TWI355390B

TWI355390B - Immunogenic peptide carrier conjugates and methods

Info

Publication number: TWI355390B
Application number: TW093139525A
Authority: TW
Inventors: Rasappa G Arumugham; A Krishna Prasad
Original assignee: Wyeth Llc
Priority date: 2003-12-17
Filing date: 2004-12-17
Publication date: 2012-01-01
Also published as: CN1984676A; CR8444A; KR20070027502A; PT1701968E; HK1091219A1; SG149013A1; JP2008505052A; BRPI0417744A8; AU2004299501B2; SI1701968T1; WO2005058940A2; ES2546175T3; PL1701968T3; AU2004299501A1; BRPI0417744A; AR046960A1; NZ548352A; EA010060B1; EP1701968A2; DK1701968T3

Description

1355390 (1) 九、發明說明【發明所屬之技術領域】根據35 U.S.A. §119(e)條款本發明主張於2003年〗2月】7日提出之美國臨時專利申請案第60/5 3 0,4 80號之權益’ 其全部併此以供所有目的作參考。【先前技術】適應性免疫的要素爲有機體有能力對外來物質的存在有所反應且能產生可與該異物特異性交互作用之成份（抗體及細胞）並保護該宿主免於異物的入侵。”抗原”或”免疫原”爲一種物質，其能引起此類型免疫反應且可與被製造來對抗它之敏感化細胞及抗體相互作用。抗原或免疫原通常爲巨分子且含有獨特的抗原性部位或”抗原決定部位”，其可被免疫系統辨識且與免疫系統的多種成份相互反應。它們可呈個別分子的形式存在且可由合成性有機化學物質、蛋白質、脂蛋白、糖蛋白' RN A、 DNA、或多醣所組成，或者它們可爲部份細胞結構（細菌或真菌）或病毒（Harl 〇 w and Lane 1 9 9 8 a, b,c ; Male et al.: ] 98 7)。小分子如短肽雖然通常可與免疫反應的產物相互作用 ’但是僅有其自身時經常無法引起反應。此等肽免疫原或被稱爲”半抗原”事實上爲不完全抗原，雖然本身不具致免疫性或無法引起抗體產生，不過可以藉由偶合到適當的載體上而使其具致免疫性。載體通常爲分子量較大之蛋白質 -4 - (2) (2)1355390 抗原且在活體內投予時會造成免疫性反應。於免疫反應中，抗體係由B_淋巴球以及T-輔助（Τη) 細胞所製造及分泌。於大多數半抗原-載體系統中，Β細胞製造的抗體對於半抗原及載體都具特異性。於此等例中，Τ淋巴球具有針對載體的特殊結合域，但在只有半抗原時卻無法辨識出來。在一種協同作用下，該Β及Τ細胞合作則可引發對半抗原具特異性之抗體反應。在此種免疫反應發生後，若宿主後來只受到半抗原之挑釁，通常初次疫苗接種後髟成之記憶細胞還是能對該半抗原有所反.應而產生半抗原·特異性抗體。. 模仿較大巨分子上某些精確的抗原決定部位結構之合成性半抗原通常會被接合到載體上以產生針對該較大”母體”分子之免疫反應。例如，可根據一蛋白質之已知序列來合成短肽片段且將該片段偶合到載體上以引發針對該天然蛋白質之免疫反應。免疫原製造之此類合成性策略已成爲近年來疫苗產製之硏究基礎。然而在許多情形下，在使用合成肽-載體共軛物時若僅僅造成Β -細胞反應，不論該共軛物設計得有多好，卻無法保證總能針對該完整免疫原產生徹底的免疫性保護。來自較大病毒顆粒或細菌細胞之短肽抗原決定部位所產生的免疫反應可能僅足以在Β_細胞層次產生記憶。於此例中，現在一般已同意：細胞毒性 Τ-細胞反應才是保護性免疫的更重要指標。所以設計出具有適當抗原決定部位之結合位以供Β-細胞及Τ-細胞兩者皆可辨識之肽免疫原已成爲今日免疫學中最具挑戰性的硏 -5 - (3) (3)1355390 究領域之一。將小型或不良的免疫原分子接合到較大之，·載體”分子上以增加致免疫性的策略已成功地運用數十年（參考例如 Goebel et al· (1939) J. Exp. Med. 69: 53)。例如，已有許多免疫原組成物被加以描述，其係將已純化的被膜聚合物接合到載體蛋白質上且藉由此種”載體效果”來產製出.更有效的免疫原組成物。Schneerson et al. (]984) Infect. Immun. 45: 582-591。還有，當使用一種游離多醣來免疫嬰兒時往往只能得到不良的抗體反應，但是若把該等多醒與載體接合後就可以避免此種抗體反應·不良之現象 (Anderson et a]. (19 8 5) J. Pediatr. 107 : 346; Insel et al. (l986)J.Exp.Med.l58:294)° 半抗原-載體接合之共軛物可用多種交聯/偶合反應劑如同雙官能基、異雙官能基或零-長度交聯劑成功地製造。許多此等方法近來已被用來把醣類、蛋白質及肽類偶合到肽載體上。大多數的方法係產生胺、醯胺、胺基甲酸酯、異胺基甲酸酯 '或二硫化物鍵結，或者於某些例爲產生硫醚。使用偶合劑可將反應性部位引入位於載體及/或半抗原分子上之反應性胺基酸分子之側鏈中，所以使用偶合劑之一項缺點爲：若未將反應性部位中和那麼此等反應性部位即可自由地與活體外（如此會不當地影響該共（等）軛物之官能性或穩定性）或活體內（如此會將接受此等製劑免疫之人類或動物置於不良條件的潛在風險中）的任何不良分子反應。此等過量的反應性部位可採用多種已知的化學 -6- (4) (4)1355390 反應來加以耗用或”加蓋”好讓此等部位鈍化，不過此等反應卻另外地可能會妨礙共軛物的官能性。當意圖把反應性部位引入載體分子以製造共軛物時特別會有問題，由於其有更大且更複雜的結構（相較於半抗原）使其更易於感受化學處理的妨礙影響。事實上，目前還沒有以如下方法製成之共軛物實例，該方法係先將載體活化，然後於接合反應中讓載體與半抗原反應，最後將剩下的反應性部位”加蓋，，以製成共軛物，同時使得所產生之共軛物仍保有成爲具有所需”載體效果”特性之免疫原組成物之能力。【發明內容〕：本發明係關於一種由肽免疫原以及蛋白質/多肽載體形成之免疫原共軛物之產製方法，其中該肽免疫原係經由該載體之胺基酸殘基如離胺酸之衍生化官能基來接合到該載體上，且其中該等胺基酸殘基上任何未進行接合之衍生化官能基會經由加蓋來鈍化以阻斷其與其它分子包括蛋白質/多肽進行反應，以保留該載體之官能性，如此該共軛物即可保有引發所需之抗該肽免疫原之免疫反應之能力且若無載體則無法產生該等免疫反應。進一步地，本發明亦關於以如上方法產製之共軛物，以及含有此等共軛物之免疫原組成物。於一具體例中，本發明之第一方法係把肽免疫原經由該肽免疫原上之一胺基酸殘基之反應性基團來與具有一或多個官能基之蛋白質/多肽載體接合在一起之方法，該方 (5) (5)1355390 法包含的步驟有：（a)將該蛋白質/多肽載體之一或多個官能基衍生化以產生具有反應性部位之衍生化分子；（b)讓步驟U)之衍生化蛋白質/多肽載體於反應條件下與該肽免疫原胺基酸殘基之反應性基團反應，使得該肽免疫原經由該等官能基團接合到該衍生化蛋白質/多肽載體上；及（〇進一步地將該共軛物與一種加蓋劑反應好讓已活化蛋白質 /多肽載體上之游離反應性官能基鈍化以保留該載體之官能性，如此該共軛物即可保有該載體抗該肽免疫原之官能性且若無載體則無法產生此反應。於一具體例中，該蛋白質/多肽載體係選自人類血淸白蛋白、匙孔帽貝血淸蛋白、免疫球蛋白分子 '甲狀腺球蛋白、卵白蛋白、流感血球凝集素、P.AN-DR結合肽 (PADRE多肽）、瘧疾環孢蟲（CS)蛋白質、B型肝炎表.面抗原（HB5Ag19_28)、熱休克蛋白質（HSP)65、卡-介二氏桿菌 (BCG) '霍亂毒素、毒性較低之霍亂毒素突變體、白.喉毒素 '與白喉毒素交叉反應之CRM197蛋白質、重組鏈球菌性 C5a 肽酶、釀膿鏈球菌（S/repiococcwi jd少 ORF1224 '釀膿鏈球菌ORF]664、釀膿鏈球菌ORF24 52 ' 肺炎衣原體（匸/7/〇”7>^;'〇；?；^1/»7〇«丨以）〇]1?丁367 '肺炎衣原體ORF T858、破傷風類毒素、HIV gpl20 T1'辨認黏附性基質分子之細菌表面成份（MSCRAMMS)、生長因子/激素、細胞因子及趨化因子等所組成之群組。於另一具體例中，該蛋白質/多肽載體含有T-細胞抗原決定部位。 -8- (6) (6)1355390 於再一具體例中，該蛋白質/多肽載體爲細菌性類毒素如破傷風類毒素、霍亂毒素或如上所述之霍亂毒素突變體。於較佳具體例中，該蛋白質/多肽爲crmI97。於再一具體例中，該蛋白質/多肽載體可爲流感血球凝集素、PADRE多肽、瘧疾CS蛋白質、B型肝炎表面抗原（HSBAI9-28)、熱休克蛋白質65(HSP 65)、或來自結核桿菌之多肽（BCG)。於再一具體例中，該蛋白質/多肽載體係選自鏈球菌性 rC5a肽酶 '釀膿鏈球菌 ORFI 224、釀膿鏈球菌 ORF 1 664、釀膿鏈球菌ORF2 45 2 '肺炎衣原體〇RF T367 、肺炎衣原體ORF T8 5 8。於再一具體例中，該蛋白質/多肽載體可爲生長因子或激素，其可刺激或強化免疫反應且係選自.IL-1、IL-2、 7 -千擾素、IL-10 ' GM-CSF ' ΜΙΡ-1α ' MIP-Ιβ 及 RANTES » 於一具體例中，該肽免疫原係選自一種細菌性蛋白質、一種病毒性蛋白質及一種真核生物蛋白質。於另一具體例中，該肽免疫原係衍生自一種細菌性蛋白質，該等細菌係選自肺炎鏈球菌，金黃色酿膿葡萄球菌 aureus) > 表皮葡萄球菌腦膜炎奈瑟氏菌wew/wg/Πϋ)，淋病奈瑟氏菌 (Λ? e 7· s j e r ί a g 〇 » 〇 r r /? e 〇 e )，流桿嗜血桿菌（β 〇 e w 〇 / / w ί 7· w./7 w e » z o e )，大腸桿菌（£ s/7 e r / c/7 / 〇 c o / /)，腸克雷白氏桿菌 -9- (7) (7)1355390 (尺，單細胞增多性李司戎氏菌 (Z^s/er/a mo«oc;yioge«e5)，霍亂弧菌（Fcho/erae)，產氣莢膜梭狀胞桿菌（C7〇i/r;cfiwm pe r/r /«gen_s)，梭狀芽胞桿菌（C7〇iiri_山_ww ，假單胞菌屬（Pseudononas) ，鼠傷寒沙門氏菌（S » e " σ /少；? H w w d w w ) ‘ ’包柔氏螺旋體（5orre/ifl Z?wrg<ior/er〇，.弗氏志賀氏菌（5^/ge//a /Vejcwer/)，波伊德氏志賀氏菌Z?o_y心〇，痢疾志賀氏菌（*SAige//a 及 Β 群鏈球菌屬細菌。於另一具體例中，該肽免疫原係衍生自一種病毒之·蛋白質抗原，該病毒係選自人類免疫不全病毒（HIV)、單純疱疹病毒（HSV)、人類乳突病毒（HPV)、副流感病毒（PIV) 、水泡性口炎病毒（V S V )、呼吸道融合病毒（R S V )、E B病毒（EBV)(Epstein-Barr virus)、冠狀病毒、牛瘦病毒、輪狀病毒、狂犬病毒、C型肝炎病毒（H CV)及B型肝炎病毒: (HBV)° 於再一具體例中，該肽免疫原係衍生自一種真菌之蛋白質抗原。該真菌係選自念珠囷屬（Candida)、隱球囷屬 (Cryptococcus)、球抱子囷屬（Coccidioides)、組織胞發菌屬（Histoplasma)、麴黴屬（Aspergillus)之真菌。於另一具體例中，該肽免疫原係衍生自一種寄生蟲之蛋白質抗原，該寄生蟲係選自瘧原蟲屬（P】asmodium)、錐蟲屬（Trypanosome)、血吸蟲屬（Schistosome) '利什曼原蟲屬（Leishniania)之寄生蟲° -10- (8) (8)1355390 於另一具體例中，該肽免疫原係衍生自一種真核生物之蛋白質抗原。於較佳具體例中該真核生物爲人類。於另一較佳具體例中，該來自人類之肽免疫原係來自惡性腫瘤。於更佳具體例中，該肽免疫原係一種腫瘤抗原，其係來自腎細胞癌、乳癌、黑素瘤及前列腺癌。於其它較佳具體例中，該肽抗原係衍生自腫瘤抗原、癌胚胎性抗原（CEA)。於一態樣中，本發明係提供一種含有A万肽或A石片段或其類似物之肽免疫原，其可引起抗A 內特殊抗原決定部位之免疫反應。本發明之免疫原肽類包括異源性免疫原肽類。於某些免疫原肽中，其係將A沒片段連接到載體上以形成異源性免疫原肽，然後可用本發明方法來將此種異源肽連接到載體上以形成共軛物。

於本發明另一態樣中，該肽免疫原爲一種包含A 之 N端部份至少第]-5個殘基之多肽，該A /S之第】個殘基爲該多肽的N-端殘基，其中該多肽不含有該a冷的c端片段。於本發明再一態樣中，本發明之肽免疫原爲含有A冷之N -端片段之多肽，該片段係以A泠之第1 - 3個殘基開始且以A々之第7·]1個殘基結束。於本發明某些態樣中，該肽免疫原爲一種會引起抗A/S之Ν-端片段之免疫反應之化學劑且該Α冷之Ν端片段係以A /3之第]-3個殘基開始且以Ayg之第7-11個殘基結束且不會引起針對Ay543第 4 3個殘基之抗原決定部位之免疫反應。於本發明另—態樣中，該肽免疫原爲一種含有連接一段異源胺基酸序列及A -11 - (9) (9)1355390 召片段之異源性多肽，其可引發抗該胺基酸序列之輔助者 T-細胞反應及抗該N-端片段之B·細胞反應。於某些肽免疫原中，該AyS之N·端片段係以其C端連接到異源多肽上。於某些肽免疫原中，該 A召之N-端片段係以其N端連接到異源多肽上。於某些肽免疫原中，該A万之N-端片段係以其C端及N端分別連接到第一及第二異源多肽上。於某些肽免疫原中，該之N-端片段係以其N端連接到異源.多肽且以其C端連接到至少額外一段N-端片段複本上。於某些肽免疫原中，該多肽含有N-端到C端部份、之N-端片段、多個複本之N-端片段及該異源胺基酸片段。於某些如上的肽免疫原中，該多肽進一步含有至少一個額外的N-端片段複本。於某些如上肽免疫原中，該片段不含至少5個A yS 43之C·端胺基酸。於如上肽免疫原之某些態樣中，該A万片段含有最多 1 〇個鄰近的A万胺基酸。於另一態樣中，本發明提供一種含有A yS肽或A 片段或其類似物之肽免疫原且其可引起抗A点內特殊抗原決定部位之免疫反應，該肽免疫原之構型爲一種被稱爲多抗原性肽（MAP)之構型。於某些上述之本發明態樣中，該肽免疫原係來自h β 之Ν端那半。於本發明之某些態樣中，該肽免疫原係選自 Α；β】-3、]-4、1-5']-6']-7']-；Ι〇、】-]]、]-12、]- 1 6 ' 3 - 6及3 · 7之Α Θ片段。於某些如上態樣中，該肽免疫 -12 - (10) (10)1355390 原係來自A冷的中間區域》於本發明某些態樣中，該肽免疫原係選自 Ayg 13-28、15-24、17-28 及 25-35 之 AyS 片段。於本發明某些態樣中，該肽免疫原係來自A万的C端。於本發明某些態樣中，該肽免疫原係選自 ΑΘ33-42、35-4〇及3 5·42之A在片段。於本發明某些態樣中，該肽免疫原係選自 A/S 1-3、1-4、1-5、1-6' 1-7、1-10、1-11' 1-12、1-16 '1-28' 3-6、3 - 7 ' 13-28' 15-24 ' 17-28、25-35 、33-42、35-4〇及35-42之AyS片段。於本發明某些態樣中，該肽免疫原係選自六冷1-5、六冷1-7、八.卢1-9及八01· 1 2之A /5片段。於.本發明某些態樣中，該肽免疫原係選自 A 冷 l-5-L、A冷卜7-L、A；Sl-9-L 及 A；5l-]2-L 之片段’其中L爲連接子？於本發明某些態樣中，該肽免疫原係選自八泠1-5-1^(：、八/5 1- 7-[-(：、八）0 1- 9-1<-(：及入万1-12-L-C之A/5片段’其中C爲半胱胺酸殘基。於本發明某些態樣中，該肽免疫原係選自A召1 6 - 2 2 、16-23 ' Αβ 17-23、17-24 ' AyS 18-24 及 Ay5 18· 2 5之A石片段。於本發明某些態樣中，該肽免疫原係選自 Α β 16-22-C' Α β 16-23-C' A β 17-23-C' A β 17-24-C' A 召18-24-C及A^]8-25-C之A/S片段，其中c爲半胱胺酸殘基。於本發明某些態樣中，該肽免疫原係選自c-A沒 ]6 - 2 2 ' C - A 万 I 6 - 2 3 、 C - A /3 1 7 - 2 3 ' C - A 沒 1 7 - 2 4、 C - A 冷 18-24及C-A^ 18-25之Ay3片段’其中c爲半胱胺酸殘基〇於某些如上肽免疫原中’該異源多肽係選自具有τ · -13- (11) (11)1355390 細胞抗原決定部位、B -細胞抗原決定部位及其組合之肽類〇於一具體例中，該蛋白質/多肽載體或該任意地依附在該載體上之多肽連接子之一或多個胺基酸分子之官能基可使用交聯劑來衍生化。於另一具體例中，該衍生性反應劑爲一種零長度交聯劑。於另一具體例中，該衍生性反應劑爲一種同雙官能交聯劑。於再一具體例中，該衍生性反應劑爲一種異雙官能交聯劑》 φ 於一較佳具體例中，該異雙官能反應劑寧一種可與該蛋白質/多肽載體之一或多個胺基酸分子的初級或ε -胺官能基反應以及與該肽免疫原之一或多個胺基酸分子之突出硫醇基反應之反應劑。於一具體例中，該異雙官能反應劑爲Ν-琥珀醯亞胺基溴醋酸酯。於另一具體例中，該初級或ε -胺官能基爲離胺酸/ 於再一具體例中，將該蛋白質/多肽載體之離胺酸之初級或ε -胺官能基用Ν-琥珀醯亞胺基溴醋酸酯來衍生化會使 φ 得該蛋白質/多肽載體上之離胺酸分子之初級或ε -胺官能基溴乙醯化。於一更佳具體例中，該突出的硫醇基爲該肽免疫原的半胱胺酸殘基，其可位在該肽免疫原的胺基端、該肽免疫原的羧基端或該肽免疫原的內部。於另一具體例中，該硫醇基係用硫醇化劑如Ν-乙醯基高半胱胺酸硫內酯、陶特試劑（Train、reagent，2·亞胺硫烷）SATA(N-琥珀醯亞胺基 S-乙醯基硫醋酸酯）、 SMPT(4-琥珀醯亞胺氧羰基-甲基-2-吡啶二硫甲苯）' 硫 -14- (12) (12)1355390 LC SPDP(硫琥珀醯亞胺基吡啶基二硫丙醯胺基乙酸酯）' SPSP(琥珀醯亞胺基吡啶基二硫丙酸酯）》於一較佳具體例中，用來把已活化蛋白質/多肽載體上游離之反應性官能基鈍化之加蓋劑係選自半胱胺、N-乙醯基半胱胺及乙醇胺〇 *· · * 於一特佳具體例中，用來把已活化蛋白質/多肽載體上游離之反應性官能基鈍化之加蓋劑係選自氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫銨及氨所組成之反應劑群組。 φ 於一具體例中，該肽免疫原之胺基酸殘基之反應性基團爲游離之硫氫基。於其它具體例中，該一或多個官能基係位在連接子上，其係任意地被依附在該蛋白質/多肽載體上。於一較佳具體例中，該連接子爲肽連接子。於一更佳具體例中，該肽連接子爲聚離胺酸。於其它具體例中，本發明之第二方法係關於把肽免疫原與具有如下結構之蛋白質/多肽載體接合在一起之方法 φ (X)m

