結合。結合位點可與結合部分結合。結合部分可包含例如與疾病或病況相關之蛋白質之域、片段、抗原決定基、區或一部分。結合部分可包含例如原癌基因之域、片段、抗原決定基、區或一部分。結合部分可包含例如致癌基因之域、片段、抗原決定基、區或一部分。結合部分可包含例如抑瘤基因之域、片段、抗原決定基、區或一部分。結合部分可包含例如炎性基因(例如細胞介素)之域、片段、抗原決定基、區或一部分。圖 1 展示具有序列特異性RNA結合模體、序列特異性DNA結合模體及蛋白質特異性結合模體之環狀多核糖核苷酸的一個實例。在一些實施例中，circRNA可包括用於結合其他細胞內分子之其他結合模體。表1中列出circRNA應用之非限制性實例。 表1
過程 MOA ( 實例 )
定向轉錄 DNA-circRNA-蛋白質(pol 、TF )
表觀遺傳重塑 DNA-circRNA-蛋白質(SWI/SNF )
轉錄干擾 circRNA-DNA
轉譯干擾 circRNA-mRNA或核糖體
蛋白質相互作用抑制劑 circRNA-蛋白質
蛋白質降解 蛋白質-circRNA-蛋白質(ubiq )
RNA降解 RNA-circRNA-RNA (RNAse 至 RNA )
DNA降解 DNA-circRNA-蛋白質(DNA 至 DNAse )
人工受體 細胞表面-circRNA-受質
蛋白質易位 蛋白質-circRNA-蛋白質/RNA
細胞融合 細胞表面-circRNA-細胞表面
複合物分解 蛋白質-circRNA-蛋白質/RNA
受體抑制 蛋白質-circRNA-受質
信號轉導 蛋白質-circRNA-蛋白質(凋亡蛋白酶)
多酶加速 多種酶-circRNA
受體誘導 circRNA-受體
RNA結合位點
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含一或多個RNA結合位點。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括修飾內源基因及/或外源基因之表現的RNA結合位點。在一些實施例中，RNA結合位點調節宿主基因之表現。RNA結合位點可包括與內源基因(例如，如本文所述之miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反義RNA、gRNA之序列)雜交之序列、與外源核酸(諸如病毒DNA或RNA)雜交之序列、與RNA雜交之序列、干擾基因轉錄之序列、干擾RNA轉譯之序列、使RNA穩定或使RNA不穩定(諸如經由靶向降解)之序列或調節DNA或RNA結合因子之序列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含與RNA結合之適體序列。適體序列可與內源基因(例如，如本文所述之miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反義RNA、gRNA之序列)、外源核酸(諸如病毒DNA或RNA)、RNA、干擾基因轉錄之序列、干擾RNA轉譯之序列、使RNA穩定或使RNA不穩定(諸如經由靶向降解)之序列或調節DNA或RNA結合因子之序列結合。適體序列之二級結構可與RNA結合。環狀RNA可藉由適體序列與RNA之結合形成與RNA之複合物。
在一些實施例中，RNA結合位點可為tRNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、rRNA、snRNA、微RNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、Y RNA及hnRNA結合位點中之一者。RNA結合位點為一般熟習此項技術者熟知的。
某些RNA結合位點可經由RNA干擾(RNAi)之生物過程抑制基因表現。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含具有RNA或RNA樣結構之RNAi分子，其通常具有15-50個鹼基對(諸如約18-25個鹼基對)，且具有與細胞內表現之目標基因中的編碼序列一致(互補)或幾乎一致(實質上互補)的核鹼基序列。RNAi分子包括但不限於：短干擾RNA (siRNA)、雙股RNA (dsRNA)、微RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)、部分雙螺旋體及切丁酶受質。
在一些實施例中，RNA結合位點包含siRNA或shRNA。siRNA及shRNA類似於內源miRNA基因之處理途徑中的中間體。在一些實施例中，siRNA可充當miRNA，反之亦然。微RNA，與siRNA一樣，可使用RISC下調靶基因，但與siRNA不同，大多數動物miRNA不裂解mRNA。實際上，miRNA經由轉譯抑制或多A移除及mRNA降解來減少蛋白質輸出。已知的miRNA結合位點在mRNA 3'-UTR內；miRNA似乎靶向與miRNA之5'端的核苷酸2-8幾乎完全互補的位點。此區稱為種子區。由於siRNA及miRNA可互換，所以外源siRNA可下調與siRNA具有種子互補性之mRNA。3'-UTR內之多個目標位點可給予更強的下調作用。
微RNA (miRNA)為短非編碼RNA，其與核酸分子之3'-UTR結合且藉由降低核酸分子穩定性或藉由抑制轉譯來下調基因表現。環狀多核糖核苷酸可包含一或多個miRNA目標序列、miRNA序列或miRNA種子。此類序列可對應於任何miRNA。
miRNA序列包含「種子」區，亦即成熟miRNA之位置2-8之區域中的序列，該序列與miRNA目標序列具有華特生-克里克互補性(Watson-Crick complementarity)。miRNA種子可包含成熟miRNA之位置2-8或2-7。在一些實施例中，miRNA種子可包含7個核苷酸(例如成熟miRNA之核苷酸2-8)，其中相應miRNA目標中之種子互補位點由與miRNA位置1相對之腺嘌呤(A)側接。在一些實施例中，miRNA種子可包含6個核苷酸(例如成熟miRNA之核苷酸2-7)，其中相應miRNA目標中之種子互補位點由與miRNA位置1相對之腺嘌呤(A)側接。
miRNA種子之鹼基可與目標序列實質上互補。藉由將miRNA目標序列工程改造成環狀多核糖核苷酸，環狀多核糖核苷酸可逃避或由宿主之免疫系統偵測，具有經調節之降解或經調節之轉譯。此過程可降低環狀多核糖核苷酸遞送時偏離目標效應的危害。
環狀多核糖核苷酸可包括與目標基因之約5至約25個連續核苷酸一致的miRNA序列。在一些實施例中，miRNA序列靶向mRNA且以二核苷酸AA開始，包含約30%-70%、約30%-60%、約40%-60%或約45%-55%之GC含量，且與欲引入之哺乳動物基因體中除目標以外之任何核苷酸序列不具有高比例一致性，例如，如藉由標準BLAST搜尋所測定。
相反，miRNA結合位點可經工程改造以自環狀多核糖核苷酸離開(亦即移除)，以調節特定組織中之蛋白質表現。可經由引入或移除或一個或若干個miRNA結合位點實現對多個組織中表現之調節。
已知miRNA調控mRNA，從而調控蛋白質表現之組織的實例包括但不限於肝臟(miR-122)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)、內皮細胞(miR-17-92、miR-126)、骨髓細胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪組織(let-7、miR-30c)、心臟(miR-ld、miR-149)、腎臟(miR-192、miR-194、miR-204)及肺上皮細胞(let-7、miR-133、miR-126)。miRNA亦可調控複雜的生物過程，諸如血管生成(miR-132)。在本文所述之環狀多核糖核苷酸中，可移除或引入參與此類過程之miRNA的結合位點，以調整環狀多核糖核苷酸之表現適應生物學相關的細胞類型或相關生物過程之情形。在一些實施例中，miRNA結合位點包括例如miR-7。
經由瞭解miRNA在不同細胞類型中之表現模式，本文所述之環狀多核糖核苷酸可經工程改造以在特定細胞類型中或僅在特定生物條件下更有針對性地表現。經由引入組織特異性miRNA結合位點，環狀多核糖核苷酸可經設計以在組織中或在生物條件之情形下進行最佳蛋白質表現。
另外，可將miRNA種子位點併入環狀多核糖核苷酸中，以調節某些細胞中之表現，從而得到生物學改良。此舉之一個實例為miR-142位點之併入。將miR-142位點併入本文所述之環狀多核糖核苷酸中可調節造血細胞中之表現，且亦減少或消除對環狀多核糖核苷酸中編碼之蛋白質的免疫反應。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含至少一個miRNA，例如2、3、4、5、6個或更多個。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含與任一個核苷酸序列或與目標序列互補之序列具有至少約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%核苷酸序列一致性的miRNA。
已知的miRNA序列表可見於由例如以下研究組織維護之資料庫：Wellcome Trust Sanger Institute、Penn Center for Bioinformatics、Memorial Sloan Kettering Cancer Center及European Molecule Biology Laboratory。RNAi分子可藉由此項技術中已知的技術容易地設計及生產。另外，計算工具可用於確定有效及特定的序列模體。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含長非編碼RNA。長非編碼RNA (lncRNA)包括長於100個核苷酸之非蛋白質編碼轉錄本。較長的長度使lncRNA區別於小的調節性RNA，諸如miRNA、siRNA及其他短RNA。一般而言，大部分(約78%)之lncRNA表徵為組織特異性的。以與附近蛋白質編碼基因相反的方向轉錄之發散lncRNA (佔哺乳動物基因體中總lncRNA之約20%的顯著比例)可調控附近基因之轉錄。
RNA結合位點之長度可為約5至30個核苷酸、約10至30個核苷酸或約11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個核苷酸。RNA結合位點之長度可為約5至30個核苷酸。RNA結合位點之長度可為約10至30個核苷酸。RNA結合位點之長度可為11個核苷酸。RNA結合位點之長度可為12個核苷酸。RNA結合位點之長度可為13個核苷酸。RNA結合位點之長度可為14個核苷酸。RNA結合位點之長度可為15個核苷酸。RNA結合位點之長度可為16個核苷酸。RNA結合位點之長度可為17個核苷酸。RNA結合位點之長度可為18個核苷酸。RNA結合位點之長度可為19個核苷酸。RNA結合位點之長度可為20個核苷酸。RNA結合位點之長度可為21個核苷酸。RNA結合位點之長度可為22個核苷酸。RNA結合位點之長度可為23個核苷酸。RNA結合位點之長度可為24個核苷酸。RNA結合位點之長度可為25個核苷酸。RNA結合位點之長度可為26個核苷酸。RNA結合位點之長度可為27個核苷酸。RNA結合位點之長度可為28個核苷酸。RNA結合位點之長度可為29個核苷酸。RNA結合位點之長度可為30個核苷酸。RNA結合位點與所關注之目標的一致性程度可為至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括一或多個大的基因間非編碼RNA (lincRNA)結合位點。lincRNA構成長非編碼RNA之大部分。lincRNA為非編碼轉錄本且在一些實施例中，其長度超過約200個核苷酸。在一些實施例中，lincRNA具有外顯子-內含子-外顯子結構，類似於蛋白質編碼基因，但不涵蓋開放閱讀框架且不編碼蛋白質。與編碼基因相比，lincRNA表現可具有驚人的組織特異性。lincRNA通常與其鄰近的基因共表現，其程度與鄰近蛋白質編碼基因對之表現類似。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含環化的lincRNA。
在一些實施例中，本文所揭示之環狀多核糖核苷酸包括一或多種lincRNA，例如FIRRE、LINC00969、PVT1、LINC01608、JPX、LINC01572、LINC00355、C1orf132、C3orf35、RP11-734、LINC01608、CC-499B15.5、CASC15、LINC00937及RP11-191。
已知的lincRNA及lncRNA序列表可見於由例如以下研究組織維護之資料庫：基因體學及綜合生物學研究所(Institute of Genomics and Integrative Biology)、昆士蘭大學Diamantina學院(Diamantina Institute at the University of Queensland)、根特大學(Ghent University)及中山大學(Sun Yat-sen University)。LincRNA及lncRNA分子可藉由此項技術中已知的技術容易地設計及生產。另外，計算工具可用於確定有效及特定的序列模體。
RNA結合位點可包含與內源基因或基因產物(例如mRNA)之全部或片段實質上互補或完全互補的序列。互補序列可與內含子與外顯子之間的邊界處之序列互補，以防止特定基因之新產生的核RNA轉錄本成熟為mRNA進行轉錄。互補序列可藉由與基因之mRNA雜交而對該基因具有特異性且防止其轉譯。RNA結合位點可包含與內源基因或基因產物(諸如DNA、RNA或其衍生物或雜交體)之全部或片段反義或實質上反義的序列。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含RNA結合位點，其具有通常約5-5000個鹼基對之RNA或RNA樣結構(視具體RNA結構而定，例如miRNA 5-30 bp，lncRNA 200-500 bp)，且具有與細胞內表現之目標基因中之編碼序列一致(互補)或幾乎一致(實質上互補)的核鹼基序列。 DNA結合位點
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含DNA結合位點，諸如嚮導RNA (gRNA)之序列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含嚮導RNA或gRNA序列之互補序列。gRNA短合成RNA由與不完全效應部分結合所必需的「骨架」序列及使用者定義之基因體目標之約20個核苷酸靶向序列構成。嚮導RNA序列可具有17-24個核苷酸(例如19、20或21個核苷酸)之長度，且與靶向核酸序列互補。定製的gRNA生成器及算法可用於設計有效的嚮導RNA。基因編輯可使用嵌合的「單嚮導RNA」(「sgRNA」)來實現，其為一種經工程改造(合成)之單RNA分子，模擬天然存在之crRNA-tracrRNA複合物且含有tracrRNA (用於結合核酸酶)及至少一個crRNA (將核酸酶導引至靶向編輯序列)。經化學修飾之sgRNA可有效進行基因體編輯。
gRNA可識別特定的DNA序列(例如，與基因之啟動子、強化子、靜止子或抑制子相鄰或在其內之序列)。
在一些實施例中，gRNA為用於基因編輯之CRISPR系統的一部分。對於基因編輯，環狀多核糖核苷酸可經設計以包括一或多個對應於所需目標DNA序列之嚮導RNA序列。gRNA序列可包括至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個核苷酸，用於與Cas9或其他核酸外切酶相互作用以裂解DNA，例如Cpf1與至少約16個核苷酸之gRNA序列相互作用以裂解可偵測的DNA。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含可與DNA結合之適體序列。適體序列之二級結構可與DNA結合。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸藉由適體序列與DNA之結合而與DNA形成複合物。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括結合雙螺旋DNA之大溝的序列。在一種此類情況下，由環狀多核糖核苷酸及雙螺旋DNA形成之三螺旋體結構的特異性及穩定性係經由胡斯坦氫鍵(Hoogsteen hydrogen bond)獲得，該等氫鍵不同於雙螺旋體DNA之經典華特生-克里克鹼基配對中形成的氫鍵。在一種情況下，環狀多核糖核苷酸經由大溝與目標雙螺旋體之富嘌呤股結合。
在一些實施例中，三螺旋體形成發生在兩個模體中，其區別在於環狀多核糖核苷酸相對於目標雙螺旋體之富嘌呤股的取向。在一些情況下，環狀多核糖核苷酸之多嘧啶序列段以平行方式(亦即，與雙螺旋體之富嘌呤股相同的5'至3'取向)經由胡斯坦氫鍵結與雙螺旋DNA之多嘌呤序列段結合，而多嘌呤段(R)以反平行方式經由反向胡斯坦氫鍵與雙螺旋體之嘌呤股結合。在反平行中，嘌呤模體包含G:G-C、A:A-T或T:A-T之三聯體；而在平行中，嘧啶模體包含C+:G-C或T:A-T三聯體之典型三聯體(其中C+表示N3位置上之質子化胞嘧啶)。環狀多核糖核苷酸中之反平行GA及GT序列可在中性pH下形成穩定的三螺旋體，而環狀多核糖核苷酸中之平行CT序列可在酸性pH下結合。環狀多核糖核苷酸中胞嘧啶上之N3可經質子化。用5-甲基-C取代C可允許在生理pH下結合環狀多核糖核苷酸中之CT序列，因為5-甲基-C之pK比胞嘧啶高。對於嘌呤及嘧啶模體，至少10個鹼基對之連續同型嘌呤-同型嘧啶序列段有助於環狀多核糖核苷酸與雙螺旋DNA結合，因為較短的三螺旋體在生理條件下可能不穩定，且序列的中斷可能使三螺旋體結構不穩定。在一些實施例中，用於形成三螺旋體之DNA雙螺旋目標包括一股中之連續嘌呤鹼基。在一些實施例中，用於形成三螺旋體之目標包含DNA雙螺旋之一股中之同型嘌呤序列及互補股中之同型嘧啶序列。
在一些實施例中，包含環狀多核糖核苷酸之三螺旋體為穩定的結構。在一些實施例中，包含環狀多核糖核苷酸之三螺旋體表現出增加的半衰期，例如增加約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更大，例如持續至少約1小時至約30天，或至少約2小時、6小時、12小時、18小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更長時間或其間任何時間。 蛋白質結合位點
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括一或多個蛋白質結合位點。在一些實施例中，蛋白質結合位點包含適體序列。在一個實施例中，與由參考化合物(例如缺少蛋白質結合位點之環狀多核糖核苷酸，例如線性RNA)引發之反應相比，環狀多核糖核苷酸包括蛋白質結合位點以降低宿主之免疫反應。
在一些實施例中，本文所揭示之環狀多核糖核苷酸包括一或多個蛋白質結合位點，以結合蛋白質，例如核糖體。藉由將蛋白質結合位點(例如核糖體結合位點)工程改造成環狀多核糖核苷酸，環狀多核糖核苷酸可逃避或減少宿主免疫系統之偵測，具有經調節之降解或經調節之轉譯。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含至少一個免疫蛋白結合位點，例如以將環狀多核糖核苷酸自宿主免疫系統之組分掩蔽，例如逃避CTL反應。在一些實施例中，免疫蛋白結合位點為與免疫蛋白結合且有助於將環狀多核糖核苷酸掩蔽為非內源性的核苷酸序列。
核糖體與線性RNA接合之傳統機制涉及核糖體與RNA之加帽5'端的結合。核糖體自5'端遷移至起始密碼子，之後形成第一肽鍵。根據本發明，環狀多核糖核苷酸之內部起始(亦即，不依賴於帽)或轉譯不需要自由端或加帽端。相反，核糖體與非加帽內部位點結合，由此核糖體在起始密碼子處開始多肽伸長。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括一或多個包含核糖體結合位點，例如起始密碼子之RNA序列。
在一些實施例中，本文所揭示之環狀多核糖核苷酸包含與蛋白質結合之蛋白質結合序列。在一些實施例中，蛋白質結合序列將環狀多核糖核苷酸靶向或定位至特定目標。在一些實施例中，蛋白質結合序列特異性結合蛋白質之富含精胺酸之區域。
在一些實施例中，本文所揭示之環狀多核糖核苷酸包括一或多個蛋白質結合位點，其各自結合目標蛋白，例如充當骨架以使兩個或更多個蛋白質緊密接近。在一些實施例中，本文所揭示之環狀多核苷酸包含兩個蛋白質結合位點，其各自結合目標蛋白，從而使目標蛋白緊密接近。在一些實施例中，本文所揭示之環狀多核苷酸包含三個蛋白質結合位點，其各自結合目標蛋白，從而使三個目標蛋白緊密接近。在一些實施例中，本文所揭示之環狀多核苷酸包含四個蛋白質結合位點，其各自結合目標蛋白，從而使四個目標蛋白緊密接近。在一些實施例中，本文所揭示之環狀多核苷酸包含五個或更多個蛋白質結合位點，其各自結合目標蛋白，從而使五個或更多個目標蛋白緊密接近。在一些實施例中，目標蛋白為相同的。在一些實施例中，目標蛋白為不同的。在一些實施例中，使目標蛋白緊密接近促進蛋白質複合物之形成。舉例而言，本發明之環狀多核糖核苷酸可充當骨架以促進包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個目標蛋白或更多之複合物的形成。在一些實施例中，使兩個或更多個目標蛋白緊密接近促進兩個或更多個目標蛋白之相互作用。在一些實施例中，使兩個或更多個目標蛋白緊密接近調節、促進或抑制酶促反應。在一些實施例中，使兩個或更多個目標蛋白緊密接近調節、促進或抑制信號轉導途徑。
在一些實施例中，蛋白質結合位點包括但不限於與以下蛋白質之結合位點，諸如ACIN1、AGO、APOBEC3F、APOBEC3G、ATXN2、AUH、BCCIP、CAPRIN1、CELF2、CPSF1、CPSF2、CPSF6、CPSF7、CSTF2、CSTF2T、CTCF、DDX21、DDX3、DDX3X、DDX42、DGCR8、EIF3A、EIF4A3、EIF4G2、ELAVL1、ELAVL3、FAM120A、FBL、FIP1L1、FKBP4、FMR1、FUS、FXR1、FXR2、GNL3、GTF2F1、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPC、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPM、HNRNPU、HNRNPUL1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ILF3、KHDRBS1、LARP7、LIN28A、LIN28B、m6A、MBNL2、METTL3、MOV10、MSI1、MSI2、NONO、NONO-、NOP58、NPM1、NUDT21、p53、PCBP2、POLR2A、PRPF8、PTBP1、RBFOX1、RBFOX2、RBFOX3、RBM10、RBM22、RBM27、RBM47、RNPS1、SAFB2、SBDS、SF3A3、SF3B4、SIRT7、SLBP、SLTM、SMNDC1、SND1、SRRM4、SRSF1、SRSF3、SRSF7、SRSF9、TAF15、TARDBP、TIA1、TNRC6A、TOP3B、TRA2A、TRA2B、U2AF1、U2AF2、UNK、UPF1、WDR33、XRN2、YBX1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YWHAG、ZC3H7B、PDK1、AKT1及任何其他結合RNA之蛋白質。
在一些實施例中，蛋白質結合位點為與蛋白質結合之核酸序列，例如可結合轉錄因子、強化子、抑制子、聚合酶、核酸酶、組蛋白或任何其他結合DNA之蛋白質的序列。在一些實施例中，蛋白質結合位點為與蛋白質結合之適體序列。在一些實施例中，適體序列之二級結構結合蛋白質。在一些實施例中，環狀RNA藉由適體序列與蛋白質之結合而與蛋白質形成複合物。
在一些實施例中，環狀RNA與小分子或其一部分接合，其中該小分子或其一部分與諸如蛋白質之目標結合。小分子可經由經修飾之核苷酸，例如藉由點擊化學與環狀RNA接合。可與蛋白質結合之小分子的實例包括但不限於4-羥基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen，4-OHT)、AC220、阿法替尼(Afatinib)、胺基吡唑類似物、AR拮抗劑、BI-7273、伯舒替尼(Bosutinib)、塞利替尼(Ceritinib)、氯烷烴、達沙替尼(Dasatinib)、弗雷替尼(Foretinib)、吉非替尼(Gefitinib)、HIF-1α衍生之(R)-羥脯胺酸、HJB97、基於羥脯胺酸之配體、IACS-7e、依魯替尼(Ibrutinib)、依魯替尼衍生物、JQ1、拉帕替尼(Lapatinib)、LCL161衍生物、來那度胺(Lenalidomide)、nutlin小分子、OTX015、PDE4抑制劑、泊利度胺(Pomalidomide)、ripk2抑制劑、RN486、Sirt2抑制劑3b、SNS-032、Steel因子、TBK1抑制劑、沙利度胺(Thalidomide)、沙利度胺衍生物、基於噻唑啶二酮之配體、VH032衍生物、VHL配體2、VHL-1、VL-269及其衍生物。
