TWI361221B - Immunoglobulin production - Google Patents

Description

1361221 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本申請案闡述可用於在哺乳動物細胞中製造免疫球蛋白 之方法及核酸》 【先前技術】 用於製造重組多肽之表現系統已為吾人所熟知且在先前 技術文獻中已有報導。對於製造用於醫藥應用之多肽，可 使用諸如CHO細胞、BHK細胞、NSO細胞、Sp2/0細胞、 COS細胞、HEK細胞、PER.C6®細胞及諸如此類等哺乳動 物細胞。將編碼多肽之核酸引入至細胞中，例如質粒（例 如’表現質粒）中。表現質粒之基本元件係原核質粒繁殖 單元（例如對於大腸桿菌（Escherichia coli)而言，包含複製 起點及選擇標§己）、真核選擇標記及一或多個用於表現所 關注核酸之表現盒，該等中之每一者皆包含啓動子、結構 基因及包括聚腺苷酸化信號之轉錄終止子。對於在哺乳動 物細胞中瞬時表現’可包括諸如SV40 0rUt〇rip等哺乳動 物複製起點。作為啓動子，可選擇組成型或誘導型啓動 子。對於最佳化轉錄，K〇zak序列可包括於5，非轉譯區 中。對於mRNA處理，亦可包括聚腺苷酸化信號。 蛋白質且尤其免疫球蛋白在當今醫學業務中起重要作 用》對於人類應用，各醫藥物質必須符合不同的標準。為 確保生物藥劑對人類物質之安全性， 只〜文主Γ生，&成厫重傷害者必須 尤其移除。 A剪接係藉由存在剪接供體_ 设货媸位點與剪接受體位點調 130900.doc 1361221

控’該等位點分別位於内含子之5，末端及3•末端。按照 伽咖等人（Watson 等人（編輯），Recombinant DNA: A

Short course，Scientific American Books，由 W_H. Freeman and C〇mpany，紐約，USA (1983)分發）者係5|剪接供體位 =ag|gtragt(外顯子丨内含子）與3,剪接受體位點（y)nNCag|g(内 3子丨外顯子）〇=嘌呤鹼基；y=嘧啶鹼基；n=整數；任何 天然驗基）之共有序列。 在1980年，發表論及分泌型及膜結合形式免疫球蛋白之 起源的最早文章。分泌型（sIg)及膜結合（mIg)同種型之形 成係由於重鏈mRNA前體之交替剪接而產生。在mig同種 型中，使用編碼分泌型形式之c-端結構域（即分別為Ch3或 CH4結構域）之外顯子中的剪接供體位點及位於其下游距離 之剪接受體位點以將恆定區與編碼跨膜結構域之下游外顯 子連接。 製備當在特定宿主細胞中表現時具有降低之不合適或不 期望轉錄特徵之合成性核酸分子的方法報導於W〇 2002/016944中。在w〇 2〇〇6/〇42158中報導經修飾以增強 重組蛋白表現及/或減少或消除錯誤剪接及/或内含子連讀 副產物之核酸分子。 因此，需要具有減少之副產物之免疫球蛋白的重組製造 方法。 【發明内容】 在第I、樣中本發明包含編碼IgA或IgG類免疫球蛋白 之Ch3-結構域之c-端部分或IgE或IgM類免疫球蛋白之匸一_ 130900.doc 1361221 結構域之c-端部分的胺基酸序列的核酸，其中包含在該 CH3-或CH4-結構域之c·端部分的一級胺基酸序列中之甘胺 酸離胺酸-_狀係藉由核酸ggaaaa、或核酸ggCaaa、或核 酸gggaaa、或核酸gggaag、或核酸ggCaag、或核酸gggaag 編碼。

在一個實施例中，本發明核酸編碼選自胺基酸序列SEQ ID NO’· 1、3、4、5、6、7或8之胺基酸序列。在另一實施 例中’核酸編碼以核苷酸g或a為首之甘胺酸-離胺酸-二 肽。在另一實施例中’編碼甘胺酸-離胺酸-二肽之核酸係 核 ggaaaa、或核酸 ggcaaa、或核酸 gggaaa。 本發明之第二態樣係包含本發明核酸之質粒，且本發明 之第二態樣係包含本發明核酸之細胞。 本發明之又一態樣係具有SEQ ID NO: 17、18、19、 20、21、22、23、30或31核苦酸序列之核酸。 本發明之第五態樣係用於在哺乳動物細胞中製造免疫球 蛋白之方法，其包含以下步驟：

a) 用編碼包含 SEQ ID NO: 17、18、19、20 ' 21 ' 22、 23、30或31核酸之免疫球蛋白重鏈的核酸轉染哺乳動 物細胞，該核酸編碼該免疫球蛋白重鏈之C-端部分， b) 在適於表現該免疫球蛋白之條件下對該經轉染之哺乳 動物細胞實施培養， c) 自培養物或細胞回收免疫球蛋白。 在一個實施例中，哺乳動物細胞係CHO細胞、BHK細 胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、HEK細胞或 130900.doc 1361221 PER.C6®細胞》較佳地，哺乳動物細胞係CH〇細胞、或 BHK細胞、或PER.C6®細胞。在另一實施例中，該哺乳動 物細胞經兩種核酸轉染，其中第一核酸包含編碼免疫球蛋 白輕鏈之表現盒，且其中第二核酸包含編碼免疫球蛋白重 鏈之表現盒’該免疫球蛋白重鏈包含編碼免疫球蛋白重鏈 之 C-端部分的核酸 SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、 22、23、30或 31 ° 本發明最後態樣係用於改良免疫球蛋白在哺乳動物細胞 中之表現的方法’其中編碼免疫球蛋白重鍵之核酸包含編 碼CH3-或CH4-結構域中含有之甘胺酸_離胺酸_二肽的核酸 ggaaaa、或核 Stggcaaa、或核酸gggaaa、或核酸ggaaag、 或核酸ggcaag、或核酸gggaag。 【實施方式】 本發明包含編碼IgA或IgG類免疫球蛋白之CH3 -結構域之 C-端部分或IgE或IgM類免疫球蛋白之cH4-結構域之C-端部 分的胺基酸序列的核酸，其中包含在該CH3-或CH4-結構域 之C-端部分的胺基酸序列中之甘胺酸-離胺酸-二肽係藉由 核酸ggaaaa、或核酸ggcaaa、或核酸gggaaa、或核酸 ggaaag、或核酸ggcaag、或核酸gggaag編碼，且其中該編 碼甘胺酸-離胺酸-二肽之核酸視情況以核苷酸g或核苷酸a 為首。 可用於實施本發明之方法及技術已為熟習此項技術者所 習知且闡述於（例如）Ausubel，F.M.編輯，Current Protocols in Molecular Biology，第 I至 III 卷（1997)，及 Sambrook 等 130900.doc 1361221 人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二版， 冷泉港實驗室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷束港，N.Y. (1989)中。如熟習此項技術者所習 知’使用重組DNA技術能夠製造核酸及/或多肽之多種衍 生物。該等衍生物可（例如）在一個個體中或在數個位置藉 由替代、改變、交換、缺失或插入經修飾。該修飾或衍生 化可（例如）藉助定向誘變實施。該等修飾可容易地由熟習 此項技術者實施（參見（例如）Sambrook，J.等人，Molecular Cloning: A laboratory manual (1999)冷泉港實驗室出版 社，紐约，USA)。使用重組技術使得熟習此項技術者能 夠用異源核酸轉化各種宿主細胞。儘管不同細胞之轉錄及 轉譯（即表現）機制使用相同元件，但是屬於不同物種之細 胞可能尤其具有不同的所謂密碼子使用。因此，相同多肽 (就胺基酸序列而言）可能藉由不同核酸編碼。而且，由於 基因代碼之簡併性，不同核酸可能編碼相同多肽。 本文所用之”核酸”係指由個體核苷酸（亦稱為鹼基）a、 c、g及t(在RNA中或u)組成之聚合分子，例如係指DNa、 RNA或其修飾。該聚核普酸分子可為天然存在之聚核芽酸 分子或合成性聚核皆酸分子或一或多種天然存在之聚核苦 酸分子與-或多種合成性聚核苷酸分子之組合。該定義亦 涵蓋其中一或多個核皆酸經改變（例如藉由誘變）、缺失或 添加之天时在的聚料酸分子。核酸可經分離或整合於 另核酸中’例如於表現盒、質粒或宿主細胞之染色體 中。核酸之特徵亦在於其核酸序列由個體核皆酸組成。 130900.doc 熟習此項技術者已熟知將（例如）多肽之胺基酸序列轉變 成編碼該胺基酸序列之對應核酸序列的程序及方法。因 此，核酸之特徵在於由個體核苷酸組成之其核酸序列且亦 在於由此經編碼之多肽之胺基酸序列。 , 術語"質粒”包括（例如）穿梭質粒及表現質粒以及轉染質 • 粒。術語"載體'，在本申請案中與"質粒，，同義使用。_般而 。，，質粒"將亦包含複製起點（例如ColEl或〇rip複製起點) 鲁 及選擇標記（例如胺节西林、卡那黴素、四環素、或氯黴 素選擇標記）以分別用於細菌中質粒之複製及選擇。 表現盒’’係指含有諸如啓動子及聚腺苷酸化位點等必需 調控7L件以在細胞中表現至少所含有核酸之構建體。 •’選擇標記”係容許攜帶選擇標記之細胞在對應選擇劑存 在下特異性經選擇或不選擇之核酸。一般而言，選擇標記 將賦予藥物抗性或補償宿主細胞t之代謝或分解代謝缺 陷。選擇標記可為陽性、陰性或雙功能選擇標記。有用之 • 帛性選擇標記係抗生素抗性基因。該選擇標記容許以其轉 化之宿主細胞在諸如抗生素等對應選擇劑存在下經陽性選 擇。未經轉化之宿主細胞在選擇性培養條件（即在選擇劑 存在下）下於培養物中不能生長或存活。陽性選擇標記容 許選擇攜帶標記之細胞，而陰性選擇標記容許攜帶標記之 細胞經選擇性消除。用於真核細胞之選擇標記包括(例如） 胺基糖苦磷酸轉移酶（APH)之基因，例如潮黴素（hyg)、新 黴素（neo)、及選擇標記、二氫葉酸還原酶（dhfr)、 胸普激酶（tk)、楚胺酿胺合成酶（GS)、天冬酿胺合成酶、 I30900.doc 1361221 色胺酸合成酶（選擇劑吲哚）、組胺醇脫氫酶（選擇劑組胺醇 D)、及賦予對嘌呤黴素、博來黴素、腐草黴素、氣黴素、 爭光黴素（Zeocin)及黴酚酸之抗性的核酸。其他標記基因 報導於（例如）W0 92/08796及 W0 94/28143 中。 本文所用之術語"表現"係指在細胞内發生之轉錄及/或轉 譯過程。細胞中所關注核酸序列之轉錄程度可基於細胞中 存在之對應mRNA的量來測定。例如，自所關注序列轉錄 之mRNA可藉由RT_PCR或藉由北方雜交定量（參見 Sambrook等人，1989，見上文）。藉由所關注核酸編碼之 多肽可使用識別且與該多肽結合之免疫球蛋白藉由多種方 法疋里，例如藉由ELISA、藉由分析多肽之生物活性、或 藉由使用獨立於該活性之分析法，例如西方墨點法或放射 免疫分析法（參見Sambrook等人，1989，見上文）。 術語"細胞”或"宿主細胞"係指核酸（例如編碼異源多肽之 核酸）可或已經引入/轉染至其中之細胞。術語"細胞，，包括 用於質粒繁殖之原核細胞及用於核酸表現之真核細胞二 者。較佳地’真核細胞係哺乳動物細胞。較佳地，哺乳動 物細胞係選自包含CHO細胞（例如CHO Kl、CHO DG44)、 BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6®細胞及COS細胞之哺乳動物細胞 群組。本文所用之表現"細胞"包括標的細胞及其子代。因 此’詞語”轉化體，，及"轉化細胞”包括初級標的細胞及培養 物中衍生自其之細胞而不考慮轉移次數。亦應瞭解，所有 子代之DNA含量可能由於特意的或無意的突變而不精確地 130900.doc 12 1361221 相同。包括與最初轉化細胞中所筛選者具有相同功能或生 物活性之變異子代。 少肽係天'然製造或合成製造之由藉由肽鍵連接之胺基 酸組成的聚合物。少於約2Q個胺基酸殘基之多肽可稱為 肽而由兩個或更多個多肽組成或包含一個多於1〇〇個 胺基酸殘基之多肽的分子可稱為"蛋白質”。多肽亦可包含 諸如碳水化合物基團、金屬離子或羧酸酯等非胺基酸組 份。該等非胺基酸組份可藉助其中該多肽經表現之細胞添 加，且可隨細胞類型而變化。本文中之多肽根據其胺基酸 骨架結構或編碼其之核酸定義。諸如碳水化合物基團等添 加物通常並不指定’但仍然可以存在。 本申請案中所用之術語"胺基酸"表示羧基〜胺基酸基 團，其可直接或以前體形式藉由核酸編碼。單個胺基酸係 藉由各由三個核苷酸組成之核酸（所謂密碼子或鹼基三聯 體）編碼。每一胺基酸藉由至少一個密碼子編碼。例如， 胺基酸甘胺酸可藉由四個核酸（密碼子）gga、ggc、ggg及 ggt中之每一個編碼，而胺基酸離胺酸僅可藉由兩個核酸 aaa及aag編碼《該現象稱為基因代碼之簡併，，。胺基酸群 組包含丙胺酸（三字母代碼：ala ’ 一字母代碼：a)、精胺 酸（arg，R)、天冬醯胺（asn，n)、天冬胺酸（aSp，D)、半胱胺 酸（cys，C)、麩胺醯胺（gin，Q)、麩胺酸（g丨u，E)、甘胺酸 (gly，G)、組胺酸（his，H)、異白胺酸（ile，I)、白胺酸（ieu， L)、離胺酸（lys，K)、甲硫胺酸（met, Μ)、苯丙胺酸（phe， F)、脯胺酸（pro，P)、絲胺酸（ser，S)、蘇胺酸（thr，τ)、色 130900.doc 13 1361221 胺酸（trp，W)、酪胺酸（tyr，γ)及纈胺酸（㈤，v)。 本文所用之術語"免疫球蛋白"表示由一或多個基本上藉 由免疫球蛋白基因編碼之多狀組成之蛋 諸如突變形式等變體，即具有—或多個胺基酸替義^ 及插入之形式、N·端經截短之形式、融合形式、嵌合形式 以及人類化形式、經識別之免疫球蛋白基因包括來自（例 如)靈長類動物及齧齒類動物之不同恆定區基因以及监數