其中c爲蛋白質/多肽載體且X爲位在該蛋白質/多肽載體上之胺基酸殘基之可衍生化官能基或者任意地共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘基之可 -15- (13) (13)1355390 衍生化官能基，且其中m爲大於0但小於或等於85之整數，該方法包含的步驟有：（a)將位在該蛋白質/多肽載體上或位在任意地被接在該載體上之連接子之一或多個官能基衍生化以產生具有反應性部位之衍生化分子；（b)讓步驟 (a)之衍生化蛋白質/多肽載體與該肽免疫原之胺基酸殘基之反應性基團反應，以形成共價偶合之肽免疫原·蛋白質/ 多肽載體共軛物；及（c)進一步地將該共軛物與一種加蓋劑反應，好讓已活化蛋白質/多肽載體上之游離反應性官能基鈍化，使得已加蓋基團無法自由地與其它分子包括蛋白質/多肽反應，藉以保留該載體之官能性，如此一來該共軛物即可保有所需之引發抗該肽免疫原之免疫反應之能力且若無載體則無法產生該等免疫反應，如此來產生一種具有如下結構之加蓋肽免疫原-蛋白質/多肽載體共軛物： (Xd——p)n

其中c爲該蛋白質/多肽載體且χο爲位在該蛋白質/ 多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基或者任意地共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化官能基，且其中 P爲肚免疫原分子，其係共價地依附到該蛋白質/多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基上或者依附到任 -16 - (14) (14)1355390 意地共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化官能基上； R爲加蓋分子，其係共價地依附到該蛋白質/多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基上或者依附到任意地共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化官能基上；η爲大於0但小於或等於8 5之整數，且Ρ爲大於〇但小於85之整數。前文所述之第一方法的詳細具體例亦可應用在第二方法產製之共軛物上。於一具體例中，本發明係關於一種肽免疫原與蛋白質 /多肽載體之共軛物，其中該蛋白質/多肽載體具有如下結構： (X)m

其中C爲蛋白質/多肽載體且X爲位在該蛋白質/多肽載體上之胺基酸殘基之可衍生化官能基或者任意地共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘基之可衍生化官能基，且其中m爲大於0但小於或等於85之整數 ’且已加蓋之肽免疫原-蛋白質/多肽載體共軛物具有如下結構： -17- (15) (15)1355390 (Xd—P)n 0H-(xLR)p 其中c爲該蛋白質/多肽載體且Xd爲位在該蛋白質/ - 多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基或·者位於任意地共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化官能基，且其中P爲肽免疫原分子，其係 · 共價地依附到該蛋白質/多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基上或者依附到任意地共價依附在該蛋白質/多月太載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化官能基上； R爲加蓋分子，其係共價地依附到該蛋白質/多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基上或者依附到任意地共價依附·在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化官能基上’藉以保留該載體之官能性，如此—來物即可保有引發所需之抗該肽免疫原之免疫反應之 φ @力且若無載體則無法產生該等免疫反應；^爲大於〇但小於或等於8 5之整數’且Ρ爲大於0但小於8 5之整數。如上第一及第二方法之詳細具體例亦可應用在如上所述之共軛物上。於另一具體例中’本發明係關於以本發明第二方法所產一之肚免疫原與蛋白質/多肽載體之共軛物，其具有如構： -18 - (16) (16)1355390 (Xd—p)n (^)—(X^—R)p 其中c爲該蛋白質/多肽載體且xd爲位在該蛋白質/ 多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基或者任意地位在共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化官能基，且其中P爲肽免疫原分子，其係共價地依附到該蛋白質/多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基上或者依附到任意地共價依附在該蛋白質/多月太載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化官能基上； R爲加蓋分子，其係共價地依附到位在該蛋白質/多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基上或者依附到任意地共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化官能基上，藉以保留該載體之官能性，如此該共軛物即可保有引發所需之抗該肽免疫原之免疫反應之能力且若無載體則無法產生該等免疫反應；n爲大於〇但小於或等於8 5之整數，且ρ爲大於〇但小於8 5之整數》如±第二方法之詳細具體例亦可應用在如上所述以第二方法製成之共軛物上。於其它具體例中，本發明亦關於一種免疫原組成物，其含有以本發明第二方法所產製之肽免疫原與蛋白質/多肽載體之共軛物，以及一或多種藥學可接受之賦形劑 '稀釋劑及佐劑。該第二方法之詳細具體例及藉此產生之共軛物亦可應 -19- (17) (17)1355390 用在含有此等共軛物之免疫原組成物中。於其它具體例中，本發明係關於一種在哺乳動物主體引起免疫反應之方法，其包含將有效份量之本發明免疫原組成物投予至該主體。可應用在含有本發明共軛物之免疫原組成物之詳細具體例亦可應用在使用此等免疫原組成物之方法之具體例中

序列簡要說明

SEQ ID NO: 序列說明 1 DAEFR-C ΑβΙ-5-C 2 DAEFRHD-C Αβ 1-7-C 3 DAEFRHDSG-C ΑβΙ-9-C 4 DAEFRHDSGYEV-C ΑβΙ-12-C 5 DAEFR-GAGA-C ΑβΙ-5-L-C

-20 - (18)1355390

SEQ Ώ> NO: 序列說明 6 DAEFRHD-GAGA-C ΑβΙ-7-L-C 7 DAEFRHDSG-GAGA-C ΑβΙ-9-L-C 8 DAEFRHDSGYEV-GAGA-C ΑβΙ-12-L-C 9 VEYGSDHRFEAD-C Αβ]2 小 C 10 GAGA 連接子 11 PKYVKQNTLKLAT 流感血球凝集素:ha307.319 12 AKXVAAWTLKAAA PANO-DRIM (PADRE Sic) 13 EKKIAKMEKASSVFNV 瘧疾CS:T3抗原決定部位 14 FELLTRILTI B型肝炎表面抗原： HBsAg]9-28 15 DQS1GDLIAEAMDKVGNEG 熱休克蛋白質65:hsp65⑸-η】 16 QVHFQPLPPAWKL 卡介二氏桿菌(BCG) 17 QYIKANSKJIGITEL 破傷風類毒素:TT830.S44 18 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE 破傷風類毒素:TT947.967 19 KQIINMWQEVGKAMY HIVgpl20Tl 20 DAEFRHD-QYDCANSKFIGITEL-C- FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE- DAEFRHD Ap].7/TT830-844/C/TT947-967/A3i.7 21 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSN KGAUGLMVGGWIA Αβ].42 22 DAEFRHDQYIKANSKPIGITEL ΑΝ90549: Αβι.7/ΤΤ83〇.844 (以ΜΑΡ4構型使用） 23 DAEFRHDFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE ΑΝ90550: Αβ]-7/ΤΤ947-967 似ΜΑΡ4構型使用） 24 DAEFRHD- ΑΝ90542: Αβ]-7</ΤΤβ3〇.844 + ΤΤ947- QYrKANSKPIGITELFNNFTVSFWLRVPK： 967 VSASHLE (以線性構型使用） 25 EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL ΑΝ90576: Ap3-9/TT83〇.g44 (以MAP4構型使用） 26 AKXVAA'VTLKAAA-DAEFRHD AN90562: APi.7/PADRE

-21 - (19)1355390 SEQ ID NO: 序列說明 27 DAEFRHD-DAEFRHDD- AEFRHDAKXVAAWTLKAAA AN90543: Αβι-7 x 3/PADRE 28 AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD- DAEFRHD-DAEFRHD PADRE/AP，.7 x 3 29 DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA Αβ,-7χ 3/PADRE: 30 DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR Αβι.7/白蛋白片段 31 FKHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR Αβϋ〇/白蛋白片段 32 EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR Αβ3.9/白蛋白片段 33 PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD . ΗΑ3〇7-31?/Αβ].7 x 3 34 DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT- DAEFRHD Αβι.7/ΗΑ3〇7-319/Αβι.7 35 DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD- PKYVKQNTLKLAT Αβ]，7 χ 3/ ΗΑ307.319 36 DAEFRHD-DAEFRHD- PKYVKQNTLKLAT Αβ】·7 x 2/ ΗΑ3〇7-3】9 37 DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT- EKKIAKMEKASSVFNV- QYIKANSKFIGITEL- FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE- DAEFRHD Αβ丨·7/ΗΑ3〇7·3】9/ 瘧疾 CS/ ΤΤ S30-844/TT 947-967/Α β j .η 38 DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD- QYIKANSKF1GITEL-C- FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE Αβ).7 X 3/ΤΤ830-844/C/TT947-967 39 ΟΑΕΡΚΗΌ^ΥΙΚΑΝ8ΚΡΙΟΙΤΕί-0-FNNF 丁 VSFWLRVPKVSASHLE Αβ] ,ηΓΓΤ830-844/C/TT947-967 -22 - (20) SEQ ID NO: 序列說明 40 GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGY VDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFY STDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGW KVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLS LTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRWLS LPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEIN FETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVR RSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLK EHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEE FHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGAN YAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAAL SILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSI ALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFV ESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFL HDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDI KITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSK THISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSP VYVGNG\OIANLHVAFHRSSSEKIHSNEI SSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEI KS ^CRM3i97 41 ISQAVHAAHAEINEAGR 白蛋白片段 42 DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSN KGAIIGLMVGGWIA 鼠 ΑβΜ2 43 VFFAEDVG-C Αβΐ8-25 -C 44 LVFFAEDV-C Αβπ-24 -C 45 KLVFFAED-C Αβ】6·23，ε 46 OVFFAEDVG 0-Αβΐ8_25 47 C-LVFFAEDV 0-Αβ]7-24 48 C-KLVFFAED 〇-Αβΐ6-23 49 VFFAEDV-C Αβ]β-24 -C 50 LVFFAED-C Αβπ-23-C 51 KLVFFAE-C Αβ]6-22'〇 52 C-VFFAEDV 0-Αβ]8-24 53 C-LWFAED C-Ap]7-23 54 C-KLVFFAE C-AP]6-22 1355390 發明詳細說明本發明係關於一種產製肽免疫原·載體共軛物之方法 -23 - (21) (21)1355390 ，其中在載體上於活化過程中形成之活性官能基若未被反應掉，則會用加蓋劑如N -乙醯基半胱胺使其鈍化’以防止其作進一步反應。本發明亦關於用此等方法產製之加蓋載體-肽免疫原共軛物以及含有此等共軛物之免疫原組成物。將小型或不良的免疫原分子如醣類經由接合作用增加免疫原性的策略已成功地運用數十年（參考例如Goebel et al. ( 1 93 9) J. Exp. Med. 69 ： 53)，且已有許多免疫原組 φ 成物被描述，其係將已純化的被膜聚合物接合到載體蛋白質上且藉由此種”載體效果”來產製出更有效的免疫原組成物。例如 Schneerson et al. (J· Exp. Med. 152: 361-376，1980)已說明一種流感嗜血桿菌b多醣蛋白質共軛物 ’其可對此等微生物引起之疾病提供免疫性。PRP(多核糖核糖醇碟酸醋）’ 一種流感嗜血桿菌b之被膜聚合物之共軛物已顯示出比單獨含有該多糖之免疫原組成物更有效 (Chu et a).,(1983) Infect. Immun. 40 ： 245; Schneerson et · a]. ( 1 9 8 4 )’Infect· Iramu· 4 5 : 5 8 2- 5 9 1 )。還有，當使用一種游離多醣來免疫嬰兒時往往只能得到不良的抗體反應，但是右將多醣與載體接合後就可以避免此種抗體反應不良之現象（Anderson et aI.(】985 ) j pediau ι〇7 · 346;Insei et al. (]986) J. Exp. Med. 158: 294)» 使用細菌性毒素或類毒素（該等毒素或類毒素已被常 I?、地用來免疫人類（如破傷風或白喉）且爲標準實務）作爲蛋白質載體之一項優點爲使用該等毒素或類毒素可以引起 -24 - (22) (22)1355390 對抗含被膜聚合物之病原體之免疫作用。抗原性決定子（antigenic determinant)/半抗原-載體共輥物亦已被用來產製具有高度特異性之單株抗體，其可辨識位在偶合半抗原上獨特的化學抗原決定部位。所產生的單株抗體亦常被用來硏究該抗原決定部位的結構及天然蛋白質彼此間的交互作用。於許多例中，用來產製此等單株抗體之抗原性決定子/半抗原爲可代表較大蛋白質表面之嚴格抗原性部位之小型肽片段。可用來作爲產製抗原性決 | 定子/半抗原-載體共軛物之成功載體之要件爲其具有免疫效能’並存在適當的官能基以供抗原性決定子/半抗原接合’而且即使在衍生化以後仍有合理的溶解性質及在活體內並無毒性。本發明方法製成的共轭物便符合此等要件。該等共車尼物可爲使用在此所述之接合過程所產製之穩定免疫原-載體共範物。該等共轭物係使用本發明之方法所產製的且其中具有如下結構之蛋白質/多肽會共價依附到該肽免疫原鲁上： (X)m

其中C爲蛋白質/多肽載體且X爲位在該蛋白質/多肽載體上之胺基酸殘基之可衍生化官能基或者是位在任意地共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘 -25- (23) (23)1355390 基之可衍生化官能基，且其中m爲大於〇但小於或等於85 之整數，且其中該肽免疫原-蛋白質/多肽載體共軛物具有如下結構： (Xd——P)n

其中c爲該蛋白質/多肽載體且xd爲位在該蛋白質/ 多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基或者任意地共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化宫能基；P爲肽免疫原分子，其係共價地依附到該蛋白質/多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基上或者依附到任意地共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化官能基上；R爲加蓋分子，其係共價地依附到該蛋白質/多肽載體上之胺基酸殘基之已衍生化官能基上或者依附到任意地共價依附在該蛋白質/多肽載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化官能基上藉以保存該載體之官能性，如此一來該共軛物即可保有引發所需之抗該肽免疫原之免疫反應之能力且若無載體則無法產生該等免疫反應；η爲大於0但小於或等於8 5 之整數，且Ρ爲大於〇但小於85之整數。載體之選擇某些肽免疫原含有引發免疫反應之適當抗原決定部位 -26- (24)1355390 ，但是太小而無法導致免疫。於此等情況下，會將肽免疫原連接到適當的載體上以輔助引發免疫反應。於前文圖式所表示之本發明方法製得之肽免疫原-載體共軛物中C爲蛋白質/多肽載體，該等肽免疫原可直接透過載體本身之胺基酸殘基之已衍生化官能基或者間接地透過共價依附在該載體上之肽連接子之胺基酸殘基之已衍生化官能基而接合在一起。適當的蛋白質/多肽載體之實例包括.但不限於 :白蛋白（.包括人類血淸白蛋白）、匙孔帽貝血淸蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白、破傷風類毒素、來自其它致病細菌且毒性較低之類毒素包括其突變體，如白喉、大腸桿菌、霍亂或H. pylori，或者減毒之毒素衍生物。一種此類載體爲CRM197蛋白質（SEQ ID NO: 40) ，其與白喉毒素有交叉反應。其它的載體還包括T細胞抗原決定部位，其會結合到多個MHC等位基因上如至少75 %所有人類MHC等位基因。此等載體有時在此技術中係以”通用 T-細胞抗原決定部位”爲人所知。具有通用T-細胞抗原決定部位之示範性載體包括： PKYVKQNTLKLAT (SEQ. ID NO. Π) AKXVAAWTLKAAA (SEQ. ID NO. 12) EKKIAKMEKASSVFNV (SEQ. ID NO. 13) FELLTRILTI (SEQ. ID NO. 14) QSIGDLIAEAMDKVGNEG (SEQ. ID NO. 15) 流感血球凝集素：HA·”9 PAN-DR 肽（PADRE 肽）瘧疾CS:T3抗原決定部位 B型肝炎表面抗原:HBsAg]9.28 熱休克蛋白質65>ρ65]53·171 -27- (25)1355390 卡介二氏桿菌（BCG) 破傷風類毒素:TIW844 破傷風類毒素:TT947.967 HIVgpl20Tl: CRM )97 白蛋白片段 QVHFQPLPPAWKL (SEQ.IDNO. 16) QYIKANSKFIGITEL (SEQ.IDNO. 17) NNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ.IDNO. 18) KQI1NMWQEVGKAMY (SEQ.IDNO. 19) 參考序列簡要說明 (SEQIDNO.:40) ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQIDNO: 41)

.可刺激或強化免疫反應且可與肽免疫原或半抗原接合之其它載體還包括細胞因子如IL-1、IL-la及β肽、1L-2 、TlNF' IL-IO、GM-CSF及趨化因子如ΜΙΡ Ια及 β及 RANTES 〇免疫原肽類亦可被連接至！J可增力口組織輸送通透率之蛋白質/肽載體，如 O'Mahon y，WO 97/17163及 WO >· 9 7/ 1 7 6 1 4所述，其皆倂此以供所有目的參考。其它載體還包括重組鏈球菌性C 5 a肽酶、釀膿鏈球菌

•9T

ORF 1 2 2 4 ' ORF1664 及 ORF2452、肺炎衣原體 ORFT367 及 ,ORF T858、生長因子及激素。於本發明一較佳具體例中，該載體蛋白會爲crm197 ，其#爲一種白喉毒素之無毒突變栋且係於初級序列上有一處胺基酸變異。於該分子胺基酸第52位置之甘胺酸由於單一核酸密碼子的變異而被一個麩胺酸所替代。由於此種改變，所以該蛋白質不具有ADP-核糖基轉移酶活性且變得無毒。其分子量爲5 8,4 0 8 Da。CRM,97可根據美國專利第 |6]4; 3 8 2號之方法以重組表現來大量產製，·其倂此以爲參考。將醣類以及肽類接合到 CRM197上之接合作用可透 -28 - (26) (26)1355390 過連接離胺酸殘基之ε -胺基來進行。從多種市售產物可完善地確定0111\4,97爲一種針對Β-細胞抗原決定部位之優良及安全載體。免疫原肽類在此使用時，術語”肽免疫原”或”半抗原”爲任何蛋白質或次單元結構/片段/由.其衍生之類似物，當對哺乳動物投予時其可引發、促進或誘生免疫反應。更詳言之，此術語係用來指稱來自任何來源（細菌、病毒或真核生物）之多肽抗原性決定子，其可使用在此所掲示之方法偶合到載體上。此等多肽免疫原/抗原性決定子可有病毒性' 細菌性或真核細胞來源。來自細菌細胞之肽免疫原包括衍生自細菌細胞表面或分泌蛋白質者，其可用於蛋白質爲主之免.疫原組成物中。舉例用細菌性菌株包括肺炎鏈球菌（•Sirep/ococcwi pneumoniae)，金黃色釀膿葡萄球菌（心少/ococci/5 flwrewi)，表皮葡萄球菌（SiflpA/y/ococcwse/M'i/ermi'i/i··?)，流桿嗜血桿菌（//aewop/W/ws inyVwewzae)，克雷白氏桿菌屬，假單胞菌屬，沙門氏菌屬，志賀氏菌屬，’d//〇/0COCCWi 〇 r / / / ch’ 5及B群鏈球菌屬細菌之細菌。來自病毒之示範性肽免疫原包括舉例來說衍生自人類免疫不全病毒（HI V)、單純疱疹病毒（HSV)、人類乳突病毒 (HPV)、副流感病毒（PIV)、水泡性口炎病毒（VSV)、呼吸道融合病毒（RSV)、EB 病毒（EBV)(Epstein-Barr virus)、 -29- (27) (27)1355390 冠狀病毒、牛痘病毒、輪狀病毒、狂犬病毒、C型肝炎病毒（HCV)及B型肝炎病毒（HBV)g β 舉例用真菌性肽免疫原包括衍生自白色念珠菌 (Candida albicans)、新型隱球菌（Cryptococcus neoformans) '球抱子菌屬（Coccidioides)、組織胞獎菌屬 (Histoplasma)'麴黴屬（Aspergillus)者。寄生蟲性抗原包括了衍生自瘧原蟲屬（Plasmodium)、錐蟲屬（Trypanosome) 、血吸蟲屬（Schistosome)、利什曼原蟲屬（Leishmania)等等者。可被接合到載體上並用在防止、治療、預防或緩和多種人類疾病之免疫療法之真核生物性肽免疫原舉例來說包· 括與腫瘤細胞有關者，衍生自3 9 -4 3個胺基酸之A /5肽者，較佳爲衍生自4 2個胺基酸之A冷肽者，此種A /5肽爲帕金森氏症之特徵斑塊的主要成份（參考 US 4,666,829 ; Glenner & Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 1 20 ： 1 1 3 ] ,Hardy ( 1 984) TINS 20 ： 113 1; Hardy ( 1 977) TINS 20: 154)，其係衍生自澱粉不溶素之澱粉樣肽，一種第Π型糖尿病中胰島細胞製造的多肽物質，衍生自低密度脂蛋白基因產物之肽類，其與動脈硬化有關以及衍生自發炎性細胞因子及生長因子之抗原性肽類如干擾素 6(IL-6)、腫瘤壞死因子α (TNF - α )及GDF-8。此等真核生物性肽免疫原可包括Τ-細胞（CTL)或_ Β-細胞抗原決定部位〇 “CTL抗原決定部位”係一種衍生自有效目標抗原上所 -30- (28) (28)1355390 選定之抗原決定部位區域’如腫瘤相關抗原，包括但不限於腎細胞癌 '乳癌、癌胚胎性抗原、黑素瘤（MAGE)抗原及及前列腺癌特異性抗原如前列腺特異性膜抗原（p s Μ A ) 及前列腺幹細胞抗原（PSCA)、.C型肝炎抗原。 A冷’亦以/3 -澱粉樣肽或A 4肽爲人所習知（參考U S 4,666,829; Glenner & W〇ng5biochem. Biophys. Res. Commun.，120，l]3] ( 1 984))，爲一種 3 9-4 3 個胺基酸之肽類 ’此爲帕金森氏症之特徵斑塊的主要成份。AyS的生成係將較大蛋白質APP用兩種酶（被稱爲万及^分泌酶）加工所製成（參考Hardy，TINS 20，154(] 99 7))。已知與帕金森氏病有關之APP突變係在鄰近冷及r分泌酶作用部位之處或於A冷內部。例如，位置7 1 7係鄰近7分泌酶將APP加工以製成 A《之剪切位，而位置670/67 I則鄰近沒分泌酶剪切位。一般認爲此等突變會與形成A沒之剪切反應相互作用而增加4 2/43個胺基酸形式之AyS量而造成AD。 A /9具有可以固定以及活化典型性及替換性補體級聯之特殊性質。更詳言之，其會結合到 Clq且最後結合到 C 3 bi上。此種結合會促進與巨噬細胞結合且活化B-細胞。此外，C3bi會進一步地分解且然後以T-細胞相關方式結合到B細胞上的CR2，造成此等.細胞的活化提高10,000 倍。此等機制使得A 引起之免疫反應程度超越其它抗原所引起的反應。

A /3具有多種天然形式。人類類型的有39’ A yS 40、A石4 1 ' A 42及 A彡43。此等肽類以及其與APP v -31 - (29) (29)1355390 前體蛋白質間的關係係示於Hardy et a丨.，TINS 2(M55-】58 (1997)之第1圖中。例如AyS 42具有如下序列： H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Aig-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-IIe-Ala-OH (SEQ ID NO. 21).