在一些實施例中，環狀RNA與多於一個小分子，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與2個小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與3個小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與4個小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與5個小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與6個小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與7個小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與8個小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與9個小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與10個小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與多於一個不同的小分子，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個不同的小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與2個不同的小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與3個不同的小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與4個不同的小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與5個不同的小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與6個不同的小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與7個不同的小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與8個不同的小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與9個不同的小分子接合。在一些實施例中，環狀RNA與10個不同的小分子接合。在一些實施例中，與環狀RNA接合之多於一個小分子經組態以募集其各自的目標蛋白接近，此可導致目標蛋白之間的相互作用及/或其他分子及細胞變化。舉例而言，環狀RNA可與JQ1及沙利度胺或其衍生物接合，從而可募集JQ1之目標蛋白，例如BET家族蛋白，及沙利度胺之目標蛋白，例如E3連接酶。在一些情況下，與JQ1及沙利度胺接合之環狀RNA經由JQ1或其衍生物募集BET家族蛋白，藉由沙利度胺或其衍生物募集之E3連接酶用泛素標記BET家族蛋白，從而導致經標記之BET家族蛋白之降解。 其他結合位點
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含一或多個與非RNA或非DNA目標之結合位點。在一些實施例中，結合位點可為小分子、適體、脂質、碳水化合物、病毒粒子、膜、多組分複合物、細胞、細胞部分或其任何片段結合位點中之一者。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含一或多個與脂質之結合位點。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含一或多個與碳水化合物之結合位點。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含一或多個與碳水化合物之結合位點。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含一或多個與膜之結合位點。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含一或多個與多組分複合物(例如核糖體、核小體、轉錄機構等)之結合位點。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含適體序列。適體序列可與如本文所述之任何目標(例如核酸分子、小分子、蛋白質、碳水化合物、脂質等)結合。適體序列具有可結合目標之二級結構。在一些實施例中，適體序列具有可結合目標之三級結構。在一些實施例中，適體序列具有可結合目標之四級結構。環狀多核糖核苷酸可經由適體序列與目標結合以形成複合物。在一些實施例中，複合物可偵測至少5天。在一些實施例中，複合物可偵測至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天。 螯合  在一些實施例中，本文所述之circRNA螯合目標，例如DNA、RNA、蛋白質及其他細胞組分以調節細胞過程。具有所關注目標之結合位點的circRNA可與內源性結合搭配物競爭與目標之結合。在一些實施例中，本文所述之circRNA螯合miRNA。在一些實施例中，本文所述之circRNA螯合mRNA。在一些實施例中，本文所述之circRNA螯合蛋白質。在一些實施例中，本文所述之circRNA螯合核糖體。在一些實施例中，本文所述之circRNA螯合其他circRNA。在一些實施例中，本文所述之circRNA螯合非編碼RNA、lncRNA、miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA或shRNA。在一些實施例中，本文所述之circRNA包括降解元件，其降解螯合之目標，例如與circRNA結合之DNA、RNA、蛋白質或其他細胞組分。表 2 中列出circRNA螯合應用之非限制性實例。表 2
過程 MOA ( 實例 )
轉錄干擾 circRNA-DNA
轉譯干擾 circRNA-mRNA或核糖體
蛋白質相互作用抑制劑 circRNA-蛋白質
微RNA螯合 circRNA-RNA (反義)
circRNA螯合(內源性circRNA) circRNA-circRNA (反義)
在一些實施例中，使用本文所述之circRNA的任何方法可與轉譯元件組合。本文所述之含有轉譯元件之circRNA可將RNA轉譯成蛋白質。圖 3 示出由含有序列特異性RNA結合模體、序列特異性DNA結合模體、蛋白質特異性結合模體(蛋白質1)及調節性RNA模體(RNA 1)之circRNA促進之蛋白質表現的示意圖。調節性RNA模體可啟動RNA轉錄及蛋白質表現。 非轉譯區
在一些實施例中，如本文所揭示之circRNA可包含隱源子。在一些實施例中，隱源子包含非轉譯區(UTR)。基因之UTR可經轉錄但不轉譯。在一些實施例中，UTR可包括在本文所述之表現序列之轉譯起始序列的上游。在一些實施例中，UTR可包括在本文所述之表現序列的下游。在一些情況下，第一表現序列之一個UTR與第二表現序列之另一個UTR相同或連續或重疊。在一些實施例中，內含子為人類內含子。在一些實施例中，內含子為全長人類內含子，例如ZKSCAN1。
在一些實施例中，隱源子增強穩定性。在一些實施例中，UTR之調控特徵可包括於隱源子中，以增強環狀多核糖核苷酸之穩定性。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含具有一或多個腺苷及尿苷段嵌入其中之UTR。富含AU之標誌可增加表現產物之周轉率。
引入、移除或修飾UTR富含AU之元件(ARE)可用於調節環狀多核糖核苷酸之穩定性或免疫原性。當工程改造特定的環狀多核糖核苷酸時，可引入一或多個ARE複本以使環狀多核糖核苷酸不穩定，且ARE複本可減少轉譯及/或減少表現產物之產生。同樣，ARE可經鑑別且移除或突變，以增加細胞內穩定性，從而增加所得蛋白質之轉譯及產生。
來自任何基因之UTR可併入環狀多核糖核苷酸之各別側接區中。此外，可利用任何已知基因之多個野生型UTR。在一些實施例中，可使用並非野生型基因變體之人工UTR。此等UTR或其部分可以與自其選擇之轉錄本相同的取向置放，或可改變取向或位置。因此，5'-或3'-UTR可反向、縮短、延長或與一或多種其他5'-或3'-UTR進行嵌合。如本文所用，術語「改變」在與UTR序列有關時，意謂UTR已相對於參考序列以某種方式進行變化。舉例而言，3'-或5'-UTR可相對於野生型或原生UTR藉由如上文所教示之取向或位置的變化而改變，或可藉由包含額外核苷酸、核苷酸之缺失、核苷酸之交換或轉位而改變。產生「改變」的UTR (不論3'或5')之任何此等變化構成變異UTR。
在一些實施例中，可使用雙UTR、三UTR或四UTR，諸如5'-或3'-UTR。如本文所用，「雙」UTR為同一UTR之兩個複本串聯或實質上串聯編碼的UTR。舉例而言，在本發明之一些實施例中，可使用雙β-球蛋白3'-UTR。 隱源子
如本文所述，環狀多核糖核苷酸可包含隱源子，以減少、逃避或避免細胞之先天性免疫反應。在一些實施例中，與由參考化合物(例如對應於所述環狀多核糖核苷酸之線性多核苷酸或缺乏隱源子之環狀多核糖核苷酸)引發之反應相比，本文提供之環狀多核糖核苷酸使得宿主之免疫反應降低。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸之免疫原性低於缺乏隱源子之對應物。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸在哺乳動物(例如人類)中為非免疫原性的。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸能夠在哺乳動物細胞(例如人類細胞)中複製。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括序列或表現產物。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸之半衰期至少為線性對應物(例如線性表現序列或線性環狀多核糖核苷酸)之半衰期。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸之半衰期相比於線性對應物之半衰期增加。在一些實施例中，半衰期增加約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更大。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸在細胞中之半衰期或持久性為至少約1小時至約30天，或至少約2小時、6小時、12小時、18小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更長時間或其間的任何時間。在某些實施例中，環狀多核糖核苷酸在細胞中之半衰期或持久性不超過約10分鐘至約7天，或不超過約1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、4天、5天、6天、7天或其間的任何時間。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸例如短暫或長期地調節細胞功能。在某些實施例中，細胞功能經穩定改變，諸如調節持續至少約1小時至約30天，或至少約2小時、6小時、12小時、18小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更長時間或其間的任何時間。在某些實施例中，細胞功能經短暫改變，例如調節持續不超過約30分鐘至約7天，或不超過約1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、4天、5天、6天、7天或其間的任何時間。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸為至少約20個鹼基對、至少約30個鹼基對、至少約40個鹼基對、至少約50個鹼基對、至少約75個鹼基對、至少約100個鹼基對、至少約200個鹼基對、至少約300個鹼基對、至少約400個鹼基對、至少約500個鹼基對或至少約1,000個鹼基對。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸可具有足以容納核糖體之結合位點的尺寸。熟習此項技術者可瞭解，環狀多核糖核苷酸之最大尺寸可與產生環狀多核糖核苷酸及/或使用環狀多核糖核苷酸之技術限制內的一樣大。雖然不受理論束縛，但可由DNA產生RNA之多個區段，且將其5'及3'自由端黏接以產生RNA之「串」，最終在僅剩一個5'及一個3'自由端時可環化。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸之最大尺寸可受限於將RNA包裝及遞送至目標之能力。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸之尺寸為足以編碼有用多肽之長度，因此，長度小於約20,000個鹼基對、小於約15,000個鹼基對、小於約10,000個鹼基對、小於約7,500個鹼基對或小於約5,000個鹼基對、小於約4,000個鹼基對、小於約3,000個鹼基對、小於約2,000個鹼基對、小於約1,000個鹼基對、小於約500個鹼基對、小於約400個鹼基對、小於約300個鹼基對、小於約200個鹼基對、小於約100個鹼基對可為有用的。 裂解序列
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個裂解序列。在一些實施例中，裂解序列與表現序列相鄰。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括裂解序列，諸如在分解circRNA或可裂解circRNA或自裂解circRNA中。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含兩個或更多個裂解序列，導致環狀多核糖核苷酸分離成多個產物，例如miRNA、線性RNA、較小的環狀多核糖核苷酸等。
在一些實施例中，裂解序列包括核糖核酸酶RNA序列。核糖核酸酶(ribozyme)(來自核糖核酸酶(ribonucleic acid enzyme)，亦稱為RNA酶或催化性RNA)為催化化學反應之RNA分子。許多天然核糖核酸酶催化其自身一個磷酸二酯鍵之水解或其他RNA中之鍵水解，但亦發現其催化核糖體之胺基轉移酶活性。催化性RNA可藉由活體外方法「進化」。與上文所論述之核糖開關活性類似，核糖核酸酶及其反應產物可調節基因表現。在一些實施例中，催化性RNA或核糖核酸酶可置於較大的非編碼RNA內，使得核糖核酸酶在細胞內以許多複本存在，以達到化學轉化總體積之分子的目的。在一些實施例中，適體及核糖核酸酶可編碼在同一非編碼RNA中。 分解序列  在一些實施例中，本文所述之circRNA包含分解circRNA或可裂解circRNA或自裂解circRNA。circRNA可遞送細胞組分，包括例如RNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA或shRNA。在一些實施例中，circRNA包括由(i)可自裂解元件；(ii)裂解募集位點；(iii)可降解連接子；(iv)化學連接子；及/或(v)間隔序列分隔開的miRNA。在一些實施例中，circRNA包括由(i)可自裂解元件；(ii)裂解募集位點(例如ADAR)；(iii)可降解連接子(例如丙三醇)；(iv)化學連接子；及/或(v)間隔序列分隔開的siRNA。可自裂解元件之非限制性實例包括錘頭、剪接元件、髮夾、肝炎δ病毒(HDV)、Varkud衛星(VS)及glmS 核糖核酸酶。表3中列出circRNA分解應用之非限制性實例。表 3
過程 MOA ( 實例 )
miRNA遞送 具有自裂解元件(例如錘頭)、裂解募集(例如ADAR)或可降解連接子(例如丙三醇)之呈環狀的微RNA
siRNA遞送 具有自裂解元件(例如錘頭)、裂解募集(例如ADAR)或可降解連接子(例如丙三醇)之呈環狀的siRNA
核糖開關
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含一或多個核糖開關。
核糖開關可為環狀多核糖核苷酸之一部分，可直接結合小目標分子，且其與目標之結合影響RNA轉譯及表現產物穩定性及活性。因此，包括核糖開關之環狀多核糖核苷酸可視目標分子之存在或不存在而調節環狀多核糖核苷酸之活性。在一些實施例中，核糖開關具有對單獨分子之適體樣親和力的區域。包括於非編碼核酸內之任何適體可用於自總體積中螯合分子。在一些實施例中，「(核糖)開關」活性可用於事件之下游報告。
在一些實施例中，核糖開關藉由轉錄終止、抑制轉譯起始、mRNA自裂解及在真核生物中剪接途徑之改變來調節基因表現。核糖開關可經由結合或移除觸發分子來控制基因表現。因此，使包括核糖開關之環狀多核糖核苷酸經受活化、去活化或阻斷核糖開關之條件可改變基因表現。舉例而言，基因表現可由於轉錄終止或阻斷核糖體與RNA之結合而改變。觸發分子或其類似物之結合可視核糖開關之性質而降低/阻止RNA分子之表現或促進/增加其表現。
在一些實施例中，核糖開關為鈷胺素核糖開關(亦為B12元件)，其結合腺苷鈷胺素(維生素B12之輔酶形式)以調節鈷胺素及類似代謝物之生物合成及轉運。
在一些實施例中，核糖開關為環二GMP核糖開關，其結合環二GMP以調控多種基因。存在兩類非結構相關的環二GMP核糖開關：環二GMP-I及環二GMP-II。
在一些實施例中，核糖開關為FMN核糖開關(亦為RFN元件)，其結合黃素單核苷酸(FMN)以調控核黃素之生物合成及轉運。
在一些實施例中，核糖開關為glmS核糖開關，其在存在足夠濃度的葡糖胺-6-磷酸時自行裂解。
在一些實施例中，核糖開關為麩醯胺酸核糖開關，其結合麩醯胺酸以調控參與麩醯胺酸及氮代謝之基因。麩醯胺酸核糖開關亦可結合功能不明的短肽。此類核糖開關屬於兩個結構上相關之類別：glnA RNA模體及下游肽模體。
在一些實施例中，核糖開關為甘胺酸核糖開關，其結合甘胺酸以調控甘胺酸代謝基因。其包含同一mRNA中之兩個相鄰的適體域，且為唯一已知的表現出協同結合之天然RNA。
在一些實施例中，核糖開關為離胺酸核糖開關(亦為L盒)，其結合離胺酸以調控離胺酸之生物合成、分解代謝及轉運。
在一些實施例中，核糖開關為preQ1核糖開關，其結合前Q核苷以調控參與此前體至Q核苷之合成或轉運的基因。兩個不同類別之preQ1核糖開關為preQ1-I核糖開關及preQ1-II核糖開關。在天然存在之核糖開關中，preQ1-I核糖開關之結合域異常地小。PreQ1-II核糖開關僅存在於鏈球菌屬(Streptococcus)及乳球菌屬(Lactococcus)之某些物種中，其結構完全不同且比preQ1-I核糖開關大。
在一些實施例中，核糖開關為嘌呤核糖開關，其結合嘌呤以調控嘌呤代謝及轉運。不同形式之嘌呤核糖開關結合鳥嘌呤或腺嘌呤。對鳥嘌呤或腺嘌呤之特異性取決於與核糖開關中位置Y74處之單個嘧啶的華特生-克里克相互作用。在鳥嘌呤核糖開關中，單個嘧啶為胞嘧啶(亦即C74)。在腺嘌呤核糖開關中，單個嘧啶為尿嘧啶(亦即U74)。同源類型之嘌呤核糖開關可結合脫氧鳥苷，但具有比單核苷酸突變更顯著的差異。
在一些實施例中，核糖開關為S-腺苷同型半胱胺酸(SAH)核糖開關，其結合SAH以調控參與回收在甲基化反應中由S-腺苷甲硫胺酸(SAM)產生之SAH的基因。
在一些實施例中，核糖開關為S-腺苷甲硫胺酸(SAM)核糖開關，其結合SAM以調控甲硫氨酸及SAM之生物合成及轉運。存在三種不同的SAM核糖開關：SAM-I (原先稱為S盒)、SAM-II及SMK盒。SAM-I廣泛存在於細菌中。SAM-II僅存在於α-、β-及若干γ-變形菌門(proteobacteria)中。SMK盒核糖開關存在於乳桿菌目(Lactobacillales)中。此三個品種之核糖開關沒有明顯的序列或結構相似性。第四個品種SAM-IV似乎具有與SAM-I相似的配體結合核心，但在不同骨架之情形下。
在一些實施例中，核糖開關為SAM-SAH核糖開關，其以類似的親和力結合SAM及SAH。
在一些實施例中，核糖開關為四氫葉酸核糖開關，其結合四氫葉酸以調控合成及轉運基因。
在一些實施例中，核糖開關為茶鹼結合核糖開關或胸腺嘧啶焦磷酸結合核糖開關。
在一些實施例中，核糖開關為來自騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)之glmS催化性核糖開關，其感應葡糖胺-6磷酸。
在一些實施例中，核糖開關為硫胺素焦磷酸(TPP)核糖開關(亦為Thi盒)，其結合TPP以調控硫胺素之生物合成及轉運以及類似代謝物之轉運。TPP核糖開關發現於真核生物中。
在一些實施例中，核糖開關為Moco核糖開關，其結合鉬輔因子，以調控參與此輔酶以及使用鉬或其衍生物作為輔因子之酶之生物合成及轉運的基因。
在一些實施例中，核糖開關為腺嘌呤感應add-A核糖開關，其發現於創傷弧菌(Vibrio vulnificus)之腺嘌呤脫胺酶(add)編碼基因的5'-UTR中。 適體酶
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含適體酶。適體酶為用於條件表現之開關，其中適體區用作異位控制元件且與催化性RNA (如下所述之「核糖核酸酶」)之區域偶合。在一些實施例中，適體酶在細胞類型特異性轉譯中具有活性。在一些實施例中，適體酶在細胞狀態特異性轉譯，例如病毒感染之細胞下或在病毒核酸或病毒蛋白存在下具有活性。
核糖核酸酶為催化化學反應之RNA分子。許多天然核糖核酸酶可催化核糖核酸酶自身磷酸二酯鍵之水解或其他RNA中磷酸二酯鍵之水解。天然核糖核酸酶亦可催化核糖體之胺基轉移酶活性。催化性RNA可藉由活體外方法「進化」。核糖核酸酶及核糖核酸酶之反應產物可調控基因表現。在一些實施例中，催化性RNA或核糖核酸酶可置於較大的非編碼RNA內，使得核糖核酸酶在細胞內以許多複本存在，用於化學轉化總體積之分子。在一些實施例中，適體及核糖核酸酶可編碼在同一非編碼RNA中。
核糖核酸酶之非限制性實例包括錘頭核糖核酸酶、VL核糖核酸酶、先導酶及髮夾核糖核酸酶。
在一些實施例中，適體酶為可裂解RNA序列且可由於結合配體或調節劑而經調控之核糖核酸酶。核糖核酸酶可為自裂解核糖核酸酶。因此，此等核糖核酸酶可組合核糖核酸酶及適體之特性。
在一些實施例中，適體酶包括於本文所述之環狀多核糖核苷酸的非轉譯區中。在不存在配體/調節劑之情況下的適體酶為非活性的，其可允許轉殖基因之表現。藉由添加配體可關閉或下調表現。響應於特定調節劑之存在而下調的適體酶可用於需要響應於調節劑而上調基因表現之控制系統中。
適體酶亦可用於開發用於自調節環狀多核糖核苷酸表現之系統。舉例而言，本文所述之環狀多核糖核苷酸的蛋白質產物為特定小分子合成中決定速率之酶，可經修飾以包括經選擇在小分子存在下具有增加的催化活性之適體酶，得到分子合成之自調節反饋迴路。或者，適體酶活性可經選擇以感應環狀多核糖核苷酸之蛋白質產物或任何其他細胞大分子的累積。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸可包括適體序列。適體之非限制性實例包括結合溶菌酶之RNA適體、Toggle-25t (含有2'-氟嘧啶核苷酸之RNA適體，以高特異性及親和力結合凝血酶)、結合人類免疫缺陷病毒反式作用反應元件(HIV TAR)之RNA-Tat、結合氯化血紅素之RNA適體、結合干擾素γ之RNA適體、結合血管內皮生長因子(VEGF)之RNA適體、結合前列腺特異性抗原(PSA)之RNA適體、結合多巴胺之RNA適體及結合熱休克因子1 (HSF1)之RNA適體。 在一些實施例中，本文所述之circRNA可用於RNA之轉錄及複製。舉例而言，circRNA可用於編碼非編碼RNA、lncRNA、miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA或shRNA。在一些實施例中，circRNA可包括反義miRNA及轉錄元件。在轉錄後，此類circRNA可產生功能性線性miRNA。表4中列出circRNA表現及調節應用之非限制性實例。表 4
過程 MOA ( 實例 )
抑制及轉譯之組合療法 抑制一種蛋白質且補充另一種(或相同)蛋白質
複製元件
環狀多核糖核苷酸可編碼可用於複製之序列及/或模體。環狀多核糖核苷酸之複製可藉由產生互補環狀多核糖核苷酸而發生。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括啟動轉錄之模體，其中轉錄由內源性細胞機構(DNA依賴性RNA聚合酶)或由環狀多核糖核苷酸編碼之RNA依賴性RNA聚合酶驅動。滾環轉錄事件之產物可藉由核糖核酸酶切割以產生單位長度之互補或傳播的環狀多核糖核苷酸。核糖核酸酶可由環狀多核糖核苷酸、其互補序列或反式RNA序列編碼。在一些實施例中，所編碼之核糖核酸酶可包括調控(抑制或促進)核糖核酸酶之活性的序列或模體，以控制circRNA傳播。在一些實施例中，單位長度之序列可藉由細胞RNA連接酶連接成環狀形式。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括有助於自擴增之複製元件。此類複製元件之實例包括HDV複製域及複製勝任型環狀RNA有義及/或反義核糖核酸酶，諸如反基因體5'-CGGGUCGGCAUGGCAUCUCCACCUCCUCGCGGUCCGACCUGGGCAUCCGAAGGAGGACGCACGUCCACUCGGAUGGCUAAGGGAGAGCCA-3'或基因體5'-UGGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCG CUGGCGCCGGCUGGGCAACAUUCCGAGGGGACCGUCCCCUCGGUAAUGGCGAAUGGGACCCA-3'。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個如本文所述之裂解序列以幫助複製。環狀多核糖核苷酸內之裂解序列可將自環狀多核糖核苷酸複製之長轉錄本裂解至特定長度，其可隨後環化以形成環狀多核糖核苷酸之互補序列。
在另一個實施例中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個核糖核酸酶序列，以將自環狀多核糖核苷酸複製之長轉錄本裂解至特定長度，其中另一種編碼之核糖核酸酶在核糖核酸酶序列處切割轉錄本。環化形成環狀多核糖核苷酸之互補序列。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸實質上對例如藉由核酸外切酶降解具有抗性。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸在細胞內複製。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸在細胞內以約10%-20%、20%-30%、30%-40%、40%-50%、50%-60%、60%-70%、70%-75%、75%-80%、80%-85%、85%-90%、90%-95%、95%-99%或其間任何百分比的速率複製。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸在細胞內複製且傳遞至子細胞。在一些實施例中，細胞以至少25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%之效率將至少一種環狀多核糖核苷酸傳遞至子細胞。在一些實施例中，進行減數分裂之細胞以至少25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%之效率將環狀多核糖核苷酸傳遞至子細胞。在一些實施例中，進行有絲分裂之細胞以至少25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%之效率將環狀多核糖核苷酸傳遞至子細胞。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸在宿主細胞內複製。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸能夠在哺乳動物細胞(例如人類細胞)中複製。