免疫料白可變區基因。單株免疫球蛋自較佳。免疫球蛋 白之母-重多肽鏈及輕多肽鏈可包含恆定區（通常為竣基 端部分）。 本文所用之術浯”單株免疫球蛋白"係指自實質上同源之 免疫球蛋白群體獲得之免疫球蛋白’ ％包含該群體之單個 免疫球蛋白除了可能之天然存在之可少量存在的突變外完 王相同4株免疫；求蛋白具有高度特異性其針對單個抗 原位點。而且，與包括針對不同抗原位點（決定子或抗原 決定部位）之不同免疫球蛋白之多株免疫球蛋白製品相 反每-單株免疫球蛋白皆針對抗原上之單個抗原位點。 除單株免疫球蛋白之特異性外，單株免疫球蛋白之優勢亦 在於其可不受其它免疫球蛋白污染而合成。修飾詞"單株" 表明該免疫球蛋白之特徵係、自實質上同源之免疫球蛋白群 體獲得’且不能理解為需要藉由任-特定方法來製造該免 疫球蛋白。 非人類（例如齧齒類動物）免疫球蛋白之”人類化”形式係 含有街生自非人類免疫球蛋白及人類免疫球蛋白之部分序 130900.doc •14· 1361221 列的嵌合免疫球蛋白。在極大程度上，人類化免疫球蛋白 係衍生自人類免疫球蛋白（接受者免疫球蛋白）之具有期望 特異性及親和性的免疫球蛋白，其中來自超變區之殘基藉 由來自諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物等非人類 - 物種之超變區的殘基（供體免疫球蛋白）替換（參見（例 如）Morrison，S.L.等人，Proc. Natal Acad Sci USA 81 (1984) 6851-6855 ;美國專利第5,202 238號；美國專利第 5,204,244號）。在一些情形中，人類免疫球蛋白之框架區 籲 （FR)殘基藉由對應非人類殘基所替換。而且，人類化免疫 球蛋白可包含進一步修飾，例如未在接受者免疫球蛋白或 供體免疫球蛋白中發現之胺基酸殘基。該等修飾導致與對 應親本序列同源但不相同之該接受者或供體免疫球蛋白之 變體。實施該等修飾可進一步改進免疫球蛋白性能。通常 而言，人類化免疫球蛋白將包含基本上所有至少一個（且 一般兩個）可變結構域，其中所有或基本上所有超變環對 應於非人類供體免疫球蛋白之超變環，且所有或基本上所 φ 有FR為人類接受者免疫球蛋白之fr。人類化免疫球蛋白 視情況亦包含至少一部分免疫球蛋白恆定區（一般而言為 人類免疫球蛋白恒·定區）。用於人類化非人類免疫球蛋白 之方法業内已有闡述。較佳地，將一或多個來自非人類來 源之胺基酸殘基引入至人類化免疫球蛋白中。該等非人類 胺基酸殘基通常稱為"引入"殘基，其一般取自"引入，，可變 結構域。人類化可基本上按照Winter及同事之方法藉由用 超變區序列替代非人類免疫球蛋白之對應序列來實施。因 130900.doc 15 1361221 此，該等"人類化”免疫球蛋白係嵌合免疫球蛋白，其中實 質上少於一個完整人類可變結構域已由來自非人類物種之 對應序列所替代》實際上，人類化免疫球蛋白一般為人類 免疫球蛋白，其中一些超變區殘基且可能一些框架區殘基 由來自齧齒類動物或非人類靈長類動物免疫球蛋白之類似 位點之殘基所替代。 端視免疫球蛋白重鏈之恆定區的胺基酸序列，免疫球蛋 白可分成以下種類：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。一些該 等種類可進一步分成亞類（同種型），例如IgG1、IgG2、 IgG3及IgG4、IgAl及IgA2。根據重鏈恆定區，免疫球蛋白 重鏈之不同種類分別表示為α-、δ-、ε-、γ-及μ-鏈^ igA、 IgD及IgG類全長人類免疫球蛋白之重鏈恆定區由恆定結構 域1(本文中表示為CH1)、鉸鏈區、怪定結構域2 (cH2)及值 定結構域3 (CH3)構成。IgE及IgM類人類免疫球蛋白包含 額外第四個恆定結構域（CH4)。而且，IgM類免疫球蛋白聚 合物包含多個（例如五個或六個）藉由二硫鍵共價連接之免 疫球蛋白。該等不同人類免疫球蛋白種類之C-端恆定結構 域胺基酸序列列示於表1中。SEQ ID NO: 01至08之第_胺 基酸可存在或不存在，因為該胺基酸係藉由兩個外顯子編 碼，編碼C-端恆定結構域之外顯子及編碼前述結構域之外 顯子。 130900.doc -16- 1361221 球蛋白重鏈之一級胺基酸序列之c-端相同。術語"一級胺 基酸序列"表示對應！nRNA轉譯後之免疫球蛋白重鏈的胺基 酸序列°該一級胺基酸序列可在mRNA轉譯後在表現細胞 中藉由（例如）自一級胺基酸序列肽酶切割一或多個c_端胺 基酸進一步經修飾。因此，該一級胺基酸序列及分泌型胺 基酸序列可不相同’而是在C-端相差一些胺基酸。在一個 實化例中’§亥C-端部分包含至少1 〇〇個免疫球蛋白重鏈一 級胺基酸序列之C-端胺基酸，或較佳至少5〇個免疫球蛋白

重鏈一級胺基酸序列之C-端胺基酸，或較佳至少2〇個免疫 球蛋白重鏈一級胺基酸序列之c_端胺基酸。在一個實施例 中，本發明核酸編碼IgG類免疫球蛋白之(^3_結構域之。 端部分或IgE類免疫球蛋白之以肛結構域之c_端部分的胺 基酸序列。在又一實施例中，本發明核酸編碼IgG類免疫