A β…A β A 39與A冷42差異之處在於於C 端分別略去 Ala，A]a-Ile 及 Ala-Ile-Val。A泠 43 與 AyS42 不同之處在於其C端多了羥丁胺酸之存在。基於多個理由，在.本發明方法中以A泠片段作爲肽免疫原比起以完整分子作爲免疫原更有利。首先，由於在A 召內僅有特定的抗原決定部位會誘生出治療帕金森氏症之有效免疫反應，所以一劑含有此等抗原決定部位之片段比. 起同樣劑量之完整A沒能提供更高莫耳濃度之有效免疫原抗原決定部位。其次，特定的肽免疫原可誘生抗澱粉樣蛋白澱積物之免疫反應，但不會對衍生之 ΑΡΡ蛋白質引發顯著的免疫反應。第三，由於Aj肽免疫原較小，所以製造此等免疫原比製造完整Ayg更容易。第四，完整會凝集在一起但是ΑΘ肽免疫原不會，可簡化與載體製成共軛物的製程。某些A沒肽免疫原具有來自天然肽之至少2' 3' 5、6 、：I 0或2 0個連續胺基酸之序列。某些肽免疫原具有不超過 10、9、8、7、5或3個來自 A々之連續胺基酸。於一較佳具體例中，係使用A点之N端那半作爲肽免疫原來製備共 -32- (30) (30)1355390 軛物。較佳肽免疫原包括1-5、]-6、1-7、1-1〇、卜11 、3-7、1 - 3及]-4。例如A沒1 - 5之標示係指包括A 0 N端之殘基I _ 5之片段。以A /3的N端開始且結束於殘基7 - 1 1 間之殘基之A yS片段爲特佳。亦可使用A卢1 - ] 2之片段但較不好。於某些方法中，該片段爲A)gl-10以外的N端片段。其它的較佳片段還有13-28、15·24、1·28、25-35 、3 5 -4 0、3 5-42以及其它的內部片段及C端片段。本發明某些A点肽爲免疫原肽，其在投予人類患者或動物時所產生之抗體能特異地結合到一或多個A点殘基I 6 到25間之抗原決定部位上。較佳的片段爲六万16-22、16-23、17-23、17-24、18-24及18-25。會特異地結合到 A泠殘基1 6到2 5間之抗原決定部位之抗體能特異地結合到溶解性A石上但不會與A /3斑塊結合在一起。此等類型的抗體可特異性地結合到患者或動物模式循環系統內之溶解性A 召上，但不會特異性地結合到患者或動物模式腦內之A泠澱積物斑塊上。抗體對溶解性A yS之特異性結合可抑制該 A冷被倂入斑塊中，如此便可抑制患者發展出斑塊或者若在治療投藥前已發展出此等斑塊的話亦可抑制此等斑塊進一步長大或再產生的頻率。較佳地，所投予之A召片段宜不含會引發T-細胞反應之抗原決定部位。一般而言，T-細胞抗原決定部位會大於】〇個連續胺基酸。所以較佳的A /9片段爲5-10個連續胺基酸大小，較佳爲7 ·】0個連續胺基酸或最佳爲7個連續胺基酸，即其長度足以引起抗體反應但不會產生T細胞反應。 -33- (31)1355390 不含T-細胞抗原決定部位是比較好的，因爲需此等抗原決定部位就可具有免疫反應且於某者中此等抗原決定部位會引起不良的發炎反 et al.,(2002) J. Immunol. 168,3679-370]： S< Lancet Neurol.1,3) °

以片段A石1 5 - 2 5以及其7 - 8個連續胺基酸佳，因爲此等肽會持續地引發抗A沒肽之高度此等片段包括八/9 16-22、六召16-23'八/9 16· 23、A 冷 17-24、AyS 18-24及 A 沒 18-25。特佳 | 次片段爲長度7.個連續胺基酸之次片段。舉例i 21之表示係指含有之殘基15-2 1但不含A 之片段，且較佳爲7 - 1 0個連續胺基酸長。此等抗體反應且其包括端特異（end· specific)抗體。需將A/3肽免疫原進行篩選以選取出具有澱粉樣澱積活性者（參考 WO 00/72880，其全所有目的參考）。投予 AySN端片段可以誘生及活體外辨識AyS澱積之抗體。於某些方法中至少]個（有時至少5或]0個）天然型式之C 片段。例如，缺乏5個C端胺基酸之Α召4 3片 A冷N端的前3 8個胺基酸。除非另有說明，否則A /3 —詞係包括如上人類胺基酸序列及其它包括等位基因、不同物異型之類似物。類似物一般與天然肽於一、二有所不同，通常係由於保守性取代作用而產生此等片段無 :些次群組患應（Anderson ϊ n i 〇 r (2002) 之次片段爲 :免疫反應。 •24 ' Α β 17-5¾ A yS 1 5-25 A β 15-i 其它殘基片段可引發淸除或預防部倂此以供能於活體內會使用缺乏端胺基酸之段即包括了所述之天然種及誘發變或多處位置。類似物與 -34 - (32) (32)1355390 天然肽間典型地具有至少8 0或9 0 %之序列同—性。某些類似物亦包括非天然胺基酸或者在N端或C端胺基酸之一、二或多處位置有修改。例如，於Ayg之位置】及/或7之天然天冬胺酸可爲異天冬胺酸所取代。非天然胺基酸之實例有D、〇： ' 〇:-取代胺基酸、烷基胺基酸' 乳酸、4-羥基脯胺酸、羧基麩胺酸、£· Ν，Ν，Ν-三甲基離胺酸' ε-Ν-乙醯基離胺酸、〇·磷絲胺酸、Ν -乙醯基絲胺酸' Ν -甲醯基甲硫胺酸、3 _甲基組胺酸、 5·羥基離胺酸、ω -Ν-甲基精胺酸、汐-丙胺酸、鳥胺酸、己胺酸 '戊胺酸、經基脯胺酸、甲狀腺素、7 -胺基丁酸 '高絲胺酸 '瓜胺酸、及異天冬胺酸。免疫原肽亦包括入類似物及其片段。本發明某些治療劑爲全-D肽，如全-D Α汐 '全-D Α冷片段或全-D Ay5或全-D Α沒片段之類似物。可依WO 00/728 80所述，將該等片段及類似物用轉基因動物模式與未治療或安慰劑對照組比較來篩選其預防或治療效能。肽免疫原亦包括較長多肽，其包括例如一種含有A召肽及其它胺基酸之免疫原多肽。例如，較佳的免疫原多肽可爲將A点片段連接到一段異源胺基酸序列之融合蛋白質，其可引起抗該異源胺基酸序列之輔助者T-細胞反應且藉此產生抗該A/3片段之B-細胞反應》可依WO 0 0/7 2880 所述，將此等多肽置於轉基因動物模式中與未治療或安慰劑對照組比較來篩選其預防或治療效能。該等A Θ肽' 類似物、免疫原片段或其它多肽可採分 -35- (33) (33)1355390 b女或凝集形式來投藥。分散型或其片段意指單體型肽單元。分散型AA或其片段一般係可溶的且可自行凝集成可溶性寡聚物、原纖維絲及A D D L s。A冷或其片段之寡聚物通常具可溶性且主要呈α_螺旋狀或隨機盤捲型。凝集型ΑΘ或其片段係指Α沒或其片段之寡聚物結合成不溶性々-片狀組合。凝集型Α沒或其片段亦指纖維狀聚合物。纖維絲通常不可溶。某些抗體會結合到溶解性Α石或其片段或凝集型Α/3或其片段中之一者。某些抗體會同時結合到溶解性Α冷或其片段及凝集型a召或其片段兩者上。免疫原肽亦包括免疫原肽單體之多聚體形式。Af肽以外之其匕免疫原肚應可引發對抗一或多種如上列示之較佳A/3片段（如A/S 1-3、17…1-1〇及3-7)之免疫反應。本發明之免疫原肽係使用本發明之方法連接到載體上而形成共軛物。該免疫原肽可用其胺基端 '其羧基端或兩者連接到載體上來形成共鞭物。任意地，在共鞭物中可存在該免疫原肽之多個複本。 A冷的N端片段可用其C端連接到載體肽上來形成共軛物。於此等共軛物中’該片段的N端殘基會構成該共軛物的N端殘基。據此，此等共軛物有效誘生之抗體所結合之抗原決定部位爲需要A万之N端殘基呈游離形式之部位。本發明某些免疫原肽含有多個AyS-N端片段複本，其係以其C端連接到一或多個載體肽複本上以形成共軛物。合倂到此等共軛物中之A汐-N端片段有時係以a召 ]-3 開始且以 A /3 7 - Π 結束。A /3 ] - 7、] - 3、] - 4、】-5 及 3 - 7 -36- (34) (34)1355390 爲較佳之 AyS-N端片段。有些共軛物含有不同的AyS-N 端片段且縱排成列。例如，一共軛物可含有A ^ 1 - 7接著爲Α石1-3然後連接到載體上。於某些共軛物中，A召-N端片段係用其N-末端連接到載體肽上。同樣種類之A ^ -N端片段可如C端鍵結般使用。某些共軛物含有載體肽且連接到 AyS-N端片段之 N -末端，其然後呈縱.排地連接到一或多個額外的 A召-N 端片段上。較佳地此等免疫原片段在接合到適當的載體後所引發之免疫反應係特異地針對該Αβ片段而不會對其它ΑΘ片段有反應.。本發明之免疫原肽包括異源性免疫原肽。於某些免疫原肽中’係將Α万片段連接到載體上以形成異源性免疫原肽。此等異源肽係使用本發明方法連接到載體上以形成共軛物。一些此等異源性免疫原肽所含A石片段係連接到破傷風類毒素抗原決定部位上，如US 5，]96,5]2 , ΕΡ 3 7 8，S81 ’及ΕΡ 427:3 47號所述。任意地，—段免疫原肽例如可利用載體的N末端及C末端兩者來連接到—或多個載體複本上以形成該異源性免疫原肽。其它此種異源性免疫原肽還包括如U S 5,7 3 6，I 4 2所述之連接到載體肽上之 A沒片段。例如’一段異源性免疫原肽可含有a石】_7接著爲A/5 1-3然後爲載體。此等異源性免疫原肽之實例包括 A冷1-7/破傷風類毒素830-844 + 947-967呈線性構型 -37- (35)1355390 Αβ 1-7碰傷風類毒素830-844 + 947-967皆呈線性構型

DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEO Π) Ν〇.:24) 述於US 5,736,]42之肽(皆呈線性構型） PADRE/Αβ 1-7: AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD (SEQ ID NO. :26) Αβ1-7 x 3/PADRE:

DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-AXXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO. :27) PADRE/A31-7x3: AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO. :2 8) ΑβΙ-7/PADRE: DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO.:29) Αβ1-7/白蛋白片段： DAEFRHD-1SQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO.:30) Αβ4-10/白蛋白片段： FRHDSGY-1SQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO.:31) Αβ3-9/白蛋白片段： EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO.:32)

ΗΑ3〇7.3ΐ9/Αβ].7 X 3： PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO.:33) Αβ].7/ΗΑ307-3)9/Αβ].7： DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD (SEQ ID NO.:34) Αβι_7Χ 3/HA3C7.319· DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO.:35) Αβ].7Χ 2/HA307-319： DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO.:36) Αβ].7/ΗΑ3〇7·3]9/ 瘡疾 CS/TT830-M4/丁丁Μ7-967/Αβ】.7 -38- (36) (36)1355390 DAEFRHD-PKYVKQNTXKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV-QYIKANSKPIGITEL· FKWTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (SEQ ID NO.:37) Αβ]，7 X 3/TT830-8WC/TT947-967 DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKPIGITEL-C-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO.:38)

Ap].7/TT830-8WC/TT947-967 DAEFRHD<)Y1KANSKF1G1TELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ IDNO.:39) APj_7/TT83〇-g44/C/TT947-967/Ap].7

DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C-FNNFTVSFWLRWKVSASHLE-DAEFRHD (SEQIDNO.:20) 某些異源性免疫原肽包含免疫原肽之2X多聚體，其中X爲1-5之整數。較佳地X爲1、2或3，以2爲較佳。當 X爲2時，此等多聚體有4個免疫原肽以被稱爲MAP4之較佳構型連接著（參考US 5,229,4 90號）。然後可使用本發明方法來將此等免疫原肽連接到載體上以形成共軛物。該MAP4構型顯示如下，其中該分支結構係在離胺酸的N端及側鏈胺兩者同時引發肽合成作用而造成的。視將離胺酸倂入序列且令其分岔之次數而定，所產生的結構可具有多個N末端。於此實例中，在含有離胺酸之分支核上可製造出四個同樣N -末端。此等多重性大幅增強了關聯B細胞的反應性。

-39- (37)1355390 此等免疫原異源肽之實例包括： Αβ 1-7/破傷風類毒素83〇-844呈MAP4構型： DAEFRHD-QY1KANSKFIGITEL (SEQ ID NO.:22) Αβ 1-7/破傷風類毒素947-967呈MAP4構型： DAEFRHD-PNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO.:23) Αβ 3-9/5皮傷風類毒素830-844呈MAP4構型： EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO.:25) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL 於 2 分支樹脂上肽肽