雖然在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸在宿主細胞中複製，但環狀多核糖核苷酸未整合至宿主之基因體中，例如與宿主之染色體整合。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸例如與宿主之染色體的重組頻率可忽略。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸例如與宿主之染色體的重組頻率例如小於約1.0 cM/Mb、0.9 cM/Mb、0.8 cM/Mb、0.7 cM/Mb、0.6 cM/Mb、0.5 cM/Mb、0.4 cM/Mb、0.3 cM/Mb、0.2 cM/Mb、0.1 cM/Mb或更小。 表現序列肽或多肽
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含編碼肽或多肽之序列。
多肽可為直鏈或分支鏈的。多肽之長度可為約5至約4000個胺基酸、約15至約3500個胺基酸、約20至約3000個胺基酸、約25至約2500個胺基酸、約50至約2000個胺基酸或其間的任何範圍。在一些實施例中，多肽之長度小於約4000個胺基酸、小於約3500個胺基酸、小於約3000個胺基酸、小於約2500個胺基酸、或小於約2000個胺基酸、小於約1500個胺基酸、小於約1000個胺基酸、小於約900個胺基酸、小於約800個胺基酸、小於約700個胺基酸、小於約600個胺基酸、小於約500個胺基酸、小於約400個胺基酸、小於約300個胺基酸或更小可為有用的。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含一或多個RNA序列，其中之每一者可編碼多肽。多肽可大量產生。因此，多肽可為可產生之任何蛋白質分子。多肽可為可自細胞分泌或定位至細胞之細胞質、細胞核或膜區室的多肽。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括編碼蛋白質(例如治療蛋白)之序列。治療蛋白之一些實例可包括但不限於蛋白質替代物、蛋白質補充物、疫苗接種、抗原(例如腫瘤抗原、病毒及細菌)、激素、細胞介素、抗體、免疫療法(例如癌症)、細胞重新程式化/轉分化因子、轉錄因子、嵌合抗原受體、轉位酶或核酸酶、免疫效應子(例如影響對免疫反應/信號之敏感性)、受調控之死亡效應蛋白(例如凋亡或壞死之誘導劑)、腫瘤之非溶解性抑制劑(例如致癌蛋白之抑制劑)、表觀遺傳修飾劑、表觀遺傳酶、轉錄因子、DNA或蛋白質修飾酶、DNA嵌入劑、流出泵抑制劑、核受體活化劑或抑制劑、蛋白酶體抑制劑、酶之競爭性抑制劑、蛋白質合成效應子或抑制劑、核酸酶、蛋白質片段或域、配體或受體以及CRISPR系統或其組分。 調控序列
在一些實施例中，調控序列為啟動子。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括與至少一個表現序列相鄰的至少一個啟動子。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括與各表現序列相鄰之啟動子。在一些實施例中，啟動子存在於各表現序列之一側或兩側，使得表現產物(例如肽及或多肽)分離。
環狀多核糖核苷酸可調節由基因編碼之RNA的表現。由於多個基因可彼此具有一定程度之序列同源性，因此環狀多核糖核苷酸可經設計以靶向具有足夠序列同源性之一類基因。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸可含有與在不同基因目標中共有或特定基因目標所獨有之序列互補的序列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸可經設計以靶向若干基因之間具有同源性之RNA序列的保守區，從而靶向基因家族中之若干基因。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸可經設計以靶向單個基因之特定RNA序列所獨有的序列。
在一些實施例中，表現序列之長度小於5000 bp (例如小於約5000 bp、4000 bp、3000 bp、2000 bp、1000 bp、900 bp、800 bp、700 bp、600 bp、500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、100 bp、50 bp、40 bp、30 bp、20 bp、10 bp或更小)。在一些實施例中，表現序列之長度獨立地或額外地大於10 bp (例如至少約10 bp、20 bp、30 bp、40 bp、50 bp、60 bp、70 bp、80 bp、90 bp、100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb、1.5 kb、1.6 kb、1.7 kb、1.8 kb、1.9 kb、2 kb、2.1 kb、2.2 kb、2.3 kb、2.4 kb、2.5 kb、2.6 kb、2.7 kb、2.8 kb、2.9 kb、3 kb、3.1 kb、3.2 kb、3.3 kb、3.4 kb、3.5 kb、3.6 kb、3.7 kb、3.8 kb、3.9 kb、4 kb、4.1 kb、4.2 kb、4.3 kb、4.4 kb、4.5 kb、4.6 kb、4.7 kb、4.8 kb、4.9 kb、5 kb或更大)。
在一些實施例中，表現序列包含本文所述之特徵中之一或多者，例如編碼一或多種肽或蛋白質之序列、一或多種調節性核酸、一或多種非編碼RNA及其他表現序列。 內部核糖體進入位點(IRES)
在一些實施例中，本文所述之環狀多核糖核苷酸包含內部核糖體進入位點(IRES)元件。適合之IRES元件可含有能夠接合真核生物核糖體之RNA序列。在一些實施例中，IRES元件為至少約50個鹼基對、至少約100個鹼基對、至少約200個鹼基對、至少約250個鹼基對、至少約350個鹼基對或至少約500個鹼基對。在一些實施例中，IRES元件來源於生物體之DNA，該生物體包括但不限於病毒、哺乳動物及果蠅。病毒DNA可來源於例如小RNA病毒cDNA、腦心肌炎病毒(EMCV) cDNA及脊髓灰質炎病毒cDNA。在一些實施例中，衍生IRES元件之果蠅DNA可包括例如來自黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)之觸角足基因。
在一些實施例中，本文所述之環狀多核糖核苷酸包括側接至少一個(例如2、3、4、5個或更多個)表現序列之至少一個IRES。在一些實施例中，IRES可側接至少一個(例如2、3、4、5個或更多個)表現序列之兩側。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸可在各表現序列之一側或兩側包括一或多個IRES序列，從而引起所得肽及或多肽之分離。 轉譯起始序列
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸編碼多肽且可包含轉譯起始序列，例如起始密碼子。在一些實施例中，轉譯起始序列包括Kozak或Shine-Dalgarno序列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括與表現序列相鄰之轉譯起始序列，例如kozak序列。在一些實施例中，轉譯起始序列，例如kozak序列，存在於各表現序列之一側或兩側，引起表現產物之分離。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個與表現序列相鄰之轉譯起始序列。
天然5'-UTR可帶有在轉譯起始中起作用的特徵。天然5'-UTR可帶有類似於Kozak序列之標誌，其可參與核糖體啟動許多基因轉譯之過程。Kozak序列具有共同CCR(A/G)CCAUGG，其中R為起始密碼子(AUG)上游三個鹼基之嘌呤(腺嘌呤或鳥嘌呤)，其後為另一個「G」。5'-UTR亦可形成參與延長因子結合之二級結構。
環狀多核糖核苷酸可包括多於1個起始密碼子，諸如但不限於至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少50個、至少60個或多於60個起始密碼子。轉譯可在第一起始密碼子上啟動或在第一起始密碼子下游啟動。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸可在並非第一起始密碼子之密碼子處啟動，例如AUG。環狀多核糖核苷酸之轉譯可在替代性轉譯起始序列處啟動，諸如但不限於ACG、AGG、AAG、CTG/CUG、GTG/GUG、ATA/AUA、ATT/AUU、TTG/UUG。在一些實施例中，轉譯在選擇性條件下，例如應力誘導條件下在替代性轉譯起始序列處開始。作為一個非限制性實例，環狀多核糖核苷酸之轉譯可在替代性轉譯起始序列，諸如ACG處開始。作為另一個非限制性實例，環狀多核糖核苷酸轉譯可在替代性轉譯起始序列CTG/CUG處開始。作為另一個非限制性實例，環狀多核糖核苷酸轉譯可在替代性轉譯起始序列GTG/GUG處開始。作為另一個非限制性實例，環狀多核糖核苷酸可在重複相關之非AUG (RAN)序列，諸如包括重複RNA之短鏈段之替代性轉譯起始序列(例如CGG、GGGGCC、CAG、CTG)處開始轉譯。
側接啟動轉譯之密碼子的核苷酸可影響環狀多核糖核苷酸之轉譯效率、長度及/或結構。掩蔽側接啟動轉譯之密碼子的核苷酸中之任一者可用於改變環狀多核糖核苷酸之轉譯起始位置、轉譯效率、長度及/或結構。
在一些實施例中，掩蔽劑可在起始密碼子或替代性起始密碼子附近使用，以掩蔽或隱藏該密碼子，以降低在經掩蔽之起始密碼子或替代性起始密碼子處的轉譯起始概率。掩蔽劑之非限制性實例包括反義鎖核酸(LNA)寡核苷酸及外顯子接合複合物(EJC)。在一些實施例中，掩蔽劑可用於掩蔽環狀多核糖核苷酸之起始密碼子，以增加轉譯將在替代性起始密碼子處啟動的可能性。
在一些實施例中，轉譯在選擇性條件下啟動，諸如但不限於在GRSF-1存在下病毒誘導之選擇，且環狀多核糖核苷酸包括GRSF-1結合位點。
在一些實施例中，轉譯由用羅卡格列特(Rocaglate)處理之真核起始因子4A (eIF4A)啟動。轉譯可藉由阻斷43S掃描來抑制，導致過早的上游轉譯起始且減少攜帶RocA-eIF4A目標序列之轉錄本的蛋白質表現。 終止序列
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括一或多個表現序列，且各表現序列可具有終止序列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括一或多個表現序列且表現序列缺乏終止序列，使得環狀多核糖核苷酸連續轉譯。由於缺乏核糖體停滯或脫落，排除終止序列可導致滾環轉譯或連續產生表現產物，例如肽或多肽。在此類實施例中，滾環轉譯經由各表現序列產生連續的表現產物。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括交錯序列。為了避免在維持滾環轉譯時產生連續的表現產物，例如肽或多肽，可包括交錯序列以在轉譯期間誘導核糖體停滯。交錯序列可包括2A樣或CHYSEL (順式作用水解酶元件)序列。在一些實施例中，交錯元件編碼C端共同序列為X1X2X3EX5NPGP之序列，其中X1不存在或為G或H，X2不存在或為D或G，X3為D或V或I或S或M，且X5為任何胺基酸。在一些實施例中，此序列包含具有強α-螺旋傾向在胺基酸的非保守序列，其後為共同序列-D(V/I)ExNPG P，其中x=任何胺基酸。交錯元件之一些非限制性實例包括GDVESNPGP、GDIEENPGP、VEPNPGP、IETNPGP、GDIESNPGP、GDVELNPGP、GDIETNPGP、GDVENPGP、GDVEENPGP、GDVEQNPGP、IESNPGP、GDIELNPGP、HDIETNPGP、HDVETNPGP、HDVEMNPGP、GDMESNPGP、GDVETNPGP、GDIEQNPGP及DSEFNPGP。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸在一或多個表現序列末端處包括終止序列。在一些實施例中，一或多個表現序列缺乏終止序列。一般而言，終止序列包括傳導轉譯終止信號之同框核苷酸三聯體，例如UAA、UGA、UAG。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸中之一或多個終止序列為框移終止序列，諸如但不限於可終止轉譯之出框或-1及+1移動閱讀框架(例如隱藏終止)。框移終止序列包括出現在表現序列之第二及第三閱讀框架中之核苷酸三聯體TAA、TAG及TGA。框移終止序列在防止通常對細胞不利的mRNA誤讀方面可為重要的。
在一些實施例中，本文所述之交錯序列可終止轉譯及/或裂解本文所述之共同序列的G與P之間的表現產物。作為一個非限制性實例，環狀多核糖核苷酸包括至少一個交錯序列以終止轉譯及/或裂解表現產物。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括與至少一個表現序列相鄰之交錯序列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括在各表現序列之後的交錯序列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括存在於各表現序列之一側或兩側的交錯序列，引起各表現序列之個別肽及或多肽的轉譯。 多A序列
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括多A序列。在一些實施例中，多A序列之長度大於10個核苷酸。在一些實施例中，多A序列之長度大於15個核苷酸(例如，至少或大於約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500及3,000個核苷酸)。在一些實施例中，多A序列為約10至約3,000個核苷酸(例如，30至50、30至100、30至250、30至500、30至750、30至1,000、30至1,500、30至2,000、30至2,500、50至100、50至250、50至500、50至750、50至1,000、50至1,500、50至2,000、50至2,500、50至3,000、100至500、100至750、100至1,000、100至1,500、100至2,000、100至2,500、100至3,000、500至750、500至1,000、500至1,500、500至2,000、500至3,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至2,500、1,000至3,000、1,500至2,000、1,500至2,500、1,500至3,000、2,000至3,000、2,000至2,500及2,500至3,000)。
在一些實施例中，多A序列係相對於整個環狀多核糖核苷酸之長度來設計。該設計可基於編碼區之長度、特定特徵或區(諸如第一或側接區)之長度，或基於由環狀多核糖核苷酸表現之最終產物的長度。在此情形下，多A序列之長度可比環狀多核糖核苷酸或其特徵大10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%。多A序列亦可設計為環狀多核糖核苷酸之一部分。在此情形下，多A序列可為構築體之全長或構築體之全長減去多A序列的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。此外，環狀多核糖核苷酸與多A結合蛋白之經工程改造之結合位點及接合可增強表現。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸經設計以包括多A-G四聯體。G四聯體為四個鳥嘌呤核苷酸之環狀氫鍵結陣列，其可由DNA及RNA中之富G序列形成。在一些實施例中，G四聯體可併入多A序列之末端。可在不同時間點分析所得環狀多核糖核苷酸構築體之穩定性、蛋白質產生及/或包括半衰期之其他參數。在一些實施例中，多A-G四聯體可導致蛋白質產生相當於單獨使用120個核苷酸之多A序列所見之蛋白質產生的至少75%。 其他序列
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸進一步包括另一核酸序列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸可包括DNA、RNA或人工核酸序列。其他序列可包括但不限於基因體DNA、cDNA或編碼tRNA、mRNA、rRNA、miRNA、gRNA、siRNA或其他RNAi分子之序列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括編碼siRNA以靶向與環狀多核糖核苷酸相同的基因表現產物之一或多個不同基因座之序列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括編碼siRNA以靶向與環狀多核糖核苷酸不同的基因表現產物之序列。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸缺乏5'-UTR。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸缺乏3'-UTR。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸缺乏多A序列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸缺乏終止序列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸缺乏內部核糖體進入位點。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸缺乏核酸外切酶之降解敏感性。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸缺乏與帽結合蛋白之結合。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸缺乏5'帽。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含以下序列中之一或多者：編碼一或多個miRNA之序列、編碼一或多個複製蛋白之序列、編碼外源基因之序列、編碼治療劑之序列、調控序列(例如啟動子、強化子)、編碼一或多個靶向內源基因(siRNA、lncRNA、shRNA)之調控序列的序列以及編碼治療性mRNA或蛋白質之序列。
另一序列之長度可為約2至約5000 nt、約10至約100 nt、約50至約150 nt、約100至約200 nt、約150至約250 nt、約200至約300 nt、約250至約350 nt、約300至約500 nt、約10至約1000 nt、約50至約1000 nt、約100至約1000 nt、約1000至約2000 nt、約2000至約3000 nt、約3000至約4000 nt、約4000至約5000 nt或其間的任何範圍。
由於環化，環狀多核糖核苷酸可包括某些區別於線性RNA之特徵。舉例而言，與線性RNA相比，環狀多核糖核苷酸不易由核酸外切酶降解。因此，環狀多核糖核苷酸比線性RNA更穩定，尤其在核酸外切酶存在下培育時。與線性RNA相比，環狀多核糖核苷酸之穩定性增加，使得環狀多核糖核苷酸作為產生多肽之細胞轉型試劑更有用，且可比線性RNA更容易儲存，儲存時間更長。用核酸外切酶處理之環狀多核糖核苷酸的穩定性可使用此項技術中標準的方法測試，該等方法判定RNA是否發生降解(例如藉由凝膠電泳)。
此外，與線性RNA不同，當環狀多核糖核苷酸與磷酸酶(諸如小牛腸磷酸酶)一起培育時，環狀多核糖核苷酸不易去磷酸化。 核苷酸間隔序列
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含間隔序列。
間隔子可為GC含量低之核酸分子，例如在間隔子之全長中，或在間隔子之至少50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的連續核酸殘基中少於65%、60%、55%、50%、55%、50%、45%、40%、39%、38%、37%、36%、35%、34%、33%、32%、31%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。在一些實施例中，間隔子基本上不含二級結構，諸如小於40 kcal/mol，小於-39、-38、-37、 -36、-35、-34、-33、-32、-31、-30、-29、-28、-27、-26、-25、-24、-23、-22、-20、-19、-18、-17、-16、-15、-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2或-1 kcal/mol。間隔子可包括核酸，諸如DNA或RNA。
間隔序列可編碼RNA序列，較佳編碼蛋白質或肽序列，包括分泌信號肽。
間隔序列可為非編碼的。當間隔子為非編碼序列時，可在相鄰序列之編碼序列中提供起始密碼子。在一些實施例中，設想編碼序列之第一核酸殘基可為起始密碼子諸如AUG之A殘基。當間隔子編碼RNA或蛋白質或肽序列時，可在間隔序列中提供起始密碼子。
在一些實施例中，間隔子可操作地連接於本文所述之另一序列。 非核酸連接子
本文所述之環狀多核糖核苷酸亦可包含非核酸連接子。在一些實施例中，本文所述之環狀多核糖核苷酸在本文所述之序列或元件中之一或多者之間具有非核酸連接子。在一些實施例中，一或多個本文所述之序列或元件與連接子連接。非核酸連接子可為化學鍵，例如一或多個共價鍵或非共價鍵。在一些實施例中，非核酸連接子為肽或蛋白質連接子。此類連接子可為2-30個胺基酸或更長。連接子包括本文所述之可撓性、剛性或可裂解連接子。
最常用的可撓性連接子具有主要由Gly及Ser殘基段構成之序列(「GS」連接子)。可撓性連接子可用於接合需要一定程度之移動或相互作用的域，且可包括小型非極性(例如Gly)或極性(例如Ser或Thr)胺基酸。併入Ser或Thr亦可藉由與水分子形成氫鍵來維持連接子在水溶液中之穩定性，且因此減少連接子與蛋白質部分之間的不利相互作用。
剛性連接子可用於保持域之間的固定距離及維持其獨立功能。當域之空間分離對於保持融合物中之一或多種組分的穩定性或生物活性至關重要時，剛性連接子亦可為有用的。剛性連接子可具有α螺旋結構或富含Pro之序列(XP)n ，其中X表示任何胺基酸，較佳Ala、Lys或Glu。
可裂解連接子可活體內釋放游離的功能域。在一些實施例中，連接子可在特定條件下，諸如在還原試劑或蛋白酶之存在下裂解。活體內可裂解連接子可利用二硫鍵之可逆性。一個實例包括兩個Cys殘基之間的凝血酶敏感性序列(例如PRS)。活體外凝血酶處理CPRSC使得凝血酶敏感性序列裂解，而可逆的二硫鍵保持完整。融合物中連接子之活體內裂解亦可藉由在病理條件(例如癌症或炎症)下活體內表現、在特定細胞或組織中或受限於某些細胞區室內之蛋白酶進行。許多蛋白酶之特異性使得連接子在受限區室中較慢地裂解。
連接分子之實例包括疏水性連接子，諸如帶負電荷之磺酸酯基；脂質，諸如聚(‒CH2 ‒脂質，諸如聚(‒CHe g聚乙二醇(PEG)基團、其不飽和變體、其羥基化變體、其醯胺化或其他含N變體、非碳連接子；碳水化合物連接子；磷酸二酯連接子或其他能夠共價連接兩個或更多個多肽之分子。亦包括非共價連接子，諸如多肽連接之疏水性脂質小球體，例如經由多肽之疏水性區域或多肽之疏水性延長段，諸如一系列富含白胺酸、異白胺酸、纈胺酸或可能亦富含丙胺酸、苯丙胺酸或甚至酪胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸或其他疏水性殘基之殘基。多肽可使用基於電荷之化學方法連接，使得多肽之帶正電荷部分連接至另一多肽或核酸之負電荷。 修飾
在一些態樣中，本文所述之本發明包含使用及製造經修飾之環狀多核糖核苷酸以及遞送經修飾之環狀多核糖核苷酸的組合物及方法。術語「經修飾之核苷酸」可指相對於未經修飾之天然核糖核苷酸之化學組成，諸如表 5 中之化學式所示之天然未經修飾之核苷酸腺苷(A)、尿苷(U)、鳥嘌呤(G)、胞苷(C)及單磷酸酯，具有一或多個化學修飾的任何核苷酸類似物或衍生物。經修飾之核糖核苷酸的化學修飾為對核糖核苷酸之任一或多個官能基，諸如糖、核鹼基或核苷間鍵(例如對連接磷酸酯/磷酸二酯鍵/磷酸二酯主鏈)的修飾。 表5. 未經修飾之天然核糖核苷
核糖核苷 IUPAC 名稱 化學式
腺苷 (2R ,3R ,4S ,5R )-2-(6-胺基-9H -嘌呤-9-基)-5-(羥甲基)氧雜環戊烷-3,4-二醇
Figure 02_image005
尿苷 1-[(3R ,4S ,5R )-3,4-二羥基-5-(羥甲基)氧雜環戊-2-基]嘧啶-2,4-二酮
Figure 02_image007
鳥嘌呤 2-胺基-9H -嘌呤-6(1H )-酮
Figure 02_image009
胞苷 4-胺基-1-[(2R ,3R ,4S ,5R )-3,4-二羥基-5-(羥甲基)氧雜環戊-2-基]嘧啶-2(1H )-酮
Figure 02_image011
環狀多核糖核苷酸可包括相對於參考序列，特別是親本多核糖核苷酸之一或多個取代、插入及/或添加、缺失及共價修飾，其均包括於本發明之範疇內。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括一或多種轉錄後修飾(例如加帽、裂解、多腺苷酸化、剪接、多A序列、甲基化、醯化、磷酸化、離胺酸及精胺酸殘基之甲基化、乙醯化及硫醇基及酪胺酸殘基之亞硝基化等)。環狀多核糖核苷酸可包括任何有用的修飾，諸如對糖、核鹼基或核苷間鍵(例如對連接磷酸酯/磷酸二酯鍵/磷酸二酯主鏈)之修飾。嘧啶核鹼基之一或多個原子可經視情況經取代之胺基、視情況經取代之硫醇、視情況經取代之烷基(例如甲基或乙基)或鹵基(例如氯或氟)置換或取代。在某些實施例中，修飾(例如一或多個修飾)存在於糖及核苷間鍵中之每一者中。修飾可為核糖核酸(RNA)修飾成去氧核糖核酸(DNA)、蘇糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)或其雜交體)。本文描述了額外修飾。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個N(6)甲基腺苷(m6A)修飾以提高轉譯效率。