球蛋白之CH3結構域之C_端部分的胺基酸序列。 不同人類免疫球蛋白之匕端恆定結構域胺基酸序列係由 對應DNA序列編碼。在基因組中，該等〇1^八序列含有編碼 (外顯子）及非編碼（内含子）序歹,j。在DNA轉錄成mRNA前體 後’該mRNA前體亦含有該等内含子及外顯子序列。在轉 譯之前，於mRNA加工期間藉由將非編碼内含子序列剪出 初級mRNA轉錄物來移除非編碼内含子序列以產生成熟 mRNA。 初級mRNA之剪接係由剪接供體位點與適當隔開 之剪接受體位點組合控制 剪接供體位點位於内含子序列 之5,端且剪接受體位點位 K円含子序列之3,端，二者在 mRNA前體剪接過程期間均被部分移除。 130900.doc 18· 1361221 術語"適當隔開"表示剪接供體位點及剪接受體位點在核 酸中以可使所有剪接過程所需之元件可利用且在合適位置 以容許剪接過程發生之方式排列。 本發明包含編碼IgA或IgG類免疫球蛋白之CH3 -結構域之 C-端部分或lgE或IgM類免疫球蛋白之CH4-結構域之c-端部 分的胺基酸序列的核酸，其中包含在該CH3-或CH4-結構域 之C-端部分的該胺基酸序列中之甘胺酸_離胺酸·二肽係由 核酸ggaaaa、或核酸ggcaaa、或核酸gggaaa編碼。 已驚奇地發現，用本發明核酸可減少不期望剪接事件之 不期望副產物形成。 本申請案中所用之術語”甘胺酸-離胺酸-二肽"表示在… 端至C-端方向上包含由一個肽鍵連接之兩個胺基酸甘胺酸 及離胺酸的肽。本申請案中所用之術語”甘胺酸_離胺酸·二 肽"表示較大多肽或蛋白質之二肽部分，其可見於該較大 多肽之開始、内部或末端。胺基酸離胺酸可由核酸aaa及 aag編碼。因此，本發明之另一實施例係包含於免疫球蛋 白重鏈之CH3-或CH4-結構域之C-端部分的胺基酸序列中之 甘胺酸-離胺酸-二肽係由核酸ggaaag、或核酸ggcaag、或 核酸gggaag編碼。在另一實施例中，編碼該甘胺酸-離胺 酸-二肽之核酸係以核苷酸a或g為首。 編碼不同人類免疫球蛋白種類及亞類之c端恆定結構域 的核酸序列列示於表2中《已知人類1§(31及1§(}2之Ch3結構 域的兩種變體形式。在一個實施例中，該核酸編碼免疫球 蛋白重鏈之C·端恆定結構域的一部分。 130900.doc •19· 1361221 表2: 編碼不同人類免疫球蛋白種類之重鏈之C-端部分的 核酸序列。

免疫球蛋白種類 編碼免疫球蛋白重鏈之胺基酸序列之C-端部分的 SEQ ID (C-端恆定結構域） 核酸序列 NO: ggcttcagcc ccaaggacgt gctggttcgc tggctgcagg ggtcacagga gctgccccgc gagaagtacc tgacttgggc atcccggcag gagcccagcc agggcaccac caccttcgct IgAl (CH3)、 gtgaccagca tactgcgcgt ggcagccgag gactggaaga 09 IgA2 (Ch3) agggggacac cttctcctgc atggtgggcc acgaggccct gccgctggcc ttcacacaga agaccatcga ccgcttggcg ggtaaaccca cccatgtcaa tgtgtctgtt gtcatggcgg aggtggacgg cacctgctac taccacccaa cgtccgtgac tgtcacctgg tacatgggga cacagagcca gccccagaga accttccctg agatacaaag acgggacagc tactacatga caagcagcca gctctccacc IgD (Ch3) cccctccagc agtggcgcca aggcgagtac aaatgcgtgg 10 tccagcacac cgccagcaag agtaagaagg agatcttccg ctggccaggt aggtcgcacc ggagatcacc cagaagggcc ccccaggacc cccagcacct tccactcagg gcctgaccac aaagacagaa gcaagggctg tttgcgacgc cggagtggcc ggggagccgg gacaagcgca ccctcgcctg cctgatccag aacttcatgc ctgaggacat ctcggtgcag tggctgcaca acgaggtgca gctcccggac IgE (Ch4) gcccggcaca gcacgacgca gccccgcaag accaagggct 11 ccggcttctt cgtcttcagc cgcctggagg tgaccagggc cgaatgggag cagaaagatg agttcatctg ccgtgcagtc catgaggcag cgagcccctc acagaccgtc cagcgagcgg tRtctgtaaa tcccggtaaa acgggcttct ctcccgcgga cgtcttcgtg cagtggatgc agagggggca gcccttgtcc ccggagaagt atgtgaccag cgccccaatg cctgagcccc aggccccagg ccggtacttc IgM (Ch4) gcccacagca tcctgaccgt gtccgaagag gaatggaaca 12 cgggggagac ctacacctgc gtggtggccc atgaggccct gcccaacagg gtcaccgaga ggaccgtgga caagtccacc ggtaaaccca ccctgtacaa cgtgtccctg gtcatgtccg acacagctgg cacctgctac gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg IgGl ((Jh3) gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg 13 變體1 acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa IgGl (Ch3) gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat 變體2 cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg 28 cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 130900.doc -20- 1361221 免疫球蛋白種類 (c-端恆定結構域）

IgG2(CH3) 變體1 編碼免疫球蛋白重鏈之胺基酸序列之C-端部分的 SEQID 核酸序列 NO: tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a_ gtgtacaccc accaggtcag cagcgacatc gagaacaact acggctcctt gagcaggtgg atgcatgagg tgcccccatc cctgacctgc gccgtggagt acaagaccac cttcctctac cagcagggga ctctgcacaa ccgggaggag ctggtcaaag gggagagcaa acctcccatg agcaagctca acgtcttctc ccactacacg atgaccaaga gcttctaccc tgggcagccg ctggactccg ccgtggacaa atgctccgtg cagaagagcc

IgG2(CH3) 變體2

IgG3 (Ch3) tctccctgtc tccgggtaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat ctccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccat gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a_ 29 15 gtgtacaccc accaggtcag cagcgacatc gagaacaact acggctcctt gagcaggtgg atgcatgagg tgcccccatc cctgacctgc gccgtggagt acaacaccac cttcctctac cagcagggga ctctgcacaa ccgggaggag ctggtcaaag gggagagcag gcctcccatg agcaagctca acatcttctc ccgcttcacg atgaccaaga gcttctaccc cgggcagccg ctggactccg ccgtggacaa atgctccgtg cagaagagcc

IgG4 (Ch3) tctccctgtc tccgggtaaa gtgtacaccc accaggtcag cagcgacatc gagaacaact acggctcctt gagcaggtgg atgcatgagg tgcccccatc cctgacctgc gccgtggagt acaagaccac cttcctctac caggagggga ctctgcacaa ccaggaggag ctggtcaaag gggagagcaa gcctcccgtg agcaggctaa atgtcttctc ccactacaca atgaccaaga gcttctaccc tgggcagccg ctggactccg ccgtggacaa atgctccgtg cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa 在一個實施例中，本發明核酸編碼選自SEQ ID NO: 1、 3、4、5、6、7或8之胺基酸序列的胺基酸序列。 在一個實施例中，該核酸編碼IgA、IgE、IgM或IgG類 免疫球蛋白重鏈之C-端恆定結構域的一部分且係選自SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、22、或 23、或 30、或 31 之 -21 · 130900.doc

T. 「.· •i ·*、.·： ;V J 1361221 核酸。在另一實施例中’該核酸編碼IgA、IgE、IgM或IgG 類免疫球蛋白重鏈之C-端恆定結構域的一部分且係選自 SEQ ID NO: 17、18、19、22、23、30 或 31 之核酸。在又 一實施例中，該核酸編碼IgA、IgE、IgM或IgG類免疫球蛋 白重鏈之C·端恆定結構域的一部分且係選自SEQ ID NO: 17、 18、19、22 或 23 之核酸。 具有SEQ ID NO: 17至23及30至31之核苷酸序列的核酸 亦為本發明之態樣。在一個實施例中，SEQ ID NO: 17、 18、 19、22、23、30或31之核苷酸序列係本發明之態樣。 在另一實施例中，SEQ ID NO: 17、18、19、22或23之核 苷酸序列係本發明之態樣。 在一個實施例中，該核酸編碼IgA、IgE、IgM或IgG類 免疫球蛋白之C-端恆定結構域，且包含選自SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、22、或 23、或 30、或 31 核酸之核 酸，該核酸編碼該免疫球蛋白重鏈之C-端結構域的一部 分。在另一實施例中，該核酸編碼IgA、IgE、IgM或IgG類 免疫球蛋白之C-端恆定結構域，且包含選自SEQ ID NO: 1 7、1 8、1 9、22、23、30或3 1核酸之核酸，該核酸編碼該 免疫球蛋白重鏈之C-端結構域的一部分》在又一實施例 中’該核酸編碼IgA ' IgE、IgM或IgG類免疫球蛋白之C-端 恆定結構域，且包含選自SEQ ID NO: 17、18、19、22或 23核酸之核酸，該核酸編碼該免疫球蛋白重鏈之c_端結構 域的一部分。 130900.doc •22· 1361221 表3: 編碼不同種類免疫球蛋白重鏈之C-端恆定結構域胺 基酸序列之一部分的本發明核酸序列。 免疫球蛋 白種類 編碼C-端胺基酸序列之核酸序列 SEQ ID NO： IgA ggcaaaccca cccatgtcaa tgtgtctgtt gtcatggcgg aggtggacgg cacctgctac 17 IgE catgaggcag cgagcccctc acagaccgtc cagcgagcgg tgtctgtaaa tcccggcaaa 18 IgM ggcaaaccca ccctgtacaa cgtgtccctg gtcatgtccg acacagctgg cacctgctac 19 IgGl 變體1 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggcaaa 20 IgGl 變體2 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tccgggcaaa 30 IgG2 變體1 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggcaaa 21 IgG2 變體2 atctccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggc aaa 31 IgG3 atgcatgagg ctctgcacaa ccgcttcacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggcaaa 22 IgG4 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggcaaa 23