Lys-GIy-Cys

該 A yS肽、類似物、活性片段或其它多肽可採組合或多聚體形式或分散形式來投藥。治療劑亦包括了單體性免疫原藥劑的多聚體。ΑΘ肽以外的治療劑應引發抗一或多種前文所述之較佳AyS片段（如卜10、1-7、1-3及3-7)之免疫反應，且可使用本發明方法接合到載體上。較佳地，此等治療劑一旦被接合到適當載體上，即可引發特異地抗此等片段之免疫反應但不會對其它A0片段產生反應。爲了 β 促進肽免疫原及載體之接合作用，可將額外的胺基酸加到該抗原性決定子的末端。此等額外的殘基亦可用來修改該肽免疫原之物理或化學性質。可在該肽免疫原的C或N 末端引入胺基酸如酪胺酸、半胱胺酸、離胺酸、麩胺酸或天冬胺酸等。此外，還可引入含有胺基酸如甘胺酸及丙胺酸之肽連接子。另外，該抗原性決定子可經由末端NH2-基乙醯化如烷醯基（cn-C2〇)或硫甘醇基乙醯化或用氨 '甲胺等將末端·菝基醯胺化來加以修改而與天然序列有所不 -40 - (38) (38)1355390 同。於某些例中，此等修改可提供用來連接撐體或其它分子之部位。以在此所揭示之過程產製本發明共軛物所用之肽免疫原係透過鍵結來組合一成聚合體（多聚體），或者可無需鍵結而用混合形式來配方成組成物。當肽被連接到同一種肽上形成同聚合體時，則在聚合體上會出現複數個重覆的抗原決定單元。例如，使用多抗原肽（Μ P A)技術可建構出含有 CTL及/或抗體肽及肽兩者之聚合體。當肽有所不同時，像是如雞尾般之不同病毒亞型時，在該亞型內會有不同的抗原決定部位 '不同的HLA限制酶特異性，如此便可提供含有T-輔助者抗原決定部位之肽類、具有重覆單元之雜聚合體。除了共價鍵結以外，本發明亦包括可形成分子間及結構內鍵結之非共價性鍵結。此等肽免疫原及其類似物可用固相肽合成法或重組表現法來合成，或從天然來源取得。自動肽合成器可從多種供應商如 Applied Biosystems，Foster City,California 購得 ο 重組表現可在細菌（如大腸桿菌）、酵母菌、昆蟲細胞或哺乳動物細胞中進行。重組表現之步驟係述於 Sambrook et al.，Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press:NY,2nd ed·,1989) » 某些免疫原肽亦可商業取得（如 American Peptide Company,Inc. Sunnyvale:CA:及 California Peptide Research.Inc..Napa. CA) ° -41 - (39) (39)1355390 亦可在肽或其它化合物之隨機庫中篩選出適合作爲肽免疫原者。亦可使用許多類型之化合物來製成組合庫，其係採一步一步的形式合成的。此等化合物包括多肽、石-旋轉模仿劑、激素、寡聚性取代甘胺酸、寡聚胺基甲酸酯等。諸化合物之大型組合庫亦可使用述於 WO 95/ 1 2 608 ' WO 93/06 1 2 1、W094/0805 1、WO 95/3 5 5 03 及 WO 95/30642(皆倂此以供所有目的參考）編碼合成庫（ESL) 法來構築。肽庫亦可使用噬菌體顯示法來產生（參考例如 Devlin，WO 9 1 / 1 8 9 8 0)。將免疫肽衍生化且接合到蛋白質載體上用來把肽免疫原依附到蛋白質/多肽載體之部位以及把肽免疫原依附到該載體上之交聯劑的特性兩者對於其所誘生之抗體的特異性十分重要。爲了讓該免疫原能正確地被辨識出來’該肽免疫原必需以適當的方向偶合到該載體上。接下來爲了讓抗體辨識出沒有載體之游離肽免疫原部份’該肽免疫原-蛋白質/多肽載體共軛物必需用顯露及可接近形式來呈現該肽免疫原。將交聯反應導向肽免疫原的特殊部位通常可以達到最佳的方向性。—種以肽免疫原達成此目的的方法爲在肽合成期間於末端加上一個半胱胺酸殘基。如此便可在肽的一端提供氫硫基以供載體接合。透過此基團交聯可以使得該肽免疫原僅用一端依附，如此即可確保恆定的方向性。於肽免疫原-載體接合作用中，其目標並非維持該載 -42 - (40)1355390 體之天然態或穩定性，而在於以最佳方式呈現以供免疫系統辨識。爲了達到此目標，接合化可控制所產生之抗該半抗原抗體之效價、親和。在某些例子中很重要地必需選取一種交聯劑頭臂必需長得足以非限制地呈現該抗原。控制免疫原之密度也很重要。肽免疫原取代太少可微弱反應，甚至無法反應。事實上肽免疫原密會造成免疫抑制作用且降低反應。此外，交聯能會引起不必要的免疫反應。必需考慮此等因選擇時不僅要選擇適當的交聯劑，還要選擇適 /多肽載體與肽免疫原比例。可以使用多種方法來將該蛋白質/多肽載肽免疫原上。可透過末端或者離胺酸之ε -胺子性交互作用。也可以透過殘基側基團與肽免鍵鍵結來進行。最後，蛋白質/多肽載體與免結構交互作用亦可產生穩定的依附作用。可使用多種交聯劑如零長度交聯劑、同雙或異雙官能交聯劑來成功地產生肽免疫原-載在生物性接合作用中可用的最小反應劑系統被交聯劑。此等化合物可透過在兩分子間形成鍵入額外原子來媒介兩分子的接合。所以係以分原子來作爲連接子。在許多接合計劃中，最後本上係在交聯物質中加入外來結構來把此等化在一起。於某些應用中，此等介入連接子之存出該半抗原學的選擇就力及特異性，其所含接載體表面肽能只能引起度過高可能劑本身也可素，所·以在當的蛋白質體依附到該基來進行離疫原間的氫疫原肽間的官能交聯劑體共軛物。稱爲零長度結且並未加子內的一個的複合體基學成份交聯在對於所需 -43 - (41) (41)1355390 用途具有決定性。例如，在製備肽免疫原-載體共軛物時 ’所形成的複合物則是要用來引發抗所附半抗原之免疫反應的。有時候，有一部份免疫反應產生之抗體會對接合過程所用之交聯劑具有特異性。零長度交聯劑係在兩物質間媒介直接的鍵結作用’便能消除此類型交叉反應的可能性〇同雙官能反應劑其爲最先被用來修改及接合巨分子之交聯劑’係由兩端含有相同官能基之雙反應性化合物所組成（Hartman and Weld, 1 966)。此等反應劑係藉著與兩分子上的共同之相同基團共價反應來把一蛋白質連接到另一者上。所以可簡單地將兩種蛋白質與同雙官能反應劑混合在一起，而使得一蛋白質上之離胺酸ε-胺基或N-端胺與第二種蛋白質上相同官能基交聯在一起。異雙官能接合反應劑則含有兩種不同的反應性基團，其可與蛋白質及另一巨分子上不同的官能基標的偶合在一起。例如，一部份載體交聯劑可含有胺·反應性基團，另一部份則含有硫氫基-反應性基團。其結果使得該反應劑具有針對標的分子所選定部份進行交聯反應的能力，如此可對該接合過程有更佳控制。異雙官能反應劑可用兩步驟或三步驟方式來交聯蛋白質及其它分子，如此便可限制聚合的程度，此爲使用同雙官能交聯劑常產生的狀況。近來已有許多方法可用零長度、同雙官能或異雙官能交聯劑來將肽免疫原偶合到蛋白質/多肽載體上。多數方 -44 - (42) (42)1355390 法會形成胺、醯胺、胺基甲酸酯、異胺基甲酸酯或二硫化物鍵結，有時則會形成硫醚鍵結。將蛋白質或肽偶合到肽上的最常用方法爲使用雙官能交聯劑。此爲兩端具有活性基團之小型接頭分子。該等接頭分子在兩端各具有相同或不同的活性基團。最常用的活性官能基團、偶合基團及所形成的鍵結爲： 1 .醛·胺基-次級胺 2 .馬來醯亞胺-硫氫基—硫醚 φ 3. 琥珀醯亞胺-胺基—醯胺 4. 亞胺酸鹽-胺基—醯胺 5. 苯基疊氮化物-胺基—苯基胺 6. 酿基齒-氯硫基~^硫酸 7 .吡啶基二硫化物-氫硫基—二硫化物 8.異硫氰酸鹽-胺基—異硫特定載體蛋白質之反應性，換句話說爲其用交聯劑修改來接合到肽免疫原的能力，係由其胺基酸組成、個別胺 φ 基酸在分子三級節構中的序列位置、以及肽免疫原之胺基酸組成所決定。在位於蛋白質/肽載體及其它肽（如蛋白質/肽載體及肽免疫原）間的連接子（“ L ”）之例中，此等連接子典型地係選自 Ala' G]y或其它非極性胺基酸之中性連接子或中性極性胺基酸。於特定具體例中，該中性連接子爲Ala。應瞭解地任意存在之連接子不需要係由同樣殘基所組成且所以可爲異寡聚體或同寡聚體。示範性連接子包括A ] a之同寡 -45- (43) (43)1355390 聚體。當存在時，該連接子通長有至少一或兩個殘基長，最常見爲二到六個殘基長。於其它具體例中，該蛋白質/ 多肽載體係被接合到肽免疫原上，較佳係以胺基端與該蛋白質/肽載體接合在一起。該等肽可用中性連接子如AU-Ala_Ala等連接在一起’較佳地進一步含有—個依附在離胺酸（Lys)殘基之〇：及ε胺基酸上之脂質殘基如棕櫚酸等 ((P A Μ ) 2 L y s)，其典型地係經 S e r - S e r鍵結等依附到該肽共軛物之胺基端。 φ 於本發明某些態樣中，該肽免疫原爲一種選自Α β ]· 5-L、Α 冷卜7-L、Α/3 卜9-L 及 1-12-L 之 Α/3 片段。於本發明某些態樣中，該連接子爲GAGA (SEQ IN NO: 10) ο 爲了促進肽眼免疫原與載體之接合作用，可將額外的胺基酸加到該抗原性決定子之末端。該額外的殘基亦可用來修改該肽免疫原的物理或化學性質。可將胺基酸如酷胺酸、半胱胺酸' 離胺酸、麩胺酸或天冬胺酸等引入該肽免 φ 疫原的C -或Ν -末端。此外’還可引入含有胺基酸如甘胺酸及丙胺酸之肽連接子。另外，該抗原性決定子可經由末端ΝΗί-基乙醯化如烷醯基（C1-C20)或硫甘醇基乙醯化或用氨、甲胺等將末端-羧基醯胺化來加以修改而與天然序列有所不同。於某些例中，此等修改可提供用以連接撐體或其它分子之部位。於本發明某些態樣中，該肽免疫原爲一種選自k β \ · 5-C' Α 召】-7-C' Ajg 1-9-C 及 A/9 ]-]2-C 之 Α冷片段，其 -46- (44) (44)1355390 中C爲半胱胺酸殘基。於本發明某些態樣中，該肽免疫原爲一種選自八召1-5-1^-(：、八/3 1- 7-1^(：'六冷1-9-1^(：及八 yS ] -12-L-C之A召片段。該等肽免疫原係直接地或經由位於該肽免疫原之胺基或羧基末端之連接子來連接到該蛋白質/肽載體上。該肽免疫原或該蛋白質/肽載體之胺基末端可被乙醯化。此外，該肽免疫原-蛋白質/肽載體共軛物可經由一或多個接頭殘基如下文所述之Gly、Gly-Gly、Ser、Ser-Ser來連接到 g 特定烷醯基（Cl-C20)脂質上。其它有用的脂質基團還包括膽固醇、脂肪酸等。肽免疫原可藉著化學交聯來連接到載體上。將免疫原連接到載體上之技術包括使用N -琥珀醯亞胺基· 3 - (2 -吡啶基-硫）丙酸酯（SPDP)(Carlssonm J et al.( 1 978) biochem J:173 : 72 3 )，及琥珀醯亞胺基4-(Ν·馬來醯亞胺甲基）環己院-】-殘酸醋（SMCC)(若該肽缺乏氫硫基，可藉由在半抗原上添加一個半胱胺酸來提供。此等反應劑可在彼此間及蛋 φ 白質上的肽半胱胺酸殘基間形成二硫化物鍵結及透過離胺酸上的ε -胺基或其它胺基酸上的它種游離胺基來形成醯胺鍵結。多種此等二硫化物/醯胺形成反應劑係述於 Immuno. Rev. 62 ： 85 (1982)中。其它雙官能偶合劑則會形成硫醚而非二硫化物鍵結。該等硫醚形成劑包括5 ·馬來醯亞胺己酸、2-溴乙酸及2-碘乙酸' 4-(N-馬來醯亞胺甲）機環己烷-1-羧酸之反應性酯。該等羧基團可藉由將其與琥珀醯亞胺或]-羥基-2 ·硝基-4 -硫酸鈉鹽結合來被活化。 -47- (45) (45)1355390 最常見地’離胺酸爲載體蛋白質上數量最多的胺基酸殘基’且此等殘基可用交聯反應劑來修改而生成親核性部位’其而後可被偶合到半抗原上。此等偶合作用係透過化學活化之半抗原分子上任何一個親水部位來進行。其包括舉例來說有精胺酸之胍基'麩胺酸及天冬胺酸之羧基'半胱胺酸之氫硫基、及離胺酸之ε-胺基酸。修改蛋白質使其得以與其它基團偶合之修改作用可使用交聯劑來達成，該交聯劑可與蛋白質載體或半抗原分子的任一側鏈反應。於本發明一態樣中，具有或不具有接頭分子之載體蛋白質可用能將反應性部位引入載體蛋白質分子之反應·劑來官能化（衍生化），其可被進一步修改而引入親核性基團。於一具體例中，該載體係與鹵乙醯化劑反應，該反應劑較佳地會與多種蛋白質胺基酸殘基上的官能基如半胱胺酸的氫硫基、離胺酸殘基的初級ε -胺基團、α -胺之α末端、甲硫胺酸之硫醚及組胺酸之兩個咪唑醯基側鏈之氮原子來反應（Gur<M967)。於一較佳具體例中，該載體蛋白質之離胺酸殘基上之初級ε -胺基係用b N -羥琥珀醯亞胺基溴乙酸酯來衍生化以生成溴乙醯化載體。肽免疫原及已活化蛋白質載體之接合係藉由將已活化載體緩慢地加到含有該肽免疫原之溶液中來進行。藉由使用本發明方法，可將文中B部份討論之肽免疫原與任何文中A部份討論之載體接合在一起。從本發明方法製成的共軛物會被用來當作被動/活性預防接種治療中之免疫原以誘生抗A石-抗體之產生。進一步地，連接 -48- (46) (46)1355390 到載體上之六万或Α;β·片段可被投予至實驗動物以製造抗A"之單株抗體。於本發明一態樣中，該共軛物爲選自 Ay3 1- 7- CRMi97 ' (A 冷 1-7 X 3)-CRM|97&(A 泠 1-7 X 5)-CRM197之共軛物。於本發明另一態樣中，該共軛物係選自C R Μ , 9 7 - A万〗-5、 CRM】97-A/3 1-7、CRM197-A 召 1-9 及 C R Μ ! 9 7 - A 冷 1 -1 2。於本發明另一態樣中，·該共軛物係選自A泠1 - 5-C-CRM197、 Α β I-7-C-CRM197 ' A β l-9-C-CRM,97 > A β 1-12-C-CRMi97' A β 16-23-C-CRM,97' A β 17-24-C-CRMi97' A β 1 8-25-C-CRM,97 ' CRMj97-C-A/3 16-23 ' C RM , 9 7 · C - A/3 17-24 ' CRMi97-C-Ayg 18-25 ' k β l6-22-C-CRM,97 ' A β 17* 23-C-CRMi97 ' A β 18-24-C-CRM.197 ' CRMJ97-C-A^ 16-22 、CRM】97-C-A 泠 17-23、CRM197-C-A ^ 18-24。於本發明再一具體例中，該共軛物係選自A；5l-5-L-C-CRM197、A 泠 1 - 7 · L - C - C R Μ 】9 7、a /5 卜 9 - L - C - C R Μ , 9 7 及 A /9 1 · I 2 - L - C -C R M j 9 7 〇加蓋使用能將反應性部位引入載體上及/或半抗原分子上之反應性胺基酸分子側鏈之偶合劑之一項缺點爲：若反應性部位未經中和則其可在活體外或活體內與任何不良分子自由反應。於本發明方法中，未反應官能基之加蓋可藉由讓具有突出反應性基團之共軛物與可將該等反應性基團鈍化/加蓋之反應劑反應來進行。可用於本發明接合過程之 -49- (47)1355390

鈍化/加蓋反應劑之實例有半胱胺、N-乙醯基半胱胺 '及乙醇胺。另外，加蓋可藉著與氨或碳酸氫銨反應來進行，任一者皆可將鹵乙醯基轉變成胺乙醯基。加蓋亦可藉由氫氧化鈉或碳酸鈉以鹼性pH値（9.0-9.8)來進行，其鹵乙醯基轉變成羥乙醯基《相對於與半胱胺衍生物、乙醇胺等反應，將鹵乙醯基轉變成胺乙醯基或羥乙醯基的一項潛在優點爲與氨或氫氧化物/碳酸鹽反應時可引入體積較小之化學官能基團。如此產生之加蓋官能基如胺乙醯基或羥乙醯基可對共軛物的載體部份造成相對較小的干擾性》可依需要使用已知方法來純化加蓋之肽免疫原·載體蛋白質，此等方法如層析（膠過濾、離子交換、厭水性交互作用或親和力）' 透析、超過濾-通透過濾、使用硫酸銨或醇類作選擇性沉澱等。免疫原共軛物及組成物該加蓋肽免疫原-載體蛋白質共軛物係以免疫原組成鲁物之形式來投予至哺乳動物，特別是人類以供預防及/或治療。本發明共軛物可用來引發及/或增強抗該等免疫原之免疫反應。例如，CTL -載體共軛物可用來治療及/或預防病毒感染，澱粉樣變性病、癌症等。另外，亦可使用會誘生抗體反應之肽免疫原-載體共軛物。可使用本發明共軛物治療之疾病的實例包括不同細菌性感染、病毒性感染、真菌感染、寄生蟲感染及癌症。於治療性應用中’本發明之共軛物係投予至已患有源 -50- (48)1355390 粉樣變性病如阿茲海默氏症、癌症或病原個體。此等處於疾病培育期或急症期之患發明之共軛物或配合其它適當療法來治療於治療性應用中，可將本發明之免疫患者，其份量係足以引起抗該澱粉樣斑之或體液反應，以治癒或至少部份地遏阻疾 /或倂發症。足以達到此等目的之份量被孝量”。可有效達到此用途目的之份量部份、投藥方式、欲治療疾病之階段及嚴重性般健康狀態、及處方醫師的判斷來決定。在治療性或預防性投藥作初次預防接原組成物之治療有效劑量一般的範圍爲對予約0.1//g到約10,000eg肽，通常爲0. 更佳爲約〇.]到約5000# g且最佳爲0.1到糸予此等劑量之後，視患者反應及所測得特情況而定，在數週或數個月後的追加促升之追加劑量爲約〇 · 1 Αί g到約1 0 0 0 // g肽。進一步地，本發明可預防性地使用細菌性感染、病毒性感染、真菌感染、寄變性病及癌症。有效劑量如前所述。此外將瞭解如何適當地調整或修正預防療法，升投藥及調整投藥劑量及投藥計劃。治療性投藥可在首次出現疾病徵兆或去腫瘤後或在診斷出急性感染後於短時間性微生物感染之者可個別使用本〇原組成物投予至 .有效CTL反應病進程、症狀及 g爲”治療有效劑將視該肽組成物、患者體重及一種時本發明免疫 70公斤患者可投 1 至!1 約 8 0 0 0 v g， 51000 /zg。於投異性免疫反應之投藥計劃中所用又防止及/或緩和生蟲感染澱粉樣，熟悉此技術者例如使用追加促偵測到或手術除內便開始進行。 -51 - (49) (49)1355390 然後接著進行追加投藥直到疾病病程停止或逆轉或症狀減輕一段時期。於慢性感染時’可能會需要在開始時先使用高劑量投藥接著再進行追加投藥。以本發明組成物來對感染個體進行治療時’可促進急性感染患者感染消退。對於易於轉變成（罹患）慢性感染之個體，本發明組成物可特別地用來防止病症從急性轉成慢性。例如正如同在此所述般，在感染前或感染期間確認出易感染者後若使用本發明組成物對他們投藥.，可使得用本發明組成物對更大族群投藥的需求降到最小。本發明共軛物亦可用來治療慢性感染及刺激免疫系統以消除潛伏性感染個體體內受病毒感染之細胞。極重要地需提供足夠份量的本發明免疫原組成物及投藥模式以以有效引發或加強免疫反應。所以在進行慢性感染的治療時，對於一名7 0 k g的患者而言每劑的代表性劑量爲約〇 .]以g 到約1 0 ; 0 0 0 μ g肽’通常爲〇 . 1到約8 0 0 0 // g，更佳爲約〇 . 1 到約5 Ο Ο Ο μ g且最佳爲0 ·]到約1 0 〇〇 μ g。爲了對個體長期且有效地免疫，可能會需要在一段既定時間如1到4週的時間以追加劑量來免疫投藥。於慢性感染的情形下，應持續投藥直到至少臨床徵狀或實驗性測試顯示已除掉或基本上已削弱病毒性感染一段時間爲止。本發明治療或預防治療用之免疫原組成物可非經腸' 局部、靜脈內、經口、皮下 '經動脈、顱內、腹腔內 '鼻內或肌肉內途徑來作預防性或治療性處理。免疫原劑投藥的一種典型途徑爲經皮’不過其它途徑同樣有效。其它常 -52 - (50) (50)1355390 用的途徑爲肌肉內注射。此種類型的注射常在手臂或大腿肌肉內進行。於某些方法，藥劑會直接注射到澱積物累積的特殊組織，例如顱內注射。投予抗體時較佳係使用肌肉內注射或靜脈內灌注。於某些方法中，係將特殊抗體直接注射到顱內。基於投藥的容易性，本發明免疫原組成物特別適合口服投藥。本發明進一步提供一種非經腸投藥的免疫原組成物，其含有肽或共軛物之溶液，溶於或懸浮於一種可接受載體，特別是水性載體內。有多種稀釋劑、賦形劑及緩衝液可使用，例如水、緩衝水 '磷酸鹽緩衝鹽水、〇 . 3 %甘胺酸、玻璃酸等。此等組成物亦可用傳統習知消毒技術來滅菌或可過濾滅菌。產生之水溶液可就此分裝使用或者被冷凍乾燥，該等冷凍乾燥製劑可在投藥前與無菌溶液合倂。此等組成物可含有接近生理條件需要之藥學可接受輔助物質，如緩衝液、肌肉彈性調整劑、濕化劑等，如醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、單月桂酸山梨聚糖 '油酸三乙醇胺等。固體載劑中可使用習知的無毒載劑。其可包括例如藥用級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖 '碳酸鎂等。口服投藥之藥學可接受無毒組成物可藉由倂入任何常用賦形劑例如先前列示之賦形劑以及一般爲10-95%之活性成份（即本發明一或多種共軛物）且更佳爲濃度2 S 7 5 %之活性成份來製成。在藥學調合物中本發明免疫原組成物之濃度變化極大，可從低於約0 ·]重量％，到通常爲約2重量％或更少，到 -53- (51) (51)1355390 多達2 0重量％到5 0重量％，且將依所選用之特殊投藥模式主要根據流體體積、黏度等來選用。本發明共軛物亦可經由脂質體來投藥，該脂質體可將共軛物瞄準特殊組織如淋巴組織或瞄準感染細胞來投予，且可增加該肽組成物之半衰期壽命。脂質體包括乳液、泡沬、膠粒、不溶性單層體 '液態結晶、磷脂質分散液 '單層體等。於此等製劑中，欲運送之組成物會被合倂成脂質體的一部份，其可單獨存在或與一種能與大量存在於淋巴 φ 細胞內之受器相結合之分子接合在一起。此等分子包括能與CD45抗原結合之單株抗體，或者以及其它治療性或免疫原組成物。所以，裝塡有本發明組成物之脂質體可針對淋巴細胞部位來運送所選用之治療性/免疫原性肽組成物。用於本發明之脂質體係由標準囊泡形成脂質所形成，其 —般包括中性及帶負電磷脂質及固醇如膽固醇。脂質的選用一般要考慮脂質體大小、酸不穗定性及脂質體於血流中的穩定性來決定。多種方法可用來製備脂質體，如述於 φ Szoka e t a 1.. A η η . Rev . Biophys. Bioeng. 9 : 4 6 7 ( 1 980)，美國專利第4,235,871、 4:501,728、 4,873,028及 5，019:369 號皆倂此以爲參考。爲了瞄準免疫細胞，合倂在脂質體中之配體可包含對所需免疫系統細胞之細胞表面決定子具特異性之抗體或其片段。含有本發明組成物之脂質體懸浮液可經靜脈 '侷限性地或局部性地投藥，且其劑量將視投藥方式、所運送之組成物及所治療疾病之階段而有所不同。 -54 - (52) (52)1355390 在以氣霧劑投藥時，本發明組成物較佳呈細分形式與一種界面活性劑及推進劑一起供應。該組成物典型的比例爲0.020重量％，較佳爲卜10重量％。當然，該界面活性劑必需無毒且較佳地溶於推進劑中。此等化學劑的代表爲含有6到22個碳原子之脂肪酸酯類或部份酯，如己酸 '辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸' 油硬脂酸、油酸以及脂族多氫醇或其環狀酐。可採用混合酯如混合或中性甘油酯。該界面活性劑可構成〇.]-20重量％之組成物，較佳爲0.2 5 - 5重量°/。。組成物之平衡劑通常爲推進劑。若有需要可包括載體與卵磷脂以作鼻內投藥。本發明組成物亦可用來製造單株抗體。此等抗體亦可用來作爲有效的診斷或治療劑。本發明組成物亦發現到具有作爲診斷性試劑的用途。例如，本發明組成物亦可用來測定採用多肽免疫原之特殊個體對治療計劃之感受性，且如此有助於修改既定治療方案或測定一感染個體之預後情形。此外，本發明組成物亦可用來預測個體發展出慢性感染之基本風險。. 本發明之共軛物可任意地組合至少部份有效地治療及 /或緩和疾病及/或其症狀之其它藥劑來投予。於澱粉樣澱積係發生在腦部之阿茲海默氏症及唐氏徵候群之例中，本發明共軛物可組合得以增加本發明藥劑通過血腦屏障之通透性之其它藥劑來投予。該免疫原組成物典型地含有佐劑。佐劑爲一種與免疫原或抗原一起投藥時可加強免疫反應之物質。多種細胞因 -55- (53) (53)1355390 子及淋巴因子已顯示出具有免疫調節功能，所以可用來當作佐劑，包括但不限於白介素1 - a、1 -点、2、4、5、6、 7、8、10、12(參考美國專利第 5,723，]27號）、]3、14' 15 、16、17及18(及其突變型），干擾素〇： '召及τ ，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（參考例如美國專利第5507 8,996 號）、巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子、CSF 、及腫瘤壞死因子α及Θ。可用於本發明之其它佐劑還有趨化因子，包括但不限於 MCP-1、ΜΙΡ-1α、MIP-Ιβ及 RANTES。黏附分子如選凝素像是L-選凝素' ρ-選凝素及 Ε-選凝素亦可用來當作佐劑。其它可用的佐劑包括但不限於類黏蛋白分子，如CD34、GlyCAM-Ι及MadCAM-Ι、整連蛋白家族之一員如1^八-1'¥1^-1、1^(：-1及]31 50.95, 免疫球蛋白超族之一員如PECAM'ICAMs如I.CAM-1、 ICAM-2及ICAM-3 ’ CD2及LFA-3，共刺激分子如CD40及 CD40L '生長因子包括血管生長因子、神經生長因子 '成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、B7.2、PDGF、 BL-1、及血管內皮細胞生長引子、受器分子包括Fas、 TN F 受器 ' F】t、Apo-1、ρ 5 5 ' WSL-1 ' DR3' TRAMP' A p o - 3、AIR、LARD、NGRF、D R 4 ' DR5 ' KILLER、 TRA1L-R2 ' TRICK2及 DR6。其它佐劑分子還包括 Caspase(ICE)。亦可參考國際專利公告第 w〇98/】7799及 W09 9/43 8 3 9號，其全部倂此以供所有目的參考。