在一些實施例中，修飾可包括化學或細胞誘導之修飾。舉例而言，細胞內RNA修飾之一些非限制性實例由Lewis及Pan在「RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions」, Nat Reviews Mol Cell Biol, 2017, 18:202-210中描述。
在另一個實施例中，「假尿苷」係指m1 acp3 Ψ (1-甲基-3-(3-胺基-3-羧丙基)假尿苷。在另一個實施例中，該術語係指m1 Ψ (1-甲基假尿苷)。在另一個實施例中，該術語係指Ψm (2'-O-甲基假尿苷。在另一個實施例中，該術語係指m5D (5-甲基二氫尿苷)。在另一個實施例中，該術語係指m3 Ψ (3-甲基假尿苷)。在另一個實施例中，該術語係指未進一步修飾之假尿苷部分。在另一個實施例中，該術語係指以上假尿苷中之任一者的單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。在另一個實施例中，該術語係指此項技術中已知的任何其他假尿苷。各可能性代表本發明之各別實施例。
在一些實施例中，對環狀多核糖核苷酸之核糖核苷酸的化學修飾可增強免疫逃避。修飾包括例如末端修飾，例如5'末端修飾(磷酸化(單、二及三)、接合、反向鍵等)、3'末端修飾(接合、DNA核苷酸、反向鍵等)、鹼基修飾(例如用穩定化鹼基、去穩定化鹼基或與擴大的搭配物庫形成鹼基對之鹼基置換)、移除鹼基(無鹼基核苷酸)或接合鹼基。經修飾之核糖核苷酸鹼基亦可包括5-甲基胞苷及假尿苷。在一些實施例中，鹼基修飾可調節環狀多核糖核苷酸之表現、免疫反應、穩定性、亞細胞定位等功能效應。在一些實施例中，修飾包括雙正交核苷酸，例如非天然鹼基。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸之一或多個核糖核苷酸的糖修飾(例如在2'位置或4'位置)或糖置換以及主鏈修飾可包括磷酸二酯鍵之修飾或置換。環狀多核糖核苷酸之非限制性實例包括具有經修飾之主鏈或非天然核苷間鍵的環狀多核糖核苷酸，諸如磷酸二酯鍵經修飾或置換之環狀多核糖核苷酸。具有經修飾之主鏈的環狀多核糖核苷酸尤其包括主鏈中不具有磷原子之環狀多核糖核苷酸。出於本申請案之目的，且如此項技術中有時所提及，在核苷間主鏈中不具有磷原子之經修飾之RNA亦可視為寡核苷。在特定實施例中，環狀多核糖核苷酸將包括在核苷間主鏈中具有磷原子之核糖核苷酸。
經修飾之環狀多核糖核苷酸主鏈可包括例如硫代磷酸酯；對掌性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；胺基烷基磷酸三酯；甲基及其他烷基膦酸酯，諸如3'-伸烷基膦酸酯及對掌性膦酸酯；亞膦酸酯；胺基磷酸酯，諸如具有正常3'-5'鍵之3'-胺基胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷酸酯、硫代胺基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯及硼烷磷酸酯、其2'-5'鍵聯之類似物及具有反向極性之胺基磷酸酯，其中相鄰的核苷單元對以3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'鍵聯。亦包括各種鹽、混合鹽及游離酸形式。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸可帶負電荷或正電荷。
可併入環狀多核糖核苷酸中之經修飾之核苷酸可在核苷間鍵(例如磷酸酯主鏈)上進行修飾。在本文中，在多核苷酸主鏈之上下文中，片語「磷酸酯」及「磷酸二酯」可互換使用。主鏈磷酸酯基團可藉由用不同的取代基置換一或多個氧原子來修飾。此外，經修飾之核苷及核苷酸可包括用如本文所述之另一核苷間鍵全盤置換未經修飾之磷酸酯部分。經修飾之磷酸酯基團之實例包括但不限於硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate ester)、氫膦酸酯、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯及磷酸三酯。二硫代磷酸酯之兩個非連接氧均經硫置換。磷酸酯連接子亦可藉由用氮(橋接胺基磷酸酯)、硫(橋接硫代磷酸酯)及碳(橋接亞甲基-膦酸酯)置換連接氧來修飾。
提供經α-硫基取代之磷酸酯部分以經由非天然硫代磷酸酯主鏈鍵聯賦予RNA及DNA聚合物穩定性。硫代磷酸酯DNA及RNA具有增加的核酸酶抗性，隨後在細胞環境中具有更長的半衰期。預期連接至環狀多核糖核苷酸之硫代磷酸酯經由細胞先天性免疫分子之較弱的結合/活化來減少先天性免疫反應。
在一些實施例中，經修飾之核苷包括α-硫基-核苷(例如5'-O-(l-硫代磷酸酯)-腺苷、5'-O-(l-硫代磷酸酯)-胞苷(α-硫基-胞苷)、5'-O-(l-硫代磷酸酯)-鳥苷、5'-O-(l-硫代磷酸酯)-尿苷或5'-O-(1-硫代磷酸酯)-假尿苷)。其他核苷間鍵可包括不含磷原子之核苷間鍵。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸可包括一或多種細胞毒性核苷。舉例而言，細胞毒性核苷可併入環狀多核糖核苷酸中，諸如雙官能修飾。細胞毒性核苷可包括但不限於腺苷阿拉伯糖苷、5-氮雜胞苷、4'-硫基-阿糖胞苷、環戊烯基胞嘧啶、克拉屈濱(cladribine)、氯法拉濱(clofarabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、l-(2-C-氰基-2-去氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊醣基)-胞嘧啶、地西他濱(decitabine)、5-氟尿嘧啶、氟達拉濱(fludarabine)、氟尿苷、吉西他濱(gemcitabine)、喃氟啶(tegafur)與尿嘧啶之組合、喃氟啶((R,S)-5-氟-l-(四氫呋喃-2-基)嘧啶-2,4(lH,3H)-二酮)、曲沙他濱(troxacitabine)、替紮他濱(tezacitabine)、2'-去氧-2'-亞甲基胞嘧啶核苷(DMDC)及6-巰基嘌呤。額外實例包括磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate)、N4-二十二烷醯基-l-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、N4-十八烷基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、N4-棕櫚醯基-l-(2-C-氰基-2-去氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊醣基)胞嘧啶及P-4055 (阿糖胞苷5'-反油酸酯)。
環狀多核糖核苷酸可沿分子之整個長度均勻地修飾。舉例而言，一或多種或所有類型之核苷酸(例如天然存在之核苷酸、嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C、I、pU中之任一或多者或全部)可在環狀多核糖核苷酸中或在其給定的預定序列區中均勻地修飾。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括假尿苷。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括肌苷，其可有助於免疫系統相對於病毒RNA將環狀多核糖核苷酸表徵為內源性的。肌苷之併入亦可介導改良之RNA穩定性/減少降解。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸(或其給定序列區)中之所有核苷酸經修飾。在一些實施例中，修飾可包括m6A，其可加強表現；肌苷，其可減弱免疫反應；假尿苷，其可增加RNA穩定性或轉譯連讀(終止密碼子=編碼潛力)；m5C，其可增加穩定性；及2,2,7-三甲基鳥苷，其有助於亞細胞易位(例如核定位)。
不同的糖修飾、核苷酸修飾及/或核苷間鍵(例如主鏈結構)可存在於環狀多核糖核苷酸之不同位置。一般熟習此項技術者應瞭解，核苷酸類似物或其他修飾可位於環狀多核糖核苷酸之任何位置，使得環狀多核糖核苷酸之功能實質上不降低。修飾亦可為非編碼區修飾。環狀多核糖核苷酸可包括約1%至約100%經修飾之核苷酸(相對於總核苷酸含量，或相對於一或多種類型之核苷酸，亦即A、G、U或C中之任一或多者)或任何中間百分比(例如1%至20%＞、1%至25%、1%至50%、1%至60%、1%至70%、1%至80%、1%至90%、1%至95%、10%至20%、10%至25%、10%至50%、10%至60%、10%至70%、10%至80%、10%至90%、10%至95%、10%至100%、20%至25%、20%至50%、20%至60%、20%至70%、20%至80%、20%至90%、20%至95%、20%至100%、50%至60%、50%至70%、50%至80%、50%至90%、50%至95%、50%至100%、70%至80%、70%至90%、70%至95%、70%至100%、80%至90%、80%至95%、80%至100%、90%至95%、90%至100%及95%至100%)。
在一些實施例中，本文提供之環狀多核糖核苷酸為經修飾之環狀多核糖核苷酸。舉例而言，經完全修飾之環狀多核糖核苷酸包含全部或基本上全部經修飾之腺苷殘基、全部或基本上全部經修飾之尿苷殘基、全部或基本上全部經修飾之鳥嘌呤殘基、全部或基本上全部經修飾之胞苷殘基或其任何組合。在一些實施例中，本文提供之環狀多核糖核苷酸為經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸。經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸可具有至少一個經修飾之核苷酸，且可具有一部分連續未經修飾之核苷酸。經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之此未經修飾之部分可具有至少約5、10、15或20個連續未經修飾之核苷酸，或其間的任何數目。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之未經修飾之部分具有至少約30、40、40、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、180、200、220、250、280、300、320、350、380、400、420、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或1000個連續未經修飾之核苷酸，或其間的任何數目。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個未經修飾之部分。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、30、40、50、70、80、100、120、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000個或更多個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸具有至少1%、2%、5%、7%、8%、10%、12%、15%、18%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%、95%或99%但小於100%的核苷酸經修飾。在一些實施例中，未經修飾之部分包含結合位點。在一些實施例中，未經修飾之部分包含經組態以結合蛋白質、DNA、RNA或細胞目標之結合位點。在一些實施例中，未經修飾之部分包含IRES。
在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之免疫原性低於相應未經修飾之環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之免疫原性比相應未經修飾之環狀多核糖核苷酸低至少約1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍。在一些實施例中，如本文所述之免疫原性藉由RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR及IFN-β中之至少一者的表現量或信號傳導或活化來評定。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之半衰期高於相應未經修飾之環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之半衰期比相應未經修飾之環狀多核糖核苷酸高至少約1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍。在一些實施例中，半衰期係藉由將環狀多核糖核苷酸或相應環狀多核糖核苷酸引入細胞中，且量測所引入之環狀多核糖核苷酸或相應環狀多核糖核苷酸在細胞內之含量來量測。
在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸包含一或多個表現序列。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之一或多個表現序列的轉譯效率類似於或高於相應未經修飾之環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之一或多個表現序列的轉譯效率比相應未經修飾之環狀多核糖核苷酸高至少約0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8或3倍。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之一或多個表現序列的轉譯效率高於具有包含經修飾之核苷酸之部分(例如，該部分對應於經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之未經修飾之部分)的相應環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸之一或多個表現序列經組態以具有比具有包含大於10%或至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%經修飾之核苷酸之第一部分的相應環狀多核糖核苷酸高的轉譯效率。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之一或多個表現序列的轉譯效率比具有包含經修飾之核苷酸之部分(例如，該部分對應於經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之未經修飾之部分)的相應環狀多核糖核苷酸高至少約1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍。如本文所述，在一些實施例中，轉譯效率係在包含環狀多核糖核苷酸或相應環狀多核糖核苷酸之細胞中或在活體外轉譯系統(例如兔網狀紅血球溶解物)中進行量測。
在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸具有未經修飾(例如無經修飾之核苷酸)之結合位點。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸具有經組態以與蛋白質、DNA、RNA或細胞目標結合之結合位點，該結合位點未經修飾，例如無經修飾之核苷酸。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸具有未經修飾(例如無經修飾之核苷酸)之內部核糖體進入位點(IRES)。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之結合位點中不超過10%的核苷酸為經修飾之核苷酸。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之經組態以與蛋白質、DNA、RNA或細胞目標結合之結合位點中不超過10%的核苷酸為經修飾之核苷酸。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之內部核糖體進入位點(IRES)中不超過10%的核苷酸為經修飾之核苷酸。在一些實施例中，除結合位點之外，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸整個具有經修飾之核苷酸。在一些實施例中，除經組態以結合蛋白質、DNA、RNA或細胞目標之結合位點之外，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸整個具有經修飾之核苷酸。在一些實施例中，除IRES元件之外，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸整個具有經修飾之核苷酸。在其他實施例中，除IRES元件及一或多個其他部分之外，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸整個具有經修飾之核苷酸。不希望受某種理論束縛，未經修飾之IRES元件使得經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸成為轉譯勝任型，例如對一或多個表現序列之轉譯效率類似於或高於不具有任何經修飾之核苷酸的相應環狀多核糖核苷酸。
在一些實施例中，除IRES元件或經組態以結合蛋白質、DNA、RNA或細胞目標之結合位點之外，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸在整個環狀多核糖核苷酸中具有經修飾之核苷酸，例如5'甲基胞苷及假尿苷。在此等情況下，與不包含5'甲基胞苷及假尿苷之相應環狀多核糖核苷酸相比，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸具有較低的免疫原性。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之免疫原性比相應未經修飾之環狀多核糖核苷酸低至少約1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍。在一些實施例中，如本文所述之免疫原性藉由RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR及IFN-β中之至少一者的表現或信號傳導或活化來評定。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之半衰期高於相應未經修飾之環狀多核糖核苷酸，例如不包含5'甲基胞苷及假尿苷之相應環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸之半衰期比相應未經修飾之環狀多核糖核苷酸高至少約1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0倍。在一些實施例中，半衰期係藉由將環狀多核糖核苷酸或相應環狀多核糖核苷酸引入細胞中，且量測所引入之環狀多核糖核苷酸或相應環狀多核糖核苷酸在細胞內之含量來量測。
在一些情況下，如本文所述之經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸與其他方面相同但經完全修飾之相應環狀多核糖核苷酸相比，具有類似的免疫原性。舉例而言，除IRES元件之外整個具有5'甲基胞苷及假尿苷之經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸，與其他方面相同但整個具有5'甲基胞苷及假尿苷且無未經修飾之胞苷及尿苷的相應環狀多核糖核苷酸相比，可具有類似的免疫原性或更低的免疫原性。在一些實施例中，除IRES元件之外整個具有5'甲基胞苷及假尿苷之經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸的轉譯效率類似於或高於其他方面相同但整個具有5'甲基胞苷及假尿苷且無未經修飾之胞苷及尿苷的相應環狀多核糖核苷酸的轉譯效率。 環狀多核糖核苷酸之接合
本發明之circRNA可例如與化合物(例如小分子)、抗體或其片段、肽、蛋白質、適體、藥物或其組合接合。在一些實施例中，小分子可與circRNA接合，從而產生包含小分子之circRNA。
本發明之circRNA可包含接合部分以促進接合。接合部分可例如在環狀多核苷酸之內部位點，或在線性多核苷酸之5'端、3'端或內部位點處併入。接合部分可以化學或酶促方式併入。舉例而言，接合部分可在固相寡核苷酸合成期間、共轉錄(例如用耐受性RNA聚合酶)或轉譯後(例如用RNA甲基轉移酶)併入。接合部分可為經修飾之核苷酸或核苷酸類似物，例如溴去氧尿苷。接合部分可包含反應性基團或官能基，例如疊氮基或炔基。接合部分能夠進行化學選擇性反應。接合部分可為半抗原基團，例如包含地高辛(digoxigenin)、2,4-二硝基苯基、生物素、抗生物素蛋白，或選自唑類、硝基芳基化合物、苯并呋呫類、三萜類、脲類、硫脲類、魚藤酮類、㗁唑類、噻唑類、香豆素類、環木脂體類、雜聯芳基化合物、偶氮芳基化合物或苯并二氮呯類。接合部分可包含能夠進行可逆電環重排的二芳基乙烯光開關。接合部分可包含親核體、碳陰離子及/或α,β-不飽和羰基化合物。
circRNA可經由化學反應來接合，例如使用點擊化學、施陶丁格連接(Staudinger ligation)、Pd催化之C-C鍵形成(例如鈴木-宮浦反應(Suzuki-Miyaura reaction))、邁克爾加成(Michael addition)、烯烴複分解或反電子需求狄爾斯-阿爾德(Diels-Alder)。點擊化學可使用在適當反應條件下彼此迅速且選擇性地反應(「點擊」)之官能基對。非限制性的點擊化學反應包括疊氮-炔烴環加成、銅催化之1,3-偶極疊氮-炔烴環加成(CuAAC)、張力促進之疊氮-炔烴點擊化學反應(SPAAC)及四𠯤-烯烴連接。
官能化核苷酸之非限制性實例包括經疊氮修飾之UTP類似物、5-疊氮基甲基-UTP、5-疊氮基-C3-UTP、5-疊氮基-PEG4-UTP、5-乙炔基-UTP、DBCO-PEG4-UTP、乙烯基-UTP、8-疊氮基-ATP、3'-疊氮基-2',3'-ddATP、5-疊氮基-PEG4-CTP、5-DBCO-PEG4-CTP、N6-疊氮基己基-3'-dATP、5-DBCO-PEG4-dCpG及5-疊氮基丙基-UTP。在一些實施例中，circRNA包含至少一個5-疊氮基甲基-UTP、5-疊氮基-C3-UTP、5-疊氮基-PEG4-UTP、5-乙炔基-UTP、DBCO-PEG4-UTP、乙烯基-UTP、8-疊氮基-ATP、5-疊氮基-PEG4-CTP、5-DBCO-PEG4-CTP或5-疊氮基丙基-UTP。
所選單個經修飾之核苷酸(例如，在2'-位置含有疊氮之經修飾之A、C、G、U或T)可在最佳化條件下(例如，經由固相化學合成)位點特異性地併入。複數個在2'-位置含有疊氮之核苷酸可例如藉由在活體外轉錄反應期間取代核苷酸(例如，用UTP取代5-疊氮基-C3-UTP)來併入。
可使用銅催化之點擊反應，例如炔烴官能化小分子及疊氮官能化多核糖核酸之銅催化之1,3-偶極疊氮-炔烴環加成(CuAAC)生成circRNA接合物。線性RNA可與小分子接合。舉例而言，線性RNA可在其3'端藉由多(A)聚合酶用疊氮基衍生之核苷酸進行修飾。疊氮可經由銅催化或張力促進之疊氮-炔烴點擊反應與小分子接合，且線性RNA可環化。
可使用施陶丁格反應生成circRNA接合物。舉例而言，包含疊氮官能化核苷酸之環狀RNA可在三苯基膦-3,3',3''-三磺酸(TPPTS)存在下與炔烴官能化小分子接合。
可使用鈴木-宮浦反應生成circRNA接合物。舉例而言，包含鹵化核苷酸類似物之circRNA可在同源反應性搭配物存在下進行鈴木-宮浦反應。舉例而言，包含5-碘尿苷三磷酸(IUTP)之circRNA可與Pd(OAc)2 及2-胺基嘧啶-4,6-二醇(ADHP)或經二甲胺基取代之ADHP (DMADHP)一起用於催化系統，以在各種
Figure 110103507-A0101-12-0030-1
酸(boronic acid)及酯受質存在下使碘尿苷標記之circRNA官能化。在另一個實例中，包含8-溴鳥苷之circRNA可在由Pd(OAc)2 及水溶性三苯基膦-3,3',3''-三磺酸鹽配體構成之催化系統存在下與芳基
Figure 110103507-A0101-12-0030-1
酸反應。
可使用邁克爾加成，例如經由富含電子之邁克爾供體與α,β-不飽和化合物(邁克爾受體)之反應生成circRNA接合物。 結構
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含高階結構，例如二級或三級結構。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸之互補區段自身摺疊成雙股區段，用例如A-U及C-G對之間的氫鍵固持在一起。在一些實施例中，螺旋，亦稱為莖，在分子內形成，具有連接至末端環之雙股區段。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸具有至少一個具有準雙股二級結構之區段。在一些實施例中，具有準雙股二級結構之區段具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個或更多個配對的核苷酸。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸具有一或多個(例如2、3、4、5、6個或更多個)具有準雙股二級結構之區段。在一些實施例中，各區段由3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個或更多個核苷酸分隔開。