本發明核酸編碼IgA、IgE、IgM或IgG類免疫球蛋白之 C-端丨亙定結構域的至少一部分。術語"C-端恒定結構域”表 示IgA或IgG類免疫球蛋白重鏈之CH3-結構域或IgE或IgM類 免疫球蛋白重鏈之CH4-結構域。說法”一部分"表示在自免 疫球蛋白重鏈C-端至N-端方向上自C-端計數具有_、級胺& 酸序列之至少20個連續胺基酸、或至少50個連續胺基酸 或至少100個連續胺基酸之IgA、IgE、IgM或Ig〇類免疫球 蛋白重鏈之C-端恆定結構域的C-端部分。 且閑 免疫球蛋白之重組製造已為熟習此項技術者所熟知 •23- 130900.doc 1361221 述於（例如）Makrides，S.C.，Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202 ; Geisse，S.等人 ’ Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ； Kaufman, R.J. > Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160，Werner, R.G. ，Arzneimittelforschung - Drug Research 48 (1998) 870-880 等綜述文章中。 對於製造包含藉由本發明核酸編碼之胺基酸序列的免疫 球蛋白，本發明進一步包含用於在哺乳動物細胞中製造免 疫球蛋白的方法，其包含以下步驟： a) 用編碼免疫球蛋白重鏈之核酸轉染哺乳動物細胞，其中 選自 SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、22、或 23、或 3 0、或3 1核酸之核酸編碼該免疫球蛋白重鏈之c_端結構 域的一部分， b) 在適於表現該免疫球蛋白之條件下對該經轉染之哺乳動 物細胞實施培養， c) 自培養物或細胞回收免疫球蛋白。 術語”在適於表現免疫球蛋白之條件下"表示用於表現免 疫球蛋白之哺乳動物細胞之培養且已為熟習此項技術者所 S知或可谷易地由熟習此項技術者所確定之條件。熟習此 項技術者亦習知該等條件可端視所培養之哺乳動物細胞類 型及所表現之免疫球蛋白類型而變化。通常而言，哺乳動 物細胞係在（例如）介於之間之溫度下培養且培 養足以谷許免疫球蛋白之有效蛋白質製造的時間段，例如 4天至28天。 在-個實施例中’該轉染哺乳動物細胞係用編碼免疫球 130900.doc -24· 1361221 蛋白重鏈之核酸實施，其中選自SEQ ID NO: 17、18、 19、22、23、30或31核酸之核酸編媽該免疫球蛋白重鏈之 C-端結構域的一部分。在又一實施例中，該轉染哺乳動物 細胞係用編碼免疫球蛋白重鏈之核酸實施，其中選自SEq ID NO: 17、18、19、22或23核酸之核酸編碼該免疫球蛋 白重鏈之C -端結構域的一部分。在一個實施例中，哺乳動 物細胞係用一種（a，即one)包含編碼免疫球蛋白重鏈之表 現盒及編碼免疫球蛋白輕鏈之表現盒的核酸轉染。在另_ 實施例中，哺乳動物細胞係用兩種核酸轉染，一種核酸包 含編碼免疫球蛋白輕鏈之表現盒且一種核酸包含編碼免疫 球蛋白重鏈之表現盒。 用本發明方法製造之免疫球蛋白較佳係異源免疫球蛋 白。術語"異源免疫球蛋白”表示非藉由該哺乳動物細胞天 然製造之免疫球蛋白。按照本發明方法製造之免疫球蛋白 係藉由重組手段製造。該等方法廣泛為熟習此項技術者所 習知且包含於原核及真核細胞中表現蛋白質以及隨後回收 及分離異源免疫球蛋白及通常將其純化至醫藥上可接受之 純度。對於免疫球蛋白之製造（即表現），藉由標準方法將 編碼輕鏈之核酸及編碼包含本發明核酸之重鏈之核酸各插 入至表現盒中。可容易地使用習用程序對編碼免疫球蛋白 之核酸實施分離及測序。雜交瘤細胞可用作該等核酸之來 源。可將表現盒插入至表現質粒中’隨後將表現質粒轉染 至宿主細胞中，否則其不製造免疫球蛋白。表現係在合適 原核或真核宿主細胞中實施且自溶胞後之細胞或自培養物 130900.doc •25· 1361221 上清液回收免疫球蛋白。 不同方法已非常確實且廣泛用於蛋白質回收及純化例 如用微生物蛋白質之親和層析法（例如蛋白質A或蛋白質〇 親和層析法）、離子交換層析法（例如陽離子交換（羧基甲基 樹脂）、陰離子交換（胺基乙基樹脂）及混合形式交換）、嗜 硫菌吸附（例如用β·巯基乙醇及其他SH配體）、疏水性相互 作用或芳香族吸附層析法（例如用苯基_瓊脂糖、氮雜_親芳 fe(arenophihc)樹脂、或間-胺基苯基硼酸）、金屬螯合親和 層析法（例如用Ni(II)-及Cu(II)-親和性物質）、尺寸排除層 析法及電泳方法（例如凝膠電泳、毛細管電 /永）（Vijayalakshmi ’ Μ·Α· Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)° 本發明進一步包含編碼包含本發明核酸之免疫球蛋白重 鏈的核酸。而且’本發明包含質粒及細胞，該質粒包含本 發明核酸，該細胞包含該質粒。 本發明之另一態樣係用於改良免疫球蛋白在哺乳動物細 胞中之表現的方法’其中編碼免疫球蛋白重鏈之核酸包含 編碼CH3-或CH4-結構域中含有之甘胺酸_離胺酸_二肽的核 酸ggaaaa、或核酸ggcaaa、或核酸gggaaa、或核酸 ggaaag、或核酸ggcaag、或核酸gggaag。該核酸可減少或 抑制不期望之剪接事件。 在本發明之一個實施例中，該免疫球蛋白重鏈係IgG4亞 類人類抗體之免疫球蛋白重鏈或IgG1、IgG2或lgG3亞類人 類抗體之免疫球蛋白重鏈。在一個實施例中，該免疫球蛋 -26· 130900.doc

1361221 白重鏈係人類免疫球蛋白重鏈且較佳來自人類1gG4亞類或 係來自人類IgGl亞類之突變免疫球蛋白重鏈。在另一實施 例中，該免疫球蛋白重鏈係來自具有突變[234八及[235八 之人類IgG 1亞類。在又一實施例中，該免疫球蛋白重鏈係 具有突變S228P之人類IgG4免疫球蛋白重鏈。在一個實施 例中，該免疫球蛋白重鏈係在L234、L235及/或0265具有 突變及/或含有PVA236突變之IgG4亞類或IgGl或IgG2亞類 之免疫球蛋白重鏈。在其他實施例中’突變係S228P、 L234A、L235A、L235E及 / 或 PVA236(PVA236 意指 IgGl 之 自胺基酸位置233至236的胺基酸序列ELLG(以一字母胺基 酸代碼給出）或IgG4之EFLG藉由PVA替換）。較佳者係突變 IgG4 之 S228P 及 IgGl 之 L234A及 L235A(按照 Kabat 之 EU 索 引編號）。 本文所用之"調控元件·•係指編碼所關注多肽之核酸序列 轉錄及/或轉譯所必需之以順式形式存在之核苷酸序列。 轉錄調控元件通常包含擬表現核酸序列之啓動子上游、轉 錄起始及終止位點及聚腺苷酸化信號序列。術語"轉錄起 始位點”係指核酸中對應於納入初級轉錄物（即mRNA前體） 中之第一核酸的核酸鹼基；轉錄起始位點可能與啓動子序 列重疊。術語"轉錄終止位點"係指通常在擬轉錄所關注基 因之3'末端呈現之造成RNA聚合酶終止轉錄的核苷酸序 列。聚腺苷酸化信號序列或聚腺苷酸添加信號提供用於在 真核mRNA之3'末端的具體位點上切割及在核中向經切割3' 末端轉錄後添加約1 00-200個腺嘌呤核苷酸（聚腺苷酸尾）之 130900.doc •27- 1361221 序列的信號。聚腺苷酸化信號序列可包括位於自切割位點 約10-3 0個核苷酸上游之共有序列AATAAA。 為製造分泌型多肽，所關注核酸包括編碼信號序列/前 導肽之DNA片段。信號序列引導新近合成之多肽到達及通 過ER膜，其中可確定該多肽之分泌途徑。信號序列在蛋白 質越過ER膜期間藉由信號肽酶切除。就信號序列之功能而 吕，伟主細胞分泌機制之識別甚為重要。因此，所用信號 序列應藉由宿主細胞之分泌機制蛋白質及酶識別。 轉譯調控元件包括轉譯起始（AUG)及終止密碼子（taa、 TAG或TGA)。内核糖體進入位點（IRES)可包括於一些構建 體中。 "啓動子"係指控制基因/結構基因或與其可操作地連接之 核酸序列轉錄的聚核苦酸序列。啓動子包括用於rna聚合 酶結合及轉錄起始之信號。所用啓動子將在預期在其中表 現所選擇序列之宿主細胞細胞類型中起作用。包括來自多 種不同來源之組成型、誘㈣及㈣㈣動子之許多戍動 子已為熟習此項技術者所熟知(且在諸如GenBank等資料庫 中予以鑑別）且可以選殖聚核錢或在選殖聚料酸内得 到(自(例如)諸如ATCC等存儲機構以及其他商業或個人來 源）。啓動子”包含引導結構基因轉錄之核苦酸序列。—般 ρ α動子位於基gj之5，非編碼或非轉譯區_，與結構 基因之轉錄起始位點鄰近。在轉_始中起作用之啓料 内的序列7G件之特徵通常在於共有核㈣序列1等啓動 子凡件包括RNA聚合酶結合位點、TATA序列、cm 130900.doc •28- 1361221 歹1J、分化特異性元件（DSE ; McGehee，R.E.等人，Mol. Endocrinol, η (1993) 55 1·560)、環 AMP反應元件（CRE)、 血清反應元件（SRE; Treisman，R.，Seminars in Cancer Biol. 1 (1990) 47-5 8)、糖皮質激素反應元件（GRE)及用於其他轉 錄因子之結合位點，例如CRE/ATF(Treisman，R.，Seminars in Cancer Biol. 1 (1990) 47-58 ; O'Reilly，Μ.A.等人，J_ Biol. Chem· 267 (1992) 19938)、AP2(Ye，J.等人-J.Biol. Chem. 269 (1994) 25728)、SP1、cAMP反應元件結合蛋白 (CREB; Loeken，M.R.，Gene Expr. 3 (1993) 253)及八聚體 因子（參見，通常而言，Watson等人編輯，Molecular

Biology 〇f the Gene ’ 第 4 版（The Benjamin/Cummings Publishing Company 公司，1987)及 Lemaigre，F.P·及 Rousseau, G.G.，Biochem. J. 303 (1994) 1-14)。若啓動子 為誘導型啓動子，則轉錄速率響應誘導劑而增加。相反， 若啓動子為組成型啓動子，則轉錄速率不受誘導劑調控。 亦已知抑制型啓動子。例如，c-fos啓動子在生長激素結合 至細胞表面上之其受體時特異性地被激活。四環素（tet)調 控表現可藉助由（例如）CMV啓動子繼之兩個Tet-操縱基因 位點組成之人工雜合啓動子達成。Tet-抑制子與兩個Tet_ 操縱基因位點結合並阻斷轉錄。在添加誘導物四環素後， 丁et-抑制子自Tet-操縱基因位點釋放並進行轉錄（(}〇ssen， Μ.及 Bujard，H. PNAS 89 (1992) 5547-5551)。對於包括金 屬硫蛋白及熱激啓動子之其他誘導型啓動子參見，例 如，Sambrook等人（見上文）及〇〇_，Μ，^ 130900.doc •29- 1361221

Biotech. 5 (1994) 516-520。已由於高程度表現鑑別為強啓 動子之真核啓動子包括SV40早期啓動子、腺病毒主要晚期 啓動子、小鼠金屬硫蛋白_1啓動子、R〇us$瘤病毒長末端 重複序列' t國倉鼠延長因子丨a(c卿，參見例如美國 專利第5,888,8G9號）、人類㈣a、泛素及人類巨細胞病 毒立即早期啓動子（CMV IE)。

a動子可為組成型或誘導型啓動子。可能需要增強子 (即作用於啓動子以增加轉錄之順式作用元件）結合 啓動子起作用以提高單獨用啓動子所獲得之表現程度，且 可作為轉錄調控元件包括。通常，含有啓動子之聚核發酸 片段亦包括增強子序列（例如，CMV! sv4〇)。 本文所用之，，增強子”係指可增強基因或與其可操作地連 接之編碼序㈣錄的聚料酸序？|卜與啓動子不同，增強 子之取向及位置相對獨立且可見於轉錄單元之5.或3, (Lusky M·，等人，Mol Cel 1 15 · * ,