可用來增強免疫反應之適當佐劑包括但不限於 MPLtm(3-0-去醯基單磷醯基脂質 A; C〇rixa5Hamni〇»;MT -56- (54) (54)1355390 )’其係述於美國專利第4,9 1 2,094號且該專利倂此以爲參考。同樣適合用來作爲佐劑的還有合成性脂質A類似物或fee院基葡糖胺碟酸醋化合物（AGP)、或其衍生物或類似物，其可取自 Corixa(Hamilton,MT)且係述於美國專利第 6，113,918號，其倂此以爲參考。—種此類AGP爲2-[(R)- 3-十四烷醯氧基十四烷醯胺基]乙基2·去氧·4·〇_膦- 3_〇· [(S)-3-十四院醯氧基十四院酿基]-2-[(R )-3-十四院酿氧基-十四烷醯胺基]-b-D -吡喃葡糖式试，其以529爲人所習知（亦以RC529爲人所知；Corixa)。此種529佐劑可被配方成液體形式（529AF)或穩定的乳液（529SE)。其它的佐劑還包括礦物油及水乳液，耗鹽如憐酸鈣、金呂鹽（如明攀）如氣氧化銘' 隣酸纟g等，安福精（Amphigen): 艾福黎汀（Avridine)、L121/鯊烯、D -交酯-聚交酯/甙、 pluronic酸、多元醇、胞壁醯二肽、死亡的博代氏桿菌、皂苷 '如 StimulonTM QS-21(Antigenics, Framingham:MA)，其係述於美國專利第55〇5 7,54 0號且該文件倂爲參考資料3以爲參考，及由其製成的顆粒如 ISCOMS (免疫刺激性複合物）、結核桿菌（从少cohflc/er丨‘wm ufterciWohi)、細菌性脂多醣、合成性聚核苷酸如含有 CpG motif之寡聚核苷酸（美國專利第6,207,646號，其倂此以爲參考），百日咳類毒素（pT)、或大腸桿菌熱-不穩定毒素（LT)、特別是 LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129;參考例如國際專利公告第WO 93/ 1 3 3 02及WO 92 / 1 92 6 5號，其倂此以供所有目的參考。 -57 - (55) (55)1355390 同樣可用來作爲佐劑的還有霍亂毒素及其突變體，包括述於已公開之國際專利申請案第WO 00/ 1 8434號者（其中於胺基酸位置29之麩胺酸已被另一種胺基酸（除了天冬胺酸以外之胺基酸，較佳爲組胺酸）所替代）》類似的CT 毒素或其突變物係述於已公開之國際專利申請案第WO 02/098368號（其中於胺基酸位置16之異白胺酸已被另一種胺基酸所替代，其可單獨存在或合倂有胺基酸位置68之絲胺酸被另一種胺基酸替代的情形；及/或其中位於胺基酸 φ 位置7 2之纈胺酸被另一種胺基酸替代）。其它C T毒素.則述於已公開之國際專利申請案第WO 02/0 9 8 3 69號（其中位於. 胺基酸位置25之精胺酸被另一種胺基酸替代；及/或有一個胺基酸插到胺基酸位置49之處；及/或有兩個胺基酸插到胺基酸位置35及36之處）。應了解地在本說明書中所有引用之參考資料即使用任何理論來解釋本發明結果也不能用以限制本發明之範圍。基於本發明可發揮效用之方法的獨立性，在此所述之結果 φ 及優點可參考如下實施例來達成。對於熟悉此技術者極明顯地可在不悖離後附申請專利範圍之精神或範疇下進行許多改變及修正。所有在此說明書中提到的公告、專利及專利申請案全部倂此以供所有目的參考，如同特殊且個別標示地倂用各個公告 '專利及專利申請案以爲參考。【實施方式】 -58 - (56) (56)1355390 實施例] CRM197與Αβ肽的接合半抗原/抗原性肽的接合係使用如下所述之方法（第1 圖）將已活化且具有3 9個離胺酸殘基之CRMI97載體與具有突出硫醇基之半抗原/抗原性肽反應來進行。所有Αβ肽於羧基端含有半胱胺酸殘基以促使此等肽經由半胱胺酸基硫氫基來接合到載體蛋白質上。此等肽可用固相合成來產生 I.活化將CRM197之游離胺基與過量溴乙酸Ν-羥基琥珀醯亞胺醋（Sigma Chemical Co·,St. Louis，MO)(Bernatowicz and Matsueda，1986)反應來漠乙酿化》在 CRM197 (約15 mg)之冰冷卻溶液中加入 1 0%(ν/ν)1 ·0 Μ碳酸氫鈉（PH8.4)。將重量與所用 CRM197 相同之溴乙酸N -羥基琥珀醯亞胺酯溶於20〇mL二甲醯甲醯胺（DMF)中，緩慢地加到 CRM197內，且於室溫黑暗下溫和攪拌1小時。所產生的溴乙醯化（活化）蛋白質可藉著通過去鹽（P6-DG)管柱並使用PBS/〗mM EDTA(pH7.0)作爲溶析液來純化。純化後，將相當於活化CRM ^ 97之餾份合倂且用BC A檢定來估算蛋白質濃度。用溴乙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯處理前及處理後之蛋白質胺基用2,4,6-三硝苯磺酸（TNBSA)來反應，其可作爲溴乙醯化的指標（Means et a]·, 1 9 7 2)。 -59- (57) (57)1355390 Π.接合在接合前，先將肽與5,5’-二硫-雙（2-硝基苯甲酸）[艾蒙試劑]反應以確定游離-SH基團的量（介於62-88 %已還原）。對於前4種肽（胺基酸1-7無連接子、胺基酸1-12具 GAGA連接子、胺基酸1_9具GAGA連接子、及胺基酸1-7 具GAGA連接子），約有8.0-10.0 mg肽被溶於無菌蒸餾水中使得濃度爲約20 mg/mi。以1 : 1比例（w/w)將肽緩慢地 φ 加到冷的已活化CRM197中且加入20-26以1之IN NaOH來把pH値調整成約7.0-7.2。把所產生的物質置於黑暗4T：下溫和攪拌隔夜，接著於黑暗ρΗ7·2下針對PBS的兩種 IL變化透析。至於其次4種Α沒肽（胺基酸】-5無連接子，胺基酸〗-9有接頭、胺基酸.1-1 2有接頭 '及胺基酸1-5有接頭），用艾蒙試劑反應以確定游離-SH基量。將CRM]97溴乙醯基化 '純化且與TNBSA反應如前所述。各個肽之PH 値可藉著加入體積爲溶解肽2.2倍之0· 1 M _NaP04(pH 8.5) φ 來調整成pH 7.0。以1 :]比例（w/w)將肽緩慢地加到冷的已活化CRM197中且於黑暗4°C下任其反應隔夜。將所產生之物質透析。如上所述並採取如下修正來將終控制肽（】-12逆向聚體）接合到CRM197上。與把肽pH値調整成7.0不同地，已活化CR]Vh972 pH値係藉著加入20%(v/v)0.5 Μ NaP04 (ρΗ8·0)來調整。於透析後，各個共軛物會被轉移到無菌]5 m L聚丙烯管中：用鋁箔止包裹住，且儲存在4 °C 。而後載體上反應性胺基殘基活化的情形可使用質譜儀來 -60- (58)1355390 確認。共軛物 ΑβΙ-5-C-CRMw. Apl-7'C-CRMj9? Apl*9-C-CRMj97 Αβί -12-C-CRM J97 Apl-5-L-C-CRMi97 Αβ l-7-L-C-CRMi97 Αβί -9-L-C-CRM]97 Αβί -12-L-C-CRM]97 致免疫肽 DAHFR-C (SEQ. ID. NO.：]) DAEFRHD-C (SEQ. ID NO.:2) DAEFRHDSG-C (SEQ ID NO:3) DAEFKHDSGYEV-C (SEQ ID NO:4) DAEFR-GAGA-C (SEQ ID NO.:5) DAEFW3D-GAGA-C (SEQ ID NO.:6) DAEFRHDSG-GAGA-C (SEQ ID NO.:7) DAEFRHDSGYEV-GAGA-C (SEQ ID NO.:8)

AP12-1-C-CRMip7 (-VE CONTROL) VEYGSDHRFEAD-C (SEQ ID NO.: 9) L=連接子(GAGA) (SEQ ID NO.:10) 實施例2 製備肽-CRM197共軛物並以超過濾來純化CRM197之溴乙醯化

於氣氣下以1:】重量比來將（】〇〇11^)於0.0】]\4碟酸鈉緩衝液，0.9%氯化鈉，ρΗ7·0與溴乙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯（於DMSO溶成20 mg/ml)反應。依需要將反應加以研製直到 pH値保持在7.0。混合物於室溫黑暗中攪拌1 . 5小時。反應混合物用]· 2 " m過濾到 U F / D F系統（M i 11 i p o r e Labscale TFF，BilleriCa,MA)之保留儲槽中。純化係以 1 0K或3 OK UF膜相對於0.01 Μ磷酸鈉緩衝液/ 0.9 %N a C ]， pH7.0進行通透過濾（30倍）。讓溴乙醯化CRM197通過0.2# m濾器來過濾。溴乙醯化程度之測定係將已活化CRM 197 與半胱胺酸反應，接著進行胺基酸分析及定量所產生之羧 -61 - (59) (59)1355390 甲基半胱胺酸（CMC)。肽與溴乙醯化定量之接合以及使用N-乙析醯基半胱胺來加蓋將溴乙醯化CRM197 (5 0mg)轉移到反應容器中。將維持於2-8 °C之攪拌溶液中加入1M碳酸鈉/碳酸氫鈉。於氬氣下進行硏製以達到PH9.0之目標。個別地，秤量50mg A 冷肽且溶於注射用水（WFI)中直到成爲20 mg/mL。在此溶液中加入1M碳酸鈉/碳酸氫鈉直到達到pH9.0。將肽溶液加到溴乙醯化CRM197溶液，且混合物於2-8t下攪拌14-18小時。剩下的溴乙醯化基團用20倍過量之N-乙醯基半胱胺於2-8 °C下進行3-6小時之加蓋反應。將反應混合物用1 .2 // m濾器來過濾到 UF/DF系統 (Millipore XL)之保留儲槽中，且共軛物係於室溫下以]〇κ 或30K MWCO膜（Mil]ipore)相對於0.01M 磷酸鈉緩衝液 /0.9%NaCl，ρΗ7·0進行3 0倍通透過濾。收集保留物且用 0·2μ m過濾且分析蛋白質含量（Lowry或Micro-BCA比色檢定）’以SDS-PAGE分析，以胺基酸分析，及分析其於小鼠體內之免疫原性。實施例3 將未反應之溴乙醯基團加蓋轉化成胺乙醯基團將如上實施例2製得之溴乙醯化CRM197 (50 mg)轉移到反應容器中。將維持於2-8 °C之攪拌溶液中加入]Μ .碳酸鈉/碳酸氫鈉。於氬氣下進行硏製以達到ρ Η 9.0之目標。個 -62 - (60) (60)1355390 別地，秤量5 0 m g A万肽且溶於注射用水（W F I)中直到成爲 20 mg/mL。在此溶液中加入1M碳酸鈉/碳酸氫鈉直到達到PH9.0。將肽溶液加到溴乙醯化CRM197溶液，且混合物於2-8 °C下攪拌I4-18小時。剩下的溴乙醯化基團於2-8 °C下用8%碳酸氫銨溶液進行4小時加蓋反應。將反應混合物用1.2ym濾器來過濾到UF/DF系統 (Millip0re XL)之保留儲槽中，且共軛物係於室溫下以1〇κ 或30Κ MWCO膜（Millipore.)相對於0.01Μ磷酸鈉緩衝液 /0.9 % NaCl，pH 7.0進行30倍通透過濾。收集保留物且芾〇.2//m過濾且分析蛋白質含量（Lowry或Micro-BCA比色檢定）’以SDS-PAGE分析，以胺基酸分析，及分析其於小鼠體內之免疫原性。實施例4 定量測定S -羧甲基半胱胺酸及S -羧甲基半胱胺以評估肽免疫原-蛋白質/多肽共軛物之接合及加蓋程度對使用溴乙醯活化化學所產生之蛋白質-肽共軛物在酸水解後會從接合部位的半胱胺酸生成酸穩定之s_錢甲基半胱胺酸（CMC)且從加蓋部位之半胱胺生成酸穩定之s_ 羧甲基半胱胺（CMCA)(第2圖）。所有已接合及已加蓋離胺酸都會被轉變回離胺酸且以此形式來被偵測。除了色胺酸及半胱胺酸以外（其在水解條件下會被破壞），所有其它胺基酸會被水解成游離的胺基酸。天冬醯胺及麩醯胺分別會被轉化成天冬胺酸及麩胺酸。 -63 - (61) (61)1355390 將共軛物樣本用去離子水來稀釋直到總蛋白質濃度低於1 mg/mL。將各個共軛物之10微克液份各兩份加以乾燥且再懸浮於]OOgL 6N HC】[Pierce]，5μί融化苯酚[Sigma-Aldrich]及1//L 2-氫硫基乙醇[Sigma-Aldrich]。然後此等樣本於n〇°C真空（]00 mT)下培育22小時。將所產生的水解物乾燥，再懸浮於2 5 0μί貝克曼（Beckman) Na-S檸檬酸納樣本稀釋緩衝液（ρΗ2·2) [Beckman Instruments,Inc. ，FulIerton，CA]，且使用華特曼（Whatman) 0.2 μιη 尼龍注射器頂端濾器及1 m L注射器來過濾。然後將所有樣本裝載到貝克曼6 3 0 0胺基酸分析器樣本環中且置入分析器中。將各水解樣本及控制組胺基酸使用離子交換層析分離出來且接著於135。(：下與貝克曼 Ninhydrin NinRX溶液反應。然後衍生化胺基酸會於 570nm及44〇nm之可見範圍下偵測（見表含有5〇0微微莫耳各種胺基酸之標準胺基酸組[pierce Amino acid Standard Η]會與樣本一起測試且作爲各分析組之對照組。加入S -殘甲基半腕胺酸[Sigma-Aldrich]作爲標準物。 -64 - (62)1355390

表I 使用貝克曼63 00胺基酸分析器之梯度計劃1時胺基酸的滯留時間滯留時間胺基酸偵測用波長 (分鐘） 8.3 羧甲基半胱胺酸 CMC 570 9.6 天冬胺酸&天冬醯胺 A s X 5 70 11.3 羥丁胺酸 Thr 570 12.2 絲胺酸 S e r 570 15.8 麩胺酸&麩醯胺 Glx 570&440 18.5 脯胺酸 Pro 440 2 1.8 甘胺酸 Gly 5 70 23.3 丙胺酸 A 1 a 5 70 29.0 纈胺酸 Val 5 70 3 2.8 甲硫胺酸 Met 5 70 3 5.5 異白胺酸 lie 570 3 6.8 白胺酸 Leu 5 70 40.5 酪胺酸 Ty r 570 42.3 苯丙胺酸 Phe 570 45.4 羧甲基半胱胺 CMCA 570 4 8.8 組胺酸 His 570 5 3.6 離胺酸 Ly s 570 70.8 精胺酸 A r g 5 70

各標準峰之面積會在對各樣本進行比例性評估時被用 -65 - (63) (63)1355390 來作爲定量性等量（quantitative equivalence)。脯胺酸係於44 0 nm下測定且使用麩胺酸（最接近的胺基酸）於 57〇nm下轉化成等量値。各項此等微微莫耳數會藉著把所測得之離胺酸之微微莫耳數與蛋白質內離胺酸量理論値作比較來轉化成肢基酸殘基之莫耳比例。由於離胺酸會共價依附到半胱胺酸及半胱胺上及其預期的類似水解作用，所以被選來用在此評估作用。然後各胺基酸所測得的莫耳數會與該蛋白質之胺基酸組成作比較，且與CMC及CMC A的數據共同顯示出來。CMC値被直接用來評估接合程度且CMCA値被直接用來評估加蓋程度。實施例5 界定Ay3-CRM197肽共軛物之特性及最適化爲了確定接合作用，所有肽- CRM197共軛物會用胺基酸分析及基質-輔助雷射解析離子化-時間之航行（MALDI· TOF)質譜儀來分析。對於各個共軛物，接合到各莫耳 CRM197之肽莫耳數係使用胺基酸分析（s -羧甲基半胱胺酸殘基之數目）及M A L DI · Τ Ο F質譜儀來測定。各個方法所測得之數値一般係一致的》 I.尺寸排除層析從儲存處取出批次濃縮樣本且回溫至室溫。將A乃肽共軛物樣本溫和搅拌以確保均質製備。將該A点肽共軛物 -66 - (64)1355390 樣本用Eppendorf微離心機離心以除去任何粒狀物。取出上淸液且作 TosoHass TSK-Gel G3000SW 層析

(TosoHaas，Stuttgart，德國）。將 TosoHass TSK-Gel G3 0 00SW管柱連接到HPLC系統且把壓力限度設定在Ι·4 MPa。管柱用至少30 ml，流速0.75 mL/分鐘之PBS (10mM 磷酸鈉，150mM氯化鈉，ρΗ7·2±0·】）來平衡。採用如下參數將 Α0肽共軛物樣本裝載到 TosoHass TSK-Gel G3000SW 管柱：肽共輕物樣本之濃度· 1.5±1.0 mg/ml 流速：0.7 5 mL/分鐘樣本體積：1.0 ml 進行時間：30分鐘吸光度係以280 nm及210 nm監測。爲了長期儲存，將 TosoHass TSK-Gel G3000SW 管柱用至少 50 ml，流速 0.5-1.0 ml/分鐘之20%乙醇來平衡。

II.PAGE (聚丙烯醯胺凝膠電泳）：已活化（溴乙醯化）C RM】9 7及A冷肽-C R Μ , 9 7共軛物係以SDS -凝膠來檢驗，其中採用了 NuPAGE Bis-Tris電泳法（Novex，Frankfurt,德國）及中性pH値，預鑄聚丙烯醯胺迷你膠系統及NuPAGE M ES SDS跑膠緩衝液。將8" g液份已活化CR Μ或其共軛物與還原性樣本緩衝液混合在一起且於]0 0 °C加熱5分鐘。將共軛物及分子量（M W)標準物 (I η ν i u 〇 g e η，C a r 1 s b a d : C A )載入基於 B i s - T r i s - H C ]緩衝系統 -67- (65) (65)1355390 之]0%(w/v’丙燃醯胺）NuPAGE凝朦（Novex)且於MES SDS跑膠緩衝液-PAGE(Laemmli)上跑膠。於SDS-PAGE 後’將凝膠用 Pierce Gel Code Blue(Pierce，Rockford;IL) 染色。A冷肽-CRM! 97共軛物係以在天然CRM譜帶上方約 66 kDa之主.譜帶’及約120kDa之二聚體譜帶，以及微弱的多聚體譜帶（數據未顯示）來代表。 III. 肽-CRMI97共軛物之MALDI-TOF質譜分析質譜分析可用來立即測定接合的約略程度。將適當液份之已活化CRM197及共軛物樣本用MALDI-TOF質譜分析法使用3,5 -二甲氧基-4-羥基-肉桂酸（芥子酸）作基質來分析。以 MALDI-TOF 質譜分析（Finnigan MAT Lasermat 200 質譜儀，Ringoes，NY)測得之已活化之CRM197分子量係集中在約60.5 kDa附近且其共軛物之分子量視接合程度不同係從65kDa到74kDa不等（數據未顯示）。在CRMi97中發現到有最多高達2 2個離胺酸（約5 0 %)以1 : 1的比例被修改。 IV. 最適化實驗活化及接合的程度爲反應劑：蛋白質比例，反應溫度及反應緩衝液之pH値的函數。爲了取得接合反應中可再現之過程控制參數，所以於下文提供一些實例以顯示產生最適接合結果之最適pH値。其結果（第3圖）顯示A万5·聚體（DAEFRC)(SEQ ID N 0 ： U 以及 A β 7-聚體 (D AEFRHDC)(SEQNO: 2)的接合與pH相關，且當反 -68- (66) (66)1355390 應條件的pH値增加時可產生較高度的修改/接合反應。使用5-聚體及7-聚體肽之TFA鹽類時，接合程度係在PH9.0 下評估不同肽裝載量的情形（第4圖）。從此等結果明顯可知於每個CRM分子中具有定義數量之肽複本之肽共軛物可藉由變化接合反應中肽/已活化CRM之比例來產生。已使用A々7 -聚體肽之醋酸鹽來進行類似的實驗。至於1J/CRM的接合，其加蓋過程係藉由比較每 CRM之CMCA莫耳數與每CRM之CMCA莫耳數來進行。由於在所測試之肽：CRM比例下CMC及CMCA的總量係恆定的，所以加蓋過程被假定已經完成（第5圖）》共軛物的總修改量係停留在I 9到2 ]之間，相當於溴乙醯化之離胺酸的數量（第5圖）。此等實驗係以TFA作爲肽的抗衡離子來進行。使用肽的醋酸鹽而非TFA鹽重覆該A召1-7/CRM 的接合作用，且數據係顯示在第5圖及第6圖。加蓋過程似乎已經完成，且各點的C M C及C M C A總量係停留在2 0到 22之間。A石-CRM接合反應的條件在PH9.0下達最適化，且接合程度係由反應中肽對CRM的比率所控制。藉由將比例從0.1到1.5間變動，接合程度便有所不同（第6圖）。活化及接合的程度爲反應劑：蛋白質比例，反應溫度及反應緩衝液之pH値的函數。各共軛物之修改（接合）程度係將各共軛物的質量減掉已活化CRM ! 97的質量，然後除以用來製備該共軛物之肽的質量來計算β所有共軛物的修改（接合）程度係示於表2。接合程度也會與每莫耳crm197上形成之S-羧甲基半 -69- (67)1355390 胱胺酸殘基的估計量比較（亦示於表2)。表2 修改程度：MALDI-TOF及AAA數據之比較樣本 Da (來自質譜儀）接合程度 (來自質譜儀）接合程度 (來自 CMC-胺基酸分析） C R M j 9 7 58,408 BrAc-CRM 60,752 19 Αβ 1 -7/CRM 74,463 14 1 5 Αβ 1 -7/CRM 72,3 75 1 2 14 Αβ 1 -5/CRM 75,425 20 2 1 Αβ 1 -5/CRM 7 1,690 15 18 實施例6 Α β肽共軛物之免疫原性硏究 A冷之Ν端殘基]-5、] - 7、1 · 9及1 - 1 2 (有及無連接子 GAGAC)之肽，及相當於A召之N端胺基酸12至胺基酸1 反向序列（1-1 2聚體呈反向順序）之肽，各連接到CRM197上，將此等共軛物以及未接合之 AySl-12聚體肽與 ST1MULON™ QS-21調配成調合物來免疫小鼠。各組小鼠係以3 0 e g或5 //劑量之一種前述樣本調合2 0 μ g佐劑 STIMULON™ QS-2]，於硏究一開始（第0週）及後續第3及6 週進行皮下預防接種。如表3所示，A冷之N端殘基]-5、】-7、]-9及]-]2(有 -70- (68)1355390