存在16種可能的鹼基配對，然而，其中六種(AU、GU、GC、UA、UG、CG)可形成實際的鹼基對。其餘稱為失配且在螺旋中以極低的頻率出現。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸之結構無法輕易破壞而不影響其功能及致死性後果，此提供維持二級結構之選擇。在一些實施例中，莖之一級結構(亦即其核苷酸序列)仍可變化，同時仍維持螺旋區。鹼基之性質對高級結構而言為次要的，且只要保留二級結構即可進行取代。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸具有準螺旋結構。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸具有至少一個具有準螺旋結構之區段。在一些實施例中，具有準螺旋結構之區段具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個或更多個核苷酸。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸具有一或多個(例如2、3、4、5、6個或更多個)具有準螺旋結構之區段。在一些實施例中，各區段由3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個或更多個核苷酸分隔開。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括富含U或富含A之序列或其組合中之至少一者。在一些實施例中，富含U及/或富含A之序列以將產生三重準螺旋結構之方式排列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸具有雙重準螺旋結構。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸具有一或多個(例如2、3、4、5、6個或更多個)具有雙重準螺旋結構之區段。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括富含C及/或富含G之序列中之至少一者。在一些實施例中，富含C及/或富含G之序列以將產生三重準螺旋結構之方式排列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸具有有助於穩定之分子內三重準螺旋結構。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸具有兩個準螺旋結構(例如由磷酸二酯鍵分隔開)，以使其末端鹼基對堆疊且準螺旋結構變得共線，從而產生「同軸堆疊」子結構。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸具有至少一個miRNA結合位點、至少一個lncRNA結合位點及/或至少一個tRNA模體。 環化
在一些實施例中，線性環狀多核糖核苷酸可經環化或串聯。在一些實施例中，線性環狀多核糖核苷酸可在調配及/或遞送之前活體外環化。在一些實施例中，線性環狀多核糖核苷酸可在細胞內環化。 細胞外環化
在一些實施例中，線性環狀多核糖核苷酸使用化學方法環化或串聯以形成環狀多核糖核苷酸。在一些化學方法中，核酸(例如線性環狀多核糖核苷酸)之5'端及3'端包括化學反應性基團，該等基團靠近在一起時可在分子之5'端與3'端之間形成新的共價鍵。5'端可含有NHS-酯反應性基團且3'端可含有3'-胺基封端之核苷酸，使得在有機溶劑中，線性RNA分子之3'端上的3'-胺基封端之核苷酸將對5'-NHS-酯部分進行親核攻擊，從而形成新的5'-或3'-醯胺鍵。
在一些實施例中，可使用DNA或RNA連接酶將5'-磷酸化核酸分子(例如線性環狀多核糖核苷酸)與核酸(例如線性核酸)之3'-羥基酶促連接，形成新的磷酸二酯鍵。在一個例示性反應中，根據製造商的方案，將線性環狀多核糖核苷酸與1-10單位之T4 RNA連接酶(New England Biolabs, Ipswich, MA)一起在37℃下培育1小時。連接反應可在能夠與並列之5'-及3'-區鹼基配對的線性核酸存在下進行，以輔助酶促連接反應。在一些實施例中，連接為夾板連接。舉例而言，夾板連接酶，如SplintR®連接酶，可用於夾板連接。對於夾板連接，單股多核苷酸(夾板)，如單股RNA，可經設計以與線性多核糖核苷酸之兩個末端雜交，使得在與單股夾板雜交後，兩個末端可並列。因此，夾板連接酶可催化線性多核糖核苷酸並列之兩個末端連接，產生環狀多核糖核苷酸。
在一些實施例中，DNA或RNA連接酶可用於環狀多核苷酸之合成中。作為非限制性實例，連接酶可為circ連接酶或環狀連接酶。
在一些實施例中，線性環狀多核糖核苷酸之5'端或3'端可編碼連接酶核糖核酸酶序列，使得在活體外轉錄期間，所得線性環狀多核糖核苷酸包括能夠將線性環狀多核糖核苷酸之5'端連接至線性環狀多核糖核苷酸之3'端的活性核糖核酸酶序列。連接酶核糖核酸酶可來源於I組內含子、肝炎δ病毒、髮夾核糖核酸酶，或可藉由SELEX (指數富集之配體系統進化技術，systematic evolution of ligands by exponential enrichment)來選擇。核糖核酸酶連接酶反應可在0至37℃之溫度下進行1至24小時。
在一些實施例中，線性環狀多核糖核苷酸可藉由使用至少一個非核酸部分環化或串聯。在一個態樣中，至少一個非核酸部分可與線性環狀多核糖核苷酸之5'端附近及/或3'端附近之區域或特徵反應，以使線性環狀多核糖核苷酸環化或串聯。在另一個態樣中，至少一個非核酸部分可位於或連接至或接近線性環狀多核糖核苷酸之5'端及/或3'端。所考慮之非核酸部分可為同源或異源的。作為一個非限制性實例，非核酸部分可為鍵，諸如疏水鍵、離子鍵、可生物降解鍵及/或可裂解鍵。作為另一個非限制性實例，非核酸部分為連接部分。作為另一個非限制性實例，非核酸部分可為寡核苷酸或肽部分，諸如本文所述之適體或非核酸連接子。
在一些實施例中，線性環狀多核糖核苷酸可由於非核酸部分引起線性環狀多核糖核苷酸之5'端及3'端處、附近或相連之原子、分子表面之間的引力而環化或串聯。作為非限制性實例，一或多個線性環狀多核糖核苷酸可藉由分子間力或分子內力而環化或串聯。分子間力之非限制性實例包括偶極-偶極力、偶極誘導之偶極力、誘導之偶極誘導之偶極力、凡得瓦爾力(Van der Waals force)及倫敦分散力(London dispersion force)。分子內力之非限制性實例包括共價鍵、金屬鍵、離子鍵、共振鍵、不可知鍵、偶極鍵、接合、超接合及反鍵。
在一些實施例中，線性環狀多核糖核苷酸可在5'端附近及3'端附近包含核糖核酸酶RNA序列。當核糖核酸酶RNA序列暴露於核糖核酸酶之其餘部分時，該序列可與肽共價連接。在一個態樣中，與5'端及3'端附近之核糖核酸酶RNA序列共價連接的肽可彼此締合，使得線性環狀多核糖核苷酸環化或串聯。在另一個態樣中，與5'端及3'端附近之核糖核酸酶RNA序列共價連接的肽可在使用此項技術中已知的各種方法(諸如但不限於蛋白質連接)進行連接後使線性初級構築體或線性mRNA環化或串聯。用於本發明之線性初級構築體或線性RNA之核糖核酸酶的非限制性實例或併入及/或共價連接肽之方法的非詳盡性清單描述於美國專利申請案第US20030082768號中，其內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，線性環狀多核糖核苷酸可包括核酸之5'三磷酸，其例如藉由使5'三磷酸與RNA 5'焦磷酸水解酶(RppH)或ATP二磷酸水解酶(腺苷三磷酸雙磷酸酶(apyrase))接觸而轉化為5'單磷酸。或者，線性環狀多核糖核苷酸之5'三磷酸轉化為5'單磷酸可藉由包含以下之兩步反應進行：(a)使線性環狀多核糖核苷酸之5'核苷酸與磷酸酶(例如南極磷酸酶、蝦鹼性磷酸酶或小牛腸磷酸酶)接觸，以移除所有三個磷酸；及(b)使步驟(a)之後的5'核苷酸與添加單個磷酸之激酶(例如多核苷酸激酶)接觸。
在一些實施例中，本文提供之環化方法的環化效率為至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或100%。在一些實施例中，本文提供之環化方法的環化效率為至少約40%。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個剪接元件。例示性剪接元件描述於WO2019/118919之第[0270] - [0275]段中，其以全文引用之方式併入本文中。 其他環化方法
在一些實施例中，線性環狀多核糖核苷酸可包括互補序列，包括個別內含子內或跨側接內含子之重複或非重複核酸序列。重複核酸序列為出現在環狀多核糖核苷酸之區段內的序列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括重複核酸序列。在一些實施例中，重複核苷酸序列包括多CA或多UG序列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個重複核酸序列，其與環狀多核糖核苷酸之另一區段中的互補重複核酸序列雜交，其中雜交區段形成內部雙股。在一些實施例中，來自兩個單獨環狀多核糖核苷酸之重複核酸序列及互補重複核酸序列雜交以產生單個環化多核糖核苷酸，其中雜交區段形成內部雙股。在一些實施例中，互補序列存在於線性環狀多核糖核苷酸之5'端及3'端。在一些實施例中，互補序列包括約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個或更多個配對的核苷酸。
在一些實施例中，可使用化學環化方法來生成環狀多核糖核苷酸。此類方法可包括但不限於點擊化學(例如基於炔烴及疊氮之方法，或可點擊之鹼基)、烯烴複分解、胺基磷酸酯連接、半胺縮醛-亞胺交聯、鹼基修飾及其任何組合。
在一些實施例中，可使用酶促環化方法來生成環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，可使用連接酶，例如DNA或RNA連接酶來生成環狀多核糖核苷酸或互補序列之模板、環狀多核糖核苷酸之互補股或環狀多核糖核苷酸。
環狀多核糖核苷酸之環化可藉由此項技術中已知的方法來完成，例如Petkovic及Muller, 「RNA circularization strategies in vivo and in vitro」, Nucleic Acids Res, 2015, 43(4): 2454-2465及Muller及Appel, 「In vitro circularization of RNA」, RNA Biol, 2017, 14(8):1018-1027中描述之方法。
環狀多核糖核苷酸可編碼可用於複製之序列及/或模體。例示性複製元件包括RNA聚合酶之結合位點。其他類型之複製元件描述於WO2019/118919之第[0280] - [0286]段中，其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，如本文所揭示之環狀多核糖核苷酸缺乏複製元件，例如缺乏RNA依賴性RNA聚合酶結合位點。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸缺乏多A序列及複製元件。 生產方法
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包括非天然存在之去氧核糖核酸序列，且可使用重組技術(例如使用DNA質體活體外衍生)、化學合成或其組合生產。
在本發明之範疇內，用於生產RNA環之DNA分子可包含天然存在之原始核酸序列的DNA序列、其經修飾之型式或編碼自然界中通常不存在之合成多肽(例如嵌合分子或融合蛋白，諸如包含多個抗原及/或抗原決定基之融合蛋白)的DNA序列。DNA及RNA分子可使用多種技術進行修飾，包括但不限於經典突變誘發技術及重組技術，諸如定點突變誘發、對核酸分子之化學處理以誘導突變、核酸片段之限制酶裂解、核酸片段之連接、核酸序列選定區之聚合酶鏈反應(PCR)擴增及/或突變誘發、寡核苷酸混合物之合成及混合基團之連接以「構建」核酸分子之混合物及其組合。
環狀多核糖核苷酸可根據任何可用的技術製備，包括但不限於化學合成及酶促合成。在一些實施例中，線性初級構築體或線性mRNA可經環化或串聯以產生本文所述之環狀多核糖核苷酸。環化或串聯之機制可經由諸如但不限於化學、酶促、夾板連接)之方法或核糖核酸酶催化之方法進行。新形成的5'-/3'-鍵可為分子內鍵或分子間鍵。
製造本文所述之環狀多核糖核苷酸之方法描述於例如Khudyakov及Fields, Artificial DNA: Methods and Applications, CRC Press (2002)；Zhao, Synthetic Biology: Tools and Applications, (第一版), Academic Press (2013)；以及Egli及Herdewijn, Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids, (第一版), Wiley-VCH (2012)中。
此項技術中亦描述多種合成環狀多核糖核苷酸之方法(參見例如美國專利案第US6210931號、美國專利案第US5773244號、美國專利案第US5766903號、美國專利案第US5712128號、美國專利案第US5426180號、美國公開案第US20100137407號、國際公開案第WO1992001813號及國際公開案第WO2010084371號；其中之每一者的內容以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸經純化，例如移除游離核糖核酸、線性或帶切口的RNA、DNA、蛋白質等。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸可藉由此項技術中常用的任何已知方法純化。非限制性純化方法之實例包括管柱層析、凝膠切除、尺寸排阻等。 應用
本文所述之非經腸遞送系統包含環狀多核糖核苷酸及非經腸可接受之稀釋劑，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。非經腸遞送系統可為不含任何載劑之遞送系統。非經腸遞送系統進一步包含載劑。本發明亦考慮一種活體內遞送環狀多核糖核苷酸之方法，其包含向個體非經腸投與該環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。環狀多核糖核苷酸之活體內遞送亦可包含將環狀多核糖核苷酸活體內遞送至個體之細胞或組織的方法，其包含向該細胞或組織非經腸投與該環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。環狀多核糖核苷酸可在組合物中。非經腸投與可包含肌肉內投與、靜脈內投與、經眼投與或局部投與。本文所述之環狀多核糖核苷酸可向有需要之細胞、組織或個體投與，例如以調節細胞、組織或個體之細胞功能或細胞過程，例如基因表現。本發明亦考慮調節細胞功能或細胞過程(例如基因表現)之方法，其包含向有需要之細胞、組織或個體投與本文所述之環狀多核糖核苷酸。所投與之環狀多核糖核苷酸可為經修飾之環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，所投與之環狀多核糖核苷酸為經完全修飾之環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，所投與之環狀多核糖核苷酸為經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸。在其他實施例中，所投與之環狀多核糖核苷酸為未經修飾之環狀多核糖核苷酸。
本文所述之非經腸遞送系統包含環狀多核糖核苷酸及非經腸可接受之稀釋劑，其中該環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸且包含結合目標之序列。非經腸遞送系統可為不含任何載劑之遞送系統。非經腸遞送系統進一步包含載劑。本發明亦考慮一種活體內遞送環狀多核糖核苷酸之方法，其包含向個體非經腸投與該環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸且包含結合目標之序列。環狀多核糖核苷酸之活體內遞送亦可包含將環狀多核糖核苷酸活體內遞送至個體之細胞或組織的方法，其包含向該細胞或組織非經腸投與該環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸且包含結合目標之序列。環狀多核糖核苷酸可在組合物中。非經腸投與可包含肌肉內投與、靜脈內投與、經眼投與或局部投與。本文所述之環狀多核糖核苷酸可向有需要之細胞、組織或個體投與，例如以調節細胞、組織或個體之細胞功能或細胞過程，例如基因表現。本發明亦考慮調節細胞功能或細胞過程(例如基因表現)之方法，其包含向有需要之細胞、組織或個體投與本文所述之環狀多核糖核苷酸。所投與之環狀多核糖核苷酸可為經修飾之環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，所投與之環狀多核糖核苷酸為經完全修飾之環狀多核糖核苷酸。在一些實施例中，所投與之環狀多核糖核苷酸為經雜交修飾之環狀多核糖核苷酸。在其他實施例中，所投與之環狀多核糖核苷酸為未經修飾之環狀多核糖核苷酸。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸缺乏多A序列、缺乏複製元件、缺乏自由3'端或缺乏RNA聚合酶識別模體或其任何組合。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸。
在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸進一步包含表現序列。在一些實施例中，環狀多核糖核苷酸包含終止元件或IRES，或其組合。
本文引用之所有參考文獻及出版物以引用的方式併入本文中。
提供以下實例以進一步說明本發明之一些實施例，例如使用模型元素，但並不意欲限制本發明之範疇；藉由其例示性應理解，可替代地使用熟習此項技術者已知之其他程序、方法或技術。 編號實施例#1[1]       一種非經腸核酸遞送系統，其包含環狀多核糖核苷酸及非經腸可接受之稀釋劑，其中該環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸且包含結合目標之序列。 [2]       如實施例[1]之非經腸核酸遞送系統，其中該遞送系統不含任何載劑。 [3]       一種活體內遞送環狀多核糖核苷酸之方法，其包含向個體非經腸投與該環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸且包含結合目標之序列。 [4]       如實施例[3]之方法，其中該環狀多核糖核苷酸之量有效地引起該個體之生物反應。 [5]       如實施例[3]之方法，其中該環狀多核糖核苷酸之量有效地對該個體之細胞或組織產生生物效應。 [6]       一種將環狀多核糖核苷酸活體內遞送至個體之細胞或組織的方法，其包含向該細胞或組織非經腸投與該環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸且包含結合目標之序列。 [7]       一種將組合物遞送至個體之方法，其包含向該個體非經腸投與該組合物，其中該組合物包含環狀多核糖核苷酸，該環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸及結合目標之序列。 [8]       一種將組合物活體內遞送至個體之細胞或組織的方法，其包含向該細胞或組織非經腸投與該組合物，其中該組合物包含環狀多核糖核苷酸，該環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸及結合目標之序列。 [9]       如實施例[3]-[6]中任一項之方法，其中該環狀多核糖核苷酸以組合物形式投與。 [10]    如實施例[3]-[8]中任一項之方法，其中非經腸投與為靜脈內、肌肉內、經眼或局部投與。 [11]    如實施例[7]-[10]中任一項之方法，其中該組合物為醫藥組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。 [12]    如實施例[7]-[10]中任一項之方法，其中該組合物包含載劑。 [13]    如實施例[7]-[10]中任一項之方法，其中該組合物包含非經腸可接受之稀釋劑且不含任何載劑。 [14]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該環狀多核糖核苷酸與該目標形成複合物，且該環狀多核糖核苷酸或該目標在遞送後至少5天為可偵測的。 [15]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該目標係選自由以下組成之群：核酸分子、小分子、蛋白質、碳水化合物及脂質。 [16]    如實施例[15]之系統或方法，其中該小分子為分子量不超過900道爾頓且調節細胞過程之有機化合物。 [17]    如實施例[16]之系統或方法，其中該小分子為藥物。 [18]    如實施例[16]之系統或方法，其中該小分子為螢光團。 [19]    如實施例[16]之系統或方法，其中該小分子為代謝物。 [20]    如實施例[1]-[19]中任一項之系統或方法，其中該目標為基因調控蛋白。 [21]    如實施例[20]中任一項之系統或方法，其中該基因調控蛋白為轉錄因子。 [22]    如實施例[15]之系統或方法，其中該核酸分子為DNA分子或RNA分子。 [23]    如實施例[14]-[22]中任一項之系統或方法，其中該複合物調節基因表現。 [24]    如實施例[14]-[23]中任一項之系統或方法，其中該複合物調節DNA分子之定向轉錄、DNA分子之表觀遺傳重塑或DNA分子之降解。 [25]    如實施例[14]-[24]中任一項之系統或方法，其中該複合物調節該目標之降解、該目標之易位或目標信號轉導。 [26]    如實施例[23]-[25]中任一項之系統或方法，其中該基因表現與疾病或病況之發病機制相關。 [27]    如實施例[14]-[26]中任一項之系統或方法，其中該複合物之該環狀多核糖核苷酸或該複合物之該目標在遞送後至少7、8、9或10天為可偵測的。 [28]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸在遞送後存在至少五天。 [29]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸在遞送後存在至少6、7、8、9或10天。 [30]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸為未經修飾之轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸。 [31]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸具有準雙股二級結構。 [32]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該序列為具有結合該目標之二級結構的適體序列。 [33]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該適體序列進一步具有結合該目標之三級結構。 [34]    如前述實施例中任一項之方法，其中該細胞為真核細胞。 [35]    如實施例[34]之方法，其中該真核細胞為動物細胞。 [36]    如實施例[34]之方法，其中該真核細胞為寵物細胞。 [37]    如實施例[34]之方法，其中該真核細胞為哺乳動物細胞。 [38]    如實施例[34]之方法，其中該真核細胞為人類細胞。 [39]    如實施例[34]之方法，其中該真核細胞為家畜細胞。 編號實施例#2[1]       一種非經腸核酸遞送系統，其包含環狀多核糖核苷酸及非經腸可接受之稀釋劑，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。 [2]       如實施例[1]之非經腸核酸遞送系統，其中該遞送系統不含任何載劑。 [3]       如實施例[1]之非經腸核酸遞送系統，其中該遞送系統包含載劑。 [4]       一種活體內遞送環狀多核糖核苷酸之方法，其包含向個體非經腸投與該環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。 [5]       如實施例[4]之方法，其中該環狀多核糖核苷酸之量有效地引起該個體之生物反應。 [6]       如實施例[4]之方法，其中該環狀多核糖核苷酸之量有效地對該個體之細胞或組織產生生物效應。 [7]       一種將環狀多核糖核苷酸活體內遞送至個體之細胞或組織的方法，其包含向該細胞或組織非經腸投與該環狀多核糖核苷酸，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。 [8]       一種將組合物遞送至個體之方法，其包含向該個體非經腸投與該組合物，其中該組合物包含環狀多核糖核苷酸，該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。 [9]       一種將組合物活體內遞送至個體之細胞或組織的方法，其包含向該細胞或組織非經腸投與該組合物，其中該組合物包含環狀多核糖核苷酸，該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。 [10]    如實施例[4]-[6]中任一項之方法，其中該環狀多核糖核苷酸以組合物形式投與。 [11]    如實施例[4]-[9]中任一項之方法，其中非經腸投與為靜脈內、肌肉內、經眼或局部投與。 [12]    如實施例[8]-[11]中任一項之方法，其中該組合物為醫藥組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。 [13]    如實施例[8]-[11]中任一項之方法，其中該組合物包含載劑。 [14]    如實施例[8]-[11]中任一項之方法，其中該組合物包含非經腸可接受之稀釋劑且不含任何載劑。 [15]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該環狀多核糖核苷酸與該目標形成複合物，且該環狀多核糖核苷酸或該目標在遞送後至少5天為可偵測的。 [16]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該目標係選自由以下組成之群：核酸分子、小分子、蛋白質、碳水化合物及脂質。 [17]    如實施例[16]之系統或方法，其中該小分子為分子量不超過900道爾頓且調節細胞過程之有機化合物。 [18]    如實施例[17]之系統或方法，其中該小分子為藥物。 [19]    如實施例[17]之系統或方法，其中該小分子為螢光團。 [20]    如實施例[17]之系統或方法，其中該小分子為代謝物。 [21]    如實施例[1]-[20]中任一項之系統或方法，其中該目標為基因調控蛋白。 [22]    如實施例[21]中任一項之系統或方法，其中該基因調控蛋白為轉錄因子。 [23]    如實施例[16]之系統或方法，其中該核酸分子為DNA分子或RNA分子。 [24]    如實施例[15]-[23]中任一項之系統或方法，其中該複合物調節基因表現。 [25]    如實施例[15]-[24]中任一項之系統或方法，其中該複合物調節DNA分子之定向轉錄、DNA分子之表觀遺傳重塑或DNA分子之降解。 [26]    如實施例[15]-[25]中任一項之系統或方法，其中該複合物調節該目標之降解、該目標之易位或目標信號轉導。 [27]    如實施例[24]-[26]中任一項之系統或方法，其中該基因表現與疾病或病況之發病機制相關。 [28]    如實施例[15]-[27]中任一項之系統或方法，其中該複合物之該環狀多核糖核苷酸或該複合物之該目標在遞送後至少7、8、9或10天為可偵測的。 [29]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該環狀多核糖核苷酸在遞送後存在至少五天。 [30]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該環狀多核糖核苷酸在遞送後存在至少6、7、8、9或10天。 [31]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該環狀多核糖核苷酸為未經修飾之環狀多核糖核苷酸。 [32]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該環狀多核糖核苷酸具有準雙股二級結構。 [33]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該序列為具有結合該目標之二級結構的適體序列。 [34]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該適體序列進一步具有結合該目標之三級結構。 [35]    如前述實施例中任一項之方法，其中該細胞為真核細胞。 [36]    如實施例[35]之方法，其中該真核細胞為動物細胞。 [37]    如實施例[35]之方法，其中該真核細胞為寵物細胞。 [38]    如實施例[35]之方法，其中該真核細胞為哺乳動物細胞。 [39]    如實施例[35]之方法，其中該真核細胞為人類細胞。 [40]    如實施例[35]之方法，其中該真核細胞為家畜細胞。 [41]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該環狀多核糖核苷酸缺乏多A序列、缺乏複製元件、缺乏自由3'端或缺乏RNA聚合酶識別模體或其任何組合。 [42]    如前述實施例中任一項之系統或方法，其中該環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸。 [43]    如實施例[1]-[42]中任一項之系統或方法，其中該環狀多核糖核苷酸進一步包含表現序列。 [44]    如實施例[43]之系統或方法，其中該環狀多核糖核苷酸包含終止元件或IRES，或其組合。實例 實例1：在無載劑存在下細胞內遞送之環狀RNA (裸遞送)