CeU Bl〇·，3 (1983) 1 1〇8·1122)、内 含t内（Β — υ·等人，⑽，33⑽3)729··)以及編 碼序列本身内(〇sborne，T.F等人，制⑽則。，* (1984) 1293-1305)。因此，辦 L 增強子可置於轉錄起始位點之 =或下游或距啓動子相當大距離處，儘管實際上增強子 上與啓動子重疊…多種不同來源之 ;=φ習此項技術者所熟知(且在諸如一 …別)且可以選殖聚核*酸序列或在選殖 聚核苷酸序列内得到（自“丨 其他商業或個人來源)」:二):如ATCC等存健機構以及 卉夕包含啓動子序列（例如常用之 I30900.doc -30· 1361221 CMV啓動子）之聚核苷酸亦包含增強子序列。例如，所有 上文所列示之強啓動子亦可含有強增強子（參見（例 如）Bendig，Μ.Μ·，Genetic Engineering, 7 (Academic Press ’ 1988) 91-127)。 ··内核糖體進入位點"或"IRES”闡述功能上啓動獨立於 IRES之基因5’之轉譯起始且容許兩個順反子（開放閱讀框） 在動物細胞中自單個轉錄物轉譯之序列。IRES提供用於其 開放閱讀框立即下游（在本文中下游與3,可互換使用）轉譯 之獨立核糖體進入位點。與可為多順反子（即，編碼數個 自mRN A依序轉譯之不同多肽）的細菌mRNA不同，動物細 胞之大多數mRNA係單順反子且編碼僅一個蛋白質之合 成。就真核細胞中之單順反子轉錄物而言，轉譯將始於5, 端轉譯起始位點’終止於第一終止密碼子，且該轉錄物將 自核糖體釋放’導致mRNA中僅第一經編碼多肽轉譯。在 真核細胞中’在轉錄物中具有與第二或隨後開放閱讀框可 操作地連接之IRES的多順反子轉錄物容許該下游開放閱讀 框依序轉譯以產生兩個或更多個藉由相同轉錄物編碼之多 肽。先前已闡述在載體構建中使用IRES元件，參見，例 如，Pelletier, J·等人，Nature 334 (1988) 320-325 ; Jang S.K.等人 ’ J. Virol. 63 (1989) 1651- 1660 ; Davies，M.V.等 人，J. Virol. 66 (1992) 1924-1932 ; Adam, M.A.等人，j.

Virol. 65 (1991) 4985- 4990 ; Morgan，R.A.等人，Nucl.

Acids Res. 20 (1992) 1293-1299 ; Sugimoto，Y 等人，

Biotechnology 12 (1994) 694-698 ; Ramesh，N.等人，Nucl. 130900.doc •31· 1361221

Acids Res. 24 (1996) 2697-2700;及 M〇sser，D.D.等人， BioTechniques 22 (1997) 150-161。 可操作地連接"係指兩個或更多個組件之並置其中所 述之該等組件係呈允許該等以期望方式起作用之關係。例 如，若啓動子及/或增強子以順式方式作用以控制或調節 所連接序列之轉錄，則該啓動子及/或增強子可操作地連 接於、扁碼序列。通常而言（但並非必需），"可操作地連接" 之DNA序列係鄰接序列，在需要連接兩個蛋白質編碼區域 (例如分泌前導序列及多肽）時，則為鄰接序列且在（閱讀） 框中H儘管可操作料接之啓動子0位於編碼序 上游仁不必與其鄰接。增強子無需鄰接。若增強子 、曰力、扁碼序列之轉錄，則增強子可操作地連接於編碼序 歹!可操作地連接之增強子可位於編碼序列之上游、内部 〆游及距啓動子相當大距離。若聚腺普酸化位點位於編 碼序列之Τ游端《輯錄經過編碼序列進行至聚腺苦酸化 J則該聚腺苷酸化位點可操作地連接於編碼序列。若 轉譯終止密碼子位於編碼序列之下游端（3•端）以致轉譯經 過=碼序列進行至終止密碼子並在該處終止則該轉譯終 Ή可操作地連接於外顯子核酸序列。連接係藉由此 、诗s知之重組方法完成，例如，使帛方法及/或藉 2適且限制位點接合。若適宜限制位點不存在，則根據 &用操作使用合成之募料酸銜接子（adapt㈣或連接子。 中、源DNA或"異源多肽"係指天然不存在於給定宿主細 之DNA分子或多肽、*DNa分子群體或多肽群體。只 130900.doc -32· 1361221 要宿主DNA與非宿主DNA(即外源DNA)組合，對於特定宿 主細胞異源之DNA分子即可含有來源自宿主細胞物種之 DNA(即内源DNA)。例如，含有編碼多肽之非宿主片 段可操作地連接於包含啓動子之宿主職片段的腿分子 視為異源DNA分子。反之，異源舰分子可包含與外源啓 動子可操作地連接之内源結構基因。 由非宿主D N A分子所編碼之肽或多肽係"異源" 肽。

八”表現質粒”係、編碼擬在宿主細胞中表現之蛋白質的核酸 刀子。-般而·Τ ’表現質粒包含原核質粒繁殖單元(例如 對於大腸桿菌，包含複製起點及選擇標記）、真核選擇標 記或多個用於表現所關注結構基因之表現盒，該等： 之每-者皆包含啓動子、結構基因及包括聚腺苷酸化信號 之轉錄終止子基因表現通f置於啓動子之控制下，且稱 該結構基因與啓動子"可操作地連接|，。類似地，若調控元 件調節核d動子之活性，則調控元件與核心啓動子可操 作地連接。 ’’經分離多肽”係基本上不含雜質細胞組份之多肽，該等 雜質細胞組份係例如碳水化合物、脂質或與天然多肽‘關 之其他蛋白質雜質…般而t，經分離多肽製品含有高度 純化形式之多肽，即至少約80%純淨、至少約90%純淨、 至少約95%純淨、高於95%純淨或高於99%純淨。一種顯 示特定蛋白質製品含有經分離多肽之方法係藉由在蛋白質 製品之十二烷硫酸鈉(s叫聚丙烯酿胺凝膠電泳及凝膠之 130900.doc -33- 1361221 考馬斯冗藍（Coomassie Brilliant blue)染色後出現單鍵。然 而，術語"經分離的"不排除存在呈替代物理形式之相同多 肽，例如二聚體或（另一選擇為）糖基化或衍生化形式。 本申請案中表示之"轉錄終止子，，係長度上具有5〇 75〇個 鹼基對之DNA序列，其給與RNA聚合酶mRNA合成終止之 信號。在表現盒之3,末端的非常高效（強）之終止子可用以 防止RNA聚合酶連讀，尤其當使用強啓動子時。無效轉錄

終止子可導致形成操縱子樣mRNA，此可能緣於不期望（例 如經質粒編碼）之基因表現。 以下實例、序列表及圖係提供用於幫助理解本發明，本 發明之真實範圍於隨附專利申請範圍中闡明。應瞭解，可 對所述程序實施修改，此並不偏離本發明之精神。 序列說明 SEQ ID NO: 01 SEQ ID NO: 02 SEQ ID NO: 03 SEQ ID NO: 04 SEQ ID NO: 05 SEQ ID NO: 06 人類IgA類免疫球蛋白之重鏈恆定結 構域（Ch3)胺基酸序列的C-端部分 人類IgD類免疫球蛋白之重鏈恆定姓 構域（CH3)胺基酸序列的C-端部分 人類IgE類免疫球蛋白之重鏈恆定結 構域（CH4)胺基酸序列的C-端部分 人類IgM類免疫球蛋白之重鏈恆定結 構域（CH4)胺基酸序列的C-端部分 人類IgG 1類免疫球蛋白之重鍵值定6士 構域（CH3)胺基酸序列的c-端部分 人類IgG2類免疫球蛋白之重鏈恆定結 130900.doc -34- 1361221 SEQ ID NO: 07 構域（CH3)胺基酸序列的C-端部分 人類IgG3類免疫球蛋白之重鍵，艮a 構域（CH3)胺基酸序列的C-端部分 SEQ ID NO: 08 人類IgG4類免疫球蛋白之重鏈,卜 構域（CH3)胺基酸序列的C-端部> SEQ ID NO: 09 編碼人類IgA類免疫球蛋白之番 定結構域（CH3)胺基酸序列之八 的核酸序列 SEQ ID NO: 10 編碼人類IgD類免疫球蛋白之番 定結構域（CH3)胺基酸序列之C-端 的核酸序列 SEQ ID NO: 1 1 編碼人類IgE類免疫球蛋白之重鍵十互 定結構域（CH4)胺基酸序列之C·端部分 的核酸序列 SEQ ID NO: 12 編碼人類IgM類免疫球蛋白之重鏈十互 定結構域（Ch4)胺基酸序列之C-端部分 的核酸序列 SEQ ID NO: 13、28編碼人類1§〇1類免疫球蛋白（變體1及 SEQ ID NO: 14 2)之重鏈恆定結構域（CH3)胺基酸序列 之C-端部分的核酸序列 、29編碼人類IgG2類免疫球蛋白（變體1及 2)之重鏈恆定結構域（CH3)胺基酸序列 之C-端部分的核酸序列 SEQ ID NO: 15 編碼人類IgG3類免疫球蛋白之重鏈恨 130900.doc 35- 1361221 SEQ ID NO: 16

SEQ ID NO: 17

SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 19 定結構域（Ch3)胺基酸序列之C-端部分 的核酸序列 編碼人類IgG4類免疫球蛋白之重鏈，良 定結構域（CH3)胺基酸序列之C-端部& 的核酸序列 編碼IgA類免疫球蛋白之一部分C -端 怪定結構域（Ch3)胺基酸序列的本發明 核酸序列 編碼IgE類免疫球蛋白之一部分端 恆定結構域（Ch4)胺基酸序列的本發明 核酸序列 編碼IgM類免疫球蛋白之一部分端 恆定結構域（CH4)胺基酸序列的本發明 核酸序列 SEQ ID NO: 20、30編碼IgG 1類免疫球蛋白（變體1及2)之

一部分C-端恆定結構域（CH3)胺基酸序 列的本發明核酸序列 SEQ ID NO: 21、31編碼IgG2類免疫球蛋白（變體1及2)之 一部分C-端恆定結構域（cH3)胺基酸序 列的本發明核酸序列 SEQ ID NO: 22 編碼1gG3類免疫球蛋白之一部分端 怪定結構域（CH3)胺基酸序列的本發明 核酸序列 SEQ ID NO: 23 編碼1gG4類免疫球蛋白之一部分〇端 130900.doc -36· 1361221 恆定結構域（CH3)胺基酸序列的本發明 核酸序列 SEQ ID NO: 24至27實例中所用之核酸引物。 材料及方法 重組DNA技術 如Sambrook等人，1989(見上文）中所述使用標準方法來 處理DNA。所有分子生物學試劑皆為市售（若無另外說明） 且按照製造商說明書使用。 核酸序列測定 DNA序列係藉由在 MediGenomix GmbH(Martinsried，德 國）上實施之雙鏈測序測定。 DNA及蛋白質序列分析及序列資料管理 使用 GCG(Genetics Computer Group ， Madison ， Wisconsin，USA)之軟體包（版本 10.2)及 Infomax 之 Vector NTI Advance suite(版本8.0)來創建序列、映射、分析、注 釋及說明。 細胞培養技術 使CHO-DXB11 細胞在含有 10% FCS(自 Hyclone，Thermo Fisher Scientific公司獲得之胎牛血清，目錄號： SH3007.03)的 MEM α培養基（Invitrogen公司，Gibco®，目 錄號：22571)中生長。