及無連接子GAG AC)之肽，及相當於a冷之n端胺基酸12 至胺基酸1反向序列（1-12聚體呈反向順序）之肽，各連接到CRM|97上，將此等共軛物以及未接合之Α)β1·]2聚體肽與QS-2 1調配成調合物來免疫小鼠。各組小鼠係以30 a g或5//劑量之一種前述樣本調合20/zg佐劑QS-21，於硏究一開始（第〇週）及後續第3及6週進行皮下預防接種。使用瑞士威伯司特小鼠來進行整個硏究且每組有5隻小鼠。注射體積=1〇〇μ1; B =血液；V =接種；E =放血。

抗·Α /3效價係如下文所述以抗 A冷及 CRM197之 ELISA來測量。簡要地，在寇司塔（Costar)96凹孔平板 (#3591)上塗以2/i g/mL AyS ]-42於無菌碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液，ρΗ9·6於室溫下隔夜。將平板淸空且每凹孔用200 μ. 1 之〇_〇5%BSA 於 I X PBS/0.05%Tween 20於室溫下阻斷 2小時。將已阻斷平板淸空且用含有TBS，0. ] %Brij-35(無疊氮化物）淸洗緩衝液之平板淸洗液來淸洗。所有的初級抗血淸係用〇.〇5%BSA 於 1 X PBS 含有 0.05°/〇Tween 20/0.02 %疊氮化物來作系列稀釋，且將ΙΟΟμί各稀釋液轉移到適當的平板凹孔中且於室溫下培育2小時。然後將平板淸空/如前文所述般淸洗。將來自Southern Biotech之鹼性磷酸酶接合山羊抗-小鼠IgG次級抗體用0.05%BSA於 1又卩63含有0.05%丁％“11 20/0.02%疊氮化物以]:100〇來稀釋，且取]00 # L加到各凹孔中且於室溫下培育]小時。然後將平板淸空且如前所述來淸洗且最後於每凹孔加入 1 00 L之]mg/ml對硝苯基磷酸鹽基質於二乙醇胺/MgC]2 -71 - (69) (69)1355390 ，pH 9.8之溶液於室溫下培育]小時。顏色的發生可藉由在每凹孔加入50 // 1之3N NaOH來終止。將平板置於405 nm下讀數且以690nm爲參考。終點效價係以0.1 AU的 O.D値來計算。

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Wkl6 w PJ w ω w PQ w W w Wkl3 CQ PQ CQ DQ CQ PQ CQ CQ CQ CQ CQ CQ CQ CQ Wk8 CQ ΡΩ CQ CQ CQ cn CO CQ PQ CQ PQ CQ CQ Wk6 B，V B,V B，V B,V B，V B，V B，V B，V B，V B，V B，V B，V B，V B，V Wk3 B,V B,V B,V B，V B,V : B，V B，V B，V B，V B，V B，V B，V B，V B,V WkO > CQ > CQ > cn > CQ > CQ > CQ > CQ > CQ > PQ > > CQ > CQ B，V B,V 劑量 (β g) κη yn 說明 CRM/l-7w/〇接頭 CRM/l-12有接頭 CRM/l-9有接頭 CRM/1-7有接頭 CRM/l-5w/〇接頭 CRM/l-9w/o 接頭 CRM/M2w/〇接頭 CRM/丨-5有接頭 CRM/l-7w/o 接頭 CRM/l-12有接頭 CRMAl-9有接頭 CRM/l-7有接頭 CRM/l-5w/o 接頭 CRM/l-9w/〇接頭群組編號 AE488 AE489 AE490 AE491 AE492 AE493 AE494 AE495 AE496 AE497 AE498 AE499 AE500 AE501

-73- 1355390 _岛保萑墩轵躪七 (鰹)e谳

Wkl6 w ω ω uo. PL) U〇 Wkl3 CQ PO CO CQ CQ CQ CQ .CQ CQ Wk8 CQ CQ CQ CQ CQ P3 PQ PQ Wk6 > CQ > CP > m > CQ > cn > CQ > CQ > CO > CQ > PO Wk3 > CQ > CQ > CQ > PQ > CQ > PQ > CQ > CQ > CQ > PQ WkO > CQ > CO > CQ > CQ > CQ > CQ > CQ > CQ > CQ > CQ 劑量 (β g) <n o m in 〇〇說明 CRM/l-12w/〇接頭 CRM/l-5有接頭 CRM,97C1-6151 CRM,97C]-6151 CRM/12-1 聚體 CRM/12-1 聚體 1-12聚體肽 1-12聚體肽 JD < < 群組編號 AE502 A E 5 0 3 AE504 A E 5 0 5 1 AE506 AE5 07 A E 5 0 8 AE509 A E 5 1 0 AE5 1 1

-74 - (72) (72)1355390

C R Μ 1 9 7 E LIS A 在格林納（Greiner) 96凹孔平板（#650011)上塗以5.0// g/mL (每凹孔]OOyl)之CRM197於無菌碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液，pH 9.6置於37 °C下處理90分鐘》將平板淸空且用含有1 X TBS，0.1%Brij-35淸洗緩衝液之平板淸洗液來淸洗。所有的初級抗血淸係用含有〇.3%Tween 20/EDTA之1 XTBS來作系列稀釋，且將100μί各稀釋液轉移到適當的平板凹孔中且於37°C下培育1小時。然後將平板淸空/如前文所述般淸洗。將來自Southern Biotech之驗性碟酸酶接合山羊抗-小鼠IgG次級抗體用含有0.05%Tween 20/0.02% 疊氮化物之1 X PBS以1 : 1 000來稀釋。然後將平板淸空且如前所述來淸洗且最後於每凹孔加入I00#L之I mg/ml 對硝苯基磷酸鹽基質於二乙醇胺/M gCl2，pH 9.8之溶液於室溫下培育1小時。顏色的發生可藉由在每凹孔加入50#1 之3N NaOH來終止。將平板置於40 5 nm下讀數且以690nm 爲參考。終點效價係以0 . 1 A U的Ο . D値來計算。表4-6顯示終點ELIDA中抗A/5效價。於初次疫苗接種後’所有八種共軛物（除了負對照組以外）都可以誘發可測量的抗-A泠IgG免疫反應。不過。在初次疫苗接種3週後’ 30//g劑量而非5；t/g劑量之產生了正反應。在所有的共軛物中’似乎是無連接子之Ay9 1-7肽比所硏究的其它共軛物更能引發更好或一樣好的免疫反應。在5"g 劑量下，第8·]6週時A召1-5C有更好的表現。在30/zg劑量下’ A泠1-7C表現最佳。不論是用30// g劑量或5 4 g劑 -75- (73) (73)1355390 量在第二及第三次疫苗接種後進行之抗體效價分析，顯示對於大多數共軛物而言抗Ay5最佳的免疫反應係在進行第二次疫苗注射後發生的。至少在小鼠身上，第三次疫苗注射似乎並不能再提高免疫反應。不過，AyS肽需要用30# g劑量進行三次免疫接種才能達到抗該種肽之最大免疫反應（表5)»以隨著時間流逝抗體減少之抗體衰變的術語來說’相較於用各軛物來免疫群組時該群組所產生的最高抗體量相比，抗體衰變後群組之抗體量可減少2至3倍。分析 φ 來自第6及8週之個別樣本以計算各群組抗AyS之GMTs量 (表6)’以瞭解是否有某一群組實質上比其它各組更佳。對第6週時A/3l-5C、AyS17-C& A0 1- 9C共軛物之效價作統計分析’其顯示A A 1 - 7共軛物顯著地引發更高的抗體效價。從該實驗亦顯示連接子GAGAC並不會提高針對該肽之免疫反應。

-76- (74)1355390 表4 群組第〇第3週第6週第8週第]3週第16週 1 -5C <100 14,960 687,691 882,012 625,208 771,828 1-7C <100 5 1 s253 1,280,181 860,463 520,060 571,043 1 -9C <1 〇〇 18:615 1 ,008,872 622,325 348,967 380,755 1 -1 2C <100 6 15 132,009 390,624 166,162 184,170 1-5LC <100 4,999 458,075 454,631 237,573 220,09 1 1 -7LC <100 17,693 849,170 842,402 446,089 400,5 3 6 1 -9LC <1 00 18,544 1,465,115 1,1 8 0,347 571,127 579,4 77 1 -12LC <100 12,664 908,360 598,867 3 68,1 0 1 3 16,075 C R Μ ] 9 7 <1 00 <1 00 <1 00 <100 <100 <100 1-42 <100 <100 <100 <]00 <1 00 <100 1-12 <1 00 <1 00 <1 00 <100 <100 <1 00 1 .2 - 1 C <1 00 <100 <100 <100 <100 <1 00

表4:於第0、3、6、8' 13及16週，以ELISA終點法滴定 5 V g劑量之肽共軛物製得之抗血淸中抗A /3之量，該肽共軛物具有不同長度之N端澱粉樣AyS肽，參考標準物：愛倫（Elan)超免疫多株#5 92 = 3,0 73,3 07。終點爲0.1 AU O.D.値。瑞士威伯司特（Webster)小鼠係於第〇' 3、6週使用5jug如上抗原並與2〇//g STIMULONtmQS-21配方在一起以SC-N來免疫。 -77 - (75)1355390 表5 群組第3週第6週第8週第]3週第]6週 1 -5C <100 1 8;150 590:355 332,832 204,645 176,159 1 -7C <100 100,672 1,840,74 1 647,470 592,638 779,072 1-9C <1 00 18,520 1 51 84,696 713,494 363,459 327,065 1 -1 2C <1 00 7,83 7 1,325,725 1 5 1 26,3 89 681,268 577,604 1 -5LC < 1 00 16,347 469,191 184,077 1 77,3 5 8 164,680 1 -7LC <1 00 47,866 971,229 462,200 463,466 529,726 1-9LC <100 59,002 921,544 787,273 405,023 500,468 1 -12LC <100 27,348 697,150 483,320 284,800 3 97,8 1 6 C R M j 9 7 <1 00 <100 <1 00 <100 <100 <100 1-42 <1 00 <100 <1 00 <100 <100 <100 1-12 <100 <100 <1 00 <100 <]00 < 100 1 2 - ] C <100 <100 <1 00 <100 <1 00 <!〇〇 | 表5:於第0、3、6、8、13及16週，以ELISA終點法滴定 3 〇 V g劑量之肽共軛物製得之抗血淸中抗A /9之量，該肽共軛物具有不同長度之N端澱粉樣肽，參考標準物·· 愛倫（Elan)超免疫多株# 5 92 = 3,0 7393 0：^終點爲n Au 0 · D ·値。瑞士威伯司特（W e b s t e r)小鼠係於第〇、3、6週使用30以g如上抗原並與20/i g ST1MUL0NtmQS-21配方在一起以SC-N來免疫。 -78- (76)1355390 表6 群組第6週第8週 ]-5C 237,6683 1 6 ]，67 1 b 1 -7C 1 ,866,7023 88 1，146b 1 -9C 963,323" 595,414b 1 -1 2C 940,260 955,470 1 -5LC 395,553 141,084 1 - 7 L. C 516,921 394,521 1 -9LC 826,773 562,458 ]-12LC 544,768 376,952 1 -42 365 4,565

表6 :於第6及8週，以ELISA終點法測定30 // g.劑量之肽共軛物製得之抗血淸中抗AyS之GMTs量，該肽共軛物具有不同長度之N端澱粉樣A A肽，參考標準物：愛倫 (£131〇超免疫多株#5 92 = 3,073,3 0 7。終點爲0_1六1；〇.〇.値。瑞士威伯司特（Webster)小鼠係於第〇、3、6週使用30 μ g如上抗原並與2〇eg STIMULONtmQS-2I配方在一起以 SC-N來免疫。 a.於第6週時1-5C ' ]-7C及]-9C滴定測得之效價使用

Tukey-Kramer統計分析顯示出只有1-5C與卜7C間顯示出統計性差異，然而使用學生型T測試時在〗-5C與1-7C之間以及〗-5C與]-9C之間皆顯出統計性差異。 b.對第8週時1-5C、]-7C及1-9C滴定測得之效價進行 -79- (77) (77)1355390 統計分析，顯示此三個群組間並沒有統計性差異。不過在 1 -5C與〗-7C間似乎有所差異。 PDAPP小鼠腦組織染色 PDAPP腦組織染色檢定提供一種指示A 肽共轭物及 /或 A召1 -42抗血淸之功能性的指標。對於來自個別小鼠群組之血淸樣本，分別針對其辨識PDAPP小鼠腦組織內含有澱粉樣肽之斑塊的能力來作分析。此等結果顯示於表 φ 7A及7B。除了 AyS5聚體共軛物抗血淸以外，其它共軛物抗血淸在辨識該等斑塊時都有著劑量相關反應。與連接子無關地，30//g共軛物引發之抗血淸較5#g共軛物引發之抗血淸具有更佳的反應性型式。不過對於 5-聚體共軛物抗血淸而言，5 g群組似乎有類似或更好的反應性。比較所有此等結果，得到的結論指出從 A万1 - 5聚體到 A 冷1-9聚體作成的共軛物皆足以引發斑塊辨識之免疫反應且連接子存在與否並不重要。從此一硏究可得到如下結論 φ :(a)與未接合之CRM197對照組相比，所有肽共軛物都可以引起相當或略高效價之抗載體蛋白質CRM197之抗血淸（未顯示）。（b)與不具連接子之共軛物相比，具有GAGAC 連接子之共軛物的免疫原性或功能性並未提高。（c)免疫原性數據及PDAPP腦組織染色（功能性抗體之主要指標）顯示Α々1-5聚體及Α；β]-7聚體共軛物似乎爲可再進一步發展之較佳免疫原。 -80- (78)1355390 表7A.PDAPP小鼠腦組織染色 5 // g劑量無連接子有連接子疫苗動物# PDAPP 染色疫苗動物# PD ΑΡΡ 染色 CRM/Αβΐ -5 1 + (無擴散） CRM/Αβ 1 -5 1 - 2 + + / + + + 2 - 3 + + / + + + 3 土 4 + + 4 土 5 + + 5 土 CRM/Αβ 1 -7 1 + + CRM/Αβ 1 -7 1 + 2 + + 2 + + 3 + + 3 + + 4 + + 4 十 5 + + 5 + + CRM/Αβ 1 -9 1 + CRM/Αβ 1 -9 1 + + 2 + / + + 2 + + 3 土 3 + 4 土 4 + 5 土 5 + CRM/Αβ 1 -12 1 - CRM/Αβ 1 -12 ] + 2 ? 2 + 3 土 3 + + 4 - 4 - 5 土 5 土 CRM/Αβ 1 2- 1聚體 1 - Αβ 1 2 1 - 2 - 2 - 3 土 3 • 4 - 4 - 5 土 5 - 所有抗血淸以】：】〇〇〇稀釋來進行染色步驟。

-81 - (79)1355390 表7 B. PDA PP小鼠腦組織染色 3 0 ν g劑量無連接子有連接子疫苗動物# PD ΑΡΡ 染色疫苗動物# PDAPP 染色 CRM/Αβ 1 -5 1 - CRM/Αβ 1 -5 1 + 2 + / + + 2 - Λ - 3 4 土 4 土 5 + + 5 - CRM/Αβ 1 -7 1 + / + + CRM/Αβ 1 -7 1 + 2 + + 2 ±/ + 3 + + 3 + / + + 4 + + 4 ±/ + 5 + + /+ + + 5 + /+ + CRM/Αβ 1 -9 1 ++/+++ CRM/Αβ 1 -9 1 + / + + 2 + + 2 + + 3 + + 3 + + 4 + 4 土 5 + 5 + / + + CRM/Αβ 1 -1 2 1 - CRM/Αβ 1 -12 ] + / + + 2 + / + + 2 + 3 + / + + 3 - 4 士 4 + / + + 5 士 5 + CRM/Αβ 1 2-1聚體 1 - Α β 1 2 ] 土 2 - 2 - 3 - 3 - 4 - 4 - 5 - 5 -

所有抗血淸以]:1 〇〇〇稀釋來進行染色步驟 -82 - (80) (80)1355390 實施例7 猴的免疫原硏究於第0、29及58天對諸猴群（每組6隻）給予30// g之7-聚體共軛物（總共軛物）及佐以 SIMULONtm QS-21，明礬或RC529 SE佐劑之調合物。其它各組調合物還包括30" g之5-聚體共軛物以及明礬（Al(OH)3)或RC529 SE，並以 75// g 及 300//g Αβ 與 SIMULONtm QS-21 作爲正對照組。正對照組每2週進行一次免疫接種。於第36及64天測定抗-Αβ抗體效價（第7-9圖）》於第36天，7-聚體/CRM共軛物以及 SIMULONtm QS-21，明礬及 RC529 SE 引發之 GMT 效價分別爲]〇11〇，13330及17090(第7圖）。相對地，75/ig 及3 0 0；ug劑量之 Αβ卜42及 SIMULONtm QS-2】所引發之 GMT效價則分別爲223及I 73。Αβ5-聚體共軛物與明礬所引發的效價爲2134且其與RC529 SE引發之效價爲1 5980 。於第64天，即投予3劑共軛物與 SIMULONtm QS-21或 RCN529 SE後所引發的效價基本上高出第二次投藥後引發的效價（7-聚體/1^-529 5£之〇1^丁5爲699 1 0;“以5-聚體 /RC-5 29 SE 則爲 2 1 640;且 Αβ7-聚體 / SIMULONtm QS-2] 則爲3 03 10)(第8圖）。共軛物及明礬在第三次免疫後引發的效價則低於第二次免疫後引發的效價。似乎 Αβ 7-聚體共軛物比Αβ5·聚體共軛物更能引發較佳的免疫反應。於猴，Αβ7-聚體共軛物佐以RC- 5 2 9 SE或SIMULONtm QS-21 可引發最高度的反應（第 9圖）。 Αβ7_聚體共軛物與明礬引起的反應則爲中度的且類似於3 0 0 g之 Α β ] - 4 2與 -83 - (81) (81)1355390 SIMULONtm QS-21的反應程度。從這些實例可以獲得數項結論。首先，兩種共軛物在靈長類極具免疫原性。其次，在免疫調合物中佐劑的存在會顯著影響免疫反應。第三，除了鋁佐劑以外，佐劑RC-529 SE及SIMULONtm QS-2]若在每次疫苗接種中皆投予且投予至少高達三次的情況下則可強化免疫反應（第9圖）。總括而言，Αβ7-聚體在存在529下可引發較好的抗體反應，存在SIMULONtm QS-21時則次之（參考第9圖）。 φ 實施例8 多抗原性肽（MAP)共軛物的製備及其免疫原性硏究多種方法可用來於載體上製造多抗原性部位。於先前實施例中，個別的抗原性部位係以所定義的接合及加蓋化學法個別地接合到載體上。於此實施例中，多抗原性部位係用固相合成法來合成Αβ]-7聚體之縱排複本構築而成。另一選擇地，此等縱排複本可透過或不透過它處說明之離 φ 胺酸核連接來與Τ -細胞抗原決定部位偶合在一起。所合成之此等多抗原性肽可具有額外半胱胺酸殘基以接合到載體蛋白質上。合成含有1組複本單元（1-7)、3組複本單元 (1-7)及5組複本單元（卜7)之肽且在其羧基端有額外的半胱胺酸。將此等肽與溴乙醯化CR Μ處理隔夜且透過C端之半胱胺酸殘基共價依附在一起。此等反應係在ΡΗ9.0-9.2 下以表8所列示的肽：CRM比例來進行。未與肽反應之溴乙醯基團會周N -乙醯基半胱胺加蓋。此等編號分別代表 -84 - (82)1355390 接合到CRM之Αβ卜7肽單一複本共軛物、三縱排複本共軛物及五縱排複本共軛物。表8簡要地顯示出此等樣本之性質。表8 多抗原性肽（map)共軛物樣本共軛物肽：CRM(w/w) 反應之pH値 Ab( 1 -7) 1 /CRM 0.37 8.99 Ab( 1 -7)3/CRM 1.02 8.95 Ab( 1 -7)5/CRM 1.67 9.17 肽裝載量（每個載體之1-7肽之平均數目）及加蓋數目（表9)係以胺基酸分析所測得、位於每個載體上獨特胺基酸（CMC或CMCA)之數目。表9 各個共軛物之接合及加蓋程度共軛物肽裝載量（CMC) 加蓋量（C M C A ) Ab(l-7),/CRM 12.5 11.7 Ab( 1 -7)3/CRM 10.4 15.2 Ab( 1 -7)5/CRM 9.8 15.9