此實例展示在無載劑存在下細胞中之功能性環狀RNA細胞內遞送。
活性芒果RNA適體在與TO-1生物素染料結合時發螢光。如以下實例中所示，含有與TO-1生物素結合之芒果RNA適體的功能性環狀RNA以不依賴載劑之方式進入細胞。
環狀RNA經設計以包括芒果RNA小分子結合適體位點及穩定莖：5'-AATAGCCGGUCUACGGCCAUACCACCCU GAACGCGCCCGAUCUCGUCUGAUCUCGGAAGCUAAGCAGGGUCGGGCCUGGUUAGUACUUGGAUGGGAGACCGCCUGGGAAUACCGGGUGCUGUAGGCGUCGACUUGCCAUGUGUAUGUGGGUACGAAGGAAGGAUUGGUAUGUGGUAUAUUCGUACCCACAUACUCUGAUGAUCCUUCGGGAUCAUUCAUGGCAACGGCTATT-3'，以及環化序列：5'-AATAGCCG-3'及5'-CGGCTATT-3' (「環狀RNA適體」)。
未經修飾之線性RNA係藉由使用T7 RNA聚合酶自包含芒果RNA模體、莖及環化序列之DNA區段活體外轉錄來合成。轉錄的RNA用RNA清理套組(New England Biolabs，T2050)純化，按照製造商說明書用RNA 5'-磷酸水解酶(RppH，New England Biolabs，M0356)處理，且用RNA純化管柱再次純化。經RppH處理之RNA使用與環化序列互補之夾板DNA及T4 RNA連接酶2 (New England Biolabs，M0239)環化。環狀RNA適體經尿素-PAGE純化，在含有(0.5 M乙酸鈉、0.1% SDS、1 mM EDTA之緩衝液中溶離，乙醇沈澱且再懸浮於無RNase之水中。RNA品質係藉由尿素-PAGE或經由自動化電泳(Agilent)來評定。
使用螢光顯微鏡在BJ纖維母細胞中活體外評估環狀RNA適體與TO-1生物素之結合。當TO-1生物素與RNA結合時，其螢光增強超過100倍。在無任何轉染試劑存在下，將含有10 mM MgCl2及50 mM KCl之緩衝液中之線性或環狀RNA適體(50 nM)添加至保存在Opti-MEM (ThermoFisher Scientific)中之BJ纖維母細胞中。無RNA對照僅使用緩衝液。培養物用TO-1生物素處理且在6小時後分析螢光。如圖 8 所示，在用環狀RNA適體處理之細胞中偵測到螢光，但在用線性RNA適體或僅緩衝液處理之細胞中未偵測到螢光。
此實例證明環狀RNA在無載劑存在下(裸)細胞內遞送。 實例2：在無載劑存在下環狀RNA介導之直接遞送至特定細胞類型中(裸遞送)
此實例展示在無載劑存在下環狀RNA介導之直接遞送至特定細胞類型中。
如以下實例中所示，環狀RNA內含有適體序列之環狀RNA (其中RNA適體序列靶向目標細胞上之治療相關蛋白質)以不依賴載劑之方式進入細胞。
環狀RNA經設計以包括已知與人類運鐵蛋白受體競爭性結合之C2min適體序列(5' - GGG GGA UCA AUC CAA GGG ACC CGG AAA CGC UCC CUU ACA CCC C – 3')；或已知與人類運鐵蛋白受體非競爭性結合之36a適體序列(5' - GGG UGA AUG GUU CUA CGA UAA ACG UUA AUG ACC AGC UUA UGG CUG GCA GUU  CCU AUA GCA CCC – 3')。環狀RNA經設計以包括用於與螢光單股DNA寡核苷酸雜交以便觀測之間隔區。亦使用包括經預測不會與人類運鐵蛋白受體結合之適體序列的對照環狀RNA。此等環狀RNA之示意圖展示於圖 9 中。
活體外生成環狀RNA。自DNA模板活體外轉錄未經修飾之線性RNA，該模板包括以上列出之所有模體以及驅動轉錄之T7 RNA聚合酶啟動子。轉錄的RNA用RNA清理套組(New England Biolabs，T2050)純化，按照製造商說明書用RNA 5'磷酸水解酶(RppH) (New England Biolabs，M0356)處理，且用RNA純化管柱再次純化。經RppH處理之線性RNA使用夾板DNA (5' - TGT TGT GTC TTG GTT GGT – 3'或5' - TGT TGT GTG TTG GTT GGT – 3')及T4 RNA連接酶2 (New England Biolabs，M0239)環化。環狀RNA經尿素-PAGE純化，在緩衝液(0.5 M乙酸鈉、0.1% SDS、1 mM EDTA)中溶離，乙醇沈澱且再懸浮於RNase儲存溶液(ThermoFisher Scientific，目錄號AM7000)中。
使用具有AlexaFluor488短單股DNA寡核苷酸標記適體以便細胞內觀測(5' - AF488-TGT TGT GTC TTG GTT GGT -3'或5' - AF488-TGT TGT GTG TTG GTT GGT – 3'，Integrated DNA Technologies，IDT)。將螢光ssDNA寡核苷酸相對於環狀RNA以3倍莫耳過量添加，在60℃下培育10分鐘，隨後在150 mM KCL存在下在室溫下培育20分鐘。使用Microbiospin管柱(Biorad)將RNA緩衝液交換成PBS。
在無載劑存在下，將用AlexaFluor488-DNA寡核苷酸黏接之環狀RNA以0.1 µM最終濃度添加至100 µL Optimem介質中的HeLa細胞。在37℃下培育一小時後，將細胞用磷酸鹽緩衝鹽水溶液洗滌且轉移至具有DAPI溶液之Fluorobrite中。使用Evos細胞成像儀(ThermoFischer Scientific)對細胞進行成像。
藉由螢光顯微鏡評估環狀RNA與人類運鐵蛋白之結合。當環狀RNA中含有C2min及36a適體時，在HeLa細胞內偵測到作為點狀螢光信號之AlexaFluor488活性(圖 10 )。相反，對於含有非結合適體序列之對照環狀RNA，沒有觀察到螢光信號。此表明環狀RNA內所含之適體序列負責經由運鐵蛋白受體結合進行內化。
此實例證明環狀RNA所含之RNA適體序列結合目標蛋白，且環狀RNA在無載劑存在下(裸)經由與特異性表面受體之相互作用細胞內遞送至哺乳動物細胞中。 實例3：在無載劑存在下環狀RNA介導之直接遞送至特定細胞類型中(裸遞送)
此實例描述在無載劑存在下環狀RNA介導之直接遞送至特定細胞類型中。
如以下實例中所述，含有環狀RNA內之RNA適體序列(其中RNA適體序列靶向目標細胞上之治療相關蛋白質)及長腹水蚤螢光素酶(GLuc) ORF之環狀RNA以不依賴載劑之方式進入細胞。
環狀RNA經設計以包括已知與人類運鐵蛋白受體競爭性結合之C2min適體序列(5'- GGG GGA UCA AUC CAA GGG ACC CGG AAA CGC UCC CUU ACA CCC C – 3') (TfR適體)、間隔區及EMCV IRES及GLuc ORF。在一些環狀RNA設計中，TfR適體以多個複本存在。無適體序列之環狀RNA用作對照。
活體外生成環狀RNA。自DNA模板活體外轉錄未經修飾之線性RNA，該模板包括以上列出之所有模體以及驅動轉錄之T7 RNA聚合酶啟動子。轉錄的RNA用RNA清理套組(New England Biolabs，T2050)純化，按照製造商說明書用RNA 5'磷酸水解酶(RppH) (New England Biolabs，M0356)處理，且用RNA純化管柱再次純化。經RppH處理之線性RNA使用夾板DNA (5'- GTCAACGGATTTTCCCAAGTCCGTAGCGTCTC – 3')及T4 RNA連接酶2 (New England Biolabs，M0239)環化。環狀RNA經尿素-PAGE純化，在緩衝液(0.5 M乙酸鈉、0.1% SDS、1 mM EDTA)中溶離，乙醇沈澱且再懸浮於RNase儲存溶液(ThermoFisher Scientific，目錄號AM7000)中。
將含有適體序列之環狀RNA添加至在標準條件下(在具有10% FBS之RPMI-1640 (ATCC)中，在37℃、5% CO2下)生長之NALM6人類外周血細胞(ATCC CRL-3273)中。在無載劑存在下，將0.1 pmol、1 pmol及5 pmol環狀RNA轉染至細胞中。研究多個時間點。收集細胞培養基進行發光分析以偵測GLuc活性，且在37℃下培育6小時、24小時及48小時後用新鮮培養基替換。48小時後，收集培養基且提取RNA以分析環狀RNA含量。
環狀RNA之遞送效率以兩種不同的方式進行量測：(i)發光分析以偵測GLuc活性，其與環狀RNA之GLuc蛋白質表現相關；及(ii)針對環狀RNA遞送之qRT-PCR。為了量測GLuc活性，使用市售發光套組(例如長腹水蚤螢光素酶快速分析套組；Pierce 16159)偵測螢光素酶活性。簡言之，將各樣品之10 μL收集的培養基置於96孔白色盤中。將50 µl含GLuc受質之反應緩衝液添加至含有培養基之各孔中。在光度計儀器(Promega)中讀取發光。對於RT-qPCR，使用市售套組進行反轉錄(例如Power SYBR Green Cell-to-CT套組；(Invitrogen，目錄號4402953)。qRT-PCR用GLuc特異性引子(正向：CCTGAGATTCCTGGGTTCAAG，反向：CTTCTTGAGCAGGTCAGAACA)及針對基於染料之定量PCR最佳化之即用型反應主混合物(例如iTaq Universal SYBR Green Supermix；Bio-RAD，目錄號1725120)來進行，且藉由市售即時PCR偵測系統來監測。β肌動蛋白用作參考(正向：GACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGG，反向：GGTGTTGAAGGTCTCAAACATG)。 實例4：與含有RNA適體序列之單股RNA寡核苷酸雜交之環狀RNA可靶向表面蛋白質且能夠在無載劑存在下實現環狀RNA之攝取(裸遞送)
此實例描述經由與環狀RNA雜交之單股RNA寡核苷酸中所含之RNA適體序列使環狀RNA靶向目標細胞上之治療相關蛋白質。
如以下實例中所述，包含GLuc ORF且與含有RNA適體序列之單股RNA寡核苷酸雜交之環狀RNA(其中RNA適體序列靶向目標細胞上之治療相關蛋白質)以不依賴載劑之方式進入細胞。
在此實例中，線性RNA寡核苷酸包括已知與人類運鐵蛋白受體競爭性結合之TfR適體序列(5' - GGG GGA UCA AUC CAA GGG ACC CGG AAA CGC UCC CUU ACA CCC C – 3')；或已知與人類運鐵蛋白受體非競爭性結合之36a適體序列(5'- GGG UGA AUG GUU CUA CGA UAA ACG UUA AUG ACC AGC UUA UGG CUG GCA GUU CCU AUA GCA CCC-3')；或陰性對照(5'- GGC GUA GUG AUU AUG AAU CGU GUG CUA AUA CAC GCC – 3')。此線性RNA寡核苷酸亦包括用於與環狀RNA雜交之結合模體。此等實體之示意圖展示於圖 11 中。
設計六個不同的寡核苷酸，其含有與環狀RNA之不同區結合的黏接區。此等寡核苷酸中之兩者與間隔區結合，而四者與GLuc ORF結合。環狀RNA包括用於與含有適體之單股寡核苷酸雜交的互補結合區以及EMCV IRES及GLuc ORF。使用如上所述與包括適體序列之單股線性RNA寡核苷酸雜交之相同環狀RNA生成對照複合物，該適體序列經預測不與人類運鐵蛋白受體結合。
如實例3中所述，活體外生成環狀RNA。
含有TfR適體序列及結合模體之單股RNA寡核苷酸係藉由整合DNA技術(IDT)定製合成。適體序列以未經修飾之核苷酸形式合成。環狀RNA結合序列經設計以在黏接序列中包括2'-O-甲基修飾之核苷酸。
將單股RNA寡核苷酸相對於環狀RNA以2倍莫耳過量添加，在65℃下培育10分鐘且隨後在20 mM HEPES (pH 7.0)、100 mM NaCl及2 mM MgCl2存在下逐漸冷卻至室溫。藉由瓊脂糖凝膠電泳確認黏接。
將與含有適體之RNA寡核苷酸黏接的環狀RNA在標準條件下(在具有10% FBS之RPMI-1640 (ATCC)中，在37℃、5% CO2下)生長之NALM6人類外周血細胞(ATCC CRL-3273)中。在無載劑存在下，將0.1 pmol、1 pmol及5 pmol環狀RNA轉染至細胞中。研究多個時間點。收集細胞培養基進行發光分析以偵測GLuc活性，且在37℃下培育6小時、24小時及48小時後用新鮮培養基替換。48小時後，收集培養基且自細胞提取RNA以分析環狀RNA含量。 如實例3中所述使用以下量測環狀RNA之遞送效率：(i)發光分析以偵測GLuc活性，其與環狀RNA之GLuc蛋白質表現相關；及(ii)針對環狀RNA遞送之qRT-PCR。 實例5：與含有RNA適體序列之單股RNA寡核苷酸雜交之環狀RNA可靶向表面蛋白質且能夠在無載劑存在下實現環狀RNA之攝取(裸遞送)
此實例描述經由與環狀RNA雜交之單股RNA寡核苷酸中所含之RNA適體序列使環狀RNA靶向目標細胞上之治療相關蛋白質。
如以下實例中所述，包含GLuc ORF且與含有RNA適體序列之單股RNA寡核苷酸雜交之環狀RNA(其中RNA適體序列靶向目標細胞上之治療相關蛋白質)以不依賴載劑之方式進入細胞。
在此實例中，線性RNA寡核苷酸包括已知與人類EpCAM蛋白質競爭性結合之EpCAM適體序列(5' - GCG ACU GGU UAC CCG GUC G – 3')。設計六個不同的寡核苷酸，其中各寡核苷酸與環狀RNA之不同區結合，兩個與間隔區結合且四個與GLuc ORF結合。環狀RNA包括用於與含有適體之單股寡核苷酸雜交的互補結合區以及EMCV IRES及GLuc ORF。使用如上所述與包括適體序列之單股線性RNA寡核苷酸雜交之相同環狀RNA生成對照複合物，該適體序列經預測不與人類EpCAM蛋白結合。
如實例3中所述，活體外生成環狀RNA。
含有EpCAM適體序列及結合模體之單股RNA寡核苷酸係藉由整合DNA技術(IDT)定製合成。
適體序列以未經修飾之嘌呤及2'氟嘧啶形式合成。環狀RNA結合序列經設計以在黏接序列中包括2'-O-甲基修飾之核苷酸。
將單股RNA寡核苷酸相對於環狀RNA以2倍莫耳過量添加，在65℃下培育10分鐘且隨後在20 mM HEPES (pH 7.0)、100 mM NaCl及2 mM MgCl2存在下逐漸冷卻至室溫。藉由瓊脂糖凝膠電泳確認黏接。
將與含有適體之RNA寡核苷酸黏接的環狀RNA添加至在標準條件下(在具有10% FBS之RPMI-1640 (ATCC)中，在37℃、5% CO2下)生長之HCC1143人類乳房細胞(ATCC CRL-2321)；或(2)在標準條件下(在具有10% FBS之RPMI-1640培養基(ATCC)中，在37℃、5% CO2下)生長之BT549人類乳腺細胞(ATCC HTB-122中。HCC1143展示高EpCAM表面表現，但BT549之表面表現極少。在無載劑存在下，將0.1 pmol、1 pmol及5 pmol環狀RNA轉染至細胞中。研究多個時間點。收集細胞培養基進行發光分析以偵測GLuc活性，且在37℃下培育6小時、24小時及48小時後用新鮮培養基替換。48小時後，收集培養基且自細胞提取RNA以分析環狀RNA含量。
如實例3中所述使用以下量測環狀RNA之遞送效率：(i)發光分析以偵測GLuc活性，其與環狀RNA之GLuc蛋白質表現相關；及(ii)針對RNA遞送之qRT-PCR。 實例6：與含有DNA適體序列之單股DNA寡核苷酸雜交之環狀RNA可靶向表面蛋白質且能夠在無載劑存在下實現環狀RNA之攝取(裸遞送)
此實例描述經由單股DNA寡核苷酸中所含之DNA適體序列使環狀RNA靶向目標細胞上之治療相關蛋白質，該單股DNA寡核苷酸與環狀RNA雜交且引起環狀RNA之內化。
如以下實例中所述，包含GLuc ORF且與含有DNA適體序列之單股DNA寡核苷酸雜交之環狀RNA(其中DNA適體序列靶向目標細胞上之治療相關蛋白質)以不依賴載劑之方式進入細胞。
在此實例中，線性DNA寡核苷酸包括已知與細胞表面核仁素結合之核仁素適體序列(5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3')。此線性DNA寡核苷酸亦包括用於與環狀RNA雜交之結合模體。設計四個不同的寡核苷酸，且各寡核苷酸與環狀RNA之不同區結合；兩個與間隔區結合且兩個與GLuc ORF結合。環狀RNA包括用於與含有適體之單股寡核苷酸雜交的互補結合區以及EMCV IRES及GLuc ORF。
活體外生成環狀RNA。自DNA模板活體外轉錄未經修飾之線性RNA，該模板包括以上列出之所有模體以及驅動轉錄之T7 RNA聚合酶啟動子。轉錄的RNA用RNA清理套組(New England Biolabs，T2050)純化，按照製造商說明書用RNA 5'磷酸水解酶(RppH) (New England Biolabs，M0356)處理，且用RNA純化管柱再次純化。經RppH處理之線性RNA使用夾板DNA (5'- GTCAACGGATTTTCCCAAGTCCGTAGCGTCTC – 3')及T4 RNA連接酶2 (New England Biolabs)環化。環狀RNA經尿素-PAGE純化，在緩衝液(0.5 M乙酸鈉、0.1% SDS、1 mM EDTA)中溶離，乙醇沈澱且再懸浮於水中。
適體序列以DNA形式合成。環狀RNA結合序列經設計以在黏接序列中包括2'-O-甲基修飾之核苷酸。
將單股RNA寡核苷酸相對於環狀RNA以2倍莫耳過量添加，在65℃下培育10分鐘且隨後在20 mM HEPES (pH 7.0)、100 mM NaCl及2 mM MgCl2存在下逐漸冷卻至室溫。藉由瓊脂糖凝膠電泳確認黏接。
將與含有適體之DNA寡核苷酸黏接之環狀RNA添加至(1)在標準條件下(在具有10% FBS及0.01 mg/mL人類重組胰島素之伊格爾氏最低必需培養基(Eagle's Minimum Essential Medium，EMEM；Sigma)中，在37℃、5% CO2下)生長之MCF-7人類乳癌細胞(ATCC HTB-22)；或(2)在標準條件下(在具有100 ng/mL霍亂毒素之MEBM™乳房上皮細胞生長基本培養基(Lonza/Clonetics Corporation)中，在5% CO2下)生長之MCF-10A人類乳房上皮細胞(ATCC CRL-10317)中。MCF7展示高核仁素表面表現，但BT549之表面表現極少。在無載劑存在下，將0.1 pmol、1 pmol及5 pmol環狀RNA轉染至細胞中。研究多個時間點。收集細胞培養基進行發光分析以偵測GLuc活性，且在37℃下培育6小時、24小時及48小時後用新鮮培養基替換。48小時後，收集培養基且自細胞提取RNA以分析環狀RNA含量。
如實例3中所述使用以下量測環狀RNA之遞送效率：(i)發光分析以偵測GLuc活性，其與環狀RNA之GLuc蛋白質表現相關；及(ii)針對環狀RNA遞送之qRT-PCR。 實例7：與含有DNA適體序列之單股DNA寡核苷酸雜交之環狀RNA可靶向表面蛋白質且能夠在無載劑存在下實現環狀RNA之攝取(裸遞送)
此實例描述經由與環狀RNA雜交之單股DNA寡核苷酸中所含之DNA適體序列使環狀RNA活體內靶向目標細胞上之治療相關蛋白質。
如以下實例中所述，包含GLuc ORF且與含有DNA適體序列之單股DNA寡核苷酸雜交之環狀RNA(其中DNA適體序列靶向目標細胞上之治療相關蛋白質)活體內以不依賴載劑之方式進入細胞。
在此實例中，單股DNA寡核苷酸包括已知與小鼠運鐵蛋白受體競爭性結合之適體序列；或已知與小鼠運鐵蛋白受體非競爭性結合之適體序列。此單股DNA寡核苷酸亦包括用於與環狀RNA雜交之結合模體。環狀RNA包括用於與含有適體之單股寡核苷酸雜交的互補結合區以及EMCV IRES及長腹水蚤螢光素酶(GLuc) ORF。使用如上所述與包括適體序列之單股DNA寡核苷酸雜交之相同環狀RNA生成對照複合物，該適體序列經預測不與小鼠運鐵蛋白受體結合。此等實體之示意圖展示於圖 12 中。
如實例3中所述，活體外生成環狀RNA。
在此實例中，單股DNA寡核苷酸係藉由整合DNA技術(IDT)定製合成，含有前述適體序列及結合模體。單股DNA寡核苷酸(1)未經修飾；或(2)含有5'-氟修飾，如Kratschmer等人, (2017) Nucleic Acid Ther. 27(6):335-344中所述；或(3)經修飾以包括修飾，諸如5'-羥基部分或2'-O-甲基修飾。
將單股DNA寡核苷酸相對於環狀RNA以3倍莫耳過量添加，在60℃下培育10分鐘且隨後在150 mM KCL存在下逐漸冷卻至室溫。使用Microbiospin管柱(Biorad)將RNA緩衝液交換成PBS。藉由瓊脂糖凝膠電泳確認黏接。
隨後將PBS在100 μL最終體積中添加至25 pmol之所需最終構築體濃度。
小鼠在後腿接受25 pmol之雜交單股DNA寡核苷酸及環狀RNA構築體中之任一者的單次注射。
在給藥後0、1、6小時、1、2、4、7天，處死小鼠，收集肝臟組織且儲存於RNAlater溶液(ThermoFisher Scientific，目錄號AM7020)中，並冷凍直至處理。為了分離總RNA，將組織樣品在trizol中均質化，苯酚-氯仿提取，且隨後使用RNA清理套組(New England Biolabs，T2050)對水相進行管柱純化。使用Superscipt IV (Thermo Scientific，目錄號18091050)由總RNA合成cDNA。使用對GLuc ORF具有特異性的引子在cDNA模板上進行qRT-PCR。針對管家基因小鼠28s rRNA之引子用於標準化(F：GGTTGAGGGCCACCTTATTT，R：GAAGAAAGACCGGGAAGAGAAA)。使用ΔΔCt法計算相對基因表現，絕對數將使用標準曲線獲得。
相比於與含有非結合適體之單股DNA寡核苷酸雜交的環狀RNA，預期與含有競爭性結合適體之單股DNA寡核苷酸或含有非競爭性結合適體之單股RNA寡核苷酸雜交之環狀RNA一起培育的細胞展示進入肝細胞及肝臟組織細胞中之內化增加。
此實例描述在與環狀RNA雜交之單股DNA寡核苷酸內編碼的DNA適體序列可在無轉染劑之情況下，經由與特異性表面受體之相互作用增加活體內哺乳動物細胞之攝取。 實例8：結合脂膜之環狀RNA
此實例描述環狀RNA與脂膜之結合。
環狀RNA可經設計以與脂膜特異性結合。以下實例描述環狀RNA與膜之結合。藉由介導細胞膜之結合，環狀RNA能夠使相鄰的細胞彼此緊密接近。
環狀RNA經設計以包括至少一個設計成結合膜之RNA模體(本文所述之序列)： GUGAUGGCGCCUACGUCGAAGAAAGGAGUCUCAAGGGAAGGAGCGUAUAUGGUCGAUGAAUCGGUCAUGUCGUCAGGGU； GAGUCAUAGGACGCUCGCUCUUGCGACCAUGGGGCACGGGGAGCCCACUGCAUGGAUCU AUCGUAU CAUAGUGCGGU； GUAGCUUCCAUGAGACUUGAUCGGGGUCAUGGCUCUAGGCAUCGGAGAAGCUGACUAACU UGGUCACGUCGUACCUGGU； GGACGCGUACGAAGGGCUGAUAGGGCAGAGCUCCAACUAUGCGUCCAGCUCGUGCAGUGGAUCGGGUCGUGCCUGGU；及 CUUUGUCGGCCGAACUCGCUGUUUAACUGCCCGGCGAGAUCGCAGGGUGUUGUGCUAUU CGCGUGCCGUGUG。