HEK-293-EBNA 細胞（ATCC # CRL-10852)係在補充有2 mM麩胺醯胺（Gibco®，目錄號：25030)、1% (v/v) MEM非 必需胺基酸（Gibco®，目錄號：11140)、10% (v/v)超低IgG 130900.doc •37- FCS(Gibco®，目錄號：16250)及 250 pg/ml G418(Roche Applied Sciences，Roche Diagnostics GmbH，德國，目錄 號：1464981)之DMEM中培養。 用於培養CHO-DG44細胞之培養基係補充有10% (v/v)經 透析FCS(Gibco®，目錄號：26400)及2% (v/v) HT補充物 (Gibco®，目錄號：41065)之ΜΕΜα培養基（Gibco®，目錄 號：22561)。為選擇經穩定轉染之CHO DG44細胞系，省 去HT補充物並添加20至500 nM胺曱蝶呤（MTX) ’單獨或與 400 pg/ml 潮黴素 B(Roche Diagnostics GmbH，Roche Applied Sciences，德國，目錄號：10843555001)—起。 所有細胞系皆保持在37°C下具有5% C02之增濕培育箱 中。細胞轉染係藉由核轉染（Amaxa GmbH，德國）或藉由 使用 FuGENE 6(Roche Diagnostics GmbH，Roche Applied Sciences，德國，目錄號：1815075)之脂轉染實施。 而且，採用如（例如）Bonifacino，J_ S.等人（編輯）（2000) Current Protocols in cell Biology, John Wiley and Sons公司 中所述之標準細胞培養技術。 蛋白質A-沈殿、SDS-PAGE及西方墨點法 用蛋白質A-瓊脂糖珠粒使來自細胞培養物上清液之免疫 球蛋白沈澱並隨後藉由SDS/聚丙烯醯胺凝膠電泳（十二烷 硫酸鈉，SDS-PAGE)及西方墨點法實施分析。 為使免疫球蛋白沈澱，將含有高達7 pg免疫球蛋白之細 胞培養物上清液用TBS緩衝液（50 mM TRIS/HC1、pH 7.5 ’ 補充有 150 mM NaCl)、1% (v/v)諾乃洗滌劑（Nonidet)- 130900.doc ·38· 1361221 P40(Roche Diagnostics GmbH . Roche Applied Sciences » 目錄號.1754599)稀釋至最終體積為〗mi，且隨後與Μ y 濕體積蛋白質A-瓊脂糖珠粒培育1小時。將該等珠粒藉由 離心分離回收並用含有1% (v/v)諾乃洗滌劑p_4〇之TBS、 然後用經2倍濃之PBS(填酸鹽緩衝鹽水）及最後用1〇〇 mM檸檬酸鈉緩衝液（pH 5)洗滌。在最後洗滌步驟後，將上 清液完全自該等珠粒移除。將結合免疫球蛋白用2〇 μ1含有 50 mM DTT(二硫蘇糖醇）之經2倍濃縮之Lds(十二烷硫酸 鋰）樣品緩衝液（Invitrogen公司）溶析。在於95°C下培育5分 鐘後，對懸浮液實施離心分離並回收上清液以用於進一步 分析。 SDS-PAGE : SDS-PAGE係按照製造商建議使用 NuPAGE®凝膠系統（Invitrogen公司）實施。將樣品裝載至 10% NuPAGE® Novex Bis/TRIS凝膠（Invitrogen公司，目錄 號：NP0301)上並在還原NuPAGE® MES SDS(4-嗎啉乙績 酸/十二烧硫酸鈉）運行緩衝液中分離蛋白質。一般而言， 對於用 Simply Blue Safe. Stain®(Invitrogen公司）之考馬斯 染色裝載2至3 pg免疫球蛋白/泳道且對於西方墨點法裝載 0.4至 0.6 pg 〇 西方墨點法：對於蛋白質自SDS/聚丙烯醯胺凝膠之電轉 移，使用標準PVDF(聚二氟亞乙烯）或硝酸纖維素膜。在電 轉移之後於丁BS(三羥甲基胺基甲烷緩衝鹽水，50 mM TRIS/HC1 ’ pH 7.5，150 mM NaCl)中洗滌膜。藉由在含有 1 % (w/v)西方阻斷試劑（R0che Diagnostics GmbH，R0che I30900.doc -39- 1361221

Applied Sciences，目錄號：1 1921673001)之 TBS 中實施培 育阻斷非特異性結合位點。人類免疫球蛋白γ重鏈及κ輕鏈 係用稀釋於含有0·5% (w/v)西方阻斷試劑之TBS中之偶聯 過氧化物酶的多株檢測抗體（進一步細節參見以下段落）來 檢測。在用含有0.05% (v/v) Tween® 20之TBS實施三次洗 滌步驟及用TBS實施一次洗滌步驟後，藉由化學發光使用

LumiLightPlus受質溶液（Roche Diagnostics GmbH，Roche Applied Sciences，目錄號：12015196001)及 LUMI-Imager FI 分析儀（Roche Diagnostics GmbH，Roche

Applied Sciences)檢測結合之偶聯過氧化物酶的檢測抗 體。 人類免疫球蛋白γ重鏈（H)及K輕鏈（L)係同時或分開檢 測。對於同時檢測，使用經1:2500 (ν/ν)稀釋之偶聯過氧化 物酶的山羊抗-人類IgG (H+L)-抗體（jackson ImmunoResearch Laboratories 公司，目錄號：109-035-088)。對於連續檢測，首先用以ι:ι〇〇〇 (v/v)稀釋之偶聯過 氧化物之兔抗-人類Ig γ-抗體（DAKO GmbH，德國，代 號P0214)或用以1:7500 (v/v)稀釋之偶聯過氧化物酶之 F(ab’）2 山羊抗-人類 Fc γ-抗體（Jackson ImmunoResearxh

Laboratories ’目錄號：109-036-008)對膜實施探測。在檢 測免疫球蛋白γ重鏈後，將該等膜在補充有2% (w/v) SDS 及1〇〇1111^0-巯基乙醇之62.5 1111^丁1118出〇：1(卩116.7)中於 5 0°C下刮除30分鐘。對於第二次檢測，用以ι:1000 (v/v)稀 釋之偶聯過氡化物酶之兔抗-人類IgK-抗體（DAKO GmbH， 130900.doc -40- 1361221 代號P0129)實施再探測。 實例1 製備IgGl類免疫球蛋白之表現質粒 質粒4831(在下文中表示為p4831)係用於在真核細胞中 表現抗-IGF-1R-抗體（具有保留外顯子-内含子組織之經基 因組學組織之表現盒）之表現質粒（序列參見（例如）美國專 利第2005/0008642號或歐洲專利第1 646 720)。其包含以 下功能元件： -衍生自載體pUC18之複製起點（PUC起點）， -在大腸桿菌中賦予胺苄西林抗性之β(β)_内醯胺酶基因 (Amp)， -用於表現γ1·重鏈之表現盒，其包含以下元件： -來自人類巨細胞病毒之主要立即早期啓動子及增強子 (hCMV ΙΕ1啓動子）， -包括Kozak序列之合成性5，UTR， •包括信號序列内含子仏1_内含子一L2)之鼠科動物免疫 球蛋白重鏈信號序列， _佈置在3·末端剪接供體位點之重鏈可變區（vh) cDNA， -小鼠免疫球蛋白μ-增強子區， •人類免疫球蛋白重鏈γΐ-基因（IGHG1),其包括外顯子 cm、鉸鏈、0^2及0：出、間插内含子及具有聚腺苦 酸化信號序列及視情況含有突變之3,UTR， -用於表現κ·輕鏈之表現盒，其包含以下元件： 130900.doc 41 1361221 -來自人類巨細胞病毒之主要立即早期啓動子及增強子 (hCMV IE1 啓動子）， -包括Kozak序列之合成性5'UTR， -包括信號序列内含子（Ll_内含子_L2)之鼠科動物免疫 球蛋白重鏈信號序列， ' -佈置在3'末端剪接供體位點之輕鏈可變區（VL) cDNA > -内含子小鼠Ig-κ增強子區，

• -包括IGKC外顯子及具有聚腺苷酸化信號序列之IGK 3'UTR的人類免疫球蛋白κ基因（IGK)。 -適於在真核細胞中選擇之潮黴素B磷酸轉移酶轉錄單元， 其包括 • SV40早期啓動子及起點， -潮黴素B磷酸轉移酶編碼序列（HygB)， -SV40早期聚腺苷酸化信號 -用於在真核細胞中表現適於營養缺陷選擇之鼠科動物二 ^ 氫葉酸還原酶（DHFR)之表現盒，其包括 -縮短形式之SV40早期啓動子及起點， •-鼠科動物DHFR之編碼序列， -SV40早期聚腺苷酸化信號。 p4 83 1之有注釋的質粒圖譜顯示於圖1中。