將瑞士威伯司特小鼠（每組】0隻）以]或0· I // g Αβ/CRM 接合肽以皮下注射來免疫。有一半的小鼠係用調合1 0 0 g 佐劑A1(0H)3之組成物來免疫，另一半小鼠則不含佐劑來 -85- (83)1355390 免疫。免疫接種係排定在第〇週及第3週進行。抽血係排定在第〇、3及6週進行。分析血淸樣本中抗Αβ卜42聚體肽之抗體反應。此結果示於表1〇。表1 〇多抗原性肽（MAP)共軛物之抗Αβ終點效價群組編號樣本說明佐劑第〇週池第3週 GMT 第6週 GMT AG332 lHgAP(l-7)]/CRM ai(oh)3 <100 18,096 100,279 AG333 lpgAP(l-7)3/CRM ai(oh)3 <100 44,911 420,235 AG334 1μ§Αβ(1·7)5/αΐΜ Al(OH)3 <100 27,032 394,488 AG335 0.lMgA3(l-7)i/CRM Al(OH)3 <100 19,350 66,834 AG336 O.]pgA0(l-7)3/CRM Al(OH)3 <100 13,307 208,272 AG337 0.^gA3(l-7)5/CRM ai(oh)3 <100 1,196 22,665 AG338 1μ£Αβ(1-7),/ΟΚΜ •M、、 <100 5,273 370,980 AG339 lMgAp(l-7)3/CRM 紐 J \ \\ <100 9,299 541:093 AG340 ^gAp(l-7)5/CRM M <100 3,100 185,272 AG341 0.1μ£Αβ(1-7),/€ΚΜ M 〆》、、 <100 340 25,839 AG342 0.^gAp(l-7)3/CRM M 川、 <100 128 5,553 AG343 0.lMgAp(]-7)5/CRM 無 <100 668 2,098

在初次免疫後所有共軛物都可誘生抗Αβ1-42抗體之效價且在追加促升投藥後抗體效價有實質的提升。在缺乏鋁佐劑時，於第3週及第6週抽血時劑量反應的差異係很顯著的。較高劑量會誘發高效價的抗體反應。與未加佐劑的 -86- (84) (84)1355390 群組相比，加入鋁佐劑者於兩種劑量下（〇.】// g及1 g)於第3週時皆可誘發基本上較高的抗體效價。於第二次疫苗接種後，〗//g劑量之共軛物的抗體量會升高5至10倍。於此劑量下，含有3及5組複本之肽共軛物比僅含單一複本之共軛物可誘發更高的抗體反應。亦測定抗CRM載體之效價，其係列於表1 1。表1 1 多抗原性肽（MAP)共軛物之抗CRM終點效價群組樣本說明佐劑第0週第3週第6週編號池 GMT GMT AG332 ^gAp(l-7),/CRM A](OH)3 <50 10,531 114,602 AG333 l.ugAp(l-7)3/CRM ai(oh)3 <50 4,274 83,065 AG334 ]μ£Αβ(卜 7)5/CRM ai(oh)3 <50 L680 49,320 AG335 0.1μ§Αβ(1-7)ι/ΟΙΙΜ a](oh)3 <50 1,114 13,231 AG336 0.^gAP(l-7)3/CRM ai(oh)3 <50 197 1,484 AG337 0.^gAp(l-7)5/CRM ai(oh)3 <50 65 222 AG338 ^gA3(l-7),/CRM 並 <50 35 309 AG339 bgAp(]-7)3/CRM 4EE y »NS <50 29 1,085 AG340 ]pgAp(I-7)5/CRM 姐 ON <50 29 542 AG34] 0.^gA3(l-7),/CRM to J \ w <50 25 55 AG342 0.；lpgAp(]-7)3/CRM fiE <50 25 34 AG343 0.]pgAp(]-7)5/CRM ^ΤΤΓ. <50 29 ND 動物係在第〇、3及6週被免疫。佐劑：1 〇〇从g Al(OH)j 無。：ND =未測定。 -87 - (85)1355390

表11的數據指出未加佐劑之群組不論是劑量1y g或 o.l/ig即使在免疫兩次以後也只能誘發極低的抗-CRM抗體反應。然而，共軛物與氫氧化鋁佐劑在1 V g劑量下則可誘發實質量的抗-CRM抗體反應且於0.1 # g下反應則低得多。於存在佐劑時，具有單一複本之共軛物可產生最高 CRM效價，具有三複本之共軛物則份量中等，具有四複本之共軛物量最低。此結果正如預期般，因爲就每肽劑量之CRM量而言以Ap(I-7)5/CRM最低而以Αβ(】-7)丨/CRM 最高。只有以0.1// g劑量投藥且於第6週時彼此差異才具有統計上的顯著性。

本發明之目的在於引發高效價的抗·抗原性半抗原免疫反應但是抗載體蛋白質之免疫反應並非必要。於特殊情況下，較佳爲引發抗該半抗原之抗原性.決定子之最適免疫反應但沒有或只有極少的抗載體蛋白質之免疫反應。對於此等應用，具有縱排多複本之多抗原性決定子之共軛物且不搭配佐劑之調合物便能符合此等需要。實施例9 製備具有不同載體蛋白質之Α β-肽共軛物及其免疫原性此等實施例係在比較分別使用六種不同載體蛋白質之共軛物之免疫原性。將Αβ] -7醋酸鹽於pH9下以]:]之重量比來加到溴乙醯化載體中。除了 Ap]-7/rC5ap以外，所有的共軛物都用N _乙醯基半胱胺來加蓋。所有的其它載目豆都疋重過性細囷蛋白質’包括C R Μ (白喉類毒素），重 -88- (86)1355390 組C5a肽酶（rC5ap ;係選殖自無乳鏈球菌（S/repM CO ccu s 包括 D130A 及 S5]2A 突變），ORFs 】224、 1664、2452(全部皆選殖自釀膿鏈球菌），及T367及T858( 皆選殖自肺炎衣原體）。所用載體之槪述係示於表1 2。各 Αβ1-7共軛物對此等載體之接合及加蓋程度係示於表13。此等硏究顯示重組C 5 a肽酶共軛物比起所測試的大多數載體包括CRM更能引發高效價的抗Αβ反應》接受氫氧化鋁佐劑之群組於第6週測得之效價間的差異便具有統計上的顯著性。此外在無佐劑時，ΑβΙ-7/T 858共軛物顯著地比起大多數其它共軛物更具有免疫原性。唯一表現得比 CRM對照組共軛物更差的共軛物爲 Αβ1-7/Τ367，其在蛋白質印跡法中也不與Αβ特異性單株抗體反應。此等硏究確認了多種其它載體亦可成功地用在來引發抗Αβ肽的免疫反應。表12 載體及共軛物性質表載體蛋白質載體MW(Da) 離胺酸# CRM 5 8,408 39 r C 5 ap 108,560 85 ORF 〗224 3 0,950 1 8 ORF1 664 3 1,270 38 ORF2452 31,790 29 丁 367 49,700 \ 29 T858 3 7: ] 90 23 -89- (87)1355390 表13 各共軛物接合及加蓋程度共軛物肽裝載量（CMC) 力口蓋（CMCA) Αβ 1 - 7/rC5ap 25.9 Αβ 1 -7/0RF1 224 12.8 5.7 Αβ 1 -7/ORF1 664 13.4 10.8 Αβ 1 -7/ORF24 5 2 12.03 10.5 Αβ 1 -7/T3 67 13.2 8.2 Α β 1 -7/T85 8 5.2 1 . 7 接合結果：肽裝載量（每個載體之 1-7肽之平均數目）及加蓋數目爲以胺基酸分析所測得之每個載體上獨特胺基酸（CMC或CM CA)的數目。該CMC與CMCA數目係指離胺酸數目。免疫結果將此硏究中各群組之幾何平均效度列於表]4。於第3 週，不論有無佐劑存在，A石l-7/rC5ap比從釀膿鏈球菌 ORFs ]224、1664、2452，或從肺炎衣原體 ORFs T367 及 T858製造的對應共軛物可顯著引發更高的抗效價。在缺乏佐劑下，於第3週時 AyS ]-7/rC5ap亦比除了 Α冷卜 7/T858以外的所有其它共軛物有更好的免疫原性。無 A](OH)3之T8 5 8共鞭物引發的效價比無佐劑之〇RF]224、 ORF 1 6 64 ' 0 R F 2 4 5 2及C R Μ共軛物更高。免疫原性顯著地 •90- (88)1355390 低於 A yS 1 - 7/CRM 之唯一共軛物爲 A泠1·7/Τ367 (ρ<0.00002)。該Τ3 67載體不論有或無佐劑在第3及6週時表現都不佳。於第6週，rC5ap共軛物與氫氧化鋁比起除了 AA 1-7/ORF2452以外的所有其它共軛物更具免疫原性 (ρ<0·04)。在缺乏佐齊!J 時，A)Sl-7/rC5ap 及 Α/31-7/ Τ858 所引發的效價顯著地高於〇 R F 1 2 2 4、Ο R F〗6 6 4或T 3 6 7共

軛物之效價。無氫氧化鋁之AyS 1-7/CRM所引發之效價亦高於 A)5 卜7/〇1^1664或 1-7/T367。

-91 - (89)1355390 表14 抗Αβ1-42終點效價群組樣本說明佐劑第0週第3週第6週編號池 GMT GMT AG344 5pgAP(l-7)/CRM Α1(ΟΗ)3 <100 21,404 54,157 AG345 5pgAP(l'7)/rC5ap Α1(ΟΗ)3 <100 61,967 402,972 AG346 5pgAp(l-7)/ORF1224 αι(οη)3 <100 10,711 30,084 AG347 5pgAp(l-7)/ORFI664 Α1(ΟΗ)3 <100 7,188 43,226 AG348 5pgAp(l-7)/ORF2452 Α1(ΟΗ)3 <100 11,437 109,091 AG349 5μβΑβ(1-7)/Τ367 αι(οη)3 <100 321 5,139 AG350 5μβΑβ(]-7)/Τ858 αι(οη)3 <100 16,656 33,328 AG351 5pgAP(l-7)/CRM Μ J 1 \\ <100 2,615 119,488 AG352 5pgAp(卜 7)/rC5ap ίκ /1 '、 <100 11,858 279,113 AG353 5pgAp(]-7)/ORF1224 相f <100 L674 18,719 AG354 5pgAp(卜 7)/ORF]664 4E <100 119 9,832 AG355 5μβΑβ(]-7)/ΟΚΡ2452 4e <100 2,493 76,038 AG356 5μβΑβ(]-7)/Τ367 赃 JWS <100 50 620 AG357 5μ£Αβ(1-7)/Τ858 M <100 28,820 275,202

動物係在第〇及3週被免疫且於第0、3及6週採血。劑量係基於共軛物的總量。佐劑：100// g Α】（ΟΗ)3或無。 -92 - (90) (90)1355390 實施例l 〇額外Αβ肽-蛋白質共軛物之製備 I. 活化將解凍之 CRMl97(8mL，59.84 mg，於 7.48 mg/mL)溶於0.1M硼酸鹽緩衝液（pH 9，3.968 ml)使得濃度成爲5 mg/ml »將溶液置於冰浴0-5°C下冷卻。將溴乙酸N-羥基琥珀醯亞胺（59.9 mg)(Aldrich-Sigma)溶於 DMF(lOOpL) (aldrich-Sigma)且逐滴加到CRM197溶液中》在加入溴乙酸羥基琥珀醯亞胺時可觀察到沉澱產生。檢查pH値，可發現pH降至pH6。藉著加入更多0.1M硼酸緩衝液來將反應混合物的pH値調回pH9。然後將反應混合物置於4°C下溫和攪拌1小時。混合物用 YM-10 centriprep離心濃縮器來純化及濃縮且於Sephadex G-25使用10 mM硼酸鹽作爲溶析劑來再純化。把對布來德福特（Bradford)反應劑呈正反應之f留份合倂且使用centriprep YM-10來濃縮。漠乙醯化程度係用布來德福特檢定（線性）來測量。發現濃度爲 5.36 mg/mL (產量30 mg)。然後把終濃度調整爲5 mg/mL 且於冷凍器中儲存在5 %蔗糖中直到進一步使用。 II. 接合在每次接合時係使用解凍之溴乙醯化CRM]97。把肽溶解在硼酸鹽緩衝液中（2.5 mg於125 ml之0.1M硼酸鹽緩衝液）。在使用 Αβ 肽 KLVFFAED-C(SEQ ID NO ： 45) ' C-LVFFAEDV(SEQ ID NO ： 47)、C-KLVFFAED(SEQ ID N〇 -93 - (91) (91)1355390 :48)、LVFFAED-C(SEQIDN0: 50)時可觀察到有稍不溶解性。將溴乙醯化CRMI97(5 mg/mL)用肽溶液/懸浮液處理。混合物中肽與蛋白質之比例爲爲]:2。在使用 KLVFFAED-C(SEQ ID NO ： 45)、C - L V F F A ED V (S E Q ID NO·· 47)、C-KLVFFAED(SEQ ID NO : 48)及 L VFFAED-C(SEQ ID NO : 50)之共軛混合物中可觀察到混濁現象。然後檢查混合物之pH値（pH9)且在緩慢搖晃下於4°C培育隔夜。在培育前先將混合物的終濃度調整爲3 mg/mL。培育後，C-LVFFAEDV(SEQ ID NO : 47)及 LVFFAED-C(SEQ ID NO : 5 0)肽之共軛物混合液的混濁現象便消失了。不過，KLVFFAED-C(SEQ ID NO ： 45)及 C-KLVFFAED(SEQ ID NO : 4 8)仍稍微混濁。可溶性仿製蛋白質（mock protein)共軛物亦可用1 : l(w/w)比例與半胱胺一起製成。可從 BIOSOURCE獲得純度約95%之合成肽。八聚體： LVFFAEDV-C (SEQ ID NO ： 44) KLVFFAED-C (SEQ ID NO ： 45) VFFAEDVG-C (SEQ ID NO ： 43) C-LVFFAEDV (SEQ ID NO ： 47) C-KLVFFAED (SEQ ID NO : 48) C-VFFAEDVG (SEQ ID NO ： 46) 七聚體： -94 - (92) (92)1355390 VFFAEDV-C (SEQ ID NO ： 49) LVFFAED-C (SEQ ID NO ： 50) III. 加蓋蛋白質上未反應之離胺酸基團未反應的離胺酸基團係用N -乙醯基半胱胺（CMCA; Aldrich-Sigma)以1 : 1 (w/\v)的比例於黑暗4°C下搖晃4小時來加蓋。然後，未反應的肽及加蓋劑係使用 Slide-A-Lyzer 匣（Mw 切掉 l〇5〇〇〇)(Pierce)相對於 pbs 緩衝液（2 L) 進行透析隔夜（I 3小時）來從共軛物中移除掉。更換緩衝液及透析各進行兩次（2 X 14 hr)。可發現到肽KLVFFAED-C(SEQ ID NO ： 45)及 C-KLVFFAED(SEQ ID NO : 48)之共軛物有稍不溶性。所有共軛物係於4 °C冰箱中儲存於保存劑中。 IV. 蛋白質載體之特性使用MALDI-TOF MS來測定溴乙醯化CRM197之質量及仿製共軛物N -乙醯半胱胺-CRM197之質量。基於該 CRM197及溴乙醯化CRM】97之質量，有1]個離胺酸殘基被修改了。 (5 994 1 .4 6- 5 8 5 9 0.2 9)/ 1 22= 1 1 其中； CRM,97之 Mw 爲 5 8624.2 9 溴乙醯化匸只3^197之]^災爲5994].46 溴乙酸之M w爲】2 2 -95- (93) (93)1355390 溴乙醯化程度超過28%(於CRM,97上之離胺酸總數爲 3 9)。於此]]個已修改離胺酸殘基中，有10個係與半胱胺偶合。偶合效能爲90% » (61143-59941)/119=10 其中；溴乙醯化CRMi97之Mw爲59941.46 仿製共軛物之Mw爲61 143 N-乙醯半胱胺之Mw爲1 1 9 φ (10/11)x100=90 V.以 SDS-PAGE蛋白質印跡法使用三羥甲基胺基甲烷-N-三曱基甘胺酸（1^5-^4丨!^)預鑄凝膠來界定肽-蛋白質共軛物之特性將蛋白質-肽共軛物用蛋白質印跡法來分析。各線道分別爲：標記物（第1線道）；L - 2 8 3 7 5 2 4 /0 1 (第2線道）；L · 2 8 3 7 5 24/02 (第 3 線道）；L-2 83 7 5 24/03 (第 4.線道）；L- φ 2 8 3 7 5 24/04 (第 5 線道）；L-2 8 3 7 5 2 4/05 (第 6 線道）；L- 2S 3 7 5 24/06 (第 7 線道）；L-2 83 7 5 24/07 (第 8 線道）；L- 2 8 3 7 5 24/08(第 9 線道）；L- 2 8 3 7 5 24/09(Mock)(第 10 線道） ;及BrAcCRM197(第1 ]線道）。使用來自小鼠之肽特異性單株抗體（248-61^9 - 8 06八石17-2 8)作爲初級抗體（抗血淸）（發現以1 : 3000的比例最佳）。山羊-抗小鼠IgG(H + L)-HPR 爲次級抗體（I : ] 〇〇〇稀釋比例）。我們發現到除了仿製共軛物及已活化C R Μ , 9 7以外，所有共軛物都可被初級抗體 -96- (94) (94)1355390 辨識出來（參考第10圖）。蛋白質濃度共軛物樣本之蛋白質濃度係以Pierce BCA檢定來測量（參考表15)。胺基酸分析進行胺基酸分析以測定接合程度。該接合程度係以在共軛物內發現之CMCA(羧甲基半胱胺）殘基量來計算。在用肽接合後，使用CMCA來加蓋未反應的已活化部位（參考表]5)。

-97 - (95)1355390 表]5 目太及BrAcCRM197之接合程度接合碼肽序列 (SEQ ID NO ：) 終濃度 (mg/mL) 接合程度 (以CMCA爲準） L-28375 24/01 LVFFAEDV-C (SEQ ID NO ： 44) 1.67 8/10 L-28375 24/02 KLVFFAED-C (SEQ ID NO ： 45) 0.82 5/10 L-28375 24/03 VFFAEDVG-C (SEQ ID NO : 43) 1.43 8/10 L-28375 24/04 C-LVFFAEDV (SEQ ID NO ： 47) 1.04 9/10 L-28375 24/05 C-KLVFFAED (SEQ ID NO : 48) 0.78 1/10 L-28375 24/06 C-VFFAEDVG (SEQ ID NO ： 46) 0.97 9/10 L-28375 24/07 VFFAEDV-C (SEQ ID MO ： 49) 1.00 7/10 L-28375 24/08 LVFFAED-C (SEQ ID NO ： 50) 0.99 8/10 L-28375 24/09(仿製） 1.89 10/11

所有比色檢定係使用微平板光譜劑及SOFTmax Pro -98- (96) (96)1355390 來進行。實施例1 1 A冷肽共軛物於瑞士威伯司特小鼠之免疫原硏究遠系繁殖之瑞士威伯司特小鼠用接合到CRM197之. VFFAEDVG-C (SEQ ID NO ： 43) ' LVFFAEDV-C (SEQ ID NO ： 44) 、 KLVFFAED-C (SEQ ID NO ： 45) 、 C- VFFAEDVG (SEQ ID NO ： 46) ' C-LVFFAEDV (SEQ ID NO :47)、C-KLVFFAED (SEQ ID NO ： 48)、VFFAEDV-C (SEQ ID NO: 49)及 LVFFAED-C (SEQ ID NO: 50)，或以 A/3 1-7CRM197來免疫，所有共軛物皆與RC 5 2 9 SE調合在一起。每組1 0隻動物且共有九組動物係在硏究一開始（第0週）及後續第4週用一種AyS肽共軛物經皮下來接種。血淸係在接種當天於接種之前收集的。 A /3肽共軛物於純系Balb/c小鼠之免疫硏究如前一段所述來免疫純系 B a 1 b / c小鼠，不過在第1 2 週還會用共軛物及佐劑來進行追加促升接種。結果收集兩種硏究之血淸以分析八沒13_28肽-特異性IgG 抗體效價。在Balb/c小鼠進行第】2週追加注射的前一天及一週之後收集Balb/c小鼠血淸。用實施例11動物之脾細胞來評估此等細胞於活體外使用A沒，.^肽片段、A石^^全 -99 - (97) (97)1355390 長’ CRM !97或多株抗體活化物之重疊池剌激時反應的潛能。分析包括在Elispot對白介素4及5及干擾素τ的讀取値。於完成後，該A沒肽共軛物如前所述及如實施例6所述來評估。實施例1 2