未經修飾之線性RNA係藉由使用T7 RNA聚合酶自包含一或多個RNA脂質結合模體之DNA區段活體外轉錄來合成。轉錄的RNA用RNA純化系統(QIAGEN)純化，按照製造商說明書用鹼性磷酸酶(ThermoFisher Scientific，EF0652)處理，且再次用RNA純化系統純化。
夾板連接環狀RNA係藉由使用T4 DNA連接酶(New England Bio, Inc.，M0202M)處理轉錄的線性RNA及DNA夾板來生成，且在用RNase R處理富集後分離環狀RNA。RNA品質係藉由瓊脂糖凝膠或經由自動化電泳(Agilent)來評定。
一種評定環狀RNA與脂膜結合之方法為將環狀RNA與脂質體一起培育。使用Sephacryl S-1000管柱對脂質體進行分餾。丟棄所有未結合的RNA。經由qPCR或北方墨點法評定結合的環狀RNA。 實例9：結合碳水化合物之環狀RNA
此實例描述環狀RNA與碳水化合物之結合。
唾液酸Lewis X為膜蛋白之四糖糖接合物。其在細胞黏附過程中充當選擇素蛋白之配體。如以下實例中所示，環狀RNA與唾液酸Lewis X結合以抑制細胞黏附。
經工程改造之環狀RNA經設計以包括唾液酸Lewis X結合序列(例如5'-CCGUAAUACGACUCACUAUAGGGGAGCUCGG UACCGAAUUCAAGGUACUCUGUGCUUGUCGAUGUGUAUUGAUGGCACUUUCGAGUCAACGAGUUGACAGAACAAGUAGUCAAGCUUUGCAGAGAGGAUCCUU-3')。
未經修飾之線性RNA係藉由使用T7 RNA聚合酶自包含唾液酸Lewis X結合序列之DNA區段活體外轉錄來合成。轉錄的RNA用RNA純化系統(QIAGEN)純化，按照製造商說明書用鹼性磷酸酶(ThermoFisher Scientific，EF0652)處理，且再次用RNA純化系統純化。夾板連接環狀RNA係藉由使用T4 DNA連接酶(New England Bio, Inc.，M0202M)或T4 RNA連接酶2 (New England Bio, Inc.，M0239S)處理轉錄的線性RNA及DNA夾板來生成，且在用RNase R處理富集後分離環狀RNA。RNA品質係藉由瓊脂糖凝膠或經由自動化電泳(Agilent)來評定。
一種評定環狀RNA與唾液酸Lewis X結合之方法為量測唾液酸Lewis X介導之細胞黏附。E-選擇素識別唾液酸Lews X，且前髓細胞性白血病細胞株HL60之表面富含唾液酸Lews X，尤其在TNF-a處理後。將重組的可溶性E-選擇素(Calbiochem)添加至含0.05 M NaHCO3之微量滴定盤(250 ng/孔)中，pH值為9.2 (10 µg/ml)，且在4℃下培育隔夜。隨後培育具有或不具有唾液酸Lewis X結合位點之環狀RNA (10 µg/mL)。將TNF-α活化(10 ng/ml，20小時)之HL60人類前髓細胞性白血病細胞在室溫下在盤上培育30分鐘，洗滌且量測黏附細胞之數目。 實例10：結合病毒之環狀RNA
此實例描述環狀RNA與病毒之結合。
流感病毒具有兩種膜糖蛋白組分，包括血凝素(HA)及神經胺糖酸酶(NA)。各病毒粒子之表面上分別表現約900及300個複本之HA及NA。如以下實例中所示，經工程改造之環狀RNA經設計以與血凝素結合以進行病毒結合。
環狀RNA經設計以包括血凝素結合位點(例如5'-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGGGUUAGCAGUCGGCAUGCGGUACAGACAGACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3')以結合至流感病毒之表面。
未經修飾之線性RNA係藉由使用T7 RNA聚合酶自包含血凝素結合序列之DNA區段活體外轉錄來合成。轉錄的RNA用RNA純化系統(QIAGEN)純化，按照製造商說明書用鹼性磷酸酶(ThermoFisher Scientific，EF0652)處理，且再次用RNA純化系統純化。夾板連接環狀RNA係藉由使用T4 DNA連接酶(New England Bio, Inc.，M0202M)或T4 RNA連接酶2 (New England Bio, Inc.，M0239S)處理轉錄的線性RNA及DNA夾板來生成，且在用RNase R處理富集後分離環狀RNA。RNA品質係藉由瓊脂糖凝膠電泳或經由自動化電泳(Agilent)來評定。
一種評定環狀RNA與血凝素結合之方法為RNA適體對HA誘導之膜融合的抑制作用。當血凝素與環狀RNA結合時，膜融合之發生頻率低於未結合之環狀RNA。
藉由使用螢光標記之病毒及人類紅血球(RBC)血影膜來檢查HA誘導之膜融合。A/Panama/2007/1999 (H3N2)之病毒膜用螢光脂質探針十八烷基若丹明B(R18；Molecular Probes)標記。
對於融合抑制分析，將與環狀RNA (0.5或5 mM)混合之H3N2病毒(0.05-0.1 mg總蛋白/ml)添加至安裝於金屬腔室中之蓋玻片上的血影膜。在病毒與血影膜融合後，病毒與血影膜之間的脂質互混誘導R18之螢光去淬滅。 實例11：結合適體之環狀RNA
此實例描述環狀RNA與適體之結合。
經工程改造之環狀RNA經設計以包括一或多個新穎的RNA適體結合序列。RNA適體經由互補性靶向環狀RNA結合。如以下實例中所示，環狀RNA與LIN28A結合適體互補結合以進行螯合。
環狀RNA經設計以包括LIN28A結合適體序列之互補序列5'-GGGGUAGUGAUUUUACCCUGGAGAU-3'。
未經修飾之線性RNA係藉由使用T7 RNA聚合酶自具有互補LIN28A結合適體序列之DNA區段活體外轉錄來合成。轉錄的RNA用RNA純化系統(QIAGEN)純化，按照製造商說明書用鹼性磷酸酶(ThermoFisher Scientific，EF0652)處理，且再次用RNA純化系統純化。
夾板連接環狀RNA係藉由使用T4 DNA連接酶(New England Bio, Inc.，M0202M)或T4 RNA連接酶2 (New England Bio, Inc.，M0239S)處理轉錄的線性RNA及DNA夾板來生成，且在用RNase R處理富集後分離環狀RNA。RNA品質係藉由瓊脂糖凝膠或經由自動化電泳(Agilent)來評定。
環狀RNA與LIN28A結合適體之結合係藉由寡核苷酸下拉qPCR分析來評估，其中使用與環狀RNA互補之經修飾之寡核苷酸下拉LIN28A結合適體，對該適體進行反轉錄及qPCR擴增。 實例12：結合細胞之環狀RNA
此實例描述環狀RNA與目標細胞類型之結合。
在此實例中，經由先前所述方法中之一者設計經工程改造之環狀RNA。環狀RNA及線性RNA經設計以包括芒果適體、穩定莖及非編碼區：運鐵蛋白適體(例如GGGGGAUCAAUCCAAGGGACCCG GAAACGCUCCCUUACACCCC)。此適體區結合運鐵蛋白受體，從而使RNA與表現該受體之細胞結合。運鐵蛋白受體在多種細胞類型上表現，包括紅血球及一些癌細胞。作為陰性對照，RNA經設計以不包括適體區。
HeLa細胞為已知表現運鐵蛋白受體之子宮頸癌細胞。HeLa細胞在標準條件下(在具有10% FBS之DMEM中，在37℃、5% CO2下)生長。定期對細胞進行繼代以維持指數生長。使用螢光顯微鏡在HeLa細胞中活體外評估環狀RNA與TO-1生物素之結合。當TO-1生物素與RNA結合時，其螢光增強超過100倍。將具有或不具有適體之環狀RNA (50 nM)以及無RNA對照添加至HeLa培養物之培養基中。添加基於脂質之轉染試劑(Thermo Fisher Scientific)以確保RNA遞送。用TO-1生物素處理培養物，且在3及6小時後分析螢光。 實例13：用於siRNA遞送之環狀RNA
此實例描述遞送數種siRNA之環狀RNA。
非天然存在之環狀RNA經工程改造以包括與模型目標甲狀腺素運載蛋白(TTR) mRNA結合之siRNA序列。以下實例描述環狀RNA衍生之siRNA與目標TTR mRNA結合以抑制甲狀腺素運載蛋白轉譯。
環狀RNA經設計以包括與TTR mRNA互補之序列(例如auggaauacu cuugguuactt)，其與甲狀腺素運載蛋白mRNA結合導致此mRNA之裂解。
未經修飾之線性RNA係藉由使用T7 RNA聚合酶自具有TTR互補序列之DNA區段活體外轉錄來合成。轉錄的RNA用RNA純化系統(QIAGEN)純化，按照製造商說明書用鹼性磷酸酶(ThermoFisher Scientific，EF0652)處理，且再次用RNA純化系統純化。
為了生成環狀RNA，帶有5'-磷酸及3'-OH之兩個RNA末端經設計以具有額外的側接互補序列。此等互補序列雜交，產生切口環。此切口藉由T4 DNA連接酶封閉。環狀RNA品質係藉由瓊脂糖或PAGE凝膠或經由自動化電泳(Agilent)來評定。
藉由使用與環內特定序列互補之生物素化寡核苷酸下拉環狀RNA，隨後藉由RT-PCR來評估環狀RNA與TTR mRNA之結合。藉由RT-PCR量測經處理與未處理細胞中之TTR目標mRNA含量來評估siRNA功能。TTR蛋白之表現係藉由西方墨點法來評估。 實例14：生成具有經修飾之核苷酸的環狀RNA且選擇性結合蛋白質
此實例展示支持蛋白質結合之經修飾之環狀多核糖核苷酸的生成。另外，此實例展示，經選擇性地與參與免疫系統監測之蛋白質相互作用之核苷酸修飾工程改造之環狀RNA與未經修飾之RNA相比具有降低的免疫原性。
產生非天然存在之環狀RNA，其經工程改造以包括完全或部分併入經修飾之核苷酸。如以下實例中所示，將經全長修飾之線性RNA或經修飾及未經修飾之線性RNA的雜交體環化，且經由量測nLuc表現來評定蛋白質骨架。另外，與未經修飾之環狀RNA相比，經選擇性修飾之環狀RNA與BJ細胞中活化免疫相關基因(MDA5、OAS及IFN-β表現之q-PCR)之蛋白質的相互作用減少。
生成具有WT EMCV Nluc終止間隔子之環狀RNA。對於修飾取代，在活體外轉錄反應期間，分別添加經修飾之核苷酸假尿苷及甲基胞嘧啶或m6A代替標準的未經修飾之核苷酸尿苷及胞嘧啶或腺苷。WT EMCV IRES與nLuc ORF分開合成。WT EMCV IRES係使用經修飾(經完全修飾)或未經修飾之核苷酸(經雜交修飾)合成。相反，在活體外轉錄反應期間，對於完整序列，分別使用經修飾之核苷酸假尿苷及甲基胞嘧啶或m6A代替標準的未經修飾之核苷酸尿苷及胞嘧啶或腺苷來合成nLuc ORF序列。在合成經修飾或未經修飾之IRES及經修飾之ORF後，使用T4 DNA連接酶將此兩個寡核苷酸連接在一起。如圖 13A 中所示，生成經完全修飾(上部構築體)或經雜交修飾(下部構築體)之環狀RNA。
為了量測蛋白質骨架效率，量測經完全修飾或經雜交修飾之構築體的nLuc表現。將0.1 pmol線性及環狀RNA轉染至BJ纖維母細胞中6小時後，在轉染後6小時、24小時、48小時及72小時量測nLuc表現。
如圖 13B 及圖 13C 中所示，與未經修飾之環狀RNA相比，經完全修飾之環狀RNA的蛋白質結合能力大大降低，如藉由蛋白質轉譯輸出所量測。相反，雜交修飾表現出與蛋白質，例如蛋白質轉譯機構之結合能力相同或增加。
為了進一步量測蛋白質骨架效率，將經完全修飾之環狀RNA轉染至細胞中，且量測免疫蛋白之蛋白質骨架。在經未經修飾之環狀RNA或具有假尿苷及甲基胞嘧啶或m6A修飾之經完全修飾之環狀RNA轉染的BJ細胞中，監測活化先天性免疫反應基因之免疫蛋白的蛋白質骨架含量。使用基於苯酚之提取試劑(Invitrogen)自細胞分離總RNA，且進行反轉錄以生成cDNA。使用基於染料之定量PCR混合物(BioRad)進行免疫相關基因之qRT-PCR分析。
如圖 14A-C 中所示，與未經修飾之環狀RNA轉染的細胞相比，經完全修飾之環狀RNA，亦即經假尿苷及甲基胞嘧啶或m6A完全修飾之環狀RNA轉染的BJ細胞的免疫相關基因的qRT-PCR含量顯示MDA5、OAS及IFN-β表現量降低，表明經修飾之環狀RNA與活化免疫原性相關基因之免疫蛋白之間的蛋白質骨架減少。因此，與未經修飾之環狀RNA相比，環狀RNA之修飾對蛋白質骨架具有影響。選擇性修飾允許蛋白質轉譯機構結合，而完全修飾減少與經轉染之受體細胞中活化免疫原性相關基因之蛋白質的結合。 實例15：具有經修飾之核苷酸的環狀RNA降低免疫原性
此實例展示產生蛋白質產物之經修飾之環狀多核糖核苷酸的生成。另外，此實例展示經核苷酸修飾工程改造之環狀RNA與未經修飾之RNA相比具有降低的免疫原性。
產生非天然存在之環狀RNA，其經工程改造以包括一或多種所需特性且完全或部分併入經修飾之核苷酸。如以下實例中所示，將經全長修飾之線性RNA或經修飾及未經修飾之線性RNA的雜交體環化，且評定nLuc之表現。另外，與未經修飾之環狀RNA相比，經修飾之環狀RNA顯示出減少BJ細胞中免疫相關基因(MDA5、OAS及IFN-β表現之q-PCR)之活化。
生成具有WT EMCV Nluc終止間隔子之環狀RNA。對於修飾取代，在活體外轉錄反應期間，分別添加經修飾之核苷酸假尿苷及甲基胞嘧啶或m6A代替標準的未經修飾之核苷酸尿苷及胞嘧啶或腺苷。WT EMCV IRES與nLuc ORF分開合成。WT EMCV IRES係使用經修飾(經完全修飾)或未經修飾之核苷酸(經雜交修飾)合成。相反，在活體外轉錄反應期間，對於完整序列，分別使用經修飾之核苷酸假尿苷及甲基胞嘧啶或m6A代替標準的未經修飾之核苷酸尿苷及胞嘧啶或腺苷來合成nLuc ORF序列。在合成經修飾或未經修飾之IRES及經修飾之ORF後，使用T4 DNA連接酶將此兩個寡核苷酸連接在一起。如圖 13A 中所示，生成經雜交修飾之環狀RNA。
為了量測表現效率，將經雜交修飾之環狀RNA轉染至細胞中，且量測免疫蛋白之表現。在經未經修飾之環狀RNA或具有假尿苷及甲基胞嘧啶或m6A修飾之經雜交修飾之環狀RNA轉染的細胞中，監測先天性免疫反應基因之表現量。使用基於苯酚之提取試劑(Invitrogen)自細胞分離總RNA，且進行反轉錄以生成cDNA。使用基於染料之定量PCR混合物(BioRad)進行免疫相關基因之qRT-PCR分析。
如圖 15 中所示，與未經修飾之環狀RNA轉染的細胞相比，經雜交修飾之環狀RNA，亦即經假尿苷及甲基胞嘧啶雜交修飾之環狀RNA轉染的BJ細胞中免疫相關基因之qRT-PCR含量顯示RIG-I、MDA5、IFN-β及OAS之表現量降低，表明此經雜交修飾之環狀RNA活化免疫原性相關基因之免疫原性降低。與實例24中所示之經完全修飾之環狀RNA不同，經m6A雜交修飾之環狀RNA顯示出與未經修飾之環狀RNA轉染的細胞類似之RIG-I、MDA5、IFN-β及OAS表現量。因此，與未經修飾之環狀RNA相比，環狀RNA之修飾以及修飾水準對活化免疫原性相關基因具有影響。 實例16：環狀RNA結合小分子
此實例展示環狀RNA結合小分子以用於螯合/生物活性。
線性芒果RNA適體在與小分子TO-1生物素染料結合時發螢光。如以下實例中所示，環狀芒果RNA與噻唑橙色衍生物TO-1生物素結合以用於螯合/生物活性。
環狀RNA經設計以包括芒果RNA小分子結合適體位點及穩定莖：5'- AATAGCCG GUCUACGGCC AUACCACCCU GAACGCGCCC GAUCUCGUCU GAUCUCGGAAGCUAAGCAGG GUCGGGCCUG GUUAGUACUU GGAUGGGAGA CCGCCUGGGAAUACCGGGUG CUGUAGGCGU CGACUUGCCA UGUGUAUGUG GGUACGAAGGAAGGAUUGGU AUGUGGUAUA UUCGUACCCA CAUACUCUGA UGAUCCUUCG GGAUCAUUCA UGGCAA CGGCTATT-3'，以及環化序列：5'-AATAGCCG-3'及5'-CGGCTATT-3'。
未經修飾之線性RNA係藉由使用T7 RNA聚合酶自包含芒果RNA模體、莖及環化序列之DNA區段活體外轉錄來合成。轉錄的RNA用RNA清理套組(New England Biolabs，T2050)純化，按照製造商說明書用RNA 5'-磷酸水解酶(RppH，New England Biolabs，M0356)處理，且用RNA純化管柱再次純化。經RppH處理之RNA使用與環化序列互補之夾板DNA及T4 RNA連接酶2 (New England Biolabs，M0239)環化。環狀RNA經尿素-PAGE純化，在含有(0.5 M乙酸鈉、0.1% SDS、1 mM EDTA之緩衝液中溶離，乙醇沈澱且再懸浮於無RNase之水中。RNA品質係藉由尿素-PAGE或經由自動化電泳(Agilent)來評定。
使用螢光顯微鏡在BJ纖維母細胞中活體外評估與TO-1生物素結合之環狀RNA。當TO-1生物素與RNA結合時，其螢光增強超過100倍。向BJ纖維母細胞培養物之培養基中添加線性或環狀適體(50 nM)以及無RNA對照。添加轉染試劑脂染胺以確保RNA遞送。培養物用TO-1生物素處理且在3小時及6小時後分析螢光。如圖 16 中所示，在3小時及6小時自環狀適體偵測到增加的螢光/穩定性。
使用環狀適體觀察到更有效的遞送及更持久的螢光。 實例17：具有小分子之環狀RNA結合蛋白質
此實例展示環狀RNA與小分子連接以結合且募集所選蛋白質。
沙利度胺為一種臨床上批准之藥物(Thalomid )，已知與細胞蛋白質降解機構之成員E3泛素連接酶相關聯。藉由將沙利度胺與環狀RNA接合(例如經由點擊化學 )，沙利度胺接合之環狀RNA可將細胞降解機構募集至第二種致病蛋白(例如，亦由環狀 RNA 靶向 )。如以下實例中所示，小分子與環狀RNA接合以結合E3泛素連接酶Cereblon。
環狀RNA經設計以包括反應性尿苷殘基(例如5-疊氮基-C3-UTP)，用於接合已知與所關注之細胞內蛋白相互作用的烷烴官能化小分子。
線性RNA係藉由使用T7 RNA聚合酶(Lucigen)活體外轉錄來合成。所有UTP在活體外轉錄反應中經5-疊氮基-C3-UTP (Jena Biosciences)取代，生成疊氮官能化RNA。合成的線性RNA用RNA清理套組(New England Biolabs)純化，且進行RNA 5'焦磷酸水解酶(RppH，New England Biolabs)處理以移除焦磷酸。經RppH處理之線性RNA用RNA清理套組(New England Biolabs)純化。
藉由夾板連接生成環狀RNA。經RppH處理之線性RNA (100 μM)及夾板DNA (200 μM)藉由在75℃下加熱5分鐘且在室溫下逐漸冷卻20分鐘而黏接。在37℃下用T4 RNA連接酶2 (0.2 U/μL，New England Biolabs)進行連接反應4小時。藉由乙醇沈澱純化連接之混合物。為了分離環狀RNA，將連接之混合物在4%變性UREA-PAGE上分離。凝膠上之RNA用SYBR-green (Thermo Fisher)染色且用透照器(Transilluminators)觀測。將環狀RNA之相應RNA條帶切下且藉由破膠管(Ist Engineering)壓碎。對於環狀RNA之溶離，將壓碎的具有環狀RNA之凝膠在37℃下用溶離緩衝液(0.5 M乙酸鈉、1 mM EDTA、0.1% SDS)培育一小時，且小心地收穫上清液。對剩餘的壓碎凝膠溶離液再進行一輪溶離，共重複三次。具有環狀RNA之溶離緩衝液經由0.45 μm乙酸纖維素過濾器過濾以移除凝膠碎片，且藉由乙醇沈澱純化/濃縮環狀RNA。
使用點擊化學反應套組，基於製造商說明書(Jena Bioscience)，經由銅催化之疊氮-炔烴點擊化學反應(CuAAC)將炔烴官能化之沙利度胺(Jena Bioscience)與疊氮官能化之環狀RNA接合。用RNA清理套組(New England Biolab)純化沙利度胺接合之環狀RNA。
使用GST下拉分析沙利度胺接合之環狀RNA的結合特性，隨後藉由qPCR偵測RNA。對於GST下拉分析，將沙利度胺接合之環狀RNA (2 nM)與同沙利度胺相互作用之GST-E3泛素連接酶Cereblon (50 nM)在室溫下，在25 mM Tris-Cl (pH 7.0)、100 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5% NP-40、5%甘油存在下培育2小時。無沙利度胺接合之疊氮官能化環狀RNA用作陰性對照。
將RNA-蛋白質混合物與GSH-瓊脂糖珠粒在室溫下進一步培育一小時，以評定GST-GSH相互作用。在用結合緩衝液洗滌三次後，用Trizol (Thermo Fisher)提取與GSH-珠粒特異性結合之RNA。將提取的環狀RNA反轉錄，且藉由用特異性針對環狀RNA之引子(正向：TACGCCTGCAACTGTGTTGT，反向：TCGATGATCTTGTCGTCGTC)進行定量RT-PCR來偵測。
圖 17 表明，與沙利度胺小分子接合之環狀RNA在GST下拉分析中高度富集，表明環狀RNA具有小分子且經由小分子與特定蛋白質結合。 實例18：環狀RNA結合轉錄因子
此實例展示環狀RNA與蛋白質結合以進行螯合。NF-kB為活化轉錄且誘導存活途徑之轉錄因子家族。如以下實例中所示，環狀RNA與NF-kB結合以進行螯合。
環狀RNA經設計以包括NF-kB RNA結合適體模體：5'- aaaaaaaaaaGATCTTGAAACTGTTTTAAGGTTGGCCGATCTTaaaaaa-3'，以競爭性結合NF-kB且抑制其結合/下游功能。將多(A)段添加至內部結合模體，以(1)使RNA寡核苷酸適合於連接且維持適體之二級結構。使用RNAfold WebServer檢查正確的摺疊。作為對照，使用加擾RNA序列(aaaaaaaTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAAaaaaaa)。此加擾的RNA序列摺疊成類似於適體之三維結構，但不靶向任何蛋白質，如Mi等人, Mol Ther. 2008年1月; 16(1):66-73中所述。
具有NF-kB結合適體模體之RNA係由商業供應商(IDT)合成，具有5'單磷酸酯基及3'羥基。使用RNA連接酶1 (New England Biolabs，M0204S)連接RNA寡核苷酸。根據製造商說明書(Lucigen，RNR07250)，使用RNase R自樣品移除殘餘線性RNA。另外，藉由自15%尿素PAGE凝膠提取環狀RNA來純化環狀mRNA。環狀RNA係在含有以下之緩衝液中自凝膠中溶離：0.5 M乙酸鈉、0.1% SDS、1 mM EDTA。來自凝膠提取之殘餘凝膠碎片或鹽類係藉由使溶離液流經旋轉管柱(New England Biolabs，T2030S)來移除。將RNA溶離至RNA儲存緩衝液(1 mM檸檬酸鈉，Thermo Fisher，AM7000)中，且藉由尿素-PAGE或經由自動化凝膠毛細管電泳(Agilent)評定RNA完整性。
進行電泳遷移率變化分析(EMSA)以評定環狀RNA對NF-kB之結合親和力。在室溫下在緩衝反應(20 mM Tris-HCl，pH 8.0，50 mM NaCl，1mM MgCl2)中，將1 pmol線性或環狀RNA與相對於RNA濃度之不同濃度(亦即0、0.1、1、10 pmol蛋白質)之重組NF-kB p50次單元(Caymen Chemical，10009818)一起培育20分鐘。樣品在200V下運行6% TBE尿素凝膠25分鐘。用SybrGold (Thermo Scientific，S11494)對凝膠進行染色，且用藍色E-gel成像系統(Thermo Scientific，4466612)進行成像。
如圖 18 中所示，具有加擾結合適體序列之RNA未顯示出對NF-kB之p50次單元的結合親和力。線性及環狀型式之NF-kB結合適體序列以類似親和力與p50次單元結合。
藉由NF-kB之EMSA活體外評估環狀RNA與NF-kB之結合。NF-kB選擇性地結合含有NF-kB RNA結合適體模體之環狀RNA。此結果表明，所關注之生物分子由環狀RNA中之序列選擇性地結合。 實例19：環狀RNA螯合目標蛋白且抑制功能
此實例展示環狀RNA與細胞中之蛋白質結合，且此螯合導致功能之抑制。如以下實例中所示，環狀RNA與NF-kB結合以進行螯合，導致抑制細胞中NF-kB活化之存活。
如先前所述設計及合成環狀、線性及線性加擾RNA。
在遞送具有NF-kB結合適體序列之環狀RNA後，藉由MTT分析(Thermo Scientific，V13154)量測細胞活力來測定非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株A549中之NF-kB功能。簡而言之，A549細胞在與脂質轉染試劑(Thermo Scientific，LMRNA003)複合後，用1 pmol線性、線性加擾或環狀RNA轉染。藉由根據製造商說明書進行之MTT分析來量測活力。
如圖 19 中所示，用線性RNA處理之細胞在第1天表現出活力沒有變化，而在第2天表現出活力略微降低(第1天之活力為101%，第2天為97%)。相反，用環狀RNA處理之細胞在第1天表現出可量測之活力降低且至第2天表現出更大的增長(第1天為89%，第2天為86%)。
總體而言，結果表明環狀RNA結合細胞中之NF-kB且抑制NF-kB活化存活途徑。 實例20：環狀RNA結合且螯合蛋白質以影響化學治療劑敏感化
此實例展示環狀RNA與細胞中之目標蛋白結合，從而抑制目標蛋白的信號傳導路徑。如以下實例中所示，環狀RNA螯合化學抗性細胞中之NF-kB且抑制NF-kB之信號傳導，從而使細胞對化學治療劑重新敏感。
如先前所述設計及合成線性、線性加擾及環狀RNA。
在遞送靶向NF-kB之環狀RNA且暴露於化學治療劑後，測定NF-kB螯合在化學抗性非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株A549中之作用。細胞活力藉由MTT分析(Thermo Scientific，V13154)來測定。簡而言之，A549細胞在與脂質轉染試劑(Thermo Scientific，LMRNA003)複合後，用1 pmol加擾線性對照、線性或環狀RNA轉染。轉染後24小時，用5 μM小紅莓再處理細胞18小時。藉由根據製造商說明書進行之MTT分析來量測活力。在轉染後48小時及72小時重複小紅莓處理。
如圖 20 中所示，小紅莓處理與加擾線性RNA(對照)在第1天不影響小紅莓抗性A549肺癌細胞株之細胞活力。小紅莓與線性RNA共處理在第2天降低細胞活力(78%存活率)。相反，與環狀適體共處理在第1天及第2天均導致更多細胞死亡(第1天之存活率為79%且第2天之存活率為73%)。
總體而言，結果表明環狀RNA結合細胞中之NF-kB且抑制NF-kB存活信號傳導，從而增加細胞對化學治療劑小紅莓之敏感性。 實例21：環狀RNA標記目標蛋白以進行降解
此實例展示與小分子連接之環狀RNA募集兩種不同的所選蛋白質且藉此標記目標蛋白以進行降解。