將P4831轉染至CHO-DG44細胞中並在用潮黴素B及胺曱 蝶呤（MTX)選擇後分離穩定細胞系。用蛋白質A-瓊脂糖珠 粒使藉由所選擇純系#23分泌之抗體沈澱並藉由SDS-PAGE 130900.doc • 42- 1361221 及考馬斯染色（圖2a))實施分析。除預期之5〇让〇&免疫球蛋 白γ-l重鏈及25 kDa免疫球蛋白κ輕鏈外，亦檢測到相當大 3：之80 kDa副產物蛋白質。藉由抗_人類免疫球蛋白γ鏈抗 體（圖2b))以及藉由抗-人類免疫球蛋白< 鏈抗體（圖2c))識別 該蛋白質。 實例2 製備具有經修飾CH3-結構域之igGl類免疫球蛋白的表現 質粒 為防止由異常剪接之γΐ mRNA前體所造成之副產物產 生’藉由使4573位置上之T突變成C破壞p4831之CH3外顯 子的内剪接位點。同時T4567由C替換以移除BsmA I限制 位點。 如下構建P4855 » p4817(具有相同γι重鏈轉錄單元之 ρ483 1的原種質粒）係由以下元件構成： -來自載體pUC18之容許該質粒在大腸桿菌中複製之複製 起點（pUC Ori) -在大腸桿菌中賦予胺苄西林抗性之β_内醯胺酶基因（Amp) -用於表現γΐ -重鏈之表現盒，其包含以下元件： -來自人類巨細胞病毒之主要立即早期啓動子及增強子 (hCMV ΙΕ1啓動子）， -包括Kozak序列之合成性5，UTR， -包括信號序列内含子（Ll_内含子_L2)之鼠科動物免疫 球蛋白重鏈信號序列， -佈置在3'末端剪接供體位點之重鏈可變區（vH) 130900.doc -43· 1361221 cDNA， -小鼠免疫球蛋白μ-增強子區， -人類免疫球蛋白重鏈γΐ-基因（IGHG1)，其包括外顯子 CH1、鉸鏈、CH2及CH3、間插内含子及具有聚腺苷 酸化信號序列及視情況含有突變之3'UTR， p48 17之質粒圖譜顯示於圖3中。 藉由以下對P4817實施處理：使用QuickChange定向誘變 套組（Stratagene，目錄號：200518)及序列特異性寡核苷酸1 agcctctccc tgtccccggg caaatgagtg cgacggccgSEQ ID NO: 24 及2 cggccgtcgc actcatttgc ccggggacag ggagaggct SEQ ID NO: 25 定向誘變將突變p4817之839 bp Sfil/SgrAI片段切除並使 其與p4831之13133 bp SgrAI/Sfil片段連接以形成p4855。 實例3 實例1及2核酸之表現、所製造免疫球蛋白之分離及所製造 免疫球蛋白之分析 將質粒p483 1及p4855瞬時轉染至CHO-DXB11細胞中。 在非選擇條件下培養細胞。培養三天後，收穫細胞培養物 上清液並用蛋白質A-瓊脂糖珠粒純化分泌之免疫球蛋白。 用抗-人類IgG-抗體（H+L)之免疫球蛋白的西方墨點分析顯 示80 kDa副產物已藉由經p483 1轉染之細胞而非藉由經 p4855轉染之細胞表現（圖4)。 實例4 製備IgG4類免疫球蛋白之表現質粒 130900.doc -44- 質粒503 1座設計用於人類抗·p•選擇素抗體在真核組織 。養、-田胞中之瞬時及穩定表現。對於例示性抗_ρ·選擇素_ 抗體參見（例如）歐洲專利第i 737 89丨或美國專利第 200動6876號βρ5031係由以下元件構成： 來自載體PUC18之容許該f粒在大腸桿g中複製之複製 起點（pUC起點）， 在大腸柃菌中賦予胺苄西林抗性之β_内醯胺酶基因 (Amp)， •用於表現人類γ 4-重鏈之表現盒，其包含以下元件： -來自人類巨細胞病毒之主要立即早期啓動子及增強子 (hCMV ΙΕ1 啓動子）， -包括Kozak序列之合成性vutr， -包括信號序列内含子（L1 —内含子_L2)之鼠科動物免疫 球蛋白重鏈信號序列， -佈置在3’末端剪接供體位點之重鍵可變區（VH) cDNA， •小鼠Ig μ-增強子區， •人類免疫球蛋白重鏈γ4-基因（IGhG4)，其包括外顯子 CH1、鉸鏈、CH2及CH3、間插内含子及具有聚腺苷 酸化信號序列及視情況含有突變之3 'UTR， -用於表現人類κ_輕鏈之表現盒，其包含以下元件： -來自人類巨細胞病毒之主要立即早期啓動子及增強子 (hCMV ΙΕ1 啓動子）， -包括Kozak序列之合成性5'UTR， 130900.doc -45- 1361221 •包括信號序列内含子（Ll_内含子_L2)之鼠科動物免疫 球蛋白重鏈信號序列， 佈置在3'末端剪接供體位點之輕鏈可變區（vl) cDNA , -内含子小鼠Ig-κ增強子區，

-包括IGKC外顯子及具有聚腺苷酸化信號序列之IGK 3'UTR的人類免疫球蛋白κ基因（IGK：)， -適於在真核細胞中選擇之潮黴素B磷酸轉移酶轉錄單元， 其包括 -SV40早期啓動子及起點， -潮黴素B磷酸轉移酶編碼序列（HygB)， -SV40早期聚腺苷酸化信號， •用於在真核細胞中表現適於營養缺陷選擇之鼠科動物二 氫葉酸還原酶（DHFR)之表現盒，其包括 -縮短形式之SV40早期啓動子及起點， -鼠科動物DHFR之編碼序列， -SV40早期聚腺苷酸化信號。 p503 1之質粒圖譜顯示於圖5中。 當用質粒P5031轉染HEK-293-EBNA細胞時，該等細胞 製造包含80 kDa副產物之免疫球蛋白（圖6，泳道1及2)。該 蛋白質在西方墨點分析中藉助抗-人類Ig γ_抗體以及藉助 抗-人類IgK-抗體結合。 實例5 製備具有經修飾CH3-結構域之IgG4類免疫球蛋白的表現 130900.doc •46· 1361221 質粒 按照實例3引入修飾。簡言之，使T4565突變成C，同時 第二核苷酸T4559亦交換成C以移除BsmAI限制位點。寡核 苷酸3 gcctctccct gtccctgggc aaatgagtgc cagg SEQ ID NO: 26 及寡核苷酸4 cctggcactc atttgcccag ggacagggag aggc SEQ ID NO: 27 用於定向誘變。所獲得之質粒命名為p5032。 實例6 實例5核酸之表現、所製造免疫球蛋白之分離及所製造免 疫球蛋白之分析 將質粒p5031及p5032瞬時轉染至HEK-293-EBNA細胞 中。在非選擇條件下培養細胞。培養三天後，收穫細胞培 養物上清液並用蛋白質A-瓊脂糖珠粒純化分泌之免疫球蛋 白。用抗-人類IgG-抗體（H+L)之免疫球蛋白的西方墨點分 析顯示經p503 1轉染之細胞表現80 kDa副產物（圖6，泳道 1 + 2)，而經p5032轉染之細胞未表現副產物（圖6，泳道 3 + 4) ° 將質粒p5032轉染至HEK-293-EBNA細胞中，未表現80 kDa蛋白質（圖6，泳道3及4)。此清楚地表明，80 kDa融合 蛋白係異常mRNA前體剪接之結果且瞬時表現期間該不期 望蛋白質之製造可藉由免疫球蛋白重鏈γ4基因（IGHG4)之 内CH3剪接位點突變有效抑制。 IGHG4之内CH3剪接位點突變亦在穩定細胞系中防止80 130900.doc • 47- 1361221 kDa表現。用p5032將CHO-DG44細胞轉染並經選擇用於質 粒與胺甲蝶呤（MTX)之穩定整合。將來自6種純系之抗體 純化並藉由SDS-PAGE及考馬斯染色（圖7)進行分析。該等 . 抗體中沒有一種抗體含有80 kDa亞單元。 【圖式簡單說明】 圖1 p4831之有注釋的質粒圖譜。 圖2藉由純系#23分泌之抗體的SDS-PAGE及西方墨點分 析；a)考馬斯染色，b)用偶聯過氧化物酶之抗-人類免疫球 • 蛋白γ鏈-抗體之西方墨點分析，c)用偶聯過氧化物酶之抗_ 人類免疫球蛋白κ輕鏈-抗體之西方墨點分析。泳道1 :人 類抗-IGF-1R-參考抗體；泳道2 :包含純系#23之抗體的 CHO-DG44純系#23之培養物上清液。 圖3 p48 17之有注釋的質粒圖譜。 圖4藉由經p4831或4855轉染之CHO-DXB11分泌之免疫 球蛋白的西方墨點分析β泳道1 :經p483 1轉染之CHO細 胞，泳道2 :經p4855轉染之CHO細胞》 Φ 圖5 p5031之有注釋的質粒圖譜。 圖6藉由經質粒p5031或p5032轉染後之HEK-293-EBNA 細胞分泌之抗體的SDS-PAGE分析；泳道1 +2 : p503 1，泳 道3+4 : p5032，泳道5-8 :人類抗-IGF-1R-抗體作為參考抗 體；5 : 0.2 pg，6 : 0_7 pg，7 : 2 pg，8 : 6 pg。 圖7用p503 2將CHO-DG44細胞轉染並經選擇用於質粒與 胺曱蝶呤（MTX)之穩定整合。將來自6種純系之抗體純化 並藉由SDS-PAGE及考馬斯染色進行分析。 • 48 · I3090〇d〇c

J 1361221 序列表 <11〇>瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 <120>免疫球蛋白之製造

<130 24355 FT <140> 097124423 <141〉2008*06*27 <150 EP 07012774.1 <151> 2007-06-29 <160> 31 <170> Patentln version 3.2

1rta 113服智 1 '">>> > 0 12 3 o n 1 n 11 <2<2<2<2<4

Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu 1 5 10 15

Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly 20 25 30

Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gin Gly Ser Gin Glu 35 40 45

Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gin Glu Pro Ser 50 55 60

Gin Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser lie Leu Arg Val Ala Ala 65 70 75 80

Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu 85 90 95

Ala I*eu Pro Leu Ala Phe Thr Gin Lys Thr lie Asp Arg Leu Ala Gly 100 105 110

Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly 115 120 125

Thr Cys Tyr 130 I30900.doc 1361221 <210> 2 <211> 109 <212> PRT <213> 智人 <400> 2

Ala Ala Gin Ala Pro Val Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser 15 10 15

Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe 20 25 30

Ser Pro Pro Asn lie Leu Leu Met Trp Leu Glu Asp Gin Arg Glu Val 35 40 45

Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gin Pro Gly Ser 50 55 60

Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser 65 70 75 80

Pro Gin Pro Ala Thr Tyr Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg 85 90 95

Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg Ser Leu Glu Val Ser Tyr 100 105 <210> 3 <211> 110 <212> PRT <213> 智人 <400> 3

Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp 15 10 15

Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu lie Gin Asn Phe 20 25 30

Met Pro Glu Asp lie Ser Val Gin Trp Leu His Asn Glu Val Gin Leu 35 40 45 2- 130900.doc 1361221

Thr Gin Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser 60

Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu 65 70 75 80

Gin Lys Asp Glu Phe He Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro 85 90 95

Ser Gin Thr Val Gin Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys 100 105 110 <210> 4 <211> 131 <212> PRT <213> 智人 <400> 4

Pro Asp Ala Arg His Ser Thr 50 55

Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg 15 10 15

Glu Gin Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr lie Thr Cys Leu Val Thr 20 25 30

Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gin Trp Met Gin Arg Gly Gin 35 40 45

Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro 50 55 60

Gin Ala Pro Gly Arg Tyx Phe Ala His Ser lie Leu Thr Val Ser Glu 65 70 75 80

Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala His Glu 85 90 95

Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly 100 105 110

Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly 1X5 120 125

Thr Cys Tyr 130900.doc 130 1361221 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> 智人 <400> 5

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 15 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala 35

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Phe LeU Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His iyr 85 90 95

Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> 智人 <400> 6

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 15 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 35 40 45 4- 130900.doc 1361221

Pro Pro Met 55

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 50

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95

Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 7 <211> 107

<212> PRT <213> 智人 <400> 7

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 15 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gin Pro Glu 35 40 45

Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 65 70 75 80

Asn lie Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe 85 90 95

Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> 智人 130900.doc <400> 8

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu 1 5 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly 65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95

Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 9 <211> 300 <212> DNA <213> 智人 <400> 9 ggcttcagcc ccaaggacgt gctggttcgc tggctgcagg ggtcacagga gctgccccgc gagaagtacc tgacttgggc atcccggcag gagcccagcc agggcaccac caccttcgct gtgaccagca tactgcgcgt ggcagccgag gactggaaga agggggacac cttctcctgc atggtgggcc acgaggccct gccgctggcc ttcacacaga agaccatcga ccgcttggcg ggtaaaccca cccatgtcaa tgtgtctgtt gtcatggcgg aggtggacgg cacctgctac <210> 10 <211> 300 <212> DNA <213> 智人 <400> 10 taccacccaa cgtccgtgac tgtcacctgg tacatgggga cacagagcca gccccagaga I30900.doc accttccctg agatacaaag acgggacagc tactacatga caagcagcca gctctccacc cccctccagc agtggcgcca aggcgagtac aaatgcgtgg tccagcacac cgccagcaag agtaagaagg agatcttccg ctggccaggt aggtcgcacc ggagatcacc cagaagggcc ccccaggacc cccagcacct tccactcagg gcctgaccac aaagacagaa gcaagggctg 120 180 240 300 <210> 11 <211> 300 <212> DNA <213>智人 <400> 11 tttgcgacgc aacttcatgc gcccggcaca cgcctggagg catgaggcag cggagtggcc ctgaggacat gcacgacgca tgaccagggc cgagcccctc ggggagccgg ctcggtgcag gccccgcaag cgaatgggag acagaccgtc gacaagcgca tggctgcaca accaagggct cagaaagatg cagcgagcgg ccctcgcctg acgaggtgca ccggcttctt agttcatctg tgtctgtaaa cctgatccag gctcccggac cgtcttcagc ccgtgcagtc tcccggtaaa 60 120 180 240 300 <210> 12 <211> 300 <212> DNA <213> 智人 <400> 12 acgggcttct ctcccgcgga cgtcttcgtg cagtggatgc agagggggca gcccttgtcc ccggagaagt atgtgaccag cgccccaatg cctgagcccc aggccccagg ccggtacttc gcccacagca tcctgaccgt gtccgaagag gaatggaaca cgggggagac ctacacctgc gtggtggccc atgaggccct gcccaacagg gtcaccgaga ggaccgtgga caagtccacc ggtaaaccca ccctgtacaa cgtgtccctg gtcatgtccg acacagctgg cacctgctac 60 120 180 240 300 <210> 13 <211> 300 <212> DNA <213>智人 <400> 13 gtgtacaccc tgcccccatc ctggtcaaag gcttctatcc gagaacaact acaagaccac agcaagctca ccgtggacaa ccgggatgag ctgaccaaga cagcgacatc gccgtggagt gcctcccgtg ctggactccg gagcaggtgg cagcagggga accaggtcag cctgacctgc gggagagcaa tgggcagccg acggctcctt cttcctctac acgtcttctc atgctccgtg 60 120 180 130900.doc 240 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa <210> 14 <211> 300 <212> DNA <213> 智人 <400> 14 gtgtacaccc ctggtcaaag gagaacaact agcaagctca atgcatgagg tgcccccatc gcttctaccc acaagaccac ccgtggacaa ctctgcacaa ccgggaggag cagcgacatc acctcccatg gagcaggtgg ccactacacg atgaccaaga gccgtggagt ctggactccg cagcagggga cagaagagcc accaggtcag gggagagcaa acggctcctt acgtcttctc tctccctgtc cctgacctgc tgggcagccg cttcctctac atgctccgtg tccgggtaaa <210> 15 <211> 300 <212> DNA <213>智人 <400> 15 gtgtacaccc ctggtcaaag gagaacaact agcaagctca atgcatgagg tgcccccatc gcttctaccc acaacaccac ccgtggacaa ctctgcacaa ccgggaggag cagcgacatc gcctcccatg gagcaggtgg ccgcttcacg atgaccaaga gccgtggagt ctggactccg cagcagggga cagaagagcc accaggtcag gggagagcag acggctcctt acatcttctc tctccctgtc cctgacctgc cgggcagccg cttcctctac atgctccgtg tccgggtaaa <210> 16 <211> 300 <212> DNA <213> 智人 <400> 16 gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa <210> 17 130900.doc 1361221 <211> 60 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> IgA <400> 17 ggcaaaccca cccatgtcaa tgtgtctgtt gtcatggcgg aggtggacgg cacctgctac <210> 18 <211> 60 <212> DNA <213> 人工序列 c220> <223> IgE <400> 18

catgaggcag cgagcccctc acagaccgtc cagcgagcgg tgtctgtaaa tcccggcaaa <210> 19 <211> 60 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> igM <400> 19 ggcaaaccca ccctgtacaa cgtgtccctg gtcatgtccg acacagctgg cacctgctac <210> 20 <211> 60 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> (gGl(變《 i) c400> 20 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggcaaa <210> 21 <211> 60 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> kG2(變體】) <400> 21 130900.doc 1361221 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggcaaa 60 <210> 22 <211> SO <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> IgG3 <400> 22 atgcatgagg ctctgcacaa ccgcttcacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggcaaa 60

<210> 23 <211> 60 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> IgG4 <400> 23 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggcaaa 60 <210> 24 <211> 39 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 誘變？1物 <400> 24 agcctctccc tgtccccggg caaatgagtg cgacggccg 39

<210> 25 <211> 39 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 誘變引物 c400> 25 cggccgtcgc actcatttgc ccggggacag ggagaggct 39 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> 人工序列 130900.doc 10· 1361221 <220> <223>誘變引物3 <400> 26 gcctctccct gtccctgggc aaatgagtgc cagg 34 <210> 2Ί <211> 34 <212> DNA <=213> 人工序列 <220> <223>誘變引物4 <400> 27 cctggcactc atttgcccag ggacagggag aggc 34 <210> 28 <211> 321 <212> DNA <213> 智人 <400> 28

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 60 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 180 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 240 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 300 ctctccctgt ctccgggtaa a 321 <210> 29 <211> 321 <212> DNA <213> 智人 <400> 29 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 60 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat ctccgtggag 120 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccat gctggactcc 180 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 240 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 300 ctctccctgt ctccgggtaa a 321 .11 - 130900.doc 1361221 <210> 30 <211> 60 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> IgG2(變體 2) <400> 30 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tccgggcaaa <210> 31 <211> 213 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> IgGl(變《2) <400> 31

atctccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggc aaa

12· 130900.doc

Claims (1)

1361221 鲈月，修正本丨公告本 第097124423號專利申請案 ι<?, 中文申請專利範圍替換本(1〇〇年6月）〔 十、申請專利範圍： 1， 一種經分離核酸，其編碼IgA或IgG類免疫球蛋白之Ch3-結構域之C-端部分的胺基酸序列、或IgE或IgM類免疫球 蛋白之CH4-結構域之C-端部分的胺基酸序列，其特徵在 於包含在該CH3-或CH4-結構域之C-端部分的胺基酸序列 中之甘胺酸-離胺酸-二肽係由核酸ggaaaa、或核酸 ggcaaa、或核酸gggaaa、或核酸ggaaag、或核酸ggcaag、 或核酸gggaag編碼。

2.如請求項1之核酸，其特徵在於該核酸編碼一個選自SEq ID NO: 1、3、4、5、6、7或8之胺基酸序列的胺基酸序 列。 3 ·如請求項1或2之核酸，其特徵在於編碼該甘胺酸-離胺 酸-二肽之核酸係以核苷酸g或a為首。 4.如請求項1或2之核酸，其特徵在於該甘胺酸_離胺酸_二 肽係由核酸ggaaaa、或核酸ggcaaa、或核酸gggaaa編 碼0 5·如請求項1之核酸，其特徵在於該C-端部分包含該免疫 球蛋白重鏈一級胺基酸序列之至少20個C-端胺基酸。 6.如請求項1之核酸，其特徵在於該核酸編碼IgA、IgE、 IgM或IgG類免疫球蛋白重鏈之c—端恆定結構域的一部分 且係選自 SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、22、23、30 或3 1之核酸。 7·如請求項6之核酸’其特徵在於該核酸係選自SEQ ID NO: 17、ι8、19、22、23、3〇或 31之核酸。 130900-1000614.doc 1361221 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 如請求項7之核酸’其特徵在於該核酸係選自SEQ ID NO: 17、18、19、22 或 23 之核酸。 如請求項1、2及5至7中任一項之核酸，其特徵在於該核 酸編碼IgGl或IgG4類人類免疫球蛋白重鏈之c-端恆定結 構域的一部分。 一種質粒，其包含如請求項1之核酸。 一種細胞，其包含如請求項1之核酸。 如請求項1 1之細胞’其特徵在於該細胞係哺乳動物細 胞。 如請求項12之細胞，其特徵在於該哺乳動物細胞係選自 CHO細胞、HEK細胞或BHK細胞。 一種在哺乳動物細胞中製造免疫球蛋白之活體外方法， 其包含以下步驟： a) 用編碼免疫球蛋白重鏈之核酸轉染該哺乳動物細 胞’其中 SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、22、23、 30或31之核酸編碼該免疫球蛋白重鏈之c端部分， b) 經轉染之哺乳動物細胞在適於表現該免疫球蛋白 之條件下培養， c) 自該培養物或該細胞回收該免疫球蛋白。 如請求項14之方法，其特徵在於該哺乳動物細胞係用— 種包含編碼免疫球蛋白重鏈之表現盒及編碼免疫球蛋白 輕鏈之表現盒的核酸轉染。 如請求項14之方法，其特徵在於該哺乳動物細胞係用兩 種核酸轉染，其中第一核酸包含編碼免疫球蛋白輕鏈之 130900-100Q6i4.doc 1361221 表現盒，第二核酸包含編碼免疫球蛋白重鏈之表現盒。 17. 如請求項14至16中任一項之方法，其特徵在於該轉染該 哺乳動物細胞係用編碼免疫球蛋白重鏈之核酸實施，其 中 SEQ ID NO: 17、18、19、22、23、30或 31 之核酸編碼 該免疫球蛋白重鏈之C-端部分。 18. 如請求項17之方法，其特徵在於該轉染該哺乳動物細胞 係用編碼免疫球蛋白重鏈之核酸實施，其中SEQ ID NO: 17、18、19、22或23之核酸編碼該免疫球蛋白重鏈之C_ 端部分。 19· 一種改良免疫球蛋白在哺乳動物細胞中表現的活體外方 法’其中編碼該免疫球蛋白重鏈之核酸包含編碼該免疫 球蛋白重鍵之CH3-或CH4-結構域中所含之甘胺酸-離胺 酸-二肽的核酸ggaaaa、或核酸ggcaaa、或核酸gggaaa、 或核酸ggaaag、或核酸ggCaag、或核酸gggaag。

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