AyS肽共軛物於PSAPP小鼠之免疫硏究將 PSAPP 小鼠用 VFFAEDVG-C (SEQ ID NO: 43)、 LVFFAEDV-C (SEQ ID NO : 44)、KLVFFAED-C (SEQ ID NO : 45) 、 C-VFFAEDVG (SEQ ID NO ： 46) 、 C- LVFFAEDV (SEQ ID NO : 47)、C-KLVFFAED (SEQ ID NO ：48)、VFFAEDV-C (SEQ ID NO : 49)及 LVFFAED-C (SEQ ID NO: 50)來免疫。該PSAPP小鼠爲一種過度表現 APP突變及PS]轉基因之雙轉基因小鼠，係述於Holcomb et a 1. (1 998) Nature Medicine 4 : 9 7-11。 A 肽共軛物於PD APP小鼠之免疫硏究將 PDAPP 小鼠用 VFFAEDVG-C (SEQ ID NO: 43)、 LVFFAEDV-C (SEQ ID NO : 44) ' KLVFFAED-C (SEQ ID N〇 : 45) 、 C-VFFAEDVG (SEQ ID NO ： 46) ' C- LVFFAEDV (SEQ ID NO ： 47) ' C-KLVFFAED (SEQ ID NO ：48)、VFFAEDV-C (SEQ ID NO ： 49)及 LVFFAED-C (SEQ ID NO: 50)來免疫。該PDAPP小鼠會表現一種人類 APP之突變形式（APP V”F)且在年輕時便發展出阿茲海默 -100- (98) (98)1355390 氏症（Bard et al. (2000) Nature Medicine 6 : 916-919; Masliah e,et al. (1996) J Neutosci. 15： 16(18)： 5795-8 11)。結果收集兩種硏究之血淸以分析八召13.28肽·特異性IgG 抗體效價。於完成後，該A；5肽共軛物如前所述及如實施例6及11所述’以及於制約恐懼調教（c〇ntextua丨fear conditioning)(CFC)檢定來評估。典型地’該CFC檢定係在標準動物槽中進行且所採用的調教訓練包括伴有聽覺的（如一段時間的8 5 d b白色雜音）’嗅覺的（如杏仁或檸檬味），觸覺（如獸欄地板材質紋理）及/或視覺線索（閃光）之輕微電擊（如0 · 3 5 m足部電擊）。對於負面經驗（電擊）之反應一般爲停頓（除了呼吸以外沒有其它動作）不過也可能包括眨眼或瞬膜反射，視所選動物而定。通常會在測驗第一天測定該負面反應以決定基線値以瞭解在後續測試期間非調教性恐懼之負面反應，例如出現線索但無負面經驗之停頓，即被定義成制約性調教恐懼。爲了改善可信度，測試動物一般會分別由個別技術人員來測試且隨時間來計分。額外的實驗設計可於此技術中如 Craw]ey:JN, What’s Wrong with my Mouse; Behavioral Phenotying of Transgenic and Knockout Mice，Wiley-LisssNY (2000)發現得到。用來測試在此所述之共軛物功能之條件性恐懼調教及 -101 - (99) (99)1355390 其它活體內檢定可使用野生型小鼠或具有特定基因變異導致記憶受損之小鼠或神經退化性疾病如阿茲海默氏症小鼠模式，包括在腦脊髓液（CSF)或血漿中顯示高含量 Α Θ之小鼠模式來進行。例如，阿茲海默氏症小鼠動物模式包括過度表現人類灑粉樣前體蛋白質之”瑞典型”突變 (hAPPswe; Tg2 5 7 6)之轉基因小鼠，其會顯示出年齡相關之記億缺損及斑塊（Hsiao et a 1. (1996) Science 274 : 99-]〇2)。在此所述共軛物之活體內功能性亦可使用述於Duff et al· ( 1 99 6) Nature 3 83,7 10-713 之 PS-1 突變小鼠來測試。阿茲海默氏症之其它基因變異之轉基因模式係述於 Masliah E and Rockenstein E. (2000) J Neural Tr an sm

Suppl. 59:175-83。 CFC檢定爲一種模式小鼠檢定，其至少部份係根據制約恐懼調教硏究中對動物投予測試之免疫原藥·劑後測定動物認知情況並與適當對照組進行比較的結果。該CFC檢定會評估使用有潛力之治療性藥物來治療動物後，該動物 (通常爲小鼠或大鼠）認知情況改變的情形。於特定具體例中，所評估之認知改變爲一種記億受損狀態的改善或者記憶缺失的回復。據此，該CFC檢定可提供一種測定藥物預防或治療認知疾病之治療效果之直接方法，特別是該等疾病或異常會影響腦的—或多處區域如海馬回、海馬回下腳、帶狀皮質' 額葉前部皮質、鼻週皮質、感覺皮質及內側顳葉等。此等CFC檢定於20〇4年12月]5日提出且目前正審查中的美國專利申請案第60/XXX: XXX(具律師檔案第 -102- (100)1355390 ELN-〇5 8-])中有討論，該案全部倂此以爲參考。【圖式簡單說明〕第1圖：顯示將A 肽片段接合到蛋白質/多 CRM197以形成該A沒/CRM197共軛物之化學加工過程圖；第2圖：顯示以酸水解法定量測定S·羧甲基半及S-羧甲基半胱胺之流程圖，其可用來評估例 /CRM197共軛物之肽免疫原-蛋白質/多肽共軛物接度。第3圖：此圖顯示A泠肽/CRM接合反應與pH 相關性。第4圖：此圖顯示 A冷肽/CRM接合反應與肽比例間之相關性。第5圖：A泠1-7/CRM接合反應之加蓋過程的用。反應之pH値爲9.15。與肽反應的反應時間爲，用N-乙醯基半胱胺加蓋的反應時間爲8小時。第6圖：採用不同肽：CRM比例進行之肽接合作用。反應的pH値爲9.0 »與肽反應的反應時間爲 ’用N -乙醯基半胱胺加蓋的反應時間爲8小時》第7圖：在用Ayg肽共軛物及不同佐劑來對靈疫後第36天時靈長類血淸的抗體效價。第8圖：在用A点肽共軛物及不同佐劑來對靈疫後第64天時靈長類血淸的抗體效價。肽載體程之流胱胺酸如 A冷合的程値間之：CRM 確認作 ]6小時及加蓋 ]6小時長類免長類免 -103- (101) (101)1355390 第9圖：不同治療群組在不同天數時之靈長類血淸的抗體效價。靈長類動物係以A冷！-7或A冷]-5 -CRMi97共軛物且以明礬或RC5 2 9爲佐劑來進行免疫且在第29天' 36 天、57天及54天時測量抗A冷抗體之效價。第]0圖：肽-蛋白質共軛物係使用SDS-PAGE蛋白質印跡分析並以三羥甲基胺基甲烷·三甲基甘胺酸預鑄凝膠來界定特徵。各線道分別爲：標記物（第〗線道）；L-28375 24/01(第 2 線道）；L-2 83 7 5 24/02 (第 3 線道）；L-2 83 75 24/03(第 4 線道）；L-283 75 24/04(第 5 線道）；L-28375 24/05(第 6 線道）；L-283 75 24/06(第 7 線道）；L-2 83 75 24/07(第 8 線道）；L-283 75 24/08(第 9 線道）；L-28375 2 4/09(仿製物）（第1〇線道）；及以八<^111\4197(第11線道）》 -104 - 序列表 fi 4 6 i <110> Arumugham, Rasappa Prasad, A. Krishna <120> 製造致免疫性肽載體共軛物之方法 <130> <140> <141> 025721-000110US <150> US 60/530,480 <151> 2003-12-17 <160> 54 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> 智人 <400> 1

Asp Ala Glu Phe Arg Cys 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> 智人 <400> 2 1355390

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Cys 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> 智人 <400> 3 1355390

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Cys 15 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> 智人 <400> 4

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val Cys 15 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> 智人 <400> 5

Asp Ala Glu Phe Arg Gly Ala Gly Ala Cys 15 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> 智人 <400> 6

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gly Ala Gly Ala Cys 1355390 15 ίο <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> 智人 <400> 7

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Gly Ala Gly Ala Cys 15 10 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> 智人 <400> 8

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val Gly Ala Gly Ala 15 10 15

Cys <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> 智人 <400> 9

Val Glu Tyr Gly Ser Asp His Arg Phe Glu Ala Asp Cys 1 5 10 <210> 10 3- <211> 4 <212> PRT <213> 智人 <400> 10 1355390

Gly Ala Gly Ala 1 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> 智人 <400> 11

Pro Lys Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 1 5 10 <210> 12 <211> 13

<212> PRT <213> 智人 <220> <221> misc_feature <222> (3) ..(3) <223> Xaa可爲任何自然生成之胺基酸 <400> 12

Ala Lys Xaa Vsl Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 15 10 <210> 13

<211> 16 <212> PRT 1355390 <213>智人 <400> 13

Glu Lys Lys lie Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn Val 1 5 10 15 <210> 14

<211> 10 <212> PRT <213>智人 <400> 14

Phe Glu Leu Leu Thr Arg lie Leu Thr lie 15 10 <210> 15 <211> 19 <212> PRT <213>智人 <400> 15

Asp Gin Ser lie Gly Asp Leu lie Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly 15 10 15

Asn Glu Gly <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213>智人 16 <400> 1355390

Gin Val His Phe Gin Pro Leu Pro Pro Ala Val Val Lys Leu X 5 10 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213>智人 <400> 17

Gin Tyr He Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr Glu Leu 1 <210> 18 <211> 21 <212> PRT <213> 智人 <400> 18

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 15 10 15

Ala Ser His Leu Glu <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213>智人 <400> 19

Lys Gin lie lie Asn Met Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr 1 5 10 15 -6- 1355390 <210> 20 ， <211> 51 <212> PRT <213>智人 <400> 20

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe 15 10 15 lie Gly lie Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp 20 25 30

Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Asp Ala Glu Phe 35 40 45

Arg His Asp 50 <210> 21 <211> 42 <212> PRT <213>智人 <400> 21

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 1 5 l〇 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val He Ala 35

40 1355390 <210> 22 <211> 22 <212> PRT <213>智人 <400> 22

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe 1 5 10 15

lie Gly lie Thr Glu Leu 20 <210> 23 <211> 28 <212> PRT <213> 智人 <400> 23

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp 15 10 15

Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu 20 25 <210> 24 <211> 43 <212> PRT <213> 智人 <400> 24

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe 1 5 10 15 -8- 1355390 lie Gly lie Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu 20 25 30

Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu 35 <210> 25 <211> 22 <212> PRT <213> 智人 <400> 25 40

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe 15 10 15 lie Gly lie Thr Glu Leu 20

<210> 26 <211> 20 <212> PRT <213>智人 <220> <221> misc__f eature <222> (3) ..(3) <223> Xaa可爲任何自然生成之胺基酸 <400> 26

Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asp Ala Glu 1 5 10 15 -9-

Phe Arg His Asp 20 <210> 27 <211> 34 <212> PRT <213> 智人 <220> <221> misc_feature <222> (24) . . (24) <223> Xaa可爲任何自然生成之胺基酸 <400> 27 1355390

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala 15 10 15

Glu Phe Arg His Asp Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala 20 25 30

Ala Ala <210> 28 <211> 34 <212> PRT <213>智人 <220> <221 > misc_f eature <222> (3) . . (3) <223> Xaa可爲任何自然生成之胺基酸 <400> 28 -10- 1355390

Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asp Ala Glu 15 10 15

Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg 20 25 30

His Asp <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213>智人 <220> <22l> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa可爲任何自然生成之胺基酸 <400> 29

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu 1 5 10 15

Lys Ala Ala Ala 20 <210> 30 <211> 24 <212> PRT <213>智人 30 <400> 1355390

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp lie Ser Gin Ala Val His Ala Ala His 15 10 15

Ala Glu lie Asn Glu Ala Gly Arg 20 <210> 31 <211> 24 <212> PRT <213> 智人 <400> 31

Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr lie Ser Gin Ala Val His Ala Ala His 1 5 10 15

Ala Glu lie Asn Glu Ala Gly Arg 20 <210> 32 <2I1> 24

<212> PRT <213>智人 <400> 32

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly lie Ser Gin Ala Val His Ala Ala His 15 10 15

Ala Glu He Asn Glu Ala Gly Arg 20 <210> 33 <211> 34

PRT <212> 1355390 <213>智人 <400> 33

Pro Lys Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Asp Ala Glu 15 10 15

Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg 20 25 30

His Asp <210> 34 <2ia> 27 <212> PRT <213> 智人 <400> 34

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu 15 10 15

Lys Leu Ala Thr Asp Ala Glu Phe Arg His Asp 20 25 <210> 35 <211> 34 <212> PRT <213>智人 <400> 35

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg Kis Asp Asp Ala 1 ^ 10 15

-13- 1355390

Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu 20 25 30

Ala Thr <210> 36 <211> 27

<212> PRT

<213>智人 <400> 36

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys 15 10 15

Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 20 25 <210> 37 <211> 79

<212> PRT <213>智人 <400> 37

Asp Ala Glu Pile Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu 15 10 15

Lys Leu Ala Thr Glu Lys Lys lie Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser 20 25 30

Val Phe Asn Val Gin Tyr He Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie 35 40 45 -14- 1355390

Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro 50 55 60

Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp 65 IQ 75 <210> 38 <211> 58 <212> PRT c213> 智人 <400> 38

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala 15 10 15

Glu Phe Arg His Asp Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly 20 25 30

He Thr Glu Le*u Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg 35 40 45

Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu 50 55 <210> 39 <211> 44 <212> PRT <213> 智人 <400> 39

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gin Tyr Tie Lys Ala Asn Ser Lys Phe -15- 1355390 15 10 15

He Gly He Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp 20 25 30

Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu 35 40 <210> 40 <211> 535 <212> PRT <213> 智人 <400> 40

Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 15 10 15

Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser He Gin 20 25 30

Lys Gly lie Gin Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gin Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45

Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60

Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80

Val Lys V〇l Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 S5 -16- 1355390

Asp Asn Ala Glu Thr lie Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110

Pro Leu Met Glu Gin Val Gly Thr Glu Glu Phe lie Lys Arg Phe Gly 115 120 125

Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140

Ser Ser Val Glu Tyr lie Asn Asn Trp Glu Gin Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160

Val Glu Leu Glu lie Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gin Asp 165 170 175

Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gin Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg 180 185 190

Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys lie Asn Leu Asp Trp Asp Val 195 200 205

lie Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys He Glu Ser Leu Lys Glu His Gly 210 215 220

Pro lie Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu 225 230 235 240

Glu Lys Ala Lys Gin Tyr Leu Glu Glu Phe His Gin Thr Ala Leu Glu 245 250 255 -17- 1355390

His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val 260 265 270

Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gin Val 275 280 285 lie Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu 290 295 300

Ser lie Leu Pro Gly lie Gly Ser Val Met Gly lie Ala Asp Gly Ala 305 310 315 320

Val His His Asn Thr Glu Glu lie Val Ala Gin Ser lie Ala Leu Ser 325 330 335

Ser Leu Met Val Ala Gin Ala He Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp 340 345 350 lie Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser lie lie Asn Leu Phe 355 360 365

Gin Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His 370 375 380

Lys Thr Gin Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr 385 390 395 400

Val Glu Asp Ser lie lie Arg Thr Gly Phe Gin Gly Glu Ser Gly His 405 410 415

Asp He Lys lie Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro lie Ala Gly Val -18- 1355390 420 425 430

Leu Leu Pro Thr lie Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr 435 440 445

His lie Ser Val Asn Gly Arg Lys lie Arg Met Arg Cys Arg Ala lie 450 455 460

Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly 465 470 475 480

Asn Gly Val Kis Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser 485 490 495

Glu Lys lie His Ser Asn Glu lie Ser Ser Asp Ser lie Gly Val Leu 500 505 510

Gly Tyr Gin Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser 515 520 525

Leu Phe Phe Glu lie Lys Ser 530 535 <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> 智人 <4〇〇> 41 lie Ser Gin Ala Val His Ala Ala His Ala Glu lie Asn Glu Ala Gly 1 5 10 15 -19- 1355390

Arg <210> 42 <211> 42 <212> PRT <213> 小鼠 <400> 42 Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser 1 5 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val 20 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <21C> 43 <21I> 9 <212> PHT <213> 人造的 <220> <223> A-beta 18-25 + C <400> 43 lie Ala

Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly 1 5 <210> 44 <211> 9

<212> PRT

Gly Phe Glu Val Arg His Gin Lys 10 15 Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 25 30

Cys 1355390 <213>人造的 <220>

<223> A-beta 17-24 + C <400> 44

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Cys 1 5 <210> 45

<211> 9 <212> PRT <213>人造的 <220> <223> A-beta 16-23 + C <400> 45

Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Cys 1 5 <210> 46

<211> 9

<212> PRT 人造的 <220> <223> A-beta 18-25 + C <400> 46

Cys Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly 1 5 <210> 47 <211> 9 -21 1355390 <212> PRT <213>人造的 <220> <223> C + A-beta 18-25 <400> 47

Cys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val 1 5 <210> 48

<211> 9 <212> PRT <213>人造的 <220> <223> C + A-beta 16-23 <400> 48

Cys Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp X 5 <210> 49

<211> 8 <212> PRT <213>人造的 <220> <223> A-beta 18-24 + C <400> 49

Val Phe Phe Ala Giu Asp Val Cys 1 5 <210> 50 -22- 1355390

<211> 8 <212> PRT <213>人造的 <220> <223> A-beta 17-23 + C <400> 50

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Cys 1 5

<210> 51 <211> 8 <212> PRT <213>人造的 <220> <223> A-beta 16-22 + C <220> <221> misc—feature <222> (8)..(8) < 2 2 3 > CRM H 97經由終端半胱胺酸力口入

<400> 51

Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Cys 1 5 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213>人造的 <220> <223> C + A-beta 18-24 -23- 1355390 <220> <221 > misc_feature <222> (1)..(1) <223:* CRM 197經由N-端半腕胺酸加入 <400> 52

Cys Val Phe Phe Ala Glu Asp Val 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213>人造的 <220> <223> C + A-beta 17-23 <400> 53

Cys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp 1 5 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213 > 人造的 <220> <223> C + A-beta 16-22 + C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223 > CRM 197經由N-端半胱胺酸加入 <400> 54 -24- 1355390

Cys Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu 1 5 -25

Claims

1355390

附件3A:第93139525號申請專#!!_笳囿條TF本 ·-·.·， 9 9聋1¾月£1銜更)正本民厘十、申請專利範園 1. 一種下式之肽免疫原-蛋白質/多肽載體之共軛物 (Xd——P)n

其中c爲蛋白質/多肽載體，其包含crm197 ; xd爲位在該蛋白質/多肽載體上之胺基酸殘基之衍生化官能基或任意地經共價依附該蛋白質/多肽載體之肽連接子之胺基酸殘基之衍生化官能基；P爲選自細菌蛋白、病毒蛋白、真菌蛋白或寄生蟲蛋白之肽免疫原分子，其係共價依附該蛋白質/多肽載體之胺基酸殘基的衍生化官能基或任意地共價依附在已共價依附該蛋白質/多肽載體之肽連接子的胺基酸殘基之衍生化官能基；R爲選自半胱胺基、N-乙醯基半胱胺基、乙醇胺基、胺基或羥基之加蓋分子，其係共價依附該蛋白質/多肽載體的胺基酸殘基之衍生化官能基或任意地共價依附在已共價依附該蛋白質/多肽載體之肽連接子的胺基酸殘基之衍生化官能基，進而保留該載體之官能性，使得該共軛物保有引發拮抗該肽免疫原之所欲免疫反應的能力，且若無載體該免疫反應將不會發生；η爲大於〇但小於或等於3 8之整數，且ρ爲大於〇但小於等於38之整數。

1355390 2 ·如申請專利範圍第1項所述之共輕物，分子係N-乙醯基半胱胺基。 3·—種免疫原性組成物，其包含如申請專至2項中任一項之共軛物及一或多種藥學上可劑 '稀釋劑及/或佐劑。 4.如申請專利範圍第3項所述之免疫原性中一或多種佐劑選自 GM-CSF、529SE、IL-1: 氫氧化鋁、結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis) 菌（Bordetella pertussis)、細菌性脂多醣、胺磷酸酯化合物、MPLtm (3-0-去醯基化單磷醯3 多肽、Quil A ' STIMULON™ QS-21、百曰咳大腸桿菌熱不安定毒素（LT)、IL-Ια、IL-1/3 4 、 IL-5 、 IL-6 、 IL-7 、 IL-8 、 IL-10 、 IL-13 、 15、IL-16、IL-17、IL-18、干擾素- a、干擾 5 素-r 、G-CSF、TNF-a 或 TNF-/3。其中該加蓋利範圍第1 接受的賦形組成物，其 !、磷酸鋁、、百日咳桿院基葡糖胺 ;脂質A)、毒素（PT)、、IL-2 、 IL-IL-14 ' IL--召、干擾