沙利度胺為一種臨床上批准之藥物(Revlimid )，已知與細胞蛋白質降解機構之成員E3泛素連接酶相關聯。藉由將沙利度胺與環狀RNA接合(例如經由點擊化學)，沙利度胺接合之環狀RNA可將細胞降解機構募集至第二種致病蛋白(例如，亦由環狀RNA靶向)。圖 21 為顯示例示性環狀RNA遞送至細胞中且標記細胞中之目標BRD4蛋白以便由泛素系統降解的示意圖。如以下實例中所示，兩種小分子(沙利度胺及JQ1)與環狀RNA接合以結合(1) E3泛素連接酶Cereblon進行鄰近蛋白質之泛素化及後續降解；及(2)經由JQ1結合BET家族蛋白質，JQ1為結合BET家族蛋白質的小分子抑制劑。
環狀RNA經設計以包括多個(49個殘基)反應性尿苷殘基(例如5-疊氮基-C3-UTP)，用於接合已知與所關注之細胞內蛋白相互作用的烷烴官能化小分子。
線性RNA係藉由使用T7 RNA聚合酶(Lucigen)活體外轉錄來合成。所有UTP在活體外轉錄反應中經5-疊氮基-C3-UTP (Jena Biosciences)取代，生成疊氮官能化RNA。合成的線性RNA用RNA清理套組(New England Biolabs)純化，且進行RNA 5'焦磷酸水解酶(RppH，New England Biolabs)處理以移除焦磷酸。經RppH處理之線性RNA用RNA清理套組(New England Biolabs)純化。
藉由夾板連接生成環狀RNA。經RppH處理之線性RNA (100 μM)及夾板DNA (200 μM)藉由在75℃下加熱5分鐘且在室溫下逐漸冷卻20分鐘而黏接。在37℃下用T4 RNA連接酶2 (0.2 U/μL，New England Biolabs)進行連接反應4小時。藉由乙醇沈澱純化連接之混合物。為了分離環狀RNA，將連接之混合物在4%變性UREA-PAGE上分離。凝膠上之RNA用SYBR-green (Thermo Fisher)染色且用透照器(Transilluminators)觀測。將環狀RNA之相應RNA條帶切下且藉由破膠管(Ist Engineering)壓碎。對於環狀RNA之溶離，將壓碎的具有環狀RNA之凝膠在37℃下用溶離緩衝液(0.5 M乙酸鈉、1 mM EDTA、0.1% SDS)培育一小時，且小心地收穫上清液。對剩餘的壓碎凝膠再進行一輪溶離，共重複三次。具有環狀RNA之溶離緩衝液經由0.45 μm乙酸纖維素過濾器過濾以移除凝膠碎片，且藉由乙醇沈澱純化/濃縮環狀RNA。
使用點擊化學反應套組，基於製造商說明書(Jena Bioscience)，經由銅催化之疊氮-炔烴點擊化學反應(CuAAC)將炔烴官能化之沙利度胺及/或JQ1 (噻吩并三唑并二氮呯，Jena Bioscience)與疊氮官能化之環狀RNA接合。為了進行比較，將三個不同種類之小分子與環狀RNA接合；具有JQ1及沙利度胺、僅沙利度胺或僅JQ1之RNA。用RNA清理套組(New England Biolab)純化小分子接合之環狀RNA。
隨後藉由使用脂質轉染試劑(Invitrogen)，根據製造商說明書，將此等不同的RNA轉染至HEK293T細胞中以監測目標蛋白之降解。使用1 pmol各RNA轉染HEK293T細胞，且將細胞接種於12孔盤中(最終2 nM)。在環狀RNA與JQ1及沙利度胺接合之情況下，將3 pmol RNA轉染至HEK293T細胞中以測試不同濃度之環狀RNA對BRD4降解之影響(最終6 nM)。作為陽性對照，使用具有JQ1及沙利度胺之PROTAC dBET1 (Tocris Biosciences)，且已知其經由CRBN募集降解細胞中之BRD4蛋白(2 μM、10 μM濃度)。對於陰性對照，使用僅載劑及無接合之環狀RNA。轉染24小時後，藉由將RIPA緩衝液直接添加至盤上來收穫細胞。
使用西方墨點法分析與E3泛素連接酶CRBN及BET家族蛋白質結合之小分子接合之環狀RNA的降解能力。簡言之，將12 μg蛋白質在4%-12%梯度Bis-Tris凝膠(Thermo Fisher Scientific)上解析，且使用墨點轉移系統(Thermo Fisher Scientific)轉移至硝化纖維素膜。兔抗BRD4抗體(Abcam)用於偵測BRD4蛋白，且兔抗α微管蛋白抗體(Abcam)用於偵測α微管蛋白作為上樣對照。藉由Fc成像系統(LI-COR)監測BRD4及α微管蛋白之蛋白質條帶的化學發光信號。
亦使用ImageJ使用密度測定法來量測BRD4蛋白質含量以及作為上樣對照之α微管蛋白。
如圖 22 中所示，含有沙利度胺及JQ1小分子之環狀RNA能夠降解BRD4，如藉由BRD4之標準化含量所表明。此結果表明，具有小分子之環狀RNA與兩種特異性蛋白結合，使用小分子接合物降解目標蛋白。 實例22：環狀RNA結合比其線性對應物長的小分子
此實例展示環狀RNA結合小分子以用於螯合/生物活性。如以下實例中所示，環狀RNA比其線性對應物更穩定。
線性芒果RNA適體在與小分子TO-1生物素染料結合時發螢光。如以下實例中所示，環狀芒果RNA與噻唑橙色衍生物TO-1生物素結合以用於螯合/生物活性。
環狀RNA經設計以包括芒果RNA小分子結合位點及穩定莖：5'- AATAGCCG GUCUACGGCC AUACCACCCU GAACGCGCCC GAUCUCGUCU GAUCUCGGAAGCUAAGCAGG GUCGGGCCUG GUUAGUACUU GGAUGGGAGA CCGCCUGGGAAUACCGGGUG CUGUAGGCGU CGACUUGCCA UGUGUAUGUG GGUACGAAGGAAGGAUUGGU AUGUGGUAUA UUCGUACCCA CAUACUCUGA UGAUCCUUCG GGAUCAUUCA UGGCAA CGGCTATT-3'，以及環化序列：5'-AATAGCCG-3'及5'-CGGCTATT-3'。
未經修飾之線性RNA係藉由使用T7 RNA聚合酶自包含芒果RNA模體、莖及環化序列之DNA區段活體外轉錄來合成。轉錄的RNA用RNA清理套組(New England Biolabs，T2050)純化，按照製造商說明書用RNA 5'-磷酸水解酶(RppH，New England Biolabs，M0356)處理，且用RNA純化管柱再次純化。經RppH處理之RNA使用與環化序列互補之夾板DNA及T4 RNA連接酶2 (New England Biolabs，M0239)環化。環狀RNA經尿素-PAGE純化，在含有(0.5 M乙酸鈉、0.1% SDS、1 mM EDTA之緩衝液中溶離，乙醇沈澱且再懸浮於無RNase之水中。RNA品質係藉由尿素-PAGE或經由自動化電泳(Agilent)來評定。
使用螢光顯微鏡在HeLa細胞中活體外評估環狀RNA與TO-1生物素之結合。當TO-1生物素與RNA結合時，其螢光增強超過100倍。向BJ纖維母細胞培養物之培養基中添加線性或環狀適體(50 nM)以及無RNA對照。添加轉染試劑脂染胺以確保RNA遞送。培養物用TO-1生物素處理且在6小時及第1-12天分析螢光。如圖 23 中所示，自環狀適體偵測到螢光/穩定性增加，其中在培養物中偵測到螢光至少10天。 實例23：環狀RNA結合蛋白質及RNA
此實例展示環狀RNA與蛋白質及RNA結合以進行螯合。
人類抗原受體(HuR)可為一種致病蛋白，例如已知其結合且穩定癌症相關之mRNA轉錄本，諸如原癌基因、細胞介素、生長因子及侵襲因子之mRNA。HuR藉由實現多種癌症表型而具有核心致瘤活性。用環狀RNA螯合HuR可減弱多種癌症之致瘤性生長。
RNA在細胞代謝中起核心作用，且RNA分子經歷多個轉錄後過程，諸如剪接、編輯、修飾、轉譯及降解。
如以下實例中所示，環狀RNA與HuR及RNA結合以進行螯合。
環狀RNA經設計以包括HuR RNA結合模體：5'-UCAUAAUCAA UUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAA UUUUGUUUUU-3'以競爭性結合HuR且抑制其結合/下游功能；及RNA結合模體：5'-CGA GAC GCT ACG GAC TTA AAA TCC GTT GAC-3'。
未經修飾之線性RNA係藉由使用T7 RNA聚合酶自包含HuR RNA模體及蛋白質結合序列之DNA區段活體外轉錄來合成。
環狀RNA經設計以包括HuR RNA結合適體模體：5'-UCAUAAUCAA UUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAA UUUUGUUUUU-3'以競爭性結合HuR且抑制其結合/下游功能；及RNA結合適體模體：5'-CGA GAC GCT ACG GAC TTA AAA TCC GTT GAC-3'。
未經修飾之線性RNA係藉由使用T7 RNA聚合酶自包含HuR RNA模體及蛋白質結合序列之DNA區段活體外轉錄來合成。
轉錄的RNA用RNA清理套組(New England Biolabs，T2050)純化，按照製造商說明書用RNA 5'-磷酸水解酶(RppH，New England Biolabs，M0356)處理，且用RNA純化管柱再次純化。經RppH處理之RNA使用與環化序列互補之夾板DNA及T4 RNA連接酶2 (New England Biolabs，M0239)環化。環狀RNA經尿素-PAGE純化，在含有(0.5 M乙酸鈉、0.1% SDS、1 mM EDTA之緩衝液中溶離，乙醇沈澱且再懸浮於無RNase之水中。RNA品質係藉由尿素-PAGE或經由自動化電泳(Agilent)來評定。
藉由HuR免疫沈澱(IP)及生物素RNA下拉分析之組合，隨後藉由qPCR活體外評估環狀RNA與HuR及RNA之結合。將與蛋白質G-抗HuR抗體偶合之HuR蛋白與環狀RNA一起培育，洗滌且在低pH值下溶離。將結合之物質與生物素化RNA一起培育，洗滌且用鏈黴親和素dynabeads下拉。
HuR結合具有HuR RNA結合適體模體之環狀RNA，且鏈黴親和素下拉產生具有RNA結合適體模體之RNA，如圖24中所示。因此，當HuR及RNA兩個結合模體存在時觀察到結合。此結果表明所關注之生物分子經選擇性地結合。 實例24：環狀RNA結合蛋白質及DNA
此實例展示環狀RNA與蛋白質及DNA結合以進行螯合。
藉由蛋白質及RNA之DNA結合在不同的細胞過程中起關鍵作用，亦即轉錄。
人類抗原受體(HuR)在mRNA命運中起核心作用，且在轉錄後調控具有核心細胞功能之mRNA目標中起關鍵作用，從而使其成為發病機制中之重要蛋白質。已知其結合且穩定癌症相關之mRNA轉錄本，因此，HuR藉由實現多種癌症表型而具有核心致瘤活性。
靶向及競爭此等與環狀RNA之接觸可用於調節此等相互作用且控制疾病及非疾病過程中之成效。
環狀RNA經設計以包括DNA結合適體模體：5'-CGA GAC GCT ACG GAC TTA AAA TCC GTT GAC-3' RNA。
未經修飾之線性RNA係使用T7 RNA聚合酶自DNA區段活體外轉錄來合成。轉錄的RNA用RNA清理套組(New England Biolabs，T2050)純化，按照製造商說明書用RNA 5'-磷酸水解酶(RppH，New England Biolabs，M0356)處理，且用RNA純化管柱再次純化。經RppH處理之RNA使用與環化序列互補之夾板DNA及T4 RNA連接酶2 (New England Biolabs，M0239)環化。環狀RNA經尿素-PAGE純化，在含有(0.5 M乙酸鈉、0.1% SDS、1 mM EDTA之緩衝液中溶離，乙醇沈澱且再懸浮於無RNase之水中。RNA品質係藉由尿素-PAGE來評定。
藉由HuR免疫沈澱(IP)及生物素化DNA下拉分析之組合，隨後藉由RT-qPCR活體外評估環狀RNA與DNA及HuR之結合。缺乏DNA結合模體或HuR模體之環狀RNA用作特異性對照。生物素化DNA結合具有DNA結合適體模體之環狀RNA。
將與蛋白質G-抗HuR珠粒偶合之HuR蛋白與環狀RNA一起培育，洗滌且在低pH值下溶離。將結合之物質與生物素化DNA一起培育，洗滌且用鏈黴親和素Dynabeads下拉。HuR結合具有HuR DNA結合適體模體之環狀RNA，且鏈黴親和素下拉產生具有DNA結合適體模體之RNA，如圖 25 中所示。因此，當HuR及DNA兩個結合適體模體存在時觀察到結合。此結果表明所關注之蛋白質及DNA分子選擇性地結合至同一環狀構築體。 實例25：環狀RNA轉譯蛋白質，且與影響其轉譯之不同蛋白質結合
此實例展示編碼蛋白質且結合在環狀RNA轉譯中具有作用之不同蛋白質的環狀RNA。
人類抗原受體(HuR)在mRNA命運中起核心作用，且在轉錄後調控具有核心細胞功能之mRNA目標中起關鍵作用。因此，使用HuR控制RNA表現可提供對經轉譯蛋白質劑量之控制。
如以下實例中所示，非天然存在之環狀RNA經工程改造以編碼長腹水蚤螢光素酶(GLuc)，一種具有生物活性之分泌蛋白，且結合HuR以調控GLuc轉譯。此環狀RNA包括IRES、編碼長腹水蚤螢光素酶之ORF、側接IRES-ORF之兩個間隔子元件及1X、2X或3X HuR結合適體模體：5'-UCA UAA UCA AUU UAU UAU UUU CUU UUA UUU UAU UCA CAU AAU UUU GUU UUU-3'、5'-AUU UUG UUU UUA ACA UUUC-3'、5'-UCA UAA UCA AUU UAU UAU UUU CUU UUA UUU UAU UCA CAU AAU UUU GUU UUU AUU UUG UUU UUA ACA UUU C-3'以結合HuR。
未經修飾之線性RNA係藉由使用T7 RNA聚合酶自包含HuR RNA模體及蛋白質結合序列之DNA區段活體外轉錄來合成。
轉錄的RNA用RNA清理套組(New England Biolabs，T2050)純化，按照製造商說明書用RNA 5'-磷酸水解酶(RppH，New England Biolabs，M0356)處理，且用RNA純化管柱再次純化。經RppH處理之RNA使用與環化序列互補之夾板DNA及T4 RNA連接酶2 (New England Biolabs，M0239)環化。環狀RNA經尿素-PAGE純化，在含有(0.5 M乙酸鈉、0.1% SDS、1 mM EDTA之緩衝液中溶離，乙醇沈澱且再懸浮於無RNase之水中。RNA品質係藉由尿素-PAGE或經由自動化電泳(Agilent)來評定。
如先前所述，藉由活體外RNA下拉分析來測定環狀RNA與HuR之結合。
為了評估HuR結合之效應及其對細胞中環狀RNA蛋白質表現之影響，用基於脂質之轉染試劑(Invitrogen)及2 nM環狀RNA成功地反向轉染5×103 個HeLa細胞。使用長腹水蚤螢光素酶分析套組且按照製造商說明書，每日監測細胞培養上清液中之長腹水蚤螢光素酶活性多達96小時，作為表現之量度。
圖 26 展示具有HuR結合適體位點之環狀RNA的分泌蛋白表現較低。更有甚者，GLuc表現量隨環狀RNA中HuR結合適體模體之數目而變化。此實例表明，自經工程改造之環狀RNA的轉譯水準受額外蛋白質結合適體之影響。
雖然本文已顯示及描述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者應顯而易見，此類實施例僅藉助於實例提供。熟習此項技術者現將在不背離本發明之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之實施例的各種替代方案可用於實踐本發明。預期以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且由此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。
當結合附圖閱讀時，將更好地理解本發明之實施例的以下詳細描述。為了說明本發明，在圖式中展示當前例示之實施例。然而，應理解，本發明不限於圖式中所示實施例之精確佈置及工具。
圖 1 示出例示性環狀多核糖核苷酸分子骨架。
圖 2 示出例示性反式核糖核酸酶環狀多核糖核苷酸。
圖 3 示出環狀多核糖核苷酸之蛋白質表現的示意圖。
圖 4 示出用於脂質(諸如膜)之例示性環狀多核糖核苷酸分子骨架。
圖 5A 示出用於DNA之例示性環狀多核糖核苷酸分子骨架。
圖 5B 示出具有序列特異性DNA結合模體之例示性環狀多核糖核苷酸分子骨架。circRNA可結合至DNA雙螺旋體之大溝，以基於第三股之取向形成平行或反平行的三螺旋體結構。例示性平行三螺旋體結構包括TA·U、CG·G及CG·C (DNA DNA·RNA)。例示性反平行三螺旋體結構包括TA·A、TA·U及CG·G (DNA DNA·RNA)。
圖 6 示出用於RNA之例示性環狀多核糖核苷酸分子骨架。
圖 7A 示出用於目標RNA以螯合及/或降解目標RNA之例示性環狀多核糖核苷酸分子骨架。
圖 7B 示出用於RNA及靶向RNA之酶(例如，誘導RNA降解之去封端酶)的例示性環狀多核糖核苷酸分子骨架。
圖 7C 示出用於RNA、DNA及蛋白質(例如，以驅動目標基因轉譯)之例示性環狀多核糖核苷酸分子骨架。
圖 8 示出包含與TO-1生物素結合之適體(環狀適體)的環狀RNA在不存在轉染試劑之情況下遞送(載劑非依賴性遞送)後在細胞中發螢光，相比之下，包含與TO-1生物素結合之適體的線性RNA或無適體之單獨緩衝液遞送後未偵測到螢光。
圖 9 示出環狀RNA的示意圖。左下方示意圖展示包含結合運鐵蛋白受體之C2min適體序列的環狀RNA。底部中間示意圖展示包含結合運鐵蛋白受體之36a適體序列的環狀RNA。右下方示意圖展示包含不結合運鐵蛋白受體之非結合序列的環狀RNA。所有三個環狀RNA亦包含與AF488標記之DNA寡核苷酸結合之序列(黏接序列)。
圖 10 展示包含結合運鐵蛋白受體之適體序列(C2.min或36a)的環狀多核糖核苷酸基於螢光內化至表現運鐵蛋白受體之細胞中。包含非結合適體之環狀多核糖核苷酸基於螢光未內化至表現運鐵蛋白受體之細胞中。
圖 11 展示與包含適體序列之單股RNA寡核苷酸雜交之環狀RNA的示意圖。單股RNA寡核苷酸包含適體序列及與環狀多核糖核苷酸結合之序列(結合模體)。環狀RNA包含與單股RNA寡核苷酸之結合模體中之結合序列結合的序列。左下方示意圖展示包含結合運鐵蛋白受體之C2min適體序列及與環狀多核糖核苷酸結合之序列的單股RNA寡核苷酸，其與環狀多核糖核苷酸結合。底部中間示意圖展示包含結合運鐵蛋白受體之36a適體序列及與環狀多核糖核苷酸結合之序列的單股RNA寡核苷酸，其與環狀多核糖核苷酸結合。右下方示意圖展示包含不結合運鐵蛋白受體之適體序列及與環狀多核糖核苷酸結合之序列的單股RNA寡核苷酸，其與環狀多核糖核苷酸結合。
圖 12 展示與包含適體序列之單股DNA寡核苷酸雜交之環狀RNA的示意圖。單股DNA寡核苷酸包含適體序列及與環狀多核糖核苷酸結合之序列(結合模體)。環狀RNA包含與單股DNA寡核苷酸之結合模體中之結合序列結合的序列。左下方示意圖展示包含結合運鐵蛋白受體之競爭性結合適體序列及與環狀多核糖核苷酸結合之序列的單股DNA寡核苷酸，其與環狀多核糖核苷酸結合。底部中間示意圖展示包含結合運鐵蛋白受體之非競爭性結合適體序列及與環狀多核糖核苷酸結合之序列的單股DNA寡核苷酸，其與環狀多核糖核苷酸結合。右下方示意圖展示包含不結合運鐵蛋白受體之適體序列及與環狀多核糖核苷酸結合之序列的單股DNA寡核苷酸，其與環狀多核糖核苷酸結合。
圖 13A 、13B 及13C 展示經修飾之環狀RNA結合細胞中之蛋白質轉譯機構。
圖 14A 、14B 及14C 展示，如藉由免疫相關基因之活化(MDA5、OAS及IFN-β表現)所評定，與未經修飾之環狀RNA相比，經修飾之環狀RNA在細胞中與免疫蛋白之結合減少。
圖 15 展示，如藉由RIG-I、MDA5、IFN-β及OAS在細胞中之表現所評定，與未經修飾之環狀RNA相比，經雜交修飾之環狀RNA的免疫原性降低。
圖 16 展示，與線性適體相比，環狀RNA適體表現出增加的細胞內遞送及增強的與小分子目標之結合。
圖 17 展示小分子-環狀RNA接合物與小分子靶向之蛋白質結合。
圖 18 展示來自電泳遷移率變化分析(EMSA)之影像，證明具有加擾結合適體序列之RNA未顯示出對NF-kB之p50次單元的結合親和力，而具有NF-kB結合適體序列之線性及環狀RNA以類似親和力與p50次單元結合。
圖 19 展示，用具有NF-kB結合適體序列之環狀RNA處理與其線性對應物相比導致A549細胞之細胞生存力降低。
圖 20 展示在小紅莓(dox)抗性A549肺癌細胞株中，用線性RNA及dox共同處理在第2天降低細胞生存力，用環狀適體及dox共同處理在第1天及第2天均導致更多的細胞死亡。
圖 21 為顯示例示性環狀RNA遞送至細胞中且標記細胞中之目標BRD4蛋白以便由泛素系統降解的示意圖。
圖 22 展示西方墨點影像及定量圖表，證明含有沙利度胺及JQ1小分子之環狀RNA能夠降解細胞中之BRD4。
圖 23 展示在向HeLa細胞培養物遞送環狀RNA (環形適體)或線性RNA (線性適體)之後的不同時間點與TO-1生物素結合時之適體螢光。螢光影像(頂部)展示在遞送環狀RNA (環形適體)或線性RNA (線性適體)之後6小時、第1天及第10天與TO-1生物素結合之適體螢光。圖(底部)展示在遞送環狀RNA (環形適體)、線性RNA (線性適體)或僅TO-1生物素(對照)之後6小時、第1天、第3天、第5天、第7天、第10天及第12天HeLa細胞培養物中螢光細胞之百分比。
圖 24 展示HuR結合之環狀RNA與HuR RNA結合適體模體及鏈黴親和素下拉產生的具有RNA結合適體模體之RNA與無結合適體模體之環狀RNA、具有HuR RNA結合適體模體之環狀RNA及具有RNA結合適體模體之環狀RNA進行比較。
圖 25 展示HuR結合之環狀RNA與HuR DNA結合適體模體及鏈黴親和素下拉產生的具有DNA結合適體模體之RNA與無結合適體模體之環狀RNA、具有HuR DNA結合適體模體之環狀RNA及具有DNA之環狀RNA進行比較。
圖 26 展示，與具有1X HuR結合模體、2X HuR結合模體及3X HuR結合模體之環狀RNA相比，無HuR結合模體之環狀RNA的分泌蛋白表現較低。

Claims (42)

  1. 一種非經腸核酸遞送系統，其包含環狀多核糖核苷酸及非經腸可接受之稀釋劑，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。
  2. 如請求項1之非經腸核酸遞送系統，其中該遞送系統不含任何載劑。
  3. 如請求項1之非經腸核酸遞送系統，其中該遞送系統包含載劑。
  4. 一種環狀多核糖核苷酸用於製造非經腸遞送至個體之組合物的用途，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。
  5. 如請求項4之用途，其中該環狀多核糖核苷酸之量有效地引起該個體之生物反應。
  6. 如請求項4之用途，其中該環狀多核糖核苷酸之量有效地對該個體之細胞或組織產生生物效應。
  7. 一種環狀多核糖核苷酸用於製造遞送至個體之細胞或組織之非經腸組合物的用途，其中該環狀多核糖核苷酸包含結合目標之序列。
  8. 如請求項4至7中任一項之用途，其中該組合物經調配用於靜脈內、肌肉內、經眼或局部投與。
  9. 如請求項4至7中任一項之用途，其中該組合物為醫藥組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。
  10. 如請求項4至7中任一項之用途，其中該組合物包含載劑。
  11. 如請求項4至7中任一項之用途，其中該組合物包含非經腸可接受之稀釋劑且不含任何載劑。
  12. 如請求項1至7中任一項之系統或用途，其中該環狀多核糖核苷酸與該目標形成複合物，且該環狀多核糖核苷酸或該目標在遞送後至少5天為可偵測的。
  13. 如請求項1至7中任一項之系統或用途，其中該目標係選自由以下組成之群：核酸分子、小分子、蛋白質、碳水化合物及脂質。
  14. 如請求項12之系統或用途，其中該目標係選自由以下組成之群：核酸分子、小分子、蛋白質、碳水化合物及脂質。
  15. 如請求項13之系統或用途，其中該小分子為分子量不超過900道爾頓且調節細胞過程之有機化合物。
  16. 如請求項15之系統或用途，其中該小分子為藥物。
  17. 如請求項15之系統或用途，其中該小分子為螢光團。
  18. 如請求項15之系統或用途，其中該小分子為代謝物。
  19. 如請求項1至7中任一項之系統或用途，其中該目標為基因調控蛋白。
  20. 如請求項19之系統或用途，其中該基因調控蛋白為轉錄因子。
  21. 如請求項14之系統或用途，其中該核酸分子為DNA分子或RNA分子。
  22. 如請求項12之系統或用途，其中該複合物調節基因表現。
  23. 如請求項12之系統或用途，其中該複合物調節DNA分子之定向轉錄、DNA分子之表觀遺傳重塑或DNA分子之降解。
  24. 如請求項12之系統或用途，其中該複合物調節該目標之降解、該目標之易位或目標信號轉導。
  25. 如請求項22之系統或用途，其中該基因表現與疾病或病況之發病機制相關。
  26. 如請求項12之系統或用途，其中該複合物之該環狀多核糖核苷酸或該複合物之該目標在遞送後至少7、8、9或10天為可偵測的。
  27. 如請求項1至7中任一項之系統或用途，其中該環狀多核糖核苷酸在遞送後存在至少五天。
  28. 如請求項1至7中任一項之系統或用途，其中該環狀多核糖核苷酸在遞送後存在至少6、7、8、9或10天。
  29. 如請求項1至7中任一項之系統或用途，其中該環狀多核糖核苷酸為未經修飾之環狀多核糖核苷酸。
  30. 如請求項1至7中任一項之系統或用途，其中該環狀多核糖核苷酸具有準雙股二級結構。
  31. 如請求項1至7中任一項之系統或用途，其中該序列為具有結合該目標之二級結構的適體序列。
  32. 如請求項1至7中任一項之系統或用途，其中該適體序列進一步具有結合該目標之三級結構。
  33. 如請求項7之用途，其中該細胞為真核細胞。
  34. 如請求項33之用途，其中該真核細胞為動物細胞。
  35. 如請求項33之用途，其中該真核細胞為寵物細胞。
  36. 如請求項33之用途，其中該真核細胞為哺乳動物細胞。
  37. 如請求項33之用途，其中該真核細胞為人類細胞。
  38. 如請求項33之用途，其中該真核細胞為家畜細胞。
  39. 如請求項1至7中任一項之系統或用途，其中該環狀多核糖核苷酸缺乏多A序列、缺乏複製元件、缺乏自由3'端或缺乏RNA聚合酶識別模體或其任何組合。
  40. 如請求項1至7中任一項之系統或用途，其中該環狀多核糖核苷酸為轉譯非勝任型環狀多核糖核苷酸。
  41. 如請求項1至7中任一項之系統或用途，其中該環狀多核糖核苷酸進一步包含表現序列。
  42. 如請求項41之系統或用途，其中該環狀多核糖核苷酸包含終止元件或IRES，或其組合。
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